BR112020024109A2

BR112020024109A2 - processo para produção de açúcares a partir de materiais de carboidrato

Info

Publication number: BR112020024109A2
Application number: BR112020024109-1A
Authority: BR
Inventors: Bertus Noordam; Herman Jan Pel
Original assignee: Dsm Ip Assets B.V.
Priority date: 2018-05-30
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2021-02-17
Also published as: EP3802843B1; ES2944736T3; SI3802843T1; EP3802843A1; WO2019229108A1; LT3802843T; FI3802843T3; HRP20230442T1; BR112020024109B1; HUE061611T2; RS64143B1; DK3802843T3; CN112204151A; PL3802843T3; CA3099202A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de um produto de açúcar e/ou de fermentação a partir de material lignocelulósico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PRO- CESSO PARA PRODUÇÃO DE AÇÚCARES A PARTIR DE MATE- RIAIS DE CARBOIDRATO". Campo

[001] A presente invenção refere-se a um processo para a prepa- ração de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato por hidrólise enzimática e a um processo para a preparação de um produto de fermentação por fermentação de açúcares. Antecedentes

[002] Material lignocelulósico é principalmente constituído de ce- lulose, hemicelulose e lignina e provê uma plataforma atraente para geração de fontes de energia alternativas para combustíveis fósseis. O material está disponível em grandes quantidades e pode ser converti- do em produtos valiosos, por exemplo, açúcares ou biocombustível, tal como as bioetanol.

[003] Produção de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico é conhecida na técnica e em geral inclui as etapas de pré-tratamento, hidrólise, fermentação, e opcionalmente recuperação dos produtos de fermentação.

[004] Comumente, os açúcares produzidos são convertidos em produtos de fermentação valiosos tais como etanol por micro- organismos como levedura. A fermentação ocorre em uma etapa de processo de preferência anaeróbico, separada, ou no mesmo ou em um vaso diferente.

[005] Em geral, custo de produção de enzima é um fator de custo maior no processo de produção global de produtos de fermentação a partir de material lignocelulósico. Até agora, redução de custos de pro- dução de enzima é conseguida por aplicação de produtos de enzima a partir de umas fontes microbianas simples ou múltiplas (vide WO 2008/008793) com atividade hidrolítica mais ampla e/ou mais alta. Isto leva a uma necessidade de enzima menor, taxas de conversão mais rápidas e/ou rendimentos de conversão mais altos e assim diminuir os custos de produção global.

[006] A seguir à otimização das enzimas, otimização de projeto de processo é uma ferramenta crucial para reduzir custos globais da produção de produtos de açúcar e produtos de fermentação. Por exemplo, perda de açúcar por meio de produtos de degradação de açúcar aumenta com rendimento decrescente. Uma vez que produtos de degradação de açúcar podem inibir fermentação, projeto de pro- cesso seria otimizado para diminuir a quantidade destes produtos de degradação de açúcar.

[007] Por razões econômicas, é, portanto, desejável incluir confi- gurações de processo novas e inovadoras que visaram na redução de custos de produção global no processo que envolve o pré-tratamento, hidrólise e fermentação de material de carboidrato. Sumário

[008] Um objetivo do pedido é para prover um processo aperfei- çoado para a preparação de um produto de açúcar e/ou um produto de fermentação a partir de material de carboidrato. O processo é aperfei- çoado por uso de condições de hidrólise específicas. Descrição Detalhada

[009] Através de todo o presente relatório e as reivindicações anexas, as palavras "compreender" e "incluir" e variações tais como "compreende", "compreendendo", "inclui" e "incluindo" devem ser in- terpretados inclusivamente. Isto é, pretende-se que estas palavras transportem a possível inclusão dos outros elementos ou números in- teiros não especificamente relatado, onde o contexto permite. Os arti- gos "um" e "uma" são usados aqui para referir-se a um ou a mais do que um (isto é, a um ou pelo menos um) do objeto gramatical do arti- go. A título de exemplo, "um elemento" pode significar um elemento ou mais do que um elemento.

[0010] Descrito aqui é um processo para a preparação de um pro- duto de açúcar a partir de material de carboidrato, compreendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato, (b) liquefação do material de carboidrato pré-tratado com uma composição de enzi- ma a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato liquefeito, (c) sacarificação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma tempera- tura de 50ºC até 60ºC por de 1 a 120 horas para produzir um produto de açúcar, em que oxigênio é adicionado durante a sacarificação, e (d) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar. O termo "produto de açúcar", "um ou mais açúcares" ou "açúcar" são usados intercam- beavelmente aqui. Alternativamente, o termo "material de carboidrato hidrolisado" pode ser usado ao invés destes termos.

[0011] Descrito aqui é um processo para a preparação de um pro- duto de açúcar a partir de material de carboidrato, compreendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato em um primei- ro reator, (b) liquefação do material de carboidrato pré-tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato liquefeito em um segundo reator, (c) sacarificação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas para produzir um produto de açúcar, em que oxigê- nio é adicionado durante a sacarificação, em um terceiro reator, e (d) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar. "Reator" como usado aqui pode também significar mais do que um reator. Assim, "um primeiro reator" pode também significar uma série de primeiros reato- res.

[0012] Descrito aqui é também um processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material de carboidrato, com-

preendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidra- to, (b) liquefação do material de carboidrato pré-tratado com uma com- posição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 ho- ras para produzir um material de carboidrato liquefeito, (c) sacarifica- ção do material de carboidrato liquefeito com uma composição de en- zima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas para pro- duzir um produto de açúcar, em que oxigênio é adicionado durante a sacarificação, (d) fermentação do produto de açúcar para produzir um produto de fermentação, e (e) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação.

[0013] Descrito aqui é também um processo para a preparação de um produto de fermentação a partir de material de carboidrato, com- preendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato em um primeiro reator, (b) liquefação do material de carboidrato pré- tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato lique- feito em um segundo reator, (c) sacarificação do material de carboidra- to liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas para produzir um produto de açúcar, em que oxigênio é adicionado durante a sacarificação, em um terceiro reator, (d) fermentação do produto de açúcar para produzir um produto de fermentação em um quarto reator, e (e) opcionalmente, recupera- ção do produto de fermentação.

[0014] Em uma concretização do processo como descrito aqui o material de carboidrato liquefeito é sacarificado na ausência da adição de oxigênio depois da etapa b e antes da etapa c. Em outras palavras, descrito aqui é também um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato, compreendendo as eta- pas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato, (b) liquefação do material de carboidrato pré-tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato liquefeito, (c) sacarificação do material de car- boidrato liquefeito com uma composição de enzima sem adição de oxigênio para produzir um produto de açúcar, (d) sacarificação do ma- terial de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas com a adição de oxigê- nio para produzir um produto de açúcar, e (e) opcionalmente, recupe- ração do produto de açúcar da etapa c e/ou da etapa d. Descrito aqui é também um processo para a preparação de um produto de fermenta- ção a partir de material de carboidrato, compreendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato, (b) liquefação do materi- al de carboidrato pré-tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um materi- al de carboidrato liquefeito, (c) sacarificação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima sem adição de oxigênio pa- ra produzir um produto de açúcar, (d) sacarificação do material de car- boidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas com a adição de oxigênio para pro- duzir um produto de açúcar, (e) fermentação do produto de açúcar da etapa c e/ou da etapa d para produzir um produto de fermentação; e (e) opcionalmente, recuperação do produto de fermentação.

[0015] Em uma concretização o material de carboidrato liquefeito é sacarificado sem adição de oxigênio a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas. Em uma concretização o material de carboi- drato liquefeito é sacarificado sem adição de oxigênio a uma tempera- tura de 52ºC a 58ºC por 10 a 60 horas.

[0016] Em uma concretização liquefação do material de carboidra- to pré-tratado com uma composição de enzima é feita a uma tempera- tura de 61ºC a 65ºC. Em uma concretização liquefação do material de carboidrato pré-tratado com uma composição de enzima é feita a uma temperatura de 62ºC a 65ºC.

[0017] Em uma concretização liquefação do material de carboidra- to pré-tratado com uma composição de enzima é feita por 1 a 20 ho- ras.

[0018] Em uma concretização o material de carboidrato liquefeito é sacarificado com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas com a adição de oxigênio. Em uma concretização o material de carboidrato liquefeito é sacarificado com uma composição de enzima a uma temperatura de 51ºC a 59ºC com a adição de oxigênio. Em uma concretização o material de carboidrato liquefeito é sacarificado com uma composição de enzima a uma tem- peratura de 52ºC a 58ºC com a adição de oxigênio. Em uma concreti- zação o material de carboidrato liquefeito é sacarificado com uma composição de enzima a uma temperatura de 53ºC a 57ºC com a adi- ção de oxigênio.

[0019] Em uma concretização a liquefação é feita em um reator. Em uma concretização a liquefação pode também ser feita em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou ainda mais reatores. Assim, o termo "reator" não é limitado a um único reator, mas pode significar múltiplos reatores.

[0020] Nos processos como descritos aqui, o material de carboi- drato pré-tratado é adicionado ao reator em que a liquefação ocorre. Isto pode ser feito por alimentação por batelada ou continuamente. Em uma concretização uma composição de enzima é adicionada ao reator em que a liquefação ocorre. Isto pode ser feito por alimentação por batelada ou continuamente. A composição de enzima pode ser uma composição aquosa. Em uma concretização o material de carboidrato liquefeito e/ou o material de carboidrato parcialmente liquefeito é reci- clado de volta para o reator em que a liquefação ocorre. Em uma con- cretização o material de carboidrato liquefeito e/ou o material de car-

boidrato parcialmente liquefeito é resfriado antes da adição ao reator em que a liquefação ocorre. Em uma concretização o material de car- boidrato liquefeito e/ou o material de carboidrato parcialmente liquefei- to é submetido a uma separação de sólido/líquido antes da adição ao reator em que a liquefação ocorre. Em uma concretização a separação sólida/líquida é feita antes da etapa de resfriamento. Em uma concreti- zação, apenas a fração líquida obtida depois da separação sóli- da/líquida é resfriada. Em uma concretização tanto a fração líquida quanto a fração sólida são adicionadas ao reator em que a liquefação ocorre.

[0021] Em uma concretização a sacarificação sem adição de oxi- gênio é feita em um reator. Em uma concretização a sacarificação po- de também ser feita em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou ainda mais reatores. Assim, o termo "reator" não é limitado a um único reator, mas pode significar múltiplos reatores.

[0022] Em uma concretização a sacarificação com a adição de oxigênio é feita em um reator. Em uma concretização a sacarificação pode também ser feita em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, no- ve, dez ou ainda mais reatores. Assim, o termo "reator" não é limitado a um único reator, mas pode significar múltiplos reatores.

[0023] Em uma concretização a liquefação e sacarificação são fei- tas em reatores diferentes. Em uma concretização a sacarificação sem adição de oxigênio e a sacarificação com a adição de oxigênio são fei- tas em reatores diferentes.

[0024] Descrito aqui é também um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato, compreen- dendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato em um primeiro reator, (b) liquefação do material de carboidrato pré- tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato lique-

feito em um segundo reator, (c) sacarificação do material de carboidra- to liquefeito com uma composição de enzima sem adição de oxigênio para produzir um produto de açúcar em um terceiro reator, (d) sacarifi- cação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas com a adição de oxigênio para produzir um produto de açúcar em um quarto reator, e (e) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar da eta- pa c e/ou da etapa d. Descrito aqui é também um processo para a pre- paração de um produto de fermentação a partir do material de carboi- drato, compreendendo as etapas de (a) pré-tratamento do material de carboidrato em um primeiro reator, (b) liquefação do material de car- boidrato pré-tratado com uma composição de enzima a uma tempera- tura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato liquefeito em um segundo reator, (c) sacarificação do ma- terial de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima sem adição de oxigênio para produzir um produto de açúcar em um terceiro reator, (d) sacarificação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas com a adição de oxigênio para produzir um produto de açúcar em um quarto reator, (e) fermentação do produto de açúcar da etapa c e/ou da etapa d para produzir um produto de fermentação em um quin- to reator, e (e) opcionalmente, recuperação do produto de fermenta- ção.

[0025] Em uma concretização o pré-tratamento é feito em um rea- tor tendo um volume de 30 - 200 m3, de preferência de 100 - 150 m3. No caso de múltiplos reatores são usados no pré-tratamento do pro- cesso como descrito aqui, eles podem ter o mesmo volume, mas tam- bém podem ter um volume diferente.

[0026] Em uma concretização o reator de pré-tratamento usado nos processos como descritos aqui tem uma razão de altura para diâ-

metro de 3:1 a 12:1.

[0027] Em uma concretização a liquefação é feita em um reator tendo um volume de 10-500 m3, de preferência de 50-350 m3. No caso de múltiplos reatores são usados na liquefação, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.

[0028] Em uma concretização o reator em que a liquefação é feita tem uma razão de altura para diâmetro de 0.1:1 a 10:1.

[0029] Em uma concretização a sacarificação sem adição de oxi- gênio é feita em um reator tendo um volume de 10 - 5000 m3, de prefe- rência de 50 - 5000 m3. No caso de múltiplos reatores são usados na sacarificação sem adição de oxigênio, eles podem ter o mesmo volu- me, mas também podem ter um volume diferente.

[0030] Em uma concretização o reator em que a sacarificação sem adição de oxigênio é feita tem uma razão de altura para diâmetro de 0,1:1 a 10:1.

[0031] Em uma concretização a sacarificação com a adição de oxigênio é feita em um reator tendo um volume de 10 - 5000 m3, de preferência de 50 - 5000 m3. No caso de múltiplos reatores são usados na sacarificação com a adição de oxigênio, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.

[0032] Em uma concretização o reator em que a sacarificação com a adição de oxigênio é feita tem uma razão de altura para diâmetro de 0,1:1 a 10:1.

[0033] Em uma concretização oxigênio é adicionado ao material de carboidrato pré-tratado durante a sacarificação. Em uma concreti- zação oxigênio é adicionado durante pelo menos uma parte da sacari- ficação. Oxigênio pode ser adicionado continuamente ou descontinu- amente durante a sacarificação. Em uma concretização oxigênio é adi- cionado um ou mais vezes durante o processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato como descrito aqui. Oxigênio é adicionado aos reatores usado na sacarificação com a adição de oxigênio.

[0034] Oxigênio pode ser adicionado de várias formas. Por exem- plo, oxigênio pode ser adicionado como gás de oxigênio, gás enrique- cido com oxigênio, tal como ar enriquecido com oxigênio ou ar. Oxigê- nio pode também ser adicionado por meio de geração de oxigênio in situ.

[0035] Exemplos como adicionar oxigênio incluem, mas não são limitados a, adição de oxigênio por meio de pulverização, insuflação, eletrólise, adição química de oxigênio, enchimento de um reator usado na sacarificação a partir do topo (mergulhar o hidrolisado liquefeito no reator e consequentemente introdução de oxigênio para dentro do hi- drolisado) e adição de oxigênio ao espaço de topo de um reator. Quando oxigênio é adicionado ao espaço de topo do reator, oxigênio suficiente necessário para a reação de hidrólise pode ser fornecido. Em geral, a quantidade de oxigênio adicionado ao reator pode ser con- trolada e/ou variada. Restrição do oxigênio fornecido é possível por adição apenas de oxigênio durante parte do tempo de hidrólise no rea- tor. Uma outra opção é adição de oxigênio a uma baixa concentração, por exemplo, por uso de uma mistura de ar e ar reciclado (ar que sai do reator) ou por "diluição" de ar com um gás inerte. Aumentando a quantidade de oxigênio adicionado pode ser conseguido pela adição de oxigênio durante períodos mais longos do tempo de hidrólise, por adição do oxigênio a uma concentração mais alta ou por adição de mais ar. Um outro meio de controlar a concentração de oxigênio é para adicionar um consumidor de oxigênio e/ou um gerador de oxigênio. Oxigênio pode ser introduzido para dentro do material de carboidrato liquefeito presente no reator. Pode também ser introduzido para dentro do espaço de topo do reator. Oxigênio pode ser soprado no material de carboidrato liquefeito presente no reator. Pode também ser soprado no espaço de topo do reator.

[0036] Em uma concretização oxigênio é adicionado ao reator usado na sacarificação antes e/ou durante e/ou depois da adição do material de carboidrato liquefeito ao reator. O oxigênio pode ser intro- duzido juntamente com o material de carboidrato liquefeito que entra no reator. O oxigênio pode ser introduzido para dentro da corrente de material que entrará no reator ou com parte do conteúdo do reator que passa que passa por um circuito externo do reator. De preferência, oxigênio é adicionado quando o material de carboidrato liquefeito está presente no reator.

[0037] Em uma concretização oxigênio é adicionado durante a sa- carificação para manter o oxigênio dissolvido a 11% até 80% do nível de saturação. Em uma concretização oxigênio é adicionado durante a sacarificação para manter o oxigênio dissolvido a 20% até 60% do ní- vel de saturação.

[0038] Em uma concretização as composições de enzima usadas para liquefação e sacarificação são as mesmas. Em uma outra concre- tização as composições de enzima usadas para liquefação e sacarifi- cação são diferentes. Em uma concretização preferida as composições de enzima usadas para sacarificação sem adição de oxigênio e sacari- ficação com a adição de oxigênio são as mesmas.

[0039] Em uma concretização a composição de enzima usada na liquefação e/ou sacarificação é de um fungo, de preferência um fungo filamentoso. Em uma concretização as enzimas na composição de en- zima são derivadas de um fungo, de preferência um fungo filamentoso. Em uma concretização a composição de enzima compreende uma en- zima fúngica, de preferência uma enzima fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentodas da subdivisão Eumycota e Oomycota (as defined by Hawksworth e outros, In, Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB

International, University Press, Cambridge, UK). Fungos filamentosos incluem, mas não são limitados a Acremonium, Agaricus, Aspergillus, Aureobasidium, Beauvaria, Cephalosporium, Ceriporiopsis, Chaeto- mium paecilomyces, Chrysosporium, Claviceps, Cochiobolus, Copri- nus, Cryptococcus, Cyathus, Emericella, Endothia, Endothia mucor, Filibasidium, Fusarium, Geosmithia, Gilocladium, Humicola, Magna- porthe, Mucor, Myceliophthora, Myrothecium, Neocallimastix, Neuros- pora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Panerochaete, Pleurotus, Podospora, Pyricularia, Rasamsonia, Rhizomucor, Rhizopus, Scylati- dium, Schizophyllum, Stagonospora, Talaromyces, Thermoascus, Thermomyces, Thielavia, Tolypocladium, Trametes pleurotus, Tricho- derma e Trichophyton. Em uma concretização preferida o fungo é Ra- samsonia, com Rasamsonia emersonii sendo mais preferido. Ergo, os processos como descritos aqui são vantajosamente aplicados em combinação com enzimas derivadas de um micro-organismo do gêne- ro Rasamsonia ou as enzimas usadas nos processos como descritos aqui compreendem uma enzima de Rasamsonia.

[0040] Várias cepas de fungos filamentosos estão prontamente acessíveis ao público em numerosas coleções de cultura, tais como the American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0041] De preferência, os processos como descritos aqui são fei- tos com enzimas termoestáveis. Enzimas "termoestáveis" como usa- das aqui significam que a enzima tem uma ótima temperatura de 50ºC ou mais alta, 60ºC ou mais alta, 70ºC ou mais alta, 75ºC ou mais alta, 80ºC ou mais alta, ou ainda 85ºC ou mais alta. Eles podem, por exem- plo, ser isolados de micro-organismos termofílicos ou podem ser proje- tados pela pessoa versada e artificialmente sintetizados. Em uma con-

cretização os polinucleotídeos que codificam as enzimas termoestá- veis podem ser isolados ou obtidos a partir de fungos filamentosos termofílicos ou termotolerantes ou isolados de fungos não termofílicos ou não termotolerantes, mas demonstraram ser termoestáveis. Por "fungo termofílico" que ser dizer um fungo que se desenvolve a uma temperatura de 50°C ou mais alta. Por fungo "termotolerante" quer se dizer um fungo que se desenvolve a uma temperatura de 45°C ou mais alta, tendo um máximo perto 50°C.

[0042] Células fúngicas termofílicas ou termotolerantes adequadas podem ser células de Humicola, Rhizomucor, Myceliophthora, Rasam- sonia, Talaromyces, Thermomyces, Thermoascus ou Thielavia, de pre- ferência células de Rasamsonia. Fungos termofílicos ou termotoleran- tes preferidos são Humicola grisea var. thermoidea, Humicola lanugi- nosa, Myceliophthora thermophila, Papulaspora thermophilia, Rasam- sonia byssochlamydoides, Rasamsonia emersonii, Rasamsonia argil- lacea, Rasamsonia eburnean, Rasamsonia brevistipitata, Rasamsonia cylindrospora, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor miehei, Talaromyces bacillisporus, Talaromyces leycettanus, Talaromyces thermophilus, Thermomyces lenuginosus, Thermoascus crustaceus, Thermoascus thermophilus Thermoascus aurantiacus e Thielavia terrestris.

[0043] Rasamsonia é um novo gênero compreendendo espécie de Talaromyces e Geosmithia termotolerante e termofílica. Com base nos dados fisiológicos e moleculares, fenotípico, as espécies Talaromyces emersonii, Talaromyces byssochlamydoides, Talaromyces eburneus, Geosmithia argillacea e Geosmithia cylindrospora foram transferidos para Rasamsonia gen. nov. Talaromyces emersonii, Penicillium geos- mithia emersonii e Rasamsonia emersonii são usadas intercambea- velmente aqui.

[0044] Nos processos como descritos aqui composições de enzi- ma são usadas. Em uma concretização as composições são estáveis.

"Composições de enzima estáveis" como usadas aqui significam que as composições de enzima retem a atividade depois de 30 horas de tempo de reação de hidrólise, de preferência pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de sua atividade inicial depois de 30 horas de tempo de reação de hidrólise. Em uma concretização a composição de enzima retem atividade depois de 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 horas de tempo de reação de hidró- lise.

[0045] As enzimas podem ser preparadas por fermentação de um substrato adequado com um micro-organismo adequado, por exemplo, Rasamsonia emersonii ou Aspergillus niger, em que as enzimas são produzidas pelo micro-organismo. O micro-organismo pode ser altera- do para aperfeiçoar ou para fazer as enzimas. Por exemplo, o micro- organismo pode ser mutado por procedimentos de aperfeiçoamento de cepa clássica ou por técnicas de DNA recombinante. Portanto, os mi- cro-organismos mencionados aqui podem ser usados como tais para produzir as enzimas ou podem ser alterados para aumentar a produ- ção ou para produzir enzimas alteradas que podem incluir enzimas heterólogas, por exemplo, celulases, assim enzimas que são não ori- ginalmente produzidas pelo por aquele micro-organismo. De preferên- cia, um fungo, mais de preferência um fungo filamentoso é usado para produzir as enzimas. Vantajosamente, um micro-organismo termofílico ou termotolerante é usado. Opcionalmente, um substrato é usado que induz a expressão das enzimas pelo micro-organismo de produção de enzima.

[0046] As enzimas são usadas para liquefazer o material de car- boidrato e/ou sacarificar o material de carboidrato (liberar açúcares de material de carboidrato que compreende polissacarídeos). Os princi- pais polissacarídeos são celuloses (glucanos) e hemiceluloses (xila-

nos, heteroxilanos e xiloglucanos). Além disso, alguma hemicelulose pode ser apresentada como glucomanas, por exemplo, em material lignocelulósico derivado de madeira. A hidrólise enzimática destes po- lissacarídeos para dar açúcares solúveis, incluindo tanto monômeros quanto multímeros, por exemplo, glicose, celobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramanose, ribose, ácido galacturônico, ácido glucurônico e outras hexoses e pentoses ocorre sob a ação de diferentes enzimas que agem em conjunto. Um produto de açúcar compreende açúcares solúveis, incluindo tanto monômeros quanto multímeros. Em uma concretização o produto de açúcar compreende glicose, galactose e arabinose. Exemplos de outros açúcares são ce- lobiose, xilose, arabinose, galactose, frutose, manose, ramanose, ribo- se, ácido galacturônico, ácido glucorônico e outras hexoses e pento- ses. O produto de açúcar pode ser usado como tal ou pode ser ulteri- ormente processado, por exemplo, recuperado e/ou purificado.

[0047] Além disso, pectinas e outras substâncias pécticas tais co- mo arabinanas podem formar proporção consideravelmente da massa seca de paredes tipicamente celulares de tecidos de planta não lenho- sas (cerca de um quarto até a metade de massa seca pode ser pecti- nas). Além do mais, o material de carboidrato pode compreender ligni- na.

[0048] Enzimas que podem ser usadas nos processos como des- critos aqui são descritas em mais detalhes abaixo.

[0049] Mono-oxigenases de polissacarídeos líticos, endoglucana- ses (EG) e exo-celobioidrolases (CBH) catalisam a hidrólise de celulo- se insolúvel em produtos tais como celooligossacarídeos (celobiose como um principal produto), embora β-glucosidases (BG) convertem os oligossacarídeos, principalmente celobiose e celotriose, em glicose.

[0050] Xilanases juntamente com outras enzimas acessórias, por exemplo, α-L- arabinofuranosidases, feruloila e acetolxilan esterases,

glucuronidases, e β-xilosidases catalisam a hidrólise de hemicelulose.

[0051] Uma composição de enzima para o uso nos processos co- mo descritos aqui pode compreender pelo menos duas atividades, apesar de tipicamente uma composição compreenderá mais do que duas atividades, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou ainda mais atividades. Tipicamente, uma composição de enzima para o uso nos processos como descritos aqui compreende pelo me- nos duas celulases. As pelo menos duas celulases podem conter ativi- dades iguais ou diferentes. A composição de enzima para o uso nos processos como descritos aqui pode também compreender pelo me- nos uma enzima outra que não uma celulase. De preferência, a pelo menos uma outra enzima tem uma atividade de enzima auxiliar, isto é, uma atividade adicional que, ou diretamente ou indiretamente leva a degradação de lignocelulose. Exemplos de tais atividades auxiliares são mencionados aqui e incluem mas não são limitados a hemicelula- ses.

[0052] Uma composição de enzima para o uso nos processos co- mo descritos aqui pelo menos compreende uma mono-oxigenase de polissacarídeo lítica (LPMO), uma endoglucanase (EG), uma celobioi- drolase (CBH), uma xilanase, uma beta-xilosidase (BX) e uma beta- glucosidase (BG). Uma composição de enzima pode compreender mais do que uma atividade de enzima por classe de atividade. Por exemplo, uma composição pode compreender duas endoglucanases, por exemplo, uma endoglucanase tendo atividade de endo-1,3(1,4)-β glucanase e uma endoglucanase tendo atividade de endo-β-1,4- glucanase.

[0053] Uma composição para o uso nos processos como descritos aqui pode ser derivada de um fungo, tal como um fungo filamentoso, tal como Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii. Em uma con- cretização pelo menos uma das enzimas pode ser derivada de Ra-

samsonia emersonii. Em uma concretização a mono-oxigenase de po- lissacarídeo lítica e/ou a beta-xilosidase são derivadas de Rasamsonia emersonii. Se necessário, a enzima pode ser suplementada com en- zimas adicionais de outras fontes. Tais enzimas adicionais podem ser derivadas de fontes clássicas e/ou produzidas pelos organismos gene- ticamente modificados.

[0054] Além disso, enzimas nas composições de enzima para o uso nos processos como descritos aqui podem ser capazes de traba- lhar a pH baixo. Para as finalidades desta invenção, pH baixo indica um pH de 5,5 ou mais baixo, 5 ou mais baixo, 4,9 ou mais baixo, 4,8 ou mais baixo, 4,7 ou mais baixo, 4,6 ou mais baixo, 4,5 ou mais baixo, 4,4 ou mais baixo, 4,3 ou mais baixo, 4,2 ou mais baixo, 4,1 ou mais baixo, 4,0 ou mais baixo 3,9 ou mais baixo, 3,8 ou mais baixo, 3,7 ou mais baixo, 3,6 ou mais baixo, 3,5 ou mais baixo.

[0055] A composição de enzima para o uso nos processos como descritos aqui pode compreender uma celulase e/ou uma hemicelulose e/ou uma pectinase oriundas de Rasamsonia. Elas podem também compreender uma celulase e/ou uma hemicelulose e/ou uma pectinase oriundas de uma fonte outra que não Rasamsonia. Elas podem ser usadas juntamente com uma ou mais enzimas de Rasamsonia ou elas podem ser usadas sem enzimas de Rasamsonia adicionais estando presente.

[0056] Uma composição de enzima para o uso nos processos co- mo descritos aqui compreende uma mono-oxigenase de polissacarí- deo lítica, uma endoglucanase, uma celobioidrolase I (CBHI), uma ce- lobioidrolase II (CBHII), uma beta-glucosidase, uma endoxilanase (EX) e uma beta-xilosidase.

[0057] Uma composição de enzima para o uso nos processos co- mo descritos aqui pode compreender um tipo de atividade de celulose e/ou atividade de hemicelulose e/ou atividade de pectinase providas por uma composição como descritas aqui e um segundo tipo de ativi- dade de celulase e/ou atividade de hemicelulose e/ou atividade de pectinase providas por uma celulase/hemicelulase/pectinase adicio- nais.

[0058] Em uma concretização a composição de enzima usada na sacarificação é um caldo de fermentação total de um fungo filamento- so, o dito caldo compreendendo uma celobioidrolase, uma beta- glucosidase, uma xilanase, uma beta-xilosidase e uma oxigenase de monossacarídeo lítica. Estas enzimas em mais detalhes aqui.

[0059] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma endoglucanase. Em uma concretização a endoglucanase compreende uma endoglucanase de GH5 e/ou uma endoglucanase de GH7. Em uma concretização a composição de enzima usada na lique- fação é um caldo de fermentação inteiro de um fungo filamentoso, o dito caldo compreendendo uma endoglucanase. Em uma concretiza- ção a quantidade de endoglucanase na composição de enzima usada na liquefação é de 50 – 1000 µg/grama matéria seca no material de carboidrato pré-tratado. Endoglucanases foram descritos em mais de- talhes aqui. Em uma concretização a composição de enzima usada para liquefação compreende mais endoglucanase do que a composi- ção de enzima usada para sacarificação.

[0060] Como usada aqui, uma celulase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar celulose. Um polipeptídeo que é capaz de degradar celulose é um que é capaz de catalisar o processo de decomposição de celulose em unidades menores, ou parcialmente, por exemplo, em celodextrinas, ou totalmente em monômeros de gli- cose. Uma celulase como descrita aqui pode ser originar uma popula- ção mista de celodextrinas e monômeros de glicose. Tal degradação tipicamente ocorrerá a título de uma reação de hidrólise.

[0061] Como usada aqui, uma hemicelulose é qualquer polipeptí-

deo que é capaz de degradar ou modificar hemicelulose. Isto é, uma hemicelulose pode ser capaz de degradar ou modificar um ou mais de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano e xiloglucano. Um polipeptídeo que é capaz de degradar a hemicelulose é um que é ca- paz de catalisar o processo de decomposição da hemicelulose em po- lissacarídeos menores, ou parcialmente, por exemplo, em oligossaca- rídeos, ou totalmente em monômeros de açúcar, por exemplo, monô- meros de açúcar de hexose ou pentose. Uma hemicelulose como a descrita aqui pode originar uma população mista de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Tal degradação tipicamente ocorrerá a título de uma reação de hidrólise.

[0062] Como usada aqui, a pectinase é qualquer polipeptídeo que é capaz de degradar ou modificar pectina. Um polipeptídeo que é ca- paz de degradar pectina é uma que é capaz de catalisar o processo de decomposição de pectina em unidades menores, ou parcialmente, por exemplo, em oligossacarídeos, ou totalmente em monômeros de açú- car. A pectinase como descrita aqui pode originar uma população mis- ta de oligossacarídeos e monômeros de açúcar. Tal degradação tipi- camente ocorrerá a título de uma reação de hidrólise.

[0063] Correspondentemente, uma composição de enzima para o uso nos processos como descritos aqui pode compreender um ou mais das seguintes enzimas, uma mono-oxigenase de polissacarídeo lítica (por exemplo, GH61), uma celobioidrolase, uma endo-β-1,4-glucanase, uma beta-glucosidase, e uma β-(1,3)(1,4)-glucanase. Uma composição para o uso nos processos como descritos aqui podem também com- preender uma ou mais hemicelulases, por exemplo, uma endoxilanase, uma β-xilosidase, uma α-L-arabionofuranosidase, uma α-D- glucuronidase, uma esterase de acetil xilano, uma esterase de feruloi- la, uma esterase de cumaroila, uma α-galactosidase, uma β- galactosidase, uma β-mananase e/ou uma β-manosidase. Uma com-

posição para o uso nos processos como descritos aqui podem também compreender um ou mais pectinases, por exemplo, uma endo- poligalacturonase, uma esterase de pectin-metila, uma endo- galactanase, uma beta-galactosidase, uma esterase de pectin-acetila, uma liase de endo-pectina, liase de pectato, alfa-ramnosidase, uma exo-galacturonase, uma liase de expoligalacturonato, uma hidrolase de ramnogalacturonano, uma liase de ramnogalacturonano, um esterase de acetila de ramnogalacturonano, uma galacturonoidrolase de ram- nogalacturonano, e/ou uma xilogalacturonase. Além disso, uma ou mais das seguintes enzimas, uma amilase, uma protease, uma lipase, uma ligninase, uma hexosiltransferase, uma glucuronidase, uma ex- pansina, uma proteína induzida por celulose ou uma proteína de inte- gração de celulose ou como proteína pode estar presente em uma composição para o uso nos processos como descritos aqui (estes são chamados de atividades auxiliares acima).

[0064] Como usada aqui, mono-oxigenases de polissacarídeo líti- cas são enzimas que foram recentemente classificadas por CAZy na família AA9 (Família de atividade auxiliar 9) ou família AA10 (Família de atividade auxiliar 10). Ergo, existe mono-oxigenases de polissacarí- deo líticas AA9 e mono-oxigenases de polissacarídeo líticas AA10. Mono-oxigenases de polissacarídeo líticas são capazes de abrir uma estrutura de glucano cristalina e melhora de celulases nos substratos de lignocelulose. Elas são enzimas tendo atividade de melhoramento celulolítica. Mono-oxigenases de polissacarídeo líticas podem também afetar celo-oligossacarídeos. De acordo com a literatura posterio (vide Isaksen e outros, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, p. 2632-2642), proteínas chamadas H61 (glicosídeo hidrolase família 61 ou algumas vezes chamados de EGIV) são mono-oxigenases de polis- sacarídeo líticas. GH61 foi originalmente classificado como endogluca- nase com base na medição de atividade de endo-1,4-β-d-glucanase muito fraca em um membro da família, mas foram recentemente re- classificas por CAZy na família AA9. CBM33 (módulo de ligação de carboidrato família 33) é também uma mono-oxigenase de polissacarí- deo lítica (vide Isaksen e outros, Journal of Biological Chemistry, vol. 289, no. 5, pp. 2632-2642). CAZy foi recentemente reclassificado CBM33 na família AA10.

[0065] Em uma concretização a mono-oxigenase de polissacarí- deo lítica compreende uma mono-oxigenase de polissacarídeo lítica AA9. Isto significa que pelo menos uma de umas mono-oxigenases de polissacarídeo líticas na composição de enzima é uma mono- oxigenase de polissacarídeo lítica AA9. Em uma concretização, todas as mono-oxigenases de polissacarídeo líticas na composição de enzi- ma são mono-oxigenase de polissacarídeo lítica AA9.

[0066] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma mono-oxigenase de polissacarídeo lítica de Thermoascus, tal como Thermoascus aurantiacus, tal como aquele descrito na WO 2005/074656 como SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 1 na WO 2014/130812 e na WO 2010/065830; ou da Thielavia, tal como Thiela- via terrestris, tal como aquela descrita na WO 2005/074647 como SEQ ID NO: 8 ou SEQ ID NO: 4 na WO 2014/130812 e na WO 2008/148131, e WO 2011/035027; ou do Aspergillus, tal como Asper- gillus fumigatus, tal como aquele descrito na WO 2010/138754 como SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3 na WO 2014/130812; ou de Penicil- lium, tal como Penicillium emersonii, tal como aquela revelada como SEQ ID NO: 2 na WO 2011/041397 ou SEQ ID NO: 2 na WO 2014/130812. Outras mono-oxigenases de polissacarídeo líticas ade- quadas incluem, mas não são limitadas a, Trichoderma reesei (vide WO 2007/089290), Myceliophthora thermophila (vide WO 2009/085935, WO 2009/085859, WO 2009/085864, WO 2009/085868), Penicillium pinophilum (vide WO 2011/005867), Thermoascus sp. (vide

WO 2011/039319), e Thermoascus crustaceous (vide WO 2011/041504). Outras enzimas celulolíticas que podem ser contidas na composição de enzima são descritas na WO 98/13465, WO 98/015619, WO 98/015633, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, na patente US no. 5.457.046, na patente US no. 5.648.263, e na pa- tente US no. 5.686.593, para nomear exatamente alguns. Em uma concretização preferida, uma mono-oxigenase de polissacarídeo lítica é de Rasamsonia, por exemplo, Rasamsonia emersonii (vide WO 2012/000892).

[0067] Como usada aqui, endoglucanases são enzimas que são capazes de catalisar a endoidrólise de ligações de 1,4-β-D- glucosídicas em celulose, lichenina ou cereal β-D-glucanos. Elas per- tencem a EC 3.2.1.4 e podem também ser capazes de hidrolisar 1,4- ligações em β-D-glucanos também contendo 1,3-ligações. Endogluca- nases podem também ser chamadas de celulases, avicelases, hidrola- ses de β-1,4-endoglucano, β-1,4-glucanases, carboximetil celulases, celudextrinases, endo-1,4-β-D-glucanases, endo-1,4-β-D- glucanoidrolases ou endo-1,4-β-glucanases.

[0068] Em uma concretização a endoglucanase compreende uma endoglucanase GH5 e/ou a endoglucanase GH7. Isto significa que pe- lo menos uma das endoglucanases na composição de enzima é uma endoglucanase GH5 ou uma endoglucanase GH7. No caso há mais endoglucanases na composição de enzima, estas endoglucanases po- dem levar endoglucanases GH5, endoglucanases GH7 ou uma combi-

nação de endoglucanases GH5 e endoglucanases GH7. Em uma con- cretização preferida a endoglucanase compreende uma endogluca- nase GH5.

[0069] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma endoglucanase de Trichoderma, tal como Trichoderma ree- sei; de Humicola, tal como uma cepa de Humicola insolens; de Asper- gillus, tal como Aspergillus aculeatus ou Aspergillus kawachii; de Erwi- nia, tal como Erwinia carotovara; de Fusarium, tal como Fusarium oxisporum; de Thielavia, tal como Thielavia terrestris; de Humicola, tal como Humicola grisea var. thermoidea ou Humicola insolens; de Mela- nocarpus, tal como Melanocarpus albomyces; de Neurospora, tal co- mo Neurospora crassa; de Myceliophthora, tal como Myceliophthora thermophila; de Cladorrhinum, tal como Cladorrhinum foecundissimum; e/ou de Chrysosporium, tal como uma cepa de Chrysosporium luckno- wense. Em uma concretização preferida a endoglucanase é de Ra- samsonia, tal como uma cepa de Rasamsonia emersonii (vide WO 01/70998). Em uma concretização ainda uma endoglucanase bacteria- na pode ser usada incluindo, mas não são limitadas a, Acidothermus cellulolyticus endoglucanase (vide WO 91/05039; WO 93/15186; a pa- tente US no. 5.275.944; WO 96/02551; a patente US no. 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); endoglucanase III de Thermobifida fusca (vide WO 05/093050); e endoglucanase V de Thermobifida fusca (vide WO 05/093050).

[0070] Como usada aqui, beta-xilosidases (EC 3.2.1.37) são poli- peptídeos que são capazes de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D-xilanos, para remover resíduos de D-xilose sucessivos a partir de terminais de não redução. Beta-xilosidases podem também hidrolisar xilobiose. Be- ta-xilosidase pode também ser chamada de xilan 1,4-β-xilosidase, 1,4- β-D-xilan xiloidrolase, exo-1,4-β-xilosidase ou xilobiase.

[0071] Em uma concretização uma beta-xilosidase compreende uma beta-xilosidase GH3. Isto significa que pelo menos uma e uma beta-xilosidases na composição de enzima é uma beta-xilosidase GH3. Em uma concretização todas as beta-xilosidases na composição de enzima são beta-xilosidases GH3.

[0072] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma beta-xilosidase de Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus ou Trichoderma reesei. Em uma concretização preferida a composição de enzima compreende uma beta-xilosidase de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2014/118360).

[0073] Como usada aqui, uma endoxilanase (EC 3.2.1.8) é qual- quer polipeptídeo que é capaz de catalisar a endoidrólise de ligações de 1,4-β-D-xilosídicas em xilanos. Esta enzima pode também ser cha- mada de endo-1,4-β-xilanase ou 1,4-β-D-xilan xilanoidrolase. Uma al- ternativa é EC 3.2.1.136, uma glucuronoarabinoxilan endoxilanase, uma enzima que é capaz de hidrolisar ligações de 1,4 xilosídicas em glucuronoarabinoxilanos.

[0074] Em uma concretização a endoxilanase compreende a xila- nase GH10. Isto significa que pelo menos uma das endoxilanases na composição de enzima é uma xilanase GH10. Em uma concretização a totalidade de endoxilanases na composição de enzima são xilanases GH10.

[0075] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma endoxilanase oriunda de Aspergillus aculeatus (vide WO 94/21785), Aspergillus fumigatus (vide WO 2006/078256), Penicillium pinophilum (vide WO 2011/041405), Penicillium sp. (vide WO 2010/126772), Thielavia terrestris NRRL 8126 (vide WO 2009/079210), Talaromyces leycettanus, Thermobifida fusca, ou Trichophaea saccata GH10 (vide WO 2011/057083). Em uma concretização preferida a composição de enzima compreende uma endoxilanase from Rasam- sonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 02/24926).

[0076] Como usada aqui, uma beta-glucosidase (EC 3.2.1.21) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de terminal, resíduos de β-D-glicose de não redução com liberação de β-D-glicose. Tal polipeptídeo pode ter uma ampla especificidade para β-D- glicosídeos e podem também hidrolisar um ou mais das seguintes: uma β-D-galactosídeo, um α-L-arabinosídeo, um β-D-xilosídeo ou um β-D-fucosídeo. Esta enzima pode também ser chamada de amigda- lase, glucoidrolase de β-D-glucosídeo, celobiase ou gentobiase.

[0077] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma beta-glucosidase de Aspergillus, tal como Aspergillus ory- zae, tal como aquela revelada na WO 02/095014 ou a proteína de fu- são tendo uma atividade de beta-glucosidase revelada na WO 2008/057637, ou Aspergillus fumigatus, tal como aquela revelada co- mo SEQ ID NO:2 na WO 2005/047499 ou SEQ ID NO:5 na WO 2014/130812 ou uma variante de beta-glucosidase de Aspergillus fu- migatus, tal como aquele revelado na WO 2012/044915, tal como uma com as seguintes substituições: F100D, S283G, N456E, F512Y (usan- do SEQ ID NO: 5 na WO 2014/130812 para a numeração), ou Asper- gillus aculeatus, Aspergillus niger ou Aspergillus kawachi. Em uma ou- tra concretização a beta-glucosidase é derivada de Penicillium, tal co- mo Penicillium brasilianum revelada como SEQ ID NO:2 na WO 2007/019442, ou de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, tal como aquelas descritas na patente US no. 6.022.725, na patente US no. 6.982.159, na patente US no. 7.045.332, na patente US no.

7.005.289, na patente US no. 2006/0258554, na patente US no. 2004/0102619. Em uma concretização, ainda uma beta-glucosidase bacteriana pode ser usada. Em uma outra concretização a beta- glucosidase é derivada de Thielavia terrestris (WO 2011/035029) ou Trichophaea saccata (WO 2007/019442). Em uma concretização pre- ferida a composição de enzima compreende uma beta-glucosidase de

Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2012/000886).

[0078] Como usada aqui, uma celobioidrolase (EC 3.2.1.91) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de 1,4-β-D- glucosídico ligações em celulose ou celotetraose, liberação de celobi- ose a partir das extremidades das cadeias. Esta enzima pode também ser chamada de celulase 1,4-β-celobiosidase, 1,4-β-celobioidrolase, 1,4-β-D-glucan celobioidrolase, avicelase, exo-1,4-β-D-glucanase, exocelobioidrolase ou exoglucanase.

[0079] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma celobioidrolase I de Aspergillus, tal como Aspergillus fumi- gatus, tal como a Cel7A CBH I revelada na SEQ ID NO: 6 na WO 2011/057140 ou na SEQ ID NO: 6 na WO 2014/130812; de Tricho- derma, tal como Trichoderma reesei; de Chaetomium, tal como Chaetomium thermophilum; de Talaromyces, tal como Talaromyces leycettanus ou de Penicillium, tal como Penicillium emersonii. Em uma concretização preferida a composição de enzima compreende uma celobioidrolase I de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emersonii (vi- de WO 2010/122141).

[0080] Em uma concretização a composição de enzima compre- ende uma celobioidrolase II de Aspergillus, tal como Aspergillus fumi- gatus, tal como aquele na SEQ ID NO:7 na WO 2014/130812 ou de Trichoderma, tal como Trichoderma reesei, ou de Talaromyces, tal como Talaromyces leycettanus, ou de Thielavia, tal como Thielavia terrestris, tal como celobioidrolase II CEL6A de Thielavia terrestris. Em uma concretização preferida a composição de enzima compreende uma celobioidrolase II de Rasamsonia, tal como Rasamsonia emer- sonii (vide WO 2011/098580).

[0081] Em uma concretização a composição de enzima também compreende uma ou mais das enzimas mencionadas abaixo.

[0082] Como usada aqui, a β-(1,3)(1,4)-glucanase (EC 3.2.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ligações de 1,4-β-D-glucosídico nas β-D-glucanos contendo 1,3- e 1,4-ligações. Tal polipeptídeo pode agir na lichenina e cereal β-D-glucanos, mas não nos β-D-glucanos contendo apenas 1,3- ou 1,4-ligações. Esta en- zima pode também ser chamada de licheninase, 1,3-1,4-β-D-glucan 4- glucanoidrolase, β-glucanase, endo-β-1,3-1,4 glucanase, lichenase ou β-glucanase de ligação mista. Uma alternativa para este tipo de enzi- ma é EC 3.2.1.6, que é descrito como endo-1,3(4)-beta-glucanase. Es- te tipo de 1,3- ou 1,4-ligações de hidrolases de enzima em beta-D- glucanose quando o resíduo de glicose cujo grupo de redução está envolvido na ligação a ser hidrolisada é ela própria a ser substituída em C-3. Nomes alternativos incluem endo-1,3-beta-glucanase, lamina- rinase, 1,3-(1,3;1,4)-beta-D-glucano 3 (4) glucanoidrolase. Substratos incluem laminarina, lichenina e cereal beta-D-glucanos.

[0083] Como usada aqui, uma α-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de agir sobre α-L- arabinofuranoídeos, α-L-arabineses contendo (1,2) e/ou (1,3)- e/ou (1,5)-ligações, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima pode também ser chamada de α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosida- se ou arabinosidase. Exemplos de arabinofuranosidases que podem ser compreendidas na composição de enzima incluem, mas não são limitados a, arabinofuranosidases de Aspergillus niger, Humicola inso- lens DSM 1800 (vide WO 2006/114094 e WO 2009/073383) e M. gi- ganteus (vide WO 2006/114094).

[0084] Como usada aqui, uma α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da seguin- te forma: alfa-D-glucuronosídeo + H(2)O = um álcool + D-glucuronato. Esta enzima pode também ser chamada de alfa-glucuronidase ou alfa- glucosiduronase. Estas enzimas podem também hidrolisar ácido glu- corônico 4-O-metilado, que podem também estar presentes como um substituinte em xilanos. Uma alternativa é EC 3.2.1.131: xilan alfa-1,2- glucuronosidase, que catalisa a hidrólise de ligações de alfa-1,2-(4-O- metil)glucuronosila. Exemplos de alfa-glucuronidases que podem ser contidos na composição de enzima incluem, mas não são limitados a, alfa-glucuronidases from Aspergillus clavatus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Humicola insolens (vide WO 2010/014706), Penicillium aurantiogriseum (vide WO 2009/068565) e Trichoderma reesei.

[0085] Como usada aqui, uma esterase de acetil xilano (EC

3.1.1.72) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a desaceti- lação de xilanos e xilo-oligossacarídeos. Tal polipeptídeo pode catali- sar a hidrólise de grupo acetila a partir de xilano polimérico, xilose ace- tilado, glicose acetilado, alfa-naftil acetato ou p-nitrofenil acetato mas, tipicamente, não a partir de triacetilglicerol. Tal polipeptídeo tipicamen- te não age em pectina ou manano acetilado. Exemplos de acetilxilan esterases que podem estar contidos na composição de enzima inclu- em, mas não são limitados a, acetilxilan esterases oriundas de Asper- gillus aculeatus (vide WO 2010/108918), Chaetomium globosum, Chaetomium gracile, Humicola insolens DSM 1800 (vide WO 2009/073709), Hypocrea jecorina (vide WO 2005/001036), Myceli- ophtera thermophila (vide WO 2010/014880), Neurospora crassa, Phaeosphaeria nodorum e Thielavia terrestris NRRL 8126 (vide WO 2009/042846). Em uma concretização preferida a composição de en- zima compreende uma esterase de acetil xilano oriunda de Rasamso- nia, tal como Rasamsonia emersonii (vide WO 2010/000888)

[0086] Como usada aqui, uma esterase de feruloila (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação da forma: feruloil-sacarídeo + H2O = ferulato + sacarídeo. O sacarídeo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polissacarídeo. Pode tipica- mente catalisar a hidrólise do grupo 4-hidróxi-3-metoxicinamoila (feru-

loila) a partir de um açúcar esterificado, que é usualmente arabinose em substratos 'naturais'. p-Nitrofenol acetato e metil ferulato são tipi- camente substratos mais pobres. Esta enzima pode também ser cha- mada de hidrolase de éster de cinamoila, esterase de ácido ferúlico ou esterase de hidroxicinamoila. Pode também ser chamada de uma en- zima acessória de hemicelulose, uma vez que pode auxiliar xilanases e pectinases para decompor a hemicelulose e pectina da parede celu- lar de planta de. Exemplos esterases de feruloila (esterase de ácido ferúlicos) que podem estar contidos na composição de enzima inclu- em, mas não são limitados a, feruloila esterases de Humicola insolens DSM 1800 (vide WO 2009/076122), Neosartorya fischeri, Neurospora crassa, Penicillium aurantiogriseum (vide WO 2009/127729), e Thiela- via terrestris (vide WO 2010/053838 e WO 2010/065448).

[0087] Como usada aqui, uma esterase de cumaroila (EC 3.1.1.73) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar uma reação de the form: cumaroil-sacarídeo + H(2)O = cumarato + sacarídeo. O sacarí- deo pode ser, por exemplo, um oligossacarídeo ou um polisacarídeo. Esta enzima pode também ser chamada de trans-4-cumaroil esterase, trans-p-cumaroil esterase, p-cumaroil esterase ou esterase de ácido p- cumárico. Esta enzima também cai dentro de EC 3.1.1.73 assim pode também ser chamada de uma esterase de feruloila.

[0088] Como usada aqui, uma α-galactosidase (EC 3.2.1.22) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-D-galactose de não redução, terminais em α-D-galactosídeos, incluindo galactose oligossacarídeos, galactomannans, galactanos e arabinogalactanos. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidro- lisar α-D-fucosídeos. Esta enzima pode também ser chamada de meli- biase.

[0089] Como usada aqui, uma β-galactosidase (EC 3.2.1.23) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de β-D-galactose de não redução terminais em β-D-galactosídeos. Tal polipeptídeo pode também ser capaz de hidrolisar α-L-arabinosídeos. Esta enzima pode também ser chamada de exo-(1->4)-β-D- galactanase ou lactase.

[0090] Como usada aqui, uma β-mananase (EC 3.2.1.78) é qual- quer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de liga- ções de 1,4-β-D-manosídicas em mananas, galactomananas e gluco- manas. Esta enzima pode também ser chamada de manana endo-1,4- β-manosidase ou endo-1,4-mananase.

[0091] Como usada aqui, uma β-mannosidase (EC 3.2.1.25) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de terminal, resíduos de β-D-manose de não redução em β-D-manosídeos. Esta enzima pode também ser chamada de mananase ou manase.

[0092] Como usada aqui, uma endo-poligalacturonase (EC

3.2.1.15) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise aleatória de ligações 1,4-α-D-galactosidurônicos em pectato e outras galacturonanas. Esta enzima pode também ser chamada de poligalac- turonase pectina depolimerase, pectinase, endopoligalacturonase, pec- tolase, hidrolase de pectina, poligalacturonase de pectina, poli-α-1,4- galacturonídeo glicanoidrolase, endogalacturonase; endo-D- galacturonase ou poli(1,4-α-D-galacturonídeoo) glicanoidrolase.

[0093] Como usada aqui, uma esterase de metila de pectina (EC

3.1.1.11) é qualquer enzima que é capaz de catalisar a reação: pectina + n H2O = n metanol + pectato. A enzima pode também ser conhecida como pectinesterase, desmetoxilase de pectina, metoxilase de pectina, metilesterase, pectase, pectinoesterase ou pectin pectilidrolase de pectina.

[0094] Como usada aqui, uma endo-galactanase (EC 3.2.1.89) é qualquer enzima capaz de catalisar a endoidrólise de ligações de 1,4- β-D-galactosídicos em arabinogalactanos. A enzima pode também ser conhecida como arabinogalactan endo-1,4-β-galactosidase, endo-1,4- β-galactanase, galactanase, arabinogalactanase ou arabinogalactan 4- β-D-galactanoidrolase.

[0095] Como usada aqui, uma esterase de acetila de pectina é de- finida aqui como qualquer enzima que tem uma atividade de esterase de acetila que catalisa a desacetilação dos grupos acetila nos grupos hidroxila de resíduos de GalUA de pectina.

[0096] Como usada aqui, uma liase de endo-pectina (EC 4.2.2.10) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de éster de metila de (1 4)-α-D-galacturonana para dar oligossacarídeos com grupos 4-desóxi-6-O-metil-α-D-galact-4-enuronosila em suas extremi- dades de não redução. A enzima pode também ser conhecida como liase de pectina, trans-eliminase de pectina; liase de endo-pectina, transeliminase polimetilgalacturônico, metiltranseliminase pectina, pec- toliase, PL, PNL ou PMGL ou liase de (1 4)-6-O-metil-α-D- galacturonana.

[0097] Como usada aqui, uma liase de pectato (EC 4.2.2.2) é qualquer enzima capaz de catalisar a clivagem eliminativa de (1 4)-α- D-galacturonana para dar oligossacarídeos com grupos 4-deóxi-α-D- galact-4-enuronosila em suas extremidades de não redução. A enzima pode também ser conhecida transeliminase de poligalacturônico, tran- seliminase de ácido péctico, liase de poligalacturonato, metiltranselimi- nase de endopectina, transeliminase de pectato, transeliminase de en- dogalacturonato, liase de ácido péctico, liase pético, liase de ácido α- 1,4-D-endopoligalacturônico, liase de PGA, PPase-N, liase de ácido endo-α-1,4-poligalacturônico, liase de poligalacturônico, trans- eliminase de pectina, trans-eliminase de ácido poligalacturônico ou li- ase de (1 4)-α-D-galacturonana.

[0098] Como usada aqui, uma alfa ramnosidase (EC 3.2.1.40) é qualquer polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de resíduos de α-L-ramanose de não redução terminais em α-L-ramnosídeos ou alternativamente em ramnogalacturonano. Esta enzima pode também ser conhecida como α-L-ramnosidase T, α-L-ramnosidase N ou α-L- ramnosídeo ramnoidrolase.

[0099] Como usada aqui, exo-galacturonase (EC 3.2.1.82) é qual- quer polipeptídeo capaz de hidrolisar de ácido péctico a partir da ex- tremidade de não redução, liberando digalacturonato. A enzima pode também ser conhecida como exo-poli-α-galacturonosidase, exopoliga- lacturonosidase ou exopoligalacturanosidase.

[00100] Como usada aqui, exo-galacturonase (EC 3.2.1.67) é qual- quer polipeptídeo capaz de catalisar: (1,4-α-D-galacturonídeo)n + H2O = (1,4-α-D-galacturonídeo)n-1 + D-galacturonato. A enzima pode tam- bém ser conhecida como galacturan 1,4-α-galacturonidase, exopoliga- lacturonase, poli(galacturonato) hydrolase, exo-D-galacturonase, exo- D-galacturonanase, exopoli-D-galacturonase ou poli(1,4-α-D- galacturonídeo) galacturonoidrolase.

[00101] Como usada aqui, liase de exopoligalacturonato (EC

4.2.2.9) é qualquer polipeptídeo capaz de catalisar clivagem eliminati- va de 4-(4-desóxi-α-D-galact-4-enuronosil)-D-galacturonato a partir da extremidade redução de pectato, isto é, pectina de desesterificada. Esta enzima pode ser conhecida como dissacarídeo-liase de pectato, exo-liase de pectato, transeliminase de ácido exopéctico, liase de exopectato, trans-eliminase de ácido exopoligalacturônico, PATE, exo- PATE, exo-PGL ou liase de dissacarídeo de extremidade de redução de (1 4)-α-D-galacturonana.

[00102] Como usada aqui, ramnogalacturonano hidrolase é qual- quer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar a ligação entre ácido ga- lactossilurônico e ramnopiranosia em uma forma endo em estruturas de ramnogalacturonano estritamente alternantes, que consiste do dis- sacarídeo [(ácido 1,2-alfa-L-ramnoil-(1,4)-alfa-galactossilurônico].

[00103] Como usada aqui, ramnogalacturonano liase é qualquer polipeptídeo que é qualquer polipeptídeo que é capaz de clivar liga- ções de α-L-Rhap-(1 4)-α-D-GalpA em uma forma endo em ramnoga- lacturonano por beta-eliminação.

[00104] Como usada aqui, ramnogalacturonano acetil esterase é qualquer polipeptídeo que catalisa a desacetilação da cadeia principal de resíduos de ramanose e ácido galacturônico alternantes em ramno- galacturonano.

[00105] Como usada aqui, ramnogalacturonano galacturonoidrolase é qualquer polipeptídeo que é capaz de hidrolisar ácido galacturônico a partir da extremidade de não redução de estruturas de ramnogalactu- ronano estritamente alternantes em uma forma exo.

[00106] Como usada aqui, xilogalacturonase é qualquer polipeptí- deo que age em xilogalacturonana por clivagem da cadeia principal de ácido galacturônico substituída por β-xilose de um modo endo. Esta enzima pode também ser conhecida como hidrolase de xilogalacturo- nana.

[00107] Como usada aqui, uma α-L-arabinofuranosidase (EC

3.2.1.55) é qualquer polipeptídeo que é capaz de agir em α-L- arabinofuranosídeos, α-L-arabineses contendo (1,2) e/ou (1,3)- e/ou (1,5)-ligações, arabinoxilanos e arabinogalactanos. Esta enzima pode também ser chamada de α-N-arabinofuranosidase, arabinofuranosida- se ou arabinosidase.

[00108] Como usada aqui, endo-arabinanase (EC 3.2.1.99) é qual- quer polipeptídeo que é capaz de catalisar endoidrólise de ligações de 1,5-α-arabinofuranosídicas em 1,5-arabinanas. A enzima pode tam- bém ser conhecida como endo-arabinase, arabinan endo-1,5-α-L- arabinosidase, endo-1,5-α-L-arabinanase, endo-α-1,5-arabanase; en- do-arabanase ou 1,5-α-L-arabinan 1,5-α-L-arabinanoidrolase.

[00109] "Protease" inclui enzimas que hidrolisam ligações de peptí-

deo (peptidases), bem como enzimas que hidrolisam ligações entre peptídeos e outras porções, tais como açúcares (glicopeptidases). Mui- tas proteases são caracterizadas sob EC 3.4 e são adequadas para o uso nos processos como descritos aqui. Alguns tipos específicos de proteases incluem, proteases de cisteína incluindo proteases de pep- sina, de papaína e de serina incluindo quimiotripsinas, carboxipeptida- ses e metaloendopeptidases.

[00110] "Lipase" inclui enzimas que hidrolisam lipídeos, ácidos gra- xos, e acilglicerídeos, incluindo fospoglicerídeos, lipoproteínas, diacil- glicerois, e similares. Em planta, lipídeos são usados como componen- tes estruturais para limitar perda de água e infecção de patógeno. Es- tes lipídeos incluem ceras derivadas de ácidos graxos, bem como cuti- na e suberina.

[00111] "Ligninase" inclui enzimas que podem hidrolisar ou romper a estrutura de polímeros de lignina. Enzimas que podem romper ligni- na incluem peroxidases de lignina, peroxidases de manganês, lacases e esterases de feruloila, e outras enzimas descritas na técnica conhe- cido para despolimerizar ou de outra maneira romper polímeros de lig- nina. Também incluídas são enzimas capazes de hidrolisar ligações formadas entre açúcares hemicelulósicos (notavelmente arabinose) e lignina. Ligninases incluem mas não são limitadas ao seguinte grupo de enzimas: peroxidases de lignina (EC 1.11.1.14), peroxidases de manganês (EC 1.11.1.13), laccases (EC 1.10.3.2) e esterases de feru- loila (EC 3.1.1.73).

[00112] "Hexosiltransferase" (2.4.1-) inclui enzimas que são capa- zes de catalisar uma reação de transferase, mas que pode também catalisar uma reação de hidrólise, por exemplo, celulose e/ou produtos de degradação de celulose. Um exemplo de uma hexossiltransferase que pode ser usado é uma ß-glucanossiltransferase. Tal uma enzima pode ser capaz de catalisar degradação de (1,3)(1,4)glucano e/ou ce-

lulose e/ou um produto de degração de celulose.

[00113] "Glucuronidase" inclui enzimas que catalisam a hidrólise de um glucuronosídeo, por exemplo, β-glucuronosídeo para fornecer um álcool. Muitas glucuronidases foram caracterizadas e podem ser ade- quadas para o uso, por exemplo, β-glucuronidase (EC 3.2.1.31), hialu- rono-glucuronidase (EC 3.2.1.36), glucuronosil-dissulfoglucosamina glucuronidase (3.2.1.56), glicirrizinato β-glucuronidase (3.2.1.128) ou α-D-glucuronidase (EC 3.2.1.139).

[00114] Expansinas estão implicadas na perda da estrutura da pa- rede celular durante o crescimento de célula de planta. Expansinas foram propostas para romper ligação de hidrogênio entre celulose e outros polissacarídeos da parede celular sem ter atividade hidrolítica. Deste modo, eles são pensados como permitindo o deslizamento de fibras de celulose e alargamento da parede celular. Swollenin, uma proteína de tipo expansina contém um domínio da família 1 de módulo de ligação de carboidrato N-terminal (CBD) e um domínio de tipo ex- pansina C-terminal. Como descrito aqui, uma proteína de tipo expansi- na ou proteína de tipo swollenin pode compreender um ou ambos de tais domínios e/ou podem romper a estrutura das paredes celulares (tal como rompimento de estrutura de celulose), opcionalmente sem produzir quantidades detectáveis da redução de açúcares.

[00115] Uma proteína induzida por celulose, por exemplo o produto de polipeptídeo do gene cip1 ou cip2 ou genes similares (vide Fore- man e outros, J. Biol. Chem. 278(34), 31988-31997, 2003), uma prote- ína de integração de celulose/celulosoma, por exemplo o produto de polipeptídeo do gene cipA ou cipC, ou a scaffoldina ou uma proteina do tipo scaffoldina. Scaffoldinas e proteínas de integração de celulose são subunidades de integração multifuncionais que podem organizar subunidades celulolíticas em um complexo de multi-enzimas. Isto é realizado pela interação de duas classes complementares de domínio,

isto é, um domínio de coesão na scaffoldina e um domínio de dockeri- na em cada unidade enzimática. A subunidade de scaffoldina também porta um modulo de ligação de celulose (CBM) que media ligação da cellulosoma a seu substrato. A scaffoldina ou proteína de integração de celulose pode compreender um ou ambos os tais domínios.

[00116] Uma catalase; o termo "catalase" significa um peróxido de hidrogênio: oxidorredutase de peróxido de hidrogênio (EC 1.11.1.6 ou EC 1.11.1.21) que catalisa a conversão de dois peróxidos de hidrogê- nio em oxigênio e duas águas. Atividade de catalase pode ser deter- minada por monitoração da degração de peróxido de hidrogênio a 240 nm com base na seguinte reação: 2H2O2 → 2H2O + O2. A reação é conduzida em fosfato a 50 mM pH 7,0 a 25°C com substrato (H202) a 10,3 mM e cerca de 100 unidades de enzima por ml. Absorbância é monitorada espectrofotometricamente no período de 16-24 segundos, que corresponderia a uma redução de absorbância de 0,45 a 0,4. Uma unidade de atividade de catalase pode ser expressa como um micro- mol de H202 degradado por minuto a pH 7,0 e 25°C.

[00117] O termo "amilase" como usado aqui significa enzimas que hidrolisam ligações de alfa-1,4-glucosídico em amido, tanto em amilo- se quanto em amilopectina, tal como alfa-amilase (EC 3.2.1.1), beta- amilase (EC 3.2.1.2), glucan 1,4-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.3), glucan 1,4-alfa-maltotetraoidrolase (EC 3.2.1.60), glucan 1,4-alfa- maltohexaosidase (EC 3.2.1.98), glucan 1,4-alfa-maltotrioidrolase (EC

3.2.1.116) e glucan 1,4-alfa-maltoidrolase (EC 3.2.1.133), e enzimas que hidrolisam ligações de alfa-1,6-glucosídico, sendo os pontos de ramificação em amilopectina, tal como pululanase (EC 3.2.1.41) e limi- tam dextinase (EC 3.2.1.142).

[00118] Uma composição para o uso nos processos como descritos aqui pode ser constituída de enzimas de (1) fornecedores comerciais; (2) genes clonados que expressam enzimas; (3) caldo (tal como aque-

le resultando de crescimento de uma cepa microbiana no meio, em que as cepas secretam proteínas e enzimas no meio; (4) lisados de células de cepas se desenvolvem como em (3); e/ou (5) material de planta que expressa enzimas. Diferentes enzimas em uma composição da invenção podem ser obtidas a partir de diferentes fontes.

[00119] As enzimas podem ser produzidas ou exogenamente em micro-organismos, leveduras, fungos, bactérias ou plantas, então iso- lados e adicionados, por exemplo, um material lignocelulósico. Alterna- tivamente, a enzima pode ser produzida na fermentação que usa um material lignocelulósico (pré-tratado) (tal como, palha de milho ou pa- lha de trigo ) para prover nutrição a um organismo que produz uma enzima(s). Deste modo, plantas que produzem as enzimas podem por elas mesmas servir como um material lignocelulósico e serem adicio- nadas em material lignocelulósico.

[00120] Nos usos e nos processos descritos aqui, os componentes das composições acima podem ser providos concomitantemente (isto é, como uma composição simples per se) ou separadamente ou se- quencialmente.

[00121] Em uma concretização a composição de enzima é um caldo de fermentação inteiro de um fungo, de preferência um caldo de fer- mentação inteiro de um fungo filamentoso, mais de preferência um caldo de fermentação inteiro de Rasamsonia. O caldo de fermentação inteiro pode ser preparado a partir de fermentação de fungos filamen- tosos não recombinantes e/ou recombinantes. Em uma concretização o fungo filamentoso é um fungo filamentoso recombinante compreen- dendo um ou mais genes que podem ser homólogo ao fungo filamen- toso. Em uma concretização, o fungo filamentoso is a fungo filamento- so recombinante compreendendo um ou mais genes que podem ser homólogo ou heterólogo ao fungo filamentoso em que o(s) um ou mais genes codificam enzimas que podem degradas um substrato celulósi-

co. O caldo de fermentação inteiro pode compreender qualquer um dos polipeptídeos descritos acima ou qualquer sua combinação.

[00122] De preferência, a composição de enzima é um caldo de fermentação inteiro em que as células são mortas. O caldo de fermen- tação inteiro pode conter ácido(s) orgânico(s) (usados para matar as células), células mortas e/ou fragmentos de células, e meio de cultura.

[00123] Em geral, fungos filamentosos são cultivados em um meio de cultura de células adequado para a produção de enzimas capaz de hidrolisar um substrato celulósico. O cultivo ocorre em um meio de nu- triente adequado compreendendo fontes de carbono e de nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meio de cultura adequado, faixas de temperatura e outras condições ade- quadas para o crescimento de produção de celulase e/ou hemicelulase e/ou pectinase são conhecidos na técnica. O caldo de fermentação inteiro pode ser preparado por desenvolvimento dos fungos filamento- sos para fase estacionária e manutenção dos fungos filamentosos sob limitação de condições de carbono por um período de tempo suficiente para expressar a(s) uma ou mais celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases. Uma vez que enzimas, tal como celulases e/ou hemicelu- lases e/ou pectinases, são secretadas pelos fungos filamentosos no meio de fermentação, o caldo de fermentação inteiro pode ser usado. O caldo de fermentação inteiro da presente invenção pode compreen- der fungos filamentosos. Em algumas concretizações, o caldo de fer- mentação inteiro compreende o conteúdo não fracionado dos materiais de fermentação derivados na extremidade da fermentação. Tipicamen- te, o caldo de fermentação inteiro compreende o meio de cultura gasto e fragmentos de célula presentes depois que os fungos filamentosos são desenvolvidos para saturação, são incubados sob condições de limitação de carbono para permitir síntese de proteína (particularmen- te, expressão de celulases e/ou hemicelulases e/ou pectinases). Em algumas concretizações, o caldo de fermentação inteiro compreende o meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares e fungos fila- mentosos. Em algumas concretizações, os fungos filamentosos pre- sentes no caldo de fermentação inteiro podem ser lisados, permeabili- zados ou mortos usando métodos conhecidos na técnica para produzir um caldo de fermentação inteiro de célula morta. Em uma concretiza- ção, o caldo de fermentação inteiro é um caldo de fermentação inteiro de célula morta, em que o caldo de fermentação inteiro contendo as células de fungos filamentosos são lisadas ou são mortas. Em algu- mas concretizações, as células são mortas por lise dos fungos filamen- tosos por tratamento químico e/ou pH para gerar caldo inteiro de célula morta da fermentação dos fungos filamentosos. Em algumas concreti- zações, as células são mortas por lise dos fungos filamentosos por tra- tamento químico e/ou pH e ajuste do pH da mistura de fermentação de célula morta para um pH adequado. Em uma concretização, o caldo de fermentação inteiro compreende um primeiro componente de ácido orgânico compreendendo pelo menos um ácido orgânico de 1 a 5 car- bonos e/ou um sal e um segundo componente de ácido orgânico com- preendendo pelo menos ácido orgânico de 6 ou mais carbonos e/ou um seu sal. Em uma concretização, o primeiro componente de ácido orgânico é ácido acético, ácido fórmico, ácido propiônico, um seu sal, ou qualquer sua combinação e o segundo componente de ácido orgâ- nico é ácido benzóico, ácido cicloexanocarboxílico, ácido 4- metilvalérico, ácido fenilacético, um seu sal, ou qualquer sua combina- ção.

[00124] O termo "caldo de fermentação inteiro" como usado aqui refere-se a uma preparação produzida por fermentação celular que sofre nehuma recuperação ou recuperação mínima e/ou purificação. Por exemplo, caldos de fermentação inteiros são produzidos quando culturas microbianas são desenvolvidas para saturação, são incubadas sob condições de limitação de carbono para permitir síntese de proteí- na (por exemplo, expressão de enzimas por células hospedeiras) e secreção em meio de cultura de células. Tipicamente, o caldo de fer- mentação inteiro é não fracionado e compreende meio de cultura de células gasto, enzimas extracelulares, e células microbianas, de prefe- rência não viáveis.

[00125] Se necessário, o caldo de fermentação inteiro pode ser fra- cionado e o(s) um ou mais do conteúdo fracionado pode ser usado. Por exemplo, as células mortas e/ou fragmentos de célula podem ser removidos a partir de um caldo de fermentação inteiro para prover uma composição que está livre destes componentes.

[00126] O caldo de fermentação inteiro pode ulteriormente compre- ender um agente antimicrobiano e/ou conservante. Tais conservantes e/ou agentes são conhecidos na técnica.

[00127] O caldo de fermentação inteiro como descrito aqui é tipica- mente um líquido, mas pode conter componentes insolúveis, tais como células mortas, fragmentos de célula, componentes de meio de cultura, e/ou enzima(s) insolúvel(eis). Em algumas concretizações, componen- tes insolúveis podem ser removidos para prover um caldo de fermen- tação inteiro clarificado.

[00128] Em uma concretização, o caldo de fermentação inteiro pode ser suplementado com uma ou mais atividades de enzima que não são expressas endogenamente, ou são expressas a nível relativamente baixo pelos fungos filamentosos, para aperfeiçoar a degradação do substrato celulósico, por exemplo, para açúcares fermentáveis tal co- mo glicose ou xilose. A(s) enzima(s) suplementar(es) podem ser adici- onadas como um suplemento ao caldo de fermentação inteiro e as en- zimas podem ser um componente de um caldo de fermentação inteiro separado, ou pode ser purificado, ou minimamente recuperado e/ou purificado.

[00129] Em uma concretização, o caldo de fermentação inteiro compreende um caldo de fermentação inteiro da fermentação de um fungo filamentoso recombinante que ultra-expressa uma ou mais en- zimas para aperfeiçoar a degradação do substrato celulósico. Alterna- tivamente, o caldo de fermentação inteiro pode compreender uma mis- tura de um caldo de fermentação inteiro da fermentação de um fungo não filamentoso recombinante e um fungo filamentoso recombinante que ultra-expressa uma ou mais enzimas para aperfeiçoar a degrada- ção do substrato celulósico. Em uma concretização, o caldo de fer- mentação inteiro compreende um caldo de fermentação inteiro da fer- mentação de um fungo filamentoso que ultra-expressa beta- glucosidase ou endoglucanase. Alternativamente, o caldo de fermen- tação inteiro para o uso nos presentes métodos e composições reati- vas podem compreender uma mistura de um caldo de fermentação inteiro da fermentação de um fungo não filamentoso recombinante e um caldo de fermentação inteiro da fermentação de um fungo filamen- toso recombinante que ultra-expressa uma beta-glucosidase ou endo- glucanase.

[00130] Material de carboidrato como usado aqui inclui qualquer material contendo amido e/ou sacarose e/ou celulose. De preferência, material de carboidrato como usado aqui inclui material lignocelulósico e/ou hemicelulósico. Mais de preferência, o material de carboidrato como usado aqui é material lignocelulósico. Material de carboidrato adequado para o uso nos processos como descritos aqui inclui bio- massa, por exemplo, biomassa virgem e/ou biomassa não virgem tal como biomassa agrícola, produtos orgânicos comerciais, fragmentos de construção e demolição, resíduos sólidos, resíduos de papel e lixo de quintais municipais. Formas comuns da biomassa incluem árvores, arbustos e gramíneas, trigo, centeio, aveia, palha de trigo, cana de açúcar, palha de cana, bagaço de cana de açúcar, "switch grass", mis-

canthus, cana de energia, mandioca, melaço, cevada, milho, palha de milho, fibra de milho, sementes de milho, espigas de milho, caules de canola, caules de soja, sorgo doce, semente de milho incluindo fibra oriunda de grâos, grãos secos em destiladores (DDGS), produtos e sub-produtos oriundos de moagem de grãos tais como milho, trigo e cevada (incluindo moagem por via úmida e moagem por via seca) fre- quentemente chamados "farelo ou fibra" bem como resíduos sólidos, resíduos de papel e lixo de quintal municipais. A biomassa pode tam- bém ser, but não é limitada a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos fluorestais, resíduos sólidos, resíduos de papel e lixo de quin- tal municipais, e polpa e resíduos de moagem de papel. "Biomassa agrícola" inclui ramos, arbustos, cana, milho e sementes de milho, cul- turas energéticas, florestas, frutas, flores, gãos, gramíneas, colheitas de herbáceas, folhas, casca, agulhas, tora, raízes, mudas, culturas de madeira de curta rotação, arbustos, gramíneas "switch', árvores, vege- tais, cascas de frutas, videiras, beterraba, polpa de beterraba, farelo de trigo midlings, cascas de aveia, e madeira dura e mole (não incluindo madeiras com materiais nocivos). Além disso, biomassa agrícola inclui materiais de resíduo orgânico gerados a partir de processos agrícolos incluindo atividades agrícolas e florestais, especificamente incluindo resíduo de madeira da floresta. Biomassa agrícola pode ser qualquer um dos singularamente acima mencionados ou em qualquer combina- ção ou sua mistura.

[00131] Em uma concretização o material de carboidrato é pré- tratado antes da liquefação. Métodos de pré-tratamento são conheci- dos na técnica e incluem, mas não são limitados a, modificação térmi- ca, mecânica, química, modificação biológica e qualquer sua combina- ção. Pré-tratamento é tipicamente realizado a fim de melhorar a aces- sabilidade do material de carboidrato a hidrólise enzimática e/ou hidro- lisar a hemicelulose e/ou solubilizar a hemicelulose e/ou celulose e/ou lignina, no material de carboidrato. Em uma concretização, o pré- tratamento compreende tratamento do material de carboidrato com explosão de vapor, tratamento com água quente ou tratamento com ácido diluído e ou base diluída. Exemplos de pré-tratamento métodos incluem, mas não são limitados a, tratamento com vapor (por exemplo, tratamento a 100-260ºC, a uma pressão de 7-45 bar, a pH neutro, por 1-10 minutos), tratamento com ácido diluído (por exemplo, tratamento com 0,1 – 5% de H2SO4 e/ou de SO2 e/ou de HNO3 e/ou de HCl, na presença ou na ausência de vapor, a 120-200ºC, a uma pressão de 2- 15 bar, a pH ácido, por 2-30 minutos), tratamento organosolv (por exemplo, tratamento com 1 – 1,5% de H2SO4 na presença de solvente orgânico e vapor, a 160-200ºC, a uma pressão de 7-30 bar, um pH ácido, por 30-60 minutos), tratamento com cal (por exemplo, tratamen- to com 0,1 - 2% de NaOH/Ca(OH)2 na presença de água/vapor a 60- 160ºC, a uma pressão de 1-10 bar, a pH alcalino, por 60-4800 minu- tos), tratamento com ARP (por exemplo, tratamento com 5 - 15% de NH3, a 150-180ºC, a uma pressão de 9-17 bar, a pH alcalino, por 10- 90 minutos), tratamento com AFEX (por exemplo, tratamento com > 15% de NH3, a 60-140ºC, a uma pressão de 8-20 bar, a pH alcalino, por 5-30 minutos). Em uma concretização o pré-tratamento é feito na ausência de oxigênio.

[00132] O material de carboidrato pode ser lavado. Em uma concre- tização o material de carboidrato pode ser lavado depois do pré- tratamento. A etapa de lavagem pode ser usada para remover com- postos solúveis em água que podem agir como inibidores para a etapa de fermentação e/ou de hidrólise. A etapa de lavagem pode ser con- duzida de modo conhecido pela pessoa versada. Após a lavagem, ou- tros métodos de destoxificação fazem existir. O material de carboidrato pode também ser destoxificado por qualquer (ou qualquer combina- ção) destes métodos que incluem, mas não são limitados a, separação sólida/líquida, evaporação a vácuo, extração, adsorção, neutralização, calagem, adição de redução de agentes, adição de enzimas de desto- xificação tais como lacases ou peroxidases, adição de micro- organismos capazes de destoxificação de hidrosilados.

[00133] A composição de enzima usada no processo como descrito aqui pode extremamente eficazmente hidrolisar material de carboidra- to, por exemplo palha de milho, palha de trigo, palha de cana, e/ou bagaço de cana de açúcar, que pode então ser convertida em um pro- duto, tal como etanol, biogas, butanol, um plástico, um ácido orgânico, um solvente, um suplemento de ração de animal, um produto farma- cêutico, uma vitamina, um amino ácido, uma enzima ou uma carga de alimentação química. Adicionalmente, produtos intermediários de um processo após a hidrólise, por exemplo, ácido láctico como intermediá- rio na produção de gás, pode ser usado como blocos de construção para outros materiais.

[00134] Em uma concretização a quantidade de enzima adicionada (aqui também chamada dosagem de enzima ou carga de enzima) é baixa. Em uma concretização a quantidade de enzima é de 0,1 - 10 mg de proteína /g de matéria seca. Proteína é medida de acordo com aná- lise de TCA-Biuret como descrito aqui.

[00135] Em uma concretização a liquefação é realizada usando ma- terial de carboidrato pré-tratado tendo um peso de matéria seca de 15 a 25% (p/p).

[00136] Em uma concretização a fermentação é feita em um reator. Em uma concretização a fermentação pode também ser feita em dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou ainda mais reatores. Assim, o termo "reator" não é limitado a um único reator, mas pode significar múltiplos reatores.

[00137] Em uma concretização a fermentação é feita em um reator tendo um volume de 1 – 5000 m3. No caso de múltiplos reatores são usados na fermentação do processo como descrito aqui, eles podem ter o mesmo volume, mas também podem ter um volume diferente.

[00138] Em uma concretização o reator em que a fermentação é feita tem uma razão de altura para diâmetro de 2:1 a 8:1.

[00139] Em uma concretização a fermentação é feita por um micro- organismo de produção de álcool para produzir álcool. A fermentação por um micro-organismo de produção de álcool para produzir álcool pode ser feita no mesmo reator em que a hidrólise é realizada. De pre- ferência, a fermentação por um micro-organismo de produção de álco- ol para produzir álcool é realizada em um reator separador.

[00140] Em uma concretização a fermentação é feita por uma leve- dura. Em uma concretização o micro-organismo de produção de álcool é uma levedura. Em uma concretização the micro-organismo de pro- dução de álcool é capaz de fermentar pelo menos a C5 açúcar e pelo menos a C6 açúcar. Em uma concretização a fermentação é feita com uma levedura que é capaz de converter pelo menos um açúcar C5. Em uma concretização a fermentação é feita com uma levedura que é ca- paz de converter pelo menos um açúcar C5. Em uma concretização o produto de açúcar como descrito aqui compreende glicose, galactose e arabinose. Em uma concretização o produto de açúcar como descrito aqui compreende ácido acético, de preferência 0,3% (w/w) ou mais. Em uma concretização o produto de açúcar como descrito aqui com- preende glicerol. Em uma concretização o produto de açúcar como descrito aqui compreende ácido acético, glicerol e um açúcar C6 e/ou um açúcar C5. Em uma concretização o micro-organismo usado para os fermentos de fermentação de ácido acético, glicerol e um açúcar C6 e/ou um açúcar C5 para dar um produto de fermentação. Em uma concretização a levedura usada para os fermentos de fermentação de ácido acético, glicerol e um açúcar C6 e/ou um açúcar C5 para dar um produto de fermentação. Em uma concretização a levedura usada para os fermentos de fermentação de ácido acético, glicerol e um açúcar C6 e/ou um açúcar C5 para dar etanol. Em uma concretização o produto de açúcar como descrito aqui compreende Mn2+.

[00141] Em um outro aspecto, o pedido inclui um processo como descrito aqui em que um micro-organismo é usado para a fermentação de uma fonte de carbono compreendendo açúcar(es), por exemplo, glicose, L-arabinose, galactose e/ou xilose. A fonte de carbono pode incluir qualquer oligo- ou polímero de carboidrato compreendendo uni- dades de L-arabinose, galactose, xilose ou glicose, tal como, por exemplo, lignocelulose, xilanos, celulose, amido, arabinano e similares. Para liberação de unidades de xilose ou glicose a partir de tais carboi- dratos, carboidrases apropriados (tais como xilanases, glucanases, amilases e similares) podem ser adicionados ao meio de ou podem ser produzidos pela célula hospedeira modificada. No ultimo caso, a célula hospedeira modificada pode ser geneticamente modificada para pro- duzir e excretar tais carboidrases. Uma vantagem adicional de uso de fontes oligo- ou poliméricas de glicose é que permite manter uma con- cetração baixa (mais baixa) da glicose livre durante a fermentação, por exemplo, por uso de quantidades de limitação de taxa das carboidra- ses. Isto, por sua vez, evitará repressão de sistemas exigidos para o metabolismo e transporte de açúcares de não glicose tal como xilose. Em uma concretização a célula hospedeira modificada fermenta tanto a L-arabinose (opcionalmente xilose) quanto a glicose, de preferência simultaneamente, caso esse em que de preferência uma célula hospe- deira modificada é usada que intensiva a repressão de glicose para prevenir crescimento diaúxico. Além de uma fonte de L-arabinose, op- cionalmente xilose (e glicose) como fonte de carbono, o meio de fer- mentação ulteriormente compreende o ingrediente apropriado exibido para o crescimento da célula hospedeira modificada.

[00142] O processo de fermentação pode ser um processo de fermentação aeróbico ou anaeróbico. Um processo de fermentação anaeróbico é aqui definido como um processo de fermentação operado na ausência de oxigênio ou em que substancialmente nenhum é con- sumido, de preferência menos do que 5, 2,5 ou 1 mmol/L/h, mais de preferência 0 mmol/L/h é consumido (isto é, consumo de oxigênio não é detectável), e em que moléculas orgânicas servem tanto como doa- dor de elétron quanto ambos aceitantes de elétrons. Na ausência de oxigênio, NADH produzido na formação de biomassa e glicólise, não pode se oxidado por fosforilação oxidativa. Para resolver este proble- ma, muitos micro-organismos usam piruvato ou um dos derivados co- mo um aceitante de hidrogênio e elétron desse modo regeração de NAD+. Assim, em um processo de fermentação anaeróbico piruvato é usado como (e aceitante de hidrogênio) e é reduzido em produtos de fermentação tal como etanol, ácido láctico, ácido 3-hidróxi-propiônico, ácido acrílico, ácido acético, ácido succínico, ácido cítrico, ácido máli- co, ácido fumárico, um amino ácido, 1,3-propano-diol, etileno, glicerol, butanol, um antibiótico de β-lactama e um cefaloesporina. Em uma concretização preferida, o processo de fermentação é anaeróbico. Um processo anaeróbico é vantajoso, uma vez que é mais barato do que processos aeróbicos: equipamento menos especial é necessário. Além do mais, processos anaeeróbicos são esperados para dar um rendi- mento de produto mais alto do que os processos aeróbicos. Sob con- diçõe aeróbicas, usualmente o rendimento de biomassa é mais alta do que sob condições anaeróbicas. Como uma consequência, usualmen- te sob condições aeróbicas, o rendimento de produto esperado é mais baixo do que sob condições anaeróbicas.

[00143] Em uma outra concretização o processo de fermentação é sob condições limitadas a oxigênio. Mais de preferência, o processo de fermentação é aeróbico e sob condições limitadas a oxigênio. Um pro- cesso de fermentação limitado a oxigênio é um processo em que o consumo de oxigênio é limitado pela transferência de oxigênio do gás para o líquido. O grau de limitação de oxigênio é determinado pela quantidade e composição do fluxo de gás de entrada bem como as propriedades de transferência de massa/misturação real do equipa- mento de fermentação usado. De preferência, em um processo sob condições limitadas a oxigênio, a taxa de consumo de oxigênio é pelo menos 5,5, mais de preferência pelo menos 6 e ainda mais de prefe- rência pelo menos 7 mmol/L/h. Em uma concretização a fermentação é anaeróbica.

[00144] O processo de fermentação é de preferência operado a uma temperatura que é ótima para o micro-organismo usado. Assim, para a maioria das leveduras ou células fúngicas, o processo de fer- mentação é realizado a uma temperatura que é menor do que 42ºC, de preferência 38ºC ou mais baixo. Para levedura ou células hospedei- ras fúngicas filamentosas, o processo de fermentação é de preferência realizado a uma temperatura que é mais baixo do que 35, 33, 30 ou 28ºC e a uma temperatura que é mais alta do que 20, 22, ou 25ºC. Em uma concretização a fermentação é realizada entre 25ºC e 35ºC.

[00145] Em uma concretização as fermentações são conduzidas com um micro-organismo de fermentação. Em uma concretização da invenção, o álccol (por exemplo, etanol) fermentações de C5 açúcares são conduzidas com um micro-organismo de fermentação C5. Em uma concretização da invenção, o álccol (por exemplo, etanol) fermenta- ções de açúcares C6 são conduzidas com um micro-organismo de fermentação C5 ou um micro-organismo de fermentação C6 comercial. Levedura comercialmente disponível adequada para a produção de etanol inclui, mas não são limitados a, BIOFERMR AFT e XR (NABC— North American Bioproducts Corporation, GA, USA), levedura de ETANOL REDR (Fermentis/Lesaffre, USA), FALIR (Fleischmann's Yeast, USA), FERMIOLR (DSM Specialties), GERT STRANDR (Gert

Strand AB, Sweden), e SUPERSTARTR e levedura fresca THERMO- SACCR (Etanol Technology, WI, USA).

[00146] Em uma concretização o micro-organismo de produção de álcool é um micro-organismo que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5. De preferência, é também capaz de fermentar pelo menos um açúcar C6. Em uma concretização a ampliação descreve um pro- cesso para a preparação de etanol a partir de material lignocelulósico, compreendendo as etapas de (a) realização de um processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material lignocelulósi- co como descrito acima, (b) fermentação do produto de açúcar para produzir etanol; e (c) opcionalmente, recuperação do etanol. A fermen- tação pode ser feita com uma levedura que é capaz de fermentar pelo menos um açúcar C5.

[00147] O micro-organismo usado na fermentação pode ser um or- ganismo procariótico ou eucariótico. O micro-organismo usado pode ser micro-organismo geneticamente engenheirado. Exemplos de mi- cro-organismos adequados são leveduras, por exemplo Saccha- romyces, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus ou Saccharomyces uvarum, Hansenula, Issatchenkia, por exemplo, Issatchenkia orientalis, Pichia, por exemplo, Pichia stipites ou Pichia pastoris, Kluyveromyces, por exemplo, Kluyveromyces fagilis, Candida, por exemplo, Candida pseudotropicalis ou Candida aci- dothermophilum, Pachysolen, por exemplo, Pachysolen tannophilus ou bactérias, por exemplo Lactobacillus, por exemplo, Lactobacillus lactis, Geobacillus, Zymomonas, por exemplo, Zymomonas mobilis, Clostri- dium, por exemplo, Clostridium phytofermentans, Escherichia, por exemplo, E. coli, Klebsiella, por exemplo, Klebsiella oxitoca. Em uma concretização o micro-organismo que é capaz de fermentar pelo me- nos um açúcar C5 é uma levedura. Em uma concretização, a levedura pertence ao genêro Saccharomyces, de preferência da espécie Sac-

charomyces cerevisiae. A levedura, por exemplo, Saccharomyces ce- revisiae, usada nos processos como descritos aqui é capaz de conver- ter açúcares de hexose (C6) e açúcares de pentose (C5). A levedura, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, usada nos processos como descritos aqui podem anaerobicamente fermentar pelo menos um açú- car C6 e pelo menos um açúcar C5. Em uma concretização a levedura como descrita aqui é capaz de usar L-arabinose e xilose além de gli- cose anaerobicamente. Em uma concretização, a levedura é capaz de converter L-arabinose em L-ribulose e/ou xilulose 5-fosfato e/ou em um produto de fermentação desejado, por exemplo em etanol. Orga- nismos, por exemplo, cepas de Saccharomyces cerevisiae, capazes de produzir etanol a partir de L-arabinose podem ser produzidos por modificação de uma levedura hospedeira que introduz os genes araA (L-arabinose isomerase), araB (L-ribuloglioxalato) e araD (L-ribulose-5- P4-epimerase) de uma fonte adequada. Tais genes podem ser intro- duzidos para dentro de uma célula hospedeira a fim de que ela seja capaz de usar arabinose. Tal abordagem é dada como descrita na WO 2003/095627. Genes araA, araB e araD oriundos de Lactobacillus plantarum podem ser usados e são revelados na WO 2008/041840. O gene araA oriundo de Bacillus subtilis e os genes araB e araD oriundos de Escherichia coli podem ser usados e são revelados em EP1499708. Em uma outra concretização, genes araA, araB e araD podem ser de- rivados desde de pelo menos um do genêro Clavibacter, Arthrobacter e/ou Gramella, em particular um de Clavibacter michiganensis, Ar- throbacter aurescens, e/ou Gramella forsetii, como revelados na WO

2009011591. Em uma concretização, a levedura pode também com- preender uma ou mais cópias de gene de xilose isomerase e/ou uma ou mais cópias xilose redutase e/ou xilitol desidrogenase.

[00148] A levedura pode compreender uma ou mais modificações genéticas para permitir a levedura para fermentar xilose. Exemplos de modificações genéticas são introdução de um ou mais gene xilA, gene XIL1 e gene XIL2 e/ou gene XKS1-; deleção do gene de redutase de aldose (GRE3); ultra-expressão de genes PPP TAL1, TKL1, RPE1 e RKI1 para permitir o aumento do fluxo através da trajetória de pentose fosfato na célulal. Exemplos de levedura geneticamente engenheirada são descritos na EP1468093 e/ou na WO 2006/009434.

[00149] Um exemplo de uma levedura commercial adequada é RN1016 que é uma fermentação de glicose e xilose de cepa de Sac- charomyces cerevisiae oriunda de DSM, Países Baixos.

[00150] Em uma concretização, o processo de fermentação para a produção de etanol é anaeróbica. Anaeróbica já foi definida anterior- mente aqui. Em uma outra concretização, o processo de fermentação para a produção de etanol é aeróbica. Em uma outra concretização, o processo de fermentação para a produção de etanol está sob condi- ções limitadas a oxigênio, por exemplo, aeróbica e sob condições limi- tadas a oxigênio. Condições limitadas a oxigênio já foram definidas anteriormente aqui.

[00151] Alternativamente, aos processos de fermentação descritos acima, pelo menos duas células distintas podem ser usadas, isto signi- fica este processo é um processo de co-fermentação. Todas as con- cretizações dos processos de fermentação como descritos acima são também concretiziaçções deste processo de fermentação, identidade de fonte de L-arabinose e fonte de xilose, condições de fermentação (condições aeróbica ou anaeróbica, condições limitadas a oxigênio, temperatura em que o processo está sendo realizado, produtividade de etanol, rendimento de etanol).

[00152] Produtos de fermentação que podem ser produzidos pelos processos da invenção podem ser qualquer substância derivada de fermentação. Eles incluem, mas não são limitados a, álcool (tais como arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol, e xilitol); ácido orgânico (tal como ácido acético, ácido acetônico, ácido adípico, ácido ascórbico, ácido acrílico, ácido cítrico, ácido 2,5-diketo- D-glucônico, ácido fórmico, ácido fumárico, ácido glucárico, ácido glu- cônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, 3- ácido hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido maléico, ácido málico, ácido malô- nico, ácido oxálico, ácido oxaloacético, ácido propiônico, ácido succíni- co, e ácido xilônico); cetonas (tal como acetona); amino ácidos (tais como como ácido aspártico, ácido glutâmico, glicine, lisina, serina, trip- tofano, e treonina); alcanos (tal como pentano, hexano, heptano, octa- no, nonano, decano, undecano, e dodecano), cicloalcanos (tal como ciclopentano, cicloexano, cicloeptano, e ciclooctano), alcenos (tais co- mo penteno, hexeno, hepteno, e octeno); e gases (tais como metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (C02), e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação pode também ser uma proteína, uma vitamina, um produto farmacêutico, um suplemento de ração de ani- mal, um produto especialmente químico, uma carga de alimentação química, um plástico, um solvente, etileno, uma enzima, tais como uma protease, uma celulase, uma amilase, uma glucanase, uma lactase, uma lipase, uma liase, uma oxidoredutase, uma transferase ou uma xilanase. Em uma concretização preferida um álcool é preparedo nos processos de fermentação como descritos aqui. Em uma concretiza- ção preferida etanol é preparado nos processos de fermentação como descritos aqui.

[00153] Os processos como descritos aqui podem compreender a recuperação de todas as espécies de produtos feitos durante os pro- cessos incluindo produtos de fermentação tal como etanol. Um produto de fermentação pode ser separado do caldo de fermentação de modo conhecido pela pessoa versada. Exemplos das técnicas para a recupe- ração incluem, mas não são limitados a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação ou extração. Para cada produto de fermentação a pessoa versada assim será capaz de selecionar uma técnica de separação adequada. Por exemplo, etanol pode ser separado de um caldo de fermentação de levedura por desti- lação, por exemplo, destilação por vapor/destilação por vácuo de modo convencional.

[00154] Em uma concretização os processos como descritos aqui também produzem energia, calor, eletricidade e/ou vapor.

EXEMPLOS Exemplo 1 O efeito de temperatura de liquefação e sacarificação na produção de glicose

[00155] O efeito de temperatura durante liquefação e sacarificação de material lignocelulósico é mostrado neste Exemplo.

[00156] As experiências foram feitas nos reatores de temperature controlada e pH controlado, agitados com um volume de trabalho de 1 l. Cada experiência foi realizada com 2,5 mg de proteína/grama de ma- téria seca de material lignocelulósico pré-tratado de um coquetel de celulase de Rasamsonia emersonii mais 0,2 mg de proteína/g matéria seca de material lignocelulósico pré-tratado de uma beta glucose d Rasamsonia emersonii.

[00157] A concentração de proteína foi determinada usando o mé- todo de Biuret. Amostas foram diluídas com base no peso com água e foram centrifugadas por 5 minutos a >14000xg. Diluições de albumina de soro bovino (BSA) (0,5, 1, 2, 5, 10 e 15 mg/ml) foram feitas para gerar uma curva de calibração. De cada amostra de proteína diluída (da BSA e o coquetel), 200 µl do sobrenadante em um tubo de reação de 1,5 ml. 800 µl de reagente de BioQuant Biuret foram adicionados e foram totalmente misturados. A partir da mesma amostra diluída, 500 µl foram adicionados ao tubo de reação contendo um filtro de 10KD. 200 µl do efluente foram transferidos em um tubo de reação de 1,5 ml,

800 µl de reagente BioQuant Biuret foram adicionados e foram total- mente misturados. A seguir, todas as misturas (amostras de proteína diluídas antes e depois de filtro de 10KD com BioQuant) foram incuba- das a temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. A absorção das misturas foi medida a 546 nm com uma amostra de água usada como uma medição em branco. Diluições do coquetel que deu um va- lor de absorção a 546 nm dentro da faixa da linha de calibração foram usadas para calcular à concentração de proteína total das amostras a linha de calibração de BSA.

[00158] Coquetel de celulose de Rasamsonia emersonii foi produzi- da de acordo com os métodos como descritos na WO 2011/000949. beta-Glucosidase Rasamsonia emersonii como descrita na WO 2012/000890 foi usada nas experiências. Adições de enzima foram feitas no início da liquefação.

[00159] Palha de milho pré-tratada com ácido (aCS) foi feita por in- cubação de palha de milho por 6,7 minutos at a°C. Antes do tratamen- to térmico, a palha de milho foi impregnada com H2SO4 por 10 minutos para ajustar o pH a 2,3 durante o pré-tratamento. A quantidade de glu- cano no material lignocelulósico pré-tratado foi medido de acordo com o método descrito por Carvalho de Souza e outros (Carboidrate Poli- mers, 95 (013) 657-663. As reações de hidrólise foram realizadas com palha de milho pré-tratada com ácido (aCS) a uma concentração final de 17% (w/w) de matéria seca. A solução de carga de alimentação foi preparada via diluição de uma solução de carga de alimentação con- centrada com água. Subsequentemente, o pH foi ajustado para pH 4,5 com uma solução de 10 % (p/p) de NH4OH.

[00160] Em primeiro lugar, o material lignocelulósico pré-tratado foi submetido a liquefação por 6 horas. Durante este período, o espaço de topo dos reatores foi lavado com nitrogênio. A seguir, o material ligno- celulósico liquefeito foi submetido a sacarificação por 114 horas, em-

bora o espaço de topo dos reatores foi lavado com ar a uma taxa de 0,1 l/minuto. Durante a sacarificação o nível de oxigênio dissolvido (DO) na mistura de reação foi mantido a 20% do nível de saturação de oxigênio por ajuste da velocidade do agitador. Experiências foram rea- lizadas com as temperaturas de liquefação e sacarificação como mos- tradas na tabela 1.

[00161] Depois da sacarificação, amostras foram tiradas para análi- se. As amostras foram resfriadas no gelo, foram centrifugadas por 10 minutos a 3220xg e imediatamente 50 µl de cada sobrenadante foram diluídos em 1450 µl de água grau I. O sobrenadante diluído foi subse- quentemente filtrado em um filtro de 0,45 µm e os filtrados foram anali- sados quanto ao teor de açúcar como descrito abaixo.

[00162] As concentrações de açúcar das amostras diluídas foram medidas usando um HPLC equipado com um Aminax HPX-87P de acordo com o relatório técnico NREL NREL/TP-510-42623. Os resulta- dos são mostrados na tabela 1.

[00163] Os dados demonstram que os níveis mais altos de glicose foram obtidos quando a temperatura de liquefação é de 60ºC a 65ºC e a temperatura de sacarificação é de 50ºC to 60ºC. Exemplo 2 O efeito de temperatura de liquefação e sacarificação na produção de glicose

[00164] A experiência foi feita como descrito no exemplo 1 com a condição de que o nível de glicose fosse medido nas amostras que foram tiradas depois der 54,5 horas. Os resultados são mostrados na tabela 2.

[00165] Os dados demonstram que os níveis mais altos de glicose foram obtidos quando a temperatura de liquefação é de 60ºC a 65ºC e a temperatura de sacarificação é de 50ºC a 60ºC. Exemplo 3

O efeito de temperatura de liquefação e sacarificação na produção de glicose

[00166] A experiência foi feita como descrito no exemplo 1 com a condição de que cada experiência fosse realizada com o coquetel de celulase Ctec2 (Combinação de enzimas SAE0020 oriunda de No- vozymes) que foi adquirida a partir de Sigma-Aldrich. Ctec2 é um co- quetel de enzima Trichoderma reesei contendo celulases, ß- glucosidases, e hemicelulase. Além do mais, na experiência o nível de oxigênio dissolvido (DO) na mistura de reação durante a sacarificação foi mantida a cerca de 40% do nível de saturação de oxigênio. Além disso, nesta experiência a solução de carga de alimentação foi prepa- rada via diluição de uma solução de carga de alimentação concentrada com água. Subsequentemente, o pH foi ajustado para pH 5,0 com uma solução de 10% (p/p) de NH4OH. As temperaturas de liquefação e sa- carificação usadas e os resultados são mostrados na tabela 3.

[00167] Os dados demonstram que com um coquetel de celulase de Trichoderma reesei os níveis mais altos de glicose foram obtidos quando a temperatura de liquefação é de 60ºC a 65ºC e a temperatura de sacarificação é de 50ºC a 60ºC. Tabela 1: Produção de glicose a várias temperaturas de liquefação e sacarificação depois de 120 horas. Experiência Temperatura de Temperatura de sa- Nível de glicose liquefação (em °C) carificação (em °C) a 120h (em g/l) 1 62 55 42,7 2 60 50 42,5 3 65 60 41,2 4 60 50 42,5 5 70 55 36,0 6 62 65 36,2

Tabela 2: Produção de glicose a várias temperaturas de liquefação e sacarificação depois de 54,5 horas, Experiência Temperatura de Temperatura de sa- Nível de glicose liquefação (em °C) carificação (em °C) a 54,5 h (in g/l) 1 62 55 39,8 2 60 50 38,8 3 65 60 38,6 4 70 55 32,7 5 62 45 37,2 Tabela 3: Produção de glicose a várias temperaturas de liquefação e sacarificação after 120 horas.

Experiência Temperatura de Temperatura de sa- Nível de glicose liquefação (em °C) carificação (em °C) a 120h (em g/l) 1 60 50 29,7 2 60 55 30,8 3 50 65 21,3 4 70 55 10,3 5 60 45 27,9 6 60 65 18,0

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para a preparação de um produto de açúcar a partir de material de carboidrato, caracterizado pelo fato de que com- preende as seguintes etapas: a) pré-tratamento do material de carboidrato, b) liquefação do material de carboidrato pré-tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato liquefeito, c) sacarificação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas para produzir um produto de açúcar, em que oxigênio é adicionado durante a sacarificação, e d) opcionalmente, recuperação do produto de açúcar.

2. Processo para a preparação de um produto de fermen- tação a partir do material de carboidrato, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) pré-tratamento do material de carboidrato, b) liquefação do material lignocelulósico pré-tratado com uma composição de enzima a uma temperatura de 60ºC a 65ºC por 1 a 20 horas para produzir um material de carboidrato liquefeito, c) sacarificação do material de carboidrato liquefeito com uma composição de enzima a uma temperatura de 50ºC a 60ºC por 1 a 120 horas para produzir um produto de açúcar, em que oxigênio é adicionado durante a sacarificação, d) fermentação do produto de açúcar para produzir um produto de fermentação; e e) opcionalmente, recuperação do produto de fermenta- ção.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, carac- terizado pelo fato de que depois da etapa b e antes da etapa c, o ma-

terial de carboidrato liquefeito é sacarificado na ausência da adição de oxigênio.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição de enzima compreende endoglucanase.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteriza- do pelo fato de que a endoglucanase compreende uma endoglucanase GH5 e/ou a endoglucanase GH7.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as composições de enzima usadas para liquefação e sacarificação são as mesmas.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as composições de enzima usadas para liquefação e sacarificação são diferentes.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- do pelo fato de que a composição de enzima usada para liquefação compreende mais endoglucanase do que a composição de enzima usada parar sacarificação.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição de enzima usada na sacarificação é um caldo de fermentação inteiro de um fungo filamentoso, o dito caldo compreendendo uma celobioidrolase, uma beta-glucosidase, uma xilanase, uma beta-xilosidase e uma oxigenase de monossacarídeo lítica.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a liquefação é feita em um material de carboidrato pré-tratado com o peso de matéria seca de 15 a 25% (p/p).

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 2 a 10, caracterizado pelo fato de que a fermentação é feita com uma levedura que é capaz de converter pelo menos um açúcar C5.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a liquefação e a sacarifi- cação são feitas em reatores diferentes.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a etapa c compreende a uma temperatura de 52ºC a 58ºC.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 3 a 13, caracterizado pelo fato de que o material de carboidrato liquefeito é sacarificado na ausência da adição de oxigênio a uma temperatura de 55ºC a 65ºC por 1 a 120 horas.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o pré-tratamento é feito na ausência de oxigênio.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 15, caracterizado pelo fato de que oxigênio é adicionado du- rante a sacarificação para manter o oxigênio dissolvido de 11% até 80% do nível de saturação.