BR112020023357A2 - anticorpos anti-cd33, anticorpos biespecíficos anti-cd33/anti-cd3 e usos dos mesmos - Google Patents

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Abstract

ANTICORPOS ANTI-CD33, ANTICORPOS BIESPECÍFICOS ANTI-CD33/ANTI-CD3 E USOS DOS MESMOS. São descritos anticorpos anti-CD33 e seus fragmentos de ligação a antígeno e anticorpos biespecíficos anti-CD33/anti-CD3 ou seus fragmentos de ligação a antígeno. Também são descritos ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, composições que compreendem os anticorpos, métodos para produzir os anticorpos, e métodos de uso dos anticorpos para tratamento ou prevenção de doenças como câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ANTI-CD33, ANTICORPOS BIESPECÍFICOS ANTI- CD33/ANTI-CD3 E USOS DOS MESMOS".
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A invenção refere-se a anticorpos monoclonais anti-CD33, anticorpos biespecíficos anti-CD33, anti-CD3, ácidos nucleicos e vetores de expressão que codificam os anticorpos, células recombinantes contendo os vetores, e composições compreendendo os anticorpos. Também são fornecidos, métodos para a produção dos anticorpos, e métodos para o uso dos anticorpos para tratar doenças incluindo câncer.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] A leucemia mieloide aguda (LMA) é uma doença geneticamente heterogênea caracterizada pela expansão clonal de células leucêmicas. Apesar de uma melhor compreensão da biologia da doença subjacente em LMA, o tratamento padrão com quimioterapia citotóxica permaneceu praticamente inalterado nas últimas décadas e a sobrevida geral de cinco anos permanece insatisfatória, sendo <30% (Burnett, Wetzler, & Lowenberg, 2011; Cancer Genome Atlas Research et al., 2013). Portanto, há uma necessidade urgente por novas terapias com maior eficácia e toxicidade diminuída, que direcionem idealmente as células-tronco de LMA porque acredita-se que essas células sejam críticas na patogênese de LMA, e acredita-se que sua erradicação inadequada por terapia padrão contribua para a alta incidência de recidiva (Hope, Jin, & Dick, 2004; Ishikawa et al., 2007). Embora anticorpos terapêuticos direcionados a moléculas da superfície celular tenham se mostrado eficazes para o tratamento de distúrbios malignos, como linfomas e leucemia linfoblástica aguda, bem como tumores sólidos (Hoelzer, 2013; Jackson & Chester, 2015), apenas uma terapia baseada em anticorpos está atualmente aprovada para LMA (Godwin,
Gale, & Walter, 2017).
[003] A CD33 é uma glicoproteína de transmembrana de passagem única de 67 kD e é um membro da família das lectinas semelhantes a imunoglobulina de ligação ao ácido siálico (Siglecs, "sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins"). Embora sua função biológica exata seja incerta, em indivíduos normais, é principalmente considerada um antígeno de diferenciação mieloide, com baixa expressão em progenitores mieloides, neutrófilos e macrófagos embora seja altamente expresso em monócitos e células dendríticas circulantes. De modo importante, a CD33 foi detectada em blastos e células-tronco leucêmicas de 85 a 90% de doentes com LMA. Curiosamente, a expressão de CD33 é restrita a células hematopoiéticas (Paul, Taylor, Stansbury, & McVicar, 2000; Ulyanova, Blasioli, Woodford Thomas, & Thomas, 1999), mas está ausente em células-tronco hematopoiéticas normais (Andrews, Torok Storb, & Bernstein, 1983; Griffin, Linch, Sabbath, Larcom, & Schlossman, 1984; Jilani et al., 2002). Estes resultados sugerem que a CD33 é um alvo adequado para uma terapia à base de anticorpos em LMA.
[004] A estrutura de CD33 consiste em um domínio V-set semelhante a Ig amino-terminal (codificado pelo éxon 2 de CD33) que medeia a ligação do ácido siálico e um domínio C2-set semelhante a Ig (codificado pelos éxons 3 e 4) em sua porção extracelular (Laszlo et al., 2016). O splicing alternativo de RNA de CD33 pode levar a uma isoforma mais curta que é expressa na superfície celular, que não tem o domínio V-, mas retém o domínio C2-set semelhante a Ig (Laszlo, Estey &, Walter, 2014; Laszlo et al., 2016). A importância biológica deste processo de splicing foi em grande parte desconhecida até que estudos recentes mostraram que um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs12459419 estava presente em ~50% da população de LMA e leva ao salto do éxon 2 de CD33, o que resulta na deleção do domínio V de
CD33 (Lambda et al., 2017). Curiosamente várias terapias baseadas em anticorpos CD33, incluindo Mylotarg, o único anticorpo aprovado para LMA, se liga e reconhece o domínio de V de CD33. O estudo mencionado acima mostrou, de fato, que o Mylotarg não tem eficácia em pacientes que expressam o SNP e, portanto, apenas ~50% apresentaram eficácia na população de LMA (Lambda et al., 2017). Considerando os dados com Mylotarg, é razoável conjecturar que os outros anticorpos CD33 de ligação V também serão apenas eficazes em um pool limitado de pacientes com LMA, especificamente os pacientes que não apresentam a mutação SNP rs12459419.
[005] De fato, ao estudar o espaço clínico de CD33, anticorpos anti-CD33 adicionais incluem AMG330 e AMG673 de Amgen, AMV564r de Amphivena, IMGN779 de Immunogen, BI836858 de Boehringer Ingelheim, Actimabe de Actinium Pharma e SGN33A de Seattle Genetic. O anticorpo AMG330 de Amgen é um BiTE de CD33xCD3 e foi relatado como sendo "reconhece um epítopo linear localizado no domínio V-set de CD33 com a sequência central IPYYDKN". (Friedrich et al., 2014). Dado que AMG673 é a versão de extensão de meia-vida útil do BiTE de CD33, acreditada-se que se ligue ao mesmo epítopo que o BiTE. O AMV564 de Amphivena é um anticorpo biespecífico tetravalente CD33/CD3 e de acordo com o documento US9803029, o anticorpo se liga ao domínio V de CD33. O IMGN779 de Immunogen é um anticorpo CD33 (My9-6) conjugado a um agente alquilante de DNA e de acordo com a figura 1 na patente US9359442, o anticorpo My9-6 marcado com I125 competiu com o anticorpo My9 pela ligação com as células U-937 positivas para CD33. O anticorpo My9 se liga ao domínio V de CD33 (Perez-Oliva et al., 2011). Juntos, a evidência sugere que IMGN779 se liga ao domínio V de CD33. O BI 836858 de Boehringer Ingelheim é um anticorpo anti-CD33 manipulado com Fc que medeia ADCC mediada por células NK e se liga ao domínio V de CD33 (Vasu et al., 2016).
Adicionalmente, Vasu et al. mostram evidências para o mapeamento de lintuzumabe (HuM195) para o domínio V de CD33 junto com Malik et al. e Perez-Oliva et al. (Malik et al., 2015; Perez-Oliva et al., 2011). O anticorpo HuM195 é atualmente em ensaios clínicos conjugado a actínio pela Actinium pharma para produzir Actimabe. O anticorpo HuM195 também tem sido conjugado a um agente de ligação de DNA por Seattle Genetics para produzir SGN33A; entretanto esse fármaco está atualmente suspenso devido a preocupações de toxicidade. Consequentemente, os anticorpos anti -D33 conhecidos na técnica se ligam ao domínio V de CD33.
[006] Tendo em conta estes dados, há uma necessidade médica crítica não atendida quando se trata de terapias com anticorpos à base de CD33 em LMA e a necessidade de ter um anticorpo que se liga ao domínio C2 de CD33 para o tratamento de cânceres que expressam CD33.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[007] Em um aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD33 Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao domínio C2 de CD33. Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao domínio V de CD33.
[008] Em um outra aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos biespecíficos isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD33 e CD3. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao domínio C2 de CD33. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam à região V de CD33.
[009] São fornecidos anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente ao domínio C2 de CD33. Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das:
[010] SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
[011] SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente;
[012] SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente;
[013] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente;
[014] SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente;
[015] SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente;
[016] SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente;
[017] SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente;
[018] SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente;
[019] SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente;
[020] SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente;
[021] SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente;
[022] SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente;
[023] SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente; ou
[024] SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente.
[025] O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode, por exemplo, se ligar especificamente a CD33, de preferência, CD33 humano.
[026] Em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ou 285, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324, ou 325.
[027] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:
[028] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332;
[029] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331;
[030] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302;
[031] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310;
[032] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322;
[033] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300;
[034] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304;
[035] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305;
[036] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306;
[037] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307;
[038] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307;
[039] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317;
[040] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319;
[041] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; ou
[042] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325.
[043] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno induz citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) in vitro com um EC50 menor que cerca de 2 nM. O anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode, por exemplo, compreender uma cadeia principal de IgG1 com baixo teor de fucose.
[044] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao CD33 com uma constante de dissociação (KD) menor que cerca de 5 x 10-9 M.
[045] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga ao CD33 e induz a internalização com um EC50 menor que cerca de 2 nM.
[046] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno é conjugado a um agente terapêutico.
[047] Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno é quimérico, parcialmente humanizado ou totalmente humanizado.
[048] São também aqui fornecidos anticorpos biespecíficos anti- CD33/anti-CD3 ou seus fragmentos de ligação a antígeno, que compreendem um anticorpo anti-CD3 ou um seu fragmento de ligação ao antígeno e um anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[049] SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
[050] SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente;
[051] SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente;
[052] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente;
[053] SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente;
[054] SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente;
[055] SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente;
[056] SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente;
[057] SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente;
[058] SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente;
[059] SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente;
[060] SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente;
[061] SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente;
[062] SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente; ou
[063] SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente;
[064] e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[065] SEQ ID NOs: 342, 343, 344, 465, 466, e 467, respectivamente; ou
[066] SEQ ID NOs: 345, 346, 347, 468, 469, e 470, respectivamente.
[067] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ou 285, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324, ou
325. e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:257 ou 258, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:298 ou 299.
[068] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico isolado anti-CD33/anti-CD3, ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:
[069] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[070] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[071] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[072] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[073] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[074] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[075] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[076] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[077] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[078] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[079] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[080] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[081] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[082] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[083] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[084] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[085] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:291 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[086] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[087] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[088] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:280 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[089] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[090] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[091] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[092] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[093] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[094] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[095] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[096] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[097] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:284 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; ou
[098] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299.
[099] Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos biespecíficos anti-CD33/anti-CD3 ou seus fragmentos de ligação a antígeno induzem a citotoxicidade dependente de células em células que expressam CD33 in vitro com um valor de EC50 menor que cerca de 1 nM.
[0100] Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos anti- CD33/anti-CD3 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno são quiméricos, parcialmente humanizados ou totalmente humanizados.
[0101] Também são fornecidos ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos monoclonais e/ou biespecíficos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.
[0102] São também fornecidos vetores que compreendem os ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos monoclonais e/ou biespecíficos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.
[0103] São também fornecidas células hospedeiras que compreendem os vetores que compreendem os ácidos nucleicos isolados que codificam os anticorpos monoclonais e/ou biespecíficos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno da invenção.
[0104] Em certas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo biespecífico isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0105] São também fornecidos métodos para tratar câncer em um indivíduo que precisa de tal tratamento, que compreendem administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da invenção. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer hematológico. O câncer hematológico pode, por exemplo, ser selecionado de, mas não se limita a, o grupo que consiste em uma leucemia, um linfoma ou um mieloma múltiplo. Em determinadas modalidades, o câncer hematológico pode ser leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásica (SMD, de baixo ou alto risco), leucemia linfoide aguda (LLA, incluindo todos os subtipos), linfoma de células B grandes difusas (LCBGD), leucemia mieloide crônica (LMC) ou neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN).
[0106] Também são fornecidos métodos de produção do anticorpo monoclonal ou biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Os métodos compreendem cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno, e recuperar o anticorpo monoclonal ou biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura.
[0107] Também são fornecidos métodos de produção de uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo monoclonal e/ou biespecífico ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Os métodos compreendem combinar o anticorpo monoclonal e/ou biespecífico e/ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0108] O sumário supracitado, bem como a descrição detalhada a seguir das modalidades preferenciais do presente pedido, serão mais bem entendidos quando lidos em conjunto com os desenhos em anexo. Deve-se compreender, no entanto, que o pedido de patente não se limita às modalidades precisas mostradas nos desenhos.
[0109] As Figuras 1A a 1B mostram ensaios de citotoxicidade mediada por células T de CD33xCD3. Anticorpos biespecíficos CD33xCD3 com o uso do braço anti-CD3 CD3B219 foram incubados com células pan-T humanas e uma linhagem celular de LMA CD33+.
Após 48 horas a 37°C, CO2 a 5%, a citotoxicidade da célula tumoral total foi medida por citometria de fluxo. A Figura 1A mostra os anticorpos candidatos identificados por OMNIRat e a Figura 1B mostra os anticorpos candidatos identificados por OMNIMouse.
[0110] As Figuras 2A a 2B mostram a avaliação ex vivo de anticorpos biespecíficos CD33xCD3 com o uso de citotoxicidade de blastos dos braços anti-CD3 CD3B219 e CD3B376 e a ativação de células T em sangue total fresco de pacientes com LMA. A Figura 2A mostra a porcentagem de citotoxicidade celular total de células de LMA com o uso de anticorpos biespecíficos CD33 ou os controles CD3xnull. A Figura 2B mostra a ativação de células T induzidas por anticorpos biespecíficos CD33 ou os controles CD3xnull. Nenhum bloqueador de Fc foi adicionado.
[0111] As Figuras 3A a 3C mostram ensaios de citotoxicidade mediada por células T de CD33xCD3. Anticorpos biespecíficos CD33xCD3 que usam os braços anti-CD3 CD3B219 e anti-CD3B376 foram incubados com células pan-T humanas e linhagens celulares de LMA que são selvagens (KG1, Figura 3A), heterozigotas (SH2, Figura 3B) ou homozigotas (OCIAML3, Figura 3C) para a mutação de CD33 SNP rs12459419. Após 48 horas a 37°C, CO2 a 5%, a citotoxicidade da célula tumoral total foi medida por citometria de fluxo.
[0112] As Figuras 4A a 4B mostram a avaliação ex vivo de anticorpos C33B904 pareados com CD3B219 ou CD3B376 sobre a citotoxicidade de células MOLM-13 exogenamente adicionadas ao sangue total humano, saudável, normal (N=6 doadores): Porcentagem de citotoxicidade de células MOLM-13 (Figura 4A) e monócitos CD33 + CD14+ (Figura 4B) com o uso de CD33xCD3 biespecíficos e respectivos controles nullxCD3 em 48 horas.
[0113] As Figuras 5A a 5B mostram a avaliação ex vivo de anticorpos biespecíficos CD33xCD3 com o uso dos braços anti-CD3
CD3B219 e CD3B376 sobre a citotoxicidade de monócitos e a ativação de células T em sangue total fresco obtido de seis doadores macacos cinomolgos normais. A Figura 5A mostra a porcentagem de citotoxicidade celular total de monócitos CD33+CD14+ de macaco cinomolgo com o uso de anticorpos biespecíficos CD33 ou seus controles CD3xnull. A Figura 5B mostra a ativação de células T por anticorpos biespecíficos CD33 ou seus controles CD3xnull. Nenhum bloqueador de Fc foi adicionado.
[0114] A Figura 6 mostra a eficácia antitumoral de C3CB189 em xenoenxertos de MOLM-13 de LMA humana em camundongos NSG humanizados com células T. Tumores disseminados de MOLM-13 foram imageados para avaliar a bioluminescência (BLI) duas vezes por semana e os resultados são apresentados como a radiância média (p/s/cm2/sr) ± SEM (n=8 a 10/grupo). *p≤ 0,0001 para tratamento em função de controle, calculada por ANOVA de duas vias com o teste de Bonferroni.
[0115] A Figura 7 mostra a sobrevida de animais tratados com C3CB189 em xenoenxertos de MOLM-13 de LMA humana em camundongos NSG humanizados com células T. A sobrevida de camundongos portadores de MOLM-13 é representada graficamente com o uso de uma curva de Kaplan Meier e avaliada pelo teste de classificação logarítmica (Mantel-Cox). *p≤ 0,0001 para o tratamento em função de grupos de controle.
[0116] A Figura 8 mostra a eficácia antitumoral de C3CB88 em xenoenxertos de MOLM-13 de LMA humana em camundongos NSG humanizados com células T. Tumores disseminados de MOLM-13 foram imageados para avaliar a bioluminescência (BLI) duas vezes por semana e os resultados são apresentados como a radiância média (p/s/cm2/sr) ± SEM (n=8 a 10/grupo). *p≤ 0,0001 para tratamento em função de controle, calculada por ANOVA de duas vias com o teste de
Bonferroni.
[0117] A Figura 9 mostra a sobrevida de animais tratados com C3CB88 em xenoenxertos de MOLM-13 de LMA humana em camundongos NSG humanizados com células T. A sobrevida de camundongos portadores de MOLM-13 é representada graficamente com o uso de uma curva de Kaplan Meier e avaliada pelo teste de classificação logarítmica (Mantel-Cox). *p≤ 0,05 para o tratamento em função de grupos de controle.
[0118] A Figura 10 mostra o ensaio de viabilidade celular in vitro do conjugado proteína A-fármaco para detecção de internalização de cinco anticorpos anti-CD33 em células MOLM13. Todos os cinco anticorpos anti-CD33 mostraram citotoxicidade em uma maneira dependente de dose.
[0119] As Figuras 11A a 11B mostram que os mAbs anti-CD33 de IgG1 com baixo teor de fucose medeiam a atividade de ADCC. ADCC de células NK humanas contra células-alvo MOLM-13 (Figura 11A) e MV4-11 (Figura 11B) em resposta a concentrações crescentes de mABs anti-CD33 de IgG1.
[0120] A Figura 12 mostra que linhagens celulares CD33-positivo e CD33-negativo foram coradas durante 4 h com várias concentrações de C3CB189 para caracterizar os perfis de ligação de superfície do anticorpo biespecífico.
[0121] A Figura 13 mostra células T de seis doadores saudáveis testados em ensaios de redirecionamento T com as linhagens celulares indicadas e a porcentagem de citotoxicidade foi determinada por FACS. A média ± SD é representada graficamente.
[0122] Figuras 14A a 14B. C3CB189 se liga ao domínio C2 e medeia a citotoxicidade de amostras primárias independentemente do estado de seu genótipo 12459419 de SNP. A Figura 14A) mostra ensaios de citotoxicidade mediada por células T e de ativação com o uso de anticorpos biespecíficos CD33xCD3 ou CD123xCD3 em linhagens celulares CD33+ KG-1 e CD33- KG1ΔCD33. A Figura 14B) células T apenas foram incubadas com concentrações crescentes de C3CB189 durante 48 horas e a ativação de células T foi medida por citometria de fluxo. A média ± SD é representada graficamente.
[0123] Figuras 15A a 15C. A Figura 15A mostra valores medianos de EC20, EC50 e EC90 para a leitura de citotoxicidade de seis doadores saudáveis. A Figura 15B é similar ao à Figura 13 mas aqui a ativação de células T foi medida. A Figura 15C é similar à Figura 15A mas aqui são mostrados os valores medianos de EC20, EC50 e EC90 para a leitura da ativação de células T de seis doadores saudáveis.
[0124] Figuras 16A a 16E: C3CB189 medeia a potente atividade tumoral in vivo em dois modelos murinos de LMA estabelecidos. A Figura 16A mostra camundongos NSG humanizados com célula de T portando tumores KG-1 estabelecidos foram dosados i.p. com C3CB189 a 0,1, 0,5 e 1 mg/kg. O volume tumoral foi medido duas vezes por semana e os resultados apresentados como o volume médio do tumor ± EPM para cada grupo. A Figura 16B mostra camundongos NSG humanizados com célula de T portando células MOLM-13Luc disseminadas foram dosados i.p. com C3CB189 a 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg. A sobrevida foi determinada utilizando-se análise de sobrevida de Kaplan Meier. A Figura 16C é igual à Figura 16B mas aqui a bioluminescência foi medido duas vezes por semana e imagens representativas de imageamento de animais vivos de bioluminescência (vistas ventral e dorsal de n=3 a 5 animais) nos dias 9, 13, e 16 são mostradas (n=3 no grupo de controle no dia 16 devido à mortalidade). A Figura 16D é similar à Figura 16B mas aqui os camundongos foram dosados com C3CB189 a 0,005 e 0,05 mg/kg para três doses. A infiltração de células T na medula óssea foi medida por análise citométrica de fluxo e os resultados são apresentados como porcentagem de células tumorais (painel superior) ou porcentagem de células T de CD3+ (painel de fundo). A Figura 16E é igual à Figura 16D mas aqui a infiltração de células T na medula óssea foi medida por coloração IHC e os resultados são apresentados como células tumorais CD33+ (painel superior) ou células T CD8+ (painel de fundo).
[0125] A Figura 17 mostra que C3CB189 medeia as respostas antitumorais em um modelo murino de LMA disseminada. As células tumorais foram implantadas no dia 0, as células T foram implantadas no dia 5, e a dosagem ocorreu conforme indicado pela barra abaixo do eixo X. A bioluminescência do grupo é representada graficamente como a média ± EPM. * denota diferença significativa no dia 13 (p≤0,05) entre tratamento com C3CB189 e com controle nullxCD3 (n=9-10/grupo no dia 13).
[0126] As Figuras 18A e 18B mostram que C3CB189 induziu a citotoxicidade dependente de células T de linhagens celulares de CD33 + no sangue total. A Figura 18A mostra células T de dez doadores saudáveis (único ponto por doador) foram testados em ensaios de redirecionamento de células T com as linhagens celulares indicadas. A média ± SD é representada graficamente. A Figura 18B é igual à Figura 18A mas aqui são mostrados os valores de EC20, EC50 e EC90 de citotoxicidade e de ativação de células T. ND indica não pode ser determinado, ou seja, Prism forneceu um valor aproximado ou a curva era ambígua. Os valores são médias de 10 doadores saudáveis.
[0127] As Figuras 19A e 19B mostram que C3CB189 medeia a citotoxicidade de blastos de LMA de amostras de pacientes primários. A Figura 19A mostra a avaliação ex vivo da citotoxicidade mediada por C3CB189 de blastos CD33+ em sangue total fresco de pacientes com LMA após 48 horas. Valores individuais de EC50 são mostrados para cada amostra de paciente. A Figura 19B é igual à Figura 19A mas aqui foi medida a ativação de células T.
[0128] A Figura 20 mostra que CD33 é expresso em subconjuntos imune de macacos cinomolgos. O sangue total de seis doadores macacos cinomolgos saudáveis normais foi corado com um anticorpo monoclonal para CD33 e analisado por citometria de fluxo. A média ± SD é representada graficamente.
[0129] A Figura 21 mostra que C3CB189 medeia a citotoxicidade de células MOLM-13, monócitos e neutrófilos de CD33+ normais de macaco cinomolgo juntamente com a ativação de células T de macaco cinomolgo. Avaliação ex vivo da citotoxicidade mediada por C3CB189 em células MOLM-13 da linhagem celular de LMA exogenamente adicionadas ao sangue total normal de macacos cinomolgos saudáveis (n=6). São mostradas a porcentagem de citotoxicidade das células MOLM-13, a ativação de células T, bem como citotoxicidade de monócitos e neutrófilos de CD33+ com o uso de anticorpos biespecíficos C3CB189 e nullxCD3. A média ± EPM é representada graficamente.
[0130] As Figuras 22A a 22D mostram que C3CB189 medeia a redução de leucócitos de CD33+ em macacos cinomolgos. Os macacos cinomolgos foram tratados com uma única dose IV de controlo (veículo), 0,05, 0,2 ou 1 mg/kg de C3CB189. A Figura 22A mostra perfis de concentração ao longo do tempo de C3CB189 A Figura 22B mostra a ativação de células T (% CD25+ em CD8+) no sangue periférico. A Figura 22C mostra o efeito de C3CB189 sobre granulócitos (neutrófilos). A Figura 22D mostra o efeito de C3CB189 sobre monócitos.
[0131] A Figura 23 mostra a liberação de citocinas após a dosagem de C3CB189 em macacos cinomolgos. A média (SD) dos níveis de citocina em macacos cinomolgos após uma dose única intravenosa de C3CB189. (A) IFNγ, (B) IL-10, (C) IL-2, (D) IL-6, (E) MCP, (F) TNFγ. Todos os valores de LLOQ abaixo foram tratados como metade de LLOQ para fins de plotagem e de cálculo da média.
[0132] As Figuras 24A a 24C mostram que C3CB189 se liga ao domínio C2 e medeia a citotoxicidade de amostras primárias independentemente do estado de seu genótipo 12459419 de SNP. A Figura 24A mostra o mapeamento de HDX e a subsequente ilustração de regiões do epítopo no domínio IgC e IgV da proteína ECD de CD33 para mAbs aglutinante de V e C2. A região V do epítopo é colorida de azul e a região C2 do epítopo é colorida de vermelho. A Figura 24B mostra a avaliação ex vivo da citotoxicidade de blastos de CD33+ em sangue total fresco de paciente com LMA fresco paciente em sangue total realizada a 27 nM de concentração de anticorpo biespecífico. A média ± SD é representada graficamente. A Figura 24C mostra citotoxicidade mediada por C3CB189 de monócitos purificados congelados de 25 dadores normais avaliada a 0,27 nM de concentração de anticorpo biespecífico. Média ± SD é representada graficamente.
[0133] As Figuras 25A a 25C mostram resultados de genotipagem para SNP rs12459419. A Figura 25A mostra os resultados da genotipagem utilizando ensaios Taqman para rs12459419 de SNP em linhagens celulares. A Figura 25B é igual à Figura 25A, mas aqui as amostras de pacientes primários foram genotipadas. A Figura 25C é igual à Figura 25A, mas aqui monócitos congelados de doadores saudáveis foram genotipados com o uso de ensaios Taqman bem como sequenciamento de Sanger.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0134] Várias publicações, artigos e patentes são citados ou descritos em segundo plano e ao longo do relatório descritivo; cada uma dessas referências está aqui incorporada por referência em sua totalidade. A discussão de documentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que tenha sido incluída no presente relatório descritivo tem o propósito de fornecer contexto para a invenção. Tal discussão não é uma admissão de que qualquer um ou todos esses assuntos façam parte da técnica anterior no que diz respeito a quaisquer invenções reveladas ou reivindicadas.
[0135] Exceto onde definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados na presente invenção têm o mesmo significado como comumente compreendido pelo versado na técnica à qual essa invenção pertence. De outro modo, certos termos utilizados na presente invenção têm os significados conforme definidos no relatório descritivo.
[0136] Deve-se observar que, conforme usado na presente invenção e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um/uma" e "o/a" incluem a referência no plural, salvo se o contexto claramente indicar o contrário.
[0137] Exceto onde especificado de outra forma, quaisquer valores numéricos, como uma concentração ou uma faixa de concentração aqui descrita, deve ser entendido como sendo modificado em todos os casos pelo termo "cerca de". Dessa forma, um valor numérico tipicamente inclui ± 10% do valor mencionado. Por exemplo, uma concentração de 1 mg/ml inclui 0,9 mg/ml a 1,1 mg/ml. De modo semelhante, uma faixa de concentração de 1% a 10% (p/v) inclui 0,9% (p/v) a 11% (p/v). Como usado na presente invenção, o uso de uma faixa numérica inclui expressamente todas as subfaixas possíveis, todos os valores numéricos individuais dentro dessa faixa, incluindo números inteiros dentro dessas faixas, e frações dos valores, a menos que o contexto indique claramente de outro modo.
[0138] Exceto onde indicado em contrário, o termo "ao menos" anterior a uma série de elementos deve ser entendido como se referindo a cada elemento na série. Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de verificar com o uso de não mais que experimentação de rotina, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes se destinam a ser abrangidos pela invenção.
[0139] Como usado na presente invenção, os termos
"compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "tem", "tendo", "contém" ou "contendo", ou qualquer outra variação dos mesmos, será entendido como implicando a inclusão de um número inteiro ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de inteiros e se destina a ser não exclusivo ou aberto Por exemplo, uma composição, uma mistura, um processo, um método, um artigo ou um aparelho que compreende um grupo de elementos não é necessariamente limitado apenas àqueles elementos mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal composição, mistura, processo, método, artigo ou aparelho. Além disso, exceto onde expressamente declarado em contrário, "ou" se refere a um "ou" inclusivo e não a um "ou" exclusivo. Por exemplo, uma condição A ou B é satisfeita por qualquer um dos seguintes: A é verdadeiro (ou está presente) e B é falso (ou não está presente), A é falso (ou não está presente) e B é verdadeiro (ou está presente), e tanto A como B são verdadeiros (ou estão presentes).
[0140] Como usado aqui, o termo conjuntivo "e/ou" entre múltiplos elementos mencionados é entendido como abrangendo ambas as opções individuais e combinadas. Por exemplo, quando dois elementos são co-unidos por "e/ou", uma primeira opção se refere à aplicabilidade do primeiro elemento sem o segundo. Uma segunda opção se refere à aplicabilidade do segundo elemento sem o primeiro. Uma terceira opção se refere à aplicabilidade do primeiro e do segundo elementos juntos. Entende-se que qualquer uma dessas opções se enquadra no significado, e portanto satisfazem o requisito do termo "e/ou" conforme usado na presente invenção. Também entende-se que a aplicabilidade simultânea de mais de uma das opções se enquadra no significado e, portanto, atende ao requisito do termo "e/ou".
[0141] Como usado na presente invenção, o termo "consiste em", ou variações como "consiste em" ou "consistindo em", conforme usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados, mas que nenhum número inteiro ou grupo adicional de números inteiros pode ser adicionado ao método, estrutura ou composição especificada.
[0142] Como usado na presente invenção, o termo "consiste essencialmente em, ou variações como "consiste essencialmente em" ou "consistindo essencialmente em", conforme usado ao longo do relatório descritivo e reivindicações, indica a inclusão de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados, e a inclusão opcional de qualquer número inteiro ou grupo de números inteiros mencionados que não alteram materialmente as propriedades básicas ou inovadoras do método, estrutura ou composição especificados. Consulte M.P.E.P. § 2111.03.
[0143] Para uso na presente invenção, "sujeito" significa qualquer animal, de preferência um mamífero, com a máxima preferência um ser humano. O termo "mamífero", como usado aqui, abrange qualquer mamífero. Exemplos de mamíferos incluem, mas não se limitam a, vacas, cavalos, ovelhas, porcos, gatos, cães, camundongos, ratos, coelhos, porquinhos da Índia, macacos, seres humanos, etc., com mais preferência, um ser humano.
[0144] Deve-se compreender, também, que os termos "cerca de", ou "aproximadamente", e "de modo geral", "substancialmente" e termos similares, usados na presente invenção quando se referem a uma dimensão ou característica de um componente da invenção preferencial, indicam que a dimensão/característica descrita não é um limite ou parâmetro estrito e não exclui variações menores da mesma que sejam funcionalmente iguais ou similares, como seria compreendido pelo versado na técnica. No mínimo, tais referências que incluem um parâmetro numérico podem incluir variações que, com o uso de princípios matemáticos e industriais aceitos na técnica (por exemplo,
arredondamento, medição ou outros erros sistemáticos, tolerâncias de fabricação, etc.), não variariam o dígito menos significativo.
[0145] Os termos "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos (por exemplo, anticorpo anti-CD33 anticorpos e polinucleotídeos que codificam os mesmos, anticorpos biespecíficos anti-CD33 anti-CD3 e polinucleotídeos que codificam os mesmos, polipeptídeos de CD33, e polinucleotídeos de CD33 que codificam os mesmos), se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para máxima correspondência, conforme medido com o uso de um dos algoritmos de comparação de sequência a seguir ou por inspeção visual.
[0146] Para a comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, à qual as sequências de teste são comparadas. Ao se usar um algoritmo de comparação de sequências, as sequências de teste e de referência são inseridas em um computador, as coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros de programa de algoritmo de sequência são designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula a porcentagem de identidade de sequência para a sequência (ou sequências) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros de programa designados.
[0147] O alinhamento ótimo de sequências para comparação pode ser feito, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pela pesquisa pelo método de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2.444 (1988), por implementações computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, EUA) ou por inspeção visual (consulte, em geral, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (Suplemento, 1995) (Ausubel)).
[0148] Exemplos de algoritmos que são adequados para determinar a porcentagem de identidade de sequência e a similaridade de sequências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3.389 a 3.402, respectivamente. O software para realizar análises de BLAST está disponível publicamente junto ao National Center for Biotechnology Information (Centro Nacional para Informação de Biotecnologia). Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de sequências de alta pontuação (HSPs) por identificação de palavras curtas de comprimento W na sequência de consulta, que que se correlacionam ou satisfazem alguma pontuação limite com valor positivo T quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência de dados. T é chamado de limite de pontuação de palavra de vizinhança (Altschulet et al., acima). Estes acertos iniciais de palavras vizinhas agem como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os acertos de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência até o ponto em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada.
[0149] As pontuações cumulativas são calculadas com o uso, por exemplo, de sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos correspondentes; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos não correspondentes;
sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão dos acertos de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa diminui pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai para zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou o fim de cada sequência é alcançado. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para sequências de nucleotídeos) usa como padrões um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação entre ambas as fitas. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa os padrões de um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte Henikoff & Henikoff, Proc Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915 (1989)).
[0150] Além de calcular a porcentagem de identidade de sequência, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similaridade entre duas sequências (consulte, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P (N)), que fornece uma indicação da probabilidade através da qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado similar a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação entre o ácido nucleico de teste e o ácido nucleico de referência é menor que cerca de 0,1, com mais preferência menor que cerca de 0,01, e com mais preferência menor que cerca de 0,001.
[0151] Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos ou polipeptídeos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo codificado pelo primeiro ácido nucleico é reativo de forma cruzada imunologicamente com o polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucleico, conforme descrito abaixo. Dessa forma, um polipeptídeo é substancialmente tipicamente idêntico a um segundo polipeptídeo, por exemplo, quando os dois peptídeos diferem apenas por substituições conservativas. Uma outra indicação de que duas sequências de ácidos nucleicos são substancialmente idênticas é que as duas moléculas hibridizam entre si sob condições estringentes, conforme descrito abaixo. Anticorpos
[0152] A invenção se refere, em geral, a anticorpos anti-CD33 isolados ou seus fragmentos de ligação a antígeno, ácidos nucleicos e vetores de expressão que codificam os anticorpos, células recombinantes contendo os vetores, e composições que compreendem os anticorpos. A invenção se refere adicionalmente a anticorpos anti- CD33 isolados ou seus fragmentos de ligação a antígeno, ácidos nucleicos e vetores de expressão que codificam os anticorpos, células recombinantes contendo os vetores, e composições que compreendem os anticorpos. Também são fornecidos, métodos para a produção dos anticorpos, e métodos para o uso dos anticorpos para tratar doenças incluindo câncer. Os anticorpos da invenção possuem uma ou mais propriedades funcionais desejáveis, incluindo, mas não se limitando a, ligação de alta afinidade a CD33 e/ou CD3, alta especificidade para CD33 e/ou CD3, e a capacidade de tratar ou evitar câncer quando administrados sozinhos ou em combinação com outras terapias anticâncer.
[0153] Em um aspecto geral, a invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a CD33. Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao domínio C2 de CD33. Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais isolados ou seus fragmentos de ligação ao antígeno se ligam ao domínio V de CD33.
[0154] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo" é usado em um sentido amplo e inclui moléculas de imunoglobulina ou anticorpos incluindo anticorpos e fragmentos de anticorpo humanos, humanizados, compósitos e anticorpos quiméricos que são monoclonais ou policlonais. Em geral, os anticorpos são proteínas ou cadeias peptídicas que apresentam especificidade de ligação para um antígeno específico. As estruturas de anticorpos são bem conhecidas. As imunoglobulinas podem ser divididas em cinco classes principais (isto é, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM), dependendo da sequência de aminoácidos do domínio constante da cadeia pesada. IgA e IgG são, ainda, subclassificados como os isótipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem ser de qualquer das cinco principais classes ou subclasses correspondentes. De preferência, os anticorpos da invenção são IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. As cadeias leves de anticorpos de espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, a saber, kappa (κ) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Consequentemente, os anticorpos da invenção podem conter um domínio constante de cadeia leve kappa ou lambda. De acordo com modalidades específicas, os anticorpos da invenção incluem regiões constantes de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de anticorpos de camundongos ou de seres humanos. Em adição aos domínios constantes pesados e leves, os anticorpos contêm uma região de ligação a antígeno que é composta de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada, cada uma das quais contém três domínios (isto é, regiões determinantes de complementaridade 1 a 3; CDR1, CDR2, e CDR3). Os domínios da região variável de cadeia leve são alternativamente chamados de LCDR1, LCDR2 e LCRD3, e os domínios da região variável de cadeia pesada são alternativamente chamados de HCDR1, HCRD2 e HCDR3.
[0155] Como usado aqui, o termo um "anticorpo isolado" se refere a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos tendo diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à CD33 é substancialmente isento de anticorpos que não se ligam a CD33). Além disso, um anticorpo isolado é substancialmente isento de outro material celular e/ou produto químico.
[0156] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo monoclonal" se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser produzidos pelo método de hibridoma, tecnologia de exibição de fago, tecnologia de clonagem de gene de linfócito único ou por métodos de DNA recombinante. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, como um camundongo ou rato transgênico, que tem um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve.
[0157] Para uso na presente invenção, o termo "fragmento de ligação de antígeno" se refere a um fragmento de anticorpo como, por exemplo, um diacorpo, um Fab, um Fab', um F(ab')2, um fragmento Fv (dsFv), um fragmento Fv, um dissulfeto estabilizadas fragmento Fv (dsFv), a (dsFv)2, um dsFv biespecífico dsFv-dsFv'), um diacorpo estabilizado por dissulfureto (diacorpo ds), uma molécula de anticorpo de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único (sdab), um dímero de scFv (diacorpo bivalente), um anticorpo multiespecífico formado a partir de uma porção de um anticorpo compreendendo uma ou mais CDRs, um anticorpo de domínio único camelizado, um nanocorpo, um anticorpo de domínio, um anticorpo de domínio bivalente ou qualquer outro fragmento de anticorpo que se liga a um antígeno, mas não compreende uma estrutura do anticorpo. Um fragmento de ligação a antígeno é capaz de se ligar ao mesmo antígeno ao qual o anticorpo parental ou um fragmento de anticorpo parental se liga. De acordo com modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia leve, uma região constante de cadeia leve e um segmento Fd da cadeia pesada. De acordo com outras modalidades específicas, o fragmento de ligação ao antígeno compreende Fab e F(ab').
[0158] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo de cadeia única" se refere a um anticorpo de cadeia única convencional no campo, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve conectadas por um peptídeo curto de cerca de 15 cerca de 20 aminoácidos. Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo de domínio único" se refere a um anticorpo de domínio único convencional no campo, que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região constante de cadeia pesada ou que compreende apenas uma região variável de cadeia pesada.
[0159] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo humano" se refere a um anticorpo produzido por um ser humano ou um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos que corresponde a um anticorpo produzido por um ser humano produzido usando-se qualquer técnica conhecida na técnica. Esta definição de um anticorpo humano inclui anticorpos intactos ou de comprimento total, seus fragmentos, e/ou anticorpos que compreendem ao menos um polipeptídeo de cadeia pesada e/ou de cadeia leve humanos.
[0160] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo humanizado" se refere a um anticorpo não humano que é modificado para aumentar a homologia de sequência àquela de um anticorpo humano, de modo que as propriedades de ligação ao antígeno do anticorpo sejam retidas, mas sua antigenicidade no corpo humano seja reduzida.
[0161] Para uso na presente invenção, o termo "anticorpo quimérico" se refere a um anticorpo em que a sequência de aminoácidos da molécula de imunoglobulina é derivada de duas ou mais espécies. A região variável de ambas as cadeias leve e pesada frequentemente corresponde à região variável de um anticorpo derivado de uma espécie de mamífero (por exemplo, camundongo, rato, coelho, etc.) com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas, enquanto as regiões constantes correspondem às sequências de um anticorpo derivado de outra espécie de mamífero (por exemplo, seres humanos) para evitar a indução de uma resposta imunológica naquela espécie.
[0162] Como usado aqui, o termo "anticorpo multiespecífico" se refere a um anticorpo que compreende uma pluralidade de sequências de domínio variável de imunoglobulina, sendo que uma primeira sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência de domínio variável de imunoglobulina da pluralidade tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, na mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem ou substancialmente se sobrepõem. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos não se sobrepõem ou não se sobrepõem substancialmente. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão em antígenos diferentes, por exemplo, as diferentes proteínas (ou subunidades diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, um anticorpo multiespecífico compreende um terceiro, quarto ou quinto domínio variável de imunoglobulina. Em uma modalidade, um anticorpo multiespecífico é uma molécula de anticorpo biespecífico, uma molécula de anticorpo triespecífico ou uma molécula de anticorpo tetraespecífico.
[0163] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo bisespecífico" se refere a um anticorpo multiespecífico que se liga a não mais do que dois epítopos ou dois antígenos. Um anticorpo biespecífico é caracterizado por uma primeira sequência do domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma segunda sequência do domínio variável de imunoglobulina que tem especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão no mesmo antígeno, por exemplo, na mesma proteína (ou subunidade de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos se sobrepõem ou substancialmente se sobrepõem. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo epítopos estão em antígenos diferentes, por exemplo, as diferentes proteínas (ou subunidades diferentes de uma proteína multimérica). Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia leve que têm especificidade de ligação para um primeiro epítopo e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada e uma sequência de domínio variável de cadeia leve que têm especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende um meio anticorpo, ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo e um meio anticorpo, ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo.
Em uma modalidade, um anticorpo biespecífico compreende um scFv, ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um primeiro epítopo, e um scFv, ou seu fragmento, tendo especificidade de ligação para um segundo epítopo. Em uma modalidade, o primeiro epítopo está situado em CD33 e o segundo epítopo está situado em CD3. Em uma modalidade, o primeiro epítopo está situado em CD33 e o segundo epítopo está situado em PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, EGFR, HER-2, CD19, CD20, CD3, e/ou outros supressores ou antígenos de superfície imunes associados a tumor.
[0164] Como usado na presente invenção, o termo "CD33" se refere a uma glicoproteína de transmembrana de passagem única que é um membro da família de lectinas semelhantes a imunoglobulina de ligação ao ácido siálico (Siglecs). A CD33 é também conhecida como Siglec-3, gp67, ou p67. A estrutura de CD33 consiste em um domínio V-set semelhante a Ig amino-terminal (codificado pelo éxon 2 de CD33) que medeia a ligação do ácido siálico e um domínio C2-set semelhante a Ig (codificado pelos éxons 3 e 4) em sua porção extracelular (Laszlo et al., 2016). O splicing alternativo de RNA de CD33 pode levar a uma isoforma mais curta que é expressa na superfície celular, que não tem o domínio V-, mas retém o domínio C2-set semelhante a Ig (Laszlo, Estey &, Walter, 2014; Laszlo et al., 2016). A importância biológica deste processo de splicing foi em grande parte desconhecida até que estudos recentes mostraram que um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) rs12459419 estava presente em ~50% da população de LMA e leva ao salto do éxon 2 de CD33, o que resulta na deleção do domínio V de CD33 (Lambda et al., 2017). O CD33 humano de comprimento total é fornecido pela Uniprot P20138 (SEQ ID NO:1).
[0165] Como aqui usado, um anticorpo que "se liga especificamente a CD33" se refere a um anticorpo que se liga a um CD33, de preferência um CD33 humano, de preferência o domínio C2 do CD33, com um KD dea KD de 1×10−7 M ou menos, de preferência, 1×10−8 M ou menos, com mais preferência, 5×10−9 M ou menos, 1×10−9 M ou menos, 5×10−10 M ou menos, ou 1×10−10 M ou menos. O termo "KD" se refere à constante de dissociação, que é obtida a partir da razão de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores de KD para os anticorpos podem ser determinados com o uso dos métodos na técnica em vista da presente revelação. Por exemplo, a KD de um anticorpo pode ser determinada com o uso de ressonância de plásmons de superfície, como com o uso de um sistema biossensor, por exemplo, um sistema Biacore®, ou com o uso de uma tecnologia de interferometria de biocamada, como um sistema Octet RED96.
[0166] Quanto menor o valor de KD de um anticorpo, a maior afinidade que o anticorpo se liga a um antígeno alvo.
[0167] De acordo com um aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreendendo uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), uma HCDR2, uma HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR2), uma LCDR2 e uma LCDR3 com as sequências de polipeptídeos das:
[0168] SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
[0169] SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente;
[0170] SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente;
[0171] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente;
[0172] SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente;
[0173] SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente;
[0174] SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente;
[0175] SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente;
[0176] SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente;
[0177] SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0178] SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0179] SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente;
[0180] SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente;
[0181] SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente;
[0182] SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente;
[0183] SEQ ID NOs:351, 352, 353, 474, 475, e 476, respectivamente;
[0184] SEQ ID NOs:357, 358, 359, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0185] SEQ ID NOs:372, 373, 374, 495, 496, e 497, respectivamente;
[0186] SEQ ID NOs:375, 376, 377, 498, 499, e 500, respectivamente;
[0187] SEQ ID NOs:381, 382, 383, 504, 505, e 506, respectivamente;
[0188] SEQ ID NOs:384, 385, 386, 507, 508, e 509, respectivamente;
[0189] SEQ ID NOs:390, 391, 392, 510, 511, e 512, respectivamente;
[0190] SEQ ID NOs:393, 394, 395, 513, 514, e 515, respectivamente;
[0191] SEQ ID NOs:396, 397, 398, 516, 517, e 518, respectivamente;
[0192] SEQ ID NOs:399, 400, 401, 519, 520, e 521, respectivamente;
[0193] SEQ ID NOs:405, 406, 407, 525, 526, e 527, respectivamente;
[0194] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 534, 535, e 536, respectivamente;
[0195] SEQ ID NOs:417, 418, 419, 537, 538, e 539, respectivamente;
[0196] SEQ ID NOs:420, 421, 422, 540, 541, e 542, respectivamente;
[0197] SEQ ID NOs:429, 430, 431, 549, 550, e 551, respectivamente;
[0198] SEQ ID NOs:432, 433, 434, 552, 553, e 554, respectivamente;
[0199] SEQ ID NOs:435, 436, 437, 555, 556, e 557, respectivamente;
[0200] SEQ ID NOs:438, 439, 440, 558, 559, e 560, respectivamente;
[0201] SEQ ID NOs:441, 442, 443, 561, 562, e 563, respectivamente;
[0202] ii. SEQ ID NOs:450, 451, 452, 570, 571, e 572, respectivamente;
[0203] SEQ ID NOs:453, 454, 455, 573, 574, e 575, respectivamente;
[0204] SEQ ID NOs:456, 457, 458, 576, 577, e 578, respectivamente;
[0205] SEQ ID NOs: 459, 460, 461, 579, 580, e 581, respectivamente;
[0206] SEQ ID NOs: 378, 379, 380, 582, 583, e 584, respectivamente;
[0207] SEQ ID NOs: 414, 415, 416, 585, 586, e 587, respectivamente; ou
[0208] SEQID NOs: 429, 430, 431, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0209] sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente ao CD33, de preferência, CD33 humano.
[0210] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos de ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma dentre as SEQ ID NOs:259 a 296, ou uma região varável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a um dentre as SEQ ID NOs:300 a 338. De acordo com uma modalidade preferencial, o anticorpo monoclonal isolado ou o seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos de ao menos 85%, de preferência 90, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma dentre as SEQ ID Nos:259 a 296, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma dentre as SEQ ID Nos:300 a 338, respectivamente.
[0211] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, que compreende:
[0212] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332;
[0213] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331;
[0214] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302;
[0215] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310;
[0216] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322;
[0217] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300;
[0218] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304;
[0219] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305;
[0220] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306;
[0221] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307;
[0222] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307;
[0223] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317;
[0224] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319;
[0225] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324;
[0226] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325;
[0227] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301;
[0228] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303;
[0229] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:267, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:308;
[0230] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309;
[0231] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:270 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:311;
[0232] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312;
[0233] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313;
[0234] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314;
[0235] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315;
[0236] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316;
[0237] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318;
[0238] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321;
[0239] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:282, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322;
[0240] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323;
[0241] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326;
[0242] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327;
[0243] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:288, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:328;
[0244] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329;
[0245] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330;
[0246] ii. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:293, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:333;
[0247] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334;
[0248] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335;
[0249] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336;
[0250] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337;
[0251] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338; ou
[0252] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303.
[0253] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:300. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300.
[0254] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3,
tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:351, 352, 353, 474, 475, e 476, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:260, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:301. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301.
[0255] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:302. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301.
[0256] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:357, 358, 359, 480, 481, e 482, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:262, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:303. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303.
[0257] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95%, ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou
99% idêntica à SEQ ID NO:304. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304.
[0258] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:305. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305.
[0259] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:306. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306.
[0260] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:307. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307.
[0261] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:372, 373, 374,
495, 496, e 497, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:267, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:308. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:267; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:308.
[0262] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:375, 376, 377, 498, 499, e 500, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:309. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309.
[0263] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:310. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310.
[0264] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:381, 382, 383, 504, 505, e 506, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95%, ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:270, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:311. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:270; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:311.
[0265] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:384, 385, 386, 507, 508, e 509, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:312. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312.
[0266] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%
idêntica à SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:307. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307.
[0267] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:390, 391, 392, 510, 511, e 512, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:313. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313.
[0268] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:357, 393, 394, 395,513, 54, e 515, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:314. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314.
[0269] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:396, 397, 398, 516, 517, e 518, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:315. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315.
[0270] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:399, 400, 401, 519, 520, e 521, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:316. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316.
[0271] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:317. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317.
[0272] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:405, 406, 407, 525, 526, e 527, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:318. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318.
[0273] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:319. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319.
[0274] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:320. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:320.
[0275] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:414, 415, 416, 534, 535, e 536, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:321. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321.
[0276] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:417, 418, 419, 537, 538, e 539, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:282, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:322. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:282; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322.
[0277] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:420, 421, 422, 540, 541, e 542, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:323. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323.
[0278] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:324. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324.
[0279] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:325. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325.
[0280] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:429, 430, 431, 549, 550, e 551, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%,
com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:326. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326.
[0281] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:432, 433, 434, 552, 553, e 554, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:287, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:327. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327.
[0282] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:435, 436, 437, 555, 556, e 557, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:288, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:328. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:288; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:328.
[0283] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:438, 439, 440, 558, 559, e 560, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:329. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329.
[0284] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3,
tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:441, 442, 443, 561, 562, e 563, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:330. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330.
[0285] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:291, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:331. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331.
[0286] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:292, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:332. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332.
[0287] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:450, 451, 452, 570, 571, e 572, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:293, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou
99% idêntica à SEQ ID NO:333. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:293; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:333.
[0288] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:453, 454, 455, 573, 574, e 575, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:334. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334.
[0289] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:456, 457, 458, 576, 577, e 578, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:335. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335.
[0290] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:459, 460, 461, 579, 580, e 581, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:336. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336.
[0291] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:378, 379, 380,
582, 583, e 584, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:337. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337.
[0292] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:414, 415, 416, 585, 586, e 587, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:338. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338.
[0293] Em uma modalidade, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:429, 430, 431, 480, 481, e 482, respectivamente. Em uma outra modalidade, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:303. De preferência, o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286; e uma região variável da cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303.
[0294] São também aqui fornecidos anticorpos biespecíficos anti- CD33/anti-CD3 ou seus fragmentos de ligação a antígeno, que compreendem um anticorpo anti-CD3 ou um seu fragmento de ligação a antígeno e um anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno, Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da HCDR3 invenção e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das (1) SEQ ID NOs: 342, 343, 344, 465, 466, e 467, respectivamente, ou (2) SEQ ID NOs:345, 346, 347,
468, 469, e 470, respectivamente.
[0295] O termo "CD3" se refere ao complexo de múltiplas subunidades da proteína CD3. CD3 pode também ser chamado de "agrupamento de diferenciação 3". O complexo de múltiplas subunidades de proteína CD3 é composto de seis (6) cadeias distintas de polipeptídeo, que incluem uma cadeia de CD3γ (SwissProt P09693) (SEQ ID NO:588), uma cadeia CD3δ (SwissProt P04234) (SEQ ID NO:589), duas cadeias CD3ε (SwissProt P07766) (SEQ ID NO:590), e um homodímero de cadeia CD3ζ (SwissProt 20963) (SEQ ID NO:591), que está associado com o receptor de células T α e β cadeia. CD3 é co- receptor de células T que funciona para ativar a célula T citotóxica (células T naïve de CD8+) e também as células T-helper (células T naïve de CD4+). As cadeias de polipeptídeos de CD3γ, CD3δ, e CD3ε do complexo de múltiplas unidades de CD3 se associam com o receptor de células T (TCR) e a cadeia de CD3ζ para gerar um sinal de ativação em linfócitos T, e a interação entre CD3 e o receptor de células T constitui o complexo de TCR. O termo "CD3" inclui qualquer variante, isoforma e espécie homóloga de CD3 que é naturalmente expressa por células (incluindo células T) ou pode ser expressa em células transfectadas com genes ou cDNA codificando aqueles polipeptídeos, a menos que seja especificado, de preferência, "CD3" é um complexo de múltiplas subunidades da proteína CD3.
[0296] O redirecionamento de linfócitos T para células de câncer que expressam CD33 através do complexo TCR/CD3 representa uma abordagem alternativa atrativa. O complexo TCR/CD3 dos linfócitos T consiste em um heterodímero de quer TCR alfa (α)/beta (β) ou TCR gama (γ)/delta (δ) coexpressado na superfície celular com as subunidades invariantes de CD3 marcadas gama (γ), delta (δ), épsilon (ε), zeta (ζ), e eta (η). O CD3ε humano é descrito sob UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). Um anticorpo anti-CD3ε descrito no estado da técnica é SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100), que reage com CD3 de primatas e humanos e está disponível comercialmente junto à Pharmingen. Anticorpos anti-CD3 adicionais descritos no estado da técnica incluem UCHT-1 (consulte WO2000041474) e BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; usado em testes de Fases I/II de GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 difere do UCHT-1 e do BC-3 pelo fato de que o SP-34 reconhece um epítopo presente somente na cadeia ε de CD3 (consulte Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047) enquanto que UCHT-1 e BC-3 reconhecem um epítopo presente em ambas as cadeias ε e γ. Sequências de anticorpo com a mesma sequência de SP34 são descritas ao menos em WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837 e WO2010037838. Uma sequência de anticorpos que é 96% idêntica à VH de SP34 é descrita em US8236308 (WO2007042261).
[0297] Diferentes formatos de anticorpos biespecíficos foram descritos e foram recentemente analisados por Chames e Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276.
[0298] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico da presente invenção é um diacorpo, um anticorpo cruzado (cross-body) ou um anticorpo biespecífico obtido através de uma troca controlada de braço Fab como aqueles descritos na presente invenção.
[0299] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos incluem moléculas do tipo IgG com domínios CH3 complementares para forçar a heterodimerização; moléculas de direcionamento dual do tipo IgG recombinantes, em que os dois lados da molécula, cada um contém o fragmento Fab ou parte do fragmento Fab de ao menos dois anticorpos diferentes; moléculas de fusão com IgG, sendo que os anticorpos IgG de comprimento total são integrados a um fragmento Fab extra ou partes do fragmento Fab; moléculas de fusão Fc, em que as moléculas Fv de cadeia única ou diacorpos estabilizados são fusionados a domínios constantes de cadeia pesada, regiões Fc ou partes das mesmas; moléculas de fusão Fab, sendo que diferentes fragmentos Fab são fusionados juntos; anticorpos com base em ScFv e diacorpos e de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) em que diferentes moléculas Fv de cadeia única ou diferentes diacorpos ou diferentes anticorpos de cadeia pesada (por exemplo, anticorpos de domínio, nanocorpos) são fusionados entre si ou a uma outra proteína ou molécula carreadora.
[0300] Em algumas modalidades, moléculas semelhantes a IgG com moléculas de domínios CH3 complementares incluem Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knobs-into- Holes (Genentech), CrossMAbs (Roche) e eletrostaticamente correlacionadas (Amgen), LUZ-Y (Genentech), o corpo de domínio manipulado de troca de cadeia (SEEDbody)(EMD Serono), Biclonic (Merus) e DuoBody (Genmab A/S).
[0301] Em algumas modalidades, as moléculas de direcionamento dual semelhantes a IgG incluem Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis), Two-in-one Antibody (Genentech), Cross-linked Mabs (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) e CovX-body (CovX/Pfizer).
[0302] Em algumas modalidades, as moléculas de fusão de IgG incluem Dual Variable Domain (DVD)-Ig (Abbott), IgG-like Bispecific (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) e BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) e TvAb (Roche).
[0303] Em algumas modalidades, as moléculas de fusão incluem as Fusões ScFv/Fc Fusions (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics) e Dual(ScFv).sub.2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China).
[0304] Em algumas modalidades, os anticorpos biespecíficos de fusão Fab incluem F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Dual-Action ou Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), Bivalent Bispecific (Biotecnol) e Fab-Fv (UCB-Celltech). Anticorpos ScFv, com base em diacorpos e de domínio incluem, mas não se limitam a, fragmento de mAb biespecífico com redirecionamento de células T (Bispecific T Cell Engager, BiTE) (Micromet), diacorpo em tandem (Tandab) (Affimed), Tecnologia de redirecionamento de afinidade dupla (DART) (MacroGenics), diacorpo de cadeia simples (Academic), anticorpos similares a TCR (AIT, ReceptorLogics), Fusão de ScFv de Albumina Sérica Humana (Merrimack) e COMBODY (Epigen Biotech), nanocorpos de direcionamento duplo (Ablynx), anticorpos de domínio de apenas com cadeia pesada e de direcionamento duplo.
[0305] Os anticorpos biespecíficos de comprimento total da invenção podem ser gerados, por exemplo, usando troca de braço Fab (ou troca de metade da molécula) entre dois anticorpos bivalentes monoespecíficos por meio da introdução de substituições na interface CH3 de cadeia pesada em cada metade da molécula para favorecer a formação de heterodímero das duas metades de moléculas do anticorpo tendo especificidade distinta ou no ambiente isento de células in vitro ou usando coexpressão. A reação de troca do braço Fab é o resultado de uma reação de isomerização de ponte dissulfeto e dissociação- associação de domínios CH3. As pontes dissulfetos de cadeia pesada nas regiões de dobradiça dos anticorpos monoespecíficos parentais são reduzidas. As cisteínas livres resultantes de um dos anticorpos monoespecíficos parentais formam uma ponte dissulfeto de cadeia pesada com resíduos de cisteína de uma segunda molécula de anticorpo monoespecífico parental, e, simultaneamente, domínios CH3 dos anticorpos parentais liberam e reformam pela dissociação- associação. Os domínios CH3 dos braços Fab podem ser manipulados para favorecer a heterodimerização em relação à homodimerização. O produto resultante é um anticorpo biespecífico tendo dois braços Fab ou metades de moléculas que, se ligam, cada um(a), a um epítopo diferente, isto é, um epítopo em CD33 e um epítopo em CD3.
[0306] "Homodimerização", como usado aqui, refere-se a uma interação de duas cadeias pesadas tendo sequências de aminoácidos CH3 idênticas. "Homodímero", como usado aqui, refere-se a um anticorpo tendo duas cadeias pesadas com sequência de aminoácidos CH3 idênticas.
[0307] "Heterodimerização", como usado aqui, refere-se a uma interação de duas cadeias pesadas tendo sequências de aminoácidos CH3 não idênticas. "Heterodímero", como usado aqui, refere-se a um anticorpo tendo duas cadeias pesadas com sequências de aminoácidos CH3 não idênticas.
[0308] A estratégia "knob-in-hole", ou botão no orifício (consulte, por exemplo, a publicação PCT. internacional n° WO 2006/028936), pode ser usada para gerar anticorpos biespecíficos de comprimento total. Resumidamente, os aminoácidos selecionados que formam a interface dos domínios CH3 na IgG humana podem ser mutados em posições que afetam as interações do domínio CH3 para promover a formação de heterodímero. Um aminoácido com uma cadeia lateral (orifício) é introduzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um primeiro antígeno e um aminoácido com uma cadeia lateral grande (botão) é introduzido em uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga especificamente a um segundo antígeno. Após a coexpressão dos dois anticorpos, um heterodímero é formado como resultado da interação preferencial de cadeia pesada com um "orifício" com a cadeia pesada com um "botão". Pares de substituição de CH3 exemplificadores que formam um botão e um orifício são (expressos como posição modificada no primeiro domínio CH3 da primeira posição de cadeia pesada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda cadeia pesada): T366Y/F405A, T366W/ F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S e T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0309] Outras estratégias, como promoção da heterodimerização de cadeia pesada usando interações eletrostáticas através da substituição de resíduos carregados positivamente em uma superfície CH3 e resíduos negativamente carregados em uma segunda superfície CH3 podem ser usados, conforme descrito na publicação de patente US n° 2010/0015133; publicação de patente US n° US2009/0182127; publicação de patente US n° US2010/028637, ou publicação de patente US n° 2011/0123532. Em outras estratégias, a heterodimerização pode ser promovida pelas seguintes substituições (expressas como posição modificada no primeiro domínio CH3 da primeira posição de cadeia pesada/posição modificada no segundo domínio CH3 da segunda cadeia pesada): L351Y_F405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, ou T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W conforme descrito na publicação de patente US n° US2012/0149876, publicação de patente US n° US2013/0195849.
[0310] Além dos métodos descritos anteriormente, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser gerados in vitro em um ambiente livre de células através da introdução de mutações assimétricas nas regiões de CH3 de dois anticorpos homodiméricos monoespecíficos e da formação do anticorpo heterodimérico biespecífico de dois anticorpos homodiméricos monoespecíficos parentais em condições redutoras para permitir a isomerização da ligação dissulfeto de acordo com os métodos descritos na publicação de patente internacional n° W02011/131746. Nos métodos, o primeiro anticorpo bivalente monoespecífico (por exemplo, anticorpo anti-CD33) e o segundo anticorpo bivalente monoespecífico (por exemplo, anticorpo anti-CD3) são manipulados para terem determinadas substituições no domínio CH3 que promovem estabilidade do heterodímero; os anticorpos são incubados juntos sob condições redutoras suficientes para permitir que as cisteínas na região da dobradiça sofram isomerização da ligação de dissulfeto; gerando, assim, o anticorpo biespecífico pela troca do braço do Fab. As condições de incubação podem ser idealmente restauradas para condições não redutoras. Agentes redutores exemplificadores que podem ser usados são 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutationa, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L- cisteína e beta-mercaptoetanol, de preferência, um agente redutor selecionado do grupo que consiste em: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol e tris(2-carboxietil)fosfina. Por exemplo, a incubação durante ao menos 90 min, a uma temperatura de ao menos 20 °C na presença de 25 mM de 2-MEA ou na presença de ao menos 0,5 mM de ditiotreitol a um pH 5-8, por exemplo, pH 7,0 ou pH 7,4, pode ser usada.
[0311] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo a sequência de polipeptídeos das:
[0312] SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
[0313] SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente;
[0314] SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente;
[0315] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente;
[0316] SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente;
[0317] SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente;
[0318] SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente;
[0319] SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente;
[0320] SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente;
[0321] SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0322] SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0323] SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente;
[0324] SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente;
[0325] SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente;
[0326] SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente;
[0327] SEQ ID NOs:357, 358, 359, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0328] SEQ ID NOs:372, 373, 374, 495, 496, e 497, respectivamente;
[0329] SEQ ID NOs:375, 376, 377, 498, 499, e 500, respectivamente;
[0330] SEQ ID NOs:381, 382, 383, 504, 505, e 506, respectivamente;
[0331] SEQ ID NOs:384, 385, 386, 507, 508, e 509, respectivamente;
[0332] SEQ ID NOs:390, 391, 392, 510, 511, e 512, respectivamente;
[0333] SEQ ID NOs:393, 394, 395, 513, 514, e 515, respectivamente;
[0334] SEQ ID NOs:396, 397, 398, 516, 517, e 518, respectivamente;
[0335] SEQ ID NOs:399, 400, 401, 519, 520, e 521, respectivamente;
[0336] SEQ ID NOs:405, 406, 407, 525, 526, e 527, respectivamente;
[0337] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 534, 535, e 536, respectivamente;
[0338] SEQ ID NOs:417, 418, 419, 537, 538, e 539, respectivamente;
[0339] SEQ ID NOs:420, 421, 422, 540, 541, e 542, respectivamente;
[0340] SEQ ID NOs:429, 430, 431, 549, 550, e 551, respectivamente;
[0341] SEQ ID NOs:432, 433, 434, 552, 553, e 554, respectivamente;
[0342] SEQ ID NOs:435, 436, 437, 555, 556, e 557, respectivamente;
[0343] SEQ ID NOs:438, 439, 440, 558, 559, e 560, respectivamente;
[0344] SEQ ID NOs:441, 442, 443, 561, 562, e 563, respectivamente;
[0345] SEQ ID NOs:450, 451, 452, 570, 571, e 572, respectivamente;
[0346] ii. SEQ ID NOs:453, 454, 455, 573, 574, e 575, respectivamente;
[0347] SEQ ID NOs:456, 457, 458, 576, 577, e 578, respectivamente;
[0348] SEQ ID NOs:459, 460, 461, 579, 580, e 581, respectivamente;
[0349] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 582, 583, e 584, respectivamente;
[0350] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 585, 586, e 587, respectivamente; ou
[0351] SEQID NOs:429, 430, 431, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0352] e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[0353] SEQ ID NOs: 342, 343, 344, 465, 466, e 467, respectivamente; ou
[0354] SEQ ID NOs: 345, 346, 347, 468, 469, e 470, respectivamente.
[0355] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos de ao menos 85 99%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma dentre as SEQ ID NOs:259 a 296, ou uma região varável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%
idêntica a um dentre as SEQ ID NOs:300 a 338. e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos de ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95%, ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:257 ou 258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 85%, de preferência 90%, com mais preferência 95% ou mais, como 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica à SEQ ID NO:298 ou 299.
[0356] Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico isolado anti-CD33/anti-CD3, ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende:
[0357] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0358] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0359] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0360] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0361] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0362] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0363] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0364] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0365] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0366] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0367] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0368] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0369] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0370] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0371] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0372] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0373] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0374] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:267, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:308; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0375] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0376] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:270 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:311; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0377] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0378] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0379] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0380] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0381] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0382] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0383] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0384] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:282, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0385] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0386] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0387] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0388] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:288, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:328; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0389] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0390] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0391] ii. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:293, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:333; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0392] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0393] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0394] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0395] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0396] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0397] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0398] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0399] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0400] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0401] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0402] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0403] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0404] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0405] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0406] xx. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0407] yy. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0408] zz. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0409] aaa. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0410] bbb. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0411] ccc. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; ou
[0412] ddd. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0413] eee. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0414] fff. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0415] ggg. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:267, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:308; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0416] hhh. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0417] iii. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:270, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:311; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0418] jjj. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0419] kkk. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0420] lll. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0421] mmm. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0422] nnn. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0423] ooo. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0424] ppp. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0425] qqq. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:282, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0426] rrr. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0427] sss. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0428] ttt. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0429] uuu. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:288, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:328; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0430] vvv. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0431] www. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0432] xxx. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:293, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:333; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0433] yyy. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0434] zzz. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0435] aaaa. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0436] bbbb. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0437] cccc. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; ou
[0438] dddd. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299.
[0439] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal anti-CD33 isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que a induz citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC). O anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode, por exemplo, induzir ADCC in vitro. O anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode induzir ADCC com uma EC50 menor que cerca de 2 nM. Em certas modalidades, a EC50 é menor que cerca de 2,0 nM, menor que cerca de 1,9 nM, menor que cerca de 1,8 nM, menor que cerca de 1,7 nM, menor que cerca de 1,6 nM, menor que cerca de 1,5 nM, menor que cerca de 1,4 nM, menor que cerca de 1,3 nM, menor que cerca de 1,2 nM, menor que cerca de 1,1 nM, menor que cerca de 1,0 nM, menor que cerca de 0,9 nM, menor que cerca de 0,8 nM, menor que cerca de 0,7 nM, menor que cerca de 0,6 nM, menor que cerca de 0,5 nM, menor que cerca de 0,4 nM, menor que cerca de 0,3 nM, menor que cerca de 0,2 nM, ou menor que cerca de 0,1 nM. Em certas modalidades, o anticorpo monoclonal CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia principal de IgG1 com baixo teor de fucose.
[0440] Em algumas modalidades aqui descritas, as propriedades de efetor imunológico dos anticorpos específicos para CD33 podem ser acentuadas ou silenciadas através de modificações em Fc por técnicas conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo, as funções efetoras de Fc como a ligação de Clq, citotoxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo, regulação negativa de receptores de superfície de célula (por exemplo, receptor de célula B; BCR), etc. podem ser fornecidas e/ou controladas por meio da modificação dos resíduos no Fc responsável por essas atividades.
[0441] A "citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpo" ou "ADCC" se refere a uma reação mediada por células na qual células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado em uma célula-alvo e, subsequentemente, causam a lise da célula-alvo.
[0442] A capacidade dos anticorpos monoclonais de induzir ADCC pode ser intensificada por manipulação de seu componente oligossacarídeo. A IgG1 e a IgG3 humanas são N-glicosiladas em Asn297 com a maior parte dos glicanos nas formas biantenárias G0, G0F, G1, G1F, G2 ou G2F bem conhecidas. Os anticorpos produzidos pelas células CHO não manipuladas tipicamente têm um teor de glicano fucose de ao menos 85%. A remoção da fucose de núcleo dos oligossacarídeos do tipo complexo biantenário ligados às regiões Fc aumenta a ADCC dos anticorpos através da ligação Fc.gama.RIIIa melhorada sem alterar a ligação do antígeno ou atividade da CDC. Estes mAbs podem ser obtidos com o uso de diferentes métodos relatados por levar à expressão bem-sucedida de anticorpos relativamente altamente defucosilados com o tipo complexo biantenário de oligossacarídeos de Fc como controle da osmolalidade da cultura (Konno et al., Cytotechnology 64:249 a 265, 2012), aplicação de uma linhagem CHO variante Lec13 como linhagem celular hospedeira (Shields et al., J Biol Chem 277:26.733 a 26.740, 2002), aplicação de uma linhagem CHO variante EB66 como linhagem celular hospedeira (Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; publicado eletronicamente antes da impressão; PMID:20562582), aplicação de uma linhagem celular de hibridoma de rato YB2/0 como a linhagem celular hospedeira (Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3.466 a 3.473, 2003), introdução de pequeno RNA de interferência especificamente contra o gene de α-1,6- fucosiltrasferase (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng88:901 a 908, 2004), ou coexpressão de β-1,4-N-acetilglicosaminiltransferase III e α- manosidase de Golgi II ou um potente inibidor de alfa-manosidase I, cifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem281:5.032 a 5.036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851 a 861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
[0443] Em algumas modalidades aqui descritas, a ADCC induzida pelos anticorpos CD33 pode também ser aumentada por certas substituições no Fc do anticorpo. As substituições exemplificadoras são, por exemplo, substituições nas posições de aminoácidos 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 ou 430 (numeração de resíduos de acordo com o índice EU), como descrito na patente US n° 6.737.056.
[0444] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que é capaz de ligar CD33 com uma constante de dissociação (KD) menor que cerca de 5 x 10-8 M. Em certas modalidades, a constante de dissociação é menor que cerca de 5 x 10- 8 M, menor que 1 x 10-8 M, menor que 5 x 10-9 M, menor que 1 x 10-9 M, menor que 5 x 10-10 M, menor que 1 x 10-10 M, menor que 5 x 10- 11 M, ou menor que 1 x 10-11 M.
[0445] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal isolado anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que é capaz de ligar CD33 e induzir a internalização de CD33 com uma EC50 menor que cerca de 2 nM. Em certas modalidades, a EC50 é menor que cerca de 2,0 nM, menor que cerca de 1,9 nM, menor que cerca de 1,8 nM, menor que cerca de 1,7 nM, menor que cerca de 1,6 nM, menor que cerca de 1,5 nM, menor que cerca de 1,4 nM, menor que cerca de 1,3 nM, menor que cerca de 1,2 nM, menor que cerca de 1,1 nM, menor que cerca de 1,0 nM, menor que cerca de 0,9 nM, menor que cerca de 0,8 nM, menor que cerca de 0,7 nM, menor que cerca de 0,6 nM, menor que cerca de 0,5 nM, menor que cerca de 0,4 nM, menor que cerca de 0,3 nM, menor que cerca de 0,2 nM, e menor que cerca de 0,1 nM.
[0446] De acordo com outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno capaz de induzir a citotoxicidade dependente de células T em células que expressam CD33. O anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno pode, por exemplo, induzir a citotoxicidade dependente de células T em células que expressam CD33 in vitro com um valor de EC50 menor que cerca de 2 nM. Em certas modalidades, a EC50 é menor que cerca de 2,0 nM, menor que cerca de 1,9 nM, menor que cerca de 1,8 nM, menor que cerca de 1,7 nM, menor que cerca de 1,6 nM, menor que cerca de 1,5 nM, menor que cerca de 1,4 nM, menor que cerca de 1,3 nM, menor que cerca de 1,2 nM, menor que cerca de 1,1 nM, menor que cerca de 1,0 nM, menor que cerca de 0,9 nM, menor que cerca de 0,8 nM, menor que cerca de 0,7 nM, menor que cerca de 0,6 nM, menor que cerca de 0,5 nM, menor que cerca de 0,4 nM, menor que cerca de 0,3 nM, menor que cerca de 0,2 nM, e menor que cerca de 0,1 nM.
[0447] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal anti-CD33 isolado e/ou a um anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, sendo que o anticorpo monoclonal anti-CD33 ou o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno é quimérico.
[0448] De acordo com um outro aspecto específico, a invenção se refere a um anticorpo monoclonal anti-CD33 isolado e/ou a um anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, sendo que o anticorpo monoclonal anti-CD33 ou o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno é humano ou humanizado.
[0449] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Será entendido pelos versados na técnica que a sequência de codificação de uma proteína pode ser alterada (por exemplo,
substituída, deletada, inserida, etc.) sem alterar a sequência de aminoácidos da proteína. Consequentemente, será entendido pelos versados na técnica que sequências de ácido nucleico que codificam anticorpos e/ou anticorpos biespecíficos da invenção podem ser alteradas sem modificar as sequências de aminoácidos das proteínas.
[0450] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção. Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um vetor que compreende um ácido nucleico isolado que codifica anticorpos monoclonais ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Qualquer vetor conhecido pelos versados na técnica, em vista da presente revelação, pode ser usado, como um plasmídeo, cosmídeo, um vetor de fago ou um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão recombinante como um plasmídeo. O vetor pode incluir qualquer elemento para estabelecer uma função convencional de um vetor de expressão, por exemplo, um promotor, elemento de ligação ao ribossoma, terminador, intensificador, marcador de seleção e origem de replicação. O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou reprimível. Vários vetores de expressão capazes de liberar ácidos nucleicos a uma célula são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção para a produção de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na célula. Técnicas de clonagem convencionais ou síntese de gene artificiais podem ser usadas para gerar um vetor de expressão recombinante de acordo com as modalidades da invenção. Tais técnicas são bem conhecidas pelos versados na técnica em vista da presente revelação.
[0451] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo monoclonal e/ou anticorpo biespecífico ou um seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Qualquer célula hospedeira conhecida pelos versados na técnica em vista da presente revelação pode ser utilizada para a expressão recombinante de anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção. Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células TG1 ou BL21 de E. coli (para expressão de, por exemplo, um anticorpo scFv ou Fab), células CHO-DG44 ou CHO-K1 ou células de HEK293 (para expressão de, por exemplo, um anticorpo IgG de comprimento total). De acordo com modalidades específicas, o vetor de expressão recombinante é transformado em células hospedeiras por métodos convencionais como transfecção química, choque térmico, ou eletroporação, onde ele é integrado de maneira estável ao genoma da célula hospedeira, de modo que o ácido nucleico recombinante é expresso de forma eficaz.
[0452] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método para produzir um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo sob condições para produzir um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da célula ou cultura celular (por exemplo, do sobrenadante). Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método para produzir um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, e recuperar o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da célula ou da cultura celular
(por exemplo, do sobrenadante). Os anticorpos expressos ou seus fragmentos de ligação ao antígeno podem ser colhidos das células e purificados de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica e conforme aqui descrito. Composições farmacêuticas
[0453] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo biespecífico isolado ou um seu fragmento de ligação a antígeno da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "composição farmacêutica" como usada na presente invenção significa um produto que compreende um anticorpo da invenção em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os anticorpos da invenção e as composições que os compreendem também são úteis na fabricação de um medicamento para as aplicações terapêuticas mencionadas na presente invenção.
[0454] Como usado na presente invenção, o termo "veículo" se refere a qualquer excipiente, diluente, carga, sal, tampão, estabilizante, solubilizante, óleo, lipídio, vesícula contendo lipídio, microesfera, encapsulação em lipossomas ou outro material bem conhecido na técnica para uso em formulações farmacêuticas. Deve-se compreender que as características do veículo, excipiente ou diluente dependerão da via de administração para uma aplicação específica. Como usado aqui, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um material não tóxico que não interfere com a eficácia de uma composição de acordo com a invenção ou com a atividade biológica de uma composição de acordo com a invenção. De acordo com modalidades específicas, em vista da presente revelação, qualquer veículo farmaceuticamente aceitável adequado ao uso na composição farmacêutica de anticorpo pode ser usado na invenção.
[0455] A formulação de ingredientes farmaceuticamente ativos com veículos farmaceuticamente aceitáveis é conhecida na técnica, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (por exemplo, 21a edição (2005), e quaisquer edições posteriores). Exemplos não limitadores de ingredientes adicionais incluem: tampões, diluentes, solventes, agentes reguladores de tonicidade, conservantes, estabilizantes e agentes quelantes. Um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados na formulação das composições farmacêuticas da invenção.
[0456] Em uma modalidade da invenção, a composição farmacêutica é uma formulação líquida. Um exemplo preferencial de uma formulação líquida é uma formulação aquosa, isto é, uma formulação que compreende água. A formulação líquida pode compreender uma solução, uma suspensão, uma emulsão, uma microemulsão, um gel e similares. Uma formulação aquosa compreende tipicamente ao menos 50% em peso/peso de água, ou ao menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou ao menos 95% em peso/peso de água.
[0457] Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser formulada como um injetável que pode ser administrado, por exemplo, por meio de um dispositivo de injeção (por exemplo, uma seringa ou uma bomba de infusão). A injeção pode ser administrada por via subcutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa, por exemplo.
[0458] Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma formulação sólida, por exemplo, uma composição seca por congelamento ou seca por atomização, que pode ser usada como é, ou ao qual o médico ou o paciente adiciona solventes, e/ou diluentes antes do uso. As formas de dosagem sólidas podem incluir comprimidos, como comprimidos compactados, e/ou comprimidos revestidos, e cápsulas (por exemplo, cápsulas de gelatina dura ou macia). A composição farmacêutica pode também estar sob a forma de sachês, drágeas, pós, grânulos, pastilhas ou pós para reconstituição, por exemplo.
[0459] As formas de dosagem podem ser de liberação imediata, caso em que podem compreender um veículo solúvel em água ou dispersível, ou podem ser de liberação retardada, liberação sustentada ou liberação modificada, caso em que podem compreender polímeros insolúveis em água que regulam a taxa de dissolução da forma de dosagem no trato gastrointestinal ou sob a pele.
[0460] Em outras modalidades, a composição farmacêutica pode ser administrada por via intranasal, intrabucal ou sublingual.
[0461] O pH em uma formulação aquosa pode estar entre pH 3 e pH 10. Em uma modalidade da invenção, o pH da formulação é de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. Em uma outra modalidade da invenção, o pH da formulação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0.
[0462] Em uma outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um tampão. Exemplos não limitadores de tampões incluem: arginina, ácido aspártico, bicina, citrato, hidrogenofosfato dissódico, ácido fumárico, glicina, glicilglicina, histidina, lisina, ácido maleico, ácido málico, acetato de sódio, carbonato de sódio, di-hidrogenofosfato de sódio, fosfato de sódio, succinato, ácido tartárico, tricina e tris(hidroximetil)-aminometano, e misturas dos mesmos. O tampão pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses tampões específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0463] Em uma outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um conservante. Exemplos não limitadores de tampões incluem: cloreto de benzetônio, ácido benzoico, álcool benzílico, bronopol, 4-hidroxibenzoato de butila, clorobutanol, clorocresol, cloro-hexidina, clorfenesina, o-cresol, m-cresol, p-cresol, 4- hidroxibenzoato de etila, imidureia, 4-hidroxibenzoato de metila, fenol, 2-fenoxietanol, 2-feniletanol, 4-hidroxibenzoato de propila, desidroacetato de sódio, tiomossal, e misturas dos mesmos. O conservante pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses conservantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0464] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um agente isotônico. Exemplos não limitadores da modalidade incluem um sal (como cloreto de sódio), um aminoácido (como glicina, histidina, arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano e treonina), um alditol (como glicerol, 1,2- propanodiol propileno glicol), 1,3-propanodiol e 1,3-butanodiol), polietileno glicol (por exemplo, PEG400) e misturas dos mesmos. Outro exemplo de um agente isotônico inclui um açúcar. Exemplos não limitadores de açúcares podem ser mono, di, ou polissacarídeos, ou glucanos solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, lactose, sacarose, trealose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, alfa- e beta- HPCD, amido solúvel, hidroxietilamido e carboximetilcelulose de sódio. Um outro exemplo de um agente isotônico é um álcool de açúcar, sendo que o termo "álcool de açúcar" é definido como um hidrocarboneto C(4 a 8) que tem ao menos um grupo -OH. Exemplos não limitadores de álcoois de açúcar incluem manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol e arabitol. As composições farmacêuticas compreendendo cada agente isotônico mencionado neste parágrafo constituem modalidades alternativas da invenção. O agente isotônico pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses agentes isotônicos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0465] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um agente quelante. Exemplos não limitadores de agentes quelantes incluem ácido cítrico, ácido aspártico, sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), e misturas dos mesmos. O agente quelante pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses agentes quelantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0466] Em uma outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um estabilizante. Exemplos não limitadores de estabilizantes incluem um ou mais inibidores de agregação, um ou mais inibidores de oxidação, um ou mais tensoativos e/ou um ou mais inibidores de protease.
[0467] Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um estabilizante, sendo que o dito estabilizante é carbóxi-/hidroxicelulose e derivados do mesmo (como HPC, HPC-SL, HPC-l e HPMC), ciclodextrinas, 2-metiltioetanol, polietileno glicol (como PEG 3350), álcool polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona, sais (tais como cloreto de sódio), substâncias contendo enxofre, como monotioglicerol) ou ácido tioglicólico. O estabilizante pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 50 mg/ml, por exemplo, de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses estabilizantes específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0468] Em modalidades adicionais da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais tensoativos, de preferência, um tensoativo, ao menos um tensoativo, ou dois tensoativos diferentes. O termo "tensoativo" se refere a quaisquer moléculas ou íons que são compostos por uma parte solúvel em água (hidrofílica) e uma parte solúvel em gordura (lipofílica). O tensoativo pode, por exemplo, ser selecionado do grupo que consiste em tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos não iônicos, e/ou tensoativos zwiteriônicos. O tensoativo pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses tensoativos específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0469] Em uma outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica compreende um ou mais inibidores da protease, como, por exemplo, EDTA e/ou ácido clorídrico (HCl) benzamidina. O inibidor de protease pode estar presente individualmente ou coletivamente, em uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 20 mg/ml de. As composições farmacêuticas que compreendem cada um desses inibidores de protease específicos constituem modalidades alternativas da invenção.
[0470] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de produção de uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção, que compreende combinar um anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica. Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método para produzir uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção, que compreende combinar um anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica. Métodos de uso
[0471] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método de direcionamento de CD33 em uma superfície de células de câncer em um indivíduo, sendo que o método compreende administrar ao indivíduo um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD33 ou um anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno ou uma composição farmacêutica da invenção.
[0472] Também está contemplado na presente invenção um imunoconjugado terapêutico de anticorpo anti-CD33 compreendendo um agente terapêutico que é selecionado do grupo que consiste em um radionuclídeo, átomos de boro, gadolínio ou urânio, um imunomodulador, como uma citocina, um fator de crescimento de células-tronco, uma linfotoxina, como fator de necrose tumoral (TNF), um fator hematopoiético, como uma interleucina (IL), um fator estimulador de colônias (CSF), como fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) ou fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF)), um interferon (IFN) como interferons-α, -β ou - γ, e um fator de crescimento de células-tronco como o designado "fator de S1", um fator hematopoiético, eritropoietina, trombopoietina, um anticorpo, um hormônio, um antagonista de hormônio, uma enzima, um inibidor de enzima, um agente terapêutico fotoativo, um fármaco citotóxico, como agentes antimitóticos, agentes alquilantes, agentes antimetabólitos, agentes inibidores de angiogênese, agentes apoptóticos, agentes alcaloides, agentes inibidores de COX-2, e agentes antibióticos, uma toxina citotóxica, como toxinas de planta, toxinas microbianas, e toxinas animais, e suas variações sintéticas, um inibidor de angiogênese, um anticorpo diferente, e um combinação dos mesmos. Em uma modalidade preferencial, a citocina é selecionada do grupo que consiste em IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, interferon-γ, TNF-α e uma combinação dos mesmos, o radionuclídeo é selecionado do grupo que consiste em um emissor-Auger, um emissor- beta e um emissor-alfa, como P-32, P-33, Sc-47, Fe-59, Cu-64, Cu-67, Se-75, As-77, Sr-89, Y-90, Mo-99, Rh-105, Pd-109, Ag-111, I-125, I-131, Pr-142, Pr-143, Pm-149, Sm-153, Tb-161, Ho-166, Er-169, Lu-177, Re- 186, Re-188, Re-189, Ir-194, Au-198, Au-199, Pb-211, Pb-212, e Bi-213, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I- 125, Ho-161, Os-189m, Ir-192, Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213, Fm-255, B-10, Gd-157, U-235, e combinações dos mesmos. De preferência, o radionuclídeo tem uma energia entre 20 e 10.000 Kev.
[0473] A atividade funcional dos anticorpos humanizados e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD33 pode ser caracterizada por métodos conhecidos na técnica e conforme descrito na presente invenção. Os métodos para caracterizar anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD33 incluem, mas não se limitam a, ensaios de afinidade e especificidade, incluindo análise Biacore, ELISA e OctetRed; ensaios de ligação para detectar a ligação de anticorpos a CD33 em células cancerosas por FACS. De acordo com modalidades específicas, os métodos para caracterizar anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a CD33 incluem aqueles descritos abaixo.
[0474] Em um outro aspecto geral, a invenção se refere a um método para tratar um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo,
que compreende administrar ao indivíduo um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno que se liga especificamente a CD33 ou uma composição farmacêutica da invenção. O câncer pode, por exemplo, ser um câncer que expressa CD33. O câncer pode, por exemplo, ser selecionado dentre, mas não se limita a, um câncer de pulmão, um câncer gástrico, câncer de cólon, um carcinoma hepatocelular, um carcinoma de células renais, um carcinoma urotelial de bexiga, um melanoma metastático, um câncer de mama, um câncer de ovário, um câncer cervical, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer pancreático, um glioma, ume glioblastoma, e outros tumores sólidos, e um linfomade de não Hodgkin (NHL), uma leucemia linfocítica aguda (ALL), uma leucemia linfocítica crônica (CLL), uma leucemia mieloide crônica (CML), um mieloma múltiplo (MM), uma leucemia mieloide aguda (AML), e outros tumores líquidos. O câncer pode, por exemplo, ser um câncer hematológico. O câncer hematológico pode, por exemplo, ser uma leucemia, um linfoma, e um mieloma. Em determinadas modalidades, o câncer hematológico pode ser leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásica (SMD, de baixo ou alto risco), leucemia linfoide aguda (LLA, incluindo todos os subtipos), linfoma de células B grandes difusas (LCBGD), leucemia mieloide crônica (LMC) ou neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN).
[0475] De acordo com modalidades da invenção, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Como usado na presente invenção, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um ingrediente ou componente ativo que induz a resposta biológica ou medicinal desejada em um indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente e de maneira rotineira, em relação à finalidade declarada.
[0476] Como usado aqui com referência aos anticorpos anti-CD33 ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade do anticorpo anti-C D33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno que modula uma resposta imune em um indivíduo que necessita dos mesmos.
[0477] De acordo com as modalidades particulares, uma quantidade terapeuticamente eficaz se refere à quantidade de terapia que é suficiente para alcançar um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ii) reduzir a duração da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iii) evitar a progressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (iv) causar a regressão da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (v) evitar o desenvolvimento ou o início da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vi) evitar a recorrência da doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (vii) reduzir a hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (viii) reduzir o período de hospitalização de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (ix) aumentar a sobrevida de um indivíduo com a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo; (xi) inibir ou reduzir a doença, distúrbio ou condição a ser tratado, ou um sintoma associado ao mesmo em um indivíduo; e/ou (xii) aumentar ou melhorar o efeito profilático ou terapêutico (ou os efeitos profiláticos e terapêuticos) de outra terapia.
[0478] A quantidade terapeuticamente eficaz ou a dosagem pode variar de acordo com vários fatores, como a doença, distúrbio ou condição a ser tratada, os meios de administração, o sítio alvo, o estado fisiológico do indivíduo (incluindo, por exemplo, idade, peso corporal, saúde), se o indivíduo é um ser humano ou um animal, outros medicamentos administrados, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. As dosagens de tratamento são idealmente tituladas para otimizar a segurança e a eficácia.
[0479] De acordo com modalidades particulares, as composições descritas na presente invenção são formuladas para serem adequadas para a via de administração tencionada a um indivíduo. Por exemplo, as composições aqui descritas podem ser formuladas para serem adequadas para administração intravenosa, subcutânea ou intramuscular.
[0480] Como usados na presente invenção, os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" destinam-se a referir a uma melhora ou reversão de ao menos um parâmetro físico mensurável relacionado a um câncer, que é não necessariamente discernível no indivíduo, mas que pode ser discernível no indivíduo. Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento" também podem se referir a causar a regressão, evitar a progressão ou, pelo menos, diminuir a progressão da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um alívio, prevenção do desenvolvimento ou início, ou redução na duração de um ou mais sintomas associados à doença, distúrbio ou condição, como um tumor ou, com mais preferência, um câncer. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à prevenção da recorrência da doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se a um aumento na sobrevida de um indivíduo que tem a doença, distúrbio ou condição. Em uma modalidade particular, "tratar", "tratando" e "tratamento" referem-se à eliminação da doença, distúrbio ou condição no indivíduo.
[0481] De acordo com modalidades específicas, são fornecidas composições para uso no tratamento de um câncer. Para terapia de câncer, as composições podem ser usadas em combinação com outro tratamento incluindo, mas não se limitando a, uma quimioterapia, um mAb anti-CD20, um mAb anti-TIM-3, um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-PD-1, uma terapia PD-1/PD-L1, outros fármacos imuno-oncológicos, um agente antiangiogênico, uma terapia de radiação, um conjugado anticorpo-fármaco (ADC), uma terapia direcionada, ou outros fármacos anticâncer.
[0482] Como usado uso na presente invenção, o termo "em combinação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia. O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias são administradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, uma composição aqui descrita) pode ser administrada antes de (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas antes), concomitantemente com, ou posteriormente a (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou 12 semanas depois) da administração de uma segunda terapia a um indivíduo. Modalidades
[0483] Esta revelação fornece as seguintes modalidades não limitadoras.
[0484] A modalidade 1 é um anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno que se liga especificamente ao domínio C2 de CD33.
[0485] A modalidade 2 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 1, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3, tendo a sequência de polipeptídeos das:
[0486] SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
[0487] SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente;
[0488] SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente;
[0489] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente;
[0490] SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente;
[0491] SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente;
[0492] SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente;
[0493] SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente;
[0494] SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente;
[0495] SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0496] SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494,
respectivamente;
[0497] SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente;
[0498] SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente;
[0499] SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente; ou
[0500] SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente;
[0501] sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente a CD33, de preferência, CD33 humano.
[0502] A modalidade 3 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 1 ou 2, que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ou 285, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324, ou 325.
[0503] A modalidade 4 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 3, que compreende:
[0504] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332;
[0505] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331;
[0506] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302;
[0507] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310;
[0508] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322;
[0509] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300;
[0510] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304;
[0511] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305;
[0512] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306;
[0513] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307;
[0514] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307;
[0515] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317;
[0516] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319;
[0517] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; ou
[0518] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325.
[0519] A modalidade 5 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno, que compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das:
[0520] SEQ ID NOs:357, 358, 359, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0521] SEQ ID NOs:372, 373, 374, 495, 496, e 497, respectivamente;
[0522] SEQ ID NOs:375, 376, 377, 498, 499, e 500, respectivamente;
[0523] SEQ ID NOs:381, 382, 383, 504, 505, e 506, respectivamente;
[0524] SEQ ID NOs:384, 385, 386, 507, 508, e 509, respectivamente;
[0525] SEQ ID NOs:390, 391, 392, 510, 511, e 512, respectivamente;
[0526] SEQ ID NOs:393, 394, 395, 513, 514, e 515, respectivamente;
[0527] SEQ ID NOs:396, 397, 398, 516, 517, e 518,
respectivamente;
[0528] SEQ ID NOs:399, 400, 401, 519, 520, e 521, respectivamente;
[0529] SEQ ID NOs:405, 406, 407, 525, 526, e 527, respectivamente;
[0530] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 534, 535, e 536, respectivamente;
[0531] SEQ ID NOs:417, 418, 419, 537, 538, e 539, respectivamente;
[0532] SEQ ID NOs:420, 421, 422, 540, 541, e 542, respectivamente;
[0533] SEQ ID NOs:429, 430, 431, 549, 550, e 551, respectivamente;
[0534] SEQ ID NOs:432, 433, 434, 552, 553, e 554, respectivamente;
[0535] SEQ ID NOs:435, 436, 437, 555, 556, e 557, respectivamente;
[0536] SEQ ID NOs:438, 439, 440, 558, 559, e 560, respectivamente;
[0537] SEQ ID NOs:441, 442, 443, 561, 562, e 563, respectivamente;
[0538] SEQ ID NOs:450, 451, 452, 570, 571, e 572, respectivamente;
[0539] SEQ ID NOs:453, 454, 455, 573, 574, e 575, respectivamente;
[0540] SEQ ID NOs:456, 457, 458, 576, 577, e 578, respectivamente;
[0541] SEQ ID NOs:459, 460, 461, 579, 580, e 581, respectivamente;
[0542] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 582, 583, e 584,
respectivamente;
[0543] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 585, 586, e 587, respectivamente; ou
[0544] SEQ ID NOs:429, 430, 431, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0545] sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente a CD33, de preferência, CD33 humano.
[0546] A modalidade 6 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 5, que compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica a uma das SEQ ID NOs:260, 262, 267, 268, 270, 271, 273, 274, 275, 276, 278, 281, 282, 283, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 294, 295, ou 296, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica a uma das SEQ ID NOs:301, 303, 308, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 333, 334, 335, 336, 337, ou 338.
[0547] A modalidade 7 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 5 ou 6, que compreende:
[0548] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301;
[0549] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303;
[0550] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:267, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:308;
[0551] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309;
[0552] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:270, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:311;
[0553] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312;
[0554] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313;
[0555] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314;
[0556] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315;
[0557] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316;
[0558] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318;
[0559] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321;
[0560] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:282, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322;
[0561] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323;
[0562] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326;
[0563] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327;
[0564] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:288 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:328;
[0565] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329;
[0566] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330;
[0567] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:293 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:333;
[0568] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334;
[0569] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335;
[0570] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336;
[0571] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337;
[0572] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338; ou
[0573] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303;
[0574] A modalidade 8 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 4, sendo que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno induz a citotoxicidade medida por células dependente de anticorpo (ADCC) in vitro com uma EC50 menor que cerca de 2 nM.
[0575] A modalidade 9 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 8, sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma cadeia principal de IgG1 com baixo teor de fucose.
[0576] A modalidade 10 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 7, sendo que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga a CD33 com uma constante de dissociação (KD) menor que cerca de 5 x 10-9 M.
[0577] A modalidade 11 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 7, sendo que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno se ligar a CD33 e induzi a internalização com uma EC50 menor que cerca de 2 nM.
[0578] A modalidade 12 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 11, sendo que o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno inibe a atividade de CD33.
[0579] A modalidade 13 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 12, sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é quimérico.
[0580] A modalidade 14 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 13, sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é humano ou humanizado.
[0581] A modalidade 15 é o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 13, sendo que o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno é conjugado a um agente terapêutico.
[0582] A modalidade 16 é um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 14.
[0583] A modalidade 17 é um vetor que compreende o ácido nucleico isolado da modalidade 16.
[0584] A modalidade 18 é uma célula hospedeira que compreende o vetor da modalidade 17.
[0585] A modalidade 19 é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0586] A modalidade 20 é um método de tratamento de um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 19.
[0587] A modalidade 21 é o método da modalidade 20, em que o câncer é um câncer colorretal.
[0588] A modalidade 22 é o método da modalidade 21, em que o câncer hematológico é selecionado do grupo que consistem em uma leucemia, um linfoma, ou um mieloma múltiplo.
[0589] A modalidade 23 é o método da modalidade 22, em que o câncer hematológico é leucemia mieloide aguda (AML), síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), leucemia mieloide crônica (CML) ou neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides (DPDCN).
[0590] A modalidade 24 é um método para produzir o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das reivindicações 1 a 14, que compreende cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno, e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura.
[0591] A modalidade 25 é um método para produzir uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno, conforme definido em qualquer uma das modalidades 1 a 14, que compreende combinar o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.
[0592] A modalidade 26 é um anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 que compreende um anticorpo anti-CD33 ou um seu fragmento de ligação a antígeno e um anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno,
[0593] sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1
(LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[0594] SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
[0595] SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente;
[0596] SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente;
[0597] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente;
[0598] SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente;
[0599] SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente;
[0600] SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente;
[0601] SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente;
[0602] SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente;
[0603] SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0604] SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente;
[0605] SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente;
[0606] SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente;
[0607] SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente; ou
[0608] SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente;
[0609] e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[0610] SEQ ID NOs: 342, 343, 344, 465, 466, e 467, respectivamente; ou
[0611] SEQ ID NOs: 345, 346, 347, 468, 469, e 470, respectivamente.
[0612] A modalidade 27 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 25, sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ou 285, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324, ou 325; e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:257 ou 258, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:298 ou 299.
[0613] A modalidade 28 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 25 ou 26, que compreende:
[0614] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0615] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0616] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0617] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0618] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0619] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0620] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0621] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0622] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0623] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0624] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0625] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0626] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0627] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0628] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0629] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0630] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:291 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0631] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0632] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0633] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:280 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0634] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0635] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0636] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0637] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0638] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0639] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0640] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0641] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0642] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:284 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; ou
[0643] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299.
[0644] A modalidade 29 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-
CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 28, sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga especificamente ao domínio C2 de CD33.
[0645] A modalidade 30 é um anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 que compreende um anticorpo anti-CD33 ou um seu fragmento de ligação a antígeno e um anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno,
[0646] sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[0647] SEQ ID NOs:357, 358, 359, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0648] SEQ ID NOs:372, 373, 374, 495, 496, e 497, respectivamente;
[0649] SEQ ID NOs:375, 376, 377, 498, 499, e 500, respectivamente;
[0650] SEQ ID NOs:381, 382, 383, 504, 505, e 506, respectivamente;
[0651] SEQ ID NOs:384, 385, 386, 507, 508, e 509, respectivamente;
[0652] SEQ ID NOs:390, 391, 392, 510, 511, e 512, respectivamente;
[0653] SEQ ID NOs:393, 394, 395, 513, 514, e 515, respectivamente;
[0654] SEQ ID NOs:396, 397, 398, 516, 517, e 518, respectivamente;
[0655] SEQ ID NOs:399, 400, 401, 519, 520, e 521, respectivamente;
[0656] SEQ ID NOs:405, 406, 407, 525, 526, e 527, respectivamente;
[0657] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 534, 535, e 536, respectivamente;
[0658] SEQ ID NOs:417, 418, 419, 537, 538, e 539, respectivamente;
[0659] SEQ ID NOs:420, 421, 422, 540, 541, e 542, respectivamente;
[0660] SEQ ID NOs:429, 430, 431, 549, 550, e 551, respectivamente;
[0661] SEQ ID NOs:432, 433, 434, 552, 553, e 554, respectivamente;
[0662] SEQ ID NOs:435, 436, 437, 555, 556, e 557, respectivamente;
[0663] SEQ ID NOs:438, 439, 440, 558, 559, e 560, respectivamente;
[0664] SEQ ID NOs:441, 442, 443, 561, 562, e 563, respectivamente;
[0665] SEQ ID NOs:450, 451, 452, 570, 571, e 572, respectivamente;
[0666] SEQ ID NOs:453, 454, 455, 573, 574, e 575, respectivamente;
[0667] SEQ ID NOs:456, 457, 458, 576, 577, e 578, respectivamente;
[0668] SEQ ID NOs:459, 460, 461, 579, 580, e 581, respectivamente;
[0669] SEQ ID NOs:378, 379, 380, 582, 583, e 584, respectivamente;
[0670] SEQ ID NOs:414, 415, 416, 585, 586, e 587, respectivamente; ou
[0671] SEQ ID NOs: 429, 430, 431, 480, 481, e 482, respectivamente;
[0672] e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3 e uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das SEQ ID NOs:
[0673] SEQ ID NOs: 342, 343, 344, 465, 466, e 467, respectivamente; ou
[0674] SEQ ID NOs: 345, 346, 347, 468, 469, e 470, respectivamente.
[0675] A modalidade 31 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 29, sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica a uma das SEQ ID NOs:260, 262, 267, 268, 270, 271, 273, 274, 275, 276, 278, 281, 282, 283, 286, 287, 288, 289, 290, 293, 294, 295, ou 296, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica a uma das SEQ ID NOs:301, 303, 308, 309, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 318, 321, 322, 323, 326, 327, 328, 329, 330, 333, 334, 335, 336, 337, ou 338. e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:257 ou 258, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:298 ou 299.
[0676] A modalidade 32 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno da modalidade 29 ou 30, que compreende:
[0677] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0678] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0679] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:267, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:308; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0680] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0681] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:270, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:311; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0682] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0683] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0684] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0685] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0686] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0687] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0688] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0689] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:282, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0690] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0691] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0692] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0693] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:288 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:328; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0694] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0695] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0696] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:293 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:333; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0697] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0698] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0699] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0700] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0701] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0702] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
[0703] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:260, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:301; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0704] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:262, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0705] uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:267 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:308; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0706] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:268, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:309; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0707] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:270, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:311; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0708] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:271, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:312; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0709] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:273, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:313; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0710] uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:274, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:314; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0711] ii. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:275, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:315; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0712] jj. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:276, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:316; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0713] kk. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:278, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:318; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0714] ll. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:321; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0715] mm. uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:282 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0716] nn. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:283, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:323; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0717] oo. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:326; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0718] pp. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:287 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:327; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0719] qq. uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:288 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:328; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0720] rr. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:289, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:329; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0721] ss. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:290, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:330; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0722] tt. uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:293 e uma sequência de polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:333; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0723] uu. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:294, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:334; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0724] vv. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:295, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:335; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0725] ww. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:296, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:336; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0726] xx. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:337; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
[0727] yy. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:281, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:338; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; ou
[0728] zz. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:286, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:303; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299.
[0729] A modalidade 33 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 32, sendo que o anticorpo biespecífico anti- CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno induz a citotoxicidade dependente de células T em células que expressam CD33 in vitro com um valor de EC50 menor que cerca de 1 nM.
[0730] A modalidade 34 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 33, sendo que o anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno é quimérico.
[0731] A modalidade 35 é o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 34, sendo que o anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação ao antígeno é humano ou humanizado.
[0732] A modalidade 36 é um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 35.
[0733] A modalidade 37 é um vetor que compreende o ácido nucleico isolado da modalidade 36.
[0734] A modalidade 38 é uma célula hospedeira que compreende o vetor da modalidade 37.
[0735] A modalidade 39 é uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 35 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0736] A modalidade 40 é um método de tratamento de um câncer em um indivíduo que precisa do mesmo, que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica da modalidade 39.
[0737] A modalidade 41 é o método da modalidade 40, sendo que o câncer é um câncer hematológico.
[0738] A modalidade 42 é o método da modalidade 41, sendo que o câncer hematológico é selecionado do grupo que consiste em uma leucemia, um linfoma, ou um mieloma múltiplo.
[0739] A modalidade 43 é o método da modalidade 42, em que o câncer hematológico é leucemia mieloide aguda (AML), síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), leucemia mieloide crônica (CML) ou neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides (DPDCN).
[0740] A modalidade 44 é um método para produzir o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno de qualquer uma das reivindicações 26 a 35, que compreende cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo biespecífico anti- CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação ao antígeno, e recuperar o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura.
[0741] A modalidade 45 é um método para produzir uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação a antígeno de qualquer uma das modalidades 26 a 35, que compreende combinar o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica. Exemplos Reagentes Geração de antígeno
[0742] As proteínas CD33 humana e de macaco cinomolgo foram produzidas com ou sem uma forma monomérica mutada de albumina sérica humana (HSA), Uniprot P02768 com uma mutação C58S, fundidas no C-terminal para imunizações e ensaios. Os cDNAs que codificam os antígenos da proteína CD33 com uma etiqueta de seis histidinas, foram sintetizados sinteticamente e clonados em um vetor de expressão e secreção de mamífero sob o promotor de actina usando-se técnicas padrão de biologia molecular.
[0743] O domínio extracelular (ECD) de CD33 humano de comprimento total derivado do Uniprot P20138 (SEQ ID NO:1 (ECD de CD33 humano) foi fundido na terminação N com uma sequência de sinais e com ou sem o HSA, seguido de uma etiqueta de seis histidina na terminação C, ECD de hCD33 com HSA e ECD de hCD33 apenas). O construto de expressão do ECD de CD33 humano foi transitoriamente transfectado em células derivadas HEK293, Expi293 (Gibco/Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, EUA) com o uso de Expifectamina de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram incubadas a 37°C durante 5 dias com 8% de CO2 em um agitador orbital antes da colheita. As células expressas foram removidas por centrifugação e o CD33 solúvel foi purificado do meio com o uso de cromatografia de afinidade de metal imobilizado com o uso de resina Flow Fast 6 Sepharose Ni (GE Healthcare; Little Chalfont, Reino Unido) seguido de cromatografia de exclusão por tamanho (CET) preparativa 200 Superdex (GE Healthcare) em solução salina tampão de fosfato de Dubelcoo pH 7,2 (1x DPBS). Frações de eluição de CET que excluem quaisquer agregados de dissulfeto foram combinadas e esterilizadas por filtração para produzir a proteína final para ensaios de imunização e CD33. A concentração de proteína foi determinada por A280 e a qualidade da proteína purificada foi avaliada por SD-PAGE e CET analítica (Coluna Phenomenex; Torrance, CA, EUA). As medições de endotoxina foram realizadas com o uso de cartucho EndoSafe-PTS, um Ensaio de LAL cromogênico (Charles River; Wilmington, MA, EUA).
[0744] As proteínas do subdomínio de ECD humano, domínio V- HSA de hCD33, domínio V-His de HCD33e, domínio C-HSA de hCD33, e domínio C2-His de hCD33, foram similarmente construídas, expressas e purificadas como o ECD de CD33 humano de comprimento total.
[0745] Os construtos CD33 de macaco cinomolgo para ensaios de imunização e seletividade cruzada, ECD-HSA de CD33 de cino, CD33- His de cino, foram também gerados com base na sequência do Genbank XP_005590138.1, A expressão e a purificação de CD33 de macaco cinomolgo foram iguais às das proteínas CD33 humanas.
[0746] Os antígenos CD33 para triagem foram biotinilados em 50 mM presença de fosfato de Na pH 7,2 com o uso do kit de rotulagem cromogênica de biotina SureLink (SeraCare KPL) de acordo com as condições do fabricante. Resumidamente, uma solução estoque de biotina de 25 mM foi adicionada à proteína CD33 a uma razão molar de 4:1 entre biotina e proteína e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos com rotação suave e então a 4°C durante mais 2 horas. A biotina não incorporada foi removida por troca de tampão em DPBS 1x. A concentração de proteína e a incorporação de biotina foram determinadas mediante medição a A280 nm e A354 nm com o uso de NanoDrop. Consulte a Tabela 1 para as sequências de cada um dos antígenos descritos acima. Tabela 1: Sequências de antígeno Nome da Proteína ID da proteína SEQ ID NO ECD-HSA de CD33 de cino C33W1 2 ECD-HSA de CD33 humano C33W2 3 V-HSA de CD33 humano C33W3 4 C2-HSA de CD33 humano C33W4 5 V-His de CD33 humano C33W8 6 C2-His de CD33 humano C33W9 7 ECD-His de CD33 humano C33W49 8 ECD-His de CD33 de cino C33W50 9 CD33 humano de comprimento total 10 CD33 cino de comprimento total 11 Geração de linhagens celulares isogênicas que expressam CD33
[0747] Linhagens celulares que expressam CD33 humano e de cino foram geradas com o uso de lentivírus (Genecopoeia; Rockville, MD, EUA) contendo CD33 humano ou CD33 de ciano de comprimento total e puromicina para seleção de células positivas CD33. Células HEK293F (ATCC), negativas para CD33, foram transduzidas com partículas lentivirais para superexpressar CD33 humano e CD33 de cino. Após a transdução, as células que expressam positivamente CD33 e o marcador de resistência foram selecionadas pelo tratamento de células agrupadas, cultivadas em DMEM + 10% de HI FBS ("Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum", soro fetal bovino inativado por calor) (Life Technologies; Carlsbad, CAm Eua) e suplementado com diferentes concentrações de Puromicina (Life Technologies).
[0748] Além das células HEK gerarem linhagens celulares, várias linhagens celulares comerciais foram usadas para ensaios de ligação e de toxicidade celular. Estas incluíram MOLM13, KG1, SH2, e MV411 e OCIAML3 e foram obtidas junto ao American Type Culture Collection ou ao Deutsche Sammlung von Mikrooranismen und Zellkulturen, e cultivadas a 37°C, 5% de CO2 em meio de cultura completo RPMI com 10% de FBS. Exemplo 1: Campanhas de imunização OmniRat
[0749] Uma cepa de rato transgênico contendo imunoglobulina humana (OmniRat®; Ligand Pharmaceuticals; San Diego, CA) foi usada para desenvolver células de hibridoma que expressam anticorpos monoclonais humanos anti-CD33. O OmniRat® contém um lócus de IgH quimérica de rato/humano (compreendendo 22 VHs humanos, todos os segmentos D e JH humanos na configuração natural ligados ao lócus CH de rato) juntamente com os lócus de IgL completamente humana (12 Vκs ligados a Jκ-Cκ e 16 Vλs ligados a Jλ-Cλ). (consulte, por exemplo, Osborn, et al. (2013) J Immunol 190(4): 1481-1490). Consequentemente, os ratos apresentam expressão de imunoglobulina de rato, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e leve humanos introduzidos experimentam mudança de classe e mutação somática para gerarem anticorpos monoclonais IgG humanos/de rato de alta afinidade com regiões variáveis completamente humanas. A preparação e o uso de OmniRat®, e as modificações genômicas realizada em tais ratos, são descritos na publicação PCT n° WO 2014/093908 de Bruggemann et al.
[0750] Quando imunizados com CD33 humano e de cinomolgo recombinantes (ECD-HSA de CD33 humano e ECD-HSA de CD33 de cino, respectivamente), esse rato transgênico produz anticorpos IgG de humano-rato quiméricos para CD33 humano, alguns dos quais também se ligam ao CD33 de cinomolgo.
[0751] Oito OmniRats foram imunizados alternadamente com ECD-
HSA de huCD33 e ECD-HSA de CD33 de cino. Após um regime de imunização de 46 dias, os linfonodos de todos os oito OmniRats foram colhidos e usados para gerar hibridomas. Oitenta e uma placas de 96 poços de sobrenadantes de hibridoma foram triadas através do ELISA de ligação e AlphaLISA com o uso de técnicas padrão, das quais 128 sobrenadantes de hibridoma foram selecionados para ligação específica a ECD-HSA de huCD33 e ECD-HSA de CD33 de cino. A maioria dos 128 sobrenadantes foram também positivas para ligação em células que superexpressma huCD33 ou cyCD33.
[0752] Seis OmniRats adicionais foram imunizados apenas com rhuCD33. Após um regime de imunização de 31 dias, os linfonodos de todos os seis OmniRats foram colhidos e usados para gerar hibridomas. Trinta placas de 96 poços de sobrenadantes de hibridoma foram triadas através do ELISA de ligação com o uso de técnicas padrão, das quais 94 sobrenadantes de hibridoma foram selecionados para ligação específica a ECD-HSA de huCD33 e ECD-HSA de CD33 de cino. Os lisados de hibridoma foram preparados a partir dos clones positivos e progrediram para clonagem da região v descrita a seguir. OmniMouse
[0753] Uma cepa de rato transgênico vvimunoglobulina humana (OmniRat ®; Ligand Pharmaceuticals) foi usada para desenvolver células de hibridoma que expressam anticorpos monoclonais anti-CD33 humanos. O OmniMouse® contém lócus de IgH humano/rato quiméricos juntamente com os lócus de IgL completamente humanos. Os camundongos apresentam expressão de imunoglobulina de camundongo, e em resposta à imunização, os transgenes de cadeias pesada e leve humanos introduzidos experimentam mudança de classe e mutação somática para gerarem anticorpos monoclonais IgG humanos/de rato quiméricos de alta afinidade com regiões variáveis completamente humanas.
[0754] Quando imunizados com CD33 humano e de cinomolgo recombinantes (ECD-HSA (huCD33 e ECD-HSA de CD33 de cino, respectivamente), esse camundongo transgênico produz anticorpos IgG de humano-rato quiméricos para CD33 humano, alguns dos quais também se ligam ao CD33 de cinomolgo.
[0755] Quatro OmniMice foram imunizados alternadamente com ECD-HSA de huCD33 e ECD-HSA de CD33 de cino. Após um regime de imunização de 53 dias, baços e linfonodos de todos os quatro OmniMice foram colhidos e usados para gerar hibridomas. Quarenta e oito placas de 96 poços de sobrenadantes de hibridoma foram triadas através do ELISA de ligação e AlphaLISA, dos quais 8 sobrenadantes de hibridoma foram selecionados para ligação específica a ECD-HSA de huCD33 e ECD-HSA de CD33 de cino. Os lisados de hibridoma foram preparados a partir dos clones positivos e progrediram para clonagem da região v descrita a seguir. Clonagem da região V
[0756] O RNA total dos lisados das células de hibridoma foi purificado com o uso do kit RNeasy 96 (Qiagen; Hilden, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante, e o RNA resultante foi quantificado usando-se Drop Sense e armazenado a -80°C ou o cDNA foi sintetizado usando-se Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen; Carlsbad, CA, EUA). A síntese da primeira fita de cDNA foi feita usando-se iniciadores específicos para genes anelados às regiões constantes de cadeias pesadas, kappa, e lambda, respectivamente. A mistura de reação RT-PCR é compreendida de até 3 µg de RNA purificado, iniciador específico de gene, mistura de dNTP, tampão de reação, 25 mM de MgCl 2, DTT, RNaseOUT™ (40 U/µl, Invitrogen), e SuperScript™ III RT (200 U/µl, Invitrogen n° de cat.18080- 051), e incubada a 50°C durante 50 minutos e 85°C durante 5 minutos. O cDNA de fita simples resultante foi armazenado a -20°C, ou o DNA de fita simples foi amplificado por PCR.
A reação de PCR foi realizada com o uso de polimerase Platinum Pfx (Invitrogen). Os fragmentos da região v foram amplificados por iniciadores forward e reverso que anelam às sequências líderes e às regiões constantes das cadeias pesadas, kappa e lambda, respectivamente, com o uso de condições de PCR otimizadas.
Os fragmentos de PCR resultantes foram executados no gel e sequenciados em GENEWIZ com o uso de iniciadores pré- projetados para obter sequências da região v.
Os arquivos abi. resultantes de sequências da região v foram coletados e analisados pelo programa de análise de sequências da região v Sanger criado na Janssen Biologics Discovery.
As sequências AA das regiões v recuperadas foram registradas na base de dados interna, otimizadas por códon e clonadas no vetor de expressão à base de pUnder que tem a região constante adequada do isótipo de anticorpo humano desejado: F405L de IgG1 e PAA de IgG4. Um total de 76 anticorpos OMNIRat e 8 anticorpos OMNIMouse foram clonados corretamente e prosseguiram para caracterização adicional.
As tabelas abaixo resumem as sequências a partir das 42 sequências principais identificadas nas campanhas OMNIRat (consulte a Tabela 2) e as 16 identificada na campanha OMNIMouse (consulte Tabela 3) com vários dos anticorpos OMNIRat clonados em IgG1 bem como PAA de IgG4 e todos da campanha OMNIMouse foram clonados em IgG1 e em PAA de IgG 4. Tabela 2: Sequências de anticorpo identificadas através de imunização de CD33 em OMNIRat mAb ID de HC Isótipo de HC SEQ ID NO SEQ ID de ID de LC SEQ ID NO SEQ ID de de proteína nucleotídeo de proteína nucleotídeo C33B46 C33H108 hulgG1F405L 12 54 C33L74 96 138 C33B48 C33H80 hulgG1F405L 13 55 C33L73 97 139 C33B52 C33H42 hulgG1F405L 14 56 C33L8 98 140 C33B54 C33H44 hulgG1F405L 15 57 C33L10 99 141 C33B55 C33H45 hulgG1F405L 16 58 C33L11 100 142 C33B56 C33H46 hulgG1F405L 17 59 IAPL24 101 143 mAb ID de HC Isótipo de HC SEQ ID NO SEQ ID de ID de LC SEQ ID NO SEQ ID de de proteína nucleotídeo de proteína nucleotídeo C33B61 C33H48 hulgG1F405L 18 60 C33L58 102 144 C33B62 C33H49 hulgG1F405L 19 61 C33L59 103 145 C33B63 C33H51 hulgG1F405L 20 62 C33L34 104 146 C33B64 C33H52 hulgG1F405L 21 63 N46L109 105 147 C33B66 C33H55 hulgG1F405L 22 64 C33L42 106 148 C33B72 C33H65 hulgG1F405L 23 65 C33L47 107 149 C33B73 C33H66 hulgG1F405L 24 66 C33L60 108 150 C33B75 C33H70 hulgG1F405L 25 67 N46L109 109 151 C33B77 C33H72 hulgG1F405L 26 68 C33L40 110 152 C33B79 C33H74 hulgG1F405L 27 69 C33L38 111 153 C33B80 C33H76 hulgG1F405L 28 70 C33L39 112 154 C33B82 C33H78 hulgG1F405L 29 71 C33L57 113 155 C33B83 C33H81 hulgG1F405L 30 72 C33L53 114 156 C33B87 C33H87 hulgG1F405L 31 73 C33L35 115 157 C33B88 C33H88 hulgG1F405L 32 74 C33L61 116 158 C33B89 C33H90 hulgG1F405L 33 75 C33L51 117 159 C33B94 C33H98 hulgG1F405L 34 76 C33L69 118 160 C33B95 C33H98 hulgG1F405L 35 77 IAPL24 119 161 C33B96 C33H99 hulgG1F405L 36 78 C33L37 120 162 C33B101 C33H69 hulgG1F405L 37 79 C4LL152 121 163 C33B107 C33H68 hulgG1F405L 38 80 C33L17 122 164 C33B120 C33H87 hulgG1F405L 39 81 C33L41 123 165 C33B122 C33H92 hulgG1F405L 40 82 C33L30 124 166 C33B123 C33H91 hulgG1F405L 41 83 C33L44 125 167 C33B124 C33H73 hulgG1F405L 42 84 C33L32 126 168 C33B125 C33H84 hulgG1F405L 43 85 C33L66 127 169 C33B760 C33H45 huIgG4 PAA 44 86 C33L11 128 170 C33B777 C33H65 huIgG4 PAA 45 87 C33L47 129 171 C33B778 C33H66 huIgG4 PAA 46 88 C33L60 130 172 C33B782 C33H72 huIgG4 PAA 47 89 C33L40 131 173 C33B792 C33H87 huIgG4 PAA 48 90 C33L35 132 174 C33B799 C33H98 huIgG4 PAA 49 91 C33L69 133 175 C33B806 C33H69 huIgG4 PAA 50 92 C4LL152 134 176 C33B830 C33H84 huIgG4 PAA 51 93 C33L66 135 177 C33B836 C33H80 huIgG4 PAA 52 94 C33L73 136 178 C33B937 C33H66 huIGG4 PAA 53 95 C33L132 137 179
[0757] HC Cadeia pesada: LC: Cadeia leve Tabela 3: Sequências de anticorpo identificadas através de imunização de CD33 em OMNIMouse mAb ID de HC SEQ ID SEQ ID NO ID de LC SEQ ID SEQ ID NO NO de de NO de de proteína nucleotídeo proteína nucleotídeo C33B901 C33H249 180 196 C33L115 212 228 C33B902 C33H250 181 197 C33L116 213 229 C33B903 C33H251 182 198 C33L117 214 230 C33B904 C33H252 183 199 C33L118 215 231 C33B905 C33H253 184 200 C33L119 216 232 C33B906 C33H254 185 201 C33L120 217 233 C33B907 C33H255 186 202 C33L121 218 234 C33B908 C33H256 187 203 C33L122 219 235 C33B909 C33H249 188 204 C33L115 220 236 C33B910 C33H250 189 205 C33L116 221 237 C33B911 C33H251 190 206 C33L117 222 238 C33B912 C33H252 191 207 C33L118 223 239 C33B913 C33H253 192 208 C33L119 224 240 C33B914 C33H254 193 209 C33L120 225 241 C33B915 C33H255 194 210 C33L121 226 242 C33B916 C33H256 195 211 C33L122 227 243
[0758] HC Cadeia pesada; LC: Cadeia leve
[0759] Transfecção e purificação de células Expi293 em pequena escala
[0760] Os anticorpos identificados nas campanhas de imunização e subsequente clonagem de região v (em F405L de IgG1 e PAA de IgG4) foram expressos e purificados através de pequena escala de 2 mL. Células Expi293™ (ThermoFisher Scientific) foram semeadas a uma densidade de 1,25 x 105 – 2,25 x 105 células viáveis/mL em meio de expressão de Expi293™ e cultivadas em frascos de agitação Erlenmeyer, descartáveis, estéreis, ventilados, não aletados de policarbonato, em uma incubadora agitadora a 37°C, 7% de CO (INFORS HT Multitron Pro). Para crescimento celular de rotina em frascos de 125 mL a 2L, a velocidade de agitação foi ajustada para 130 rpm por agitadores com um diâmetro de agitação de 19 mm. As células foram subcultivadas quando a densidade atingiu a fase exponencial de crescimento celular a 3 × 106 – 5 × 106 células viáveis/mL com uma viabilidade de 98 a 99%.
[0761] No dia da transfecção, a densidade de células viáveis e a porcentagem de viabilidade foram determinadas. As células foram transfectadas a uma densidade de 3 x 106 células viáveis/mL. Para transfecção ótima, é usado um DNA plasmidial de cadeia pesada e leve estéril a uma concentração de 0,1 mg/ml em tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0).
[0762] As células Expi293™ foram transfectadas segundo o protocolo de transfecção do fabricante (ThermoFisher, número de publicação MAN0007814). A transfecção foi realizada em placas de 24 poços profundos (GE Healthcare). Resumidamente, o DNA plasmidial foi diluído com 0,1 ml de meio OptiMEM™ (ThermoFisher Scientific) na seguinte razão: 0,250 µg de DNA de cadeia pesada: 0,750 µg de DNA de cadeia levada: 0,5 µg de pAdvantage. Cinco µL de reagente de transfecção ExpiFectamine™ 293 foram diluídos e misturados gentilmente com 95 µL de meio OptiMEM™ e incubados durante 1 min. O reagente ExpiFectamine™ 293 diluído foi adicionado ao DNA diluído, misturado gentilmente e os complexos ExpiFectamine™ 293/DNA plasmidial foram incubados à temperatura ambiente durante 40 minutos. Após a incubação, 1,8 mL de células Expi293™ foram adicionadas aos complexos incubados de um dia para o outro em uma incubadora agitadora a 37°C, 7% de CO2
[0763] No dia 1 após a transfecção, 10 µL de ExpiFectamine™ 293 Enhancer 1e 100 µL de ExpiFectamine 293™ Enhancer 2 foram adicionados e as placas foram retornadas para a incubadora por 5 dias adicionais. A cultura foi coletada no dia 6 após a transfecção por centrifugação a 850xG durante 15 minutos antes da purificação.
[0764] 1,7 mL dos sobrenadantes de expressão clarificada preparados acima foram transferidos para uma nova placa de 96 poços profundos de 2 ml. As placas de purificação foram preparadas por pipetagem de 800 µl de uma mistura 1:4 de resina mAbSelect Sure (GE Healthcare) e DPBS -/- pasta fluida em cada poço de uma placa de filtro de vidro de 1 µm de 96 poços Acroprep Advance (Pall). Uma pressão de vácuo de 200 mbar foi aplicada à placa para remover o excesso de PBS a qual foi subsequentemente lavada com 800 µl de PBS fresco. Uma pressão de 200 mbar foi aplicada para remover o tampão de lavagem. Os sobrenadantes clarificados foram então transferidos para a resina lavada com PBS, misturados gentilmente e incubados durante 15 minutos. Após a incubação, uma pressão de vácuo de 200 mbar foi aplicada para remover o sobrenadante. A resina mAbSelect Sure foi lavada três vezes com PBS e uma vez com 25 mM de acetato de sódio, pH 5 (TEKNOVA; Hollister, CA, EUA) com uma pressão de vácuo de 200 mbar aplicada entre as lavagens para remover o excesso de tampão. Os mAbs ligados à resina foram eluídos usando-se acetato de sódio 0,1 M, pH 3,5 e incubados durante 10 minutos para uma dissociação eficaz. A placa de filtro foi colocada em cima de uma placa de 96 poços profundos e os mAbs eluídos foram coletados na placa inferior através de centrifugação a 1.000 g durante 2 minutos. Ointenta µL de tris-actetate 0,25 M, pH 7,2 foram adicionados para neutralizar os mAbs. Os mAbs foram dialisados em PBS de um dia para o outro em uma placa 96 poços DispoDIALYZER (Harvard Apparatus; Holliston, MA, EUA), transferidos para uma placa de filtro de 96 poços Acroprep Advance 0,2 µm Supor (Pall; Port Washington, NY, EUA), colocado sobre uma placa 96 poços profundos e as soluções de proteína filtradas através de centrifugação a 1.500 g durante 15 minutos em uma centrífuga de mesa. As concentrações de proteína foram determinadas por medição de absorbância a 280 nm (A280) no filtrado com o uso de um instrumento DropSense (Trinean).
[0765] Exemplo 2: Caracterização de mAbs anti-CD33
[0766] Anticorpos OMNIRat identificados por imunização, clonados na região v e subsequentemente expressos e purificados foram caracterizados adicionalmente pela ligação a células que expressam CD33 e pela ligação a antígenos recombinantes. Os anticorpos purificados foram avaliados quanto à ligação a células HEK293F estavelmente transfectadas que expressam CD33 humano ou CD33 de macaco cinomolgo (geração descrita acima) junto com as células parentais HEK293F como controle negativo. As células foram colhidas de frascos de cultura de tecido com o uso de tampão de dissociação não enzimática (Thermo Scientific). Os frascos foram enxaguados duas vezes com PBS e tampão de dissociação foi adicionado ao frasco, e o frasco foi incubada durante 10 minutos a 37°C até que as células se tornarem não aderentes. As células foram centrifugadas a 300 g durante 5 minutos, e ressuspensas a 1 x 106 células/mL em tampão de coloração (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ, EUA). 50.000 células/poço de cada tipo de célula foram plaqueadas em 50 µl de tampão de coloração em placas de fundo redondo (Becton Dickinson). 50 µL de mAb de teste a uma concentração de 2x ou controle de isotipo foram adicionados a 3 diluições e zero (120 nM, 12 nM, e 1,2 nM e 0 nM), e a solução resultante foi incubada por 30 minutos a 4°C. 100 µL de tampão de coloração foram adicionados em todos os poços de cada placa, as placas foram centrifugadas a 300 g durante 5 minutos, o tampão foi removido, 200 µl de tampão de coloração foram adicionado em todos os poços de cada placa, as placas foram centrifugadas a 300 g durante 5 minutos, e o tampão foi removido. 50 µL de 2 µg/mL de anticorpo secundário AF647 de cabra-anti-Fc humano (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA, EUA) foram adicionados a todos os poços das placas, e as placas foram incubadas durante 30 minutos a 4°C. 100 µL de tampão de coloração foram adicionados a todos os poços das placas, as placas foram centrifugadas a 300 g durante 5 minutos, e o tampão foi removido. 200 µl de tampão de corrida (tampão de corrida é tampão de coloração, 1 mM de EDTA, 0,1% de ácido plurônico) foram adicionados a todos os poços das placas, as placas foram centrifugadas a 300 g durante minutos, e o tampão foi removido. 30 ul de tampão de corrida contendo corante vivo/morto Sytox Green (ThermoFisher) foram adicionados a todos os poços com células e as placas foram lidas em um citômetro de fluxo iQue IntelliCyt. As células foram agrupadas em espalhamento frontal vs. espalhamento lateral para eliminar o resíduo ("debris") e então em células vivas o que excluiu o corante Sytox. A ligação do anticorpo foi avaliada pela intensidade média de fluorescência no canal AF647.
[0767] Para começar a avaliação das propriedades das ligações biofísicas dos mAbs purificados foi realizada uma triagem da taxa de dissociação (off-rate). 76 mAbs anti-CD33 OMNIRat foram testados quanto à ligação às proteínas recombinantes CD33 ECD-HSA humana (C33W2) e CD33 ECD-HSA de macaco cinomolgo (C33W1) (Janssen production) e o off-rate foi medido pela plataforma de arranjo IBIS MX96 SPRi (Carterra; (MX96) e a taxa de dissociação (off-rate) foi medida pela plataforma de matriz IBIS SPRi (Carterra; Newton, PA, EUA). IgG de cabra-anti-Fc humana (Jackson Immunoresearch, n° de cat 109-005- 098) foi diretamente imobilizado por meio de acoplamento de amina a 100 µg/mL em tampão acetato, pH 4,5 com o uso de um chip sensor CMD50 m (Xantec, lote CMD50 m 0415.a) com um tempo de associação de 10 minutos no instrumento IBIS. Um nível de imobilização médio de GAH-Fc de ~9.000 RU foi obtido. O chip sensor foi transferido para a unidade Continuous Flow Microspotter (CFM) para capturar cada mAb anti-CD33 a 10 µg/mL durante 10 minutos. A ligação foi medida em IBIS SPRi por cinética de ciclo único sem regeneração. Cada série de concentração de antígeno (3 µM em 3 séries de diluição) foi sequencialmente injetada a partir de concentrações baixa (0,46 nM) até alta (3 µM) para se ligar aos mAbx capturados com um tempo de associação de 5 minutos e um tempo de dissociação de 15 minutos com o uso de PBST (PBS com 0,005% de Tween) como o tampão de corrida. Os dados de ligação brutos (formato de arquivo.trix) foram referenciados e alinhados com o uso do software SprintX (Wasatch, Ver 1.9.3.2), então, exportados (formato de arquivo.ibmx) para o software Scrubber (Ver. 2.0) para as análises de cinética de ligação 1:1 (Wasatch, versão
2.0.0.33) para extrair os resultados de koff.
[0768] A Tabela 4 abaixo resume os 32 clones principais conforme avaliados pela ligação a linhagens celulares que expressam CD33 humano e de macaco cinomolgo bem como para antígeno recombinante (taxa de dissociação (off-rate) de ao menos >10e-3 para um dos antígenos). Desses 32, todos exceto 4 mostraram ligação apreciável para células expressoras humanas e de macaco cinomolgo. Todos os 32 foram adicionalmente caracterizados através de mapeamento de epítopos e análise cinética completa.
[0769] Tabela 4. Ligação celular e análise da taxa de dissociação dos anticorpos anti-CD33 derivados de OMNIRat Prot. ID de AA %Mon 60 nM de CD33 6 nM de CD33 0,6 nM de CD33 0 nM de kD CD33 C33B48 91,96 400995,84 428948,75 391157,69 91,12 5,47E-05 C33B73 100,00 201493,02 33443,28 4034,64 93,98 9,12E-05 C33B125 98,48 258779,13 79728,78 9203,75 78,26 1,54E-04 C33B55 96,39 188278,42 59155,10 7625,56 105,39 2,15E-04 C33B96 98,75 476040,28 475653,41 187925,80 55,23 2,28E-04 C33B124 100,00 798,33 126,37 90,26 172,03 2,38E-04 C33B72 96,94 328194,72 105474,59 12506,85 93,32 2,84E-04 C33B79 100,00 236644,03 41925,89 4988,81 77,78 3,28E-04 C33B77 92,11 241787,16 88691,05 11484,97 69,46 3,37E-04 C33B82 96,21 188508,56 41264,92 5033,60 73,44 3,41E-04
Prot.
ID de AA %Mon 60 nM de CD33 6 nM de CD33 0,6 nM de CD33 0 nM de kD CD33 C33B87 100,00 242185,48 79532,87 12547,05 73,65 3,52E-04 C33B80 98,33 5799,64 409,97 114,93 88,88 3,84E-04 C33B101 96,91 268805,28 204984,16 35513,63 70,07 3,98E-04 C33B83 98,07 92956,55 7856,70 1020,48 87,37 4,61E-04 C33B46 95,81 509865,97 447627,97 418017,22 134,53 4,67E-04 C33B94 98,31 200142,00 93852,22 13274,87 89,59 5,38E-04 C33B88 98,36 393148,13 481100,91 274293,53 94,81 8,25E-04 C33B66 98,71 444680,31 313288,41 56628,04 129,73 8,59E-04 C33B120 97,63 190036,14 60357,11 7054,28 92,94 1,40E-03 C33B64 98,13 200158,36 54138,77 7556,04 114,85 1,71E-03 C33B52 96,76 196557,09 46286,13 6751,01 82,46 3,13E-03 C33B56 95,59 143,73 79,73 111,95 138,04 4,02E-03 C33B75 98,68 163795,25 29603,57 4517,81 95,94 4,16E-03 C33B107 96,90 375388,25 339798,53 161369,64 86,54 4,44E-03 C33B63 98,79 247758,77 62221,71 9671,48 86,34 4,57E-03 C33B95 97,77 154556,58 44354,07 6402,00 87,38 5,99E-03 C33B61 98,87 198777,34 38699,10 5308,45 79,84 6,71E-03 C33B89 100,00 315,38 119,12 65,61 70,94 8,11E-03 C33B122 98,49 259183,69 84281,03 14291,17 65,01 8,74E-03 C33B62 99,05 157786,36 37359,44 6092,03 75,00 1,00E-02 C33B123 95,08 224078,95 88155,99 8864,39 71,05 1,03E-02 C33B54 100,00 147753,30 27461,06 3766,69 61,26 2,48E-02
Prot.
ID 60 nM de 6 nM de CD33 0,6 nM de 0 nM de CD33 kD de ligação de de AA CD33 de cino de cino CD33 de cino de cino CD33 de cino C33B48 56491,32 47326,85 43351,12 94,01 1,20E-04 C33B73 14799,14 6987,92 795,57 72,51 4,08E-04 C33B125 15603,45 11526,47 3458,27 70,22 3,51E-04 C33B55 16020,78 9994,42 2433,94 69,38 1,16E-04 C33B96 37273,19 20087,29 11574,59 86,31 8,19E-04 C33B124 593,00 132,19 77,26 98,41 4,77E-04 C33B72 19422,07 13975,14 3894,84 90,81 7,63E-04 C33B79 15538,97 6427,73 1082,85 63,59 6,82E-03 C33B77 17516,20 11665,49 3601,76 85,23 4,18E-04 C33B82 14269,38 6622,07 1540,09 84,24 6,70E-04 C33B87 19597,18 12652,44 3266,36 103,07 2,28E-04
Prot. ID 60 nM de 6 nM de CD33 0,6 nM de 0 nM de CD33 kD de ligação de de AA CD33 de cino de cino CD33 de cino de cino CD33 de cino C33B80 4612,58 248,60 108,93 82,38 2,66E-04 C33B101 48016,75 46115,96 17989,37 79,69 1,06E-04 C33B83 5304,40 687,44 159,37 87,35 2,17E-03 C33B46 49840,14 49816,36 49729,78 92,05 1,48E-04 C33B94 16126,84 10782,54 3183,70 87,82 5,37E-04 C33B88 50388,18 43928,95 43940,23 90,13 3,89E-04 C33B66 48905,04 49076,39 42160,22 77,96 9,33E-05 C33B120 13211,32 7865,37 2726,18 75,77 8,54E-04 C33B64 21109,59 9685,04 3102,56 99,82 1,21E-03 C33B52 12582,90 8444,39 2063,44 75,24 1,20E-03 C33B56 104,27 85,94 78,56 83,31 8,46E-04 C33B75 12194,41 5577,80 1709,40 124,32 1,20E-03 C33B107 50325,07 47810,05 36786,69 55,11 1,35E-04 C33B63 18322,71 11642,38 2879,89 87,94 9,47E-04 C33B95 14774,34 9594,12 1637,99 80,81 6,98E-03 C33B61 13552,71 8211,09 1595,90 106,84 1,83E-03 C33B89 47301,14 34193,78 23334,20 112,80 4,65E-05 C33B122 19740,29 13907,32 5838,25 82,53 1,45E-03 C33B62 12737,71 5620,17 1922,97 934,44 1,32E-03 C33B123 10665,93 10404,03 3232,18 61,08 2,74E-03 C33B54 50466,68 43011,75 38091,89 28785,80 1,35E-04
[0770] O painel de mAbs foi então adicionalmente caracterizado por análise de afinidade completa bem como por mapeamento de epítopos. A ligação de mAbs anti-CD33 ao CD33 de ECD-HSA humano recombinante (C33W2) e CD33 de ECD-HSA de cino recombinante (C33W1) foi medida por ProteOn SPR (Bio-Rad). IgG de cabra anti-Fc humana (Jackson Immunoresearch, n° de cat. 109-005-098) foi diretamente imobilizada via acoplamento de amina a 30 µg/mL em tampão de acetato, pH 5,0 em todos os 6 canais de ligação em orientação horizontal sobre GLC Sensor Chip (Bio-Rad, catálogo n° 176-5011) com uma vazão de 30 µL/min durante 300 segundos em PBS contendo 0,005% de Tween-20. As densidades de imobilização foram em média cerca de 5.000 Unidades de Resposta (RU) com variação menor que 5% dentre os diferentes canais. mAbs diferentes foram capturados na superfície de IgG anti-Fc humana a 0,25 ou 0,5 µg/mL (160 a 300 RU) na orientação vertical do ligante, com o 6° canal de ligação como controle de superfície sem ligante. Proteínas CD33-HSA humanas e de cino a uma concentração de 0,3 µM em séries de diluição de 3x de 5 concentrações fluíram como analito para ligar os mAbs capturados na orientação horizontal. Uma amostra de agente tamponante foi injetada no sexto canal para monitorar a dissociação do mAb capturado e a estabilidade da linha de base. A fase de dissociação para todas as concentrações de CD33-HSA humano e de cino foi monitorada a uma taxa de fluxo de 100 µL/minuto durante 15 minutos para a ligação a C33B782, 60 minutos para ligação a C33B912 (idêntico ao C33B904 com hIgG4), e a seguir pela regeneração com o uso de um pulso de 18 segundo de 0,85% de ácido fosfórico para remover o antígeno e o mAb ligado. Os dados de ligação brutos foram processados por referência dupla após a subtração dos dados de resposta a partir de: 1) os inter-spot para corrigir as interações não específicas entre o Ag e a superfície vazia do chip; 2) o canal de agente tamponante para corrigir o desvio de linha base devido à dissociação da superfície dos mAbs capturados ao longo do tempo. Os dados processados em todas as concentrações de antígeno para cada mAb foram globalmente ajustados para um modelo de ligação de Langmuir simples 1:1 para extrair estimativas das constantes cinéticas (kon, koff) e de afinidade (KD).
[0771] Para determinar no painel de mAbs se todos os mAbs se ligam a 1 epítopo distinto ou se houve uma cobertura ampla de epítopos, foi realizado um experimento de mapeamento de epítopos. O mapeamento de epítopos competitivos de mAbs CD33 foi realizado em um instrumento IBIS SPRi (Carterra) com o uso de um chip sensor e prisma CMD-200M. Cada anticorpo anti-CD33 foi diretamente imobilizado através de acoplamento de amina no circuito integrado a 10 µg/ml em tampão de acetato (pH 4,5) com o uso de um Microspotter de fluxo contínuo (CFM) separado. O chip sensor impresso foi então transferido para instrumento IBIS para as análises de mapeamento com o uso de um mapeamento em formato clássico ou de "sandwich". O mapeamento foi realizado por injeção sequencial de CD33 ECD-HSA humano, (C33W2) a 50 nM seguido de uma única injeção de mAb anti- CD33 como o analito competitivo em solução a 133 nM para ligar mAbs anti-CD33 imobilizados com regeneração de superfície após cada ciclo de injeção sequencial de antígeno e anticorpo.
[0772] Para monitorar a atividade dos mAbs imobilizados antes e após a regeneração, uma injeção de agente tamponante sem qualquer mAb competitivo foi realizada no início e no final do experimento para medir a atividade de ligação ao antígeno sozinho. A resposta da ligação dos mAbs competitivos em relação à ligação do tampão (antígeno isolado) é uma indicação se o anticorpo na solução bloqueia ou liga a ligação do antígeno aos MABs imobilizados. Os dados brutos do mapeamento (formato de arquivo.trix.) foram referenciados e zerados com o uso de software SprintX (Wasatch, Ver 1.9.3.2), então exportados (formato de arquivo.ibmx.) para o software de mapeamento HtTools.exe (Wasatch, versão 2.0.0.33) para análises. Os dados foram com curados mediante a remoção dos anticorpos com respostas de antígeno abaixo de 20 RU, e dos anticorpos que não se autobloquearam. As respostas dos mAb competitivos foram normalizadas em relação à resposta de ligação ao antígeno sozinho. Os anticorpos com respostas normalizadas < 0,25 foram designados bloqueadores, aqueles com respostas normalizadas ≥ 0,25 foram designados como não bloqueadores/sandwichers. Diferentes bins foram previstos com o uso de um corte na altura 2,5 no dendrograma (gráfico) combinado.
[0773] A tabela abaixo resume a análise cinética completa e o mapeamento de epítopos de 32 mAbs selecionados.
Há um total de 8 mAbs anti-CD33 que têm afinidade sub-nanomolar tanto para CD33 humano quanto para CD33 de cino e esses mAbs correspondem a 3 bins de epítopos distintos, enquanto o painel maior tem uma faixa de afinidades e 7 bins de epítopos distintos.
Tabela 5. Análise cinética completa e mapeamento de epítopos de mAbs derivados de OMNIRat ECD-HSA de CD33 humano Prot.
ID de AA Bin de ID da região V ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Epítopo C33B48 C33F53 1,62E+06 1,82E-05 1,12E-11 1 C33B46 C33F51 1,45E+06 1,99E-03 1,38E-09 1 C33B66 C33F71 3,85E+04 2,03E-03 5,29E-08 1 C33B107 C33F112 ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste 1 C33B88 C33F93 ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste 1 C33B96 C33F101 2,26E+05 4,36E-04 1,92E-09 3 C33B101 C33F106 1,62E+05 1,08E-03 6,64E-09 3 C33B73 C33F78 5,59E+05 5,59E-05 1,00E-10 4 C33B125 C33F130 9,92E+05 1,34E-04 1,40E-10 4 C33B55 C33F60 9,85E+05 2,53E-04 2,60E-10 4 C33B82 C33F87 4,45E+05 2,70E-04 6,10E-10 4 C33B83 C33F88 2,70E+05 5,21E-04 1,93E-09 4 C33B75 C33F80 3,85E+05 4,41E-03 1,14E-08 4 C33B123 C33F128 1,02E+06 1,52E-02 1,48E-08 4 C33B52 C33F57 2,06E+05 3,96E-03 1,92E-08 4 C33B61 C33F66 4,89E+05 1,05E-02 2,14E-08 4 C33B62 C33F67 5,07E+05 1,26E-02 2,49E-08 4 C33B64 C33F69 4,33E+05 2,21E-03 5,10E-09 4 C33B63 C33F68 5,33E+05 3,74E-03 7,01E-09 4 C33B122 C33F127 7,47E+05 7,12E-03 9,53E-09 4 C33B72 C33F77 8,71E+05 2,00E-04 2,30E-10 5 C33B79 C33F84 5,15E+05 3,90E-04 7,60E-10 5 C33B77 C33F82 8,28E+05 2,62E-04 3,20E-10 6 C33B87 C33F92 7,20E+05 4,32E-04 6,00E-10 6 C33B94 C33F99 9,22E+05 5,85E-04 6,30E-10 6
ECD-HSA de CD33 humano C33B95 C33F100 4,82E+05 7,40E-03 1,54E-08 6 C33B120 C33F125 5,75E+05 1,68E-03 2,93E-09 6 C33B89 C33F94 baixa ligação baixa ligação baixa ligação 8 C33B54 C33F59 baixa ligação baixa ligação baixa ligação 9 C33B124 C33F129 3,57E+05 1,24E-04 3,50E-10 NB C33B80 C33F85 3,23E+05 4,25E-04 1,32E-09 NB C33B56 C33F61 baixa ligação baixa ligação baixa ligação NB
ECD-HSA de CD33 de cino Prot.
ID de AA Bin de ID da região V ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Epítopo C33B48 C33F53 4,31E+06 1,58E-04 3,66E-11 1 C33B46 C33F51 2,97E+06 3,75E-04 1,26E-10 1 C33B66 C33F71 1,22E+06 2,66E-04 2,17E-10 1 C33B107 C33F112 3,31E+05 7,01E-05 2,12E-10 1 C33B88 C33F93 ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste 1 C33B96 C33F101 ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste 3 C33B101 C33F106 2,25E+05 2,69E-04 1,20E-09 3 C33B73 C33F78 6,00E+05 5,08E-04 8,46E-10 4 C33B125 C33F130 1,12E+06 3,39E-04 3,04E-10 4 C33B55 C33F60 1,16E+06 8,37E-05 7,23E-11 4 C33B82 C33F87 5,45E+05 7,51E-04 1,38E-09 4 C33B83 C33F88 2,47E+05 2,88E-03 1,17E-08 4 C33B75 C33F80 6,16E+05 1,32E-03 2,15E-09 4 C33B123 C33F128 1,26E+06 3,39E-03 2,69E-09 4 C33B52 C33F57 3,13E+05 1,48E-03 4,74E-09 4 C33B61 C33F66 7,34E+05 1,62E -03 2,21E-09 4 C33B62 C33F67 8,05E+05 1,49E-03 1,85E-09 4 C33B64 C33F69 5,90E+05 1,01E-03 1,71E-09 4 C33B63 C33F68 7,23E+05 8,80E-04 1,22E-09 4 C33B122 C33F127 ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste ligação/sem ajuste 4 C33B72 C33F77 9,19E+05 5,40E-04 5,87E-10 5 C33B79 C33F84 5,48E+05 2,20E-03 4,01E-09 5 C33B77 C33F82 1,08E+06 2,66E-04 2,47E-10 6 C33B87 C33F92 1,12E+06 2,64E-04 2,36E-10 6 C33B94 C33F99 1,10E+06 5,20E-04 4,73E-10 6 C33B95 C33F100 8,44E+05 8,06E-03 9,56E-09 6
ECD-HSA de CD33 de cino Prot. ID de AA Bin de ID da região V ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Epítopo C33B120 C33F125 8,76E+05 9,02E-04 1,03E-09 6 C33B89 C33F94 2,65E+05 2,01E-04 7,60E-10 8 C33B54 C33F59 1,32E+06 6,37E-04 4,84E-10 9 C33B124 C33F129 4,67E+05 4,72E-04 1,01E-09 NB C33B80 C33F85 4,92E+05 2,59E-04 5,27E-10 NB C33B56 C33F61 baixa ligação baixa ligação baixa ligação NB
[0774] O painel OmniMouse (total de 8 mAbs) foi gerado separadamente e caracterizado adicionalmente para ligação a células. A ligação celular foi realizada conforme descrito acima e resumido na tabela abaixo. Dos 8 mAbs testados, 6 se ligaram diretamente a células que expressam CD33 enquanto 2 não se ligaram. Tabela 6. Ligação celular de mAbs derivados de OMNIMouse a linhagens celulares que expressam CD33 humano e de cino Parental CD33 humano mAb 60 nM 6 nM 0,6 nM 0 nM 60 nM 6 nM 0,6 nM 0 nM C33B909 253,50 206,04 169,77 119,51 176,49 170,25 154,00 191,28 C33B910 193,52 176,14 108,46 190,17 213,55 183,33 151,25 155,29 C33B911 1466,02 389,41 186,22 113,30 237954,27 100333,48 13501,02 114,07 C33B912 977,91 273,07 140,62 124,53 237140,86 101295,70 15726,96 149,54 C33B913 174,49 118,08 123,26 129,07 518952,00 409071,06 204694,14 127,82 C33B914 181,37 142,74 139,10 113,48 304350,88 315129,56 153252,58 185,45 C33B915 101,28 147,65 143,51 100,00 390477,25 362902,66 138398,56 112,22 C33B916 416,08 145,16 115,70 91,75 447815,47 404033,19 192941,55 167,07 CD33 de cino mAb 60 nM 6 nM 0,6 nM 0 nM C33B909 180,33 135,33 115,73 124,03 C33B910 202,42 135,18 116,71 175,97 C33B911 17036,56 7729,14 1935,16 97,94 C33B912 15070,88 7271,38 1726,03 124,69 C33B913 40661,90 36920,95 35224,10 106,19 C33B914 44964,85 33368,26 22086,01 86,76
CD33 de cino C33B915 37495,34 35692,21 36165,59 113,92 C33B916 41004,43 33294,78 22790,61 104,43
[0775] Os 6 mAbs que se ligaram ao CD33 nas células foram adicionalmente caracterizados biofisicamente através de análise cinética completa ao antígeno recombinante com o uso dos métodos descritos acima e resumidos na tabela abaixo. Dos 6 mAbs testados, 1 se ligou ao CD33 humano com uma afinidade picomolar (C33B912) e ao CD33 de cino com afinidade subnanomolar, enquanto 1 apresentou afinidade muito forte para CD33 humano, mas apenas afinidade nanomolar para CD33 de cino (C33B911). Mais dois clones apresentaram afinidade subnanomolar para CD33 humano e para CD33 de cino (C33B913 e C33B916), mas nenhuma afinidade estava na faixa de C33B912. Tabela 7. Análise cinética total de mAbs derivados de OMNIMouse ECD-HSA de CD33 humano ECD-HSA de CD33 de cino mAb ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) C33B911 1,10E+06 4,14E-05 3,78E-11 1,15E+06 1,15E-03 1,00E-09 C33B912 1,42E+06 4,29E-05 3,02E-11 1,50E+06 6,50E-04 4,33E-10 C33B913 6,60E+05 6,40E-04 9,69E-10 2,56E+06 3,08E-04 1,20E-10 C33B914 4,44E+05 9,80E-03 2,21E-08 5,29E+05 2,33E-04 4,40E-10 C33B915 2,18E+05 9,89E-04 4,53E-09 3,81E+06 8,93E-05 2,34E-11 C33B916 6,27E+05 4,11E-04 6,55E-10 4,73E+05 4,03E-04 8,2E-10
[0776] Um experimento de mapeamento de epítopos realizado nos 6 mAbs de ligação derivados de OMNIMouse juntamente com vários mAbs de controle identificados anteriormente na campanha OMNIRat. Os mAbs de controle foram escolhidos com base na sua afinidade subnanomolar ao CD33 humano e no número de bins de epítopos distintos. O software de mapeamento HtTools atribui números aos bins de epítopos números em uma base experimental e ter, portanto, vários controles com bins de epítopos já definidos foi de importância crítica para comparação cruzada. Os dois clones de CD33 humano de alta afinidade derivados de OMNIMouse (C33B911 e C33B912) foram ambos binados com clones do bin 4 acima (o bin 4 neste experimento, enquanto o clone subnanomolar(C33B916) foi binado em 2 juntamente com C33B836 (bin 1 no experimento acima). Tabela 8: Bins de epítopos de mAbs anti-CD33 de OMNIMouse mAb ID da região V Bin de epítopo C33B915 C33F553 1 C33B916 C33F554 2 C33B836 C33F53 2 C33B914 C33F552 2 C33B913 C33F551 3 C33B806 C33F106 3 C33B911 C33F549 4 C33B912 C33F550 4 C33B778 C33F78 4 C33B830 C33F130 4 C33B782 C33F82 5 C33B792 C33F92 5 C33B799 C33F99 5 C33B760 C33F60 6 C33B777 C33F77 7
[0777] O CD33 é compreendido de 2 domínios de IgG, o domínio V distal à membrana, e o domínio C2 proximal à membrana. O SNP rs12459419 pode fazer com que o splicing alternativo seletivo do transcrito de mRNA de CD33 produza uma forma C2 apenas expressa em células e, portanto, o direcionamento para este domínio pode fornecer benefício clínico. Para determinar a qual dos dois domínios os mAbs foram capazes de se ligar, uma triagem de taxa de dissociação foi realizada após o protocolo acima em 6 mAbs com a mais alta capacidade de ligação que cobriu 4 bins de epítopos distintos com o uso de ECD-HSA de CD33 humano, V-HSA de CD33 humano e C2-HSA de CD33 humanos como os antígenos de ligação. Conforme mostrado na tabela abaixo, os dois clones anteriormente agrupados no bin 4 se ligaram ao domínio C2 de huCD33, mas não o domínio V de huCD33, enquanto os clones nos bins 2 e 3 se ligaram ao domínio V, mas não ao domínio C2. Dois clones agrupados no bin 5 não se ligaram a nenhum domínio e, portanto, seu local exato de ligação poderia abranger os dois domínios. Três (3) mAbs comercialmente disponíveis foram incluídos neste experimento (WM53 (EMD Millipore; Darmstadt, Alemanha), P67.7 (Biolegend, San Diego, CA, EUA), e LSBio clone 906 (lifespan Biosciences, Seattle, WA, EUA)) e todos mostraram ligação no domínio V, mas não no domínio C2. Os bins de epítopos nas Tabelas 5 e 8 em relação aos dados de ligação no domínio C2 na Tabela 9 mostram que há um total de 15 mAbs que poderiam potencialmente se ligar ao domínio C2 em uma faixa de afinidades de ~25 nM a ~30 pM na proteína humana de comprimento total. Tabela 9. Ligação de domínio off-rate ECD-HSA de huCD33 V-HSA de huCD33 C2-HSA de huCD33 Bin de epítopo ID da proteína kd (1/s) kd (1/s) kd (1/s) Resposta de ligação C33B912 1,29E-05 baixa/nenhuma 6,68E-05 4 Resposta de ligação C33B778 4,72E-05 baixa/nenhuma 2,57E -03 4 Resposta de ligação Resposta de ligação C33B782 2,58E-04 baixa/nenhuma baixa/nenhuma 5 Resposta de ligação Resposta de ligação C33B792 4,27E-04 baixa/nenhuma baixa/nenhuma 5 Resposta de ligação C33B836 5,52E-05 3,71E-05 baixa/nenhuma 2 Resposta de ligação C33B806 1,36E-03 3,18E-03 baixa/nenhuma 3 Resposta de ligação WM53 2,37E-03 3,78E-02 baixa/nenhuma Resposta de ligação P67,7 1,05E-03 2,43E-03 baixa/nenhuma Clone 906 Resposta de ligação LSBio 2,45E-03 4,34E-02 baixa/nenhuma
[0778] Para reforçar os estudos em vivo e em vitro, clones selecionados (C33B836, C33B782, C33B778, C33B904, C33B806, C33B830, C33B937, C33B792, C33B760, e C33B777) foram escolhidos para aumento em escala e troca do braço fab para produzir moléculas DuoBody biespecíficas com anticorpos anti-CD3. Células ExpiCHO-S™ (ThermoFisher Scientific) foram semeadas a uma densidade de 1,25 x 105 – 2,25 x 105 células viáveis/mL em meio de expressão de ExpiCHO™ e cultivadas em frascos de agitação Erlenmeyer, descartáveis, estéreis, ventilados, não aletados de policarbonato, em uma incubadora agitadora a 37°C, 7% de CO2 (INFORS HT Multitron Pro). Para crescimento celular de rotina em frascos de 125 mL a 2 L, a velocidade de agitação foi ajustada para 130 rpm por agitadores com um diâmetro de agitação de 19 mm. As células foram subcultivadas quando a densidade atingiu a fase exponencial de crescimento celular a 4 × 106 – 6 × 106 células viáveis/mL com uma viabilidade de 98 a 99%.
[0779] Dois dias antes da transfecção, as células ExpiCHO-S™ foram semeadas a 1,5 x 106 células viáveis/mL para o volume de cultura necessário. No dia da transfecção, foram determinadas a densidade de células viáveis e a porcentagem de viabilidade celular. As células foram transfectadas a uma densidade de 6 x 106 células viáveis/mL. Para transfecção ótima, foi usado DNA plasmidial estéril de cadeia pesada e leve a uma concentração ≥1 mg/mL em tampão TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 m, pH 8,0).
[0780] As células ExpiCHO-S™ foram transfectadas segundo o protocolo do fabricante Max Titer Transfection (ThermoFisher de publicação número MAN0014337). Todas as quantidades e volumes mostrados abaixo foram por mL do volume final da cultura transfetada. Resumidamente, o DNA plasmidial foi diluído com 0,04 mL de meio OptiPRO™ frio (ThermoFisher Scientific) na seguinte razão: 0,125 µg de DNA de cadeia pesada: 0,375 µg de DNA de cadeia levada: 0,5 µg de pAdvantage. 6,4 µL de reagente de transfecção ExpiFectamine™ CHO foram diluídos e misturados gentilmente com 0,04 mL de meio OptiMEM™ frio e incubados durante 1 min. O reagente
ExpiFectamine™ CHO diluído foi adicionado ao DNA diluído, misturado gentilmente e os complexos ExpiFectamine™ CHO/DNA plasmidial foram incubados à temperatura ambiente durante 5 minutos. Após a incubação, os complexos foram adicionados às células ExpiCHO-S™ em um frasco agitador e incubados de um dia para o outro em uma incubadora agitadora a 37°C, 7% de CO2.
[0781] Para o protocolo de titulação máxima, no dia 1 após a transfecção, 6 µL de ExpiFectamine™ CHO Enhancer e 160 µL de ExpiCHO™ Feed foram adicionados e o frasco foi transferido para uma incubadora agitador a 32°C, 7% de CO2. No dia 5 após a transfecção, 160 µL de ExpiCHO™ Feed foram adicionados pela segunda vez ao frasco o qual foi colocado de volta na incubadora a 32°C, com agitação. A cultura foi coletada no dia 12 após a transfecção, centrifugada a 5.000 rpm durante 15 minutos e clarificada através de uma cápsula de filtro Acropak 1500, 0,2 um (Pall).
[0782] Os anticorpos expressos foram purificados dos sobrenadantes clarificados com o uso de resina mAbSelect Sure (GE Healthcare). As colunas carregadas com proteína A MabSelect foram equilibradas com 1x D -PBS, pH 7,2 antes do carregamento dos sobrenadantes de cultura individuais. As proteínas não ligadas foram removidas por lavagem extensiva com 1x D-PBS, pH 7,2. As proteínas ligadas foram eluídas com 0,1M de acetato de sódio, pH 3,5. As frações de pico foram neutralizadas com Tris 2,5 M, pH 7,2 e agrupadas. Os pools das frações neutralizadas foram dialisados em 1xdPBS para ensaios e caracterização biofísica ou utilizados para a montagem do DuoBody biespecífico.
[0783] A concentração de proteína para cada pool de eluição foi determinada mediante medição da absorbância a OD280 nm e cálculo do coeficiente de extinção com base na sequência de aminoácidos.
[0784] Exemplo 3: Troca de braço Fab com o uso de mAbs parentais purificados
[0785] A formação dos anticorpos biespecíficos CD33 X CD3 exige dois mAbs parentais, um específico para o braço de direcionamento (por exemplo, CD33) e um específico para o braço efetor (por exemplo, CD3). Os mAbs CD33 foram recombinados com um braço de alta afinidade (CD3B219) ou um braço CD3 de baixa afinidade (CD3B376). Estes mAbs parentais estão no formato IgG4 PAA (Labrijn et al., 2013) onde o parental de direcionamento (CD33) contém a mutação K409R (aminoácido nativo para IgG4), enquanto o parental de morte (CD3) contém a mutação F405L e R409K. O anticorpo monoespecífico anti- CS3 foi expresso como IgG4, tendo as substituições de Fc S228P, F234A, L235A, F405L, e R409K (braço CD3)(numeração de acordo com o índice EU) nas suas regiões Fc. Os anticorpos monoespecíficos foram expressos e purificados conforme descrito acima. Após a purificação, os anticorpos CD33 parentais foram misturados com o anticorpo CD3 parental desejado sob condições redutoras em 75 mM de cisteamina- HCl e incubados a 31°C durante 5 horas. As reações de recombinação foram baseadas em razões molares, onde uma quantidade definida de anticorpo CD33 (por exemplo, 10 mg, ou ~74,6 nanomols) foi combinada com o anticorpo CD3 (por exemplo, ~67,8 nanomols), onde o anticorpo CD33 foi adicionado em um excesso de 6% do anticorpo CD3. As concentrações dos estoques de anticorpo CD33 estavam na faixa de 0,8 a 6 mg/mL, e os volumes das reações de recombinação variaram para cada pareamento. As reações de recombinação foram subsequentemente dialisadas contra PBS durante a noite para remover o redutor. As reações dos anticorpos biespecíficos CD33xCD3 foram realizadas com um excesso do anticorpo CD33 (razão) para minimizar a quantidade do anticorpo CD3 parental não reagido que permaneceu após a recombinação.
[0786] Os anticorpos biespecíficos CD33 X CD3 finais produzidos,
juntamente com os mAbs parentais (CD33, CD3, ou Null) usados nas reações de recombinação são mostrados na Tabela 10.
[0787] Os acertos ("hits") de CD33 selecionados foram também pareados com um braço não-morte (Null) para criar controlos negativos para fins de teste. Para os anticorpos biespecíficos do controle, B2M1, um anticorpo de RSV no formato IgG4 PAA foi gerado, purificado e, combinado com os braços CD3 CD3B219 e D3B376 -F405L, R409K para gerar CD3B288 (CD3xNull) e CD3B510 (CD3B376xNull) ou os braços CD33 C33B836, C33B806, C33B782, C33B792, C33B760, C33B830, C33B799, C33B778, C33B777 para gerar C33B941, C33B943, C33B946, C33B945, C33B949, C33B942, C33B944, C33B947, C33B948, respectivamente (CD33xNull). Tabela 10: Anticorpos biespecíficos CD33 x CD3 Ab bispec Parental ID do Pep da SEQ ID SEQ ID ID do Pep SEQ ID SEQ ID HC do Pec do Nuc da LC do Pep do Nuc da HC da JHC da LC da LC C33B836 C33H80 52 94 C33L73 136 178 C3CB7 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B830 C33H84 51 93 C33L66 135 177 C3CB5 CD3B219 CD3H141 244 147 CD3L66 250 253 C33B806 C33H69 50 92 C4LL152 134 176 C3CB4 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B799 C33H98 49 91 C33L69 133 175 C3CB16 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B792 C33H87 48 90 C33L35 132 174 C3CB14 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B782 C33H72 47 89 C33L40 131 173 C3CB12 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B778 C33H66 46 88 C33L60 130 172 C3CB11 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B777 C33H65 45 86 C33L47 129 171 C3CB10 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B760 C33H45 44 85 C33L11 128 170 C3CB8 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C3CB97 C33B836 C33H80 52 94 C33L73 136 178
Ab bispec Parental ID do Pep da SEQ ID SEQ ID ID do Pep SEQ ID SEQ ID HC do Pec do Nuc da LC do Pep do Nuc da HC da JHC da LC da LC CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B830 C33H84 51 93 C33L66 135 177 C3CB98 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B806 C33H69 50 92 C4LL152 134 176 C3CB99 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B799 C33H98 49 91 C33L69 133 175 C3CB100 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B792 C33H87 48 90 C33L35 132 174 C3CB101 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B782 C33H72 47 89 C33L40 131 173 C3CB102 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B778 C33H66 46 88 C33L60 130 172 C3CB103 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B777 C33H65 45 86 C33L47 129 171 C3CB104 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B760 C33H45 44 85 C33L11 128 170 C3CB105 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B836 C33H80 52 94 C33L73 136 178 C33B941 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B830 C33H84 51 93 C33L66 135 177 C33B942 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B806 C33H69 50 92 C4LL152 134 176 C33B943 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B799 C33H98 49 91 C33L69 133 175 C33B944 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B792 C33H87 48 90 C33L35 132 174 C33B945 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B782 C33H72 47 89 C33L40 131 173 C33B946 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B778 C33H66 46 88 C33L60 130 172 C33B947 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B777 C33H65 45 86 C33L47 129 171 C33B948 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255 C33B760 C33H45 44 85 C33L11 128 170 C33B949 B23B49 B23H1 246 249 B23L3 252 255
Ab bispec Parental ID do Pep da SEQ ID SEQ ID ID do Pep SEQ ID SEQ ID HC do Pec do Nuc da LC do Pep do Nuc da HC da JHC da LC da LC B23B39 B23H1 246 249 B23L3 252 255 CD3B288 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 B23B39 B23H1 246 249 B23L3 252 255 CD3B510 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254 C33B903 C33H251 182 198 C33L117 214 230 C3CB87 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B904 C33H252 183 199 C33L118 215 231 C3CB88 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B905 C33H253 184 200 C33L119 216 232 C3CB89 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B907 C33H255 186 202 C33L121 218 234 C3CB90 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B908 C33H256 187 203 C33L122 219 235 C3CB91 CD3B219 CD3H141 244 247 CD3L66 250 253 C33B904 C33H252 183 199 C33L118 215 231 C3CB189 CD3B376 CD3H219 245 248 CD3L150 251 254
[0788] Pep: Peptídeo; Nuc: Nucleotídeo; SEQ ID: SEQ ID NO
[0789] Exemplo 4: Ensaios de citotoxicidade in vitro mediada por células T com anticorpos biespecíficos CD33xCD3
[0790] Ensaios de citotoxicidade in vitro mediada por células T foram realizados para avaliar se os acertos de CD33 pareados com o braço CD3 (CD3B219) medeiam a morte da linhagem celular de LMA que expressa CD33 OCI-AML5. Resumidamente, células efetoras (células pan-T adquiridas junto à Biological Speciality) foram coletadas, contadas, lavadas e ressuspensas em 1x106 células/mL em meio celular RPMI (Invitrogen) com 10% de FBS (Invitrogen). As células-alvo (MOLM13) foram marcadas com CFSE (Invitrogen) e ressuspensas em 2x105 células/mL em RPMI com 10% de FBS. As células efetoras e as células-alvo marcadas com CFSE foram misturadas a E:T=5:1 em placas de fundo redondo de 96 poços. 10 µL de bloco Fc (fragmento ReoPro Fc) juntamente com um 5 µL de alíquota de anticorpo biespecífico foram adicionados a cada poço contendo diferentes concentrações. As coculturas foram incubadas a 37°C durante 48 horas sob 5% de CO2. Após 48 horas, o tampão de coloração de células mortas, fixável, próximo ao IV LIVE/DEAD® (Life Technologies) foi adicionado às amostras, e as culturas foram incubadas durante 20 minutos no escuro à temperatura ambiente, lavadas e ressuspensas em 100 a 200 µl de tampão de FACs. A citotoxicidade induzida por fármaco foi determinada com o uso de citômetro de fluxo CANTO II (BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ, EUA, e analisada com o software FlowJo ou o software Dive (BD Biosciences). A população de interesse são as células duplo-positivas CFSE+/ live/dead+. Conforme mostrado na Figura 1, todos os anticorpos multiespecíficos para CD33xCD3, induziram citotoxicidade celular redirecionada por células T de células MOLM-13 de CD33+ em 48 horas. A Tabela 11 resume os valores de EC50 gerados com os anticorpos multiespecíficos CD33xCD3. Os 4 anticorpos principais, C3CB10, C3CB12, C3CB7 e C3CB88 foram levados adiante para caracterização adicional. Tabela 11: Ensaios de citotoxicidade mediada por células T de CD33xCD3 Sumário de valores EC50 para 13 anticorpos biespecíficos CD33xCD3 Leva C3CB8 C3CB10 C3CB28 C3CB12 C3CB14 C3CB16 C3CB5 C3CB7 EC50 de 0,513 0,4728 0,6041 0,2677 0,538 0,6669 1,262 0,02129 citotoxicidade (nM) Leva C3CB87 C3CB88 C3CB89 C3CB90 C3CB91 EC50 de 0,067 0,11 0,41 10,56 0,35 citotoxicidade (nM)
[0791] Exemplo 5: Redução ex vivo mediada por CD33xCD3 de blastos de LMA e ativação de células T em uma amostra primária de
LMA
[0792] Para avaliar adicionalmente o potencial de citotoxicidade dos anticorpos biespecíficos CD33xCD3, um ensaio de citotoxicidade ex vivo foi realizado usando-se sangue total de paciente com LMA e os quatro anticorpos principais de LMA (Figura 2). Neste ensaio, vários anticorpos biespecíficos (anticorpos CD33 pareados com qualquer braço CD3 CD3B219 e CD3B376) foram adicionados ao sangue total diluído de doadores de LMA durante um período de 48 horas sem fornecer células T adicionais, uma vez que este ensaio depende da presença de células T autólogas no sangue do doador. Em 48 horas, as amostras foram coradas com CD3 PerCPCy5.5, CD25 PE, CD33 FITC e CD38 APC (todos os anticorpos foram adquiridos junto à Biolegend; San Diego, CA, EUA). As amostras foram então lavadas ao menos 3 vezes em tampão de lise de 1x de glóbulos vermelhos (RBC) (eBioscience). As amostras foram então coradas com o tampão de coloração de células mortas, fixável, próximo ao IV LIVE/DEAD® (à Life Technologies). A extensão da citotoxicidade tumoral foi determinada primeiro por quantificação das células CD33+ vivas na fração de células cancerosas de pacientes com LMA (definidas como células CD3-CD38+) na presença dos anticorpos biespecíficos. A citotoxicidade foi calculada como uma porcentagem em relação ao PBS/controle não tratado usando-se a seguinte equação: (% de CD33+ em PBS/controle não tratado - % de CD33+ na amostra tratada)/(% de CD33+ em PBS/controle não tratado). A ativação de células T foi calculada como uma porcentagem de eventos CD25+ na fração CD3+.
[0793] Conforme mostrado na Figura 2, todos os anticorpos lead CD33 pareados com qualquer braço de CD3 (CD3B376 e CD3B219) promoveram uma redução dose-dependente da citotoxicidade total que se correlacionou com a ativação das células T após 48 horas. Os anticorpos de controle de braço Null (NullxCD3B219 e nullxCD3B376) não mostraram citotoxicidade de células tumorais ou ativação de células
T. Esse resultado também demonstrou que os anticorpos biespecíficos CD33xCD3 agem em uma configuração autóloga. Esses resultados são representativos de 4 outras amostras de doadores de LMA (dados não mostrados). A Tabela 12 resume os valores de EC50 gerados com os anticorpos multiespecíficos CD33xCD3. Conforme visto a partir dos valores de EC50, o C33B904 pareado com qualquer braço de CD3 (C3CB88, C3CB189) bem como o C33B836 pareado com qualquer braço CD3 (C3CB7, C3CB97) foram os anticorpos mais potentes e eficazes. Estes 4 anticorpos foram, portanto, o foco da caracterização adicional. Tabela 12: Ensaios de citotoxicidade ex vivo mediada por célula T de CD33xCD3 Resumo dos valores de E50 para 8 anticorpos biespecíficos CD33xCD3 ID do anticorpo biespecífico EC50 que induz morte de células de LMA primárias (nM) C3CB11 3,958 C3CB12 2,635 C3CB7 0,3315 C3CB88 0,6722 C3CB103 4,186 C3CB102 4,973 C3CB97 0,2316 C3CB189 0,5782
[0794] Exemplo 6: Demonstração de que o anticorpo biespecífico CD33xCD3 se liga aos domínios C2 de CD33 e induz a citotoxicidade de linhagens celulares de CD33 que expressam polimorfismo de nucleotídeo único (SNP)
[0795] Ensaios de citotoxicidae in vitro mediada por células T com anticorpos biespecíficos CD33xCD3
[0796] Estudos recentes mostraram que um polimorfismo de um nucleotídeo único (SNP) rs12459419 estava presente em ~50% da população de LMA e leva ao salto do éxon 2 de CD33 que resulta na deleção do domínio V de CD33. Este estudo também mostrou que Mylotarg que se liga ao domínio V de CD33 V, não apresentou qualquer eficácia em pacientes que expressam o SNP, e, portanto, reduziram o risco de recidiva e aumentaram a sobrevida em ~50% da população de LMA AML da LMA população (Lamba et al. 2017, JCO, CD33 Splicing Polymorphism Determines Gemtuzumab Ozogamicin Response in De Novo Acute Myeloid Leukemia: Report From Randomized Phase III Children's Oncology Group Trial AAML0531). Tendo em conta os dados com Mylotarg no estudo acima mencionado, ensaios de citotoxicidade in vitro mediada por células de T foram realizados para avaliar se os acertos de CD33 (C33B836 de ligação V vs C33B904 de ligação C2) pareados com braços de CD3 (CD3B219 ou CD3B376) medeiam a morte das linhagens celulares que expressam SNP rs12459419. Resumidamente, células efetoras (células pan-T adquiridas junto à Biological Speciality) foram coletadas, contadas, lavadas e ressuspensas em 1x106 células/mL em meio celular RPMI (Invitrogen) com 10% de FBS (Invitrogen). As células-alvo (KG1, SH2 e OCIAML3) foram marcadas com CFSE (Invitrogen #C34554) e ressuspensas em 2x105 células/mL em RPMI com 10% de FBS.
KG1, SH2 e OCIAML3 foram escolhidos para representar heterozigoto e homozigoto, de tipo selvagem, para a mutação de CD33 SNP rs12459419, respectivamente.
As células efetoras e as células-alvo marcadas com CFSE foram misturadas na razão efetor-alvo (E:T) = 5:1 em placas de fundo redondo de 96 poços. 10 µL de bloco Fc (fragmento ReoPro Fc) juntamente com um 5 µL de alíquota de anticorpo biespecífico foram adicionados a cada poço contendo diferentes concentrações.
As coculturas foram incubadas a 37°C durante 48 horas sob 5% de CO2. Após 48 horas, o tampão de coloração de células mortas, fixável, próximo ao IV LIVE/DEAD® (Life Technologies) foi adicionado às amostras, e as culturas foram incubadas durante 20 minutos no escuro à temperatura ambiente, lavadas e ressuspensas em 100 a200 µL de tampão de FACs. A citotoxicidade induzida por fármaco foi determinada com o uso do citometria de fluxo CANTO II (BD Biosciences) e analisada com o software FlowJo ou o software Dive (BD Biosciences). A população de interesse são as células duplo-positivas CFSE+/ live/dead+. Conforme mostrado na Figura 3, ao contrário dos controles de braço Null (null x CD3B219 e null x CD3B376), anticorpos multiespecíficos CD33xCD3 de ligação V e ligação C2 induziram a citotoxicidade celular redirecionada a células T de CD33+ WT para a linhagem celular KG1 das mutações SNP rs12459419 KG1 em 48 horas. Em contrapartida, ao contrário do C33B836 de ligação V (C3CB97, C3CB7), apenas os anticorpos biespecíficos emparelhados C33B904 de ligação C2 (C3CB189, C3CB88) mediaram a citotoxicidade das linhagens celulares SH2 e OCIAML3 que foram heterozigotas ou homozigotas para as mutações SNP rs12459419, respectivamente. Por essa razão, os anticorpos biespecíficos C33B904 pareados (C3CB189, C3CB88) foram levados adiante para análise e caracterização adicionais. Coletivamente, esses dados sugerem que anticorpos biespecíficos CD33 de ligação C2 como os anticorpos biespecíficos C33B904 pareados têm o potencial para mostrar eficácia em um grupo mais amplo de pacientes com LMA do que os anticorpos anti-CD33 competitivos de ligação V.
[0797] Exemplo 7: Redução ex vivo mediada por CD33xCD3 de reforço em MOLM-13 e monócitos em um ensaio de citotoxicidade ex vivo de MOLM-13 de sangue total
[0798] Para avaliar o potencial de citotoxicidade de anticorpos biespecíficos CD33xCD3 para eliminar reforços em células MOLM-13 e em monócitos humanos normais, foi usado um ensaio de citotoxicidade ex vivo usando-se sangue total humano, saudável, normal com linhagem celular MOLM-13 de LMA de CD33+ exogenamente adicionada. De modo semelhante ao experimento acima, vários anticorpos biespecíficos (anticorpos CD33 pareados com qualquer braço de CD3 CD3B219 e CD3B376) foram adicionados ao sangue total diluído de 6 doadores humanos normais diferentes durante um período de 48 horas sem fornecimento de células T adicionais, uma vez que este ensaio depende da presença de T células autólogas no sangue do doador.
Antes da diluição, a concentração de células T no sangue de cada doador foi enumerada.
O sangue foi então diluído com células MOLM-13 marcadas com CFSE (Nitrocelulose), de modo que a razão efetor:alvo (E: T) é 1:5 para mimetizar a razão efetor:alvo em amostras de pacientes com LMA.
Em 48 horas, as amostras foram coradas com CD3 PerCPCy5.5, CD25 PE, CD33 FITC e CD14 Pacific Blue (todos os anticorpos foram adquiridos junto à Biolegend). As amostras foram então lavadas ao menos 3 vezes em tampão de lise de 1x de glóbulos vermelhos (RBC) (eBioscience). As amostras foram então coradas com o tampão de coloração de células mortas, fixável, próximo ao IV LIVE/DEAD® (à Life Technologies). A extensão da citotoxicidade tumoral foi determinada primeiro por quantificação das células CD33+ vivas na fração de monócitos CD14+ na presença dos anticorpos biespecíficos.
A citotoxicidade das células MOLM-13 foi determinada enumerando-se a porcentagem de células CFSE+ mortas.
A citotoxicidade foi calculada como uma porcentagem em relação ao controle de PBS/não tratado usando-se a seguinte equação: (% de CD33+ CD14+ em PBS/controle não tratado-% de CD33+ CD14+ em amostra tratada)/(% de CD33+ CD14+ em PBS/controle não tratado). Os dados na Figura 4 indicam que ambos os anticorpos biespecíficos CD33xCD3 (mesmo CD33 lead C33B904 pareado com qualquer braço CD3, CD3B376 e CD3B219) induzem especificamente a citotoxicidade celular de células MOLM-13 e monócitos CD33+ em 48 h.
Os controles de braço nulo foram usados como controles negativos de anticorpos biespecíficos.
O controle de braço nulo mostrou pouca a nenhuma atividade de citotoxicidade dos monócitos MOLM-13 e CD33+. Esses dados mostram os valores médios de 6 doadores normais diferentes. Os valores médios de EC50 para a citotoxicidade de monócitos MOLM- 13 e CD14+ são mostrados na Tabela 13.
[0799] Tabela 13: Ensaios de citotoxicidade ex vivo mediada por célula T de CD33xCD3 Sumário de valores EC50 para 2 anticorpos biespecíficos CD33xCD3. ID de anticorpos EC50 de morte de MOLM13 EC50 de morte de CD33+ CD14+ biespecíficos (nM) (nM) C3CB189 0,1677 1,156 C3CB88 0,671 0,506
[0800] Exemplo 8: Demonstração de reatividade cruzada de espécies de anticorpos biespecíficos CD33xCD3 a macaco cynomolgo
[0801] Redução ex vivo mediada por CD33xCD3 de monócitos em um ensaio de citotoxicidade ex vivo com sangue total de cinomolgo
[0802] Para demonstrar a reatividade cruzada funcional e para avaliar o potencial de citotoxicidade de anticorpos biespecíficos CD33xCD3 na eliminação de monócitos cinomolgos normais, foi usado um ensaio de citotoxicidade ex vivo com o uso de sangue total de cinomolgo saudável. De modo semelhante ao experimento acima, vários anticorpos biespecíficos (anticorpos CD33 pareados com qualquer braço de CD3 CD3B219 e CD3B376) foram adicionados ao sangue total diluído de 6 doadores humanos normais diferentes durante um período de 48 horas sem fornecimento de células T adicionais, uma vez que este ensaio depende da presença de T células autólogas no sangue dos doadores. Em 48 horas, as amostras foram coradas com CD3 PerCPCy5.5, CD25 PE, CD33 FITC e CD14 Pacific Blue (todos os anticorpos foram adquiridos junto à Biolegend exceto para o anticorpo CD33 que foi adquirido junto a Miltenyi; Bergisch Gladbach, Alemanha). As amostras foram então lavadas ao menos 3 vezes em tampão de lise de 1x de glóbulos vermelhos (RBC) (eBioscience) antes da coloração com o tampão de coloração de células mortas, fixável, próximo ao IV LIVE/DEAD® (Life Technologies) A extensão da citotoxicidade dos monócitos foi determinada primeiro por quantificação das células CD33 + vivas na fração de monócitos CD14+ na presença dos anticorpos biespecíficos. A citotoxicidade foi calculada como uma porcentagem em relação ao PBS/controle não tratado usando-se a seguinte equação: (% de CD33+ CD14+ em PBS/controle não tratado-% de CD33+ CD14+ em amostra tratada)/(% de CD33+ CD14+ em PBS/controle não tratado). A ativação de células T foi calculada como uma porcentagem de eventos CD25+ na fração CD3+. Os dados na Figura 5 indicaram que ambos os anticorpos biespecíficos CD33xCD3 (mesmo CD33 lead C33B904 pareado com qualquer braço CD3, CD3B376 e CD3B219) induziram especificamente a citotoxicidade celular de monócitos CD33+ bem como a ativação de células T em 48 h. Os controles de braço nulo foram usados como controles negativos de anticorpos biespecífico e mostraram pouca a nenhuma citotoxicidade ou atividade de células T. A Tabela 14 mostra os valores médios de 6 doadores cinomolgos diferentes.
[0803] Tabela 14: Ensaios de citotoxicidade ex vivo mediada por células T de CD33xCD3. Resumo dos valores de E50 para 2 anticorpos biespecíficos CD33xCD3. ID de proteína AA EC50 de morte de CD33+ CD14+ (nM) EC50 de ativação de células T (nM) C3CB189 3,60 0,02 C3CB88 0,89 0,02
[0804] Exemplo 9: Eficácia de C3CB189 e C3CB88 em xenoenxertos de MOLM-13 de LMA humana em camundongos NSG humanizados com células T
[0805] A eficácia de C3CB189 e C3CB88 foi avaliada em xenoenxertos de leucemia mielóide aguda (LMA) humana estabelecida de MOLM-13 disseminada transfectada com luciferase em camundongos fêmeas NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) humanizados com 20 milhões de células T. Os animais foram randomizados em n=10/grupo por imageamento de bioluminescência ao vivo (BLI) no dia 5 após a implantação i.v. do tumor. C3CB189 e C3CB88 a 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg ou anticorpo de controle NullxCD3 a 0,5 mg/kg foram administrados i.p. a cada 3 a 4 dias durante 6 semanas.
[0806] No dia 13 após a implantação do tumor, quando ao menos oito animais restaram por grupo, a inibição do crescimento tumoral (% de ICT) foi calculada conforme determinado por bioluminescência. Inibição do crescimento tumoral estatisticamente significativa foi observada com C3CB189 (Figura 6) e C3CB88 (Figura 8) em todas as concentrações, em comparação com o controle NullxCD3. C3CB189 a 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg induziu a inibição do crescimento tumoral de 76%, 100% e 82%, respectivamente, e o C3CB88 a 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg induziu a inibição do crescimento tumoral de 100%, 100% e 91%, respectivamente, em comparação com os controles tratados com NullxCD3.
[0807] O tratamento com C3CB189 e C3CB88 resultou em uma carga tumoral reduzida e um tempo de vida aumentado (ILS, "increased life span") maior do que a sobrevida mediana de 16 dias do grupo de controle NullxCD3. Os animais tratados com C3CB189 tiveram uma sobrevida mediana de 19 a 27,5 dias (Figura 7) e os animais tratados com C3CB88 tiveram uma sobrevida mediana de 26 a 28,5 dias (Figura 9) através das doses. C3CB189 a 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg resultou em um tempo de vida aumentado de 19%, 72% e 50%, respectivamente, e C3CB88 resultou em um tempo de vida aumentado de 63%, 78% e 72%, respectivamente, em comparação com o grupo de controle.
[0808] Exemplo 10: Demonstração de internalização de anticorpos CD33 em um ensaio de viabilidade celular in vitro em conjugados de proteína A-fármaco
[0809] Um ensaio de viabilidade celular in vitro com o uso do conjugado proteína A-fármaco pré-carregado, A-MMAF, foi realizado para detectar a internalização dos anticorpos-alvo ligados ao ligante. Este ensaio funcional baseado em célula foi realizado com um painel de anticorpos anti-CD33, C33B782, C33B806, C33B836, C33B904, C33B937, e um anticorpo de controle de isotipo CNTO9412 em uma linhagem celular de LMA, MOLM13. O anticorpo-alvo sozinho foi testado como um controle neste ensaio para diferenciar a citotoxicidade devida à internalização do anticorpo e a citotoxicidade devida à atividade dos anticorpos de teste sozinhos. A Figura 10 mostra a citotoxicidade com anticorpos ligados a proteína A-MMAF em MOLM13 após 72 horas de incubação a 37 °C, 5% de CO2. Citotoxicidade dependente de concentração foi observada com todos cinco anticorpos CD33 em células MOLM13, sugerindo internalização de todos os cinco anticorpos nesta linhagem celular. O anticorpo de controle de isotipo, CNTO9412, não mostrou citotoxicidade dependente de concentração significativa, sugerindo internalização específica para o alvo desses anticorpos CD33 nas células MOLM13. A Tabela 15 mostra os valores de E50 para 5 anticorpos biespecíficos CD33xCD3.
[0810] Os resultados também indicaram que o anticorpo C33B836 tem melhor internalização em células MOLM13 do que outros. Tabela 14: Ensaios de internalização de CD33. Resumo dos valores de EC50 para cinco anticorpos anti-CD33. C33B782 C33B806 C33B836 C33B904 C33B937 CNTO9412 EC50 0,88 0,22 0,04 0,96 1,92 (nM)
[0811] Exemplo 11: Demonstração de que os anticorpos CD33 podem mediar a atividade de ADCC
[0812] Para caracterizar a atividade de citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpo (ADCC) de mABs anti-CD33, ensaios de ADCC in vitro foram realizados utilizando células efetoras NK de doadores saudáveis e células-alvo MOLM-13 e MV4-11 de LMA. Células NK de doadores saudáveis (Biological Specialty Corporation doador CC00061 e M7015; Colmar, PA, EUA) foram plaqueados em meio de crescimento MyeloCult H5100 (Stem Cell Technologies; Vancouver, CA, EUA) suplementado com 1 x 10-6 de hidrocortisona (células-tronco), 7,5 ng/ml de IL-2 humana recombinante (R&D Systems; Minneapolis, MN, EUA), 1% de piruvato de sódio (Life Technologies), 1% de aminoácidos não essenciais (Life Technologies), 1% de penicilina estreptomicina (Life Technologies) 16 a 24 horas antes do início dos ensaios de ADCC. No dia do ensaio, 1x106 células/mL de células MOLM-13 e MV4-11 foram marcadas com 10 µM de calceína AM a 37°C durante 30 minutos. Após a marcação, as células foram lavadas três vezes para remover o excesso de calceína AM. Subsequentemente, 1 x 105 células-alvo MOLM-13 ou MV4 11 marcadas com calceína AM foram incubadas durante 1,5 horas a 37°C com células NK doadoras saudáveis (3 x 105) na presença de diferentes concentrações de anticorpos anti-CD33. Amostras de controle de lise máximo foram geradas pela adição de Triton X100 a poços designados de amostras de controle em uma concentração final de 0,5%. A liberação de calceína AM foi medida por fluorescência a 485 a 535 nm com um leitor de placas multimodo SpectraMaxx® M5 (Molecular Devices, LLC; Sunnyvale, CA, EUA). A porcentagem de lise celular foi determinada pela normalização dos dados aos lises máxima (mediado por Triton X10) e mínima (células efetoras sozinhas) usando-se a seguinte equação: % de lise=[(lise experimental - lise espontânea)/(lise máxima - lise espontânea)]*100.
[0813] Os anticorpos anti-CD33 de IgG1 com baixo teor de fucose induziram a ADCC de uma maneira dependente de concentração (Figura 11). C33B48.CLF demonstrou atividade de ADCC mais potente contra células MOLM-13 e MV4-11 do que C33B912.CLF com valores de concentração efetiva máxima a 50% 12 a 23 vezes maiores (EC50, Tabela 16). A lise máxima de células MOLM-13 e MV4-11 células em resposta C33B48.CLF e C33B912.CLF foi similar.
[0814] Tabela 16: Ensaios de ADCC de CD33 Resumo dos valores de EC50 para cinco anticorpos anti-CD33. EC50 ADCC C33B48.CLF (nM) EC50 ADCC C33B912.CLF (nM) MOLM-13 0,023 0,292 MV4-11 0,113 2,008
[0815] Exemplo 12: Características de ligação do anticorpo C3CB189 que tem como alvo CD33, um antígeno abundantemente expresso por blastos leucêmicos.
[0816] C3CB189 é um anticorpo biespecífico de imunoglobulina G (IgG)4-PAA totalmente humana que direciona o complexo do receptor CD3 em células T e CD33 em células mieloides. C3CB189 se liga a (r)CD33 humano recombinante com uma afinidade (Kd) de 0,89 pM e a rCD33 de cinomolgo (cino) com uma afinidade (Kd) de 363 pM. C3CB189 também se liga a rCD3e humano e de macaco cinomolgo com afinidades (Kd) de 151,32 e 43,83 nM, respectivamente. C3CB189 se ligou especificamente às linhagens de células de LMA que expressam CD33 KG-1, MOLM-13, Kasumi-1 e OCI-AML3 (Figura 12). Um padrão de ligação similar foi observado com o anticorpo de controle negativo CD33×null, como esperado, uma vez que ele contém um único braço Fab de anti-CD33. Os anticorpos biespecíficos de controle negativo null×CD3, bem como null×null, não mostraram ligação significativa nestas células. Nenhum dos anticorpos biespecíficos testados se ligou às linhagens celulares negativas para CD33, CARNAVAL e KG 1ΔCD33, isto é, células KG1 com deleção genética de CD33 com o uso de CRISPR (Figura 12). Adicionalmente, em contraste, as células HEK- 293 parentais, C3CB189, se ligaram a céllas HEK 293T que expressam CD33 de cino, que demonstram reatividade cruzada de cinomolgo
(Figura 12).
[0817] Exemplo 13: C3CB189 mata linhagens celulares de LMA de CD33+e ativa células T in vivo
[0818] Um ensaio de citotoxicidade mediado por célula T foi a seguir usado para avaliar a atividade de C3CB189 in vitro em várias linhagens celulares incluindo linhagens celulares CD33+ como MOLM-13, KG-1, SKNO-1, Kasumi-1, e OCI-AML3 bem como em linhagens celulares CD33sem/baixa como CARNAVAL e KG1ΔCD33. Os ensaios foram configurados com células pan-T de CD3+ humano isoladas de seis doadores saudáveis e bloqueador de região Fc de fragmento cristalizável (Fc). Um bloqueador de Fc foi adicionado para evitar o recrutamento mediado por Fc de C3CB189 uma vez que as mutações de PAA na região Fc de IgG4 não a tornam completamente silenciosa (Vafa et al., 2014) e porque os receptores de Fc gama (FcγR) são frequentemente expressos em células de LMA (Ball et al., 1989).
[0819] Conforme visto na Figura 13, C3CB189 demonstrou citotoxicidade mediada por células de T de linhagens celulares de LMA de CD33+ quando combinadas com células T purificadas após 48 horas (Figura 13). A concentração efetiva máxima mediana a 50% (EC50), [bem como os valores EC20] para MOLM-13, KG-1, Kasumi-1, e OCI- AML3 foram 0,1307 [0,0283], 0,1677 [0,0525], 0,05 [0,0366], e 0,1826 [0,0844] nM, respectivamente (Figura 2B). Não foi observada citotoxicidade com as linhagens celulares negativas para CD33 CARNAVAL e KG-1ΔCD33 ou com anticorpos biespecíficos de controle (nulo×CD3 ou CD33×nulo; consulte a Figura 13). Foi confirmado que as células KG1ΔCD33 poderiam ser efetivamente direcionadas para células T, mediante a realização de ensaios de citotoxicidade com um anticorpo biespecífico CD123xCD3 (Figura 14A).
[0820] A extensão da ativação de células T induzidas por C3CB189 na presença de linhas celulares tumorais de CD33+ foi também avaliada in vitro nos ensaios de citotoxicidade, com a expressão de CD25 medida como um indicador de ativação. Conforme mostrado na Figura 2C, a ativação de células T induzidas por C3CB189 quando incubadas com linhagens celulares tumorais de CD33+ e células pan-T de doadores saudáveis, enquanto ativação mínima ou nenhuma foi observada com células CD33- CARNAVAL e KG-1ΔCD33. Os valores medianos de EC50 [EC20] para MOLM-13, KG-1, Kasumi-1, e OCI-AML3 foram 0,0283 [0,0077], 0,0664 [0,0256], 0,0432 [0,0267], e 0,0500 [0,0178] nM, respectivamente (Figura 15C). C3CB189 não causou a ativação de células T na ausência de células alvo, demonstrando a especificidade da ativação de células T (Figura 14B). O anticorpo de controle CD33xnulo não induziu a ativação da célula T em nenhuma linhagem celular. O anticorpo de controle nullxCD3 induziu a ativação de células T nas concentrações mais altas de 533 e 53 nM na presença de linhagens celulares de CD33+ e CD33- mas não mediaram a ativação em qualquer outra dose. De modo importante, C3CB189 mostrou indução específica da ativação de células T, apenas na presença de linhagens celulares de CD33+ e não na presença de linhagens celulares de CD33- (Figura 15A) ou quando células T foram incubadas na ausência de células-alvo (Figura 14B).
[0821] Finalmente, respostas de citocina também foram avaliadas no ensaio de redirecionamento in vitro de células T com a linhagem celular Kasumi-1. C3CB189 levou à secreção de várias citocinas incluindo interferon gama (IFN-γ), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina (Il)-2 e IL-8 (Figura 3 suplementar). Estes dados são consistentes com os dados de citotoxicidade e de ativação de células T mostrados na Figura 13 e nas Figuras 15A a 15C. Um resumo da mediana de EC50 e da concentração que produz 20% dos valores de efeito máximo possível (EC20) para as respostas de citocina é mostrado na Tabela 17.
[0822] Tabela 17. Valores de concentração eficaz para a liberação de citocina mediada por C3CB189 em um ensaio de redirecionamento de células T com células T purificadas e células-alvo Kasumi-1. Os valores EC estão em nM. n representa o número de dadores de 6 para os quais os valores EC poderiam ser determinados. Citocina n EC20 mediana EC50 mediana EC90 mediana IFN-gama 6 0,048 0,16 1,409 IL-1beta 6 0,013 0,045 0,226 IL-2 4 0,090 0,346 5,282 IL-4 4 0,054 0,078 0,153 IL-8 6 0,015 0,042 0,246 IL-10 6 0,052 0,123 1,271 IL-13 5 0,008 0,034 0,103 TNF-alfa 6 0,049 0,208 3,530 Exemplo 14: C3CB189 mostra atividade antitumoral eficaz in vivo
[0823] Foi avaliada a função de C3CB189 em dois modelos estabelecidos de tumor de xenoenxerto em camundongos NSG humanizados com células T. Em camundongos portando o tumor KG-1 subcutâneo, o tratamento com C3CB189 a 0,1, 0,5 e 1 mg/kg induziu a inibição do crescimento tumoral de 41%. 92%, e 87%, respectivamente, em comparação com animais de controle tratados com nullxCD3 (p<0,0001 para 0,5 e 1 mg/kg, Figura 16A). C3CB189 a 0,5 e 1 mg/kg também resulto em 6 a 7 respostas completas no dia 55, respectivamente.
[0824] No modelo MOLM-13 que expressa luciferase disseminado, estabelecido (MOLM-13-luc), o tratamento com C3CB189 foi iniciado após a migração celular ("homing") das células LMA para a medula óssea (BM) e foi confirmado após injeção intravenosa. C3CB189 a 0,005, 0,05, 0,5 mg/kg foi administrado a cada 3 a 4 dias significativamente inibiu o crescimento do tumor conforme avaliado por bioluminescência (76%, 100%, 82% e, respectivamente) em comparação com camundongos tratados com controle nullxCD3 (Figura
17). C3CB189 a 0,005, 0,05 e 0,5 mg/kg resultou em uma vida útil aumentada estatisticamente significativa de 19%, 72% e 50%, respectivamente (p<0,0001, Figura 16B) correlacionando com a carga tumoral reduzida no BM, na coluna vertebral e no membro traseiro, conforme observado por bioluminescência (Figura 16C). No final do estudo no dia 55, os três animais tratados com C3CB189 a 0,05 mg/kg mostraram resposta completa conforme avaliado pelo BLI.
[0825] Além disso, camundongos com tumor MOLM-13-luc tratados com C3CB189 a 0,05 mg/kg e, em menor extensão a 0,005 mg/kg, mostraram diminuição das células tumorais e aumento da infiltração de células T deCD3+ na medula óssea conforme medido por citometria de fluxo (Figura 16D) e aumento da infiltração de células T CD8+ (Figura 3E) no dia 11. Estes dados são relevantes uma vez que o BM é muitas vezes um local de resistência para células estaminais leucêmicas (LSCs) em LMA e persistência da doença residual mínima. Juntos, estes dados demonstram que C3CB189 inibe o crescimento tumoral de dois modelos tumorais de LMA por recrutamento de células T ao sítio tumoral em camundongos humanizados com células T.
[0826] Exemplo 15: C3CB189 medeia a citotoxicidade de células de LMA adicionadas em sangue total saudável bem como em blastos de LMA de amostras de pacientes primários
[0827] O domínio extracelular (ECD) de CD33 é, conforme relato, desprendido das células; portanto, amostras normais e de paciente poderiam conter CD33 solúvel (sCD33). Um estudo mostrou que há aproximadamente 4 a 30 ng/ml de sCD33 detectado no plasma de pacientes com LMA (Biedermann, B., Gil, D., Bowen, D. T., e Crocker, P. R. (2007). Leuk Res 31, 211-220.). Este valor é maior que a concentração de 0,6 a 5,8 ng/mL determinada em soro humano saudável (Biedermann, B., Gil, D., Bowen, D. T., e Crocker, P. R. (2007). Leuk Res 31, 211-220.).
[0828] Para determinar os níveis fisiológicos de sCD33 em doadores normais e portadores de LMA, foi desenvolvido um ensaio de espectrometria de massa (MS) acoplado com imunocaptura. A análise das amostras de soro normais e de LMA mostrou níveis médios de sCD33 similares de 53,03 ng/ml (1,91 nM) e 52,90 ng/ml (1,90 nM), respectivamente (Tabela 18).
[0829] Tabela 18: Avaliação dos níveis de sCD33 em amostras de pacientes normais e portadores de LMA. Amostras de soros humanos saudáveis e portadores de LMA (n=20/cada) foram analisadas quanto aos níveis de sCD33 com o uso de espectroscopia de massa. Amostra Concentração (nM) Concentração (ng/mL) Indivíduo 1 0,23 6,15 Indivíduo 2 NA NA Indivíduo 3 NA NA Indivíduo 4 0,21 5,59 Soro humanos normais (NHS) Indivíduo 5 NA NA Indivíduo 6 0,25 6,73 Indivíduo 7 0,24 6,39 Indivíduo 8 NA NA Indivíduo 9 0,23 6,14 Indivíduo 10 0,21 5,69 Média de NHS (reportável) 0,23 6,12 Doador 1 com LMA 0,14 3,76 Doador 2 com LMA 0,14 3,71 Doador 3 com LMA NA NA Doador 4 com LMA 0,15 3,92 Doador 5 com LMA 0,16 4,32 Soro de doador com LMA Doador 6 com LMA 0,13 3,61 Doador 7 com LMA NA NA Doador 8 com LMA 0,17 4,44 Doador 9 com LMA 0,14 3,81 Doador 10 com LMA NA NA Média de LMA (relatável) 0,15 3,94
[0830] Para avaliar a atividade de C3CB189 em um ambiente mais fisiologicamente relevante, foram realizados ensaios de citotoxicidade mediada por células T com o uso de sangue total periférico humano como uma fonte de células efetoras T, com várias células tumorais de CD33+ adicionadas como alvos e incubadas durante 48 horas. C3CB189 induziu a citotoxicidade mediada por células T de células MOLM-13 e Kasumi-1 de CD33+, com valores medianos de EC50 [EC20] de 0,111 [0,054] e 0,124 [0,06] nM, respectivamente (Figura 17). De modo similar, C3CB189 levou à ativação de células T (conforme indicado por CD25), MOLM-13, e células Kasumi-1, com valores medianos de EC50 [EC20] de 0,037 [0,017] e 0,085 [0,039] nM, respectivamente (Figura 18A e 18B). A ativação medida de células T mediada por C3CB189 representa a ativação de células T total no sangue, e reflete a ativação relacionada com a morte tanto de células tumorais de CD33+ exógenas quanto de leucóticos periférico de CD33+ possivelmente periféricos, como neutrófilos e monócitos que não foram medidos para citotoxicidade neste ensaio. Adicionalmente, esses dados sugerem que C3CB189 medeia a morte de células tumorais apesar da presença de níveis basais de sCD33 e outros leucócitos CD33+ no sangue total.
[0831] A capacidade de C3CB189 para induzir a citotoxicidade em um contexto clinicamente mais relevante foi a seguir avaliada em um ensaio de citotoxicidade ex vivo com o uso de sangue total de doadores portadores de LMA. Este sistema depende da presença de células T autólogas no próprio sangue do paciente para matar células LMA. Foram medidas a extensão da citotoxicidade mediada por células T das células CD33+ e a ativação das célula T. C3CB189 induziu uma citotoxicidade dependente de concentração de blastos CD3+ (Figura 19A) que também se correlacionou com a ativação de células T aumentada (Figura 19B) em todas as 6 amostras de paciente. A citotoxicidade máxima induzida por C3CB189 foi de aproximadamente 60% dos blastos CD33+. A anticorpo de controle de braço nulo induziu limitada citotoxicidade e ativação de células T. C3CB189 induziu a citotoxicidade e a ativação de células T que resultou em valores de EC50 na faixa de 0,052 a 9,52 nM de (mediana: 0,365 nM) e 0,03 5,109 nM (mediana: 0,355 nM), respectivamente (Figuras 19A e 19B). Estes dados indicam que C3CB189 foi eficaz na morte de células CD33+ de LMA em um ambiente fisiológico ex vivo e na presença de níveis basais de sCD33. Exemplo 16: Avaliação de reatividade cruzada de cinomolgo para C3CB189
[0832] Para avaliar se o macaco cinomolgo (cino) foi um modelo adequado para avaliar a atividade de C3CB189, foi primeiro investigado por análise de FACS a expressão de CD33 em leucócitos obtidos de 6 macacos cinomolgos saudáveis. Foi encontrado que células T e B no sangue periférico de macacos têm níveis baixos a zero de expressão de CD33 (Figura 20). Aproximadamente 75% a 96% dos neutrófilos cino expressaram CD33 a uma densidade de antígeno média de 7.545 moléculas/célula (Figura 20). Por outro lado, a porcentagem de CD33+ de monócitos cino foi variável entre os 6 doadores, na faixa de 0% a 84% com uma densidade média de antígeno de 2.146 moléculas/células (Figura 20).
[0833] Em seguida, para demonstrar a reatividade cruzada de cino e para avaliar o potencial de citotoxicidade de C3CB189 na eliminação de monócitos e neutrófilos de macaco cinomolgo normal, foram realizados ensaios de citotoxicidade ex vivo com o uso de sangue total de macacos cino saudáveis com células MOLM-13 de CD33 + exogenamente adicionadas. Neste sistema, a depleção de monócitos CD33+ de macacos cino normais e de neutrófilos CD33+ de macacos cino normais também foi monitorada junto com a ativação de células T.
De fato, a morte mediada por C3CB189 de células MOLM-13 de CD33 + (EC50: 0,013 a 0,452 nM de) juntamente com monócitos CD33+ normais de macaco cinomolgo (EC50: 0,625 a 5,636 nM) e neutrófilos CD33+ normais de macaco cino (EC50: 0,013 a 0,714 nM) in vitro após 48 horas de incubação ex vivo (Figura 21). O controle nuloxCD3 mostrou limitada citotoxicidade de todas as células-alvo CD33+ e mostrou ativação de células T apenas na dose mais elevada de 533 nM. Juntos, esses dados mostram reatividade cruzada funcional de C3CB189 de macaco cinomolgo e estabelecem monócitos e neutrófilos CD33+ de cino como potenciais marcadores farmacodinâmicos (PD) em estudos de primatas não humanos. Esses dados também mostram que C3CB189 pode mediar a depleção de uma linhagem celular de LMA humana por células T de cino. De modo importante, estes resultados validam o macaco cinomolgo como um modelo adequado de eficácia para C3CB189. Exemplo 17: C3CB189 medeia a redução de leucócitos CD33+ em macacos cinomolgo
[0834] Para avaliar a farmacocinética (PK) e a farmacodinâmica (PD) de C3CB189 in vivo, C3CB189 foi administrado como uma dose IV única a macacos cinomolgos. Os perfis de PK são mostrados na Figura 22A. C3CB189 apresentou características PK de um anticorpo monoclonal típico (mAb) com PK aproximadamente linear na faixa de dose de 0,05 a 1/mg/kg. A depuração média total estimada de C3CB189 foi de 13,03 a 21,39 mL/dia/kg, o volume de distribuição foi de 89,14 a 154,91 mL/kg, e a meia vida terminal foi de 4,20 a 5,06 dias. Foi observada uma eliminação aparentemente acelerada de C3CB189 após o dia 10 nos animais do grupo de dose de 1 mg/kg. Isto está mais provavelmente relacionado com o desenvolvimento de anticorpos anti- fármaco (ADAs), embora ADA não tenha sido testado neste estudo.
[0835] Consistente com o mecanismo de ação previsto, aumentos dependentes de dose na ativação de células T (% de CD25+) foram observados após uma dose IV única de C3CB189, CD25% com um pico de % de CD25+ em linfócitos citotóxicos T (CD8+/CD4-) observado no primeiro ponto de tempo a 24 horas após a administração (Figura 22B). Os linfócitos T-helper (CD4+/CD8-) também apresentaram perfis de ativação similares (% de CD25+) após a dosagem de C3CB189 (dados não mostrados). A administração de C3CB189 também resultou em um aumento dependente da dose nas concentrações plasmáticas das citocinas sendo analisadas (IFNγ, IL-10, IL-2, IL-6, MCP-1, e TNFα) 2 horas após a dose (Figura 23). Com a exceção de IL-10 e MCP-1, as citocinas voltaram para níveis abaixo do limite inferior de quantificação (LLOQ) 24 horas após a dose.
[0836] A dosagem relacionada a C3CB189 levou à redução sustentada em granulócitos CD33+ (neutrófilos). Consistente com os níveis de expressão de CD33 mais baixo em monócitos, uma redução mais transitória em monócitos CD33+ foi também observada. Os perfis de concentração-tempo para granulócitos e monócitos são mostrados na Figura 22C e na Figura 22D, respectivamente. Embora o rápido desaparecimento inicial de granulócitos e monócitos do sangue periférico possa estar relacionado com a marginação transitória de leucócitos associada com a ativação de células T, a redução de populações de granulócitos/monócitos CD33+ foi muito mais sustentada. Em particular, a redução das populações de granulócitos continuou a estar no nível próximo ao máximo através do dia 8, e gradualmente foi recuperada depois disso. A religação dos monócitos ocorreu antes e foi mais proeminente.
[0837] C3CB189 foi também estudado em outros dois estudos de macaco cinomolgo após administração IV múltipla em níveis de dose na faixa de 0,01 mg/kg a 30 mg/kg. As alterações relacionadas a C3CB189 foram geralmente consistentes com aquelas observadas após uma dose única e C3CB189 foi bem tolerado nesses níveis de dose (dados não mostrados). Juntos, esses dados fornecem evidência da atividade mediadora de C3CB189 enquanto mantém a tolerabilidade em macacos cinomolgos.
[0838] Exemplo 18: Citotoxicidade mediada por C3CB189 de + linhagens celulares CD33 e amostras de pacientes independentemente dos genótipos de SNP rs12459419
[0839] Um SNP, rs12459419 (C>T; Ala14Val no éxon 2) ocorre dentro de um sítio regulador de splicing de CD33, no qual um alelo T resulta em expressão aumentada de transcritos previstos para codificar uma proteína isoforma CD33 sem o domínio V-set. Dados recentes demonstram adicionalmente que indivíduos com genotipo SNP rs12459419 CC (cerca de 50% dos participantes do estudos) apresentaram um risco significativamente menor de recidiva e melhor sobrevida livre de eventos (EFS, "event-free survival") e sobrevida livre de doença terapia GO, enquanto esse benefício não foi observado em paciente com os genótipos CT ou TT (Lamba, J. K., Chauhan, L., Shin, M., Loken, M. R., Pollard, J. A., Wang, Y. C., Ries, R. E., Aplenc, R., Hirsch, B. A., Raimondi, S. C., et al. (2017). J Clin Oncol 35, 2674-
2682.). Considerando os dados com GO no estudo mencionado acima, foi avaliado o impacto de genótipos SNP rs12459419 sobre a atividade de C3CB189. Primeiro foi confirmado através do mapeamento de troca hidrogênio/deutério (HDX), que C33B904 (versão de IgG4 do braço parental de CD33 de C3CB189) se liga a regiões distintas no domínio C2 (IgC na Figura 24A) de CD33 e não tem nenhuma ligação na região V (IgV na Figura 24A). Em contraste, C33B836 (versão de IgG4 do braço parental de CD33 de C3CB97) se liga ao domínio V de CD33 e não tem nenhuma ligação na região C2 de CD33. Em seguida, foram usados ensaios de citotoxicidade in vitro medida por células T para comparar respostas medidas por C3CB97 (ligante V) a C3CB189 (ligante C2). Com base nos dados de genotipagem (Figura 25A), KG-1, SH2, e OCI-
AML3 foram escolhidos para representar CC do tipo selvagem, CT heterozigoto e TT homozigoto para a mutação SNP rs12459419 de CD33, respectivamente. Ao contrário do controle nullxCD3, os anticorpos biespecíficos CD33xCD33 de ligação V e ligação C2 induziram a citotoxicidade celular redirecionada de células T da linhagem celular CD33+ KG-1 "CC" a 48 horas (Figura 6B). Em contrapartida, ao contrário do ligante V C3CB97, apenas a citotoxicidade medida por C3CB189 de ligação C2 da linhagem celular SSH2 "CT" e das linhagens celulares OCI-AML3 "TT", enquanto nenhuma atividade foi observada para o ligante V C3CB97.
[0840] A seguir foram realizados ensaios de citotoxicidade ex vivo com o uso de sangue total de pacientes portadores de LMA para estender e confirmar nossas observações acima. Com base nos dados de genotipagem, as amostras de pacientes 6095, 6116 e 6152 foram identificadas como sendo genótipo CC, enquanto as amostras de pacientes 6129 e a USAML0078 foram identificadas como sendo heterozigotas CT para o CD33 SNP rs12459419, respectivamente (Figura 25B) Nenhuma amostra foi identificada como sendo TT homozigoto para o CD33 SNP rs12459419. Anticorpos biespecíficos CD33xCD3 de ligação V e de ligação C2 induziram, de fato, a citotoxicidade celular redirecionada para células Y comparável de amostras de LMA que foram identificadas como genótipo CC; em contraste, C3CB189 de ligação C2 mostrou intensificada citotoxicidade de amostras de LMA que eram heterozigotos (CT) para mutação SNP rs12459419, em comparação com o C3CB97 de ligação V (Figura 24B). Em seguida, dado que SNP rs12459419 é uma mutação de linhagem germinativa, foram realizados experimentos ex vivo similares com monócitos purificados e células T autólogas correspondentes T de 25 doadores diferentes. Os dados de genotipagem para todos os 25 dadores são mostrados na Figura 25C. Consistente com o fato de que
C3CB189 se liga ao domínio C2 de CD33, C3CB189 mediou a citotoxicidade de monócitos humanos primários, independentemente de seu estado de genótipo SNP (consulte a Figura 24C). Em contraste, C3CB97 de ligação V mediou limitada a nenhuma citotoxicidade quando as amostras foram CT ou TT para SNP rs12459419. Juntas, essas três linhas de evidência sugerem que C3CB189 poderia demonstrar a eficácia em um grupo mais amplo de pacientes com LMA através de direcionamento do epítopo C2 observado.
[0841] Será entendido pelos versados na técnica que podem ser feitas alterações nas modalidades descritas acima sem que se desvie do amplo conceito da invenção. Entende-se, portanto, que esta invenção não é limitada às modalidades específicas reveladas, mas tem por objetivo cobrir modificações dentro do espírito e escopo da presente invenção, como definido pela presente invenção. Tabela 19: Sequências de região variável de cadeia pesada ID de HC DI Sequência de aminoácido B23H1 256 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWLAHIYWDDD
KRYNPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARLYGFTYGFAYWGQGTL
VTVSS CD3H141 257 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKY
NNYATYYAASVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSW
FAYWGQGTLVTVSS CD3H219 258 QVQLQQSGPRLVRPSQTLSLTCAISGDSVFNNNAAWSWIRQSPSRGLEWLGRTYYR
SKWLYDYAVSVKSRITVNPDTSRNQFTLQLNSVTPEDTALYYCARGYSSSFDYWGQ
GTLVTVSS C33H42 259 QLQLQESGPGLVNPSETLSHTCTVSGGSISSSSHYWGWIRQPPGKGLEWIGKIYYSG
NTYYNPSLKSRVTISIDTSKNQFSLKMSSVTAADTAVYYCARLADVVVVPAARYFDSW
GQGTLVTVSS C33H44 260 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYR
SKWYNDYAVSVRSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYHCARETMFRGLMDYW
GQGTLVTVSS C33H45 261 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQSPGKGLEWVAVISYDG
SNKYCADSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSLDWLPPDSTS
YDGMDVWGQGTTVTVSS C33H46 262 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNT
ID de HC DI Sequência de aminoácido
GNPTYAQAFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDREVRDYWGQGTLV
TVSS C33H48 263 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSTNYYWGWIRQPPGKGLEWIGTIYYSG
NTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLADVVVVPAARYFDY
WGQGILVTVSS C33H49 264 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSSGFYWGWIRQPPRKGLEWIGTIYYSG
NTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARLADVVVVPAARYFDN
WGQGTLVTVSS C33H51 265 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISTGRYYWGWIRQPPGKGVIWIGNIYYSG
NTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARLGSLVVVPAAMSFDY
WGQGTLVTVSS C33H52 266 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGSSYYWGWVRQPPGKGLEWIGSIYSS
GNTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTALYYCARLGSLVVVPAAMSFDY
WGQGTLVTVSS C33H55 267 QVQLQESGPGLVKPSGTLSLTCAVSGGSISSSNWWSWVRQPPGRGLEWIGEIYHSG
NTNNSPSLKSRVTISADKSKNQFSLKLSSVTAADTAVYFCARIIAVARYFDSWGQGTL
VTVSS C33H65 268 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVVVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRDFDWLPPDSTS
YHGMDVWGQGTTVTVSS C33H66 269 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSAS
YHGMDVWGQGTTVTVSS C33H68 270 EVQLLESGGGLVQPGGSLGLSCAASGFTFSGYAMSWVRQAPGKGLNWVSAIDYSG
NDTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKESQLLHGLFEHWG
QGILVTVSS C33H69 271 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLDWIGSINYSG
STYYNPSLKSRVTISVDTSKIQFSLKLRSVTAADTAVYYCARLDGYESPFDYWGQGTL
VTVSS C33H70 272 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRGSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIYSSG
NTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLGSLVVVPAAMSFDY
WGQGTLVTVSS C33H72 273 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHG
SEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQG
TLVTVSS C33H73 274 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASRFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSTINISGG
STYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTKGGYSSGPFDYWGQG TLVSVSS
ID de HC DI Sequência de aminoácido C33H74 275 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASRFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVHYCAKDFRSFDWLPPDSAS
YHGMDVWGQGTTVTVSS C33H76 276 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGG
STYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTYNSGYYDGDFDYWG
QGTLVTVSS C33H78 277 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRYFDWLPPDSSS
YYGMDVWGQGTTVTVSS C33H80 278 QVQLVQSGSELRKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTN
TGNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSSAYLQISSLKAEDTAMYYCATDRDRGTDYWGQG
TLVTVSS C33H81 279 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSAYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEGTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSAS
YHGMDVWGQGTTVTVSS C33H84 280 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDG
SNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDFRSFDWLPPDSTS
YYGMDVWGQGTTVTVSS C33H87 281 EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHG
SEKYYVDSVKGRFTISRDNVKNSLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQG
TLVTVSS C33H88 282 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTLTRSAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNT
GNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVNTAYLLISSLKTEDTAVYYCASDILPGYHEDYWGQG
TLVTVSS C33H90 283 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYR
SKWYNDYALSVQSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVAVAASFDYWG
QGTLVTVSS C33H91 284 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSRSHYWGWIRQPPGVGLEWIGSIYYTG
STYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLADIVVVPAARYFDYW
GQGTLVTVSS C33H92 285 QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIRSSSYYWGWIRQPPGKGPEWIGSIYSSG
NTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLISMTAADTAVFYCARLAATIVVPAARYFDCW
GQGTLVTVSS C33H98 286 EVQLVESGGGFVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQHG
SEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRDLGYFDYWGQG
TLVTVSS C33H99 287 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMTWVRPAPGKGLEWVANIKRDG
GEKYYVDSVKGRFTISRDNAANSLYLQMNSLRVEDTAVYYCARPFYDHFDYWGQGT
ID de HC DI Sequência de aminoácido
LVTVSS C33H108 288 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFSTYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINTNT
GNPTYAQGFTGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDRDRGTDYWGQGT
LVTVSS C33H249 289 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCVASGFTFDDYAIHWVRQAPGKGLEWVSGLSWNG
GNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKTEDTAFYYCTKDTPYGDYFDYWGQ
GTLVTVSS C33H250 290 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAGSGFTFDDYAIHWVRQAPGKGLEWVSGLSWNG
GNIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQLNSLKTEDTAFYYCAKDSPYGDYFDYWGQG
TLVTVSS C33H251 291 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIGWSG
GSIVYADSVKGRFKISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQ
GTLVTVSS C33H252 292 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGIGWSG
GSIVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAKDSPYGDFFDYWGQ
GTLVTVSS C33H253 293 EVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCTASGFTFRSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINGYG
DGRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYSCAKDQGFGELFFDYWG
QGTLVTVSS C33H254 294 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSYYGMHWVRQAPDKGLEWVAVIWFDG
NNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRELLFDYWGQGT
LVTVSS C33H255 295 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQVPGEGLEWVSGISWNG
GDMVYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRPEDTALYYCVKDMPYFDFLTGSDY
YYYGMDVWGQGTTVTVSS C33H256 296 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCATSGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYVG
SHKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGSLCFDYWGQGT LVTVSS
Tabela 20: Regiões variáveis de cadeia leve ID de LC DI SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASQSVDYNGISYMHWYQQKPGQPPKLLIYAASN B23L3 297 PESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQIIEDPWTFGQGTKVEIK
QTVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKR CD3L66 298 APGTPARFSGSLLGGKAALTLSGVQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNIGTYKFVSWYQQHPDKAPKVLLYEVSKRPS CD3L150 299 GVSSRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDQADYHCVSYAGSGTLLFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASIICSGDKLGNKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGI C33L8 300 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQAWDSSTYVFGTGTKVTVL
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGSNIGSKSVHWYQQKPGQAPVMVVYDDSDRPSG C33L10 301 IPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGHKLGDKYACWYQQKPGQSPVVVIYKDSKRPSGI C33L11 302 PERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGI IAPL24 303 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDYKRPSGI C33L58 304 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTYVFGTGTKVTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDYKRPSGI C33L59 305 PERFSGSNSGNTATLTISGTQTMDEADYYCQAWDISTYVFGTGTKVTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQLRPGQSPILVIYQDSNRPSGIP C33L34 306 ERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTWVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGI N46L109 307 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTWVFGGGTKLTVL
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGIKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPPGI C33L42 308 PERFSGSNSGNTATLTITRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVVVIYQDRKRPSGI C33L47 309 PERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDGKRPSGI C33L60 310 PERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYCQAWDRNTVVFGGGTKLTVL
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKAGQPPKLLIYWA C33L17 311 STRESGVPDRFSGSGSGTDFILIISSLQAEDVAVYYCQQYYGTPWTFGQGTKVEIK
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSG C4LL152 312 VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGNKLGAKFASWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGI C33L40 313 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAVDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVRWYQQKTGQSPVLVMYQDSKRPSG C33L32 314 IRERFYGSNSGNTATPTISGTQAVDEAEYYCQAWDSSTGVVFGGGTKLTVL
ID de LC DI SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO
SYELTQPPSVSVPPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGI C33L38 315 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWGRNTVVFGGGTKLTVL
QSALTQPASVSGSPGQSIPISSTGTSSDDGKNNIVSWYQQHPGKAPKLMIYKDSKRP C33L39 316 SGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQADDEADYHCCSYAGASNHVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDELGNKYACWYQQKPGQSPVVVVYQDRKRPS C33L57 317 GIPERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDYNYVSWYQQHPGKVPKLMIYDVSNRP C33L73 318 SGVSNRFSGSMSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYSSSSALEVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDNKRPSGI C33L53 319 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSNTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYVCWYQQKPGQSPVVVIHQDRKRPSGI C33L66 320 PERFSGSNFGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDTKRPSGI C33L35 321 PERVSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYHCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGINSDVGSYDLVSWYQQHPGKAPKLLIYDGSERPS C33L61 322 GVFGRFSGSKSDNTTSLTISGLQAEDEAAYYCCSYEVTTTYVVFGGGTKLTVL
SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKSVHWSQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSG C33L51 323 IPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSNSDHVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSNRPSGI C33L44 324 PERFSGSNSGNTATLTISETQAMDEADYYCQAWDSSTYVFGTGTKVTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTVSISCSGDRLGDKYACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGI C33L30 325 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSSYVFGTGTKVTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGSKFACWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGI C33L69 326 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL
SYVLTQPPSVAVAPGQTARITCGGSNIGKISVHWYQQKAGQAPVLVVHDDRARPSGI C33L37 327 PERLSGSNSGTTATLTISRVEVGDEADYYCQVWNSSSVHPVFGGGTKLTVL
QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGDDNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNR C33L74 328 PSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQSEDEADYYCSSYSSSTTLEVFGGGTKLTVL
DIQMTQSPSSVWASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQQPGKAPNLLIYRSSSLQS C33L115 329 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNSFPYTFGQGTKLEIK
DIQMTQSPSSEWASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSWQS C33L116 330 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDNSFPYTFGQGTKLEIK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWA C33L117 331 STRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIK
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQTVFYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLISWA C33L118 332 STRKSGVPDRFSGSGSGTDFTLTVSSLQAEDVAVYYCQHYYSTPYTFGQGTKLEIK
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGV C33L119 333 PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYCCQQYNSYPWTFGQGTKVEIK
ID de LC DI SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDO
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDELGDMYACWYQQKPGQSPLVVIYQDSKRPSGI C33L120 334 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYYCQTWDTRIAVFGGGTNLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLGNEHVCWYHQKPGQSPVLVIYQNNKRPSGI C33L121 335 PERFSGSNSGNTATLSISGTQATDEADYYCQAWDSTTAVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTANISCSGVTLGYNYAYWYQQKPGQSPILVISQDTQRPSGI C33L122 336 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEAAYYCQAWDITTVLFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDGKRPSGI C33L132 337 PERFSGSNFGNKATLTISGTQAMDEADYYCQAWDRNTVVFGGGTKLTVL
SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGNKYASWYQQKPGQSPVLVIYQDSKRPSGI C33L41 338 PERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSSTVVFGGGTKLTVL Tabela 21: Sequências de cadeia pesada CDR1-3 ID de HC DI CDR1 DI CDR2 DI CDR3 DI B23H1 256 GFSLSTSGM 339 YWDDD 340 LYGFTYGFA 341 CD3H141 257 GFTFNTY 342 RSKYNNYA 343 HGNFGNSYVSWFA 344 CD3H219 258 GDSVFNNNA 345 YYRSKWL 346 GYSSSFD 347 C33H42 259 GGSISSSSH 348 YYSGN 349 LADVVVVPAARYFD 350 C33H44 260 GDSVSSNSA 351 YYRSKWY 352 ETMFRGLMD 353 C33H45 261 GFTFSSY 354 SYDGSN 355 DFRSLDWLPPDSTSYDGMD 356 C33H46 262 GYTFTNY 357 NTNTGN 358 DREVRD 359 C33H48 263 GGSIRSTNY 360 YYSGN 361 LADVVVVPAARYFD 362 C33H49 264 GGSIRSSGF 363 YYSGN 364 LADVVVVPAARYFD 365 C33H51 265 GGSISTGRY 366 YYSGN 367 LGSLVVVPAAMSFD 368 C33H52 266 GGSIRGSSY 369 YSSGN 370 LGSLVVVPAAMSFD 371 C33H55 267 GGSISSSN 372 YHSGN 373 IIAVARYFD 374 C33H65 268 GFTFSSY 375 SYDGSN 376 DFRDFDWLPPDSTSYHGMD 377 C33H66 269 GFTFSSY 378 SYDGSN 379 DFRSFDWLPPDSASYHGMD 380 C33H68 270 GFTFSGY 381 DYSGND 382 ESQLLHGLFE 383 C33H69 271 GGSISSSSY 384 NYSGS 385 LDGYESPFD 386 C33H70 272 GGSIRGSSY 387 YSSGN 388 LGSLVVVPAAMSFD 389 C33H72 273 GFTFSSY 390 KQHGSE 391 DRDLGYFD 392 C33H73 274 RFTFSSY 393 NISGGS 394 GGYSSGPFD 395 C33H74 275 RFTFSSY 396 SYDGSN 397 DFRSFDWLPPDSASYHGMD 398 C33H76 276 GFTFNY 399 SGSGGS 400 TYNSGYYDGDFD 401 C33H78 277 GFTFSSY 402 SYDGSN 403 DFRYFDWLPPDSSSYYGMD 404 C33H80 278 GYTFTNY 405 NTNTGN 406 DRDRGTD 407 C33H81 279 GFTFSAY 408 SYDGSN 409 DFRSFDWLPPDSASYHGMD 410
ID de HC DI CDR1 DI CDR2 DI CDR3 DI C33H84 280 GFTFSSY 411 SYDGSN 412 DFRSFDWLPPDSTSYYGMD 413 C33H87 281 GFTFSSY 414 KQHGSE 415 DRDLGYFD 416 C33H88 282 GYTLTRS 417 NTNTGN 418 DILPGYHED 419 C33H90 283 GDSVSSNSA 420 YYRSKWY 421 EVAVAASFD 422 C33H91 284 GGSISSRSH 423 YYTGS 424 LADIVVVPAARYFD 425 C33H92 285 GGSIRSSSY 426 YSSGN 427 LAATIVVPAARYFD 428 C33H98 286 GFTFSSY 429 KQHGSE 430 DRDLGYFD 431 C33H99 287 GFTFSSY 432 KRDGGE 433 PFYDHFD 434 C33H108 288 GYTFSTY 435 NTNTGN 436 DRDRGTD 437 C33H249 289 GFTFDDY 438 SWNGGN 439 DTPYGDYFD 440 C33H250 290 GFTFDDY 441 SWNGGN 442 DSPYGDYFD 443 C33H251 291 GFTFDDY 444 GWSGGS 445 DSPYGDFFD 446 C33H252 292 GFTFDDY 447 GWSGGS 448 DSPYGDFFD 449 C33H253 293 GFTFRSY 450 NGYGDG 451 DQGFGELFFD 452 C33H254 294 GFTFSYY 453 WFDGNN 454 DRELLFD 455 C33H255 295 GFTFDDY 456 SWNGGD 457 DMPYFDFLTGSDYYYYGMD 458 C33H256 296 GFTFSNY 459 WYVGSH 460 DGSLCFD 461
Tabela 22: Sequências de cadeia leve CDR1-3 ID de LC DI CDR1 DI CDR2 DI CDR3 DI B23L3 297 SQSVDYNGISY 462 AAS 463 IIEDPW 464 CD3L66 298 STGAVTTSNY 465 GTN 466 WYSNLW 467 CD3L150 299 TSSNIGTYKF 468 VE 469 YAGSGTL 470 C33L8 300 DKLGNKY 471 QDS 472 WDSSTY 473 C33L10 301 SNIGSKS 474 DDS 475 WDSSSDV 476 C33L11 302 HKLGDKY 477 KDS 478 WDSSTV 479 IAPL24 303 DKLGDKY 480 QDS 481 WDSSTV 482 C33L58 304 DKLGDKY 483 QDY 484 WDSSTY 485 C33L59 305 DKLGDKY 486 QDY 487 WDISTY 488 C33L34 306 DKLGDKY 489 QDS 490 WDSSTW 491 N46L109 307 DKLGDKY 492 QDS 493 WDSSTW 494 C33L42 308 NNIGIKS 495 DDS 496 WDSSSDHV 497 C33L47 309 DKLGDKY 498 QDR 499 WDSSTV 500 C33L60 310 DKLGDKY 501 QDG 502 WDRNTV 503 C33L17 311 SQSVLYSSNNKNY 504 WAS 505 YYGTPW 506 C4LL152 312 SQGISSW 507 AAS 508 ANSFPF 509 C33L40 313 NKLGAKF 510 QDN 511 WDSSTV 512
ID de LC DI CDR1 DI CDR2 DI CDR3 DI C33L32 314 DKLGDKY 513 QDS 514 WDSSTGV 515 C33L38 315 DKLGDKY 516 QDN 517 WGRNTV 518 C33L39 316 TSSDDGKNNI 519 KDS 520 YAGASNHV 521 C33L57 317 DELGNKY 522 QDR 523 WDSSTV 524 C33L73 318 TSSDVGDYNY 525 DVS 526 YSSSSALE 527 C33L53 319 DKLGDKY 528 QDN 529 WDSNTV 530 C33L66 320 DKLGDKY 531 QDR 532 WDSSTV 533 C33L35 321 DKLGNKY 534 QDT 535 WDSSTV 536 C33L61 322 INSDVGSYDL 537 DG 538 YEVTTTYV 539 C33L51 323 NNIGSKS 540 DDS 541 WDSNSDHV 542 C33L44 324 DKLGDKY 543 QDS 544 WDSSTY 545 C33L30 325 DRLGDKY 546 QDS 547 WDSSSY 548 C33L69 326 DKLGSKF 549 QDS 550 WDSSTV 551 C33L37 327 SNIGKIS 552 DDR 553 WNSSSVHP 554 C33L74 328 TSSDVGDDNY 555 DVS 556 YSSSTTLE 557 C33L115 329 SQGISSW 558 O RSS 559 DNSFPY 560 C33L116 330 SQGISSW 561 GAS 562 DNSFPY 563 C33L117 331 SQTVLYSSNNKNY 564 WAS 565 YYSTPY 566 C33L118 332 SQTVFYSSNNKNY 567 WAS 568 YYSTPY 569 C33L119 333 SQSISSW 570 KAS 571 YNSYPW 572 C33L120 334 DELGDMY 573 QDS 574 WDTRIA 575 C33L121 335 DNLGNEH 576 QNN 577 WDSTTA 578 C33L122 336 VTLGYNY 579 QDT 580 WDITTV 581 C33L132 337 DKLGDKY 582 QDG 583 WDRNTV 584 C33L41 338 DKLGNKY 585 QDS 586 WDSSTV 587

Claims (38)

REIVINDICAÇÕES
1. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, caracterizado por se ligar especificamente ao domínio C2 de CD33.
2. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno caracterizado por compreender uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2 e LCDR3 tendo a sequência de polipeptídeos das: a. SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente; b. SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente; c. SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente; d. SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente; e. SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente; f. SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente; g. SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente; h. SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente; i. SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente; j. SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494,
respectivamente; k. SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente; l. SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente; m. SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente; n. SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente; ou o. SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente.
3. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ou 285, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324, ou 325.
4. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender: a. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; b. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; c. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; d. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; f. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; g. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; h. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; i. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; j. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; k. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; l. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; m. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; n. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; ou o. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325.
5. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por induzir a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) in vitro com uma EC50 menor que cerca de 28 nM.
6. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 5, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por compreender uma cadeia principal de IgG1 com baixo teor de fucose.
7. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por se ligar ao CD33 com uma constante de dissociação (KD) menor que cerca de 5 x 10-9 M.
8. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por se ligar ao CD33 e induzir internalização com um EC50 menor que cerca de 2 nM.
9. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por ser quimérico.
10. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por ser humano ou humanizado.
11. Anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, sendo o anticorpo ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por ser conjugado a um agente terapêutico.
12. Ácido nucleico isolado caracterizado por codificar o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. Vetor, caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 12.
14. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o vetor, como definido na reivindicação 13.
15. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o anticorpo monoclonal isolado ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das modalidades 1 a 10, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Método para tratar câncer em um indivíduo que precisa de tal tratamento, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo a composição farmacêutica, como definida na reivindicação
15.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o câncer ser um câncer hematológico.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o câncer hematológico ser selecionado do grupo que consiste em uma leucemia, um linfoma, ou um mieloma múltiplo.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17,
caracterizado por o câncer hematológico ser leucemia mieloide aguda (AML), síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), leucemia mieloide crônica (CML) ou neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides (DPDCN).
20. Método para produzir o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno sob condições para produzir o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação ao antígeno, e recuperar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da célula ou cultura .
21. Método para produzir uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo monoclonal ou o fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por compreender combinar o anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.
22. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3, caracterizado por compreender um anticorpo anti-CD33 ou um seu fragmento de ligação a antígeno e um anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, sendo que o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das: a. SEQ ID NOs:447, 448, 449, 567, 568, e 569, respectivamente;
b.
SEQ ID NOs:444, 445, 446, 564, 565, e 566, respectivamente; c.
SEQ ID NOs:354, 355, 356, 477, 478, e 479, respectivamente; d.
SEQ ID NOs:378, 379, 380, 501, 502, e 503, respectivamente; e.
SEQ ID NOs:411, 412, 413, 531, 532, e 533, respectivamente; f.
SEQ ID NOs:348, 349, 350, 471, 472, e 473, respectivamente; g.
SEQ ID NOs:360, 361, 362, 483, 484, e 485, respectivamente; h.
SEQ ID NOs:363, 364, 365, 486, 487, e 488, respectivamente; i.
SEQ ID NOs:366, 367, 368, 489, 490, e 491, respectivamente; j.
SEQ ID NOs:369, 370, 371, 492, 493, e 494, respectivamente; k.
SEQ ID NOs:387, 388, 389, 492, 493, e 494, respectivamente; l.
SEQ ID NOs:402, 403, 404, 522, 523, e 524, respectivamente; m.
SEQ ID NOs:408, 409, 410, 528, 529, e 530, respectivamente; n.
SEQ ID NOs:423, 424, 425, 543, 544, e 545, respectivamente; ou o.
SEQ ID NOs:426, 427, 428, 546, 547, e 548, respectivamente; e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação ao antígeno compreende uma região determinante de complementaridade de cadeia pesada 1 (HCDR1), HCDR2, HCDR3, uma região determinante de complementaridade de cadeia leve 1 (LCDR1), LCDR2, e LCDR3, tendo as sequências de polipeptídeos das: 1) SEQ ID NOs: 342, 343, 344, 465, 466, e 467, respectivamente; ou 2) SEQ ID NOs: 345, 346, 347, 468, 469, e 470, respectivamente.
23. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 22, sendo o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por compreender uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:292, 291, 261, 269, 280, 259, 263, 264, 265, 266, 272, 277, 279, 284, ou 285, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica às SEQ ID NOs:332, 331, 302, 310, 320, 300, 304, 305, 306, 307, 317, 319, 324, ou 325; e o anticorpo anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno compreende uma região variável de cadeia pesada tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:257 ou 258, ou uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos ao menos 95% idêntica à SEQ ID NO:298 ou 299.
24. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizado por compreender: a. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
b. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; c. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; d. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; e. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; f. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
g. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; h. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; i. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; j. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; k. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298;
l. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; m. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; n. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; o. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:257, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:298; p. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:292 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:332; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
q. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:291 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:331; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; r. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:261, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:302; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; s. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:269, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:310; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; t. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:280 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:322; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; u. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:259, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:300; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
v. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:263, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:304; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; w. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:264, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:305; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; x. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:265, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:306; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; y. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:266, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; z. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:272, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:307; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299;
aa. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:277, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:317; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; bb. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:279, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:319; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; cc. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:284 e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:324; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:299; ou dd. uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:285, e uma região variável de cadeia leve tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:325; e uma região variável de cadeia pesada tendo a sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO:258, e uma região variável de cadeia leve tendo uma sequência de polipeptídeos da SEQ ID NO NO:299.
25. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 24, sendo o anticorpo anti-CD33 ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por se ligar ao domínio C2 de CD33.
26. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 25, sendo o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti- CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por induzir a citotoxicidade dependente de células-T de células que expressam CD33 in vitro com um valor de EC50 menor que cerca de 1 nM.
27. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 26, sendo o anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por ser quimérico.
28. Anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 22 a 27, sendo o anticorpo biespecífico ou seu fragmento de ligação a antígeno caracterizado por ser humano ou humanizado.
29. Ácido nucleico isolado, caracterizado por codificar o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 28.
30. Vetor, caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 29.
31. Célula hospedeira, caracterizada por compreender o vetor, como definido na reivindicação 30.
32. Composição farmacêutica, caracterizada por compreender o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 28, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
33. Método para tratar câncer em um indivíduo que precisa de tal tratamento, caracterizado por compreender administrar ao indivíduo a composição farmacêutica, como definida na reivindicação
32.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o câncer ser um câncer hematológico.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado por o câncer hematológico ser selecionado do grupo que consiste em uma leucemia, um linfoma, ou um mieloma múltiplo.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o câncer hematológico ser leucemia mieloide aguda (AML), síndrome mielodisplásica (MDS), leucemia linfocítica aguda (ALL), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), leucemia mieloide crônica (CML) ou neoplasia blástica de células dendríticas plasmocitoides (DPDCN).
37. Método para produzir o anticorpo biespecífico anti- CD33/anti-CD3 ou seu fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado por compreender cultivar uma célula que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação a antígeno sob condições para produzir o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou fragmento de ligação a antígeno, e recuperar o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou fragmento de ligação a antígeno da célula ou cultura.
38. Método para produzir uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 22 a 28, caracterizado por compreender combinar o anticorpo biespecífico anti-CD33/anti-CD3 ou o fragmento de ligação a antígeno com um veículo farmaceuticamente aceitável para obter a composição farmacêutica.
BR112020023357-9A 2018-05-24 2019-05-21 anticorpos anti-cd33, anticorpos biespecíficos anti-cd33/anti-cd3 e usos dos mesmos BR112020023357A2 (pt)

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