BR112020021228A2

BR112020021228A2 - moléculas de união trans

Info

Publication number: BR112020021228A2
Application number: BR112020021228-8A
Authority: BR
Inventors: Philip R. Johnson; Bruce C. SCHNEPP; Jean Bennett; Scott J. Dooley; Krishna Jawaharlal Fisher; Junwei Sun
Original assignee: The Trustees Of The University Of Pennsylvania; Ascidian Therapeutics, Inc.
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2019-04-17
Publication date: 2021-03-02
Also published as: CN112449605A; IL278019A; EP3781213A4; CA3097004A1; US11993776B2; EP3781213A1; AU2019255708A1; JP2021520837A; MX2020010959A; US20210155938A1; KR20210018222A; WO2019204514A1

Abstract

"MOLÉCULAS DE UNIÃO TRANS". A presente invenção refere-se a moléculas de união trans de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de união trans pre-mRNA (RTMs)) capazes de corrigir uma ou mais mutações no gene ABCA4 ou gene CEP290. Tais moléculas são úteis no tratamento de distúrbios associados com mutações em ABCA4, tal como Doença de Stargardt (por exemplo, Doença de Stargardt 1) e distúrbios associados com uma mutação em CEP290, tal como amaurose congênita de Leber 10 (LCA 10). São também providos pela invenção descrita aqui métodos de uso das moléculas de união trans de ácido nucleico para correção de mutações em ABCA4 e CEP290 e para tratamento de distúrbios associados com mutações em ABCA4 e CEP290, tais como Doença de Stargardt e LCA 10.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉ- CULAS DE UNIÃO TRANS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade para os pedidos provisórios U.S. números de série 62/658.658 e 62/658.667, ambos depositados em 17 de abril de 2018, cujos conteú- dos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência que foi apresentada eletronicamente em formato ASCII e é aqui incorpora- da a título de referência em sua totalidade. A dita cópia ASCII, criada em 17 de março de 2019, é nomeada 51219- 016WO2_Sequence_Listing_04.16.19_ST25 e tem 608.489 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] Em geral, a invenção refere-se a moléculas de união trans de ABCA4 e CEP290.

ANTECEDENTES

[004] A Doença de Stargardt é uma doença ocular progressiva caracterizada por perda de visão central e colorida, o que pode ocorrer rapidamente ou durante o curso de vários anos. A visão periférica ge- ralmente permanece intacta. Várias mutações ao longo do comprimen- to do gene ABCA4 podem causar a Doença de Stargardt. Tratamentos atualmente em desenvolvimento para a Doença de Stargardt incluem administração lentiviral de ABCA4, variantes quimicamente modifica- das de vitamina A e terapia de célula epitelial do pigmento retinal.

[005] Amaurose congênita de Leber 10 (LCA 10) é uma condição caracterizada por prejuízo visual severo começando na infância. A perda de visão está associada com morte de fotorreceptor devido a defeitos ciliares. A mutação conhecida mais comum associada com

LCA 10 é uma mutação por ponto em que uma adenina é substituída com uma guanina no nucleotídeo 1.655 do íntron 26 do gene CEP290, que resulta em um defeito de união em que um códon de parada críp- tico é unido entre os exons 26 e 27. Essa mutação autossômica reces- siva causa a produção de uma proteína centrossomal não funcional, causando a cegueira característica de LCA 10.

[006] Terapia gênica mediada por vetor viral adenoassociado (AAV) tem um perfil de segurança provado em humanos e representa uma abordagem promissora para tratamento de uma variedade de de- feitos genéticos. No entanto, vetores de AAV podem ter limitações di- tadas por biologia viral, tais como limitações de tamanho de empaco- tamento que podem impedir a administração de moléculas de ácido nucleico grandes, tais como aquelas necessárias para substituir o ge- ne ABCA4 ou o gene CEP290. Portanto, há uma necessidade no campo de composições e métodos para correção de mutações em ABCA4 e CEP290.

SUMÁRIO

[007] A presente invenção refere-se a moléculas de união trans de ácido nucleico e métodos de uso das mesmas para correção de mutações no gene ABCA4 ou no gene CEP290. As composições e métodos providos aqui podem ser úteis no tratamento ou prevenção de doenças associadas com mutações em ABCA4, tal como Doença de Stargardt (por exemplo, Doença de Stargardt 1) ou mutações em CEP290, tal como LCA (por exemplo, LCA10). ABCA4

[008] Em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a moléculas de união trans de ABCA4. Por exemplo, a invenção provê uma molé- cula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente ligado ou em uma direção 3’-para-5’ ou uma direção 5’-para-3’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar um íntron de ABCA4 alvo selecionado do grupo consistindo em íntrons 19, 22, 23 ou 24; (b) um domínio de união configurado para mediar ligação trans; e (c) um do- mínio de codificação compreendendo um exon de ABCA4 funcional; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada pa- ra unir trans o domínio de codificação a um exon de ABCA4 endógeno adjacente ao íntron de ABCA-alvo, dessa maneira substituindo o exon de ABCA4 endógeno com um exon de ABCA4 funcional e corrigindo uma mutação em ABCA4.

[009] Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga o ín- tron de ABCA4 alvo 3’ à mutação, e em que a mutação é em qualquer um dos exons 1-24 ou íntrons 1-24 do ABCA4. Em algumas modalida- des, o íntron de ABCA4 alvo é íntron 19, é mutação é em qualquer um dos exons 1-19 ou íntrons 1-19 de ABCA4 e o domínio de codificação compreende exons 1-19 de ABCA4. Em algumas modalidades, o do- mínio de ligação é configurado para ligar íntron 19 em um sítio de liga- ção compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 990 a

2.174 de SEQ ID NO: 25 (por exemplo, qualquer um ou mais dos nu- cleotídeos 1.670 a 2.174 de SEQ ID NO: 25, por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.810 a 2.000 de SEQ ID NO: 25, por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.870 a 2.000 de SEQ ID NO: 25, por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos

1.920 a 2.000 de SEQ ID NO: 25.

[0010] Em algumas modalidades, o íntron de ABCA4 alvo é o ín- tron 23, a mutação é em qualquer um dos exons 1-23 ou íntrons 1-23 de ABCA4 e/ou o domínio de codificação compreende exons 1-23 de ABCA4. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 23 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 80 a 570 ou nucleotídeos 720 a 1.081 da SEQ ID NO: 29.

[0011] Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configu-

rado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compre- endendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29 (por exemplo, de 1 a 200, de 6 a 150, de 12 a 100 ou de 20 a 80 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nu- cleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, de a partir de 1 a 6, de a partir de 6 a 12, de a partir de 12 a 18, de a partir de 18 a 24, de a partir de 24 a 50, de a partir de 50 a 100, de a partir de 100 a 150 ou de a partir de 150 a 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo me- nos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150 ou pelo menos 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou com- preendendo nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29). Por exemplo, em modalidades particulares, o sítio de ligação compreende seis ou mais de nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29. Em algumas mo- dalidades, o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a (por exemplo, antissentido para) os seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende um conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a um conjunto correspondente de nucleotídeos complementares de um sítio de ligação de ABCA4 tendo um ou mais dos nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29, em que o conjunto de resíduos de ácido nu- cleico consecutivos do domínio de ligação é de a partir de 6 a 500 re- síduos de comprimento (por exemplo, de a partir de 8 a 400, de a par- tir de 12 a 300, de a partir de 16 a 200, de a partir de 24 a 280 ou de a partir de 50 a 150 resíduos de comprimento, por exemplo, de a partir de 100 a 200, de a partir de 6 a 10, de a partir de 10 a 20, de a partir de 20 a 30, de a partir de 30 a 40, de a partir de 40 a 50, de a partir de 50 a 80, de a partir de 80 a 100, de a partir de 100 a 120, de a partir de 120 a 150, de a partir de 150 a 200 ou de a partir de 200 a 300 resí- duos de comprimento, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 ou mais resí- duos de comprimento).

[0012] Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configu- rado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compre- endendo qualquer um ou mais nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29 (por exemplo, de a partir de 1 a 200, de a partir de 6 a 150, de a partir de 12 a 100 ou de a partir de 20 a 80 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, de a partir de 1 a 6, de a partir de 6 a 12, de a partir de 12 a 18, de a partir de 18 a 24, de a partir de 24 a 50, de a partir de 50 a 100, de a partir de 100 a 150 ou de a partir de 150 a 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleo- tídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, pelo menos um, pe- lo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150 ou pelo menos 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29). Por exemplo, em modalidades particulares, o sítio de ligação compreende seis ou mais nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreen- de seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a (por exemplo, antissentido para) os seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende um conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a um conjunto correspondente de nucleotídeos complementares de um sítio de ligação de ABCA4 tendo um ou mais de nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29, em que o conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos do domínio de ligação é de a partir de 6 a 500 resíduos de comprimento (por exemplo, de a partir de 8 a 400, de a partir de 12 a 300, de a partir de 16 a 200, de a partir de 24 a 280 ou de a partir de 50 a 150 resíduos de comprimento, por exemplo, de a partir de 100 a 200, de a partir de 6 a 10, de a partir de 10 a 20, de a partir de 20 a 30, de a partir de 30 a 40, de a partir de 40 a 50, e a partir de 50 a 80, de a partir de 80 a 100, de a partir de 100 a 120, de a partir de 120 a 150, de a partir de 150 a 200 ou de a partir de 200 a 300 resíduos de comprimento, por exem- plo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,

128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 ou mais resíduos de comprimento).

[0013] Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configu- rado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compre- endendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29 (Por exemplo, de a partir de 1 a 200, de a partir de 6 a 150, de a partir de 12 a 100, ou de a partir de 20 a 80 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, de a partir de 1 a 6, de a partir de 6 a 12, de a partir de 12 a 18, de a partir de 18 a 24, de a partir de 24 a 50, de a partir de 50 a 100, de a partir de 100 a 150 ou de a partir de 150 a200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleo- tídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, pelo menos um, pe- lo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150 ou pelo menos 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29). Por exemplo, em modalidades particulares, o sítio de ligação compreende seis ou mais de nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, o domínio de ligação com- preende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a (por exemplo, antissentido para) os seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação. Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende um conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a um conjunto correspondente de nucleotídeos complementares de um sítio de ligação a ABCA4 ten-

do um ou mais de nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29, em que o conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos do domínio de ligação é de a partir de 6 a 500 resíduos de comprimento (por exem- plo, de a partir de 8 a 400, de a partir de 12 a 300, de a partir de 16 a 200, de a partir de 24 a 280 ou de a partir de 50 a 150 resíduos de comprimento, por exemplo, de a partir de 100 a 200, de a partir de 6 a 10, de a partir de 10 a 20, de a partir de 20 a 30, de a partir de 30 a 40, de a partir de 40 a 50, de a partir de 50 a 80, de a partir de 80 a 100, de a partir de 100 a 120, de a partir de 120 a 150, de a partir de 150 a 200 ou de a partir de 200 a 300 resíduos de comprimento, por exem- plo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 ou mais resíduos de comprimento).

[0014] Em outras modalidades, o íntron de ABCA4 alvo é o íntron 24, a mutação é em qualquer um dos exons 1-24 ou íntrons 1-24 de ABCA4, e o domínio de codificação compreende exons 1-24 de AB- CA4. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 24 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 600 a 1.250 ou nucleotídeos 1.490 a

2.660 de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.000 a 1.200 de SEQ ID NO:30.

[0015] Em algumas modalidades, o domínio de ligação liga o ín-

tron de ABCA4 alvo 5’ à mutação, e em que a mutação está em qual- quer um dos exons 23-50 ou íntrons 22-49 de ABCA4. Por exemplo, em algumas modalidades, o íntron de ABCA4 alvo é íntron 23, a muta- ção está em qualquer um dos exons 24-50 ou íntrons 23-49 de AB- CA4, e o domínio de codificação compreende exons 24-50 de ABCA4. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 23 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 80 a 1.081 de SEQ ID NO: 29. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 230 a 1.081 de SEQ ID NO: 29, por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 250 a 400 de SEQ ID NO: 29 ou qual- quer um ou mais de nucleotídeos 690 a 850 de SEQ ID NO: 29.

[0016] Em algumas modalidades, o íntron de ABCA4 alvo é o ín- tron 24, a mutação é em qualquer um dos exons 25-50 ou íntrons 24- 49 de ABCA4, e o domínio de codificação compreende exons 25-50 de ABCA4. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 24 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais de nucleotídeos 1 a 250, nucleotídeos 300 a 2.100 ou nu- cleotídeos 2.200 a 2.692 de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalida- des, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotí- deos 360 a 610 de SEQ ID NO: 30. Em outras modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 750 a 1.110 de SEQ ID NO: 30.

[0017] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente li- gado em uma direção 5’ para 3’: (a) um domínio de ligação configura- do para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreen- dendo qualquer um ou mais nucleotídeos 60 a 570, 600 a 800 ou 900 a 1.350 de SEQ ID NO: 28; (b) um domínio de união configurado para mediar a ligação trans; e (c) um domínio de codificação compreenden-

do exons 23-50 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para unir trans o domínio de co- dificação a exon 22 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 23-50 de ABCA4 endógenos com os exons 23-50 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 70-250 de SEQ ID NO: 28.

[0018] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente li- gada em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configura- do para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreen- dendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1 a 510 ou 880 a 1.350 de SEQ ID NO: 28; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1-22 funcionais de ABCA4; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para união trans do domínio de codificação ao exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1- 22 de ABCA4 endógenos com exons 1-22 de ABCA4 funcionais.

[0019] Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configu- rado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compre- endendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28 (por exemplo, de a partir de 1 a 200, de a partir de 6 a 150, de a partir de 12 a 100 ou de a partir de 20 a 80 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28, por exemplo, de a partir de 1 a 6, de a partir de 6 a 12, de a partir de 12 a 18, de a partir de 18 a 24, de a partir de 24 a 50, de a partir de 50 a 100, de a partir de 100 a 150 ou de a partir de 150 a 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nu- cleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28, por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150 ou pelo menos 200 nucleotí- deos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28). Em modalidades particulares, o sítio de ligação compreende seis ou mais nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, o domínio de ligação com- preende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a (por exemplo, antissentido para) os seis ou mais nucleotídeos no sítio de ligação.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende um conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a um conjunto correspondente de nucleotídeos complementares de um sítio de ligação de ABCA4 tendo um ou mais nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28, em que o conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos do domínio de ligação é de a partir de 6 a 500 resíduos de comprimento (por exemplo, de a partir de 8 a 400, de a partir de 12 a 300, de a partir de 16 a 200, de a partir de 24 a 280 ou de a partir de 50 a 150 resíduos de comprimento, por exemplo, de a partir de 100 a 200, de a partir de 6 a 10, de a partir de 10 a 20, de a partir de 20 a 30, de a partir de 30 a 40, de a partir de 40 a 50, de a partir de 50 a 80, de a partir de 80 a 100, de a partir de 100 a 120, de a partir de 120 a 150, de a partir de 150 a 200 ou de a partir de 200 a 300 resíduos de comprimento, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,

113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 ou mais resíduos de comprimento).

[0020] Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configu- rado para ligar um ou mais de nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28 (por exemplo, de a partir de 1 a 200, de a partir de 6 a 150, de a partir de 12 a 100 ou de a partir de 20 a 80 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo os nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28, por exemplo, de a partir de 1 a 6, de a partir de 6 a 12, de a partir de 12 a 18, de a partir de 18 a 24, de a partir de 24 a 50, de a partir de 50 a 100, de a partir de 100 a 150 ou de a partir de 150 a 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nu- cleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28, por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150 ou pelo menos 200 nucleotí- deos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28). Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico con- secutivos que são complementares a (por exemplo, antissentido para) os seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação. Em algumas modali- dades, o domínio de ligação compreende um conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a um conjunto correspondente de nucleotídeos complementares de um sítio de liga- ção de ABCA4 tendo um ou mais de nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO:28, em que o conjunto de resíduos de ácido nucleico con-

secutivos do domínio de ligação é de a partir de 6 a 500 resíduos de comprimento (por exemplo, de a partir de 8 a 400, de a partir de 12 a 300, de a partir de 16 a 200, de a partir de 24 a 280 ou de a partir de 50 a 150 resíduos de comprimento, por exemplo, de a partir de 100 a 200, de a partir de 6 a 10, de a partir de 10 a 20, de a partir de 20 a 30, de a partir de 30 a 40, de a partir de 40 a 50, de a partir de 50 a 80, de a partir de 80 a 100, de a partir de 100 a 120, de a partir de 120 a 150, de a partir de 150 a 200 ou de a partir de 200 a 300 resíduos de com- primento, por exemplo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 ou mais resíduos de compri- mento).

[0021] Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configu- rado para ligar qualquer um ou mais de nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28 (por exemplo, de a partir de 1 a 200, de a partir de 6 a 150, de a partir de 12 a 100 ou de a partir de 20 a 80 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28, por exemplo, de a partir de 1 a 6, de a partir de 6 a 12, de a partir de 12 a 18, de a partir de 18 a 24, de a partir de 24 a 50, de a partir de 50 a 100, de a partir de 100 a 150 ou de a partir de 150 a 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreen- dendo nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28, por exemplo, pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo me- nos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 60, pelo menos 70, pelo menos 80, pelo menos 90, pelo menos 100, pelo menos 120, pelo menos 150 ou pelo menos 200 nucleotídeos de um sítio de ligação dentro ou compreendendo nucleo- tídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28). Em modalidades particulares, o sítio de ligação compreende seis ou mais de nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28. Em algumas modalidades, o domínio de liga- ção compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares a (por exemplo, antissentido para) os seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação compreende um conjunto de resíduos de ácido nu- cleico que são complementares a um conjunto correspondente de nu- cleotídeos complementares de um sítio de ligação de ABCA4 tendo um ou mais de nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28, em que o conjunto de resíduos de ácido nucleico consecutivos do domínio de ligação é de a partir de 6 a 500 resíduos de comprimento (por exem- plo, de a partir de 8 a 400, de a partir de 12 a 300, de a partir de 16 a 200, de a partir de 24 a 280 ou de a partir de 50 a 150 resíduos de comprimento, por exemplo, de a partir de 100 a 200, de a partir de 6 a 10, de a partir de 10 a 20, de a partir de 20 a 30, de a partir de 30 a 40, de a partir de 40 a 50, de a partir de 50 a 80, de a partir de 80 a 100, de a partir de 100 a 120, de a partir de 120 a 150, de a partir de 150 a 200 ou de a partir de 200 a 300 resíduos de comprimento, por exem- plo, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160 ou mais resíduos de comprimento).

[0022] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o domínio de ligação pode ser de 20-1.000 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 25-900 nucleotídeos de comprimento, 30-800 nucleotídeos de comprimento, 40-700 nucleotídeos de comprimento, 50-600 nucleo- tídeos de comprimento, 75-500 nucleotídeos de comprimento, 100-400 nucleotídeos de comprimento, 125-200 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 150 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 20-30 nucleotídeos de comprimento, 30-40 nucleotídeos de comprimento, 40-50 nucleotídeos de comprimento, 50-75 nucleotídeos de compri- mento, 75-100 nucleotídeos de comprimento, 125-150 nucleotídeos de comprimento, 150-175 nucleotídeos de comprimento, 175-200 nucleo- tídeos de comprimento, 200-250 nucleotídeos de comprimento, 250- 500 nucleotídeos de comprimento, 500-750 nucleotídeos de compri- mento ou 750-1,000 nucleotídeos de comprimento).

[0023] Em algumas modalidades, o domínio de codificação é uma sequência de cDNA. Em algumas modalidades, o domínio de codifica- ção compreende uma sequência de ocorrência natural. Em outras mo- dalidades, o domínio de codificação inclui uma sequência com códon otimizado. Em algumas modalidades, a molécula de união trans inclui um íntron artificial que compreende uma sequência espaçadora.

[0024] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos an- teriores, a molécula de união trans de ácido nucleico é de a partir de

3.000 a 4.000 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 3.100-3.900 nucleotídeos de comprimento, 3.200-3.800 nucleotídeos de compri- mento, 3.300-3.700 nucleotídeos de comprimento, 3.400-3.600 nucleo-

tídeos de comprimento ou cerca de 3.500 nucleotídeos de comprimen- to, por exemplo, 3.000-3.100 nucleotídeos de comprimento, 3.100-

3.200 nucleotídeos de comprimento, 3.200-3.300 nucleotídeos de comprimento, 3.300-3.400 nucleotídeos de comprimento, 3.400-3.500 nucleotídeos de comprimento, 3.500-3.600 nucleotídeos de compri- mento, 3.600-3.700 nucleotídeos de comprimento, 3.800-3.900 nucleo- tídeos de comprimento ou 3.900-4.000 nucleotídeos de comprimento).

[0025] Em algumas modalidades, a mutação no gene ABCA4 está associada com Doença de Stargardt. Em algumas modalidades, a mu- tação no gene ABCA4 associada com a Doença Stargardt é expressa em uma célula fotorreceptora.

[0026] Em um outro aspecto, é provida aqui uma molécula de uni- ão trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente ligado em uma direcao 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico con- secutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de união; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 1-23 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nuclei- co é configurada para unir trans o domínio de codificação a exon 24 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo exons 1-23 de ABCA4 endógenos com os exons 1-23 de ABCA4 funcionais.

[0027] Em um outro aspecto, a invenção provê uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente ligado em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nu-

cleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleo- tídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de união; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 1-23 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para unir trans o domínio de codifica- ção ao exon 24 de ABCA4, dessa maneira substituindo os exons 1-23 de ABCA4 endógenos com os exons 1-23 de ABCA4 funcionais.

[0028] Em um outro aspecto, é provida aqui uma molécula de uni- ão trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente ligado em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nu- cleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleo- tídeos no sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de união; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 1-23 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para ligar trans o domínio de codifica- ção ao exon 24 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-23 de ABCA4 endógenos com os exons 1-23 de ABCA4 fun- cionais.

[0029] Em um outro aspecto, a invenção provê uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente ligado em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nu- cleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleo- tídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de união; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 1-22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para unir trans o domínio de codifica- ção a exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-22 de ABCA4 endógenos com os exons 1-22 de ABCA4 fun- cionais.

[0030] Em um outro aspecto, a invenção provê uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente ligado em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nu- cleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleo- tídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de união; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 1-22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para unir trans o domínio de codifica- ção a exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-22 de ABCA4 endógenos com os exons 1-22 de ABCA4 fun- cionais.

[0031] Em ainda um outro aspecto, é provida aqui uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente li- gada em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configura- do para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreen- dendo seis ou mais de nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compre- endendo um domínio de união; e (c) um domínio de codificação com- preendendo exons 1-22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para unir trans o domínio de codificação a exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substi- tuindo os exons 1-22 de ABCA4 endógenos com os exons 1-22 de ABCA4 funcionais.

[0032] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um plasmídeo proviral incluindo a molécula de união trans de ácido nucleico de qual- quer uma das modalidades anteriores.

[0033] Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um ví- rus adenoassociado (AAV) compreendendo a molécula de ácido nu- cleico de qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas mo- dalidades, o AAV se direciona preferivelmente a uma célula fotorrecep- tora. Em algumas modalidades, o AAV compreende uma proteína do capsídeo de AAV5, uma proteína do capsídeo de AAV8, uma proteína do capsídeo de AAV8(b) ou uma proteína do capsídeo de AAV9.

[0034] Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de união trans de ácido nucleico, o plasmídeo proviral ou o AAV de qualquer um dos aspectos anteriores.

[0035] Em um outro aspecto, é provida aqui uma composição far- macêutica tendo qualquer uma das moléculas de união trans de ácido nucleico 5’ de qualquer uma das modalidades anteriores e uma molé- cula de união trans de ácido nucleico 3’ de qualquer uma das modali- dades anteriores.

[0036] Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um mé- todo de correção de uma mutação em um gene ABCA4 em uma célu- la-alvo do indivíduo através da administração ao indivíduo da compo- sição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores.

[0037] Em ainda um outro aspecto, é provido aqui um método de correção de uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 1-24 de ABCA4 em um indivíduo com necessidade do mesmo através da ad- ministração ao indivíduo de uma composição farmacêutica tendo uma molécula de união trans de ácido nucleico de qualquer uma das moda- lidades anteriores. Em modalidades particulares, o exon de ABCA4 mutado a ser corrigido por uma molécula de união trans de ABCA4 da invenção é exon 2. Adicionalmente ou alternativamente, o exon de ABCA4 mutado a ser corrigido por uma molécula de união trans de ABCA4 da invenção é o exon 3. Adicionalmente ou alternativamente, o exon de ABCA4 mutado a ser corrigido por uma molécula de união trans de ABCA4 da invenção é o exon 4.

[0038] Em um outro aspecto, a invenção inclui um método de cor- reção de uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 23-50 de ABCA4 em um indivíduo com necessidade do mesmo através da ad- ministração ao indivíduo de uma composição farmacêutica compreen- dendo a molécula de união trans de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0039] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de correção de uma mutação em qualquer um dos exons 1-24 de ABCA4 e uma segunda mutação em qualquer um dos exons 23-50 em um in- divíduo com necessidade do mesmo, o método compreendendo admi- nistrar ao indivíduo a composição farmacêutica tendo uma molécula de união trans de ácido nucleico 5’ de qualquer uma das modalidades an- teriores e uma molécula de união trans de ácido nucleico 3’ de qual- quer uma das modalidades anteriores.

[0040] Em ainda uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio associado com uma mutação em ABCA44, o método compreendendo administrar ao indivíduo qualquer uma das composições farmacêuticas anteriores. Em algumas modalidades, um indivíduo tendo um distúrbio associado com uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 1-2 ou íntrons 1-24 de ABCA4 é tratado através da administração de uma composi- ção farmacêutica compreendendo a molécula de união trans de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades anteriores. Em algumas modalidades, um indivíduo tendo um distúrbio associado com uma mu- tação em qualquer um ou mais dos exons 23-50 ou íntrons 22-49 de ABCA4 é tratado através da administração de uma composição farma- cêutica compreendendo a molécula de união trans de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0041] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento de um indivíduo tendo um distúrbio associado com uma primeira mutação em qualquer um dos exons 1-24 de ABCA4 e uma segunda mutação em qualquer um dos exons 23-50 através da admi- nistração ao indivíduo da composição farmacêutica tendo uma molécu- la de união trans de ácido nucleico 5’ de qualquer uma das modalida- des anteriores e uma molécula de união trans de ácido nucleico 3’ de qualquer uma das modalidades anteriores.

[0042] Em qualquer um dos métodos anteriores, o indivíduo pode ter a Doença de Stargardt. Em algumas modalidades, a composição é administrada através de injeção sub-retinal, injeção intravítrea ou inje- ção intravenosa.

[0043] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos an- teriores, o indivíduo exibe pelo menos 1% de aumento em expressão de proteína de ABCA4 após administração (por exemplo, um aumento de 1-5%, um aumento de 5-10%, um aumento de 10-15%, um aumen- to de 15-20%, um aumento de 20-25%, um aumento de 25-50% ou um aumento de 50-100% em expressão de proteína ABCA4 após adminis- tração, por exemplo, em relação a uma expressão de proteína ABCA4 no mesmo indivíduo antes da administração, ou em relação a uma amostra de referência, indivíduo de referência ou um grupo de refe- rência de indivíduos).

CEP290

[0044] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a moléculas de união trans de CEP290. Por exemplo, a invenção provê uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente li- gado em uma direção 3’-pra-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 26 de CEP290 em um sítio de ligação compreen- dendo qualquer um ou mais de nucleotídeos 4.800 a 5.838 de SEQ ID NO: 84; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 2-26 funcio- nais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configura- da para unir trans o domínio de união a exon 27 de CEP290 endóge- no, dessa maneira substituindo os exons 2-26 de CEP290 endógenos com os exons 2-26 de CEP290 funcionais e correção da mutação por ponto patogênica. Em algumas modalidades, a mutação por ponto pa- togênica é uma mutação A-em-G no nucleotídeo 1.655 de SEQ ID NO:

85.

[0045] Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 4.980 a 5.838 de SEQ ID NO:

85. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 5.348 a 5.838 de SEQ ID NO: 85. Em al- gumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 5.348 a 5.700 deSEQ ID NO: 85. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 5.400 a 5,600 de SEQ ID NO: 85. Em algumas modalida- des, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotí- deos 5.460 a 5.560 de SEQ ID NO: 85. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende nucleotídeo 5.500 de SEQ ID NO: 85.

[0046] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma molécula de união trans de ácido nucleico compreendendo, operativamente li- gado em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configura- do para ligar CEP290 em qualquer um dos íntrons-alvo 27, 28, 29 ou

30; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons de CDP290 funcio- nais 5’ para o íntron-alvo; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para unir trans o domínio de codificação a CEP290 endógeno, dessa maneira substituindo os exons de CEP290 endógenos 5’ para o íntron-alvo com os exons de CEP290 funcionais e corrigindo a mutação por ponto patogênica. Em algumas modalidades, a mutação por ponto patogênica é uma mutação A-para-G no nucleo- tídeo 1.655 de SEQ ID NO: 85.

[0047] Em algumas modalidades, o íntron-alvo é o íntron 27, o domínio de codificação compreendendo os exons 2-27 de CEP290 funcionais e a molécula de união trans de ácido nucleico é configurado para substituir os exons 2-27 de CEP290 endógenos com os exons 2- 27 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o domínio de li- gação é configurado para ligar o íntron 27 em um sítio de ligação com- preendendo qualquer um ou mais de nucleotídeos 120 a 680, nucleo- tídeos 710 a 2.200 ou nucleotídeos 2.670 a 2.910 de SEQ ID NO: 86. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 790 a 2.100 de SEQ ID NO: 86, por exemplo, qualquer um ou mais nucleotídeos 1.020 a 1.630 de SEQ ID NO: 86. Em outras modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 1.670 a 2.000 de SEQ ID NO: 86.

[0048] Em algumas modalidades, o íntron-alvo é o íntron 28, o domínio de codificação compreendendo os exons 2-28 de CEP290 funcionais e a molécula de união trans de ácido nucleico é configurada para substituir os exons 2-28 de CEP290 endógenos com os exons 2- 28 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o domínio de li- gação é configurado para ligar o íntron 28 em um sítio de ligação com- preendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1 a 390, nucleotí- deos 410 a 560 ou nucleotídeos 730 a 937 de SEQ ID NO: 87. Em al-

gumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1 a 200 de SEQ ID NO: 87. Em outras modali- dades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucle- otídeos 720 a 900 de SEQ ID NO: 87.

[0049] Em algumas modalidades, o íntron-alvo é o íntron 29, o domínio de codificação compreendendo os exons 2-29 de CEP290 funcionais, e a molécula de união trans de ácido nucleico é configura- da para substituir os exons 2-29 de CEp290 endógenos com os exons 2-29 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 29 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1 a 600, nu- cleotídeos 720 a 940 ou nucleotídeos 1.370 a 1.790 de SEQ ID NO:

88.

[0050] Em algumas modalidades, o íntron-alvo é o íntron 30, o domínio de codificação compreendendo os exons 2-30 de CEP290 funcionais, e a molécula de união trans de ácido nucleico é configura- da para substituir os exons 2-30 de CEP290 endógenos com os exons 2-30 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 29 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 800 a 1.240 de SEQ ID NO: 89, por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotí- deos 950 a 1.240 de SEQ ID NO: 89, por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.060 a 1.240 de SEQ ID NO: 89.

[0051] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o domínio de ligação é 20-1.000 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 25- 900 nucleotídeos de comprimento, 30-800 nucleotídeos de compri- mento, 40-700 nucleotídeos de comprimento, 50-600 nucleotídeos de comprimento, 75-500 nucleotídeos de comprimento, 100-400 nucleotí- deos de comprimento, 125-200 nucleotídeos de comprimento ou cerca de 150 nucleotídeos de comprimento, por exemplo,20-30 nucleotídeos de comprimento, 30-40 nucleotídeos de comprimento, 40-50 nucleotí- deos de comprimento, 50-75 nucleotídeos de comprimento, 75-100 nucleotídeos de comprimento, 125-150 nucleotídeos de comprimento, 150-175 nucleotídeos de comprimento, 175-200 nucleotídeos de com- primento, 200-250 nucleotídeos de comprimento, 250-500 nucleotí- deos de comprimento, 500-750 nucleotídeos de comprimento ou 750-

1.000 nucleotídeos de comprimento).

[0052] Em algumas modalidades, o domínio de codificação é uma sequência de cDNA. Em algumas modalidades, o domínio de codifica- ção é uma sequência de ocorrência natural. Em outras modalidades, o domínio de codificação é uma sequência com códon otimizado.

[0053] Em algumas modalidades, um íntron artificial compreende um íntron artificial e uma sequência espaçadora.

[0054] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a molécula de união trans de ácido nucleico pode ser de 3.000 a 4.000 nucleotí- deos de comprimento.

[0055] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o exon de CEP290 mutado pode ser associado com LCA 10. Em algumas moda- lidades, o exon de CEP290 mutado associado com LCA 10 é expresso em uma célula fotorreceptora.

[0056] Em um outro aspecto da invenção, é provido aqui um plas- mídeo proviral compreendendo a molécula de união trans de ácido nu- cleico de qualquer um dos aspectos anteriores.

[0057] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um vírus adenoassociado (AAV) compreendendo a molécula de ácido nucleico de qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, o AAV se direciona preferivelmente a uma célula fotorreceptora. Em al- gumas modalidades, o AAV compreende uma proteína do capsídeo AAV5, uma proteína do capsídeo AAV8, uma proteína do capsídeo AAV8(b) ou uma proteína do capsídeo AAV9.

[0058] Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma compo- sição farmacêutica compreendendo a molécula de união trans de áci- do nucleico, o plasmídeo proviral ou o AAV de qualquer um dos aspec- tos anteriores.

[0059] Em um outro aspecto, são providos aqui métodos de corre- ção de uma mutação por ponto patogênica no íntron 26 de CEP290 em uma célula-alvo de um indivíduo, os métodos compreendendo ad- ministrar ao indivíduo a molécula de união trans de ácido nucleico, o plasmídeo proviral, o AAV ou a composição farmacêutica de qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, o indivíduo tem LCA 10.

[0060] Em ainda um outro aspecto, a invenção provê um método de tratamento de um indivíduo tendo LCA 10 causada por uma muta- ção por ponto patogênica em íntrons 260 de CEP290, o método com- preendendo administrar ao indivíduo a molécula de união trans de áci- do nucleico, o plasmídeo proviral, o AAV ou a composição farmacêuti- ca de qualquer um dos aspectos anteriores.

[0061] Em qualquer um dos métodos anteriores, a mutação por ponto patogênica pode ser uma mutação A-em-G no nucleotídeo 1.655 do íntron 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 85). Em algumas modalidades, a molécula de união trans de ácido nucleico, o plasmídeo proviral, o AAV ou a composição farmacêutica é administrado através de injeção sub-retinal, injeção intravítrea ou injeção intravenosa.

[0062] Em um outro aspecto, a invenção provê um estojo compre- endendo qualquer um ou mais das moléculas de união trans de ácido nucleico, plasmídeos provirais, AAVs, ou composições farmacêuticas anteriores, em que o estojo inclui ainda instruções para uso dos um ou mais moléculas de união trans de ácido nucleico, plasmídeos provirais, AAVs ou composições farmacêuticas para correção de uma mutação em um gene de CEP290 de um indivíduo (por exemplo, uma mutação associada com um distúrbio, tal como LCA 10).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0063] A FIG. 1 é um desenho esquemático de várias moléculas de união trans de ácido nucleico exemplares para correção de um exon de ABCA4 mutado com um exon de ABCA4 funcional. Caixas sombreadas escuras representam exons de ABCA4 nativos. As linhas pontilhadas unindo as caixas sombreadas escuras representam ín- trons nativos. Caixas sombreadas claras com bordas escuras repre- sentam exons de ABCA4 funcionais com uma molécula de união trans de ácido nucleico. Um domínio de união, representado por uma linha curvada, é ligado a uma extremidade de cada um dos exons de AB- CA4 funcionais e leva a um íntron do pre-mRNA de ABCA4.

[0064] A FIG. 2 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 19 de ABCA4 (SEQ ID NO: 25) em inter- valos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 5’. Os ró- tulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começando a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0065] A FIG. 3 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 22 de ABCA4 (SEQ ID NO: 28) em inter- valos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 5’. Os ró- tulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começando a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0066] A FIG. 4 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 22 de ABCA4 (SEQ ID NO: 28) em inter- valos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 3’. Os ró-

tulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começando a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0067] A FIG. 5 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 23 de ABCA4 (SEQ ID NO: 29) em inter- valos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 5’. Os ró- tulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começando a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0068] A FIG. 6 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 23 de ABCA4 (SEQ ID NO: 29) em inter- valos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 3’. Os ró- tulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começando a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0069] A FIG. 7 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 24 de ABCA4 (SEQ ID NO: 308) em in- tervalos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 5’. Os rótulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começan- do a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0070] A FIG. 8 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150-mer através do íntron 24 de ABCA4 (SEQ ID NO: 308) em in- tervalos de dez nucleotídeos usando moléculas de união trans 3’. Os rótulos do eixo X indicam o número de cada sítio de ligação começan- do a partir da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0071] A FIG. 9 é um desenho esquemático mostrando uma prote- ína TALEN consistindo em um domínio de ligação a DNA ligado a um domínio de ativação de transcrição. Um domínio de ativação de trans- crição VD64 é mostrado. O painel da direita mostra uma porção da re- gião não traduzida 5’ (5’-UTR) de ABCA44. A caixa TATA e o sítio de iniciação de transcrição putativo são mostrados. As sequências direci- onadas pelos três domínios de ligação a DNA de TALENs são também mostradas. TALEN 1 se liga à primeira sequência sublinhada, TALEN 2 se liga à segunda sequência sublinhada e TALEN 3 se liga à terceira sequência sublinhada, como indicado.

[0072] A FIG. 10 é um gel mostrando células 293T que foram transfectadas com construtos de TALEN projetados para induzir ex- pressão de ABCA4 endógeno. Todos os três TALENS da FIG. 9 foram introduzidos estavelmente em células 293 e clones de célula únicos foram escolhidos e analisados através de Western blot. O controle po- sitivo (+) indica células transfectadas com um plasmídeo expressando um cDNA de ABCA4. Lisatos de célula foram feitos 48 horas após transfecção e as frações de membrana foram examinadas quanto à expressão de ABCA4 usando anticorpo ab72955 (Abcam). Os clones ZT-22 e ZT-48 mostraram expressão da proteína ABCA44.

[0073] A FIG. 11 é um desenho esquemático mostrando uma li- nhagem de célula de promotor CAG.

[0074] As FIGS. 12A e 12B mostram guias específicos de sítio (FIG. 12A) que foram planejados para inserir o promotor CAG e um marcador selecionável de puromicina usando braços de homologia (FIG. 12B).

[0075] A FIG. 13 é desenho esquemático mostrando uma linha- gem de célula de promotor CAG.

[0076] As FIGS. 14A e 14B são um gráfico e um gel, respectiva-

mente, mostrando resultados de expressão de várias linhagens clonais que foram selecionadas para análises adicionais. A FIG. 14A mostra expressão de RNA e a FIG. 14B mostra expressão de proteína das linhagens de célula. Preparações de membrana das linhagens de célu- las indicadas foram sondadas quanto à proteína ABCA4 usando um anticorpo policlonal de coelho para ABCA4 (Abcam, ab72955). O tem- po de exposição é de 23 segundos. Células 293 são a célula de ori- gem que não expressam ABCA4. A faixa superior é antecedente não específico presente em todas as células.

[0077] A FIG. 15 é um desenho esquemático mostrando RNA guia de CRISPR para direcionamento aos exons 3 e 4.

[0078] A FIG. 16 é um gráfico mostrando expressão de RNA e um gel mostrando perfis de proteína de clones de célula únicos derivados após tratamento com CRISPR/Cas9, como mostrado na FIG. 15.

[0079] As FIGS. 17A e 17B são desenhos esquemáticos mostran- do PCR para análises de mutação em cDNA (FIG. 17A) e PCR para genotipificação em cDNA (FIG. 17B), confirmando que os exons 3 e 4 foram direcionados e interrompidos.

[0080] A FIG. 18 é um conjunto de tabelas mostrando que as aná- lises de mutação das FIGS. 17A r 17B confirmaram que os exons 3 e 4 foram direcionados e interrompidos em alelos nas linhagens de célula 17+06 e 17+21.

[0081] As FIGS. 19A e 19B são desenhos esquemáticos de molé- culas de união trans se direcionando a pre-mRNA de ABCA4. A FIG. 19A mostra uma molécula de união trans genérica incluindo um exon com códon otimizado (ou conjunto de exons), um domínio de ligação que hibridiza para um RNA-alvo e um ligante de íntron artificial. A FIG. 19B mostra várias moléculas de união trans que se direcionam a regi- ões particulares-alvo dentro dos íntrons 22 e 23 de ABCA4.

[0082] As FIGS. 20A-20D são géis (FIGS. 20A e 20C) e gráficos

(FIGS. 20B e 20D) mostrando resultados de reações de união trans. As FIGS. 20A e 20B mostram níveis de proteína e RNA, respectiva- mente, das reações de união trans do íntron 22 e as FIGS. 20C e 20D mostram níveis de proteína e RNA, respectivamente, de reações de união trans do íntron 23.

[0083] A FIG. 21 é um desenho esquemático de várias moléculas de união trans de ácido nucleico exemplares para correção de uma mutação no íntron 26 de CEP290 com uma porção 5’ do gene de CEP290. Caixas sombreadas escuras representam exons de CEP290 nativos. As linhas pontilhadas unindo as caixas sombreadas escuras representam íntrons nativos. Caixas sombreadas claras com bordas escuras representam exons de CEP290 funcionais dentro de uma mo- lécula de união trans de ácido nucleico. Um domínio de união, repre- sentado por uma linha curvada, é ligado a uma extremidade de cada uma das sequências de exon de CEP290 funcionais e leva a um íntron do pre-mRA de CEP290.

[0084] A FIG. 22 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínios de ligação de 150 mer através do íntron 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 85) em in- tervalos de dez nucleotídeos. Os rótulos do eixo X indicam "número do motivo" do número de cada sítio de ligação começando a partir da ex- tremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0085] A FIG. 23 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (variação na concentração relativa) conferida por domínio de ligação de 150 mer através do íntron 27 de CEP290 (SEQ ID NO: 86) em in- tervalos de dez nucleotídeos. Cada uma das três linhas representa um experimento independente. Os rótulos do eixo X indicam "número do motivo" do número de cada sítio de ligação começando da extremida- de 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0086] A FIG. 24 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (razão de mudança em vezes) conferida por domínios de ligação de 150 mer através do íntron 28 de CEP290 (SEQ ID NO: 87) em interva- los de dez nucleotídeos. Cada uma das três linhas representa um ex- perimento independente. Os rótulos do eixo X indica "numero do moti- vo" do número de cada sítio de ligação começando da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0087] A FIG. 25 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (razão de mudança em vezes) conferida por domínios de ligação de 150 mer através do íntron 29 de CEP290 (SEQ ID NO: 88) em interva- los de dez nucleotídeos. Cada uma das três linhas representa um ex- perimento independente. Os rótulos do eixo X indicam "número de mo- tivo" do número de cada sítio de ligação começando da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo da sequência de íntron).

[0088] A FIG. 26 é um gráfico mostrando eficiência de união trans (razão de mudança em vezes) conferida por domínios de ligação de 150 mer através do íntron 30 de CEP290 (SEQ ID NO:89) em interva- los de dez nucleotídeos. Cada uma das três linhas representa um ex- perimento independente. Os rótulos do eixo X indicam "número do mo- tivo" do número de cada sítio de ligação começando da extremidade 5’ do íntron (isto é, o primeiro nucleotídeo na sequência de íntron).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0089] As composições e métodos descritos aqui envolvem molé- culas de união trans (por exemplo, moléculas de união trans de pre- mRNA administradas pelo vírus adenoassociado (AAV)) para trata- mento de doenças ou distúrbios causados por uma mutação no gene ABCA4. Os métodos e composições descritos aqui empregam união trans de pre-MRA como uma terapia gênica (por exemplo, terapia de gene ex vivo e in vivo) para o tratamento de doenças causadas por uma mutação de ABCA4, tal como Doença de Stargardt (por exemplo,

Doença de Stargardt 1).

[0090] Alternativamente, as composições e métodos descritos aqui envolvem moléculas de união trans (por exemplo, moléculas de união trans pre-mRNA administradas pelo vírus adenoassociado (AAV) para tratamento de doenças ou distúrbios causados por uma mutação no gene CEP290, tal como LCA 10. Esses métodos empregam união trans de pre-mRNA como uma terapia gênica (por exemplo, terapia gênica ex vivo e in vivo) para o tratamento de doenças causadas por uma mutação de CEP290, tal como LCA 10.

[0091] As moléculas de união trans e métodos de uso das mes- mas exemplificados aqui proveem várias vantagens com relação a te- rapias convencionais. Primeiro, o uso da molécula de união trans ad- ministrada pelo AAV provê administração eficiente e específica de uma terapia gênica para fotorreceptores, enquanto superando dificuldades associadas com o limite de empacotamento de AAV. Segundo, essas composições e métodos permitem correção do defeito genético na fon- te. Ainda, as composições e métodos providos aqui são úteis para tra- tar qualquer tipo de mutação em ABCA4 (ou outros cassetes de cDNAs/transgenes grandes). Correção do defeito em fotorreceptores provê resgate secundário para células do epitélio do pigmento retinal. Ainda, os presentes métodos e composições são geralmente imunolo- gicamente benignos. O uso de administração sub-retinal e outros ele- mentos torna o efeito específico para células-alvo, tais como fotorre- ceptores, de modo que toxicidade devido à união fora do alvo é redu- zida. Ainda, diferente de nucleases, união trans não requer alterações genômicas. Finalmente, reparo de RNA não requer divisão celular, en- quanto metodologias de reparo de DNA (tal como CRISPR-Cas9 ou dedos-de-zinco) têm uma exigência que a célula cresça através de mi- tose para reparo direcionado por homologia ocorrer, o que é uma des- vantagem em tecidos pós-mitóticos tal como a retina.

I. Definições

[0092] A menos que de outro modo definido, termos técnicos e ci- entíficos usados aqui têm o mesmo significado comumente compreen- dido por um versado de habilidade comum na técnica à qual a presen- te invenção pertence e a título de referência a textos publicados, que proveem um versado na técnica com uma orientação geral para muitos dos termos usados no presente pedido. No caso de quaisquer defini- ções conflitantes entre aquelas mostradas aqui e aquelas de uma pu- blicação referida, a definição provida aqui deve prevalecer.

[0093] Uma "molécula de união trans de ácido nucleico" ou "molé- cula de união trans" tem três elementos principais: (a) um domínio de ligação que confere especificidade através de ancoragem da molécula de união trans ao seu gene-alvo (por exemplo, pre-mRNA); (b) um domínio de união (por exemplo, um domínio de união tendo um sítio de união 3’ ou 5’); e (c) uma sequência de codificação configurada pa- ra ser unida trans ao gene-alvo, que pode substituir um ou mais exons no gene-alvo (por exemplo, um ou mais exons mutados). Uma "molé- cula de união trans de pre-mRNA" ou "RTM" se refere a uma molécula de união trans de ácido nucleico que se direciona a pre-mRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de união trans, tal como uma RTM, pode incluir cDNA, por exemplo, como parte de um exon funcio- nal (por exemplo, um exon funcional de ABCA4 ou CEP290, por exemplo, um exon com códon otimizado) para substituição ou corre- ção de um exon de ABCA4 ou CEP290 mutado).

[0094] Por "união trans" quer dizer união de uma molécula de áci- do nucleico contendo um ou mais exons (por exemplo, exons exóge- nos, por exemplo, exons que são parte de um domínio de codificação de uma molécula de união trans) a uma primeira porção de uma molé- cula de RNA separada (por exemplo, uma molécula de pre-mRNA, por exemplo, uma molécula de pre-mRNA endógena) por substituição de uma segunda porção da molécula de RNA através de um mecanismo mediado por spliceossoma.

[0095] "Ligação" entre um domínio de ligação e um íntron-alvo, como aqui usado, se refere à ligação hidrogênio entre o domínio de ligação e o íntron-alvo em um grau suficiente para mediar união trans ao trazer a molécula de união trans em associação com o gene-alvo (por exemplo, pre-mRNA). Em algumas modalidades, as ligações hi- drogênio entre o domínio de ligação e o íntron-alvo estão entre bases de nucleotídeo que são complementares a e em orientação antissenti- do uma da outra (por exemplo, hibridizadas uma para a outra).

[0096] Como aqui usado, um "íntron artificial" se refere a uma se- quência de ácido nucleico que liga (diretamente ou indiretamente) um domínio de ligação a um domínio de codificação. Um íntron artificial inclui um domínio de união e pode incluir ainda uma ou mais sequên- cias espaçadoras e/ou outros elementos reguladores.

[0097] Um "domínio de união", como aqui usado, se refere a uma sequência de ácido nucleico tendo motivos que são reconhecidos pelo spliceossoma e media união trans. Um domínio de união inclui um sítio de união (por exemplo, um sítio de união único, isto é, um e apenas um sítio de união), que pode ser um sítio de união 3’ ou um sítio de união 5’. Um domínio de união pode incluir outros elementos regulado- res. Por exemplo, em algumas modalidades, um domínio de união in- clui potencializadores de união (por exemplo, potencializadores de união exônicos (ESSE) ou potencializadores de união intrônicos (ISE)). Em algumas modalidades, um domínio de união inclui um ponto de ramificação (por exemplo, um ponto de ramificação conservado forte) ou sequência de sítio de ramificação e/ou trato de polipirimidina (PPT). Em algumas modalidades, o domínio de união de uma molécula de união trans 5’ não contém o ponto de ramificação ou PPT, mas com- preende um aceitador de união 5’ ou um doador de união 3’.

[0098] Como aqui usado, uma "mutação" se refere a qualquer se- quência de ácido nucleico aberrante que causa um produto de proteí- na defeituoso (por exemplo, um produto de proteína não funcional, um produto de proteína tendo função reduzida, um produto de proteína tendo função aberrante e/ou um produto de proteína que é produzido em quantidades menores do que o normal ou maiores do que o nor- mal). As mutações incluem mutações de par de base (por exemplo, polimorfismo de nucleotídeo único), mutações sem sentido, mutações de mudança de estrutura, deleções, inserções e mutação de união. Em algumas modalidades, uma mutação se refere a uma sequência de ácido nucleico que é diferente em uma ou mais porções de sua se- quência de uma sequência de ácido nucleico do tipo selvagem corres- pondente ou variante funcional da mesma. Um "exon mutado" (por exemplo, um exon de ABCA4 mutado) se refere a um exon contendo uma mutação ou uma sequência de exon que reflete uma mutação em uma região diferente, tal como um exon críptico resultante de uma mu- tação em um íntron.

[0099] Como aqui usado, o termo "ABCA4" se refere a um polinu- cleotídeo (por exemplo, RNA (por exemplo, pre-mRNA ou mRNA) ou DNA) que codifica transportador de cassete de ligação a ATP específi- co-retinal. Uma sequência de pre-mRNA exemplar de um gene de ABCA4 humano funcional é dada pela SEQ ID NO: 6. Uma sequência de DNA genômico exemplar de um gene ABCA4 humano funcional (tipo selvagem) é dada pela Sequência de Referência NCBI: NG_009073. A sequência de aminoácido de uma proteína ABCA4 exemplar é dada pelo No. de Acesso de Proteína P78363.

[00100] Exons e íntrons de ABCA4 são identificados aqui como mostrado na Tabela 1, abaixo, que podem ser mapeados na molécula de pre-mRNA de ABCA4 de SEQ ID NO: 6. Cada exon e íntron de ABCA4 é identificado aqui de acordo com o número de referência na primeira coluna (esquerda). O tamanho de cada exon e íntron (pares de base; pb) é indicado nas segunda e terceira colunas.

A quarta colu- na indica o comprimento da molécula de cDNA correspondendo aos exons 5’ para o número de íntron correspondente.

A quinta coluna in- dica o comprimento de uma molécula de cDNA correspondendo a mRNA 31 para o número de íntron correspondente.

Tabela 1. Sumário de exon e íntron de ABCA4 Número do Tamanho do Tamanho do 5' cDNA 3' cDNA Exon/Íntron Exon Íntron 1 153 7,913 66 6,822 2 94 1,393 160 6,756 3 142 2,721 302 6,662 4 140 5,434 442 6,520 5 128 4,023 570 6,380 6 198 15,352 768 6,252 7 90 2,633 858 6,054 8 241 1,016 1,099 5,964 9 140 615 1,239 5,723 10 117 702 1,356 5,583 11 198 14,372 1,554 5,466 12 206 358 1,760 5,268 13 177 1,817 1,937 5,062 14 223 3,714 2,160 4,885 15 222 1,285 2,382 4,662 16 205 3,412 2,587 4,440 17 66 2,675 2,653 4,235 18 90 1,774 2,743 4,169 19 175 2,174 2,918 4,079 20 132 1,137 3,050 3,904 21 140 437 3,190 3,772 22 138 1,358 3,328 3,632 23 194 1,081 3,522 3,494

Número do Tamanho do Tamanho do 5' cDNA 3' cDNA Exon/Íntron Exon Íntron 24 85 2,692 3,607 3,300 25 206 356 3,813 3,215 26 49 4,696 3,862 3,009 27 266 657 4,128 2,960 28 125 469 4,253 2,694 29 99 796 4,352 2,569 30 187 4,396 4,539 2,470 31 95 1,535 4,634 2,283 32 33 1,434 4,667 2,188 33 106 131 4,773 2,155 34 75 230 4,848 2,049 35 170 1,480 5,018 1,974 36 178 3,727 5,196 1,804 37 116 1,048 5,312 1,626 38 148 3,157 5,460 1,510 39 124 332 5,584 1,362 40 130 1,928 5,714 1,238 41 121 453 5,835 1,108 42 63 494 5,898 987 43 107 2,051 6,005 924 44 142 3,448 6,147 817 45 135 752 6,282 675 46 104 73 6,386 540 47 93 2,725 6,479 436 48 250 1,665 6,729 343 49 87 2,866 6,816 93 50 406 6,822 6

[00101] Como aqui usado, um "íntron de ABCA4 alvo" se refere a um dos 49 íntrons de ABCA4 identificados na Tabela 1, acima. Identifi- cadores de sequência de ácido nucleico para cada sequência de íntron de ABCA4 são providos na Tabela 2, abaixo. Será compreendido que o escopo do termo "íntron de ABCA4 alvo" compreende variantes de íntrons de ABCA4 providos aqui, tais como sequências de íntron tendo 90-100% de homologia com as sequências providas aqui (por exem- plo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de homologia com as sequências providas aqui), onde a localização do íntron variante no gene ABCA4 corresponde àquela provida aqui (por exemplo, em relação a seus exons adjacentes como mostrado na Tabela 1). Tabela 2. Sequências de íntron de ABCA4 Número do Íntron Sequência 1 SEQ ID NO: 7 2 SEQ ID NO: 8 3 SEQ ID NO: 9 4 SEQ ID NO: 10 5 SEQ ID NO: 11 6 SEQ ID NO: 12 7 SEQ ID NO: 13 8 SEQ ID NO: 14 9 SEQ ID NO: 15 10 SEQ ID NO: 16 11 SEQ ID NO: 17 12 SEQ ID NO: 18 13 SEQ ID NO: 19 14 SEQ ID NO: 20 15 SEQ ID NO: 21 16 SEQ ID NO: 22 17 SEQ ID NO: 23 18 SEQ ID NO: 24 19 SEQ ID NO: 25 20 SEQ ID NO: 26 21 SEQ ID NO: 27 22 SEQ ID NO: 28

Número do Íntron Sequência 23 SEQ ID NO: 29 24 SEQ ID NO: 30 25 SEQ ID NO: 31 26 SEQ ID NO: 32 27 SEQ ID NO: 33 28 SEQ ID NO: 34 29 SEQ ID NO: 35 30 SEQ ID NO: 36 31 SEQ ID NO: 37 32 SEQ ID NO: 38 33 SEQ ID NO: 39 34 SEQ ID NO: 40 35 SEQ ID NO: 41 36 SEQ ID NO: 42 37 SEQ ID NO: 43 38 SEQ ID NO: 44 39 SEQ ID NO: 45 40 SEQ ID NO: 46 41 SEQ ID NO: 47 42 SEQ ID NO: 48 43 SEQ ID NO: 49 44 SEQ ID NO: 50 45 SEQ ID NO: 51 46 SEQ ID NO: 52 47 SEQ ID NO: 53 48 SEQ ID NO: 54 49 SEQ ID NO: 55

[00102] Como aqui usado, o termo "CEP290" se refere a um polinu- cleotídeo (por exemplo, RNA (por exemplo, pre-mRNA ou mRNA) ou DNA) que codifica a proteína centrossomal 290. Uma sequência de pre-mRNA exemplar de um gene CEP290 humano funcional é dada pela SEQ ID NO: 113. Uma sequência de DNA genômico exemplar de um gene CEP290 humano funcional (tipo selvagem) é dada pela Se- quência de Referência NCBI: NG_008417. A sequência de aminoácido de uma proteína 290 centrossomal humana exemplar é dada pelo Acesso de Proteína No. O15078.

[00103] Exons e íntrons de CEP290 são identificados aqui como mostrado na Tabela 3, abaixo, que podem ser mapeados na molécula de pre-mRNA de CEP290 de SEQ ID NO: 112. Cada exon e íntron de CEP290 é identificado aqui de acordo com o número de referência na primeira coluna (esquerda). O tamanho de cada exon e íntron (pares de base; pb) é indicado nas segunda e terceira colunas. A quarta colu- na indica o comprimento de uma molécula de cDNA correspondendo a exons 5’ para o número de íntron correspondente. A quinta coluna in- dica o comprimento de uma molécula de cDNA correspondendo ao mRNA 3’ para o número de íntron correspondente. Tabela 3. Sumário de exon e íntron de CEP290 Número do Tamanho do Tamanho do 5’ cDNA 3’ cDNA Exon/Íntron Exon Íntron 1 317 565 N/A 7440 2 129 172 102 7338 3 78 1391 180 7260 4 70 303 250 7190 5 47 2358 297 7143 6 144 5424 441 6999 7 54 599 495 6945 8 21 124 516 6924 9 153 391 669 6771 10 183 658 852 6588 11 90 2507 942 6498 12 123 946 1065 6375 13 124 4079 1189 6251 14 170 720 1359 6081 15 163 1370 1522 5918

Número do Tamanho do Tamanho do 5’ cDNA 3’ cDNA Exon/Íntron Exon Íntron 16 101 72 1623 5817 17 88 1337 1711 5729 18 113 1850 1824 5616 19 85 535 1909 5531 20 143 2561 2052 5388 21 165 342 2217 5223 22 150 2020 2367 5073 23 116 1967 2483 4957 24 103 90 2586 4854 25 231 3663 2817 4623 26 174 5838 2991 4449 27 112 2912 3103 4337 28 206 937 3309 4131 29 152 1841 3461 3979 30 112 1240 3573 3867 31 456 1087 4029 3411 32 165 1281 4194 3246 33 108 217 4302 3138 34 135 1186 4437 3003 35 267 631 4704 2736 36 108 616 4812 2628 37 200 2635 5012 2428 38 214 952 5226 2214 39 138 1173 5364 2076 40 222 352 5586 1854 41 123 5295 5709 1731 42 146 331 5855 1585 43 156 2648 6011 1429 44 124 4406 6135 1305 45 135 1202 6270 1170 46 87 1697 6357 1083

Número do Tamanho do Tamanho do 5’ cDNA 3’ cDNA Exon/Íntron Exon Íntron 47 165 809 6522 918 48 123 877 6645 795 49 173 3130 6818 622 50 142 1162 6960 480 51 74 593 7034 406 52 95 3218 7129 311 53 80 939 7209 231 54 395 N/A 7440 N/A

[00104] Como aqui usado, um "íntron de CEP290-alvo" se refere a um dos 53 íntrons de CEP290 identificados na Tabela 3, acima. Identi- ficadores de sequência de ácido nucleico para cada sequência de ín- tron de CEP290 são providos na Tabela 4, abaixo. Será compreendido que o escopo do termo "íntron de CEP290-alvo" compreende variantes de íntron de CEP290 providas aqui, tais como sequências de íntron tendo 90-100% de homologia com as sequências providas aqui (por exemplo, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de homologia com as sequências providas aqui), onde a locali- zação do íntron variante no gene CEP290 corresponde àquela provida aqui (por exemplo, em reação a seus exons adjacentes como mostra- do na Tabela 3). Tabela 4. Sequências de íntron de CEP290 Número do Íntron Sequência 1 SEQ ID NO: 60 2 SEQ ID NO: 61 3 SEQ ID NO: 62 4 SEQ ID NO: 63 5 SEQ ID NO: 64 6 SEQ ID NO: 65 7 SEQ ID NO: 66 8 SEQ ID NO: 67

Número do Íntron Sequência 9 SEQ ID NO: 68 10 SEQ ID NO: 69 11 SEQ ID NO: 70 12 SEQ ID NO: 71 13 SEQ ID NO: 72 14 SEQ ID NO: 73 15 SEQ ID NO: 74 16 SEQ ID NO: 75 17 SEQ ID NO: 76 18 SEQ ID NO: 77 19 SEQ ID NO: 78 20 SEQ ID NO: 79 21 SEQ ID NO: 80 22 SEQ ID NO: 81 23 SEQ ID NO: 82 24 SEQ ID NO: 83 25 SEQ ID NO: 84 26 SEQ ID NO: 85 27 SEQ ID NO: 86 28 SEQ ID NO: 87 29 SEQ ID NO: 88 30 SEQ ID NO: 89 31 SEQ ID NO: 90 32 SEQ ID NO: 91 33 SEQ ID NO: 92 34 SEQ ID NO: 93 35 SEQ ID NO: 94 36 SEQ ID NO: 95 37 SEQ ID NO: 96 38 SEQ ID NO: 97 39 SEQ ID NO: 98 40 SEQ ID NO: 99

Número do Íntron Sequência 41 SEQ ID NO: 100 42 SEQ ID NO: 101 43 SEQ ID NO: 102 44 SEQ ID NO: 103 45 SEQ ID NO: 104 46 SEQ ID NO: 105 47 SEQ ID NO: 106 48 SEQ ID NO: 107 49 SEQ ID NO: 108 50 SEQ ID NO: 109 51 SEQ ID NO: 110 52 SEQ ID NO: 111 53 SEQ ID NO: 112

[00105] Como aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer mamí- fero com necessidade desses métodos de tratamento ou profilaxia, incluindo humanos. Outros mamíferos com necessidade de tal trata- mento ou profilaxia incluem cachorros, gatos ou outros animais do- mesticados, cavalos, animais de fazenda, animais de laboratório, inclu- indo primatas não humanos, etc. O indivíduo pode ser macho ou fê- mea. Em uma modalidade, o indivíduo tem uma doença ou distúrbio causado por uma mutação no gene ABCA4 (por exemplo, Doença de Stargardt, por exemplo, Doença de Stargardt 1) ou o gene CEP290 (por exemplo, um distúrbio autossômico recessivo, tal como LCA 10). Em uma outra modalidade, o indivíduo está sob risco de desenvolver uma doença ou distúrbio causado por uma mutação no gene ABCA4 ou no gene CEP290. Em uma outra modalidade, o indivíduo mostrou sinais clínicos de uma doença ou distúrbio causado por uma mutação no gene ABCA4 (tal como Doença de Stargardt) ou no gene CEP290 (tal como LCA 10). O indivíduo pode ser de qualquer idade durante a qual tratamento ou terapia profilática possa ser benéfico. Por exemplo, em algumas modalidades, o indivíduo tem 0-5 anos de idade, 5-10 anos de idade, 10-20 anos de idade, 20-30 anos de idade, 30-50 anos de idade, 50-70 anos de idade ou mais de 70 anos de idade. Em uma outra modalidade, o indivíduo tem 12 meses de idade ou mais, 18 me- ses de idade ou mais, 2 anos de idade ou mais, 3 anos de idade ou mais, 4 anos de idade ou mais, 5 anos de idade ou mais, 6 anos de idade ou mais, 7 anos de idade ou mais, 8 anos de idade ou mais, 9 anos de idade ou mais ou 10 anos de idade ou mais. Em uma outra modalidade, o indivíduo tendo células retinais viáveis.

[00106] Como aqui usado, o termo "distúrbio associado com uma mutação" ou "mutação associada com um distúrbio" se refere a uma correlação entre um distúrbio e uma mutação. Em algumas modalida- des, um distúrbio associado com uma mutação é conhecido ou suspei- to ser totalmente ou parcialmente, ou diretamente ou indiretamente, causado pela mutação. Por exemplo, um indivíduo tendo a mutação pode estar sob risco de desenvolver o distúrbio, e o risco pode depen- der ainda de outros fatores, tais como outras mutações (isto é, inde- pendentes) (por exemplo, no mesmo gene ou um diferente) ou fatores ambientais.

[00107] Como aqui usado, o termo "tratamento", ou uma derivação gramatical do mesmo, é definido como reduzindo a progressão de uma doença, reduzindo a severidade de um sintoma de doença, retardando a progressão de um sintoma de doença, removendo um sintoma da doença ou retardando o início de uma doença.

[00108] Como aqui usado, o termo "prevenção" de um distúrbio, ou uma derivação gramatical do mesmo, é definido como reduzindo o ris- co de início de uma doença, por exemplo, como uma terapia profilática para um indivíduo que está sob risco de desenvolver um distúrbio as- sociado com uma mutação. Um indivíduo pode ser caracterizado como "sob risco" de desenvolver um distúrbio através da identificação de uma mutação associada com o distúrbio, de acordo com qualquer mé-

todo conhecido adequado na técnica ou descrito aqui. Em algumas modalidades, um indivíduo que está sob risco de desenvolver um dis- túrbio tem uma ou mais mutações de ABCA4 ou CEP290 associadas com o distúrbio. Adicionalmente ou alternativamente, um indivíduo po- de ser caracterizado como "sob risco" de desenvolver um distúrbio se o indivíduo tiver um histórico familiar do distúrbio.

[00109] Tratamento ou prevenção de um distúrbio em um indivíduo pode ser realizado administrando diretamente a molécula de união trans (por exemplo, dentro de um vetor de AAV ou partícula de AAV) ao indivíduo. Alternativamente, células hospedeiras contendo a molé- cula de união trans podem ser administradas ao indivíduo.

[00110] O termo "administrar", ou uma derivação gramatical do mesmo, como usado nos métodos descritos aqui, se refere à adminis- tração da composição, ou uma célula tratada ex vivo, ao indivíduo com necessidade do mesmo, por exemplo, tendo uma mutação ou defeito no gene direcionado. Por exemplo, em uma modalidade em que célu- las oculares são direcionadas, o método envolve administrar a compo- sição através de injeção sub-retinal às células fotorreceptoras ou ou- tras células oculares. Em uma outra modalidade, injeção intravítrea a células oculares ou injeção por meio da via palpebral a células ocula- res pode ser empregada. Em uma outra modalidade, a composição é administrada intravenosamente. Ainda outros métodos de administra- ção podem ser selecionados por um versado na técnica, em vista da presente descrição.

[00111] Otimização do códon se refere à modificação de uma se- quência de ácido nucleico para mudar ácidos nucleicos individuais sem nenhuma mudança resultante no aminoácido codificado. Sequên- cias modificadas desta maneira são referidas aqui como "com códon otimizado". Esse processo pode ser realizado em qualquer uma das sequências descritas no presente pedido para melhorar a expressão ou estabilidade. Otimização do códon pode ser realizada de uma ma- neira tal como aquela descrita nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos.

7.561.972, 7.561.973 e 7.888.112, cada uma das quais é aqui incorpo- rada a título de referência em sua totalidade. A sequência circundando o sítio de início traducional pode ser convertida em uma sequência Kozak de consenso de acordo com métodos conhecidos. Vide, por exemplo, Kozak e outros, Nucleic Acids Res. 15 (20): 8125-8148, in- corporado aqui a título de referência em sua totalidade.

[00112] O termo "homólogo" se refere ao grau de identidade entre sequências de duas sequências de ácido nucleico. A homologia de sequências homólogas é determinada comparando duas sequências alinhadas sob condições ótimas com relação às sequências a serem comparadas. As sequências a serem comparadas aqui podem ter uma adição ou deleção (por exemplo, lacuna ou similar) no alinhamento ótimo das duas sequências. Tal homologia de sequência pode ser cal- culada criando um alinhamento usando, por exemplo, o algoritmo ClustalW (Nucleic Acid Res., 1994, 22(22): 4673 4680). Software de análise de sequência comumente disponível, tais como Vector NTI, GENETYX, BLAST, ou ferramentas de análise providas pelos bancos de dados públicos podem ser também usados.

[00113] O termo "farmaceuticamente aceitável" significa seguro pa- ra administração a um mamífero, tal como um humano. Em algumas modalidades, uma composição farmaceuticamente aceitável é aprova- da por uma agência reguladora do governo Federal ou estadual ou lis- tada na Farmacopeia U.S. ou outra farmacopeia geralmente reconhe- cida para uso em animais, e mais particularmente em humanos.

[00114] O termo "veículo" se refere a um diluente, adjuvante, exci- piente ou veículo com o qual uma molécula terapêutica (por exemplo, uma molécula de união trans ou uma molécula de união trans incluindo um vetor ou célula da presente invenção) é administrada. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA., 2ª edi- ção, 2005.

[00115] Os termos "um" e "uma" significam "um ou mais de". Por exemplo, "um gene" é compreendido representar um ou mais tais ge- nes. Desta maneira, os termos "um" e "uma", "um ou mais de um (ou uma)" e "pelo menos um de um (ou uma)" são usados intercomuta- velmente aqui.

[00116] Como aqui usado, o termo "cerca de" se refere a um valor dentro de ±10% de variabilidade a partir do valor de referência, a me- nos que de outro modo especificado. II. Moléculas de União Trans

[00117] São providas aqui moléculas de união trans de ABCA4 e moléculas de união trans de CEP290. Moléculas de união trans de ABCA4

[00118] A presente invenção se refere a moléculas de união trans de ácido nucleico úteis para tratamento de doenças e distúrbios asso- ciados com uma mutação em um gene ABCA4 através da substituição de um ou mais exons no gene ABCA4 (por exemplo, um gene ABCA4 tendo um exon de ABCA4 mutado). Em algumas modalidades, a mo- lécula de união trans de ácido nucleico é uma molécula de união trans de pre-RNA (RTM). O projeto da molécula de união trans permite substituição da porção defeituosa ou mutada do(s) exon(s) de pre- mRNA com uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, o(s) exon(s) tendo uma sequência funcional (por exemplo, normal) sem a mutação. A sequência funcional pode ser uma sequência do tipo sel- vagem, de ocorrência natural, ou uma sequência corrigida com alguma outra modificação, por exemplo, otimização do códon.

[00119] Em uma modalidade, uma molécula de união trans é confi- gurada para corrigir uma ou mais mutações localizadas em uma por-

ção 3’ do gene ABCA4. Em uma modalidade, uma molécula de união trans é configurada para corrigir uma ou mais mutações localizadas em uma porção 5’ do gene ABCA4. As moléculas de união trans provi- das aqui funcionam para reparar o gene defeituoso na célula-alvo de um indivíduo através da substituição da sequência do gene de pre- mRNA defeituoso e remoção da porção defeituosa do pre-mRNA-alvo, provendo um gene ABCA4 funcional capaz de transcrever um produto de gene funcional na célula.

[00120] A invenção provê moléculas de união trans tendo um domí- nio de ligação configurado para se ligar a um íntron de ABCA4 alvo, um domínio de união configurado para mediar união trans e um domí- nio de codificação tendo um ou mais exons de ABCA4 funcionais. Em uma molécula de união trans 5’, o domínio de codificação, sítio de uni- ão e domínio de ligação são ligados operavelmente em uma direção 5’-para-3’, de modo que a molécula de união trans é configurada para substituir a extremidade 5’ do gene endógeno com o domínio de codi- ficação, que inclui um exon de ABCA4 funcional para substituir o exon de ABCA4 mutado. Por outro lado, em uma molécula de união trans 3’, o domínio de codificação, sítio de união e domínio de ligação são liga- dos operavelmente em uma direção 3’-para-5’, de modo que a molécu- la de união trans é configurada para substituir a extremidade 3’ do ge- ne endógeno com o domínio de codificação, que inclui um exon de ABCA4 funcional para substituir o exon de ABCA4 mutado. Em algu- mas modalidades, o domínio de união reside dentro de um íntron artifi- cial, que liga o domínio de ligação ao domínio de codificação. O íntron artificial pode incluir componentes adicionais, tal como um espaçador.

[00121] Em algumas modalidades, a molécula de união trans ou domínio de codificação da mesma têm até 4.700 bases de nucleotídeo de comprimento (por exemplo, de a partir de 200 a 300 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 300 a 400 bases de nucleotí-

deo de comprimento, de a partir de 400 a 500 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 500 a 600 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 600 a 700 bases de nucleotídeo de compri- mento, de a partir de 700 a 800 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 800 a 900 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 900 a 1.000 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 1.000 a 1.500 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

1.500 a 2.000 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

2.000 a 2.500 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

2.500 a 3.000 bases de nucleotídeo de comprimento ou de a partir de

3.000 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, de a partir de 3.100 a 3.800 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.200 a 3.700 bases de nucleotídeo de comprimento ou de a partir de 3.300 a 3.500 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, de a partir de 3.000 a 3.100 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.100 a 3.200 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.200 a 3.300 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.300 a 3.400 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.400 a 3.500 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.500 a 3.600 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.600 a 3.700 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.700 a 3.800 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.800 a 3.900 bases de nucleotídeo de com- primento ou de a partir de 3.900 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, cerca de 2.918 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.328 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.522 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.607 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.632 bases de nu- cleotídeo de comprimento, cerca de 3.494 bases de nucleotídeo de comprimento ou cerca de 3.300 bases de nucleotídeo de comprimen-

to).

[00122] Devido ao tamanho grande do gene ABCA4 e das limita- ções de tamanho de administração de AAV, uma molécula de união trans única configurada para empacotamento com um vetor de AAV pode não alcançar todas as mutações em um gene ABCA4 que pos- sam estar associadas com um distúrbio e dessa maneira pode não corrigir mutações ao longo do comprimento de todo o gene ABCA4. Portanto, as moléculas de união trans da invenção podem ser adapta- das como parte de métodos descritos abaixo para corrigir mutações múltiplas se estendendo por todo o comprimento do gene de ABCA4.

[00123] Um gene ABCA4 direcionado por uma molécula de união trans descrito aqui contém uma ou múltiplas mutações que estão as- sociadas com (por exemplo, causam ou estão relacionadas com) uma doença, tal como Doença de Stargardt (por exemplo, Doença de Star- gardt 1). Uma sequência de DNA exemplar de um gene ABCA4 huma- no funcional (do tipo selvagem) é dada pela Sequência de Referência NCBI: NG_009073. A sequência de aminoácido de um transportador de cassete de ligação de ATP específico-retinal de proteína exemplar expressa pelo gene ABCA4 é dada pelo Acesso de Proteína No. P78363.

[00124] Em adição a essas sequências publicadas, todas as corre- ções mais tarde obtidas ou sequências variantes conservativas de ocorrência natural ou causadoras de não doença que ocorrem na po- pulação de humanos ou outros mamíferos são também incluídas. Substituições de nucleotídeo conservativas adicionais ou aquelas cau- sadoras de otimizações no códon são também incluídas. As sequên- cias tal como providas pelos números de acesso a bancos de dados podem ser também usadas para pesquisa por sequências homólogas no mesmo ou um outro organismo de mamífero.

[00125] É antecipado que as sequências de ácido nucleico de AB-

CA4 e truncados de proteína ou fragmentos de aminoácido resultantes podem tolerar certas modificações pequenas de aminoácido no nível de ácido nucleico para incluir, por exemplo, modificações nas bases de nucleotídeo que são silenciosas, por exemplo, códons de preferência. Em outras modalidades, modificações da base de ácido nucleico que mudam os aminoácidos, por exemplo, para melhorar a expressão do peptídeo/proteína resultante (por exemplo, otimização do códon) são antecipadas. Também incluídas como modificação ou fragmentos pro- váveis são variações alélicas causadas pela degeneração natural do código genético.

[00126] Também incluídos como modificações de genes ABCA4 são análogos, ou versões modificadas, dos fragmentos de proteína codificados providos aqui. Tipicamente, tais análogos diferem das pro- teínas especificamente identificadas por apenas um a quatro mudan- ças no códon. Substituições conservativas são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que estão relacionados em su- as cadeias alterais e propriedades químicas.

[00127] A sequência de ácido nucleico de um gene ABCA4 funcio- nal pode ser derivada de qualquer mamífero que expresse nativamen- te transportador de cassete de ligação de ATP específico retinal- funcional ou homólogo do mesmo. Em outras modalidades, certas mo- dificações são feitas na sequência de gene de ABCA4 a fim de melho- rar a expressão na célula-alvo. Tais modificações incluem otimização do códon.

[00128] Em algumas modalidades, o distúrbio associado com uma mutação em ABCA4 é uma doença recessiva autossomal, por exem- plo, Doença de Stargardt. Em certos casos envolvendo um indivíduo tendo um distúrbio autossômico recessivo, o indivíduo tem uma muta- ção em ABCA4 em ambos os alelos. Composições compreendendo moléculas de união trans podem corrigir as mutações em ambos os alelos, sem importar a localização da mutação dentro do gene ABCA4. Por exemplo, para um indivíduo tendo um exon 1 de ABCA4 mutado em um primeiro alelo e um exon 30 de ABCA4 mutado em um segun- do alelo, é provida aqui uma composição tendo uma molécula de união trans 5’ para substituir o exon 1 de ABCA4 mutado e uma molécula de união trans 3’ para substituir o exon 30 de ABCA4 mutado. Em tais modalidades, as duas moléculas de união trans podem ser coadminis- tradas como parte do mesmo vetor de AAV ou administradas em veto- res de AAV separados (por exemplo, no caso em que ambas as molé- culas de união trans excedem o limite de empacotamento de AAV).

[00129] Alternativamente, em modalidades em que duas ou mais mutações estão localizadas em uma porção do gene ABCA4 que po- dem ser substituídas pela mesma molécula de união trans, uma molé- cula de união trans única tendo uma região de codificação contendo um exon de ABCA4 funcional pode substituir os um ou mais exons contendo as mutações. Mutações em exons de ABCA4 particulares são também listadas na Publicação de Patente Internacional No. WO 2017/087900, incorporada aqui a título de referência. Domínios de Codificação de ABCA4

[00130] Em algumas modalidades, o domínio de codificação de uma molécula de união trans 5’ inclui todos os exons de ABCA4 (por exemplo, exons de ABCA4 funcionais) que estão 5’ para o íntron de ABCA4 alvo. Por exemplo, em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 19 de ABCA4, o domínio de codi- ficação inclui exons 1-19 de ABCA4 funcionais. Em tais modalidades se relacionando à molécula de união trans 5’ tendo um domínio de co- dificação incluindo os exons 1-19 de ABCA4 funcionais, o domínio de codificação é de 2918 pb de comprimento. Em tais modalidades em que uma molécula de união trans 5’ que se direciona ao íntron 22 de ABCA4, o domínio de codificação inclui exons 1-22 de ABCA4 funcio-

nais. Em tais modalidades se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 1-22 de ABCA4 funcionais, o domínio de codificação é de cerca de 3.328 pb de com- primento. Em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 23 de ABCA4, o domínio de codificação inclui os exons 1-23 de ABCA4 funcionais. Em tais modalidades se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação inclu- indo os exons 1-23 de ABCA4 funcionais, o domínio de codificação é de cerca de 3.522 pb de comprimento. Em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 24 de ABCA4, o do- mínio de codificação inclui os exons 1-24 de ABCA4. Em tais modali- dades se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 1-24 de ABCA4 funcionais, o domí- nio de codificação é de cerca de 3.607 pb de comprimento. As modali- dades mencionadas acima de moléculas de união trans de direciona- mento a ABCA4 5’ são ilustradas à esquerda inferior da FIG. 1.

[00131] Em algumas modalidades, o domínio de codificação de uma molécula de união trans 3’ inclui qualquer um ou mais dos exons 20-50 de ABCA4. Por exemplo, em modalidades em que uma molécu- la de união trans 3’ se direciona ao íntron 22 de ABCA4, o domínio de codificação inclui os exons 23-50 de ABCA4 funcional. Em tais modali- dades se referindo a uma molécula de união trans 3’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 23-50 de ABCA4 funcionais, o do- mínio de codificação é cerca de 3.632 pb de comprimento. Em modali- dades em que uma molécula de união trans 3’ se direciona ao íntron 23 de ABCA4, o domínio de codificação inclui os exons 24-50 de AB- CA4 funcionais. Em tal modalidade se referindo a uma molécula de união trans 3’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 24- 50 de ABCA4 funcionais, o domínio de codificação é de cerca de 3.494 pb de comprimento. Em modalidades em que uma molécula de união trans 3’ se direciona ao íntron 24 de ABCA4, o domínio de codificação inclui os exons 25-50 funcionais. Em tais modalidades se referindo a uma molécula de união trans 3’ tendo um domínio de codificação inclu- indo os exons 25-50 de ABCA4 funcionais, o domínio de codificação é de cerca de 3.300 pb de comprimento. As modalidades mencionadas acima de moléculas de união trans de direcionamento a ABCA4 3’ são ilustradas na porção direita superior da FIG. 1.

[00132] Em algumas modalidades, o domínio de codificação inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 exons de ABCA4 funcionais.

[00133] Em alguns casos, ambas as mutações ocorrem na porção 5’ do gene-alvo, e uma molécula de união trans 5’ é selecionada para corrigir ambas as mutações. Em uma modalidade, o domínio de liga- ção se liga ao íntron 19, e o domínio de codificação inclui os exons 1- 19 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, o domínio de ligação se liga ao íntron 22, e o domínio de codificação inclui os exons 1-22 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, o domínio de ligação se liga ao íntron 23, e o domínio de codificação inclui os exons 1-23 de AB- CA4 funcionais. Em uma modalidade, o domínio de ligação se liga ao íntron 24, e o domínio de codificação inclui os exons 1-24 de ABCA4 funcionais. Alternativamente, em casos onde ambas as mutações ocorrem na porção 3’ do gene-alvo, uma molécula de união trans 3’ é selecionada para corrigir ambas as mutações. Em uma modalidade, o domínio de ligação se liga ao íntron 22, e o domínio de codificação in- clui os exons 23-50 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, o do- mínio de ligação se liga ao íntron 23, e o domínio de ligação inclui os exons 24-50 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, o domínio de ligação se liga ao íntron 24, e o domínio de ligação inclui os exons 25- 50 de ABCA4 funcionais.

[00134] Como um exemplo, uma molécula de união trans de AB-

CA4 pre-mRNA 3’ opera como segue: um mRNA quimérico é criado através de uma reação de união trans mediada por spliceossoma entre o sítio de união 5’ do pre-mRNA-alvo endógeno e o sítio de união 3’ da molécula de união trans. A molécula de união trans se liga através de emparelhamento de base específico a um íntron de ABCA4 do pre- mRNA-alvo endógeno e substitui a sequência 3’ inteira do gene AB- CA4 endógeno a montante do íntron direcionado com o domínio de codificação tendo uma sequência de exon de ABCA4 funcional da mo- lécula de união trans.

[00135] Uma molécula de união trans 3’ inclui um domínio de liga- ção que se liga ao íntron de ABCA4 alvo 5’ para mutação ou defeito, um íntron artificial compreendendo espaçador opcional e um sítio de união 3’, e um domínio de codificação que codifica todos os exons do gene-alvo ocular que são 3’ para a ligação do domínio de ligação ao alvo. Uma molécula de união trans 5’ inclui um domínio de ligação que se liga ao íntron de ABCA4 alvo 3’ para a mutação ou defeito, um sítio de união 5’, um espaçador opcional e um domínio de codificação que codifica todos os exons do gene-alvo ocular que são 5’ para a ligação do domínio de ligação ao alvo.

[00136] Em algumas modalidades, o domínio de codificação inclui uma sequência de DNA (cDNA) complementar. Por exemplo, um ou mais exons de ABCA4 funcionais dentro do domínio de codificação podem ser uma sequência de cDNA. Em algumas modalidades, o do- mínio de codificação inteiro é uma sequência de cDNA. Adicionalmen- te ou alternativamente, todo ou uma porção do domínio de codificação, ou um ou mais exons de ABCA4 funcionais do mesmo, pode ser uma sequência de ocorrência natural (por exemplo, uma sequência tendo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um exon de ABCA4 endógeno).

[00137] Em algumas modalidades, todo ou uma porção do domínio de codificação, ou um ou mais exons de ABCA4 funcionais do mesmo, é uma sequência com códon otimizado em que uma sequência de áci- do nucleico foi modificada, por exemplo, para melhorar a expressão ou estabilidade, sem resultar em uma mudança no aminoácido codificado. Otimização de códon pode ser realizada de uma maneira tal como aquela descrita nas, por exemplo, Patentes U.S. 7.561.972, 7.561.973 e 7.888.112, cada uma delas é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Para administração por meio de um AAV recombi- nante, como descrito aqui, em uma modalidade, o domínio de codifica- ção pode ser uma sequência de ácido nucleico de até 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento (por exemplo, de a partir de 3.000 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.100 a 3.800 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.200 a 3.700 bases de nucleotídeo de comprimento ou de a partir de 3.300 a 3.500 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, de a partir de

3.000 a 3.100 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.100 a 3.200 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.200 a 3.300 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.300 a 3.400 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.400 a 3.500 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.500 a 3.600 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.600 a 3.700 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.700 a 3.800 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.800 a 3.900 bases de nucleotídeo de comprimento ou de a partir de

3.900 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento). Domínio de Ligação de ABCA4

[00138] As moléculas de união trans da invenção se referem a um domínio de ligação configurado para ligar um íntron de ABCA4 alvo. Em uma modalidade, o domínio de ligação é uma sequência de ácido nucleico complementar a uma sequência do pre-mRNA de ABCA4 al-

vo (por exemplo, um íntron de ABCA4 alvo) para suprimir união cis- alvo endógena enquanto melhorando a união trans entre a molécula de união trans e o pre-mRNA de ABCA4 alvo, por exemplo, para criar uma molécula quimérica tendo uma porção de mRNA de ABCA4 en- dógeno e o domínio de codificação tendo um ou mais exons de AB- CA4 funcionais. Em algumas modalidades, o domínio de ligação está em uma orientação antissentido para a sequência do íntron de ABCA4 alvo.

[00139] Uma molécula de união trans 5’ se ligará geralmente ao ín- tron de ABCA4 alvo 3’ para a mutação, enquanto uma molécula de união trans 3’ geralmente se ligará ao íntron de ABCA4 alvo 5’ para a mutação. Em uma modalidade, o domínio de ligação compreende uma parte de uma sequência complementar ao íntron de ABCA4. Em uma presente modalidade, o domínio de ligação é uma sequência de ácido nucleico complementar ao íntron mais próximo da (isto é, adjacente a) sequência de exon que está sendo corrigida.

[00140] Em uma outra modalidade, o domínio de ligação é direcio- nado a uma sequência de íntron em proximidade grande com os sinais de união 3’ ou 5’ de um íntron-alvo. Em ainda uma outra modalidade, uma sequência de domínio de ligação pode se ligar ao íntron-alvo em adição à parte de um exon adjacente.

[00141] Portanto, em alguns casos, o domínio de ligação se liga es- pecificamente ao pre-mRNA-alvo endógeno mutado para ancorar o domínio de codificação da molécula de união trans ao pre-mRNA para permitir que união trans ocorra na posição correta no gene de ABCA4 alvo. O maquinário de processamento de spliceossoma do núcleo po- de então mediar com sucesso união trans do exon corrigido com o exon mutado causando a doença.

[00142] Em certas modalidades, as moléculas de união trans se re- ferem a domínios de ligação que contêm sequências no pre-mRNA-

alvo que se ligam em mais de um local. O domínio de ligação pode conter qualquer número de nucleotídeos necessário para ligar esta- velmente ao pre-mRNA-alvo para permitir que união trans ocorra com o domínio de codificação. Em uma modalidade, os domínios de ligação são selecionados usando análise estrutural mFOLD para alças acessí- veis (Zuker, Nucleic Acids Res. 2003, 31(13): 3406-3415).

[00143] Domínios de ligação-alvo adequados podem ser de a partir de 10 a 500 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 20 a 400 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 50 a 300 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 100 a 200 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 10-20 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento), 20-30 nu- cleotídeos de comprimento (por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento), 30-40 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de comprimento), 40-50 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotídeos de comprimento), 50-60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 nucleotídeos de comprimento), 60-70 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 nucleotídeos de comprimento), 70-80 nucleo- tídeos de comprimento (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos de comprimento), 80-90 nucleotídeos de com- primento (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90 nu- cleotídeos de comprimento), 90-100 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos de comprimento), 100-110 nucleotídeos de comprimento (por exemplo,

100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ou 110 nucleotídeos de comprimento), 110-120 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ou 120 nucleotídeos de comprimento), 120-130 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 ou 130 nucleotídeos de comprimento), 130-140 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 ou 140 nucleotídeos de comprimento), 140-150 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 ou 150 nucleotídeos de comprimento), 150-160 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160 nucleotídeos de comprimento), 160-170 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 ou 170 nucleotídeos de comprimento), 170-180 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 ou 180 nucleotídeos de comprimento), 180-190 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 ou 190 nucleotídeos de comprimento), 190-200 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 ou 200 nucleotídeos de comprimento), 200-210 nucleotídeos de comprimento, 210-220 nu- cleotídeos de comprimento, 220-230 nucleotídeos de comprimento, 230-240 nucleotídeos de comprimento, 240-250 nucleotídeos de com- primento, 250-260 nucleotídeos de comprimento, 260-270 nucleotí- deos de comprimento, 270-280 nucleotídeos de comprimento, 280-290 nucleotídeos de comprimento, 290-300 nucleotídeos de comprimento, 300-350 nucleotídeos de comprimento, 350-400 nucleotídeos de com- primento, 400-450 nucleotídeos de comprimento ou 450-500 nucleotí- deos de comprimento.

Em algumas modalidades, o domínio de ligação é cerca de 150 nucleotídeos de comprimento.

Em uma outra modali- dade, os domínios de ligação-alvo podem incluir uma sequência de ácido nucleico de até 750 nucleotídeos de comprimento. Em uma outra modalidade, os domínios de ligação-alvo podem incluir uma sequência de ácido nucleico de até 1000 nucleotídeos de comprimento. Em uma outra modalidade, os domínios de ligação-alvo podem incluir uma se- quência de ácido nucleico de até 2000 nucleotídeos ou mais de com- primento.

[00144] Em algumas modalidades, a especificidade da molécula de união trans pode ser aumentada aumentando o comprimento do domí- nio de ligação-alvo. Outros comprimentos podem ser usados depen- dendo dos comprimentos dos outros componentes da molécula de união trans.

[00145] O domínio de ligação pode ser de a partir de 80% a 100% complementar ao íntron-alvo para ser capaz de hibridizar estavelmente com o íntron-alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio de ligação é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar ao íntron-alvo. O grau de complementaridade é selecio- nado por um versado na técnica com base na necessidade de manter a molécula de união trans e o construto de ácido nucleico contendo as sequências necessárias para expressão e para inclusão no rAAV den- tro de um limite de base de 3.000 ou até 4.000 nucleotídeos. A seleção dessa sequência e resistência de hibridização depende da comple- mentaridade e do comprimento do ácido nucleico.

[00146] Qualquer um dos domínios de ligação mencionados acima pode se ligar a um sítio de ligação dentro do íntron 19 (SEQ ID NO: 25), íntron 22 (SEQ ID NO: 28), íntron 23 (SEQ ID NO: 29) ou íntron 24 (SEQ ID NO: 30).

[00147] Em certos casos da invenção, a molécula de união trans é uma molécula de união trans 5’ e se refere a um domínio de ligação que se liga ao íntron 19 de ABCA4 (SEQ ID NO: 25) e inclui um domí-

nio de codificação tendo os exons 1-19 de ABCA4 funcionais. Em al- gumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 990 a 2.174 de SEQ ID NO: 25 (por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.670 a 2.174 de SEQ ID NO: 25, qualquer um ou mais de nucleotídeos 1.810 a 2.000 de SEQ ID NO: 25, qualquer um ou mais de nucleotídeos 1.870 a 2.000 de SEQ ID NO: 25 ou qualquer um ou mais de nucleotídeos 1.920 a 2.000 de SEQ ID NO: 25).

[00148] Em algumas modalidades, a molécula de união trans é uma molécula de união trans 5’ e se refere a um domínio de ligação que se liga ao íntron 22 de ABCA4 (SEQ ID NO: 28) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 1-22 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 60 a 570, nucleotídeos 600 a 800 ou nucleotídeos 900 a

1.350 de SEQ ID NO: 28 (por exemplo, qualquer um ou mais dos nu- cleotídeos 70 a 250 de SEQ ID NO: 28).

[00149] Alternativamente, a molécula de união trans pode ser uma molécula de união trans 3’ e pode se referir a um domínio de ligação que se liga ao íntron 22 de ABCA4 (SEQ ID NO: 28). Essas moléculas de união trans podem incluir um domínio de codificação tendo os exons 23-50 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 1 a 510 ou 880 a 1.350 de SEQ ID NO: 28.

[00150] Em outras modalidades, a molécula de união trans é uma molécula de união trans 5’ e se refere a um domínio de ligação que se liga ao íntrons 23 de ABCA4 (SEQ ID NO: 29) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 1-23 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 80 a 570 ou 720 a 1.081 de SEQ ID NO: 29.

[00151] Alternativamente, a molécula de união trans pode ser uma molécula de união trans 3’ e pode se referir a um domínio de ligação que se liga ao íntron 23 de ABCA4 (SEQ ID NO: 29) e um domínio de codificação tendo os exons 24-50 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 80 a 1.081 de SEQ ID NO: 29 (por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 230 a 1.081 de SEQ ID NO: 29, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 250 a 400 de SEQ ID NO: 29 ou qualquer um ou mais de nucleotídeos 690 a 850 de SEQ ID NO: 29).

[00152] Em algumas modalidades, a molécula de união trans é uma molécula de união trans 5’ e se refere a um domínio de ligação que se liga ao íntron 24 de ABCA4 (SEQ ID NO: 30) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 1-24 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 600 a 1.250 ou 1.490 a 2.650 de SEQ ID NO: 30 (por exemplo, qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.000 a 1.200 de SEQ ID NO: 30).

[00153] Em outras modalidades, a molécula de união trans é uma molécula de união trans 3’ e se refere a um domínio de ligação que se liga ao íntron 24 de ABCA4 (SEQ ID NO: 30) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 25-50 de ABCA4 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou amis dos nucleotídeos 1 a 250, nucleotídeos 300 a 2.100 ou nucleotídeos 2.200 a 2.692 de SEQ ID NO: 30 (por exemplo, qualquer um ou mais de nu- cleotídeos 360 a 610 de SEQ ID NO: 30 e qualquer um ou mais de nu- cleotídeos 750 a 1.110 de SEQ ID NO: 30). Moléculas de união trans a CEP290

[00154] A presente invenção se refere a moléculas de união trans de ácido nucleico úteis para tratamento de doenças e distúrbios asso- ciados com uma mutação em um gene CEP290 através da substitui- ção de um ou mais exons no gene CEP290 (por exemplo, um gene

CEP290 tendo uma mutação no íntron 26). Em algumas modalidades, a molécula de união trans de ácido nucleico é uma molécula de união trans de pre-RNA (RTM). O projeto da molécula de união trans permite substituição da porção defeituosa ou mutada do pre-mRNA com uma sequência de ácido nucleico, por exemplo, o(s) exon(s) tendo uma se- quência funcional (por exemplo, normal) sem a mutação. A sequência funcional pode ser uma sequência de ocorrência natural, do tipo sel- vagem, ou uma sequência corrigida com alguma outra modificação, por exemplo, otimização no códon.

[00155] Em uma modalidade, uma molécula de união trans é confi- gurada para corrigir uma ou mais mutações localizadas em uma por- ção 5’ do gene CEP290. As moléculas de união trans providas aqui funcionam para reparar o gene defeituoso na célula-alvo de um indiví- duo ao substituir a sequência de gene de pre-mRNA defeituosa, pro- vendo o gene CEP290 funcional capaz de transcrever um produto de gene funcional na célula.

[00156] A invenção provê moléculas de união trans tendo um domí- nio de ligação configurado para ligar um íntron de CEP290-alvo, um domínio de união configurado para mediar a união trans e um domínio de codificação tendo um ou mais exons de CEP290 funcionais. Em uma molécula de união trans 5’, o domínio de codificação, sítio de uni- ão e domínio de ligação são operavelmente ligados em uma direção 5’-para-3’, de modo que a molécula de união trans é configurada para substituir a extremidade 5’ do gene endógeno com o domínio de codi- ficação, que inclui um exon de CEP290 funcional para corrigir o pre- mRNA de CEP290 mutado. Em algumas modalidades, o domínio de união reside dentro de um íntron artificial, que liga o domínio de liga- ção ao domínio de codificação. O íntron artificial pode incluir compo- nentes adicionais, tal como um espaçador.

[00157] Em algumas modalidades, a molécula de união trans é de até 4.700 bases de nucleotídeo de comprimento (por exemplo, de a partir de 3.000 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, (por exemplo, de a partir de 3.000 a 4.000 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.100 a 3.800 bases de nucleotídeo de com- primento, de a partir de 3.200 a 3.700 bases de nucleotídeo de com- primento ou de a partir de 3.300 a 3.500 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, de a partir de 3.000 a 3.100 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.100 a 3.200 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.200 a 3.300 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.300 a 3.400 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.400 a 3.500 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.500 a 3.600 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.600 a 3.700 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.700 a 3.800 bases de nu- cleotídeo de comprimento, de a partir de 3.800 a 3.900 bases de nu- cleotídeo de comprimento ou de a partir de 3.900 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, cerca de 2.991 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.103 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.309 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.461 bases de nucleotídeo de comprimento ou cerca de

3.573 bases de nucleotídeo de comprimento).

[00158] Um gene CEP290 direcionado por uma molécula de união trans descrito aqui contém uma ou múltiplas mutações que estão as- sociadas com (por exemplo, causam ou estão relacionadas com) uma doença, tal como amaurose congênita de Leber (por exemplo, LCA 10). Uma sequência de DNA exemplar de um gene CEP290 humano funcional (do tipo selvagem) é dada pela Sequência de Referência NCBI: NG_008417. A sequência de aminoácido de uma proteína cen- trossomal exemplar 290 é dada pelo Acesso de Proteína No. O15078.

[00159] Em adição a essas sequências publicadas, todas as corre-

ções mais tarde obtidas ou sequências conservativas de ocorrência natural e variantes de sequência não causadoras de doença que ocor- rem na população humana ou de outro mamífero estão também incluí- das. Substituições de nucleotídeo conservativas adicionais ou aquelas que causam otimizações no códon estão também incluídas. As se- quências conforme providas pelos números de acesso a banco de da- dos podem ser também usadas para pesquisar sequências homólogas no mesmo ou um outro organismo mamífero.

[00160] É antecipado que as sequências de ácido nucleico de CEP290 e truncados de proteína ou fragmentos de aminoácido resul- tantes podem tolerar certas pequenas modificações no nível de ácido nucleico para incluir, por exemplo, modificações nas bases de nucleo- tídeo que são silenciosas, por exemplo, códons de preferência. Em outras modalidades, modificações da base de ácido nucleico que mu- dam os aminoácidos, por exemplo, para melhorar a expressão do pep- tídeo/proteína resultante (por exemplo, otimização do códon) são an- tecipadas. Também incluídas como modificação provável de fragmen- tos são variações alélicas causadas pela degeneração natural do có- digo genético.

[00161] Também incluídos como modificações de genes CEP290 são análogos, ou versões modificadas, dos fragmentos de proteína codificados providos aqui. Tipicamente, tais análogos diferem das pro- teínas especificamente identificadas por apenas um a quatro mudan- ças de códon. Substituições conservativas são aquelas que aconte- cem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais e propriedades químicas.

[00162] A sequência de ácido nucleico de um gene CEP290 funcio- nal pode ser derivada de qualquer mamífero que expresse nativamen- te a proteína centrossomal 290 funcional ou homólogo da mesma. Em outras modalidades, certas modificações são feitas na sequência de gene CEP290 a fim de melhorar a expressão na célula-alvo. Tais mo- dificações incluem otimização do códon.

[00163] Mutações de CEP290 podem ser encontradas no CCHMC Molecular Genetics Laboratory Mutation Database, LOVD v.2.0. Muta- ções em exons de CEP290 particulares são também listadas na Publi- cação de Patente Internacional No. WO 2017/087900, incorporada aqui a título de referência. A Tabela 3, acima, provê informação com relação ao tamanho e posição de cada exon e íntron de CEP290.

[00164] Em algumas modalidades, o distúrbio associado com uma mutação em CEP290 é uma doença autossômica recessiva, por exemplo, LCA 10. Domínios de codificação

[00165] Em algumas modalidades, o domínio de codificação de uma molécula de união trans 5’ inclui todos os exons de CEP290 (por exemplo, exons de CEP290 funcionais) que estão 5’ para o íntron de CEP290-alvo. Por exemplo, em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 26 de CEP290, o domínio de codi- ficação inclui os exons 2-26 de CEP290 funcionais. Em tais modalida- des se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 2-26 de CEP290 funcionais, o domí- nio de codificação é de cerca de 2.991 pb de comprimento. Em moda- lidades em que a molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 27 de CEP290, o domínio de codificação inclui os exons 2-27 de CEP290 funcionais. Em tais modalidades se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 2-27 de CEP290 funcionais, o domínio de codificação é de cerca de 3.103 pb de comprimento. Em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 28 de CEP290, o domínio de codificação inclui os exons 2-28 de CEP290 funcionais. Em tais modalidades se referindo à molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codifica-

ção incluindo os exons 2-28 de CEP290 funcionais, o domínio de codi- ficação é cerca de 3.309 pb de comprimento. Em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 29 de CEP290, o domínio de codificação inclui os exons 2-29 de CEP290 funcionais. Em tais modalidades se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação incluindo os exons 2-29 de CEP290 funcionais, o domínio de codificação é cerca de 3.461 pb de compri- mento. Em modalidades em que uma molécula de união trans 5’ se direciona ao íntron 30 de CEP290, o domínio de codificação inclui os exons 2-30 de CEP290 funcionais. Em tais modalidades se referindo a uma molécula de união trans 5’ tendo um domínio de codificação inclu- indo os exons 2-30 de CEP290 funcionais, o domínio de codificação é cerca de 3.573 pb de comprimento. As modalidades mencionadas acima de moléculas de união trans de direcionamento a CEP290 5’ são ilustradas na FIG. 21.

[00166] Em algumas modalidades, o domínio de codificação inclui 25, 26, 27, 28 ou 29 exons de CEP290 funcionais.

[00167] Em algumas modalidades, o domínio de codificação inclui uma sequência de DNA complementar (cDNA). Por exemplo, um ou mais exons de CEP290 funcionais dentro do domínio de codificação podem ser uma sequência de cDNA. Em algumas modalidades, o do- mínio de codificação inteiro é uma sequência de cDNA. Adicionalmen- te ou alternativamente, todo ou uma porção do domínio de codificação, ou um ou mais exons de CEP290 funcionais do mesmo, pode ser uma sequência de ocorrência natural (por exemplo, uma sequência tendo 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com um exon de CEP290 endógeno).

[00168] Em algumas modalidades, todo ou uma porção do domínio de codificação, ou um ou mais exons de CEP290 funcionais do mes- mo, é uma sequência com códon otimizado em que uma sequência de ácido nucleico foi modificada, por exemplo, para melhorar a expressão ou estabilidade, sem resultar em uma mudança no aminoácido codifi- cado. Otimização de códon pode ser realizada de uma maneira tal como aquela descrita nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 7.561.972,

7.561.973 e 7.888.112, cada uma das quais é aqui incorporada a título de referência em sua totalidade. Para administração por meio de um AAV recombinante, como descrito aqui, em uma modalidade, o domí- nio de codificação pode ser uma sequência de ácido nucleico de até

4.000 bases de nucleotídeo de comprimento (por exemplo, de a partir de 3.000 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.100 a 3.800 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de

3.200 a 3.700 bases de nucleotídeo de comprimento ou de a partir de

3.300 a 3.500 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, de a partir de 3.000 a 3.100 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.100 a 3.200 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.200 a 3.300 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.300 a 3.400 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.400 a 3.500 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.500 a 3.600 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.600 a 3.700 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.700 a 3.800 bases de nucleotídeo de comprimento, de a partir de 3.800 a 3.900 bases de nucleotídeo de comprimento ou de a partir de 3.900 a 4.000 bases de nucleotídeo de comprimento, por exemplo, cerca de 3.108 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.285 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.375 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.503 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.630 bases de nucleotídeo de comprimen- to, cerca de 3.540 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de

3.363 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.273 bases de nucleotídeo de comprimento, cerca de 3.145 bases de nucleotídeo de comprimento ou cerca de 3.018 bases de nucleotídeo de comprimen- to). Domínios de Ligação

[00169] Moléculas de união trans da invenção se referem a um do- mínio de ligação configurado para ligar um íntron de CEP290-alvo. Em uma modalidade, o domínio de ligação é uma sequência de ácido nu- cleico complementar a uma sequência do pre-mRNA de CEP290-alvo (por exemplo, um íntron de CEP290-alvo) para suprimir união cis-alvo endógena enquanto melhorando a união trans entre a molécula de união trans e o pre-mRNA de CEP290-alvo, por exemplo, para criar uma molécula quimérica tendo uma porção de mRNA de CEP290 en- dógeno e o domínio de codificação tendo um ou mais exons de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o domínio de ligação está em uma orientação de antissentido para uma sequência do íntron de CEP290-alvo.

[00170] Uma molécula de união trans 5’ geralmente se ligará ao ín- tron de CEP290-alvo 3’ para a mutação. Em uma modalidade, o domí- nio de ligação compreende uma parte de uma sequência complemen- tar ao íntron de CEP290-alvo.

[00171] Em uma outra modalidade, o domínio de ligação é direcio- nado a uma sequência de íntron em proximidade grande com os sinais de união 3’ e 5’ de um íntron-alvo. Em ainda uma outra modalidade, uma sequência de domínio de ligação pode se ligar ao íntron-alvo em adição à parte de um exon adjacente.

[00172] Portanto, em alguns casos, o domínio de ligação se liga es- pecificamente ao pre-mRNA-alvo endógeno mutado para ancorar o domínio de codificação da molécula de união trans ao pre-mRNA para permitir que união trans ocorra na posição correta no gene CEP290- alvo. O maquinário de processamento de spliceossoma do núcleo po- de então mediar com sucesso união trans do exon corrigido para o exon mutado causando a doença.

[00173] Em certas modalidades, a molécula de união trans se refere a domínios de ligação que contêm sequências no pre-mRNA-alvo que se ligam em mais de um lugar. O domínio de ligação pode conter qualquer número de nucleotídeos necessário para ligar estavelmente ao pre-mRNA-alvo para permitir união trans ocorrer com o domínio de codificação. Em uma modalidade, os domínios de ligação são selecio- nados usando análise estrutural mFOLD para alças acessíveis (Zuker, Nucleic Acids Res. 2003, 31(13): 3406-3415).

[00174] Domínios de ligação-alvo adequados podem ser de a partir de 10 a 500 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 20 a 400 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 50 a 300 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 100 a 200 nucleotídeos de com- primento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é de a partir de 10-20 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos de comprimento), 20-30 nu- cleotídeos de comprimento (por exemplo, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos de comprimento), 30-40 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos de comprimento), 40-50 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleotídeos de comprimento), 50-60 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ou 60 nucleotídeos de comprimento), 60-70 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 ou 70 nucleotídeos de comprimento), 70-80 nucleo- tídeos de comprimento (por exemplo, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 ou 80 nucleotídeos de comprimento), 80-90 nucleotídeos de com- primento (por exemplo, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ou 90 nu-

cleotídeos de comprimento), 90-100 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos de comprimento), 100-110 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ou 110 nucleotídeos de comprimento), 110-120 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119 ou 120 nucleotídeos de comprimento), 120-130 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 ou 130 nucleotídeos de comprimento), 130-140 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139 ou 140 nucleotídeos de comprimento), 140-150 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 ou 150 nucleotídeos de comprimento), 150-160 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160 nucleotídeos de comprimento), 160-170 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169 ou 170 nucleotídeos de comprimento), 170-180 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 ou 180 nucleotídeos de comprimento), 180-190 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189 ou 190 nucleotídeos de comprimento), 190-200 nucleotídeos de comprimento (por exemplo, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199 ou 200 nucleotídeos de comprimento), 200-210 nucleotídeos de comprimento, 210-220 nu- cleotídeos de comprimento, 220-230 nucleotídeos de comprimento, 230-240 nucleotídeos de comprimento, 240-250 nucleotídeos de com- primento, 250-260 nucleotídeos de comprimento, 260-270 nucleotí- deos de comprimento, 270-280 nucleotídeos de comprimento, 280-290 nucleotídeos de comprimento, 290-300 nucleotídeos de comprimento, 300-350 nucleotídeos de comprimento, 350-400 nucleotídeos de com- primento, 400-450 nucleotídeos de comprimento ou 450-500 nucleotí-

deos de comprimento. Em algumas modalidades, o domínio de ligação é cerca de 150 nucleotídeos de comprimento. Em uma outra modali- dade, os domínios de ligação-alvo podem incluir uma sequência de ácido nucleico de até 750 nucleotídeos de comprimento. Em uma outra modalidade, os domínios de ligação-alvo podem incluir uma sequência de ácido nucleico de até 1000 nucleotídeos de comprimento. Em uma outra modalidade, os domínios de ligação-alvo podem incluir uma se- quência de ácido nucleico de até 2000 nucleotídeos ou mais de com- primento.

[00175] Em algumas modalidades, a especificidade da molécula de união trans pode ser aumentada aumentando o comprimento do domí- nio de ligação-alvo. Outros comprimentos podem ser usados depen- dendo dos comprimentos dos outros componentes da molécula de união trans.

[00176] O domínio de ligação pode ser de a partir de 80% a 100% complementar ao íntron-alvo para ser capaz de hibridizar estavelmente com o íntron-alvo. Por exemplo, em algumas modalidades, o domínio de ligação é 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complementar ao íntron-alvo. O grau de complementaridade é selecio- nado por um versado na técnica com base na necessidade de manter a molécula de união trans e o construto de ácido nucleico contendo as sequências necessárias para expressão e para inclusão no rAAV den- tro de um limite de 3.000 ou até 4.000 bases de nucleotídeo. A seleção dessa sequência e resistência de hibridização dependem da comple- mentaridade e do comprimento do ácido nucleico.

[00177] Qualquer um dos domínios de ligação mencionados acima pode se ligar a um sítio de ligação dentro do íntron 26 (SEQ ID NO: 85; por exemplo, em ou 3’ para uma mutação, por exemplo, uma mu- tação de substituição no nucleotídeo 1.655 do íntron 26), íntron 27

(SEQ ID NO: 86), íntron 28 (SEQ ID NO: 87), íntron 29 (SEQ ID NO: 88) ou íntron 30 (SEQ ID NO: 89).

[00178] Em certos casos da invenção, a molécula de união trans se refere a um domínio de ligação que se liga ao íntron 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 85) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 2- 26 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 4.980 a 5.383 de SEQ ID NO: 85. Em uma modalidade, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 5.348 a 5.838 de SEQ ID NO: 85 (por exemplo, qualquer um ou mais de nucleotídeos 5.348 a 5.700 de SEQ ID NO: 85, por exemplo, qualquer um ou mais de nucleotídeos

5.400 a 5.600 de SEQ ID NO: 85, por exemplo, qualquer um ou mais de nucleotídeos 5.460 a 5.560 de SEQ ID NO: 85, por exemplo, pelo menos nucleotídeo 5.500 de SEQ ID NO: 85).

[00179] Em outras modalidades, a molécula de união trans se refe- re a um domínio de ligação que se liga ao íntron 27 de CEP290 (SEQ ID NO: 86) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 2-27 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação com- preende qualquer um ou mais de nucleotídeos 120 a 680, nucleotídeos 710 a 2.200 ou nucleotídeos 2.670 a 2.910 de SEQ ID NO: 86. Em al- gumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 790 a 2.100 de SEQ ID NO: 86, por exemplo, qualquer um ou mais de nucleotídeos 1.020 a 1.630 de SEQ ID NO:

86. Em outras modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 1.670 a 2.000 de SEQ ID NO: 86.

[00180] Em algumas modalidades, a molécula de união trans se refere a um domínio de ligação que liga ao íntron 28 de CEP290 (SEQ ID NO: 87) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 2-28 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação com- preende qualquer um ou mais nucleotídeos 1 a 390, nucleotídeos 410 a 560 ou nucleotídeos 730 a 937 de SEQ ID NO: 87. Em algumas mo- dalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nu- cleotídeos 1 a 200 de SEQ ID NO: 87. Em outras modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 720 a 900 de SEQ ID NO: 87.

[00181] Em algumas modalidades, a molécula de união trans se refere a um domínio de proteína que se liga ao íntron 29 de CEP290 (SEQ ID NO: 88) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 2- 29 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais de nucleotídeos 1 a 600, nucleotí- deos 720 a 940 ou nucleotídeos 1.370 a 1.790 de SEQ ID NO: 88.

[00182] Em outras modalidades, a molécula de união trans se refe- re a um domínio de ligação que se liga ao íntron 30 de CEP290 (SEQ ID NO: 89) e inclui um domínio de codificação tendo os exons 2-30 de CEP290 funcionais. Em algumas modalidades, o sítio de ligação com- preende qualquer um ou mais de nucleotídeos 880 a 1.240 de SEQ ID NO: 89, por exemplo, qualquer um ou mais de nucleotídeos 950 a

1.240 de SEQ ID NO: 89, por exemplo, qualquer um ou mais de nucle- otídeos 1.060 a 1.240 de SEQ ID NO: 89. Domínios de União

[00183] Os domínios de união que seguem podem ser usados em qualquer uma das moléculas de união trans da invenção (por exemplo, qualquer uma das moléculas de união trans de ABCA4 ou moléculas de união trans de CEP290 descritas aqui).

[00184] O domínio de união pode incluir um sítio de união e/ou um trato de PPT para mediar a união trans. Em algumas modalidades, um domínio de união tem um sítio de união único, que indica que o sítio de união permite união trans, mas não união cis, devido à falta de um sítio de união correspondente. Em algumas modalidades, os domínios de união da molécula de união trans 3’ incluem uma sequência de ponto de ramificação ou sítio de ramificação conservada forte, um trato de polipirimidina (PPT) e um sítio aceitador de união 3’ (AG ou YAG) e/ou um sítio de doador de união 5’. Os domínios de união da molécula de união trans 5’ não contêm o ponto de ramificação ou PPT, mas com- preendem um sítio de união aceitador de união 5’ ou doador de união 3’.

[00185] Os domínios de união podem ser selecionados pelo versa- do na técnica de acordo com métodos e princípios conhecidos. O do- mínio de união provê motivos de consenso essenciais que são reco- nhecidos pelo spliceossoma. O uso de ponto de ramificação e PPT segue as sequências de consenso requeridas para desempenho das duas reações de transferência de fosforila envolvidas em união trans. Em uma modalidade uma sequência de consenso de ponto de ramifi- cação em mamíferos é YNYURAC (Y=pirimidina; N=qualquer nucleotí- deo). Um trato de polipirimidina está localizado entre o ponto de ramifi- cação e o aceitador de sítio de união e é importante para utilização de ponto de ramificação diferente e reconhecimento de sítio de união 3’. Sequências de consenso para o sítio doador de união 5’ e a região de união 3’ usadas na união de RNA são bem conhecidas na técnica. Ainda, sequências de consenso modificadas que mantêm a habilidade de funcionar com sítios de união doadores 5’ e regiões de união 3’ po- dem ser usadas. Em suma, em uma modalidade, a sequência de con- senso de sítio de união 5’ é a sequência de ácido nucleico AG/GURAGU (onde / indica o sítio de união). Em uma outra modalida- de os sítios de união endógenos que correspondem ao exon proximal do sítio de união podem ser empregados para manter quaisquer sinais reguladores de união.

[00186] Em uma modalidade, um sítio de união 5’ adequado com espaçador é: 5’- GTA AGA GAG CTC GTT GCG ATA TTA T-3’ (SEQ ID NO: 1). Em uma modalidade, um sítio de união 5’ adequado é

AGGT.

[00187] Em uma modalidade, um sítio de ramificação de molécula de união trans 3’ adequado é 5’-TACTAAC-3’. Em uma modalidade, um sítio de união 3’ adequado é: 5’- TAC TAA CTG GTA CCT CTT CTT TTT TTT CTG CAG -3’ (SEQ ID NO: 2) ou 5’-CAGGT-3’. Em uma modalidade, uma molécula de união trans 3’ PPT é: 5’-TGG TAC CTC TTC TTT TTT TTC TG-3’ (SEQ ID NO: 3). Componentes ou Modificações Adicionais

[00188] Em algumas modalidades de qualquer uma das moléculas de união trans da invenção (por exemplo, qualquer uma das moléculas de união trans de ABCA4 ou moléculas de união trans de CEP290 descritas aqui), o domínio de união é incluído como parte de um íntron artificial, que pode incluir um ou mais componentes adicionais. Por exemplo, uma região espaçadora pode ser incluída dentro de um ín- tron artificial para separar o domínio de união do domínio de ligação- alvo na molécula de união trans. A região espaçadora pode ser proje- tada para incluir elementos tais como (i) códons de parada que funcio- nariam para bloquear tradução de qualquer molécula de união trans não unida e/ou (ii) sequências que melhoram a união trans ao pre- mRNA-alvo. O espaçador pode ser entre 3 a 25 nucleotídeos ou mais dependendo dos comprimentos dos outros componentes da molécula de união trans e as limitações de rAAV. Em uma modalidade, um es- paçador de molécula de união trans 5’ é AGA TCT CGT TGC GAT ATT AT (SEQ ID NO: 4). Em uma modalidade, um espaçador 3’ ade- quado é: 5 '- GAG AAC ATT ATT ATA GCG TTG CTC GAG -3’ (SEQ ID NO: 5).

[00189] Ainda outros componentes opcionais da molécula de união trans (por exemplo, como parte de íntrons artificiais) inclui mini-íntrons e potencializadores intrônicos e exônicos (por exemplo, potencializa- dores de união intrônicos, por exemplo, potencializadores de união in-

trônicos a jusante) ou silenciadores que regulariam a união trans.

[00190] Em uma outra modalidade, a molécula de união trans com- preende ainda (por exemplo, como parte de um íntron artificial) pelo menos uma sequência de segurança incorporada ao espaçador, do- mínio de ligação ou qualquer outro local na molécula de união trans para prevenir união trans não específica. Essa é uma região da molé- cula de união trans que compreende os elementos do sítio de união 3’ e/ou 5’ da molécula de união trans através de complementaridade rela- tivamente fraca, evitando união trans não específica. A molécula de união trans é projetada de tal maneira que quando da hibridização da(s) porção(ões) de ligação/direcionamento da molécula de união trans, o sítio de união 3’ ou 5’ não é coberto e se torna integralmente ativo. Tais sequências de segurança compreendem uma extensão complementar de sequência cis (ou poderia ser um segundo filamento, separado, de ácido nucleico) que se liga a um ou ambos os lados do ponto de ramificação de molécula de união trans, trato de pirimidina, sítio de união 3’ e/ou sítio de união 5’ (elementos de união) ou poderia se ligar a partes dos próprios elementos de união. A ligação da se- quência de segurança pode ser rompida pela ligação da região de li- gação-alvo da molécula de união trans ao pre-mRNA-alvo, desta ma- neira expondo e ativando os elementos de união (tornando-os disponí- veis para união trans para o pre-mRNA-alvo). Em uma outra modali- dade, a molécula de união trans tem sequências UTR 3’ ou sequên- cias de ribozima adicionadas à extremidade 3’ ou 5’.

[00191] Em uma modalidade, potencializadores de união tais como, por exemplo, sequências referidas como potencializadores de união exônicos, também podem ser incluídos na estrutura de um íntron artifi- cial. Elementos adicionais podem ser adicionados ao íntron artificial, tais como sinais de poliadenilação para modificar a expres- são/estabilidade do RNA ou sequências de união 5’ para melhorar a união, regiões de ligação adicionais, regiões autocomplementares de segurança, sítios de união adicionais ou grupos de proteção para mo- dular a estabilidade da molécula e evitar degradação. Ainda, códons de parada podem ser incluídos na estrutura da molécula de união trans (por exemplo, como parte do íntron artificial) para evitar tradução de moléculas de união trans não unidas. Elementos adicionais, tais como a estrutura grampo-de-cabelo 3’, RNA circularizado, modificação de base de nucleotídeo ou análogos sintéticos podem ser incorpora- dos às moléculas de união trans para promover ou facilitar a localiza- ção nuclear e incorporação spliceossomal e estabilidade intracelular.

[00192] Em algumas modalidades, ligação de uma molécula de uni- ão trans ao pre-mRNA-alvo é mediada por complementaridade (isto é, baseada em características de emparelhamento de base de ácidos nucleicos), formação de hélice tripla ou interação de proteína-ácido nucleico (como descrito nos documentos citados aqui). Em uma moda- lidade, a molécula de união trans de ácido nucleico inclui moléculas de DNA, RNA ou DNA/RNA, em que o DNA ou RNA é ou de filamento simples ou duplo. Também incluídos aqui estão RNAs ou DNAs, que podem hibridizar para um dos RNAs ou DNAs mencionados acima, preferivelmente sob condições adstringentes, por exemplo, a 60º C em tampão 2,5x SSC e várias lavagens a 37º C em uma concentração de tampão menor, por exemplo, tampão 0,5x SSC. Esses ácidos nuclei- cos podem codificar proteínas exibindo atividade fosfatase de fosfato lipídico e/ou associação com membranas do plasma. Quando molécu- las de união trans são sintetizadas in vitro, tais moléculas de união trans podem ser modificadas na porção de base, porção de açúcar ou estrutura principal do fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilida- de da molécula, hibridização para o mRNA-alvo, transporte para a cé- lula, estabilidade nas células à clivagem enzimática, etc. Por exemplo, modificação de uma molécula de união trans para reduzir a carga total pode melhorar a absorção celular da molécula. Ainda, modificações podem ser feitas para reduzir a susceptibilidade à degradação por nu- clease ou química. As moléculas de ácido nucleico podem ser sinteti- zadas de tal maneira a serem conjugadas a uma outra molécula, por exemplo, um peptídeo, agente de reticulação disparado por hibridiza- ção, agente de transporte, agente de clivagem disparado por hibridiza- ção, etc.

[00193] Várias outras modificações bem conhecidas nas moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas como meio de aumentar a estabilidade intracelular e a meia-vida (vide também acima quanto a oligonucleotídeos). Modificações possíveis são conhecidas na técnica. Modificações que podem ser feitas na estrutura de moléculas de união trans sintéticas incluem modificações na estrutura principal. III. Moléculas de AAV Recombinantes

[00194] Qualquer vetor de ácido nucleico adequado pode ser usado em conjunto com as presentes composições e métodos para projetar e montar os componentes da molécula de união trans e um vírus adeno- associado recombinante (AAV). Em uma modalidade, o vetor é um AAV recombinante carregando a molécula de união trans e acionado por um promotor que expressa uma molécula de união trans em célu- las selecionadas de um indivíduo. Métodos para montagem dos veto- res recombinantes são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Au- subel e outros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989; Kay, M. A. e outros, Nat. Medic, 2001, 7(l):33- 40; e Walther W. e Stein U., Drugs 2000, 60(2):249-71.

[00195] Em certas modalidades descritas aqui, a molécula de união trans carregando os domínios de ligação e codificação de gene AB- CA4 é administrada às células selecionadas, por exemplo, células fo- torreceptoras, com necessidade de tratamento por meio de um vetor de AAV. Mais de 30 sorotipos de ocorrência natural de AAV estão dis-

poníveis. Muitas variantes naturais no capsídeo de AAV existem, per- mitindo a identificação e uso de um AAV com propriedades especifi- camente adequadas para células oculares. Vírus de AAV podem ser engenheirados através de técnicas de biologia molecular convencio- nais, tornando possível otimizar essas partículas para administração específica de célula das sequências de ácido nucleico de molécula de união trans, para minimização de imunogenicidade, para ajuste da es- tabilidade e tempo de vida da partícula, para degradação eficiente, pa- ra administração precisa ao núcleo, etc.

[00196] A expressão das moléculas de união trans descritas aqui pode ser obtida nas células selecionadas através de administração por AAVs recombinantemente engenheirados ou AAVs artificiais que con- têm sequências codificando a molécula de união trans desejada. O uso de AAVs é um modo comum de administração exógeno de DNA uma vez que ele é relativamente não tóxico, provê transferência de gene eficiente e pode ser facilmente otimizado para propósitos especí- ficos. Dentre os sorotipos bem caracterizados de AAVs isolados de primatas humanos ou não humanos, o sorotipo 2 humano tem sido amplamente usado para experimentos de transferência de gene efici- entes em tecidos-alvo e modelos de animais diferentes. Outros soroti- pos de AAV incluem, mas não estão limitados a, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 e AAV9. A menos que de outro modo es- pecificado, os ITRs de AAV, e outros componentes de AAV seleciona- dos descritos aqui, podem ser prontamente selecionados dentre qual- quer um sorotipo de AAV incluindo, sem limitação, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 ou outros sorotipos de AAV conhecidos e desconhecidos. Em uma modalidade, os ITRs são de AAV2. Esses ITRs ou outros componentes de AAV podem ser prontamente isolados usando técnicas disponíveis para aqueles de habilidade na técnica a partir de um sorotipo de AAV. Tal AAV pode ser isolado ou obtido de fontes acadêmicas, comerciais ou públicas (por exemplo, o American Type Culture Collection, Manassas, VA). Alternativamente, as sequências de AAV podem ser obtidas através de meios sintéticos ou outros adequados com referência a sequências publicadas tais como as disponíveis na literatura ou em bancos de da- dos tais como, por exemplo, GenBank, PubMed ou similar.

[00197] Fragmentos de AAV desejáveis para montagem em vetores incluem as proteínas cap, incluindo as vp1, vp2, vp3, e regiões hiper- variáveis, as proteínas rep, incluindo rep 78, rep 68, rep 52 e rep 40 e as sequências codificando essas proteínas. Esses fragmentos podem ser prontamente utilizados em uma variedade de sistemas de vetor e células hospedeiras. Tais fragmentos podem ser usados sozinhos, em combinação com outras sequências ou fragmento de sorotipo de AAV ou em combinação com elementos de outras sequências virais de AAV ou não AAV. Como aqui usado, sorotipos de AAV artificiais incluem, sem limitação, AAV com uma proteína do capsídeo de ocorrência não natural. Tal capsídeo artificial pode ser gerado através de qualquer técnica adequada, usando uma sequência de AAV selecionada (por exemplo, um fragmento de uma proteína do capsídeo vp1) em combi- nação com sequências heterólogas que podem ser obtidas a partir de um sorotipo de AAV selecionado diferente, porções não contíguas do mesmo sorotipo de AAV, de uma fonte viral não AAV ou de uma fonte não viral. Um sorotipo de AAV artificial pode ser, sem limitação, um AAV pseutotipificado, um capsídeo de AAV quimérico, um capsídeo de AAV recombinante ou um capsídeo de AAV "humanizado". Vetores pseudotipificados, em que o capsídeo de um AAV é utilizado com os ITRs de um AAV tendo uma proteína do capsídeo diferente, são úteis na invenção. Em uma modalidade, o AAV é AAV2/5 (isto é, um AAV tendo ITRs de AAV2 e um capsídeo de AAV5). Em uma outra modali- dade, o AAV é AAV2/8 (isto é, um AAV tendo ITRs de AAV2 e um capsídeo de AAV8). Em uma modalidade, o AAV inclui um capsídeo de AAV8. Tal capsídeo de AAV8 inclui a sequência de aminoácido en- contrada sob a Sequência de Referência NCBI: YP_077180.1 (SEQ ID NO: 56). Em uma outra modalidade, o capsídeo de AAV8 inclui um capsídeo codificado por nt 2121 a 4337 do Acesso GenBank: AF513852.1 (SEQ ID NO: 57).

[00198] Em uma modalidade, o AAV inclui uma sequência do cap- sídeo derivada de AAV8. Em algumas modalidades, o AAV derivado de AAV8 é AAV8(b), descrito na Patente U.S. No. 9.567.376, que é incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. AAV(b) (SEQ ID NO: 58) compreende a sequência de aminoácido de Pro-Glu-Arg- Thr-Ala-Met-Ser-Leu-Pro nas posições de aminoácido 587-595 compa- rado com o AAV8 do tipo selvagem. Em uma outra modalidade, o cap- sídeo de AAV8(b) é codificado pela SEQ ID NO: 59.

[00199] Em uma modalidade, os vetores úteis em composições e métodos descritos aqui contêm, no mínimo, sequência codificando um capsídeo do sorotipo de AAV selecionado, por exemplo, um capsídeo de AAV2, ou um fragmento do mesmo. Em uma outra modalidade, ve- tores úteis contêm, no mínimo, sequências codificando uma proteína rep do sorotipo de AAV, por exemplo, proteína rep de AAV2, ou um fragmento das mesmas. Opcionalmente, tais vetores podem conter ambas as proteínas cap e rep de AAV. Em vetores em que ambas rep e cap de AAV são providas, as sequências de rep de AAV e cap de AAV podem ser ambas de uma origem de sorotipo, por exemplo, uma origem de AAV2.

[00200] Alternativamente, podem ser usados vetores em que as se- quências de rep são de um sorotipo de AAV que difere daquele que está fornecendo as sequências de cap. Em uma modalidade, as se- quências de rep e cap são expressas a partir de fontes separadas (por exemplo, vetores separados ou uma célula hospedeira e um vetor).

Em uma outra modalidade, essas sequências de rep são fundidas em estrutura a sequências de cap de um sorotipo de AAV diferente para formar um vetor de AAV quimérico descrito na Patente U.S. No.

7.282.199, que é aqui incorporada a título de referência.

[00201] Um AAV recombinante adequado (rAAV) é gerado através de cultura de uma célula hospedeira que contém uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína do capsídeo do sorotipo de AAV, ou seu fragmento, como aqui definido; um gene de rep funcional; um minigene composto de, por exemplo, ITRs de AAV e a sequência de ácido nucleico da molécula de união trans; e funções auxiliares su- ficientes para permitir empacotamento do minigene na proteína do capsídeo de AAV. Os componentes que precisam ser culturados na célula hospedeira para empacotar um minigene de AAV em um capsí- deo de AAV podem ser providos à célula hospedeira em trans. Alterna- tivamente, qualquer um ou mais dos componentes requeridos (por exemplo, minigene, sequências de rep, sequências de cap e/ou fun- ções auxiliares) podem ser providos por uma célula hospedeira estável que foi engenheirada para conter um ou mais dos componentes reque- ridos usando métodos conhecidos daqueles de habilidade na técnica.

[00202] Em uma modalidade, o AAV inclui um promotor (ou um fra- gmento funcional de um promotor). A seleção do promotor a ser em- pregado no rAAV pode ser feita dentre um grande número de promoto- res constitutivos ou induzíveis que podem expressar o transgene sele- cionado na célula-alvo desejada. Vide, por exemplo, a lista de promo- tores identificados na Publicação de Patente Internacional No. WO 2014/012482, incorporada aqui a título de referência. Em uma modali- dade, o promotor é específico de célula. O termo "específico de célula" significa que o promotor particular selecionado para o vetor recombi- nante pode direcionar a expressão do transgene selecionado em um tipo de célula particular. Em uma modalidade, o promotor é específico para expressão do transgene em células fotorreceptoras. Em uma ou- tra modalidade, o promotor é específico para expressão nos bastões e/ou cones. Em uma outra modalidade, o promotor é específico para expressão do transgene em células do epitélio do pigmento retinal (RPE). Em uma outra modalidade, o promotor é específico para ex- pressão do transgene em células Mueller. Em uma outra modalidade, o promotor é específico para expressão do transgene em células bipo- lares. Em uma outra modalidade, o promotor é específico para expres- são do transgene em células bipolares. Em uma outra modalidade, o promotor é específico para expressão do transgene em células hori- zontais. Em uma outra modalidade, o promotor é específico para ex- pressão do transgene em células amácrinas. Em uma outra modalida- de, o transgene é expresso em qualquer uma das células menciona- das acima.

[00203] Em uma outra modalidade, o promotor é o promotor nativo para o gene-alvo a ser expresso. Promotores úteis incluem, sem limi- tação, um promotor da opsina em bastão, um promotor da opsina ver- melho-verde, um promotor da opsina azul, um promotor de cGMP- fosfodiesterase, um promotor da opsina do camundongo, um promotor da rodopsina, uma subunidade alfa de transdução de cone, um promo- tor de beta fosfodiesterase (PDE), um promotor de retinite pigmentosa, um promotor de NXNL2/NXNL1, o promotor de RPE65, o promotor lento da degeneração retinal/periferina 2 (Rds/perph2) e o promotor de VMD2.

[00204] Outras sequências reguladoras convencionais contidas no mini-gene ou rAAV são também reveladas em documentos tal como WO 2014/124282 e outros citados e incorporados aqui a título de refe- rência. Um versado de habilidade na técnica pode fazer a seleção den- tre essas, e outras, sequências de controle de expressão sem se afas- tar do escopo descrito aqui.

[00205] Um minigene de AAV pode incluir a molécula de união trans descrita aqui e sua sequência reguladora, e ITRs de AAV 5’ e 3’. Em uma modalidade, os ITRs de sorotipo 2 de AAV são usados. Em uma outra modalidade, os ITRs de sorotipo 5 ou 8 de AAV são usados. No entanto, ITRs de outros sorotipos adequados podem ser selecionados. Em algumas modalidades, o minigene é empacotado em uma proteína do capsídeo e administrado a uma célula hospedeira selecionada.

[00206] O minigene, sequências de rep, sequências de cap e fun- ções auxiliares requeridos para produção do rAAV podem ser adminis- trados à célula hospedeira de empacotamento na forma de qualquer elemento genético que transfere as sequências carregadas nos mes- mos. O elemento genético selecionado pode ser administrado através de qualquer método adequado, incluindo aqueles descritos aqui. Os métodos usados para construir qualquer modalidade descrita aqui são conhecidos daqueles com habilidade em manipulação de ácido nuclei- co e incluem engenharia genética, engenharia recombinante e técni- cas sintéticas. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY. Similarmente, métodos de geração de vírions de rAAV são bem conhecidos e a seleção de um método adequado não é uma limi- tação na presente invenção. Vide, por exemplo, K. Fisher e outros, J. Virol., 1993 70: 520-532 e Patente U.S. 5.478.745, cada um dos quais é aqui incorporado a título de referência.

[00207] Em uma outra modalidade, o minigene da molécula de uni- ão trans é preparado em um plasmídeo proviral, tais como aqueles re- velados na Publicação de Patente Internacional No. WO 2012/158757, incorporado aqui a título de referência. Tal plasmídeo proviral contém um genoma de AAV recombinante modular compreendendo em asso- ciação operativa: uma sequência de ITR de AAV2 5’ do tipo selvagem flanqueada por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição imediata do dito ITR; um promotor compreendendo uma sequência de citomegalovírus de 49 ácidos nucleicos a montante de uma sequência de citomegalovírus (CMV)-beta actina da galinha, ou um promotor/potencializador específico de fotorreceptor, o promotor flanqueado por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição imediata da sequência de promotor inteira, e a sequência a montante flanqueada por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição imediata apenas da sequência de CMV ou promotor a montante, da sequência de promotor. A molécula de união trans descrita aqui pode ser inserida no sítio de um poliligante de clo- nagens múltiplas, em que a molécula de união trans é operavelmente ligada ao, e sob o controle regulador do, promotor. Uma sequência de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino flanqueada por sí- tios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição imedia- ta da dita sequência de poliA; e uma sequência de ITR de AAV2 3’ do tipo selvagem flanqueada por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição imediata do ITR 3’; são também parte desse plasmídeo. A estrutura principal do plasmídeo compreende os elemen- tos necessários para replicação em células bacterianas, por exemplo, um gene de resistência à canamicina, e é ela mesma flanqueada por sequências terminadoras/isoladoras transcripcionais.

[00208] Em uma modalidade, um plasmídeo proviral compreende: (a) um genoma de AAV recombinante modular compreendendo em associação operativa: (i) uma sequência de ITR de AAV2 de 5’ do tipo selvagem flanqueada por sítios de restrição únicos que permitem re- moção ou substituição imediata do dito ITR; (ii) um promotor compre- endendo (A) uma sequência de CMV de 49 ácidos nucleicos a monta- gem da sequência de CMV-beta actina da galinha; (b) um promo- tor/potencializador específico de fotorreceptor; ou (c) um promo- tor/potencializador específico de célula neuronal. O promotor é flan-

queado por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substi- tuição imediata da sequência promotora inteira, e a sequência a mon- tante flanqueada por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição imediata apenas da sequência de CMV ou potenciali- zadora a montante, da sequência de promotor. Também parte desse plasmídeo proviral é uma sequência de poliligante de clonagem múlti- plas que permite inserção de uma sequência de molécula de união trans incluindo qualquer uma daquelas descritas aqui, em que a molé- cula de união trans é ligada operativamente ao, e sob o controle regu- lador do, promotor; uma sequência de poliadenilação de hormônio do crescimento bovino flanqueada por sítios de restrição únicos que per- mitem remoção ou substituição imediata da dita sequência de poliA; e uma sequência de ITR de AAV2 3’ do tipo selvagem flanqueada por sítios de restrição únicos que permitem remoção ou substituição ime- diata do ITR 3’. O plasmídeo proviral também contém uma estrutura principal de plasmídeo compreendendo os elementos necessários pa- ra replicação em células bacterianas, e compreendendo ainda um ge- ne de resistência à canamicina, a dita estrutura principal de plasmídeo flanqueada por sequências terminadoras/isoladoras transcripcionais. O plasmídeo proviral descrito aqui pode também conter na estrutura principal do plasmídeo uma sequência stuffer de de 5,1 kb de fago lambda de não codificação para aumentar o comprimento da estrutura principal e evitar empacotamento reverso de genomas de AAV não funcionais.

[00209] Em algumas modalidades, um plasmídeo proviral contém cópias múltiplas de uma molécula de união trans. Por exemplo, a pre- sente invenção refere-se a moléculas de união trans que são menos do que metade do limite de empacotamento para AAV e podem então ser repetidas uma vez, duas vezes, três vezes, quatro vezes, cinco vezes, seis vezes, sete vezes, oito vezes, nove vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes ou mais em um plasmídeo proviral úni- co.

[00210] Em ainda um aspecto adicional, o promotor do plasmídeo proviral é modificado para reduzir o tamanho do promotor para permitir que sequências de molécula de união trans maiores sejam inseridas no rAAV. Em uma modalidade, o promotor híbrido de CMV/CBA, que inclui normalmente um exon e íntron de não codificação totalizando cerca de 1.000 pares de base, é substituído com um íntron quimérico de 130 pares de base, como descrito na Publicação de Patente Inter- nacional No. WO 2017/087900, que é aqui incorporada a título de refe- rência em sua totalidade.

[00211] Esses plasmídeos provirais são então empregados em me- todologias de empacotamento atualmente convencionais para gerar um vírus recombinante expressando o transgene de molécula de união trans carregado pelos plasmídeos provirais. Linhagens de célula de produção adequadas são prontamente selecionadas pelo versado na técnica. Por exemplo, uma célula hospedeira adequada pode ser sele- cionada de qualquer organismo biológico, incluindo células procarióti- cas (por exemplo, bacterianas) e células eucarióticas, incluindo células se inseto, células de levedura e células de mamífero. Em suma, o plasmídeo proviral é transfectado em uma célula de empacotamento selecionada, onde ele pode existir transientemente. Alternativamente, o minigene ou cassete de expressão de gene com seus ITRs de flan- queamento é estavelmente integrado ao genoma da célula hospedeira, ou cromossomalmente ou como um epissoma. Técnicas de transfec- ção adequadas são conhecidas e podem ser prontamente utilizadas para administrar o genoma de AAV recombinante à célula hospedeira. Tipicamente, os plasmídeos provirais são culturados nas células hos- pedeiras que expressam as proteínas cap e/ou rep. Nas células hos-

pedeiras, o minigene consistindo na molécula de união trans com ITRs de AAV de flanqueamento é resgatado e empacotado na proteína do capsídeo ou proteína envelope para formar uma partícula viral infecci- osa. Portanto, uma partícula infecciosa de AAV recombinante é produ- zida culturando uma célula de empacotamento carregando o plasmí- deo proviral na presença de sequências virais suficientes para permitir empacotamento do genoma viral do cassete de expressão de gene em um envelope de AAV infeccioso ou capsídeo. IV. Composições farmacêuticas e Estojos

[00212] São providas aqui composições farmacêuticas incluindo uma molécula de união trans de ácido nucleico, um plasmídeo proviral ou um rAAV compreendendo a molécula de união trans de ácido nu- cleico descrita aqui. Em algumas modalidades, a composição farma- cêutica inclui qualquer uma das moléculas de união trans 5’ descritas aqui. Em outras modalidades, a composição farmacêutica inclui qual- quer uma das moléculas de união trans 3’ descritas aqui. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui uma molécula de união trans 5’ e uma molécula de união trans 3’, por exemplo, em que a mo- lécula de união trans 5’ e a molécula de união trans 3’ juntas contêm os exons 1-50 de ABCA4 funcionais e se ligam ao mesmo íntron de ABCA4 alvo.

[00213] A composição farmacêutica descrita aqui pode ser avaliada quanto à contaminação através de métodos convencionais e então formulada em uma composição farmacêutica pretendida para uma via de administração adequada. Ainda outras composições contendo a molécula de união trans, por exemplo, DNA nu ou uma proteína, po- dem ser formuladas similarmente com um veículo adequado. Tal for- mulação envolve o uso de um veículo ou veículo farmaceuticamente e/ou fisiologicamente aceitável, particularmente direcionado para ad- ministração à célula-alvo. Em uma modalidade, veículos adequados para administração ás células-alvo incluem solução salina tamponada, uma solução de cloreto de sódio isotônica ou outros tampões, por exemplo, HEPES, para manter o pH em níveis fisiológicos apropriados e, opcionalmente, outros agentes medicinais, agentes farmacêuticos, agentes estabilizantes, tampões, veículos, adjuvantes, diluentes, etc.

[00214] Em algumas modalidades, o veículo é um líquido para inje- ção. Veículos fisiologicamente aceitáveis exemplares incluem água estéril, livre de pirógeno, e solução salina tamponada com fosfato, es- téril, livre de pirógeno. Uma variedade de tais veículos conhecidos é provida na Patente U.S. No. 7.629.322, incorporada aqui a título de referência. Em uma modalidade, o veículo é uma solução de cloreto de sódio isotônica. Em uma outra modalidade, o veículo é solução salina equilibrada. Em uma modalidade, o veículo inclui tween. Se o vírus tiver que ser armazenado por longo tempo, ele pode ser congelado na presença de glicerol ou Tween20.

[00215] Em outras modalidades, composições contendo moléculas de união trans descritas aqui incluem um tensoativo. Tensoativos úteis, tal como Pluronic F68 (Poloxamer 188, também conhecido como LUTROL® F68), podem ser incluídos uma vez que eles evitam que AAV grude a superfícies inertes e então asseguram administração da dose desejada. Como um exemplo, uma composição ilustrativa proje- tada para o tratamento das doenças oculares descritas aqui compre- ende um vetor adenoassociado recombinante carregando uma se- quência de ácido nucleico codificando molécula de união trans 3’ como aqui descrito, sob o controle de sequências reguladoras que expres- sam a molécula de união trans em uma célula ocular de um indivíduo mamífero, e um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo é so- lução de cloreto de sódio isotônica e inclui um tensoativo Pluronic F68. Em uma modalidade, a molécula de união trans é qualquer uma da- quelas descritas aqui.

[00216] Em ainda uma outra modalidade exemplar, a composição compreende um vírus adenoassociado pseudotipificado AAV2/5 re- combinante carregando uma molécula de união trans 3’ ou 5’ para substituição do gene ABCA4, a sequência de ácido nucleico sob o controle de promotor que direciona expressão da molécula de união trans nas ditas células fotorreceptoras, em que a composição é formu- lada com um veículo e componentes adicionais adequados para inje- ção sub-retinal. Em ainda uma outra modalidade, a composição ou componentes para produção ou montagem dessa composição, inclu- indo veículos, partículas de rAAV, tensoativos e/ou os componentes para geração do rAAV, bem como hardware de laboratório adequado para preparar a composição, podem ser incorporados a um estojo.

[00217] Em alguns casos, a composição compreende um vírus adenoassociado pseudotipificado AAV2/5 recombinante carregando uma molécula de união trans 5’ para substituição do gene CEP290, a sequência de ácido nucleico sob o controle de promotor que direciona expressão da molécula de união trans nas ditas células fotorrecepto- ras, em que a composição é formulada com um veículo e componen- tes adicionais adequados para injeção sub-retinal. Em ainda uma outra modalidade, a composição ou componentes para produção ou monta- gem desta composição, incluindo veículos, partículas de rAAV, tensoa- tivos e/ou os componentes para geração do rAAV, bem como hardwa- re de laboratório adequado para preparar a composição, podem ser incorporados a um estojo.

[00218] Ainda providos aqui são estojos contendo uma primeira composição farmacêutica compreendendo uma molécula de união trans 5’ e uma segunda composição farmacêutica compreendendo uma molécula de união trans 3’, por exemplo, em que a molécula de união trans 5’ e a molécula de união trans 3’ juntas contêm os exons 1- 50 de ABCA4 funcionais e se ligam ao mesmo íntron de ABCA4 alvo

(por exemplo, em que as moléculas de união trans são empacotadas em quaisquer vetores descritos aqui). Em algumas modalidades, o es- tojo inclui instruções para mistura das duas composições farmacêuti- cas antes da administração.

[00219] São ainda providos aqui estojos contendo uma primeira composição farmacêutica compreendendo uma molécula de união trans 5’ para se ligar a um íntron de CEP290. V. Métodos

[00220] As composições descritas acima envolvendo união trans de ABCA4 são úteis em métodos de tratamento de doenças ou distúrbios causados por uma mutação no gene ABCA4, tal como Doença de Stargardt (por exemplo, Doença de Stargardt 1) incluindo retardo ou melhora de sintomas associados com a doença descrita aqui. Tais mé- todos envolvem contato de um gene ABCA4 alvo (por exemplo, pre- mRNA de ABCA4) com uma molécula de união trans como descrito aqui (por exemplo, uma ou mais molécula de união trans 3’, molécula de união trans 5’ ou ambas moléculas de união trans 3’ e 5’ como des- crito aqui), sob condições em que um domínio de codificação da molé- cula de união trans é unido ao gene ABCA4 alvo para substituir uma parte do gene direcionado carregando um ou mais defeitos ou muta- ções, com um mRNA funcional (isto é, saudável), ou normal ou do tipo selvagem ou corrigido, a fim de corrigir a expressão de ABCA4 na cé- lula-alvo. Portanto, os métodos e composições são usados para tratar as doenças/patologias oculares associadas com as mutações especí- ficas e/ou expressão de gene.

[00221] Em uma modalidade, o contato envolve administração dire- ta ao indivíduo afetado. Em uma outra modalidade, o contato pode ocorrer ex vivo com a célula culturada e a célula ocular tratada reim- plantada no indivíduo. Em uma modalidade, o método envolve admi- nistrar um rAAV carregando uma molécula de união trans 3’. Em uma outra modalidade, o método envolve administrar um rAAV carregando uma molécula de união trans 5’. Em ainda uma outra modalidade, o método envolve administrar uma mistura de rAAV carregando uma molécula de união trans 3’ e rAAV carregando uma molécula de união trans 5’. Esses métodos compreendem administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma concentração eficaz de uma composição de qualquer uma daquelas descritas aqui.

[00222] Em algumas modalidades, os métodos incluem selecionar uma ou mais moléculas de união trans para tratamento de um indiví- duo tendo um distúrbio associado com uma mutação em ABCA4, tal como Doença de Stargardt (por exemplo, Doença de Stargardt 1). Tal seleção pode ser baseada no genótipo do indivíduo. Em algumas mo- dalidades, um distúrbio associado com ABCA4 pode ser um distúrbio autossômico recessivo. Em alguns casos, o indivíduo é homozigoto ou composto heterozigoto para a mutação em ABCA4. Métodos para ava- liação de e identificação de mutações particulares em ABCA4 são co- nhecidos na técnica.

[00223] Em outros casos, as composições descritas aqui envolven- do união trans de CEP290 são úteis em métodos de tratamento de do- enças ou distúrbios causados por uma mutação no gene CEP290, tal como amaurose congênita de Leber (por exemplo, LCA 10) incluindo retardo ou melhora de sintomas associados com a doença descrita aqui. Tais métodos envolvem contato de um gene CEP290-alvo (por exemplo, pre-mRNA de CEP290) com uma molécula de união trans como descrito aqui (por exemplo, uma molécula de união trans 5’), sob condições em que um domínio de codificação da molécula de união trans é unido ao gene CEP290-alvo para substituir uma parte do gene direcionado carregando um ou mais defeitos ou mutações, com um mRNA funcional (isto é, saudável), ou normal ou do tipo selvagem ou corrigido do gene direcionado, a fim de corrigir expressão de CEP290 na célula-alvo. Portanto, os métodos e composições são usados para tratar as doenças/patologias oculares associadas com as mutações específicas e/ou expressão de gene. Os métodos da invenção incluem correção de uma mutação por ponto patogênica no íntron 26 (por exemplo, no nucleotídeo 1.655 do íntron 26) de CEP290 através da administração de uma molécula de união trans 5’ (por exemplo, qual- quer uma das moléculas de união trans 5’ descritas aqui), ou uma composição farmacêutica das mesmas. Portanto, a invenção provê métodos de tratamento de um indivíduo tendo uma doença ou distúr- bio associado com uma mutação em CEP290 (por exemplo, uma do- ença ou distúrbio associado com uma mutação no íntron 26 de CEP290, por exemplo, no nucleotídeo 1.655 do íntron 26) através da administração de uma molécula de união trans descrita aqui. Qualquer uma das moléculas de união trans mencionadas acima pode ser inclu- ída em uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica única incluindo ambas as moléculas, ou pré-preparadas ou misturadas antes da administração, por exemplo, como parte de um estojo).

[00224] Em uma modalidade, o contato envolve administração dire- ta ao indivíduo afetado. Em uma outra modalidade, o contato pode ocorrer ex vivo com a célula culturada e a célula ocular tratada reim- plantada no indivíduo. Em uma modalidade, o método envolve admi- nistrar um rAAV carregando uma molécula de união trans 5’. Esses métodos compreendem administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma concentração eficaz de uma composição de qualquer uma daquelas descritas aqui.

[00225] Em algumas modalidades, os métodos incluem selecionar uma ou mais moléculas de união trans para tratamento de um indiví- duo tendo um distúrbio associado com uma mutação em CEP290, tal como LCA 10. Tal seleção pode ser baseada no genótipo do indivíduo.

Em algumas modalidades, um distúrbio associado com CEP290 pode ser um distúrbio autossômico recessivo. Em alguns casos, o indivíduo é homozigoto ou composto heterozigoto para a mutação em CEP290. Métodos de avaliação e identificação de mutações particulares em CEP290 são conhecidos na técnica. Moléculas de união trans únicas para correção de uma mutação única

[00226] Os métodos da invenção incluem selecionar uma molécula de união trans única com base na localização de uma mutação única em ABCA4 (por exemplo, uma mutação de um alelo do indivíduo). Em alguns casos, no contexto de mutações autossômicas recessivas, cor- reção de apenas uma de duas mutações pode ser suficiente para res- taurar atividade de proteína funcional, por exemplo, em que o segundo alelo tem uma mutação na porção oposta do gene ABCA4, fora da fai- xa de uma molécula de união trans administrada por AAV única confi- gurada para corrigir a primeira mutação.

[00227] Isto é, em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem selecionar uma molécula de união trans única para corrigir uma mutação única na porção 5’ do gene-alvo, por exemplo, sem im- portar a localização da mutação no outro alelo. Em uma modalidade, o exon mutado é o exon 1, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codificação inclui um exon 1 de ABCA4 funcional. Em uma modalidade, o exon 1 ou o exon 2 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codificação inclui os exons 1 e 2 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2 e 3 é mu- tado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codifica- ção inclui os exons 1-3 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3 e 4 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codificação inclui os exons 1-4 de ABCA4 funcio- nais. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4 e 5 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-5. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5 e 6 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-

6. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-7. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcio- nais 1-8. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de co- dificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-9. Em uma modalida- de, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-10. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-11. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-12. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codifi- cação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-13. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 é mutado, o ín- tron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-13. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-14. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-15. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-16. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-17. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-18. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 é muta- do, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-19. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-20. Em uma moda- lidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-21. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-22. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-23. Em uma modalidade, um dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 24 e o domínio de codifica- ção inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-24.

[00228] Alternativamente, em casos em que uma mutação é na porção 3’ do gene-alvo, uma molécula de união trans 3’ é selecionada para corrigir a mutação, por exemplo, sem importar a localização da mutação no outro alelo.

Em uma modalidade, um dos exons 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 23-50. Em uma modalidade, um dos exons 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22 ou 23 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 24-50. Em uma modalidade, um dos exons 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o ín- tron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 25-50. Em uma modalidade, um dos exons 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 26-50. Em uma modalidade, um dos exons 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 27-50. Em uma modalidade, um dos exons 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domí- nio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 28-50. Em uma modalidade, um dos exons 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 29-50. Em uma modalidade, um dos exons 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codi-

ficação inclui os exons de ABCA4 funcionais 30-50. Em uma modali- dade, um dos exons 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 31-

50. Em uma modalidade, um dos exons 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de AB- CA4 funcionais 32-50. Em uma modalidade, um dos exons 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 33-50. Em uma modalidade, um dos exons 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codi- ficação inclui os exons de ABCA4 funcionais 34-50. Em uma modali- dade, um dos exons 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domí- nio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 35-50. Em uma modalidade, um dos exons 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 36-50. Em uma modalidade, um dos exons 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 37-50. Em uma modalidade, um dos exons 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 38-50. Em uma modalidade, um dos exons 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domí- nio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 39-50. Em uma modalidade, um dos exons 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 40-50. Em uma mo- dalidade, um dos exons 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mu- tado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 41-50. Em uma modalidade, um dos exons 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 42-50. Em uma modalidade, um dos exons 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 43-50. Em uma modalidade, um dos exons 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mu- tado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 44-50. Em uma modalidade, um dos exons 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 45-50. Em uma modalidade, um dos exons 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 46-50. Em uma mo- dalidade, um dos exons 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de AB- CA4 funcionais 47-50. Em uma modalidade, um dos exons 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codi- ficação inclui os exons de ABCA4 funcionais 48-50. Em uma modali- dade, um dos exons 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 49 ou 50. Em uma modalidade, exon 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui o exon 50 de AB- CA4 funcional. Moléculas de união trans únicas para correção de mutações múltiplas

[00229] Os métodos da invenção incluem selecionar uma molécula de união trans única com base na localização de uma mutação em ABCA4 em cada alelo do indivíduo, quando duas mutações estão ou em uma porção 5’ do gene ou na porção 3’ do gene, de modo que uma molécula de união trans única capaz de ser empacotada em um vetor de AAV é capaz de abranger ambas mutações, dessa maneira corri- gindo ambas mutações.

[00230] Por exemplo, em casos em que ambas mutações ocorrem na porção 5’ do gene-alvo, uma molécula de união trans 5’ é selecio- nada para corrigir ambas mutações. Em uma modalidade, o exon mu- tado é o exon 1 (isto é, ambas mutações são no exon 1), o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codificação inclui um exon 1 de ABCA4 funcional. Em uma modalidade, o exon 1 e/ou o exon 2 são mutados, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codificação inclui os exons 1 e 2 de ABCA4 funcionais. Em uma moda- lidade, um ou dois dos exons 1, 2 e 3 é mutado, o íntron-alvo é o ín- tron 19, 22, 23 ou 24, e o domínio de codificação inclui os exons 1-3 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3 e 4 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24, e o domí- nio de codificação inclui os exons 1-4 de ABCA4 funcionais. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4 e 5 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-5. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5 e 6 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-

6. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codifi- cação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-7. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-8. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-

9. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-10. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codifi- cação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-11. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-12. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-13. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-13. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 é mutado, o ín- tron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-14. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-15. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 é muta- do, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-16. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-17. Em uma moda- lidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,

15, 16, 17 ou 18 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-18. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 19, 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-19. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-20. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-21. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22 é mutado, o íntron-alvo é o ín- tron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-22. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-23. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 1-24.

[00231] Alternativamente, em casos em que ambas mutações ocor- rem na porção 3’ do gene-alvo, uma molécula de união trans 3’ é sele- cionada para corrigir ambas mutações. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 são mutados, o íntron-alvo é o íntron 22 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 23-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,

43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22 ou 23 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 24-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 25-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é muta- do, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 26-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o ín- tron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 27-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 28-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 29-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 30-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 31-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 32-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 33-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 34-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codi- ficação inclui os exons de ABCA4 funcionais 35-50. Em uma modali- dade, um ou dois dos exons 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 36-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 37-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcio- nais 38-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcio- nais 39-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 40-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 41-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48,

49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 42-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codifica- ção inclui os exons de ABCA4 funcionais 43-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 44-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcio- nais 45-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 46, 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 46-50. Em uma mo- dalidade, um ou dois dos exons 47, 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron- alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 47-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 48, 49 ou 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 48-50. Em uma modalidade, um ou dois dos exons 49 ou 50 é mutado, o ín- tron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codificação inclui os exons de ABCA4 funcionais 49 ou 50. Em uma modalidade, exon 50 é mutado, o íntron-alvo é o íntron 22, 23 ou 24 e o domínio de codifica- ção inclui o exon de ABCA4 funcional 50. Duas moléculas de união trans para correção de mutações múltiplas

[00232] Ainda, são providos aqui métodos de correção de mutações múltiplas dentro de um gene ABCA4 usando duas moléculas de união trans – uma molécula de união trans 5’ e uma molécula de união trans 3’. Em algumas modalidades, o gene ABCA4 inteiro é substituído quando da ligação de ambas moléculas de união trans, por exemplo, onde a molécula de união trans 5’ e a molécula de união trans 3’ se ligam ao mesmo íntron de ABCA4 alvo e são substituídas pelos exons a montante e a jusante, respectivamente, do íntron-alvo.

[00233] Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, uma molécula de união trans 5’ e uma molécula de união trans 3’ se ligam, cada uma, ao íntron 22 de ABCA4; a molécula de união trans 5’ substi- tui os exons 1-22 endógenos com exons 1-22 funcionais; e a molécula de união trans 3’ substitui os exons 23-50 endógenos com os exons 23-50 funcionais. Em outras modalidades, uma molécula de união trans 5’ e uma molécula de união trans 3’ se ligam, cada uma, ao ín- tron 23 de ABCA4 alvo; a molécula de união trans 5’ substitui os exons 1-23 endógenos com os exons 1-23 funcionais; e a molécula de união trans 3’ substitui os exons 24-50 endógenos com os exons funcionais 24-50. Em outras modalidades, uma molécula de união trans 5’ e uma molécula de união trans 3’ se ligam, cada uma, ao íntron de ABCA4 24 alvo; a molécula de união trans 5’ substitui os exons endógenos 1-24 com os exons funcionais 1-24; e a molécula de união trans 3’ substitui os exons 25-50 endógenos com os exons funcionais 25-50. Qualquer uma das combinações mencionadas acima de moléculas de união trans 5’ e 3’ pode ser incluída em uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição farmacêutica única incluindo ambas molé- culas, ou prepreparada ou misturada antes da administração, por exemplo, como parte de um estojo). Dosagem, monitoramento e terapias de combinação

[00234] Uma concentração eficaz de um vírus adenoassociado re- combinante carregando uma molécula de união trans como aqui des- crito varia entre cerca de 108 e 1013 genomas de vetor por mililitro (vg/mL). As unidades infecciosas de rAAV são medidas como descrito em McLaughlin e outros, J. Virol. 1988, 62: 1963. Em uma modalidade, a concentração varia entre 109 e 1013 vg/mL. Em uma outra modalida- de, a concentração eficaz é cerca de 1,5 x 1011 vg/mL. Em uma moda-

lidade, a concentração eficaz é cerca de 1,5 x 1010 vg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é cerca de 2,8 x 1011 vg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é cerca de 5 x 1011 vg/mL. Em ainda uma outra modalidade, a concentração eficaz é cerca de 1,5 x 1012 vg/mL. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é cerca de 1,5 x 1013 vg/mL.

[00235] É desejável que a dosagem eficaz mais baixa (cópias de genoma totais administradas) de vírus seja utilizada a fim de reduzir o risco de efeitos indesejáveis, tal como toxicidade, e outras questões relacionadas com administração ao olho, por exemplo, displasia e descolamento retinal. Uma dosagem eficaz de um vírus adenoassoci- ado recombinante carregando uma molécula de união trans como aqui descrito varia entre cerca de 108 e 1013 genomas de vetor (vg) por do- se (isto é, por injeção). Em uma modalidade, a dosagem varia entre 109 e 1013 vg. Em uma outra modalidade, a dosagem eficaz é cerca de 1,5 x 1011 vg. Em uma outra modalidade, a dosagem eficaz é cerca de 5 x 1011 vg. Em uma modalidade, a dosagem eficaz é cerca de 1,5 x 1010 vg. Em uma outra modalidade, a dosagem eficaz é cerca de 2,8 x 1011 vg. Em ainda uma outra modalidade, a dosagem eficaz é cerca de 1,5 x 1012 vg. Em uma outra modalidade, a concentração eficaz é cer- ca de 1,5 x 1013 vg. Ainda outras dosagens nessas faixas ou em outras unidades podem ser selecionadas pelo médico acompanhante, levan- do em conta o estado físico do indivíduo sendo tratado, incluindo a idade do indivíduo; a composição sendo administrada e o distúrbio particular; a célula direcionada e o grau ao qual o distúrbio, se pro- gressivo, se desenvolveu.

[00236] A composição pode ser administrada em um volume de a partir de cerca de 50 μL a cerca de 1 mL, incluindo todos os números dentro da faixa, dependendo do tamanho da área a ser tratada, do títu- lo viral usado, da via de administração e do efeito desejado do método.

Em uma modalidade, o volume é cerca de 50 μL. Em uma outra moda- lidade, o volume é cerca de 70 μL. Em uma outra modalidade, o volu- me é cerca de 100 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 125 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 150 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 175 μL. Em ainda uma outra modalidade, o volume é cerca de 200 μL. Em uma outra modali- dade, o volume é cerca de 250 μL. Em uma outra modalidade, o volu- me é cerca de 300 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 350 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 400 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 450 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 500 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 600 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cer- ca de 750 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 850 μL. Em uma outra modalidade, o volume é cerca de 1.000 μL.

[00237] Em uma modalidade, o volume e a concentração da com- posição de rAAV são selecionados de modo que apenas certas regi- ões anatômicas tendo células-alvo são impactadas. Em uma outra modalidade, o volume e/ou concentração da composição de rAAV é uma quantidade maior, a fim de alcançar porções maiores do olho. Dosagens similares são ajustadas para administração a outros órgãos.

[00238] Em uma outra modalidade, a invenção provê um método para prevenir, ou parar, perda de função de fotorreceptor, ou aumentar a função do fotorreceptor no indivíduo. A composição pode ser admi- nistrada antes ou após início da doença. Por exemplo, a função do re- ceptor pode ser avaliada usando os estudos funcionais, por exemplo, ERG ou perimetria, que são convencionais na técnica. Como aqui usado, "perda da função fotorreceptora" significa uma diminuição em função fotorreceptora comparado com um olho não doente, normal, ou o mesmo olho em um ponto de tempo anterior. Como aqui usado, "aumento da função fotorreceptora" significa melhorar a função dos fotorreceptores ou aumentar o número ou porcentagem de fotorrecep- tores funcionais comparado com um olho doente (tendo a mesma do- ença ocular), o mesmo olho em um ponto de tempo anterior, uma por- ção não tratada do mesmo olho ou o olho contralateral do mesmo indi- víduo.

[00239] Para cada um dos métodos descritos, o tratamento pode ser usado para evitar a ocorrência de dano adicional ou resgatar tecido tendo doença leve ou avançada. Como aqui usado, o termo "resgate" significa evitar progressão da doença, evitar espalhamento de dano para células não danificadas ou melhorar dano em células lesionadas.

[00240] Portanto, em uma modalidade, a composição é administra- da antes do início da doença. Em uma outra modalidade, a composi- ção é administrada antes do desenvolvimento dos sintomas. Em uma outra modalidade, a composição é administrada após desenvolvimento dos sintomas. Em ainda uma outra modalidade, a composição é admi- nistrada quando menos de 90% das células-alvo estão funcionando ou restando, por exemplo, comparado com um tecido de referência. Em ainda uma outra modalidade, a composição é administrada quando mais de 10% das células-alvo estão funcionando ou restando, por exemplo, comparado com um tecido de referência. Em ainda uma ou- tra modalidade, a composição é administrada quando mais de 20% das células-alvo estão funcionando ou restando. Em ainda uma outra modalidade, a composição é administrada quando mais de 30% das células-alvo estão funcionando ou restando.

[00241] Em ainda uma outra modalidade, qualquer um dos métodos descritos acima é realizado em combinação com uma outra, ou secun- dária, terapia. A terapia pode ser qualquer uma terapia conhecida ago- ra, ou ainda desconhecida, que ajude a prevenir, parar ou melhorar essas mutações ou defeitos ou qualquer um dos efeitos associados com os mesmos. A terapia secundária pode ser administrada antes,

concomitante com ou após administração das moléculas de união trans descritas acima. Em uma modalidade, uma terapia secundária envolve abordagens específicas para manutenção da saúde das célu- las retinais, tal como administração de fatores neurotróficos, antioxi- dantes e agentes apoptóticos. As abordagens não específicas são ob- tidas através de injeção de proteínas, DNA recombinante, vetores vi- rais recombinantes, células-tronco, tecido fetal ou células genetica- mente modificadas. As últimas poderiam incluir células geneticamente modificadas que são encapsuladas.

[00242] Em uma outra modalidade, o método inclui realização de estudos funcionais e de imagem para determinar a eficácia do trata- mento. Esses estudos incluem eletrorretinografia (ERG) e imagem re- tinal in vivo, como descrito na Patente U.S. No. 8.147.823; na Publica- ção de Patente Internacional Nos. WO2014/011210 ou WO 2014/124282, incorporado aqui a título de referência. Em adição a es- tudos de campo visual, perimetria e microperimetria, teste de mobili- dade, acuidade visual e/ou teste de visão de cor podem ser realizados.

[00243] Em certas modalidades, é desejável realizar imagem retinal não invasiva e estudos funcionais para identificar áreas de fotorrecep- tores retidos a serem direcionados para terapia. Nessas modalidades, testes clínicos de diagnóstico são empregados para determinar a(s) localização(ões) precisa(s) para uma ou mais injeção(ões) sub- retinais. Esses testes podem incluir ERG, perimetria, mapeamento to- pográfico das camadas da resina e medição da espessura de suas camadas por meio de oftalmoscopia a laser de varredura confocal (cSLO) e tomografia de coerência óptica (OCT), mapeamento topográ- fico de densidade do cone por meio de óptica adaptativa (AO), exame funcional dos olhos, etc. Em vista dos estudos de imagem e funcio- nais, em algumas modalidades uma ou mais injeções são realizadas no mesmo olho a fim de se direcionar a áreas diferentes dos fotorre-

ceptores retidos.

[00244] Para uso nesses métodos, o volume e o título viral de cada injeção são determinados individualmente, e podem ser iguais ou dife- rentes de outras injeções realizadas no mesmo, ou contralateral, olho. Em uma outra modalidade, uma injeção de volume maior, única, é feita a fim de tratar o olho inteiro. As dosagens, administrações e regimes podem ser determinados pelo médico acompanhante dados os ensi- namentos da presente invenção.

EXEMPLOS

[00245] A invenção é baseada, pelo menos em parte, na constata- ção da Requerente que íntrons particulares de ABCA4, e regiões es- pecíficas dentro desses íntrons, proveem sítios de ligação altamente eficientes para ligar domínios de moléculas de união trans e mediar eficientemente união trans. A Requerente gerou uma série de molécu- las de união trans falsas tendo domínios de ligação de 150 mer proje- tados para hibridizar para uma série correspondente de sequências de sítio de ligação de 150 pares de base de (i) íntrons de ABCA4 de inte- resse (íntrons 19 e 22-24) e (ii) íntrons de CEP290 de interesse (ín- trons 26-30). Cada domínio de ligação nas séries de ABCA4 e nas sé- ries de CEP290 foi projetado para sobrepor 140 nucleotídeos, permi- tindo varredura de cada íntron por 10 nucleotídeos entre cada domínio de ligação de teste sequencial. Eficiência de união trans foi quantifica- da para cada domínio de ligação através de cada um dos íntrons 19 e 22-24 de ABCA4 e os íntrons 26-30 de CEP290. Avaliação de ABCA4 é descrita no Exemplo 1, e os resultados são mostrados nas FIGS. 1-

8. Avaliação de CEP290 é descrita no Exemplo 2, e os resultados são mostrados nas FIGS. 21-26. Exemplo 1. ABCA4

[00246] Esse Exemplo descreve desenvolvimento de moléculas de união trans de ABCA4, por exemplo, através da avaliação de sítios de ligação eficazes dentro de íntrons de ABCA4 particulares, desenvolvi- mento de uma linhagem de célula de ABCA4 para teste de moléculas de união trans e teste de várias moléculas de união trans de ABCA4 para restauração de expressão de proteína ABCA4. Avaliação do Sítio de Ligação

[00247] Avaliação de uma série domínios de ligação configurados para ligar o íntron 19 de ABCA4 (SEQ ID NO: 25) em sítios de ligação sequenciais revelou uma região na porção 3’ do íntron 19 de ABCA4 que era preferivelmente eficiente em união trans de uma molécula de união trans 5’ – uma região a partir dos nucleotídeos 990 a 2.174 do íntron 19 (FIG. 2). Os sítios de ligação dentro da faixa de nucleotídeos de 1.670 a 2.174, de 1.810 a 2.000, de 1.870 a 2.000 ou de 1.920 a

2.000 foram revelados como particularmente altamente eficientes na mediação da união trans 5’ no íntron 19.

[00248] Os sítios de ligação adequados para moléculas de união trans 5’ dentro do íntron 22 foram similarmente identificados (FIG. 3). Os sítios de ligação dentro das faixas de nucleotídeos 1 a 150 ou nu- cleotídeos 880 a 1.350 do íntron 22 eram especialmente eficientes, em relação ao restante do íntron.

[00249] A FIG. 4 mostra resultados de uma avaliação análoga para o íntron 22 de ABCA4 (SEQ ID NO: 28) para uma molécula de união trans 3’. Os sítios de ligação tendo os nucleotídeos 60 a 570, nucleotí- deos 600 a 800 ou nucleotídeos 900 a 1.350 foram identificados como preferivelmente adequados para união trans de uma molécula de uni- ão trans 3’. Em particular, os domínios de ligação direcionados para sítios de ligação dentro da faixa de nucleotídeos 70 a 250 eram alta- mente eficientes na união trans 3’.

[00250] Dentro do íntron 23, sítios de ligação relativamente eficien- tes para moléculas de união trans 5’ foram identificados como aqueles dentro das faixas de nucleotídeos 80 a 570 ou nucleotídeos 720 a

1.081 de SEQ ID NO: 29 (FIG. 5). Para moléculas de união trans 3’, os sítios de ligação com eficiência particularmente boa incluem aqueles dentro dos nucleotídeos 80 a 1.081 de SEQ ID NO: 29 (por exemplo, nucleotídeos 230 a 1.081 de SEQ ID NO: 29, nucleotídeos 250 a 400 de SEQ ID NO: 29 ou nucleotídeos 690 a 850 de SEQ ID NO: 29), co- mo mostrado na FIG. 6.

[00251] Uma avaliação análoga no íntron 24 ABCA4 (SEQ ID NO: 30) revelou que sítios de ligação dentro das faixas de nucleotídeos 600 a 1.250 ou nucleotídeos 1.490 a 2.660 foram eficientes na união trans 5’ (FIG. 7). Em particular, sítios de ligação dentro da faixa de nucleotí- deos de 1.000 a 1.200 exibiram a maior eficiência de união trans 5’. A FIG. 8 mostra os resultados de uma avaliação de eficiência de união trans 3’, que revelou que sítios de ligação dentro da faixa de nucleotí- deos 1 a 250, nucleotídeos 300 a 2.000 ou nucleotídeos 2.200 a 2.692 (em particular, sítios de ligação dentro da faixa de nucleotídeos ou nu- cleotídeos 750 a 1.110) foram mais eficientes. Linhagens de Célula de ABCA4

[00252] Primeiro, linhagens de célula expressando ABCA4 foram geradas. O gene ABCA4 é apenas conhecido ser expresso em fotorre- ceptores vivos na retina, e pre-mRNA de ABCA4 de comprimento inte- gral e proteína não são geralmente detectáveis em células culturadas in vitro. Portanto, para testar estratégias de união trans para ABCA4, as células foram engenheiradas para expressar ABCA4 a partir de seu locus genômico nativo no cromossomo 1 (1p22.1). Duas estratégias foram adotadas. No primeiro caso, linhagens de célula estáveis foram derivadas para expressar TALENS de ligação a DNA específicos de sítio (a montante do sítio de início transcripcional de ABCA4) que fo- ram fundidos ao transativador viral VP64. No segundo caso, um pro- motor eucariótico constitutivo foi inserido diretamente (usando CRISPR/Cas9) no locus genômico imediatamente a montante do sítio de início transcripcional de ABCA4. Os resultados em ambos os casos foram linhagens de célula estáveis que expressaram robustamente pre-mRNA de ABCA4 e proteína. Linhagens de célula TALEN

[00253] TALENS direcionados a domínios específicos a montante do sítio de início transcripcional de ABCA4 foram projetados e fundidos a uma sequência de transativador VP-64 (FIG. 9). Essa combinação de três TALENs foi transfectada em células 293 e clones de célula úni- ca estáveis foram derivados. Dois clones foram mostrados para direci- onar a expressão de proteína ABCA4 (FIG. 10). Linhagens de célula de promotor CAG

[00254] A estratégia geral para derivação de linhagens de célula de promotor CAG é mostrada nas FIGS. 11-13. Guias específicos de sítio (FIG. 12A) foram projetados para inserir o promotor CAG e um marca- dor selecionável de puromicina usando braços de homologia (FIG. 12B). Células resistentes à puromicina foram clonadas e analisadas através de PCR quanto à inserção desejada. Várias linhagens clonais foram selecionadas para análises adicionais. Expressão de RNA e pro- teína para duas linhas (B6 e C3) é mostrada nas FIGS. 14A e 14B. Ambas as linhagens continham claramente a inserção de promotor, como demonstrado através de análises de RNA e proteína. Linhagens de célula de inativação de ABCA4

[00255] Uma vez expressão estável de ABCA4 tendo sido estabele- cida em células culturadas, inativações de expressão de ABCA4 foram geradas para testagem de moléculas de união trans de ABCA4 proje- tadas para restaurar expressão da proteína ABCA4. Em geral, RNA e proteína Cas9-guia foram cotransfectados em células B6 (promotor CAG inativado no locus de ABCA4 e mediando expressão de ABCA4). Depois de nove dias, uma segunda transfecção com RNA e proteína Cas9-guia foi realizada. O projeto básico se direcionando aos exons 3 e 4 é mostrado na FIG. 15. Células únicas foram plaqueadas limitando a diluição e uma vez cultivadas, avaliadas quanto à expressão de pro- teína de ABCA4 através de Western blot.

[00256] A FIG. 16 mostra os perfis de RNA e proteína de clones de célula única derivados de após tratamento com CRISPR/Cas9, como mostrado na FIG. 15. Havia graus variáveis de ablação de RNA e pro- teína. Os clones 17+06 e 17+21 foram escolhidos porque eles exibi- ram inativação de proteína ABCA4 completa. Análises de mutação (FIGS. 17A-17B e 18) confirmaram que os exons 3 e 4 foram atingidos e interrompidos. Restauração de Proteína Mediada por União Trans de ABCA4

[00257] Oito moléculas de união trans foram selecionadas com ba- se na avaliação de sítio de ligação de alto rendimento descrita acima. Métodos e resultados desses estudos são descritos abaixo. Métodos

[00258] Para ensaios Western blot, células 17+06 ou 17+21 foram semeadas em uma densidade de 106 células por poço em cada poço de placas de doze poços. Os poços individuais foram transfectados com 1 μg de plasmídeo (RTMx). Em 48 horas, as células foram coleta- das, e preparações de membrana foram processadas para análise através de Western blotting padrão usando Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit (Thermo Fisher 89842) de acordo com o protoco- lo do fabricante com adição de 1x HALT™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Fisher 78440)) em todos os tampões. RNA foi também processado para análise como descrito abaixo. Lisatos de membrana foram desnaturados com 4x Laemmli Sampler Buffer (Bio- rad 161-0737) incluindo agente de redução 10% TCEP 0,5 M (Sigma 646547) por 30 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram administradas em NuPage Precast 3-8% Tris-Acetate gels (Thermo Fisher) e proteínas foram transferidas usando o iBlot 2 Mini PVDF

Transfer Packs – administrada em 25 V 10 minutos com iBlot 2. O an- ticorpo primário para ABCA4 era Abcam ab72955, policlonal de coelho (diluição @ 1:2500). O anticorpo secundário era anticoelho (diluição @ 1:5000). Os blots foram expostos por várias vezes, dependendo da resistência do sinal.

[00259] Para qPCR para amostras de RNA, RNA foi coletado como acima descrito para análise qPCR usando RNeasy Plus Mini kit (Qia- gen). cDNA foi sintetizado a partir de 400 ng de RNA em 20 μl de rea- ção com SuperScript IV VILO Master Mix (Thermo 11756500; diluído 1:4 em água). ABCA4 nativo (ensaio comercial Thermo Hs00979594_m1) se estende pelos exons 49-50. Para o gene house- keeper como um controle, um ensaio RNF20 foi usado (Ensaio comer- cial Thermo HS00219623_m1). Inicadores e sondas de qPCR de exon 22 – exon nativo 23 – com códon otimizado de ABCA4 quiméricos fo- ram os que seguem: Sonda (FAM) 063_ABCA4 co22n23_P1:

CGTGGACCCTTACAGCAGAAG Inicador Avançado 064_ABCA4 co22n23_F1:

GATCCTGGATGAGCCTAC Inicador Reverso 065_ABCA4 co22n23_R1:

GGACATGATGATGGTTCTG Dúplex com inicadores e sondas de qPCR de ensaio de RNF20 foram o que segue: Sonda (VIC) 088_RNF20_P2:

CAGCGACTCAACCGACACTT Inicador avançado 091_RNF20_F2:

GCAGTGGGATATTGACAA Inicador reverso 099_RNF20_R5:

CGAGCATTGATAGTGATTG

[00260] A reação de PCR foi realizada usando QuantiFast 2x qPCR

Mastermix. Resultados

[00261] Moléculas de união trans se ligando aos íntrons 19, 22, 23 e 24 foram testadas. Nenhuma restauração de proteína foi observada em moléculas de união trans se ligando aos íntrons 19 e 24 (dados não mostrados), mas moléculas de união trans se ligando aos íntrons 22 e 23 proveram restauração de expressão de proteína ABCA4 e RNA (FIGS. 19A e 19B), como discutido abaixo.

[00262] A FIG. 20 é um Western blot mostrando expressão de pro- teína ABCA4 atribuída a reações de união trans de duas linhagens de célula diferentes (17+06 e 17+21) com um falso controle de GFP ou 5’A4ln22 ancorado a cinco domínios de ligação diferentes (Nenhum controle de domínio de ligação (NBD), 92, 99, 105, 118 e 121, nume- ração correspondendo a RTM# FIG. 3, onde o domínio de ligação 92 se liga aos nucleotídeos 911-1060 do íntron 22, o domínio de ligação 90 se liga aos nucleotídeos 981-1130 do íntron 22, o domínio de liga- ção 105 se liga aos nucleotídeos 1041-1190 do íntron 2, o domínio de ligação 118 se liga aos nucleotídeos 1171-1320 do íntrons 22 e o do- mínio de ligação 212 se liga aos nucleotídeos 1201-1350 do íntron 22 (seguindo o intervalo de mudança de base 10 de 150 mers por todo o íntron 22, descrito acima)). Quatro desses construtos de ligação a ín- tron 22, 99, 105, 118 e 212, proveram restauração de proteína, com 105, 118 e 121 mostrando restauração particularmente melhorada e 118 mostrando a quantidade maior de proteína expressa em ambas as linhagens de célula. Perfis de expressão de mRNA mostraram um pa- drão similar, com o construto 118 provendo os níveis maiores de mRNA de ABCA4 em ambas as linhagens de célula (FIG. 20B). Uni- dades são relativas ao gene housekeeping RNF20.

[00263] A FIG. 20C é um Western blot mostrando expressão da proteína ABCA4 atribuída a reações de união trans a partir de duas linhagens de célula diferentes (17+06 e 17+21) com um controle GFP falso ou 5’A4ln23 ancorado a três domínios de ligação diferentes (con- trole NBD, 27, 81 e 85, numeração correspondendo a RTM# FIG. 5, onde o domínio de ligação 27 se liga aos nucleotídeos de ligação 261- 410 do íntron 23, o domínio de ligação 81 se liga a 801-950 do íntron 23 e o domínio de ligação 85 se liga a 841-990 do íntron 23 (seguindo o intervalo de mudança de base 10 de 150 mers por todo o íntron 23, descrito acima)). Todos os três construtos de ligação ao íntron 23 pro- veram união trans como indicado pela quantidade de proteína expres- sa em ambas as linhagens de célula. Perfis de expressão de mRNA proveram resultados similares, com todos os três construtos provendo expressão de mRNA de ABCA4 em ambas as linhagens celulares (FIG. 20D). As unidades são relativas ao gene housekeeping RNF20.

[00264] Juntos, os dados de expressão da proteína ABCA4 e RNA obtidos para as moléculas de união trans de ligação a 22 e 23 se rela- cionam com a avaliação do domínio de ligação descrita acima. Em particular, os construtos de ligação ao íntron 22 105, 118 e 121 e os construtos de ligação ao íntron 23 27, 81 e 85 foram previstos se ligar com alta eficiência (FIGS. 3 e 5), e os dados de restauração de proteí- na ABCA4 presentes indicam que as regiões do íntron de ABCA4 con- tendo os sítios de ligação desses construtos são condescendentes à ligação a moléculas de união trans de ABCA4 para conferir restaura- ção de proteína e RNA. Nos presentes exemplos, expressão de prote- ína de 10-20% foi restaurada, com restauração sendo comparável en- tre as moléculas de união trans ligando 22 e 23. Importante, devido ao fato das doenças relacionadas a ABCA4 (tal como Doença Stargardt) serem recessivas, veículos assintomáticos da doença provavelmente expressam ABCA4 menos do que o normal e, sem desejar ser ligado à teoria, restauração de proteína parcial, como mostrado aqui, é prová- vel conferir um benefício clínico significante.

Exemplo 2. CEP290

[00265] Avaliação de uma série de domínios de ligação configura- dos para se ligar ao íntron 26 de CEP290 (SEQ ID NO: 85) em sítios de ligação sequenciais revelou uma região na porção 3’ do íntron 26 de CEP290 que era preferivelmente condescendente à união trans de uma molécula de união trans 5’ – uma região dos nucleotídeos 4.980 a

5.838 do íntron 26 (FIG. 22). Os sítios de ligação dentro da faixa de nucleotídeos de 5.348 a 5.838, de 5.348 a 5.700, de 5.400 a 5.600, de

5.460 a 5.560 ou 5.500 foram revelados como particularmente alta- mente eficientes na mediação da união trans.

[00266] A FIG. 23 mostra resultados de uma avaliação similar para o íntron 27 de CEP290 (SEQ ID NO: 86). Os sítios de ligação tendo os nucleotídeos 120 a 680, 710 a 2.200, 2.670 a 2.910 foram identificados como preferivelmente adequados para união trans de uma molécula de união trans 5’. Em particular, os domínios de ligação direcionados a sítios de ligação dentro das faixas de nucleotídeos 790 a 2.100, nucle- otídeos 1.020 a 1.630 ou nucleotídeos 1.670 a 2.000 foram altamente eficientes em união trans.

[00267] No íntron 27 (SEQ ID NO: 87), sítios de ligação dentro das faixas de nucleotídeo 1 a 390 (por exemplo, nucleotídeos 1 a 200), nu- cleotídeos 410 a 560 ou nucleotídeos 720 a 937 foram identificados como tendo eficiência relativamente alta de união trans (FIG. 24).

[00268] O íntron 28 (SEQ ID NO: 88) foi similarmente caracterizado e mostrado possuir sítios de ligação relativamente eficientes dentro dos nucleotídeos 1 a 600, nucleotídeos 720 a 940 ou nucleotídeos

1.370 a 1.790 (FIG. 25).

[00269] No íntron 29 (SEQ ID NO: 89), a porção 3’ do íntron foi sig- nificantemente mais eficiente na mediação da união trans 5’ em rela- ção ao restante do íntron (FIG. 26). Em particular, os domínios de liga- ção se direcionando a sítios de ligação dentro da faixa de nucleotídeos

95 a 1.240, por exemplo, nucleotídeos 1.060 a 1.240, exibiram a maior eficiência de união trans.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligado ou em uma direção 3’-para-5’ ou uma direção 5’-para-3’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar um íntron de ABCA4 alvo selecionado do grupo consistindo em íntron 19, 23 ou 24; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo um exon de ABCA4 funcional; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação a um exon de ABCA4 endógeno adjacente ao íntron de ABCA-alvo, dessa maneira substi- tuindo o exon de ABCA4 endógeno com um exon de ABCA4 funcional e corrigindo uma mutação em ABCA4.

2. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação se liga ao íntron de ABCA4 alvo 3’ para a mutação, e em que a mutação é qualquer um dos exons de 1-24 ou íntrons 1-24 de ABCA4.

3. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o íntron de AB- CA4 alvo é o íntron 19, a mutação é em qualquer um dos exons 1-19 ou íntrons 1-19 de ABCA4 e o domínio de codificação compreende os exons de ABCA4 1-19.

4. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 19 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 990 a 2.174 de SEQ ID NO: 25.

5. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.670 a 2.174 de SEQ ID NO: 25.

6. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.810 a 2.000 de SEQ ID NO: 25.

7. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.870 a 2.000 de SEQ ID NO: 25.

8. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.920 a 2.000 de SEQ ID NO: 25.

9. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o íntron de AB- CA4 é o íntron 23, e a mutação é qualquer um ou mais dos exons 1-23 ou íntrons 1-23 de ABCA4.

10. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o domínio de codificação compreende os exons 1-23 de ABCA4 funcionais.

11. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 23 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 80 a 570 ou nucleotídeos 720 a 1.081 de SEQ ID NO: 29.

12. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo: (a) qualquer um ou mais dos nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29; (b) qualquer um ou mais dos nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29; ou (c) qualquer um ou mais dos nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29.

13. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende: (a) seis ou mais de nucleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29; (b) seis ou mais de nucleotídeos de nucleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29; ou (c) seis ou mais de nucleotídeos de nucleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29.

14. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecu- tivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação.

15. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o íntron de AB- CA4 alvo é o íntron 24, a mutação é em qualquer um dos exons 1-24 ou íntrons 1-24 de ABCA4 e o domínio de codificação compreende os exons 1-14 de ABCA4.

16. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 24 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 600 a 1.250 ou nucleotídeos 1.490 a 2.600 de SEQ ID NO: 30.

17. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1.000 a 1.200 de SEQ ID NO: 30.

18. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação se liga ao íntron de ABCA4 alvo 5’ para a mutação, e em que a mutação é em qualquer um dos exons 23-50 ou íntrons 22-49 de AB- CA4.

19. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o íntron de ABCA4 é o íntron 23, a mutação é qualquer um dos exons 24-50 ou íntrons 23-49 de ABCA4 e o domínio de codificação compreende os exons 24-50 de ABCA4.

20. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 23 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 80 a 1.081 de SEQ ID NO: 29.

21. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 230 a 1.081 de SEQ ID NO: 29.

22. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 250 a 400 de SEQ ID NO: 29.

23. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 690 a 850 de SEQ ID NO: 29.

24. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o íntron de ABC4-alvo é o íntron 24, e a mutação é em qualquer um dos exons 25-50 ou íntrons 24-49 de ABCA4, e o domínio de codificação com- preende os exons 25-50 de ABCA4.

25. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 24 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1 a 250, nu- cleotídeos 300 a 2.100 ou nucleotídeos 2.200 a 2.692 de SEQ ID NO:

30.

26. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 360 a 610 de SEQ ID NO: 30.

27. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 750 a 1.110 de SEQ ID NO: 30.

28. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende operativamente ligada em uma dire- ção 5’-para-3’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais dos nucleotídeos 60 a 570, 600 a 800 ou 900 a 1.350 de SEQ ID NO: 28; (b) um domínio de união configurado para mediar a união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 23-50 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação para o exon 22 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 23-50 de AB- CA4 endógenos com os exons 23-50 de ABCA4 funcionais.

29. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende qualquer um ou mais dos nucleotídeos 70-250 de SEQ ID NO: 28.

30. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais de nucleotídeos 1 a 510 ou 880 a 1.350 de SEQ ID NO: 28; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1- 22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação ao exon 23 de AB- CA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-22 de ABCA4 endógenos com os exons 1-22 de ABCA4 funcionais.

31. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 no sítio de liga- ção compreendendo: (a) qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1041 a 1190 de

SEQ ID NO: 28; (b) qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28; (c) qualquer um ou mais dos nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28.

32. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o sítio de liga- ção compreende: (a) seis ou mais de nucleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28; (b) seis ou mais de nucleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28; (c) seis ou mais de nucleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28;

33. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação.

34. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 33, caracterizada pelo fato de que o domínio de ligação é de 100-200 nucleotídeos de compri- mento.

35. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de que o domínio de codificação é uma sequência de cDNA.

36. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de que o domínio de codificação compreende uma sequência de ocor- rência natural.

37. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de que o domínio de codificação compreende uma sequência com có- don otimizado.

38. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que um íntron artificial compreende uma sequência espaçadora.

39. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizada pelo fato de que é de a partir de 3.000 a 4.000 nucleotídeos de comprimento.

40. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizada pelo fato de que a mutação no gene ABCA4 é associada com Doença de Star- gardt.

41. Molécula de união trans de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que a mutação no gene ABCA4 associada com a Doença Stargardt é expressa em uma célula fotorreceptora.

42. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nu- cleotídeos 261 a 410 de SEQ ID NO: 29, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de uni- ão; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 1-23 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con-

figurada para unir trans o domínio de codificação a exon 24 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo exons 1-23 de ABCA4 endóge- nos com os exons 1-23 de ABCA4 funcionais.

43. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nu- cleotídeos 801 a 950 de SEQ ID NO: 29, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de uni- ão; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1- 23 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação ao exon 24 de AB- CA4, dessa maneira substituindo os exons 1-23 de ABCA4 endógenos com os exons 1-23 de ABCA4 funcionais.

44. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 23 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nu- cleotídeos 841 a 990 de SEQ ID NO: 29, em que o domínio de ligação compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos no sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de uni- ão; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1-

23 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para ligar trans o domínio de codificação ao exon 24 de AB- CA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-23 de ABCA4 endógenos com os exons 1-23 de ABCA4 funcionais.

45. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nu- cleotídeos 1041 a 1190 de SEQ ID NO: 28, em que o domínio de liga- ção compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de uni- ão; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1- 22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação a exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-22 de ABCA4 en- dógenos com os exons 1-22 de ABCA4 funcionais.

46. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nu- cleotídeos 1171 a 1320 de SEQ ID NO: 28, em que o domínio de liga- ção compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de uni- ão; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1- 22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação a exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-22 de ABCA4 en- dógenos com os exons 1-22 de ABCA4 funcionais.

47. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligado em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 22 de ABCA4 em um sítio de ligação compreendendo seis ou mais de nu- cleotídeos 1201 a 1350 de SEQ ID NO: 28, em que o domínio de liga- ção compreende seis ou mais resíduos de ácido nucleico consecutivos que são complementares aos seis ou mais nucleotídeos do sítio de ligação; (b) um íntron artificial compreendendo um domínio de uni- ão; e (c) um domínio de codificação compreendendo os exons 1- 22 de ABCA4 funcionais; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação a exon 23 de ABCA4 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 1-22 de ABCA4 en- dógenos com os exons 1-22 de ABCA4 funcionais.

48. Plasmídeo proviral, caracterizado pelo fato de que com- preende a molécula de união trans de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47.

49. Vírus adenoassociado (AAV), caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 48.

50. AAV de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o AAV se direciona preferivelmente a uma célula fo- torreceptora.

51. AAV de acordo com a reivindicação 49 ou 50, caracteri- zado pelo fato de que o AAV compreende uma proteína do capsídeo de AAV5, uma proteína do capsídeo de AAV8, uma proteína do capsí- deo de AAV8(b) ou uma proteína do capsídeo de AAV9.

52. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de união trans de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47, o plasmídeo pro- viral como definido na reivindicação 48 ou o AAV de qualquer uma das reivindicações 49 a 51.

53. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de união trans de ácido nucleico 5’ e uma molécula de união trans de ácido nucleico 3’, em que a molécula de união trans de ácido nucleico 5’ é a molécula de união trans de áci- do nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 13 ou 30 a 47 e a molécula de união trans de ácido nucleico 3’ é a molé- cula de união trans de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 25.

54. Método de correção de uma mutação em um gene AB- CA4 em uma célula-alvo de um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêutica como definida na reivindicação 52 ou 53.

55. Método de correção de uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 1-24 de ABCA em um indivíduo com necessidade do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de união trans de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 13 ou 30 a 47.

56. Método de correção de uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 23-50 de ABCA4 em um indivíduo com necessida- de do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo uma mo- lécula de união trans de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 25.

57. Método de correção de uma mutação em qualquer um dos exons 1-24 de ABCA4 e uma segunda mutação em qualquer um dos exons 23-50 em um indivíduo com necessidade do mesmo, carac- terizado pelo fato de que o método compreende administrar ao indiví- duo a composição farmacêutica como definida na reivindicação 53.

58. Método de tratamento de um indivíduo tendo um distúr- bio associado com uma mutação em ABCA4, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a composição farmacêu- tica como definida na reivindicação 52 ou 53.

59. Método de tratamento de um indivíduo tendo um distúr- bio associado com uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 1-24 ou íntrons 1-24 de ABCA4, caracterizado pelo fato de que com- preende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica com- preendendo a molécula de união trans de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 13 ou 30 a 47.

60. Método de tratamento de um indivíduo tendo um distúr- bio associado com uma mutação em qualquer um ou mais dos exons 23-50 ou íntrons 22-49 de ABCA4, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma composição farmacêutica compreendendo a molécula de união trans de ácido nucleico como de- finida em qualquer uma das reivindicações 14 a 25.

61. Método de tratamento de um indivíduo tendo um distúr-

bio associado com uma primeira mutação em qualquer um dos exons 1-24 de ABCA4 e uma segunda mutação em qualquer um dos exons 23-50, caracterizado pelo fato de que o método compreende adminis- trar ao indivíduo a composição farmacêutica como definida na reivindi- cação 53.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 54 a 61, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem Doença Stargardt.

63. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 54 a 62, caracterizado pelo fato de que a composição é adminis- trada através de injeção sub-retinal, injeção intravítrea ou injeção in- travenosa.

64. Vírus adenoassociado (AAV), caracterizado pelo fato de que compreende um capsídeo montado tendo empacotado no mesmo um genoma de vetor compreendendo um ITR 5’ de AAV, a molécula como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 47 sob o con- trole operativo de sequências reguladoras e um ITR de 3’AAV.

65. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 54 a 63, caracterizado pelo fato de que o indivíduo exibe aumen- to de pelo menos 10% em expressão de proteína ABCA4 após admi- nistração.

66. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato que compreende, operativamente ligado em uma direção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o íntron 26 de CEP290 em um sítio de ligação compreendendo qualquer um ou mais de nucleotídeos 4.800 a 5.838 de SEQ ID NO: 32; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons 2-26 de CEP290 funcionais;

em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação ao exon 27 de CEP290 endógeno, dessa maneira substituindo os exons 2-26 de CEP290 endógenos com os exons 2-26 de CEP290 funcionais e corri- gindo uma mutação por ponto patogênica.

67. Molécula de união trans de ácido nucleico, caracteriza- da pelo fato de que compreende, operativamente ligada em uma dire- ção 3’-para-5’: (a) um domínio de ligação configurado para ligar o CEP290 em qualquer um dos íntrons-alvo 27, 28, 29 ou 30; (b) um domínio de união configurado para mediar união trans; e (c) um domínio de codificação compreendendo exons de CEP290 funcionais 5’ para o íntron-alvo; em que a molécula de união trans de ácido nucleico é con- figurada para unir trans o domínio de codificação a CEP290 endógeno, dessa maneira substituindo os exons de CEP290 endógenos 5’ para o íntron-alvo com os exons de CEP290 funcionais e corrigindo a muta- ção por ponto patogênica.

68. Plasmídeo proviral, caracterizado pelo fato de que com- preende a molécula de união trans de ácido nucleico como definido na reivindicação 66 ou 67.

69. AAV, caracterizado pelo fato de que compreende a mo- lécula de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindi- cações 66 a 68.

70. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de união trans de ácido nucleico como definido na reivindicação 66 ou 67, o plasmídeo proviral como definido na reivindicação 68 ou o AAV como definido na reivindicação 69.

71. Método de correção de uma mutação por ponto patogê-

nica no íntron 26 de CEP290 em uma célula-alvo de um indivíduo, ca- racterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a molécula de união trans de ácido nucleico como definido na reivindica- ção 66 ou 67, o plasmídeo proviral como definido na reivindicação 68, o AAV como definido na reivindicação 69 ou a composição farmacêuti- ca como definida na reivindicação 70.

72. Método de tratamento de um indivíduo tendo LCA 10 causada por uma mutação por ponto patogênica no íntron 26 de CEP290, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo a molécula de união trans de ácido nucleico como definido na reivindicação 66 ou 67, o plasmídeo proviral como definido na rei- vindicação 68, o AAV como definido na reivindicação 69 ou a compo- sição farmacêutica como definida na reivindicação 70.