BR112020016666A2 - Capsídeos virais modificados - Google Patents

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Abstract

métodos para a identificação de polipeptídeos, por exemplo, derivados de proteína de hsv pul22, que quando exibidos em um capsídeo conferem uma propriedade desejada a uma partícula viral que compreende tal capsídeo, bem como métodos para manipulação e fabricação de vetores virais e partículas virais com propriedades aprimoradas. o método de identificação é baseado na biblioteca de capsídeos em que a variante de capsídeo não forma parte do genoma viral que contém um código de barras e em que o código de barras associado a uma variante de capsídeo é determinado por sequenciamento antes que o vetor viral seja usado. então, a prevalência da variante de capsídeo em uma amostra biológica pode ser determinada pelo sequenciamento exclusivo do código de barras.

Description

“CAPSÍDEOS VIRAIS MODIFICADOS” CAMPO TÉCNICO
[001] A presente invenção se refere a vetores virais e partículas e métodos e ferramentas para projetar e fabricar os mesmos.
FUNDAMENTOS
[002] A manipulação de vetores virais por meio da evolução direcionada gerou uma infinidade de capsídeos potentes com tropismo e função aprimorados1-9. Embora as adições recentes de seleção restrita de Cre- recombinase e sequenciamento profundo para otimização tenham aprimorado a precisão e a potência dessa abordagem nos últimos anos, ela ainda é restrita pela infetividade em série e quimeras geradas durante a produção que requer várias gerações de triagem até o funcionamento real da superfície de capsídeos2-4. Devido à aleatoriedade do processo, uma facção muito pequena das sequências de novo codificam para substituições de aminoácidos válidas no frame e ainda menos são montadas corretamente. Essa abordagem de triagem também é inerentemente irreproduzível e as otimizações devem ser conduzidas post hoc. As variantes resultantes de capsídeo também fornecem poucos insights sobre a função e quais alvos moleculares estão envolvidos.
[003] Uma abordagem alternativa comumente usada é o design racional, em que mudanças sistemáticas são feitas com base nas propriedades conhecidas de capsídeo (por exemplo, a remoção da ligação do proteoglicano de sulfato de heparano de capsídeo AAV2) ou através de substituições sistemáticas de aminoácidos ou exibição de nanocorpos de alta afinidade da superfície de capsídeo10-14. Embora funcionalmente mais rigorosa, essa abordagem oferece menos diversidade e tem um potencial funcional mais restrito.
[004] Consequentemente, há uma necessidade de métodos para projetar capsídeos com propriedades aprimoradas, que sejam confiáveis, reproduzíveis e permitam grande diversidade.
SUMÁRIO
[005] Os métodos providenciados neste documento superam as desvantagens descritas acima. Ao aplicar uma abordagem racionalizada e sistemática em proteínas selecionadas conhecidas por terem ou suspeitas de terem uma propriedade desejada, uma biblioteca de vetores virais modificados que codificam partículas virais modificadas pode ser expressa, em que as partículas virais modificadas compreendem um capsídeo modificado exibindo um fragmento do proteínas. Usando rastreio adaptado, podem ser identificados fragmentos das referidas proteínas que são particularmente úteis para conferir uma propriedade desejada a uma partícula viral. Estes podem ser usados para projetar capsídeos modificados, isto é, capsídeos exibindo um dos referidos fragmentos identificados, com propriedades personalizadas. Como pode ser visto nos exemplos, os métodos podem ser usados, por exemplo, para projetar partículas virais com tropismo e/ou infecciosidade aumentada para um determinado tipo de célula. Os métodos atuais são confiáveis, reproduzíveis e permitem grande diversidade. Os capsídeos gerados podem ser usados para entregar um transgene e encontrar pedidos não apenas em métodos de tratamento e terapia gênica, mas também em, por exemplo, mapeamento funcional de domínios de proteínas e triagem de drogas.
[006] Neste documento é providenciado um método de fabricação de uma biblioteca de vetores virais, compreendendo as etapas de: i) selecionar um ou mais polipeptídeos candidatos de um grupo de polipeptídeos que tem ou suspeita-se que tenha uma propriedade desejada e recuperar as sequências dos referidos polipeptídeos; ii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos candidatos, cada polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um dos referidos polipeptídeos candidatos de modo que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato seja representado por um ou mais fragmentos polipeptídicos de cada polipeptídeo candidato;
iii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos tipo código de barras (barcode); iv) inserir cada polinucleotídeo candidato juntamente com um polinucleotídeo tipo código de barras em um vetor viral, compreendendo um gene de capsídeo e um genoma viral, obtendo assim uma pluralidade de vetores virais, cada um compreendendo um único polinucleotídeo candidato operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras, em que o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo, o gene de capsídeo está fora do genoma viral e o polinucleotídeo tipo código de barras é inserido no genoma viral; em que o vetor viral compreende um polinucleotídeo marcador que codifica um marcador detectável; v) amplificar a pluralidade de vetores virais obtidos na etapa iv) em um sistema de amplificação, em que cada vetor viral está presente em uma pluralidade de cópias no sistema de amplificação; e a) recuperar e transferir pelo menos uma primeira parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) em um sistema de referência, mapeando assim cada polinucleotídeo tipo código de barras em um polinucleotídeo candidato; e b) manter uma segunda parte da pluralidade de vetores virais no sistema de amplificação e, opcionalmente, transferir toda ou parte da referida segunda parte em um sistema de produção para obter uma pluralidade de partículas virais.
[007] Também é providenciado um método para projetar um vetor viral tendo uma propriedade desejada, compreendendo as etapas i) a v) acima e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperação de uma fração de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) acima, ou recuperação de pelo menos parte das partículas virais do sistema de produção da etapa v) b) acima e contato de uma população de células com os referidos vetores virais recuperados ou partículas virais;
vii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; viii) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células selecionadas na etapa vii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; ix) projetar um vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa viii).
[008] Também é providenciado um método de fabricação de uma partícula viral com uma propriedade desejada, o referido método compreendendo as etapas i) a v) acima e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperação de pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) acima ou recuperação de pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b) acima; vii) colocar uma população de células em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos na etapa vi); viii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; ix) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células identificadas na etapa viii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; x) projetar um vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa ix); xi) produzir o vetor viral da etapa x) em um sistema de amplificação ou em um sistema de produção, obtendo assim a partícula viral com a propriedade desejada.
[009] Também é providenciado um método de distribuição de um transgene a uma célula alvo, o referido método caracterizando: a) proporcionar um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado e encapsulando um transgene, em que o vetor viral modificado ou a partícula viral modificada é o vetor viral ou a partícula viral definidos na etapa xi) acima; e b) injetar o referido vetor viral modificado ou a referida partícula viral modificada em um sítio de injeção.
Também é providenciado uma biblioteca de vetores virais, cada vetor viral compreendendo: i) uma estrutura principal para expressar o vetor viral em uma célula hospedeira; ii) um gene de capsídeo e um polinucleotídeo candidato nele inserido, o referido polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um polipeptídeo candidato; iii) um polinucleotídeo marcador; e iv) um polinucleotídeo tipo código de barras; em que o polipeptídeo candidato é selecionado a partir de um grupo predefinido compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm ou suspeita-se que tenham uma propriedade desejada; em que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato é representado por um ou mais fragmentos de polipeptídeo na biblioteca; o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo do vetor viral de modo que possa ser transcrito e traduzido para um fragmento de polipeptídeo exibido no capsídeo e está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras inserido no genoma viral, e o polinucleotídeo marcador está compreendido no genoma viral, e o gene de capsídeo está fora do genoma viral.
[010] Também é fornecida uma célula ou uma pluralidade de células compreendendo a biblioteca de vetores virais descritos neste documento.
[011] Também é proporcionado um vetor viral que codifica uma partícula viral para distribuição de um transgene a uma célula alvo, o referido vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado e um transgene a ser distribuído para a célula alvo; em que o gene de capsídeo modificado está fora do genoma viral e compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que melhora a distribuição do transgene e/ou o direcionamento para a célula alvo.
[012] Também são fornecidas partículas virais codificadas pelos vetores virais descritos neste documento.
[013] Também é proporcionado um vetor viral modificado ou partícula viral para entrega de um transgene a uma célula alvo, o referido vetor viral modificado ou partícula viral compreendendo um capsídeo modificado e um transgene a ser entregue à célula alvo; em que o capsídeo modificado aprimora um ou mais dos seguintes: entrega do transgene para a célula alvo, direcionamento para a célula alvo, infectividade do vetor viral modificado ou partícula viral modificada e/ou transporte retrógrado do vetor viral modificado ou partícula viral modificada em comparação a uma partícula viral não modificada compreendendo um gene de capsídeo nativo e o transgene.
[014] Também é proporcionada a utilização de um vetor viral, uma partícula viral, um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada descritos neste documento para terapia genética.
[015] Também é proporcionado um vetor viral, uma partícula viral, um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada descritos neste documento para uso em um método de tratamento de um distúrbio, como um distúrbio do sistema nervoso.
[016] Também é proporcionado um método de tratamento de um distúrbio, tal como um distúrbio do sistema nervoso, em um sujeito em necessidade, o referido método compreendendo a administração de um vetor viral, uma partícula viral, um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada descrita neste documento para o assunto.
[017] Também é proporcionado um método de identificação de uma droga com um efeito desejado, o referido método compreendendo as etapas de: a) Fornecer uma droga candidata; b) Administrar a droga candidata a uma célula; c) Fornecer uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado permitindo a distribuição da partícula viral para a célula de b) e um polinucleotídeo marcador; d) Monitorar e comparar a expressão e/ou localização do polipeptídeo marcador na presença e ausência da droga candidata; determinar assim se a droga candidata tem um efeito na expressão do polinucleotídeo marcador.
[018] Também é proporcionado um método para melhorar o tropismo de um vetor viral ou partícula em direção a uma célula alvo, o referido método compreendendo as etapas i) a v) acima e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador;
viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo com expressão aumentada do marcador em comparação com a expressão do vetor viral de referência ou partícula viral de referência; x) projetar um vetor viral ou uma partícula viral com tropismo aprimorado compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa ix).
[019] Também é divulgado neste documento um método de identificação de uma ou mais regiões de um polipeptídeo que confere uma propriedade desejada a uma partícula viral compreendendo um capsídeo modificado pela inserção do referido polipeptídeo nele, o referido método compreendendo as etapas i) a v) acima e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador; viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo tendo um perfil de expressão do marcador correspondente à propriedade desejada.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: Geração de biblioteca de capsídeo AAV altamente diversa para a abordagem BRAVE
[020] (A) Gráfico de pizza exibindo as 131 proteínas com afinidade documentada para sinapses que foram identificadas na literatura. Elas se enquadram em três grupos principais, proteínas derivadas de vírus (capsídeo e envelope), proteínas derivadas do hospedeiro (neurotrofinas e proteínas relacionadas a doenças, por exemplo, Tau), neurotoxinas e lectinas. (B) 1. As sequências de referência do NCBI das 131 proteínas foram traduzidas em sequências de aminoácidos e digeridas computacionalmente em polipeptídeos de comprimento 14aa com uma abordagem de janela deslizante móvel 1aa. Os 61 314 peptídeos gerados no total consistiam em 44 708 polipeptídeos únicos.
2. Três ligantes alternativos foram adicionados aos polipeptídeos; uma única Alanina (chamada 14aa), um ligador estriado com 5 resíduos de Alanina (14aaA5) e um ligador flexível com a sequência aa GGGGS (14aaG4S). Um último grupo de peptídeos aa foi gerado de forma semelhante com um comprimento de 22aa e um único ligador de Alanina (denominado 22aa). 3. Um total de 92 sequências de 358 aa foram então otimizados por códons para expressão em células humanas e saliências adicionadas às extremidades para permitir a clonagem direcional de montagem de Gibson sem cicatriz no gene AAV2 Cap na posição 588. Todos os oligos resultantes com o comprimento total de 170 bp foram sintetizados em paralelo em uma matriz de oliqonucleotídeos CustomArray. 4. O conjunto de oligonucleotídeos resultante foi montado em uma nova estrutura principal de produção de AAV com AAV2 Rep/Cap de ação Cis e CMV-GFP flanqueando ITR. Um código de barras molecular aleatório (BC) de 20 bp foi inserido simultaneamente na UTR 3' do gene GFP. 5a. Usando uma abordagem de recombinação Cre unidirecional seguida por adição baseada em emPCR de adaptadores de sequenciamento Illumina, todo o conjunto de peptídeos é então sequenciado usando sequenciamento de extremidade emparelhada ligando os códigos de barras aleatórios aos respectivos peptídeos em uma tabela Look-Up (LUT). A biblioteca resultante continha 3 934 570 combinações únicas de peptídeo e código de barras. 5b. Em paralelo à geração de LUT, a mesma biblioteca de plasmídeo é utilizada para gerar preparações de vetores virais de AAV deficientes para replicação, onde o peptídeo é exibido na superfície de capsídeo e o código de barras é empacotado como parte do genoma de AAV. Múltiplos experimentos de triagem paralelos são então realizados in vitro e in vivo e após a seleção adequada (por exemplo, dissecção da região do cérebro alvo) o mRNA é extraído e os códigos de barras expressos sequenciados. 6. Por meio da combinação dos códigos de barras sequenciados e do LUT, a eficácia pode ser mapeada de volta para as 131 proteínas originais e os motivos de consenso podem ser determinados usando a abordagem de agrupamento baseada em modelo oculto de Markov da Hammock (7). (C) Duas produções separadas de bibliotecas de AAV foram realizadas com uma concentração de plasmídeo de 3 cópias por célula (30cpc) ou uma concentração dez vezes maior (30cpc). Para avaliar quais peptídeos permitiriam a montagem correta e o empacotamento do genoma, nós tratamos os dois lotes com DNAse (para remover genomas não empacotados), lisamos os lotes e sequenciamos os códigos de barras das preparações separadamente. Devido à diversidade muito alta dos códigos de barras expressos, a sobreposição nos códigos de barras contidos era muito pequena. No entanto, a maioria absoluta de todos os peptídeos embalados no lote 3cpc também foi recuperada no lote 30cpc. (D) Para avaliar a contribuição funcional do peptídeo inserido, injetamos a biblioteca de 30cpc no prosencéfalo de ratos adultos e comparamos o padrão de expressão a um lote de vetores AAV2-WT expressando o mesmo transgene (GFP) com o mesmo título. Figura 2 Triagem BRAVE de geração única in vitro e in vivo
[021] (A-B) Em um primeiro estudo de prova de conceito, decidimos utilizar a tecnologia BRAVE para triar a reintrodução do tropismo para células HEK293T in vitro. O AAV2 de tipo selvagem exibe infecciosidade muito alta atribuída à ligação do proteoglicano de sulfato de heparina (HS) (B). O serótipo AAV-MNMnull interrompe esta ligação através da inserção de um sítio de enzima de restrição NheI na base 587/588 e, assim, reduz significativamente a infecciosidade das células HEK293T (B '). Na triagem de 4 milhões de variantes da capsídeo tipo código de barras exclusivo, encontramos várias regiões das 132 proteínas incluídas que conferiram uma infecciosidade significativamente melhorada em relação à estrutura da capsídeo parental AAV-MNMnull. Um peptídeo da proteína de superfície de HSV-2 pUL44 foi selecionado e um primeiro capsídeo novo foi gerado denominado AAV- MNM001. Este capsídeo, quando usado para embalar CMV-GFP de forma independente, exibiu um tropismo significativamente aumentado para as células HEK293T (B''). Em um segundo experimento, usamos a tecnologia BRAVE para aprimorarar a infectividade de neurônios corticais primários de ratos in vitro. Ambos AAV2-WT e o vetor AAV-MNMnull exibem infecciosidade muito pobre de neurônios primários (D-D') e o AAV-MNM001 exibe alguma aprimorara (D' '). Por meio da triagem BRAVE, identificamos uma série de peptídeos agrupados em uma região C-terminal da proteína pUL1 de HSV-2 (C) que, quando utilizada sozinha em um novo capsídeo AAV (AAV-MNM002), aprimorarou a infectividade de neurônios primários em cultura dramaticamente (D'"). (E) Comparação entre os títulos para AAV2 e AAV- MNM001/004/008/009/017/025/026. Os títulos são mostrados como cópias do genoma/célula (nenhum de HEK293T no momento da transfecção). Os capsídeos selecionados tiveram que ser produzidos pelo menos duas vezes com o mesmo método de produção para serem comparados com AAV2. As linhas pretas representam os valores médios, os dois grupos diferiram significativamente usando o teste t bicaudal,p0,05. Figura 3 Caracterização de capsídeo AAV-MNM004 para transporte retrógrado in vivo
[022] (A) Na análise de bioinformática da proteína pUL22 do HSV, uma região C-terminal da proteína apresentou transporte reprodutível para todas as regiões aferentes; Cortex, Thalamus e Substantia Nigra embora não mostrem o mesmo viés no sítio da injeção no corpo estriado. (B-D) O agrupamento HMM de todos os peptídeos exibindo essas propriedades revelou dois motivos de consenso sobrepostos (C). Estruturas de capsídeo, respectivamente. (D) O AAV-MNM004 foi comparado in vivo ao AAV2 parental por meio da injeção estriatal unilateral de um vetor scAAV|CMV-GFP com cada uma das duas estruturas de capsídeo. 5 semanas após a injeção de AAV, os animais foram sacrificados e as seções coradas para GFP usando imuno- histoquímica desenvolvida em uma coloração de precipitação marrom usando a reação DAB-peroxidase. Enquanto o AAV2-Capsídeo promoveu transdução eficiente no sítio da injeção, resultou em muito pouco transporte retrógrado do vetor. O capsídeo AAV-MNM004, por outro lado, promoveu um transporte retrógrado para todas as regiões aferentes até o córtex entorrinal medial. Figura 4 Utilização da abordagem BRAVE para mapear e compreender a função das proteínas envolvidas na doença de Alzheimer, tanto in vivo quanto in vitro
[023] (A) Curiosamente, a região sAAP compartilhou homologia de sequência significativa com uma região da proteína VP1 do vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) que parece conduzir sua absorção axonal e infectividade. (B-C, E) Após caracterização mais profunda, esta região consistia em três motivos conservados adjacentes com o terceiro motivo compartilhando homologia significativa com a glicoproteína VSV-G (bem usada para pseudotipar lentivírus para aprimorarar o tropismo neuronal) e a proteína gp120 do HIV. Duas novas estruturas de capsídeo foram geradas a partir desta região, AAV-MNM009 e AAV-MNM017. Ambos os novos capsídeos promoveram transporte retrógrado in vivo, mas AAV-MNM017 também exibiu propriedades interessantes adicionais. AAV-MNM017 infectou neurônios primários e células gliais primárias in vitro com eficácia muito alta. (D-D'') Detecção em células gliais primárias humanas. (D): AAV-MNM001 corado com mCherry; (D'): AAV-MNM017 corado com GFP; (D ''): co-coloração. Figura 5 Avaliação do rearranjo de capsídeo de AAV usando BRAVE e geração de capsídeos infectando neurônios DA
[024] (A-B) Em um último experimento de triagem BRAVE, objetivamos desenvolver uma nova variante de capsídeo AAV com transporte retrógrado eficiente para neurônios de dopamina do Substantia Nigra de injeções na região de saída do estriado. Nesta triagem, identificamos duas regiões da proteína de capsídeo CAV-2 nas proximidades. Curiosamente, o primeiro peptídeo compartilhava homologia significativa com uma terceira região da mesma proteína (A), enquanto o segundo peptídeo (B) compartilhava um motivo peptídico da lectina aglutinina de soja (SA) que também se transporta de forma eficiente da sinapse para o soma dos neurônios e, portanto, pode ser usado como traçador retrógrado. (C-C'). Por meio da imuno- histoquímica de fluorescência dupla, pudemos então confirmar que a maioria dessas células eram de fato TH-positivas e, portanto, inferidas como produtoras de DA (C'' - C'''). Usando o mesmo protocolo de diferenciação de hESC in vitro, avaliamos se o tropismo neuronal in vitro das variantes de capsídeo de novo seria mantido também em neurônios de origem humana. Na verdade, todas as variantes (MNM002, 008 e 010) que exibiram alto tropismo em neurônios de roedores primários também mostraram um tropismo muito maior do que as variantes de AAV de tipo selvagem. Figura 6 Dissecção funcional da amígdala basolateral e seu envolvimento no desenvolvimento de ansiedade
[025] (A) Em um último experimento, utilizamos a variante de capsídeo AAV-MNM004 gerada pelo BRAVE para responder a uma questão importante a respeito da contribuição funcional das aferências da amígdala basolateral para o estriado dorsal. Isso foi conduzido usando uma abordagem quimiogenética induzida retrógrada (DREADD). Injetamos o vetor AAV- MNM004 que expressa Cre-recombinase no estriado dorsal e um vetor quimogenético (DREADD) indutível por Cre (DIO) na amígdala basolateral (BLA) bilateralmente em ratos do tipo selvagem. (B) Após a indução seletiva da atividade dos neurônios BLA projetando-se para o estriado dorsal usando o ligante DREADD CNO, encontramos um fenótipo impressionante de medo e ansiedade exemplificado neste documento usando o labirinto em cruz elevado (EPM), onde os animais passaram significativamente menos tempo no braços abertos em comparação com animais de controle (onde o gene Cre foi substituído por GFP). Isso contrasta fortemente com a função considerada das projeções do BLA para o estriado ventral, promovendo estímulos positivos. (C) Este fenótipo de ansiedade aumenta foi acompanhado por hipermobilidade significativa na arena de campo aberto e um fenótipo de medo incluindo escavação excessiva, sudorese severa e episódios de congelamento (D-E) após os desafios de CNO, os animais foram sacrificados e o BLA corado para qualquer tag HA (identificando a expressão de hM3Dq DREADD) ou mCherry (visualizando os rM3Ds DREADD) usando imuno-histoquímica desenvolvida em uma coloração de precipitação marrom usando a reação DAB-peroxidase. Figura 7 Abordagens de produção de AAV
[026] (A) abordagem de 3 plasmídeos. O genoma de AAV é dividido em dois plasmídeos, um plasmídeo de transferência e um plasmídeo de empacotamento. Os genes necessários do adenovírus (Ad) são então fornecidos em trans usando um terceiro plasmídeo helper. O plasmídeo de transferência contém a sequência genética a ser empacotada nos vírions produzidos. Esta sequência é flanqueada por repetições terminais invertidas (ITR) de AAV para serem replicadas e inseridas no capsídeo. Este plasmídeo contém um gene de interesse (GOI) direcionado por um Promotor e tem uma região 3' não traduzida (3'UTR) e uma sequência de poliadenilação (pA). O plasmídeo de empacotamento contém as partes restantes do genoma de AAV de tipo selvagem, isto é, os genes Rep e Cap geralmente acionados por um promotor forte para aumentar os títulos. Como esses genes não são mais flanqueados por sequências ITR, eles não são empacotados nos vírions finais de AAV. O plasmídeo Helper contém os genes Ad E4, E2a e VA que, juntamente com os genes Ad E1a e E1b, que já podem ser expressos na linhagem celular de produção, permitem a produção de AAV. (B) abordagem de 2 plasmídeos. O plasmídeo de transferência é como em (A), mas o Helper e os plasmídeos de empacotamento foram fundidos em um plasmídeo maior. Isso retém a capacidade de produzir vírus AAV deficientes para replicação usando menos plasmídeos. (C) Abordagem alternativa de 2 plasmídeos. O plasmídeo helper é como em (A), mas os plasmídeos de transferência e empacotamento são fundidos em um plasmídeo funcional, fornecendo a funcionalidade Rep/Cap e o genoma flanqueado por ITR para ser inserido no vírion AAV enquanto o vetor AAV ainda é deficiente para replicação. Isso permite a utilização de uma quantidade muito menor de plasmídeo de transferência/empacotamento, enquanto mantém os títulos, pois o plasmídeo helper é limitante da taxa. Ele também garante uma combinação perfeita entre o gene Cap e o GOI embalado dentro dele. Figura 8 Leitura modulada de Cr-recombinase
[027] Um regime de seleção de dois fatores pode ser usado para a seleção in vivo de novas variantes de capsídeo de AAV, que é exemplificado neste documento. O primeiro fator é o sítio de entrega, por exemplo, injeção sistêmica, intraventriular ou intraparenquimatosa em um núcleo neuronal específico de escolha. O segundo fator é uma recombinase, como recombinase Cre, ou uma proteína modificadora de DNA ou RNA, como Cas9, Cas13 ou CPF1. Esta proteína pode ser fornecida através da geração de animais transgênicos ou via vetor viral. Como um vetor viral, isso pode ser entregue em um núcleo do cérebro secundário específico para marcar apenas aferentes selecionados para a triagem de capsídeo. A abordagem neste documento mostra uma nova estratégia que permite o mapeamento no alvo e fora do alvo com base em códigos de barras sequenciados do mRNA. O valor do sequenciamento de mRNA é que apenas a infecciosidade bem-sucedida resulta na formação de mRNA e, portanto, os falsos positivos (partículas não infecciosas retidas no tecido) são excluídos. (1) A biblioteca de vetores virais distribuída contém um genoma com os seguintes componentes principais. i) Um código de barras molecular (BC) que permite a identificação da estrutura de capsídeo com base em uma tabela de consulta in vitro. ii) Um sítio de ligação do primer de sequenciação único (SPBS) que permite o enriquecimento e amplificação do mRNA derivado da biblioteca para sequenciação. iii) Um sítio de poliadenilação sintético (spA) que termina a transcrição apenas na direção direta. iv) Um gene marcador para seleção no alvo, no caso de um alvo de baixa abundância. v) Dois pares de sítios de recombinação loxP não compatíveis entre si que fornecem uma reorientação irreversível na presença de recombinase Cre. vi) Uma única região 5' não traduzida (5'UTR) que permite a amplificação seletiva dos códigos de barras do mRNA para sequenciamento em células fora do alvo. vii) Uma sequência 3'UTR para o mesmo tipo de amplificação nas células-alvo. (2) Na ausência de Cre-recombinase, ou seja, após infecciosidade fora do alvo, os códigos de barras podem ser recuperados e sequenciados do mRNA usando primers direcionados aos sítios 5'UTR e SPBS. Isso permite o mapeamento de variantes de capsídeo com infectividade ampla e não seletiva. (3) Quando um vírion infecta uma célula de interesse, ou seja, uma célula que expressa Cre, a recombinação ocorre entre os dois pares de sítios loxP. Isso resulta em uma reversão da orientação do gene Marker, do código de barras e da sequência SPBS. (4) Nas células-alvo, o mRNA expresso permite a tradução do gene Marker em proteína, mas retém o SPBS e o código de barras como parte do mRNA 3'UTR, graças à sequência spA não estar ativa na orientação reversa. A partir deste mRNA, os códigos de barras podem ser seletivamente enriquecidos e amplificados usando primers direcionados ao SPBS e à sequência 3'UTR.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[028] A presente divulgação fornece uma abordagem racionalizada e sistemática para projetar e fabricar uma biblioteca de vetores virais modificados que codificam partículas virais modificadas, onde as partículas virais modificadas compreendem um capsídeo modificado exibindo um fragmento de polipeptídeo de proteínas selecionadas. Usando rastreio adaptado, podem ser identificados fragmentos das referidas proteínas que são úteis para conferir uma propriedade desejada a uma partícula viral. Estes podem ser usados para projetar capsídeos modificados, isto é, capsídeos exibindo um dos referidos fragmentos identificados, com propriedades personalizadas. Como pode ser visto nos exemplos, os métodos podem ser usados, por exemplo, para projetar partículas virais com tropismo aumentada para um determinado tipo de célula.
DEFINIÇÕES
[029] Expressão: O termo "expressão" de uma sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo que codifica um polipeptídeo refere-se à transcrição desse ácido nucleico ou sequência polipeptídica como mRNA e/ou transcrição e tradução dessa sequência de ácido nucleico ou polipeptídeo resultando na produção da proteína codificada pelo polinucleotídeo.
[030] Terapia gênica: O termo "terapia gênica" utilizado neste documento refere-se à inserção de genes nas células e tecidos de um indivíduo para tratar uma doença.
[031] Inserção: O termo "inserção" é usado neste documento para se referir a polinucleotídeos ou polipeptídeos que são inseridos em um gene ou proteína de capsídeo, respectivamente. Um polinucleotídeo inserido em um gene de capsídeo é inserido em uma determinada posição, "além" do gene de capsídeo; nenhum fragmento de polinucleotídeo do gene de capsídeo parental é substituído pelo polinucleotídeo, e o comprimento do gene de capsídeo em que o polinucleotídeo é inserido é assim igual ao comprimento do gene de capsídeo parental mais o comprimento do polinucleotídeo inserido. Da mesma forma, o comprimento de uma proteína de capsídeo exibindo um determinado polipeptídeo é igual ao comprimento da proteína de capsídeo parental mais o comprimento do polipeptídeo exibido.
[032] Modificado: O termo é utilizado neste documento em referência a uma partícula viral, um vetor viral, um gene de capsídeo ou um capsídeo. Um capsídeo modificado é um capsídeo que exibe um polipeptídeo conforme identificado pelos métodos de triagem descritos neste documento. O capsídeo pode, assim, ter propriedades que foram alterados pela inserção do referido polipeptídeo. Por extensão, um gene de capsídeo modificado refere-se a um gene de capsídeo no qual um polinucleotídeo foi inserido, codificando um polipeptídeo que, quando exibido no capsídeo, potencialmente altera suas propriedades. Da mesma forma, um vetor viral é modificado se comparado ao vetor viral do qual é derivado, ele compreende uma sequência polinucleotídica adicional que codifica para um polipeptídeo que, quando exibida no capsídeo viral, pode alterar as propriedades de capsídeo. Uma partícula viral é modificada se compreender um capsídeo modificado.
[033] Ligado operacionalmente: O termo 'ligado operacionalmente' como utilizado neste documento quando se refere a dois polinucleotídeos indica que a identificação de um dos dois polinucleotídeos permite a identificação do outro dos dois polinucleotídeos. Os dois polinucleotídeos que estão operacionalmente ligados podem ser fisicamente parte da mesma molécula de ácido nucleico, ou podem estar em diferentes moléculas de ácido nucleico, ou seja, podem estar operacionalmente ligados em trans.
[034] Promotor: O termo 'promotor' utilizado neste documento refere-se a uma região de DNA que facilita a transcrição de um gene particular. Os promotores estão normalmente localizados perto dos genes que regulam, na mesma fita e a montante.
[035] Transgene: O termo, neste documento, designa um polinucleotídeo, que é desejável introduzir numa célula hospedeira ou numa célula alvo, e que não é expresso natural ou nativamente na referida célula.
[036] Genoma viral: O termo neste documento se refere às regiões polinucleotídicas (DNA ou RNA) que são flanqueadas por repetições terminais (TR) e, consequentemente, empacotadas dentro de um vírion. Para vírus de DNA, as repetições terminais são invertidas e denominadas repetições terminais invertidas (ITR). Retrovírus e lentovírus geralmente têm repetições terminais longas (LTR). Consequentemente, um gene como um gene de capsídeo, que está fora do genoma viral, pode estar na mesma molécula de polinucleotídeo que o genoma viral, mas não é flanqueado por sequências de TR e, portanto, não é empacotado dentro dos vírions. Biblioteca de vetores ou partículas virais
[037] Os presentes inventores desenvolveram um método para a fabricação de uma biblioteca de vetores virais ou partículas virais, a partir da qual vetores virais ou partículas virais com uma propriedade desejada podem ser selecionados. O método é baseado na seleção de uma série de polipeptídeos candidatos conhecidos por terem ou suspeitos de terem uma propriedade desejada e na identificação de fragmentos dos mesmos que, quando exibidos em uma partícula viral, conferem a propriedade desejada à partícula viral assim modificada.
[038] Usando os presentes métodos, é assim possível projetar vetores virais que codificam partículas virais com uma propriedade desejada, por exemplo, partículas virais com tropismo aprimorado ou partículas virais que alvejam seletivamente um tipo específico de células. Tais partículas virais podem ser úteis para uma série de pedidos, por exemplo, terapia genética, particularmente transferência de genes para o sistema nervoso central (SNC) e pesquisa de drogas.
[039] Por conseguinte, neste documento é providenciado um método de fabricação de uma biblioteca de vetores virais, compreendendo as etapas de: i) selecionar um ou mais polipeptídeos candidatos de um grupo de polipeptídeos que tem ou suspeita-se que tenha uma propriedade desejada e recuperar as sequências dos referidos polipeptídeos; ii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos candidatos, cada polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um dos referidos polipeptídeos candidatos de modo que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato seja representado por um ou mais fragmentos polipeptídicos de cada polipeptídeo candidato; iii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos tipo código de barras (barcode); iv) inserir cada polinucleotídeo candidato juntamente com um polinucleotídeo tipo código de barras em um vetor viral, compreendendo um gene de capsídeo e um genoma viral, obtendo assim uma pluralidade de vetores virais, cada um compreendendo um único polinucleotídeo candidato operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras, em que o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo, o gene de capsídeo está fora do genoma viral e o polinucleotídeo tipo código de barras é inserido no genoma viral; em que o vetor viral compreende um polinucleotídeo marcador que codifica um marcador detectável; v) amplificar a pluralidade de vetores virais obtidos na etapa iv) em um sistema de amplificação, em que cada vetor viral está presente em uma pluralidade de cópias no sistema de amplificação; e a) recuperar e transferir pelo menos uma primeira parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) em um sistema de referência, mapeando assim cada polinucleotídeo tipo código de barras em um polinucleotídeo candidato; e b) manter uma segunda parte da pluralidade de vetores virais no sistema de amplificação e, opcionalmente, transferir toda ou parte da referida segunda parte em um sistema de produção para obter uma pluralidade de partículas virais.
[040] Também é providenciado uma biblioteca de vetores virais, cada vetor viral compreendendo: i) uma estrutura principal para expressar o vetor viral em uma célula hospedeira; ii) um gene de capsídeo e um polinucleotídeo candidato nele inserido, o referido polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um polipeptídeo candidato; iii) um polinucleotídeo marcador; e iv) um polinucleotídeo tipo código de barras; em que o polipeptídeo candidato é selecionado a partir de um grupo predefinido compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm ou suspeita-se que tenham uma propriedade desejada; em que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato é representado por um ou mais fragmentos de polipeptídeo na biblioteca; o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo do vetor viral de modo que possa ser transcrito e traduzido para um fragmento de polipeptídeo exibido no capsídeo e está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras inserido no genoma viral, e o polinucleotídeo marcador está compreendido no genoma viral, e o gene de capsídeo está fora do genoma viral. Polipeptídeos e polinucleotídeos candidatos
[041] Em uma primeira etapa, um ou mais polipeptídeos candidatos são selecionados e suas sequências são recuperadas. Os polipeptídeos candidatos são polipeptídeos que se espera ou suspeita que conferem uma propriedade desejada a uma partícula viral quando exibida na superfície de capsídeo. O um ou mais polipeptídeos candidatos podem ser um polipeptídeo, por exemplo, se alguém deseja mapear os domínios funcionais do polipeptídeo com os métodos descritos, neste documento, abaixo, ou pode ser vários polipeptídeos, conforme detalhado abaixo.
[042] Os polipeptídeos candidatos podem assim ser conhecidos como ou suspeitos de serem responsáveis por uma determinada propriedade. Por exemplo, a fim de selecionar polipeptídeos que potencialmente conferem tropismo aumentado para um determinado tipo de células quando exibidos em um capsídeo, um primeiro polipeptídeo conhecido por ser transportado para o referido tipo de células pode ser selecionado. Os polipeptídeos candidatos restantes podem ser identificados executando uma consulta de explosão para identificar outros polipeptídeos, potencialmente de outras entidades, compartilhando motivos com o primeiro polipeptídeo. O termo “entidade” deve ser interpretado, neste documento, no sentido mais amplo e abrange organismos vivos, bem como vírus, príons e semelhantes. Alternativamente, todos os polipeptídeos de uma determinada entidade que se sabe ter ou se suspeita ter a referida propriedade desejada, pelo menos em algumas condições, podem ser selecionados. As sequências dos polipeptídeos candidatos selecionados são recuperadas por métodos conhecidos do versado na técnica. No caso de as sequências dos polipeptídeos candidatos não serem conhecidas, estão disponíveis métodos para o versado na técnica para determinar as referidas sequências.
[043] Alternativamente, os polipeptídeos candidatos podem ser originários de uma biblioteca de peptídeos, como uma biblioteca sintética, por exemplo, uma biblioteca de peptídeos aleatória. Em algumas modalidades, os polipeptídeos candidatos não são derivados do vetor viral no qual devem ser exibidos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos candidatos são derivados de uma biblioteca mutante; em uma modalidade particular, a biblioteca de mutantes não compreende mutantes derivados de um polipeptídeo que é nativo do vetor viral no qual os polipeptídeos serão exibidos.
[044] Em uma próxima etapa, uma pluralidade de polinucleotídeos candidatos é fornecida. Os polinucleotídeos candidatos codificam fragmentos dos polipeptídeos candidatos. A pluralidade de polinucleotídeos candidatos pode ser solicitada de um provedor comercial ou projetada e sintetizada pelo usuário. Por exemplo, a sequência dos polinucleotídeos candidatos pode ser desenhada em papel ou in silico, e encomendada de um provedor comercial, ou sintetizada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, em uma matriz, como mostrado no exemplo 1.
[045] Em algumas modalidades, as sequências dos polinucleotídeos candidatos são otimizadas por códons para transcrição em uma determinada célula hospedeira, como é conhecido na técnica.
[046] Cada polipeptídeo candidato é representado por um ou mais fragmentos de polipeptídeo, cada um codificado por um polinucleotídeo candidato. Em algumas modalidades, cada polipeptídeo candidato é representado por pelo menos dois fragmentos polipeptídicos sobrepostos codificados por pelo menos dois polinucleotídeos, como pelo menos três fragmentos polipeptídicos sobrepostos codificados por pelo menos três polinucleotídeos. Conclui-se que os polinucleotídeos que codificam os fragmentos de polipeptídeo também se sobrepõem. Como será óbvio para o versado na técnica, o número de fragmentos de polipeptídeos para polipeptídeos candidatos diferentes pode ser diferente. Isto é simplesmente porque pode, em alguns casos, ser mais conveniente projetar polinucleotídeos candidatos que tenham o mesmo comprimento, o número de polinucleotídeos candidatos que codificam fragmentos polipeptídicos sobrepostos do mesmo polipeptídeo sendo, portanto, uma função do comprimento do polipeptídeo candidato correspondente. Em outras modalidades, o número de fragmentos de polipeptídeo por polipeptídeo candidato pode ser o mesmo para todos os polipeptídeos candidatos, mas seus comprimentos podem ser diferentes.
[047] Em algumas modalidades, pode ser desejável abranger todos os fragmentos polipeptídicos possíveis de um determinado comprimento para um determinado polipeptídeo candidato. Em tais modalidades, os polinucleotídeos candidatos são projetados de tal forma que todos os polinucleotídeos candidatos que codificam fragmentos de polipeptídeo de um mesmo polipeptídeo candidato se sobrepõem ao longo de pelo menos algum de seu comprimento, tal como ao longo de pelo menos um códon. Para que a diversidade máxima seja alcançada, os polinucleotídeos candidatos que codificam fragmentos de polipeptídeo de um mesmo polipeptídeo candidato se sobrepõem de preferência, mas para um códon, de modo que todos os fragmentos de polipeptídeo de um mesmo polipeptídeo candidato se sobreponham, mas para um resíduo de aminoácido. Essa abordagem é ilustrada nos exemplos.
[048] Em outras modalidades, os polinucleotídeos candidatos que codificam fragmentos de polipeptídeo de um mesmo polipeptídeo candidato se sobrepõem, mas para dois códons, três códons, quatro códons, cinco códons ou mais. De preferência, os polinucleotídeos candidatos que codificam fragmentos de polipeptídeo de um mesmo polipeptídeo candidato sobrepõem- se em pelo menos um códon, como pelo menos dois códons, como pelo menos três códons.
[049] Em algumas modalidades, o fragmento de polipeptídeo tem um comprimento de entre 5 e 36 resíduos de aminoácidos, tal como entre 5 e 30 resíduos de aminoácidos. Em uma modalidade, o fragmento de polipeptídeo tem um comprimento de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36 resíduos.
[050] Em algumas modalidades, os fragmentos de polipeptídeo têm todos o mesmo comprimento. Em outras modalidades, os fragmentos de polipeptídeo têm comprimentos diferentes.
[051] Os polinucleotídeos que codificam os fragmentos de polipeptídeos de polipeptídeos candidatos devem ser inseridos no vetor viral que codifica a partícula viral na qual o fragmento de polipeptídeo deve ser exibido; de preferência, o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo. De preferência, o gene de capsídeo está fora do genoma viral, ou seja, não é flanqueado por sequências de TR ou ITR. Os capsídeos modificados resultantes, portanto, cada um exibe um fragmento de polipeptídeo. Os capsídeos foram estudados exaustivamente por um longo tempo e o versado na técnica não terá dificuldade em identificar posições adequadas para inserir um fragmento de polipeptídeo a ser exibido no capsídeo.
[052] Como o versado na técnica está ciente, nas modalidades em que a partícula viral é um AAV, o sítio de inserção está preferencialmente fora do domínio de lipase de VP1. Também deve estar preferencialmente fora da proteína ativadora de montagem (AAP). O sítio de inserção pode estar no terminal N de VP2. Também pode estar nos vértices de capsídeo montado, por exemplo, centrado em torno do resíduo de aminoácido 587 do gene Cap de AAV2 ou em torno do resíduo de aminoácido 588 do gene cap de AAV9.
[053] Em modalidades preferidas, o capsídeo exibindo os polipeptídeos candidatos não foi modificado de outra forma, isto é, sua sequência de aminoácidos é de outra forma idêntica ou essencialmente idêntica ao capsídeo nativo ou de tipo selvagem. Consequentemente, o comprimento da proteína de capsídeo exibindo o polipeptídeo é, em algumas modalidades, sempre maior do que o comprimento da proteína de capsídeo nativa não modificada. Em tais modalidades, nenhum fragmento de polipeptídeo de capsídeo nativo é substituído pelo polipeptídeo candidato e todos os resíduos de capsídeo nativo também estão presentes no capsídeo modificado exibindo o polipeptídeo candidato.
[054] Em modalidades em que o vetor viral é AAV2, os polinucleotídeos que codificam os fragmentos polipeptídicos de polipeptídeos candidatos podem ser, por exemplo, concebidos de modo que o fragmento polipeptídico resultante seja inserido entre os resíduos N587 e R588 da proteína de capsídeo VP1. Polinucleotídeos de código de barras
[055] Uma vez que o número de fragmentos polipeptídicos e, portanto, de polinucleotídeos candidatos, foi determinado, uma pluralidade de polinucleotídeos de código de barras é fornecida. Os polinucleotídeos do código de barras são exclusivos, conforme será detalhado a seguir. Será reconhecido pelo versado na técnica que os polinucleotídeos de código de barras têm, preferencialmente, uma sequência que não é encontrada em nenhum dos polinucleotídeos candidatos. Os polinucleotídeos de código de barras também devem preferencialmente não estar naturalmente presentes na célula que será usada como um sistema de produção, a fim de evitar ruído de fundo em etapas posteriores. Além disso, os polinucleotídeos de código de barras também não devem estar naturalmente presentes nas células hospedeiras nas quais a biblioteca deve ser expressa e rastreada nos métodos da presente divulgação. O comprimento mínimo dos polinucleotídeos de código de barras exclusivo dependerá do número de polinucleotídeos candidatos, como será evidente para o versado na técnica. Cada polinucleotídeo candidato está operacionalmente ligado a um único polinucleotídeo de código de barras. Assim, o número de polinucleotídeos de código de barras é pelo menos igual ao número de polinucleotídeos candidatos ou fragmentos. Por "operacionalmente ligado" entende-se que cada fragmento de polinucleotídeo candidato único está direta ou indiretamente conectado a um polinucleotídeo de código de barras único, desse modo também fornecendo uma ligação entre cada fragmento de polipeptídeo candidato e o polinucleotídeo de código de barras único correspondente. Assim, a identificação de um código de barras permite a identificação do fragmento de polinucleotídeo ou fragmento de polipeptídeo correspondente. Nenhum fragmento de polinucleotídeo de código de barras pode ser ligado a dois polinucleotídeos candidatos diferentes (e, portanto, indiretamente, dois fragmentos de polipeptídeos candidatos diferentes).
[056] Métodos para sintetizar polinucleotídeos de código de barras são conhecidos na técnica. Eles também podem ser encomendados de um fornecedor comercial.
[057] Uma vez que pares únicos de polinucleotídeos candidatos e polinucleotídeos de código de barras foram obtidos, cada par é inserido em um vetor viral para obter uma pluralidade de vetores virais, cada um compreendendo um único polinucleotídeo candidato operacionalmente ligado a um polinucleotídeo de código de barras. O vetor viral compreende pelo menos um gene de capsídeo, que pode ser providenciado fora do genoma viral ou em trans. Por "genoma viral" entende-se a parte do DNA viral que é empacotada em partículas virais que está localizada dentro das repetições terminais invertidas (ITRs) que delimitam o final da molécula de DNA, ou a parte do RNA viral que é empacotada em partículas, localizadas dentro de repetições terminais (TR), como as repetições terminais longas (LTR) que delimitam o final da molécula de RNA. O vetor viral também pode compreender um gene rep, que também pode ser providenciado em trans. O gene de capsídeo (cap) e/ou o gene rep podem, assim, ser providenciados em um plasmídeo de empacotamento ou como parte de um plasmídeo helper (figura 7).
[058] Os pares de polinucleotídeos candidatos e polinucleotídeos de código de barras podem ser inseridos no vetor viral simultaneamente ou sequencialmente. Como explicado acima, uma vez que o método visa a triagem de capsídeos modificados exibindo fragmentos de polipeptídeos, a fim de identificar polipeptídeos que conferem uma propriedade desejada a uma partícula viral, o polinucleotídeo candidato é preferencialmente inserido dentro do gene de capsídeo, que está fora do genoma viral. Em contraste, o polinucleotídeo de código de barras é preferencialmente inserido dentro do genoma viral, isto é, entre as repetições terminais, tais como repetições terminais longas ou repetições terminais invertidas. Sem estar limitado pela teoria, este projeto evita enriquecimentos clonais e remove o viés introduzido por PCR, que pode ser dependente da sequência. Ao sequenciar os códigos de barras do RNA, o potencial de polarização da PCR é reduzido e independente da sequência de capsídeo modificado. Além disso, a contagem de cópias por código de barras não influencia a leitura.
[059] O polinucleotídeo de código de barras pode estar sob o controle de um promotor, conforme descrito abaixo para os polinucleotídeos marcadores. De preferência, o polinucleotídeo de código de barras é introduzido no genoma viral de modo que possa ser transcrito e, opcionalmente, traduzido, quando a partícula viral infectou uma célula.
[060] Será claro a partir do acima que, embora o polinucleotídeo de código de barras e o polinucleotídeo candidato estejam operativamente ligados, eles não precisam ser contíguos em uma mesma molécula de ácido nucleico. Polinucleotídeo marcador
[061] O vetor viral compreende um polinucleotídeo marcador que codifica um marcador detectável. O marcador detectável permite monitorar o padrão de expressão das partículas virais.
[062] O polinucleotídeo marcador pode ser qualquer polinucleotídeo que após a transcrição produz uma molécula de mRNA estável que não é produzida naturalmente nas células hospedeiras nas quais a biblioteca de vetores virais deve ser introduzida a fim de identificar os polipeptídeos candidatos responsáveis por uma propriedade desejada, conforme detalhado abaixo. Em algumas modalidades, o polinucleotídeo marcador pode codificar um marcador detectável, como um marcador fluorescente, que pode ser visualizado ou de outra forma detectado após a expressão. O polinucleotídeo marcador também pode, em algumas modalidades, ser o próprio código de barras. Isto pode ser relevante, por exemplo quando é desejável identificar vetores virais que podem infectar células que expressam um sistema de recombinase, pelos métodos descritos, neste documento, abaixo. O sistema de recombinase pode ser uma recombinase Cre combinada com sítios loxP, um sistema CRISPR/Cas, como CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas13 ou CRISPR/Cpf1.
[063] Isto é ilustrado, a título de exemplo, na Fig. 8, onde a recombinase é uma recombinase Cre. Um vetor viral (neste documento um vetor AAV) compreendendo uma sequência de código de barras (BC) entre dois pares de sítios loxP em direções opostas é mostrado. A região compreendida nos sítios loxP também compreende um sítio de ligação para um primer de sequenciação universal (SPBS). Como é conhecido na técnica, se tal vetor for transcrito em uma célula que expressa a recombinase Cre, a recombinação entre os sítios loxP resultará na inversão da sequência compreendida entre eles. Em contraste, na ausência da expressão Cre, não haverá recombinação e nenhuma inversão. Os dois eventos podem ser discriminados ao nível do mRNA por sequenciação com um primer de ligação a SPBS e um primer de ligação a 5'UTR ou um primer de ligação a 3'UTR. Ao sequenciar os códigos de barras com primers de ligação ao 5'UTR e ao SPBS, podem ser mapeadas variantes de capsídeo com ampla infecciosidade não seletiva.
[064] Um sítio de poliadenilação pode ser inserido a jusante do gene marcador, como exemplificado na figura 8, de tal forma que a transcrição só seja encerrada se o sítio de poliadenilação estiver na transcrição direta, ou seja, a transcrição é encerrada apenas se não houver recombinação, no ausência de recombinase Cre. Portanto, as transcrições emitidas por essas células não terão um código de barras. Por outro lado, se Cre for expresso, a transcrição não será encerrada e as transcrições incluem um código de barras. O sequenciamento dos transcritos permite, portanto, discriminar entre os transcritos originários de células que expressam a recombinase Cre e os transcritos originados de células sem expressão da recombinase Cre.
[065] A recombinase Cre pode ser fornecida na célula por meio de um veículo, como um plasmídeo. Também pode estar compreendido no próprio vetor viral. Assim, apenas as células realmente infectadas com a partícula viral correspondente irão expressar a recombinase Cre. A recombinase Cre também pode ser expressa pelo próprio hospedeiro, por exemplo, ao triar a biblioteca em um animal transgênico.
[066] Deve ser entendido que a caixa marcada “gene marcador” na figura é opcional - conforme explicado acima, o próprio código de barras pode servir a função de marcador. Em modalidades em que está presente um marcador que é diferente do código de barras, deve-se notar que a expressão do marcador pode exigir que a recombinação aconteça, conforme exemplificado na figura, de modo que o marcador esteja a jusante do promotor e na direção certa.
[067] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo marcador codifica um polipeptídeo marcador. O polipeptídeo marcador pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em: uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, um gene de resistência a antibióticos, um gene citotóxico, um receptor de superfície, β-galactosidase, o receptor TVA (o receptor celular para o subgrupo A do vírus da leucose aviária), pró-mitóticos/oncogenes, transativadores, fatores de transcrição e proteínas Cas. Numerosos exemplos de polipeptídeos marcadores ou polinucleotídeos adequados são conhecidos do versados na técnica.
[068] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo de código de barras é diferente do polinucleotídeo marcador e está localizado na região 3' não traduzida (3'-UTR) do polinucleotídeo marcador. O polinucleotídeo de código de barras pode, mesmo se não for usado como marcador principal, ainda servir a função de polinucleotídeo marcador adicional.
[069] Em algumas modalidades, o polinucleotídeo marcador é otimizado por códons com base nas preferências de códons das células alvo nas quais a biblioteca de vetores virais deve ser rastreada.
[070] O polinucleotídeo marcador pode estar sob o controle de um promotor. Por conseguinte, em algumas modalidades, o polinucleotídeo marcador compreende ainda uma sequência promotora. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou um promotor induzível. Quando o polinucleotídeo de código de barras não é o polinucleotídeo marcador, o polinucleotídeo de código de barras pode estar sob o controle do mesmo promotor que o polinucleotídeo marcador.
[071] O polinucleotídeo marcador pode ser orientado de tal maneira em relação ao promotor que a transcrição só seja possível se a célula expressar um sistema de recombinase, como explicado acima. O polinucleotídeo marcador pode compreender um sítio de poliadenilação, que pode ser orientado de tal forma que termina a transcrição apenas em uma direção, como explicado acima para a figura 8.
[072] A escolha do promotor pode ser direcionada pela natureza da propriedade desejada que se deseja pesquisar na biblioteca. Exemplos de promotores são: fosfoglicerato quinase (PGK), beta actina de frango (CBA), citomegalovírus (CMV) estimulador precoce/β actina de frango (CAG), híbrido CBA (CBh), enolase neurônio específico (NSE), tirosina hidroxilase (TH), triptofano hidroxilase (TPH), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), membro da família L1 aldeído desidrogenase 1 (ALDH1L1), sinapsina- 1, citomegalovírus (CMV), histona 1 (H1), RNA spliceossomo U6 (U6), calmodulina dependente da proteína quinase II (CamKII), fator de alongamento 1-alfa (Ef1a), caixa forkhead J1 (FoxJ1) ou promotores da proteína glial fibrilar ácida (GFAP). Os promotores CMV, H1, U6, CamKII, Ef1a, FoxJ1 e GFAP são conhecidos por serem adequados para a expressão de polinucleotídeos no sistema nervoso central. Vetores virais
[073] Os vetores virais que são adequados para modificação pelos métodos divulgados neste documento compreendem vetores derivados de um vírus adeno-associado viral (AAV), um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, um vírus herpes simplex, um bocavírus e um vírus da raiva. De preferência, o vetor viral é derivado de um vírus que é adequado para a entrega de um transgene a uma célula alvo. O transgene pode ser um gene usado em métodos de terapia gênica, ou pode ser um gene que codifica um produto de interesse que pode ser desejável produzir na célula alvo. Sistema de amplificação
[074] Uma vez que a pluralidade de vetores virais foi construída, ela é introduzida em um sistema de amplificação. Isso permite que várias cópias de cada vetor viral sejam produzidas. O sistema de amplificação é qualquer população de células adequada para o propósito, como é conhecido pelo versado na técnica. De preferência, o sistema de amplificação é uma população de células procarióticas, por exemplo, um sistema bacteriano, por exemplo, Escherichia coli.
[075] O sistema de amplificação pode ser usado para manter a biblioteca, ou seja, pode ser usado para preservar uma parte da biblioteca contendo pelo menos um de cada um dos vetores virais da biblioteca, em tais condições que os vetores virais possam ser recuperados do sistema de amplificação. Por exemplo, as células do sistema de amplificação contendo a biblioteca podem ser congeladas e armazenadas a -80°C. As alíquotas podem ser retiradas do sistema de amplificação armazenado para amplificar ainda mais a biblioteca e, opcionalmente, para recuperar os vetores virais por métodos conhecidos na técnica. Sistema de referência
[076] A fim de determinar como cada polinucleotídeo candidato (e, portanto, cada fragmento de polipeptídeo) está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo de código de barras, uma primeira parte da pluralidade de vetores virais é recuperada do sistema de amplificação acima e transferida para um sistema de referência. O sistema de referência é uma população de células a partir da qual os vetores virais podem ser analisados posteriormente. De preferência, o sistema de referência é uma população de células bacterianas. O sistema de referência é usado para mapear a correspondência entre o polinucleotídeo candidato e o polinucleotídeo do código de barras. Esta etapa de mapeamento pode ser realizada de várias maneiras, por exemplo, recuperando vetores virais do sistema de referência e subsequentemente sequenciando uma região de cada vetor viral, onde a região sequenciada compreende preferencialmente pelo menos o polinucleotídeo de código de barras e o polinucleotídeo candidato.
[077] Em algumas modalidades, uma tabela de consulta é gerada, listando qual polinucleotídeo de código de barras está ligado a qual polinucleotídeo candidato e, portanto, a qual fragmento de polipeptídeo. Um exemplo de como fazer isso é ilustrado no exemplo 1 e na figura 1B. Após a recombinação Cre seguida pela adição baseada em emPCR de adaptadores de sequenciamento Illumina, todo o conjunto de polinucleotídeos candidatos operacionalmente ligados aos polinucleotídeos de código de barras aleatório foi sequenciado por sequenciamento de extremidade pareada, obtendo assim uma tabela de consulta ligando cada fragmento de polipeptídeo a um código de barras exclusivo polinucleotídeo. Outros métodos para gerar uma tabela de consulta serão evidentes para o versado na técnica.
[078] Assim, o uso paralelo de um sistema de amplificação e um sistema de referência permite a geração de preparações de vetores virais simultaneamente com o mapeamento da correspondência entre cada código de barras e cada fragmento de polipeptídeo. Sistema de Produção
[079] A fim de fabricar uma biblioteca de partículas virais a partir da biblioteca de vetores virais, pode ser necessário um sistema de produção. O sistema de produção compreende uma célula e pode compreender adicionalmente plasmídeos ou vetores compreendendo os elementos necessários para os vetores virais se replicarem e/ou produzirem partículas virais se esses elementos não estiverem incluídos nos próprios vetores virais, como é conhecido na técnica. Parte da pluralidade de vetores virais pode, assim, ser recuperada do sistema de amplificação descrito acima, de modo que a referida parte compreenda pelo menos um de cada um dos vetores virais da biblioteca e possa, subsequentemente, ser transferida para um sistema de produção para obter uma pluralidade de partículas virais.
[080] O sistema de produção pode compreender ou consistir em uma célula de mamífero, por exemplo, uma célula humana, uma célula de inseto, como uma célula SF9, ou uma célula de levedura, como uma célula de Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a célula de mamífero é uma célula Hela, um neurônio primário, um neurônio induzido, um fibroblasto, uma célula-tronco embrionária, uma célula-tronco pluripotente induzida ou uma célula embrionária, como uma célula renal embrionária, por exemplo, células HEK293.
[081] O sistema de produção pode compreender ainda vetores, por exemplo, plasmídeos, necessários para produzir as partículas virais na célula. A Figura 7 mostra vários desses sistemas de plasmídeo exemplificados para a produção de um vírus de DNA. Os sistemas típicos são baseados em três plasmídeos: - Um plasmídeo de transferência contendo a sequência genética empacotada nos vírions produzidos. A sequência é flanqueada por repetições terminais invertidas para serem replicadas e inseridas no capsídeo. Este plasmídeo também pode conter um gene de interesse direcionado por um promotor, uma região 3' não traduzida (3'UTR) e uma sequência de poliadenilação. - Um plasmídeo de empacotamento, compreendendo os genes Rep e Cap, frequentemente sob o controle de um promotor forte. - Um plasmídeo helper, que fornece os genes restantes necessários para a produção viral. No caso de um AAV, estes podem ser E4, E2a e VA, e opcionalmente E1a e E1b - alguns desses genes podem, no entanto, ser expressos diretamente na célula hospedeira.
[082] Outros sistemas baseados em dois plasmídeos compreendem um plasmídeo de transferência como acima, e um plasmídeo correspondente ao plasmídeo de empacotamento e ao helper. Esses sistemas permitem a produção de vírus deficientes na replicação de uma maneira simplificada.
[083] Uma terceira abordagem desenvolvida pelos inventores é particularmente adequada para os métodos de triagem divulgados neste documento. O empacotamento e os plasmídeos de transferência são combinados em um plasmídeo funcional, o que fornece os genes Rep e Cap e o genoma flanqueado por TR ou ITR a serem inseridos no vírion, mas ainda garante que o vetor seja deficiente para replicação. O plasmídeo helper é como descrito acima, ou seja, fornece os genes restantes necessários para a produção viral. Em modalidades particulares, o sistema de produção compreende assim uma célula, um plasmídeo fornecendo os genes Rep e Cap e o genoma flanqueado por TR ou ITR e um plasmídeo helper fornecendo os genes restantes necessários para a produção viral. Diversidade
[084] Usando os presentes métodos, é assim possível conceber bibliotecas com uma elevada diversidade, como ilustrado no exemplo 1. A diversidade irá normalmente aumentar proporcionalmente ao número de fragmentos de polipeptídeos de polipeptídeos candidatos. Também é possível aumentar ainda mais a diversidade da biblioteca projetando diferentes polinucleotídeos para cada fragmento de polipeptídeo. Da mesma forma, os polinucleotídeos que codificam fragmentos de polipeptídeos mutantes, correspondentes aos polipeptídeos candidatos compreendendo um ou mais resíduos mutados em comparação com o polipeptídeo nativo, também podem ser incluídos na biblioteca.
[085] Em algumas modalidades, pode ser desejável obter uma biblioteca de partículas virais com fragmentos polipeptídicos de um pequeno subconjunto de proteínas, sendo tão baixo quanto apenas uma proteína, a fim de mapear sistematicamente os domínios funcionais da referida proteína. Esta abordagem foi usada com sucesso pelos inventores para identificar regiões de APP e Tau, proteínas conhecidas por estarem envolvidas na doença de Alzheimer, que conferem transporte retrógrado, como mostrado no exemplo 3.
Projetar e fabricar vetores virais e partículas virais com uma propriedade desejada
[086] A presente divulgação, portanto, também fornece métodos para projetar e fabricar vetores virais com uma propriedade desejada, o referido método compreendendo as etapas i) a v) conforme descrito neste documento acima, e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperação de uma fração de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) acima, ou recuperação de pelo menos parte das partículas virais do sistema de produção da etapa v) b) acima e contato de uma população de células com os referidos vetores virais recuperados ou partículas virais; vii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; viii) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células selecionadas na etapa vii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; ix) projetar um vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa viii).
[087] Em algumas modalidades, o vetor viral da etapa ix) é amplificado em um sistema de amplificação, conforme descrito acima.
[088] Em alguns aspectos, o vetor viral compreende ainda um transgene a ser entregue a uma célula hospedeira e é produzido em um sistema de produção, obtendo assim uma partícula viral com a propriedade desejada.
[089] Também é providenciado um método de fabricação de uma partícula viral com uma propriedade desejada, o referido método compreendendo as etapas i) a v) acima e compreendendo ainda as etapas de:
vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células em contato com os vetores virais recuperados ou partículas virais recuperados obtidas na etapa vi); viii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; ix) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células identificadas na etapa viii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; x) projetar um vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa ix); xi) produzir o vetor viral da etapa x)em um sistema de amplificação ou em um sistema de produção, obtendo assim a partícula viral com a propriedade desejada.
[090] Consequentemente, são providenciados métodos para identificar os polipeptídeos candidatos responsáveis por uma propriedade desejada e usar os referidos polipeptídeos candidatos para projetar e fabricar vetores virais e partículas com uma propriedade desejada. Propriedade desejada
[091] Como será evidente a partir dos exemplos abaixo, a propriedade desejada pode ser qualquer propriedade que seja desejável para um determinado pedido. Os presentes métodos permitem, assim, a identificação e subsequente projeto e produção de vetores virais e partículas virais correspondentes, com base na identificação dos polipeptídeos candidatos que, quando introduzidos em um capsídeo, conferem uma ou mais das seguintes propriedades: - afinidade para uma determinada estrutura celular, como uma estrutura específica para um determinado tipo de células, como uma sinapse, ou para uma estrutura específica para um determinado evento celular, como divisão celular, diferenciação celular, ativação neuronal, inflamação ou dano ao tecido; - propriedades de transporte aprimoradas, tais como transporte aprimorado no ambiente em torno da célula hospedeira ou transporte aprimorado através da barreira hematoencefálica; - aumento da capacidade de escapar do metabolismo hepático; - maior capacidade de evadir o sistema imunológico; - aumento da capacidade de ativar o sistema imunológico. Os presentes métodos podem assim ser usados para identificar fragmentos polipeptídicos que, quando inseridos no capsídeo de uma partícula viral, podem, por exemplo, modificar o tropismo da partícula, sua infecciosidade ou seu transporte no ambiente em torno de um sítio de injeção.
[092] Os inventores, usando os presentes métodos e conforme ilustrado nos exemplos, selecionaram polipeptídeos conhecidos por terem afinidade para sinapses para projetar uma biblioteca de vetor viral. A biblioteca foi então rastreada para identificar os polipeptídeos que conferem infecciosidade significativamente aprimorada em comparação com um capsídeo mutado tendo perdido o tropismo para células HEK293T in vitro. Da mesma biblioteca, capsídeos modificados foram identificados como tendo infectividade aprimorada em relação aos neurônios corticais primários ou capacidade de transporte retrógrado aprimorada.
[093] A presente divulgação, portanto, também fornece um método para melhorar uma propriedade desejada para uma partícula viral compreendendo um capsídeo modificado pela inserção do referido polipeptídeo nele, o referido método compreendendo as etapas i) a v) acima, e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador; viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo tendo um perfil de expressão do marcador correspondente à propriedade.
[094] O vetor viral de referência ou a partícula viral de referência podem ser preferencialmente idênticos ao vetor viral modificado ou à partícula viral modificada, com a notável exceção de capsídeo. De preferência, o capsídeo do vetor ou partícula viral de referência não é modificado. População celular e células-alvo
[095] Em uma etapa subsequente, a biblioteca de partículas virais é testada em uma população de células. A natureza da propriedade desejada será importante para determinar a natureza da população de células que deve ser contatada com a pluralidade de partículas virais da biblioteca, a fim de identificar as partículas que possuem a propriedade desejada. Por exemplo, se a propriedade desejada é o aumento do tropismo para tipos específicos de células, por exemplo, do sistema nervoso central, a população de células deve compreender os referidos tipos específicos de células.
[096] A biblioteca de partículas pode ser contatada com uma população de células in vitro ou in vivo. A biblioteca de partículas virais pode, por exemplo, ser injetada em um animal ou humano, por exemplo, em um sítio de injeção específico, ou pode simplesmente ser colocada em contato com uma cultura de células.
[097] É então possível monitorar a expressão do marcador e selecionar as células onde a expressão do marcador segue o padrão esperado ou desejado. Isso pode ser feito por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, se um marcador fluorescente for usado, as células podem ser monitoradas quanto à emissão fluorescente, após o que o RNA é extraído das células para identificar os códigos de barras expressos. O RNA também pode apenas ser extraído das células alvo e os polinucleotídeos do código de barras podem ser posteriormente identificados por sequenciamento.
[098] Uma vez que os polinucleotídeos de código de barras estão cada um operacionalmente ligados a um único fragmento de polipeptídeo, a identificação do polinucleotídeo de código de barras permite a identificação dos fragmentos de polipeptídeo responsáveis pelo padrão de expressão desejado. Os referidos fragmentos de polipeptídeo podem então ser usados para projetar vetores virais que codificam partículas virais modificadas com um capsídeo modificado, inserindo o polinucleotídeo que codifica o fragmento de polipeptídeo relevante no capsídeo de modo que seja exibido na superfície da partícula, alterando assim as propriedades de capsídeo nativo, conforme descrito acima. Os vetores ou partículas virais modificados não requerem a presença do polinucleotídeo de código de barras. Alternativamente, os vetores virais ou partículas virais que exibem as propriedades desejadas podem ser recuperados diretamente da população de células em que são testados.
[099] As partículas virais modificadas podem então ser amplificadas em um sistema de amplificação e/ou produzidas em um sistema de produção, conforme descrito acima. Entrega de um transgene a uma célula-alvo
[100] Os métodos divulgados neste documento podem, assim, ser usados para projetar partículas virais modificadas compreendendo um capsídeo modificado pela inserção de um polipeptídeo que confere uma propriedade desejada, onde as partículas virais modificadas são particularmente bem adequadas para a entrega de um transgene a uma célula alvo.
[101] Pelo termo "transgene" deve ser entendido como se referindo a um polinucleotídeo que compreende um gene isolado de um organismo e a ser introduzido em um organismo diferente. Um transgene, portanto, não é nativo da célula-alvo.
[102] Consequentemente, as presentes partículas virais modificadas podem encapsular um transgene para ser entregue a uma célula alvo. Após a injeção do vetor viral modificado ou partícula viral em um sítio de injeção, ou após o contato com uma população de células compreendendo a célula-alvo, o transgene é entregue à célula-alvo. Deve-se notar que a célula alvo não precisa estar na vizinhança do sítio da injeção, desde que o vetor viral modificado ou partícula viral modificada seja capaz de ser transportado para a célula alvo a partir do sitio da injeção. O termo "sítio de injeção" deve ser entendido em seu sentido amplo, ou seja, pode se referir a um sítio de um organismo ao qual os vetores ou partículas são injetados, ou pode simplesmente se referir a uma população de células compreendendo as células alvo que é desejável para infectar com os vetores ou partículas em contato com os mesmos.
[103] Assim, também são divulgadas neste documento partículas virais modificadas para entrega de um transgene a uma célula alvo, compreendendo um gene de capsídeo modificado e um transgene a ser entregue à célula alvo. Os vetores virais que codificam tais partículas virais também são divulgados.
[104] Por conseguinte, o uso das partículas virais modificadas divulgadas neste documento, que podem compreender um capsídeo modificado, conforme detalhado abaixo, para um método de tratamento que compreende ou consiste em uma etapa de terapia gênica também é proporcionada.
[105] De preferência, as partículas virais modificadas apresentam propriedades aprimoradas em comparação com uma partícula viral não modificada, isto é, uma partícula viral que compreende um gene de capsídeo nativo não modificado. As propriedades aprimoradas podem ser qualquer uma das propriedades listadas acima.
[106] A partícula viral modificada pode ser derivada de um vírus adeno-associado (AAV), um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, um vírus herpes simplex, um bocavírus ou um vírus da raiva.
[107] A partícula viral modificada pode compreender um capsídeo modificado conforme divulgado neste documento, em particular um capsídeo modificado compreendendo ou consistindo em um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo um amino resíduo de ácido foi excluído, modificado ou substituído. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo dois resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo três resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. A variante pode ser uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ
ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50. Transgene
[108] A natureza do transgene será tipicamente direcionada pelo resultado desejado.
[109] O transgene pode ser um gene útil para terapia gênica, por exemplo, um gene de "substituição" ou "correção" que substitui um gene que é deficiente em um indivíduo. O transgene também pode codificar uma proteína ou um transcrito que após a expressão pode compensar um mecanismo deficiente na célula alvo. O transgene também pode ser usado para derrubar ou reduzir a expressão de um gene que causa uma doença. Isso pode ser por meio de inibição se o transgene codificar um RNA silenciador. Abaixo estão listados alguns exemplos de genes que podem ser direcionados por transgenes usando os presentes vetores para tratar ou aliviar sintomas de doenças do sistema nervoso, a título de ilustração.
[110] O transgene pode ser um gene envolvido na síntese de dopamina, que pode ser útil para aliviar os sintomas da doença de Parkinson, por exemplo, genes que codificam tirosina hidroxilase, aminoácido aromático descarboxilase (AADC), GTP-ciclo-hidrolase 1 (GCH1) ou mono vesicular transportador de amina 2 (VMAT2). O transgene também pode ser um gene neuroprotetor, que pode ser desejável expressar, por exemplo, em pacientes que sofrem de doença de Parkinson, como Nurr1, GDNF, neurturina (NRTN), CNDF ou MANF. O transgene pode, após a expressão, resultar em knock- down ou correção de genes que causam a doença de Parkinson, por exemplo, alfa-sinucleína (SNCA), LRRK2, Pink1, PRKN, GBA, DJ1, UCHL1, MAPT, ATP13A2 ou VPS35.
[111] Exemplos de genes que podem ser eliminados ou corrigidos em pacientes com Alzheimer são APP, MAPT, SPEN1 e PSEN2. Em pacientes com doença de Huntington, o gene HTT (que codifica para huntingtina) pode ser eliminado ou corrigido pela liberação do transgene. Em pacientes que sofrem de ataxia espinocerebelar, a ataxina 1, 2, 3, 7 ou 10, PLEKHG4, SPTBN2, CACNA1A, IOSCA, TTBK2, PPP2R2B, KCNC3, PRKCG, ITPR1, TBP, KCND3 ou FGF14 pode ser derrubado ou corrigido após a entrega expressão do transgene. Na atrofia de múltiplos sistemas, SNCA ou COQ2 podem ser alvos relevantes para derrubada ou correção. Na esclerose lateral amiotrófica, o transgene pode levar à superexpressão ou correção de C9orf72, SOD1, TARDBP ou FUS. SMN1, SMN2, UBA1, DYNC1H1 ou VAPB são alvos para derrubada ou correção em pacientes com atrofia muscular espinhal. DMD é um alvo para superexpressão ou correção na distrofia muscular de Duchenne. O transgene pode permitir a correção de ABCA13, C4A, DGCR2, DGCR8, DRD2, MIR137, NOS1AP, NRXN1, OLIG2, RTN4R, SYN2, TOP3B, YWHAE ou ZDHHC8 em pacientes esquizofrênicos. Galanina, NPY, somatostatina ou KCNA1 podem ser alvos de superexpressão em pacientes epilépticos. O transgene pode permitir a superexpressão de p11, PDE11a, rodopsinas de canal ou receptores quimogenéticos em indivíduos que sofrem de depressão.
[112] O transgene pode, em outras modalidades, ser um agente imunogênico, por exemplo, a partícula viral modificada pode ser usada para direcionar células do sistema imunológico para imunizar um indivíduo a um determinado epítopo.
[113] São divulgadas, neste documento, partículas virais modificadas compreendendo um capsídeo modificado, em que o capsídeo modificado compreende ou consiste em um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50. Também são divulgados vetores virais modificados que codificam as referidas partículas virais modificadas. Em uma modalidade, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou SEQ ID NO: 50.
[114] Tais capsídeos modificados podem compreender qualquer um dos fragmentos polipeptídicos acima, ou variantes dos mesmos, isto é, fragmentos polipeptídicos modificados, em que no máximo um, tal como no máximo dois, tal como no máximo três resíduos de aminoácidos foram deletados, modificados ou substituídos.
[115] Por conseguinte, em algumas modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo um resíduo de aminoácido foi excluído, modificado ou substituído. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo dois resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo três resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. A variante pode ser uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50.
[116] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO: 51 a SEQ ID NO: 100. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo em uma sequência selecionada de SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99 ou SEQ ID NO: 100.
[117] Como é conhecido na técnica, o transgene pode ser inserido no genoma viral, isto é, entre as sequências de repetição terminal, tais como repetições terminais longas ou sequências de repetição terminais invertidas, delimitando o genoma viral. Células alvo
[118] As células a serem direcionadas para a entrega do transgene são preferencialmente células nas quais a expressão do transgene é desejada. As células alvo podem ser, por exemplo, neurônios, tais como neurônios corticais e/ou neurônios do hipocampo e/ou córtex entorrinal e/ou cerebelo e/ou da medula espinhal e/ou no foco epiléptico e/ou do núcleo accumbens e/ou dos Habenula; células da glia, em particular no caudato-putâmen e/ou na substância negra e/ou no córtex cerebral e/ou na área do enfarte; Neurônios DA, em particular da substância negra e da área tegmental ventral; ou miócitos musculares.
[119] Bibliotecas de vetores virais modificados podem ser triados como descrito acima, onde a propriedade aprimorada que é selecionada é o aumento da infecciosidade e/ou tropismo para uma célula alvo, em particular as células alvo listadas acima. Métodos de Tratamento
[120] Também é fornecido neste documento um vetor viral modificado, conforme divulgado em qualquer lugar neste documento, ou uma partícula viral modificada, conforme divulgado neste documento, para uso em um método de tratamento ou profilaxia de um distúrbio.
[121] A partícula viral modificada exibe um polipeptídeo que pode, por exemplo, resultar em aumento da infecciosidade das células a serem direcionadas para distribuição de um transgene que pode ser útil para o tratamento ou prevenção do referido distúrbio.
[122] Consequentemente, neste documento, é divulgado um método de tratamento ou profilaxia de uma doença ou distúrbio, compreendendo as etapas de administração de um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada, conforme descrito neste documento, a um sujeito em necessidade, o referido vetor viral modificado ou partícula compreendendo um transgene. De preferência, a partícula viral modificada tem maior tropismo e/ou infecciosidade para a célula alvo à qual o transgene deve ser entregue do que uma partícula viral não modificada correspondente com um capsídeo não modificado.
[123] A partícula viral modificada pode compreender um capsídeo modificado conforme divulgado neste documento, em particular um capsídeo modificado compreendendo ou consistindo em um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo um amino resíduo de ácido foi excluído, modificado ou substituído. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo dois resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo três resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. A variante pode ser uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50.
[124] O sujeito em necessidade pode ser um sujeito sofrendo, suspeito de sofrer ou em risco de sofrer de uma doença ou distúrbio.
[125] Em algumas modalidades, a doença é doença de Parkinson. O transgene pode codificar tirosina hidroxilase, aminoácido descarboxilase aromático (AADC), GTP-ciclo-hidrolase 1 (GCH1) ou transportador vesicular mono-amina 2 (VMAT2); as células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios e/ou células gliais no putâmen caudado e/ou na substância negra. O transgene pode levar à superexpressão de genes neuroprotetores, como Nurr1, GDNF, neurturina (NRTN), CNDF ou MANF; as células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios e/ou células gliais no putâmen caudado e/ou na substância negra. O transgene pode levar ao knock-down ou correção de alfa- sinucleína (SNCA), LRRK2, Pink1, PRKN, GBA, DJ1, UCHL1, MAPT, ATP13A2, VPS35; células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios DA da substância negra e a área tegmental ventral.
[126] Em outras modalidades, a doença é a doença de Alzheimer e o transgene leva ao knock-down ou correção de APP, MAPT, SPEN1 ou PSEN2. As células alvo preferidas para tais modalidades são os neurônios do hipocampo e do córtex entorrinal.
[127] Em outras modalidades, a doença é a doença de Huntington e o transgene derruba ou corrige o HTT. As células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios e/ou células gliais no putâmen caudado e/ou no córtex cerebral.
[128] Em outras modalidades, a doença é ataxia espinocerebelar e o transgene derruba ou corrige a ataxina 1, 2, 3, 7 ou 10, PLEKHG4, SPTBN2, CACNA1A, IOSCA, TTBK2, PPP2R2B, KCNC3, PRKCG, ITPR1, TBP, KCND3 ou FGF14. As células alvo preferidas para tais modalidades são os neurônios do cerebelo.
[129] Em outras modalidades, a doença é a atrofia de múltiplos sistemas e o transgene derruba ou corrige SNCA ou COQ2. As células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios e/ou células gliais no putâmen caudado e/ou no córtex cerebral
[130] Em outras modalidades, o distúrbio é esclerose lateral amiotrófica e o transgene leva à superexpressão ou correção de C9orf72, SOD1, TARDBP ou FUS. As células alvo preferidas para tais modalidades são os neurônios da medula espinhal.
[131] Em outras modalidades, o distúrbio é atrofia muscular espinhal e o transgene leva ao knock-down ou correção de SMN1, SMN2, UBA1, DYNC1H1 ou VAPB. As células alvo preferidas para tais modalidades são os neurônios da medula espinhal.
[132] Em outras modalidades, o distúrbio é distrofia muscular de Duchenne e o transgene leva à superexpressão ou correção de DMD. As células alvo preferidas para tais modalidades são miócitos musculares.
[133] Em outras modalidades, o distúrbio é esquizofrenia e o transgene leva à correção de ABCA13, C4A, DGCR2, DGCR8, DRD2, MIR137, NOS1AP, NRXN1, OLIG2, RTN4R, SYN2, TOP3B, YWHAE ou ZDHHC8. As células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios corticais.
[134] Em outras modalidades, o distúrbio é epilepsia e o transgene leva à superexpressão de galanina, NPY, somatostatina ou KCNA1. As células alvo preferidas para tais modalidades são neurônios no foco epiléptico.
[135] Em outras modalidades, o distúrbio é depressão e o transgene leva à superexpressão de p11, PDE11a; as células alvo preferidas para tais formas de realização são neurônios do núcleo accumbens; ou o transgene leva à superexpressão de rodopsinas de canal ou receptores quimiogenéticos; as células alvo preferidas para tais modalidades são os neurônios de Habenula. Triagem da droga
[136] Os vetores virais modificados e partículas obteníveis pelos métodos divulgados neste documento também podem ser úteis para uma série de pedidos adicionais, incluindo triagem de drogas.
[137] Em um aspecto, é fornecido um método para identificar uma droga tendo um efeito desejado, o referido método compreendendo as etapas de: a) Fornecer uma droga candidata; b) Administrar a droga candidata a uma célula;
c) Fornecer uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado permitindo a distribuição da partícula viral para a célula de b) e um polinucleotídeo marcador; d) Monitorar e comparar a expressão e/ou localização do polipeptídeo marcador na presença e ausência da droga candidata; determinar assim se a droga candidata tem um efeito na expressão do polinucleotídeo marcador.
[138] A partícula viral modificada pode compreender um capsídeo modificado conforme divulgado neste documento, em particular um capsídeo modificado compreendendo ou consistindo em um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo um amino resíduo de ácido foi excluído, modificado ou substituído. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo dois resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. Em outras modalidades, o capsídeo modificado compreende um polipeptídeo que é uma variante de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50, em que no máximo três resíduos de aminoácidos foram excluídos, modificados ou substituídos. A variante pode ser uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50.
Mapeamento funcional de domínios de proteínas
[139] Os vetores virais modificados e partículas obtidas pelos métodos descritos neste documento podem ser usados para realizar o mapeamento funcional de domínios de proteína. Isso é ilustrado no exemplo 5.
[140] Pelos presentes métodos, fragmentos de polipeptídeos de polipeptídeos conhecidos ou suspeitos de estarem envolvidos em um determinado mecanismo ou distúrbio podem ser usados para fabricar uma biblioteca de capsídeos modificados, onde os capsídeos modificados exibem diferentes regiões dos polipeptídeos.
[141] Por conseguinte, é fornecido neste documento um método de identificação de uma ou mais regiões de um polipeptídeo que confere uma propriedade desejada a uma partícula viral compreendendo um capsídeo modificado pela inserção do referido polipeptídeo nele, o referido método compreendendo as etapas i) a v) acima e compreendendo ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador; viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo com um perfil de expressão do marcador correspondente à propriedade desejada, identificando assim a região do polipeptídeo responsável pela referida propriedade.
[142] Para tais pedidos, como será evidente para os versados na técnica, quanto maior o número de fragmentos de polipeptídeos exibidos pela biblioteca de capsídeo e/ou quanto maior a sobreposição entre os fragmentos de polipeptídeos individuais, mais preciso será o mapeamento funcional. Consequentemente, em algumas modalidades, cada polipeptídeo é representado por uma série de fragmentos de polipeptídeo de tal forma que os fragmentos de polipeptídeo se sobrepõem por todos, exceto um resíduo de aminoácido.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Projeto e geração de biblioteca AAV altamente diversa e triagem para função de transporte retrógrado Materiais e métodos Clonagem de plasmídeo de estrutura de biblioteca AAV
[143] O plasmídeo de base usado para clonar os capsídeos de AAV modificados tipo código de barras foi desenvolvido a partir de um vetor AAV auto-complementar (scAAV) que expressa GFP (pscAAV-GFP24) and pDG25 (com deleções dos genes de adenovírus VA, E2A e E4). O plasmídeo final continha um cassete de expressão de eGFP conduzido por um promotor CMV e o genoma AAV2 de tipo selvagem com o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV). Primeiro, os sítios XbaI, BsiWI e MluI foram inseridos entre os sítios XhoI e HindIII em pscAAV-GFP [Addgene # 32396]. Em segundo lugar, um sítio NheI foi introduzido entre as sequências de N587 e R588 da proteína da cápside VP1 por PCR26 de extensão de sobreposição usando pDG modificado como molde. Além do sítio NheI, o produto final de PCR também continha um sítio BsiWI e um sítio MluI para facilitar a clonagem subsequente e a inserção LoxP-JTZ17 (para recombinação Cre e sequenciamento de próxima geração da biblioteca final). Finalmente, o pscAAV-GFP modificado foi digerido usando XbaI e MluI, o produto de PCR de extensão de sobreposição foi digerido com MluI e BsiWI e o pDG foi digerido por BsiWI e XbaI. Os três fragmentos de DNA foram então ligados para adquirir o plasmídeo de estrutura final para a biblioteca AAV. Seleção de proteínas para exibição de peptídeos
[144] Os candidatos a peptídeos a serem inseridos eram derivados de proteínas conhecidas relacionadas a neurônios. Foram selecionadas 131 proteínas, pertencentes a cinco categorias; vírus neurotrópicos, lectinas, neurotrofinas, neurotoxinas e proteínas neuronais. A seleção da proteína candidata foi baseada na interação conhecida entre as proteínas e os neurônios na ligação e nos diferentes estágios do processo de infecção e replicação de AAV (por exemplo, internalização, tráfico endossomal, importação nuclear, etc.). Os peptídeos foram concebidos para serem 11, incorporados entre N587 e R588 da proteína de capsídeo VP1 um sítio que 14, anteriormente foi relatado como tolerando a inserção de peptídeos grandes 27 12, 13 e bloqueia a ligação do proteoglicano de sulfato de heparano . Quatro conformações peptídicas diferentes foram concebidas como: A-14aa-A, A- 22aa-A, A5-14aa-A5, G4S-14aa-G4S. Eles continham dois comprimentos de peptídeos de 14 ou 22 resíduos de aminoácidos (aa) e eram flanqueados por um espaçador de um aminoácido de alanina (A) ou um ligante curto (A5 ou 28, 29. G4S) Todos os possíveis peptídeos únicos de 14 ou 22 aa das proteínas candidatas foram identificados e gerados por uma abordagem de janela deslizante usando o programa R. A biblioteca de peptídeos foi traduzida reversamente para oligonucleotídeos usando otimização de códons para expressão de alto nível em células HEK293. Síntese e amplificação de oligonucleotídeos da matriz
[145] O conjunto final de oligonucleotídeos contendo 92.918 oligonucleotídeos únicos foi sintetizado usando 90k DNA da matriz (Custom Array), que codificava todos os peptídeos únicos possíveis de A-14aa-A, e peptídeos selecionados das outras três conformações de peptídeos.
[146] O agrupamento de oligonucleotídeos foi amplificado e preparado para montagem de Gibson em uma emulsão PCR com longo tempo de extensão para reduzir artefatos de PCR 17, 30.
[147] A mistura de PCR foi preparada usando polimerase de DNA de alta fidelidade PhusionTM Hot Start II (Thermofisher) de acordo com a recomendação do fabricante com exceção da adição de 0,5 µg/µl de BSA (NEB). Resumidamente, 9 volumes de uma mistura de óleo surfactante (92,95% de óleo mineral, 7% de ABIL WE e 0,05% de Triton X-100) foram adicionados à mistura de PCR e uma emulsão foi criada por homogeneização por 5 min a uma velocidade de 4 m/s usando MP FastPrep-24 Tissue and Cell Homogenizer (MP Biomedicals). O programa de PCR usado para o PCR de emulsão foi; 1 ciclo de 30s a 98°C, 30 ciclos de 5s a 98°C, 30s a 65°C e 2 min (8 vezes do tempo de extensão regular) a 72°C e, finalmente, 1 ciclo de 5 min a 72°C. Após a PCR, a emulsão foi quebrada pela adição de 2 volumes de isobutanol a cada tubo, a fase aquosa contendo o produto da PCR foi separada por uma centrifugação curta (16.000g por 2 min) e finalmente purificada usando o kit E.Z.N.A.TM Cycle Pure (Omega). Clonagem e código de barras da biblioteca AAV
[148] A montagem de Gibson foi usada para inserir o agrupamento de oligonucleotídeos (no gene capsídeo localizado fora dos ITR’s) e códigos de barras (a jusante de GFP localizados dentro dos ITR’s) para gerar uma biblioteca de plasmídeos AAV tipo código de barras (Fig. 1). Uma PCR de um ciclo foi realizada para gerar fragmentos em código de barras com saliências para montagem Gibson. O comprimento do código de barras era de 20 nucleotídeos e definido como nucleotídeos de ambiguidade usando a sequência V-H-D-B (código de ambiguidade IUPAC) repetida cinco vezes e flanqueada por sequências estáticas para ligação. Os oligos também continham um sítio LoxP-JTZ17, para facilitar a recombinação Cre subsequente. Uma reação de montagem Gibson de 40 µl (NEB) foi realizada para inserir o agrupamento de oligonucleotídeos e fragmentos de código de barras em 200 ng de vetor digerido, usando uma razão molar de 1,3:1,3:1. A reação foi incubada por 1 h a 50°C e purificada usando DNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research). 1 µl (37,4 ng) de produto de montagem Gibson purificado foi transformado em 20 µl de células MegaX DH10BTM T1R
ElectrocompTM (Thermo Fischer Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. 5 transformações individuais foram realizadas e agrupadas em um tubo. Uma pequena fração das bactérias transformadas foi semeada em placas de ágar para validar a eficácia da transformação. 10 clones foram escolhidos das placas e a inserção do oligonucleotídeo e do código de barras foi validada por digestão com enzimas de restrição usando Bsp120I, BsrGI e SpeI (Fastdigest, Thermo Fischer Scientific). As bactérias transformadas sem placas foram cultivadas como um maxi prep e purificadas usando o kit ZymoPURE Plasmid Maxiprep (ZYMO Research). Biblioteca de produção AAV
[149] As células HEK293T foram semeadas em frascos de cultura de células de 175 cm para atingir 60-80% de confluência antes da transfecção. 25 µg, 250 ng ou 25 ng da biblioteca de plasmídeo AAV e 46 µg de pHGTI- 18 adeno1 foram transfectados usando fosfato de cálcio. A razão molar da biblioteca de plasmídeo AAV: pHGTI-adeno1 foi de 1:1, 0,01:1 (30cpc) ou 0,001:1 (3cpc), respectivamente. Esperava-se que a razão de 1:1 recebesse uma biblioteca AAV quimérica, na qual cada partícula provavelmente continha proteínas de capsídeo de mutação quimérica. A razão de 0,01:1 e 0,001:1 foi assumida para fazer as células receberem aproximadamente um membro da biblioteca de plasmídeo AAV6.e, subsequentemente, para receber uma biblioteca AAV limpa, em que cada partícula única consistia nas mesmas proteínas de capsídeo de mutação e um código de barras. Bibliotecas virais foram coletadas e purificadas usando gradiente de iodixanol como descrito anteriormente31. O título genômico de AAV foi determinado pela quantificação do DNA do vetor, conforme descrito usando PCR em tempo real32. Biblioteca de plasmídeo de sequenciamento AAV
[150] Para facilitar o sequenciamento Illumina de extremidade emparelhada da biblioteca de plasmídeo, uma parte do plasmídeo AAV foi excisada por recombinase Cre para aproximar a sequência de peptídeo inserida e o código de barras (Figura 1). 1,5 µg de DNA foi incubado com 6U de recombinase Cre (NEB) em um volume de 100 µl a 37°C por 1h. A reação foi terminada a 70°C por 10 minutos e purificada por DNA Clean & Concentrator-5 (ZYMO Research). O produto foi digerido usando BsiWI e MunI, executado em gel de agarose e o fragmento desejado foi selecionado e purificado usando Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research). O produto de extração de gel foi submetido a Reparo PreCR usando Mistura de reparo de preCR (NEB). Em 50 µl de reação, 50 ng de DNA, 100 µM dNTPs e 1X NAD+ foram incubados em 1X Tampão ThermoPol a 37°C por 20 min. 5 µl de DNA reparado por PreCR foi PCR: ed com primers P5/P7 Illumina P11 e mistura de P12, P13, P14, P15 usando Phusion HSII (Thermo Fischer Scientific). Novamente, para reduzir a recombinação entre os fragmentos na PCR, foi realizada uma emulsão PCR. A emulsão foi criada conforme descrito anteriormente. Os ciclos de PCR foram 1 ciclo de 30s a 98°C, 18 ciclos de 5s a 98°C, 15s a 63°C e 3 min (8 vezes do tempo de extensão regular) a 72°C e 1 ciclo de 5 min a 72°C. A emulsão foi quebrada, o produto foi purificado conforme descrito anteriormente e um reparo PreCR foi realizado. 5 µl de DNA reparado por PreCR da etapa anterior foram usados no próximo PCR de emulsão para adicionar índices Nextera XT, usando Kit NexteraTM XT Index (Illumina). O programa de PCR foi; 1 ciclo de 1 min a 98°C, 10 ciclos de 15 s a 98°C, 20 s a 65°C e 3 min (8 vezes do tempo de extensão regular) a 72°C e 1 ciclo de 5 min a 72°C. O produto do Nextera XT Index emulsion PCR foi purificado e o tamanho selecionado usando o kit SPRIselect (Beckman Culter). Os produtos de PCR purificados e indexados foram sequenciados usando Illumina MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina) com sequenciamento de extremidades emparelhadas de 150 bp. Código de barras derivado de RNA de sequenciamento
[151] O RNA total foi isolado do tecido cerebral, neurônios primários e células HEK293T usando PureLinkTM RNA Mini Kit (Thermo Fischer Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras de RNA foram incubadas com DNase I (NEB) para remover a contaminação de DNA. 5 µg de RNA foi incubado com 1 unidade de DNase I em 1X DNase I do Tampão de Reação até um volume final de 50 µl e incubado a 37°C por 10 minutos. Subsequentemente, 0,5 µl de 0,5 M EDTA foi adicionado e depois inativado por calor a 75°C durante 10 minutos. O RNA tratado com DNase I foi transcrito reversamente para cDNA usando qScript cDNA Synthesis Kit (Quanta) de acordo com as recomendações do fabricante. 2 µl de cDNA foram então amplificados por PCR usando os primers P16 e P17. O programa de PCR foi de 1 ciclo de 30 s a 98°C, 35 ciclos de 5 s a 98°C, 15 s a 65°C e 30 s a 72°C seguido por 1 ciclo de 5 min a 72°C. Os produtos de PCR contendo os códigos de barras foram purificados por extração em gel usando o kit Zymoclean Gel DNA Recovery (Zymo Research). 20 ng de DNA purificado foi submetido a um adaptador de PCR P5/P7 Illumina usando os primers P18 e uma mistura igual de P12, P13, P14, P15. Os ciclos de PCR foram 1 ciclo de 30 s a 98°C, 10 ciclos de 5 s a 98°C, 15 s a 65°C e 30 s a 72°C, seguido por 1 ciclo de 5 min a 72°C. Os produtos de PCR foram purificados por extração em gel conforme descrito anteriormente. Posteriormente, foi realizada uma Nextera XT Index PCR usando NexteraTM XT Index Kit (Illumina). O programa de PCR foi; 1 ciclo de 1 min a 98°C, 6 ciclos de 15 s a 98°C, 20 s a 65°C e 1 min a 72°C, seguido por 1 ciclo de 5 min a 72°C. Os produtos de PCR foram purificados usando SPRIselect (Beckman Culter). Os produtos de PCR purificados foram sequenciados usando Illumina NextSeqTM 500/550 Mid Output Kit v2 (Illumina) com leituras finais emparelhadas de 75 pb. Biblioteca viral de sequenciamento
[152] Dois lotes de AAV foram produzidos (para o método de produção, consulte "Estudos de validação de capsídeo de produção de AAV"), um lote com diluição 100 vezes (30cpc) de plasmídeo contendo os capsídeos e código de barras e uma diluição 1000 vezes (3cpc) do mesmo plasmídeo (correspondendo a 250ng e 25ng na “Biblioteca de produção AAV”). Após a produção, purificação e titulação, ambos os lotes foram tratados com DNaseI e lisados por Proteinase K. O lisado viral foi submetido a duas rodadas de PCR para adicionar sequências P5/P7 compatíveis com Illumina e índices NexteraXT e depois purificado usando SPRIselect (Beckman Culter). As amostras purificadas e indexadas foram sequenciadas usando Illumina NextSeqTM 500/550 Mid Output Kit v2 (Illumina) com leituras finais emparelhadas de 75 bp. Transdução de células ES humanas
[153] As células ES humanas foram diferenciadas em células
36. progenitoras dopaminérgicas 42 dias após o início da diferenciação, as células foram transduzidas com scAAV-GFP usando 5x108 gc/poço e incubadas 72 horas após a transdução, as células foram fixadas com 4% de PFA e coradas para Map- 2, Tirosina Hidroxilase e DAPI (consulte imuno- histoquímica). No total, 29 capsídeos de AAV diferentes foram validadas. As células foram analisadas em Cellomics, Trophos Plate runner e microscópio confocal. Fluxo de trabalho de avaliação de dados
[154] Um fluxo de trabalho livre de interação completo foi implementado usando o pacote estatístico R junto com vários pacotes do repositório Bioconductor. A partir desses scripts, uma série de aplicativos externos de ampla utilidade (bbmap, Blast, Starcode37, bowtie2, samtools, Weblogo 3 and Hammock38) foram chamados e a saída retornada para R para análise posterior. Está publicamente disponível como um repositório Git em https://bitbucket.org/MNM-LU/aav-library e como uma imagem Docker auto- sustentada Bjorklund/aavlib: v0.2.
[155] Em resumo; código de barras e identificação de sequência, corte e filtragem de qualidade foram conduzidos usando o pacote de software bbmap39, que permite a correspondência de kmere de sequências de estrutura principal conhecidas com as leituras. Como a grande maioria das leituras de código de barras foi sequenciada para o comprimento de 20, com a maioria dos códigos de barras de comprimento divergente terminando com 19 bp de comprimento, para todas as análises neste estudo, foi aplicada filtração de comprimento de 18≤BC≤22.
[156] Os fragmentos de sequência de peptídeo foram isolados de forma semelhante usando o pacote de software bbmap, mas desta vez sem qualquer pedido de restrições de comprimento e, em seguida, alinhados aos peptídeos de referência usando blastn.
[157] O principal componente da estrutura de análise baseada em R é uma implementação paralela da filosofia de programação MapReduce40, 41. Para obter mais detalhes sobre este processo, consulte17. Neste processo, Bowtie2 foi utilizado pela primeira vez para alinhar os trechos de peptídeo sintetizado com as sequências de referência de proteína, em seguida, blastn foi usado para mapear os fragmentos sequenciados para os peptídeos e, finalmente, um fluxo de trabalho R construído para um propósito foi implementado para selecionar os resultados de sequenciamento puro filtrando erroneamente leituras geradas por meio de troca de modelo na preparação de amostra baseada em PCR e para identificar mutações resultantes da síntese de oligonucleotídeos de CustomArray.
[158] A partir das amostras in vitro e in vivo, os códigos de barras derivados de AAV foram identificados por sequenciamento direcionado e mapeados de volta para os respectivos fragmentos e sua origem nas proteínas selecionadas. A eficácia do transporte foi então quantificada e mapeada com a identificação dos candidatos mais eficientes. Em paralelo, a contagem do código de barras junto com a sequência aa do peptídeo foi alimentada na 38 ferramenta Hammock e os motivos de consenso foram visualizados usando o Weblogo 3. Resultados Geração de uma biblioteca de vetores virais
[159] Como uma primeira etapa, identificamos na literatura 131 proteínas com afinidade documentada para sinapses (Figura 1A). Elas se enquadram em quatro grupos principais, proteínas derivadas de vírus (capsídeo e envelope), proteínas derivadas do hospedeiro (neurotrofinas e proteínas relacionadas a doenças, por exemplo, Tau), neurotoxinas e lectinas. As sequências de referência do NCBI das 131 proteínas foram traduzidas em sequências de aminoácidos e digeridas computacionalmente em polipeptídeos de comprimento 14aa com uma abordagem de janela deslizante móvel 1aa (1. na Figura 1B). Os 61 314 peptídeos gerados no total consistiam em 44 708 polipeptídeos únicos. Três ligantes alternativos foram adicionados aos polipeptídeos; uma única Alanina (chamada 14aa), um ligante rígido com 5 resíduos de Alanina (14aaA5) e um ligante flexível com a sequência aa GGGGS (14aaG4S) (2. na Figura 1B). Um último grupo de peptídeos aa foi gerado de forma semelhante com um comprimento de 22aa e um único ligante de Alanina (denominado 22aa). Um total de 92 sequências de 343 aa foram então otimizados por códons para expressão em células humanas e saliências adicionadas às extremidades para permitir a clonagem direcional de montagem de Gibson sem cicatriz no gene AAV2 Cap na posição N587 (3. na Figura 1B). Todos os oligos resultantes com o comprimento total de 170 bp foram sintetizados em paralelo em uma matriz de oligonucleotídeos CustomArray. Geração de biblioteca de capsídeo AAV altamente diversa para a abordagem BRAVE
[160] Para desenvolver a biblioteca AAV para a abordagem BRAVE, onde os peptídeos são exibidos em N587 e códigos de barras associados a peptídeos simultaneamente inseridos na UTR do genoma AAV, primeiro geramos um novo plasmídeo de base. Neste plasmídeo de estrutura principal, combinamos os genes de empacotamento de AAV (Rep, Cap e AAP) sob o controle do promotor MMTV e o cassete de expressão de GFP flanqueado por repetições terminais invertidas mutadas (ITR) formando um genoma de AAV auto-complementar eviscerado15, 16.
[161] Para incorporar sequências de peptídeos, introduzimos um sítio NheI no aminoácido N587 da proteína de capsídeo VP111 , na qual o agrupamento de oligonucleotídeos foi inserido. Esta adição de um sítio de restrição altera as propriedades de ligação do proteoglicano de sulfato de heparano AAV2 de tipo selvagem12 e esta variante é doravante referida como AAV-MNMnull.
[162] O conjunto resultante de oligonucleotídeos foi montado na estrutura de produção de AAV (4. na Figura 1B). Um código de barras molecular aleatório (BC) de 20 bp foi inserido simultaneamente na UTR 3' do gene GFP usando uma reação de montagem Gibson de 4 fragmentos. Usando uma abordagem de recombinação Cre unidirecional seguida por adição baseada em emPCR de adaptadores de sequenciamento Illumina, todo o conjunto de peptídeos foi então sequenciado usando sequenciamento de extremidade emparelhada ligando os códigos de barras aleatórios aos respectivos peptídeos em uma tabela Look-Up (LUT) (5a. na Figura 1B). Esta abordagem evita a troca de modelo durante a PCR e permite uma correspondência quase perfeita do código de barras ao fragmento inserido (não mostrado)17. A biblioteca resultante continha 3 934 570 combinações únicas de peptídeo e código de barras contendo 90 635 (e, portanto > 98% de recuperação) dos fragmentos projetados e perto de 50X sobre-amostragem tipo código de barras. Este último é essencial para filtragem de ruído, correção de erros e mapeamento de mutações (geradas na matriz customizada) no processo de bioinformática abaixo. Em paralelo à geração de LUT, a mesma biblioteca de plasmídeo é utilizada para gerar preparações de vetores virais de AAV deficientes para replicação, onde o peptídeo é exibido na superfície de capsídeo e o código de barras é empacotado como parte do genoma de AAV (5b. na Figura 1B). Múltiplos experimentos de triagem paralela foram então realizados in vitro e in vivo e após seleção adequada (por exemplo, dissecção da região do cérebro alvo) o mRNA foi extraído e os códigos de barras expressos sequenciados. Através da combinação dos códigos de barras sequenciados e do LUT, a eficácia pode ser mapeada de volta para as 131 proteínas originais (6 na Figura 1B) e os motivos de consenso podem ser determinados usando a abordagem de agrupamento baseada no modelo de Markov oculto (HMM) de Hammock (7 em Figura 1B). Produção da biblioteca AAV
[163] Para produzir a biblioteca de partículas AAV, a biblioteca de plasmídeo AAV foi co-transfectada juntamente com o plasmídeo auxiliar adenoviral (pHGTI-adeno1) nas células HEK293T 18. O plasmídeo da biblioteca AAV foi fornecido em uma concentração muito baixa para garantir que a célula produtora produzisse poucas (ou uma única) variantes de capsídeo da biblioteca do plasmídeo AAV6, 19 ou seja, que cada vírion produzido consiste apenas nas mesmas proteínas de capsídeo de mutação e pacote o código de barras correto. Usamos 3 ou 30 cópias por célula (cpc) da biblioteca de plasmídeos AAV para produção e adquirimos duas bibliotecas AAV com o título de 2,5x1012 e 4,4x1010 GC/ml para AAV-MNMlib[30cpc] e AAV-MNMlib[3cpc], respectivamente. Para avaliar quais peptídeos permitiriam a montagem correta e o empacotamento do genoma, nós tratamos os dois lotes com DNase (para remover genomas não empacotados), lisamos os lotes e sequenciamos os códigos de barras das preparações separadamente. Devido à diversidade muito alta dos códigos de barras expressos, a sobreposição nos códigos de barras foi pequena entre as produções (Figura 1C). No entanto, a maioria absoluta de todos os peptídeos embalados no lote 3cpc também foi recuperada no lote 30cpc (Figura 1C). A injeção da biblioteca AAV-MNMlib[30cpc] no prosencéfalo de ratos adultos revelou que os peptídeos inseridos conferem uma mudança notável no padrão de transdução em comparação com um vetor AAV2-WT com disseminação mais ampla de transdução e transporte retrógrado para as regiões aferentes de conexão (Figura 1D). Para triar novas estruturas individuais de capsídeo de AAV que permitiriam o transporte retrógrado eficiente em neurônios in vivo, realizamos um experimento maior em que os animais receberam as mesmas injeções de biblioteca no corpo estriado do AAV-MNMlib[30cpc] ou do AAV-MNMlib[3cpc] preparação da biblioteca (Figura 1E). 8 semanas após a injeção, o RNA total foi extraído do tecido estriatal, córtex orbitofrontal (PFC), tálamo (Thal), região do mesencéfalo (SNpc) juntamente com o tecido estriado injetado (Str), seguido por RT-PCR e sequenciamento massivamente paralelo de cDNA de códigos de barras transcritos. A análise dos peptídeos únicos recuperados nas diferentes regiões dissecadas revelam que ≈ 13% dos peptídeos inseridos promovem transdução eficiente in vivo e ≈ 4% promovem o transporte retrógrado.
[164] Este exemplo mostra que as bibliotecas geradas pelos métodos descritos neste documento podem ser usadas para identificar peptídeos que potencialmente conferem uma propriedade desejada a uma partícula viral quando exibida no capsídeo. Exemplo 2 - Triagem BRAVE de geração única in vitro e in vivo Materiais e métodos Estudos de validação de capsídeo de produção de AAV
[165] As células HEK293T foram semeadas em frascos de cultura de células de 175 cm para atingir 60-80% de confluência antes da transfecção. 2 horas antes da transfecção, o meio foi substituído por 27 ml de meio Eagle modificado de Dulbecco fresco (DMEM) + FBS a 10% + P/S. AAV foi produzido 33 usando transfecção PEI padrão usando um sistema de três plasmídeos; vetor de transferência, capsídeo AAV modificado e plasmídeo auxiliar adenoviral pHGT-1 em uma razão de 1,2: 1:1. PEI e plasmídeos foram misturados em 3ml de DMEM, incubados por 15 min e então adicionados às células. 16 horas após a transfecção, 27 ml de meio foram removidos e igual volume de meio OptiPRO sem soro (Thermo Fischer Scientific) +P/S foi adicionado. Os AAVs foram coletados 72 horas após a transfecção usando precipitação com polietilenoglicol 8000 (PEG8000) e extração com clorofórmio seguida por troca
34. de PBS em filtros Centrífugos Amicon Ultra-0,5 (Merck Millipore) Os AAVs purificados foram titulados usando qPCR com primers específicos para o promotor ou transgene. Infecção in vitro
[166] As células HEK293T foram cultivadas em DMEM + FBS a 10% e P/S. Neurônios corticais primários foram isolados de rato embrionário (E18) 35 ou camundongo neonatal de 1 dia de idade como previamente descrito e cultivados em meio Neurobasal/B27 em placas de cultura de fundo plano de 96 poços pretos (Greiner Bio One). As células foram transduzidas com 2 x10 6, 2 x107 e 2 x108 gc/poço. AAV foi adicionado ao meio e as células foram incubadas durante a noite. O meio contendo AAV foi substituído por meio fresco no dia seguinte. As células foram analisadas 72 horas após a transdução usando Cellomics (Thermo Fischer Scientific) e Plate Runner (Trophos). Animais de pesquisa
[167] Ratos Sprague Dawley fêmeas adultas (225-250 g) usados neste estudo foram adquiridos de Charles River (Alemanha) e foram alojados com livre acesso a comida e água sob um ciclo de 12 horas de luz/12 horas de escuridão em uma sala com temperatura controlada. Todos os procedimentos experimentais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética para Utilização de Animais de Laboratório da região de Lund-Malmö. Injeção estereotáxica de AAV
[168] Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia geral com uma mistura 20:1 de citrato de fentanil (Fentanil) e hipoclorito de medetomidina (Dormitor), injetados por via intraperitoneal. As coordenadas de direcionamento para todas as infusões estereotáxicas foram identificadas em relação ao bregma. Um pequeno orifício foi feito no crânio e nas soluções de vetor foram injetadas com uma seringa Hamilton de 25 µl equipada com um capilar de vidro (60–80 μm i.d. e 120–160 μm o.d.) e conectadas a uma bomba de infusão automática. A injeção foi realizada unilateralmente no lado direito ou bilateralmente.
A biblioteca AAV foi injetada unilateralmente no estriado e nas seguintes coordenadas: ântero-posterior, +1,2 mm; mediolateral, -2,4 mm; dorsoventral, -5,0/-4,0 mm; barra de dentes, - 3,2 mm.
Os vetores AAV candidatos foram infundidos em ântero-posterior, +1,2 mm; mediolateral, -2,4 mm; dorsoventral, -5,0/-4,0 mm e ântero-posterior, + 0,0 mm; mediolateral, -3,5 mm; dorsoventral, -5,0/-4,0 mm; barra de dentes, -3,2 mm.
A análise vetorial comparativa entre MNM-004-GFP e AAV-2 Retro- mCherry, bem como a comparação lateralizada entre MNM-004-GFP e MNM- 004 mCherry foram injetados bilateralmente no ântero-posterior, +1,2 mm; mediolateral, -2,4/+ 2,4 mm; dorsoventral, -5,0/-4,0 mm.
Para análise comparativa do transporte retrógrado para neurônios dopaminérgicos do mesencéfalo do estriado entre MNM-008, AAV-Retro e AAV-2, animais TH-cre foram injetados unilateralmente com vetores CTE-GFP em dois sítios nas seguintes coordenadas: em ântero-posterior, + 0,8/-0,2 mm; mediolateral, -3,0/- 3,7 mm; dorsoventral, -5,0/-5,0/-4,0 mm.
Os animais de modulação BLA foram injetados com o vetor MNM-004 em ântero-posterior, +1,2 mm; mediolateral, - 2,4 mm; dorsoventral, -5,0/-4,0 mm; barra de dente, -3,2 mm e vetores AAV-8 no ântero-posterior, -2,2 mm; mediolateral, +/- 4,8 mm; dorsoventral, -7,4 mm; barra de dentes, -3,2 mm.
Para os animais da biblioteca AAV, cada rato recebeu 5 µl de soluções de vetor na dose de 2,5x1010ou 4,4 x108 genomas de vetor da biblioteca AAV com concentração de capsídeo de 30cpc ou 3cpc para a biblioteca de plasmídeo AAV e quantidades normais de plasmídeo pHGTI- adeno1. Os animais do vetor candidato receberam 2 µl de vetor por sítio de infusão, enquanto os animais nos animais de modulação BLA foram infundidos com 3 µl de MNM-004 no corpo estriado e 3 µl de DREADDs AAV-8 DIO- hM3Dq/rM3Ds indutíveis por Cre no BLA.
A análise comparativa entre os vetores injetados no corpo estriado foram injetados com uma dose viral de 2,3x1012 genomas de vetor em um volume total de 1 µl por sítio de depósito.
Todas as infusões foram realizadas a uma taxa de 0,2 ml/min, e a agulha foi deixada no sítio por um período adicional de 3 minutos antes de ser retraída lentamente. No pós-operatório, a ferida foi fechada com grampos cirúrgicos e o animal colocado em uma esteira térmica até acordar. Processamento de tecido
[169] Oito semanas após a injeção, os cérebros foram processados de acordo com a análise post mortem subsequente. Para extrações de RNA, os animais foram sacrificados com CO2, os cérebros foram removidos e fatiados no eixo coronal em fatias de dois milímetros de espessura usando um molde de cérebro. O tecido estriado, córtex orbitofrontal, tálamo e região do mesencéfalo foram rapidamente dissecados e congelados individualmente em gelo seco e armazenados a -80°C até a extração do RNA. Para a análise imuno- histoquímica, os animais foram profundamente anestesiados com overdose de pentobarbital de sódio (Apoteksbolaget, Suécia) e perfundidos transcardialmente com 50 ml de solução salina fisiológica seguida por 250 ml de paraformaldeído (PFA) a 4% recém-preparado, gelado, em tampão de fosfato 0,1 M ajustado para pH = 7,4. Os cérebros foram então removidos e pós-fixados por mais 2 horas em PFA frio antes de serem armazenados em sacarose tamponada a 25% para crioproteção por pelo menos 24 horas até processamento posterior. Os cérebros fixos de PFA restantes foram cortados em seções coronais de 35 mm de espessura usando um micrótomo de congelamento (Leica SM2000R) e coletados em 8 séries e armazenados em solução anticongelante (tampão de fosfato de sódio de 0,5 M, 30% de glicerol e 30% de etilenoglicol) em -20°C. Imuno-histoquímica
[170] Para a análise imuno-histoquímica, os cortes de tecido foram lavados (3x) com TBS (pH 7,4) e incubados por uma hora em H2O2 de 3% em solução de Triton a 0,5% TBS para extinguir a atividade da peroxidase endógena e aumentar a permeabilidade do tecido. Seguindo outra etapa de lavagem, as seções foram bloqueadas em 5% de soro bovino e incubadas por uma hora e subsequentemente incubadas com anticorpos monoclonais primários durante a noite. Para avaliar a expressão de GFP, a imuno- histoquímica foi realizada em seções cerebrais usando anticorpo primário de anti-GFP de galinha (1: 20000; ab13970, Abcam), rM3Ds que expressam neurônios foram identificados por coloração para HA-tag (anti-HA de camundongo, Covance Research Products Inc Cat # MMS-101R-200 RRID: AB_10064220, 1: 2000). Os neurônios que expressam hM3Ds foram identificados por coloração para mCherry (cabra anti-mCherry, LifeSpan Biosciences Cat # LS-C204207, 1:1000) Após a incubação durante a noite, o anticorpo primário foi lavado usando TBS (x3) e depois incubado com anticorpos secundários para dois horas. Para a imuno-histoquímica de 3, 30-di- aminobenzidina (DAB), anti-camundongo biotinilado (Vector Laboratories Cat # BA-2001 RRID: AB_2336180, 1: 250), anti-cabra (Jackson ImmunoResearch Labs Cat # 705-065-147 RRID: AB_2340397, 1: 250) e anticorpos secundários anti-galinha (Vector Laboratories Cat # BA-9010 RRID: AB_2336114, 1: 250). Para a análise de microscopia de fluorescência ou galinha de anti-cabra biotinilado (1: 250; BA9010, Vector laboratories) foi usado. Para imuno- histoquímica DAB, o kit ABC (Vectorlabs) foi utilizado após incubação do anticorpo secundário para amplificar a intensidade de coloração por conjugação estreptavidina-peroxidase e seguida de exposição de cor em H2O2 de 0,01%. Imunocitoquímica de neurônios primários da glia e neurônios diferenciados terminalmente
[171] A análise da eficiência de transdução do vetor na glia primária e neurônios diferenciados de hESC utilizou a detecção de imunofluorescência. Primeiro, o meio foi removido e as células foram lavadas em 1x PBS. Em seguida, 100 µl de PFA a 4% foram adicionados a cada poço contendo as células e incubados a 37 graus durante 10 minutos. Após a incubação, as células foram lavadas com PBS. A cultura de células fixadas foi então bloqueada por uma hora em temperatura ambiente usando 100 µl de solução de bloqueio consistindo em KPBS com 5% de BSA e 0,25% de triton-x por poço. A solução de bloqueio foi removida e substituída por anticorpo primário em PBS e incubada durante a noite a 4 graus. As células gliais foram identificadas usando os seguintes anticorpos: anti-GFAP de coelho (1∶1000; ab7260, Abcam) e anti-IBA-1 de coelho (1∶2000; 019-19741, Wako) Após incubação durante a noite, os poços foram lavados duas vezes com KPBS e então incubado com anticorpos secundários em KPBS por um total de duas horas em temperatura ambiente. Os anticorpos secundários usados incluíram: anti-coelho conjugado com Alexa (Jackson ImmunoResearch Labs Cat # 711- 165-152 RRID: AB_2307443, 1: 250) Finalmente, as células foram lavadas duas vezes em KPBS e deixadas em solução KBPS para análise de imagem. Microscopia confocal de triagem a laser
[172] Todas as análises de imunofluorescência foram realizadas usando o microscópio Leica SP8. As imagens confocais sempre foram capturadas usando um detector HyD com os lasers configurados para serem ativados no modo sequencial, evitando assim o sangramento do sinal de fluorescência. Lasers de estado sólido em comprimentos de onda de 405, 488, 552 e 650 nm foram utilizados para excitar os respectivos fluoróforos. O furo de alfinete sempre foi mantido em Airy 1 para todas as aquisições de imagens. Após a aquisição, a deconvolução foi realizada usando o plugin “Deconvolution” para ImageJ (desenvolvido pelo Biomedical Imaging Group [BIG] - EPFL - Suíça http: //bigwww.ep.ch/) utilizando o algoritmo Richardson- Lucy e aplicando funções de dispersão de pontos (PSFs) calculadas para o equipamento de imagem específico usando o modelo Gibson e Lanni no PSF Generator (BIG, EPFL - Suíça http://bigwww.ep.ch/algorítmos/psfgenerator/). Resultados
[173] Em seguida, utilizamos a tecnologia BRAVE para triar a reintrodução do tropismo para células HEK293T in vitro (Figura 2B), perdidas quando a ligação de HS foi mutada no capsídeo AAV-MNMnull (Figura 2B'). Na triagem de 4 milhões de variantes de capsídeo tipo código de barras exclusivo,
encontramos várias regiões das 131 proteínas incluídas que conferiram uma infecciosidade significativamente melhorada em relação à estrutura de capsídeo parental AAV-MNMnull (não mostrado). Um peptídeo da proteína de superfície de HSV-2 pUL44 foi selecionado e um primeiro capsídeo novo foi gerado denominado AAV-MNM001 (Figura 2A). Este capsídeo, quando usado para embalar CMV-GFP de forma independente, exibiu um tropismo significativamente aumentado para as células HEK293T (Figura 2B''). Em um segundo experimento, usamos a tecnologia BRAVE para melhorar a infectividade de neurônios corticais primários de ratosin vitro. Ambos AAV2-WT e o vetor AAV-MNMnull exibem infecciosidade muito pobre de neurônios primários (Figura 2D-D') e o AAV-MNM001 exibe algumas melhorias (Figura 2D''). Por meio da triagem BRAVE, identificamos uma série de peptídeos agrupados em uma região C-terminal da proteína pUL1 de HSV-2 (Figura 2C) que, quando utilizada sozinha em um novo capsídeo AAV (AAV-MNM002), melhorou a infectividade dos neurônios primários em cultura dramaticamente (Figura 2D'''). Após esses dois estudos de prova de conceito, demonstrando a validade da triagem BRAVE de geração única, estabelecemos a triagem BRAVE in vivo na escala real para a descoberta de novos capsídeos AAV com capacidade de transporte retrógrado aprimorada (não mostrado). A partir dessa triagem, selecionamos 23 peptídeos de 19 proteínas, todos representados por vários códigos de barras e encontrados em vários animais. 23 das 25 estruturas de capsídeo de AAV de novo permitiram uma eficácia de empacotamento de AAV2-WT maior ou igual (Figura 2F). Usando o agrupamento baseado no modelo de Markov oculto Hammock de todos os peptídeos com capacidade de transporte retrógrado, pudemos determinar o motivo de consenso putativo para cada um dos 23 sorotipos, fornecendo uma base para a otimização direcionada. Caracterização de capsídeo AAV-MNM004 para transporte retrógrado in vivo
[174] Na análise de bioinformática da proteína pUL22 de HSV, uma região C-terminal da proteína apresentou transporte reproduzível para todas as regiões aferentes; Cortex, Thalamus e Substantia Nigra, embora não mostrando o mesmo viés no sítio da injeção no estriado (Figura 3A). O agrupamento HMM de todos os peptídeos exibindo essas propriedades revelou dois motivos de consenso sobrepostos (Figura 3C). Aqueles foram gerados nas estruturas de capsídeo AAV-MNM004 e AAV-MNM023, respectivamente, com ambos exibindo padrões de transporte semelhantes in vivo (não mostrado) com o capsídeo AAV-MNM004 mostrando capacidade de transporte mais potente e menos disseminação no sítio da injeção. O capsídeo AAV-MNM004 promoveu um transporte retrógrado para todas as regiões aferentes até o córtex entorrinal medial, enquanto o capsídeo AAV2-parental promoveu transdução eficiente no sítio da injeção, mas resultou em muito pouco transporte retrógrado do vetor (Figura 3D). Enquanto estávamos finalizando este trabalho, outro peptídeo foi publicado promovendo forte transporte retrógrado quando exibido no mesmo sítio na superfície de capsídeo AAV2 (AAV2-Retro)9. Quando comparado in vivo, o capsídeo AAV-MNM004 exibiu propriedades de transporte retrógrado muito semelhantes em comparação ao capsídeo AAV2 com o retro-peptídeo (Retro) injetado no estriado contralateral do mesmo animal (não mostrado). Esta abordagem de injeção bilateral de dois fluoróforos nos permitiu visualizar com eficiência as projeções decussantes versus ipsilaterais do PFC, dos núcleos intralaminares do tálamo e da amígdala basolateral (BLA).
[175] Este exemplo mostra que o capsídeo modificado com propriedades aprimoradas pode ser projetado identificando fragmentos de proteínas que, quando exibidos no capsídeo, conferem uma propriedade desejada ao capsídeo modificado. Exemplo 3 - Utilização da abordagem BRAVE para mapear e compreender a função das proteínas envolvidas na doença de Alzheimer, tanto in vivo quanto in vitro
[176] A abordagem BRAVE oferece uma possibilidade única de mapear sistematicamente a função da proteína in vivo.
Portanto, utilizamos esta abordagem para exibir peptídeos de proteínas endógenas envolvidas na doença de Alzheimer; APP e Tau e estudaram se quaisquer peptídeos dessas proteínas poderiam promover um transporte retrógrado de capsídeo de AAV e, assim, fornecer informações sobre o mecanismo subjacente à comunicação célula a célula proposta dessas proteínas na doença (Figura 4). No mapeamento de APP, encontramos duas regiões que conferiam transportes retrógrados, uma na região do N-terminal de sAAP e uma na região beta de amiloide (não mostrada). Curiosamente, a região sAPP compartilhou homologia de sequência significativa com uma região da proteína VP1 do vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) que parece conduzir sua absorção axonal e infectividade (Figura 4A). As propriedades funcionais dos peptídeos originários da proteína Tau associada ao microtúbulo foram ainda mais impressionantes.
Nesta proteína, uma região central transmitia um transporte retrógrado muito eficiente.
Após uma caracterização mais profunda, esta região consistia em três motivos conservados adjacentes com o terceiro motivo compartilhando homologia significativa com a glicoproteína VSV-G (bem usada para pseudotipar lenti-vírus para aprimorar o tropismo neuronal) e a proteína gp120 do HIV (Figura 4B-C, E). Duas novas estruturas de capsídeo foram geradas a partir desta região, AAV-MNM009 e AAV-MNM017. Ambos os novos capsídeos promoveram transporte retrógrado in vivo, mas AAV-MNM017 também exibiu propriedades interessantes adicionais.
AAV-MNM017 infectou neurônios primários e células gliais primárias in vitro com eficácia muito alta.
Usando essa propriedade, realizamos um experimento de deslocamento comparando o AAV-MNM017 ao capsídeo neurotrófico AAV-MNM002 que não é gerado a partir de um peptídeo relacionado a Tau (não mostrado). Três grupos de populações de neurônios primários foram pré-tratados com diferentes variantes Tau recombinantes (T44, T39 e K18). A variante T44 não teve efeito aparente na proporção de MNM017 para MNM002 de infecciosidade, enquanto K18 aumentou a infecciosidade de MNM017 enquanto a variante T39 bloqueou eficientemente a infecciosidade em comparação com AAM-MNM002. Isto sugere que o peptídeo derivado de Tau exibido na superfície de AAV está utilizando um receptor nos neurônios que também possui uma atividade de ligação da proteína Tau humana de comprimento total, mas que a modificação pós-tradução da Tau pode ser crítica para esta função. Na avaliação in vitro das 24 estruturas de capsídeode novo geradas (AAV-MNM001-024), encontramos um subconjunto delas (cinco) que exibiu um tropismo aprimorado para as células gliais primárias in vitro (não mostrado). Enquanto a maior parte da infectividade foi de astrócitos positivos para GFAP, alguns deles também infectaram a microglia positiva para IBA1. Um grande obstáculo para o projeto de novo capsídeo usando modelos animais tem sido a falta de previsibilidade com relação à tradução para células humanas. Espera-se que a abordagem BRAVE aprimore isso por meio do uso de peptídeos naturais de vírus e proteínas com função conhecida no cérebro humano. Na glia primária humana, o AAV-MNM017 mantém seu excelente tropismo (Figura 4D-D'').
[177] Este exemplo mostra que as partículas virais modificadas obtidas pelos métodos divulgados neste documento podem ser usadas para estudar a função da proteína e combinar domínios funcionais.
[178] Exemplo 4 - Avaliação do rearranjo de capsídeo de AAV usando BRAVE e geração de capsídeos infectando neurônios DA
[179] Uma série de estudos bem-sucedidos utilizaram a remodelação de capsídeo de AAV entre sorotipos para gerar novos capsídeos usando evolução direcionada. Utilizamos, neste documento, o BRAVE para estudar o potencial de inserção de peptídeos de outros serotipos de AAV no capsídeo de AAV2 (Figura 5). Curiosamente, a inserção de peptídeos da mesma região de AAV1,2 e 8 cobrindo os N587 aa foram inseridos de forma eficiente no capsídeo de AAV2. No entanto, a mesma região de AAV9 não conferiu a mesma função. Além disso, quatro regiões adicionais do domínio N-
terminal de VP1 (também conhecido por ser apresentado na superfície de capsídeo de AAV) também poderiam ser inseridas de forma eficiente.
Três desses domínios foram conservados entre AAV1,6,8 e 9, enquanto o quarto estava ausente em AAV8. Em um experimento final de triagem BRAVE, objetivamos desenvolver uma nova variante de capsídeo AAV com transporte retrógrado eficiente para neurônios de dopamina do Substantia Nigra de injeções na região de saída do estriado.
Nesta triagem, identificamos duas regiões da proteína de capsídeo CAV-2 nas proximidades (Figura 5 A-B). Curiosamente, o primeiro peptídeo compartilhou homologia significativa com uma terceira região da mesma proteína (Figura 5A), enquanto o segundo peptídeo (Figura 5B) compartilhou um motivo peptídico da aglutinina de lectina de soja (SA) que também se transporta de forma eficiente da sinapse para o soma de neurônios e, portanto, pode ser usado como traçador retrógrado 20. O CAV-2 é um vetor viral frequentemente usado para o direcionamento de neurônios DA do terminal in vivo21 e, portanto, realizamos um experimento para confirmar se essa propriedade foi mantida na variante de capsídeo AAV- MNM008 resultante.
Usando um genoma de AAV indutível por Cre (CMV-loxP- GFP) injetado no estriado de ratos knock-in TH-Cre, descobrimos que o AAV- MNM008 foi mais eficiente em infectar os neurônios nigrais em comparação com um capsídeo AAV2-WT carregando o mesmo genoma (não mostrado). Para confirmar que essa propriedade não estava limitada a neurônios DA de roedores, realizamos um experimento em ratos desnervados por DA, hemi- parkinsonianos e imunocomprometidos.
Estes animais receberam primeiro um transplante neuronal rico em DA gerado através da diferenciação de células- tronco embrionárias humanas que expressam Cre (hESCs). 6 meses após o transplante dos neurônios, o vetor AAV-MNM008 foi injetado no córtex frontal dos animais e foi transportado de forma eficiente para os neurônios transplantados que inervam esta região (Figura 5C-C''). Por meio da imuno- histoquímica de fluorescência dupla, pudemos então confirmar que a maioria dessas células eram de fato TH-positivas e, portanto, inferidas como produtoras de DA (Figura 5C'-C''). Usando o mesmo protocolo de diferenciação de hESC in vitro, avaliamos se o tropismo neuronal in vitro das variantes de capsídeo de novo seria mantido também em neurônios de origem humana. Na verdade, todas as variantes (AAV-MNM002, 008 e 010) que exibiram alto tropismo em neurônios de roedores primários também mostraram um tropismo muito maior do que as variantes de AAV de tipo selvagem (não mostrado). Digno de nota é que a variante de capsídeo AAV-MNM004, tão eficiente in vivo, não era de todo adequado para a transdução in vitro (não mostrado). Também foi de interesse que o AAV-MNM001, BRAVE triado em células HEK293T de origem humana não foi eficiente em neurônios primários de rato, mas foi muito eficiente em neurônios humanos (não mostrado), sugerindo uma diferença na expressão ou estrutura do receptor entre roedores e humanos células e, portanto, mostrando o valor da triagem diretamente em células humanas ou em sistemas humanizados in vivo.
[180] Este exemplo mostra que os presentes métodos podem ser usados para melhorar o tropismo de partículas virais. Exemplo 5 - Dissecção funcional da amígdala basolateral e seu envolvimento no desenvolvimento de ansiedade Materiais e métodos Teste de preferência de lugar condicionado
[181] Para avaliar a ativação seletiva do DREADD do BLA na aversão ao lugar condicionado, foi utilizada uma caixa de duas câmaras, onde cada câmara era separada por uma parede com uma porta fechada. Cada câmara foi feita diferente da outra usando questões visuais nas paredes e sensação tátil no chão da câmara, mantendo a mesma intensidade de luz. Todos os testes foram gravados usando câmeras CCD iluminadas por infravermelho e a posição do animal gravada usando o pacote de software Stoelting ANY-maze 5,2. No primeiro dia, os animais foram primeiro adaptados em uma das duas câmaras por um total de três horas após a injeção de solução salina, sendo alternados dentro do grupo entre as duas câmaras para controlar qualquer viés da câmara. Este teste é denominado “Controle”. No segundo dia, os animais foram colocados na câmara oposta desde o primeiro dia após a injeção sc com CNO (3mg/kg) e deixados na câmara por 3 horas. Este teste é denominado teste de “Condicionamento”. No terceiro dia, a porta que separa as câmaras foi removida e o animal foi colocado dentro da caixa sem qualquer administração de droga e registrado por um total de três horas para qualquer aparente condicionamento da câmara preferencial, denotado o “teste de preferência”. Labirinto em cruz elevado
[182] Para avaliar os níveis de ansiedade após a ativação selecionada do BLA usando DREADDs, foi usado o Labirinto em cruz elevado (EPM). Todos os animais estimulados no EPM foram registrados usando o software Stoelting ANY-maze 5,2. O EPM foi feito de acrílico preto e consistia em quatro braços em forma de cruz. Dois dos braços (opostos um do outro estavam abertos, ou seja, sem paredes, enquanto os dois braços restantes estavam fechados, ou seja, tinham paredes. Os animais foram injetados com CNO (3mg/kg) uma hora e meia antes do início do teste. No início do teste, os animais foram colocados no centro do labirinto e foram autorizados a explorar livremente os braços abertos e fechados do labirinto enquanto eram gravados por um total de 5 minutos. O tempo dos animais explorando os braços abertos ou fechados foi então quantificado a partir das gravações para determinar o nível de ansiedade dos animais. Resultados
[183] Utilizamos a variante de capsídeo AAV-MNM004 gerada pelo BRAVE para responder a uma questão importante a respeito da contribuição funcional das aferências da amígdala basolateral para o estriado dorsal (Figura 6). Isso foi conduzido usando uma abordagem quimiogenética induzida retrógrada (DREADD). Injetamos o vetor AAV-MNM004 que expressa recombinase Cre no estriado dorsal e um vetor quimogenético (DREADD) indutível por Cre (DIO) na amígdala basolateral (BLA) bilateralmente em ratos do tipo selvagem (Figura 6A). Após a indução seletiva da atividade dos neurônios BLA projetando-se para o estriado dorsal usando o ligante DREADD CNO, encontramos um fenótipo impressionante de medo e ansiedade exemplificado, neste documento, usando o labirinto em cruz elevado (EPM), onde os animais passaram significativamente menos tempo nos braços abertos (Figura 6 B) em comparação com animais de controle (onde o gene Cre foi substituído por GFP). Isso contrasta fortemente com a função considerada das projeções do BLA para o estriado ventral, promovendo estímulos positivos. Este fenótipo de ansiedade aumenta foi acompanhado por hipermobilidade significativa na arena de campo aberto e um fenótipo de medo, incluindo escavação excessiva, sudorese intensa e episódios de congelamento (Figura 6 C). Após os desafios de CNO, os animais foram sacrificados e o BLA corado para HA-tag (identificando a expressão de hM3Dq DREADD) ou mCherry (visualizando rM3Ds DREADD) usando imuno-histoquímica desenvolvida em uma coloração de precipitação marrom usando a reação DAB-peroxidase (Figura 6 D-E).
[184] Este exemplo mostra que os vetores virais modificados e partículas obtidas pelos métodos divulgados, neste documento, podem ser usados para ajudar a elucidar mecanismos celulares complexos. Exemplo 6 - Visão geral da sequência Sequência Nome Sequência ID NO: 1 AAV-MNM001 TVGPRGNASN AAPS 2 AAV-MNM002 ASSQSKPLAT QPPV 3 AAV-MNM003 NLTEYSLSRV DLGD 4 AAV-MNM003 YPDAVYLHRI DLGP 5 AAV-MNM004 VMSVLLVDTD ATQQ
6 AAV-MNM004 VMSVLLVDTD ATQQQLA 7 AAV-MNM004 VMSVLLVDTD NTQQQIA 8 AAV-MNM005 TDDGVSAPIL PNFH 9 AAV-MNM006 SALLPVGQPS HAPSVHLAAA TQ 10 AAV-MNM007 RTPGDEPAPA 11 AAV-MNM007 RTPGDEPAPA VAAQ 12 AAV-MNM008 FTSPLHKNEN TV 13 AAV-MNM008 FAYPLVKNDN HV 14 AAV-MNM008 SFTSPLHKNE NTVS 15 AAV-MNM009 FSKVSAETQA SPPE 16 AAV-MNM010 EDNRGINQKL AFNY 17 AAV-MNM011 GAYVAAN 18 AAV-MNM011 ADTVAAP 19 AAV-MNM011 TGDYVAANET HSGR 20 AAV-MNM012 ADSESGGHIT HSGM 21 AAV-MNM012 ADSESGEHIT HSGM 22 AAV-MNM013 ELFSSPN 23 AAV-MNM013 VLFSSPP 24 AAV-MNM013 GLIQSDQELFSSPN 25 AAV-MNM014 GQTGDSESVP DPQP 26 AAV-MNM014 GQTGDTESVP DPQP 27 AAV-MNM015 PAHLVNVSEG ANFT 28 AAV-MNM015 LVNVSEGANF T 29 AAV-MNM016 SALLEDPVGT VAPQI 30 AAV-MNM016 SALLEDPAGT VSSQI 31 AAV-MNM017 SIPGFPAEGS IPLP 32 AAV-MNM018 STLLPPELSD TTNAT 33 AAV-MNM018 STLLPPEVVE TANV
34 AAV-MNM019 EDENGTLKVT FPTP 35 AAV-MNM019 VDENGTPKPS SLGR 36 AAV-MNM020 SSTDPATGDV HAMG 37 AAV-MNM020 QSSSTDPATG DVHV 38 AAV-MNM020 QSSSTDPATG DVHA 39 AAV-MNM021 DPGYAETPYA SVSH 40 AAV-MNM022 PGGDVPPAGP GEI 41 AAV-MNM022 PGGEVPPAGP GAI 42 AAV-MNM022 LPGGEVPPAG PGAI 43 AAV-MNM023 QQIAAGPTEG APSV 44 AAV-MNM024 LVDTSGY 45 AAV-MNM024 YVDTSGY 46 AAV-MNM024 FIDISGY 47 AAV-MNM024 NTLVDTSGYN AEVS 48 AAV-MNM025 QVVAVEFDTF 49 AAV-MNM025 QTVAVEFDTF 50 AAV-MNM025 SGDQVVAVEF DTFR 51 AAV-MNM001 ACCGTGGGCCCCCGGGGCAACGCCAG
CAACGCCGCCCCCAGC 52 AAV-MNM002 GCCAGCAGCCAGAGCAAGCCCCTGGC
CACCCAGCCCCCCGTG 53 AAV-MNM003 AACCTGACCGAGTACAGCCTGAGCCG
GGTGGACCTGGGCGAC 54 AAV-MNM003 TACCCCGACGCCGTGTACCTGCACCG
GATCGACCTGGGCCCC 55 AAV-MNM004 GTGATGAGCGTGCTGCTGGTGGACAC
CGACGCCACCCAGCAG 56 AAV-MNM004 GTGATGAGCGTGCTGCTGGTGGACAC
CGACGCCACCCAGCAGCAGCTGGCC
57 AAV-MNM004 GTGATGAGCGTGCTGCTGGTGGACAC
CGACAACACCCAGCAGCAGATCGCC 58 AAV-MNM005 ACCGACGACGGCGTGAGCGCCCCCAT
CCTGCCCAACTTCCAC 59 AAV-MNM006 AGCGCCCTGCTGCCCGTGGGCCAGCC
CAGCCACGCCCCCAGCGTGCACCTGG
CCGCCGCCACCCAG 60 AAV-MNM007 CGGACCCCCGGCGACGAGCCCGCCCC
CGCC 61 AAV-MNM007 CGGACCCCCGGCGACGAGCCCGCCCC
CGCCGTGGCCGCCCAG 62 AAV-MNM008 TTCACCAGCCCCCTGCACAAGAACGAG
AACACCGTG 63 AAV-MNM008 TTCGCCTACCCCCTGGTGAAGAACGAC
AACCACGTG 64 AAV-MNM008 AGCTTCACCAGCCCCCTGCACAAGAAC
GAGAACACCGTGAGC 65 AAV-MNM009 TTCAGCAAGGTGAGCGCCGAGACCCA
GGCCAGCCCCCCCGAG 66 AAV-MNM010 GAGGACAACCGGGGCATCAACCAGAA
GCTGGCCTTCAACTAC 67 AAV-MNM011 GGCGCCTACGTGGCCGCCAAC 68 AAV-MNM011 GCCGACACCGTGGCCGCCCCC 69 AAV-MNM011 ACCGGCGACTACGTGGCCGCCAACGA
GACCCACAGCGGCCGG 70 AAV-MNM012 GCCGACAGCGAGAGCGGCGGCCACAT
CACCCACAGCGGCATG 71 AAV-MNM012 GCCGACAGCGAGAGCGGCGAGCACAT
CACCCACAGCGGCATGGC
72 AAV-MNM013 GAGCTGTTCAGCAGCCCCAAC 73 AAV-MNM013 GTGCTGTTCAGCAGCCCCCCCGC 74 AAV-MNM013 GGCCTGATCCAGAGCGACCAGGAGCT
GTTCAGCAGCCCCAAC 75 AAV-MNM014 GGCCAGACCGGCGACAGCGAGAGCGT
GCCCGACCCCCAGCCC 76 AAV-MNM014 GGCCAGACCGGCGACACCGAGAGCGT
GCCCGACCCCCAGCCC 77 AAV-MNM015 CCCGCCCACCTGGTGAACGTGAGCGA
GGGCGCCAACTTCACC 78 AAV-MNM015 CTGGTGAACGTGAGCGAGGGCGCCAA
CTTCACC 79 AAV-MNM016 AGCGCCCTGCTGGAGGACCCCGTGGG
CACCGTGGCCCCCCAG ATC 80 AAV-MNM016 AGCGCCCTGCTGGAGGACCCCGCCGG
CACCGTGAGCAGCCAGATC 81 AAV-MNM017 AGCATCCCCGGCTTCCCCGCCGAGGG
CAGCATCCCCCTGCCC 82 AAV-MNM018 AGCACCCTGCTGCCCCCCGAGCTGAG
CGACACCACCAACGCCACC 83 AAV-MNM018 AGCACCCTGCTGCCCCCCGAGGTGGT
GGAGACCGCCAACGTG 84 AAV-MNM019 GAGGACGAGAACGGCACCCTGAAGGT
GACCTTCCCCACCCCC 85 AAV-MNM019 GTGGACGAGAACGGCACCCCCAAGCC
CAGCAGCCTGGGCCGG 86 AAV-MNM020 AGCAGCACCGACCCCGCCACCGGCGA
CGTGCACGCCATGGGC
87 AAV-MNM020 CAGAGCAGCAGCACCGACCCCGCCAC
CGGCGACGTGCACGTG 88 AAV-MNM020 CAGAGCAGCAGCACCGACCCCGCCAC
CGGCGACGTGCACGCC 89 AAV-MNM021 GACCCCGGCTACGCCGAGACCCCCTA
CGCCAGCGTGAGCCAC 90 AAV-MNM022 CCCGGCGGCGACGTGCCCCCCGCCGG
CCCCGGCGAGATC 91 AAV-MNM022 CCCGGCGGCGAGGTGCCCCCCGCCG
GCCCCGGCGCCATC 92 AAV-MNM022 CTGCCCGGCGGCGAGGTGCCCCCCGC
CGGCCCCGGCGCCATC 93 AAV-MNM023 CAGCAGATCGCCGCCGGCCCCACCGA
GGGCGCCCCCAGCGTG 94 AAV-MNM024 CTGGTGGACACCAGCGGCTAC 95 AAV-MNM024 TACGTGGACACCAGCGGCTAC 96 AAV-MNM024 TTCATCGACATCAGCGGCTAC 97 AAV-MNM024 AACACCCTGGTGGACACCAGCGGCTAC
AACGCCGAGGTGAGC 98 AAV-MNM025 CAGGTGGTGGCCGTGGAGTTCGACAC
CTTC 99 AAV-MNM025 CTGACAAGACCACCCAGACCGTGGCC
GTGGAGTTCGACACCTTCGC 100 AAV-MNM025 AGCGGCGACCAGGTGGTGGCCGTGGA
GTTCGACACCTTCCGG 101 AAV2 VP1 MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKP
GPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGP FNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQL DSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFG GNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTA PGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQP ARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPA APSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADG VGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTW ALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGY STPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTT TIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQ GCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAV GRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTF EDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLY YLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIR DQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNS EYSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMAS HKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDI EKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNL QRGNRQAATADVNTQGVLPGMVWQDR DVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGF GLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFA SFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWN PEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEP
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1. Método de fabricação de uma biblioteca de vetores virais, o referido método compreendendo: i) selecionar um ou mais polipeptídeos candidatos de um grupo de polipeptídeos que tem ou suspeita-se que tenha uma propriedade desejada e recuperar as sequências dos referidos polipeptídeos;
ii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos candidatos, cada polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um dos referidos polipeptídeos candidatos de modo que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato seja representado por um ou mais fragmentos polipeptídicos de cada polipeptídeo candidato; iii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos tipo código de barras (barcode); iv) inserir cada polinucleotídeo candidato juntamente com um polinucleotídeo tipo código de barras em um vetor viral, compreendendo um gene de capsídeo e um genoma viral, obtendo assim uma pluralidade de vetores virais, cada um compreendendo um único polinucleotídeo candidato operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras, em que o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo, o gene de capsídeo está fora do genoma viral e o polinucleotídeo tipo código de barras é inserido no genoma viral; em que o vetor viral compreende um polinucleotídeo marcador que codifica um marcador detectável; v) amplificar a pluralidade de vetores virais obtidos na etapa iv) em um sistema de amplificação, em que cada vetor viral está presente em uma pluralidade de cópias no sistema de amplificação; e a) recuperar e transferir pelo menos uma primeira parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) em um sistema de referência, mapeando assim cada polinucleotídeo tipo código de barras em um polinucleotídeo candidato; e b) manter uma segunda parte da pluralidade de vetores virais no sistema de amplificação e, opcionalmente, transferir toda ou parte da referida segunda parte em um sistema de produção para obter uma pluralidade de partículas virais.
2. O método do item 1, em que um ou mais fragmentos de polipeptídeo são pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo sobrepostos.
3. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que o vetor viral é um plasmídeo.
4. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que o mapeamento de cada polinucleotídeo de código de barras para um polinucleotídeo candidato é feito por sequenciamento de uma região de cada vetor viral da pluralidade de vetores virais, a referida região compreendendo pelo menos o polinucleotídeo tipo código de barras e o polinucleotídeo candidato.
5. O método de qualquer um dos itens anteriores, em que o sequenciamento é realizado por sequenciamento de próxima geração, como o sequenciamento Illumina da região.
6. Método de manipulação de um vetor viral com uma propriedade desejada, que compreende o método de qualquer um dos itens de 1 a 5 e compreende ainda as etapas de; vi) recuperar uma fração de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) do item 1, ou recuperar pelo menos parte das partículas virais do sistema de produção da etapa v) b) do item 1, e colocar uma população de células em contato com os referidos vetores virais ou partículas virais recuperados; vii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; viii) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células selecionadas na etapa vii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; ix) projetar um vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa viii).
7. O método do item 6, compreendendo ainda a etapa de amplificação do vetor viral obtido na etapa ix) em um sistema de amplificação.
8. Método de fabricação de uma partícula viral com uma propriedade desejada, o referido método compreendendo o método de qualquer um dos itens de 1 a 5 e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos na etapa vi); viii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; ix) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células identificadas na etapa viii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; x) projetar um vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa ix); xi) produzir o vetor viral da etapa x) em um sistema de produção, obtendo assim o vetor viral ou a partícula viral com a propriedade desejada.
9. Método de distribuição de um transgene a uma célula alvo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a) proporcionar um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado e encapsulando um transgene, em que o vetor viral modificado ou a partícula viral modificada é o vetor viral ou a partícula viral definidos na etapa xi) do item 8; e b) injetar o referido vetor viral modificado ou a referida partícula viral modificada em um sítio de injeção.
10. Método, de acordo com o item 9, em que a partícula viral modificada compreende um capsídeo modificado compreendendo ou consistindo em um polipeptídeo que compreende ou consiste em uma variante da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50, em que no máximo um, dois ou três resíduos de aminoácidos foram deletados, modificados ou substituídos.
11. Biblioteca de vetores virais, cada vetor viral compreendendo: i) uma estrutura principal para expressar o vetor viral em uma célula hospedeira; ii) um gene de capsídeo e um polinucleotídeo candidato nele inserido, o referido polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um polipeptídeo candidato; iii) um polinucleotídeo marcador; e iv) um polinucleotídeo tipo código de barras; em que o polipeptídeo candidato é selecionado a partir de um grupo predefinido compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm ou suspeita-se que tenham uma propriedade desejada; em que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato é representado por um ou mais fragmentos de polipeptídeo na biblioteca; o polinucleotídeo candidato é inserido no gene de capsídeo do vetor viral de modo que possa ser transcrito e traduzido para um fragmento de polipeptídeo exibido no capsídeo e está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras inserido no genoma viral, e o polinucleotídeo marcador está compreendido no genoma viral, e o gene de capsídeo está fora do genoma viral.
12. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que um ou mais fragmentos de polipeptídeo são pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo sobrepostos.
13. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o polinucleotídeo marcador é o polinucleotídeo de código de barras.
14. A biblioteca de vetores virais, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o vetor viral é um vírus adeno-associado (AAV), um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, um vírus herpes simplex, um bocavírus ou um vírus da raiva, de preferência um vírus adenoassociado (AAV).
15. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o vetor viral compreende ainda pelo menos um gene de replicação.
16. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o vetor viral compreende ainda pelo menos um gene de montagem.
17. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o polinucleotídeo candidato está localizado entre a extremidade 5' do gene de capsídeo e a extremidade do terminal 3' do gene de capsídeo.
18. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o polipeptídeo marcador é selecionado do grupo que consiste em: uma proteína fluorescente, uma proteína bioluminescente, um gene de resistência a antibióticos, um gene citotóxico, um receptor de superfície, β-galactosidase, o receptor TVA, pró-mitóticos/oncogenes, transativadores, fatores de transcrição e proteínas Cas.
19. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o polinucleotídeo marcador compreende ainda uma sequência promotora.
20. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o promotor é um promotor constitutivo ou um promotor induzível.
21. A biblioteca de vetores virais, de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o promotor é uma fosfoglicerato quinase (PGK), beta actina de frango (CBA), citomegalovírus (CMV), estimulador precoce/β actina de frango (CAG), híbrido CBA (CBh), enolase neurônio específico (NSE), tirosina hidroxilase (TH), triptofano hidroxilase (TPH), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), membro da família L1 aldeído desidrogenase 1 (ALDH1L1), sinapsina-1, citomegalovírus (CMV), histona 1 (H1), RNA spliceossomo U6 (U6), calmodulina dependente da proteína quinase II (CamKII), fator de alongamento 1-alfa (Ef1a), caixa forkhead J1 (FoxJ1) ou promotor da proteína glial fibrilar ácida (GFAP).
22. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o polinucleotídeo tipo código de barras está localizado na região não traduzida 3' (3'-UTR) do polinucleotídeo marcador.
23. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a célula hospedeira é uma célula de mamífero, como uma célula humana, uma célula de inseto, como uma célula SF9, ou uma célula de levedura, como uma célula de Saccharomyces cerevisiae.
24. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a célula hospedeira é uma célula Hela, um neurônio primário, um neurônio induzido, um fibroblasto, uma célula-tronco embrionária, uma célula-tronco pluripotente induzida, uma célula de inseto, como uma célula SF9, uma célula de levedura ou uma célula embrionária, como uma célula renal embrionária, por exemplo, células HEK293.
25. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os polipeptídeos candidatos são selecionados a partir de: polipeptídeos virais, tais como um polipeptídeo de capsídeo ou um polipeptídeo de envelope; polipeptídeos relacionados a uma doença ou distúrbio; polipeptídeos que compartilham uma função comum; neurotoxinas e lectinas.
26. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que os polipeptídeos candidatos são polipeptídeos conhecidos por terem ou são suspeitos de terem uma propriedade desejada.
27. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que a propriedade desejada é uma ou mais de: - afinidade para uma determinada estrutura celular, como uma estrutura específica para um determinado tipo de células, como uma sinapse, ou para uma estrutura específica para um determinado evento celular, como divisão celular, diferenciação celular, ativação neuronal, inflamação ou dano ao tecido; - propriedades de transporte melhoradas, tais como transporte melhorado no ambiente em torno de uma célula hospedeira ou transporte melhorado através da barreira hematoencefálica; - aumento da capacidade de escapar do metabolismo hepático; - maior capacidade de evadir o sistema imunológico; - aumento da capacidade de ativar o sistema imunológico.
28. A biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens anteriores, em que o polinucleotídeo candidato, o polinucleotídeo marcador e/ou o polinucleotídeo tipo código de barras é otimizado por códons.
29. Uma célula ou uma pluralidade de células, compreendendo a biblioteca de vetores virais de acordo com qualquer um dos itens de 11 a 28.
30. Um vetor viral que codifica uma partícula viral para distribuição de um transgene a uma célula alvo, o referido vetor viral compreendendo um gene de capsídeo modificado e um transgene a ser distribuído para a célula alvo;
em que o gene de capsídeo modificado está fora do genoma viral e compreende ou consiste de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que melhora a distribuição do transgene e/ou o direcionamento para a célula alvo.
31. O vetor viral, de acordo com o item 30, em que o vetor viral é um vírus adenoassociado (AAV), um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, um vírus herpes simplex, um bocavírus ou um vírus da raiva.
32. O vetor viral de acordo com qualquer um dos itens de 30 a 31, em que o polipeptídeo compreende ou consiste da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50.
33. O vetor viral de acordo com qualquer um dos itens de 30 a 32, em que o polipeptídeo é selecionado a partir do grupo que consiste da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ
ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50.
34. O vetor viral de acordo com qualquer um dos itens 30 a 33, em que o transgene é inserido entre as sequências de repetição terminal (TR) do genoma viral.
35. O vetor viral de acordo com qualquer um dos itens de 30 a 34, em que o vetor viral após a injeção em um sítio de injeção promove o transporte retrógrado para regiões aferentes ao sítio de injeção.
36. Uma partícula viral codificada pelo vetor viral de acordo com qualquer um dos itens de 30 a 35.
37. Um vetor viral modificado ou partícula viral para entrega de um transgene a uma célula alvo, o referido vetor viral modificado ou partícula viral compreendendo um capsídeo modificado e um transgene a ser entregue à célula alvo; em que o capsídeo modificado aprimora um ou mais dos seguintes: entrega do transgene para a célula alvo, direcionamento para a célula alvo, infectividade do vetor viral modificado ou partícula viral modificada e/ou transporte retrógrado do vetor viral modificado ou partícula viral modificada em comparação a uma partícula viral não modificada compreendendo um gene de capsídeo nativo e o transgene.
38. O vetor viral modificado ou a partícula viral modificada de acordo com o item 37, em que o capsídeo modificado compreende ou consiste de um polipeptídeo compreendendo ou consistindo da SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21,
SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49 ou da SEQ ID NO: 50 .
39. O vetor viral modificado ou a partícula viral modificada de acordo com qualquer um dos itens de 37 a 38, em que o peptídeo é exibido no capsídeo modificado.
40. Uso de um vetor viral ou uma partícula viral de acordo com qualquer um dos itens 30 a 36, ou de um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada de acordo com qualquer um dos itens de 37 a 40, para terapia gênica.
41. Um vetor viral ou uma partícula viral de acordo com qualquer um dos itens de 30 a 35, ou um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada de acordo com qualquer um dos itens de 36 a 40, para uso em um método de tratamento de um distúrbio, tal como um distúrbio do sistema nervoso.
42. O vetor ou partícula viral ou o vetor ou partícula viral modificado para uso de acordo com o item 41, em que o distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em: deficiência de enzima, distúrbios metabólicos, agregopatia, oncogenicidade, hiper ou hipoatividade neuronal, desregulação de proteína e splicing errôneo de genes.
43. O vetor ou partícula viral ou o vetor ou partícula viral modificado para uso de acordo com qualquer um dos itens de 41 a 41, em que o distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em doença de Huntington, ataxia cerebelar, atrofia de múltiplos sistemas, depressão, epilepsia, esclerose lateral amiotrófica, acidente vascular cerebral, hemofilia, atrofia muscular espinhal, distrofia muscular.
44. Método de identificação de uma droga com um efeito desejado, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) Fornecer uma droga candidata; b) Administrar a droga candidata a uma célula; c) Fornecer uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado permitindo a distribuição da partícula viral para a célula de b) e um polinucleotídeo marcador; d) Monitorar e comparar a expressão e/ou localização do polipeptídeo marcador na presença e ausência da droga candidata; determinando assim se a droga candidata tem um efeito na expressão do polinucleotídeo marcador em que a partícula viral modificada e/ou o capsídeo modificado são conforme definido em qualquer um dos itens anteriores.
45. Método de aprimoramento do tropismo de um vetor ou partícula viral em direção a uma célula alvo, o referido método compreendendo o método de qualquer um dos itens de 1 a 5 e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador; viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo com expressão aumentada do marcador em comparação com a expressão do vetor viral de referência ou partícula viral de referência; x) projetar um vetor viral ou uma partícula viral com tropismo aprimorado compreendendo um gene de capsídeo modificado, em que o gene de capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa ix).
46. Um método de identificação de uma ou mais regiões de um polipeptídeo que confere uma propriedade desejada a uma partícula viral compreendendo um capsídeo modificado pela inserção do referido polipeptídeo nele, o referido método compreendendo o método, de qualquer um dos itens de 1 a 5 e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador; viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo com um perfil de expressão do marcador correspondente à propriedade desejada, identificando assim a região do polipeptídeo responsável pela referida propriedade.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de fabricação de uma biblioteca de vetores virais, caracterizado pelo fato de que compreende: i) selecionar um ou mais polipeptídeos candidatos de um grupo de polipeptídeos que tem ou suspeita-se que tenha uma propriedade desejada e recuperar as sequências dos referidos polipeptídeos; ii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos candidatos, cada polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um dos referidos polipeptídeos candidatos de modo que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato seja representado por um ou mais fragmentos polipeptídicos de cada polipeptídeo candidato; iii) fornecer uma pluralidade de polinucleotídeos tipo código de barras (barcode); iv) inserir cada polinucleotídeo candidato juntamente com um polinucleotídeo tipo código de barras em um vetor viral, compreendendo um gene do capsídeo e um genoma viral, obtendo assim uma pluralidade de vetores virais, cada um compreendendo um único polinucleotídeo candidato operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras, em que o polinucleotídeo candidato é inserido no gene do capsídeo, o gene do capsídeo está fora do genoma viral e o polinucleotídeo tipo código de barras é inserido no genoma viral; em que o vetor viral compreende um polinucleotídeo marcador que codifica um marcador detectável; v) amplificar a pluralidade de vetores virais obtidos na etapa (iv) em um sistema de amplificação, em que cada vetor viral está presente em uma pluralidade de cópias no sistema de amplificação; e a) recuperar e transferir pelo menos uma primeira parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa (v) em um sistema de referência, mapeando assim cada polinucleotídeo tipo código de barras em um polinucleotídeo candidato; e b) manter uma segunda parte da pluralidade de vetores virais no sistema de amplificação e, opcionalmente, transferir toda ou parte da referida segunda parte em um sistema de produção para obter uma pluralidade de partículas virais.
2. Método de manipulação de um vetor viral com uma propriedade desejada, caracterizado pelo fato de que compreende o método conforme definido na reivindicação 1, e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar uma fração de vetores virais do sistema de amplificação da etapa (v) b) da reivindicação 1, ou recuperar pelo menos parte das partículas virais do sistema de produção da etapa (v) b) da reivindicação 1, e colocar uma população de células em contato com os referidos vetores virais ou partículas virais recuperados; vii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; viii) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células selecionadas na etapa (vii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; ix) manipular um vetor viral compreendendo um gene do capsídeo modificado, em que o gene do capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa (viii).
3. Método de fabricação de uma partícula viral com uma propriedade desejada, caracterizado pelo fato de que compreende o método conforme definido na reivindicação 1 e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa (v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa (v) b); vii) colocar uma população de células em contato com os vetores virais recuperados ou partículas virais recuperados obtidas na etapa vi); viii) monitorar a expressão do marcador e selecionar as células em que a expressão do marcador segue um padrão desejado; ix) identificar os polinucleotídeos tipo código de barras expressos nas células identificadas na etapa (viii), identificando assim os polinucleotídeos candidatos responsáveis pela propriedade desejada e os polipeptídeos candidatos correspondentes; x) manipular um vetor viral compreendendo um gene do capsídeo modificado, em que o gene do capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa (ix); xi) produzir o vetor viral da etapa (x) em um sistema de produção, obtendo assim o vetor viral ou a partícula viral com a propriedade desejada.
4. Método de distribuição de um transgene a uma célula alvo, o referido método caracterizado pelo fato de que compreende: a) fornecer um vetor viral modificado ou uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado e encapsulando um transgene, em que o vetor viral modificado ou a partícula viral modificada é o vetor viral ou a partícula viral definidos na etapa xi) da reivindicação 3; e b) injetar o referido vetor viral modificado ou a referida partícula viral modificada em um sítio de injeção.
5. Biblioteca de vetores virais, cada vetor viral compreendendo: i) uma estrutura principal para expressar o vetor viral em uma célula hospedeira; ii) um gene do capsídeo e um polinucleotídeo candidato nele inserido, o referido polinucleotídeo candidato codificando um fragmento de polipeptídeo de um polipeptídeo candidato; iii) um polinucleotídeo marcador; e iv) um polinucleotídeo tipo código de barras; caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo candidato é selecionado a partir de um grupo predefinido compreendendo um ou mais polipeptídeos que têm ou suspeita-se que tenham uma propriedade desejada; em que, após a transcrição e a tradução, cada polipeptídeo candidato é representado por um ou mais fragmentos de polipeptídeo na biblioteca; o polinucleotídeo candidato é inserido no gene do capsídeo do vetor viral de modo que possa ser transcrito e traduzido para um fragmento de polipeptídeo exibido no capsídeo e está operacionalmente ligado a um polinucleotídeo tipo código de barras inserido no genoma viral, e o polinucleotídeo marcador está compreendido no genoma viral, e o gene do capsídeo está fora do genoma viral.
6. Biblioteca de vetores virais, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o vetor viral é um vírus adeno-associado (AAV), um retrovírus, um lentivírus, um adenovírus, um vírus herpes simplex, um bocavírus ou um vírus da raiva, de preferência um vírus adeno-associado (AAV).
7. Vetor viral que codifica uma partícula viral para distribuição de um transgene a uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende um gene do capsídeo modificado e um transgene a ser distribuído para a célula alvo, em que: o gene do capsídeo modificado está fora do genoma viral e compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que melhora a distribuição do transgene e/ou o direcionamento para a célula alvo.
8. Vetor viral, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 50.
9. Partícula viral modificada para distribuição de um transgene para uma célula alvo, caracterizada pelo fato de que compreende um capsídeo modificado e um transgene a ser distribuído para uma célula hospedeira, em que: o capsídeo modificado melhora um ou mais dos seguintes:
distribuição do transgene para a célula alvo, direcionamento para a célula alvo, infectividade da partícula viral e/ou transporte retrógrado da partícula viral modificada em comparação com uma partícula viral não modificada compreendendo um gene do capsídeo nativo e o transgene, e o gene do capsídeo modificado está fora do genoma viral.
10. Partícula viral modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o capsídeo modificado compreende um peptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO:
50.
11. Uso de um vetor viral conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 7 a 8, ou de uma partícula viral conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 9 a 10, caracterizado pelo fato de ser para terapia gênica.
12. Vetor viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 7 a 8, ou partícula viral, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 10, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento de um distúrbio, como um distúrbio do sistema nervoso.
13. Método de identificação de uma droga com um efeito desejado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) Fornecer uma droga candidata; b) Administrar a droga candidata a uma célula; c) Fornecer uma partícula viral modificada compreendendo um capsídeo modificado permitindo a distribuição da partícula viral para a célula de b) e um polinucleotídeo marcador; d) Monitorar e comparar a expressão e/ou localização do polipeptídeo marcador na presença e ausência da droga candidata; determinando assim se a droga candidata tem um efeito na expressão do polinucleotídeo marcador.
14. Método de aprimoramento do tropismo de um vetor ou partícula viral em direção a uma célula alvo, caracterizado pelo fato de que compreende o método conforme definido na reivindicação 1, e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa (v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa (v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em (vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador; viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo com expressão aumentada do marcador em comparação com a expressão do vetor viral de referência ou partícula viral de referência; x) manipular um vetor viral ou uma partícula viral com tropismo aprimorado compreendendo um gene do capsídeo modificado, em que o gene do capsídeo modificado compreende um dos polinucleotídeos candidatos identificados na etapa (ix).
15. Método de identificação de uma ou mais regiões de um polipeptídeo que confere uma propriedade desejada a uma partícula viral compreendendo um capsídeo modificado pela inserção do referido polipeptídeo nele, caracterizado pelo fato de que compreende o método conforme definido na reivindicação 1, e compreende ainda as etapas de: vi) recuperar pelo menos parte da pluralidade de vetores virais do sistema de amplificação da etapa (v) b) ou recuperar pelo menos parte da pluralidade de partículas virais do sistema de produção da etapa (v) b); vii) colocar uma população de células compreendendo células alvo em contato com os vetores virais ou partículas virais recuperados obtidos em (vi) e com um vetor viral de referência ou uma partícula viral de referência compreendendo um marcador;
viii) monitorar e comparar a expressão do marcador nas células alvo; ix) identificar os polinucleotídeos candidatos nas células alvo com um perfil de expressão do marcador correspondente à propriedade desejada, identificando assim a região do polipeptídeo responsável pela referida propriedade.
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