BR112020008022A2 - mitoflavoscinas: o direcionamento de enzimas contendo flavina elimina as células-tronco de câncer (cscs) por meio da inibição da respiração mitocondrial - Google Patents

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Abstract

  A presente invenção refere-se a compostos que se ligam às enzimas contendo flavina e inibem a função mitocondrial, aqui referidas como mitoflavoscinas. Métodos de triagem de compostos para a inibição mitocondrial e propriedades anticâncer são divulgados. Também são descritos métodos de uso de mitoflavoscinas para prevenir ou tratar câncer, infecções bacterianas e leveduras patogênicas, assim como métodos de uso de mitoflavoscinas para fornecer benefícios antienvelhecimentos. Compostos específicos de mitoflavoscina também são divulgados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MITOFLAVOSCINAS: O DIRECIONAMENTO DE ENZIMAS CONTENDO FLAVINA ELIMINA AS CÉLULAS-TRONCO DE CÂNCER (CSCS) POR MEIO DA INIBIÇÃO DA RESPIRAÇÃO MITOCONDRIAL".
CAMPO
[0001] A presente invenção refere-se às "mitoflavoscinas", compostos que se ligam a enzimas contendo flavina e inibem a função mitocondrial, e inclui métodos para sintetizar as mitoflavoscinas, métodos de uso de mitoflavoscinas para direcionar células-tronco cancerígenas e compostos farmacêuticos para o tratamento de câncer e redução da resistência do fármaco nas células cancerígenas, as composições farmacêuticas contendo uma ou mais mitoflavoscinas como o ingrediente ativo. Também são divulgadas "mitoflavinas" – compostos que são derivados da riboflavina que inibem a função mitocondrial.
ANTECEDENTES
[0002] Os pesquisadores têm se esforçado para desenvolver novos tratamentos anticâncer. As terapias convencionais contra o câncer (por exemplo, irradiação, agentes alquilantes tais como ciclofosfamida e antimetabólitos tais como 5-Fluorouracila) tentaram detectar e erradicar seletivamente as células cancerígenas de rápido crescimento, mediante a interferência com mecanismos celulares envolvidos no crescimento celular e na replicação do DNA. Outras terapias contra o câncer utilizaram imunoterapias que seletivamente ligam antígenos tumorais mutantes nas células cancerígenas de rápido crescimento (por exemplo, anticorpos monoclonais). Infelizmente, os tumores frequentemente se repetem após essas terapias no mesmo ou em locais diferentes, indicando que nem todas as células cancerígenas foram erradicadas. A recaída pode ser devida à dosagem quimioterápica insuficiente e/ou ao surgimento de clones de câncer resistentes à terapia. Portanto, novas estratégias de tratamento do câncer são necessárias.
[0003] Os avanços na análise mutacional permitiram o estudo aprofundado das mutações genéticas que ocorrem durante o desenvolvimento do câncer. Apesar de ter conhecimento do cenário genômico, a oncologia moderna teve dificuldade em identificar mutações controladoras primárias através dos subtipos de câncer. A dura realidade parece ser que o tumor de cada paciente é único e um único tumor pode conter várias células clonais divergentes. O que é necessário, então, é uma nova abordagem que enfatize as semelhanças entre os diferentes tipos de câncer. O direcionamento das diferenças metabólicas entre o tumor e as células normais é uma promessa como uma nova estratégia de tratamento do câncer. Uma análise dos dados de perfil de transcrição das amostras de câncer de mama humano revelou mais de 95 transcritos de mRNA elevados associados à biogênese mitocondrial e/ou translação mitocondrial. Sotgia et al., Cell Cycle, 11(23):4390-4401 (2012). Adicionalmente, mais de 35 dos 95 mRNA suprarregulados codificam as proteínas ribossômicas mitocondriais (MRPs). A análise proteômica das células- tronco do câncer de mama humano também revelou a superexpressão significativa de várias proteínas mitorribossômicas, assim como outras proteínas associadas à biogênese mitocondrial. Lamb et al., Oncotarget, 5(22):11029-11037 (2014).
[0004] A inibição funcional da biogênese mitocondrial utilizando os efeitos inespecíficos e não intencionais de certos antibióticos bacteriostáticos ou inibidores de OXPHOS fornece evidências adicionais de que as mitocôndrias funcionais são necessárias para a propagação de células-tronco cancerígenas. Os inventores mostraram recentemente que um corante fluorescente mitocondrial (MitoTracker)
poderia ser efetivamente utilizado para o enriquecimento e a purificação de células-tronco cancerígenas (CSCs) de uma população heterogênea de células vivas. Farnie et al., Oncotarget, 6:30272-30486 (2015). As células cancerígenas com a maior massa mitocondrial apresentaram maior capacidade funcional de sofrer crescimento independente da ancoragem, uma característica normalmente associada ao potencial metastático. A subpopulação de células 'Mito-elevado' também teve a maior atividade de iniciação de tumor in vivo, como mostrado utilizando modelos pré-clínicos.
SUMÁRIO
[0005] Em vista dos fundamentos anteriores, os inventores concentraram uma busca por novos inibidores metabólicos das mitocôndrias através da triagem de uma grande biblioteca de fármacos aprovados pela FDA e outros compostos de teste relacionados com alvos conhecidos e mecanismos de ação estabelecidos. Os inventores limitaram a pesquisa aos compostos que reduzem significativamente a produção de ATP mitocondrial, mas não induzem a morte celular (para evitar fármacos com efeitos colaterais tóxicos agudos). É um objetivo desta invenção identificar métodos atuais de identificação de mitoflavoscinas, compostos que se ligam às enzimas contendo flavina e inibem a produção de ATP mitocondrial. Também é um objetivo desta invenção identificar mitoflavoscinas tendo propriedades anticancerígenas e antibióticas. Também é um objetivo desta invenção identificar mitoflavoscinas tendo propriedades antienvelhecimento. Também é um objetivo desta invenção identificar mitoflavoscinas que funcionam como radiossensibilizadores e fotossensibilizadores. O termo "mitoflavoscinas" refere-se amplamente aos compostos que se ligam às enzimas contendo flavina e inibem as funções mitocondriais. Portanto, esses compostos podem ser projetados para direcionar e esgotar FMN, FAD e/ou riboflavina. A presente invenção refere-se ainda a métodos de identificação de mitoflavoscinas, métodos para fabricar tais mitoflavoscinas e métodos de uso de mitoflavoscinas para propósitos terapêuticos.
[0006] Adicionalmente, os dados gerados anteriormente sugerem que inibidores da função mitocondrial que direcionam o ribossomo mitocondrial, referidos como "mitorriboscinas", podem ser utilizados para direcionar bactérias e leveduras patogênicas, fornecer benefícios antienvelhecimento, funcionar como radiossensibilizadores e/ou fotossensibilizadores, sensibilizar células cancerígenas e células-tronco cancerígenas aos agentes quimioterápicos, produtos farmacêuticos e/ou outras substâncias naturais, tais como suplementos alimentares e restrição calórica. Dadas suas propriedades de inibição mitocondrial, as mitoflavoscinas podem ser utilizadas da mesma forma para direcionar bactérias e leveduras patogênicas, fornecer benefícios antienvelhecimento, funcionar como radiossensibilizadores e/ou fotossensibilizadores, sensibilizar células volumosas e células-tronco cancerígenas aos agentes quimioterápicos, produtos farmacêuticos e/ou outras substâncias naturais.
[0007] As mitoflavoscinas podem ser identificadas através de uma abordagem convergente de varredura de alto rendimento, seguida de validação in vitro para inibição mitocondrial. As mitoflavoscinas podem ser rapidamente desenvolvidas através da combinação do projeto de fármacos em ambiente virtual com a varredura fenotípica de fármacos.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0008] A FIGURA 1 mostra um diagrama esquemático que resume uma estratégia de desenvolvimento de fármacos de acordo com as modalidades da presente invenção.
[0009] A FIGURA 2 mostra os efeitos do cloreto de difenilenoiodônio (DPI) nos níveis de ATP.
[0010] A FIGURA 3A mostra os efeitos do DPI na viabilidade celular das células MCF7. A FIGURA 3B mostra os efeitos do DPI na viabilidade celular das células hTERT-BJ1.
[0011] A FIGURA 4A mostra os efeitos do tratamento de 24 horas com DPI na taxa de consumo de oxigênio (OCR). A FIGURA 4B mostra os efeitos do DPI na respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente.
[0012] A FIGURA 5A mostra os efeitos do tratamento de 24 horas com DPI na taxa de acidificação extracelular (ECAR). A FIGURA 5B mostra os efeitos do DPI na glicólise, reserva glicolítica, ECAR não derivada de glicose e capacidade de reserva glicolítica.
[0013] A FIGURA 6 mostra os efeitos do DPI na produção de L- lactato.
[0014] A FIGURA 7 mostra os efeitos do DPI na formação da mamosfera.
[0015] As Figuras 8A e 8B mostram os efeitos do DPI no marcador de células-tronco do câncer CD44+/CD24.
[0016] A FIGURA 9 mostra os efeitos do DPI na produção de espécies reativas mitocondriais de oxigênio (ROS).
[0017] A FIGURA 10 mostra os efeitos de um tratamento de uma hora com DPI na OCR.
[0018] A FIGURA 11 mostra os efeitos do tratamento de uma hora com DPI na ECAR.
[0019] As Figuras 12A-C mostram os efeitos do tratamento, "lavagem" e recuperação de DPI na OCR.
[0020] A FIGURA 13 mostra os efeitos do tratamento, "lavagem" e recuperação de DPI sobre a respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente.
[0021] A FIGURA 14A mostra os efeitos do tratamento a longo prazo com DPI sobre a OCR. A FIGURA 14B mostra os efeitos do tratamento a longo prazo com DPI sobre a morfologia e densidade das células MCF7.
[0022] A FIGURA 15 mostra uma comparação da estrutura do composto A, DPI e do composto B, mononucleotídeo de flavina (FMN).
[0023] A FIGURA 16 compara a estrutura do composto A, DPI, e do composto B relacionado, cloreto de difeniliodônio.
[0024] A FIGURA 17 mostra locais possíveis para a ligação de grupos R funcionais que podem ser adicionados ao DPI e compostos relacionados a DPI para direcionar as mitocôndrias.
[0025] A FIGURA 18 mostra exemplos de compostos de mitoflavina, derivados da riboflavina que inibem a função mitocondrial.
DESCRIÇÃO
[0026] A seguinte descrição ilustra as modalidades da presente invenção com detalhes suficientes para permitir a prática da presente invenção. Embora a presente invenção seja descrita com referência a essas modalidades específicas, deve-se considerar que a presente invenção pode ser incorporada em diferentes formas, e essa descrição não deve ser interpretada como limitativa de quaisquer reivindicações anexas às modalidades específicas aqui apresentadas. Em vez disso, essas modalidades são fornecidas de modo que esta invenção seja meticulosa e completa e transmita totalmente o escopo da presente invenção para aqueles versados na técnica.
[0027] O metabolismo mitocondrial é uma porta inexplorada para o tratamento de várias afecções, que variam de câncer à infecções bacterianas e fúngicas até envelhecimento. As mitocôndrias funcionais são necessárias para a propagação de células-tronco cancerígenas. A inibição do metabolismo mitocondrial nas células cancerígenas impede a propagação dessas células. A presente invenção explorou essa porta através da varredura de uma grande biblioteca de fármacos aprovados pela FDA e outros compostos de teste relacionados, com alvos conhecidos e mecanismos de ação estabelecidos, além de restringir a busca a compostos que reduzissem significativamente a produção de ATP, mas não induzissem a morte celular, para evitar fármacos com efeitos colaterais tóxicos agudos.
[0028] Os novos inibidores da produção de ATP mitocondrial que se ligam às enzimas contendo flavina - mitoflavoscinas, podem ser identificados por meio de uma abordagem que combina a triagem fenotípica de fármacos e validação funcional. A FIGURA 1 é uma visão geral dos métodos para identificar mitoflavoscinas através do uso aqui divulgado de triagem fenotípica de fármacos e validação funcional. As modalidades do método podem envolver a triagem fenotípica de fármacos S101 e a validação funcional S102 e, a partir dos resultados, selecionar um ou mais fármacos candidatos S103. A triagem fenotípica de fármacos S101 pode ser conduzida utilizando ensaios de depleção de ATP. Os ensaios de depleção de ATP podem identificar compostos que podem induzir funcionalmente a depleção de ATP sem induzir a morte celular, evitando assim os efeitos colaterais tóxicos. O ensaio de triagem pode ser executado através de uma biblioteca de moléculas. Por exemplo, durante o desenvolvimento inicial dos inventores, as células MCF7 (6.000 células/cavidade) foram plaqueadas em placas pretas de 96 cavidades de fundo claro e incubadas durante a noite antes do tratamento. Logo depois, um subconjunto da biblioteca Tocriscreen™ Compound (560 compostos) foi submetido à triagem fenotípica de fármacos em uma concentração de 20 µM (Bio-Techne Corp, MN, USA). Os compostos foram testados após 72 horas de incubação e as experiências foram executadas em triplicata. Após o tratamento, o meio foi aspirado das cavidades e as placas foram lavadas com PBS quente (suplementado com Ca2+ e Mg2+). Em seguida, as células foram incubadas com uma solução de coloração Hoechst 33342
(Sigma) (10 µg/ml) durante 30 minutos e lavadas com PBS. A fluorescência foi lida com uma leitora de placas utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão em 355/460-nm. Depois, o ensaio luminescente CellTiter-Glo (Promega) foi executado para medir a atividade metabólica (teor de ATP) nas mesmas cavidades que foram tratadas com um determinado composto. Os ensaios foram executados de acordo com o protocolo do fabricante. As intensidades de fluorescência (coloração Hoechst) e luminescência (teor de ATP) foram normalizadas para controles tratados apenas com veículo e foram apresentadas como porcentagens. Os resultados positivos foram rastreados novamente em uma concentração mais baixa (10 µM) para identificar compostos que induziram com potência a depleção de ATP. Deve-se observar que aqueles de habilidade na técnica podem optar por empregar os mesmos ensaios de depleção de ATP ou semelhantes, modificar esses ensaios, ou podem substituir o ensaio de depleção de ATP por outra metodologia para a triagem dos compostos selecionados para inibição mitocondrial (por exemplo, ensaios de consumo de oxigênio).
[0029] O DPI (cloreto de difenilenoiodônio) foi identificado como um potente indutor da depleção de ATP. Os inventores levantaram a hipótese de que o DPI induz a depleção de ATP em concentrações ainda mais baixas. Os inventores trataram células de câncer de mama humano (MCF7) com concentrações variadas de DPI durante 72 horas. Em seguida, as células foram submetidas à coloração fluorescente do DNA Hoechst para normalizar o número de células. Através do emprego de CellTiter-Glo como uma sonda, os inventores foram capazes de utilizar a luminescência para medir o teor de ATP nas mesmas cavidades. Em 72 horas de tratamento, o DPI 500 nM reduziu os níveis de ATP em > 80%, mas não induziu significativamente qualquer morte celular, visto que o número de células anexadas à placa permaneceu inalterado (conforme detectado pelo teor de DNA). A FIGURA 2 resume esses resultados e demonstra que o DPI esgota seletivamente os níveis de ATP sem induzir a morte celular maciça.
[0030] A presente invenção inclui métodos para confirmar a viabilidade celular. As pessoas de habilidade na técnica podem selecionar um ou mais métodos para confirmar a viabilidade celular adequada com relação à modalidade específica. Os inventores utilizaram um ensaio de sulforodamina B (SRB), que se baseia na medição do teor de proteína celular. Após tratamento durante cinco dias em placas de 96 cavidades, as células foram fixadas com ácido tricloroacético a 10% (TCA) durante 1 hora na câmara fria, e foram secadas durante a noite na temperatura ambiente. Depois, as células foram incubadas com SRB durante 15 min, lavadas duas vezes com ácido acético a 1% e secadas ao ar livre durante pelo menos 1 hora. Finalmente, o corante ligado à proteína foi dissolvido em uma solução Tris 10 mM, pH 8,8 e lido utilizando a leitora de placas em 540 nm. A FIGURA 3A mostra os efeitos do DPI na viabilidade celular das células MCF7. Em particular, os dados mostram que o DPI significativamente não afeta a viabilidade celular, mesmo após cinco dias de tratamento. O DPI mostrou pouca ou nenhuma toxicidade nas células MCF7, em uma concentração tão elevada quanto 33 nM. A FIGURA 3B mostra os efeitos do DPI sobre a viabilidade celular das células hTERT-BJ1. Resultados virtualmente idênticos também foram obtidos com fibroblastos normais (hTERT-BJ1), que apresentaram pouco ou nenhum efeito tóxico, até 100 nM, após cinco dias de incubação (FIGURA 3B).
[0031] A presente invenção envolve ainda métodos de validação funcional S102, durante a qual a função de um composto como um inibidor mitocondrial pode ser confirmada. Vários métodos podem ser utilizados para validação funcional, incluindo, por exemplo, análise de fluxo metabólico, ensaios de mamosfera, ensaios de viabilidade e atividade de antibiótico (antibacteriano e/ou antifúngico). Os inventores determinaram taxas de consumo de oxigênio em tempo real (OCR) e taxas de acidificação extracelular (ECAR) em células MCF7 utilizando o analisador Seahorse Extracellular Flux (XF96) (Seahorse Bioscience, MA, USA). Resumidamente, as células MCF7 foram mantidas em DMEM suplementado com FBS 10% (soro bovino fetal), GlutaMAX 2 mM e Pen-Strep 1%. 8.000 células por cavidade foram semeadas em placas de cultura celular com cavidade XF96 e incubadas durante a noite a 37 °C em uma atmosfera umidificada com CO2 5%. No dia seguinte, as células foram lavadas em meio de ensaio XF pré-aquecido (para medição da OCR, o meio de ensaio XF foi suplementado com glicose 10 mM, piruvato 1 mM e ajustado no pH 7,4). As células foram então mantidas em 175 μl/cavidade de meio de ensaio XF a 37 °C, em uma incubadora sem CO2 durante 1 hora. Durante a incubação, 25 μl de glicose 80 mM, oligomicina 9 μM, 2-desoxiglucose 1 M (para medição da ECAR) e 25 μl de oligomicina 10 μM, FCCP 9 μM, rotenona 10 μM, antimicina A 10 μM (para medição da OCR) em meio de ensaio XF foram carregados nas portas de injeção do cartucho do sensor XFe-96. Durante o experimento, o instrumento injetou esses inibidores nas cavidades em um determinado momento, enquanto que a ECAR/OCR foi medida continuamente. As medidas de ECAR e OCR foram normalizadas pelo teor de proteínas (ensaio de sulforodamina B). Os conjuntos de dados foram analisados pelo software XFe-96, utilizando ANOVA unidirecional e cálculos do teste t de Student. Todas as experiências foram realizadas em triplicata.
[0032] Os resultados de OCR mostram que o DPI teve pouco ou nenhum efeito em uma concentração de 2,5 nM. No entanto, em 5 nM, a respiração basal foi reduzida em ~50%. Finalmente, em 10 nM, a taxa de respiração basal diminuiu em ~85%, resultando em uma redução >90% na produção de ATP. A FIGURA 4A-B resume esses resultados e ilustra que o DPI inibe com potência a respiração mitocondrial. A FIGURA 4A mostra os efeitos do tratamento com DPI na OCR ao longo do tempo, e a FIGURA 4B mostra os efeitos do tratamento com DPI na respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória sobressalente. Deve-se observar que numerosos métodos são conhecidos para validação funcional e que pessoas de habilidade na técnica podem selecionar um ou mais, dependendo das necessidades de validação (por exemplo, outros ensaios que medem ou se aproximam da função mitocondrial).
[0033] Como mencionado, para determinar se os efeitos anti- mitocondriais do DPI induzem uma resposta glicolítica reativa, os inventores submeteram as células de câncer de mama tratadas com DPI a um "teste de estresse glicolítico", através da determinação da ECAR. As células MCF7 foram submetidas à análise de fluxo metabólico com o Seahorse XFe96, que também mede a ECAR como um marcador substituto para a produção de L-lactato. Após 24 horas de tratamento com DPI (2,5 nM), pouco ou nenhum efeito foi observado. No entanto, em DPI 10 nM, a glicólise foi aumentada em ~2 vezes. A FIGURA 5A-B destaca que o DPI induziu com potência um fenótipo glicolítico. A FIGURA 5A mostra os efeitos do DPI na ECAR ao longo do tempo. A FIGURA 5B mostra os efeitos do DPI na glicólise, reserva glicolítica e capacidade de reserva glicolítica.
[0034] Para confirmar que o aumento observado no ECAR correspondia à produção de L-lactato, os níveis de L-lactato foram medidos diretamente utilizando o ISCUSflex Microdialysis Analyzer (M Dialysis Inc., MA, USA). Os meios de cultura foram coletados, centrifugados e analisados com o ISCUSflex Microdialysis Analyzer após tratamento das células MCF7 com várias concentrações de DPI durante 1, 3 ou 5 dias. A calibração do instrumento foi executada por amostras fornecidas pelo fabricante. Então, os níveis de L-lactato foram medidos e normalizados com as amostras tiradas de células MCF7 tratadas apenas com veículo. A FIGURA 6 mostra que o DPI induziu uma produção significativa de L-lactato, quase dobrando a quantidade de lactato produzido, consistente com um aumento de 2 vezes na glicólise.
[0035] A presente abordagem pode, em algumas modalidades, envolver métodos de teste de compostos para propriedades anticâncer. Por exemplo, os inventores examinaram a capacidade do DPI em inibir a formação de mamosfera nas células MCF7. Uma suspensão de célula única de células MCF7 foi preparada utilizando a desagregação enzimática (1x Tripsina-EDTA, Sigma Aldrich) e manual (agulha de calibre 25). As células foram então plaqueadas em uma densidade de 500 células/cm2 no meio de mamosfera (DMEM-F12/B27/20-ng/ml de EGF/PenStrep) em condições não aderentes, em placas de cultura revestidas com (2-hidroxietilmetacrilato) (poly-HEMA, Sigma). As células foram cultivadas durante 5 dias e mantidas em uma incubadora umidificada a 37 °C em uma pressão atmosférica com dióxido de carbono/ar 5% (v/v). Após 5 dias em cultura, esferas >50 μm foram contadas utilizando um retículo de ocular, e a porcentagem de células plaqueadas que formaram esferas foi calculada e é referida como porcentagem de formação de mamosfera, normalizada para controles tratados apenas com veículo. Os ensaios de mamosfera foram executados em triplicata e repetidos três vezes de forma independente. A FIGURA 7 destaca que a propagação de CSC inibiu de forma dependente da dose o DPI no ensaio da mamosfera. O tratamento com DPI reduziu significativamente a propagação de CSC, de maneira dependente da concentração, com uma IC-50 de 3,23 nM. Deve ser observado que aqueles versados na técnica podem utilizar outros métodos conhecidos na especialidade para avaliar os efeitos candidatos de mitoflavoscina em uma linhagem celular específica sem se afastar da presente invenção. Também deve ser observado que aqueles versados na técnica podem avaliar os efeitos candidatos de mitoflavoscina em outros tipos de câncer, como os inibidores das células-tronco cancerígenas alvo (CSCs). As CSCs mostram características conservadas ou semelhantes na maioria dos tipos de câncer.
[0036] Para validar ainda mais as descobertas, os inventores utilizaram uma segunda abordagem independente para quantificar as "stemness (propriedades das células-tronco-tumorais)" nas células cancerígenas. Os inventores examinaram marcadores específicos da superfície celular, a saber, sondas de anticorpos fluorescentes direcionadas contra CD44 e CD24. A população de células CD44+/CD24- representa uma fração enriquecida com CSC. 1 x 105 células MCF7 foram plaqueadas em placas de 6 reservatórios em meio completo suplementado com FBS inativado por calor 10%. No dia seguinte, as células foram tratadas com DPI (5, 10, 50 nM) durante 5 dias. As células de controle isoladas do veículo (DMSO) foram processadas em paralelo. Resumidamente, 30.000 a 50.000 células vivas, como identificadas pela coloração com tintura 7-AAD, foram analisadas quanto à expressão de CD24/CD44. Os inventores utilizaram anticorpos CD24 (IOTest CD24-PE, Beckman Coulter) e CD44 (APC mouse Anti-Human CD44, BD Pharmingen) para análise de separador celular ativado por fluorescência (FACS), utilizando o BD LSR Fortessa (BD Bioscience). Os resultados são a média de três reproduções biológicas (repetições) e são expressos como porcentagens da intensidade de fluorescência média, normalizada para o controle. ANOVA unidirecional foi utilizada com o teste de comparações múltiplas de Bonferroni. As Figuras 8A e 8B mostram que o DPI seletivamente elimina essas CSCs da população total de células. A população de células CD44+/CD24- foi reduzida de forma dependente da dose pelo tratamento com DPI, com uma IC-50 de 10 nM. Deve-se observar que outros métodos são conhecidos para quantificar as stemness (propriedades das células-tronco-tumorais) nas células cancerígenas, e que pessoas de habilidade na técnica podem selecionar uma ou mais, dependendo das necessidades de validação.
[0037] Os inventores levantaram a hipótese de que o possível mecanismo pelo qual o DPI inibe a propagação de CSC é através da indução da produção de espécies reativas mitocondriais de oxigênio (ROS). Para testar esta hipótese, os inventores determinaram os efeitos do DPI na produção de ROS mitocondrial, na faixa de 5 a 50 nM. Resumidamente, a produção de superóxido pelas mitocôndrias foi medida pelo indicador de superóxido mitocondrial MitoSOX™ Red (ThermoFisher Sci., M36008). 3 x 105 células MCF7/cavidade foram plaqueadas em placas de 6 cavidades em meio completo suplementado com FBS inativado por calor 10%. No dia seguinte, as células foram tratadas com DPI (5, 50 nM) ou Rotenona (0,5 µM) durante 24 horas. Veículo isoladamente (DMSO) para células de controle foram processados em paralelo. Pelo menos 30.000 eventos foram registrados pelo FACS utilizando Fortessa (BD Bioscience). Três reproduções biológicas (repetições) foram analisadas em experimentos independentes. Os resultados são a média da média de cada experiência e são expressos como porcentagens da intensidade média de fluorescência normalizada para controle. A FIGURA 9 mostra que, em uma concentração de 5 nM, o DPI falhou em induzir qualquer produção detectável de ROS mitocondrial, em relação às células de controle, tratadas apenas com veículo. No entanto, DPI 50 nM induziu a mesma quantidade de ROS mitocondrial que Rotenona 500 nM, que serviu como controle positivo. Portanto, a mesma concentração de DPI (5 nM) que inibiu a formação da mamosfera em > 50% falhou em aumentar a produção de ROS mitocondrial. Como tal, os efeitos da baixa dose de DPI na "stemness (propriedades das células-tronco-
tumorais) nas células cancerígenas não podem ser explicados simplesmente pela produção de ROS.
[0038] Dada a alta potência do DPI, os inventores avaliaram sua capacidade de afetar rapidamente o metabolismo celular. A FIGURA 10 demonstra a ação rápida do DPI na respiração mitocondrial. Após apenas uma hora de tratamento com DPI, a OCR mitocondrial foi progressivamente reduzida, em uma faixa de concentração de 10 a 100 nM. A respiração basal foi inibida com uma IC-50 de 50 nM. Da mesma forma, o DPI induziu rapidamente um fenótipo glicolítico reativo. A glicólise foi aumentada progressivamente, em uma faixa de concentração de 5 a 100 nM. A FIGURA 11 mostra que a glicólise foi efetivamente duplicada.
[0039] Os efeitos do DPI também podem ser altamente reversíveis. Para avaliar a reversibilidade dos efeitos do DPI, as células MCF7 foram submetidas em primeiro lugar ao tratamento com DPI durante 24 horas. Em seguida, o DPI foi removido ("por lavagem") e as células foram cultivadas durante mais 24 horas, para permitir a recuperação. A FIGURA 12 mostra que, em DPI 10 nM, houve uma recuperação quase completa da respiração basal, aproximando-se de 100%, após apenas 24 horas (FIGURA 12C). Concentrações mais altas mostraram recuperação significativa, embora a recuperação não tenha sido tão completa. Da mesma forma, a FIGURA 13 mostra recuperação quase completa ou completa com relação à respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP e respiração máxima, para DPI 10 nM e 10 nM após populações de "removidas por lavagem".
[0040] Os inventores também examinaram os efeitos do tratamento a longo prazo com DPI sobre as células. As células MCF7 foram cultivadas durante 1 mês na presença de concentrações variáveis de DPI (10, 25 e 50 nM). Depois, a respiração mitocondrial foi avaliada. A FIGURA 14A ilustra que todas essas concentrações mostram inibição quase completa da respiração. Em uma concentração de DPI de 10 nM, a morfologia e a densidade das células permanecem inalteradas (FIGURA 14B).
[0041] Os inventores levantam a hipótese de que o DPI bloqueia a respiração mitocondrial através da inibição das enzimas contendo flavina (mononucleotídeo de flavina (FMN), dinucleotídeo de flavina adenina (FAD) e riboflavina). Uma comparação das estruturas de (A) DPI e de (B) FMN é mostrada na FIGURA 15. As enzimas contendo flavina incluem três componentes protéicos do complexo mitocondrial I – NDUFV1 (51 kD), NDUFV2 (24 kD) e NDUFV3 (10 kD). A SDHA também é uma flavo-proteína que faz parte do complexo mitocondrial II e do ciclo de Krebs. Utilizando o GeneCards® como uma ferramenta de referência de bioinformática, os inventores estimam que ~70% de todos os produtos gênicos que contêm flavina estão localizados nas mitocôndrias (Weizmann Institute of Science, Rehovot, IL). Como tal, os inventores levantam a hipótese das ações de DPI mediante a inibição das mitocôndrias no Complexo I e II. As ações do DPI podem ser por meio da indução de uma deficiência mitocondrial no FMN e/ou FAD, e/ou através da inativação de enzimas contendo flavina nas CSCs. Os inventores, portanto, esperam que o DPI, análogos de DPI e compostos relacionados com o DPI (por exemplo, cloreto de difeniliodônio), possam ser utilizados para tratar as CSCs (ver, por exemplo, a FIGURA 17). Deve ser observado que os métodos aqui divulgados podem ser utilizados para rastrear e validar tais compostos quanto à eficácia farmacêutica, incluindo, por exemplo, atividade anticâncer, atividade antienvelhecimento, atividade radiossensi-bilizante e atividade fotossensibilizante.
[0042] Em algumas modalidades, as mitoflavoscinas podem ser projetadas para direcionar as mitocôndrias através da ligação de pelo menos um sinal de direcionamento à membrana e/ou pelo menos um sinal de direcionamento mitocondrial. Sob a presente invenção, um composto pode ser modificado com um sinal de direcionamento que aumenta a especificidade do composto em direção ás mitocôndrias. Por exemplo, a FIGURA 18 mostra locais para a ligação de grupos R funcionais que podem ser adicionados ao DPI ou compostos relacionados com o DPI para direcionar as mitocôndrias. Em algumas modalidades, o sinal de direcionamento da membrana inclui ácidos graxos, tais como ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico e ácido oleico. Deve ser observado que esta não é uma lista abrangente de sinais de direcionamento de membrana e que um sinal de direcionamento de membrana não listado pode ser utilizado sem se afastar da presente invenção. Em algumas modalidades, o sinal de direcionamento mitocondrial inclui trifenil-fosfônio (TPP), componentes à base de guanidínio e ésteres de colina. Deve-se observar que esta não é uma lista abrangente de sinais de direcionamento mitocondrial, e que um sinal de direcionamento mitocondrial não listado pode ser utilizado sem se afastar da presente invenção.
[0043] Deve-se observar que os grupos R funcionais mostrados na Figura 18 podem ser iguais ou diferentes e podem ser selecionados dentre: hidrogênio, carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio, flúor, cloro, bromo, iodo, carboxila, alcanos, alcanos cíclicos, derivados à base de alcano, alquenos, alquenos cíclicos, derivados à base de alqueno, alquinos, derivados à base de alquino, cetonas, derivados à base de cetona, aldeídos, derivados à base de aldeído, ácidos carboxílicos, derivados à base de ácido carboxílico, éteres, derivados à base de éter, ésteres e derivados à base de éster, aminas, derivados à base de amino, amidas, derivados à base de amida, areno monocíclico ou policíclico, heteroarenos, derivados à base de areno, derivados à base de heteroareno, fenóis, fenóis, derivados à base de fenol, ácido benzóico, derivados à base de ácido benzóico, e um ou mais sinais de direcionamento mitocondrial, entre outros grupos funcionais identificados posteriormente. Para esclarecimento, os sinais de direcionamento mitocondrial são definidos como qualquer entidade química ou peptídica que aumenta a eficiência do direcionamento da molécula conectada às mitocôndrias. Tal modificação deve ser esperada para aumentar a potência e a eficácia de um composto. Assim, R pode ser qualquer sinal de direcionamento mitocondrial (peptídico ou químico), incluindo compostos catiônicos, tais como tri- fenil-fosfônio (TPP), uma porção à base de guanidínio e/ou ésteres de colina, entre outros.
[0044] Visto que o DPI direciona as enzimas contendo flavina, seus efeitos na função mitocondrial podem ser explicados pela indução farmacológica de uma deficiência aguda de Riboflavina (vitamina B2). A riboflavina é o precursor bioquímico do FAD e do FMN. Estudos anteriores mostraram que, quando as células HepG2 de mamífero foram cultivadas em meio livre de riboflavina, os principais componentes do complexo mitocondrial I (NDUFS1; NDUFV2) e do complexo II (SDHA) foram significativamente reduzidos (em até 5 vezes), assim como foram muitas outras proteínas relacionadas às mitocôndrias, tais como AIFM1, DLD, MCAD e NQO1. Dados anteriores também mostraram que as flavinas são automarcadores fluorescentes de maior poder mitocondrial e atividade de CSC elevada. Assim, o DPI, análogos de DPI e compostos relacionados com o DPI podem ser utilizados para tratar CSCs mediante o direcionamento das flavinas.
[0045] Visto que o DPI pode erradicar as CSCs através da inibição da respiração mitocondrial por meio da indução aguda e reversível de uma deficiência de flavina (provevelmente FMN), os inventores levantam a hipótese de que os mecanismos para induzir acentuadamente uma deficiência de riboflavina também podem ser úteis para erradicar terapeuticamente as CSCs. Outro método para induzir uma deficiência aguda de riboflavina pode ser o uso de derivados "dominantes negativos" da riboflavina. Esses derivados da riboflavina também podem ser intensificados pela adição de grupos químicos para aumentar sua potência. Por exemplo, a Roseoflavina [8-Demetil-8- (dimetilamino)-riboflavina ou 8-Dimetilaminorriboflavina] é um composto antibacteriano de ocorrência natural que é um derivado da riboflavina, que pode ser quimicamente modificado para otimizar seu potencial de direcionamento das CSCs. O Lumicromo (7,8-Dimetilaloxazina) é um fotoproduto fluorescente da degradação da riboflavina, que também pode ser quimicamente modificado para otimizar seu potencial de direcionamento das CSCs. Outros derivados comuns da riboflavina incluem: aloxazina, lumiflavina, 1,5-diidrorriboflavina e 1,5-diidroflavina. Esses derivados da riboflavina podem ser modificados para aumentar sua eficiência com relação ao direcionamento para as mitocôndrias através da adição de um sinal de direcionamento de membrana ou um sinal de direcionamento mitocondrial, tal como i) uma porção de ácido graxo ou ii) uma porção de TPP (trifenil fosfônio). Essas entidades de direcionamento mitocondrial podem ser denominadas "mitoflavinas", compostos que são derivados da riboflavina que inibem a função mitocondrial. Exemplos de mitoflavinas são fornecidos na FIGURA 19, em que FA significa uma porção de ácido graxo e TPP indica uma porção de trifenil fosfônio.
[0046] Os inventores levantam a hipótese de que um mecanismo adicional para os efeitos de DPI nas mitocôndrias é a inibição da produção de ROS (isto é, ânion superóxido), mediante o impedimento do transporte reverso de elétrons de succinato no Complexo mitocondrial I, e sem afetar o transporte de elétrons direto. O DPI impede a produção de uma reação lateral indesejada, que contribui para a produção desnecessária de ROSs e danos celulares, durante a respiração mitocondrial.
[0047] Evidências adicionais mostram que o direcionamento do metabolismo de outras vitaminas pode ser utilizado como uma estratégia de tratamento do câncer. Antifolatos são antimetabólitos que bloqueiam ou interrompem as ações do folato. A maioria dos fármacos antifolato exerce seus efeitos através do direcionamento da diidrofolato redutase (DHFR). O folato serve como um cofator para muitas enzimas biossintéticas (isto é, metiltransferases) que conduzem à biossíntese de metionina, serina, purina e timidina. Exemplos de fármacos antifolato aprovados pela FDA incluem: Methotrexate; Pemetrexed; Proguanil; Pyrimethamine; e Trimethoprim. As ações dos antifolatos direcionam preferivelmente as células que se dividem rapidamente, especialmente durante a síntese de DNA (a fase S do ciclo celular). Atualmente, o Methotrexate e o Pemetrexed são rotineiramente utilizados para o tratamento de vários tipos de câncer, tais como osteossarcoma, câncer pulmonar não de pequenas células, mesotelioma e malignidades hematológicas. Portanto, a terapia antifolato é considerada uma estratégia bem-sucedida no tratamento do câncer e de várias doenças parasitárias infecciosas, tais como malária, toxoplasmose e pneumocistose. No entanto, os antifolatos também possuem efeitos colaterais significativos, pois também afetam a proliferação de células normais, levando a náuseas, vômitos, dor abdominal, agranulocitose e anemia aplástica (supressão da medula óssea). O direcionamento de flavinas com DPI, análogos de DPI e compostos relacionados ao DPI (por exemplo, cloreto de difeniliodônio) pode fornecer melhores resultados sobre esses tratamentos atuais.
[0048] As mitocôndrias foram diretamente implicadas no processo de envelhecimento. No entanto, seu papel exato continua sendo um assunto muito debatido. Os inventores levantam a hipótese de que o DPI pode ser utilizado para manter as células normais em um estado de quiescência metabólica ou "animação suspensa", parecido com a hibernação, que pode ser extremamente útil para retardar ou reverter o processo de envelhecimento. Em apoio a esta afirmação, estudos anteriores em C. elegans mostraram que o DPI evita o acúmulo de lipofuscina (um subproduto ou marcador associado ao envelhecimento), durante a resposta ao estresse oxidativo.
[0049] A terminologia aqui utilizada na descrição da invenção é para o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não se destina a ser limitativa da invenção. Conforme utilizado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" se destinam também a incluir as formas plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A invenção inclui inúmeras alternativas, modificações e equivalentes que se tornarão evidente a partir da consideração dessa descrição detalhada.
[0050] Ficará entendido que, embora os termos "primeiro", "segundo", "terceiro", "a)", "b)" e "c)", etc. possam ser utilizados nesta invenção para descrever vários elementos da invenção, ela não deve ser limitada por estes termos. Estes termos são utilizados apenas para distinguir um elemento da invenção de outro. Assim, um primeiro elemento debatido abaixo pode ser denominado um aspecto de elemento e, similarmente, um terceiro sem se afastar dos ensinamentos da presente invenção. Assim, os termos "primeiro", "segundo", "terceiro", "a)", "b)" e "c)", etc. não se destinam necessariamente a transmitir necessariamente uma sequência ou outra hierarquia para os elementos associados, mas são utilizados apenas para propósitos de identificação. A sequência de operações (ou etapas) não se limita à ordem apresentada nas reivindicações.
[0051] A não ser que de outra maneira definida, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) aqui utilizados possuem o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa de habilidade prática na técnica à qual esta invenção pertence. Ficará ainda entendido que os termos tais como aqueles definidos em dicionários comumente utilizados, devem ser interpretados como tendo um significado que é consistente com o seu significado no contexto do presente pedido e da técnica relevante e não devem ser interpretados de maneira idealizada ou excessivamente no sentido formal, a menos que expressamente aqui definido. A terminologia aqui utilizada na descrição da invenção é para o propósito de descrever apenas as modalidades particulares e não se destina a ser limitativa da invenção. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências mencionadas nesta invenção são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de um conflito na terminologia, o presente relatório descritivo é controlador.
[0052] Também como aqui utilizado, "e/ou" refere-se e abrange toda e qualquer combinação possível de um ou mais dos itens listados associados, assim como a falta de combinações quando interpretadas na alternativa ("ou").
[0053] A não ser que o contexto indique de outra maneira, pretende- se especificamente que as várias características da invenção aqui descritas possam ser utilizadas em qualquer combinação. Além do mais, a presente invenção também contempla que, em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características aqui apresentadas pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se o relatório descritivo indicar que um complexo compreende os componentes A, B e C, pretende-se especificamente que qualquer um de A, B ou C, ou uma combinação destes, possa ser omitido e recusado.
[0054] Como aqui utilizada, a frase de transição "consistindo essencialmente em" (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como abrangendo os materiais ou etapas citados "e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas" da invenção reivindicada. Assim, o termo "consistindo essencialmente em" como aqui utilizado não deve ser interpretado como equivalente a "compreendendo".
[0055] O termo "cerca de", como aqui utilizado quando se refere a um valor mensurável, tal como, por exemplo, uma quantidade ou concentração e similares, significa abranger variações de ± 20%, ± 10%, ± 5% , ± 1%, ± 0,5% ou ainda ± 0,1% da quantidade especificada. Uma faixa aqui fornecida para um valor mensurável pode incluir qualquer outra faixa e/ou valor individual nesse particular.
[0056] Tendo assim descrito certas modalidades da presente invenção, deve ficar entendido que a invenção definida pelas reivindicações anexas não deve ser limitada por detalhes particulares apresentados na descrição acima, pois muitas de suas variações evidentes são possíveis sem se afastar do seu espírito ou escopo, conforme reivindicado em seguida.

Claims (35)

REIVINDICAÇÕES
1. Mitoflavoscina, caracterizada pelo fato de que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
2. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina compreende pelo menos um de difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, um sal farmaceuticamente aceitável de difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um sal farmaceuticamente aceitável de difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
3. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina possui pelo menos uma atividade anticâncer, atividade antienvelhecimento, atividade radiossensibilizante, atividade fotossensibilizante.
4. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina possui pelo menos uma atividade anticâncer, atividade antienvelhecimento, atividade radiossensibilizante, atividade fotossensibilizante.
5. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina sensibiliza as células cancerígenas a pelo menos um dentre agentes quimioterápicos, substâncias naturais e restrição calórica.
6. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina sensibiliza as células cancerígenas a pelo menos um dentre agentes quimioterapêuticos, substâncias naturais e restrição calórica.
7. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 1,
caracterizada pelo fato de que o pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo é selecionado de ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico e ácido oleico.
8. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo é selecionado de ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico e ácido oleico.
9. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina se liga a pelo menos um dentre dinucleotídeo de flavina adenina e mononucleotídeo de flavina.
10. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina se liga a pelo menos um dentre dinucleotídeo de flavina adenina e mononucleotídeo de flavina.
11. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina ainda compreende um composto de direcionamento de mitocôndrias.
12. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o composto de direcionamento de mitocôndrias é pelo menos um composto selecionado do grupo que compreende um segundo sinal de direcionamento da membrana e um sinal de direcionamento de ribossomo mitocondrial.
13. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o segundo sinal de direcionamento da membrana é selecionado dentre ácido palmítico, ácido esteárico, ácido mirístico e ácido oleico.
14. Mitoflavoscina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o sinal de direcionamento mitocondrial é um composto selecionado do grupo que compreende trifenil-fosfônio e guanidínio.
15. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma mitoflavoscina que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a mitoflavoscina compreende pelo menos um dentre difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, um sal farmaceuticamente aceitável de difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um sal farmaceuticamente aceitável de difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
17. Método de tratamento de uma infecção microbiana, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma mitoflavoscina que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um veículo farmaceuticamente aceitável.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a mitoflavoscina compreende pelo menos um dentre difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, um sal farmaceuticamente aceitável de difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um sal farmaceuticamente aceitável de difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
19. Método de tratamento de uma condição ou infecção relacionada à idade, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente com sua necessidade de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de uma mitoflavoscina e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a mitoflavoscina possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a mitoflavoscina compreende pelo menos um dentre difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, um sal farmaceuticamente aceitável de difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um sal farmaceuticamente aceitável de difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
21. Composição farmacêutica que compreende pelo menos uma mitoflavoscina, caracterizada pelo fato de que a mitoflavoscina possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma mitoflavoscina compreende pelo menos um dentre difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, um sal farmaceuticamente aceitável de difenilenoiodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo, difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo e um sal farmaceuticamente aceitável de difeniliodônio que possui pelo menos um sinal de direcionamento da membrana de ácido graxo.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a composição é marcada para pelo menos um dentre tratamento de um câncer,
tratamento de uma infecção bacteriana, tratamento de uma infecção por leveduras patogênicas, tratamento de uma condição relacionada à idade e redução dos efeitos do envelhecimento.
24. Método para identificar uma mitoflavoscina, caracterizado pelo fato de que compreende: a execução em um composto candidato conhecido de se ligar a uma enzima contendo flavina de pelo menos uma de uma triagem fenotípica de fármacos e uma triagem de inibição mitocondrial; e a validação da função do composto candidato como um inibidor mitocondrial.
25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a triagem fenotípica de fármacos compreende um ensaio de depleção de ATP.
26. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a triagem fenotípica de fármacos compreende pelo menos um dentre um ensaio de taxa de acidificação extracelular e um ensaio de taxa de consumo de oxigênio.
27. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que ainda compreende testar a mitoflavoscina identificada com relação a pelo menos uma de atividade anticâncer e atividade antimicrobiana.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a atividade anticâncer testada é a formação da mamosfera.
29. Mitoflavina.
30. Mitoflavina, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos um dentre um sinal de direcionamento da membrana e um sinal de direcionamento mitocondrial.
31. Método para a indução da deficiência de riboflavina em uma célula-tronco de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de pelo menos uma mitoflavina.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a mitoflavina compreende pelo menos um dentre um sinal de direcionamento da membrana e um sinal de direcionamento mitocondrial.
33. Mitoflavina, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende a fórmula geral em que FA é um ácido graxo.
34. Mitoflavina, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que compreende a fórmula geral em que TPP é uma porção de trifenil fosfônio.
35. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a validação da função do composto candidato como um inibidor mitocondrial compreende a execução, sobre o composto candidato, pelo menos uma análise de fluxo metabólico, um ensaio de formação de mamosfera, um ensaio de viabilidade, um ensaio antibacteriano e um ensaio de atividade antifúngica.
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