BR112020005747A2 - bactérias ácido-lácticas inovadoras e uso das mesmas - Google Patents

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BR112020005747A2
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neurological
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neurological mental
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BR112020005747-9A
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Dong-Hyun Kim
Myung Joo Han
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University-Industry Cooperation Group Of Kyung Hee University
Navipharm Co, Ltd
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Abstract

A presente invenção se refere a uma bactéria ácidoláctica inovadora e, mais particularmente, a uma composição compreendendo Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P) ou Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P), que são as inovadoras bactérias ácido-lácticas, úteis na prevenção e tratamento de uma doença mental neurológica ou uma doença inflamatória. Além disso, a presente invenção se refere a uma composição para diagnosticar uma doença mental neurológica compreendendo uma preparação para medir um nível de um microrganismo intestinal, um kit compreendendo tal preparação e um método para diagnosticar a doença mental neurológica compreendendo uma etapa de medir o nível do microrganismo intestinal.

Description

“BACTÉRIAS ÁCIDO-LÁCTICAS INOVADORAS E USO DAS MESMAS” Campo Técnico
[0001] A presente invenção se refere a Lactobacillus reuteri e Bifidobacterium adolescentis, que são bactérias ácido-lácticas inovadoras e, mais particularmente, a uma composição compreendendo as inovadoras bactérias ácido- lácticas úteis na prevenção e tratamento de uma doença mental neurológica ou uma doença inflamatória.
[0002] Adicionalmente, a presente invenção se refere a uma composição para diagnosticar a doença mental neurológica, compreendendo uma preparação para medir o nível de um microrganismo intestinal. Antecedentes
[0003] Na sociedade moderna, as doenças mentais neurológicas, incluindo ansiedade, depressão, esquizofrenia etc. estão aumentando devido a um rápido aumento do estresse, etc. Em particular, a tendência é que mais e mais pacientes sofram de transtornos mentais como depressão, ansiedade e semelhantes devido a várias causas, como causas sociais e estruturais, etc. em nossos tempos modernos, transbordando de individualismo.
[0004] Em casos graves, pacientes com transtornos mentais podem acabar cometendo suicídio. Em particular, é relatado que mais da metade dos pacientes deprimidos considera o suicídio. De fato, sabe-se que 10 % a 15 % desses pacientes realmente cometem suicídio.
[0005] Os transtornos mentais ainda não têm critérios claros e objetivos de julgamento, de modo que os sintomas dos mesmos podem variar dependendo dos respectivos pacientes. Se houver alguma suspeita de transtornos mentais, o tratamento é necessário de acordo com um diagnóstico e exame precisos. No entanto, a realidade é que esse tratamento adequado não é realizado devido a atitudes sociais negativas em relação aos tratamentos hospitalares para transtornos mentais. Além disso, fármacos — como antidepressivos, etc., usados para tratar transtornos mentais, não mostraram um efeito terapêutico satisfatório e podem causar efeitos colaterais graves, como doenças cardiovasculares, suicídio e semelhantes, de modo que esses fármacos são de uso limitado.
[0006] Por outro lado, como resultado de um estudo envolvendo o uso de produtos naturais, uma composição para o tratamento de transtornos mentais usando um extrato de Fomes fomentarius e um extrato de Lithospermum erythrorhizon é revelada na publicação de patente coreana nº 10-2017-0061457, mas ainda existe a necessidade de pesquisa contínua sobre bactérias ácido-lácticas eficazes capazes de tratar transtornos mentais.
[0007] Contra esses cenários, os presentes inventores identificaram que transtornos mentais podem ser diagnosticados a partir de uma alteração nas comunidades microbianas intestinais, enquanto estudavam um agente preventivo e terapêutico para transtornos mentais, e identificaram ainda que inovadoras bactérias ácido-lácticas isoladas de fezes humanas e de camundongos apresentam um efeito de inibir um fator de indução de doença neurodegenerativa, reduzindo comportamentos ansiosos e depressivos e semelhantes, de modo que as inovadoras bactérias ácido-lácticas podem ser úteis na prevenção ou tratamento de doenças mentais neurológicas, particularmente doenças neurodegenerativas e transtornos mentais, completando assim a presente invenção. Referências da Técnica Anterior Documento de Patente
[0008] [Documento de Patente 1] Publicação de patente coreana Nº 10-2017-0061457 Descrição Detalhada da Invenção Problema Técnico
[0009] Um objetivo da presente invenção é proporcionar uma bactéria ácido-láctica inovadora.
[0010] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, compreendendo a bactéria ácido- láctica inovadora.
[0011] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, compreendendo a bactéria ácido-láctica inovadora.
[0012] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para diagnosticar a doença mental neurológica, compreendendo uma preparação para medir um nível de um microrganismo intestinal.
[0013] Outro objetivo da presente invenção consiste em proporcionar um método para diagnosticar a doença mental neurológica, compreendendo: uma etapa de medir um nível de um microrganismo intestinal a partir de fezes isoladas de um indivíduo suspeito de ter a doença mental neurológica; e uma etapa de comparar o nível do dito microrganismo intestinal com o nível do microrganismo intestinal nas fezes de um grupo controle, em vez daquele da doença mental neurológica. Solução Técnica
[0014] Em um aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona uma bactéria ácido-láctica inovadora.
[0015] Particularmente, na presente invenção, a dita bactéria ácido-láctica inovadora pode ser Lactobacillus reuteri NK33 (instituição depositária: Centro Coreano de Cultura de Microrganismos (KCCM - Korean Culture Center of Microorganisms), data do depósito: 4 de agosto de 2017, número de acesso: KCCM12090P) ou Bifidobacterium adolescentis NK98 (instituição depositária: KCCM, data de depósito: 3 de agosto de 2018, número de acesso: KCCM12297P).
[0016] Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 de acordo com a presente invenção é caracterizado por ser uma bactéria ácido-láctica inovadora isolada e identificada a partir de fezes humanas ou de camundongo.
[0017] Uma sequência de 16S rDNA para identificação e classificação de Lactobacillus reuteri NK33 da presente invenção é igual à SEQ ID NO: 1 anexada ao presente relatório descritivo. Assim, o Lactobacillus reuteri NK33 de acordo com a presente invenção pode incluir a sequência de 16S rDNA de SEQ ID NO: l. Como resultado da análise da sequência de 16S rDNA da dita SEQ ID NO:1, foi verificado que tal sequência era 99 % homóloga àquela de cepas conhecidas de Lactobacillus reuteri, mostrando assim a mais alta relação filogenética molecular com Lactobacillus reuteri. Assim, a dita bactéria ácido-láctica foi identificada como Lactobacillus reuteri, denominada como Lactobacillus reuteri NK33 e depositada no KCCM em 4 de agosto de 2017 (número de acesso: KCCM12090P).
[0018] O Lactobacillus reuteri NK33 de acordo com a presente invenção é uma bactéria gram-positiva e seu tipo de célula é bacilo. Mais particularmente, as características fisiológicas do Lactobacillus reuteri NK33 podem ser analisadas de acordo com um método convencional do estado da técnica, cujos resultados são mostrados na tabela 3 a seguir. Particularmente, Lactobacillus reuteri NK33 pode usar como fonte de carbono L-arabinose, D-ribose, D-xilose, D-galactose, D-glicose, D-frutose, D-manose, manitol, sorbitol, N-acetil-glucosamina, amigdalina, arbutina, esculina, salicina, celobiose, maltose, lactose, melibiose, sacarose, trealose, melezitose, rafinose, gentiobiose, D-turanose e gluconato.
[0019] Uma sequência de 16S rDNA para identificação e classificação de Bifidobacterium adolescentis NK98 de acordo com a presente invenção é igual à SEQ ID NO: 38 anexada ao presente relatório descritivo. Assim, o Bifidobacterium adolescentis NK98 de acordo com a presente invenção pode incluir a sequência de 16S rDNA de SEQ ID NO:
38. Como resultado da análise da sequência de 16S rDNA da dita SEQ ID NO: 38, foi verificado que tal sequência era 98 % homóloga àquela de cepas conhecidas de Bifidobacterium adolescentis, mostrando assim a mais alta relação filogenética molecular com Bifidobacterium adolescentis. Assim, a dita bactéria ácido-láctica foi identificada como Bifidobacterium adolescentis, denominada como
Bifidobacterium adolescentis NK98 e depositada no KCCM em 3 de agosto de 2018 (número de acesso: KCCM12297P).
[0020] As características fisiológicas do Bifidobacterium adolescentis NK98 de acordo com a presente invenção podem ser analisadas de acordo com um método convencional do estado da técnica, cujos resultados são mostrados na tabela 4 a seguir. Particularmente, Bifidobacterium adolescentis NK98 pode usar como fonte de carbono D-glicose, D-manitol, D-lactose, D-sacarose, D- maltose, salicina, D-xilose, L-arabinose, gelatina, citrato férrico de esculina, D-celobiose, D-rafinose e D-trealose.
[0021] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, compreendendo uma bactéria ácido-láctica inovadora.
[0022] Na presente invenção, a dita bactéria ácido- láctica inovadora pode ser Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 ou uma mistura destes.
[0023] “Lactobacillus reuteri NK33” e “Bifidobacterium adolescentis NK98” de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0024] Particularmente, a bactéria ácido-láctica contida na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser uma célula bacteriana viva desta, uma célula bacteriana morta desta, um produto da cultura desta, um produto do esmagamento desta ou um extrato desta, mas qualquer tipo de bactéria ácido-láctica pode ser usado sem limitação, desde que possa alcançar um efeito preventivo ou terapêutico na doença mental neurológica.
[0025] Na presente invenção, o termo “produto de cultura” significa um objeto obtido pela cultura de uma bactéria ácido-láctica em um meio líquido ou sólido conhecido e é um conceito que abrange uma bactéria ácido- láctica inovadora na presente invenção.
[0026] Uma doença mental neurológica de acordo com a presente invenção pode ser uma doença neurodegenerativa ou um transtorno mental.
[0027] Particularmente, a doença mental neurológica de acordo com a presente invenção pode ser o transtorno mental, e o dito transtorno mental pode ser um ou mais selecionados a partir do grupo incluindo ansiedade, depressão, transtorno de humor, insônia, transtorno delirante, transtorno obsessivo, enxaqueca, estresse, transtorno de memória, transtorno de atenção e cognitivo.
[0028] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que, quando Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 é administrado a um modelo animal com estresse induzido, comportamentos ansiosos e depressivos causados por estresse são extremamente reduzidos; uma atividade da NF-xB é inibida em um hipocampo do modelo animal com estresse induzido; uma expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro aumenta; e quantidades de corticosterona, IL-6, TNF-a e lipopolissacarídeo (LPS), que são parâmetros de estresse no sangue, são diminuídas. A partir dos resultados, também foi identificado que uma composição farmacêutica compreendendo a dita bactéria ácido-láctica pode ser útil na prevenção ou tratamento de uma doença mental neurológica, particularmente um transtorno mental.
[0029] Particularmente, a doença mental neurológica de acordo com a presente invenção pode ser uma doença neurodegenerativa, em que a dita doença neurodegenerativa pode ser uma ou mais selecionada do grupo que consiste em doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, atrofia espinocerebelar, síndrome de Tourette, ataxia de Friedrich, doença de Machado-Joseph, demência, distonia, paralisia supranuclear progressiva e demência frontotemporal.
[0030] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que, quando as células nervosas são tratadas com a dita bactéria ácido-láctica juntamente com o hormônio do estresse corticosterona, a atividade de NF-xB, conhecida como substância de indução de doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer, é inibida e uma expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), conhecido por diminuir no envelhecimento, na demência e semelhantes, aumenta simultaneamente (Tabelas 5 e 6). A partir dos resultados, também foi identificado que a composição farmacêutica compreendendo as ditas bactérias ácido-lácticas pode ser útil na prevenção e tratamento da doença mental neurológica, particularmente a doença neurodegenerativa.
[0031] Além disso, em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que, quando coadministrado com Lactobacillus reuteri NK33 e Bifidobacterium adolescentis NK98, um efeito de melhora de uma doença mental neurológica, particularmente o efeito de redução do estresse, é notavelmente aumentado em comparação com cada grupo administrado com as ditas bactérias ácido- lácticas sozinhas (Tabela 20).
[0032] Na presente invenção, a dita composição farmacêutica pode compreender ainda Bifidobacterium adolescentis IM38 KCCM11807P.
[0033] o dito Bifidobacterium adolescentis IM38 KCCM11807P é uma bactéria ácido-láctica conhecida revelada na publicação de patente coreana nº 10-2017-0090359 e está facilmente disponível com base na publicação de patente coreana nº 10-2017-0090359.
[0034] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que, quando Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 e Bifidobacterium adolescentis IM38 são coadministrados a um modelo animal com estresse induzido, comportamentos ansiosos e depressivos causados por estresse são notavelmente reduzidos e uma quantidade de corticosterona, que é um parâmetro de estresse no sangue, diminui.
[0035] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, compreendendo Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 ou uma mistura destes.
[0036] “Lactobacillus reuteri NK33” e “Bifidobacterium adolescentis NK98” de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0037] Particularmente, a bactéria ácido-láctica contida na composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser uma célula bacteriana viva desta, uma célula bacteriana morta desta, um produto da cultura desta, um produto do esmagamento desta ou um extrato desta, mas qualquer tipo de bactéria ácido-láctica pode ser usado sem limitação, desde que possa alcançar um efeito preventivo ou terapêutico na doença inflamatória.
[0038] Na presente invenção, o termo “produto de cultura” significa um objeto obtido pela cultura de uma bactéria ácido-láctica em um meio líquido ou sólido conhecido e é um conceito que abrange uma bactéria ácido- láctica inovadora na presente invenção.
[0039] A doença inflamatória de acordo com a presente invenção pode ser uma ou mais selecionada do grupo que inclui artrite, gota, hepatite, asma, obesidade, corneíte, gastrite, enterite, nefrite, colite, diabetes, tuberculose, bronquite, pleurisia, peritonite, espondilite, pancreatite, dor inflamatória, uretrite, cistite, vaginite, arteriosclerose, septicemia, queimadura, dermatite, periodontite e gengivite.
[0040] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que, quando macrófagos isolados de um camundongo são tratados com as ditas bactérias ácido- lácticas juntamente com lipopolissacarídeo (LPS), um indutor da reação inflamatória, uma reação inflamatória é notavelmente inibida (Tabelas 5 e 6). A partir dos resultados, também foi identificado que a composição farmacêutica compreendendo as ditas bactérias ácido-láticas de acordo com a invenção pode ser útil na prevenção e tratamento da doença inflamatória.
[0041] Particularmente, a doença inflamatória pode ser colite.
[0042] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que, quando Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 é administrado a um modelo animal com colite induzida por estresse, o comprimento do cólon do modelo animal, que é um indicador de colite, se recupera a um nível normal e as quantidades de mieloperoxidase, COX-2 e iNOS, que são parâmetros da colite, diminuem e a atividade do TNF-a também diminui (Fig. e Tabela 15). A partir dos resultados, também foi identificado que a composição farmacêutica compreendendo o dito Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 pode ser útil na prevenção e tratamento da doença inflamatória, particularmente colite.
[0043] Uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, ou uma composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença inflamatória de acordo com a presente invenção pode ser preparada em uma forma de dosagem farmacêutica por um método bem conhecido no estado da técnica, de modo que um componente ativo de tal composição pode ser proporcionado por liberação rápida, suspensa ou prolongada, após ser administrado a um mamífero. Na preparação de uma forma de dosagem, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável, na medida em que tal veículo não suprima uma atividade de uma bactéria ácido-lática inovadora.
[0044] o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir, sem limitação, aqueles usados convencionalmente, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, amido, goma de acácia, alginato, gelatina, fosfato de cálcio, silicato de cálcio, celulose, metilcelulose, celulose microcristalina,
polivinil pirrolidona, água, hidroxibenzoato de metila, hidroxibenzoato de propila, talco, estearato de magnésio, óleo mineral e semelhantes. Além disso, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, pode compreender um diluente ou excipiente tal como uma carga, extensor, aglutinante, umectante, agente desintegrante, tensoativo, etc., e outros aditivos farmaceuticamente aceitáveis.
[0045] Uma dosagem da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção precisa ser uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A “quantidade farmaceuticamente eficaz” significa uma quantidade suficiente para prevenir ou tratar doenças mentais neurológicas ou doenças inflamatórias a uma relação benefício/risco razoável aplicável ao tratamento médico. Um nível de dose eficaz pode ser selecionado por técnicos no assunto de acordo com fatores como o método de formulação, a condição e peso do paciente, o sexo, idade e grau de doença do paciente, a forma do medicamento, a via e período de administração, a taxa de excreção, sensibilidade da reação, etc. A quantidade eficaz pode variar dependendo da via de tratamento, do uso de excipiente e da possibilidade de uso com outros medicamentos, como reconhecido por técnicos no assunto. No entanto, no caso de uma preparação Para administração oral para obter um efeito preferido, a composição de acordo com a presente invenção pode ser geralmente administrada a um adulto em uma quantidade de 0,0001 a 100 mg/kg por dia, de preferência 0,001 a 100 mg/kg por dia com base em 1 kg de peso corporal. Quando essa preparação é administrada como mostrado acima,
Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 de acordo com a presente invenção pode ser administrado em uma quantidade de 1 x 10º? UFC/60 kg a 1 x 10!! UFC/60 kg por dia. Tal administração pode ser feita uma vez ao dia ou dividida em várias vezes ao dia. A dita dosagem não limita o escopo da presente invenção em nenhum aspecto.
[0046] A composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, ou a composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença inflamatória de acordo com a presente invenção pode ser administrada a mamíferos como camundongos, gado, seres humanos, etc., por de várias vias. Particularmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser administrada por via oral ou parenteral (por exemplo, aplicada ou injetada por via intravenosa, subcutânea ou intraperitoneal), mas pode ser de preferência, administrada por via oral. Uma preparação sólida para administração oral pode incluir pó, grânulo, comprimido, cápsula, cápsula mole, pílula, etc. Uma preparação líquida para administração oral pode incluir um agente de suspensão, um líquido para uso interno, emulsão, xarope, aerossol, etc., mas também pode incluir vários excipientes, por exemplo, umectante, um agente adoçante, um agente aromatizante, conservante, etc., além de água e parafina líquida, que são diluentes simples frequentemente usados. Uma preparação para administração parenteral pode ser usada para ser formulada em uma forma de dosagem de preparação externa e preparação injetável esterilizada como solução aquosa esterilizada, solvente líquido não aquoso, um agente de suspensão, emulsão, colírio, pomada para os olhos, xarope, supositório, aerossol, etc., de acordo com os respectivos métodos convencionais e, de preferência, pode ser usada preparando uma composição farmacêutica em creme, gel, adesivo, spray, pomada, emplastro, loção, linimento, pomada para os olhos, colírio, pasta Ou cataplasma, mas sem limitação. Uma preparação para administração local pode ser na forma anidra ou aquosa, dependendo de uma prescrição médica. Como o solvente não aquoso e o agente de suspensão acima, podem ser usados propilenoglicol, polietilenoglicol, óleo vegetal como azeite, éster injetável como oleato de etila, etc. Como base do supositório acima, podem ser utilizados witepsol, macrogol, tween 61, manteiga de cacau, óleo de laurina, glicerogelatina, etc.
[0047] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona um método para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica compreendendo uma etapa de administração de Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 ou uma mistura destes a um indivíduo.
[0048] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona um método para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, compreendendo uma etapa de administração de Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 ou uma mistura destes a um indivíduo.
[0049] os termos “Lactobacillus reuteri NK33”, “Bifidobacterium adolescentis NK98”, “administração”, “doença mental neurológica”, “doença inflamatória” e semelhantes de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0050] O indivíduo se refere a um animal e pode ser tipicamente um mamífero, no qual o tratamento usando a bactéria ácido-láctica inovadora da invenção pode apresentar um efeito benéfico. Um exemplo preferível de tal indivíduo pode incluir primatas como seres humanos, bem como um rato, camundongo, macaco, cachorro, gato, vaca, cavalo, porco, ovelha ou cabra. Além disso, esses indivíduos podem incluir todos os indivíduos com um sintoma de uma doença mental neurológica ou uma doença inflamatória, ou com risco de ter tal sintoma.
[0051] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona um alimento funcional para a saúde para prevenir ou melhorar uma doença mental neurológica, compreendendo —“Lactobacillus reuteri NK33 Bifidobacterium adolescentis NK98 ou uma mistura destes.
[0052] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona um alimento funcional para a saúde para prevenir ou tratar uma doença inflamatória, compreendendo Lactobacillus reuteri NK33, Bifidobacterium adolescentis NK98 ou uma mistura destes.
[0053] os termos “Lactobacillus reuteri NK33”, “Bifidobacterium adolescentis NK98”, “administração”, “doença mental neurológica”, “doença inflamatória” e semelhantes de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0054] O alimento funcional para a saúde, que enfatiza a função moduladora do alimento no corpo, é um alimento com valor agregado por meio de um método físico, bioquímico ou de bioengenharia, de modo que o alimento possa agir para expressar suas funções para uma finalidade específica. Um componente desse alimento funcional para a saúde é projetado e processado para exercer completamente sua função moduladora no corpo in vivo, a qual está envolvida na defesa de um corpo vivo, no ajuste do ritmo do corpo, na prevenção de uma doença e ajudando na recuperação da doença, e pode compreender aditivos alimentares suplementares que são aceitáveis,como alimentos, adoçantes ou matérias-primas funcionais.
[0055] No caso de usar Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98 de acordo com a presente invenção como um alimento funcional para a saúde (ou aditivos para bebidas funcionais para a saúde), as ditas bactérias ácido-láticas podem ser adicionadas ao alimento tal como são, usadas juntamente com outros alimentos ou componentes alimentares, ou usadas adequadamente de acordo com um método convencional. Uma quantidade mista das ditas bactérias ácido-lácticas pode ser determinada adequadamente dependendo da finalidade do seu uso (prevenção, saúde, melhoria ou tratamento terapêutico).
[0056] o alimento funcional para a saúde pode compreender vários nutrientes, vitaminas, minerais (eletrólitos), agentes aromatizantes, como agentes aromatizantes sintéticos, agentes aromatizantes naturais e semelhantes, agentes corantes e intensificadores (queijo, chocolate, etc.), ácido péctico e seus sais, ácido orgânico, espessantes coloidais de proteção, agentes de ajuste de pH, estabilizantes, conservantes, glicerina, álcool, carbonatadores usados em bebidas carbonatadas, etc. Além disso, o alimento funcional para a saúde de acordo com a presente invenção pode compreender polpa para preparar bebidas à base de frutas e vegetais. Tais componentes podem ser usados sozinhos ou em combinação e uma proporção de tais aditivos geralmente é selecionada a partir de uma faixa de 0,001 a 50 partes em peso em relação à um peso total da composição.
[0057] Um tipo de alimento funcional para a saúde não tem nenhuma limitação específica. Como alimento, ao qual as ditas bactérias ácido-lácticas podem ser adicionadas, há salsichas, carnes, pão, chocolates, salgadinhos, doces, produtos de confeitaria, macarrão instantâneo, pizza, outros tipos de macarrão, gomas de mascar, produtos lácteos incluindo sorvetes, sopas diversas, bebidas, chás, bebidas saudáveis, bebidas alcoólicas, complexos vitamínicos, etc. No caso de ser formulado em bebidas, um componente líquido que é adicionado às bebidas além das inovadoras bactérias ácido-láticas pode incluir, sem limitação, vários flavorizantes, carboidratos naturais ou semelhantes como um componente adicional, tal como contido nas bebidas convencionais. Os carboidratos naturais mencionados acima podem ser monossacarídeos (por exemplo, glicose, frutose, etc.), dissacarídeos (por exemplo, maltose, sacarose, etc.) e polissacarídeos (por exemplo, açúcar convencional, como dextrina, ciclodextrina, etc.), além de álcool de açúcar como xilitol, sorbitol, eritritol, etc.
[0058] Em outro aspecto para alcançar os ditos objetivos, a presente invenção proporciona uma composição para diagnosticar uma doença mental neurológica compreendendo uma preparação para medir um nível de microrganismos intestinais.
[0059] Os termos como “doença mental neurológica”, etc., de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0060] Na presente invenção, o termo “microrganismo intestinal” se refere a um microrganismo presente no trato digestivo, particularmente o microrganismo presente especificamente nos intestinos, em que tal microrganismo intestinal pode ser um ou mais selecionados a partir do grupo incluindo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias, lactobacilos, B-proteobactérias, õ- proteobactérias, y-proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias.
[0061] Particularmente, uma composição para diagnóstico de acordo com a presente invenção pode diagnosticar uma doença mental neurológica se houver um aumento no nível de um ou mais microrganismos selecionados do grupo incluindo B-proteobactérias, i-proteobactérias, y-proteobactérias, e£- proteobactérias e enterobactérias entre os ditos microrganismos intestinais; tal composição pode diagnosticar a doença mental neurológica se houver uma diminuição na nível de um microrganismo selecionado a partir do grupo incluindo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias e lactobacilos entre os ditos microrganismos intestinais; e tal composição pode diagnosticar a doença mental neurológica se houver um aumento no nível de um ou mais microrganismos selecionados do grupo incluindo B-proteobactérias, d-proteobactérias, y- proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias entre os ditos microrganismos intestinais, e se houver uma diminuição em um nível de um microrganismo selecionado a partir do grupo incluindo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias e lactobacilos entre os ditos microrganismos intestinais.
[0062] Particularmente, as ditas enterobactérias, cujo nível aumenta, podem ser uma ou mais selecionadas a partir do grupo incluindo Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e Morganella morganii.
[0063] Além disso, os ditos lactobacilos cujo nível diminui podem ser um ou mais selecionados do grupo incluindo Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus rhamnosus e as ditas bifidobactérias cujo nível diminui pode ser Bifidobacterium animalis.
[0064] A composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, proporcionada na presente invenção, compreende uma preparação capaz de medir um nível de um microrganismo intestinal, em que uma ocorrência da doença mental neurológica em um indivíduo pode ser identificada medindo o nível do microrganismo intestinal a partir de fezes isoladas do indivíduo, que precisa ser identificado sobre a ocorrência da doença mental neurológica, por meio da preparação contida na dita composição. O dito indivíduo pode ser um animal, de preferência um mamífero, por exemplo, primatas como seres humanos, bem como um rato, camundongo, macaco, cachorro, gato, vaca, cavalo, porco, ovelha ou cabra.
[0065] A preparação pode ser usada para identificar se a doença mental neurológica ocorreu ou não no indivíduo, medindo o nível do microrganismo intestinal isolado das fezes do dito indivíduo.
[0066] A preparação capaz de medir o dito nível do microrganismo intestinal pode ser particularmente um iniciador, sonda ou semelhante, capaz de medir um nível de um gene específico do microrganismo intestinal; pode ser um anticorpo, aptâmero ou semelhante, capaz de medir um nível de uma proteína expressa pelo dito gene específico; pode ser um iniciador, sonda ou semelhante, para analisar quantitativamente uma sequência de 168 rDNA do microrganismo intestinal; e pode ser uma preparação para a pirossequenciamento, etc., para analisar quantitativamente uma sequência de DNA do genoma do microrganismo intestinal, mas não particularmente limitada a ela, desde que a preparação possa ser usada para analisar quantitativamente o microrganismo intestinal isolado das fezes do indivíduo.
[0067] Particularmente, um iniciador específico para firmicutes, o dito microrganismo intestinal, pode ser um par de iniciadores consistindo na SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3; um iniciador específico para bacteroidetes pode ser um par de iniciadores consistindo na SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5; um iniciador específico para B-proteobactéria pode ser um par de iniciadores consistindo na SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7; um iniciador específico para 5/y-proteobactéria pode ser um par de iniciadores consistindo na SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 9; um iniciador específico para e-proteobactéria pode ser um par de iniciadores consistindo na SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11; um iniciador específico para actinobactéria pode ser um par de iniciadores consistindo na SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 13; um iniciador específico para enterobactérias pode ser um iniciador consistindo na SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 19.
[0068] Em uma modalidade exemplar da presente invenção,
os níveis de microrganismos intestinais foram medidos através da realização de pirossequenciamento por meio de uma preparação Ppara pirossequenciamento contendo um iniciador codificado de SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 19 na Tabela 1 (Exemplo Experimental 3).
[0069] A composição de acordo com a presente invenção pode compreender ainda uma preparação para medir uma quantidade de lipopolissacarídeo (LPS). Particularmente, a preparação para medir a dita quantidade de lipopolissacarídeo (LPS) pode ser uma preparação convencionalmente usada para medir a quantidade de lipopolissacarídeo (LPS), mais particularmente uma preparação incluída no kit de ensaio do lisado de amebócito de Limulus (LAL), mas sem limitação.
[0070] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, foi identificado que a quantidade de lipopolissacarídeo (LPS) aumenta como resultado da análise de fezes de um modelo animal com um transtorno mental induzido (Figs. 1, 2, 7 ell).
[0071] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um kit para diagnosticar uma doença mental neurológica compreendendo a dita composição.
[0072] O kit de acordo com a presente invenção pode incluir um recipiente de coleta capaz de coletar fezes de um indivíduo a ser identificado sobre uma ocorrência da doença mental neurológica, usando a referida composição; uma solução tampão para extrair um microrganismo intestinal nas fezes; um meio de medição usado para medir o microrganismo intestinal; e semelhantes.
[0073] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para diagnosticar uma doença mental neurológica, compreendendo: uma etapa de medir um nível de um microrganismo intestinal a partir de fezes isoladas de um indivíduo suspeito de ter a doença mental neurológica; e uma etapa de comparar o nível do dito microrganismo intestinal com um nível do microrganismo intestinal nas fezes de um grupo controle, em vez daquele da doença mental neurológica.
[0074] Além disso, a presente invenção proporciona um método para fornecer informações para diagnosticar uma doença mental neurológica, compreendendo: uma etapa de medir um nível de um microrganismo intestinal a partir de fezes isoladas de um indivíduo suspeito de ter a doença mental neurológica; e uma etapa de comparar o nível do dito microrganismo intestinal com um nível do microrganismo intestinal nas fezes de um grupo controle, em vez daquele da doença mental neurológica.
[0075] As fezes significam fezes isoladas e coletadas de um indivíduo, como uma amostra para medir o nível de um microrganismo intestinal.
[0076] Particularmente, o microrganismo intestinal pode ser um ou mais selecionados a partir do grupo incluindo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias, lactobacilos, B-proteobactérias, ô-proteobactérias, vY- proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias.
[0077] O método para diagnosticar uma doença mental neurológica ou fornecer informações sobre ela de acordo com a presente invenção pode diagnosticar se a doença mental neurológica ocorre ou tem um risco de ocorrer, pela identificação de um microrganismo, cujo nível aumenta,
entre os ditos microrganismos intestinais.
[0078] Particularmente, o método para diagnosticar uma doença mental neurológica ou fornecer informações sobre ela pode compreender ainda uma etapa de determinar um indivíduo, cujo nível de um microrganismo intestinal aumenta, como a doença mental neurológica, comparando o nível do microrganismo intestinal nas fezes de um indivíduo suspeito de ter a doença mental neurológica, com um nível do microrganismo intestinal nas fezes de um grupo controle, em vez daquele da doença mental neurológica.
[0079] O microrganismo intestinal, cujo nível aumenta, pode ser um ou mais selecionados a partir do grupo incluindo B-proteobactérias, ô-proteobactérias, vY- proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias.
[0080] Particularmente, as enterobactérias podem ser uma ou mais selecionadas a partir do grupo incluindo Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e Morganella morganii.
[0081] Além disso, o método para diagnosticar uma doença mental neurológica ou fornecer informações sobre ela de acordo com a invenção pode diagnosticar se a doença mental neurológica ocorre ou tem um risco de ocorrer, pela identificação de um microrganismo cujo nível aumenta, entre os ditos microrganismos intestinais.
[0082] Os termos como “doença mental neurológica”, etc., de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0083] Particularmente, o método para diagnosticar uma doença mental neurológica ou fornecer informações sobre ela pode compreender ainda uma etapa de determinar um indivíduo, cujo nível de um microrganismo intestinal diminui, como a doença mental neurológica, comparando um nível do microrganismo intestinal nas fezes de um indivíduo suspeito de ter a doença mental neurológica, com um nível do microrganismo intestinal nas fezes de um grupo controle, em vez daquele da doença mental neurológica.
[0084] O microrganismo intestinal, cujo nível diminui, pode ser um ou mais selecionados do grupo incluindo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias e lactobacilos.
[0085] Além disso, os ditos lactobacilos podem ser um ou mais selecionados do grupo incluindo Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus rhamnosus e as bifidobactérias podem ser Bifidobacterium animalis.
[0086] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, como resultado da identificação de uma alteração em uma comunidade microbiana intestinal usando fezes isoladas de um modelo animal com estresse induzido, como estresse por imobilização, estresse por antibiótico ou semelhantes, foi identificado que os níveis de B-proteobactérias, õ- proteobactérias, y-proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias aumentam e os níveis de bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias e lactobacilos diminuem em comparação com um modelo animal sem estresse (Figs. 2, 6, 8, 10 e 12). Em particular, foi identificado que, como uma enterobactéria específica cujo nível aumenta, existem Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e Morganella morganii; como um lactobacilo particular cujo nível diminui, existe o Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus rhamnosus; e como uma bifidobactéria particular cujo nível diminui, há Bifidobacterium animalis.
[0087] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um uso de uma bactéria ácido-lática inovadora para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica. Particularmente, a presente invenção proporciona um uso de Lactobacillus reuteri NK33 para prevenir ou tratar a doença mental neurológica. Além disso, a presente invenção proporciona um uso de Bifidobacterium adolescentis NK98 para prevenir ou tratar a doença mental neurológica.
[0088] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um uso de uma bactéria ácido-láctica inovadora para prevenir ou tratar uma doença inflamatória. Particularmente, a presente invenção proporciona um uso de Lactobacillus reuteri NK33 para prevenir ou tratar a doença inflamatória. Além disso, a presente invenção proporciona um uso de Bifidobacterium adolescentis NK98 para prevenir ou tratar a doença inflamatória.
[0089] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um uso de uma composição compreendendo uma bactéria ácido- láctica inovadora para preparar um fármaco para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica. Particularmente, a presente invenção proporciona um uso de uma composição compreendendo Lactobacillus reuteri NK33 para preparar um fármaco para prevenir ou tratar a doença mental neurológica. Além disso, a presente invenção proporciona um uso de uma composição compreendendo Bifidobacterium adolescentis NK98 para preparar um fármaco para prevenir ou tratar a doença mental neurológica.
[0090] os termos “Lactobacillus reuteri NK33”, “Bifidobacterium adolescentis NK98”, “doença mental neurológica”, “doença inflamatória” e semelhantes de acordo com a presente invenção são iguais aos descritos acima.
[0091] Os valores numéricos descritos no presente relatório descritivo devem ser interpretados como incluindo uma faixa de seus equivalentes, salvo indicação em contrário.
[0092] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes através dos Exemplos preferenciais para compreender melhor a presente invenção. No entanto, os seguintes Exemplos são fornecidos apenas para o propósito de ilustrar a presente invenção e, assim, a presente invenção não se limita a isso. Efeitos Vantajosos
[0093] Uma bactéria ácido-láctica inovadora de acordo com a presente invenção, isto é, Lactobacillus reuteri NK33 ou Bifidobacterium adolescentis NK98, tem um efeito na inibição de um fator indutor de doença neurodegenerativa e na redução de comportamentos ansiosos e depressivos. Assim, a bactéria ácido-láctica inovadora de acordo com a presente invenção pode ser usada como uma composição para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, e é particularmente eficaz na prevenção e tratamento de uma doença neurodegenerativa e um transtorno mental.
[0094] Além disso, a bactéria ácido-láctica inovadora de acordo com a presente invenção é eficaz na inibição de uma reação inflamatória e, portanto, pode ser usada em uma composição para prevenir ou tratar uma doença inflamatória e é particularmente eficaz na prevenção e tratamento de colite.
[0095] Além disso, uma composição para medir um nível de microrganismos intestinais de acordo com a presente invenção é eficaz no diagnóstico de uma doença mental neurológica pela medição do nível de microrganismos intestinais. Breve Descrição dos Desenhos
[0096] A Fig. l mostra os resultados da medição de comportamentos ansiosos e indicadores sanguíneos em relação a um camundongo (IS) submetido a estresse por imobilização; (a) é um gráfico que identifica que o tempo gasto nos braços abertos (OT) e entradas nos braços abertos (OE) diminui como resultado de um teste do labirinto em cruz elevado; (b) é um gráfico que identifica que o tempo na área clara diminui como resultado de um teste de transição claro/escuro; (c) é um gráfico que identifica que um comportamento de esconder esferas aumenta em um teste de esconder esferas; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo e um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui; (e) é um gráfico que identifica que a corticosterona no sangue aumenta; (£) é um gráfico que identifica que a IL-6 no sangue aumenta; (g) é um gráfico que identifica que o TNF-a no sangue aumenta; e (h) é um gráfico que identifica que o lipopolissacarídeo (LPS) no sangue aumenta.
[0097] A Fig. 2 (a) é um diagrama que identifica que há uma alteração na comunidade microbiana intestinal nas fezes de um camundongo (IS) submetido a estresse por imobilização; e a Fig. 2 (b) é um gráfico que identifica que há um aumento no lipopolissacarídeo (LPS) nas fezes de um camundongo (IS) submetido a estresse por imobilização.
[0098] A Fig. 3 mostra os resultados da medição dos indicadores de colite em relação a um camundongo (IS) submetido a estresse por imobilização; (a) é um gráfico que identifica que há uma diminuição no comprimento do cólon de um camundongo (1IS) submetido a estresse por imobilização; (b) é um gráfico que identifica que a mieloperoxidase aumenta no cólon; (c) é um gráfico que identifica que o TNF-a aumenta no cólon; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta e as expressões de COX-2 e iNOS aumentam no cólon; e (e) é uma imagem que identifica que ocludina e claudina-l1 diminuem no cólon.
[0099] A Fig. 4 mostra os resultados da identificação de um estado de um modelo animal (FIS), administrado com fezes de um modelo animal com estresse induzido por imobilização; (a) é um gráfico que identifica que o tempo gasto nos braços abertos (OT) e entradas nos braços abertos (OE) diminui como resultado de um teste do labirinto em cruz elevado; (b) é um gráfico que identifica que o tempo na área clara diminui como resultado de um teste de transição claro/escuro; (c) é um gráfico que identifica que um comportamento de esconder esferas aumenta em um teste de esconder esferas; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo e um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui; (e) é um gráfico que identifica que o comprimento do cólon diminui; e (£) é um gráfico que identifica que a mieloperoxidase aumenta no cólon.
[0100] A Fig. 5 mostra os resultados da medição de indicadores sanguíneos em relação a um modelo animal (FIS) administrado com fezes de um modelo animal com estresse induzido por imobilização; (a) é um gráfico que identifica que a corticosterona no sangue aumenta; (b) é um gráfico que identifica que a IL-6 no sangue aumenta; e (c) é um gráfico que identifica que o TNF-a no sangue aumenta.
[0101] A Fig. 6 mostra os resultados da identificação de uma mudança nos indicadores de colite e na comunidade microbiana intestinal em relação a um modelo animal (FIS administrado com fezes de um modelo animal com estresse induzido por imobilização; (a) é um gráfico que identifica que o TNF-a aumenta; (b) é um gráfico que identifica que a IL-6 aumenta no cólon; (c) é um gráfico que identifica que a IL-10 diminui no cólon; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta e as expressões de COX-2 e iNOS aumentam no cólon; e (e) é um diagrama que identifica que uma comunidade microbiana intestinal nas fezes se altera.
[0102] A Fig. 7 mostra os resultados da medição de comportamentos ansiosos e indicadores sanguíneos em relação a um camundongo (AP) submetido a estresse por antibiótico; (a) é um gráfico que identifica que o tempo gasto nos braços abertos (OT) e entradas nos braços abertos (OE) diminui como resultado de um teste do labirinto em cruz elevado; (b) é um gráfico que identifica que o tempo na área clara diminui como resultado de um teste de transição claro/escuro; (c) é um gráfico que identifica que um comportamento de esconder esferas aumenta em um teste de esconder esferas; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo e um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui; (e) é um gráfico que identifica que a corticosterona no sangue aumenta; (f£f) é um gráfico que identifica que a IL-6 no sangue aumenta; (9) é um gráfico que identifica que o TNF-a no sangue aumenta; e (h) é um gráfico que identifica que o lipopolissacarídeo (LPS) no sangue aumenta.
[0103] A Fig. 8 (a) é um diagrama que identifica que há uma alteração na comunidade microbiana intestinal nas fezes de um camundongo (AP) submetido a estresse por antibiótico; e a Fig. 8 (b) é um gráfico que identifica que há um aumento no lipopolissacarídeo (LPS) nas fezes de um camundongo (AP) submetido a estresse por antibiótico.
[0104] A Fig. 9 mostra os resultados da medição dos indicadores de colite em relação a um camundongo (AP) submetido a estresse por antibiótico; (a) é um gráfico que identifica que há uma diminuição no comprimento do cólon; (b) é um gráfico que identifica que a mieloperoxidase aumenta no cólon; (c) é um gráfico que identifica que o TNF-a aumenta no cólon; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta e as expressões de COX-2 e iNOS aumentam no cólon; e (e) é uma imagem que identifica que ocludina e claudina-l1 diminuem no cólon.
[0105] A Fig. 10 (A) é um diagrama que identifica qual bactéria aumenta como resultado da cultura de fezes de um camundongo (IS) submetido a estresse por imobilização e fezes de um camundongo (AP) submetido a estresse por antibiótico em um meio seletivo; e a Fig. 10 (B) é um diagrama que identifica qual bactéria diminui como resultado da cultura de fezes do camundongo (IS) submetido a estresse por imobilização e fezes do camundongo (AP) submetido a estresse por antibiótico em um meio seletivo.
[0106] A Fig. 11 mostra resultados da medição de comportamentos ansiosos e indicadores sanguíneos em relação a um camundongo (AP) administrado com um microrganismo aumentado nas fezes de camundongos submetidos a estresse por imobilização e estresse por antibiótico; (a) é um gráfico que identifica que o tempo gasto em braços abertos (OT) e entradas em braços abertos (OE) diminui notavelmente em um grupo administrado com Klebsiella oxytoca, como resultado de um teste do labirinto em cruz elevado com camundongos administrados com Klebsiella oxytoca (KO), Escherichia coli (CE), Aerococcus urinaeequi (AU) e Morganella morganii (MM); (b) é um gráfico que identifica que o tempo gasto em braços abertos (OT) e entradas em braços abertos (OE) diminui como resultado de um teste do labirinto em cruz elevado com um camundongo administrado com Klebsiella oxytoca (KO); (c) é um gráfico que identifica que o tempo na área clara diminui como resultado de um teste de transição claro/escuro; (d) é um gráfico que identifica que um comportamento de esconder esferas aumenta em um teste de esconder esferas; (e) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-KxB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo e um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui; (£) é um gráfico que identifica que a corticosterona no sangue aumenta; (9g) é um gráfico que identifica que a IL-6 no sangue aumenta; (h) é um gráfico que identifica que o TNF-a no sangue aumenta; e (i) é um gráfico que identifica que o lipopolissacarídeo (LPS) no sangue aumenta.
[0107] A Fig. 12 (a) é um diagrama que identifica que há uma alteração na comunidade microbiana intestinal nas fezes de um camundongo (KO) administrado com Klebsiella oxytoca;
e a Fig. 12 (b) é um gráfico que identifica que há um aumento no lipopolissacarídeo (LPS) nas fezes de um camundongo (KO) administrado com Klebsiella oxytoca.
[0108] A Fig. 13 mostra os resultados da medição dos indicadores de colite em relação a um camundongo (KO) administrado com Klebsiella oxytoca; (a) é um gráfico que identifica que o comprimento do cólon diminui; (b) é um gráfico que identifica que a mieloperoxidase aumenta no cólon; (c) é um gráfico que identifica que o TNF-a aumenta no cólon; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta e as expressões de COX-2 e iNOS aumentam no cólon; e (e) é uma imagem que identifica que ocludina e claudina-l1 diminuem no cólon.
[0109] A Fig. 14 mostra os resultados da medição de comportamentos ansiosos e de comparação de indicadores sanguíneos em relação a um grupo (IS), no qual um camundongo "submetido a estresse por imobilização é administrado com soro fisiológico e outro grupo é administrado com Lactobacillus reuteri NK33 (ISHLR), uma bactéria ácido-láctica inovadora; (a) é um gráfico que identifica que o tempo gasto em braços abertos (OT) e entradas em braços abertos (OE) aumenta como resultado de um teste do labirinto em cruz elevado com o grupo administrado com Lactobacillus reuteri NK33 (IS+LR), a bactéria ácido-láctica inovadora; (b) é um gráfico que identifica que o tempo na área clara aumenta como resultado de um teste de transição claro/escuro; (c) é um gráfico que identifica que um comportamento de esconder esferas diminui em um teste de esconder esferas; (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p-p65/p65) é inibida no hipocampo e um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) aumenta; (e) é um gráfico que identifica que a corticosterona no sangue diminui; (£) é um gráfico que identifica que a IL-6 no sangue diminui; e (9) é um gráfico que identifica que o TNF-a no sangue diminui.
[0110] A Fig. 15 mostra os resultados da medição dos indicadores de colite em relação a um grupo (IS), no qual um camundongo submetido a estresse por imobilização é administrado com soro fisiológico e um grupo é administrado com Lactobacillus reuteri NK33 (IS+LR), uma bactéria ácido- láctica inovadora; (a) é um gráfico que identifica que o comprimento do cólon é recuperado; (b) é um gráfico que identifica que a mieloperoxidase diminui no cólon; (c) é um gráfico que identifica que o TNF-a diminui no cólon; e (d) é uma imagem que identifica que uma atividade de NF-xB (p- p65/p65) diminui e as expressões de COX-2 e iNOS aumentam no cólon. Modo para a Invenção
[0111] Doravante, a presente invenção será descrita em detalhes através dos Exemplos preferenciais e Exemplos Experimentais para compreender melhor a presente invenção. No entanto, os seguintes Exemplos e Exemplos Experimentais são fornecidos apenas para o propósito de ilustrar a presente invenção e, assim, a presente invenção não se limita a isso. Exemplo Experimental 1. Modelo animal com um transtorno mental induzido (1) Estresse por imobilização
[0112] Para induzir um transtorno mental como ansiedade,
depressão, estresse ou semelhantes, um camundongo foi fixado a um aparelho de estresse por imobilização de forma cilíndrica de 3 x 10 cm, de modo que o camundongo não pudesse se mover de forma nenhuma nele.
[0113] Particularmente, de modo a preparar um camundongo com ansiedade induzida por estresse por imobilização, O dito camundongo que havia sido fixado ao aparelho, foi repetidamente submetido a estresse por imobilização cinco vezes, de tal modo que o camundongo foi mantido com a cabeça erguida por duas horas uma vez a cada dois dias e, em seguida, foi realizada uma experiência comportamental em duas horas após o final do estresse por imobilização.
[0114] Além disso, de modo a preparar um camundongo com depressão induzida por estresse por imobilização, o dito camundongo que havia sido fixado ao aparelho, foi repetidamente submetido a estresse por imobilização contínua uma vez ao dia por dois dias, de tal modo que o camundongo foi mantido com sua cabeça erguida por 12 horas. Uma bactéria ácido-láctica foi administrada uma vez ao dia por cinco dias e uma experiência comportamental foi realizada uma hora após a administração final. (2) Estresse por antibiótico
[0115] Para induzir um transtorno mental como ansiedade, depressão, estresse ou semelhantes, um camundongo recebeu ampicilina (100 mg/kg) por dois dias seguidos. Um comportamento de ansiedade foi medido 10 dias após a administração. (3) Método experimental em modelo animal com transtorno mental induzido
[0116] Para um modelo de camundongo com estresse induzido por imobilização, foi administrada a este uma bactéria ácido-láctica ou soro fisiológico, dependendo do grupo experimental, uma vez ao dia por três dias a partir do dia 7 após o início do estresse por imobilização. Para um modelo de camundongo com estresse induzido por antibiótico, foi administrada a este uma bactéria ácido- láctica ou soro fisiológico, dependendo do grupo experimental, uma vez ao dia por três dias a partir do dia 7 após o início do estresse por antibiótico.
[0117] Um comportamento de ansiedade foi medido cinco horas após a administração da bactéria ácido-láctica ou do soro fisiológico, e os indicadores sanguíneos (corticosterona, IL-6, TNF-a, etc.) foram medidos através da coleta de sangue uma hora após o término de um teste do labirinto em cruz elevado. Exemplo Experimental 2. Método de medição do comportamento para diagnóstico de estresse (1) Teste do labirinto em cruz elevado (EPM - elevated plus maze)
[0118] Um teste do labirinto em cruz elevado é um aparelho experimental para medir um grau de um transtorno mental como estresse, ansiedade ou semelhantes. O aparelho experimental de labirinto em cruz elevado usado na presente experiência é um aparelho de Plexiglas preto, no qual dois braços abertos (30 x 7 cm) e dois braços fechados (30 x 7 cm) com paredes de 20 cm de altura ficam 50 cm acima do chão, cada um se prolongando 7 cm de uma plataforma central. No presente teste, um camundongo foi colocado no labirinto em cruz elevado em uma sala onde uma câmera de vídeo de 20 Lux foi instalada no alto, registrando assim o movimento do camundongo.
[0119] Particularmente, um camundongo C57BL/6 (macho, 19-22 g) foi colocado no meio do labirinto em cruz elevado, de maneira que a cabeça do camundongo estivesse voltada para um braço aberto. O tempo gasto nos braços abertos e fechados, bem como o número de entradas nos braços, foram medidos durante cinco minutos. Uma entrada em um braço foi definida como um caso em que o camundongo entrou em um braço com todas as quatro patas.
[0120] Durante todo o tempo de teste, o tempo gasto em braços abertos (OT) foi calculado como [Tempo gasto em braços abertos (OT) / (Tempo gasto em braços abertos (OT) + Tempo gasto em braços fechados)] x 100. E as entradas em braços abertos (OE) foram calculadas por [Entradas em braços abertos (OE) / (Entradas em braços abertos (OE) + Entradas em braços fechados)] x 100. Após o final de cada experiência comportamental, o odor remanescente foi eliminado com etanol a 70 %.
[0121] De acordo com uma interpretação conhecida dos resultados dos testes, foi interpretado que ocorre um sintoma de transtorno mental, como ansiedade, depressão ou semelhante, se o OT e o OE diminuírem. (2) Teste de transição claro/escuro
[0122] O aparelho usado para um teste de transição claro/escuro consistia em uma área clara (21 x 42 x 25 cm, diodo branco de 390 Lux) e uma área escura (21 x 42 x 25 cm, 2 Lux), separadas por uma porta (7,5 x 7,5 cm). Um camundongo foi colocado na área clara e observado por cinco minutos, período durante o qual foi medido o tempo na área clara e o número de transições para a área clara. Após o final de cada experiência comportamental, o odor remanescente foi eliminado com etanol a 70 &%.
[0123] De acordo com uma interpretação conhecida dos resultados do teste, foi interpretado que ocorre um sintoma de transtorno mental, como ansiedade, depressão ou semelhante, se o tempo na área clara e o número de transições para a área clara diminuir. (3) Teste de esconder esferas
[0124] Um camundongo foi colocado em uma gaiola transparente cheia de serragem com 5 cm de profundidade e lá permaneceu por 15 minutos. Em seguida, 25 bolas de gude (transparentes, 2 cm de diâmetro) foram colocadas na serragem a um intervalo de 5 cm. O camundongo foi colocado novamente no centro de um lado e o número de bolas de gude que o camundongo enterrou foi medido durante 30 minutos.
[0125] De acordo com uma interpretação conhecida dos resultados do teste, foi interpretado que ocorre um sintoma de transtorno mental, como ansiedade, depressão ou semelhante, se o comportamento do rato de enterrar e esconder as bolas de gude (esferas) aumentar. (4) Teste do nado forçado (FST - forced swimming test)
[0126] De acordo com um método de Porsolt et al. (Porsolt RD, Le Pichon, Jalfre M (1977) Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments, Nature, Vol. 266; pág. 730-732), água a 25 t 1 ºC foi colocada em um tanque de água com 40 cm de altura e 20 cm de diâmetro, até o nível de água atingir 25 cm de altura. Um camundongo de laboratório foi colocado em cada tanque e ficou lá por seis minutos no total, dos quais os primeiros dois minutos não foram medidos como um tempo adaptativo e, nos últimos quatro minutos, foi medido o tempo de imobilidade do animal de laboratório. A imobilidade significa um estado em que o camundongo está flutuando na água sem movimento, exceto o movimento mínimo para manter a cabeça apenas acima da água. (5) Teste de suspensão pela cauda (TST - tail suspension test)
[0127] De acordo com um método de Steru et al. (Steru L, Chermat R, Thierry B, Simon P (1985) The tail suspension test: A new method for screening antidepressants in mice, Psychopharmacology, Vol. 85; pág. 367-370), um camundongo foi pendurado em um contêiner de 35 cm de diâmetro e 50 cm de altura, por meio de um dispositivo de fixação a aproximadamente 1 cm da ponta da cauda do camundongo, de modo que o camundongo ficasse suspenso 50 cm acima do piso. Durante seis minutos no total, foi medido um tempo de imobilidade do animal de laboratório. Exemplo Experimental 3. Experiência na identificação de uma comunidade microbiana intestinal
[0128] Foi realizada uma PCR em tempo real ou um pirossequenciamento 454 para medir as quantidades de firmicutes, proteobactérias, actinobactérias, bacteroidetes e semelhantes em uma comunidade microbiana intestinal.
[0129] Particularmente, o DNA das fezes obtidas de um modelo animal foi isolado por meio do mini kit para fezes QIAamp DNA (Qiagen, Alemanha). O pirossequenciamento foi realizado por meio de um iniciador codificado (domínios V1 a V3 de um gene 16S rDNA bacteriano). A qPCR foi analisada por meio de um iniciador mostrado na tabela 1 a seguir. [Tabela 1)
Tipo Sequência (5'-3') Direto (SEQ ID NO: 2) GGA GYA TGT Firmicutes Reverso (SEQ ID NO: 3) AGC TGA CGA (R) CAA CCA TGC AC Direto (SEQ ID NO: 4) GTT TAA TTC (F) GAT GAT ACG CGA G Bacteroidetes Reverso (SEQ ID NO: 5) TTA ASC CGA (R) CAC CTC ACG G Direto (SEQ ID NO: 6) AAC GCG AAA B- (E) AAC CTT ACC TAC C Proteobactéria Reverso (SEQ ID NO: 7) TGC CCT TTC (R) GTA GCA ACT AGT G Direto (SEQ ID NO: 8) GCT AAC GCA õ/Yy- (E) TTA AGT RYC CCG Proteobactéria Reverso |(SEQ ID NO: 9) GCC ATG CRG Direto (SEQ ID NO: 10) TAG GCT TGA e- (EF) CAT TGA TAG AAT C Proteobactéria Reverso | (SEQ ID NO: 11) CTT ACG AAG (R) GCA GTC TCC TTA Direto (SEQ ID NO: 12) TGT AGC GGT Actinobactéria Reverso (SEQ ID NO: 13) AAT TAA GCC Direto (SEQ ID NO: 14) AYT GGG CGT
Tipo Sequência (5'-3') Reverso (SEQ ID NO: 15) TAC GGY TAC Direto (SEQ ID NO: 16) TCA KGT CAG (F) TAT GGC CCT TAT Verrucomicrobia Reverso (SEQ ID NO: 17) CAG TTT TYA (R) GGA TTT CCT CCG CC Direto (SEQ ID NO: 18) CAT TGA CGT (F) TAC CCG CAG AAG AAG C Enterobactérias Reverso (SEQ ID NO: 19) CTC TAC GAG (R) ACT CAA GCT TGC Direto (SEQ ID NO: 20) CGC GTA CTA Escherichia (F) TAC GCC ATG AAC GTA coli Reverso (SEQ ID NO: 21) ACC GTT GAT (R) CAC TTC GGT CAG G Direto (SEQ ID NO: 22) GAT ACG GAG Klebsiella spp.
Reverso (SEQ ID NO: 23) TAG CCT TTA (R) TCA AGC GGA TAC TGG Direto (SEQ ID NO: 24) GTT AAT ACC Klebsiella (E) TTT GCT CAT TGA oxytoca Reverso (SEQ ID NO: 25) ACC AGG GTA Direto (SEQ ID NO: 26) CTC GCA CCA morganii Reverso (SEQ ID NO: 27) CAA AGC ATC
Tipo Sequência (5'-3') Direto (SEQ ID NO: 28) GAA CGC AYT reuteri Reverso (SEQ ID NO: 29) TCC ATT GTG (R) GCC GAT CAG T Direto (SEQ ID NO: 30) CAC TAG ACG Lactobacillus (EF) CAT GTC TAG AG johnsonii Reverso (SEQ ID NO: 31) AGT CTC TCA (R) ACT CGG CTA TG Direto (SEQ ID NO: 32) TCA TGA TTT Lactobacillus (E) ACA TTT GAG TG bplantarum Reverso (SEQ ID NO: 33) GAC CAT GCG (R) GTC CAA GTT GTT Direto (SEQ ID NO: 34) CGC CCT TAA Lactobacillus (E) CAG CAG TCT TC rhamnosus Reverso (SEQ ID NO: 35) GCC CTC CGT (SEQ ID NO: 36) TCG TCG GCA Direto
GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA
E CAG GTG CCA GCM GCC GCG GTA A 168 rDNA bacteriano (SEQ ID NO: 37) GTC TCG TGG Reverso GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG (R) ACA GGG ACT ACH VGG GTW TCT
AAT Exemplo Experimental 4. Método para medir lipopolissacarídeo (1) Método para medir lipopolissacarídeo nas fezes
[0130] As fezes (20 mg) foram suspensas em 30 ml de PBS e, em seguida, os microrganismos destas foram esmagados por meio de tratamento ultrassônico por uma hora e depois centrifugados a 500 rpm por 15 minutos. Um sobrenadante resultante foi filtrado com um filtro de 0,45 um, depois filtrado novamente com um filtro de 0,22 um, depois tratado a 70 ºC por 10 minutos e depois usado como amostra de teste. Para a dita amostra de teste, o lipopolissacarídeo foi medido por meio do kit de ensaio do lisado de amebócito de Limulus (LAL) (Cape Cod Inc., East Falmouth, MA, EUA). (2) Método para medir lipopolissacarídeo no sangue
[0131] O sangue foi diluído 10 vezes com PBS, depois centrifugado e, em seguida, o sobrenadante resultante foi tratado a 0 ºC por 10 minutos. O sobrenadante resultante foi filtrado com um filtro de 0,45 um, depois filtrado novamente com um filtro de 0,22 um e depois utilizado como amostra de teste. Para a dita amostra de teste, o lipopolissacarídeo foi medido por meio do kit de ensaio do lisado de amebócito de Limulus (LAL) (Cape Cod Inc., East Falmouth, MA, EUA). Exemplo Experimental 5. Método para medir indicadores de colite (1) Medição da atividade da mieloperoxidase
[0132] 200 nl de tampão de fosfato de potássio 10 mM, pH 7,0, contendo 0,5 % de brometo de hexadecil-trimetil amônio foram colocados em 100 mg de um tecido do cólon e depois submetidos à homogeneização. A mistura resultante foi centrifugada durante 10 minutos a 4 ºC e 10.000 g, para obter um sobrenadante. 50 1nl do sobrenadante foram colocados em 0,95 ml de uma solução de reação (contendo tetrametil benzidina a 1,6 MM e HO, a 0,1 mM), depois submetidos à reação a 37 “C e, em seguida, a absorbância foi medida microscopicamente a 650 nm. A atividade da dita mieloperoxidase (MPO) foi calculada com um reagente resultante de H202 1 umol/ml = 1 unidade. (2) Medição de indicadores inflamatórios
[0133] Os biomarcadores de reação inflamatória, como p- p65, p65, iNOS, COX-2 e fractina, foram medidos pela técnica de western blotting. Particularmente, 50 ug de sobrenadante, que foram obtidos pelo mesmo método mostrado na dita experiência para medir a atividade da mieloperoxidase (MPO), foram retirados e, em seguida, foi realizada a imunização. Além disso, um nível de expressão de citocinas foi medido por meio do kit ELISA e o LPS foi medido usando kit de ensaio de LAL. Exemplo 1: Identificação de um estado de um modelo animal com estresse induzido por imobilização
[0134] De acordo com os Exemplos Experimentais 2 a 5, foi realizada uma experiência em um camundongo (IS), que havia sido submetido a estresse por imobilização uma vez a cada dois dias, em um total de cinco vezes, pelo mesmo método mostrado no Exemplo Experimental 1-(1) acima.
[0135] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 2, foi identificado que o tempo gasto em braços abertos (OT) e entradas em braços abertos (OE) diminui em um teste do labirinto em cruz elevado; o tempo na área clara diminui em um teste de transição claro/escuro; e o comportamento de enterrar as bolas de gude aumenta em um teste de esconder esferas (Figs. 1 (a) a (c)).
[0136] Além disso, como resultado da identificação pela técnica de western blotting, foi identificada que a atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo; um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui (Fig. 1 (d)); e as quantidades de corticosterona, IL-6, TNF-a e lipopolissacarídeo no sangue aumentam (Figs. 1 (e) a (h)).
[0137] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 3, foi identificado que os bacteroidetes, actinobactérias e firmicutes nas fezes diminuem e õ- proteobactéria, y-proteobactéria e e-proteobactéria aumentam. Como resultado da realização do Exemplo Experimental 4, foi identificado que o lipopolissacarídeo nas fezes aumenta (Fig. 2).
[0138] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 5, foi identificado que, como indicadores de colite, o comprimento do cólon diminui; a mieloperoxidase aumenta; o TNF-a do cólon aumenta; as expressões de COX-2 e iNOS do cólon aumentam; uma atividade de NF-xB aumenta; e a ocludina e claudina-l, proteínas de junção oclusiva, diminuem (Fig. 3 (a) a (e)). Exemplo 2: Identificação de um estado de um modelo animal administrado com fezes de um modelo animal com estresse induzido por imobilização
[0139] De acordo com os Exemplos Experimentais 2 a 4, foi realizada uma experiência em um camundongo (FIS), que foi administrado com fezes de um camundongo que havia sido submetido a estresse por imobilização uma vez a cada dois dias, em um total de cinco vezes, pelo mesmo método mostrado no Exemplo Experimental 1-(1) acima.
[0140] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 2, foi identificado que o OT e OE diminuem em um teste do labirinto em cruz elevado; o tempo na área clara diminui em um teste de transição claro/escuro; e o comportamento de enterrar as bolas de gude aumenta em um teste de esconder esferas (Figs. 4 (a) a (c)).
[0141] Como resultado da identificação pela técnica de western blotting, foi identificado que a atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo; um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui (Fig. 4 (d)); e as quantidades de corticosterona, IL-6 e TNF-a no sangue aumentam (Fig. 5 (a) a (c)).
[0142] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 5, foi identificado que, como indicadores de colite, o comprimento do cólon diminui; a mieloperoxidase aumenta (Fig. 4 (e) e (f£); o TNF-a e IL-6 do cólon aumentam; a IL-10 do cólon diminui; as expressões de COX-2 e iNOS do cólon aumentam; e uma atividade de NF-xB aumenta (Fig. 6 (a) a (d)).
[0143] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 3, foi identificado que os bacteroidetes, actinobactérias e firmicutes nas fezes diminuem e as y- proteobactérias e e-proteobactérias aumentam (Fig. 6 (e)). Exemplo 3: Identificação de um estado de um modelo animal com estresse induzido por antibiótico
[0144] De acordo com os Exemplos Experimentais 2 a 5, foi realizada uma experiência em um camundongo (AP), que foi submetido a estresse por antibiótico com administração de ampicilina (100 mg/kg) por dois dias consecutivos pelo mesmo método conforme mostrado no Exemplo Experimental 1-
(2) acima.
[0145] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 2, foi identificado que o OT e OE diminuem em um teste do labirinto em cruz elevado; o tempo na área clara diminui em um teste de transição claro/escuro; e o comportamento de enterrar as bolas de gude aumenta em um teste de esconder esferas (Figs. 7 (a) a (c)).
[0146] Foi identificado que uma atividade de NF-xB (p- p65/p65) aumenta no hipocampo; um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui (Fig. 7 (d)); e as quantidades de corticosterona, IL-6, TNF-a e lipopolissacarídeo no sangue aumentam (Figs. 7 (e) a (h)).
[0147] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 3, foi identificado que os bacteroidetes, actinobactérias e firmicutes nas fezes diminuem e 5ôõ- proteobactéria, y-proteobactéria e e-proteobactéria aumentam. Como resultado da realização do Exemplo Experimental 4, foi identificado que o lipopolissacarídeo nas fezes aumenta (Fig. 8 (a) e (b)).
[0148] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 5, foi identificado que, como indicadores de colite, o comprimento do cólon diminui; a mieloperoxidase aumenta; o TNF-a do cólon aumenta; as expressões de COX-2 e iNOS do cólon aumentam; uma atividade de NF-xB aumenta; e a ocludina e claudina-l, proteínas de junção oclusiva, diminuem (Fig. 9 (a) a (e)). Exemplo 4: Identificação de um estado de um modelo animal administrado com microrganismos isolados das fezes de um modelo animal com estresse induzido (1) Isolamento de microrganismos das fezes do modelo animal com estresse induzido
[0149] As fezes de um camundongo submetido a estresse por imobilização e as fezes de um camundongo submetido a estresse por antibiótico foram cultivadas em um meio seletivo, respectivamente. Como resultado, foi identificado que as enterobactérias crescidas em meio DHL aumentam e, em particular, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e Morganella morganii aumentam (Fig. 10 (A)).
[0150] Por outro lado, foi identificado que as bifidobactérias e os lactobacilos cultivados em meio BL diminuem e, em particular, o Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus rhamnosus e Bifidobacterium animalis diminuem (Fig. 10 (B)). (2) Identificação de um estado de um modelo animal administrado com microrganismos
[0151] Após administração a cada camundongo de 1 x 10º UFC de Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e Morganella morganii, respectivamente, que estavam aumentadas nas fezes do camundongo submetido a estresse por imobilização e do camundongo submetido a estresse por antibiótico, foi realizado um teste do labirinto em cruz elevado de acordo com o Exemplo Experimental 2-(1) acima. Como resultado, foi identificado que o OT e o OE diminuem notavelmente em um grupo administrado com Klebsiella oxytoca em comparação com um grupo administrado com outros mircrorganismos (Fig. 11 (a)).
[0152] Depois disso, de acordo com os Exemplos Experimentais 2 a 5, foi realizada uma experiência em um camundongo (KO) administrado com Klebsiella oxytoca.
[0153] Como resultado da realização do Exemplo
Experimental 2, foi identificado que o OT e OE diminuem em um teste do labirinto em cruz elevado; o tempo na área clara diminui em um teste de transição claro/escuro; e O comportamento de enterrar as bolas de gude aumenta em um teste de esconder esferas (Figs. 11 (b) a (d)).
[0154] Foi identificado que uma atividade de NF-xB (p- p65/p65) aumenta no hipocampo; um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui (Fig. 11 (e)); e as quantidades de corticosterona, IL-6, TNF-a e lipopolissacarídeo no sangue aumentam (Figs. 11 (£) a (i)).
[0155] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 3, foi identificado que os bacteroidetes, actinobactérias e firmicutes nas fezes diminuem e ô- proteobactéria, vy-proteobactéria e e-rproteobactéria nas fezes aumentam. Como resultado da realização do Exemplo Experimental 4, foi identificado que o lipopolissacarídeo nas fezes aumenta (Fig. 12 (a) e (b)).
[0156] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 5, foi identificado que, como indicadores de colite, o comprimento do cólon diminui; a mieloperoxidase aumenta; o TNF-a do cólon aumenta; as expressões de COX-2 e iNOS do cólon aumentam; uma atividade de NF-xB aumenta; e a ocludina e claudina-l, proteínas de junção oclusiva, diminuem (Fig. 13 (a) a (e)). Exemplo 5: Isolamento e identificação de bactérias ácido- lácticas (1) Isolamento de bactérias ácido-lácticas a partir de fezes de seres humanos e de camundongo
[0157] Fezes humanas e de camundongo frescas foram inseridas e suspensas em um meio líquido GAM (caldo GAM;
Nissui Pharmaceutical, Japão), respectivamente. Depois disso, o sobrenadante foi retirado e implantado no meio ágar com MRS, BHI (Brain-Heart-Infusion [caldo cérebro- coração)) ou BL (Nissui Pharmaceutical, Japão), depois cultivado anaerobicamente a 37 ºC por cerca de 48 a 72 horas e, em seguida, as cepas formando uma colônia foram isoladas. (2) Identificação das bactérias ácido-lácticas isoladas
[0158] As características fisiológicas e as sequências de 16S rDNA de cepas isoladas de fezes humanas ou de camundongos foram analisadas, em seguida as espécies das cepas foram identificadas e foram dados nomes às cepas. Os nomes das cepas atribuídos às bactérias ácido-láticas são mostrados na tabela 2 a seguir. Particularmente, bactérias ácido-lácticas isoladas de fezes humanas ou de camundongos eram 9 tipos de Lactobacillus spp. e 22 tipos de Bifidobacterium spp. [Tabela 2] Nº do Nome da cepa tratamento 3 Lactobacillus reuteri NK33 E Fm FTSE
Nome da cepa tratamento
9 Lactobacillus johnsonii NK39 Bifidobacterium longum NK81 Bifidobacterium bifidum NK86 17 Bifidobacterium infantis NK88 18 Bifidobacterium infantis NK89
Bifidobacterium pseudocatenulatum
Bifidobacterium pseudocatenulatum
Nome da cepa tratamento Ec (3) Características fisiológicas do Lactobacillus reuteri NK33, uma bactéria ácido-láctica inovadora
[0159] Das cepas descritas na Tabela 2 acima, foi identificado que Lactobacillus reuteri NK33 (número de acesso: KCCM12090P) é um bacilo gram-positivo. Além disso, foi demonstrado que o 16S rDNA do Lactobacillus reuteri NK33 tem uma sequência de SEQ ID NO: 1. Como resultado da comparação das sequências de 16S rDNA do Lactobacillus reuteri NK33 por meio de pesquisa BLAST, foi demonstrado que não foi encontrada uma cepa de Lactobacillus reuteri com a mesma sequência de 16S rDNA e que tal sequência era 99 % homóloga à sequência de 16S rDNA de uma cepa de Lactobacillus reuteri conhecida.
[0160] Além das características fisiológicas do Lactobacillus reuteri NK33, a disponibilidade da fonte de carbono foi analisada com um teste de fermentação de açúcar usando um kit API 50 CHL (BioMerieux's, EUA). Os resultados são apresentados na tabela 3 a seguir. Na tabela 3 abaixo, “+” indica que a disponibilidade da fonte de carbono é positiva e “-” indica que a disponibilidade da fonte de carbono é negativa. [Tabela 3] L. reuteri L. reuteri Fonte de carbono NK33 carbono NK33 [| mms | sets | + |
L. reuteri Fonte de L. reuteri Fonte de carbono NK33 carbono NK33
D-arabinose - Maltose + D-ribose + Melibiose +
Metil-B-D- - Melezitose + xilopiranosídeo
D-galactose + Rafinose + D-glicose + Amido - D-manose + Xilitol - L-sorbose - Gentiobiose + Inocitol - D-tagatose -
a-metil-D- - D-arabitol -
manosídeo a-metil-D-
L-arabitol glicosídeo
L. reuteri Fonte de L. reuteri Fonte de carbono NK33 carbono NK33 N-acetil- + Gluconato + glucosamina Amigdalina + - gluconato
EO Arbutina + gluconato (4) Características fisiológicas do Bifidobacterium adolescentis NK98, uma bactéria ácido-láctica inovadora
[0161] Das cepas descritas na Tabela 2 acima, foi identificado que o 16S rDNA do Bifidobacterium adolescentis NK98 (número de acesso: KCCM12297P) tem uma sequência de SEQ ID NO: 38. Como resultado da comparação das sequências de 16S rDNA do Bifidobacterium adolescentis NK98 por meio de pesquisa BLAST, foi demonstrado que não foi encontrada uma cepa de Bifidobacterium adolescentis NK98 com a mesma sequência de 16S rDNA e que tal sequência é 98 % homóloga à sequência de 16S rDNA de uma cepa de Bifidobacterium adolescentis conhecida.
[0162] Além das características fisiológicas do Bifidobacterium adolescentis NK98, a disponibilidade da fonte de carbono foi analisada com um teste de fermentação de açúcar usando um kit API (API 20A, BioMerieux's, EUA). Os resultados são apresentados na tabela 4 a seguir. Na tabela 4 abaixo, “+” indica que a disponibilidade da fonte de carbono é positiva e “-” indica que a disponibilidade da fonte de carbono é negativa.
[Tabela 414) B. adolescentis Fonte de carbono Reação/Enzima NK98 L-triptofano Formação de indol | "']
E LS RE Acidificação D-glicose + (glicose) Acidificação D-manitol + (manitol) Acidificação D-lactose + (lactose) Acidificação D-sacarose + (sacarose) Acidificação D-maltose + (maltose) Acidificação Salicina + (salicina) Acidificação D-xilose + (xilose) Acidificação L-arabinose + (arabinose) Hidrólise Gelatina + (protease) Citrato férrico Hidrólise (B- + de esculina glicosidase) Acidificação Glicerol (glicerol) Acidificação D-celobiose + (celobiose)
B. adolescentis Fonte de carbono Reação/Enzima NK98 Acidificação D-manose (manose) Acidificação D-melezitose (melezitose) Acidificação D-rafinose + (rafinose) Acidificação D-sorbitol (sorbitol) Acidificação L-ramnose (ramnose) Acidificação D-trealose + (trealose)
FO
ELLA A EA Ed ss Exemplo 7: Comparação da atividade das bactérias ácido- lácticas isoladas (1) Atividade antioxidante (in vitro)
[0163] DPPH (2,2-difenil-l-picril-hidrazil) foi dissolvido em etanol para atingir uma concentração de 0,2 mM, para preparar uma solução de DPPH. Uma suspensão de bactérias ácido-lácticas (1 x 10º UFC/ml) ou uma solução de vitamina C (1 g/ml) foi inserida em 0,1 ml da dita solução de DPPH e depois cultivada a 37 ºC por 20 minutos. O fluido de cultura foi centrifugado a 3000 rpm por cinco minutos para obtenção do sobrenadante. Depois disso, a absorbância do sobrenadante foi medida a 517 nm e, em seguida, a atividade antioxidante das bactérias ácido-lácticas isoladas foi calculada de acordo. A atividade antioxidante de cada bactéria ácido-láctica é mostrada na tabela 5 (Lactobacillus spp.) e na tabela 6 (Bifidobacterium spp.) . (2) Medição de indicadores inflamatórios em macrófagos
[0164] 2 ml de tioglicolato a 4 % esterilizado foram administrados por via intraperitoneal em um camundongo C57BL/6 (macho, 6 semanas de idade, 20-23 g). 96 horas depois, o camundongo foi anestesiado e, em seguida, 8 ml de meio RPMI 1640 foram administrados por via intraperitoneal ao camundongo. Após 5 a 10 minutos, o meio RPMI (macrófagos) foi extraído por via intraperitoneal do camundongo, em seguida centrifugado a 1000 rpm durante 10 minutos e depois lavado duas vezes com o meio RPMI 1640. Os ditos macrófagos foram plaqueados em uma placa de 24 poços a 0,5x106 células por poço, em seguida tratados com a bactéria ácido-láctica Lactobacillus spp. isolada e lipopolissacarídeo, um indutor de reação inflamatória, durante 2 ou 24 horas, e então foram obtidos o sobrenadante e as células. As células obtidas foram inseridas em um tampão RIPA (Gibco) e homogeneizadas. O nível de expressão de citocinas como TNF-a foi medido a partir de um sobrenadante da cultura tratado por 24 horas e, em seguida, os níveis de expressão de p65 (NEF-xB), p-p65 (fósforo-NEF- KB) e B-actina foram medidos a partir das células obtidas com tratamento por duas horas pelo método de imunotransferência. Os níveis de expressão de indicadores inflamatórios para cada bactéria ácido-láctica Lactobacillus spp. são mostrados na tabela 5 a seguir.
(3) Medição de indicadores inflamatórios em micróglia
[0165] Micróglias BV-2 foram plaqueadas em uma placa de 24 poços a 0,5x10º células por poço, tratadas com a bactéria ácido-láctica Bifidobacterium spp. isolada e lipopolissacarídeo, um indutor de reação inflamatória, durante 2 ou 24 horas, e então foram obtidos o sobrenadante e as células. As células obtidas foram inseridas em um tampão RIPA (Gibco) e homogeneizadas. os níveis de expressão de p65 (NF-kB), p-p65 (fósforo-NF-xB) e B-actina foram medidos a partir das células obtidas com o tratamento por duas horas pelo método de imunotransferência. Os níveis de expressão de indicadores inflamatórios para cada bactéria ácido-láctica Bifidobacterium spp. são mostrados na tabela 6 a seguir. (4) Efeito da expressão do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e da ativação do NF-xB em células SH-SY5Y
[0166] Células SH-SY5Y, que são células nervosas, foram adquiridas do Korean Cell Line Bank, em seguida cultivadas em meio DMEM contendo 10 % de FBS e 1 % de antibióticos, e então divididas em uma placa de 12 poços a 2 x 10º células por poço. Depois disso, foi adicionada corticosterona a cada poço a uma concentração de 300 mg/ml, juntamente com as bactérias ácido-láticas (1 x 10º UFC/mMl), em seguida cultivadas e depois os níveis de expressão de NF-xB (p65, p-p65) e do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF foram medidos pelo método de imunotransferência. Os níveis de expressão de BDNF e os níveis de ativação de NF-xB para cada bactéria ácido-láctica são mostrados na tabela 5 (Lactobacillus spp.) e na tabela 6 (Bifidobacterium spp.) . [Tabela 5]
Macrófago Células SH-SY5Y 1 Capacidade | Aumento /|Capacidade | Aumento Nome da — Atividade o de da de da Inibição cepa — antioxidante inibição | expressão | inibição | expressão | de NF-xB de TNF-« | de IL-10 | de NF-xB | de BDNF reuteri + + + + + NK31 reuteri ++ ++ ++ ++ + ++ NK32 reuteri +++ ++ ++ ++ ++ ++ NK33 reuteri + + + + + NK34 L. reuteri + + + + + NK35 L,. johnsonii + +” ++ + +” + NK36 L. johnsonii + ++ +" +" + +" NK37 johnsonii NK38 johnsonii + + + + NK39 [Tabela 6]
Capacidade Capacidade de Atividade de inibição | expressão Nome da cepa antioxidante de NF-xB de | de BDNF de micróglia células SH- SY5Y B. infantis NK88 + + ++ B. catenulatum + + + NK93 B. catenulatum + + + NK94 B. adolescentis ++ + + NK95
Capacidade Capacidade de Atividade de inibição | expressão Nome da cepa antioxidante | de NF-xB de | de BDNF de micróglia células SH- SY5Y B. pseudolongum ++ + + NK96 B. adolescentis + + + NK97 B. adolescentis ++ +++ +++ NK98 B. adolescentis + ++ ++ NK99 B. pseudocatenulatum ++ + ++ NK100 B. pseudocatenulatum ++ + + NK101 * —-, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-50 %; +++, >50 & (5) Resultados experimentais
[0167] Como resultado da avaliação da atividade de bactérias ácido-lácticas isoladas, foi identificado que dentre as bactérias ácido-lácticas Lactobacillus spp. ou Bifidobacterium spp. isoladas, Lactobacillus reuteri NK33 e Bifidobacterium adolescentis NK98 têm um efeito excelente notável na promoção da atividade antioxidante e na inibição de reações inflamatórias. Em particular, foi identificado que Lactobacillus reuteri NK33 e Bifidobacterium adolescentis NK98 inibem a atividade de NF-xB, conhecida como substância que induz doenças relacionadas ao envelhecimento, como a doença de Alzheimer, inibe uma reação inflamatória da micróglia presente no envelhecimento, a demência e semelhantes e aumentam a expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) produzido por um nervo cerebral, mas diminuído no envelhecimento, na demência e semelhantes (Tabelas 5 e 6). Exemplo 8: Avaliação de um efeito imunorregulador de bactérias ácido-lácticas Bifidobacterium spp. isoladas
[0168] Para avaliar um efeito imunorregulador de bactérias ácido-lácticas Bifidobacterium spp. isoladas de fezes, foi medido o efeito da bactéria ácido-láctica Bifidobacterium spp. em uma reação imune de macrófagos e células do baço. (1) Reação imune em macrófagos
[0169] 2 ml de tioglicolato a 4 % esterilizado foram administrados por via intraperitoneal em um camundongo C57BL/6 (macho, 6 semanas de idade, 20-23 g, Raonbio Co., Ltd.). 96 horas após a administração, o camundongo foi anestesiado e, em seguida, 8 ml de meio RPMI 1640 foram administrados por via intraperitoneal ao camundongo. Após 5 a 10 minutos, o meio RPMI (incluindo macrófagos) foi extraído por via intraperitoneal do camundongo, em seguida centrifugado a 1000 rpm durante 10 minutos e depois lavado duas vezes com o meio RPMI 1640. O dito macrófago foi plaqueado em uma placa de 24 poços a 0,5 x 10º células por poço, depois cultivado durante 24 horas e então as células soltas foram removidas da cultura.
[0170] O dito fluido de cultura de macrófagos foi tratado com Bifidobacterium adolescentis NK98 e lipopolissacarídeo, um indutor de reação inflamatória, por 2 ou 24 horas e, em seguida, foram obtidos o sobrenadante e as células, em que a concentração das bactérias ácido- lácticas de tratamento era de 1 x 10º UFC/ml. As células obtidas foram inseridas em um tampão RIPA (Gibco) e homogeneizadas. O nível de expressão de TNF-a do sobrenadante obtido foi medido por meio do kit ELISA e, em seguida, os níveis de expressão de p65 (NF-xB), p-p65 (fósforo-NEF-xB) e fr-actina das células obtidas foram medidos pelo método de imunotransferência. Particularmente, 50 pg do sobrenadante foram separados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida SDS a 10 % (p/v) durante uma hora e meia. A amostra submetida à eletroforese foi transferida para um papel de nitrocelulose em condições de 100 V e 400 mA por uma hora e 10 minutos. O papel de nitrocelulose, para o qual foi transferida a amostra, foi submetido a bloqueio por meio de 5 % de leite desnatado por minutos e, em seguida, lavado com PBS-Tween três vezes por cinco minutos cada vez e, em seguida, submetido à reação durante a noite com a adição de anticorpos primários (Santa Cruz Biotechnology, EUA) a uma proporção de 1:100 Depois disso, tal papel foi lavado três vezes durante 10 minutos cada vez e submetido à reação com a adição de anticorpos secundários (Santa Cruz Biotechnology, EUA) a uma proporção de 1:1000 por uma hora e 20 minutos. Em seguida, tal papel foi lavado três vezes durante 15 minutos cada vez, em seguida submetido a fluorescência e luminescência, então tratado e, em seguida, a intensidade da banda do cromóforo foi medida, e os resultados são mostrados na tabela 7 a seguir. [Tabela 7] Capacidade de Capacidade de Nome da cepa inibição de NF-xB | inibição de TNF- (p-p65/p65) a Não tratado - - o + ++ NK98 * Taxa de inibição: -, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-60 %; +++, >60 (2) Reação imune em células do baço
[0171] O baço de um camundongo C57BL/6 (macho, 6 semanas de idade, 20-22 g, OrientBio Co., Ltd.) foi isolado e esmagado e, em seguida, suspenso em um meio RPMI 1640 contendo 10 % de FCS. As células T CD4 foram isoladas por meio de um kit de isolamento de células T CD4 (MiltenyiBiotec, Bergisch Gladbach, Alemanha) e, em seguida, as células T CD4 isoladas foram divididas em uma placa de 12 poços a 5 x 10º células por poço.
[0172] As células foram cultivadas com a adição de anti- CD3, anti-CD28, IL-2 e IL-l12 para induzir a diferenciação de células T em células Thl; anti-CD3, anti-CD28, IL-2 e IL-4 para induzir a diferenciação de células T em células Th2; anti-CD3, anti-CD28, IL-6 e TGF-B para induzir a diferenciação de células T em células Thl7; e anti-CD3 e anti-CD28 para induzir a diferenciação de células T em células Treg, em seguida as bactérias ácido-lácticas foram adicionadas a 1 x 10º UFC/mMl por poço, e depois cultivadas por quatro dias.
[0173] Depois disso, foi medida uma potência de diferenciação de células T isoladas do baço em células Thl, células Th2, células Thl17 e células Treg. Particularmente, as células do fluido de cultura foram tingidas com anticorpos anti-FoxP3 ou anti-IL-17A e depois foi analisada a distribuição de células Thl, Th2, Thl17 e Treg por meio de um dispositivo FACS (do inglês, fluorescence-activated cell sorting [separação de células ativadas por fluorescência]) (C6 Flow Cytometer System, San Jose, CA, EUA), cujos resultados são mostrados na tabela 8 a seguir. [Tabela 8] FE FT axa de | Taxa de inibição da aumento da diferenciação Nome da cepa diferenciação Células Treg Th1l Th2 Th17 eae E EE B. longum NK81 + ++ + + B. longum NK82 + ++ + + B. longum NK83 + ++ ++ + B. longum NK84 +++ + +++ ++ B. bifidum NK85 +++ + +++ ++ B. bifidum NK86 + + +++ +
E EEETPESATSPPPFAaxa de | Taxa de inibição da aumento da diferenciação Nome da cepa diferenciação Células Células Células Células Treg Th1l Th2 Th17 B. infantis NK88 + + +++ + B. infantis NK89 + + | +++ + B. breve NK90 + +++ ++ ++ B. breve NK91 ++ ++ + + B. choerinum NK92 - + + - B. catenulatum + ++ ++ + NK93 B. catenulatum ++ + + ++ NK94 B. adolescentis ++ + + + NK95 B. pseudolongum ++ ++ ++ + NK96 B. adolescentis + ++ + + NK97 B. adolescentis ++ ++ +++ +++ NK98 B. adolescentis + + ++ + NK99 B. pseudocatenulatum ++ ++ + + NK100
Taxa de Taxa de inibição da aumento da diferenciação Nome da cepa diferenciação Células Células Células , B. pseudocatenulatum + ++ + + NK101 * Taxa de inibição: -, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-60 %; +++, >60 * Taxa de aumento: -, <10 %; +, 10-50 %; ++, 50-100 %; +++, >100 %
[0174] Além disso, foram medidas as taxas de expressão de fatores de transcrição e citocinas das células Thl, Th2, Thl17 e Treg isoladas das células T do baço. Particularmente, foram analisados por qaRT-PCR os níveis de expressão de T- bet, IFN-y e IL-12 a partir de um fluido de cultura indutor de diferenciação de células Thl; de GATA3 e IL-5 a partir de um fluido de cultura indutor de diferenciação de células Th2; de RORyt e IL-17 a partir de um fluido de cultura indutor de diferenciação de células Thl7; e de Foxp3 e IL- a partir de um fluido de cultura de indução de diferenciação de células Treg, cujos resultados são mostrados na tabela 9 a seguir. [Tabela 9]
Taxa de aumento Taxa de inibição da expressão da Nome da cepa expressão T- |IFN- Células IL- IL- GATA3 RORyt FOXp3 bet) y IL-5 17 10 Es re
2. Jongum NEMO
3. Tongam NM Do pira eee | e ds 1 2 Infantis SEO Pp Infantis NEMO Pp infaneis NEM) E prove NEO B. catenulatum + + + + + + + + NK93 B. catenulatum ++ | + + + + + + + NK94 B. adolescentis + + + + ++ [|++| ++ ++ NK95 B. pseudolongum + + + + + + + + NK96 B. adolescentis + + + + + + + + NK97
Taxa de aumento Taxa de inibição da expressão —— PIE, expressão T- |IFN- Células IL- IL- GATA3 RORyt FOXp3 Teses om fee e e ee ++ | ++ ++ ++ +++ +++] +++ +++ NK98 Coe pie + + PE] + | ++ + + + + + + NK99 B. pseudocatenulatum| ++ | + + + - + + NK100 B. Ipseudocatenulatum| ++ + + + + + NK101
E * Taxa de inibição: -, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-60 %; +++, >60 * Taxa de aumento: -, <10 %; +, 10-50 %; ++, 50-100 %; +++, >100 &%
[0175] Conforme mostrado nas Tabelas 8 e 9 acima, foi identificado que o Bifidobacterium adolescentis NK98 possui uma alta taxa de inibição na diferenciação de células T em células Thl, células Th2 e células Thl7 e, em particular, uma alta taxa de aumento na diferenciação de células T em células Treg, inibindo efetivamente uma reação inflamatória e melhorando de forma eficaz uma doença inflamatória. Exemplo 9: Efeito de Lactobacillus reuteri NK33 na redução do estresse
[0176] A partir do dia 7 após o início do processo de estresse por imobilização de um camundongo, que havia sido submetido a estresse por imobilização, conforme mostrado no Exemplo Experimental 1 acima, foi administrado 1 x 10º UFC de Lactobacillus reuteri NK33, uma bactéria ácido-láctica inovadora, ou soro fisiológico uma vez ao dia por cinco dias ao camundongo. De acordo com os Exemplos Experimentais 2 a 5, foi realizada uma experiência no camundongo descrito acima.
[0177] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 2, foi identificado no grupo (IS) administrado com soro fisiológico que o OT e OE diminuem em um teste do labirinto em cruz elevado; o tempo na área clara diminui em um teste de transição claro/escuro; e o comportamento de enterrar as bolas de gude aumenta em um teste de esconder esferas. No entanto, foi identificado no grupo (IS+LR) administrado comLactobacillus reuteri NK33 que o OT e OE aumentam; o tempo na área clara aumenta; e o comportamento de enterrar as bolas de gude diminui em um teste de esconder esferas (Figs. 14 (a) a (c)).
[0178] Foi identificado no grupo (IS) administrado com soro fisiológico que a atividade de NF-xB (p-p65/p65 aumenta no hipocampo; o nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui; e as quantidades de corticosterona, IL-6, TNF-a e lipopolissacarídeo no sangue aumentam. No entanto, foi identificado no grupo (IS+LR) administrado com Lactobacillus reuteri NK33 que a atividade de NF-KxB (p- p65/p65) é inibida; um nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) aumenta; e as quantidades de corticosterona, IL-6, TNF-a e lipopolissacarídeo no sangue diminuem (Figs. 14 (d) a (9)).
[0179] Como resultado da realização do Exemplo Experimental 5, foi identificado no grupo (IS) administrado com soro fisiológico que, como indicadores de colite, o comprimento do cólon diminui; a mieloperoxidase aumenta; O TNF-a do cólon aumenta; as expressões de COX-2 e iNOS do cólon aumentam; a atividade de NF-xB aumenta. No entanto, foi identificado no grupo (IR) administrado com Lactobacillus reuteri NK33 que o comprimento do cólon é recuperado para um nível normal; a mieloperoxidase diminui; o TNF-a do cólon diminui; as expressões de COX-2 e iNOS do cólon diminuem; e a atividade de NF-xB é inibida (Fig. 15 (a) a (d)).
[0180] A partir dos resultados, foi identificado que o Lactobacillus reuteri NK33, a bactéria ácido-láctica inovadora, tem um excelente efeito de melhorar um transtorno mental como ansiedade, depressão, estresse e semelhantes.
Exemplo 10: Efeito de Bifidobacterium adolescentis NK98 na redução do estresse
[0181] A partir do dia 7 após o início do processo de estresse por imobilização de um camundongo, que havia sido submetido a estresse por imobilização conforme mostrado no Exemplo Experimental 1 acima, foi administrado 1 x 10º UFC of Bifidobacterium adolescentis NK98 (NK98), 1 x 10º UFC de Bifidobacterium adolescentis IM38 (IM38), soro fisiológico (IS) ou 1 mg/kg de Buspirona uma vez ao dia por três dias ao camundongo. Então, de acordo com os Exemplos
Experimentais 2 a 5 acima, foi realizada uma experiência. (1) Teste do labirinto em cruz elevado
[0182] Juntamente com um teste do labirinto em cruz elevado do Exemplo Experimental 2-(1) acima, foi medida uma quantidade de corticosterona (BC) no sangue, cujos resultados são mostrados na tabela 10 a seguir. [Tabela 10] oT (%) OT (%) | OE (%) mo a EO em sa |O fee | oe pende | e | 17,1 35,2 18,2 38,5 0,7 normal
[0183] Conforme mostrado na Tabela 10 acima, foi identificado no grupo (IS), dos modelos de estresse por imobilização administrados com soro fisiológico, que tanto o OT quanto o OE diminuem em um teste do labirinto em cruz elevado em comparação com um grupo de controle normal sem estresse por imobilização. No entanto, foi identificado em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 que o tempo gasto em braços abertos (OT) e a frequência de entradas em braços abertos (OE) aumentam; e uma quantidade de corticosterona no sangue diminui notavelmente, mostrando um efeito excelente em comparação como o Bifidobacterium adolescentis IM38.
(2) Teste de transição claro/escuro
[0184] De acordo com o Exemplo Experimental 2-(2) acima, foi realizado um teste de transição claro/escuro, cujos resultados são mostrados na tabela 11 a seguir. [Tabela 11) Tempo na área Número de C pes)
[0185] Conforme mostrado na Tabela 11 acima, foi identificado em um grupo (IS), de modelos de estresse por imobilização administrados com soro fisiológico, que o tempo na área clara diminui em comparação com um grupo de controle normal sem estresse por imobilização, mas em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 foi identificado que o tempo na área clara aumenta em comparação com um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis IM38. (3) Teste do nado forçado
[0186] De acordo com o Exemplo Experimental 2-(4) acima, foi realizado um teste do nado forçado, cujos resultados são mostrados na tabela 12 a seguir. [Tabela 12)
[o FAFE]
[0187] Conforme mostrado na Tabela 12 acima, foi identificado em um grupo (IS), de modelos de camundongos deprimidos administrados com soro fisiológico, que o tempo de imobilidade aumenta em comparação com um grupo de controle normal sem estresse por imobilização, mas em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 foi identificado que o tempo de imobilidade diminui em comparação com um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis IM38. (4) Teste de suspensão pela cauda (TST)
[0188] De acordo com o Exemplo Experimental 2-(5) acima, foi realizado um teste de suspensão pela cauda (TST), cujos resultados são mostrados na tabela 13 a seguir. [Tabela 13] LC Fa a
[0189] Conforme mostrado na Tabela 13 acima, foi identificado em um grupo (IS), de modelos camundongo deprimidos administrados com soro fisiológico, que o tempo de imobilidade aumenta em comparação com um gqgrupo de controle normal sem estresse por imobilização, mas em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 o tempo de imobilidade diminui. (5) Medição de biomarcadores
[0190] Em duas horas após a realização de uma última experiência comportamental em um camundongo deprimido, o camundongo foi anestesiado e a corticosterona no sangue foi medida por ELISA, e o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), NF-kB do cérebro e NF-kB do cólon foram medidos por um método de imunotransferência igual ao método mostrado no Exemplo Experimental 5 acima, cujos resultados são mostrados na tabela 14 a seguir. [Tabela 114) — ER ESTE Nível de Corticosterona inibição da . expressão no sangue ativação de NF- de BDNF (ng/ml) kB es o 0,7 normal
E E PE] A A * —-, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-50 %; +++, >50 %
[0191] Como mostrado na Tabela 14 acima, foi identificado no grupo (IS) administrado com soro fisiológico que a atividade de NF-xB (p-p65/p65) aumenta no hipocampo; o nível de expressão de um fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) diminui; e a quantidade de corticosterona no sangue aumenta. No entanto, foi identificado em um grupo administrado com NK98 que uma atividade de NF-kB é inibida; o nível de expressão de BDNF aumenta; e a quantidade de corticosterona no sangue diminui, e tal efeito é excelente em comparação com o grupo administrado com IM38. (6) Efeito de melhora da colite
[0192] Em duas horas após a realização de uma última experiência comportamental em um camundongo ansioso no Exemplo Experimental 1, o camundongo foi anestesiado e o comprimento do cólon e as ativações de MPO, COX-2, TNF-a e NF-amb foram medidos pelo mesmo método conforme o Exemplo Experimental 5, e os resultados são mostrados na tabela 15 a seguir. [Tabela 15]
ES Comprimento Capacidade de do indicador do cólon inibição de MPO inflamatório
FED es e 6,2 normal
RR
* —-, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-50 %; +++, >50 &
[0193] Conforme mostrado na Tabela 15 acima, foi identificado em um grupo (IS), de modelos de estresse por imobilização administrados com soro fisiológico, que o comprimento do cólon diminui e MPO e indicadores de inflamatórios aumentam em comparação com um grupo de controle normal sem estresse por imobilização, mas em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 o comprimento do cólon é recuperado e a capacidade inibitória de MPO e os indicadores inflamatórios melhoram.
(7) Efeito de redução do estresse induzido por antibiótico
[0194] De acordo com os Exemplos Experimentais 2 a 5, foi realizada uma experiência em um camundongo, que foi submetido a estresse por antibiótico com a administração de ampicilina (100 mg/kg) por dois dias consecutivos pelo mesmo método conforme mostrado no Exemplo Experimental 1- (2) acima, e os resultados são mostrados nas tabelas 16 e 17 a seguir.
[Tabela 16]
ERES Corticosterona no em braços braços sangue (ng/ml) abertos (%) abertos (%) e ce 16,8 33,5 0,8 normal IS 4,9 13,4 3,2
Tempo passado Entradas em Corticosterona no em braços braços sangue (ng/ml) abertos (%) abertos (%) [Tabela 17) Taxa de inibição Capacidade do indicador Comprimento de inibição inflamatório do cólon (cm) de MPO NF- COX-2 | TNF-a xB Controle 6,3 normal
FEIA * —-, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-50 %; +++, >50 %
[0195] Conforme mostrado na Tabela 16 acima, foi identificado em um grupo (IS), de modelos de estresse induzido por antibiótico administrados com soro fisiológico, que o OT e OE diminuem em comparação com um grupo de controle normal em um teste do labirinto em cruz elevado e em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 foi identificado que o OT e a frequência do OE aumentam e uma quantidade de corticosterona no sangue diminui notavelmente, e esse efeito é excelente comparado ao Bifidobacterium adolescentis IM38.
[0196] Conforme mostrado na Tabela 17 acima, foi identificado em um grupo (IS), de modelos de estresse induzido por antibiótico administrados com soro fisiológico, que o comprimento do cólon diminui em comparação com um grupo de controle normal, e que a MPO e os indicadores inflamatórios aumentam, mas em um grupo administrado com Bifidobacterium adolescentis NK98 o comprimento do cólon foi recuperado e houve melhora na capacidade inibitória da MPO e dos indicadores inflamatórios. Exemplo 11: Efeito de Bifidobacterium adolescentis NK98 na melhora da função cognitiva
[0197] Um dia após a administração intraperitoneal de LPS isolado de E. coli (0,5 mg/kg/dia) a um camundongo durante cinco dias, foram administradas bactérias ácido- lácticas a este e foi identificado um efeito das bactérias ácido-lácticas na melhora da função cognitiva, de tal modo que foram realizados um teste de reconhecimento de objeto e um teste do labirinto em Y e o BDNF no hipocampo foi medido por imunotransferência, e os resultados são mostrados na tabela 18 a seguir.
[0198] Particularmente, como um método de teste de reconhecimento de objeto, dois objetos (A, A') com a mesma forma e tamanho foram fixados em uma caixa (40 x 40 x 40 cm), da qual o exterior não era visível por dentro e, em seguida, foi permitido a um camundongo que se movesse no centro da caixa e, em seguida, o número de toques nos dois objetos foi registrado durante 10 minutos. Após 24 horas, um dos dois objetos foi substituído por um novo (A, B) e, em seguida, o número de toques no objeto antigo e no novo foi registrado e quantificado.
[0199] Além disso, como o método de teste do labirinto em Y, um aparelho de teste consistia em três braços idênticos (8 cm de comprimento, 30 cm de largura, 14 cm de altura), cada um posicionado a um determinado ângulo de 120 º*. O camundongo foi colocado no final de um braço e deixado circular livremente no labirinto em Y por oito minutos, após o qual foram medidos o número e a ordem de entrada dos respectivos braços, para avaliar uma alteração espontânea (%). A alteração foi definida como uma ordem de caracteres alfabéticos, na qual o camundongo entrava sequencialmente em três braços, ou seja, ABC, BCA, CAB, etc. % alteração = [Número total de alterações] / [Número total de entradas em braço-2] x 100 [Tabela 18] Capacidade de Teste do Teste do expressão de reconhecimento labirinto BDNF do de objeto (%) em Y (%) hipocampo Controle 52,1 76,5 normal IS 38,5 56,7 - NK98 48,6 68,4 +++ IM38 46,5 64,5 ++ * —-, <10 %; +, 10-30 %; ++, 30-50 %; +++, >50 %
[0200] Como mostrado na Tabela 18 acima, foi identificado através do teste do reconhecimento de objeto e do teste do labirinto em Y, em um grupo administrado com
Bifidobacterium adolescentis NK98, que a função cognitiva melhora e a expressão de BDNF aumenta. Exemplo 12: Efeito da redução do estresse de acordo com a coadministração de dois tipos de bactérias ácido-lácticas
[0201] Lactobacillus reuteri NK33, uma bactéria ácido- láctica inovadora, Bifidobacterium adolescentis IM38 (número de acesso: KCCM11807P), uma bactéria revelada na publicação de patente coreana nº 10-2017-0090359, ou uma mistura das mesmas, foram comparadas entre si em relação ao efeito de redução do estresse.
[0202] Em particular, soro fisiológico (IS), 1 x 10º UFC de Lactobacillus reuteri NK33 (NK33), 1 x 10º UFC de Bifidobacterium adolescentis IM38 (IM38) ou uma combinação das ditas bactérias ácido-lácticas (NK33+IM38) com 0,5 x 10º UFC de cada, foram administrados em um modelo com estresse induzido por imobilização conforme mostrado no Exemplo Experimental 1-(1) acima e, em seguida, foi realizado um teste do labirinto em cruz elevado. Após isso, foi coletado sangue de cada grupo e foi medida a quantidade de corticosterona no sangue, cujos resultados são mostrados na tabela 19 a seguir. [Tabela 19] Tempo passado Entradas em Corticosterona em braços braços abertos no sangue abertos (3%) (%) (ng/ml) Controle 16,1 34,0 0,9 normal
Tempo passado Entradas em Corticosterona em braços braços abertos no sangue abertos (%) (%) (ng/ml) IM38 14,8 31,5 1,5
[0203] Conforme mostrado na Tabela 19 acima, foi identificado em um grupo tratado por coadministração que oO tempo gasto em braços abertos e as entradas em braços abertos aumenta e a quantidade de corticosterona no sangue diminui notavelmente em comparação com um grupo administrado com bactéria ácido-láctica sozinha.
[0204] Além disso, um efeito de uma mistura de Lactobacillus reuteri NK33 e Bifidobacterium adolescentis NK98 na redução do estresse foi comparado pelo mesmo método mostrado na experiência de coadministração de NK33 e IM38 acima, e cujos resultados são mostrados na tabela 20 a seguir. [Tabela 20] em braços braços abertos no sangue abertos (3%) (%) (ng/ml) Controle 18,1 34,2 0,9 normal IS 5,5 17,1 2,9
[0205] Conforme mostrado na Tabela 20 acima, foi identificado em um grupo tratado por coadministração que o tempo gasto em braços abertos e as entradas em braços abertos aumenta e a quantidade de corticosterona no sangue diminui notavelmente em comparação com um grupo administrado com bactéria ácido-láctica sozinha. Informações de registro de bactérias ácido-lácticas
[0206] os presentes inventores depositaram o Lactobacillus reuteri NK33 para fins de patente no Korean Culture Center of Microorganisms (Centro Coreano de Cultura de Microrganismos), uma instituição depositária certificada (endereço: Yulim Hongjenae, 45, Hongjenae 2 ga-gil, Seodaemun-gu, Seul, Coreia do Sul), em 4 de agosto de 2017 e receberam o número de acesso KCCM12090P.
[0207] Além disso, os presentes inventores depositaram o Bifidobacterium adolescentis NK98 para fins de patente no Korean Culture Center of Microorganisms, uma instituição depositária certificada (endereço: Yulim Hongjenae, 45, Hongjenae 2 ga-gil, Seodaemun-gu, Seul, Coreia do Sul), em sexta-feira, 3 de agosto de 2018 e receberam o número de acesso KCCM12297P.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES
1. Bactéria ácido-láctica caracterizada por ser isolada de fezes.
2. Bactéria ácido-láctica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a bactéria ácido-láctica é Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P) ou Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P).
3. Bactéria ácido-láctica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P) compreende “uma sequência de 16S rDNA de SEQ ID NO: 1.
4, Bactéria ácido-láctica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P) compreende uma sequência de 16S rDNA de SEQ ID NO: 38.
5. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica caracterizada por conter Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P), Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P) ou uma mistura destes.
6. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P) ou Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P) é uma célula bacteriana viva, uma célula bacteriana morta, um produto de cultura destes, um extrato ou um produto de esmagamento destes.
7. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a doença mental neurológica é uma doença neurodegenerativa ou um transtorno mental.
8. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, de acordo com à reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o transtorno mental é um ou mais selecionados a partir do grupo compreendendo ansiedade, depressão, transtorno de humor, insônia, transtorno delirante, transtorno obsessivo, enxaqueca, estresse, transtorno de memória, transtorno de atenção e cognitivo.
9. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a doença neurodegenerativa é uma ou mais selecionada do grupo compreendendo doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Alzheimer, esclerose lateral amiotrófica, atrofia espinocerebelar, síndrome de Tourette, ataxia de Friedrich, doença de Machado-Joseph, demência, distonia e paralisia supranuclear progressiva.
10. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende adicionalmente Bifidobacterium adolescentis IM38 (KCCM11807P).
11. Alimento funcional para a saúde para prevenir ou melhorar uma doença mental neurológica caracterizado por compreender Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P), Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P) ou uma mistura destes.
12. Composição farmacêutica para prevenir ou tratar uma doença inflamatória caracterizada por compreender Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P), Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P) ou uma mistura destes.
13. Alimento funcional para a saúde para prevenir ou melhorar uma doença inflamatória caracterizado por compreender Lactobacillus reuteri NK33 (KCCM12090P), Bifidobacterium adolescentis NK98 (KCCM12297P) ou uma mistura destes.
14. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica caracterizada por compreender uma preparação para medir um nível de um microrganismo intestinal, em que o microrganismo intestinal é um ou mais selecionados a partir do grupo compreendendo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias, lactobacilos, B-proteobactérias, ô-proteobactérias, y-proteobactérias, e£- proteobactérias e enterobactérias.
15. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição diagnostica a doença mental neurológica se houver um aumento no nível de um ou mais microrganismos selecionados do grupo compreendendo B-proteobactérias, ô-proteobactérias, v- proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias entre os microrganismos intestinais.
16. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 15 caracterizada pelo fato de que as enterobactérias são uma ou mais selecionadas a partir do grupo compreendendo Klebsiella oxytoca, Escherichia coli e Morganella morganii.
17. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição diagnostica a doença mental neurológica se houver uma diminuição no nível de um ou mais microrganismos selecionados do grupo compreendendo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias e lactobacilos entre os microrganismos intestinais.
18. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que os lactobacilos são um ou mais selecionados do grupo compreendendo Lactobacillus reuteri, Lactobacillus johnsonii e Lactobacillus rhamnosus, e a bifidobactéria é Bifidobacterium animalis.
19. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição diagnostica a doença mental neurológica se houver um aumento no nível de um ou mais microrganismos selecionados do grupo compreendendo B-proteobactérias, ô-proteobactérias, Y- proteobactérias, e-proteobactérias e enterobactérias entre os microrganismos intestinais; e se houver uma diminuição em um nível de um microrganismo selecionado a partir do grupo compreendendo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias e lactobacilos entre os microrganismos intestinais.
20. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a preparação é um iniciador ou sonda capaz de medir um nível de um gene específico de um microrganismo intestinal; um anticorpo ou aptâmero capaz de medir um nível de uma proteína expressa pelo gene específico; um iniciador ou sonda para analisar quantitativamente uma sequência de 168 rDNA do microrganismo intestinal; ou uma preparação para pirossequenciamento para analisar quantitativamente uma sequência de DNA do genoma do microrganismo intestinal.
21. Composição para diagnosticar uma doença mental neurológica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a composição compreende adicionalmente uma preparação para medir uma quantidade de lipopolissacarídeo (LPS).
22. Kit para diagnosticar uma doença mental neurológica caracterizado por compreender a composição de acordo com uma das reivindicações 14 a 21.
23. Método para fornecer informações para diagnosticar uma doença mental neurológica caracterizado por compreender: uma etapa de medir um nível de um microrganismo intestinal a partir de fezes isoladas de um indivíduo suspeito de ter a doença mental neurológica; e uma etapa de comparação do nível do microrganismo intestinal com um nível do microrganismo intestinal nas fezes de um grupo controle, em vez daquele da doença mental neurológica, em que o microrganismo intestinal é um ou mais selecionados a partir do grupo compreendendo bacteroidetes, actinobactérias, firmicutes, bifidobactérias, lactobacilos, B-proteobactérias, ô-proteobactérias, y-proteobactérias, e£- proteobactérias e enterobactérias.
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