CN109789173B - 源自芽孢杆菌细菌的纳米囊泡及其用途 - Google Patents

源自芽孢杆菌细菌的纳米囊泡及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡及其用途。本发明人已经证实，与正常人相比，在患有癌症，例如肝癌、膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌；炎性疾病，如哮喘和特应性皮炎；或代谢疾病，例如糖尿病和肝硬化的患者的样品中囊泡显著减少，并且所述囊泡抑制由诸如源自大肠杆菌的囊泡的致病囊泡分泌炎症介质，所述致病囊泡是炎性疾病、糖尿病等的致病因素。因此，根据本发明的源自芽孢杆菌属的囊泡可有利地用于开发癌症、炎性疾病和代谢疾病的诊断方法的目的，及用于其预防或治疗的组合物。

Description

源自芽孢杆菌细菌的纳米囊泡及其用途
技术领域
本发明涉及源自芽孢杆菌属的细菌的纳米囊泡及其用途，更具体地，涉及使用源自芽孢杆菌属的细菌的纳米囊泡来诊断癌症、炎性疾病或代谢疾病的方法，以及用于预防或治疗癌症、炎性疾病或代谢疾病的包括纳米囊泡的组合物。
背景技术
进入21世纪，虽然过去被认为是流行病的急性传染病的重要性已变得不那么重要，但疾病模式已发生变化，使得人类和微生物组之间的不相容导致的慢性疾病被认为是决定生活质量和人类寿命的主要疾病。慢性疾病的特征在于伴随免疫功能障碍的慢性炎症，并且癌症、慢性炎性疾病、代谢疾病等正在成为公共健康中的严重问题。
炎症是针对细胞和组织的损伤或感染的局部或系统防御机制，并且通常由连续生物反应引起，所述生物反应由于由免疫系统组成的体液介质的直接反应或局部或全身效应系统的刺激而发生。主要的炎性疾病包括如胃炎、炎性肠炎等胃肠道疾病，牙周炎等口腔疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、鼻炎等呼吸系统疾病，特应性皮炎、脱发和牛皮癣等皮肤病，如退行性关节炎、类风湿性关节炎等关节炎，以及如肥胖、糖尿病、肝硬化等代谢性疾病。此外，各种研究报道持续炎症可导致癌症的结果(Cancers 2014,6,926-957)。
与人体共生的微生物数量为100万亿，比人类细胞数量大10倍，众所周知，微生物基因数量超过人类细胞基因数量的100倍。微生物群(microbiota)或微生物菌群(microbiome)指存在于给定栖息地中的微生物群落，包括细菌、古细菌和真核生物，并且肠道微生物群在人类的生理现象中起重要作用，并且已知通过与人体细胞的相互作用对人类健康和疾病有重大影响。
与人体共生的细菌和古细菌分泌纳米级囊泡(纳米囊泡)，以用于与其他细胞交换遗传或蛋白质信息。粘膜形成物理防御膜，尺寸为200纳米(nm)或更大的颗粒不能通过该膜，而与粘膜共生的细菌不能通过粘膜，因为源自细菌的纳米囊泡在尺寸上为100nm或更小，它们通过粘膜相对自由地穿过上皮细胞，因此被人体吸收。在人体内被吸收的源自病原菌的囊泡已经被鉴定为对于引起炎性疾病是至关重要的因素，炎性疾病如，诸如特应性皮炎之类的炎性皮肤病，诸如慢性鼻炎、哮喘或COPD之类的炎性呼吸系统疾病，或诸如溃疡性结肠炎或克罗恩病之类的炎性肠道疾病。此外，最近发现，源自致病菌的囊泡也与诸如糖尿病或肥胖等代谢性疾病，或诸如肺癌、胃癌、结肠癌等实体癌的发生密切相关，并已受到关注。然而，没有通过在临床样品中量化来自芽孢杆菌属的细菌的囊泡来诊断癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的案例。
芽孢杆菌属是包含在厚壁菌门中的革兰氏阳性杆菌，由于它们在厌氧环境和有氧环境中生长，并且在压力情况下形成孢子，因此可以存活很长一段时间。在芽孢杆菌属的细菌中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是革兰氏阳性杆菌，其可以在非致病性好氧环境中生长，并且在自然界中，例如在干草、污水、土壤和灰尘以及空气中广泛分布。另外，作为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)亚型的纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilisnatto)即使在厌氧环境中也可以生长，并且由于它在生产清麴酱(cheonggukjang)时附着在稻草上，因此，当豆被加热到约40℃，并且稻草在厌氧条件下填塞在豆中时，纳豆枯草芽孢杆菌大量生长。清麴酱是一种韩国传统食品，通过大豆发酵制成，类似于日本纳豆。虽然大酱(doenjang)在食用前需要几个月的发酵，但清麴酱可以在经发酵的2至3天内食用。换句话说，清麴酱可以在发酵的大豆糊中在最短的时间内制成。通过自然发酵制成的清麴酱是这样制成的：将大豆浸泡在热水中10至20小时，将浸泡的大豆用额外的水煮沸以充分煮熟，并将大豆酝酿成熟以用于发酵。当将吸管均匀地放在容器上，并将煮沸的大豆倒在其上，冷却至60℃并放置在温暖的地方，同时用毯子或橡皮布覆盖以将温度保持在45℃时，产生纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)以将大豆发酵成发酵产品。
用于治疗或预防慢性炎性疾病的一般组合物主要分类为类固醇组合物和非类固醇组合物，并且在许多情况下，它们中的大多数通常伴有各种副作用。此外，就类风湿性关节炎、脱发或炎性肠炎等炎性疾病的病因而言，TNF-α的重要性已引起关注，并且作为类风湿性关节炎的治疗剂，TNF-α抑制剂受到了关注。然而，不存在从芽孢杆菌属或枯草芽孢杆菌属的细菌分泌的囊泡中的基因定量用于诊断癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的情况，也没有囊泡用于预防或治疗炎性疾病的情况。
发明内容
[技术问题]
本发明人进行了深入研究以解决存在的问题，并且通过宏基因组分析存在于人样品中的源自细菌的纳米囊泡证实了，与正常人相比，从患有诸如肝癌、膀胱癌、乳腺癌或卵巢癌等实体癌，诸如哮喘或特应性皮炎等慢性炎性疾病，或诸如糖尿病或肝硬化等代谢疾病的患者获得的样品中，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量显著降低。作为评价治疗效果的结果，本发明人证实，从体外培养的芽孢杆菌属的细菌，特别是枯草芽孢杆菌中分离的囊泡显示出优异的抗炎作用，从而完成了本发明。
因此，本发明旨在提供一种提供用于诊断癌症、慢性炎性疾病和代谢疾病的信息的方法。
本发明还涉及提供用于预防或治疗癌症、慢性炎性疾病和代谢疾病的组合物，其包括源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
然而，本发明要解决的技术问题不限于上述问题，本领域普通技术人员根据以下描述将充分理解本文未描述的其他问题。
[技术方案]
为了实现本发明的目的，本发明提供一种提供用于诊断癌症、慢性炎性疾病和代谢疾病的信息的方法，其包括以下步骤：
(a)从囊泡中提取DNA，所述囊泡从从正常人和受试者获得的样品中分离出来；
(b)通过使用存在于16S rDNA序列中的引物对对所提取的所述DNA进行PCR来获得PCR产物，以检测源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定当源自所述芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量低于正常人的囊泡的含量时，为癌症、炎性疾病或代谢疾病。
在本发明的一示例性实施方案中，所述癌症可以是肝癌、膀胱癌、乳腺癌或卵巢癌。
在本发明的另一示例性实施方案中，所述炎性疾病可以是哮喘、慢性肝炎或特应性皮炎。
在本发明的一示例性实施方案中，所述代谢疾病可以是糖尿病或肝硬化。
在本发明的另一示例性实施方案中，从所述患者获得的所述样品可以是血液、尿液或粪便样品。
本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症、炎性疾病或代谢疾病的药物组合物，其包含：源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
在本发明的另一示例性实施方案中，本发明还提供了一种用于减轻癌症、炎性疾病或代谢疾病的保健功能食品组合物，其包括：源自所述芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
在本发明的另一示例性实施方案中，本发明还提供了一种用于预防或治疗癌症、炎性疾病或代谢疾病的吸入式组合物，其包括：源自所述芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
在本发明的另一示例性实施方案中，一种用于减轻炎性疾病的化妆品组合物，其包含：源自所述芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
在本发明的又一示例性实施方案中，源自所述芽孢杆菌属的细菌的囊泡可以是源自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的囊泡。
在本发明的又一示例性实施方案中，源自所述枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的囊泡可以是源自纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)的囊泡。
在本发明的又一示例性实施方案中，所述癌症可以选自肝癌、膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌；所述炎性疾病可以选自哮喘、慢性肝炎、脱发、类风湿性关节炎、炎性肠炎和特应性皮炎；并且所述代谢疾病可以是糖尿病或肝硬化。
在本发明的又一示例性实施方案中，所述炎性疾病可以是选自类风湿性关节炎、脱发和炎性肠炎中的一种或多种疾病，其中涉及炎性细胞因子如由IL-6或TNF-α作为其病因。
在本发明的又一示例性实施方案中，所述囊泡的平均直径可以为10nm至200nm。
在本发明的又一示例性实施方案中，囊泡可以是从芽孢杆菌属的细菌天然的或人工分泌的。
在本发明的又一示例性实施方案中，囊泡可以是从芽孢杆菌属的细菌的培养液中分离出来的。
本发明还提供了一种预防或治疗癌症、炎性疾病或代谢疾病的方法，其包括：将包含本发明的源自所述芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡的药物组合物施用给受试者。
本发明还提供了源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡用于预防或治疗炎性疾病的用途。
[有益效果]
发明人证实肠道细菌不被吸收到体内，但是源自细菌的囊泡被吸收到体内并全身分散，然后通过肾脏、肝脏或肺分泌，并且还通过宏基因组分析存在于患者的血液、尿液或粪便中的源自细菌的囊泡证实了，存在于患有诸如肝癌、膀胱癌、乳腺癌或卵巢癌等实体癌，诸如哮喘或特应性皮炎等慢性炎性疾病，或诸如糖尿病或肝硬化等代谢疾病的患者的血液中的囊泡明显少于正常人的血液中的囊泡。
此外，当枯草芽孢杆菌标准菌株(其是变形杆菌属的细菌中的一种)和纳豆枯草芽孢杆菌(其是枯草芽孢杆菌亚型)在体外培养以分离囊泡，将囊泡在体外施用于炎性细胞时，观察到由致病囊泡引起的炎症介质的分泌被显著抑制，表明源自根据本发明的芽孢杆菌属的细菌的囊泡可以有效地用于：诊断或预测癌症，慢性炎性疾病或代谢疾病的方法，以及用于预防或治疗癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的食品、吸入剂、化妆品或药物组合物。
附图说明
图1A显示了一组图像，其表示细胞和源自细胞的囊泡(EV)口服给药于小鼠后的细菌和囊泡的分布模式。
图1B显示了一组图像，其通过在口服给药后12小时提取血液、肾脏、肝脏和各种器官来评估体内的细胞和囊泡的分布模式。
图2是示意性地说明来源于源自人的样品的源自细胞的囊泡的宏基因组分析方法的图。
图3显示了比较肝癌患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图4显示了比较膀胱癌患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图5显示了比较乳腺癌患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图6显示了比较卵巢癌患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图7显示了比较哮喘患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图8显示了比较特应性皮炎患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图9显示了比较糖尿病患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图10显示了比较肝硬化患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图11显示了比较糖尿病患者和正常人的在对其血液中存在的源自细菌的囊泡进行宏基因组分析后，源自埃希氏菌属的细菌的囊泡分布的结果。
图12A显示了通过电子显微镜经由超速离心测量从枯草芽孢杆菌培养物溶液中分离的源自枯草芽孢杆菌的囊泡的形态和大小的结果。
图12B显示了通过动态光散射经由超速离心测量从枯草芽孢杆菌培养物溶液中分离的源自枯草芽孢杆菌的囊泡的形态和大小的结果。
图13A显示了比较在巨噬细胞Raw 264.7细胞系用源自大肠杆菌的囊泡(E.coliEV)(所述源自大肠杆菌的囊泡是癌症、炎性疾病或代谢疾病的致病因素)作为阳性对照、不同浓度的源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡(Bacillus subtilis EV)和源自纳豆芽孢杆菌的囊泡(Bacillus subtilis natto EV)处理后炎症介质的分泌的结果，并且作为炎症介质的IL-6浓度通过ELISA测量[NC：阴性对照(PBS)，EV：细胞外囊泡]。
图13B显示了比较在巨噬细胞Raw 264.7细胞系用大肠杆菌EV(其是癌症、炎性疾病或代谢疾病的致病因素)作为阳性对照、不同浓度的源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡(Bacillus subtilis EV)和源自纳豆芽孢杆菌的囊泡(Bacillus subtilis natto EV)处理后分泌炎症介质的程度的结果，并且作为炎症介质的TNF-α浓度通过ELISA测量[NC：阴性对照(PBS)，EV：细胞外囊泡]。
图14A显示了用源自植物乳杆菌的囊泡(植物乳杆菌EV)作为对照药物、源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡(Bacillus subtilis EV)和源自纳豆芽孢杆菌的囊泡(Bacillussubtilis natto EV)预处理巨噬细胞Raw 264.7细胞系，预处理后12小时，作为炎症的致病因素的源自大肠杆菌的囊泡被处理，之后，评价源自枯草芽孢杆菌标准菌株和纳豆芽孢杆菌菌株的囊泡的抗炎作用的结果，并且IL-6浓度通过ELISA测量[NC：阴性对照(PBS)，PC：阳性对照，EV：细胞外囊泡]。
图14B显示了用源自植物乳杆菌的囊泡(植物乳杆菌EV)作为对照药物、源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡(Bacillus subtilis EV)和源自纳豆芽孢杆菌的囊泡(Bacillussubtilis natto EV)预处理巨噬细胞Raw 264.7细胞系，预处理后12小时，作为炎症的致病因素的源自大肠杆菌的囊泡被处理，之后，评价源自枯草芽孢杆菌标准菌株和纳豆芽孢杆菌菌株的囊泡的抗炎作用的结果，并且TNF-α浓度通过ELISA测量[NC：阴性对照(PBS)，PC：阳性对照，EV：细胞外囊泡]。
具体实施方式
本发明涉及源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡及其用途。
本发明人通过宏基因组分析证实了，与正常人相比，从患有诸如肝癌、膀胱癌、乳腺癌或卵巢癌等实体癌，诸如哮喘或特应性皮炎等慢性炎性疾病，或诸如糖尿病或肝硬化等代谢疾病的患者获得的样品中，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量显著降低。此外，当分离包含在芽孢杆菌属的细菌中的源自枯草芽孢杆菌标准菌株和枯草芽孢杆菌菌株(纳豆枯草芽孢杆菌)的囊泡并将其施用于炎性细胞时，证实了针对源自大肠杆菌的囊泡(其是致病囊泡)的炎症反应被有效地抑制，因此完成了本发明。
在一个方面，本发明提供了一种提供用于诊断癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的信息的方法，其包括以下步骤：
(a)从囊泡中提取DNA，所述囊泡从从正常人和受试者获得的样品中分离出来；
(b)通过使用存在于16S rDNA序列中的引物对对所提取的所述DNA进行PCR来获得PCR产物，以检测源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定当源自所述芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量低于正常人的囊泡的含量时，为癌症、炎性疾病或代谢疾病。
此外，本发明人通过宏基因组学分析证实，与正常人相比，在从患有糖尿病的患者获得的样品中，源自埃希氏菌属的细菌的囊泡的含量显著增加，因此本发明提供了一种提供用于糖尿病诊断的信息的方法，其包括以下步骤：
(a)从囊泡中提取DNA，所述囊泡从从正常人和受试者获得的样品中分离出来；
(b)通过使用存在于16S rDNA序列中的引物对对所提取的所述DNA进行PCR来获得PCR产物，以检测源自埃希氏菌属的细菌的囊泡；以及
(c)通过所述PCR产物的定量分析确定当源自所述埃希氏菌属的细菌的囊泡的含量高于正常人的囊泡的含量时，为糖尿病。
这里使用的术语“诊断”是指在所有方面判断患者疾病的实际状况。判断的内容包括疾病的名称、疾病的病因、疾病的类型、严重程度、疾病状况的详细方面、并发症的存在或不存在以及预后。本发明的诊断是判断诸如癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的疾病的发生和疾病的程度。
在另一方面，本发明提供用于预防或治疗癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的食品、化妆品、吸入剂或药物组合物，其包含作为活性成分的源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡。
本文使用的术语“预防”是指通过施用根据本发明的药物组合物抑制或延迟癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的所有行动。
本文使用的术语“治疗”是指通过施用根据本发明的食品、化妆品、吸入剂或药物组合物来缓解或有益地改变癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的症状的所有行动。
源自本发明的芽孢杆菌属的细菌的囊泡可以从芽孢杆菌属的细菌的培养液或使用芽孢杆菌属的细菌制成的发酵食品中分离出来，优选从枯草芽孢杆菌或纳豆枯草芽孢杆菌的培养液或使用枯草芽孢杆菌或纳豆枯草芽孢杆菌制备的发酵食品中分离出来，以及天然地或人工分泌自枯草芽孢杆菌或纳豆枯草芽孢杆菌，但本发明不限于此。
一种分离本发明的芽孢杆菌属的细菌的培养液或发酵食品的方法没有特别限制，只要培养液或发酵食品包含囊泡即可。例如，可以使用诸如离心、超速离心、通过过滤器过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳或毛细管电泳之类的方法分离囊泡，并且该方法可以进一步包括用于去除细胞碎片的洗涤和浓缩所收集的囊泡。
在本发明中，通过上述方法分离的囊泡优选具有10至1000nm的平均直径，更优选40至100nm的平均直径，但是本发明不限于此。
根据本发明的药物组合物可包括源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体通常在制备中使用，并且包括盐水、蒸馏水、林格氏溶液、缓冲盐水、环糊精溶液、右旋糖溶液、麦芽糖糊精溶液、甘油、乙醇、脂质体等，但本发明不是限于此。如果需要，可以进一步包括其他常规使用的添加剂，例如抗氧化剂和缓冲剂。另外，可以通过另外添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂、润滑剂等来配制诸如水溶液、悬浮液或乳液之类的可注射制剂、丸剂、胶囊、颗粒或片剂。可以使用Remington's Pharmaceutical Science中公开的方法根据每种组分配制合适的药学上可接受的载体及其制剂。本发明的药物组合物不限于剂型，因此可以配制成注射剂，吸入剂或用于皮肤的外用制剂。
本发明的药物组合物可以根据所需的方法口服或非口服(例如，静脉内、皮下、腹膜内或局部)施用，并且药物组合物的剂量可以根据患者的病症和体重、疾病的严重程度、药物类型、给药途径和时间而变化，并且可以由本领域普通技术人员适当地选择。
本发明的药物组合物以药学有效量施用。本文使用的“药学有效量”是指足以以适合于医学治疗的合理的益处/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量可以通过包括患者的疾病类型、严重程度、药物活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径和排泄率、治疗持续时间和同时使用的药物在内的参数以及医学领域中众所周知的其他参数来确定。本发明的药物组合物可以单独施用或与其他治疗剂组合施用，并且可以与常规治疗剂依次或同时施用，或者以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述参数，重要的是用最小剂量实现最大效果而没有副作用，并且本领域普通技术人员可以容易地确定这样的剂量。
具体地，根据本发明的组合物的有效量可以通过患者的年龄、性别或体重来确定。通常，组合物可以按每天或每隔一天，或每日剂量的单份或三等份，每千克体重0.001至150mg，优选0.01至100mg的剂量施用。然而，由于剂量可根据给药途径、肥胖的严重程度、性别、体重、年龄等而变化，因此剂量不以任何方式限制本发明的范围。
在本发明的又一方面，本发明提供了用于减轻癌症、炎性疾病或代谢疾病的保健功能食品组合物，其包括源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
本文使用的术语“缓解”是指至少减少与待治疗的病症相关的参数(例如症状的程度)的所有类型的动作。
在本发明的保健功能食品组合物中，活性成分可以单独添加到食品中或与其他食品或食品组分一起添加，并且可以根据常规方法适当地使用。活性成分的混合量可以通过其使用目的(用于预防或缓解)适当地确定。通常，在食品或饮料生产中，相对于原料，本发明的组合物以15wt％或更少，优选10wt％或更少的量添加。但是，在为了健康和卫生或健康控制而长期摄入的情况下，数量可能低于上述范围。
除了活性成分作为预定比例的必要组分外，本发明的保健功能食品组合物对组分没有特别限制，并且可以包括各种风味剂或天然碳水化合物作为附加组分(如一般饮料)。上述天然碳水化合物的实例包括单糖，如葡萄糖、果糖等；二糖，如麦芽糖、蔗糖等；多糖，如糊精、环糊精等一般糖类，以及如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等糖醇等。除了上述组分之外，可以有利地使用天然调味剂(奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如莱鲍迪甙A、甘草甜素)等)和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)作为调味剂。天然碳水化合物的比例可以通过本领域普通技术人员的选择适当地确定。
除了上述组分之外，本发明的保健功能食品组合物可含有各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、如合成和天然调味剂等调味剂、着色剂、增稠剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇和用于碳酸化饮料的碳酸化剂。这些组分可以单独使用或组合使用。这些添加剂的比例可以由本领域普通技术人员适当选择。
另一方面，本发明提供用于预防或治疗炎性疾病的吸入式组合物，其包括源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
在本发明的吸入式组合物中，活性成分可以单独或与其它组分一起加入吸入剂中，并且可以通过常规方法适当地使用。活性成分的混合量可以通过其使用目的(用于预防或治疗)适当地确定。
另一方面，本发明提供用于缓解炎性疾病或脱发的化妆品组合物，其包括源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡。
本发明的化妆品组合物可包括常规用于化妆品组合物中的组分以及源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡，并且化妆品组合物中常规使用的组分可包括常规赋形剂，例如抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和香料，以及载体。
此外，本发明的组合物还可包含常规使用的有机UV阻断剂，其通过与源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡反应而混合，只要其不损害皮肤保护效果即可。有机紫外线阻断剂可以是选自下组中的一种或多种：甘油基PABA，甲酚曲唑三硅氧烷，甲酚曲唑(drometrizol)，二乙酰基三油酸酯，苯基二苯并咪唑四磺酸二钠，二乙基己基丁酰胺三氮唑，二乙氨基羟基苯甲酰基己基苯甲酸酯，DEA-甲氧基肉桂酸酯，指甲花醌和二羟基丙酮的混合物，亚甲基双苯并三唑基四甲基丁基苯酚，4-甲基亚苄基樟脑，邻氨基苯甲酸薄荷酯，二苯甲酮-3(氧苯酮)，二苯甲酮-4，二苯甲酮-8(二氧苯酮)，丁基甲氧基苯甲酰甲烷，二乙基己氧基苯酚甲氧基苯基三嗪，西诺沙酯(cinoxate)，乙基二羟丙基PAVA，氰双苯丙烯酸辛酯(octocrylene)，乙基己基二甲基PABA，甲氧基肉桂酸乙基己酯，水杨酸乙基己酯，乙基己基三氮唑，异戊基对甲氧基肉桂酸酯，聚硅氧烷-15(二甲基共二乙基苯亚甲基丙二酸酯(dimethicodiethylbenzal malonate))，对苯二亚甲基二樟脑磺酸(terephthalylidene dicamphor sulfonicacid)及其盐，TEA-水杨酸酯和氨基苯甲酸(PAVA)。
作为可以添加本发明的化妆品组合物的产品，例如，可以使用诸如收敛性调色剂、软化调色剂、营养调色剂、各种类型的乳膏、香精、填料(pack)和粉底、以及清洁剂、香皂、治疗或化妆品溶液等化妆品。本发明化妆品组合物的具体实例包括润肤露、皮肤柔软剂、皮肤调色剂、收敛剂、洗剂、乳液、保湿乳液、滋养乳液、按摩霜、滋养霜、保湿霜、护手霜、精华素、滋养精华、填料(pack)、香皂、洗发水、洁面泡沫、洁面乳、洁面霜、润肤露、身体清洁乳、乳剂、唇膏、彩妆基底、粉底、粉饼、散粉和眼影。
根据本发明的示例性实施方案，源自本发明的芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量相对于组合物的总重量可以为0.00001至30wt％，优选0.5至20wt％，更优选1.0至10wt％。当源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量小于0.00001wt％时，UV吸收效果大大降低，并且当源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的含量大于30wt％时，皮肤炎症可能发生，并且剂型可能存在问题。
在另一方面，本发明提供预防或治疗癌症、炎性疾病或代谢疾病的方法，该方法包括给受试者施用包含源自芽孢杆菌属的细菌的作为活性成分的囊泡的组合物。
本文使用的术语“受试者”是指需要治疗的受试者，更具体地，指需要治疗的哺乳动物，例如人，或非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马和牛。
本文使用的作为一种经过诊断的疾病的癌症表示渗入外周组织、迅速生长并扩散或转移到身体的每个部位、从而危及生命的恶性肿瘤。是体内最小单元的细胞通常通过其调节功能分裂和生长，当其接近其寿命结束或被损坏时自行死亡，从而保持数量的总体平衡。然而，如果由于各种原因在这些细胞的调节中存在问题，则通常应该死亡的异常细胞过度增殖，它们渗入外周组织和器官，从而形成肿块，并且现有结构被破坏或转化。在本发明中，癌症优选为肝癌、膀胱癌、乳腺癌或卵巢癌，但本发明不限于此。
本文使用的术语“炎性疾病”是指由哺乳动物体内的炎症反应引起的疾病，并且炎性疾病的代表性实例包括呼吸性炎性疾病，例如哮喘、慢性阻塞性肺病或鼻炎；皮肤炎性疾病，如特应性皮炎、牛皮癣、痤疮、接触性皮炎或脱发；消化性炎性疾病，如胃炎、消化道溃疡或炎性肠炎；阴道炎；关节炎，如骨关节炎或类风湿性关节炎；以及它们的并发症。此外，炎性疾病可以包括一般炎性疾病以及与炎症反应相关的癌症，例如乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌或肝癌。此外，炎性疾病包括一般炎性疾病以及与炎症反应相关的代谢疾病，例如糖尿病、肥胖症或肝硬化。在本发明中，慢性炎性疾病优选包括哮喘、慢性肝炎、脱发或特应性皮炎，但是本发明不限于此。
本文使用的术语“代谢疾病”是指在哺乳动物体内的各种器官中发生代谢紊乱诱发的并发症的疾病。例如，诸如糖尿病之类的碳水化合物代谢病症及其并发症包括肝硬化，并且在本发明中，代谢疾病优选包括糖尿病和肝硬化，但是本发明不限于此。
本文使用的术语“纳米囊泡或囊泡”是指由各种细菌分泌的纳米级膜状结构。源自革兰氏阴性细菌的囊泡或外膜囊泡(OMV)具有毒性蛋白质、细菌DNA和RNA、以及脂多糖，而源自革兰氏阳性细菌的囊泡也具有肽聚糖和脂磷壁酸，它们是细菌细胞壁组分、以及蛋白质和核酸。在本发明中，纳米囊泡或囊泡是天然分泌的并且由芽孢杆菌属的细菌人工产生，并且具有平均直径为10-200nm的球形。
本文使用的术语“宏基因组”，也称为“微生物组”，是指存在于所有病毒、细菌、真菌等中的基因组的总数存在于诸如土壤、动物肠等分离的区域中，并且是用作基因组材料的概念，以用于解释使用测序仪一次性鉴定许多微生物以通常分析不能培养的微生物。特别地，宏基因组不是指一个物种的基因组，而是指单个环境单元中所有物种的混合基因组。该术语源于这样的观点：当在生物学发展到组学的过程中定义一个物种时，各种物种以及现有的一个物种在功能上彼此相互作用以形成完整的物种。从技术上讲，宏基因组是用于以下技术的主题：经由快速测序，通过分析所有DNA和RNA(不管物种如何)来识别一个环境中的所有物种并定义相互作用和代谢作用。
在本发明中，源自细菌的纳米囊泡可以使用一种或多种方法从含有细菌的培养液中分离出来，所述方法选自离心、超速离心、挤出、超声波处理、细胞裂解、均质化、冻融、电穿孔、机械分解、化学处理、过滤器过滤、凝胶过滤色谱、自由流动电泳和毛细管电泳。另外，上述方法可以进一步包括用于去除细胞碎片的洗涤和收集的囊泡的浓缩。
在本发明的一示例性实施方案中，通过向小鼠口服施用细菌或源自细菌的囊泡以评估其细菌和囊泡的体吸收、分布和分泌模式，证实细菌没有通过肠粘膜吸收，但是，囊泡在施用后5分钟内被吸收，分散到全身，并通过肾脏、肝脏等分泌(参见实施例1)。
在本发明的一示例性实施方案中，使用从患有肝癌、膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌的每个患者以及与癌症患者的年龄和性别匹配的正常人的血液中分离的囊泡，进行细菌宏基因组分析。分析结果显示，与正常样品相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在肝癌、膀胱癌、乳腺癌和卵巢癌患者的样品中显著减少(参见实施例3、4、5和6)。
在本发明的另一示例性实施方案中，使用从患有哮喘和特应性皮炎的患者和与患者的年龄和性别匹配的正常人的样品中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。分析结果显示，与正常人的样品相比，在患有哮喘和特应性皮炎的患者的样品中，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例7和8)。
在本发明的另一示例性实施方案中，使用从患有糖尿病和肝硬化的患者以及与患者的年龄和性别匹配的正常人的样品中分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。分析结果显示，与正常人的样品相比，在患有糖尿病和肝硬化的患者的样品中，来自芽孢杆菌属的细菌的囊泡显著减少(参见实施例9和10)。
在本发明的另一示例性实施方案中，使用从糖尿病患者样品和与患者年龄和性别匹配的正常人分离的囊泡进行细菌宏基因组分析。分析结果显示，与正常人的样品相比，在糖尿病患者的样品中，源自埃希氏菌属的细菌的囊泡显著增加(参见实施例11)。
在本发明的另一示例性实施方案中，通过对于评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡是否抑制通过癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的致病因子引起的炎症反应的深入研究，观察到，与源自大肠杆菌的囊泡相比，在源自枯草芽孢杆菌(标准菌株)的囊泡和源自纳豆枯草芽孢杆菌(其是枯草芽孢杆菌亚种)的囊泡的情况下，几乎没有引起炎症的效果，并且观察到当用源自枯草芽孢杆菌或纳豆枯草芽孢杆菌的囊泡预处理时，由源自作为病原致病因子的大肠杆菌的囊泡引起的炎症反应被有效抑制，从而完成了本发明(参考实施例13和14)。
在下文中，为了帮助理解本发明，将提出示例性实施例。然而，仅提供以下实施例以更容易理解本发明，而不是限制本发明。
[实施例]
实施例1.细菌和源自细菌的囊泡的身体吸收、分化和分泌模式的分析
为了评估芽孢杆菌属的细菌和源自该细菌的囊泡是否通过胃肠道被吸收到全身中，通过以下方法进行实验。用荧光标记的细菌或源自细菌的囊泡以50μg的剂量通过胃肠道施用到小鼠胃中，并且在0分钟、5分钟、3小时、6小时或12小时后，测量荧光。通过观察小鼠的全部图像，细菌没有被全身吸收，但是源自细菌的囊泡在施用后5分钟被全身吸收，并且在施用后30分钟，在肝脏和肾脏中观察到强烈的荧光，这表明囊泡被分泌到肝脏和泌尿系统。此外，可以看出囊泡存在于体内直至在施用后12小时(参见实施例1A)。
为了评价在细菌或源自细菌的囊泡被全身吸收后将细菌或源自细菌的囊泡渗入各种器官的模式，通过上述方法施用50μg荧光标记的细菌或源自细菌的囊泡，并且在施用后12小时，对血液、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉进行提取取样。通过观察取样组织中的荧光，可以看出源自细菌的纳米囊泡分布在血液、心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、脂肪和肌肉中，但细菌未被吸收(参见实施例1B)。
实施例2.临床样品中源自细菌的囊泡的宏基因组分析
首先将诸如血液之类的临床样品加入到10ml管中并进行离心(3,500×g，10分钟，4℃)以沉淀悬浮的物质，然后仅将上清液转移到新的10ml管中。在使用0.22-μm过滤器除去细菌和细胞碎片后，将所得产物转移至Centriprep管(离心过滤器50kD)并在1500×g和4℃下离心15分钟以丢弃小于50kD的物质。然后将所得产物浓缩至10ml。再次，使用0.22-μm过滤器除去细菌和细胞碎片，将囊泡分离并溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。
将通过上述方法分离的100μL囊泡在100℃下煮沸以从脂质中释放内部DNA，然后在冰上冷却5分钟。另外，为了除去残留的悬浮物，将囊泡在10,000×g和4℃下离心30分钟，然后收集上清液。此外，通过NanoDrop量化DNA水平。然后，为了确认提取的DNA中是否存在细菌DNA，使用下表1中所示的16s rDNA引物进行PCR，以确认提取的基因中存在细菌基因。
[表1]
Figure BDA0001968147640000161
(Illumina MiSeq测序仪)，并将测序结果输出至标准流程格式(SFF)文件且使用GS FLX软件(v2.9)将SFF文件转换为序列文件(.fasta)和核苷酸质量评分文件，然后评估读数的可靠性，删除窗口的平均碱基调用精度(20bps)小于99％(Phred评分<20)的位点。为了分析操作分类单元(OTU)，使用UCLUST和USEARCH根据序列相似性进行聚类，分别基于属、科、目、纲和门的94％、90％、85％、80％和75％的序列相似性进行聚类，将OTU分类为分类水平(门、纲、目、科和属)，使用从BLASTN或者GreenGenes(QIIME)获得的16S RNA序列数据库(108,453序列)在属水平上分析具有97％或更多序列相似性的细菌。
实施例3.通过肝癌患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
根据实施例2中描述的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对从91名患有肝癌的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的99名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在胃癌患者的血液中显著降低(正常人与肝癌患者的比为：0.37％比0.13％；变化倍数：0.37；p＝0.0002)(参见图3)。
实施例4.通过膀胱癌患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
通过实施例2中描述的方法，经由从血液中存在的囊泡中提取基因，对从96名患有膀胱癌的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的184名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在膀胱癌患者的血液中显著降低(正常人与膀胱癌患者的比为：0.38％比0.10％；变化倍数：0.27；p＝0.001)(参见图4)。
实施例5.通过乳腺癌患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
根据实施例2中描述的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对从96名患有乳腺癌的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的192名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在乳腺癌患者的血液中显著降低(正常人与乳腺癌患者的比为：0.59％比0.26％；变化倍数：0.44；p＝0.0006)(参见图5)。
实施例6.通过卵巢癌患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
通过实施例2中描述的方法，经由从血液中存在的囊泡中提取基因，对从137名患有卵巢癌的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的139名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在卵巢癌患者的血液中显著降低(正常人与卵巢癌患者的比为：0.61％比0.27％；变化倍数：0.44；p＝0.01)(参见图6)。
实施例7.通过哮喘患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
根据实施例2中描述的方法，通过从血液中存在的囊泡中提取基因，对从277名患有哮喘的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的246名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在哮喘患者的血液中显著降低(正常人与哮喘患者的比为：0.47％比0.09％；变化倍数：0.20；p<0.000001)(参见图7)。
实施例8.通过特应性皮炎患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
通过实施例2中描述的方法，经由从血液中存在的囊泡中提取基因，对从25名患有特应性皮炎的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的138名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在特应性皮炎患者的血液中显著降低(正常人与特应性皮炎患者的比为：0.10％比0.04％；变化倍数：0.44；p＝0.01)(参见图8)。
实施例9.通过糖尿病患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
通过实施例2中描述的方法，经由从血液中存在的囊泡中提取基因，对从73名患有糖尿病的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的146名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在糖尿病患者的血液中显著降低(正常人与糖尿病患者的比为：0.46％比0.04％；变化倍数：0.10；p<0.000001)(参见图9)。
实施例10.通过肝硬化患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡减少
通过实施例2中描述的方法，经由从血液中存在的囊泡中提取基因，对从73名患有肝硬化的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的146名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡在肝硬化患者的血液中显著降低(正常人与肝硬化患者的比为：0.54％比0.25％；变化倍数：0.47；p＝0.003)(参见图10)。
实施例11.通过糖尿病患者血液中源自细菌的囊泡的宏基因组分析来确认源自埃希氏菌属的细菌的囊泡增加
通过实施例2中描述的方法，经由从血液中存在的囊泡中提取基因，对从73名患有糖尿病的患者和作为正常对照的与患者性别和年龄匹配的146名正常人的血液样品进行宏基因组分析，然后评估源自埃希氏菌属的细菌的囊泡的分布。评价结果证实，与正常人的血液相比，源自埃希氏菌属的细菌的囊泡在糖尿病患者的血液中显著增加(正常人与糖尿病患者的比为：0.008％比0.8.165％；变化倍数：947.3；p<0.000001)(参见图11)。
实施例12.从枯草芽孢杆菌培养液中分离囊泡并评估囊泡的特征
为了评价源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡的特征，评估从枯草芽孢杆菌标准菌株的培养液中分离的囊泡的特征。为了分离囊泡，将枯草芽孢杆菌接种于2L高压灭菌的脑心浸液肉汤(BD 237500)中，并在室中温育，使光密度(O.D.)达到1.5，持续72小时，然后将培养液进行超速离心(10,000×g)持续20分钟，得到除细胞沉淀外的上清液。使用0.45μm过滤器和0.22μm过滤器依次过滤上清液，并使用Quixstand台式系统浓缩约14倍。将培养液再次在150,000×g和4℃下超速离心2小时，从而获得沉淀，将沉淀物溶解在PBS中以定量蛋白质。
根据上述方法观察并测量从枯草芽孢杆菌培养液中获得的源自枯草芽孢杆菌的囊泡的形态和大小。首先，为了评价囊泡的形态，通过蛋白质定量获得50μg/mL的样品，并在JEM 1011电子显微镜(Jeol，日本)下进行观察，证实如图12A所示，源自枯草芽孢杆菌的囊泡是球形的。随后，使用Zetasizer Nano ZS(Malverk，UK)通过动态光散射(DLS)对50μg/mL样品进行源自枯草芽孢杆菌的囊泡的尺寸测量。结果，如图12B所示，可以看出源自枯草芽孢杆菌的囊泡的平均直径范围为40至100nm。
实施例13.在源自枯草芽孢杆菌的囊泡和源自大肠杆菌的囊泡之间的炎症诱导差异的比较
为了评价通过实施例12中描述的方法分离的源自枯草芽孢杆菌的囊泡的炎症诱导，使用作为致病因子的源自大肠杆菌的囊泡作为阳性对照组，比较炎症细胞，即，巨噬细胞系(Raw 264.7)中的炎症诱导。为此，用源自大肠杆菌的囊泡(E.coli EV，1μg/mL)或各种浓度的源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡(枯草芽孢杆菌EV，0.1μg/mL、1μg/mL或10μg/mL)和源自纳豆芽孢杆菌菌株的囊泡(Bacillus subtilis natto EV，0.1μg/mL、1μg/mL或10μg/mL)处理巨噬细胞系，并且在12小时后，通过ELISA测定诸如IL-6和TNF-α等炎性细胞因子的浓度，以比较炎症诱导能力。这里，作为阴性对照(NC)，用PBS处理。
结果，如图13所示，证实了当用源自大肠杆菌的囊泡处理时，诱导IL-6分泌，并且当用源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡或来自枯草芽孢杆菌菌株的囊泡处理时，不管处理浓度如何，都没有诱导IL-6分泌(参见图13A)。另外，关于TNF-α分泌，与相同浓度的大肠杆菌来源的囊泡相比，证实由源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡或源自纳豆芽孢杆菌的囊泡引起的TNF-α分泌能力是显著下降(参见图13B)。
实施例14.确认源自枯草芽孢杆菌的囊泡对由源自大肠杆菌的囊泡引起的炎症的炎症效应
在埃希氏菌属的细菌中，代表性细菌大肠杆菌是居住在周围环境以及大肠中的主要细菌，并且具有高抗生素抗性。此外，由于源自大肠杆菌的囊泡被确定为慢性阻塞性气道疾病如哮喘或COPD的主要致病因素，因此它被认为是慢性炎性疾病的主要致病因素。因此，评价了源自枯草芽孢杆菌的囊泡对由源自大肠杆菌的囊泡引起的炎症的抗炎作用。为此，用源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡(枯草芽孢杆菌EV，0.1μg/mL、1μg/mL或10μg/mL)或源自纳豆芽孢杆菌菌株的囊泡(纳豆芽孢杆菌EV，0.1μg/mL、1μg/mL或10μg/mL)处理巨噬细胞细胞系(Raw 264.7)，并且在12小时后，用源自大肠杆菌的囊泡(1μg/mL)处理巨噬细胞，然后通过ELISA测量炎性细胞因子如IL-6和TNF-α的浓度。在此，如实施例13中所述，作为阴性对照(NC)，用PBS处理，作为阳性对照(PC)，仅用源自大肠杆菌的囊泡(1μg/mL)处理，并且作为比较组，在与源自枯草芽孢杆菌来源的囊泡所用条件相同的条件下，用已知具有抗炎作用的源自植物乳杆菌的囊泡(植物乳杆菌EV，1μg/mL)进行预处理。
因此，如图14所示，由于用源自枯草芽孢杆菌标准菌株的囊泡进行预处理，由源自大肠杆菌的囊泡的刺激引起的IL-6分泌被抑制到与源自植物乳杆菌的囊泡相似的水平，并且由于用源自枯草芽孢杆菌标准菌株或枯草芽孢杆菌菌株的囊泡预处理，与源自植物乳杆菌的囊泡相比更完全被抑制。源自植物乳杆菌的囊泡(参见图14A)。此外，观察到，在源自植物乳杆菌的囊泡的情况下，TNF-α分泌没有被抑制，而在源自枯草芽孢杆菌标准菌株和纳豆芽孢杆菌菌株的囊泡的情况下，TNF-α分泌物是剂量依赖性抑制的(参见图14B)。该结果表明，由源自枯草芽孢杆菌的囊泡有效抑制炎症介质如IL-6和TNF-α产生的炎症。
本领域普通技术人员应该理解，本发明的上述描述是示例性的，并且在不脱离本发明的技术精神或本质特征的情况下，可以容易地将本文公开的示例性实施方案修改为其他特定形式。因此，上述示例性实施方案应被解释为说明性的而不在任何方面进行限制。
[工业适用性]
发明人证实肠道细菌不被吸收到体内，但是源自细菌的囊泡被吸收到体内并全身分散，然后通过肾脏、肝脏或肺分泌，并且还通过宏基因组分析存在于患者的血液、尿液或粪便中的源自细菌的囊泡证实了，存在于患有诸如肝癌、膀胱癌、乳腺癌或卵巢癌等实体癌，诸如哮喘或特应性皮炎等慢性炎性疾病，或诸如糖尿病或肝硬化等代谢疾病的患者的血液中的源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡明显少于正常人。
此外，当枯草芽孢杆菌标准菌株(其是变形杆菌属的一种细菌)和纳豆枯草芽孢杆菌(其是枯草芽孢杆菌亚型)在体外培养以分离囊泡时，并且将囊泡在体外施用给炎症细胞，观察到由致病囊泡引起的炎症介质的分泌被显著抑制，表明根据本发明的源自芽孢杆菌属的细菌的囊泡可以有效地用于诊断或预测癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的方法，以及有效地用于用于预防或治疗癌症、慢性炎性疾病或代谢疾病的食品、吸入剂、化妆品或药物组合物。
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 16s rDNA的反向引物(Reverse primer for 16s rDNA)
<400> 2
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggactac hvgggtatct aatcc 55

Claims (4)

1.由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)天然分泌的囊泡在制备用于抑制IL-6或TNF-α分泌的药物中的用途，其中，所述囊泡的平均直径为40～100nm。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述枯草芽孢杆菌为纳豆枯草芽孢杆菌亚型。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述囊泡是从枯草芽孢杆菌的培养液中分离出来的。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述囊泡是从通过添加枯草芽孢杆菌培养产生的食物中分离出来的。
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GR01 Patent grant
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