BR112020005331A2

BR112020005331A2 - biopesticidas para o controle de pestes de plantas

Info

Publication number: BR112020005331A2
Application number: BR112020005331-7A
Authority: BR
Inventors: Anastasija PANEVSKA; Maja GRUNDNER; Tom TURK; Jaka RAZINGER; Kristina Sepcic; Peter MACEK; Matej SKOCAJ; Spela MODIC; Marusa NOVAK; Matej BUTALA; Vesna HODNIK
Original assignee: Kmetijski Institut Slovenije; Univerza V Ljubljani
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2020-09-24
Also published as: HRP20231266T1; PL3662069T3; CA3077263A1; US20200245628A1; EP3662069B1; CN111164212A; ES2963455T3; WO2019063101A1; EP3662069C0; EP3662069A1

Abstract

A presente invenção refere-se a complexos de proteína de bi-componentes citolíticos que consiste em uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF, e particularmente ao seu uso para o controle de uma peste de plantas, tais como para o controle de besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata) ou gorgulho de raiz de milho Western (Dieabrotica virgifera virgifera). Mais especificamente, a invenção refere-se a complexos de proteína de bi-componentes citolíticos formados por uma pluralidade de moléculas de uma das aegerolisinas ostreolisina A6 (OlyA6), pleurotolisina A2 (PlyA2) e erilisina A (EryA) com uma pluralidade de moléculas de pleurotolisina B (PlyB) ou proteínas similares, que demonstraram ser tóxicas para os insetos de pestes agrícolas acima mencionados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “BIOPES- TICIDAS PARA O CONTROLE DE PESTES DE PLANTAS”. Campo da Técnica da Invenção

[0001] A presente invenção cai dentro do escopo da proteção de plantas e refere-se a complexos de proteína de bicomponentes citolí- ticos que consiste em uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 20 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 10 moléculas de um membro da super-família de MACPF, e particularmente ao seu uso para o controle de uma peste de plantas, tal como para o controle de besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata) ou gorgulho de raiz de milho Western (Diabrotica virgifera virgifera). Mais especificamente, a invenção refere-se a complexos de proteína de bi-componentes citolíticos formados por uma pluralidade de moléculas de uma das aegerolisinas ostreolisina A6 (OlyA6), pleurotolisina A2 (PlyA2) e erilisina A (EryA) com uma pluralidade de moléculas de pleurotolisina B (PlyB) ou proteínas similares, que demonstraram ser tóxicas para os insetos de pestes agrícolas acima mencionados. Problema Técnico

[0002] Pesticidas químicos sintéticos eram as ferramentas primá- rias usadas para controlar besouro da batata do Colorado (CPB) e gorgulho de raiz de milho Western (WCR). Biological pesticides, tais como as proteínas inseticidas derivadas de Bacillus thuringiensis têm desempenhado um papel importante como uma alternativa para pesti- cidas químicos. No entanto, devido à evolução constante de resistência a pesticidas, há uma necesssidade contínua de novos biopesticidas que direcionarão alvos moleculares específicos em pestes. Estado da Técnica

[0003] CPB e WCR têm o maior impacto econômico e levam dano enorme a colheitas de milho e batatas (Alyokhin e outros, 2008;

Gassmann e outros, 2011; Jakka e outros, 2016). Métodos atuais para o controle de CPB e WCR incluem pesticidas químicos que estão enfrentado problemas sérios, devido a evolução constante de resis- tência a pesticidas (Meinke e outros, 1998; Alyokhin e outros, 2008; Pereira e outros, 2015; Alyokhin e outros, 2015; Jakka e outros, 2016). Problemas adicionais são os resíduos de pesticidas químicos nos alimentos ou rações, preocupações ambientais (Devine e outros, 2007), e questões de saúde de ser humano. A busca para biopesticidas alternativas é, portanto, da maior importância.

[0004] CPB estava dirigindo o desenvolvimento da indústria de inseticida morderna desde seu início precoce (Casagrande, 1987). Pesticidas químicos, bem como algumas endotoxinas oriundas de Bacillus thuringiensis subsp. tenebrionis, estão em geral no uso para o controle de CPB. Apesar do desenvolvimento constante novos pestici- das, o problema devido à resistência em desenvolvimento através de mecanismos diferentes permanece (Alyokhin e outros, 2008).

[0005] Para o controle de WCR, fazendeiros Europeus e Ameri- canos aplicam inserticidas granulares ou usam sementes tratadas com insecticidas. Inseticidas foliares são ocasionalmente aplicados contra adultos (Meissle e outros, 2009). No entanto, essas práticas podem causar sérios problemas de saúde e ambiental. Alternativamente, WCR é controlado por milho geneticamente modificado que expressa toxinas de Cry oriundas de Bacillus thuringiensis (Bt-milho), ou por práticas agronômicas, tal como rotação de colheita (Meissle e outros, 2009). No entanto, WCR desenvolveu resistência a Bt-milho, e se adaptou a rotação de colheita (Gassman e outros, 2012; Chu e outros, 2014; Jakka e outros, 2016). Opções de controle biológico foram recomendados para WCR na Europa do Sudeste em 1998 (Kuhlmann e Burgt, 1998).

[0006] Aegerolisinas são proteínas de beta-estruturadas, ácidas de baixo peso molecular ( ͂15-20 kDa), encontradas em várias taxas eucariótica e bacteriana (Berne e outros, 2009; Novak e outros, 2015; Butala e outros, 2017). A característica comum de aegerolisinas é sua interação com lipídeos específicos nas membranas biológicas (Sepčić e outros, 2004; Ota e outros, 2013; Skočaj e outros, 2014; Bhat e outros, 2015). Aegerolisinas oriundas do gênero fúngico Pleurotus especifica- mente direcionam ceramida fosfoetanolaminas (CPE) (Figura 1), que são os principais esfingolipídeos de membrana de invertebrados (particularmente insetos e moluscos), mas estão presentes apenas em quantidades em traços em taxa mais alta (Crone e Bridges, 1963; Itasaka e outros, 1973; Vacaru e outros, 2013; Bhat e outros, 2015). Além do mais, essas aegerolisinas podem funcionar como complexos líticos de bi-componentes em combinação com uma proteína de MACPF de 59-kDa (complexo de ataque de membrana/perforina) que dire- cionam membranas de células (Tomita e outros, 2004; Shibata e outros, 2010; Ota e outros, 2013; Lukoyanova e outros, 2015). Complexos citolíticos quaternários e binários similares em que aegerolisinas são combinadas com padrão(ões) de proteína de não aegerolisina demons- travam também em bactérias Clostridium bifermentas subsp. malaysia (Quareshi e outros, 2014), Bacillus thuringiensis (Masson e outros, 2004, Kelker e outros, 2014) e Alcaligenes faecalis (Yalpani e outros, 2017). Estes complexos citolíticos com base em aegerolisina bacteriana heteromérica estão sendo explorados como inseticidas potentes para pestes específicas.

Cry34Ab1, uma proteína de aegerolisina que pertence ao grupo maior de toxinas de Cry específicas de inseto, e seu padrão de proteína Cry35Ab1 já estão em uso (Bt-milho) como ferramentas para o controle de larvas de WC.

Cry34Ab1 e seu padrão especificamente se ligam a receptores de (glico)proteína na membrana de células epiteliais nos intestino dos insetos, onde o dano ocorre (Masson e outros, 2004; Kaiser-Alexant e outros, 2009; Gassman e outros, 2011). No entanto, larvas de WCR recentemente desenvolveram resistência para Bt-milho que produz Cry34Ab1/Cry35Ab1 (Ludwick e outros, 2017).

[0007] Aegerolisinas oriundas de gênero fúngico Pleurotus (OlyA6, PlyA2, EryA) (SEQ ID NOs: 1-3 na figura 2) em combinação com seu padrão de proteína específica, PlyB (SEQ ID NO: 4 na figura 2), representam novos biopesticidas promissoras para o controle de CPB e WCR. A capacidade de aegerolisinas oriundas do gênero fúngico Pleurotus para direcionar CPE, e para formar poros de transmembrana em combinação com PlyB, significa que elas podem ser usadas como agentes de controle de pestes. Além do mais, as mudanças de desen- volvimento de resistência à elas deve ser um minuto, devido ao fato de que elas interagem com o receptor de lipídeo de membrana, e não com proteínas de peste que estão propensas a variação e assim desenvolvi- mento de resistência a um pesticida. Sumário da Invenção A presente invenção pode ser sumarizada pelos seguintes ítens:

1. Uso de um complexo de proteína de bi-componentes que consiste em uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 20 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 10 moléculas de um membro da superfamília de MACPF para o controle de uma peste de plantas.

2. O uso de acordo com o ítem 1, onde o complexo de proteína de bi- componentes consiste em 20 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e de 10 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

3. O uso de acordo com o ítem 1 ou 2, em que a razão de moléculas de um membro da família de aegerolisinas para moléculas de um membro da superfamília de MACPF é de 2:1.

4. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 3, em que o complexo de proteína de bi-componentes consiste em 20 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 10 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 22 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 11 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 24 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 12 moléculas de um membro da superfa- mília de MACPF, ou consiste em 26 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 13 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 28 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 14 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

5. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 4, em que o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

6. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 5, em que o membro da família de aegerolisinas é selecionado do grupo que consiste em ostreolisina, pleurotolisina A e erilisina A.

7. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 6, em que o membro da família de aegerolisinas é ostreolisina, tal como ostreolisina A6.

8. O uso de acordo com o ítem 7, em que a ostreolisina é um polipeptí- deo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

9. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 6, em que o membro da família de aegerolisinas é pleurotolisina A, tal como pleurotolisina A2.

10. O uso de acordo com o ítem 9, em que a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

11. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 6, em que o membro da família de aegerolisinas é erilisina A.

12. O uso de acordo com o ítem 11, em que a erilisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

13. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 12, em que o membro da superfamília de MACPF é uma proteína contendo domínio de MACPF derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

14. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 13, em que o membro da superfamília de MACPF é uma pleurotolisina B (PlyB) ou erilisina B (Ery B).

15. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 13, em que o membro da superfamília de MACPF é uma pleurotolisina B (PlyB).

16. O uso de acordo com o ítem 15, em que pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4.

17. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 13, em que o membro da superfamília de MACPF é uma erilisina B (Ery B).

18. O uso de acordo com o ítem 17, em que erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.

19. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 18, em que a peste de plantas é um inseto.

20. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 19, em que a peste de plantas é um inserto herbívoro.

21. O uso de acordo com o ítem 19 ou 20, em que a peste de plantas é a larva do inseto.

22. O uso de acordo com o ítem 19 ou 20, em que a peste de plantas é um imago do inseto.

23. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 22, em que o inseto é da ordem Coleoptera.

24. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 23, em que o inseto é da família Chrysomelidae.

25. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 24, em que o inseto é do gênero Leptinotarsa.

26. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 24, em que o inseto é Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado).

27. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 24, em que o inseto é do gênero Diabrotica.

28. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 24, em que o inseto é Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

29. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 19 a 24, em que o inseto é selecionado do grupo que consiste em Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado) e Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

30. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 24, em que a peste de plantas é selecionada de besouro da batata do Colorado e gorgulho de raiz de milho Western.

31. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 24, em que a peste de plantas é besouro da batata do Colorado, tais como larvas do besouro da batata do Colorado.

32. O uso de acordo com qualquer um dos ítens de 1 a 24, em que a peste de plantas é um gorgulho de raiz de milho Western.

33. Um método para a proteção de uma planta contra uma peste de planta, que compreende a etapa de: aplicação de uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas, uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF e um veículo adequado, tal como uma solução de tampão, a uma planta que necessita do mesmo.

34. Um método para o controle de uma peste de plantas, que compre- ende a etapa de: aplicação de uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas, uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF e um veículo adequado, tais como uma solução de tampão, a uma planta que necessita da mesma.

35. O método de acordo com o ítem 33 ou 34, em que o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

36. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 35, em que o membro da família de aegerolisinas é selecionado do grupo que consiste em ostreolisina, pleurotolisina A e erilisina A.

37. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 36, em que o membro da família de aegerolisinas é ostreolisina, tais como ostreolisina A6.

38. O método de acordo com o ítem 37, em que a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

39. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 36, em que o membro da família de aegerolisinas é pleurotolisina A, tais como pleurotolisina A2.

40. O método de acordo com o ítem 39, em que a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

41. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 36, em que o membro da família de aegerolisinas é erilisina A.

42. O método de acordo com o ítem 41, em que a erilisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

43. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 42, em que o membro da superfamília de MACPF é uma proteína contendo domínio de MACPF derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

44. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 43, em que o membro da superfamília de MACPF é uma pleurotolisina B (PlyB) ou erilisina B (Ery B).

45. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 43, em que o membro da superfamília de MACPF é uma pleurotolisina B (PlyB).

46. O método de acordo com o ítem 45, em que pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4.

47. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 43, em que o membro da superfamília de MACPF é uma erilisina B (Ery B).

48. O uso de acordo com o ítem 47, em que erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.

49. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 48, em que a razão molar entre o membro da família de aegerolisinas e o membro da superfamília de MACPF está na faixa de desde cerca de 3:1 a cerca de 1000:1, tais como cerca de 5:1, cerca de 10:1, cerca de 20:1, cerca de 25:1, cerca de 30:1, cerca de 40:1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1, cerca de 100:1, cerca de 200:1, cerca de 300:1, cerca de 400:1, cerca de 500:1, cerca de 600:1, cerca de 700:1, cerca de 800:1, ou cerca de 900:1, ou cerca de 1000:1.

50. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 49, em que a peste de plantas é um inseto.

51. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 50, em que a peste de plantas é um inserto herbívoro.

52. O método de acordo com o ítem 50 ou 51, em que a peste de plantas é a larva do inseto.

53. O método de acordo com o ítem 50 ou 51, em que a peste de plantas é um imago do inseto.

54. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 53, em que o inseto é da ordem Coleoptera.

55. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 54, em que o inseto é da família Chrysomelidae.

56. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 55, em que o inseto é do gênero Leptinotarsa.

57. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 55, em que o inseto é Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado).

58. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 55, em que o inseto é do gênero Diabrotica.

59. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 55, em que o inseto é Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

60. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 50 a 55, em que o inseto é selecionado do grupo que consiste em Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado) e Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

61. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 49, em que a peste de plantas é selecionada de besouro da batata do Colorado e gorgulho de raiz de milho Western.

62. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 49, em que a peste de plantas é besouro da batata do Colorado, tais como besouro da batata do Colorado.

63. O método de acordo com qualquer um dos ítens de 33 a 49, em que a peste de plantas é gorgulho de raiz de milho Western.

64. Uso de um complexo de proteína de bi-componentes como definido em qualquer um dos ítens de 1 a 18 ou uma composição como definido em qualquer um dos ítens 33 a 49 for the preparação de um agente de proteção de planta.

65. Uma planta transgênica ou sua progenia which expressa ou é capaz de expressar um complexo de proteína de bi-componentes como definido em qualquer um dos ítens de 1 a 18.

66. A planta transgênica ou sua progenia de acordo com o ítem 65, que compreende (tais como estavelmente transformada com) uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante que compreende sequências de nucleotídios que codificam um complexo de proteína de bi-componentes como definido em qualquer um dos ítens de 1 a 18, as ditas sequências de nucleotídios estando operavelmente ligadas a pelo menos um promotor que é funcional na dita célula de planta para causar a produção de moléculas de mRNA.

67. A planta transgênica ou sua progenia de acordo com o ítem 65 ou 66, em que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de cultura.

68. A planta transgênica ou sua progenia de acordo com qualquer um dos ítens de 65 a 67, em que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de batata ou uma planta de milho.

69. A planta transgênica ou sua progenia de acordo com qualquer um dos ítens de 65 a 68, em que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de batata.

70. A planta transgênica ou sua progenia de acordo com qualquer um dos ítens de 65 a 68, em que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de milho. Breve Descrição dos Desenhos

[0008] A Figura 1. Estrutura de ceramida fofoetanolaminas (CPE). CPEs são constituídas de um resíduo de ceramida (base de nitrogênio de cadeia longa, que está ligado a amida a um ácido graxo de 12-24 átomos de carbono, designado como R2) ligada via um grupo 1-hidróxi por um fosfodiéster que se liga a etanolamina. A base de nitrogênio de cadeia longa é ou 1,3-di-hidróxi C14:1, 1,3-di-hidróxi C16:1 ou 1,3-di- hidróxi C18:1, indicado por R1.

[0009] A Figura 2. Sequências de aminoácidos de OlyA6 (SEQ ID NO: 1), PlyA2 (SEQ ID NO: 2), EryA (SEQ ID NO: 3), PlyB (SEQ ID NO: 4) e EryB (SEQ ID NO: 5).

[0010] A Figura 3. Bioensaio de alimentação no besouro da batata do Colorado (CPB). Cada disco de folha de batata foi encharcado na mistura de OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB ou EryA/PlyB (0,5 mg/mL para OlyA6, PlyA2 ou EryA e 0,04 mg/mL para PlyB) por 5 min e então foi transferido em cada cavidade sobre a microplaca, à qual uma larva de besouro da batata do Colorado foi adicionada. A taxa de sobrevivência foi medida diariamente por 5 dias. O peso das larvas foi medido no dia 1 e dia 5.

[0011] A Figura 4. Bioensaio de alimentação no gorgulho de raiz de milho Western. Misturas de proteínas (PlyA2/PlyB) e uma dieta artificial foram misturadas (1:1, v:v) e foram aplicadas em cada cavidade. A con- centração de proteína final foi de 0,5 mg/mL de PlyA2 e 0,04 mg/mL de PlyB. Um besouro de gorgulho de raiz de milho Western simples foi transferido em cada cavidade e foi observado por 7 dias.

[0012] A Figura 5. Comparação do desenvolvimento entre larvas de besouro da batata do Colorado tratadas com OlyA6/PlyB (CPB) e larvas tratadas com tampão (dia 5). Tampão-treated Larvas jovens de CPB tratadas com tampão mostraram aumento constante no peso e no desenvolvimento (A), enquanto larvas de CPB tratadas com OlyA6/PlyB não mostravam nenhuma mudança de peso entre dia 1 e dia 5, prova- velmente como um resultado de comportamento de alimentação muda- do depois do dia 1 (B).

[0013] A Figura 6. Taxa de sobreivência e mudança de peso de besouro da batata do Colorado (CPB) durante o bioensaio de alimentação. Alimentação de larvas de CPB com discos de folhas tratados com misturas de proteínas de OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB ou EryA/PlyB (0,5 mg/mL para OlyA6, PlyA2, EryA e 0,04 mg/mL para PlyB) causavam mortalidade de larva significativa no dia 5 depois do início de alimentação no grupo de larva jovem (L1 + L2) (A). Apenas EryA/PlyB causou mudança de peso significativo no grupo de larva jovem (B). EryA/PlyB não causou mortalidade de larva significativa no grupo de larva velho (L3 + L4) (C), enquanto mostrando uma mudança de peso significativa (D). OlyA6/PlyB e PlyA2/PlyB causou mortalidade de larva significativa (C) no grupo velho bem como mudança de peso signifi- cativa (D). In L1 e L2, o pronotum é totalmente preto. No L3, a margem anterior do pronotum aparece marrom alaranjado. No L4, cerca da metade pronotum é marrom claro. Asteriscos indiam diferenças signifi- cativas entre as misturas de proteínas e tampão testados, que foi usado como um controle negativo (P < 0,05).

[0014] A Figura 7. Bioensaio de alimentação no gorgulho de raiz de milho Western (WCR). Misturas de proteínas (OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB ou EryA/PlyB) e dieta artificial foram misturadas (1:1, v:v) e aplicadas a cada cavidade. A concentração de OlyA6, EryA ou PlyA2 foi de 0,5 mg/mL e 0,04 mg/mL de PlyB. Um besouro de gorgulho de raiz de milho Western simples foi transferido a cada cavidade e foi observado por 7 dias. OlyA6/PlyB causaram mortalidade significativa de WCR adulto, re- sultando em um tempo de sobrevivência média de 5 dias. Asteriscos indicam diferenças significativas entre as misturas de proteínas testadas e tampão, que foi usado como um controle negativo (P < 0.05).

[0015] A Figura 8. A interação de OlyA6, PlyA2 ou EryA, sozinha ou em combinação com PlyB, com vesículas de lipídeos constituídas de CPE:POPC:Chol (5 : 47,5 : 47,5, mol:mol:mol). OlyA6 e PlyA2 foram injetados na concentração de 0,25 μM e EryA foi injetada na concen- tração de 5 μM. PlyB foi injetada na concentração de 20 nM quando combinado com OlyA6 e PlyA2, e 0,4 μM quando combinado com EryA. OlyA6 (A), PlyA2 (B) e EryA (C) especificamente interagem com mem- branas contendo CPE e sua interação é estabilizada na presença de PlyB. CPE, ceramida fosfoetanolamina; POPC, palmitoil-2-oleoil-sn- glicero-3-fosfocolina; Chol, colesterol.

[0016] A Figura 9. Atividade lítica de OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB e EryA/PlyB. Misturas de proteínas OlyA6/PlyB e PlyA2/PlyB testadas (10 μg/mL para OlyA6, PlyA2 ou EryA e 0,8 μg/mL para PlyB) mostram permeabilização de vesículas de lipídeos artificiais contendo CPE (A) bem como vesículas constituídas de SM:Chol (1:1, mol:mol) (B), enquanto EryA/PlyB (10 μg/mL para EryA e 0,8 μg/mL para PlyB) é lítico apenas para vesículas contendo CPE. CPE, ceramida fosfoetanolamina; POPC, palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina; Chol, cholesterol; SM, esfingomielina. Descrição Detalhada da Invenção

[0017] A presente invenção refere-se a complexos de proteína de bi-componentes citolíticos que consiste em uma pluralidade de molécu- las, tais como pelo menos 20 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 10 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, e particularmente ao seu uso para o controle de uma peste de plantas, tais como para o controle de besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata) ou gorgulho de raiz de milho Western (Diabrotica virgifera virgifera). A presente invenção assim provê complexos de proteína de bicompo- nentes citolíticos que consiste em uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF que são úteis como pesticidas.

[0018] Como descritos nos Exemplos, complexos de proteína de bicomponentes citolíticos constituídos de moléculas de um membro da família de aegerolisinas e moléculas de um membro da superfamília de

MACPF mostram efeitos tóxicos quando ingeridos por invertebrados, particularmente insetos. Esses resultados indicam que o complexo de proteína de bicomponentes danificam as membranas do intestino. O objetivo da invenção assim indica que complexos de proteína de bi- componentes que consiste emem uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas, tais como OlyA6, PlyA2 ou EryA, e uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF, tal como PlyB, pode servir como biopesticidas alternativas que podem reduzir o risco para o ambiente e para a saúde de ser humano.

[0019] De acordo com um aspecto, a presente invenção provê o uso de um complexo de proteína de bicomponentes que consiste em uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF para o controle de uma peste de plantas.

[0020] Com uma »pluralidade de moléculas« que ser dizer qualquer número de moléculas de um membro da família de aegerolisinas e qualquer número de moléculas de um membro da superfamília de MACPF que permite a formação de poros de transmembrana.

[0021] O complexo de proteína de bicomponentes pode, por exem- plo, consiste em 20 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e de 10 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

[0022] Assim, de acordo com certas concretizações, o complexo de proteína de bicomponentes consiste em 20 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e de 10 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF. De acordo com certas concreti- zações, o complexo de proteína de bi-componentes consiste em 22 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 11 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF. De acordo com certas concretizações, o complexo de proteína de bicomponentes consiste em 24 a 30 moléculas de um membro da família de aegeroli- sinas e 12 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF. De acordo com certas concretizações, o complexo de proteína de bicomponentes consiste em 26 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e de 13 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF. De acordo com certas concretizações, o complexo de proteína de bicomponentes consiste em 28 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e de 14 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF. De acordo com certas concretizações, o complexo de proteína de bicomponentes consiste em 22 a 28 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e de 11 a 14 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

[0023] Em geral, o complexo de proteína de bicomponentes é formado por uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF em uma razão de 2:1. Em outras palavras, a razão de moléculas de um membro da família de aegerolisinas para moléculas de um membro da superfamília de MACPF é de 2:1.

[0024] De acordo com algumas concretizações, o complexo de proteína de bi-componentes consiste em 20 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 10 moléculas de um membro da superfa- mília de MACPF, ou consiste em 22 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 11 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste emem 24 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 12 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 26 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 13 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste emem 28 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 14 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

[0025] De acordo com concretizações particulares, o complexo de proteína de bi-componentes consiste em 26 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 13 moléculas de um membro da superfa- mília de MACPF.

[0026] Uma vez que o complexo de proteína de bi-componentes pode ser (ou é) formado in situ será entendido que a composição molecular e frequência podem variar, significando que diferentes com- plexos de proteína de bi-componentes formados dos mesmo compo- nentes podem estar presentes no plano da bicamada de lipídeo que varia em sua composição molecular e frequência. Como um exemplo não limitante, Lukoyanova e outros, (2015) e Ota e outros, (2013), dealing com structures de complexos com base em PlyA/PlyB e OlyA6/PlyB, mostravam que os poros formados por aegerolisinas e PlyB in situ usualmente vêm nas seguintes composições moleculares (a % significa a frequência de composição molecular diferente no plano da bicamada de lipídeo): 26 PlyA : 13 PlyB (75%), 24 PlyA : 12 PlyB (15%), 22 PlyA : 11 PlyB (5%), e 28 PlyA : 14 PlyB (5%). Consequentemente, o complexo de proteína de bi-componentes pode ser uma mistura de complexos de proteína de componente formada pelos mesmos compo- nentes que variam em sua composição molecular.

[0027] Membros da família de aegerolisinas bem como membros da superfamília de MACPF oriundos de uma faixa de fungos e bactérias foram descritos na literatura científica (por exemplo, Ota e outros, 2014; Butala e outros, 2017; Anderluh e outros, 2014). A família de aegeroli- sinas é uma família de proteínas que são caracterizadas peo fato de que elas contêm um domínio de aegerolisina. A superfamília de MACPF é uma família de proteínas que são caracterizadas pelo fato de que elas contêm um domínio de MACPF (Complexo de ataue de membrana/Perforina). Membros da família de aegerolisinas especifica- mente direcionam ceramida fosfoetanolaminas, que são principais esfingolipídeos de membrana de invertebrados (insetos e moluscos particulares). Alguns membros da superfamília de MACPF têm atividade citolítica, e aqueles são úteis de acordo com a presente invenção.

[0028] Membros da família de aegerolisinas bem como membros da superfamília de MACPF para o uso de acordo com a presente invenção pode ser de origem fúngica ou bacteriana. Exemplos não limitantes de membros da família de aegerolisinas incluem aegerolisinas derivadas de um fungo do gênero Pleurotus, tal como como oriundo de Pleurotus ostreatus ou Pleurotus eryngii. Exemplos não limitantes de membros da superfamília de MACPF incluem proteínas contendo MACPF derivadas de um fungo do gênero Pleurotus, tal como como oriundo de Pleurotus ostreatus ou Pleurotus eryngii.

[0029] Portanto, de acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

[0030] De acordo com algumas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada do fungo Pleurotus ostreatus. De acordo com algumas outras concretizações, o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada do fungo Pleurotus eryngii.

[0031] De acordo com certas concretizações, o membro da superfa- mília de MACPF é uma proteína contendo MACPF derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

[0032] De acordo com algumas concretizações, o membro da superfamília de MACPF é uma proteína contendo MACPF derivada do fungo Pleurotus ostreatus. De acordo com algumas outras concreti- zações, o membro da superfamília de MACPF é uma proteína contendo MACPF derivada do fungo Pleurotus eryngii.

[0033] Exemplos não limitantes de aegerolisinas incluem ostreolisi- na, pleurotolisina A e erilisina A.

[0034] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é selecionado do grupo que consiste em ostreolisina, pleurotolisina A e erilisina A.

[0035] De acordo com algumas concretizações, o membro da famí- lia de aegerolisinas é ostreolisina, tal como ostreolisina A6. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptí- deo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 55% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos

80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. De acordo com algumas concretizações específicas, a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1. Tal(ais) polipeptídeo(s) adequadamente tem a propriedade igual ou similar do que o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 1, isto é, que se liga a CPEs e que forma um complexo citolítico com pleurotolisina B e proteínas similares. A propriedade pode ser determinada de acordo com o seguinte teste de permeabilização de membrana: Teste de permeabilização de membrana

1. Princípio:

[0036] Vesículas unilamelares pequenas carregadas com calceína (SUVs) contendo CPE são usadas a fim de confirmar a atividade lítica de um polipeptídeo a ser testado (isto é, um polipeptídeo tendo a % de identidade de sequência indicada com uma aegerolisina, tal como ostreolisina de SEQ ID NO: 1 – aqui em seguida »polipeptídeo de teste«) com a proteína no par PlyB (SEQ ID NO: 4).

[0037] Para preparar as SUVs, películas de lipídeo com proporções molares definidas de lipídeos (CPE:POPC:Chol [5 : 47,5 : 47,5, mol:mol:mol]) são preparadas por remoção do solvente orgânico a partir de soluções de lipídeo por evaporação rotativa e secagem a vácuo. Lipídeos, na concentração final de 5 mg/mL, são inchados em calceína a 80 mM e são turbilhonados vigorosamente para dar lipossomas multilamelares (MLVs). A suspensão de MLVs é sonicada por 15 minu- tos sobre gelo com ciclos de ligar/desiligar de 10 seg. para preparar SUVs. Calceína extra-vesicular é removida a partir de suspensão de SUV por filtração de gel em uma coluna Sephadex G-50 (meio), onde tampão de vesícula constituído de NaCl a 140 mM, TRIS.HCl a 20 mM, pH 8,0 é usado como uma fase móvel. A atividade lítica do complexo de proteína é analisada usando uma leitora de microplaca de fluorescência a 25˚C.

2. Procedimento:

[0038] Misturas de proteínas que compreende o polipeptídeo de teste e PlyB (12,5 :1, mol:mol) estão dispersas em uma microplaca de múltiplas cavidades nas seguintes concentrações: 10 μg/mL de polipep- tídeo de teste combinados com 0,8 μg/mL PlyB. O volume final das proteínas em cada cavidade da placa de microtítulo, diluída em tampão de vesícula (NaCl a 140 mM, TRIS.HCl a 20 mM, pH 8,0), é 100 µL. SUVs carregadas com calceína (5 μg/mL) são adicionadas às misturas de proteínas. As SUVs são excitadas a 485 nm e a intensidade do fluorescência emitida de calceína liberada é monitorada a 535 nm por 30 min com intervalos de 20 s. A intensidade da fluorescência emitida a t=30 é determinada como F. SUVs são totalmente lisadas com Triton X- 100 a 1 mM (controle positivo), onde Fmax é determinada como uma intensidade de fluorescência máxima após a lise de todas as SUVs. F0 é a fluorescência de SUVs a t=30 na ausência de misturas de proteínas líticas, ou na ausência de Triton X-100. A percentagem de liberação de calceína R (%) é calculada como:

𝐹−𝐹𝑜 𝑅 ( %) = * 100 𝐹𝑚𝑎𝑥−𝐹𝑜

[0039] O complexo de proteína pode ser considerado como lítico quando o valor de R é ≥5% do controle positivo.

[0040] De acordo com algumas concretizações, o membro da famí- lia de aegerolisinas é pleurotolisina A, tal como pleurotolisina A2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 55% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85 de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. De acordo com algumas concretizações específicas, a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2. Tal(is) polipeptídeo(s) adequadamente tem a propriedade igual ou similar do que o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 2, isto é, que se liga a CPEs e que forma um complexo citolítico com pleurotolisina B e proteí- nas similares. A propriedade pode ser determinada de acordo com o teste de permeabilização de membrana descrito acima.

[0041] De acordo com algumas concretizações, o membro da famí- lia de aegerolisinas é erilisina A. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 55% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. De acordo com algumas concretizações específicas, a erilisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3. Tal(ais) polipeptídeo(s) adequadamente tem a propriedade igual ou similar do que o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 3, isto é, que se liga a CPEs e que forma um complexo citolítico com pleurotolisina B e proteínas similares. A propriedade pode ser determinada de acordo com o teste de permeabilização de membra- na descrito acima.

[0042] Exemplos não limitantes de um membro da superfamília de MACPF incluem pleurotolisina B (PlyB), erilisina B (Ery B) ou uma proteína similar oriunda dos fungos Sphaerobolus stellatus, Moniliophtora perniciosa, Trametes pubescens, e Heterobasidion irregulare.

[0043] De acordo com certas concretizações, o membro da superfa- mília de MACPF é pleurotolisina B (PlyB) ou erilisina B (Ery B).

[0044] De acordo com algumas concretizações, o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B (PlyB). De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 55% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos

80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. De acordo com algumas concretizações específicas, pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4. Tal(is) polipep- tídeo(s) adequadamente tem a atividade citolítica igual ou similar com ostreolisina, pleurotolisina A, erilisina A ou uma proteína similar do que o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 4. Particularmente, tal(is) polipeptídeo(s) contêm um domínio de MACPF funcional. A atividade citolítica pode ser determinada por testes adequados disponíveis pela pessoa versada, tal como por ensaio de hemólise ou por monitoramento da liberação de calceína dos lipossomas. A atividade citolítica por, por exemplo, ser determinada de acordo com o seguinte teste de permeabi- lização de membrana:

[0045] Teste de permeabilização de membrana

1. Princípio:

[0046] Vesículas unilamelares pequenas carregadas com calceína (SUVs) contendo CPE são usadas a fim de confirmar a atividade lítica de polipeptídeo a serem testadas (isto é, um polipeptídeo tendo a % de identidade de sequência indicada com um membro da superfamília de MACPF, tal como pleurotolisina B da SEQ ID NO: 4 – aqui em seguida »polipeptídeo de teste«) com uma das proteínas parceiras de ostreoli- sina (SEQ ID NO: 1), pleurotolisina A (SEQ ID NO: 2) ou erilisina A (SEQ ID NO: 3).

[0047] Para preparar as SUVs, películas de lipídeo com proporções molares definidas de lipídeos (CPE:POPC:Chol [5 : 47,5 : 47,5, mol:mol:mol]) são preparadas por remoção do solvente orgânico a partir de soluções de lipídeo por evaporação rotativa e secagem a vácuo. Lipídeos, na concentração final de 5 mg/mL, são inchados em calceína a 80 mM e são turbilhonados vigorosamente para dar lipossomas multilamelares (MLVs). A suspensão de MLVs é sonicada por 15 minu- tos sobre gelo com ciclos de ligar/desligar de 10 s para preparar SUVs. Calceína extravesicular é removida a partir de Suspensão de SUV por filtração de gel em uma coluna Sephadex G-50 (meio), onde tampão de vesícula constituídos de NaCl a 140 mM, TRIS.HCl a 20 mM, pH 8,0 é usado como uma fase móvel. A atividade lítica do complexo de proteína é analisada usando uma leitora de microplaca de fluorescência a 25 ˚C.

2. Procedimento:

[0048] Misturas de proteínas que compreende o polipeptídeo de teste e ostreolisina, pleurotolisina A ou erilisina A (1 : 12,5, mol:mol) estão dispersas em uma microplaca de múltiplas camadas nas seguin- tes concretizações: 10 μg/mL de aegerolisina de teste combinados com 0,8 μg/mL PlyB. O volume final das proteínas em cada cavidade da placa de microtitulação, diluído em tampão de vesícula (NaCl a 140 mM, TRIS.HCl a 20 mM, pH 8,0), é 100 µL. SUVs carregadas com calceína (5 μg/mL) são adicionadas às misturas de proteínas. As SUVs são excitadas a 485 nm e a intensidade do fluorescência emitida de calceína liberada é monitorada a 535 nm por 30 min com intervalos de 20 s. A intensidade da fluorescência emitida a t=30 é determinada F. SUVs são totalmente lisadas com Triton X-100 a 1 mM (controle positivo), onde Fmax é determinada como uma intensidade de fluorescência máxima após a lise de todas as SUVs. F0 é a fluorescência de SUVs a t=30 na ausência de misturas de proteínas líticas, ou na ausência de Triton X-

100. A percentagem de liberação de calceína R (%) é calculada como: 𝐹−𝐹𝑜 𝑅 ( %) = * 100 𝐹𝑚𝑎𝑥−𝐹𝑜

[0049] O complexo de proteína pode ser considerado como lítico quando o valor de R é ≥5% do controle positivo.

[0050] De acordo com algumas concretizações, o membro da superfamília de MACPF é erilisina B (Ery B). De acordo com algumas concretizações específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 75% %, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 55% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 60% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 65% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 75% % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. De acordo com algumas concretiza- ções específicas, erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5. Tais polipeptídeo(s) adequadamente têm a atividade citolítica igual ou similar com ostreolisina, pleurotolisina A, erilisina A ou uma proteína similar do que o polipeptídeo de referência de SEQ ID NO: 5. Particularmente, tal(is) polipeptídeo(s) contêm um domínio de MACPF funcional. A atividade citolítica pode ser determinda por testes adequados disponíveis pela pessoa versada, tais como por ensaio de hemólise ou por monitoramento da liberação de calceína dos lipossomas. A atividade citolítica pode, por exemplo, ser determinada de acordo com o teste de permeabilização de membrana descrito acima.

[0051] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é ostreolisina, tais como ostreolisina A6, e o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B.

[0052] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é pleurotolisina A, tal como pleurotolisina A2, e o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B.

[0053] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é erilisina A e o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B.

[0054] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é ostreolisina, tais como ostreolisina A6, e o membro da superfamília de MACPF é erilisina B.

[0055] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é pleurotolisina A, tais como pleurotolisina A2, e o membro da superfamília de MACPF é erilisina B.

[0056] De acordo com certas concretizações, o membro da família de aegerolisinas é erilisina A e o membro da superfamília de MACPF é erilisina B.

[0057] O complexo de proteína de bicomponentes pode em geral ser usado a uma concentração que varia de cerca de 1,5 µg/ml (0,1 µM de um membro da família de aegerolisinas em uma razão molar de 1000:1 com um membro da superfamília de MACPF) para 34,5 mg/ml (1 mM de um membro da família de aegerolisinas em uma razão molar de 3:1 com um membro da superfamília de MACPF). Que a concentra- ção do membro da família de aegerolisinas usada está usualmente na faixa de 0,1 µM a cerca de 1 mM, tais como de cerca de 0,5 µM a cerca de 1 mM, cerca de 1 µM a cerca de 1 mM, cerca de 10 µM a cerca de 1 mM, cerca de 50 µM a cerca de 1 mM, cerca de 100 µM a cerca de 1 mM, ou cerca de 500 µM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 µM a 500 µM, 0,5 µM a cerca de 500 µM, cerca de 1 µM a cerca de 500 µM, cerca de 10 µM a cerca de 500 µM, cerca de 50 µM a cerca de 500 µM, cerca de 100 µM a cerca de 500 µM, 0,5 µM a cerca de 100 µM, cerca de 1 µM a cerca de 100 µM, cerca de 10 µM a cerca de 100 µM, ou cerca de 50 µM a cerca de 100 µM. O membro da superfamília de MACPF é usado em quantidades apropriadas para se obter a razão molar desejada que está em geral na faixa de cerca de 3:1 a cerca de 1000:1.

[0058] A peste de plantas a ser controlada por uso de um complexo de proteína de bicomponentes de acordo com a invenção pode ser um inseto, tal como um inseto herbívoro. Portanto, de acordo com certas concretizações, a peste de plantas é um inseto. De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é um inserto herbívoro.

[0059] A peste de plantas poda ser uma larva e/ou um imago do inseto. De acordo com certas concretizações, a peste de plantas é uma larva do inseto. De acordo com certas concretizações, a peste de plantas é um imago do inseto.

[0060] A larva pode estar em qualquer estágio do desenvolvimento da larva. De acordo com certas concretizações, a larva é em um estágio de larva selecionado do grupo que consiste em L1, L2, L3, L4, e L5. De acordo com certas concretizações, a larva é em um estágio de larva selecionado selecionada de L1, L2, L3, e L4. De acordo com certas concretizações, athe larva é em um estágio de larva selecionado sele- cionada de L1, L2, e L3. De acordo com certas concretizações, a larva é em um estágio de larva selecionado selecionada de L1 e L2. De acordo com certas concretizações, a larva é em um estágio de larva selecionada do grupo que consiste em L2, L3, L4, e L5. De acordo com certas concretizações, a larva é em um estágio de larva selecionada do grupo que consiste em L2, L3 e L4. De acordo com certas concretiza- ções, a larva é em um estágio de larva selecionada do grupo que consiste em L2 e L3. De acordo com certas concretizações, a larva é em um estágio de larva selecionada do grupo que consiste em L3 e L4. De acordo com algumas concretizações, a larva é no estágio de larva L1. De acordo com algumas concretizações, a larva é no estágio de larva L2. De acordo com algumas concretizações, a larva é no estágio de larva L3. De acordo com algumas concretizações, a larva é no estágio de larva L4. De acordo com algumas concretizações, a larva é no estágio de larva L5.

[0061] De acordo com certas concretizações, o inseto é da ordem Coleoptera.

[0062] De acordo com algumas concretizações, o inseto é da família Chrysomelidae.

[0063] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Leptinotarsa.

[0064] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado).

[0065] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Diabrotica.

[0066] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

[0067] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Phyllotreta.

[0068] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Phyllotreta spp.

[0069] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Phyllotreta cruciferae.

[0070] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Phyllotreta striolata.

[0071] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é selecionado do grupo que consiste em Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado) e Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

[0072] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Lilioceris.

[0073] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Lilioceris merdigera.

[0074] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Lilioceris lilii.

[0075] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Crioceris.

[0076] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Crioceris duodecimpunctata.

[0077] De acordo com algumas concretizações, o inseto é da família Scarabeidae.

[0078] De acordo com algumas concretizações particulares, o inseto é do gênero Melolontha.

[0079] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Melolontha melolontha.

[0080] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Popillia.

[0081] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Popillia japonica (Japanese beetle).

[0082] De acordo com algumas concretizações, o inseto é da família Elateridae.

[0083] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Agriotes.

[0084] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Agriotes spp.

[0085] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Agriotes lineatus.

[0086] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Agriotes obscurus.

[0087] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Agriotes ustulatus.

[0088] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Agriotes sputator.

[0089] De acordo com algumas concretizações, o inseto é da família Byturidae.

[0090] De acordo com algumas concretizações particulares, o inse- to é do gênero Byturus.

[0091] De acordo com algumas concretizações específicas, o inseto é Byturus tomentosus.

[0092] De acordo com certas concretizações, a peste de plantas é uma peste de inseto de coleopterano.

[0093] De acordo com concretizações particulares, a peste de plantas é selecionada de besouro da batata do Colorado, gorgulho de raiz de milho Western e outras pestes de inseto de coleopterano.

[0094] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é um besouro da batata do Colorado.

[0095] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é gorgulho de raiz de milho Western.

[0096] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é o besouro da pulga da couve.

[0097] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é o besouro japonês.

[0098] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é o besouro de maio.

[0099] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é a minhoca »Wireworm«.

[0100] De acordo com algumas concretizações, a peste de plantas é o besouro da framboesa.

[0101] A presente invenção ulteriormente provê um método para a proteção de uma planta contra uma peste de planta, que compreende a etapa de: aplicação de uma composição que compreende uma plurali- dade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas, uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF, e um veículo adequado, tais como uma solução de tampão, a uma planta que necessita da mesma.

[0102] A presente invenção ulteriormente provê um método para o controle de uma peste de plantas, que compreende a etapa de: aplica- ção de uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas, uma pluralidade de molé- culas de um membro da superfamília de MACPF, e um veículo adequa- do, tais como uma solução de tampão, a uma planta que necessita da mesma.

[0103] Em geral, o membro da família de aegerolisinas e o membro da superfamília de MACPF estão presentes na composição em uma forma livre, não complexada. Uma vez que a composição é aplicada a uma planta de interesse e moléculas do membro da família de aegeroli- sinas e moléculas do membro da superfamília de MACPF são ingeridos pelo inseto, complexos de proteína de bicomponentes como aqui descritos são formados in situ sobre o plasmalemma de células epiteliais do intestino médio, levando à perfuração do intestino, e subsequente- mente à morte do inseto.

[0104] É entendido que todos os detalhes providos aqui com rela- ção ao complexo de proteína de bi-componentes, particularmente com relação ao membro da família de aegerolisinas e ao membro da superfa- mília de MACPF, e à peste de planta, incluindo todas as concretizações, aplicam-se mutatis mutandis aos métodos da presente invenção.

[0105] Em geral, a composição pode ser aplicada a uma planta que necessita da mesma em qualquer adequada dose, frequência e método de administração.

[0106] A composição pode adequadamente estar em forma líquida, e pode ser aplicada por “spray”, encharcamento ou gotejamento sobre a planta. De acordo com certas concretizações, a composição é apli- cada por encharcamento. De acordo com certas concretizações, a bicomposição é aplicada by “spraying”. De acordo com certas concreti- zações, a composição é aplicada por gotejamento.

[0107] Adequadamente, o veículo é um veículo líquido, e mais par- ticularmente um veículo aquoso, e o membro da família de aegerolisinas e o membro da superfamília de MACPF são aí dissolvidos. Veículos adequados são bem conhecidos pela pessoa versada. Um veículo aquoso adequado pode por exemplo ser uma solução de tampão, e mais particularmente uma solução fisiológica de tampão. Sistemas de tampão adequados são bem conhecidos pela pessoa versada e incluem como exemplos não limitantes Tris, TABS, Bicina, Tricina, HEPES, TES, MOPS e PIPES. O pH da solução de tampão está usualmente na faixa de cerca de 6,5 a cerca de 9, tais como na faixa de cerca de 7,5 a cerca de 8,5, tais como cerca de 8. A solução de tampão pode compreender outros aditivos tais como NaCl e/ou glicerol. Um exemplo não limitativo de uma solução de tampão útil de acordo com a presente invenção é uma solução de tampão que compreende 20-50 mM Tris, 0-200 mM NaCl e 0-1% glicerol em água desionizada. Um exemplo não limitativo mais específico de uma solução de tampão útil de acordo com a pre- sente invenção é Tris a 20 mM, 0,5% glicerol, pH 8,0, em água desioni- zada.

[0108] A concentração do membro da família de aegerolisinas usado pode em geral estar na faixa de 0,1 µM a cerca de 1 mM, tais como de cerca de 0,5 µM a cerca de 1 mM, cerca de 1 µM a cerca de 1 mM, cerca de 10 µM a cerca de 1 mM, cerca de 50 µM a cerca de 1 mM, cerca de 100 µM a cerca de 1 mM, ou cerca de 500 µM a cerca de 1 mM, cerca de 0,1 µM a 500 µM, 0,5 µM a cerca de 500 µM, cerca de 1 µM a cerca de 500 µM, cerca de 10 µM a cerca de 500 µM, cerca de 50 µM a cerca de 500 µM, cerca de 100 µM a cerca de 500 µM, 0,5 µM a cerca de 100 µM, cerca de 1 µM a cerca de 100 µM, cerca de 10 µM a cerca de 100 µM, ou cerca de 50 µM a cerca de 100 µM. O membro da superfamília de MACPF é usado em quantidades apropriadas para se obter a razão molar desejada na faixa de cerca de 3:1 a cerca de 1000:1.

[0109] A razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF pode em geral estar na faixa de cerca de 3:1 a cerca de 1000:1, tais como cerca de 5:1, cerca de 10:1, cerca de 20:1, cerca de 25:1, cerca de 30:1, cerca de 40:1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1, cerca de 100:1, cerca de 200:1, cerca de 300:1, cerca de 400:1, cerca de 500:1, cerca de 600:1, cerca de 700:1, cerca de 800:1, cerca de 900:1, ou cerca de 1000:1.

[0110] De acordo com certas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF está na faixa de desde cerca de 3:1 a cerca de 1000:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 3:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfa- mília de MACPF é cerca de 5:1. De acordo com algumas concretiza- ções, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 10:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 20:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um mem- bro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 25:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfa- mília de MACPF é cerca de 30:1. De acordo com algumas concretiza- ções, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 40:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 50:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um mem- bro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 60:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfa- mília de MACPF é cerca de 70:1. De acordo com algumas concretiza- ções, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 80:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 90:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 100:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 200:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegeroli- sinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 300:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 400:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfa- mília de MACPF é cerca de 500:1. De acordo com algumas concretiza- ções, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 600:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 700:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de

MACPF é cerca de 800:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegerolisinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 900:1. De acordo com algumas concretizações, a razão molar entre um membro da família de aegeroli- sinas e um membro da superfamília de MACPF é cerca de 1000:1.

[0111] A composição pode ser aplicada pelo menos uma vez por semana. Por exemplo, ela pode ser aplicada 1 a 3 vezes por semana, tais como 2 vezes por semana. O complexo de proteína de bicompo- nentes pode ser aplicado pelo menos uma vez por dia. Por exemplo, ele pode ser aplicado 1 a 3 vezes por dia, tais como 2 vezes por dia.

[0112] A presente invenção também provê o uso de um complexo de proteína de bicomponentes ou uma composição como descrito aqui para a preparação do agente de proteção de plantas.

[0113] É entendido que todos os detalhes providos aqui com rela- ção ao complexo de proteína de bicomponentes, particularmente com relação ao membro da família de aegerolisinas e ao membro da superfa- mília de MACPF, e peste de planta, incluindo todas as concretizações, aplicam-se mutatis mutandis ao uso para a preparação de um agente de proteção de planta.

[0114] A presente invenção também provê uma planta transgênica ou sua progenia que expressa ou é capaz de expressar um complexo de proteína de bicomponentes como descrito aqui.

[0115] É entendido que todos os detalhes providos aqui em relação ao complexo de proteína de bicomponentes, particularmente em relação ao membro da família de aegerolisinas e ao membro da superfamília de MACPF, incluindo todas as concretizações, aplicam-se mutatis mutandis à planta transgênica.

[0116] Uma planta transgênica ou sua progenia da presente inven- ção adequadamente compreende (tais como estavelmente transfor- mada com) uuma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante

(tais como DNA) que compreende sequências de nucleotídios que codificam um complexo de proteína de bicomponentes como descrito aqui, as ditas sequências de nucleotídios estando operavelmente liga- das a pelo menos um promotor que é funcional na dita célula de planta para causar a produção de moléculas de mRNA. A planta transgênica ou sua progenia pode, por exemplo, compreender uma ou mais molé- culas de ácido nucleico recombinante (tais como DNA) que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o membro da família de aegerolisinas, e uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica o mem- bro da superfamília de MACPF, as ditas sequências de nucleotídios estando operavelmente ligadas a pelo menos um promotor que é funcio- nal na dita célula de planta para causar a produção de moléculas de mRNA. As sequências de codificação podem estar compreendidas por moléculas recombinantes de ácido nucleico iguais ou diferentes. Conse- quentemente, os resultantes mRNAs podem ser mono- ou policistrôni- cos.

[0117] As ditas uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombi- nante podem ser epissomais (não contidas dentro de um cromossomo) ou podem estar estavelmente integradas em um cromossomo do geno- ma de planta. De acordo com certas concretizações, as ditas uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante podem ser epissomais, tais como na forma de um vetor (tais como na forma de um vetor de expressão). De acordo com certas concretizações, as ditas uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante estão estavelmente integra- das em um cromossomo do genoma de planta.

[0118] Promotores úteis de acordo com a invenção são quaisquer promotores conhecidos que são funcionais em uma célula de planta para causar a produção de uma molécula de mRNA. Muitos desses promotores são conhecidos da pessoa versada. O uso de promotores para a expressão de proteína é em geral conhecido da pessoa versada na técnica da biologia molecular, por exemplo, ver Sambrook e outros, Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989. O promotor empregado pode ser indu- zível ou constitutivo.

[0119] Exemplos não limitantes de promotores funcionais de planta são o promotor psbA de Lactuca sativa, o promotor de tabaco psbA, o promotor de tabaco rrn16 PEP+ promotor NEP, o promotor CaMV 35S, o promotor 19S, o promotor de tomate E8, o promotor nos, o promotor Mac, o promotor de pet E ou o promotor ACT1.

[0120] A(s) molécula(s) de ácido nucleico recombinante podem compreender ulteriormente pelo menos um elemento regulador selecio- nado do grupo que consiste em uma região 5’ não traduzida (5’ UTR), região 3’ não traduzida (3’ UTR), e região de trânsito de peptídeo.

[0121] De acordo com certas concretizações, a molécula de ácido nucleico recombinante é estavelmente integrada no genoma da planta transgênica ou sua progenia.

[0122] A planta transgênica pode ser (ou derivadas de) qualquer planta de interesse. A planta transgênica pode ser um angiosperma ou um gimnosperma. De acordo com certas concretizações, a planta trans- gênica é um angiosperma. De acordo com certas concretizações, a planta transgênica é um gimnosperma.

[0123] A planta transgênica pode ser uma dicot ou uma monocot. De acordo com certas concretizações, a planta é uma dicot. De acordo com certa concretização, a planta é uma monocot.

[0124] A planta transgênica pode ser uma planta alimentícia (isto é, uma planta da qual algumas partes proveem alimento para consumo animal ou humano), tal como planta frutífera.

[0125] A planta transgênica pode ser uma planta de cultura, tais co-

mo uma planta de cultura alimentícia. De acordo com certas concretiza- ções, a planta transgênica é uma planta de cultura alimentícia tais como uma planta de batata ou uma planta de milho. De acordo com algumas concretizações, a planta transgênica é uma planta de batata, tal como Solanum tuberosum. De acordo com algumas concretizações, a planta é uma planta de milho. De acordo com algumas concretizações, a planta é repolho. De acordo com algumas concretizações, a planta é aspargo. Certas Definições

[0126] Como usado aqui, »controle de uma peste de planta« ou »controle de peste de planta« significa redução ou eliminação da peste de planta, tal como do inseto de peste.

[0127] Como usado aqui, um “pesticida” é um composto ou compo- sição usado(a) para reduzir ou eliminar insetos prejudiciais a plantas cultivadas.

[0128] Como usado aqui, “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar uma outra molécula de ácido nucleico à qual ela foi ligada. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a um laço de ácido nucleico circular de duplo fio no qual segmentos de ácido nucléico adicionais podem ser ligados. Certos vetores são capa- zes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operativa- mente ligados. Tais vetores são referidos aqui como “vetores de expres- são”. Certos outros vetores são capazes de facilitar a inserção de uma molécula de DNA recombinante em um genoma de uma planta. Tais vetores são referidos aqui como “vetores de transformação”. Em geral, vetores de utilidade em técnicas de ácido nucléico recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório, “plas- mídeo” e “vetor” podem ser usados intercambeavelmente como o plas- mídeo é a forma mais comumente usada de um vetor. Números grandes de vetores conhecidos por aqueles de habilidade na técnica e disponí- veis comercialmente.

[0129] Como usado aqui, “promotor” refere-se a uma sequência de DNA, usualmente a montante (5') da região de codificação de um gene estrutural, que controla a expressão da região de codificação por provi- são de sítios de reconhecimento e ligação para polimerase de RNA e outros fatores que podem ser exigidos para o início da transcrição. A seleção do promotor dependerá da sequência de ácidos nucléicos de interesse. um “promotor funcional em uma célula de planta “ refere-se a um “promotor” que é capaz de suporta a indicação de transcrição em células de planta, permitindo a síntese de uma molécula de mRNA.

[0130] Como usado aqui, “operavelmente ligado” refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação permitindo-os funcionar em seu modo pretendido. Uma sequência de controle “operavelmente ligada” a uma sequência de codificação é li- gada de tal modo que a expressão da sequência de codificação seja conseguida sob condições compatíveis com as sequências de controle. Uma sequência de promotor é “operavelmente ligada” a um gene quan- do está na proximidade suficiente ao sítio de partida de transcrição de um gene para regular transcrição do gene.

[0131] “% de identidade de sequência” de uma sequência de ami- noácidos com uma sequência de aminoácidos de referência, como usada aqui, define a % de identidade calculada a partir das duas se- quências de aminoácidos como se segue: As sequências são alinhadas usando Versão 9 do GAP (programa de alinhamento genético) do grupo de computação genético, usando a matriz de BLOSUM62 padrão com um pênalti de abertura de gap de -12 (para o primeiro nulo (null) de um gap) e um pênalti de extensão de gap de -4 (para cada nulo (null) adici- onal no gap). Depois do alinhamento, % de identidade é calculada por expressão dos números de emparelhamentos como uma percentagem do número de aminoácidos na sequência de aminoácidos de referência.

[0132] Onde uma faixa ou limite numérico é afirmado aqui, os pon- tos de saturação são incluídos. Também, todos os valores e sub-faixas dentro de uma faixa ou limite numérico são especificamente incluídos como se explicitamente escrito.

[0133] Tendo em geral descrito esta invenção, um outro entendi- mento pode ser obtido por referência para certos exemplos específicos, que são providos aqui para apenas as finalidades de ilustração, e não se destinam a ser limitantes a não ser de outra maneira especificado.

EXEMPLOS Ensaios Biológicos I. Bioensaio de alimentação com folhas de batata tratadas com proteí- nas recombinantes oriundas do gênero fúngico Pleurotus para avaliar toxicidade a CPB

1. Princípio:

[0134] Este bioensaio foi usado para avaliar o impacto das proteí- nas recombinantes oriundas do gênero fúngico Pleurotus na sobrevi- vência de larvas de CPB. Foram usadas folhas de batata tratadas com proteínas recombinantes. o bioensaio foi realizado por 5 dias. A taxa de sobrevivência foi registrada diariamente. Medições de peso foram registradas no dia 1 e dia 5.

2. Proteínas recombinantes:

[0135] Proteínas oriundas do gênero fúngico Pleurotus, OlyA6, PlyA2, EryA e PlyB, foram preparadas na foram recombinante pelo uso de sistema de expressão heterólogo para a produção de proteína em Escherichia coli. Proteínas foram purificadas com procedimentos cromatográficos e foram armazenados em soluções de tampão a -20˚C. Misturas de proteínas de trabalho apropriado, contendo uma aegeroli- sina e seu padrão de proteína, foram preparadas. As concentrações de aegerolisina fúngica e PlyB eram 0,5 mg/mL e 0,04 mg/mL, respecti- vamente.

3. Insetos:

[0136] larvas de CPB, coletadas a partir de campos de batatas um dia antes das experiências, foram divididas em dois grupos: larvas jovens (L1 + L2) e larvas velhas (L3+L4). Nas L1 e L2, o pronotum é inteiramente preto. Na L3, a margem anterior do pronotum aparece marrom alaranjado. Na L4, cerca da metade do pronotum é anterior- mente marrom claro.

4. Procedimento:

[0137] Discos de folha de batata, 14 mm de diâmetro, foram enchar- cados em 5 mL de cada mistura de proteínas por 5 min, antes da colo- cação na microplaca de 6 cavidades. Uma única larva de CPB foi trans- ferida para cada cavidade (Figura 3). Folhas de disco de batata frescas, tratadas com proteínas, foram adicionadas cada segundo dia. Três pla- cas de 6 cavidades em replicadas por tratamento foram realizadas, e a experiência repetiu duas vezes independentemente, dando um total de 36 larvas para cada tratamento. O bioensaio foi realizado em uma incu- badora a 22˚C ± 1, RH a 70% e um fotoperíodo de 16:8 (L:D). Tampão (Tris a 20 mM 0,5% de glicerol pH 8.0) discos de folhas tratados foram usados como um controle negativo e insecticida Actara 25 WG (a.i. tia- metoxam) discos de folhas tratados como um controle positivo. A mor- talidade de lava com base no tempo foi analisada por análise de sobre- vivência de Kaplan-Meier e o efeito de misturas de proteínas na mu- dança de peso de larva por teste de Kruskal- test, seguido por teste Dunn’s post hoc. II. Bioensaio de alimentação com dieta artificial para WCR adulto misturado com proteínas recombinantes oriundo do gênero fúngico Pleurotus para avaliar toxicidade para WCR

1. Princípio

[0138] Este bioensaio foi usado para avaliar o impacto das proteí- nas recombinantes from gênero fúngico Pleurotus na sobrevivência deWCR besouros. Nós usávamos dieta artificial misturada com proteí- nas recombinantes. O bioensaio foi realizado por 7 dias. A taxa de sobrevivência foi registrada diariamente.

2. Proteínas recombinantes

[0139] Proteínas oriundas do gênero fúngico Pleurotus, OlyA6, PlyA2, EryA e PlyB, foram preparadas na foram recombinante por O uso of sistema de expressão heterólogo para a produção de proteína Escherichia coli. Proteínas foram purificadas com procedimentos cromatográficose stored em soluções de tampão a -20˚C. Misturas de proteínas de trabalho apropriado, contendo uma aegerolisina e seu pa- drão de proteína, foram preparadas. As concentrações finais da aege- rolisina fúngica e PlyB na mistura com alimento artificial eram de 0,5 mg/mL e 0,04 mg/mL, respectivamente.

3. Insetos:

[0140] Besouros, usados para as experiências, foram coletados a partir dos campos de milhos um dia antes das experiências.

4. Procedimento:

[0141] Uma dieta artificial (pH 7,0) que compreende de: sacarose (33 g), alphacel (18,6 g), caseína (15,9 g ), farinha de soja (12,4 g), germe de trigo (12,4 g), levedura de cerveja (5 g), mistura de vitamina (Vanderzant, 1.2 g), mistura de sais (Wesson, 1,2 g), colesterol (0,3 g), glicerol (11 mL) e dH2O (82,5 mL), foi misturada para WCR. 30 μL de mistura, que compreende de dieta artificial e complexos de proteínas(15 µl cada) foram pipetadas para cada cavidade de uma placa de 6 cavidades. Um adulto de WCR foi colocado em cada cavidade (Figura 4). Três placas de 6 cavidades replicadas por tratamento foram realiza- das, e a experiência repetia duas vezes independentemente, dando um total de 36 insetos adultos para cada tratamento. O bioensaio foi reali- zado em uma incubadora a 22˚C ± 1, RH a 70% e um fotoperíodo de 16:8 (L:D). Tampão (Tris a 20 mM 0,5% de glicerol pH 8,0) foi misturado com alimento artificial (1:1, v:v) foi usado como um controle negativo e 0,5% de mistura de Decis (a.i. deltametrina) como um controle positivo. Testes Biofísicos III. Medições de Ressonânica de Plasmônio de Superfície

1. Princípio:

[0142] Foi usada Ressonânica de Plasmônio de Superfície para a determinação de interações de proteínas oriundas do gênero fúngico Pleurotus com vesículas de lipídeo artificiais contendo CPE. Foram imo- bilizadas vesículas unilamelares grandes (LUV) contendo CPE sobre a superfície do chip de sensor. Soluções da aegerolisina apropriada, so- zinhas ou em combinação com PlyB foram injetadas através da super- fície do chip de sensor.

2. Reagentes:

[0143] As interações foram monitoradas no refractômetro com base na ressonância de plasmônio de superfície Biacore X, usando chip de L1. Para imobilização de LUVs constituída de mistura de lipídeos (CPE: palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina [POPC] : Chol [5 : 47,5 : 47,5, mol:mol:mol]) e como tampão de funcionamento foram usados Tris a 20 mM, NaCl a 140 mM, EDTA a 5 μM pH 7,4. Como análitos foram usadas proteínas recombinantes oriundas do gênero fúngico Pleurotus: OlyA6, EryA, PlyA2 e PlyB. Experiências foram realizadas a 25˚C. Os dados foram processados com software de avaliação de BIA (GE Healthcare).

3. Procedimento:

[0144] Depois da limpeza inicial do chip com soluções de regene- ração (sulfato de dodecila de sódio [SDS] e octil β-D-glucopiranosídeo [OG], injeção de 1 min, taxa de fluxo 10 μL/min), LUVs contendo CPE estavam ligados à segunda célula de fluxo do chip de sensor L1 uma resposta de alcance de aproximadamente 7000 RU. A primeira célula de fluxo foi deixada vazia e foi usada para controlar a ligação não específica possível de proteínas à matriz de dextrano. LUVs ligados frouxamente foram lavadas da superfície com injeção de 1 min de NaOH a 100 mM. A ligação não específica das proteínas foi minimizada com injeção de 1 minuto de 0,1 mg/mL de albumina de soro bovino a taxa de fluxo de 30 μL/min. Soluções apropriadas de proteínas e complexos de proteínas foram injetadas a uma taxa de fluxo de 10 μL/min. As intera- ções de OlyA6, PlyA2 ou EryA com LUVs contendo CPE foram testadas. Além do mais, nós analisamos as interações de complexos de proteínas OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB ou EryA/PlyB com LUVs. Regeneração entre a injeção foi conseguida com uma injeção de 1 min de 0,5% de SDS e OG a 40 mM com taxa de fluxo de 10 μL/min. IV. Atividade Lítica de Aegerolisinas Fúngicas com seu par PlyB

1. Princípio:

[0145] Nós usávamos vesículas unilamelares pequenas carregadas com calceína (SUVs) contendo CPE a fim de confirmar a atividade lítica de OlyA6, PlyA2 ou EryA com seu par de proteína PlyB.

2. Reagentes:

[0146] A atividade lítica do complexos de proteínaes foi analisada em uma leitora de microplaca de fluorescência a 25 ˚C. Nós usávamos SUVs carregadas de calceína constituídas de mistura de lipídeos (CPE:POPC:Chol [5:47,5 : 47,5, mol:mol:mol]).

3. Procedimento:

[0147] Misturas de proteínas que compreendem aegerolisinas fún- gicas OlyA6, PlyA2 ou EryA e PlyB (12,5 :1, mol:mol) foram distribuídas em uma microplaca de múltiplas camadas nas seguintes concretiza- ções: 10 μg/mL de OlyA6, PlyA2 ou EryA combinados com 0,8 μg/mL PlyB. SUVs carregadas com calceína foram adicionadas às misturas de proteínas (5 μg/mL). As SUVs foram excitadas at 485 nm e a intensidade do fluorescência emitida de calceína liberada foi monitorada a 535 nm por 30 min com intervalos de 20 s. As intensidades da fluorescência emitida a t=0 e t=30 foram determinadas como F0 e F, respectivamente

SUVs foram totalmente lisadas com Triton X-100 a 1 mM, e fluores- cência medida foi determinada como máxima intensidade de fluores- cência (Fmax). A percentagem de liberação de calceína R (%) foi calcu- lada como: 𝐹−𝐹𝑜 𝑅 (%) = * 100 𝐹𝑚𝑎𝑥−𝐹𝑜 Resultados I. CPB bioensaio de alimentação com folhas de batata tratadas com proteínas recombinantes oriundas do gênero fúngico Pleurotus

[0148] O efeito dos complexos de pesticida de bicomponentes, que compreende aegerolisina fúngica e PlyB sobre as larvas de CPB foi testado. Mortalidade e peso de corpo da larva foram analisados. Expo- sição de larvas de CPB a discos de folhas tratados com OlyA6/PlyB ou PlyA2/PlyB misturas de proteínas caused mortalidade de larva signifi- cativa no dia 5 depois do início da alimentação em ambos os grupos (Figuras 5-6). Mistura de proteínas de EryA/PlyB causou mortalidade de larva significativa também em larvas jovens (L1+L2). O comporta- mento da alimentação de larvas expostas era significativamente dife- rente daquele das larvas de controle (Figuras 5-6). Depois do dia 1, larvas expostas mostravam uma diminuição no consumo de alimento. L1+L2 tratadas com EryA/PlyB mostravam um aumento de peso signifi- cativamente menor em comparação com os pesos de larvas de controle, enquanto que todas as misturas de proteínas significativamente reduziu o aumento de peso de larvas no caso de L3+L4. Aegerolisinas individu- ais (OlyA6, PlyA2 ou EryA) ou apenas o componente B (PlyB) sozinho não mostravam um efeito significativo sobre a mudança de peso das larvas em L1+L2 ou L3+L4. II. Bioensaio de alimentação com dieta artificial misturada com proteí- nas recombinantes oriundas de gênero fúngico Pleurotus que direciona WCR adulto

[0149] O efeito dos complexos de pesticida de bi-componentes, que compreende aegerolisina fúngica e PlyB nos besouros de WCR foi tes- tado. A mortalidade de inseto foi avaliada em uma base diária. Exposi- ção de WCR ao alimento artificial misturado com OlyA6/PlyB resultou em um aumento significativo na mortalidade no dia 5 depois do início da alimentação. O comportamento da alimentação de larvas expostas foi diferente daquele de larvas de controle. Depois do dia 4, larvas expostas mostravam uma diminuição no consumo de alimento (Figura 7). III. Ressonância de plasmônio de superfície measurements

[0150] Nós monitoramos a ligação de aegerolisinas fúngicas OlyA6, PlyA2 ou EryA (com ou sem pleurotolisina B) a vesículas unilamelares grandes contendo CPE usando ressonância de plasmônio de superfície. Os resultados mostram claramente que todas as aegerolisinas testadas especificamente interagem com membranas artificiais contendo CPE, e que essa interação é estabilizada na presença de PlyB (Figura 8). IV. Atividade lítica de aegerolisinas fúngicas com seu par PlyB

[0151] Os resultados mostram que membranas artificiais foram permeabilizadas com aegerolisinas OlyA6, PlyA2 ou EryA em combina- ção com PlyB, if the membranes contained CPE. Complexos de proteí- nas de OlyA6/PlyB e PlyA2/PlyB são mais líticos do que EryA/PlyB (Figura 9). Referência Alyokhin, A., Baker, M., Mota-Sanchez, D., Dively, G., Grafius, E. (2008). Colorado Potato Beetle Resistance to Insecticides. American Journal of Potato Research, 85(6), 395-413. http://dx.doi.org/10.1007/s12230-008- 9052-0 Alyokhin, A., Mota-Sanchez, D., Baker, M., Snyder, W., Menasha, S., Whalon, M. e outros (2014). The Red Queen in a potato field: integrated pest management versus chemical dependency in Colorado potato bee- tle control. Pest Management Science, 71(3), 343-356. http://dx.doi.org/10.1002/ps.3826

Anderluh, G., Kisovec, M., Kraševec, N., Gilbert, R.J. (2014). Distribution of MACPF/CDC proteins.

Subcellular Biochemistry, 80, 7-30 Berne, S., Lah, L., Sepčić, K. (2009). Aegerolysins: Structure, function, and putative biological role.

Protein Science, 18(4), 694–706. http://dx.doi.org/10.1002/pro.85 Bhat, H., Ishitsuka, R., Inaba, T., Murate, M., Abe, M., Makino, A. e out- ros (2015). Evaluation of aegerolysins as novel tools to detect and visu- alize ceramide phosphoethanolamine, a major sphingolipid in inverte- brates.

The FASEB Journal, 29(9), 3920-3934. http://dx.doi.org/10.1096/fj.15-272112 Butala, M., Novak, M., Kraševec, N., Skočaj, M., Veranič, P., Maček, P., Sepčić, K. (2017). Aegerolysins: Lipid-binding proteins with versatile functions.

Seminars In Cell And Developmental Biology. http://dx.doi.org/10.1016/j.semcdb.2017.05.002 Casagrande, RA. (1987). The colorado Potato Beetle: 125 Years of mis- management.

American Entomologist, 33(3),142-150. https://doi.org/10.1093/besa/33.3.142 Chu, C., Sun, W., Spencer, J., Pittendrigh, B., Seufferheld, M. (2014). Differential effects of RNAi treatments on field populations of the western corn rootworm.

Pesticide Biochemistry And Physiology, 110, 1-6. http://dx.doi.org/10.1016/j.pestbp.2014.02.003 Crone, H.D., Bridges, RG.(1963). The phospholipids of the housefly, Musca domestica.

Biochemical Journal, 89,11-21 Devine, G., Furlong, M. (2007). Insecticide use: Contexts and ecological consequences.

Agriculture And Human Values, 24(3), 281-306. http://dx.doi.org/10.1007/s10460-007-9067-z Gassmann, A. (2012). Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm: Predictions from the laboratory and effects in the field.

Journal Of Invertebrate Pathology, 110(3), 287-293. http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2012.04.006

Gassmann, A., Petzold-Maxwell, J., Keweshan, R., Dunbar, M. (2011). Field-Evolved Resistance to Bt Maize by Western Corn Rootworm.

Plos ONE, 6(7), e22629. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0022629 Itasaka, O., Hori, T., Uno, A., Iwamori, M. (1973). Occurence of of Ceramide Phosphorylethanolamine Containing Hydroxy Fatty Acid in a Bivalve.

Journal of Biochemistry, 73, 191-193. Jakka, S., Shrestha, R., Gassmann, A. (2016). Broad-spectrum re- sistance to Bacillus thuringiensis toxins by western corn rootworm (Dia- brotica virgifera virgifera). Scientific Reports, 6(1). http://dx.doi.org/10.1038/srep27860 Kaiser-Alexnat, R. (2009). Protease activities in the midgut of Western corn rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). Journal Of Inver- tebrate Pathology, 100(3), 169-174. http://dx.doi.org/10.1016/j.jip.2009.01.003 Kelker, M., Berry, C., Evans, S., Pai, R., McCaskill, D., Wang, N. e out- ros (2014). Structural and Biophysical Characterization of Bacillus thu- ringiensis Insecticidal Proteins Cry34Ab1 and Cry35Ab1. Plos ONE, 9(11), e112555. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0112555 Kuhlmann, U., Burgt, W.A.C.M., 1998. Possibilities for biologicalcontrol of the western corn rootworm, Diabrotica virgiferavirgifera LeConte, in Central Europe.

Biocontrol News And Information, 19, 59–68 Ludwick, D., Meihls, L., Ostlie, K., Potter, B., French, L., Hibbard, B. (2017). Minnesota field population of western corn rootworm (Coleop- tera: Chrysomelidae) shows incomplete resistance to Cry34Ab1/Cry35Ab1 and Cry3Bb1. Journal Of Applied Entomology, 141(1-2), 28-40. http://dx.doi.org/10.1111/jen.12377 Lukoyanova, N., Kondos, S.C., Farabella, I., Law, R.H.P., Reboul, C.F., Caradoc-Davies, T.T., Spicer, B., Kleifeld, O., Traore, D.A.K., Ekkel, S.M., Voskoboinik, I., Trapani, J.A., Hatfaludi, T.Z., Oliver, K., Hotze, E.M., Tweten, R.K., Whisstock, J.C., Topf, M., Saibil, H.R., Dunstone,

M.A.( 2015). Conformational changes during pore formation by the per- forin-related protein pleurotolysin, PLos Biology, 13 (2),1-15. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pbio.1002049 Masson, L., Schwab, G., Mazza, A., Brousseau, R., Potvin, L., Schwartz, J. (2004). A NovelBacillus thuringiensis (PS149B1) Containing a Cry34Ab1/Cry35Ab1 Binary Toxin Specific for the Western Corn Root- wormDiabrotica virgifera virgiferaLeConte Forms Ion Channels in Lipid Membranes.

Biochemistry, 43(38), 12349-12357. http://dx.doi.org/10.1021/bi048946z Meinke, L.J., Siegfried, B.

D., Wright, R.J., Chandler, L.D. (1998). Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.

Journal of Eco- nomic Entomology, 91(3),594-600 Meissle, M., Pilz, C., Romeis, J. (2009). Susceptibility of Diabrotica vir- gifera virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae) to the Entomopathogenic Fungus Metarhizium anisopliae when Feeding on Bacillus thuringiensis Cry3Bb1-Expressing Maize.

Applied And Environmental Microbiol- ogy, 75(12), 3937-3943. http://dx.doi.org/10.1128/aem.00432-09 Novak, M., Kraševec, N., Skočaj, M., Maček, P., Anderluh, G., Sepčić, K. (2014). Fungal aegerolysin-like proteins: distribution, activities, and applications.

Applied Microbiology And Biotechnology, 99(2), 601-610. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-014-6239-9 Ota, K., Leonardi, A., Mikelj, M., Skočaj, M., Wohlschlager, T., Künzler, M. e outros (2013). Membrane cholesterol and sphingomyelin, and os- treolysin A are obligatory for pore-formation by a MACPF/CDC-like pore- forming protein, pleurotolysin B.

Biochimie, 95(10), 1855-1864. http://dx.doi.org/10.1016/j.biochi.2013.06.012 Ota, K., Butala, M., Viero, G., Dalla Serra, M., Sepčič, K., Maček, P. (2014). Fungal MACPF-like proteins and aegerolysins: bi-component pore-forming proteins? Subcellular Biochemistry, 80, 271-91.

Pereira, A., Wang, H., Zukoff, S., Meinke, L., French, B., Siegfried, B. (2015). Evidence of Field-Evolved Resistance to Bifenthrin in Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) Populations in Western Nebraska and Kansas.

PlosS ONE, 10(11), e0142299. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0142299 Perlak, F.J.,Stone, B.T., Muskopf, Y.M., Petersen, L.J., Parker, G.B., McPherson, S.

A., Wyman, J., Love, S., Reed, G., Biever, D., Fischohoff. (1993). Genetically improved potatos: protection from damage by Colo- rado potato beetles.

Plant Molecular Biology, 22(2), 313-321 Qureshi, N., Chawla, S., Likitvivatanavong, S., Lee, H., Gill, S. (2014). The Cry Toxin Operon of Clostridium bifermentans subsp. malaysia Is Highly Toxic to Aedes Larval Mosquitoes.

Applied And Environmental Microbiology, 80(18), 5689-5697. http://dx.doi.org/10.1128/aem.01139- 14 Sambrook, J., Fritsch, F.

E., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual.

Second edition.

New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sepčić, K., Berne, S., Rebolj, K., Batista, U., Plemenitaš, A., Šentjurc, M., Maček, P. (2004). Ostreolysin, a pore-forming protein from the oyster mushroom, interacts specifically with membrane cholesterol-rich lipid domains.

FEBS Letters, 575(1-3), 81-85. http://dx.doi.org/10.1016/j.feb- slet.2004.07.093 Shibata, T., Kudou, M., Hoshi, Y., Kudo, A., Nanashima, N., Miyairi, K. (2010). Isolation and characterization of a novel two-component hemolysin, erylysin A and B, from an edible mushroom, Pleurotus eryngii.

Toxicon, 56(8), 1436-1442. http://dx.doi.org/10.1016/j.toxicon.2010.08.010 Skočaj, M., Resnik, N., Grundner, M., Ota, K., Rojko, N., Hodnik., V. e outros (2014). Tracking Cholesterol/Sphingomyelin-Rich Membrane Do- mains with the Ostreolysin A-mCherry Protein.

Plos ONE, 9(3), e92783. http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0092783

Tomita, T., Noguchi, K., Mimuro, H., Ukaji, F., Ito, K., Sugawara-Tomita, N., Hashimoto, Y. (2004). Pleurotolysin, a Novel Sphingomyelin-specific Two-component Cytolysin from the Edible MushroomPleurotus os- treatus, Assembles into a Transmembrane Pore Complex.

Journal Of Biological Chemistry, 279(26), 26975-26982. http://dx.doi.org/10.1074/jbc.m402676200 Tu, J., Zhang, G., Datta, K., Xu C., He, Y., Zhang, Q., Khush, S., Datta, S.K. (2000). Field performance of transgenic elite commercial hybrid rice expressing Bacillus thuringiensis δ- endotoxin.

Nature, 18, 1101-1104. http://dx.doi.org/10.1038/80310 Vacaru, A.M., van den Dikkenberg, J., Terne,s P., Holthuis, J.C. (2013). Ceramide phosphoethanolamine biosynthesis in Drosophila is mediated by a unique ethanolamine phosphotransferase in the Golgi lumen.

The Journal of Biological Chemistry, 288(16), 11520-30. http://dx.doi.org/10.1074/jbc.M113.460972 Yalpani, N., Altier, D., Barry, J., Kassa, A., Nowatzki, T., Sethi, A. e outros (2017). An Alcaligenes strain emulates Bacillus thuringiensis pro- ducing a binary protein that kills corn rootworm through a mechanism similar to Cry34Ab1/Cry35Ab1. Scientific Reports, 7(1). http://dx.doi.org/10.1038/s41598-017-03544-9

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Uso de um complexo de proteína, caracterizado pelo fato de ser o uso de um complexo de proteína de bicomponentes que consiste em uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 20 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e uma pluralidade de moléculas, tais como pelo menos 10 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, para o controle de uma peste de plantas.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o complexo de proteína de bi-componentes consiste em 20 a 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 10 a 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a razão de moléculas de um membro da família de aegerolisinas para moléculas de um membro da superfamília de MACPF é de 2:1.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o complexo de proteína de bi-compo- nentes consiste em 20 moléculas de um membro da família de aegeroli- sinas e 10 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 22 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 11 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 24 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 12 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 26 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 13 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 28 molécu- las de um membro da família de aegerolisinas e 14 moléculas de um membro da superfamília de MACPF, ou consiste em 30 moléculas de um membro da família de aegerolisinas e 15 moléculas de um membro da superfamília de MACPF.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

4, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é selecionado do grupo que consiste em ostreolisina, pleurotolisina A e erilisina A.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é ostreolisina, tais como ostreolisina A6.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é pleurotolisina A, tais como pleurotolisina A2.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é erilisina A.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a erilisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é uma proteína contendo domínio de MACPF derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B (PlyB) ou erilisina B (Ery B).

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B (PlyB).

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4.

17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é erilisina B (Ery B).

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.

19. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é um inseto.

20. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é um inserto herbívoro.

21. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracte- rizado pelo fato de que a peste de plantas é a larva do inseto.

22. Uso de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracteriza- do pelo fato de que a peste de plantas é um imago do inseto.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o inseto é da ordem Coleoptera.

24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que o inseto é da família Chrysomelidae.

25. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o inseto é do gênero Leptinotarsa.

26. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o inseto é Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado).

27. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o inseto é do gênero Diabrotica.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o inseto é Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 24, caracterizado pelo fato de que o inseto é selecionado do grupo que consiste em Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado) e Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho

Western).

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é selecionada de besouro da batata do Colorado e gorgulho de raiz de milho Western.

31. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é besouro da batata do Colorado, tais como larvas do besouro da batata do Colorado.

32. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 24, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é gorgulho de raiz de milho Western.

33. Método para a proteção de uma planta contra uma peste de planta, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de: apli- cação de uma composição que compreende uma pluralidade de molé- culas de um membro da família de aegerolisinas, uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF e um veículo ade- quado, tais como uma solução de tampão, a uma planta que necessita da mesma.

34. Método para o controle de uma peste de plantas, carac- terizado pelo fato de que compreende a etapa de: aplicação de uma composição que compreende uma pluralidade de moléculas de um membro da família de aegerolisinas, uma pluralidade de moléculas de um membro da superfamília de MACPF e um veículo adequado, tais como uma solução de tampão, a uma planta que necessita da mesma.

35. Método de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracte- rizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é uma aegerolisina derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é selecionado do grupo que consiste em ostreolisina, pleurotolisina A e erilisina A.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegeroli- sinas é ostreolisina, tais como a ostreolisina A6.

38. O método de acordo com a reivindicação 37, caracte- rizado pelo fato de que a ostreolisina é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 1.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 36, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é pleurotolisina A, tais como pleurotolisina A2.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a pleurotolisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 2.

41. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 33 a 36, caracterizado pelo fato de que o membro da família de aegerolisinas é erilisina A.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a erilisina A é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 3.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 42, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é uma proteína contendo domínio de MACPF derivada de um fungo do gênero Pleurotus.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 43, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B (PlyB) ou erilisina B (Ery B).

45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 43, em que o membro da superfamília de MACPF é pleurotolisina B (PlyB).

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a pleurotolisina B é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 4.

47. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 43, caracterizado pelo fato de que o membro da superfamília de MACPF é erilisina B (Ery B).

48. Uso de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que a erilisina B (Ery B) é um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 50%, tais como pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 5.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 48, caracterizado pelo fato de que a razão molar entre o membro da família de aegerolisinas e o membro da superfamília de MACPF está na faixa de desde cerca de 3:1 a cerca de 1000:1, tais como cerca de 5:1, cerca de 10:1, cerca de 20:1, cerca de 25:1, cerca de 30:1, cerca de 40:1, cerca de 50:1, cerca de 60:1, cerca de 70:1, cerca de 80:1, cerca de 90:1, cerca de 100:1, cerca de 200:1, cerca de 300:1, cerca de 400:1, cerca de 500:1, cerca de 600:1, cerca de 700:1, cerca de 800:1, ou cerca de 900:1, ou cerca de 1000:1.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 49, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é um inseto.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 50, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é um inserto herbívoro.

52. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, caracte- rizado pelo fato de que a peste de plantas é a larva do inseto.

53. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, carac- terizado pelo fato de que a peste de plantas é um imago do inseto.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 53, caracterizado pelo fato de que o inseto é da ordem Coleoptera.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 54, caracterizado pelo fato de que o inseto é da família Chrysomelidae.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 55, caracterizado pelo fato de que o inseto é do gênero Leptinotarsa.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 55, caracterizado pelo fato de que o inseto é Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado).

58. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 55, caracterizado pelo fato de que o inseto é do gênero Diabrotica.

59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 55, caracterizado pelo fato de que o inseto é Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 a 55, caracterizado pelo fato de que o inseto é selecionado do grupo que consiste em Leptinotarsa decemlineata (besouro da batata do Colorado) e Diabrotica virgifera virgifera (gorgulho de raiz de milho Western).

61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 49, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é selecionada de besouro da batata do Colorado e gorgulho de raiz de milho Western.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 49, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é besouro da batata do Colorado, tais como larvas do besouro da batata do Colorado.

63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 49, caracterizado pelo fato de que a peste de plantas é gorgulho de raiz de milho Western.

64. Uso de um complexo de proteína de bicomponentes como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18 ou uma com- posição como definida em qualquer uma das reivindicações 33 a 49, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um agente de prote- ção de planta.

65. Planta transgênica ou sua progenia, caracterizada pelo fato de que expressa ou é capaz de expressar um complexo de proteína de bicomponentes como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.

66. Planta transgênica ou sua progenia de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato de que compreende (tais como estavelmente transformada com) uma ou mais moléculas de ácido nucleico recombinante que compreende sequências de nucleotídios que codificam um complexo de proteína de bicomponentes como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, as ditas sequências de nucleotídios estando operavelmente ligadas a pelo menos um promotor que é funcional na dita célula de planta para causar a produção de moléculas de mRNA.

67. Planta transgênica ou sua progenia de acordo com a reivindicação 65 ou 66, caracterizada pelo fato de que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de cultura.

68. Planta transgênica ou sua progenia de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 67, caracterizada pelo fato de que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de batata ou uma planta de milho.

69. Planta transgênica ou sua progenia de acordo com qual- quer uma das reivindicações 65 a 68, caracterizada pelo fato de que a dita planta transgênica ou sua progenia é a planta de batata.

70. Planta transgênica ou sua progenia de acordo com qualquer uma das reivindicações 65 a 68, caracterizada pelo fato de que a dita planta transgênica ou sua progenia é uma planta de milho.