CN111148523A - 用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法 - Google Patents

用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111148523A
CN111148523A CN201880008104.3A CN201880008104A CN111148523A CN 111148523 A CN111148523 A CN 111148523A CN 201880008104 A CN201880008104 A CN 201880008104A CN 111148523 A CN111148523 A CN 111148523A
Authority
CN
China
Prior art keywords
host
spp
cases
peptide
species
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880008104.3A
Other languages
English (en)
Inventor
伊格纳西奥·马丁内斯
扎卡里·加罗·阿默
克里斯提·塞扎尔
巴里·安德鲁·马丁
阿马多 梅尔·史蒂夫·阿文达尼奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5
Flagship Pioneering Innovations V Inc
Original Assignee
Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5 filed Critical Flagship Entrepreneurship And Innovation Co 5
Publication of CN111148523A publication Critical patent/CN111148523A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1729—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1767—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43572—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from bees
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43577—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies
    • C07K14/43581—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from flies from Drosophila
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43586—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本文提供了有用于人健康的方法和组合物，例如有用于靶向寄宿于宿主昆虫(例如，节肢动物，例如昆虫，如病原体媒介)中的一种或多种微生物，该调节导致该宿主的适合度降低。本发明的特征在于组合物，该组合物包括调节剂(例如，噬菌体、肽、小分子、抗生素、或其组合)，该调节剂能以对宿主不利的方式改变宿主的微生物区系。通过破坏微生物水平、微生物活性、微生物代谢或微生物多样性，本文所述的调节剂可用于降低多种昆虫的适合度，这些昆虫携带导致人疾病的媒介传播的病原体。

Description

用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年1月24日提交的美国临时申请号62/450,032和于2017年11月9日提交的美国临时申请号62/583,925的优先权，其各自的内容通过引用以其全文特此并入本文。
背景技术
昆虫作为针对病原体的媒介起作用，引起严重人疾病，如登革热、锥体虫病和疟疾。疟疾被认为是全球最重大的疾病之一，2011年确诊病例1.74亿，死亡人数为6550亿。因此，本领域需要控制携带媒介传播的疾病的昆虫的方法和组合物。
发明内容
本文披露了用于调节昆虫适合度的组合物和方法，这些组合物和方法用于控制人类中媒介传播的疾病的传播。该组合物包括药剂，该药剂改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的水平、活性或代谢，该改变导致宿主的适合度的调节。
在一个方面，本文提供了降低人病原体的媒介(例如，昆虫媒介)的适合度的方法，该方法包括向该媒介递送抗微生物肽，该抗微生物肽与以下的一种或多种具有至少90％序列同一性(例如，至少90％、92％、94％、96％、98％、或100％序列同一性)：杀菌肽(SEQ IDNO：82)、蜂毒素、copsin、果蝇抗真菌肽(drosomycin)(SEQ ID NO：93)、皮离蛋白(SEQ IDNO：81)、果蝇抗菌肽(andropin)(SEQ ID NO：83)、家蚕抗菌肽(SEQ ID NO：84)、无锡亚肽(SEQ ID NO：85)、蜜蜂肽(abaecin)(SEQ ID NO：86)、蜜蜂抗菌肽(apidaecin)(SEQ ID NO：87)、猪抗菌肽(prophenin)(SEQ ID NO：88)、吲哚力西丁(indolicidin)(SEQ ID NO：89)、抗菌肽(protegrin)(SEQ ID NO：90)、速普肽(SEQ ID NO：91)、或防御素(SEQ ID NO：92)。
在一些实施例中，该递送包括向媒介生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境递送抗微生物肽。
在一些实施例中，可以将该抗微生物肽以昆虫可食用组合物进行递送，从而被媒介摄取。
在一些实施例中，可以将该抗微生物肽配制为液体、固体、气溶胶、膏剂、凝胶、或气体组合物。
在一些实施例中，该昆虫可以是蚊子、蠓(midge)、虱子、白蛉(sandfly)、蜱(tick)、锥蝽臭虫(triatomine bug)、采采蝇(tsetse fly)、或跳蚤中的至少一种。
在另一个方面，本文提供了组合物，该组合物包括抗微生物肽，该抗微生物肽与以下的一种或多种具有至少90％序列同一性(例如，至少90％、92％、94％、96％、98％、或100％序列同一性)：杀菌肽(SEQ ID NO：82)、蜂毒素、copsin、果蝇抗真菌肽(SEQ ID NO：93)、皮离蛋白(SEQ ID NO：81)、果蝇抗菌肽(SEQ ID NO：83)、家蚕抗菌肽(SEQ ID NO：84)、无锡亚肽(SEQ ID NO：85)、蜜蜂肽(SEQ ID NO：86)、蜜蜂抗菌肽(SEQ ID NO：87)、猪抗菌肽(SEQ ID NO：88)、吲哚力西丁(SEQ ID NO：89)、抗菌肽(SEQ ID NO：90)、速普肽(SEQ IDNO：91)、或防御素(SEQ ID NO：92)，该组合物被配制用于靶向针对人病原体的媒介(例如，昆虫媒介)中的微生物。
在第二方面的一些实施例中，该抗微生物肽在组合物中的浓度可以是约0.1ng/g至约100mg/g(约0.1ng/g至约1ng/g、约1ng/g至约10ng/g、约10ng/g至约100ng/g、约100ng/g至约1000ng/g、约1mg/g至约10mg/g、约10mg/g至约100mg/g)或者约0.1ng/mL至约100mg/mL(约0.1ng/mL至约1ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1000ng/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL)。
在第二方面的一些实施例中，该抗微生物肽可以进一步包括靶向结构域。
在第二方面的一些实施例中，该抗微生物肽可以进一步包括细胞穿透肽。
在又另一个方面，该组合物包括药剂，该药剂改变寄宿于昆虫宿主中的一种或多种微生物的水平、活性或代谢，该改变导致该昆虫宿主的适合度降低。
在上述组合物的任一个的一些实施例中，该一种或多种微生物可以是寄宿于宿主中的细菌或真菌。在一些实施例中，寄宿于宿主中的细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchenera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcusspp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonellaspp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermusspp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。在一些实施例中，寄宿于宿主中的真菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)、Symbiotaphrina bucneri、Symbiotaphrina kochii、休哈塔假丝酵母(Scheffersomyces shehatae)、树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、隐球菌属(Cryptococcus)、毛孢子菌属(Trichosporon)、Amylostereum areolatum、香柱菌属物种(Epichloe spp)、松果毕赤酵母(Pichia pinus)、荚膜汉逊酵母(Hansenula capsulate)、Daldinia decipien、长喙壳属属物种(Ceratocystis spp)、长喙壳菌属物种(Ophiostomaspp)、以及Attamyces bromatificus。在某些实施例中，该细菌是沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp.)(例如，在蚊子宿主中)。在某些实施例中，该细菌是立克次体属物种(Rickettsia spp.)(例如，在蜱宿主中)。
在上述组合物的任一个中，该药剂(下文中也可称为调节剂)可以改变寄宿于宿主中的微生物的生长、分裂、生存力、代谢、和/或寿命。在上述实施例的任一个中，该调节剂可以降低寄宿于宿主中的一种或多种微生物的生存力。在一些实施例中，该调节剂增加寄宿于宿主中的一种或多种微生物的生长或生存力。
在上述实施例的任一个中，该调节剂是噬菌体、多肽、小分子、抗生素、细菌、或其任何组合。
在一些实施例中，该噬菌体结合寄宿于宿主中的细菌上的细胞表面蛋白。在一些实施例中，该噬菌体对寄宿于宿主中的细菌具有毒性。在一些实施例中，该噬菌体是选自下组的至少一种，该组由以下组成：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、Ampullaviridae、Bicaudaviridae、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Gluboloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、以及复层病毒科(Tectiviridae)。
在一些实施例中，该多肽是细菌素、R-型细菌素、根瘤富含半胱氨酸肽(nodule C-rich peptide)、抗微生物肽、溶素、或含菌细胞调节肽中的至少一种。
在一些实施例中，该小分子是代谢物。
在一些实施例中，该抗生素是广谱抗生素。
在一些实施例中，该调节剂是天然存在的细菌。在一些实施例中，该细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：Bartonella apis、Parasaccharibacter apium、Frischella perrara、Snodgrassella alvi、Gilliamela apicola、双歧杆菌属物种(Bifidobacterium spp)、以及乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)。在一些实施例中，该细菌是选自下组的至少一种，该组由以下组成：暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchenera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumaniaspp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachiaspp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidusspp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylellaspp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种(Rhodococcusspp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。
在上述组合物的任一个中，宿主适合度可以通过宿主的存活、繁殖、或代谢来测量。在上述实施例的任一个中，该调节剂可以通过增加宿主的杀有害生物易感性(例如，对表12中列出的杀有害生物剂的易感性)来调节宿主的适合度。在一些实施例中，该调节剂通过增加宿主的杀有害生物易感性来调节宿主的适合度。在一些实施例中，该杀有害生物易感性是杀细菌易感性或杀真菌易感性。在一些实施例中，该杀有害生物易感性是杀昆虫易感性。
在上述组合物的任一个中，该组合物可以包括多种不同的调节剂。在一些实施例中，该组合物包括调节剂和杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀细菌剂或杀真菌剂。在一些实施例中，该杀有害生物剂是杀昆虫剂。
在上述组合物的任一个中，该调节剂可以连接至第二部分。在一些实施例中，该第二部分是调节剂。
在上述组合物的任一个中，该调节剂可以连接至靶向结构域。在一些实施例中，该靶向结构域将调节剂靶向宿主中的靶位点。在一些实施例中，该靶向结构域将调节剂靶向寄宿于宿主中的一种或多种微生物。
在上述组合物的任一个中，该调节剂可以包括失活的前序列(pre-sequence或pro-sequence)，从而形成前体调节剂。在一些实施例中，该前体调节剂在宿主中转化为活性形式。
在上述组合物的任一个中，该调节剂可以包括接头。在一些实施例中，该接头是可裂解接头。
在上述组合物的任一个中，该组合物可以进一步包括载体。在一些情况下，该载体可以是农业上可接受的载体。
在上述组合物的任一个中，该组合物可以进一步包括宿主诱饵、粘性剂、或其组合。在一些实施例中，该宿主诱饵是可食用试剂和/或化学引诱剂。
在上述组合物的任一个中，该组合物可以是处于有效调节宿主适合度的剂量。I
在上述组合物的任一个中，可以将该组合物配制用于向寄生于宿主的肠中的微生物进行递送。在上述组合物的任一个中，可以将该组合物配制用于向寄生于宿主的含菌细胞中和/或宿主的肠中的微生物进行递送。在一些实施例中，可以将该组合物配制用于向植物进行递送。在一些实施例中，可以将该组合物配制用于在宿主进食站中使用。
在上述组合物的任一个中，可以将该组合物配制为液体、粉剂、粒剂或纳米颗粒。在一些实施例中，将该组合物配制为选自下组的一种，该组由以下组成：脂质体、聚合物、细菌分泌肽、以及合成纳米胶囊。在一些实施例中，该合成纳米胶囊向宿主中的靶位点递送组合物。在一些实施例中，该靶位点是宿主的肠。在一些实施例中，该靶位点是宿主中的含菌细胞。
在另外的方面，本文还提供了包括上述组合物的任一个的宿主。在一些实施例中，该宿主是昆虫。在一些实施例中，该昆虫是蚊子、蠓、虱子、白蛉、蜱、锥蝽臭虫、采采蝇、或跳蚤。在某些实施例中，该昆虫是蚊子。在某些实施例中，该昆虫是蜱。在某些实施例中，该昆虫是螨(mite)。在某些实施例中，该昆虫是虱子。
本文还提供了用于调节宿主的适合度的系统，该系统包含靶向宿主的适合度所需的微生物的调节剂，其中该系统对于调节宿主的适合度是有效的，并且其中该宿主是昆虫。该调节剂可以包括本文所述的组合物的任一个。在一些实施例中，将该调节剂配制为粉剂。在一些实施例中，将该调节剂配制为溶剂。在一些实施例中，将该调节剂配制为浓缩物。在一些实施例中，将该调节剂配制为稀释剂。在一些实施例中，通过将先前组合物的任一个与载体组合来制备该调节剂用于递送。
在又另外的方面，本文还提供了使用本文所述的组合物的任一个来调节昆虫的适合度的方法。在一个情况下，调节昆虫宿主的适合度的方法包括向宿主递送如先前权利要求中任一项所述的组合物，其中该调节剂靶向寄宿于宿主中的一种或多种微生物，从而调节宿主的适合度。在另一个情况下，调节昆虫宿主中的微生物多样性的方法包括向宿主递送如先前权利要求中任一项所述的组合物，其中该调节剂靶向寄宿于宿主中的一种或多种微生物，从而调节宿主中的微生物多样性。
在上述方法的任一个的一些实施例中，该调节剂可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的水平。在上述方法的任一个的一些实施例中，该调节剂可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物的功能。在一些实施例中，该一种或多种微生物可以是细菌和/或真菌。在一些实施例中，该一种或多种微生物是宿主适合度所需的。在一些实施例中，该一种或多种微生物是宿主存活所需的。
在上述方法的任一个的一些实施例中，递送步骤可以包括以足以影响一种或多种微生物的剂量和时间来提供调节剂，从而调节宿主中的微生物多样性。在一些实施例中，该递送步骤包括将先前组合物的任一个局部施用至植物。在一些实施例中，该递送步骤包括通过基因工程化的植物来提供调节剂。在一些实施例中，该递送步骤包括将调节剂作为食物提供给宿主。在一些实施例中，该递送步骤包括提供携带调节剂的宿主。在一些实施例中，携带调节剂的宿主可以将调节剂传播给一种或多种另外的宿主。
在上述方法的任一个的一些实施例中，该组合物可以有效增加宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性。在一些实施例中，在递送调节剂之前，宿主对杀有害生物剂具有抗性。在一些实施例中，该杀有害生物剂是化感剂。在一些实施例中，该化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂(soyacystatin)N、单萜类、二萜酸、或酚类化合物。在一些实施例中，该组合物对于选择性地杀死宿主是有效的。在一些实施例中，该组合物对于降低宿主适合度是有效的。在一些实施例中，该组合物对于降低宿主中必需氨基酸和/或维生素的产量是有效的。
在上述方法的任一个的一些实施例中，该宿主是昆虫。在一些实施例中，该宿主是人病原体的媒介。在一些实施例中，该媒介是蚊子、蠓、虱子、白蛉、蜱、锥蝽臭虫、采采蝇、或跳蚤。在某些实施例中，该媒介是蚊子。在某些实施例中，该媒介是蜱。在某些实施例中，该媒介是螨。在某些实施例中，该媒介是虱子。
在一些实施例中，该人病原体是病毒、原生动物、细菌、原生生物、或线虫。在一些实施例中，该病毒是属于以下组的一种：披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、或Orbiviridae。在一些实施例中，该细菌是属于以下属的一种：耶尔森菌属(Yersinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、立克次体属(Rickettsia)、东方体属(Orientia)、或包柔氏螺旋体属(Borrelia)。在一些实施例中，该原生动物是属于以下属的一种：疟原虫属(Plasmodium)、锥体虫属(Trypanosoma)、利什曼原虫属(Leishmania)、或巴贝西虫属(Babesia)。在一些实施例中，该线虫是属于以下属的一种：布鲁格丝虫属(Brugia)。在一些实施例中，该组合物对于预防或降低病原体向人的传播是有效的。在一些实施例中，该组合物对于预防或降低宿主之间病原体的水平或垂直传播是有效的。在一些实施例中，该组合物对于降低宿主适合度、宿主发育、或媒介效能是有效的。
在另一个方面，本文还提供了筛选测定以鉴定调节宿主的适合度的调节剂。在一个情况下，鉴定调节宿主适合度的调节剂的筛选测定包括以下步骤：(a)将可以寄宿于宿主中的微生物暴露于一种或多种候选调节剂下，和(b)鉴定降低宿主适合度的调节剂。
在筛选测定的一些实施例中，该调节剂是寄宿于宿主中的微生物。在一些实施例中，该微生物是细菌。在一些实施例中，当寄宿于宿主中时，该细菌降低宿主适合度。在筛选测定的一些实施例中，该调节剂影响降解化感物质的微生物。在一些实施例中，该调节剂是噬菌体、抗生素、或测试化合物。在一些实施例中，该抗生素是特美汀或阿奇霉素。
在筛选测定的一些实施例中，该宿主可以是无脊椎动物。在一些实施例中，该无脊椎动物是昆虫。在一些实施例中，该昆虫是蚊子。在一些实施例中，该昆虫是蜱。在某些实施例中，该昆虫是螨。在某些实施例中，该昆虫是虱子。
在筛选测定的上述实施例的任一个中，宿主适合度可以通过调节宿主微生物区系来调节。
定义
如本文所用的，术语“细菌素”是指具有抗微生物特性的肽或多肽。天然存在的细菌素是由某些原核生物产生的，并且对抗与生产菌株相关的生物，但不针对生产菌株本身。本文所预期的细菌素包括但不限于天然存在的细菌素(如由细菌产生的细菌素)及其衍生物(如工程化的细菌素、重组表达的细菌素、以及化学合成的细菌素)。在一些情况下，该细菌素是本文所述的细菌素的功能活性变体。在一些情况下，该细菌素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的细菌素或天然存在的细菌素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
如本文所用的，术语“含菌细胞”是指在某些昆虫中发现的特化细胞，其中细胞内细菌具有共生细菌的特性。
如本文所用的，术语“有效量”是指足以影响以下所列举的结果的调节剂(例如，噬菌体、溶素、细菌素、小分子、或抗生素)或组合物(包括所述药剂)的量：例如，降低或减少宿主生物(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的适合度；达到靶宿主内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；达到靶宿主肠道内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；达到靶宿主含菌细胞内调节剂浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；调节靶宿主中一种或多种微生物(例如，内共生体)的水平或活性。
如本文所用的，术语“适合度”是指宿主生物存活和/或产生存活后代的能力。生物的适合度可以通过一个或多个参数来测量，包括但不限于寿限、繁殖速率、迁移、体重、以及代谢速率。适合度可以另外基于活性(例如，咬人动物或人)或疾病传播(例如，媒介-媒介传播或媒介-人传播)的测量值来测量。
如本文所用的，术语“肠”是指宿主肠的任何部分，包括宿主的前肠、中肠、或后肠。
如本文所用的，术语“宿主”是指携带寄宿微生物(例如，内源性微生物、内共生微生物(例如，原生或次生内共生体)、共生生物、和/或致病微生物)的生物(例如，昆虫，如蚊子、虱子、螨、或蜱)。
如本文所用的，“降低宿主适合度”或“减少宿主适合度”是指由于给予调节剂而对宿主生理学或所述宿主进行的任何活动的任何破坏，包括但不限于以下所希望作用的任何一种或多种：(1)使宿主的群体降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(2)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的繁殖速率降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(3)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的迁移降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(4)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的体重降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(5)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的代谢速率或活性增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(6)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的媒介-媒介病原体传播(例如，病原体从一种昆虫到另一种昆虫的垂直或水平传播)降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(7)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的媒介-人病原体传播降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(8)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的寿限降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；(9)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)对杀有害生物剂(例如，杀昆虫剂)的易感性增加约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多；或(10)使宿主(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的媒介效能降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、100％或更多。相比于没有被给予调节剂的宿主生物，可以确定宿主适合度的降低。
术语“昆虫”包括在任何发育阶段(即，未成熟昆虫和成虫昆虫)的属于节肢动物门以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物。
如本文所用的，“溶素”(也称为内溶素、自溶素、胞壁质水解酶、肽聚糖水解酶、或细胞壁水解酶)是指可以通过裂解细菌细胞壁中的肽聚糖来溶解细菌的水解酶。本文所预期的溶素包括但不限于天然存在的溶素(如由噬菌体产生的溶素、由细菌产生的溶素)及其衍生物(如工程化的溶素、重组表达的溶素、以及化学合成的溶素)。细菌素的功能活性变体可以例如在指定区域或整个序列上与包括任何本文所述的合成的、重组的或天然衍生的细菌素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
如本文所用的，术语“微生物”是指细菌或真菌。微生物可以是指寄宿于宿主生物(例如，内源性微生物、内共生微生物(例如，原生或次生内共生体))的微生物或者对宿主为外源的微生物，包括那些可充当调节剂的微生物。如本文所用的，术语“靶微生物”是指寄宿于宿主中的并且直接或间接地受调节剂影响的微生物。
如本文所用的，术语“药剂”或“调节剂”是指能够改变寄宿于宿主生物(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)中的微生物的水平和/或功能，从而调节(例如，降低)宿主生物(例如，昆虫，如蚊子、蜱、螨、虱子)的适合度的药剂。
如本文所用的，术语“杀有害生物剂(pesticide或pesticidal agent)”是指可用于控制农业有害生物、环境有害生物、或家养/家居有害生物，如昆虫、真菌、细菌、或病毒的物质。术语“杀有害生物剂”被理解为涵盖天然存在的或合成的杀昆虫剂(杀幼虫剂和杀成虫剂(adulticide)、昆虫生长调节剂、杀螨剂(杀螨药)、杀线虫剂、杀外寄生物药、杀细菌剂、杀真菌剂、或除草剂(可用于农业以控制或改变植物生长的物质)。杀有害生物剂(pesticide或pesticidal agent)的另外的实例列于表12中。在一些情况下，该杀有害生物剂是化感物质。如本文所用的，“化感物质”或“化感剂”是由生物产生的物质，该生物可以影响另一种生物(例如，宿主昆虫，例如蚊子)的生理功能(例如，萌发、生长、存活或繁殖)。
如本文所用的，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-或L-氨基酸)的任何链，无论长度(例如，至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)、或存在例如与肽共价连接的一个或多个非氨基酰基基团(例如，糖、脂质等)，并且包括例如天然蛋白、合成的或重组的多肽和肽、杂交分子、类肽或模拟肽。
如本文所用的，两个序列之间的“百分比同一性”通过BLAST 2.0算法(描述于Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]215：403-410)确定。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)公开获得。
如本文所用的，术语“细菌噬菌体”或“噬菌体”是指在细菌中感染和复制的病毒。细菌噬菌体在将它们的基因组注射进入细胞质后在细菌内进行复制，并使用导致细菌细胞溶解的裂解性周期或使细菌细胞保持完整的溶原性(非裂解性)周期进行复制。噬菌体可以是天然存在的噬菌体分离物，或工程化的噬菌体，包括媒介或编码部分噬菌体基因组(例如，包括在宿主细菌内进行噬菌体生命周期所必需的至少所有的必需基因)或完整噬菌体基因组的核酸。
如本文所用的，术语“植物”是指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子、以及它们的子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝、配子体、孢子体、花粉、以及小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织、以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚、以及愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。此外，植物可以被基因工程化以产生例如本文所述的方法或组合物中的调节剂的任一个的异源蛋白或RNA。
如本文所用的，术语“媒介”是指可以将人病原体从贮存器(reservoir)携带或传播给人的昆虫。示例性媒介包括昆虫，如具有刺吸式口器的那些昆虫，如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目以及双翅目(Diptera)中发现的昆虫，如蚊子、蜜蜂、黄蜂(wasp)、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚊，连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员。
从以下详细说明以及权利要求中，本发明的其他特征和优点将会是显而易见的。
附图说明
附图旨在说明本发明的一个或多个特征、方面或实施例，而非旨在进行限制。
图1A-1G显示了不同抗生素递送系统的图像。通过植物递送(图1A)、叶涂层递送(图1B)、显微注射递送(图1C)、局部递送(图1D)、叶灌注和切割递送(图1E)、叶灌注和通过植物递送(图1F)、以及喷洒植物和蚜虫两者以及通过植物递送的组合处理来递送(图1G)，用不同的治疗溶液处理第一龄LSR-1蚜虫。
图2A-2C显示了通过植物递送、用以下三种不同条件处理的第一龄LSR-1蚜虫中在利福平处理期间蚜虫发育的延迟：不含必需氨基酸的人工饲料(仅AD)，含有100μg/ml利福平但不含必需氨基酸的人工饲料(AD+Rif)，以及含有100μg/ml利福平和必需氨基酸的人工饲料(AD+Rif+EAA)。图2A是显示在每个发育阶段的活蚜虫百分比的一系列图(样品大小＝33只蚜虫/组)。图2B显示了来自每个在第12天进行的处理的代表性图像。比例尺2.5mm。图2C显示了来自蚜虫体的面积测量值，这些测量值显示了利福平处理的显著作用。将必需氨基酸添加回来可部分挽救发育缺陷。
图3显示了利福平处理导致蚜虫死亡。每天监测通过植物递送用不含必需氨基酸的人工饲料(仅AD)、含有100ug/ml利福平但不含必需氨基酸的人工饲料(AD+Rif)以及含有100ug/ml利福平和(AD+Rif+EAA)的人工饲料处理的LSR-1蚜虫的存活。括号中的数字代表每组中的蚜虫数量。通过对数秩检验确定统计学显著性，并确定以下统计学显著差异：仅AD对比AD+Rif，p＜0.0001；以及AD+Rif对比AD+Rif+EAA，p＝0.017。
图4是显示利福平处理导致蚜虫繁殖丧失的图。通过植物递送，用不含必需氨基酸的人工饲料(仅AD)、含有100ug/ml利福平但不含必需氨基酸的人工饲料(AD+Rif)以及含有100ug/ml利福平和(AD+Rif+EAA)的人工饲料处理第一龄LSR-1蚜虫，并测量蚜虫到达成虫期后每天产生的后代的数量。显示了蚜虫到达成虫期后每天产生的后代的平均数±S.D.。
图5是显示利福平处理消除内共生布赫纳氏菌(Buchnera)的图。在处理后7天确定不同条件下的共生体效价。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组3只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。使用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，随后通过图基事后检验法(Tukey’s Post-Test)确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图6A和6B显示了通过叶涂层递送的利福平处理延迟了蚜虫发育。通过用100μl的以下两种不同溶液涂覆叶来处理第一龄eNASCO蚜虫：溶剂对照(0.025％Silwet L-77)和50μg/ml利福平。图6A是显示随时间推移每种条件下的发育阶段的一系列图。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比(样品大小＝20只蚜虫/组)。图6B是显示来自蚜虫体的面积测量值的图，这些测量值显示了涂覆有利福平的叶对蚜虫大小的显著作用。使用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，随后通过图基事后检验法(Tukey’s Post-Test)确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图7显示了通过叶涂层递送的利福平处理导致蚜虫死亡。每天监测通过用100μl的以下两种不同溶液涂覆叶来处理的eNASCO蚜虫的存活：溶剂对照(Silwet L-77)和50μg/ml利福平。处理影响蚜虫的存活率。
图8显示了通过叶涂层递送的利福平处理消除内共生布赫纳氏菌。在处理后6天确定两种条件下的共生体效价。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。使用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，随后通过图基事后检验法(Tukey’s Post-Test)确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图9是显示通过显微注射的利福平处理消除内共生布赫纳氏菌的图。在指定条件下注射后4天确定共生体效价。对照样品是溶剂：前面描述的0.025％Silwet L-77。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。使用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，随后通过图基事后检验法(Tukey’s Post-Test)确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图10是显示通过局部处理递送的利福平处理消除内共生布赫纳氏菌的图。用以下喷雾后3天确定共生体效价：溶剂(silwet L-77)或在溶剂中稀释的利福平溶液。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。使用单因素方差分析(one-way-ANOVA)，随后通过图基事后检验法(Tukey’s Post-Test)确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图11显示了一组图，这些图证明将第1龄和第2龄LSR-1蚜虫放置在用水加食用色素或在水加食用色素中的50μg/ml利福平灌注的叶上。随时间推移测量每种条件下的发育阶段。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比(样品大小＝74-81只蚜虫/组)。
图12显示了证明第1龄和第2龄LSR-1蚜虫的存活的图，这些蚜虫被放置在用水加食用色素或在水加食用色素中的50μg/ml利福平灌注的叶上。括号中的数字代表每组中的蚜虫数量。通过对数秩检验确定统计学显著性。
图13显示了证明用水和食用色素、或利福平加水和食用色素灌注的叶在处理后8天确定的共生体效价的图。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。框中的数字指示实验组的中位数。
图14显示了一组图，这些图证明通过叶注射和通过植物用水加食用色素或水加食用色素中100μg/ml利福平处理的第1龄和第2龄LSR-1蚜虫。随时间推移测量每种条件下的发育阶段。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比(样品大小＝49-50只蚜虫/组)。
图15是证明第1龄和第2龄LSR-1蚜虫的存活的图，这些蚜虫被放置在用水加食用色素或在水加食用色素中的100μg/ml利福平灌注和处理的叶上。括号中的数字代表每组中的蚜虫数量。进行对数秩检验并确定组间没有统计学显著差异。
图16A和16B是显示在以用水和食用色素或利福平加水和食用色素灌注和处理的叶为食的蚜虫中，在处理后6天(16A)和8天(16B)确定的共生体效价的图。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。框中的数字指示实验组的中位数。
图17是一组图，这些图显示用对照溶液(水和Silwet L-77)或含有100μg/ml利福平处理的组合来处理第1龄和第2龄LSR-1蚜虫。随时间推移测量每种条件下的发育阶段。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比(样品大小＝76-80只蚜虫/组)。
图18是显示用含有利福平的处理组合的对照溶液来处理第1龄和第2龄LSR-1蚜虫的图。括号中的数字代表每组中的蚜虫数量。进行对数秩检验并确定组间没有统计学显著差异。
图19是显示用对照或利福平溶液处理后7天确定的共生体效价的图。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。框中的数字指示实验组的中位数。通过t检验确定统计学显著差异。
图20是显示壳聚糖递送系统的图像。如图所示，通过叶灌注递送和通过植物递送，用治疗溶液处理豌豆长管蚜(A.pisum)蚜虫。
图21是一组图，这些图显示壳聚糖处理导致蚜虫发育延迟。用对照溶液(水)和在水中的300ug/ml壳聚糖通过植物递送和叶灌注递送来处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在整个实验过程中监测发育阶段。显示了每个处理组在每个发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、或代表繁殖第5龄的5R)的蚜虫百分比。
图22是显示用壳聚糖处理后昆虫存活降低的图。通过植物递送和叶灌注递送，仅用水或壳聚糖溶液处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫，并且在实验过程中每天监测存活。括号中的数字代表处理组中的蚜虫总数。
图23是显示用壳聚糖处理减少了内共生布赫纳氏菌的图。用水或在水中的300ug/ml壳聚糖通过植物递送和叶灌注递送来处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在处理后8天，从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组6只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。每组的中位数值显示在框中。
图24是一组图，这些图显示用乳链菌肽处理导致蚜虫发育延迟。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或者1.6mg/ml或7mg/ml乳链菌肽处理第一龄和第二龄LSR-2豌豆长管蚜蚜虫，并且随时间推移测量发育。显示了在指定时间点的每个生命阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、或5R龄(繁殖第5龄))的蚜虫百分比。N＝56-59只蚜虫/组。
图25是显示用乳链菌肽处理后昆虫存活的剂量依赖性降低的图。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或者1.6mg/ml或7mg/ml乳链菌肽处理第一龄和第二龄LSR-1豌豆长管蚜蚜虫，并且随时间推移监测存活。括号中的数字指示每组中的蚜虫数量。通过对数秩(Mantel-Cox)检验确定统计学显著差异。
图26是显示用乳链菌肽处理减少了内共生布赫纳氏菌的图。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或1.6mg/ml乳链菌肽处理第一龄和第二龄LSR-1豌豆长管蚜蚜虫，并且在处理后第八天从选择的蚜虫中提取DNA并用于qPCR以确定布赫纳氏菌拷贝数。显示了每种处理的布赫纳氏菌/蚜虫的平均比率+/-SEM。每个实验组上方框中的数字指示该组的中位数值。每个数据点代表单个蚜虫。
图27是一组图，这些图显示用乙酰丙酸处理导致蚜虫发育延迟。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或者0.03％或0.3％乙酰丙酸处理第一龄和第二龄eNASCO豌豆长管蚜蚜虫，并且随时间推移测量发育。显示了在指定时间点的每个生命阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄和第5龄)的蚜虫百分比。N＝57-59只蚜虫/组。
图28是显示用乙酰丙酸处理后昆虫存活降低的图。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或者0.03％或0.3％乙酰丙酸处理第一龄和第二龄eNASCO豌豆长管蚜蚜虫，并且随时间推移监测存活。N＝57-59只蚜虫/组。通过对数秩(Mantel-Cox)检验确定统计学显著差异；**，p＜0.01。
图29是一组图，这些图显示用乙酰丙酸处理减少了内共生布赫纳氏菌。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或者0.03％或0.3％乙酰丙酸处理第一龄和第二龄eNASCO豌豆长管蚜蚜虫，并且在处理后第七天和第八天从选择的蚜虫中提取DNA并用于qPCR以确定布赫纳氏菌拷贝数。显示了每种处理的布赫纳氏菌/蚜虫的平均比率+/-SEM。通过单因素方差分析(One-Way ANOVA)与邓尼特多重比较检验(Dunnett’s MultipleComparison Test)确定统计学显著差异；*，p＜0.05。每个数据点代表单个蚜虫。
图30A和30B显示了证明棉酚处理导致蚜虫发育延迟的图。通过植物递送，用不含必需氨基酸的人工饲料(仅AD)和含有不同浓度的棉酚(0.05％，0.25％和0.5％)但不含必需氨基酸的人工饲料处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在整个实验过程中监测发育阶段。图30A是一系列图，这些图显示了每个处理组在每个发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、或代表繁殖第5龄的5R)的蚜虫平均数。在指定时间，对蚜虫进行成像，并使用Image J确定它们的大小。图30B是显示人工饲料处理的(对照)或棉酚处理的蚜虫的平均蚜虫面积±SD的图。使用单因素方差分析(One-WayANOVA)，随后通过图基事后检验法(Tukey’s post-test)确定统计学显著性。*，p＜0.05。**，p＜0.01。
图31是显示用化感物质棉酚处理后蚜虫存活的剂量依赖性降低的图。通过植物递送，用不含必需氨基酸的人工饲料(AD无EAA)，含有0.5％棉酚乙酸但不含必需氨基酸的人工饲料(0.5％棉酚)，含有0.25％棉酚乙酸但不含必需氨基酸的人工饲料(0.25％棉酚)，以及含有0.05％棉酚乙酸但不含必需氨基酸的人工饲料(0.05％棉酚)处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫，并且在实验过程中每天监测存活。括号中的数字代表每组中蚜虫的必需氨基酸数量。通过对数秩检验确定统计学显著差异，并且AD无EAA和0.5％棉酚具有显著差异，p＝0.0002。
图32A和32B是两张显示用0.25％棉酚处理导致繁殖力降低的图。通过植物递送，用不含必需氨基酸的人工饲料(AD5-2无EAA)，或含有0.25％棉酚乙酸但不含必需氨基酸的人工饲料(AD5-2无EAA+0.25％棉酚)处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫，并且在整个实验过程中确定繁殖力。图32A显示了测量蚜虫开始产生后代的平均天数±SD，以及棉酚处理延迟了后代的产生。图32B显示了测量在蚜虫成为繁殖成虫后产生的后代的平均数±SD，以及棉酚处理导致产生的后代数量降低。每个数据点代表一只蚜虫。
图33是显示用不同浓度的棉酚处理减少了内共生布赫纳氏菌的图。通过植物递送，用不含必需氨基酸的人工饲料(对照)或者含有0.5％、0.25％、或0.05％棉酚但不含必需氨基酸的人工饲料处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在处理后5天或13天从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组2-6只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。通过非配对t检验确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图34是显示棉酚的显微注射导致蚜虫中布赫纳氏菌水平降低的图。用20nl的不含必需氨基酸的人工饲料(AD)或含有0.05％棉酚但不含必需氨基酸的人工饲料(棉酚(0.05％))注射豌豆长管蚜LSR-1蚜虫＜第3龄期(蛹(nymphs))。注射后三天，从蚜虫中提取DNA并通过qPCR评估布赫纳氏菌水平。显示了布赫纳氏菌/蚜虫DNA的平均比率±SD。每个数据点代表一只蚜虫。
图35是一组图，这些图显示反式-肉桂醛处理导致蚜虫发育延迟。通过植物递送，用水和含有不同浓度的反式-肉桂醛(TC、0.05％、0.5％和5％)的水处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在整个实验过程中监测发育阶段。显示了每个处理组在每个发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、或代表繁殖第5龄的5R)的蚜虫平均数。N＝40-49只蚜虫/实验组。
图36是显示用天然抗微生物反式-肉桂醛处理后存活的剂量依赖性降低的图。通过植物递送，用水和含有不同浓度的反式-肉桂醛(TC、0.05％、0.5％和5％)的水处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在整个治疗过程中监测存活。通过对数秩检验确定统计学显著差异。N＝40-49只蚜虫/组。
图37是显示用不同浓度的反式-肉桂醛处理减少了内共生布赫纳氏菌的图。通过植物递送，用水和含有不同浓度的反式-肉桂醛(0.05％、0.5％和5％)的水处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。在处理后3天，从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组2-11只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。每个处理组的中位数显示在数据点上方的框中。通过非配对T检验确定统计学显著差异；*，p＜0.05。水对照和0.5％反式-肉桂醛组之间存在统计学显著差异。
图38是一组图，这些图显示用蝎肽Uy192处理导致蚜虫发育延迟。用对照溶液(水)和在水中的100ug/ml Uy192通过植物递送和叶灌注递送来处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫。a)在整个实验过程中监测发育阶段。显示了每个处理组在每个发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、或代表繁殖第5龄的5R)的蚜虫百分比。
图39是显示用蝎AMPUy192处理后昆虫存活降低的图。通过植物递送和叶灌注递送，仅用水或Uy192溶液处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫，并且在实验过程中每天监测存活。括号中的数字代表处理组中的蚜虫总数。
图40是显示用Uy192处理减少了内共生布赫纳氏菌的图。通过植物递送和叶灌注递送，用水或在水中的100ug/ml Uy192处理第一龄和第二龄豌豆长管蚜蚜虫，在处理后8天，从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组2-6只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。每组的中位数值显示在框中。
图41是显示用蝎肽D10和D3显微注射的蚜虫存活降低的图。用水(对照)或用100ng的蝎肽D3或D10显微注射LSR-1豌豆长管蚜蚜虫。注射后，将蚜虫释放到蚕豆叶上，并在整个实验过程中监测存活。括号中的数字指示每个实验处理组中的蚜虫数量。
图42是显示用蝎肽D3和D10注射后内共生体效价降低的图。用水(对照)或用100ng的蝎肽D3或D10显微注射LSR-1豌豆长管蚜蚜虫。注射后，将蚜虫释放到蚕豆叶上，并且在处理后5天，从剩余的活蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌与蚜虫DNA的比率。显示了每个处理组的平均值±SD。N＝2-9只蚜虫/组。每个处理组上方框中的数字代表数据集的中位数。
图43是显示用蝎AMP混合物处理后昆虫存活降低的图。通过叶灌注递送和通过植物递送，用蝎肽混合物(Uy17、D3、UyCt3和D10各自40μg/ml)处理第一龄和第二龄eNASCO蚜虫，并且在实验过程中监测存活。括号中的数字代表每个处理组中的蚜虫数量。
图44是一组图，这些图显示用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理导致蚜虫发育延迟。通过叶注射递送和通过植物递送，用水(对照)或100μg/ml Uy192+CPP+FAM处理第一龄LSR-2豌豆长管蚜蚜虫，并且随时间推移测量发育。显示了在指定时间点的每个生命阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、或5R龄(繁殖第5龄))的蚜虫百分比。N＝90只蚜虫/组。
图45是显示用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理蚜虫增加了死亡率的图。通过叶注射递送和通过植物递送，用水或在水中的100μg/ml UY192+CPP+FAM(肽)处理第一龄LSR-1豌豆长管蚜蚜虫。随时间推移监测存活。括号中的数字指示每组中的蚜虫数量。通过对数秩(Mantel-Cox)检验确定统计学显著差异，并且两个实验组之间存在显著差异(p＝0.0036)。
图46是显示用Uy192+CPP+FAM处理减少了内共生布赫纳氏菌的图。通过叶注射递送和通过植物递送，用水或在水中的100μg/ml Uy192+CPP+FAM(肽)处理第一龄LSR-1豌豆长管蚜蚜虫。在处理后五天从选择的蚜虫中提取DNA并用于qPCR以确定布赫纳氏菌拷贝数。显示了每种处理的布赫纳氏菌/蚜虫的平均比率+/-SEM。每个实验组上方框中的数字指示该组的中位数值。每个数据点代表单个蚜虫。通过学生T检验确定统计学显著差异；****，p＜0.0001。
图47是一组图像，这些图像显示Uy192+CPP+FAM渗透的含菌细胞膜。从蚜虫中切开含菌细胞，并与250ug/ml的Uy192+CPP+FAM肽一起孵育30分钟。在洗涤和成像时，可以在含菌细胞内观察到大量Uy192+CPP+FAM。
图48A和图48B是一组图，这些图显示泛醇处理延迟了蚜虫发育。通过植物递送，用以下三种不同条件处理第一龄和第二龄eNASCO蚜虫：不含必需氨基酸的人工饲料(AD无EAA)，含有10uM泛醇但不含必需氨基酸的人工饲料(10uM泛醇)，以及含有100uM泛醇但不含必需氨基酸的人工饲料(100uM泛醇)，含有100uM泛醇但不含必需氨基酸的人工饲料，以及含有10uM泛醇但不含必需氨基酸的人工饲料。图48A显示了随时间推移监测每种条件下的发育阶段。图48B显示了来自蚜虫体的相对面积测量值，这些测量值显示了泛醇处理的显著作用。
图49是显示用泛醇处理增加了蚜虫死亡率的图。每天监测通过植物递送用不含必需氨基酸的人工饲料或含有10或100uM泛醇但不含必需氨基酸的人工饲料处理的eNASCO蚜虫的存活。括号中的数字代表每组中的蚜虫数量。
图50A、50B和50C是一组图，这些图显示泛醇处理导致繁殖丧失。通过植物递送，用不含必需氨基酸的人工饲料或者含有10或100uM泛醇但不含必需氨基酸的人工饲料处理第一龄和第二龄eNASCO蚜虫。图50A显示了存活至成熟和繁殖的蚜虫的分数。图50B显示了每组中的蚜虫开始繁殖的平均天数。显示了蚜虫开始繁殖的平均天数±SD。图50C显示了蚜虫开始繁殖后每天产生的后代的平均数。显示了后代/天的平均数±SD。
图51是显示泛醇处理不影响内共生布赫纳氏菌的图。在处理后8天确定不同条件下的共生体效价。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组6只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。
图52是一组图，这些图显示通过植物递送的泛醇处理不影响蚜虫发育。通过用100μl的以下两种不同溶液涂覆叶来处理第一龄eNASCO蚜虫：溶剂对照(0.025％Silwet L-77)和10uM泛醇，并且随时间推移测量每种条件下的发育阶段。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比(样品大小＝20只蚜虫/组)。
图53是显示通过叶涂层递送的泛醇处理导致蚜虫死亡的图。每天监测通过用100μl的以下两种不同溶液涂覆叶来处理的eNASCO蚜虫的存活：溶剂对照(Silwet L-77)和10uM泛醇。处理影响蚜虫的存活率。样品大小＝20只蚜虫/组。对数秩(Mantel Cox)检验用于确定组间是否存在统计学显著差异，并鉴定两组之间存在显著差异(p＝0.0019)。
图54A和54B是一组图，这些图显示用氨基酸类似物的混合物处理延迟了蚜虫发育。通过叶灌注递送和通过植物递送，用水或在水中的氨基酸类似物的混合物(AA混合物)处理第一龄LSR-1蚜虫。图54A显示了随时间推移测量每种条件下的发育阶段。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比。图54B显示了来自蚜虫体的面积测量值，这些测量值显示了用氨基酸类似物混合物(AA混合物)处理的显著作用。使用学生T检验确定统计学显著差异；****，p＜0.0001。
图55是显示用氨基酸类似物的混合物处理消除了内共生布赫纳氏菌的图。在处理后6天确定不同条件下的共生体效价。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组19-20只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。每个数据点代表个体蚜虫。使用学生T检验确定统计学显著差异；*，p＜0.05。
图56A和56B是一组图，这些图显示用三种药剂的组合处理延迟了蚜虫发育。通过叶灌注递送和通过植物递送，用水或在水中的三种药剂的组合(Pep-Rif-壳聚糖)处理第一龄LSR-1蚜虫。图56A显示了随时间推移测量每种条件下的发育阶段。显示了在每个发育阶段的活蚜虫百分比。图56B显示了来自蚜虫体的面积测量值，这些测量值显示了用三种处理的组合(Pep-Rif-壳聚糖)处理的显著作用。使用学生T检验确定统计学显著差异；****，p＜0.0001。
图57是显示用肽、抗生素和天然抗微生物剂的组合处理增加了蚜虫死亡率的图。用水或三种处理的组合(Pep-Rif-壳聚糖)处理LSR-1蚜虫，并在处理后每天监测存活。
图58是显示用肽、抗生素和天然抗微生物剂的组合处理消除了内共生布赫纳氏菌的图。在处理后6天确定不同条件下的共生体效价。从蚜虫中提取DNA并进行qPCR以确定布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的比率。显示了每组20-21只蚜虫的布赫纳氏菌DNA与蚜虫DNA的平均比率±SD。每个数据点代表个体蚜虫。
图59A和59B是一组图像，这些图像显示环丙沙星涂覆和渗透的玉米籽粒。将玉米籽粒浸泡在水中(无抗生素)或在水中的指定浓度的环丙沙星中，并且测试全籽粒或籽粒以确定它们是否能抑制大肠杆菌(E.coli)DH5α的生长。图59A显示了在浸泡在无抗生素的水中的玉米籽粒存在下的细菌生长，以及图59B显示了当将已经浸泡在抗生素中的全籽粒或半籽粒放置于铺满大肠杆菌的板上时，细菌生长的抑制。
图60是显示用环丙沙星(250ug/ml或2.5mg/ml)处理成年玉米象(S.zeamais)象鼻虫或用水处理模拟的图。在处理18天后，从象鼻虫中分离基因组DNA，并通过qPCR确定米象属(Sitophilus)原生内共生体的量。显示了每个组的平均值±SEM。每个数据点代表一只象鼻虫。在数据集的上方列出了每组的中位数。
图61A和61B是显示用环丙沙星处理后的象鼻虫发育的图。图61A显示了从一个重复中去除成虫后25天切开的单个玉米籽粒，每个初始玉米籽粒用水(对照)或环丙沙星(250ug/ml或2.5mg/ml)浸泡/涂覆，并且检查幼虫、蛹或几乎完全发育的(成虫)象鼻虫的存在。显示了从每个处理组的籽粒中发现的每个生命阶段的百分比。在每个数据集上方指示了从每个处理组的籽粒中发现的后代的总数。图61B显示了从对照(水)和2.5mg/ml环丙沙星处理组的玉米籽粒中切开的后代分离的基因组DNA，并且进行qPCR以测量存在的米象属(Sitophilus)原生内共生体的量。显示了每个组的平均值±SD。通过非配对t检验确定统计学显著差异；***，p≤0.001。
图62A和62B是显示去除交配对后(处理后7天)，对模拟处理(水)的或者用250ug/ml或2.5mg/ml环丙沙星处理的玉米籽粒的两个剩余重复进行监测后代的出现的图。图62A显示了随时间推移每个处理组新出现的象鼻虫的平均数±SD。图62B显示了去除交配对后，在第43天每个处理组出现的象鼻虫的平均数±SEM。
图63是显示利福平和强力霉素处理导致螨死亡率的图。每天监测未经处理的棉红蜘蛛(two-spotted spider mites)以及用250μg/ml利福平和在0.025％Silwet L-77中的500μg/ml强力霉素处理的螨的存活。
图64是一组图，这些图显示了针对细菌呼吸的海马(Seahorse)通量测定的结果。如在方法中所述的，细菌生长至对数生长期并加载到海马(Seahorse)XFe96板中，用于氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)的时间测量。大约20分钟后将处理物注射入孔中，并监测细菌以检测生长变化。利福平＝100μg/mL；氯霉素＝25μg/mL；噬菌体(针对大肠杆菌为T7，以及针对黏质沙雷氏菌(S.marcescens)为ΦSmVL-C1)是在SM缓冲液中以1∶2或1∶100稀释的裂解物。每条线上的标记仅作为每条线对应的条件的指标提供，并不指示数据点。
图65是显示针对黏质沙雷氏菌的噬菌体降低了蝇(fly)死亡率的图。用黏质沙雷氏菌针刺的蝇都在一天内死亡，而用黏质沙雷氏菌和噬菌体针刺的相当大部分的蝇在处理后存活了五天。几乎所有未经处理的对照蝇无论如何都存活至实验结束。使用对数秩检验来比较统计学显著性的曲线，星号表示p＜0.0001。
具体实施方式
本文提供了有用于人健康(例如有用于改变寄宿于宿主昆虫(例如，节肢动物，例如昆虫，例如人病原体媒介，如蚊子、螨、虱子或蜱)中一种或多种微生物的水平、活性或代谢，该改变导致宿主的适合度降低)的方法和组合物。本发明的特征在于组合物，该组合物包括调节剂(例如，噬菌体、肽、小分子、抗生素、或其组合)，该调节剂能以对宿主不利的方式改变宿主的微生物区系。通过破坏微生物水平、微生物活性、微生物代谢或微生物多样性，本文所述的调节剂可用于降低多种昆虫的适合度，这些昆虫携带导致人疾病的媒介传播的病原体。
本文所述的方法和组合物部分基于本文提供的实例，这些实例说明了通过改变宿主内微生物的水平、活性或代谢，调节剂(例如抗生素(例如，土霉素、强力霉素、或其组合))如何能够用于靶向人病原体的昆虫媒介中的宿主中的共生微生物(例如，内共生体，例如，蚊子中内共生沃尔巴克氏体属(Wolbachia)或蜱中内共生立克次体属(Rickettsia))，以降低宿主的适合度。土霉素和强力霉素是此目的中有用的抗生素的代表性实例。在此基础上，本披露描述了使用改变寄宿于宿主(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、虱子或蜱)中的一种或多种微生物的水平、活性或代谢(该改变导致宿主适合度的降低)的药剂的多种不同方法。
I.宿主
i.昆虫
本文提供的方法和组合物可以与任何以下昆虫宿主一起使用，该昆虫宿主被认为是针对能够导致人疾病的病原体的媒介。
例如，该昆虫宿主可以包括但不限于：具有刺吸式口器的那些昆虫，如在半翅目和一些膜翅目以及双翅目中发现的昆虫，如蚊子、蜜蜂、黄蜂、蠓、虱子、采采蝇、跳蚤以及蚊，连同蛛形纲动物(如蜱和螨)的成员；以下的目、纲或科：蜱螨目(蜱和螨)，例如隐喙蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、硬蜱科(Ixodidae)、痒螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)的代表，以及花蜱属物种(Amblyomma spp.)、Anocenton属物种(Anocenton spp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、足螨属物种(Chorioptes spp.)、蠕形螨属物种(Demodexspp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、Denmanyssus属物种(Denmanyssus spp.)、血蜱属物种(Haemophysalis spp.)、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus属物种(Lynxacarus spp.)、中气门目属物种(Mesostigmata spp.)、耳螨属物种(Notoednes spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssusspp.)、残喙蜱属物种(Otobius spp.)、耳痒螨属物种(otodectes spp.)、肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、螨属物种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalusspp.)、疥螨科疥螨属物种(Sancoptes spp.)、或恙螨属物种(Trombicula spp.)的代表；虱目(Anoplura)(吸虱(sucking lice)和咬虱(biting lice))，例如牛虱属物种(Bovicolaspp.)、血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、禽羽虱属物种(Menopon spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、天疱疮属物种(Pemphigus spp.)、根瘤蚜属物种(Phylloxera spp.)、或管虱属物种(Solenopotes spp.)的代表；双翅目(Diptera)(蝇)，例如伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、Cw/ex属物种(Cw/ex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、血蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、牛皮蝇属物种(Hypodermaspp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、角蝇属物种(Lyperosia spp.)、蜱蝇属物种(Melophagus spp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、绿蝇属物种(Phaenicia spp.)、白蛉属物种(Phlebotomus spp.)、伏蝇属物种(Phormia spp.)、壁虱(Acari)(犬疥螨(sarcopticmange)，例如、疥螨科属物种(Sarcoptidae spp.)、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、螫蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻属物种(Tabanus spp.)、螗蜩属物种(Tannia spp.)、或Zzpu/alpha属物种(Zzpu/alpha spp.)的代表；食毛目(Mallophaga)(咬虱，例如，Damalina属物种(Damalina spp.)、猫羽虱属物种(Felicola spp.)、袋鼠虱属物种(Heterodoxus spp.)、或毛虱属物种(Trichodectes spp.)的代表；或者蚤目(Siphonaptera)(无翅昆虫)，例如，角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、客蚤属物种(Xenopsylla spp)的代表；臭虫科(Cimicidae)(椿象)，例如，臭虫属物种(Cimex spp.)、Tritominae属物种(Tritominae spp.)、Rhodinius属物种(Rhodinius spp.)、或锥蝽属物种(Triatoma spp.)的代表。
在一些情况下，该昆虫是来自双翅目(例如，长角亚目(Nematocera)，例如，Colicidae科)的吸血昆虫(blood-sucking insect)。在一些情况下，该昆虫来自蚊亚科(Culicinae)、短咀蚊亚科(Corethrinae)、蠓科(Ceratopogonidae)、或蚋科(Simuliidae)。在一些情况下，该昆虫属于库蚊属物种(Culex spp.)、赛保蚊属物种(Theobaldia spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、伊蚊属物种(Aedes spp.)、Forciponiyia属物种(Forciponiyia spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、或Helea属物种(Helea spp.)。
在某些情况下，该昆虫是蚊子。在某些情况下，该昆虫是蜱。在某些情况下，该昆虫是螨。在某些情况下，该昆虫是咬虱(biting louse)。
ii.宿主适合度
本文提供的方法和组合物可用于降低本文所述的任何宿主的适合度。适合度的降低可能是由于寄宿于宿主中的微生物的任何改变，其中这些改变是给予调节剂的结果并且对宿主具有不利的作用。
在一些情况下，由于给予调节剂，宿主适合度的降低可表现为宿主生理学的恶化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，生物的适合度可通过一种或多种参数来测量，这些参数包括但不限于相比于没有被给予调节剂的宿主生物的繁殖速率、寿限、迁移、繁殖力、体重、代谢速率或活动、或存活。例如，本文提供的方法或组合物可有效降低宿主的总体健康或降低宿主的总体存活。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，宿主的降低的存活是约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，方法和组合物有效降低了宿主繁殖(例如，繁殖速率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，方法和组合物有效使其他的生理参数(如迁移、体重、寿限、繁殖力、或代谢速率)降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，宿主适合度降低可表现为在宿主中一种或多种营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)产量的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主中的营养物(例如，维生素、碳水化合物类、氨基酸、或多肽)的产量降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过降低由宿主中的一种或多种微生物(例如，内共生体)产生的营养物的产量来降低宿主中的营养物。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的降低可表现为宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性的提高和/或宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性提高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。该杀有害生物剂可以是本领域已知的任何杀有害生物剂，包括杀昆虫剂。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可通过降低宿主将杀有害生物剂代谢或降解为可用底物的能力来提高宿主对杀有害生物剂(例如，表12中列出的杀有害生物剂)的敏感性。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度的降低可表现为宿主对化感剂的敏感性的提高和/或宿主对化感剂的抗性的降低。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对化感剂的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。在一些情况下，该化感剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N、单萜类、二萜酸、或酚类化合物。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可通过降低宿主将化感剂代谢或降解为可用底物的能力来提高宿主对化感剂的敏感性。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文提供的方法或组合物可有效降低宿主对寄生虫或病原体(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体，或者寄生虫)的抗性。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受调节剂的宿主中找到的水平)，本文提供的方法或组合物可有效使宿主对病原体或寄生虫(例如，真菌病原体、细菌病原体或病毒病原体；或者寄生螨)的抗性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或大于100％。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，宿主适合度降低可表现为其他适合度的不足，如对某些环境因素(例如，高温或低温耐受性)的降低的耐受性、在某些生境中降低的存活能力、或降低的维持某种饲料的能力。在一些情况下，本文提供的方法或组合物可以本文所述的任何多种方式有效降低宿主适合度。此外，该调节剂可在任何数量的宿主纲、目、科、属、或物种(例如，1个宿主物种、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、200个、250个、500个、或更多个宿主物种)中降低宿主适合度。在一些情况下，该调节剂作用于单一宿主纲、目、科、属、或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估宿主适合度。在一些情况下，可以通过评估个体宿主来评估宿主适合度。可替代地，可以通过评估宿主群体来评估宿主适合度。例如，宿主适合度降低可表现为与其他昆虫的成功竞争的降低，从而导致宿主群体的规模的减小。
iii.疾病传播中的宿主昆虫
通过降低携带人病原体的宿主昆虫的适合度，本文提供的调节剂有效减少传播媒介传播的疾病。可以使用本文所述的任何配制品和递送方法，以有效减少疾病传播(例如减少媒介之间的垂直或水平传播和/或减少向人的传播)的量和持续时间，将调节剂递送至昆虫。例如，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文所述的调节剂可使媒介传播的病原体的垂直或水平传播减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。作为另一个实例，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，本文所述的调节剂可使昆虫媒介的媒介效能减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或更多。
可通过本文提供的组合物和方法控制的疾病的非限制性实例包括：由披膜病毒科(Togaviridae)病毒(例如，基孔肯雅病、罗斯河热(Ross River fever)、马亚罗病毒、奥绒绒热(Onyon-nyong fever)、辛德毕斯热(Sindbis fever)、东部脑脊髓炎、西方马脑脊髓炎(Wesetern equine encephalomyelitis)、委内瑞拉马脑脊髓炎(Venezualan equineencephalomyelitis)、或巴尔马森林病毒(Barmah forest))引起的疾病；由黄病毒科病毒(例如，登革热、黄热病、凯萨努森林病、鄂木斯克出血热、日本脑炎、墨累山谷脑炎、罗氏(Rocio)、圣路易脑炎(St.Louis encephalitis)、西尼罗河脑炎(West Nileencephalitis)、或蜱传播的脑炎)引起的疾病；由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)病毒(例如，白蛉热(Sandly fever)、裂谷热、拉克罗斯脑炎(La Crosse encephalitis)、加州脑炎(California encephalitis)、克里米亚-刚果出血热、或奥罗普切热(Oropouche fever))引起的疾病；由弹状病毒科(Rhabdoviridae)病毒(例如，水泡性口炎)引起的疾病；由Orbiviridae(例如，蓝舌病(Bluetongue))引起的疾病；由细菌(例如，鼠疫、土拉菌病、Q热(Q fever)、落基山斑疹热(Rocky Mountain spotted fever)、鼠型斑疹伤寒、南欧斑疹热(Boutonneuse fever)、昆士兰壁虱斑疹伤寒(Queensland tick typhus)、西伯利亚斑疹伤寒(Siberian tick typhus)、恙虫病、回归热(Relapsing fever)、或莱姆病)引起的疾病；或由原生动物(例如，疟疾、非洲锥虫病、那加那病、查加斯病、利什曼病、梨浆虫病、班氏丝虫病(Bancroftian filariasis)、或布鲁格丝虫病(Brugian filariasis))引起的疾病。
II.靶微生物
本文所述的调节剂靶向的微生物可以包括寄宿于宿主体内或体表的任何微生物，包括但不限于本文所述的任何细菌和/或真菌。寄宿于宿主中的微生物可以包括，例如，共生微生物(例如，为宿主提供有益的营养物或酶的内共生微生物)、共生微生物、致病微生物、或寄生微生物。内共生微生物可以是原生内共生体或次生内共生体。共生微生物(例如，细菌或真菌)可以是宿主的专性共生体或宿主的兼性共生体。寄宿于宿主中的微生物可以通过任何传播方式获得，包括垂直传播、水平传播或多个传播源。
i.细菌
根据本文提供的方法和组合物可靶向的示例性细菌包括但不限于：致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp)、发光杆菌属物种(Photorhabdus spp)、暂定属物种(Candidatusspp)、布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientiaspp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcus spp)、沃廉菌属物种(Wolinellaspp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcusspp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonella spp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillusspp)、肠球菌属物种(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenes spp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、以及埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。可通过本文提供的方法和组合物靶向的细菌的非限制性实例显示于表1中。在一些情况下，调节剂靶向的细菌的16S rRNA序列与表1中列出的序列具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、99.9％、或100％同一性。
表1：靶细菌和宿主昆虫的实例
Figure BDA0002140147320000411
Figure BDA0002140147320000421
Figure BDA0002140147320000431
Figure BDA0002140147320000441
Figure BDA0002140147320000451
Figure BDA0002140147320000461
Figure BDA0002140147320000471
Figure BDA0002140147320000481
Figure BDA0002140147320000491
Figure BDA0002140147320000501
Figure BDA0002140147320000511
Figure BDA0002140147320000521
Figure BDA0002140147320000531
Figure BDA0002140147320000541
Figure BDA0002140147320000551
Figure BDA0002140147320000561
Figure BDA0002140147320000571
Figure BDA0002140147320000581
Figure BDA0002140147320000591
Figure BDA0002140147320000601
Figure BDA0002140147320000611
Figure BDA0002140147320000621
Figure BDA0002140147320000631
Figure BDA0002140147320000641
Figure BDA0002140147320000651
Figure BDA0002140147320000661
Figure BDA0002140147320000671
Figure BDA0002140147320000681
Figure BDA0002140147320000691
Figure BDA0002140147320000701
Figure BDA0002140147320000711
Figure BDA0002140147320000721
Figure BDA0002140147320000731
Figure BDA0002140147320000741
Figure BDA0002140147320000751
Figure BDA0002140147320000761
Figure BDA0002140147320000771
Figure BDA0002140147320000781
Figure BDA0002140147320000791
Figure BDA0002140147320000801
Figure BDA0002140147320000811
Figure BDA0002140147320000821
Figure BDA0002140147320000831
Figure BDA0002140147320000841
Figure BDA0002140147320000851
Figure BDA0002140147320000861
Figure BDA0002140147320000871
Figure BDA0002140147320000881
Figure BDA0002140147320000891
Figure BDA0002140147320000901
例如，蚊子(例如，伊蚊属物种(Aedes aegypt)或按蚊属物种(Anopheles spp.))包含共生细菌，这些共生细菌调节蚊子的免疫应答并影响对病原体的媒介效能。本文所述的调节剂可以有用于靶向寄宿于蚊子中的细菌，包括但不限于：EspZ、沙雷氏菌属物种(Serratia spp)(例如，黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、Enterbacterioaceae属物种(Enterbacterioaceae spp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)(例如，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii))、变形杆菌属物种(Proteus spp.)、不动杆菌属物种(Acinetobacter spp.)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp.)(Wigglesworthia gloosinidia)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas spp.)(例如，嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia))、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、霍氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae))、埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp.)(例如，大肠杆菌(Escherchia coli))、西地西菌属物种(Cedecea spp.)(例如，拉氏西地西菌(Cedecealapagei))、爱文氏菌属物种(Ewingella spp.)(例如，美洲爱文氏菌(Ewingellaamericana))、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)(例如，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus))、丛毛单胞菌属物种(Comamonas spp.)、或漫游球菌属物种(Vagococcus spp.)(例如，Vagococcus salmoninarium)、或沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp.)(例如，沃尔巴克氏体-wMel、沃尔巴克氏体-wAlbB、沃尔巴克氏体-wMelPop、沃尔巴克氏体-wMelPop-CLA)。
本文所述的组合物或方法可以靶向任何数量的细菌物种。例如，在一些情况下，该调节剂可以靶向单一细菌物种。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、或更多种不同的细菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向约1至约5、约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200、约200至约500、约10至约50、约5至约20、或约10至约100种不同的细菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多种细菌的门、纲、目、科或属中的任一者。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种细菌(例如，致病细菌、产生毒素的细菌)的群体增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种细菌(例如，共生细菌、降解杀有害生物剂的细菌，例如降解表12中列出的杀有害生物剂的细菌)的群体减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以根除宿主中的细菌(例如，共生细菌(降解杀有害生物剂的细菌))的群体。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中一种或多种致病细菌的水平提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者和/或使宿主中一种或多种共生细菌的水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
在一些情况下，该调节剂可以改变宿主的细菌多样性和/或细菌组成。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中的细菌多样性相对于起始多样性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，调节剂可使宿主中的细菌多样性相对于起始多样性减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
在一些情况下，该调节剂可以改变一种或多种细菌细胞的功能、活性、生长、和/或分化。例如，该调节剂可以改变细菌中一种或多种基因的表达。在一些情况下，该调节剂可以改变细菌中一种或多种蛋白质的功能。在一些情况下，该调节剂可以改变细菌中一种或多种细胞结构(例如，细胞壁、外膜或内膜)的功能。在一些情况下，该调节剂可以杀死(例如，裂解)细菌。
靶细菌可以寄宿于昆虫的一个或多个部分中。此外，靶细菌可以是细胞内或细胞外的。在一些情况下，细菌可以寄宿于宿主肠内或肠表的一个或多个部分中，该肠包括例如，前肠、中肠和/或后肠。在一些情况下，细菌作为细胞内细菌寄宿于宿主昆虫的细胞内。在一些情况下，细菌寄宿于宿主昆虫的含菌细胞。
可以通过本领域已知的任何方法(如微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、流式细胞术、荧光显微镜法、透射电子显微术、荧光原位杂交技术(例如FISH)、分光光度计法、基质辅助激光解析电离-质谱法(MALDI-MS)、以及DNA测序)确定宿主中细菌的群体的改变。在一些情况下，对用调节剂处理的宿主样品进行测序(例如，通过16S rRNA或rDNA的宏基因组测序)以确定在递送或给予调节剂后宿主的微生物组。在一些情况下，还对未接受调节剂的宿主样品进行测序以提供参考。
ii.真菌
根据本文提供的方法和组合物可靶向的示例性真菌包括但不限于：Amylostereumareolatum、香柱菌属物种(Epichloe spp)、松果毕赤酵母(Pichia pinus)、荚膜汉逊酵母(Hansenula capsulate)、Daldinia decipien、长喙壳属属物种(Ceratocystis spp)、长喙壳菌属物种(Ophiostoma spp)、以及Attamyces bromatificus。昆虫中发现的酵母和酵母样共生体的非限制性实例包括假丝酵母属(Candida)、梅奇酵母属(Metschnikowia)、德巴利酵母属(Debaromyces)、休哈塔假丝酵母(Scheffersomyces shehatae)和树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipites)、Starmerella、毕赤酵母属(Pichia)、毛孢子菌属(Trichosporon)、隐球菌属(Cryptococcus)、南极假丝酵母属(Pseudozyma)，以及来自盘菌亚门(subphylum Pezizomycotina)的酵母样共生体(例如，Symbiotaphrina bucneri和Symbiotaphrina kochii)。本文的方法和组合物可靶向的酵母的非限制性实例列于表2中。
表2
Figure BDA0002140147320000941
Figure BDA0002140147320000951
Figure BDA0002140147320000961
Figure BDA0002140147320000971
Figure BDA0002140147320000981
Figure BDA0002140147320000991
Figure BDA0002140147320001001
Figure BDA0002140147320001011
Figure BDA0002140147320001021
本文所述的组合物或方法可以靶向任何数量的真菌物种。例如，在一些情况下，该调节剂可以靶向单一真菌物种。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、500、或更多种不同的真菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向约1至约5、约5至约10、约10至约20、约20至约50、约50至约100、约100至约200、约200至约500、约10至约50、约5至约20、或约10至约100种不同的真菌物种中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以靶向至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、或更多种真菌的门、纲、目、科或属中的任一者。
在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种真菌(例如，致病真菌或寄生真菌)的群体增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种真菌(例如，共生真菌)的群体减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，该调节剂可以根除宿主中的真菌(例如，共生真菌)的群体。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中一种或多种共生真菌的水平提高至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者和/或可使宿主中一种或多种共生真菌的水平降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
在一些情况下，该调节剂可以改变宿主的真菌多样性和/或真菌组成。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中的真菌多样性相对于起始多样性增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。在一些情况下，相比于没有被给予调节剂的宿主生物，该调节剂可使宿主中的真菌多样性相对于起始多样性减少至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多中的任一者。
在一些情况下，该调节剂可以改变一种或多种真菌的功能、活性、生长、和/或分化。例如，该调节剂可以改变真菌中一种或多种基因的表达。在一些情况下，该调节剂可以改变真菌中一种或多种蛋白质的功能。在一些情况下，该调节剂可以改变真菌中一种或多种细胞组分的功能。在一些情况下，该调节剂可以杀死真菌。
此外，靶真菌可以寄宿于昆虫的一个或多个部分中。在一些情况下，真菌可以寄宿于昆虫肠内或肠表的一个或多个部分中，该肠包括例如，前肠、中肠和/或后肠。在一些情况下，真菌在细胞外生活在宿主的血淋巴、脂肪体或在特化结构中。
可以通过本领域已知的任何方法(如微阵列、聚合酶链式反应(PCR)、实时PCR、流式细胞术、荧光显微镜法、透射电子显微术、荧光原位杂交技术(例如FISH)、分光光度计法、基质辅助激光解析电离-质谱法(MALDI-MS)、以及DNA测序)确定宿主中真菌的群体的改变。在一些情况下，对用调节剂处理的宿主样品进行测序(例如，通过宏基因组测序)以确定在递送或给予调节剂后宿主的微生物组。在一些情况下，还对未接受调节剂的宿主样品进行测序以提供参考。
III.调节剂
本文提供的方法和组合物的调节剂可以包括噬菌体、多肽、小分子、抗生素、次生代谢物、细菌、真菌、或其任何组合。
i.噬菌体
本文所述的调节剂可以包括噬菌体(例如，裂解性噬菌体或非裂解性噬菌体)。在一些情况下，本文所述的任何噬菌体的有效浓度可以改变寄宿于本文所述的宿主(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、咬虱、或蜱)中一种或多种微生物(如本文所述)的水平、活性或代谢，该调节导致宿主的适合度降低(例如，如本文概述的)。在一些情况下，该调节剂包括选自以下目的至少一种噬菌体：复层病毒科(Tectiviridae)、肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、有尾噬菌体目(Caudovirales)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、或线状病毒目(Ligamenvirales)。在一些情况下，该组合物包括选自以下科的至少一种噬菌体：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、Ampullaviridae、Bicaudaviridae、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Gluboloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、和复层病毒科(Tectiviridae)。在本方法和组合物中有用的噬菌体的另外的非限制性实例列于表3中。
表3：噬菌体和靶细菌的实例
Figure BDA0002140147320001051
Figure BDA0002140147320001061
在一些情况下，调节剂包括裂解性噬菌体。因此，在将裂解性噬菌体递送至寄宿于宿主的细菌细胞后，该噬菌体引起靶细菌细胞中的裂解。在一些情况下，该裂解性噬菌体靶向并杀死寄宿于宿主昆虫的细菌以降低宿主的适合度。可替代地或另外地，该调节剂的噬菌体可以是非裂解性噬菌体(也称为溶原性噬菌体或温和噬菌体)。因此，在将非裂解性噬菌体递送至寄宿于宿主的细菌细胞后，该细菌细胞可保持存活并能够稳定地维持噬菌体基因组中编码的基因的表达。在一些情况下，非裂解性噬菌体用于改变寄宿于宿主昆虫中细菌中的基因表达以降低宿主的适合度。在一些情况下，该调节剂包括裂解性噬菌体和非裂解性噬菌体的混合物。
在某些情况下，该噬菌体是天然存在的噬菌体。例如，天然存在的噬菌体可以分离自含有不同噬菌体的混合物的环境样品。可以使用本领域已知的方法分离天然存在的噬菌体，以分离、纯化和鉴定靶向特定微生物(例如昆虫宿主中的细菌内共生体)的噬菌体。可替代地，在某些情况下，该噬菌体可以是基于天然存在的噬菌体工程化的。
本文所述的调节剂可包括具有窄的或宽的细菌靶范围的噬菌体。在一些情况下，该噬菌体具有窄的细菌靶范围。在一些情况下，该噬菌体是具有大的细菌靶范围的混杂的噬菌体。例如，该混杂的噬菌体可以靶向寄宿于宿主的至少约5、10、20、30、40、50、或更多中的任一者的细菌。具有窄细菌靶范围的噬菌体可靶向宿主中的特异性细菌菌株，而不影响该宿主中另一种细菌，例如非靶向的细菌。例如，该噬菌体可以靶向不超过寄宿于宿主的约50、40、30、20、10、8、6、4、2、或1中的任一者的细菌。例如，本文所述的噬菌体可以有用于靶向一种或多种寄宿于蚊子中的细菌，包括但不限于：EspZ、沙雷氏菌属物种(Serratia spp)(例如，黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、Enterbacterioaceae属物种(Enterbacterioaceae spp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)(例如，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、路德维希肠杆菌(Enterobacter ludwigii))、变形杆菌属物种(Proteus spp.)、不动杆菌属物种(Acinetobacter spp.)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp.)(Wigglesworthia gloosinidia)、黄单胞菌属物种(Xanthomonas spp.)(例如，嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia))、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、霍氏假单胞菌(Pseudomonas rhodesiae))、埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp.)(例如，大肠杆菌(Escherchia coli))、西地西菌属物种(Cedecea spp.)(例如，拉氏西地西菌(Cedecealapagei))、爱文氏菌属物种(Ewingella spp.)(例如，美洲爱文氏菌(Ewingellaamericana))、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp.)(例如，短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus))、丛毛单胞菌属物种(Comamonas spp.)、或漫游球菌属物种(Vagococcus spp.)(例如，Vagococcus salmoninarium)、或沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp.)(例如，沃尔巴克氏体-wMel、沃尔巴克氏体-wAlbB、沃尔巴克氏体-wMelPop、沃尔巴克氏体-wMelPop-CLA)。
本文所述的组合物可以包括任何数量的噬菌体，如至少约1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100或更多个噬菌体中的任一者。在一些情况下，该组合物包括来自一个或多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多种噬菌体)科，一个或多个目(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、或多种噬菌体)，或一个或多个物种(例如，1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或多种噬菌体)的噬菌体。包括一种或多种噬菌体的组合物在本文中也称为“噬菌体混合物”。噬菌体混合物是有用的，因为它们允许靶向更广泛的细菌的宿主范围。此外，它们允许每种细菌菌株(即亚种)被多个正交噬菌体靶向，从而防止或显著延迟抗性的发作。在一些情况下，混合物包括靶向一种细菌物种的多种噬菌体。在一些情况下，混合物包括靶向多种细菌物种的多种噬菌体。在一些情况下，单噬菌体“混合物”包括靶向物种内的许多菌株的单个混杂的噬菌体(即具有大宿主范围的噬菌体)。
本文所述的调节剂中噬菌体的合适浓度取决于如功效、存活率、噬菌体的可传递性、组合物中不同噬菌体的数量和/或溶素类型、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，噬菌体是处于液体或固体配制品的形式。在一些情况下，本文所述的组合物的任一个中每种噬菌体的浓度为至少约102、103、104、105、106、107、108、109、1010或更多pfu/ml中的任一者。在一些情况下，本文所述的组合物的任一个中每种噬菌体的浓度为不超过约102、103、104、105、106、107、108、109pfu/ml中的任一者。在一些情况下，组合物中每种噬菌体的浓度为约102至约103、约103至约104、约104至约105、约105至约106、约107至约108、约108至约109、约102至约104、约104至约106、约106至约109、或约103至约108pfu/ml中的任一者。在一些情况下，其中组合物包括至少两种类型的噬菌体，每种类型的噬菌体的浓度可以相同或不同。例如，在一些情况下，混合物中一种噬菌体的浓度为约108pfu/ml，并且混合物中第二噬菌体的浓度为约106pfu/ml。
包括如本文所述的噬菌体的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内噬菌体浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内噬菌体浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内噬菌体浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
如实例5-7和28所示，噬菌体(例如，一种或多种天然存在的噬菌体)可用作靶向昆虫宿主中的内共生细菌以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。
ii.多肽
许多种多肽(例如，细菌素、R型细菌素、根瘤富含半胱氨酸肽、抗微生物肽、溶素、或含菌细胞调节肽)可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，本文所述的任何肽或多肽的有效浓度可以改变寄宿于宿主(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、咬虱、或蜱)中一种或多种微生物(如本文所述的，例如，沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp.)或立克次体属物种(Rickettsia spp.)的水平、活性或代谢，该调节导致宿主的适合度降低(例如，如本文概述的)。本文包括的多肽可以包括天然存在的多肽或重组产生的变体。例如，该多肽可以是本文所述的任何多肽的功能活性变体，例如在指定区域或整个序列上与本文所述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
包括如本文所述的多肽的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
下文讨论的多肽调节剂，即细菌素、溶素、抗微生物肽、根瘤富含半胱氨酸肽和含菌细胞调节肽，可用于改变靶微生物(例如，立克次体属(Rickettsia)或沃尔巴克氏体属(Wolbachia))的水平、活性或代谢，如在用于降低宿主昆虫(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、咬虱、或蜱)的适合度的部分所指示的。
(a)细菌素
本文所述的调节剂可以包括细菌素。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌天然产生的，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、芽孢杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、或乳酸菌(LAB，如乳酸乳球菌(Lactococcuslactis))。在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌天然产生的，例如蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytoca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)、Serratia plymithicum、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、软腐欧氏杆菌(Erwinia carotovora)、青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、或大肠杆菌(Escherichia coli)。示例性细菌素包括但不限于I-IV类LAB抗生素(例如羊毛硫抗生素)、大肠杆菌素、小菌素(microcin)和脓菌素。细菌素的非限制性实例列于表4中。
表4：细菌素的实例
Figure BDA0002140147320001111
Figure BDA0002140147320001121
Figure BDA0002140147320001131
Figure BDA0002140147320001141
在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阴性细菌产生的大肠杆菌素、脓菌素、或小菌素(microcin)。在一些情况下，该细菌素是大肠杆菌素。大肠杆菌素可以是A组大肠杆菌素(例如，使用Tol系统以渗透靶细菌的外膜)或B组大肠杆菌素(例如，使用Ton系统以渗透靶细菌的外膜)。在一些情况下，该细菌素是小菌素(microcin)。小菌素(microcin)可以是I类小菌素(microcin)(例如，＜5kDa，具有翻译后修饰)或II类小菌素(microcin)(例如，5-10kDa，具有或不具有翻译后修饰)。在一些情况下，II类小菌素(microcin)是IIa类小菌素(microcin)(例如，需要多于一个基因以合成和组装功能肽)或IIb类小菌素(microcin)(例如，在C-末端具有或不具有翻译后修饰的线性肽)。在一些情况下，该细菌素是脓菌素。在一些情况下，该脓菌素是R-脓菌素、F-脓菌素、或S-脓菌素。
在一些情况下，该细菌素是由革兰氏阳性细菌产生的I类、II类、III类、或IV类、细菌素。在一些情况下，该调节剂包括I类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的含有羊毛硫氨酸的抗生素(羊毛硫抗生素))。I类细菌素或羊毛硫抗生素可以是低分子量肽(例如，小于约5kDa)并且可以具有翻译后修饰的氨基酸残基(例如，羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸、或脱水氨基酸)。
在一些情况下，该细菌素是II类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的非羊毛硫抗生素)。许多是带正电荷的不含羊毛硫氨酸的肽，这些肽(与羊毛硫抗生素不同)不进行广泛的翻译后修饰。II类细菌素可以属于以下子类之一：“片球菌素(pediocin)样”细菌素(例如，片球菌素(pediocin)PA-1和肉食杆菌素(carnobacteriocin)X(IIa类))；双肽细菌素(例如，乳酸菌素F和ABP-118(IIb类))；环形细菌素(例如，环状细菌素(Carnocyclin)A和肠道菌素AS-48(IIc类))；或未修饰的、线性的、非片球菌素(pediocin)样细菌素(例如，表皮菌素(epidermicin)NI01和乳球菌素A(IId类))。
在一些情况下，该细菌素是III类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的)。III类细菌素可以具有大于10kDa的分子量并且可以是热不稳定的蛋白质。III类细菌素可以进一步细分为IIIA组细菌素和IIIB组细菌素。IIIA组细菌素包括溶菌酶，其通过细胞壁的裂解来杀死敏感菌株，例如Enterolisin A。IIIB组细菌素包括非裂解性蛋白质，例如Caseicin80、Helveticin J和乳酸菌素B。
在一些情况下，该细菌素是IV类细菌素(例如，由革兰氏阳性细菌产生的)。IV类细菌素是一组复合物蛋白，与其他脂质或碳水化合物部分相关，似乎是活性所需的。它们是相对疏水且热稳定的。IV类细菌素的实例leuconocin S、乳酸菌素27、和乳酸菌素S。
在一些情况下，该细菌素是R型细菌素。R型细菌素是收缩性杀菌蛋白复合物。一些R型细菌素具有收缩性的噬菌体尾样结构。噬菌体尾丝蛋白的C-末端区域决定靶结合特异性。它们可以通过受体结合蛋白(例如尾丝)附着于靶细胞。附着之后是鞘收缩以及通过靶细菌的包膜插入核心。核心穿透导致细胞膜电位的快速去极化并促使细胞死亡。与单一R型细菌素颗粒接触可导致细胞死亡。例如，R型细菌素可以是不耐热的、温和酸抗性的、胰蛋白酶抗性的、可通过离心沉降的、可通过电子显微镜分辨的、或其组合。其他R型细菌素可以是包括多种蛋白质、多肽或亚单元的复合物分子，并且可以类似于肌尾噬菌体科(Myoviridae)的细菌噬菌体的尾结构。在天然存在的R型细菌素中，亚单元结构可以由细菌基因组编码，例如艰难梭状芽孢杆菌(G.Difficile)或铜绿假单胞菌(P.Aeruginosa)的基因组并形成R型细菌素以用作针对其他细菌的天然防御。在一些情况下，该R型细菌素是脓菌素。在一些情况下，该脓菌素是R-脓菌素、F-脓菌素、或S-脓菌素。
在一些情况下，该细菌素是本文所述的细菌素的功能活性变体。在一些情况下，该细菌素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的细菌素或天然存在的细菌素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性。
在一些情况下，根据标准方法，该细菌素可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在其他情况下，该细菌素是由微生物细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该细菌素是化学合成的。一些细菌素可以衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生细菌素本身的多肽。因此，在一些情况下，该细菌素由前体多肽产生。在一些其他情况下，该细菌素包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的细菌素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的细菌素，如至少约1种细菌素、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或更多种细菌素中的任一者。本文所述的组合物中每种细菌素的合适的浓度取决于如功效、细菌素的稳定性、组合物中不同细菌素类型的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种细菌素是从约0.01ng/ml至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种细菌素是从约0.01ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的细菌素，每种类型的细菌素的浓度可以相同或不同。在一些情况下，该细菌素提供于包括分泌该细菌素的细菌细胞的组合物中。在一些情况下，该细菌素提供于包括多肽(例如，从细菌细胞分离的多肽)的组合物中。
细菌素可以中和(例如，杀死)除制备多肽的个体细菌细胞以外的至少一种微生物，包括与细菌细胞和其他微生物细胞克隆相关的细胞。因此，细菌细胞可通过分泌细菌素对多种微生物有机体发挥细胞毒性或生长抑制作用。在一些情况下，细菌素经由细胞质膜孔形成、细胞壁干扰(例如，肽聚糖酶活性)或核酸酶活性(例如，DNA酶活性、16S rRNA酶活性或tRNA酶活性)靶向并杀死寄宿于宿主中的一种或多种细菌。
在一些情况下，该细菌素具有中和活性。细菌素的中和活性可以包括但不限于阻止微生物繁殖或细胞毒性。一些细菌素具有细胞毒活性，并且因此可以杀死微生物有机体，例如细菌、酵母、藻类等。一些细菌素可以抑制微生物有机体(例如细菌、酵母、藻类等)的繁殖，例如通过阻止细胞周期。
在一些情况下，该细菌素具有杀伤活性。细菌素的杀伤机制对每组细菌素都是特异性的。在一些情况下，该细菌素具有窄谱生物活性。已知细菌素针对其靶菌株具有非常高的效力。一些细菌素活性仅限于与细菌素生产菌株密切相关的菌株(窄谱生物活性)。在一些情况下，该细菌素针对宽范围的属具有广谱生物活性。
在一些情况下，细菌素与靶细菌细胞膜上的受体分子或对接分子相互作用。例如，乳链菌肽针对其靶细菌菌株非常有效，即使在一位数的纳摩尔浓度下也显示出抗微生物活性。乳链菌肽分子已被证明与脂质II结合，脂质II是肽聚糖亚单元从细胞质到细胞壁的主要转运体。
在一些情况下，该细菌素具有抗真菌活性。已经鉴定了许多具有抗酵母或抗真菌活性的细菌素。例如，已经显示来自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌素具有针对一些酵母菌株的中和活性(参见，例如，Adetunji和Olaoye，Malaysian Journal of Microbiology[马来西亚微生物学杂志]9：130-13，2013)。在另一个实例中，已显示粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)肽具有针对假丝酵母属(Candida)物种的中和活性(参见，例如，Shekh和Roy，BMCMicrobiology[BMC微生物学]12：132，2012)。在另一个实例中，已显示来自假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌素具有针对真菌的中和活性，如月状弯孢霉(Curvularia lunata)、镰刀菌属(Fusarium)物种、长蠕孢属(Helminthosporium)物种、和离蠕孢属(Biopolaris)物种(参见，例如，Shalani和Srivastava，The Internet Journal of Microbiology[网络微生物学杂志]，第5卷，第2期，2008)。在另一个实例中，已显示来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的botrycidin AJ1316和alirin B1具有抗真菌活性。
包括如本文所述的细菌素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内细菌素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
如实例8、9和16所示，细菌素(例如，colA或乳链菌肽)可用作靶向昆虫宿主中的内共生细菌以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。
(b)溶素
本文所述的调节剂可包括溶素(例如，也称为胞壁质水解酶或肽聚糖自溶素)。可以使用任何适用于抑制寄宿于宿主的细菌的溶素。在一些情况下，该溶素是可以由细菌细胞天然产生的溶素。在一些情况下，该溶素是可以由细菌噬菌体天然产生的溶素。在一些情况下，该溶素从抑制寄宿于宿主的细菌的噬菌体获得。在一些情况下，该溶素是基于天然存在的溶素工程化的。在一些情况下，将该溶素工程化使其由宿主细菌分泌，例如通过向溶素中引入信号肽。在一些情况下，该溶素与噬菌体穴蛋白组合使用。在一些情况下，溶素由对溶素不敏感的重组细菌宿主表达。在一些情况下，该溶素用于抑制寄宿于宿主的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
该溶素可以是任何类的溶素，并且可以具有一种或多种底物特异性。例如，该溶素可以是糖苷酶，内肽酶、羧肽酶或其组合。在一些情况下，该溶素裂解细胞壁的糖部分中的β-1-4糖苷键，连接细菌细胞壁的糖和肽部分的酰胺键，和/或细胞壁的肽部分之间的肽键。该溶素可以属于一个或多个特异性溶素组，这取决于肽聚糖内的切割位点。在一些情况下，该溶素是N-乙酰基-β-D-胞壁酸酶(例如溶菌酶)、裂解性转糖基酶、N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷酶、N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸酰胺酶、L，D-内肽酶、D，D-内肽酶、D，D-羧肽酶、L，D-羧肽酶或L，D-转肽酶。溶素的非限制性实例及其活性列于表5中。
表5：溶素的实例
Figure BDA0002140147320001201
Figure BDA0002140147320001211
Figure BDA0002140147320001221
Figure BDA0002140147320001231
Figure BDA0002140147320001241
Figure BDA0002140147320001251
Figure BDA0002140147320001261
Figure BDA0002140147320001271
Figure BDA0002140147320001281
Figure BDA0002140147320001291
Figure BDA0002140147320001301
Figure BDA0002140147320001311
Figure BDA0002140147320001321
Figure BDA0002140147320001331
Figure BDA0002140147320001341
Figure BDA0002140147320001351
Figure BDA0002140147320001361
Figure BDA0002140147320001371
Figure BDA0002140147320001381
在一些情况下，该溶素是本文所述的溶素的功能活性变体。在一些情况下，该溶素的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的溶素或天然存在的溶素的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
在一些情况下，该溶素可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该溶素是由微生物细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该溶素是化学合成的。在一些情况下，该溶素衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生溶素本身的多肽。因此，在一些情况下，该溶素由前体多肽产生。在一些情况下，该溶素包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的溶素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的溶素，如至少约1种溶素、2、3、4、5、10、15、20、或更多种溶素中的任一者。组合物中每种溶素的合适的浓度取决于如功效、溶素的稳定性、不同溶素的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种溶素是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种溶素是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的溶素，每种类型的溶素的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的溶素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内溶素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内溶素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内溶素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
(c)抗微生物肽
本文所述的调节剂可以包括抗微生物肽(AMP)。可以使用任何适用于抑制寄宿于宿主的微生物的AMP。AMP是一组多样化的分子，根据其氨基酸组成和结构分为亚组。AMP可以衍生或产生自天然产生AMP(包括衍生自植物的AMP(例如，copsin)、衍生自昆虫的AMP(例如，果蝇菌素、蝎肽(例如，Uy192、UyCT3、D3、D10、Uy17、Uy192)、蜂毒肽(Mastoparan)、poneratoxin、杀菌肽、家蚕抗菌肽、蜂毒素)、衍生自蛙类的AMP(例如，爪蟾抗菌肽、皮抑菌肽、aurein)，以及衍生自哺乳动物的AMP(例如，组织蛋白酶抑制素(cathelicidin)、防御素和抗菌肽))的任何生物。例如，AMP可以是蝎肽，如Uy192(5’-FLSTIWNGIKGLL-3’；SEQ IDNO：227)、UyCT3(5’-LSAIWSGIKSLF-3；SEQ ID NO：228)、D3(5’-LWGKLWEGVKSLI-3’；SEQ IDNO：229)、和D10(5’-FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL-3’；SEQ ID NO：230)、Uy17(5’-ILSAIWSGIKGLL-3’；SEQ ID NO：231)、或其组合。在一些情况下，该抗微生物肽可以与以下的一种或多种具有至少90％序列同一性(例如，至少90％、92％、94％、96％、98％、或100％序列同一性)：杀菌肽(SEQ ID NO：82)、蜂毒素、copsin、果蝇抗真菌肽(SEQ ID NO：93)、皮离蛋白(SEQ ID NO：81)、果蝇抗菌肽(SEQ ID NO：83)、家蚕抗菌肽(SEQ ID NO：84)、无锡亚肽(SEQ ID NO：85)、蜜蜂肽(SEQ ID NO：86)、蜜蜂抗菌肽(SEQ ID NO：87)、猪抗菌肽(SEQID NO：88)、吲哚力西丁(SEQ ID NO：89)、抗菌肽(SEQ ID NO：90)、速普肽(SEQ ID NO：91)、或防御素(SEQ ID NO：92)，至人病原体的宿主的媒介。AMP的非限制性实例列于表6中。
表6：抗微生物肽的实例
Figure BDA0002140147320001401
Figure BDA0002140147320001411
Figure BDA0002140147320001421
AMP可以针对任何数量的靶微生物具有活性。在一些情况下，该AMP可具有抗细菌和/或抗真菌活性。在一些情况下，该AMP可具有窄谱生物活性或广谱生物活性。例如，一些AMP仅靶向并杀死很少数种类的细菌或真菌，而其他AMP则针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌两者以及真菌都具有活性。
此外，该AMP可以通过许多已知的作用机制起作用。例如，细胞质膜是AMP的常见靶，但AMP也可以干扰DNA和蛋白质合成、蛋白质折叠和细胞壁合成。在一些情况下，具有净阳离子电荷和两亲性质的AMP破坏细菌膜，导致细胞裂解。在一些情况下，AMP可进入细胞并与细胞内靶相互作用以干扰DNA、RNA、蛋白质或细胞壁合成。除杀死微生物外，AMP已证明还具有许多免疫调节功能，这些功能与感染的清除有关，包括以下的能力：改变宿主基因表达、充当趋化因子和/或诱导趋化因子产生、抑制脂多糖诱导的促炎细胞因子产生、促进伤口愈合、并调节树突细胞和适应性免疫应答细胞的反应。
在一些情况下，该AMP是本文所述的AMP的功能活性变体。在一些情况下，该AMP的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的AMP或天然衍生的AMP的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
在一些情况下，该AMP可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该AMP是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该AMP是化学合成的。在一些情况下，该AMP衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生AMP本身的多肽。因此，在一些情况下，该AMP由前体多肽产生。在一些情况下，该AMP包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的AMP。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的AMP，如至少约1种AMP、2、3、4、5、10、15、20、或更多种AMP中的任一者。例如，组合物可以包括AMP的混合物(例如，蝎肽(例如UyCT3、D3、D10和Uy17)的混合物)。组合物中每种AMP的合适的浓度取决于如功效、AMP的稳定性、组合物中不同AMP的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中的每种AMP是从约0.1ng/mL至约100mg/mL(约0.1ng/mL至约1ng/mL、约1ng/mL至约10ng/mL、约10ng/mL至约100ng/mL、约100ng/mL至约1000ng/mL、约1mg/mL至约10mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL)。在一些情况下，固体组合物中的每种AMP是从约0.1ng/g至约100mg/g(约0.1ng/g至约1ng/g、约1ng/g至约10ng/g、约10ng/g至约100ng/g、约100ng/g至约1000ng/g、约1mg/g至约10mg/g、约10mg/g至约100mg/g)。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的AMP，每种类型的AMP的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的AMP的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内AMP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
如实例20-22所示，AMP(例如蝎肽)可用作靶向昆虫宿主中的内共生细菌以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。
(d)根瘤富含半胱氨酸肽
本文所述的调节剂可以包括根瘤富含半胱氨酸肽(NCR肽)。NCR肽在某些豆科植物中产生，并且在植物与来自根瘤菌科(Rhizobiaceae，rhizobia)的细菌的互利、固氮共生中起重要作用，导致根瘤的形成，其中植物细胞含有数千个细胞内的内共生体。NCR肽具有抗微生物剂特性，其导致细菌的不可逆的终末分化过程，例如，使细菌膜透化、破坏细胞分裂或抑制蛋白质合成。例如，在感染了苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)根瘤细胞中，产生了数百种NCR肽，其导致细菌不可逆地分化成大的多倍体固氮拟杆菌。NCR肽的非限制性实例列于表7中。
表7：NCR肽的实例
Figure BDA0002140147320001451
Figure BDA0002140147320001461
Figure BDA0002140147320001471
Figure BDA0002140147320001481
Figure BDA0002140147320001491
Figure BDA0002140147320001501
Figure BDA0002140147320001511
Figure BDA0002140147320001521
Figure BDA0002140147320001531
Figure BDA0002140147320001541
Figure BDA0002140147320001551
本领域已知的任何NCR肽都适用于在本文所述的方法或组合物中使用。产生NCR肽的植物包括但不限于碗豆(Pisum sativum，pea)、紫云英(Astragalus sinicus)(IRLC豆类)、菜豆(Phaseolus vulgaris)(豆(bean))、豇豆(Vigna unguiculata，cowpea)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula)(桶形三叶草(barrel clover))、和百脉根(Lotusjaponicus)。例如，从蒺藜状苜蓿(M.truncatula)基因组序列中预测了600多种潜在的NCR肽，并且已经在通过质谱法在从根瘤分离的细胞中检测到近150种不同的NCR肽。
本文描述的NCR肽可以是成熟或未成熟的NCR肽。未成熟的NCR肽具有易位到内质网中所需的并且在易位后裂解的C-末端信号肽。NCR肽的N-末端包括可以是可裂解的信号肽，用于靶向分泌途径。NCR肽通常是具有稳定其结构的二硫桥的小肽。成熟的NCR肽具有在约20至约60个氨基酸、约25至约55个氨基酸、约30至约50个氨基酸、约35至约45个氨基酸、或其间任何范围的范围内的长度。NCR肽可以包括半胱氨酸残基的保守序列，其中肽序列的其余部分高度可变。NCR肽通常具有约四个或八个半胱氨酸。
NCR肽可以是阴离子的、中性的或阳离子的。在一些情况下，具有pI大于约八的合成阳离子NCR肽具有抗微生物活性。例如，NCR247(pI＝10.15)(RNGCIVDPRCPYQQCRRPLYCRRR；SEQ ID NO：196)和NCR335(pI＝11.22)(MAQFLLFVYSLIIFLSLFFGEAAFERTETRMLTIPCTSDDNCPKVISPCHTKCFDGFCGWYIEGSYEGP；SEQ ID NO：197)针对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及真菌均有效。在一些情况下，中性和/或阴离子NCR肽(例如NCR001)在pI大于约8时不具有抗微生物活性。
在一些情况下，该NCR肽可有效杀死细菌。在一些情况下，该NCR肽可有效杀死S.meliloti、致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp)、发光杆菌属物种(Photorhabdus spp)、暂定属物种(Candidatus spp)、布赫纳氏菌属物种(Buchnera spp)、布拉特杆菌属物种(Blattabacterium spp)、鲍曼属物种(Baumania spp)、威格尔斯沃思氏菌属物种(Wigglesworthia spp)、沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp)、立克次体属物种(Rickettsia spp)、东方体属物种(Orientia spp)、伴突属物种(Sodalis spp)、伯克霍尔德氏菌属物种(Burkholderia spp)、贪铜菌属物种(Cupriavidus spp)、弗兰克氏菌属物种(Frankia spp)、中华根瘤菌属物种(Snirhizobium spp)、链球菌属物种(Streptococcusspp)、沃廉菌属物种(Wolinella spp)、木杆菌属物种(Xylella spp)、欧氏杆菌属物种(Erwinia spp)、农杆菌属物种(Agrobacterium spp)、芽孢杆菌属物种(Bacillus spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、链霉菌属物种(Streptomyces spp)、微球菌属物种(Micrococcus spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、醋杆菌属物种(Acetobacter spp)、蓝细菌属物种(Cyanobacteria spp)、沙门氏菌属物种(Salmonellaspp)、红球菌属物种(Rhodococcus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp)、乳杆菌属物种(Lactobacillus spp)、肠球菌属(Enterococcus spp)、产碱杆菌属物种(Alcaligenesspp)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp)、类芽孢杆菌属物种(Paenibacillus spp)、节杆菌属物种(Arthrobacter spp)、棒状杆菌属物种(Corynebacterium spp)、短杆菌属物种(Brevibacterium spp)、栖热菌属物种(Thermus spp)、假单胞菌属物种(Pseudomonasspp)、梭菌属物种(Clostridium spp)、或埃希氏杆菌属物种(Escherichia spp)。
在一些情况下，该NCR肽是本文所述的NCR肽的功能活性变体。在一些情况下，该NCR肽的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的NCR肽或天然衍生的NCR肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
在一些情况下，该NCR肽可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加或减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该NCR肽是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该NCR肽是化学合成的。在一些情况下，该NCR肽衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生NCR肽本身。因此，在一些情况下，该NCR肽由前体多肽产生。在一些情况下，该NCR肽包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的NCR肽。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型的NCR肽，如至少约1种NCR肽、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100、或更多种NCR肽中的任一者。组合物中每种NCR肽的合适的浓度取决于如功效、NCR肽的稳定性、不同NCR肽的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种NCR肽是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种NCR肽是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的NCR肽，每种类型的NCR肽的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的NCR肽的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内NCR肽浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内NCR肽浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内NCR肽浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
(e)含菌细胞调节肽
本文所述的调节剂可以包括含菌细胞调节肽(BRP)。BRP是在昆虫的含菌细胞中表达的肽。这些基因首先在与共生体的掺入一致的发育时间点表达，并且在整个昆虫的生命中维持它们的含菌细胞特异性表达。在一些情况下，该BRP具有预测为信号肽的疏水氨基末端结构域。此外，一些BRP具有富含半胱氨酸的结构域。在一些情况下，该含菌细胞调节肽是含菌细胞特异性富含半胱氨酸(BCR)的蛋白质。含菌细胞调节肽具有在约40至150个之间的氨基酸的长度。在一些情况下，该含菌细胞调节肽具有在约45至约145、约50至约140、约55至约135、约60至约130、约65至约125、约70至约120、约75至约115、约80至约110、约85至约105、或其间任何范围的范围内的长度。BRP的非限制性实例及其活性列于表8中。
表8：含菌细胞调节肽的实例
Figure BDA0002140147320001591
Figure BDA0002140147320001601
Figure BDA0002140147320001611
在一些情况下，该BRP改变寄宿于宿主的含菌细胞中一种或多种细菌的生长和/或活性。在一些情况下，该BRP可以被生物工程化以调节其生物活性(例如，增加、减少或调节)或指定其靶微生物。在一些情况下，该BRP是由细胞的翻译机制(例如核糖体等)产生的。在一些情况下，该BRP是化学合成的。在一些情况下，该BRP衍生自多肽前体。该多肽前体可以经历切割(例如，通过蛋白酶加工)以产生BRP本身的多肽。因此，在一些情况下，该BRP由前体多肽产生。在一些情况下，该BRP包括已经历翻译后修饰(例如切割，或添加一个或多个官能团)的多肽。
如本文所述的BRP的功能活性变体也可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，该BRP的变体例如在指定区域或整个序列上与本文所述的BRP或天然衍生的BRP的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的BRP。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的BRP，如至少约1种BRP、2、3、4、5、10、15、20、或更多种BRP中的任一者。组合物中每种BRP的合适的浓度取决于如功效、BRP的稳定性、不同BRP的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中每种BRP是从约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中每种BRP是从约0.1ng/g至约100mg/g。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的BRP，每种类型的BRP的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的BRP的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内BRP浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
iii.小分子
许多种小分子(例如，抗生素或代谢物)可用于本文所述的组合物和方法中。在一些情况下，本文所述的任何小分子的有效浓度可以改变寄宿于宿主中的一种或多种微生物(如本文所述的)的水平、活性或代谢，该改变导致宿主的适合度降低。
包括如本文所述的小分子的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内小分子浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
下文讨论的小分子，即抗生素和次生代谢物，可用于改变靶微生物的水平、活性或代谢，如在用于降低宿主昆虫(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、虱子、或蜱)的适合度的部分所指示的。
(a)抗生素
本文所述的调节剂可以包括抗生素。可以使用本领域已知的任何抗生素。抗生素通常根据其作用机制、化学结构或活性谱进行分类。
本文所述的抗生素可以靶向任何细菌的功能或生长过程，并且可以是抑细菌的(例如，减缓或阻止细菌生长)或杀细菌的(例如，杀死细菌)。在一些情况下，该抗生素是杀细菌抗生素。在一些情况下，该杀细菌抗生素是靶向细菌细胞壁的杀细菌抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的杀细菌抗生素(例如，多粘菌素)；或者抑制必需细菌酶的杀细菌抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素(lipiarmycins)、喹诺酮类和磺胺类)。在一些情况下，该杀细菌抗生素是氨基糖苷类。在一些情况下，该抗生素是抑细菌抗生素。在一些情况下，该抑细菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可胺类和四环素类)。本文使用的另外类的抗生素包括环脂肽(如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮类(如利奈唑胺)、或闰年霉素(lipiarmycins)(如非达霉素)。抗生素的实例包括土霉素、强力霉素、利福平、环丙沙星、氨苄青霉素、和多粘菌素B。抗生素的其他非限制性实例见表9。
表9：抗生素的实例
Figure BDA0002140147320001631
Figure BDA0002140147320001641
本文描述的抗生素可具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，该抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特异性类型的细菌，如革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。可替代地，该抗生素可以是靶向宽范围的细菌的广谱抗生素。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的抗生素。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的抗生素，如至少约1种抗生素、2、3、4、5、10、15、20、或更多种抗生素(例如，利福平和强力霉素的组合，或氨苄青霉素和利福平的组合)中的任一者。组合物中每种抗生素的合适的浓度取决于如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的抗生素，每种类型的抗生素的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的抗生素的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内抗生素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内抗生素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内抗生素浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
如实例1-4、10、14、26、和27所示，抗生素(例如，强力霉素、土霉素、阿奇霉素、环丙沙星、或利福平)可用作靶向昆虫宿主(例如，动物病原体的昆虫媒介)(如蚊子或螨或蜱或咬虱)中的内共生细菌(如沃尔巴克氏体属物种(Wolbachia spp.)以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。如实例3所示，抗生素(如土霉素)可用作靶向昆虫宿主(如蜱)中的内共生细菌(如立克次体属物种(Rickettsia spp.))以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。
(b)次生代谢物
在一些情况下，本文所述的组合物和方法的调节剂包括次生代谢物。次生代谢物衍生自由生物产生的有机分子。次生代谢物可以充当(i)用于抗细菌、真菌、变形虫、植物、昆虫和大型动物的竞争剂；(ii)金属输送剂(metal transporting agent)；(iii)微生物与植物、昆虫和高等动物之间共生的药剂；(iv)性激素；以及(v)区分效应器。次生代谢物的非限制性实例见表10。
表10：次生代谢物的实例
Figure BDA0002140147320001651
Figure BDA0002140147320001661
本文使用的次生代谢物可以包括来自任何已知的次生代谢物组的代谢物。例如，次生代谢物可分类为以下几组：生物碱类、萜类、类黄酮类、糖苷类、天然酚类(例如，棉酚乙酸)、二烯醛类(例如，反式-肉桂醛)、吩嗪类、联苯酚类和氧芴类、聚酮类、脂肪酸合酶肽类、非核糖体肽类、核糖体合成和翻译后修饰肽类、多酚类、多糖类(例如，壳聚糖)和生物聚合物。有关次生代谢物的深入审查，参见例如，Vining，Annu.Rev.Microbiol.[微生物学年鉴]44：395-427，1990。
有用于本文所述的组合物和方法的次生代谢物包括改变内共生体(例如，原生内共生体或次生内共生体)、含菌细胞或细胞外共生体的天然功能的那些次生代谢物。在一些情况下，本文所述的一种或多种次生代谢物是从抗微生物化合物的高通量筛选(HTS)中分离的。例如，HTS筛选鉴定了49种抗细菌提取物，这些提取物对来自生长于一个特定区域的不同生态系统中的生物的39,000多种粗提取物中的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌具有特异性。在一些情况下，该次生代谢物在含菌细胞内运输。
在一些情况下，小分子是维生素合成的抑制剂。在一些情况下，维生素合成抑制剂是维生素前体类似物。在某些情况下，维生素前体类似物是泛醇。
在一些情况下，小分子是氨基酸类似物。在某些情况下，氨基酸类似物是L-刀豆氨酸、D-精氨酸、D-缬氨酸、D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-组氨酸、D-色氨酸、D-苏氨酸、D-亮氨酸、L-NG-硝基精氨酸或其组合。
在一些情况下，小分子是天然抗微生物化合物，如丙酸、乙酰丙酸、反式-肉桂醛、乳链菌肽或低分子量壳聚糖。
可以在用于本文所述的任何用途的组合物中配制本文所述的次生代谢物。本文披露的组合物可以包括任何数量或类型(例如，类别)的次生代谢物，如至少约1种次生代谢物、2、3、4、5、10、15、20、或更多种次生代谢物中的任一者。组合物中每种次生代谢物的合适的浓度取决于如功效、次生代谢物的稳定性、不同次生代谢物的数量、配制品和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，其中该组合物包括至少两种类型的次生代谢物，每种类型的次生代谢物的浓度可以相同或不同。
包括如本文所述的次生代谢物的调节剂可以按足以实现以下的量和时间与靶宿主接触：(a)达到靶宿主内次生代谢物浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(b)达到靶宿主肠内次生代谢物浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(c)达到靶宿主含菌细胞内次生代谢物浓度的靶水平(例如，预定或阈值水平)；(d)调节靶宿主中一种或多种微生物(例如内共生体)的水平或活性；或/和(e)调节靶宿主的适合度。
如实例15所示，次生代谢物(例如，棉酚)可用作靶向昆虫宿主中的内共生细菌以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。如实例11-13、17-19、23、和24进一步所示，小分子(如反式-肉桂醛、乙酰丙酸、壳聚糖、维生素类似物、或氨基酸转运抑制剂)也可用作靶向昆虫宿主中的内共生细菌以降低(例如，如本文概述的)宿主的适合度的调节剂。
iv.细菌作为调节剂
在一些情况下，本文所述的调节剂包括一种或多种细菌。许多种细菌在本文所述的组合物和方法中是有用的。在一些情况下，该药剂是在宿主中内源发现的细菌物种。在一些情况下，该细菌调节剂是内共生细菌物种。可用作调节剂的细菌的非限制性实例包括具体实施方式的部分II中本文所述的所有细菌物种和表1中列出的那些细菌物种。例如，该调节剂可以是来自昆虫肠中存在的任何细菌门的细菌物种，包括γ变形菌门(Gammaproteobacteria)、α变形菌门(Alphaproteobacteria)、β变形菌门(Betaproteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)(例如，乳杆菌属(Lactobacillus)和芽孢杆菌属(Bacillus)物种)、梭菌属(Clostridia)、放线菌属(Actinomycetes)、螺旋体属(Spirochetes)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、和放线菌门(Actinobacteria)。
在一些情况下，该调节剂是破坏微生物多样性或以对宿主不利的方式改变宿主的微生物区系的细菌。在一个情况下，可以提供细菌以破坏蚊子的微生物区系。例如，细菌调节剂可以与蚊子中的共生细菌群体竞争，置换和/或减少蚊子中的共生细菌群体。
在另一个情况下，可以提供细菌以破坏螨的微生物区系。例如，细菌调节剂可以与螨中的共生细菌群体竞争，置换和/或减少螨中的共生细菌群体。
在另一个情况下，可以提供细菌以破坏咬虱的微生物区系。例如，细菌调节剂可以与咬虱中的共生细菌群体竞争，置换和/或减少咬虱中的共生细菌群体。
在另一个情况下，可以提供细菌以破坏蜱的微生物区系。例如，细菌调节剂可以与蜱中的共生细菌群体竞争，置换和/或减少蜱中的共生细菌群体。
本文讨论的细菌调节剂可用于改变靶微生物的水平、活性或代谢，如在用于降低宿主昆虫(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、咬虱、或蜱)的适合度的部分所指示的。
v.对调节剂的修饰
(a)融合
本文所述的任何调节剂可以与另外的部分融合或连接。在一些情况下，该调节剂包括一种或多种另外的部分(例如，1种另外的部分、2、3、4、5、6、7、8、9、10、或更多种另外的部分)的融合。在一些情况下，该另外的部分是本文所述的调节剂(例如，肽、多肽、小分子、或抗生素)中的任一者。可替代地，该另外的部分本身可以不充当调节剂，而是可以起辅助作用。例如，该另外的部分可以帮助调节剂在宿主中的靶位点(例如，宿主肠或宿主含菌细胞)处或在寄宿于宿主(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、咬虱、或蜱)中的靶微生物处接近、结合或激活。
在一些情况下，该另外的部分可以帮助调节剂渗透寄宿于宿主中的靶宿主细胞或靶微生物。例如，该另外的部分可以包括细胞穿透肽。细胞穿透肽(CPP)可以是衍生自以下的天然序列：蛋白质；通过两个天然序列的融合形成的嵌合肽；或合成的CPP，它们是基于结构-活性研究的合成设计的序列。在一些情况下，CPP具有普遍穿过具有有限毒性的细胞膜(例如，原核细胞膜和真核细胞膜)的能力。此外，CPP可以具有经由能量依赖性和/或独立机制，同时不需要特异性受体的手性识别而穿过细胞膜的能力。CPP可以与本文所述的任何调节剂结合。例如，CPP可以与抗微生物肽(AMP)(例如，蝎肽，例如与细胞穿透肽融合的UY192(例如，YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLLFAM；SEQ ID NO：232))结合。CPP的非限制性实例列于表11中。
表11：细胞穿透肽(CPP)的实例
Figure BDA0002140147320001701
在其他情况下，该另外的部分帮助调节剂结合寄宿于宿主的靶微生物(例如，真菌或细菌)。该另外的部分可以包括一个或多个靶向结构域。在一些情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向寄宿于宿主肠中的一种或多种微生物(例如，细菌或真菌)。在一些情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主的特异性区域(例如，宿主肠或含菌细胞)以接近通常存在于所述宿主区域中的微生物。例如，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主的前肠、中肠或后肠。在其他情况下，该靶向结构域可以将调节剂靶向宿主中的含菌细胞和/或寄宿于宿主含菌细胞中的一种或多种特异性细菌。例如，该靶向结构域可以是与本文所述的调节剂(例如AMP，例如蝎肽，如Uy192)结合的雪钟花(Galanthus nivalis)植物凝集素(lectin)或凝集素(agglutinin)(GNA)。
(b)前结构域(Pre-domain或Pro-domain)
在一些情况下，该调节剂可以包括前氨基酸序列(pre-amino acid sequence或pro-amino acid sequence)。例如，该调节剂可以是可以通过前序列(pre-sequence或pro-sequence)的切割或翻译后修饰来激活的无活性蛋白质或肽。在一些情况下，该调节剂是用失活的前序列(pre-sequence或pro-sequence)工程化的。例如，该前序列(pre-sequence或pro-sequence)可以模糊调节剂上的激活位点(例如受体结合位点)，或可以诱导调节剂的构象变化。因此，在切割前序列(pre-sequence或pro-sequence)后，该调节剂被激活。
可替代地，该调节剂可以包括前小分子(pre-small molecule或pro-smallmolecule)，例如抗生素。该调节剂可以是可以在宿主内的靶环境中被激活的本文所述的无活性小分子。例如，该小分子可在宿主肠中达到一定pH时被激活。
(c)接头
在调节剂与另外的部分连接的情况下，该调节剂可以进一步包括接头。例如，该接头可以是化学键，例如一个或多个共价键或非共价键。在一些情况下，该接头可以是肽接头(例如，2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、或更多个氨基酸长)。该接头可以包括本文所述的任何柔性、刚性或可裂解的接头。
柔性肽接头可以包括本领域常用的任何接头，包括具有主要具有Gly和Ser残基的序列的接头(“GS”接头)。柔性接头可以有用于连接需要一定程度的移动或相互作用的结构域，并且可以包括小的、非极性的(例如Gly)或极性的(例如Ser或Thr)氨基酸。
可替代地，肽接头可以是刚性接头。刚性接头有用于保持各部分之间的固定距离并维持它们的独立功能。当结构域的空间分离对于保持融合中一种或多种组分的稳定性或生物活性至关重要时，刚性接头也可以是有用的。例如，刚性接头可以具有α螺旋结构或富含脯氨酸的序列(Pro-rich sequence)、(XP)n，其中X表示任何氨基酸，优选Ala、Lys或Glu。
在又其他情况下，肽接头可以是可裂解的接头。在一些情况下，接头可以在特异性条件下(例如在还原剂或蛋白酶的存在下)裂解。体内可裂解接头可利用二硫键的可逆性质。一个实例包括两个Cys残基之间的凝血酶敏感性序列(例如，PRS)。CPRSC的体外凝血酶处理导致凝血酶敏感性序列的切割，而可逆的二硫键保持完整。此类接头是已知的并且描述于，例如，Chen等人，Adv.Drug Deliv.Rev.[先进药物输送评论]65(10)：1357-1369，2013。融合中接头的切割也可以通过在宿主或寄宿于宿主中的微生物的特异性细胞或组织的条件下体内表达的蛋白酶进行。在一些情况下，接头的切割可在到达靶位点或细胞时释放游离的功能调节剂。
本文所述的融合可以可替代地通过连接分子连接，这些连接分子包括疏水接头，如带负电荷的磺酸酯基团；脂质，如聚(--CH2--)烃链，如聚乙二醇(PEG)基团，其不饱和变体，其羟基化变体，其酰胺化或其他含N的变体，非碳接头；碳水化合物接头；磷酸二酯接头，或能够共价连接两个或多个分子(例如两种调节剂)的其他分子。可以使用非共价接头(如调节剂与之连接的疏水性脂质小球)例如通过调节剂的疏水区域或调节剂的疏水延伸，如富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、或者也可以是丙氨酸、苯丙氨酸、或甚至酪氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸的一系列残基或其他疏水残基。该调节剂可以使用基于电荷的化学连接，使得调节剂的带正电荷的部分与另一种调节剂或另外的部分的带负电荷的部分连接。
IV.配制品和组合物
可以将本文所述的组合物以纯的形式(例如，组合物仅含有调节剂)配制或与一种或多种另外的药剂(如赋形剂、递送媒介物、载体、稀释剂、稳定剂等)一起配制以促进组合物的施用或递送。合适的赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水溶液、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
在一些情况下，该组合物包括递送媒介物或载体。在一些情况下，该递送媒介物包括赋形剂。示例性赋形剂包括但不限于：固体或液体载体材料、溶剂、稳定剂、缓释赋形剂、色素和表面活性物质(表面活性剂)。在一些情况下，该递送媒介物是稳定性媒介物。在一些情况下，该稳定性媒介物包括稳定赋形剂。示例性稳定赋形剂包括但不限于：环氧化植物油、消泡剂(例如硅油)、防腐剂、粘度调节剂、粘合剂和增粘剂。在一些情况下，该稳定性媒介物是适用于调节剂的缓冲液。在一些情况下，将组合物微囊包封在聚合物珠递送媒介物中。在一些情况下，该稳定性媒介物保护调节剂免受UV和/或酸性条件的影响。在一些情况下，该递送媒介物含有pH缓冲液。在一些情况下，将组合物配制为具有在约4.5至约9.0的范围内的pH，包括例如范围在5.0至约8.0、约6.5至约7.5、或约6.5至约7.0中的任一者的pH。
取决于预期的目的和当时环境，可以将组合物配制为可乳化的浓缩物、悬浮浓缩物、可直接喷雾的溶液或可稀释的溶液、可涂覆的膏剂、稀释的乳液、喷雾粉剂、可溶性粉剂、可分散性粉剂、可湿性粉剂、尘剂、粒剂、聚合物质中的包封物、微胶囊、泡沫、气溶胶、二氧化碳气体制剂、片剂、树脂制剂、纸制剂、非织造织物制剂、或针织织物制剂或机织织物制剂。在一些情况下，该组合物是液体。在一些情况下，该组合物是固体。在一些情况下，该组合物是气溶胶，如在加压气溶胶罐中。在一些情况下，该组合物存在于有害生物的废物(如粪便)中。在一些情况下，该组合物存在于活有害生物中或活有害生物上。
在一些情况下，该递送媒介物是宿主的食物或水。在其他情况下，该递送媒介物是宿主的食物来源。在一些情况下，该递送媒介物是宿主的食物诱饵。在一些情况下，该组合物是被宿主食用的可食用试剂。在一些情况下，该组合物通过宿主被递送至第二宿主，并被第二宿主食用。在一些情况下，该组合物被宿主或第二宿主食用，并且该组合物经由宿主或第二宿主的废物(如粪便)释放到宿主或第二宿主的周围。在一些情况下，该调节剂包括于旨在由宿主食用或携带回其集落的食物诱饵中。
在一些情况下，该调节剂可占该组合物的约0.1％至约100％，如约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％、或约0.1％至约90％的活性成分(如噬菌体、溶素或细菌素)中的任一者。在一些情况下，该组合物包括0.1％、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多活性成分(如噬菌体、溶素或细菌素)中至少任一者。在一些情况下，优选浓缩剂作为商业产品，最终使用者通常使用稀释药剂(具有显著较低浓度的活性成分)。
本文所述的任何配制品能以诱饵、蚊香、电蚊香片、烟制剂、熏剂或片剂的形式使用。
i.液体配制品
本文提供的组合物可以是液体配制品的形式。液体配制品通常与水混合，但在一些情况下可与作物油、柴油燃料、煤油或其他轻油一起用作载体。活性成分的量的范围通常为按重量计从约0.5％至约80％。
可乳化的浓缩物配制品可含有液体活性成分，一种或多种基于石油的溶剂，和允许配制品与水混合形成乳液的药剂。此类浓缩物可用于农业、观赏植物和草坪、林业、建筑业、食品加工、畜牧业、和公共卫生有害生物配制品。这些可适用于从小型便携式喷雾器到液压喷雾器、小容量地面喷雾器、弥雾器弥雾机和小容量飞机喷雾器的施用设备。一些活性成分易溶于液体载体中。当与载体混合时，它们形成不会沉淀或分离的溶液，例如均相溶液。这些类型的配制品可以包括活性成分、载体和一种或多种其他成分。溶液可用于室内和室外任何类型的喷雾器。
在一些情况下，可以将该组合物可以配制为逆乳液。逆乳液是分散在油载体中的水溶性活性成分。逆乳液需要乳化剂，其允许活性成分与大量基于石油的载体(通常为燃料油)混合。逆乳液有助于减少漂移。对于其他配制品，当水滴在到达靶表面之前开始蒸发时会产生一些喷雾漂移；结果，液滴变得非常小且重量轻。由于油的蒸发速度比水慢，因此逆乳液液滴收缩较少，并且更多的活性成分到达靶。油进一步有助于减少径流并改善抗雨性。它还通过改善表面覆盖和吸收作为粘展剂。由于液滴相对较大且较重，因此难以在叶子的下侧进行彻底覆盖。最常沿着路域(rights-of-way)(其中漂移到易受影响的非靶区域)使用的逆乳液可能是一个问题。
可流动或液体配制品结合了可乳化浓缩物和可湿性粉剂的许多特征。当活性成分是不溶于水或油的固体时，制造商使用这些配制品。将浸渍在如黏土的物质上的活性成分研磨成非常细的粉剂。然后将粉剂悬浮在少量液体中。得到的液体产品很稠。可流动物和液体具有可乳化浓缩物的许多特征，并且它们具有类似的缺点。它们需要适度的搅拌以使它们保持悬浮并留下可见的残留物，类似于可湿性粉剂中的那些。
可流动物/液体易于处理和施用。因为它们是液体，所以它们会溢出和溅出。它们含有固体颗粒，因此会导致喷嘴和泵的磨损。可流动物和液体悬浮液在其容器中沉淀。由于可流动物和液体配制品倾向于沉淀，因此在五加仑或更少的容器中包装使得更容易再混合。
气溶胶配制品含有一种或多种活性成分和溶剂。大多数气溶胶含有低百分比的活性成分。有两种类型的气溶胶配制品-通常可在加压密封容器中使用的即用型，和用于电动或汽油动力气溶胶发生器(将配制品释放为烟或雾)的那些产品。
即用型气溶胶配制品通常是小型的独立单元，在喷嘴阀被触发时释放配制品。在压力下通过惰性气体驱动配制品穿过细孔，产生细小液滴。这些产品用于温室、建筑物内的小区域或小范围的室外区域。具有五至5磅的活性成分的商业模型通常是可再填充的。
烟或雾气溶胶配制品不在压力条件下。它们用于使用快速旋转盘或加热表面将液体配制品破碎成细水雾或雾(气溶胶)的机器中。
ii.干配制品或固体配制品
干配制品可分为两种类型：即用型和必须与水混合以作为喷雾施用的浓缩物。大多数尘剂配制品都可以即刻使用，并且含有低百分比的活性成分(按重量计小于约10％)，加上由滑石、白垩、黏土、坚果壳或火山灰制成的非常细的干惰性载体。单个尘剂颗粒的大小各不相同。一些尘剂配制品是浓缩物，并且含有高百分比的活性成分。在施用前将它们与干惰性载体混合。尘剂总是干燥使用，并且很容易漂移到非靶位点。
iii.粒剂或丸剂配制品
在一些情况下，将该组合物配制为粒剂。粒剂配制品类似于尘剂配制品，除了粒剂颗粒更大更重。粗颗粒可以由如黏土、玉米芯或胡桃壳之类的材料制成。活性成分涂覆在粒剂外面或被吸收进其中。活性成分的量可以相对较低，通常范围为按重量计从约0.5％至约15％。粒剂配制品最常用于施用于土壤、生活在土壤中的昆虫、或通过根吸收到植物中。粒剂配制品有时通过飞机或直升机施用，以最小化漂移或以渗透茂密的植被。一旦施用，粒剂可缓慢释放活性成分。一些粒剂需要土壤水分来释放活性成分。粒剂配制品也用于控制幼虫蚊子和其他水生有害生物。粒剂用于农业、建筑业、观赏植物、草坪、水生动物、道路和公共卫生(咬虫)有害生物控制操作。
在一些情况下，将该组合物配制为丸剂。大多数丸剂配制品与粒剂配制品非常相似；这些术语可互换使用。然而，在丸剂配制品中，所有颗粒具有相同的重量和形状。颗粒的均匀性允许与精密施用设备一起使用。
iv.粉剂
在一些情况下，将该组合物配制为粉剂。在一些情况下，将该组合物配制为可湿性粉剂。可湿性粉剂是干燥的，精细研磨的配制品，看起来像尘剂。它们通常必须与水混合用于作为喷雾施用。然而，一些产品可以作为尘剂或可湿性粉剂施用-选择取决于上涂装置。可湿性粉剂含有按重量计约1％至约95％的活性成分；在一些情况下超过约50％。这些颗粒不溶于水。它们很快沉淀，除非经常搅拌以使其悬浮。它们可用于大多数有害生物问题，并且也可用于大多数可以搅拌的喷雾设备。可湿性粉剂具有优异的残留活性。由于它们的物理特性，大多数配制品保留在经处理的多孔材料(例如混凝土)、石膏和未经处理的木材的表面上。在此类情况下，只有水渗透材料。
在一些情况下，将该组合物配制为可溶性粉剂。可溶性粉剂配制品看起来像可湿性粉剂。然而，当与水混合时，可溶性粉剂容易溶解并形成真溶液。将它们彻底混合后，不需要另外的搅拌。可溶性粉剂中活性成分的量通常范围为按重量计从约15％至约95％，在一些情况下超过约50％。可溶性粉剂具有可湿性粉剂的所有优点，并且除了混合期间的吸入危害外，不具有可湿性粉剂的任何缺点。
在一些情况下，将该组合物配制为水可分散性粒剂。水可分散性粒剂，也称为干可流动物，就像可湿性粉剂(除了不是尘剂样外)，它们被配制为易于测量的粒剂。水可分散性粒剂必须与水混合才能施用。一旦进入水中，粒剂就会分解成类似于可湿性粉剂的细颗粒。该配制品需要恒定搅拌以使其悬浮在水中。活性成分的百分比很高，通常按重量计高达90％。水可分散性粒剂(除了它们更容易测量和混合)具有许多与可湿性粉剂相同的优点和缺点。由于尘剂较少，因此在处理期间对上涂装置的吸入危害较小。
v.诱饵
在一些情况下，该组合物包括诱饵。诱饵可以处于任何合适的形式，如固体、膏剂、丸剂或粉剂形式。诱饵也可以被宿主带回到所述宿主的群体(例如，集落或蜂巢)。然后诱饵可以充当该集落的其他成员的食物来源，从而为大量宿主和潜在的整个宿主集落提供有效的调节剂。
诱饵可以提供于合适的“壳体”或“捕获器”中。此类壳体和捕获器是可商购的，并且现有的捕获器可以被调适成包括本文所述的组合物。壳体或捕获器可以是例如盒形的，并且可以在预成型条件下提供，或者可以例如由可折叠纸板形成。用于壳体或捕获器的合适材料包括塑料和纸板，特别是瓦楞纸板。捕获器的内表面可以内衬有粘性物质，以限制宿主一旦在捕获器内的移动。壳体或捕获器可以内部含有合适的槽，它可以将诱饵保持在适当位置。捕获器与壳体是有区别的，因为宿主在进入后不能容易地离开捕获器，而壳体充当“进食站”，其为宿主提供优选的环境，在该环境中它们可以进食并且远离捕食者而感到安全。
vi.引诱剂
在一些情况下，该组合物包括引诱剂(例如，化学引诱剂)。引诱剂可以将成虫宿主或未成熟宿主(例如，幼虫)吸引到组合物的附近。引诱剂包括信息素，一种由动物(尤其是昆虫)分泌的化学物质，其影响同一物种的其他个体的行为或发育。其他引诱剂包括糖和蛋白水解产物糖浆、酵母和腐肉。引诱剂还可以与活性成分组合并喷雾到处理区域中的叶子或其他物品上。
已知各种引诱剂影响宿主行为，例如宿主对食物、产卵或交配地点或配偶的搜索。可用于本文所述方法和组合物的引诱剂包括，例如，丁香酚、丙酸苯乙酯、乙基二甲基异丁基环丙烷羧酸酯、丙基苯并二噁烷羧酸酯、顺式-7，8-环氧-2-甲基十八烷、反式-8、反式-0-十二碳二烯醇、顺式-9-十四烯醛(具有顺式-11-十六烯醛)、反式-11-十四烯醛、顺式-11-十六烯醛、(Z)-11，12-十六碳二烯醛、顺式-7-十二烯基乙酸酯、顺式-8-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十二烯基乙酸酯、顺式-9-十四碳烯基乙酸酯、顺式-11-十四碳烯基乙酸酯、反式-11-十四碳烯基乙酸酯(具有顺式-11)、顺式-9、反式-11-十四碳二烯基乙酸酯(具有顺式-9、反式-12)、顺式-9、反式-12-十四碳二烯基乙酸酯、顺式-7、顺式-11-十六碳双烯乙酸酯(具有顺式-7、反式-11)、顺式-3、顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、反式-3、顺式-13-十八碳二烯基乙酸酯、茴香脑和异戊基水杨酸盐。
除化学引诱剂之外的其他方法也可用于吸引昆虫，包括各种波长或颜色的光。
vii.纳米胶囊/微胶囊/脂质体
在一些情况下，将组合物以微胶囊化配制品提供。将微胶囊化配制品与水混合并以与其他可喷雾配制品相同的方式喷雾。喷雾后，塑料涂层破裂并缓慢释放活性成分。
viii.载体
可配制本文所述的任何组合物以包括本文所述的调节剂和惰性载体。此类载体可以是固体载体、液体载体、凝胶载体和/或气体载体。在某些情况下，该载体可以是种子涂层。种子涂层是任何非天然存在的配制品，其全部或部分地粘附于种子表面。该配制品可以进一步包含佐剂或表面活性剂。该配制品还可以包含一种或多种调节剂以扩大作用光谱。
用于配制品的固体载体包括黏土(例如高岭土、硅藻土、膨润土、Fubasami黏土、酸性黏土等)、合成水合氧化硅、滑石、陶瓷、其他无机矿物质(例如，绢云母、石英、硫磺、活性炭、碳酸钙、水合二氧化硅等)、可以升华并在室温下呈固体形式的物质(例如，2，4，6-三异丙基-1，3，5-三氧杂环己烷、萘、对二氯苯、樟脑(camphor)、刚烷等)的细粉剂或粒剂；羊毛；蚕丝；棉花；大麻；纸浆；合成树脂(例如，聚乙烯树脂，如低密度聚乙烯、直低密度聚乙烯和高密度聚乙烯；乙烯-乙烯酯共聚物，如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物，如乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物和乙烯-甲基丙烯酸乙酯共聚物；乙烯-丙烯酸酯共聚物，如乙烯-丙烯酸甲酯共聚物和乙烯-丙烯酸乙酯共聚物；乙烯-乙烯基羧酸共聚物，如乙烯-丙烯酸共聚物；乙烯-四环十二烯共聚物；聚丙烯树脂，如丙烯均聚物和丙烯-乙烯共聚物；聚-4-甲基戊烯-1、聚丁烯-1、聚丁二烯、聚苯乙烯；丙烯腈-苯乙烯树脂；苯乙烯类弹性体，如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂、苯乙烯-共轭二烯嵌段共聚物、和苯乙烯-共轭二烯嵌段共聚物氢化物；氟树脂；丙烯酸树脂，如聚(甲基丙烯酸甲酯)；聚酰胺树脂，如尼龙6和尼龙66；聚酯树脂，如聚乙烯对苯二甲酸酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚丁烯对苯二甲酸酯、和聚对苯二甲酸亚环己基二亚甲酯；聚碳酸酯、聚缩醛、聚丙烯酰砜、聚芳酯、羟基苯甲酸聚酯、聚醚酰亚胺、聚酯碳酸酯、聚苯醚树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚氨酯、和有孔树脂(如发泡聚氨酯、发泡聚丙烯、或发泡乙烯等))、玻璃、金属、陶瓷、纤维、布料、针织物、片材、纸张、纱线、泡沫、有孔物质和复丝。
液体载体可以包括，例如，芳香族或脂肪族碳氢化合物(例如，二甲苯、甲苯、烷基萘、苯基二甲苯基乙烷、煤油、瓦斯油、己烷、环己烷等)、卤代烃(例如，氯苯、二氯甲烷、二氯乙烷、三氯乙烷等)、醇类(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、己醇、苄基醇、乙二醇等)、醚类(例如，乙醚、乙二醇二甲醚、二甘醇单甲醚、二甘醇单乙醚、丙二醇单甲醚、四氢呋喃、二噁烷等)、酯类(例如，乙酸乙酯、乙酸丁酯等)、酮类(例如，丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、环己酮等)、腈类(例如，乙腈、异丁腈等)、亚砜(例如，二甲亚砜等)、酰胺(例如，N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺)、环状亚胺(例如N-甲基吡咯烷酮)、亚烷基碳酸酯(例如，碳酸丙烯酯等)、蔬菜油(例如，大豆油、棉花籽油等)、植物精油(例如，橙油、海索油、柠檬油等)、或水。
气体载体可以包括，例如丁烷气、氟里昂气、液化石油气(LPG)、二甲醚和二氧化碳气体。
ix.佐剂
在一些情况下，本文提供的组合物可以包括佐剂。佐剂是不具有活性的化学物质。将佐剂在配制品中预混合或添加至喷雾罐中以改善混合或改善施用或提高性能。它们广泛用于为叶子施用而设计的产品中。佐剂可用于为特异性需要而定制配制品并补偿局部条件。佐剂可以设计用于执行特异性功能，包括润湿、涂抹、粘附、减少蒸发、减少挥发、缓冲、乳化、分散、减少喷雾漂移和减少发泡。没有单一佐剂可以执行所有这些功能，但是通常可以组合相容的佐剂以同时执行多种功能。
包含于配制品中的佐剂的非限制性实例包括：粘合剂、分散剂和稳定剂，具体为例如，酪蛋白、明胶、多糖(例如，淀粉、阿拉伯树胶、纤维素衍生物、海藻酸等)、木质素衍生物、膨润土、糖、合成水溶性聚合物(例如，聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸等)、PAP(酸性异丙基磷酸酯)、BHT(2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、BHA(2-叔丁基-4-甲氧基苯酚和3-叔丁基-4-甲氧基苯酚的混合物)、植物油、矿物油、脂肪酸和脂肪酸酯。
x.表面活性剂
在一些情况下，本文提供的组合物包括表面活性剂。表面活性剂，也称为润湿剂和涂布剂，在物理上改变喷雾液滴的表面张力。为了使配制品能够正常发挥其功能，喷雾液滴必须能够润湿叶子并均匀地散布在叶上。表面活性剂扩大了配制品的覆盖面积，从而增加了有害生物对化学物质的暴露。当将配制品施用于蜡质或多毛的叶时，表面活性剂特别重要。如果没有适当的润湿和涂布，喷雾液滴通常会流失或无法充分覆盖叶表面。然而，过多的表面活性剂会导致过多的径流并降低功效。
表面活性剂按其电离或分裂成称为离子的带电荷的原子或分子的方式分类。带负电荷的表面活性剂是阴离子的。带正电荷的表面活性剂是阳离子的，而不带电荷的表面活性剂是非离子的。在非离子表面活性剂存在下的配制品活性可以与在阳离子或阴离子表面活性剂存在下的活性完全不同。选择错误的表面活性剂会降低杀有害生物剂产品的功效并损害靶植物。当与接触杀有害生物剂(通过直接接触而不是系统吸收来控制有害生物的杀有害生物剂)一起使用时，阴离子表面活性剂是最有效的。阳离子表面活性剂绝不能用作独立的表面活性剂，因为它们通常具有植物毒性。
通常与系统杀有害生物剂一起使用的非离子表面活性剂有助于杀有害生物剂喷雾渗透植物角质层。非离子表面活性剂与大多数杀有害生物剂相容，并且大多数需要表面活性剂的EPA注册的杀有害生物剂推荐使用非离子型。佐剂包括但不限于黏着剂、增量剂、植物渗透剂、相容剂、缓冲液或pH改性剂、漂移控制添加剂、消泡剂、和增稠剂。
本文所述的组合物中包括的表面活性剂的非限制性实例包括烷基硫酸酯盐、烷基磺酸酯、烷基芳基磺酸酯、烷基芳基醚及其聚氧乙烯化产物、聚乙二醇醚、多元醇酯和糖醇衍生物。
xi.组合
在配制品和由这些配制品制备的使用形式中，调节剂可以处于含有其他活性化合物(例如杀有害生物剂(例如杀昆虫剂、杀菌剂、杀螨剂、杀线虫剂、杀软体动物剂或杀真菌剂；参见例如，列于表12中的杀有害生物剂)、引诱剂、生长调节物质或除草剂)的混合物中。如本文所用的，术语“杀有害生物剂”是指旨在用于预防、破坏、抵制或减轻任何有害生物的任何物质或物质的混合物。杀有害生物剂可以是用于对抗有害生物(包括与人竞争食物、破坏财产、传播疾病或是令人讨厌的昆虫、病原体、杂草和微生物)的化学物质或生物制剂。术语“杀有害生物剂”可以进一步涵盖其他生物活性分子，如抗生素、抗病毒杀有害生物剂、抗真菌剂、抗蠕虫剂、营养物、花粉、蔗糖和/或使昆虫运动减弱或减缓的药剂。
在将调节剂施用于植物的情况下，也可以使用含有其他已知化合物(例如除草剂、肥料、生长调节剂、安全剂、化学信息素)或用于改善植物特性的药剂的混合物。
V.递送
本文所述的宿主能以允许将组合物递送或给予至昆虫的任何合适方式而暴露于本文所述的任何组合物。调节剂可以单独递送或与其他活性或非活性物质组合递送，并且可以通过例如喷雾、显微注射、通过植物、倾倒、浸渍，以配制以递送有效浓度的调节剂的浓缩液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉剂、丸剂、块剂、砖剂等形式施用。施用本文所述的组合物的量和位置通常取决于宿主的习性、宿主微生物可被调节剂靶向的生命周期阶段、将施用的位置、以及调节剂的物理和功能特征。本文所述的调节剂可通过经口摄取给予至昆虫，但也可通过允许穿透角质层或穿透昆虫呼吸系统的方式给予。
在一些情况下，可以用包括调节剂的溶液简单地“浸泡”或“喷雾”昆虫。可替代地，调节剂可以与昆虫的食物组分(例如，可食用组分)连接以便于递送和/或为了增加昆虫对调节剂的摄取。用于经口引入的方法包括，例如将调节剂与昆虫的食物直接混合，将调节剂喷雾在昆虫的生境或田地中，以及工程化方法，其中将用作食物的物种工程化以表达调节剂，然后向有待被影响的昆虫饲喂该物种。在一些情况下，例如，该调节剂组合物可以掺入昆虫的饮食中或覆盖在昆虫的饮食的顶部。例如，可以将该调节剂组合物喷雾到昆虫栖息的作物田地上。
在一些情况下，通过例如背包喷雾、空中喷雾、作物喷雾/尘剂等将组合物直接喷雾到植物(例如作物)上。在将调节剂递送至植物的情况下，接受调节剂的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，配制的调节剂可以在植物生长的早期阶段作为种子涂层或根处理施用，或者在作物周期的后期作为总植物处理施用。在一些情况下，该调节剂可以作为局部制剂施用于植物，使得宿主昆虫在摄取或以其他方式与植物接触时与植物相互作用。
此外，可以将调节剂(例如，在植物生长的土壤中，或在用于浇灌植物的水中)作为通过植物的组织(例如茎或叶)或动物宿主而吸收和分布的内吸剂(systemic agent)施用，使得其上进食的昆虫将获得有效剂量的调节剂。在一些情况下，可以对植物或食物生物进行遗传转化以表达调节剂，使得以植物或饲料生物为食的宿主摄取调节剂。
延迟或持续释放也可以通过将调节剂或含有一种或多种调节剂的组合物涂覆有可溶解或生物可侵蚀涂层(例如明胶)(该涂层在使用环境中溶解或侵蚀，以使得该调节剂可用)或通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中来实现。此类持续释放和/或分配方式装置可有利地用于在特异性宿主生境中始终维持本文所述的一种或多种调节剂的有效浓度。
调节剂也可以掺入昆虫生长、生活、繁殖、进食或侵染的培养基中。例如，调节剂可以掺入食物容器、进食站、保护性包装或蜂巢中。对于一些施用，该调节剂可以与固体支持物结合，用于以粉剂形式或于“捕获器”或“进食站”中施用。例如，对于其中组合物用于捕获器或作为特定宿主昆虫的诱饵的施用，组合物也可以与固体支持物结合或包封在定时释放材料中。例如，本文所述的组合物可以通过将该组合物递送至媒介(例如，人病原体的媒介，例如蚊子、螨、咬虱、或蜱)生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境来给予。
VI.筛选
本文包括用于筛选调节剂的方法，这些调节剂有效改变宿主(例如昆虫)的微生物区系，从而降低宿主适合度。本文提供的筛选测定法可有效鉴定靶向寄宿于宿主的共生微生物的一种或多种调节剂(例如噬菌体)，从而降低宿主的适合度。例如，鉴定的调节剂(例如，噬菌体)可以有效减少降解杀有害生物剂或降解化感物质的微生物(例如，细菌，例如降解表12中列出的杀有害生物剂的细菌)的生存力，从而增加宿主对杀有害生物剂的敏感性(例如，对表12中列出的杀有害生物剂的敏感性)或化感剂的敏感性。
例如，可以筛选噬菌体文库以鉴定靶向寄宿于宿主的特异性内共生微生物的噬菌体。在一些情况下，可以将噬菌体文库以一种或多种环境样品(例如，土壤、池塘沉积物或污水)的形式提供。可替代地，噬菌体文库可以从实验室分离物产生。噬菌体文库可以与靶细菌菌株共培养。在与细菌菌株孵育后，将成功感染和裂解靶细菌的噬菌体富集在培养基中。富集噬菌体的培养物可以与另外的细菌一起进行任何次数的传代培养，以进一步富集感兴趣的噬菌体。可以分离噬菌体以用作本文所述的任何方法或组合物中的调节剂，其中该噬菌体以降低宿主适合度的方式改变宿主的微生物区系。
表12.杀有害生物剂
Figure BDA0002140147320001861
Figure BDA0002140147320001871
Figure BDA0002140147320001881
实例
以下是本发明的方法的实例。应理解，鉴于以上提供的一般性描述，可以实践各种其他的实施例。
实例1：用阿奇霉素溶液处理按蚊属(Anopheles)蚊子
本实例证明了通过用阿奇霉素(相对广但浅的抗菌活性)处理来杀死或降低科鲁齐伊按蚊(Anopheles coluzzii)蚊子的适合度并降低寄生虫传播率的能力。它抑制一些革兰氏阳性细菌、一些革兰氏阴性细菌和许多非典型细菌。阿奇霉素对蚊子的作用是通过调节与对阿奇霉素敏感的蚊子内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是Asaia。
蚊子被描述为世界上最危险的动物，疟疾是一种对人产生不利影响的蚊子传播的疾病。大约有3,500个蚊子物种，并且所有传播疟疾的蚊子物种都属于称为按蚊属(Anopheles)的子集。大约40种按蚊属(Anopheles)物种能够传播显著影响人健康的疟疾。
治疗性设计：配制与阿奇霉素溶液混合的血粉，其中1mL血液中最终抗生素浓度为0(阴性对照)、0.1、1或5μg/ml。
实验设计：
为了准备处理，使蚊子在实验室环境和培养基中生长。使用来自科鲁齐伊按蚊(Anopheles coluzzii)Ngousso集落(最初从喀麦隆收集的田间蚊子中发现)的雌性蚊子进行实验，将这些蚊子维持在人血上并且作为成虫用5％果糖饲喂。向幼虫饲喂四胺鱼食。在12小时光照/黑暗循环中，将温度保持在28℃(±1℃)，70％-80％湿度。
人血饲喂和疟原虫属(Plasmodium)感染：
将恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)NF54配子母细胞在RPMI培养基(GIBCO)中培养，该培养基包括300mg。L-1 L-谷氨酰胺，补充有50mg/L次黄嘌呤，25mM HEPES加10％热灭活的人血清，不含抗生素。在6％v/v洗涤的O+红细胞(RBC)中感染0.5％寄生虫血症前17和14天，开始两个25-mL的培养。每天更换培养基。在蚊子感染之前，合并离心的RBC并补充20％新鲜洗涤的RBC和人血清(RBC和血清之间的比例为2∶3v/v)。向蚊子提供血粉，这些血粉置于覆盖有石蜡膜并置于37℃下的膜进食装置(2ml Eppendorf管)中。
通过将阿奇霉素(西格玛奥德里奇公司，PZ0007)溶解于DMSO中来制备阿奇霉素溶液。将不同体积的阿奇霉素溶液添加至新鲜血液中至总量1mL以准备血粉。血液中的最终阿奇霉素浓度为0(仅溶剂作为对照溶液)、0.1、1或5μg/ml。
对于每个疟原虫属(Plasmodium)感染，向每种条件至少100只年龄匹配的、2至3日龄的蚊子提供对照血粉或实验血粉，这些血粉置于覆盖有石蜡膜并置于37℃下的膜进食装置(2ml Eppendorf管)，并去除非饱血的蚊子。每四天给予血粉一次，共计三次。在每次给予血粉之间，提供用蒸馏水润湿的棉垫供蚊子产卵。在第二次和之后的血粉给予后不去除未进食的蚊子。每天计数死亡，并且将尸体取出并储存用于如本文所述的Asaia分析。对于每个重复，每种浓度的阿奇霉素使用至少50只蚊子。在最后一次血粉给予结束时，在解剖前将蚊子饲养12小时。
通过定量聚合酶链反应进行微生物区系分析：
在解剖之前，将蚊子浸入70％乙醇中5分钟，然后在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗3次以杀死并去除表面细菌，从而在解剖期间最小化样品被角质层细菌的污染。取出每只蚊子(对照和阿奇霉素处理)的中肠并立即在干冰上冷冻并在20℃下储存直至加工。如果中肠破裂并且大量的肠道内容丢失，则将这些中肠从分析中排除。将样品在使用0.5mm宽的玻璃珠(贝尔坦公司)的Precellys 24匀浆器(贝尔坦公司)中，在6800rpm下，在苯酚-氯仿中匀浆30秒，并用苯酚-氯仿提取脱氧核糖核酸(DNA)。将16S核糖体DNA(rDNA)用于Asaia定量，并显示为按蚊属(Anopheles)管家基因40S核糖体蛋白S7(Vector-Base基因IDAGAP010592)的比率。Asaia的引物序列为：正向引物5’-GTGCCGATCTCTAAAAGCCGTCTCA-3’(SEQ ID NO：219)和反向引物5’-TTCGCTCACCGGCTTCGGGT-3’(SEQ ID NO：220)，以及S7的引物序列为：正向引物5’-GTGCGCGAGTTGGAGAAGA-3’(SEQ ID NO：221)和反向引物5’-ATCGGTTTGGGCAGAATGC-3’(SEQ ID NO：222)。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(塔卡拉公司)，在7500快速实时热循环仪(应用生物系统公司)上按照制造商的说明进行定量聚合酶链反应(qPCR)。阿奇霉素处理的蚊子显示Asaia特异性基因的减少。
将用阿奇霉素处理的蚊子的存活率与用阴性对照处理的蚊子的存活率进行比较。与对照相比，用阿奇霉素溶液处理的蚊子的存活率降低。
实例2：用抗生素溶液处理剌扰伊蚊(Aedes vexans)蚊子
本实例证明了通过用强力霉素(一种抑制蛋白质产生的广谱抗生素)处理来杀死或降低刺扰伊蚊(Aedes vexans)蚊子的适合度的能力。强力霉素对蚊子的作用是通过调节与对强力霉素敏感的蚊子内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是沃尔巴克氏体属(Wolbachia)。
成功控制和根除猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对于当今的全球养猪业至关重要。为了降低PRRSV进入的风险，养猪场主(swine producer)采用严格的措施来提高其农场的生物安全性；然而，猪群中PRRSV的感染仍然经常发生。PRRSV的一种传播媒介是刺扰伊蚊(Aedes vexans)蚊子。刺扰伊蚊(Aedes vexans)是一种世界性的常见有害蚊子。除PRRSV之外，它也是已知的犬心丝虫(Dirofilaria immitis)(狗心丝虫(dog heartworm))；粘液瘤变性(致死性兔病毒病)和东部马脑炎(美国的致死性马病毒病)的媒介。刺扰伊蚊(Aedesvexans)是欧洲最常见的蚊子，通常占欧洲蚊群落的80％以上。其数量取决于洪水池的有效性。在夏季，蚊子捕获器每晚可以在每个诱捕器收集多达8,000只蚊子。
治疗性设计：配制与强力霉素溶液混合的血粉，其中1mL血液中最终抗生素浓度为0(阴性对照)、1、10或50μg/ml。
实验设计：
为了准备处理，使蚊子在实验室环境和培养基中生长。使用来自刺扰伊蚊(Aedesvexans)(最初从明尼苏达大学圣保罗分校的田地上收集的田间蚊子中发现)的雌性蚊子进行实验，将这些蚊子维持在人血上并且作为成虫用5％果糖饲喂。通过将强力霉素(西格玛奥德里奇公司(SIGMA-ALDRICH)，D9891)溶解于无菌水中来制备强力霉素溶液。将不同体积的强力霉素溶液添加至新鲜血液中至总量1mL以准备血粉。血液中的最终强力霉素浓度大约为0(对照溶液)、1、10或50μg/ml。
对于每个重复，向年龄匹配的、2至3日龄的蚊子提供对照血粉或实验血粉，这些血粉置于覆盖有石蜡膜并置于37℃下的膜进食装置(2ml Eppendorf管)中。弃去非饱血的蚊子。每四天给予血粉一次，共计三次。在每次给予血粉之间，提供用蒸馏水润湿的棉垫供蚊子产卵。在第二次和之后的血粉给予后不去除未进食的蚊子。每天计数死亡，并且将尸体取出并储存用于如本文所述的沃尔巴克氏体属(Wolbachia)分析。对于每个重复，每种浓度的强力霉素使用至少50只蚊子。在最后一次血粉给予结束时，在解剖前将蚊子饲养12小时。
通过定量聚合酶链反应进行微生物区系分析：
在解剖之前，将蚊子浸入70％乙醇中5分钟，然后在无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冲洗3次以杀死并去除表面细菌，从而在解剖期间最小化样品被角质层细菌的污染。取出每只蚊子(对照和强力霉素处理)的中肠并立即在干冰上冷冻并在20℃下储存直至加工。如果中肠破裂并且大量的肠道内容丢失，则将这些中肠从分析中排除。将样品在使用0.5mm宽的玻璃珠(贝尔坦公司(Bertin))的Precellys 24匀浆器(贝尔坦公司)中，在6800rpm下，在苯酚-氯仿中匀浆30秒，并用苯酚-氯仿提取脱氧核糖核酸(DNA)。将16S核糖体DNA(rDNA)用于沃尔巴克氏体属(Wolbachia)定量，并显示为伊蚊属(Aedes)管家基因40S核糖体蛋白S7(Vector-Base基因ID AAEL009496)的比率。沃尔巴克氏体属(Wolbachia)的引物序列为：正向引物5′-TCAGCCACACTGGAACTGAG-3′(SEQ ID NO：225)和反向引物5′-TAACGCTAGCCCTCTCCGTA-3′(SEQ ID NO：226)；以及S7的引物序列为：正向引物5’-AAGGTCGACACCTTCACGTC-3’(SEQ ID NO：227)和反向引物5’-CCGTTTGGTGAGGGTCTTTA-3’(SEQ ID NO：228)。使用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(塔卡拉公司(Takara))，在7500快速实时热循环仪(应用生物系统公司(Applied Biosystem))上按照制造商的说明进行定量聚合酶链反应(qPCR)。强力霉素处理的蚊子显示沃尔巴克氏体属(Wolbachia)特异性基因的减少。
将用强力霉素溶液处理的蚊子的存活率与用阴性对照处理的蚊子的存活率进行比较。与对照相比，用强力霉素溶液处理的蚊子的存活率降低。
实例3：用抗生素溶液处理安氏矩头蜱(Dermacentor andersoni)
本实例证明了通过用Liquamycin LA-200土霉素(一种通常用于治疗牛的广泛细菌感染的广谱抗生素)处理来杀死或降低蜱(安氏矩头蜱(Dermacentor andersoni))的适合度的能力。Liquamycin LA-200土霉素对蜱的作用是通过调节与对Liquamycin LA-200土霉素敏感的蜱内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是立克次体属(Rickettsia)。
蜱是以脊椎动物为食的专性吸血节肢动物，并且由于它们能够将疾病传播给人和动物，给畜牧业带来了巨大的经济损失。特别地，蜱传播遍及所有大陆的病原体，并被标记为动物源性病原体的主要媒介。事实上，自1982年莱姆病被表征以来，已发现415种新的蜱传播的细菌病原体。安氏矩头蜱(Dermacentor andersoni)(洛矶山林蜱(Rocky Mountainwood tick))被称为“名副其实的致病原因的潘多拉魔盒”，并传播了包括立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)和土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)在内的若干种病原体。它也是牛边缘无浆体(Anaplasma marginale)的媒介，无形体病(anaplasmosis)的原因，以及畜牧业世界范围内最广泛的蜱传播的病原体(Gall等人，TheISMEJournal[ISME期刊]10：1846-1855，2016)。在美国，由于牛的无形体病(anaplasmosis)导致的经济损失估计为每年$3亿美元(Rochon等人，J.Med.Entomol.[医学昆虫学杂志]49：253-261，2012)。
治疗性设计：施用蜱后-4、-1、+3和+5天，接受治疗剂量(11mg/kg体重)的Liquamycin LA-200土霉素注射。
实验设计：
在俄勒冈州班斯湖(Burns)和蒙大纳州科莫湖(Lake Como)的地点通过标记和拖曳技术(flag and drag technique)收集正在研究的成年安氏矩头蜱(D.andersoni)，如在(Scoles等人，J.Med.Entomol.[医学昆虫学杂志]42：153-162，2005)中所述的。将田间收集的蜱用于建立实验室集落。对于蜱细菌分析，向来自每个集落的一个组群的成虫F1或F2雄性蜱饲喂荷斯坦犊牛并解剖以收集中肠(MG)和唾液腺(SG)用于如下的基因组DNA分离和细菌定量：
向一个组群的F1蜱饲喂用抗生素处理的犊牛或未经处理的犊牛(对照)。在施用蜱后-4、-1、+3和+5天抗生素治疗的犊牛接受治疗剂量(11mg/kg体重)的Liquamycin LA-200土霉素注射，而未经处理的犊牛不接受任何注射(未经处理的对照)。允许雌性蜱排卵以继续第二代未经处理和经处理的蜱(F2代)。F2处理的代来自于暴露于抗生素的F1成虫。F2蜱不经受抗生素。
将F1和F2代成年雄性蜱饲喂7天，然后在24小时内解剖。每天计数死亡，并将蜱取出并储存用于如本文所述的立克次体属(Rickettsia)分析。在解剖之前，将蜱进行表面消毒，并且在每次解剖之间对所有解剖工具进行消毒。将蜱MG和SG解剖并合并成30个的组，其中具有三个生物学重复。将组织储存在细胞裂解溶液(凯杰公司(Qiagen)，美国加利福尼亚州华伦西亚)和蛋白酶K(1.25mg/ml)中。使用PureGene提取试剂盒(凯杰公司)根据制造商的说明书分离基因组DNA。
贝氏立克次体(Rickettsia bellii)的定量分析：
为了定量立克次体属(Rickettsia)，使用在F1和F2蜱中未处理的和抗生素处理的SYBR Green定量PCR来测量rickA基因拷贝数。使用正向引物(5′-TACGCCACTCCCTGTGT CA-3′；SEQ ID NO：229)和反向引物(5′-GATGTAACGGTATTAC ACCAACAG-3′；SEQ ID NO：230)确定立克次体(Rickettsia)的量。在合并的样品的F1和F2的MG和SG中测量细菌量。使用SYBRPremix Ex Taq试剂盒(塔卡拉公司)，在7500快速实时热循环仪(应用生物系统公司)上按照制造商的说明进行定量聚合酶链反应(qPCR)。Liquamycin LA-200土霉素处理的蜱显示立克次体属(Rickettsia)特异性基因的减少。
将用抗生素溶液处理的蜱的存活率与未处理的蜱的存活率进行比较。与未处理的相比，用Liquamycin LA-200土霉素溶液处理的蜱的存活率降低。
实例4：用利福平溶液处理感染牲畜的螨
本实例证明了通过用抗生素溶液处理螨来杀死或降低其适合度的能力。本实例证明了土霉素对螨的作用是通过调节与对土霉素敏感的螨内源的细菌群体(如芽孢杆菌属(Bacillus))来介导的。
犬疥螨(sarcoptic mange)是由通过钻洞深入皮肤并在洞内产卵来侵染动物的螨所引起的。卵孵化到幼虫阶段。然后幼虫螨离开洞，向上移动到皮肤表面，并开始在健康的皮肤组织中形成新洞。从卵到成虫的发育在大约2周内完成。由这些螨侵染引起的损伤是动物免疫系统对螨存在做出反应的结果。由于动物的免疫应答强度，只需少量螨就可以产生广泛损伤和全身性皮炎。虽然可以用化学合成的杀螨药杀死螨，但是这些类型的化学物质必须用高压液压喷雾设备喷雾在畜群中的每只动物身上，以确保通过喷雾穿透到皮肤中。此外，这些类型的化学杀有害生物剂可以具有不利的生态和/或农业作用。
治疗性设计：将土霉素溶液用含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的0(阴性对照)、1、10、或50μg/ml于10mL无菌水配制。
实验设计：
为了确定生殖阶段的成年螨与寄生螨或其子代(因为它们的角质层没有硬化)相比是否具有不同的易感性，收集了生活在牲畜上的螨和与幼虫和蛹相关的螨。该测定在不同类型的螨上测试了抗生素溶液，并通过靶向内源性微生物(如芽孢杆菌属(Bacillus))确定了它们的适合度如何改变。
从感染螨的猪中收集传种的螨。通过用尖的茶匙轻轻刮擦外壳区域并从猪的内耳区域剥离来收集皮肤样品，随后检查螨。
根据年龄对螨进行分组并分别进行测定。根据幼虫或蛹的形态和色素沉着确定年龄如下：将从小到足以移动的吐丝期幼虫收集的螨分为第1组；将从太大而不能放在蛹室中并开始用它们的嘴朝蛹室开口方向伸直的成蛹期幼虫收集的螨分为第2组；以及将从蛹中收集的螨分为第3组。将螨以其宿主幼虫或蛹储存在有盖玻璃培养皿中，直至收集50个单位。这确保了它们的进食常规和生理状态保持不变。为了防止螨从其宿主幼虫或蛹中离群或相互攀爬，只有处于相同发育阶段的宿主才能饲养在同一培养皿中。
将设备(不锈钢环(内径56mm，高2-3mm)和2个玻璃圈(直径62mm))用丙酮和己烷或戊烷清洗，以形成测试场所。通过均匀喷雾玻璃皿和所在场所的环，将土霉素溶液和对照溶液施用到设备上。为此，在贮存器中加载1ml的溶液；将喷雾表面距管底端的距离设定为11mm，并使用0.0275英寸喷嘴。调节压力(通常在350-500hPa的范围内)，直至沉积的溶液量为1±0.05mg/cm2。将抗生素溶液倾倒入它们各自的培养皿中，覆盖培养皿的整个底部，并在通风橱下蒸发残留的液体。将环放置在玻璃圈之间以构建笼子。笼子在制备60小时内使用，用于不超过三次测定，以控制螨在抗生素溶液中的暴露。在该笼中引入10至15个螨，并且将设备片与熔化的蜡液滴结合在一起。使用从吐丝期幼虫、成蛹期幼虫、白眼蛹和黑眼蛹(具有白色和苍白身体)收集的螨。
4小时后，将螨转移到干净的有盖玻璃培养皿(直径60mm)中，用两只或三只白眼蛹(加盖后4-5天)饲喂。在用抗生素或对照溶液处理后4小时、24小时和48小时，在解剖显微镜下观察螨，并根据以下类别分类：
·移动：无论是否用针戳后，它们均会用腿四处移动。
·瘫痪：未受刺激或刺激后，它们移动一个或多个附属肢体，但它们无法四处移动。
·死亡：不动，且不会对随后的3次刺激做出反应。
使用无菌牙签或针通过触碰它们的腿来刺激螨。用新的牙签或无菌针对每组进行刺激，以避免螨组之间的污染。
测定在32.5℃和60％-70％相对湿度下进行。如果对照组的死亡率超过30％，则排除该重复。每个实验都重复四个系列的笼子。
通过PCR评估螨组中芽孢杆菌的状态。根据制造商的方案，使用DNA试剂盒(OMEGA，美国宝特公司(Bio-tek))从对照(非土霉素处理的)和土霉素处理的个体(全身)中分离总DNA。基于23S-5S rRNA序列(获得自芽孢杆菌基因组(保藏号：AP007209.1))，使用引物5.0软件(引物E有限公司(Primer-E Ltd.)，英国普利茅斯)设计芽孢杆菌(Bacillus)的引物(正向引物5′-GAGGTAGACGAAGCGACCTG-3′(SEQ ID NO：231)和反向引物5′-TTCCCTCACGGTACTGGTTC-3′(SEQ ID NO：232))(Takeno等人，J.Bacteriol.[细菌学杂志]194(17)：4767-4768，2012)。PCR扩增循环包括在95℃持续5分钟的初始变性步骤，95℃持续1分钟、59℃持续1分钟、和72℃持续2分钟的35个循环，以及在72℃进行5分钟的最终延伸步骤。将来自土霉素处理和对照样品的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分析、用SYBR safe染色、并且使用成像系统可视化。
将用土霉素溶液处理的螨的存活率与用阴性对照处理的瓦螨(Varroa mite)的存活率进行比较。
与对照相比，预期用土霉素溶液处理的螨的存活率和迁移降低。
实例5：噬菌体文库的生产
本实例证明了从环境样品中收集获得噬菌体。
治疗性设计：噬菌体文库集合具有如下噬菌体科：肌尾噬菌体科(Myoviridae)、长尾噬菌体科(Siphoviridae)、短尾噬菌体科(Podoviridae)、脂毛噬菌体科(Lipothrixviridae)、古噬菌体科(Rudiviridae)、Ampullaviridae、Bicaudaviridae、Clavaviridae、覆盖噬菌体科(Corticoviridae)、囊状噬菌科(Cystoviridae)、纺锤形噬菌体科(Fuselloviridae)、Gluboloviridae、滴状病毒科(Guttaviridae)、丝状噬菌体科(Inoviridae)、光滑噬菌体科(Leviviridae)、微小噬菌体科(Microviridae)、芽生噬菌体科(Plasmaviridae)、复层病毒科(Tectiviridae)。
实验设计：
经2周在无菌1L烧瓶中收集多个环境样品(土壤、池塘沉积物、污水)，并在收集后立即如下所述进行处理，然后在4℃下储存。将固体样品在无菌双倍强度difco公司卢里亚肉汤(Luria Broth，LB)中或补充有2mM CaCl2至最终体积100mL的胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中进行匀浆。使用磷酸盐测试条测量pH和磷酸盐水平。为了纯化，将所有样品在+4℃下在Megafuge 1.0R(贺利氏公司(Heraeus))或Eppendorf离心机5702R中以3000-6000g离心10-15分钟，并通过0.2-μm低蛋白质滤器过滤以除去所有剩余的细菌细胞。将上清液在氯仿存在下在4℃下储存于玻璃瓶中。
实例6：靶特异性噬菌体的鉴定
本实例证明了来自异源噬菌体文库的单个靶特异性噬菌体的分离、纯化和鉴定。
实验设计：
用LB-肉汤将20-30ml实例5中所述的噬菌体文库稀释至30-40ml的体积。添加靶细菌菌株，例如布赫纳氏菌(50-200μl在LB-肉汤中生长的过夜培养物)以富集靶向培养物中的该特异性细菌菌株的噬菌体。将该培养物在+37℃孵育过夜，以230rpm振荡。通过离心(3000-6000g，在Megafuge 1.0R(贺利氏公司)或在Eppendorf离心机5702R中，15-20分钟，+4℃)去除来自该富集培养物的细菌，并过滤(0.2μm或0.45μm滤器)。将2.5ml无菌培养物添加至2.5ml的LB-肉汤和50-100μl靶细菌中以富集噬菌体。将富集培养物如上生长过夜。将来自该富集培养物的样品在室温下以13,000g离心15分钟，并将10μl上清液铺板在含有LB-琼脂、同时含有100-300μl靶细菌和3ml熔化的0.7％软琼脂的培养皿上。将板在+37℃下孵育过夜。挑选在细菌菌苔上观察到的每个噬斑并将其转移到500μl的LB肉汤中。将来自该噬斑储备液的样品进一步铺板在靶细菌上。对所有发现的噬菌体进行三次噬斑纯化，以从异质噬菌体混合物中分离单个同质噬菌体。
通过收获表现出融合裂解的宿主细菌菌株的覆盖板制备来自具有高滴度噬菌体(＞1x10^10PFU/ml)的平板的裂解物。在用5ml缓冲液充满后，将软琼脂覆盖物浸软，通过离心澄清，并过滤灭菌。将得到的裂解物储存在4℃。通过等密度CsCl离心进一步纯化高滴度噬菌体裂解物，如在(Summer等人，J.B.acteriol.[细菌学杂志]192：179-190，2010)中所述的。
如在(Summer，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]502：27-46，2009)中所述的，从CsCl纯化的噬菌体悬浮液中分离DNA。通过使用454焦磷酸测序方法将个体分离的噬菌体测序为两个噬菌体基因组库的一部分。将噬菌体基因组DNA以等摩尔量混合至最终浓度为约100ng/L。将合并的DNA剪切，与对每个合并具有特异性的多重标识符(MID)标签连接，并根据制造商的方案使用Roche FLX Titanium测序仪上的全板反应通过焦磷酸测序法进行测序。将合并的噬菌体DNA存在于两个测序反应中。通过使用Newbler Assembler版本2.5.3(454生命科学公司(Life Sciences))，通过调整设置以仅包括每个组件包含单个MID的读数，将对应于每个合并的修整的FLX Titanium流量图输出单独组装。使用针对重叠群序列产生的引物和作为模板的个体噬菌体基因组DNA制备物，通过PCR确定个体重叠群的同一性。使用Sequencher 4.8(基因编码公司(Gene Codes Corporation))进行序列组装和编辑。通过实验确定噬菌体染色体端结构。通过对噬菌体基因组端进行测序以及对通过扩增(通过环化基因组DNA的连接的接点)衍生的PCR产物进行测序来确定噬菌体的粘性(cos)端，如在(Summer，Methods Mol.Biol.[分子生物学方法]502：27-46，2009)中所述的。蛋白质编码区最初使用GeneMark.hmm预测(Lukashin等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]26：1107-1115，1998)，通过Artemis中的人工分析进行精化(Rutherford等人，Bioinformatics[生物信息学]16：944-945，2000.)，并通过使用BLAST(E值截止值为0.005)进行分析(Camacho等，BMCBioinformatics[BMC生物信息学]10：421，2009)。通过InterProScan另外分析了特别感兴趣的蛋白质(Hunter等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]40：D306-D312，2012)。
通过用胰蛋白酶大豆肉汤缓冲液稀释储备液，进行裂解内共生细菌布赫纳氏菌的CsCl纯化的噬菌体(＞1x10^11PFU/ml)的电子显微镜检查。将噬菌体施用到薄的400目碳涂覆的Formvar网格上，用2％(wt/vol)乙酸铀酰染色，并风干。在以100kV的加速电压操作的JEOL 1200EX透射电子显微镜上观察试样。测量每个噬菌体的五个病毒粒子以在适当时计算衣壳和尾的尺寸的平均值和标准偏差。
实例7：用纯化的噬菌体溶液处理蚜虫
本实例证明了通过用噬菌体溶液处理蚜虫来杀死或降低蚜虫的适合度的能力。本实例证明了噬菌体对蚜虫的作用是通过调节与对噬菌体敏感的蚜虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是具有实例6中产生的噬菌体的布赫纳氏菌。
蚜虫是用于测试微生物区系调节剂和对蚜虫适合度的作用的代表性物种。
治疗性设计：
将噬菌体溶液用来自实例6的0(阴性对照)、102、105、或108的噬斑形成单元(pfu)/ml的噬菌体在10mL含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水中配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16小时光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，在24℃(伴随16小时的光照和8小时的黑暗)，蚕豆植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
如本文所述的制备噬菌体溶液。将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal of Zoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的无菌水以及0.5％蔗糖和必需氨基酸混合、或与含有改变的噬菌体浓度的噬菌体溶液混合。将噬菌体溶液与人工饲料混合以得到最终浓度在102与108(pfu)/ml之间的噬菌体。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新进食小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续4天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
通过PCR评估蚜虫样品中布赫纳氏菌的状态。将来自阴性对照(非噬菌体处理的)和噬菌体处理的组首先用70％乙醇(持续1分钟)、10％漂白剂(持续1分钟)表面灭菌，并用超纯水(持续1分钟)洗涤三次。根据制造商的方案，使用昆虫DNA试剂盒(OMEGA，美国宝特公司)从每个个体(全身)中提取总DNA。基于23S-5S rRNA序列(获得自布赫纳氏菌基因组(保藏号：GCA_000009605.1))，使用引物5.0软件(引物E有限公司，英国普利茅斯)设计布赫纳氏菌的引物(正向引物5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′(SEQ ID NO：233)和反向引物5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3′(SEQ ID NO：234))(Shigenobu等人，Nature[自然]407：81-86，2000)。PCR扩增循环包括在95℃持续5分钟的初始变性步骤，95℃持续30秒、55℃持续30秒、和72℃持续60秒的35个循环，以及在72℃进行10分钟的最终延伸步骤。将来自利福平处理和对照样品的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分析、用SYBR safe染色、并且使用成像系统可视化。噬菌体处理的蚜虫显示出布赫纳氏菌特异性基因的减少。
将用布赫纳氏菌特异性噬菌体处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫的存活率进行比较。与对照处理的蚜虫相比，用布赫纳氏菌特异性噬菌体处理的蚜虫的存活率降低。
实例8：colA细菌素溶液的生产
本实例证明了colA细菌素的生产和纯化。
构建体序列：
Figure BDA0002140147320002041
实验设计：
用具有上游(NdeI)和下游(XhoI)限制性位点的特异性引物通过PCR产生DNA。正向引物GTATCTATTCCCGTCTACGAACATATGGAATTCC(SEQ ID NO：236)和反向引物CCGCTCGAGCCATCTGACACTTCCTCCAA(SEQ ID NO：237)。用NdeI或XhoI消化纯化的PCR片段(Nucleospin Extract II-马歇雷纳高公司(Macherey Nagel))，然后连接片段。对于colA克隆，将连接的DNA片段克隆到pcr2.1(GenBank数据库登录号EY122872)运载体中(Anselme等人，BMC Biol.[BMC生物学]6：43，2008)。系统地检查核苷酸序列(Cogenics公司)。
将具有colA序列的质粒在BL21(DE3)/pLys中表达。细菌在30℃下在LB肉汤中生长。在OD600为0.9时，添加异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至最终浓度为1mM，并且使细胞生长6小时。通过在100mM NaCL、1％Triton X-100、100mM Tris-碱(pH 9.5)中超声处理来裂解细菌，并将蛋白质加载到HisTrap HP柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))上。依次用100mM NaCl、100mM Tris-HCl(pH 6.8)和PBS洗涤柱。用PBS中的0.3M咪唑进行洗脱。将脱盐PD-10柱(通用电气医疗集团(GE Healthcare))用于消除咪唑，并将PBS溶解的肽在离心滤器单元(密理博公司(Millipore))上浓缩。
ColA蛋白序列：
Figure BDA0002140147320002051
实例9：用colA细菌素的溶液处理蚜虫
此实例证明了通过用细菌素溶液处理蚜虫来杀死或降低蚜虫适合度的能力。此实例证明了细菌素对蚜虫的作用是通过调节与对ColA细菌素敏感的蚜虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是具有实例8中产生的细菌素的布赫纳氏菌。
治疗性设计：
将ColA溶液用来自实例8的0(阴性对照)、0.6、1、50或100mg/ml的ColA在10mL含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水中配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16小时光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中，并且被蚜虫侵染。在相同的气候条件中，从大规模生产获得细扁食蚜蝇(E.balteatus)幼虫；将食蚜蝇(hoverflie)用糖、花粉和水饲养；在3小时期间通过在饲养笼中引入受侵染的宿主植物来诱导产卵。在每天被蚜虫重新侵染的宿主植物上发生完整的生命周期。
将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal ofZoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水的溶液混合、或与含有改变的ColA浓度的ColA溶液混合。将ColA溶液与人工饲料混合以获得0.6至100mg/ml之间的最终浓度。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新进食小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续4天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
通过PCR评估蚜虫样品中布赫纳氏菌的状态。将来自阴性对照和噬菌体处理的蚜虫成虫首先用70％乙醇(持续1分钟)、10％漂白剂(持续1分钟)表面灭菌，并用超纯水(持续1分钟)洗涤三次。根据制造商的方案，使用昆虫DNA试剂盒(OMEGA，美国宝特公司)从每个个体(全身)中提取总DNA。基于23S-5S rRNA序列(获得自布赫纳氏菌基因组(保藏号：GCA_000009605.1))，使用Primer 5.0软件(引物E有限公司，英国普利茅斯)设计布赫纳氏菌的引物(正向引物5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′(SEQ ID NO：233)和反向引物5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3′(SEQ ID NO：234))(Shigenobu等人，Nature[自然]200.407，81-86)。PCR扩增循环包括在95℃持续5分钟的初始变性步骤，95℃持续30秒、55℃持续30秒、和72℃持续60秒的35个循环，以及在72℃进行10分钟的最终延伸步骤。将来自利福平处理和对照样品的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分析、用SYBR safe染色、并且使用成像系统可视化。ColA处理的蚜虫显示布赫纳氏菌特异性基因的减少。
将用布赫纳氏菌特异性ColA细菌素处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫的存活率进行比较。与对照处理的蚜虫相比，用布赫纳氏菌特异性ColA细菌素处理的蚜虫的存活率降低。
实例10：用利福平溶液处理蚜虫
此实例证明了通过用利福平(一种通过抑制细菌RNA聚合酶而抑制DNA依赖性RNA合成的窄谱抗生素)处理蚜虫来杀死或降低蚜虫适合度的能力。此实例证明了利福平对蚜虫的作用是通过调节与对利福平敏感的蚜虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计：
将抗生素溶液用0(阴性对照)、1、10、或50μg/ml的利福平在10mL含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水中配制。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16小时光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，在24℃(伴随16小时的光照和8小时的黑暗)，蚕豆植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
通过将利福平(西格玛奥德里奇公司，557303)溶解于含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水中来制备利福平溶液。将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal of Zoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的无菌水以及0.5％蔗糖和必需氨基酸混合，或与含有利福平浓度中的一种的利福平溶液混合。将利福平溶液与人工饲料混合以得到最终浓度在1与50μg/mL之间的抗生素。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新饲喂小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续四天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
通过PCR评估蚜虫样品中布赫纳氏菌的状态。根据制造商的方案，使用昆虫DNA试剂盒(OMEGA，美国宝特公司)从对照(非利福平处理的)和利福平处理的个体中分离总DNA。基于23S-5S rRNA序列(获得自布赫纳氏菌基因组(保藏号：GCA_000009605.1))，使用引物5.0软件(引物E有限公司，英国普利茅斯)设计布赫纳氏菌的引物(正向引物5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′(SEQ ID NO：233)和反向引物5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3(SEQ IDNO：234))(Shigenobu等人，Nature[自然]407：81-86，2000)。PCR扩增循环包括在95℃持续5分钟的初始变性步骤，95℃持续30秒、55℃持续30秒、和72℃持续60秒的35个循环，以及在72℃进行10分钟的最终延伸步骤。将来自利福平处理和对照样品的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分析、用SYBR safe染色、并且使用成像系统可视化。利福平处理的蚜虫显示布赫纳氏菌特异性基因的减少。
将用利福平溶液处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫的存活率进行比较。与对照相比，用利福平溶液处理的蚜虫的存活率降低。
实例11：布赫纳氏菌靶向分子的高通量筛选(HTS)
此实例证明了靶向布赫纳氏菌的分子的鉴定。
实验设计：用于鉴定靶向的细菌菌株(布赫纳氏菌)的抑制剂的HTS使用在pH-MMSuc培养基中的蔗糖发酵(Ymele-Leki等人，PLoS ONE[公共科学图书馆期刊]7(2)：e31307，2012)以降低培养基的pH。培养基中的pH指示剂通过615nm处的吸光度变化(A615)分光光度法监测培养基酸化。将衍生自甘油储备液的靶细菌菌株(布赫纳氏菌)铺板在LB琼脂板上并在37℃孵育过夜。收获一菌环量的细胞，用PBS洗涤三次，然后在0.015的光密度下重悬于PBS中。
对于HTS，将10μL的此细菌细胞悬浮液等分到含有30μL的pH-MMSuc培养基和100nL测试化合物级分的384孔板的孔中，该测试化合物级分来自微生物来源(如在(Ymele-Leki等人，PLoS ONE[公共科学图书馆期刊]7(2)：e31307，2012)中所述的真菌内生菌、细菌内生菌、土壤细菌和海洋细菌)的预分馏提取物(排列在384孔板中的39,314种提取物)的天然产物文库。对于每个测定，在室温孵育6小时和20小时后测量A615。使用EnVisionTM多孔分光光度计以384孔板格式自动化并验证此步骤，以测试来自文库的所有级分。选择通过蔗糖发酵证明延迟培养基酸化并抑制细胞生长的级分用于进一步纯化和鉴定。
实例12：布赫纳氏菌特异性分子的分离和鉴定
此实例证明了来自实例11中所述的级分的分离物的分离和鉴定，该分离物阻断蔗糖发酵并抑制布赫纳氏菌的细胞生长。
实验设计：
将实例11中所述的级分重悬浮于90％水/甲醇中并穿过C18 SPE柱以得到级分I。然后将该柱用甲醇洗涤以得到级分II。将级分II在具有制备型苯基-己基柱(菲罗门(Phenomenex)，Luna，25cm610mm、5mm粒度)的安捷伦(Agilent)1100系列HPLC上进行分离，使用含有20％乙腈/水与0.1％甲酸的洗脱缓冲液在2mL/min的流速下持续50分钟。这在不同的洗脱时间产生多种化合物。在αFT-IR质谱仪(布鲁克公司(Bruker))，UltrospecTM5300pro UV/可见分光光度计(安玛西亚生物科学(Amersham Biosciences))和INOVA600MHz核磁共振光谱仪(瓦里安公司(Varian))上获得每种化合物的光谱。
实例13：用布赫纳氏菌特异性分子的溶液处理蚜虫
此实例证明了通过调节与对此化合物敏感的蚜虫内源的细菌群体，用实例12中鉴定的化合物之一处理蚜虫来杀死或降低蚜虫的适合度的能力。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计：
在10mL含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水中，以0(阴性对照)、0.6、1、20或80μg/ml配制来自实例12的每种化合物。
实验设计：
为了准备处理，使蚜虫在实验室环境和培养基中生长。在气候控制室(16小时光照光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，在24℃(伴随16小时的光照和8小时的黑暗)，蚕豆植物生长在蛭石和珍珠岩的混合物中。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，将从健康植物收集第二龄和第三龄蚜虫并将其分成不同处理，使得每个处理从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
将96孔板的孔填充200μl的人工蚜虫饲料(Febvay等人，Canadian Journal ofZoology[加拿大动物学杂志]，66(11)：2449-2453，1988)，并且将板用石蜡膜覆盖以制成进食小袋。将人工饲料与作为阴性对照的含有0.5％蔗糖和必需氨基酸的无菌水混合、或与含有改变的化合物浓度的溶液混合。
对于每次重复处理，将30-50只第二龄和第三龄蚜虫分别置于96孔板的孔中，并在其上方倒置进食小袋板，允许昆虫通过石蜡膜进食并将它们限制在单个孔中。将实验蚜虫与蚜虫集落保持在相同的环境条件下。在蚜虫进食24小时后，将进食小袋用含有无菌人工饲料的新进食小袋替换，并且每24小时提供新的无菌小袋，持续4天。在替换小袋时，还检查蚜虫的死亡率。如果蚜虫已经变成棕色或位于孔底并且在观察期间不移动，则将其视为死亡。如果蚜虫在进食小袋的石蜡膜上但没有移动，则认为它将进食并且存活。
通过PCR评估蚜虫样品中布赫纳氏菌的状态。将来自阴性对照和化合物1处理的蚜虫首先用70％乙醇(持续1分钟)、10％漂白剂(持续1分钟)表面灭菌，并用超纯水(持续1分钟)洗涤三次。根据制造商的方案，使用昆虫DNA试剂盒(OMEGA，美国宝特公司)从每个个体(全身)中提取总DNA。基于23S-5S rRNA序列(获得自布赫纳氏菌基因组(保藏号：GCA_000009605.1))，使用引物5.0软件(引物E有限公司，英国普利茅斯)设计布赫纳氏菌的引物(正向引物5′-GTCGGCTCATCACATCC-3′(SEQ ID NO：233)和反向引物5′-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3′(SEQ ID NO：234))(Shigenobu等人，Nature[自然]407：81-86，2000)。PCR扩增循环包括在95℃持续5分钟的初始变性步骤，95℃持续30秒、55℃持续30秒、和72℃持续60秒的35个循环，以及在72℃进行10分钟的最终延伸步骤。将来自化合物1处理和对照样品的扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分析，用SYBR safe染色，并且使用成像系统可视化。布赫纳氏菌特异性基因的减少指示化合物1的抗微生物活性。
将用化合物处理的蚜虫的存活率与用阴性对照处理的蚜虫的存活率进行比较。预期用化合物处理的蚜虫的存活率的降低指示化合物的抗微生物活性。
实例14：用抗生素溶液处理的昆虫
此实例证明了用利福平(一种通过抑制细菌的RNA聚合酶来抑制DNA依赖性RNA合成的窄谱抗生素)处理蚜虫。此实例证明了利福平对模型昆虫物种(蚜虫)的作用是通过调节与对利福平敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计
根据如以下的递送方式配制抗生素溶液(图1A-1G)：
1)通过植物：在含有和不含必需氨基酸(2mg/ml组氨酸、2mg/ml异亮氨酸、2mg/ml亮氨酸、2mg/m赖氨酸、1mg/ml甲硫氨酸、1.62mg/ml苯丙氨酸、2mg/ml苏氨酸、1mg/ml色氨酸、和2mg/ml缬氨酸)的人工饲料(基于Akey和Beck，1971；参见实验设计)中配制的0(阴性对照)或100μg/ml的利福平。
2)叶涂层：将在水中的100μl的0.025％非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂Silwet L-77(阴性对照)、或在溶剂溶液中配制的100μl的50μg/ml的利福平直接施用至叶表面并允许干燥。
3)显微注射：注射溶液是在水中的0.025％非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂Silwet L-77(阴性对照)、或者在溶剂溶液中配制的50μg/ml的利福平。
4)局部递送：使用30mL的喷雾瓶喷雾100μl的0.025％非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂Silwet L-77(阴性对照)、或者在溶剂溶液中配制的50μg/ml的利福平。
5)叶注射方法A-叶灌注和切割：将叶用在含有食用色素的水中的大约1ml的50μg/ml的利福平、或者含有水和食用色素的大约1ml的阴性对照注射。将叶切割成2x2cm方形的片，并将蚜虫放置在叶片上。
6)叶灌注和通过植物递送：将叶用在含有食用色素的水中的大约1ml的100μg/ml的利福平、或者含有水和食用色素的大约1ml的阴性对照注射。然后将注射的叶的茎放置在Eppendorf管(含有1ml的100μg/ml的利福平加水和食用色素、或者1ml仅具有水和食用色素的阴性对照)中。
7)组合递送方法：a)局部递送至蚜虫和植物：经由用在水中的0.025％非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂Silwet L-77(阴性对照)、或者使用30mL配制在溶剂溶液中的100μg/ml的利福平两者喷雾蚜虫和植物，b)通过植物递送：仅水(阴性对照)或在水中配制的100μg/ml的利福平。
植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphonpisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄蚜虫，并且分成3个不同的处理组：1)不含必需氨基酸的单独的人工饲料，2)含有100μg/ml利福平但不含必需氨基酸的单独的人工饲料，以及3)含有必需氨基酸和100μg/ml利福平的人工饲料。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
如先前公开(Akey和Beck，1971Continuous Rearing of the Pea Aphid，Acyrthosiphon pisum，on a Holidic Diet[以全纯饲料连续饲养豌豆蚜(豌豆长管蚜)])制备含有和不含必需氨基酸(2mg/ml组氨酸、2mg/ml异亮氨酸、2mg/ml亮氨酸、2mg/m赖氨酸、1mg/ml甲硫氨酸、1.62mg/ml苯丙氨酸、2mg/ml苏氨酸、1mg/ml色氨酸、和2mg/ml缬氨酸)的所使用的人工饲料，但两种饲料都不包括高丝氨酸或β丙氨酰基酪氨酸。用KOH将饲料的pH调节至7.5，并将饲料通过0.22μm滤器过滤灭菌并在4℃短期储存(＜7天)或在-80℃长期储存。
将利福平(东京化工有限公司(Tokyo Chemical Industry，LTD))储备溶液在甲醇中以25mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。对于处理(参见治疗性设计)，将适量的储备溶液添加至含有或不含必需氨基酸的人工饲料中以获得100μg/ml利福平的最终浓度。然后将饲料放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此人工饲料饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将33只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换人工饲料饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且当发现死蚜虫时将其从装有人工饲喂系统的深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄)。一旦蚜虫到达第4龄期，在深的有盖培养皿向它们提供各自的人工饲喂系统，使得一旦它们到达成虫期，可以监测繁殖力。
对于成年蚜虫，每天计数新的蛹然后丢弃。在实验结束时，繁殖力被确定为一旦蚜虫到达成虫期后每天产生的后代的平均数量。贯穿整个实验，拍摄蚜虫照片以评估治疗组之间的大小差异。
处理7天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-340x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
抗生素处理延迟并停止了蚜虫发育的进展
如实验设计(上文)中定义的，将LSR-1第1龄蚜虫分成三个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄期)(图2A)。用利福平处理的蚜虫发育延迟，并且通过6天的处理，大多数蚜虫没有进一步比第3龄期成熟(甚至在12天的处理后也是如此)，并且它们的尺寸极大地受到影响(图2A-2C)。
相比之下，与用单独的利福平处理的蚜虫相比，用含有补充必需氨基酸的利福平的人工饲料处理的蚜虫发育更快并且发育至更高龄期，但是没有用不含必需氨基酸的人工饲料处理的蚜虫发育更快(图2A-2C)。这些数据指示用利福平处理损害蚜虫发育。将必需氨基酸部分添加回来可挽救发育的这种缺陷。
抗生素处理增加了蚜虫死亡率
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫的大多数在处理后5天存活(图3)。5天后，蚜虫开始逐渐死亡，并且一些蚜虫在处理后超过13天存活。
相比之下，用不含必需氨基酸的利福平处理的蚜虫比用单独的人工饲料(p＜0.00001)处理的蚜虫具有更低的存活率。经过1天的处理后，用利福平处理的蚜虫开始死亡，并且所有蚜虫在9天内在处理中死亡。用利福平和必需氨基酸两者处理的蚜虫比用单独的利福平处理的那些蚜虫存活更长(p＝0.017)。这些数据指示用利福平处理影响了蚜虫存活。
抗生素处理降低了蚜虫繁殖
在治疗期间还监测蚜虫的繁殖力。在处理后第7天和第8天，大多数用不含必需氨基酸的人工饲料处理的成年蚜虫开始繁殖。用不含必需氨基酸的人工饲料处理的蚜虫在成熟后每天产生的后代的平均数大约为4(图4)。相比之下，用含有或不含必需氨基酸的利福平处理的蚜虫不能达到成虫期以及产生后代。这些数据指示利福平处理导致蚜虫繁殖的丧失。
抗生素处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试利福平是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理7天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用利福平处理的蚜虫具有约4倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图5)，这指示利福平处理降低了布赫纳氏菌水平。
叶涂层递送实验设计
将利福平储备溶液添加至0.025％的非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂(Silwet L-77)中以获得50μg/ml利福平的最终浓度。如在先前实例中所述的，蚜虫(eNASCO菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)在蚕豆植物上生长。对于实验，从健康植物收集第一龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：将叶用1)阴性对照(仅溶剂溶液)、2)溶剂中的50μg/ml利福平进行喷雾。将溶液吸收到蚕豆叶的2x2cm片上。
每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。对于每次处理，将20只蚜虫放置在每片叶上。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其去除。此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R(代表繁殖第5龄))。贯穿整个实验，拍摄蚜虫照片以评估治疗组之间的大小差异。
在处理6天后，从来自每个处理组的多个蚜虫中提取DNA，并如在先前实例中所述的进行用于定量布赫纳氏菌水平的qPCR。
通过叶涂层递送的抗生素处理延迟并停止了蚜虫发育的进展
如本文所述的实验设计中定义的，将LSR-1第1龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。放置在用对照处理的涂覆的叶上的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄繁殖阶段；5R)(图6A)。放置在用利福平涂覆的叶上的蚜虫发育延迟，并且通过6天的处理，大多数蚜虫没有进一步比第3龄期成熟(甚至在12天的处理后也是如此)，并且它们的尺寸极大地受到影响(图6A和6B)。
这些数据指示用利福平的叶涂层损害蚜虫发育。
通过叶涂层递送的抗生素处理增加了蚜虫死亡率
在叶涂层处理期间还测量了蚜虫的存活率。放置在用利福平涂覆的叶上的蚜虫比放置在用对照涂覆的叶上的蚜虫具有更低的存活率(图7)。这些数据指示通过叶涂层递送的利福平处理影响了蚜虫存活。
通过叶涂层递送的抗生素处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试通过叶涂层递送的利福平处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理6天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。
放置在用对照处理的叶上的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，放置在用利福平处理的叶上的蚜虫具有布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的大幅减小(图8)，这指示利福平叶涂层处理消除了内共生布赫纳氏菌。
显微注射递送实验设计：
使用具有内部拉出的硼硅酸盐针的NanoJet III Auto-Nanoliter注射器(德拉蒙德科学公司(Drummond Scientific)；目录号3-000-203-G/XL)进行显微注射。如在先前实例中所述的，蚜虫(eNASCO菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)在蚕豆植物上生长。使用漆刷将蚜虫转移到与真空连接的管道系统中(图1C)。注射位点在蚜虫的腹侧胸腔。注射溶液是在水中的有机硅化合物表面活性剂溶剂0.025％Silwet L-77(莱尔种子公司(LehleSeeds)，目录号VIS-01)(阴性对照)、或者在溶剂溶液中配制的50μg/ml的利福平。蛹的注射体积是10nl，并且成虫的注射体积是20nl(均以2nl/秒的速率)。每个处理组具有从每个收集植物注射的大约相同数量的个体。注射后，将蚜虫释放到具有蚕豆叶的有盖培养皿中，这些叶的茎在2％琼脂中。
用抗生素处理的显微注射降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试通过显微注射递送的利福平是否导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且如先前实例中所证明的这种丧失影响蚜虫适合度，在处理4天后从每个处理组中的蚜虫中提取DNA，并且如在先前实例中所述的进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。
用阴性对照显微注射的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用利福平显微注射的蚜虫蛹和成虫具有布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的大幅减小(图9)，这指示利福平显微注射处理降低了内共生布赫纳氏菌的存在。
局部递送实验设计：
如在先前实例中所述的，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)在蚕豆植物上生长。将喷雾瓶用2ml的对照(0.025％Silwet L-77)或利福平溶液(溶剂溶液中50μg/ml)填充。将蚜虫(数目＝10)转移到干净的有盖培养皿的底部，并使用漆刷将其收集到有盖培养皿的角落。随后，将蚜虫分成两个群组并用约100μl对照或利福平溶液喷雾。喷雾后立即用盖子盖住有盖培养皿。喷雾五分钟后，将蚜虫释放到具有蚕豆叶的有盖培养皿中，其中茎在2％琼脂中。
局部递送抗生素处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试通过局部递送而递送的利福平是否导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且如先前实例中所证明的这种丧失影响蚜虫适合度，在处理3天后从每个处理组中的蚜虫中提取DNA，并且如在先前实例中所述的进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。
用对照溶液喷雾的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用利福平喷雾的蚜虫具有布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的大幅减小(图10)，这指示通过局部处理递送的利福平处理降低内共生布赫纳氏菌的存在。
叶注射方法A-叶灌注和切割
实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃+2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(用水加蓝色食用色素注射的叶)、和2)用水加蓝色食用色素中的50μg/ml利福平注射的叶。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。对于处理，将利福平储备溶液(25mg/ml，于100％甲醇中)在水加蓝色食用色素中稀释至50μg/ml。然后将溶液放置在1.5ml Eppendorf管(具有灌注溶液的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。对于每次处理，将74-81只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。
通过叶注射方法A递送的抗生素处理延迟并停止了蚜虫发育的进展
如叶注射方法A-叶灌注和切割实验设计(本文所述的)中定义的，将LSR-1第1龄和第2龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用水加食用色素处理的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄期)(图11)。用注射利福平的叶饲喂的蚜虫发育延迟，并且通过6天的处理，大多数蚜虫没有进一步比第4龄期更成熟。甚至在8天后，用注射利福平的叶饲喂的蚜虫的发育大幅延迟(图11）。这些数据指示经由叶灌注的利福平处理损害蚜虫发育。
通过叶注射方法A递送的抗生素处理增加了蚜虫死亡率
在叶灌注实验期间还测量了蚜虫的存活率。放置在用利福平注射的叶上的蚜虫比放置在用对照溶液注射的叶上的蚜虫具有更低的存活率(图12)。这些数据指示通过叶注射递送的利福平处理影响了蚜虫存活。
通过叶注射方法A递送的抗生素处理导致了降低水平的布赫纳氏菌
为了测试经由叶灌注递送的利福平是否导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且如先前实例中所证明的该丧失影响蚜虫适合度，在处理8天后从每个处理组中的蚜虫中提取DNA，并且如在先前实例中所述的进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。
用对照溶液注射的叶饲喂的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用注射利福平的叶饲喂的蚜虫具有布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图13)的减少，这指示经由叶注射递送的利福平处理降低了内共生布赫纳氏菌的存在(如在先前实例中显示的)并且导致了适合度降低。
叶灌注和通过植物递送
实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。
为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)将蚜虫放置在用阴性对照溶液(水和食用色素)注射的叶上并放置在Eppendorf管(含有阴性对照溶液)中，或者2)将蚜虫放置在用100ug/ml利福平(在水加食用色素中)注射的叶上并放置在Eppendorf管(含有在水中的100ug/ml利福平)中。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
对于处理，将利福平储备溶液(25mg/ml，于100％甲醇中)在水加蓝色食用色素中稀释至100μg/ml。然后将溶液放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有灌注溶液的叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将49-50只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。
通过叶注射递送的和通过植物递送的抗生素处理延迟并停止了蚜虫发育的进展
如在叶灌注和通过植物递送实验设计(本文所述的)中定义的，将LSR-1第1龄和第2龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用对照溶液(仅水加食用色素)处理的蚜虫在大约6天达到成熟(第5龄期)(图14)。
用利福平处理的蚜虫中发育延迟，并且通过6天的处理，大多数蚜虫没有进一步比第3龄期更成熟。甚至在8天后，它们的发育大幅延迟(图14)。这些数据指示经由叶灌注的利福平处理损害蚜虫发育。
通过叶注射递送的和通过植物递送的抗生素处理增加了蚜虫死亡率
还在实验期间测量蚜虫的存活率，其中将蚜虫用对照溶液或者经由叶灌注和通过植物递送的利福平处理。用利福平灌注和处理的叶饲喂的蚜虫比用对照溶液灌注和处理的叶饲喂的蚜虫具有更低的存活率(图15)。这些数据指示通过叶灌注和通过植物递送的利福平处理负面地影响蚜虫存活。
经由叶注射和通过植物递送的抗生素处理导致了降低水平的布赫纳氏菌
为了测试经由叶灌注和通过植物递送的利福平是否导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且如先前实例中所证明的这种丧失影响蚜虫适合度，在处理6天和8天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数，如在先前实例中所述的。
用对照溶液注射和处理的叶饲喂的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，在两个时间点(p＝0.0037和p＝0.0025分别为第6天和第8天)，用利福平灌注和处理的叶饲喂的蚜虫具有布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的统计学上显著的减少(图16A和16B)，这指示经由叶灌注和通过植物递送的利福平处理降低了内共生布赫纳氏菌的存在(并且如在先前实例中显示的)并且导致适合度降低。
组合递送方法
实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。
对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)用Silwet-L77或水对照溶液处理，或者2)用稀释在silwet L-77或水中的利福平处理。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。递送方法的组合如下：a)使用30mL喷雾瓶，通过喷雾0.025％非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂Silwet L-77(阴性对照)、或者配制在溶剂溶液中的100μg/ml的利福平局部递送至蚜虫和植物，以及b)用水(阴性对照)、或配制在水中的100μg/ml的利福平通过植物递送。对于处理，在Silwet L-77(用于局部处理蚜虫，并涂覆叶)或水(用于通过植物递送)中，将利福平储备溶液(25mg/ml，于100％甲醇中)稀释至100μg/ml。然后将溶液放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有灌注溶液的叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将76-80只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。
组合抗生素处理延迟了蚜虫发育
如在组合递送方法实验设计(本文所述的)中定义的，将LSR-1第1龄和第2龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。对照处理的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄期)(图17)。用利福平处理的蚜虫发育延迟，并且通过6天的处理，大多数蚜虫没有进一步比第3龄期成熟，甚至7天后它们的发育大幅延迟(图17)。这些数据指示利福平处理的组合损害蚜虫发育。
组合抗生素处理导致蚜虫死亡率增加
还在实验期间测量了蚜虫的存活率，其中将蚜虫用利福平处理的组合进行处理。用利福平处理的蚜虫比用对照溶液处理的蚜虫具有轻微较低的存活率(图18)。这些数据指示通过处理的组合递送的利福平处理影响了蚜虫存活。
组合抗生素处理以降低布赫纳氏菌水平
为了测试经由方法的组合递送的利福平是否导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且如先前实例中所证明的这种丧失影响蚜虫适合度，在处理7天后从每个处理组中的蚜虫中提取DNA，并且如在先前实例中所述的进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。
用对照溶液处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用利福平处理的蚜虫具有布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝的统计学上显著的和大幅的减小(p＝0.227；图19)，这指示经由方法的组合递送的利福平处理降低了内共生布赫纳氏菌的存在，并且如在先前实例中显示的，这导致适合度降低。
总之，在先前实例中所述的此数据证明了通过多个递送方法用抗生素处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、生殖能力、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例15：用天然抗微生物多糖处理昆虫
此实施例证明了用壳聚糖(衍生自几丁质的脱乙酰化β-1，4-D-葡糖胺的天然阳离子线性多糖)处理蚜虫。几丁质是昆虫、甲壳类动物(主要是虾和蟹)和真菌细胞壁的外骨骼中的结构元素，并且是纤维素之后第二丰富的天然多糖。此实例证明了壳聚糖对昆虫的作用是通过调节与对壳聚糖敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)。
治疗性设计
使用叶灌注和通过植物递送的组合配制壳聚糖溶液(图20)。对照溶液是用水+蓝色食用色素注射的叶，并且水在管中。经由叶注射(蓝色食用色素)和通过植物(在Eppendorf管中)，含有在水中的300ug/ml壳聚糖(低分子量)的处理溶液。
叶灌注-植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理的)，2)包括在水中的300ug/ml壳聚糖(低分子量)的处理溶液。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
将壳聚糖(西格玛公司(Sigma)，目录号448869-50G)储备溶液在乙酸中以1％制备，高压灭菌法灭菌，并储存在4℃。对于处理(参见治疗性设计)，将适量的储备溶液用水稀释以获得壳聚糖的最终处理浓度。然后将溶液放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有灌注溶液的叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将50-51只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。
处理8天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用天然抗微生物多糖处理后，存在对昆虫适合度的负面应答
如实验设计(上文)中定义的，将LSR-1豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。单独用阴性对照处理的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄期)(图21)。用壳聚糖溶液处理的蚜虫发育延迟，并且通过6天的壳聚糖处理，大多数蚜虫没有进一步比第4龄期更成熟。这些数据指示用壳聚糖处理延迟和停止了蚜虫发育的进展。
壳聚糖处理蚜虫死亡率增加
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。大多数单独用对照处理的蚜虫在处理后3天存活(图22)。4天后，蚜虫开始逐渐死亡，并且一些蚜虫在处理后超过7天存活。
相比之下，用壳聚糖溶液处理的蚜虫比用对照处理的蚜虫具有更低的存活率。这些数据指示用天然抗微生物多糖处理后存活降低。
壳聚糖处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试壳聚糖溶液处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理8天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。单独用对照处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用在水中的300ug/ml壳聚糖处理的蚜虫具有约5倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图23)，这指示壳聚糖处理降低了布赫纳氏菌水平。
总之，先前描述的此数据证明了通过用天然抗微生物多糖处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例16：用乳链菌肽(一种天然抗微生物肽)处理昆虫
此实例证明用通常用作食物防腐剂的天然“广谱”多环抗菌肽(由细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生)处理蚜虫。乳链菌肽的抗菌活性通过其在细菌细胞膜中产生孔并通过特异性脂质II相互作用中断细菌细胞壁生物合成的能力来介导。此实例证明乳链菌肽对昆虫适合度的负面作用是通过调节与对乳链菌肽敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)。
治疗性设计：
使用叶灌注和通过植物递送的组合配制乳链菌肽。将对照溶液(水)或处理溶液(乳链菌肽)注射到叶中并放置在Eppendorf管中。处理溶液由在水中的1.6或7mg/ml乳链菌肽组成。
叶灌注-植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃+2℃)中，LSR-1蚜虫(豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理的)，2)用在水中的1.6或7mg/ml乳链菌肽处理的乳链菌肽。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
对于处理(参见治疗性设计)，以1.6或7mg/ml(w/v)在水中制备乳链菌肽(西格玛公司，产品号：N5764)溶液，并使用0.22um针筒式滤器过滤灭菌。然后将溶液注射到植物的叶中，并且将植物的茎放置在1.5ml Eppendorf管中。使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将56-59只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄蚜虫))。
处理8天后，从每个处理组的剩余蚜虫中提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用乳链菌肽处理后，存在对昆虫适合度的剂量依赖性的负面应答
如实验设计(上文)中定义的，将LSR-1豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成三个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用阴性对照溶液(水)处理的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄期)，并且在7天后繁殖(5R期)(图24)。用7mg/ml乳链菌肽处理的蚜虫的发育严重延迟。仅用7mg/ml乳链菌肽处理的蚜虫在第3天发展至第2龄期，并且在第6天，组中的所有蚜虫死亡(图24)。用较低浓度的乳链菌肽(1.6mg/ml)处理的蚜虫的发育被轻微地延迟，并且在评估的每个时间点，与用水处理的对照相比存在更少发育的蚜虫(图24)。这些数据指示用乳链菌肽处理延迟和停止了蚜虫发育的进展，并且这种发育中的延迟取决于所给予的乳链菌肽的剂量。
然而，重要的是要注意用7mg/ml的乳链菌肽处理对用于测定中的叶的健康也具有负面影响。在叶灌注7mg/ml的乳链菌肽后不久，叶开始变成棕色。两天后，用7mg/ml灌注的叶变成黑色。用1.6mg/ml乳链菌肽处理的叶的状况没有明显差异。
用乳链菌肽的处理导致蚜虫死亡率增加
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。用单独的对照处理的蚜虫中大约50％在8天实验中存活(图25)。相比之下，对于用7mg/ml乳链菌肽处理的蚜虫存活显著较低(p＜0.0001，通过对数秩(Mantel Cox)检验)，并且在这组中的所有蚜虫在6天内在处理中死亡(图25)。与对照处理的蚜虫相比，用低剂量的乳链菌肽(1.6mg/ml)处理的蚜虫具有更高的死亡率，尽管差异没有达到统计学显著性(p＝0.0501，通过对数秩(Mantel Cox)检验)。这些数据指示用乳链菌肽处理后的存活存在剂量依赖性降低。
用乳链菌肽的处理导致蚜虫中布赫纳氏菌降低
为了测试用乳链菌肽处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理8天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。单独用对照处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用1.6mg/ml乳链菌肽处理的蚜虫在处理8天后具有约1.4倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图26)。在用7mg/ml乳链菌肽处理的组中没有蚜虫存活，因此，没有在这组中评估布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。这些数据指示乳链菌肽处理降低了布赫纳氏菌水平。
总之，先前描述的此数据证明了通过用抗微生物肽乳链菌肽处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例17：用乙酰丙酸处理昆虫降低了昆虫适合度
此实例证明了用乙酰丙酸(一种通过加热己糖(例如，木材、淀粉、小麦、稻草或蔗糖)和碳水化合物，并添加稀释的矿物酸而产生的酮酸)处理蚜虫减少了昆虫适合度。先前已经测试了乙酰丙酸在肉类生产中作为针对大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门氏菌(Salmonella)的抗微生物剂(Carpenter等人，2010，Meat Science[肉类科学]；SavannahG.Hawkins，2014，University of Tennessee Honors Thesis[田纳西大学荣誉论文])。此实例证明了乙酰丙酸对昆虫的作用是通过调节与对乙酰丙酸敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)。
治疗性设计：
使用叶灌注和通过植物递送的组合配制乙酰丙酸。对照溶液是用水注射的叶，并且将水放置在Eppendorf管中。处理溶液包括经由叶注射和通过植物的在水中的0.03％或0.3％乙酰丙酸(在Eppendorf管中)。
叶灌注-植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃+2℃)中，eNASCO蚜虫(豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理的)，2)包括在水中的0.03％或0.3％乙酰丙酸的处理溶液。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
对于处理(参见治疗性设计)，将乙酰丙酸(西格玛公司，产品号：W262706)在水中稀释至0.03％或0.3％。然后将溶液放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有灌注溶液的叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将57-59只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、和第5龄)。
处理7天后，从每个处理组的剩余蚜虫中提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和BuchgroES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用乙酰丙酸处理后，存在对昆虫适合度的剂量依赖性的负面应答
如实验设计(上文)中定义的，将eNASCO豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成三个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。单独用阴性对照处理的蚜虫在大约7天开始达到成熟(第5龄期)(图27)。在用乙酰丙酸处理的蚜虫中发育延迟，并且在处理后11天，几乎所有对照处理的蚜虫都达到成熟，而用0.03％和0.3％乙酰丙酸处理的蚜虫中分别约23％和63％没有进一步比第4龄期更成熟。这些数据指示用乙酰丙酸处理延迟和停止了蚜虫发育的进展，并且这种发育中的延迟取决于所给予的乙酰丙酸的剂量。
用乙酰丙酸的处理导致蚜虫死亡率增加
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。用单独的对照处理的蚜虫中大约50％在11天实验中存活(图28)。相比之下，用0.3％乙酰丙酸处理的蚜虫存活显著较少(p＜0.01)。与对照处理的蚜虫相比，用低剂量的乙酰丙酸(0.03％)处理的蚜虫具有更高的死亡率，尽管差异没有达到统计学显著性。这些数据指示用乙酰丙酸处理后存活存在剂量依赖性降低。
用乙酰丙酸的处理导致蚜虫中布赫纳氏菌降低
为了测试用乙酰丙酸处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理7天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。单独用对照处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用水中的0.03％或0.3％乙酰丙酸处理的蚜虫在处理7天后具有约6倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图29，左小图)。这些数据指示乙酰丙酸处理降低了布赫纳氏菌水平。
总之，先前描述的此数据证明了通过用乙酰丙酸处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例18：用植物衍生的次生代谢物溶液处理昆蚜
此实例证明用棉酚乙酸(一种衍生自棉花植物(棉属(Gossypium)的天然苯酚，该天然苯酚渗透细胞并充当若干种脱氢酶的抑制剂)处理蚜虫。此实例证明了棉酚对昆虫的作用是通过调节与对棉酚敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)。
治疗性设计：取决于以下递送方法配制棉酚溶液：
1)通过植物：在不含必需氨基酸(组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、和缬氨酸)的人工饲料(基于Akey和Beck，1971；参见实验设计)中配制0(阴性对照)或0.5％、0.25％、和0.05％的棉酚。
2)显微注射：注射溶液是0.5％的棉酚、或者仅人工饲料(阴性对照)。
植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(eNASCO(分别含有布赫纳氏菌和沙雷氏菌属(Serratia)原生和次生共生体)或者LSR-1(仅含有布赫纳氏菌)菌株豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成4个不同的处理组：1)不含必需氨基酸的单独的人工饲料，2)不含必需氨基酸的单独的人工饲料、和0.05％的棉酚，3)不含必需氨基酸的单独的人工饲料、和0.25％的棉酚，4)不含必需氨基酸的单独的人工饲料、和0.5％的棉酚。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
如先前公开(Akey和Beck，1971Continuous Rearing of the Pea Aphid，Acyrthosiphon pisum，on a Holidic Diet[以全纯饲料连续饲养豌豆蚜(豌豆长管蚜)])制备含有和不含必需氨基酸(2mg/ml组氨酸、2mg/ml异亮氨酸、2mg/ml亮氨酸、2mg/m赖氨酸、1mg/ml甲硫氨酸、1.62mg/ml苯丙氨酸、2mg/ml苏氨酸、1mg/ml色氨酸、和2mg/ml缬氨酸)的所使用的人工饲料，但两种饲料都不包括高丝氨酸或β丙氨酰基酪氨酸。用KOH将饲料的pH调节至7.5，并将饲料通过0.22μm滤器过滤灭菌并在4℃短期储存(＜7天)或在-80℃长期储存。
将棉酚乙酸(西格玛公司，目录号G4382-250MG)储备溶液在甲醇中以5％制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。对于处理(参见治疗性设计)，将适量的储备溶液添加至人工饲料中以获得棉酚的不同的最终浓度。然后将饲料放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将15-87只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换人工饲料饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且当发现死蚜虫时将其从装有人工饲喂系统的深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。一旦蚜虫到达第4龄期，在深的有盖培养皿向它们提供各自的人工饲喂系统，使得一旦它们到达成虫期，可以监测繁殖力。
对于成年蚜虫，每天计数新的蛹然后丢弃。在实验结束时，通过以下两种方式测量繁殖力：1)确定治疗组的第一后代的平均天数，和2)一旦蚜虫到达成虫期后每天产生的后代的平均数。贯穿整个实验，拍摄蚜虫照片以评估治疗组之间的大小差异。
处理5或13天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用化感物质棉酚处理后，存在对昆虫适合度的剂量依赖性的负面应答
如实验设计(如本文所述)中定义的，将eNASCO和LSR-1豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成四个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用单独的人工饲料处理的蚜虫在大约3天开始达到成熟(第5龄期)(图30A)。用棉酚处理的蚜虫发育延迟，并且通过用0.5％的棉酚处理5天，大多数蚜虫没有进一步比第3龄期成熟，并且它们的尺寸也受到影响(图30A和30B)。这些数据指示用棉酚处理延迟和停止了蚜虫发育的进展，并且此应答是剂量依赖性的。
棉酚处理增加了蚜虫死亡率
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫的大多数在处理后2天存活(图31)。4天后，蚜虫开始逐渐死亡，并且一些蚜虫在处理后超过7天存活。
相比之下，用0.25％(与对照没有显著差异，p＝0.2794)和0.5％的棉酚处理的蚜虫比用单独的人工饲料处理的蚜虫具有更低的存活率，其中0.5％棉酚处理比AD(无EAA)对照显著不同(p＝0.002)。经过2天的治疗后，用0.5％棉酚处理的蚜虫开始死亡，并且所有蚜虫在4天内在处理中死亡。用0.25％处理的蚜虫比用0.5％处理的那些蚜虫存活时间稍长，但也极大地受到影响。这些数据指示用化感物质棉酚处理后存活存在剂量依赖性降低。
棉酚处理降低了蚜虫繁殖
在治疗期间还监测蚜虫的繁殖力。在处理后第7天和第8天，大多数用不含必需氨基酸的人工饲料处理的成年蚜虫开始繁殖。用不含必需氨基酸的人工饲料处理的蚜虫在成熟后每天产生的后代的平均数大约为5(图32A和32B)。
相比之下，用0.25％的棉酚处理的蚜虫显示到达成虫期和产生后代的减少。这些数据指示棉酚处理导致蚜虫繁殖的降低。
棉酚处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试不同浓度的棉酚是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理5天或13天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料(对照)处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用0.25％和0.5％的棉酚处理的蚜虫具有约4倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图33)，这指示棉酚处理降低了布赫纳氏菌水平，并且此降低是浓度依赖性的。
显微注射递送实验设计：
使用具有内部拉出的硼硅酸盐针的NanoJet III Auto-Nanoliter注射器(德拉蒙德科学公司(Drummond Scientific)；目录号3-000-203-G/XL)进行显微注射。如在先前实例中所述的，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜)在蚕豆植物上生长。每个处理组具有从每个收集植物注射的大约相同数量的个体。使用漆刷将蛹蚜虫(＜第3龄期)转移到与真空连接的管道系统，并将20nl的不含必需氨基酸的人工饲料(阴性对照)、或者在不含必需氨基酸的人工饲料中的0.05％的棉酚溶液显微注射到腹侧胸腔中。注射后，将蚜虫放置在具有蚕豆叶的深的有盖培养皿中，其中茎在2％琼脂中。
用抗生素处理的显微注射降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试通过显微注射递送的棉酚是否导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且如先前实例中所证实的该丧失影响蚜虫适合度，在处理4天后从每个处理组中的蚜虫中提取DNA，并且如在先前实例中所述的进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。
用阴性对照显微注射的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用棉酚显微注射的蚜虫蛹和成虫具有大幅减小的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图34)，这指示棉酚显微注射处理降低了内共生布赫纳氏菌的存在，并且如在先前实例中显示的，这导致适合度降低。
总之，在先前实例中描述的此数据证明了通过多个递送方法用植物次生代谢物溶液处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、生殖能力、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例19：用天然植物衍生的抗微生物化合物(反式-肉桂醛)处理昆虫
此实例证明了用反式-肉桂醛(一种天然芳香醛，其是肉桂(锡兰肉桂(Cinnamomumzeylandicum))的树皮提取物的主要组分)处理蚜虫导致了降低的适合度。已经显示反式-肉桂醛具有针对革兰氏阴性生物和革兰氏阳性生物两者的抗微生物活性，但它们的抗微生物活性的确切作用机制仍不清楚。反式-肉桂醛可损害细菌细胞膜并抑制特异性细胞过程或酶(Gill和Holley，2004 Applied Environmental Microbiology[施用环境微生物学])。此实例证明了反式-肉桂醛对昆虫的作用是通过调节与对反式-肉桂醛敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)。
治疗性设计：
在水中将反式-肉桂醛稀释至0.05％、0.5％、或5％，并且通过叶灌注(将约1ml注射到叶中)和通过植物递送。
实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(LSR-1(其仅含有布赫纳氏菌菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成四个不同的处理组：1)水处理的对照，2)在水中的0.05％反式-肉桂醛，3)在水中的0.5％反式-肉桂醛，和4)在水中的5％反式-肉桂醛。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
将反式-肉桂醛(西格玛公司，目录号C80687)在水中稀释至适当的浓度(参见治疗性设计)，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。向蚕豆叶注射大约1ml的处理，然后将叶放置进含有相同处理溶液的1.5ml Eppendorf管中。使用石蜡膜封闭放置蚕豆茎的管的开口。然后将此处理饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(FisherScientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将40-49只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换处理饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且当发现死蚜虫时将其从装有处理饲喂系统的深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。
处理3天后，从来自每个处理组的剩余活着的蚜虫中提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用反式-肉桂醛处理后，存在对昆虫适合度的剂量依赖性的负面应答
如实验设计(如本文所述)中定义的，将LSR-1豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成四个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用单独的水处理的蚜虫在处理后3天达到第3龄期(图35)。用反式-肉桂醛处理的蚜虫发育延迟，并且通过用三个反式-肉桂醛浓度的每个处理3天，没有蚜虫成熟到通过第二龄期(图35)。此外，贯穿整个实验过程，用最高浓度的反式-肉桂醛(5％)处理的所有蚜虫保持在第1龄期。这些数据指示用反式-肉桂醛处理延迟并停止了蚜虫发育的进展，并且这种应答是剂量依赖性的。
反式-肉桂醛处理增加了蚜虫死亡率
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。用单独的水处理的蚜虫中大约75％在处理后3天存活(图36)。相比之下，用0.05％、0.5％、和5％反式-肉桂醛处理的蚜虫比用单独的水处理的蚜虫具有显著较低的(与用水处理的对照相比，每个处理组p＜0.0001)存活率。这些数据指示用天然抗微生物反式-肉桂醛处理后存活存在剂量依赖性降低。
反式-肉桂醛处理降低了蚜虫中的布赫纳氏菌
为了测试不同浓度的反式-肉桂醛是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理3天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用单独的水(对照)处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相似地，用最低浓度的反式-肉桂醛(0.5％)处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。
相比之下，用0.5％和5％的反式-肉桂醛处理的蚜虫具有约870倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图37)，这指示反式-肉桂醛处理降低了布赫纳氏菌水平，并且此降低是浓度依赖性的。
总之，在先前实例中描述的此数据证明了通过多个递送方法用植物次生代谢物溶液处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、生殖能力、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例20：用蝎抗微生物肽处理昆虫
此实例证明了用多个蝎抗微生物肽(AMP)处理蚜虫，其中若干种是在蝎Urodacusyaschenkoi的毒液腺转录组中鉴定的AMP(Luna-Ramirez等人，2017，Toxins[毒素])。AMP典型地具有净正电荷，并且因此对细菌膜具有高亲和力。此实例证明了AMP对昆虫的作用是通过调节与对AMP肽敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)，其是一种蚜虫的专性共生体。
治疗性设计：
使用叶灌注和通过植物递送的组合配制Uy192溶液。对照溶液是用水+蓝色食用色素注射的叶，并且水在管中。处理溶液由在水中的100ug/ml Uy192组成，经由叶注射(蓝色食用色素)和通过植物(在Eppendorf管中)。
叶灌注-植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；20℃±2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理的)，2)在水中的100ug/ml AMP的处理溶液。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
通过生物合成以＞75％纯度合成Uy192。将1mg的冻干的肽重组到500ul的80％乙腈、20％水、和0.1％TFA中，将100ul(100ug)等分到10个单独的Eppendorf管中，并允许干燥。对于处理(参见治疗性设计)，将1ml的水添加至肽的100ug等分试样中以获得Uy192的最终浓度(100ug/ml)。然后将溶液放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有灌注溶液的叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将50只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄)。
处理8天后，从每个处理组的剩余蚜虫中提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用蝎AMP处理后，存在对昆虫适合度的负面应答
如实验设计(上文)中定义的，将LSR-1豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。单独用阴性对照处理的蚜虫在大约6天开始达到成熟(第5龄期)(图38)。用Uy192处理的蚜虫发育延迟，并且在8天的处理后，蚜虫没有进一步比第4龄期更成熟。这些数据指示用Uy192处理延迟和停止了蚜虫发育的进展。
用蝎AMP的处理导致蚜虫死亡率增加
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。大多数单独用对照处理的蚜虫在处理后3天存活(图39)。4天后，蚜虫开始逐渐死亡，并且一些蚜虫在处理后超过7天存活。
相比之下，用Uy192处理的蚜虫比用对照处理的蚜虫具有更低的存活率。这些数据指示用蝎AMP Uly192处理后存活降低。
用蝎AMP Uy192的处理导致蚜虫中布赫纳氏菌降低
为了测试用Uy192处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理8天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。单独用对照处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，用在水中的100ug/ml Uy192处理的蚜虫具有约7倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图40)，这指示Uy192处理降低了布赫纳氏菌水平。
总之，先前描述的此数据证明了通过用天然蝎抗微生物肽处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例21：用蝎抗微生物肽处理昆虫
此实例证明了用若干个蝎抗微生物肽(AMP，D10、D3、Uyct3、和Uy17)处理蚜虫，最近在蝎Urodacus yaschenkoi的毒液腺转录组中鉴定了AMP(Luna-Ramirez等人，2017，Toxins[毒素])。AMP典型地具有净正电荷，并且因此对细菌膜具有高亲和力。此实例证明了AMP对昆虫的作用是通过调节与对AMP肽敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是蚜虫布赫纳氏菌(Buchnera aphidicola)，其是一种蚜虫的专性共生体。
蚜虫是对植物造成直接进食损害，并作为植物病毒的媒介的农业昆虫有害生物。此外，蚜虫蜜露促进了烟霉(sooty mold)的生长，并吸引了令人讨厌的蚂蚁。化学处理的使用(不幸的是，仍然普遍存在)导致选择抗性个体，这些个体的根除变得越来越困难。
治疗性设计：
将指示的肽或肽混合物(参见以下详细描述的蚜虫显微注射实验设计和叶灌注-植物实验设计部分)直接显微注射到蚜虫中或者使用叶灌注和通过植物递送的组合进行递送。作为阴性对照，将蚜虫用水显微注射(用于显微注射实验)、或放置在用水注射的叶上，并且水在管中(用于叶灌注和植物递送实验)。处理溶液由20nl的溶解在水中的5μg/μl的D3和D10(用于蚜虫显微注射)、或者40μg/ml的在水中的D10、Uy17、D3、和UyCt3的混合物组成，经由叶注射和通过植物(在Eppendorf管中)。
蚜虫显微注射实验设计
使用具有内部拉出的硼硅酸盐针的NanoJet III Auto-Nanoliter注射器(德拉蒙德科学公司(Drummond Scientific)；目录号3-000-203-G/XL)进行显微注射。在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(LSR-1菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′sSelected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。每个处理组具有从每个收集植物注射的大约相同数量的个体。向成年蚜虫的腹侧胸腔显微注射20nl的水、或者100ng(20ul的5ug/ml)的肽D3或D10溶液。显微注射速率为5nl/秒。注射后，将蚜虫放置在含有蚕豆叶的深的有盖培养皿，其中茎在2％琼脂中。
通过生物合成以＞75％纯度合成肽。将1mg的冻干的肽重组到500μl的80％乙腈、20％水、和0.1％TFA中，将100μl(100μg)等分到10个单独的Eppendorf管中，并允许干燥。
处理5天后，从每个处理组的剩余蚜虫中提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用蝎肽D3和D10显微注射蚜虫导致昆虫存活降低
如实验设计(如本文所述)中定义的，将LSR-1豌豆长管蚜第1龄和第2龄蚜虫分成三个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定存活率。处理5天后，与用水注射的对照相比，用蝎肽注射的蚜虫具有更低的存活率(对于用D3、D10、和水注射而言分别为9％、35％、和45％存活)(图41)。这些数据指示用蝎AMP D3和D10处理后存活降低。
用蝎肽D3和D10显微注射蚜虫导致布赫纳氏菌内共生体减少
为了测试用蝎AMP D3和D10注射是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在注射后5天从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用单独的水注射的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA(47.4)，而用D3和D10注射的蚜虫具有较低比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA(分别为25.3和30.9)(图42)。这些数据指示用蝎肽D3和D10处理导致降低水平的细菌共生体布赫纳氏菌。
叶灌注-植物递送实验设计：
如上所述的，eNASCO蚜虫(其仅含有布赫纳氏菌和沙雷氏菌)豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s SelectedSeeds)的Vroma vicia faba)上生长。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理的)，2)处理溶液由在水中的D10、Uy17、D3、和UyCt3中的每种40μg/ml组成。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
如上所述对肽进行合成、溶解、和等分。对于处理(参见治疗性设计)，将水添加至肽的100μg等分试样中以获得所希望的最终浓度(40μg/ml)。将四种肽进行组合以制备肽混合物溶液。将此溶液用于经由注射灌注到叶中。注射后，将注射的叶的茎放置在1.5mlEppendorf管中，然后用石蜡膜封闭该管。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将41-49只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。
用蝎肽的混合物的处理导致蚜虫死亡率增加
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。处理6天后，与用水处理的那些蚜虫进行比较，用肽混合物处理的蚜虫具有更低的存活率，并且9天后，该作用更明显(肽混合物和水处理分别为16％和29％存活)(图43)。这些数据指示用蝎AMP的混合物处理后存活降低，并且如在先前实例中显示的，这些AMP降低了蚜虫中内共生体水平。
总之，先前描述的此数据证明了通过用单个天然蝎抗微生物肽或者肽混合物处理蚜虫而杀死和降低蚜虫寿命和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例22：用与细胞穿透肽融合的抗微生物肽处理昆虫
此实例证明了用与衍生自病毒的细胞穿透肽融合的蝎抗微生物肽(AMP)(Uy192)处理蚜虫。AMP Uy192是在蝎Urodacus yaschenkoi的毒液腺转录组中的若干种最近鉴定的AMP之一(Luna-Ramirez等人，2017，Toxins[毒素])。AMP典型地具有净正电荷，并且因此对细菌膜具有高亲和力。为了增加将蝎肽Uy192递送至蚜虫细胞，将合成的肽与人免疫缺陷病毒I(HIV-1)的转录的反式激活因子(TAT)蛋白的部分融合。先前的研究已经显示，将此细胞穿透肽(CPP)与其他分子缀合经由转导增加了它们被吸收进细胞中(Zhou等人，2015Journal of Insect Science[昆虫科学杂志]和Cermenati等人，2011 Journal of InsectPhysiology[昆虫生理学杂志])。此实例证明了融合肽对昆虫的作用是通过调节与对抗微生物肽敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计
使用叶灌注和通过植物递送的组合，配制与细胞穿透肽缀合并且用6FAM(Uy192+CPP+FAM)荧光标记的蝎肽。将对照溶液(水)或处理溶液(Uy192+CPP+FAM)注射到叶中并放置在Eppendorf管中。处理溶液包括在水中的100μg/ml Uy192+CPP+FAM。
叶灌注-植物递送实验设计
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，LSR-1蚜虫(豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理的)，2)Uy192+CPP+FAM，用在水中的100μg/ml Uy192+CPP+FAM处理。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
对于处理(参见治疗性设计)，通过生物合成以＞75％纯度合成Uy192+CPP+FAM(氨基酸序列：YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLL-FAM)。将5mg的冻干的肽重组到1ml的80％乙腈、20％水、和0.1％TFA中，将50μl(100μg)等分到单独的Eppendorf管中，并允许干燥。对于处理(参见治疗性设计)，将1ml的无菌水添加至肽的100μg等分试样中以获得Uy192+CPP+FAM的最终浓度(100μg/ml)。然后将溶液注射到植物的叶中，并且将植物的茎放置在1.5mlEppendorf管中。使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。叶的Epi荧光成像证实叶在其维管系统中含有绿色荧光标记的肽。
对于每次处理，将30只蚜虫一式三份放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R龄(繁殖的第5龄蚜虫))。
处理后5天，从每个处理组的若干个蚜虫中提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用与细胞穿透肽融合的蝎肽Uy192的处理延迟和停止了蚜虫发育的进展
如实验设计(上文)中定义的，将LSR-1豌豆长管蚜第1龄蚜虫分成三个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用水处理的蚜虫和用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理的那些蚜虫两者的发育在第0天和第1天是相似的(图44)。然而，到第2天，对照处理的蚜虫发育至第二龄期或第三龄期，而用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理的一些蚜虫保持在第一龄期(图44)。甚至在处理后3天，用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理的一些蚜虫仍保持在第一龄期(图44)。在处理后7天，大部分用水处理的蚜虫发育到第5龄期或第5繁殖龄期。相比之下，用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理的蚜虫中仅50％发育至第5龄期，而约42％和约8％的蚜虫分别保持在第3龄期或第4龄期(图44)。这些数据指示用与细胞穿透肽融合的蝎肽Uy192处理延迟和停止了蚜虫发育的进展。
用与细胞穿透肽融合的蝎肽Uy192的处理导致蚜虫死亡率增加
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。用单独的对照处理的蚜虫中大约40％在7天实验中存活(图45)。相比之下，对于用100μg/ml Uy192+CPP+FAM(p＝0.0036，通过对数秩(Mantel Cox)检验确定)处理的蚜虫存活显著较低，其中仅16％的蚜虫存活至第7天(图45)。这些数据指示用与细胞穿透肽融合的蝎肽Uy192处理后存活降低。
用与细胞穿透肽融合的蝎肽的处理导致布赫纳氏菌/蚜虫DNA比率降低
为了测试用Uy192+CPP+FAM处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理5天后从每个组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用水处理的蚜虫具有高比率(约134)的布赫纳氏菌/蚜虫DNA。相比之下，在5天的处理后，与细胞穿透肽融合的蝎肽处理的蚜虫具有约1.8倍减少的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图46)。这些数据指示用与细胞穿透肽融合的蝎肽处理降低了内共生体水平。
与细胞穿透肽融合的蝎肽自由进入含菌细胞中以针对布赫纳氏菌起作用
为了测试细胞穿透肽是否有助于将蝎肽直接递送到含菌细胞中，将分离的含菌细胞直接暴露于融合蛋白并成像。将来自在补充有1％w/v BSA的施耐德培养基(Schneider'smedium)(施耐德(Schneider)-BSA培养基)中的蚜虫中的含菌细胞切开，并放置在含有20ul的施耐德培养基的成像孔中。将蝎肽的100ug冻干的等分试样重悬于100ul的施耐德培养基中以产生1mg/ml溶液，并且将5ul的此溶液混合进含有含菌细胞的孔中。在室温孵育30分钟后，彻底洗涤含菌细胞以消除溶液中任何过量的游离肽。在孵育之前和之后，捕获含菌细胞的图像(图47)。融合肽渗透含菌细胞膜，并且可直接用于布赫纳氏菌。
总之，此数据证明了通过用与细胞穿透肽融合的蝎抗微生物肽Uy192处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例23：用维生素类似物处理昆虫
此实例证明了用前维生素泛醇(其是泛酸的乙醇类似物，维生素B5)处理蚜虫。蚜虫具有专性内共生体细菌(布赫纳氏菌)，该专性内共生体细菌可以帮助它们形成必需氨基酸和维生素(包括维生素B5)。先前的研究已经显示，泛醇通过抑制特异性寄生虫激酶来抑制恶性疟原虫(Plasmodium falciparium)的生长(Saliba等人，2005)。据推测，用泛醇处理昆虫对细菌-昆虫共生是不利的，因此影响昆虫的适合度。此实例证明用泛醇处理降低了昆虫适合度。
治疗性设计：
取决于以下递送方法配制泛醇溶液：
1)在人工饲料中，通过植物：在不含必需氨基酸(2mg/ml组氨酸、2mg/ml异亮氨酸、2mg/ml亮氨酸、2mg/m赖氨酸、1mg/ml甲硫氨酸、1.62mg/ml苯丙氨酸、2mg/ml苏氨酸、1mg/ml色氨酸、和2mg/ml缬氨酸)的人工饲料(基于Akey和Beck，1971；参见实验设计)中配制的0(阴性对照)或10或100uM的泛醇。
2)叶涂层：将在水中的100μl的0.025％非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂Silwet L-77(阴性对照)、或在溶剂溶液中配制的100μl的50μg/ml的利福平直接施用至叶表面并允许干燥。
植物递送实验设计
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫(eNASCO，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄和第二龄蚜虫，并且分成3个不同的处理组：1)不含必需氨基酸的单独的人工饲料，2)含有10uM泛醇但不含必需氨基酸的单独的人工饲料，和3)含有100uM泛醇但不含必需氨基酸的单独的人工饲料。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。
如先前公开(Akey和Beck，1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid，Acyrthosiphon pisum，on a Holidic Diet[以全纯饲料连续饲养豌豆蚜(豌豆长管蚜)])制备含有和不含必需氨基酸(2mg/ml组氨酸、2mg/ml异亮氨酸、2mg/ml亮氨酸、2mg/m赖氨酸、1mg/ml甲硫氨酸、1.62mg/ml苯丙氨酸、2mg/ml苏氨酸、1mg/ml色氨酸、和2mg/ml缬氨酸)的所使用的人工饲料，但两种饲料都不包括高丝氨酸或β丙氨酰基酪氨酸。用KOH将饲料的pH调节至7.5，并将饲料通过0.22μm滤器过滤灭菌并在4℃短期储存(＜7天)或在-80℃长期储存。
将泛醇(西格玛公司，目录号295787)溶液在不含必需氨基酸的人工饲料中以10uM和100uM制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。对于处理(参见治疗性设计)，将适量的储备溶液添加至不含必需氨基酸的人工饲料中以获得10或100uM泛醇的最终浓度。然后将饲料放置在1.5ml Eppendorf管(具有带有叶的蚕豆茎)中，并且使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此人工饲料饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(FisherScientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。
对于每次处理，将16-20只蚜虫放置在每片叶上。贯穿整个实验，每2-3天更换人工饲料饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且当发现死蚜虫时将其从装有人工饲喂系统的深的有盖培养皿中去除。
此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄)。一旦蚜虫到达第4龄期，在深的有盖培养皿向它们提供各自的人工饲喂系统，使得一旦它们到达成虫期，可以监测繁殖力。
对于成年蚜虫，每天计数新的蛹然后丢弃。在实验结束时，繁殖力被确定为一旦蚜虫到达成虫期后每天产生的后代的平均数量。贯穿整个实验，拍摄蚜虫照片以评估治疗组之间的大小差异。
处理8天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
维生素类似物处理延迟了蚜虫发育
如在植物递送实验设计(本文所述的)中定义的，将eNASCO第1龄和第2龄蚜虫分成三个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫在大约5天开始达到成熟(第5龄期)(图48A)。用泛醇处理的蚜虫中发育延迟，尤其是在治疗后两天和三天(图48A)，这指示用泛酸处理损害了蚜虫的发育。最终，来自每个处理组的大多数蚜虫达到成熟并开始繁殖。除了随时间监测蚜虫的发育阶段外，还对蚜虫进行成像并确定蚜虫面积。在1天的处理后所有蚜虫的大小相同，但是，处理后3天，用泛醇处理的蚜虫的面积小于未经处理的对照。此外，与用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫相比，在实验过程中，用泛醇处理的蚜虫的虫体尺寸的增加小得多(如通过面积确定的)(图48B)。
维生素类似物处理增加了蚜虫死亡率
在处理期间还测量了蚜虫的存活率。与用10或100uM泛醇处理的蚜虫相比，饲养在不含必需氨基酸的单独的人工饲料上的蚜虫具有更高的存活率(图49)，这指示泛醇处理负面地影响了蚜虫适合度。
用泛醇的处理降低了蚜虫繁殖力
在治疗期间还监测蚜虫的繁殖力。确定了存活至成熟和繁殖的蚜虫的分数。用不含必需氨基酸的人工饲料处理的蚜虫中大约四分之一在处理后8天存活至成熟(图50A)。相比之下，只有用10或100uM泛醇处理的蚜虫中略高于1/10的蚜虫在处理后8天存活至成熟并繁殖。还测量了每个处理组中的蚜虫开始繁殖的平均天数，并且对于所有处理组，蚜虫开始繁殖的平均天数为7天(图50B)。另外地，还监测了由成熟的、繁殖蚜虫每天产生的后代的平均数量。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫每天产生大约7个后代。相比之下，用10和100uM泛醇处理的蚜虫每天分别仅产生大约4和5个后代，显示在图50C中。总之，这些数据指示泛醇处理导致蚜虫繁殖的丧失。
泛醇处理不影响蚜虫中布赫纳氏菌
为了测试用泛醇处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理8天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用不含必需氨基酸的单独的人工饲料处理的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝，用两种浓度的泛醇处理的蚜虫也是如此(图51)。这些数据指示泛醇处理不直接地影响布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝数。
叶涂层递送实验设计：
将泛醇粉剂添加至0.025％的非离子有机硅化合物表面活性剂溶剂(Silwet L-77)中以获得10uM泛醇的最终浓度。使用0.22um滤器将处理进行过滤灭菌，并储存在4℃。如在先前实例中所述的，蚜虫(eNASCO菌株，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum)在蚕豆植物上生长。对于实验，从健康植物收集第一龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(仅溶剂溶液)，和2)在溶剂中的10uM泛醇。将100ul的溶液吸收到蚕豆叶的2x2cm片上。
每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。对于每次处理，将20只蚜虫放置在每片叶上。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其去除。此外，贯穿整个实验，每天确定发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、第5龄、和5R(代表繁殖第5龄))。
通过叶涂层递送的泛醇处理不影响蚜虫发育
如在本文所述的实验设计中定义的，将eNASCO第1龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。放置在用对照或泛醇溶液处理的涂覆的叶上的蚜虫在处理后长达两天以相似的速率成熟(图52)。这些数据指示用泛醇涂覆叶不影响蚜虫发育。
通过叶涂层递送的泛醇处理增加了蚜虫死亡率
在叶涂层处理期间还测量了蚜虫的存活率。放置在用泛醇涂覆的叶上的蚜虫比放置在用对照溶液涂覆的叶上的蚜虫具有更低的存活率(图53)。这些数据指示通过叶涂层递送的泛醇处理显著地(p＝0.0019)影响了蚜虫存活。此实验中的所有蚜虫死亡，因此没有蚜虫存留以从中提取DNA并确定布赫纳氏菌/蚜虫DNA比率。
总之，在先前实例中描述的此数据证明了通过多个递送方法用泛醇处理蚜虫而杀死和降低蚜虫发育、生殖能力、寿命、和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例24：用氨基酸转运体抑制剂的混合物处理昆虫
此实例证明了用氨基酸类似物的混合物处理蚜虫。此处理的目的是通过ApGLNT1谷氨酰胺转运体抑制含菌细胞摄取谷氨酰胺。先前已经显示，精氨酸通过谷氨酰胺转运体抑制谷氨酰胺摄取(Price等人，2014 PNAS[美国国家科学院院刊])，并且我们假设用精氨酸的类似物、或其他氨基酸类似物处理也可以抑制蚜虫含菌细胞摄取必需氨基酸。此实例证明了处理后适合度的降低是通过调节与对氨基酸类似物敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是布赫纳氏菌。
治疗性设计：
将氨基酸混合物配制用于通过叶灌注递送和通过植物递送。此递送方由用以下组成：向叶注射在水中的大约1ml的氨基酸混合物(参见下面的混合物中的组分列表)、或者1ml的仅含有水的阴性对照溶液。
叶灌注和通过植物递送实验设计：
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理)，和2)氨基酸混合物处理。氨基酸混合物含有指示的最终浓度的以下每种药剂：330μM L-NNA(N-硝基-L-精氨酸；西格玛公司)、0.1mg/mlL-刀豆氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-精氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-苯丙氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-组氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-色氨酸(西格玛公司)、0.5mg/mlD-苏氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-缬氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-甲硫氨酸(西格玛公司)、0.5mg/ml D-亮氨酸、和6μM L-NMMA(柠檬酸酯)(开曼化学公司(CaymanChemical))。经由注射将约1ml的处理溶液灌注到蚕豆叶中，并且将植物的茎放置进含有处理溶液的1.5ml Eppendorf管中。使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此饲喂系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。对于每次处理，将总共56-58只蚜虫放置在每片叶上(每种处理由28-31只蚜虫的两次重复组成)。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。贯穿整个实验，每天确定蚜虫发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、和第5龄)，并在第5天拍摄蚜虫的显微图像以确定蚜虫面积测量值。
将L-NNA的储备溶液在水中以5mM制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。将L-刀豆氨酸的储备溶液在水中以100mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。将D-精氨酸和D-苏氨酸的储备溶液在水中以50mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。将D-缬氨酸和D-甲硫氨酸的储备溶液在水中以25mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。将D-亮氨酸的储备溶液在水中以12mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。将D-苯丙氨酸和D-组氨酸的储备溶液在1M HCl中以50mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。将D-色氨酸的储备溶液在0.5MHCl中以50mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在4℃。将L-NMMA的储备溶液在无菌PBS中以6mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。对于处理(参见治疗性设计)，将适量的储备溶液添加至水中以获得如上所指示的混合物中药剂的最终浓度。
处理6天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用氨基酸类似物的混合物的处理延迟和停止了蚜虫发育的进展
如在叶灌注和通过植物递送实验设计(本文所述的)中定义的，将LSR-1第1龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用水处理的蚜虫在5天处理后开始达到成熟(第5龄期)(图54A)。通过6天处理后，用水处理的蚜虫中约20％达到第5龄期。相比之下，小于3％的氨基酸混合物处理的蚜虫达到第5龄期，甚至6天后(图54A)。通过在处理后5天进行的蚜虫尺寸测量中进一步例证了用氨基酸混合物处理后的这种发育延迟。用单独的水处理的蚜虫为大约0.45mm2，而用氨基酸混合物处理的蚜虫为大约0.33mm2(图54B)。这些数据指示用氨基酸混合物处理延迟了蚜虫发育，负面地影响蚜虫适合度。
用氨基酸类似物混合物的处理导致蚜虫中布赫纳氏菌降低
为了测试用氨基酸类似物混合物处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理6天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。放置在对照溶液中的蚜虫具有高比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝。相比之下，放置在AA混合物处理上的蚜虫具有大幅减小的布赫纳氏菌/蚜虫DNA拷贝(图55)，这指示AA类似物混合物处理消除了内共生布赫纳氏菌。
总之，此数据证明了通过用氨基酸类似物的混合物处理蚜虫而降低蚜虫发育和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例25：用药剂(抗生素、肽、和天然抗微生物剂)的组合处理昆虫
此实例证明了用三种抗微生物剂(抗生素(利福平))、肽(蝎肽Uy192)、和天然抗微生物剂(低分子量壳聚糖))的组合处理昆虫。在其他实例中，单独地给予这些药剂的每个导致了降低的蚜虫适合度和减少的内共生体水平。此实例证明，通过递送处理的组合，昆虫适合度和内共生体水平降低，这与单独用每种单独药剂进行的处理一样好，或者更好。
治疗性设计
将组合处理配制用于通过叶灌注递送和通过植物递送。此递送方由用以下组成：向叶注射在水中的大约1ml的组合处理(含有100μg/ml利福平、100μg/ml Uy192、和300μg/ml壳聚糖的最终浓度)、或者1ml的仅含有水的阴性对照溶液。
叶灌注和通过植物递送实验设计
在气候控制培养箱(16小时光照/8小时黑暗光周期；60％±5％RH；25℃±2℃)中，蚜虫LSR-1(仅含有布赫纳氏菌，豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum))在蚕豆植物(来自约翰尼精选种子公司(Johnny′s Selected Seeds)的Vroma vicia faba)上生长。在用于蚜虫饲养之前，在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使蚕豆植物在盆栽土中生长。为了限制植物之间的母体效应或健康差异，将来自不同植物的5-10个成虫分布在10个两周龄的植物中，并且允许繁殖至高密度，持续5-7天。对于实验，从健康植物收集第一龄蚜虫，并且分成2个不同的处理组：1)阴性对照(水处理)，和2)100μg/ml利福平、100μg/ml Uy192、和300μg/ml壳聚糖处理的组合。经由注射将约1ml的处理溶液灌注到蚕豆叶中，并且将植物的茎放置进含有处理溶液的1.5ml Eppendorf管中。使用石蜡膜封闭管的开口。然后将此处理系统放置在深的有盖培养皿(飞世尔科技公司(Fisher Scientific)，目录号FB0875711)中，并将蚜虫施用于植物的叶。对于每次处理，将总共56只蚜虫放置在每片叶上(每种处理由28只蚜虫的两次重复组成)。每个处理组从每个收集植物接收大约相同数量的个体。贯穿整个实验，每2-3天更换饲喂系统。每天监测蚜虫的存活，并且在发现死蚜虫时将其从深的有盖培养皿中去除。贯穿整个实验，每天确定蚜虫发育阶段(第1龄、第2龄、第3龄、第4龄、和第5龄)，并在第5天拍摄蚜虫的显微图像以确定蚜虫面积测量值。
将利福平(东京化工有限公司(Tokyo Chemical Industry，LTD))储备溶液在甲醇中以25mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。对于处理，将适量的储备溶液添加至水中以获得100μg/ml利福平的最终浓度。通过生物合成以＞75％纯度合成Uy192。将1mg的冻干的肽重组到500μl的80％乙腈、20％水、和0.1％TFA中。将100μl(100μg)等分到10个单独的Eppendorf管中并允许干燥。对于处理，将1ml的水添加至肽的100μg等分试样中以获得100μg/ml Uy192的最终浓度。将壳聚糖(西格玛公司(Sigma)，目录号448869-50G)储备溶液在乙酸中以1％制备，高压灭菌法灭菌，并储存在4℃。对于处理，将适量的储备溶液添加至水中以获得300μg/ml壳聚糖的最终浓度。
处理6天后，从来自每个处理组的多个蚜虫提取DNA。简言之，通过将蚜虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对蚜虫体表进行灭菌。然后将蚜虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量布赫纳氏菌和蚜虫DNA拷贝数。用于布赫纳氏菌的引物是Buch_groES_18F(CATGATCGTGTGCTTGTTAAG；SEQ ID NO：238)和Buch_groES_98R(CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC；SEQ ID NO：239)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。用于蚜虫的引物是ApEF1a 107F(CTGATTGTGCCGTGCTTATTG；SEQ ID NO：240)和ApEF1a 246R(TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC；SEQ ID NO：241)(Chong和Moran，2016 PNAS[美国国家科学院院刊])。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)55℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
用三种抗微生物剂的组合的处理延迟和停止了蚜虫发育的进展
如在叶灌注和通过植物递送实验设计(本文所述的)中定义的，将LSR-1第1龄蚜虫分成两个不同的处理组。每天监测蚜虫并确定每个发育阶段的蚜虫数量。用水处理的蚜虫在5天处理后开始达到成熟(第5龄期)(图56A)。通过6天处理后，用水处理的蚜虫中约20％达到第5龄期。相比之下，用三种药剂的组合处理的蚜虫中没有蚜虫达到第5龄期，甚至6天后(图56A)。通过在处理后5天进行的蚜虫尺寸测量进一步例证了用组合处理后的这种发育延迟。用单独的水处理的蚜虫为大约0.45mm2，而用3种药剂组合处理的蚜虫为大约0.26mm2(图56B)。这些数据指示用药剂的组合的处理延迟了蚜虫发育，负面地影响蚜虫适合度。
用三种抗微生物剂的组合的处理增加了蚜虫死亡率
处理后也每天监测存活。在处理后2天，用水处理的蚜虫中大约75％存活，而用药剂的组合处理的蚜虫中仅62％存活。在实验期间，在对照(用水处理的)组的处理中更多的蚜虫存活的趋势持续。在处理后6天，对照(用水处理的)蚜虫中64％存活，而用利福平、Uy192、和壳聚糖的组合处理的蚜虫中58％存活(图57)。这些数据指示处理的组合负面地影响蚜虫存活。
用三种药剂的组合的处理导致蚜虫中布赫纳氏菌降低
为了测试用肽、抗生素、和天然抗微生物剂的组合处理是否特异性地导致蚜虫中布赫纳氏菌的丧失，并且这种丧失影响蚜虫适合度，在处理6天后从每个处理组的蚜虫中提取DNA并且进行qPCR以确定布赫纳氏菌/蚜虫拷贝数。用单独的水处理的蚜虫比率为大约2.3布赫纳氏菌/蚜虫DNA(图58)。相比之下，用肽、抗生素、和天然抗微生物剂的组合处理的蚜虫具有大约2倍较低比率的布赫纳氏菌/蚜虫DNA(图58)。这些数据指示组合处理减少内共生体水平，该减少的内共生体水平导致蚜虫适合度降低。
总之，此数据证明了通过用肽、抗生素、和天然抗微生物剂的组合处理蚜虫而降低蚜虫发育和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例26：用抗生素溶液处理的昆虫
此实例证明了用环丙沙星(一种抑制DNA旋转酶和拓扑异构酶(DNA复制所必需的两种酶)的活性的杀细菌的抗生素)处理象鼻虫的作用。此实例证明环丙沙星对另外的模型昆虫(象鼻虫)的表型作用是通过调节与对环丙沙星敏感的昆虫内源的细菌群体来介导的。一个靶向的细菌菌株是米象属(Sitophilus)原生内共生体(SPE，暂定属Sodalispierantonius)。
实验设计：
将米象属(Sitophilus)玉米象(maize weevils，Sitophilus zeamais)用有机玉米在27.5℃和70％相对湿度下饲养。在用于象鼻虫饲养之前，将玉米冷冻7天，然后用无菌水回火至10％湿度。对于实验，将成虫雄性/雌性交配对分成3个不同的处理组，将这些组一式三份进行：1)水对照，2)250μg/ml环丙沙星，和3)2.5mg/ml环丙沙星。将环丙沙星(西格玛公司)储备溶液在0.1N HCl中以25mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。对于处理，将适量的储备溶液在无菌水中稀释。
对象鼻虫进行以下三个连续处理：
1.第一次处理包括用上文列出的三个处理组中的每个浸泡25g玉米：1)水对照，2)250μg/ml环丙沙星，和3)2.5mg/ml环丙沙星。简言之，将25g的玉米放置在50ml锥形管中，并添加每种处理至填满管。将管置于振荡器上1.5小时，然后取出玉米并放置在深的有盖培养皿中并风干。然后将雄性/雌性交配对添加至每个处理组中并允许进食4天。
2. 4天后，取出交配对，并通过将它们置于25g用以下处理的新的玉米中进行第二次处理：1)水对照、2)250μg/ml环丙沙星、和3)2.5mg/ml环丙沙星。交配对在这种玉米上进食和产卵7天。评估来自第二次处理的玉米中后代的出现(参见下文的评估后代)。
3.对交配对进行最终处理，该最终处理包括将它们浸泡在以下处理中的组合中：(1)水对照、2)250μg/ml环丙沙星、和3)2.5mg/ml环丙沙星持续5秒，然后将它们放置在小瓶中，该小瓶含有用1ml的1)水对照、2)250μg/ml环丙沙星、和3)2.5mg/ml环丙沙星涂覆的10个玉米籽粒。
每天监测象鼻虫存活，持续18天，之后从每组中剩余的象鼻虫中提取DNA。简言之，通过将象鼻虫浸入6％漂白溶液中大约5秒来对象鼻虫体进行表面灭菌。然后将象鼻虫在无菌水中漂洗，并且使用DNA提取试剂盒(凯杰公司，DNeasy试剂盒)根据制造商的说明从每个个体蚜虫中提取DNA。使用nanodrop核酸定量法测量DNA浓度，并且通过qPCR测量SPE和象鼻虫DNA拷贝数。用于SPE的引物是qPCR_Sod_F(ATAGCTGTCCAGACGCTTCG；SEQ ID NO：242)和qPCR_Sod_R(ATGTCGTCGAGGCGATTACC；SEQ ID NO：243)。用于象鼻虫(β-肌动蛋白)的引物是SACT144_FOR(GGTGTTGGCGTACAAGTCCT；SEQ ID NO：244)和SACT314_REV(GAATTGCCTGATGGACAGGT；SEQ ID NO：245)(Login等人，2011)。使用1.6℃/秒的qPCR扩增斜率和以下条件进行qPCR：1)95℃持续10分钟，2)95℃持续15秒，3)57℃持续30秒，4)重复步骤2-3 40x，5)95℃持续15秒，6)55℃持续1分钟，7)斜率改变为0.15℃/s，8)95℃持续1秒。使用分析软件(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，QuantStudio设计和分析)分析qPCR数据。
评估后代：
在25天后，切开来自成虫交配对的第二次处理的玉米籽粒的一个重复(参见上面的实验设计)以检查任何发育中的幼虫、蛹、或成虫象鼻虫的存在。米象属(Sitophilus)象鼻虫的大部分发育都发生在谷粒/稻米/玉米中，并且一旦发育完成，成虫就会从籽粒玉米中出现。用解剖刀轻轻切开玉米籽粒，并且收集任何发育中的象鼻虫，以及确定成虫、蛹和幼虫的百分比。然后对来自解剖的象鼻虫进行表面灭菌，并通过qPCR确定SPE的水平。来自第二次处理的每组的剩余两个重复的玉米籽粒未被切开，但每天检查成虫象鼻虫的出现。
评估抗生素对玉米的渗透
将25mg的玉米籽粒放置在50ml锥形管中，并添加水或者在水中的2.5mg/ml或0.25mg/ml环丙沙星至填满管。如本文所述将籽粒浸泡1.5小时。浸泡后，将籽粒风干并进行测定以确定抗生素是否能够涂覆并渗透籽粒。为了测试这一点，将在水中的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α的浓缩的样品涂布在5个卢里亚肉汤(Luria Broth，LB)板上。对每个板进行：1)添加浸泡在水中的玉米籽粒，2)添加已经用2.5或0.25mg/ml环丙沙星浸泡的整个玉米籽粒，和3)添加已经用2.5或0.25mg/ml环丙沙星浸泡的半个玉米籽粒，并将其置于板内。将板在37℃孵育过夜，并在第二天评估细菌生长和/或一个或多个抑制区。
在抗生素中浸泡玉米籽粒允许抗生素涂覆玉米籽粒表面并渗透玉米籽粒。
为了测试环丙沙星是否能够涂覆玉米籽粒的表面，之后将籽粒(玉米籽粒)浸泡在不含抗生素的水中、或含有2.5或0.25mg/ml环丙沙星的水中(如上所述)。然后将浓缩的大肠杆菌培养物涂布在LB板上，然后将一个涂覆的籽粒放置在板的中心上。将板孵育过夜，并在第二天评估细菌生长。
细菌的菌苔在整个板上生长，其中玉米籽粒已经涂覆有水而没有任何抗生素(图56A)。相比之下，没有细菌在具有浸泡在两种浓度的环丙沙星中的任一种中的整个玉米籽粒的板上生长(图56B，左小图)。这些数据显示，在这些实验中使用的涂覆方法允许环丙沙星成功地涂覆玉米籽粒表面并抑制细菌生长。
为了测试环丙沙星是否可以渗透玉米籽粒，将浸泡在2.5或0.25mg/ml环丙沙星中的玉米籽粒切成两半，并将切面朝下放在含有浓缩的大肠杆菌培养物的LB板上。将板孵育过夜，并在第二天评估细菌生长。在板上没有细菌生长，其中籽粒浸泡在任一浓度的抗生素中，这指示环丙沙星渗透玉米籽粒(图56B，右小图)。总之，这些数据指示用于这些实验的玉米粒浸泡方法成功地使籽粒被抗生素涂覆并渗透。
抗生素处理降低了F0代中的SPE水平。
如实验设计(上文)中定义的，将S.zeamais交配对分成三个不同的处理组。每天监测象鼻虫，并且所有象鼻虫在实验过程中都保持存活。处理18天后，对象鼻虫进行表面灭菌，提取基因组DNA，并且通过qPCR测量SPE水平。与分别用250ug/ml和2.5mg/ml环丙沙星处理的象鼻虫相比，仅用水处理的象鼻虫具有大约4倍和8倍更高量的SPE(图57)。这些数据指示用环丙沙星处理象鼻虫导致SPE水平降低。
抗生素处理延迟了发育并且降低了象鼻虫的F1代的SPE水平。
通过解剖F0交配对已经产卵7天并随后被去除的玉米籽粒来评估F1代象鼻虫的发育。在25天后，在用水/对照处理的玉米中发现12个后代，其中大部分(约67％)的后代处于蛹形式(图58A)。在用250ug/ml和2.5mg/ml环丙沙星处理的象鼻虫中分别发现了13和20个后代。有趣的是，与对照处理的象鼻虫相比，用抗生素处理的象鼻虫显示出发育延迟，其中大多数(对于250ug/ml和2.5mg/ml环丙沙星，分别为38％和65％)的后代处于幼虫形式(图58A)。
从来自玉米籽粒切开的象鼻虫中提取基因组DNA，并进行qPCR以测量SPE的水平。与用2.5mg/ml环丙沙星处理的象鼻虫相比，用水处理的F1象鼻虫具有大约4倍更高的SPE水平(图58B)。这些数据指示，用环丙沙星处理降低象鼻虫中SPE水平，这导致发育延迟。
抗生素处理降低了象鼻虫繁殖
将在初始交配对从第二次处理中去除后43天的过程中出现的象鼻虫的数量用于测量繁殖力(图59A和59B)。第一个象鼻虫在第29天出现，并计算出直到第43天出现的象鼻虫总数。虽然用水和250ug/ml处理的象鼻虫具有相似量的F1后代，但是从2.5mg/ml处理组产生的后代少得多，这指示抗生素处理降低了SPE水平，影响象鼻虫繁殖力。
与先前的实例一起，此数据证明了通过多个递送方法用抗生素处理象鼻虫而杀死和降低象鼻虫发育、生殖能力、寿命和内源性细菌群体的能力(例如，适合度)。
实例27：用抗生素溶液处理螨
此实例证明了通过用利福平(一种通过抑制细菌RNA聚合酶而抑制DNA依赖性RNA合成的窄谱抗生素)和强力霉素(一种通过抑制蛋白合成阻止细菌繁殖的广谱抗生素)处理棉红蜘蛛(two-spotted spider mite)来杀死、降低棉红蜘蛛适合度的能力。利福平和强力霉素对螨的作用是通过调节与对抗生素敏感的螨内源的细菌群体来介导的。
昆虫(如，蚊子)和蛛形纲动物(如，蜱)可以作为针对病原体的媒介起作用，在人和动物中引起严重疾病，如莱姆病、登革热、锥体虫病、和疟疾。媒介传播的疾病每年引起数百万人死亡。此外，感染动物(如牲畜)的媒介传播的疾病代表主要的全球公共卫生负担。因此，需要控制携带媒介传播的疾病的对照昆虫和蛛形纲动物的方法和组合物。棉红蜘蛛是与蜱在相同亚纲中的蛛形纲动物。因此，此实例证明了用于降低棉红蜘蛛的适合度以及用于提供降低蜱适合度的见解的方法和组合物。
治疗性设计
将两种处理用于这些实验：1)0.025％Silwet L-77(阴性对照)、或2)含有250μg/ml利福平和500μg/ml强力霉素的抗生素的混合物。将利福平(东京化工有限公司(TokyoChemical Industry，LTD))储备溶液在甲醇中以25mg/ml制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。将强力霉素(制造商公司(manufacture))储备溶液在水中以50mg/mL制备，穿过0.22μm针筒式滤器灭菌，并储存在-20℃。
实验设计：
此测定在棉红蜘蛛上测试了抗生素溶液，并通过靶向内源性微生物确定了它们的适合度如何改变。
在24℃伴随16小时的光照和8小时的黑暗，使肾形豆(kidney)植物在盆栽土中生长。在26℃和15％-20％相对湿度下，在肾形豆(kidney bean)植物上饲养螨。对于处理，从肾形豆(kidney bean)叶上切下一英尺直径的叶圆盘，并使用Master Airbrush品牌压缩机型号C-16-B黑色迷你喷枪空气压缩机用0.025％Silwet L-77(阴性对照)或抗生素混合物(在0.025％Silwet L-77中的250μg/ml利福平和500μg/ml强力霉素)进行喷雾。在处理之前、之后和之间用乙醇清洁压缩机。使用四分之一英寸的管将液体通过压缩机进料。每次处理使用新管。
在叶盘干燥后，将每种处理中的四个放置在覆盖有一片擦拭纸(金佰利公司(kimwipe))的湿棉球顶部的杯中。每个处理设置一式两份进行。然后将25只成年雌性螨放入杯中。在第4天，将雌性从杯中取出，并且将卵和幼虫留在叶盘上。
在第11天，从杯中取出在第一若虫阶段和第二若虫阶段的螨并放入它们自己的管中，这样可以测量存活。每个管含有一个湿润的棉球，上面覆盖着一片擦拭纸(金佰利公司)，其中半英寸的叶盘用阴性对照或混合物处理。
在用抗生素或对照溶液处理的叶上饲喂后，每天在解剖显微镜下观察螨，并根据以下类别分类：
·存活：在用漆刷戳后，它们用腿走动或者被移动。
·死亡：不移动并且对漆刷的刺激没有反应
使用无菌漆刷通过触碰它们的腿来刺激螨。在整个测定过程中保留分类为死亡的螨并每天重新检查运动。测定在26℃和15％-20％相对湿度下进行。
抗生素处理增加了螨死亡率
将用阴性对照处理的螨与用抗生素混合物处理的棉红蜘蛛的存活率进行比较。与对照相比，用混合物处理的螨的存活率降低(图60)。
此数据证明了通过用抗生素溶液处理螨而降低螨的适合度的能力。
实例28：用纯化的噬菌体溶液处理昆虫
此实例证明了从靶向特异性昆虫细菌的环境样品中分离和纯化噬菌体。此实例还通过噬斑测定，通过测量其氧消耗率和细胞外酸化率，证明了分离的噬菌体在体外针对靶细菌的功效。最后，此实例通过测量噬菌体对来自蝇的靶细菌的能力(通过用针对细菌分离的噬菌体来处理噬菌体)证明了噬菌体在体内的功效。此实例证明了可以使用噬菌体靶向细菌来清除降低昆虫适合度的致病细菌。具体而言，可以使用从花园堆肥中分离的噬菌体清除作为蝇中的致病细菌的黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
实验设计
从天然样品中分离特异性细菌噬菌体：
从环境来源材料中分离出针对靶细菌的细菌噬菌体。简言之，将黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的饱和培养物稀释进新鲜的双倍强度胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中，并在24℃-26℃生长约120分钟至早期对数期，或者稀释进双倍强度的卢里亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani，LB)中并在37℃生长约90分钟。通过在PBS中均质化并通过0.2μm过滤灭菌来制备花园堆肥。通过0.2μm过滤对未处理的污水进行灭菌。将一体积过滤的源材料添加至对数期细菌培养物中并继续孵育24小时。通过沉淀培养物并通过0.45μm膜对上清液进行过滤来制备富集的源材料。
通过将样品铺板到双琼脂细菌菌苔上来分离噬菌体。将固定的细菌培养物与熔融的0.6％琼脂LB或TSB组合并倾倒入1.5％琼脂LB或TSB板上。凝固后，将2.5μL噬菌体样品稀释液点样在双琼脂板上并允许其吸收。然后将板包裹并在25℃(TSA)或37℃(LB)孵育过夜，然后对可见噬斑的形成进行评估。将新分离的噬斑通过在靶菌株上连续传代单个噬斑(通过将噬斑选择到SM缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 7.4]、10mM MgSO4、100mM NaCl)中并在55℃孵育15分钟)进行纯化，然后使用噬斑悬浮液重复上文的双琼脂点样方法。
如上详述，成功地从污水和堆肥中分离出细菌噬菌体。在将样品点样到用于富集的黏质沙雷氏菌细菌的菌苔上之后，噬斑形成是清楚明显的。
细菌噬菌体的传代、定量、和繁殖：
使用如上分离和纯化的细菌噬菌体进行用于后续实验的噬菌体裂解物的繁殖和产生。简言之，将饱和细菌培养物稀释100倍至新鲜培养基中并生长60-120分钟以实现用于有效噬菌体感染的早期对数生长状态。将噬菌体悬浮液或裂解物添加至早期对数期培养物中并继续孵育直至观察到肉汤清除(指示噬菌体繁殖和细菌裂解)，或直至感染后直至24小时。通过以7,197xg沉淀细胞20分钟，然后通过0.45或0.2μm膜过滤上清液来收获裂解物。将过滤的裂解物储存在4℃。
使用双琼脂点样法进行感染性噬菌体颗粒的计数。简言之，在PBS中进行1∶10稀释系列的样品，并将稀释液点样在用如上的宿主细菌制备的固化双琼脂板上。在孵育过夜后计数噬斑形成单位(PFU)以确定样品的近似滴度。
测量细菌呼吸的分离噬菌体的体外分析：
通过监测感染期间的氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)，使用海马(Seahorse)XFe96分析仪(安捷伦公司(Agilent))测量噬菌体对细菌的作用。在实验前一天，将XFe96板通过每孔15μL的1mg/mL聚-L-赖氨酸储备液涂覆并在28℃干燥过夜，并且将XFe96探针通过放置在含有200μL的校准液(XF Calibrant)的孔中平衡并在黑暗中在室温孵育。第二天，用ddH2O洗涤用聚-L-赖氨酸涂覆的板两次。将大肠杆菌BL21(LB，37℃)或黏质沙雷氏菌(TSB，25℃)的饱和的过夜培养物以1∶100继代培养到相同的培养基并在30℃通风培养约2.5小时。然后使用相同的培养基将培养物稀释(O.D.600nm)至约0.02。通过以10x最终浓度将储备液稀释到SM缓冲液中并将20μL的10x溶液加载到探针板的适当注射口中来制备处理。当探针在XFe96 Flux分析仪中平衡时，将细菌板通过添加90μL细菌悬浮液或培养基对照制备并以3,000rpm旋转10分钟。离心后，将另外的90μL适当的培养基轻轻地添加至孔中，以便不干扰细菌粘附，使每孔的总体积达到180μL。
XFe96 Flux分析仪在约30℃运行，按照1∶00、0∶30、3∶00的混合、等待、读数循环。完成四个循环以允许细菌的平衡/标准化，然后注射20μL处理并如上继续循环，持续总共大约6小时。使用海马(Seahorse)XFe96 Wave软件包分析数据。
用海马(Seahorse)XFe96分析仪，通过测量细菌的氧消耗率(OCR)和细胞外酸化率(ECAR)测定分离的细菌噬菌体的作用。当用新分离的ΦSmVL-C1感染噬菌体T7和黏质沙雷氏菌感染大肠杆菌时，在该速率短暂爆发后观察到OCR显著降低(图64)。对于具有两种宿主生物的两种噬菌体，海马(Seahorse)测定允许检测成功的噬菌体感染而无需噬斑测定。因此，此方法适用于检测不适合传统噬菌体检测方法的宿主生物的噬菌体感染。
用于感染鉴定的SYBR Gold转导测定：
通过用核酸酶预处理来除去可以干扰荧光信号说明的额外病毒核酸(extraviralnucleic acid)，制备细菌噬菌体制剂用于染色。简言之，将MgCl2添加至10mL的噬菌体裂解物(10mM最终浓度)，并且添加RNA酶A(凯杰公司)和DNA酶I(西格玛公司)两者至10μg/mL的最终浓度。将样品在室温孵育1小时。核酸酶处理后，将5mL的裂解物与1μL的SYBR Gold(赛默公司(Thermo)，10,000x)合并，并且在室温孵育约1.5小时。随后使用米康(Amicon)超滤柱从样品中去除过量的染料。简言之，通过添加10mL的SM缓冲液并在5,000xg、4℃旋转5分钟来洗涤米康(Amicon)柱(15mL，10k MWCO)。然后将标记的噬菌体样品以5,000xg、4℃旋转通过柱，直至体积减少大约10倍(15-30分钟)。为了洗涤样品，将5mL SM缓冲液添加至每个贮存器并重复旋转，然后再洗涤两次。在第三次洗涤后，将保留的样品从米康(Amicon)贮存器中用移液管移出，并使用SM缓冲液使其达到大约1mL。为了除去较大的污染物，将洗涤过的和标记的噬菌体样品以10,000xg离心2分钟，随后将上清液通过0.2μm膜过滤到黑色微管中并在4℃储存。
通过减速旋转1mL等分试样并用1mL PBS洗涤一次，然后使用1mL PBS最终重悬来制备饱和细菌培养物(在37℃在LB中生长的大肠杆菌MG1655，在26℃在TSB中生长的黏质沙雷氏菌和共生沙雷氏菌(S.symbiotica))。通过将500μL洗涤过的细菌与1μL的SYBR Gold组合并在室温在黑暗中孵育1小时来染色阳性对照标记的细菌。将细菌通过以8,000xg旋转5分钟沉淀，并用等体积的PBS洗涤两次，然后重悬于最终体积为500μL的PBS中。将体积为25μL的染色的细菌与黑色微管中的25μL的SM缓冲液合并，向其中添加50μL的10％福尔马林(5％最终体积，约2％甲醛)并通过轻弹混合。将样品在室温固定约3小时，然后使用米康(Amicon)超滤柱洗涤。简言之，将500μL的picopure水添加至米康(Amicon)柱(0.5mL，100kMWCO)上，并以14,000xg旋转5分钟以洗涤膜。将固定的样品通过添加400μL的PBS进行稀释，然后转移至预洗涤的旋转柱并以14,000xg旋转10分钟。将柱转移到新鲜的收集管中，然后添加500μL的PBS以稀释保留在渗余物中的固定剂。随后，进行另外两次PBS稀释，总共洗涤三次。将最终的渗余物稀释至约100μL，然后将柱倒入新鲜的收集管中并以1,000xg旋转2分钟以收集样品。将洗涤过的样品转移到黑色微管中并储存在4℃。
对于转导实验和对照，将25μL的细菌(或PBS)和25μL的SYBR Gold标记的噬菌体(或SM缓冲液)在黑色微管中合并，并在室温静置孵育15-20分钟以允许噬菌体吸附和注射到受体细菌中。孵育后立即向样品中添加50μL的10％福尔马林，并在室温下固定约4小时。如上，使用米康(Amicon)柱用PBS洗涤样品。
细菌噬菌体核酸的注射需要噬菌体成功地感染宿主细菌细胞。用SYBR Gold标记的并与黏质沙雷氏菌共孵育的大肠杆菌噬菌体P1kc通过显微镜检查显示荧光细菌的存在，这验证了在噬菌体分离管道中测定的用途。与海马(Seahorse)测定一样，这种方法提供了传统噬菌体方法的替代方案，以允许扩增到不适合噬斑测定的生物中。另外地，SYBR Gold转导测定不需要细菌生长，因此适用于分析靶向困难或甚至不可培养的生物(包括内共生体，如布赫纳氏菌)的噬菌体。
测试针对黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)蝇中黏质沙雷氏菌的噬菌体的体内功效
黏质沙雷氏菌培养物在30℃在胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)中生长，伴随200rpm恒定振荡。
用于饲养蝇储备的培养基是玉米粉、糖蜜和酵母培养基(11g/l酵母、54g/l黄玉米粉、5g/l琼脂、66ml/l糖蜜、和4.8ml/l丙酸)。将除丙酸外的所有饲料组分在去离子水中一起加热至80℃(伴随30分钟恒定混合)，然后冷却至60℃。然后混合进丙酸，并将50ml饲料等分到各个瓶中，并允许其冷却并固化。将蝇在26℃、16∶8 小时光照∶黑暗循环、在约60％湿度下饲养。
为了用黏质沙雷氏菌感染蝇，将细针(约10um宽的尖端)浸入密集的过夜静止期培养物中并刺破蝇的胸腔。对于此实验，使用针穿刺法，用黏质沙雷氏菌感染10只雄性和10只雌性的四个重复，作为蝇死亡率的阳性对照。对于处理组，将四个重复(每个10只雄性和10只雌性)用黏质沙雷氏菌和含有约108个噬菌体颗粒/ml的噬菌体溶液针刺。最后，将不用针刺或没有任何处理的两个重复(每个10只雄性和10只雌性)用作死亡率的阴性对照。
将所有条件下的蝇置于食品瓶中并在26℃、16∶8 光照∶黑暗循环、60％湿度下孵育。在针刺后每天计数活蝇和死蝇的数量，持续四天。所有用单独的黏质沙雷氏菌针刺的蝇都在治疗后24小时内死亡。相比之下，噬菌体处理组中超过60％的蝇和未经处理的对照组中的所有蝇在该时间点都存活(图65)。此外，当实验终止时，噬菌体处理组和阴性对照组中的大多数蝇继续存活四天。
为了确定蝇死亡的原因，将来自黏质沙雷氏菌和黏质沙雷氏菌+噬菌体两者针刺蝇中的死蝇均质化并铺板。将来自黏质沙雷氏菌和黏质沙雷氏菌+噬菌体处理的四个重复中的每一个的四只死蝇在100ul的TSB中匀浆。通过在TSB中稀释匀浆也产生1∶100稀释液。将10ul浓缩的匀浆以及1∶100稀释液铺板在TSA板上，并在30℃孵育过夜。在检查用于细菌生长的板时，来自死的质沙雷氏菌针刺的蝇的所有板都有在其上生长的细菌的菌苔，而来自死的黏质沙雷氏菌+噬菌体针刺的蝇的板上没有细菌。这显示在不存在噬菌体时，黏质沙雷氏菌可以在蝇中诱导感染性休克，导致其死亡。然而，在噬菌体的存在下，死亡率可能是由于用针刺引起的损伤。
其他实施例
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的披露都明确地通过引用以其全文并入。
序列表
<110> 旗舰创业股份有限公司（Flagship Pioneering, Inc.）
<120> 用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法
<130> 51215-006WO3
<150> US 62/583,912
<151> 2017-11-09
<150> US 62/450,057
<151> 2017-01-24
<160> 245
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1526
<212> DNA
<213> Carsonella ruddii
<400> 1
tatccagcca caggttcccc tacagctacc ttgttacgac ttcaccccag ttacaaatca 60
taccgttgta atagtaaaat tacttatgat acaatttact tccatggtgt gacgggcggt 120
gtgtacaagg ctcgagaacg tattcaccgt aacattctga tttacgatta ctagcgattc 180
caacttcatg aaatcgagtt acagatttca atccgaacta agaatatttt ttaagattag 240
cattatgttg ccatatagca tataactttt tgtaatactc attgtagcac gtgtgtagcc 300
ctacttataa gggccatgat gacttgacgt cgtcctcacc ttcctccaat ttatcattgg 360
cagtttctta ttagttctaa tatattttta gtaaaataag ataagggttg cgctcgttat 420
aggacttaac ccaacatttc acaacacgag ctgacgacag ccatgcagca cctgtctcaa 480
agctaaaaaa gctttattat ttctaataaa ttctttggat gtcaaaagta ggtaagattt 540
ttcgtgttgt atcgaattaa accacatgct ccaccgcttg tgcgagcccc cgtcaattca 600
tttgagtttt aaccttgcgg tcgtaatccc caggcggtca acttaacgcg ttagcttttt 660
cactaaaaat atataacttt ttttcataaa acaaaattac aattataata tttaataaat 720
agttgacatc gtttactgca tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tccccatgct 780
ttcgtgtatt agtgtcagta ttaaaataga aatacgcctt cgccactagt attctttcag 840
atatctaagc atttcactgc tactcctgaa attctaattt cttcttttat actcaagttt 900
ataagtatta atttcaatat taaattactt taataaattt aaaaattaat ttttaaaaac 960
aacctgcaca ccctttacgc ccaataattc cgattaacgc ttgcacccct cgtattaccg 1020
cggctgctgg cacgaagtta gccggtgctt cttttacaaa taacgtcaaa gataatattt 1080
ttttattata aaatctcttc ttactttgtt gaaagtgttt tacaacccta aggccttctt 1140
cacacacgcg atatagctgg atcaagcttt cgctcattgt ccaatatccc ccactgctgc 1200
cttccgtaaa agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg ttgttcatcc tctaagatca 1260
actacgaatc atagtcttgt taagctttta ctttaacaac taactaattc gatataagct 1320
cttctattag cgaacgacat tctcgttctt tatccattag gatacatatt gaattactat 1380
acatttctat atacttttct aatactaata ggtagattct tatatattac tcacccgttc 1440
gctgctaatt atttttttaa taattcgcac aacttgcatg tgttaagctt atcgctagcg 1500
ttcaatctga gctatgatca aactca 1526
<210> 2
<211> 1536
<212> DNA
<213> 粉虱（aleyrodidarum） BT-B
<400> 2
aagagtttga tcatggctca gattgaacgc tagcggcaga cataacacat gcaagtcgag 60
cggcatcata caggttggca agcggcgcac gggtgagtaa tacatgtaaa tatacctaaa 120
agtggggaat aacgtacgga aacgtacgct aataccgcat aattattacg agataaagca 180
ggggcttgat aaaaaaaatc aaccttgcgc ttttagaaaa ttacatgccg gattagctag 240
ttggtagagt aaaagcctac caaggtaacg atccgtagct ggtctgagag gatgatcagc 300
cacactggga ctgagaaaag gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 360
caatgggggg aaccctgatc cagtcatgcc gcgtgtgtga agaaggcctt tgggttgtaa 420
agcactttca gcgaagaaga aaagttagaa aataaaaagt tataactatg acggtactcg 480
cagaagaagc accggctaac tccgtgccag cagccgcggt aagacggagg gtgcaagcgt 540
taatcagaat tactgggcgt aaagggcatg taggtggttt gttaagcttt atgtgaaagc 600
cctatgctta acataggaac ggaataaaga actgacaaac tagagtgcag aagaggaagg 660
tagaattccc ggtgtagcgg tgaaatgcgt agatatctgg aggaatacca gttgcgaagg 720
cgaccttctg ggctgacact gacactgaga tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag 780
ataccctggt agtccacgct gtaaacgata tcaactagcc gttggattct taaagaattt 840
tgtggcgtag ctaacgcgat aagttgatcg cctggggagt acggtcgcaa ggctaaaact 900
caaatgaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgatgcaacg 960
cgcaaaacct tacctactct tgacatccaa agtactttcc agagatggaa gggtgcctta 1020
gggaactttg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgttgtgaa atgttgggtt 1080
aagtcccgta acgagcgcaa cccttgtcct tagttgccaa cgcataaggc gggaacttta 1140
aggagactgc tggtgataaa ccggaggaag gtggggacga cgtcaagtca tcatggccct 1200
taagagtagg gcaacacacg tgctacaatg gcaaaaacaa agggtcgcaa aatggtaaca 1260
tgaagctaat cccaaaaaaa ttgtcttagt tcggattgga gtctgaaact cgactccata 1320
aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt ctcgggcctt 1380
gtacacaccg cccgtcacac catggaagtg aaatgcacca gaagtggcaa gtttaaccaa 1440
aaaacaggag aacagtcact acggtgtggt tcatgactgg ggtgaagtcg taacaaggta 1500
gctgtagggg aacctgtggc tggatcacct ccttaa 1536
<210> 3
<211> 1540
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株（Buchnera aphidicola）APS（豌豆长管蚜（Acyrthosiphonpisum））
<400> 3
agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaagc ctaacacatg caagtcgagc 60
ggcagcgaga agagagcttg ctctctttgt cggcaagcgg caaacgggtg agtaatatct 120
ggggatctac ccaaaagagg gggataacta ctagaaatgg tagctaatac cgcataatgt 180
tgaaaaacca aagtggggga ccttttggcc tcatgctttt ggatgaaccc agacgagatt 240
agcttgttgg tagagtaata gcctaccaag gcaacgatct ctagctggtc tgagaggata 300
accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 360
attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc tatgccgcgt gtatgaagaa ggccttaggg 420
ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaaaa aataaaacta ataattttat ttcgtgacgt 480
tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc cgcggtaata cggagggtgc 540
aagcgttaat cagaattact gggcgtaaag agcgcgtagg tggtttttta agtcaggtgt 600
gaaatcccta ggctcaacct aggaactgca tttgaaactg gaaaactaga gtttcgtaga 660
gggaggtaga attctaggtg tagcggtgaa atgcgtagat atctggagga atacccgtgg 720
cgaaagcggc ctcctaaacg aaaactgaca ctgaggcgcg aaagcgtggg gagcaaacag 780
gattagatac cctggtagtc catgccgtaa acgatgtcga cttggaggtt gtttccaaga 840
gaagtgactt ccgaagctaa cgcattaagt cgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct 900
aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 960
gcaacgcgaa aaaccttacc tggtcttgac atccacagaa ttctttagaa ataaagaagt 1020
gccttcggga gctgtgagac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt tgtgaaatgt 1080
tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tatcccctgt tgccagcggt tcggccggga 1140
actcagagga gactgccggt tataaaccgg aggaaggtgg ggacgacgtc aagtcatcat 1200
ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggttt atacaaagag aagcaaatct 1260
gcaaagacaa gcaaacctca taaagtaaat cgtagtccgg actggagtct gcaactcgac 1320
tccacgaagt cggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg ccacggtgaa tacgttcccg 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt gcaaaagaag caggtatcct 1440
aaccctttaa aaggaaggcg cttaccactt tgtgattcat gactggggtg aagtcgtaac 1500
aaggtaaccg taggggaacc tgcggttgga tcacctcctt 1540
<210> 4
<211> 1552
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株（Buchnera aphidicola str.）Sg（麦二叉蚜（Schizaphisgraminum））
<400> 4
aaactgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctggc ggcaagccta acacatgcaa 60
gtcgagcggc agcgaaaaga aagcttgctt tcttgtcggc gagcggcaaa cgggtgagta 120
atatctgggg atctgcccaa aagaggggga taactactag aaatggtagc taataccgca 180
taaagttgaa aaaccaaagt gggggacctt ttttaaaggc ctcatgcttt tggatgaacc 240
cagacgagat tagcttgttg gtaaggtaaa agcttaccaa ggcaacgatc tctagctggt 300
ctgagaggat aaccagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa tattgcacaa tgggcgaaag cctgatgcag ctatgccgcg tgtatgaaga 420
aggccttagg gttgtaaagt actttcagcg gggaggaaaa aattaaaact aataatttta 480
ttttgtgacg ttacccgcag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 540
acggagggtg cgagcgttaa tcagaattac tgggcgtaaa gagcacgtag gtggtttttt 600
aagtcagatg tgaaatccct aggcttaacc taggaactgc atttgaaact gaaatgctag 660
agtatcgtag agggaggtag aattctaggt gtagcggtga aatgcgtaga tatctggagg 720
aatacccgtg gcgaaagcgg cctcctaaac gaatactgac actgaggtgc gaaagcgtgg 780
ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgtcg acttggaggt 840
tgtttccaag agaagtgact tccgaagcta acgcgttaag tcgaccgcct ggggagtacg 900
gccgcaaggc taaaactcaa atgaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg 960
tttaattcga tgcaacgcga aaaaccttac ctggtcttga catccacaga attttttaga 1020
aataaaaaag tgccttcggg aactgtgaga caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1080
ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttatcccctg ttgccagcgg 1140
ttcggccggg aactcagagg agactgccgg ttataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt 1200
caagtcatca tggcccttac gaccagggct acacacgtgc tacaatggtt tatacaaaga 1260
gaagcaaatc tgtaaagaca agcaaacctc ataaagtaaa tcgtagtccg gactggagtc 1320
tgcaactcga ctccacgaag tcggaatcgc tagtaatcgt ggatcagaat gccacggtga 1380
atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa 1440
gcagatttcc taaccacgaa agtggaaggc gtctaccact ttgtgattca tgactggggt 1500
gaagtcgtaa caaggtaacc gtaggggaac ctgcggttgg atcacctcct ta 1552
<210> 5
<211> 1566
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株（Buchnera aphidicola str.）Bp（黄莲木瘿蚜（Baizongiapistaciae）)
<400> 5
acttaaaatt gaagagtttg atcatggctc agattgaacg ctggcggcaa gcttaacaca 60
tgcaagtcga gcggcatcga agaaaagttt acttttctgg cggcgagcgg caaacgggtg 120
agtaacatct ggggatctac ctaaaagagg gggacaacca ttggaaacga tggctaatac 180
cgcataatgt ttttaaataa accaaagtag gggactaaaa tttttagcct tatgctttta 240
gatgaaccca gacgagatta gcttgatggt aaggtaatgg cttaccaagg cgacgatctc 300
tagctggtct gagaggataa ccagccacac tggaactgag atacggtcca gactcctacg 360
ggaggcagca gtggggaata ttgcacaatg ggctaaagcc tgatgcagct atgccgcgtg 420
tatgaagaag gccttagggt tgtaaagtac tttcagcggg gaggaaagaa ttatgtctaa 480
tatacatatt ttgtgacgtt acccgaagaa gaagcaccgg ctaactccgt gccagcagcc 540
gcggtaatac ggagggtgcg agcgttaatc agaattactg ggcgtaaaga gcacgtaggc 600
ggtttattaa gtcagatgtg aaatccctag gcttaactta ggaactgcat ttgaaactaa 660
tagactagag tctcatagag ggaggtagaa ttctaggtgt agcggtgaaa tgcgtagata 720
tctagaggaa tacccgtggc gaaagcgacc tcctaaatga aaactgacgc tgaggtgcga 780
aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc atgctgtaaa cgatgtcgac 840
ttggaggttg tttcctagag aagtggcttc cgaagctaac gcattaagtc gaccgcctgg 900
ggagtacggt cgcaaggcta aaactcaaat gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga 960
gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaag aaccttacct ggtcttgaca tccatagaat 1020
tttttagaga taaaagagtg ccttagggaa ctatgagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc 1080
agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaacccct atcctttgtt 1140
gccatcaggt tatgctggga actcagagga gactgccggt tataaaccgg aggaaggtgg 1200
ggatgacgtc aagtcatcat ggcccttacg accagggcta cacacgtgct acaatggcat 1260
atacaaagag atgcaactct gcgaagataa gcaaacctca taaagtatgt cgtagtccgg 1320
actggagtct gcaactcgac tccacgaagt aggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg 1380
ccacggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtgggtt 1440
gcaaaagaag caggtagctt aaccagatta ttttattgga gggcgcttac cactttgtga 1500
ttcatgactg gggtgaagtc gtaacaaggt aaccgtaggg gaacctgcgg ttggatcacc 1560
tcctta 1566
<210> 6
<211> 828
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola） BCc
<400> 6
atgagatcat taatatataa aaatcatgtt ccaattaaaa aattaggaca aaatttttta 60
cagaataaag aaattattaa tcagataatt aatttaataa atattaataa aaatgataat 120
attattgaaa taggatcagg attaggagcg ttaacttttc ctatttgtag aatcattaaa 180
aaaatgatag tattagaaat tgatgaagat cttgtgtttt ttttaactca aagtttattt 240
attaaaaaat tacaaattat aattgctgat attataaaat ttgatttttg ttgttttttt 300
tctttacaga aatataaaaa atataggttt attggtaatt taccatataa tattgctact 360
atattttttt taaaaacaat taaatttctt tataatataa ttgatatgca ttttatgttt 420
caaaaagaag tagcaaagag attattagct actcctggta ctaaagaata tggtagatta 480
agtattattg cacaatattt ttataagata gaaactgtta ttaatgttaa taaatttaat 540
ttttttccta ctcctaaagt agattctact tttttacgat ttactcctaa atattttaat 600
agtaaatata aaatagataa acatttttct gttttagaat taattactag attttctttt 660
caacatagaa gaaaattttt aaataataat ttaatatctt tattttctac aaaagaatta 720
atttctttag atattgatcc atattcaaga gcagaaaatg tttctttaat tcaatattgt 780
aaattaatga aatattattt gaaaagaaaa attttatgtt tagattaa 828
<210> 7
<211> 921
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）（柏大蚜（Cinara tujafilina））
<400> 7
ttatcttatt tcacatatac gtaatattgc gctgcgtgca cgaggatttt tttgaatttc 60
agatatattt ggtttaatac gtttaataaa acgtattttt ttttttattt ttcttatttg 120
caattcagta ataggaagtt ttttaggtat atttggataa ttactgtaat tcttaataaa 180
gttttttaca atcctatctt caatagaatg aaaactaata atagcaattt ttgatccgga 240
atgtaatatg ttaataataa tttttaatat tttatgtaat tcatttattt cttggttaat 300
atatattcga aaagcttgaa atgttctcgt agctggatgt ttaaatttgt catattttgg 360
gattgatttt tttatgattt gaactaactc taacgtgctt gttatggttt ttttttttat 420
ttgtaatatg atggctcggg atattttttt tgcgtatttt tcttcgccaa aattttttat 480
tacctgttct attgtttttt ggtttgtttt ttttaaccat tgactaactg atattccaga 540
tttagggttc atacgcatat ctaaaggtcc atcattcata aatgaaaatc ctcggatact 600
agaatttaac tgtattgaag aaatacctaa atctaataat attccatcta ttttatctct 660
atttttttct ttttttaata ttttttcaat attagaaaat ttacctaaaa atattttaaa 720
tcgcgaatct tttatttttt ttccgatttt tatagattgt gggtcttgat caatactata 780
taactttcca ttaaccccta attcttgaag aattgctttt gaatgaccac cacctccaaa 840
tgtacaatca acatatgtac cgtctttttt tatttttaag tattgtatga tttcttttgt 900
taaaacaggt ttatgaatca t 921
<210> 8
<211> 822
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株（Buchnera aphidicola str.）G002（桃蚜（Myzuspersicae））
<400> 8
atgaaaagta taaaaacttt taaaaaacac tttcctgtga aaaaatatgg acaaaatttt 60
cttattaata aagagatcat aaaaaatatt gttaaaaaaa ttaatccaaa tatagaacaa 120
acattagtag aaatcggacc aggattagct gcattaactg agcccatatc tcagttatta 180
aaagagttaa tagttattga aatagactgt aatctattat attttttaaa aaaacaacca 240
ttttattcaa aattaatagt tttttgtcaa gatgctttaa actttaatta tacaaattta 300
ttttataaaa aaaataaatt aattcgtatt tttggtaatt taccatataa tatctctaca 360
tctttaatta tttttttatt tcaacacatt agagtaattc aagatatgaa ttttatgctt 420
caaaaagaag ttgctgcaag attaattgca ttacctggaa ataaatatta cggtcgtttg 480
agcattatat ctcaatatta ttgtgatatc aaaattttat taaatgttgc tcctgaagat 540
ttttggccta ttccgagagt tcattctata tttgtaaatt taacacctca tcataattct 600
ccttattttg tttatgatat taatatttta agccttatta caaataaggc tttccaaaat 660
agaagaaaaa tattacgtca tagtttaaaa aatttatttt ctgaaacaac tttattaaat 720
ttagatatta atcccagatt aagagctgaa aatatttctg tttttcagta ttgtcaatta 780
gctaattatt tgtataaaaa aaattatact aaaaaaaatt aa 822
<210> 9
<211> 822
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株（Buchnera aphidicola str.） Ak（苜蓿无网长管蚜（Acyrthosiphon kondoi））
<400> 9
attataaaaa attttaaaaa acattttcct ttaaaaaggt atggacaaaa ttttcttgtc 60
aatacaaaaa ctattcaaaa gataattaat ataattaatc caaacaccaa acaaacatta 120
gtggaaattg gacctggatt agctgcatta acaaaaccaa tttgtcaatt attagaagaa 180
ttaattgtta ttgaaataga tcctaattta ttgtttttat taaaaaaacg ttcattttat 240
tcaaaattaa cagtttttta tcaagacgct ttaaatttca attatacaga tttgttttat 300
aagaaaaatc aattaattcg tgtttttgga aacttgccat ataatatttc tacatcttta 360
attatttctt tattcaatca tattaaagtt attcaagata tgaattttat gttacagaaa 420
gaggttgctg aaagattaat ttctattcct ggaaataaat cttatggccg tttaagcatt 480
atttctcagt attattgtaa aattaaaata ttattaaatg ttgtacctga agattttcga 540
cctataccga aagtgcattc tgtttttatc aatttaactc ctcataccaa ttctccatat 600
tttgtttatg atacaaatat cctcagttct atcacaagaa atgcttttca aaatagaagg 660
aaaattttgc gtcatagttt aaaaaattta ttttctgaaa aagaactaat tcaattagaa 720
attaatccaa atttacgagc tgaaaatatt tctatctttc agtattgtca attagctgat 780
tatttatata aaaaattaaa taatcttgta aaaatcaatt aa 822
<210> 10
<211> 822
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌菌株（Buchnera aphidicola str.） Ua（豚草指管蚜（Uroleuconambrosiae））
<400> 10
atgatactaa ataaatataa aaaatttatt cctttaaaaa gatacggaca aaattttctt 60
gtaaatagag aaataatcaa aaatattatc aaaataatta atcctaaaaa aacgcaaaca 120
ttattagaaa ttggaccggg tttaggtgcg ttaacaaaac ctatttgtga atttttaaat 180
gaacttatcg tcattgaaat agatcctaat atattatctt ttttaaagaa atgtatattt 240
tttgataaat taaaaatata ttgtcataat gctttagatt ttaattataa aaatatattc 300
tataaaaaaa gtcaattaat tcgtattttt ggaaatttac catataatat ttctacatct 360
ttaataatat atttatttcg gaatattgat attattcaag atatgaattt tatgttacaa 420
caagaagtgg ctaaaagatt agttgctatt cctggtgaaa aactttatgg tcgtttaagt 480
attatatctc aatattattg taatattaaa atattattac atattcgacc tgaaaatttt 540
caacctattc ctaaagttaa ttcaatgttt gtaaatttaa ctccgcatat tcattctcct 600
tattttgttt atgatattaa tttattaact agtattacaa aacatgcttt tcaacataga 660
agaaaaatat tgcgtcatag tttaagaaat tttttttctg agcaagattt aattcattta 720
gaaattaatc caaatttaag agctgaaaat gtttctatta ttcaatattg tcaattggct 780
aataatttat ataaaaaaca taaacagttt attaataatt aa 822
<210> 11
<211> 816
<212> DNA
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）（大豆蚜（Aphis glycines））
<400> 11
atgaaaaagc atattcctat aaaaaaattt agtcaaaatt ttcttgtaga tttgagtgtg 60
attaaaaaaa taattaaatt tattaatccg cagttaaatg aaatattggt tgaaattgga 120
ccgggattag ctgctatcac tcgacctatt tgtgatttga tagatcattt aattgtgatt 180
gaaattgata aaattttatt agatagatta aaacagttct cattttattc aaaattaaca 240
gtatatcatc aagatgcttt agcatttgat tacataaagt tatttaataa aaaaaataaa 300
ttagttcgaa tttttggtaa tttaccatat catgtttcta cgtctttaat attgcattta 360
tttaaaagaa ttaatattat taaagatatg aattttatgc tacaaaaaga agttgctgaa 420
cgtttaattg caactccagg tagtaaatta tatggtcgtt taagtattat ttctcaatat 480
tattgtaata taaaagtttt attgcatgtg tcttcaaaat gttttaaacc agttcctaaa 540
gtagaatcaa tttttcttaa tttgacacct tatactgatt atttccctta ttttacttat 600
aatgtaaacg ttcttagtta tattacaaat ttagcttttc aaaaaagaag aaaaatatta 660
cgtcatagtt taggtaaaat attttctgaa aaagttttta taaaattaaa tattaatccc 720
aaattaagac ctgagaatat ttctatatta caatattgtc agttatctaa ttatatgata 780
gaaaataata ttcatcagga acatgtttgt atttaa 816
<210> 12
<211> 1463
<212> DNA
<213> Annandia pinicola
<400> 12
agattgaacg ctggcggcat gccttacaca tgcaagtcga acggtaacag gtcttcggac 60
gctgacgagt ggcgaacggg tgagtaatac atcggaacgt gcccagtcgt gggggataac 120
tactcgaaag agtagctaat accgcatacg atctgaggat gaaagcgggg gaccttcggg 180
cctcgcgcga ttggagcggc cgatggcaga ttaggtagtt ggtgggataa aagcttacca 240
agccgacgat ctgtagctgg tctgagagga cgaccagcca cactggaact gagatacggt 300
ccagactctt acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgcaa gcctgatgca 360
gctatgtcgc gtgtatgaag aagaccttag ggttgtaaag tactttcgat agcataagaa 420
gataatgaga ctaataattt tattgtctga cgttagctat agaagaagca ccggctaact 480
ccgtgccagc agccgcggta atacgggggg tgctagcgtt aatcggaatt actgggcgta 540
aagagcatgt aggtggttta ttaagtcaga tgtgaaatcc ctggacttaa tctaggaact 600
gcatttgaaa ctaataggct agagtttcgt agagggaggt agaattctag gtgtagcggt 660
gaaatgcata gatatctaga ggaatatcag tggcgaaggc gaccttctgg acgataactg 720
acgctaaaat gcgaaagcat gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccatgctg 780
taaacgatgt cgactaagag gttggaggta taacttttaa tctctgtagc taacgcgtta 840
agtcgaccgc ctggggagta cggtcgcaag gctaaaactc aaatgaattg acgggggcct 900
gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gtaaaacctt acctggtctt 960
gacatccaca gaattttaca gaaatgtaga agtgcaattt gaactgtgag acaggtgctg 1020
catggctgtc gtcagctcgt gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttgtccttt gttaccataa gatttaagga actcaaagga gactgccggt gataaactgg 1140
aggaaggcgg ggacgacgtc aagtcatcat ggcccttatg accagggcta cacacgtgct 1200
acaatggcat atacaaagag atgcaatatt gcgaaataaa gccaatctta taaaatatgt 1260
cctagttcgg actggagtct gcaactcgac tccacgaagt cggaatcgct agtaatcgtg 1320
gatcagcatg ccacggtgaa tatgtttcca ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg 1380
gaagtggatt gcaaaagaag taagaaaatt aaccttctta acaaggaaat aacttaccac 1440
tttgtgactc ataactgggg tga 1463
<210> 13
<211> 1554
<212> DNA
<213> Moranella endobia
<400> 13
tctttttggt aaggaggtga tccaaccgca ggttccccta cggttacctt gttacgactt 60
caccccagtc atgaatcaca aagtggtaag cgccctccta aaaggttagg ctacctactt 120
cttttgcaac ccacttccat ggtgtgacgg gcggtgtgta caaggcccgg gaacgtattc 180
accgtggcat tctgatccac gattactagc gattcctact tcatggagtc gagttgcaga 240
ctccaatccg gactacgacg cactttatga ggtccgctaa ctctcgcgag cttgcttctc 300
tttgtatgcg ccattgtagc acgtgtgtag ccctactcgt aagggccatg atgacttgac 360
gtcatcccca ccttcctccg gtttatcacc ggcagtctcc tttgagttcc cgaccgaatc 420
gctggcaaaa aaggataagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tttcacaaca 480
cgagctgacg acagccatgc agcacctgtc tcagagttcc cgaaggtacc aaaacatctc 540
tgctaagttc tctggatgtc aagagtaggt aaggttcttc gcgttgcatc gaattaaacc 600
acatgctcca ccgcttgtgc gggcccccgt caattcattt gagttttaac cttgcggccg 660
tactccccag gcggtcgatt taacgcgtta actacgaaag ccacagttca agaccacagc 720
tttcaaatcg acatagttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc 780
acgctttcgt acctgagcgt cagtattcgt ccagggggcc gccttcgcca ctggtattcc 840
tccagatatc tacacatttc accgctacac ctggaattct acccccctct acgagactct 900
agcctatcag tttcaaatgc agttcctagg ttaagcccag ggatttcaca tctgacttaa 960
taaaccgcct acgtactctt tacgcccagt aattccgatt aacgcttgca ccctccgtat 1020
taccgcggct gctggcacgg agttagccgg tgcttcttct gtaggtaacg tcaatcaata 1080
accgtattaa ggatattgcc ttcctcccta ctgaaagtgc tttacaaccc gaaggccttc 1140
ttcacacacg cggcatggct gcatcagggt ttcccccatt gtgcaatatt ccccactgct 1200
gcctcccgta ggagtctgga ccgtgtctca gttccagtgt ggctggtcat cctctcagac 1260
cagctaggga tcgtcgccta ggtaagctat tacctcacct actagctaat cccatctggg 1320
ttcatctgaa ggtgtgaggc caaaaggtcc cccactttgg tcttacgaca ttatgcggta 1380
ttagctaccg tttccagcag ttatccccct ccatcaggca gatccccaga ctttactcac 1440
ccgttcgctg ctcgccggca aaaaagtaaa cttttttccg ttgccgctca acttgcatgt 1500
gttaggcctg ccgccagcgt tcaatctgag ccatgatcaa actcttcaat taaa 1554
<210> 14
<211> 1539
<212> DNA
<213> Ishikawaella capsulata Mpkobe
<400> 14
aaattgaaga gtttgatcat ggctcagatt gaacgctagc ggcaagctta acacatgcaa 60
gtcgaacggt aacagaaaaa agcttgcttt tttgctgacg agtggcggac gggtgagtaa 120
tgtctgggga tctacctaat ggcgggggat aactactgga aacggtagct aataccgcat 180
aatgttgtaa aaccaaagtg ggggacctta tggcctcaca ccattagatg aacctagatg 240
ggattagctt gtaggtgggg taaaggctca cctaggcaac gatccctagc tggtctgaga 300
ggatgaccag ccacactgga actgagatac ggtccagact cctacgggag gcagcagtgg 360
ggaatcttgc acaatgggcg caagcctgat gcagctatgt cgcgtgtatg aagaaggcct 420
tagggttgta aagtactttc atcggggaag aaggatatga gcctaatatt ctcatatatt 480
gacgttacct gcagaagaag caccggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taacacggag 540
ggtgcgagcg ttaatcggaa ttactgggcg taaagagcac gtaggtggtt tattaagtca 600
tatgtgaaat ccctgggctt aacctaggaa ctgcatgtga aactgataaa ctagagtttc 660
gtagagggag gtggaattcc aggtgtagcg gtgaaatgcg tagatatctg gaggaatatc 720
agaggcgaag gcgaccttct ggacgaaaac tgacactcag gtgcgaaagc gtggggagca 780
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc tgtaaacaat gtcgactaaa aaactgtgag 840
cttgacttgt ggtttttgta gctaacgcat taagtcgacc gcctggggag tacggccgca 900
aggttaaaac tcaaatgaat tgacgggggt ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 960
tcgatgcaac gcgaaaaacc ttacctggtc ttgacatcca gcgaattata tagaaatata 1020
taagtgcctt tcggggaact ctgagacgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgccct tatcctctgt tgccagcggc atggccggga 1140
actcagagga gactgccagt attaaactgg aggaaggtgg ggatgacgtc aagtcatcat 1200
ggcccttatg accagggcta cacacgtgct acaatggtgt atacaaagag aagcaatctc 1260
gcaagagtaa gcaaaactca aaaagtacat cgtagttcgg attagagtct gcaactcgac 1320
tctatgaagt aggaatcgct agtaatcgtg gatcagaatg ccacggtgaa tacgttctct 1380
ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtaagtt gcaaaagaag taggtagctt 1440
aacctttata ggagggcgct taccactttg tgatttatga ctggggtgaa gtcgtaacaa 1500
ggtaactgta ggggaacctg tggttggatt acctcctta 1539
<210> 15
<211> 1561
<212> DNA
<213> Baumannia cicadellinicola
<400> 15
ttcaattgaa gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggtaagct taacacatgc 60
aagtcgagcg gcatcggaaa gtaaattaat tactttgccg gcaagcggcg aacgggtgag 120
taatatctgg ggatctacct tatggagagg gataactatt ggaaacgata gctaacaccg 180
cataatgtcg tcagaccaaa atgggggacc taatttaggc ctcatgccat aagatgaacc 240
cagatgagat tagctagtag gtgagataat agctcaccta ggcaacgatc tctagttggt 300
ctgagaggat gaccagccac actggaactg agacacggtc cagactccta cgggaggcag 360
cagtggggaa tcttgcacaa tgggggaaac cctgatgcag ctataccgcg tgtgtgaaga 420
aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg gggaagaaaa tgaagttact aataataatt 480
gtcaattgac gttacccgca aaagaagcac cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa 540
gacggagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgtatgta ggcggtttat 600
ttagtcaggt gtgaaagccc taggcttaac ctaggaattg catttgaaac tggtaagcta 660
gagtctcgta gaggggggga gaattccagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctggaa 720
gaataccagt ggcgaaggcg cccccctgga cgaaaactga cgctcaagta cgaaagcgtg 780
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgctgt aaacgatgtc gatttgaagg 840
ttgtagcctt gagctatagc tttcgaagct aacgcattaa atcgaccgcc tggggagtac 900
gaccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg 960
gtttaattcg atacaacgcg aaaaacctta cctactcttg acatccagag tataaagcag 1020
aaaagcttta gtgccttcgg gaactctgag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt 1080
gttgtgaaat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttatccttt gttgccaacg 1140
attaagtcgg gaactcaaag gagactgccg gtgataaacc ggaggaaggt gaggataacg 1200
tcaagtcatc atggccctta cgagtagggc tacacacgtg ctacaatggt gcatacaaag 1260
agaagcaatc tcgtaagagt tagcaaacct cataaagtgc atcgtagtcc ggattagagt 1320
ctgcaactcg actctatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tggatcagaa tgccacggtg 1380
aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtgta ttgcaaaaga 1440
agttagtagc ttaactcata atacgagagg gcgcttacca ctttgtgatt cataactggg 1500
gtgaagtcgt aacaaggtaa ccgtagggga acctgcggtt ggatcacctc cttacactaa 1560
a 1561
<210> 16
<211> 1464
<212> DNA
<213> 伴突属（Sodalis）样
<400> 16
attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgagc ggcagcggga agaagcttgc 60
ttctttgccg gcgagcggcg gacgggtgag taatgtctgg ggatctgccc gatggagggg 120
gataactact ggaaacggta gctaataccg cataacgtcg caagaccaaa gtgggggacc 180
ttcgggcctc acaccatcgg atgaacccag gtgggattag ctagtaggtg gggtaatggc 240
tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagtcacact ggaactgaga 300
cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gggaaaccct 360
gatgcagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg ccttcgggtt gtaaagcact ttcagcgggg 420
aggaaggcga tggcgttaat agcgctatcg attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 480
taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcga gcgttaatcg gaattactgg 540
gcgtaaagcg tacgcaggcg gtctgttaag tcagatgtga aatccccggg ctcaacctgg 600
gaactgcatt tgaaactggc aggctagagt ctcgtagagg ggggtagaat tccaggtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg aaggcggccc cctggacgaa 720
gactgacgct caggtacgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
cgctgtaaac gatgtcgatt tgaaggttgt ggccttgagc cgtggctttc ggagctaacg 840
tgttaaatcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgacggg 900
ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgatgc aacgcgaaga accttaccta 960
ctcttgacat ccagagaact tggcagagat gctttggtgc cttcgggaac tctgagacag 1020
gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgttg tgaaatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaaccctta tcctttattg ccagcgattc ggtcgggaac tcaaaggaga ctgccggtga 1140
taaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca 1200
cacgtgctac aatggcgcat acaaagagaa gcgatctcgc gagagtcagc ggacctcata 1260
aagtgcgtcg tagtccggat tggagtctgc aactcgactc catgaagtcg gaatcgctag 1320
taatcgtgga tcagaatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380
acaccatggg agtgggttgc aaaagaagta ggtagcttaa ccttcgggag ggcgcttacc 1440
actttgtgat tcatgactgg ggtg 1464
<210> 17
<211> 1465
<212> DNA
<213> Hartigia pinicola
<400> 17
agatttaacg ctggcggcag gcctaacaca tgcaagtcga gcggtaccag aagaagcttg 60
cttcttgctg acgagcggcg gacgggtgag taatgtatgg ggatctgccc gacagagggg 120
gataactatt ggaaacggta gctaataccg cataatctct gaggagcaaa gcaggggaac 180
ttcggtcctt gcgctatcgg atgaacccat atgggattag ctagtaggtg aggtaatggc 240
tcccctaggc aacgatccct agctggtctg agaggatgat cagccacact gggactgaga 300
cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct 360
gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ctttagggtt gtaaagtact ttcagtcgag 420
aggaaaacat tgatgctaat atcatcaatt attgacgttt ccgacagaag aagcaccggc 480
taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 540
gcgtaaagcg cacgcaggcg gttaattaag ttagatgtga aagccccggg cttaacccag 600
gaatagcata taaaactggt caactagagt attgtagagg ggggtagaat tccatgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaat accagtggcg aaggcggccc cctggacaaa 720
aactgacgct caaatgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 780
tgctgtaaac gatgtcgatt tggaggttgt tcccttgagg agtagcttcc gtagctaacg 840
cgttaaatcg accgcctggg ggagtacgac tgcaaggtta aaactcaaat gaattgacgg 900
gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg caacgcgaaa aaccttacct 960
actcttgaca tccagataat ttagcagaaa tgctttagta ccttcgggaa atctgagaca 1020
ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtt gtgaaatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080
cgcaaccctt atcctttgtt gccagcgatt aggtcgggaa ctcaaaggag actgccggtg 1140
ataaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacga gtagggctac 1200
acacgtgcta caatggcata tacaaaggga agcaacctcg cgagagcaag cgaaactcat 1260
aaattatgtc gtagttcaga ttggagtctg caactcgact ccatgaagtc ggaatcgcta 1320
gtaatcgtag atcagaatgc tacggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt 1380
cacaccatgg gagtgggttg caaaagaagt aggtaactta accttatgga aagcgcttac 1440
cactttgtga ttcataactg gggtg 1465
<210> 18
<211> 1571
<212> DNA
<213> Tremblaya phenacola
<400> 18
aggtaatcca gccacacctt ccagtacggc taccttgtta cgacttcacc ccagtcacaa 60
cccttacctt cggaactgcc ctcctcacaa ctcaaaccac caaacacttt taaatcaggt 120
tgagagaggt taggcctgtt acttctggca agaattattt ccatggtgtg acgggcggtg 180
tgtacaagac ccgagaacat attcaccgtg gcatgctgat ccacgattac tagcaattcc 240
aacttcatgc actcgagttt cagagtacaa tccgaactga ggccggcttt gtgagattag 300
ctcccttttg caagttggca actctttggt ccggccattg tatgatgtgt gaagccccac 360
ccataaaggc catgaggact tgacgtcatc cccaccttcc tccaacttat cgctggcagt 420
ctctttaagg taactgacta atccagtagc aattaaagac aggggttgcg ctcgttacag 480
gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacagcc atgcagcacc tgtgcactaa 540
ttctctttca agcactcccg cttctcaaca ggatcttagc catatcaaag gtaggtaagg 600
tttttcgcgt tgcatcgaat taatccacat catccactgc ttgtgcgggt ccccgtcaat 660
tcctttgagt tttaaccttg cggccgtact ccccaggcgg tcgacttgtg cgttagctgc 720
accactgaaa aggaaaactg cccaatggtt agtcaacatc gtttagggca tggactacca 780
gggtatctaa tcctgtttgc tccccatgct ttagtgtctg agcgtcagta acgaaccagg 840
aggctgccta cgctttcggt attcctccac atctctacac atttcactgc tacatgcgga 900
attctacctc cccctctcgt actccagcct gccagtaact gccgcattct gaggttaagc 960
ctcagccttt cacagcaatc ttaacaggca gcctgcacac cctttacgcc caataaatct 1020
gattaacgct cgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagtttg ccggtgctta 1080
ttctttcggt acagtcacac caccaaattg ttagttgggt ggctttcttt ccgaacaaaa 1140
gtgctttaca acccaaaggc cttcttcaca cacgcggcat tgctggatca ggcttccgcc 1200
cattgtccaa gattcctcac tgctgccttc ctcagaagtc tgggccgtgt ctcagtccca 1260
gtgtggctgg ccgtcctctc agaccagcta ccgatcattg ccttgggaag ccattacctt 1320
tccaacaagc taatcagaca tcagccaatc tcagagcgca aggcaattgg tcccctgctt 1380
tcattctgct tggtagagaa ctttatgcgg tattaattag gctttcacct agctgtcccc 1440
cactctgagg catgttctga tgcattactc acccgtttgc cacttgccac caagcctaag 1500
cccgtgttgc cgttcgactt gcatgtgtaa ggcatgccgc tagcgttcaa tctgagccag 1560
gatcaaactc t 1571
<210> 19
<211> 1535
<212> DNA
<213> Tremblaya princeps
<400> 19
agagtttgat cctggctcag attgaacgct agcggcatgc attacacatg caagtcgtac 60
ggcagcacgg gcttaggcct ggtggcgagt ggcgaacggg tgagtaacgc ctcggaacgt 120
gccttgtagt gggggatagc ctggcgaaag ccagattaat accgcatgaa gccgcacagc 180
atgcgcggtg aaagtggggg attctagcct cacgctactg gatcggccgg ggtctgatta 240
gctagttggc ggggtaatgg cccaccaagg cttagatcag tagctggtct gagaggacga 300
tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca gtggggaatc 360
ttggacaatg ggcgcaagcc tgatccagca atgccgcgtg tgtgaagaag gccttcgggt 420
cgtaaagcac ttttgttcgg gatgaagggg ggcgtgcaaa caccatgccc tcttgacgat 480
accgaaagaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgcg 540
agcgttaatc ggaatcactg ggcgtaaagg gtgcgcgggt ggtttgccaa gacccctgta 600
aaatcctacg gcccaaccgt agtgctgcgg aggttactgg taagcttgag tatggcagag 660
gggggtagaa ttccaggtgt agcggtgaaa tgcgtagata tctggaggaa taccgaaggc 720
gaaggcaacc ccctgggcca tcactgacac tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa ccatgtcgac tagttgtcgg ggggagccct 840
ttttcctcgg tgacgaagct aacgcatgaa gtcgaccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900
ttaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg 960
atgcaacgcg aaaaacctta cctacccttg acatggcgga gattctgccg agaggcggaa 1020
gtgctcgaaa gagaatccgt gcacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1080
atgttgggtt aagtcccata acgagcgcaa cccccgtctt tagttgctac cactggggca 1140
ctctatagag actgccggtg ataaaccgga ggaaggtggg gacgacgtca agtcatcatg 1200
gcctttatgg gtagggcttc acacgtcata caatggctgg agcaaagggt cgccaactcg 1260
agagagggag ctaatcccac aaacccagcc ccagttcgga ttgcactctg caactcgagt 1320
gcatgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagcatgc cacggtgaat acgttctcgg 1380
gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagtaagccg catcagaagc agcctcccta 1440
accctatgct gggaaggagg ctgcgaaggt ggggtctatg actggggtga agtcgtaaca 1500
aggtagccgt accggaaggt gcggctggat tacct 1535
<210> 20
<211> 1450
<212> DNA
<213> Nasuia deltocephalinicola
<400> 20
agtttaatcc tggctcagat ttaacgcttg cgacatgcct aacacatgca agttgaacgt 60
tgaaaatatt tcaaagtagc gtataggtga gtataacatt taaacatacc ttaaagttcg 120
gaataccccg atgaaaatcg gtataatacc gtataaaagt atttaagaat taaagcgggg 180
aaaacctcgt gctataagat tgttaaatgc ctgattagtt tgttggtttt taaggtaaaa 240
gcttaccaag actttgatca gtagctattc tgtgaggatg tatagccaca ttgggattga 300
aataatgccc aaacctctac ggagggcagc agtggggaat attggacaat gagcgaaagc 360
ttgatccagc aatgtcgcgt gtgcgattaa gggaaactgt aaagcacttt tttttaagaa 420
taagaaattt taattaataa ttaaaatttt tgaatgtatt aaaagaataa gtaccgacta 480
atcacgtgcc agcagtcgcg gtaatacgtg gggtgcgagc gttaatcgga tttattgggc 540
gtaaagtgta ttcaggctgc ttaaaaagat ttatattaaa tatttaaatt aaatttaaaa 600
aatgtataaa ttactattaa gctagagttt agtataagaa aaaagaattt tatgtgtagc 660
agtgaaatgc gttgatatat aaaggaacgc cgaaagcgaa agcatttttc tgtaatagaa 720
ctgacgctta tatacgaaag cgtgggtagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccctaaacta tgtcaattaa ctattagaat tttttttagt ggtgtagcta acgcgttaaa 840
ttgaccgcct gggtattacg atcgcaagat taaaactcaa aggaattgac ggggaccagc 900
acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgatacgcga aaaaccttac ctgcccttga 960
catggttaga attttattga aaaataaaag tgcttggaaa agagctaaca cacaggtgct 1020
gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080
ccctactctt agttgctaat taaagaactt taagagaaca gctaacaata agtttagagg 1140
aaggagggga tgacttcaag tcctcatggc ccttatgggc agggcttcac acgtcataca 1200
atggttaata caaaaagttg caatatcgta agattgagct aatctttaaa attaatctta 1260
gttcggattg tactctgcaa ctcgagtaca tgaagttgga atcgctagta atcgcggatc 1320
agcatgccgc ggtgaatagt ttaactggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatggaaa 1380
taaatcttgt tttaaatgaa gtaatatatt ttatcaaaac aggttttgta accggggtga 1440
agtcgtaaca 1450
<210> 21
<211> 1536
<212> DNA
<213> Zinderia insecticola CARI
<400> 21
atataaataa gagtttgatc ctggctcaga ttgaacgcta gcggtatgct ttacacatgc 60
aagtcgaacg acaatattaa agcttgcttt aatataaagt ggcgaacggg tgagtaatat 120
atcaaaacgt accttaaagt gggggataac taattgaaaa attagataat accgcatatt 180
aatcttagga tgaaaatagg aataatatct tatgctttta gatcggttga tatctgatta 240
gctagttggt agggtaaatg cttaccaagg caatgatcag tagctggttt tagcgaatga 300
tcagccacac tggaactgag acacggtcca gacttctacg gaaggcagca gtggggaata 360
ttggacaatg ggagaaatcc tgatccagca ataccgcgtg agtgatgaag gccttagggt 420
cgtaaaactc ttttgttagg aaagaaataa ttttaaataa tatttaaaat tgatgacggt 480
acctaaagaa taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgca 540
agcgttaatc ggaattattg ggcgtaaaga gtgcgtaggc tgttatataa gatagatgtg 600
aaatacttaa gcttaactta agaactgcat ttattactgt ttaactagag tttattagag 660
agaagtggaa ttttatgtgt agcagtgaaa tgcgtagata tataaaggaa tatcgatggc 720
gaaggcagct tcttggaata atactgacgc tgaggcacga aagcgtgggg agcaaacagg 780
attagatacc ctggtagtcc acgccctaaa ctatgtctac tagttattaa attaaaaata 840
aaatttagta acgtagctaa cgcattaagt agaccgcctg gggagtacga tcgcaagatt 900
aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat 960
gcaacacgaa aaaccttacc tactcttgac atgtttggaa ttttaaagaa atttaaaagt 1020
gcttgaaaaa gaaccaaaac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttatta tttgctaata aaaagaactt 1140
taataagact gccaatgaca aattggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc 1200
cttatgagta gggcttcaca cgtcatacaa tgatatatac aatgggtagc aaatttgtga 1260
aaatgagcca atccttaaag tatatcttag ttcggattgt agtctgcaac tcgactacat 1320
gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tctcgggtct 1380
tgtacacacc gcccgtcaca ccatggaagt gatttttacc agaaattatt tgtttaacct 1440
ttattggaaa aaaataatta aggtagaatt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500
cagtatcgga aggtgcggct ggattacatt ttaaat 1536
<210> 22
<211> 1423
<212> DNA
<213> Hodgkinia
<400> 22
aatgctggcg gcaggcctaa cacatgcaag tcgagcggac aacgttcaaa cgttgttagc 60
ggcgaacggg tgagtaatac gtgagaatct acccatccca acgtgataac atagtcaaca 120
ccatgtcaat aacgtatgat tcctgcaaca ggtaaagatt ttatcgggga tggatgagct 180
cacgctagat tagctagttg gtgagataaa agcccaccaa ggccaagatc tatagctggt 240
ctggaaggat ggacagccac attgggactg agacaaggcc caaccctcta aggagggcag 300
cagtgaggaa tattggacaa tgggcgtaag cctgatccag ccatgccgca tgagtgattg 360
aaggtccaac ggactgtaaa actcttttct ccagagatca taaatgatag tatctggtga 420
tataagctcc ggccaacttc gtgccagcag ccgcggtaat acgaggggag cgagtattgt 480
tcggttttat tgggcgtaaa gggtgtccag gttgctaagt aagttaacaa caaaatcttg 540
agattcaacc tcataacgtt cggttaatac tactaagctc gagcttggat agagacaaac 600
ggaattccga gtgtagaggt gaaattcgtt gatacttgga ggaacaccag aggcgaaggc 660
ggtttgtcat accaagctga cactgaagac acgaaagcat ggggagcaaa caggattaga 720
taccctggta gtccatgccc taaacgttga gtgctaacag ttcgatcaag ccacatgcta 780
tgatccagga ttgtacagct aacgcgttaa gcactccgcc tgggtattac gaccgcaagg 840
ttaaaactca aaggaattga cggagacccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 900
aagctacacg aagaacctta ccagcccttg acataccatg gccaaccatc ctggaaacag 960
gatgttgttc aagttaaacc cttgaaatgc caggaacagg tgctgcatgg ctgttgtcag 1020
ttcgtgtcgt gagatgtatg gttaagtccc aaaacgaaca caaccctcac ccatagttgc 1080
cataaacaca attgggttct ctatgggtac tgctaacgta agttagagga aggtgaggac 1140
cacaacaagt catcatggcc cttatgggct gggccacaca catgctacaa tggtggttac 1200
aaagagccgc aacgttgtga gaccgagcaa atctccaaag accatctcag tccggattgt 1260
actctgcaac ccgagtacat gaagtaggaa tcgctagtaa tcgtggatca gcatgccacg 1320
gtgaatacgt tctcgggtct tgtacacgcc gcccgtcaca ccatgggagc ttcgctccga 1380
tcgaagtcaa gttacccttg accacatctt ggcaagtgac cga 1423
<210> 23
<211> 1504
<212> DNA
<213> 沃尔巴克氏体属物种（Wolbachia sp.） wPip
<400> 23
aaatttgaga gtttgatcct ggctcagaat gaacgctggc ggcaggccta acacatgcaa 60
gtcgaacgga gttatattgt agcttgctat ggtataactt agtggcagac gggtgagtaa 120
tgtataggaa tctacctagt agtacggaat aattgttgga aacgacaact aataccgtat 180
acgccctacg ggggaaaaat ttattgctat tagatgagcc tatattagat tagctagttg 240
gtggggtaat agcctaccaa ggtaatgatc tatagctgat ctgagaggat gatcagccac 300
actggaactg agatacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 360
tgggcgaaag cctgatccag ccatgccgca tgagtgaaga aggcctttgg gttgtaaagc 420
tcttttagtg aggaagataa tgacggtact cacagaagaa gtcctggcta actccgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgga gagggctagc gttattcgga attattgggc gtaaagggcg 540
cgtaggctgg ttaataagtt aaaagtgaaa tcccgaggct taaccttgga attgctttta 600
aaactattaa tctagagatt gaaagaggat agaggaattc ctgatgtaga ggtaaaattc 660
gtaaatatta ggaggaacac cagtggcgaa ggcgtctatc tggttcaaat ctgacgctga 720
agcgcgaagg cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 780
tgaatgttaa atatggggag tttactttct gtattacagc taacgcgtta aacattccgc 840
ctggggacta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaaaaacctt accacttctt gacatgaaaa 960
tcatacctat tcgaagggat agggtcggtt cggccggatt ttacacaagt gttgcatggc 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aaccctcatc 1080
cttagttgcc atcaggtaat gctgagtact ttaaggaaac tgccagtgat aagctggagg 1140
aaggtgggga tgatgtcaag tcatcatggc ctttatggag tgggctacac acgtgctaca 1200
atggtgtcta caatgggctg caaggtgcgc aagcctaagc taatccctaa aagacatctc 1260
agttcggatt gtactctgca actcgagtac atgaagttgg aatcgctagt aatcgtggat 1320
cagcatgcca cggtgaatac gttctcgggt cttgtacaca ctgcccgtca cgccatggga 1380
attggtttca ctcgaagcta atggcctaac cgcaaggaag gagttattta aagtgggatc 1440
agtgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag cagtagggga atctgcagct ggattacctc 1500
ctta 1504
<210> 24
<211> 1532
<212> DNA
<213> Uzinura diaspidicola
<400> 24
aaaggagata ttccaaccac accttccggt acggttacct tgttacgact tagccctagt 60
catcaagttt accttaggca gaccactgaa ggattactga cttcaggtac ccccgactcc 120
catggcttga cgggcggtgt gtacaaggtt cgagaacata ttcaccgcgc cattgctgat 180
gcgcgattac tagcgattcc tgcttcatag agtcgaattg cagactccaa tccgaactga 240
gactggtttt agagattagc tcctgatcac ccagtggctg ccctttgtaa ccagccattg 300
tagcacgtgt gtagcccaag gcatagaggc catgatgatt tgacatcatc cccaccttcc 360
tcacagttta caccggcagt tttgttagag tccccggctt tacccgatgg caactaacaa 420
taggggttgc gctcgttata ggacttaacc aaacacttca cagcacgaac tgaagacaac 480
catgcagcac cttgtaatac gtcgtataga ctaagctgtt tccagcttat tcgtaataca 540
tttaagcctt ggtaaggttc ctcgcgtatc atcgaattaa accacatgct ccaccgcttg 600
tgcgaacccc cgtcaattcc tttgagtttc aatcttgcga ctgtacttcc caggtggatc 660
acttatcgct ttcgctaagc cactgaatat cgtttttcca atagctagtg atcatcgttt 720
agggcgtgga ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg tgcactgagc 780
gtcagtaaag atttagcaac ctgccttcgc tatcggtgtt ctgtatgata tctatgcatt 840
tcaccgctac accatacatt ccagatgctc caatcttact caagtttacc agtatcaata 900
gcaattttac agttaagctg taagctttca ctactgactt aataaacagc ctacacaccc 960
tttaaaccca ataaatccga ataacgcttg tgtcatccgt attgccgcgg ctgctggcac 1020
ggaattagcc gacacttatt cgtatagtac cttcaatctc ctatcacgta agatatttta 1080
tttctataca aaagcagttt acaacctaaa agaccttcat cctgcacgcg acgtagctgg 1140
ttcagagttt cctccattga ccaatattcc tcactgctgc ctcccgtagg agtctggtcc 1200
gtgtctcagt accagtgtgg aggtacaccc tcttaggccc cctactgatc atagtcttgg 1260
tagagccatt acctcaccaa ctaactaatc aaacgcaggc tcatcttttg ccacctaagt 1320
tttaataaag gctccatgca gaaactttat attatggggg attaatcaga atttcttctg 1380
gctatacccc agcaaaaggt agattgcata cgtgttactc acccattcgc cggtcgccga 1440
caaattaaaa atttttcgat gcccctcgac ttgcatgtgt taagctcgcc gctagcgtta 1500
attctgagcc aggatcaaac tcttcgttgt ag 1532
<210> 25
<211> 1470
<212> DNA
<213> Carsonella ruddii
<400> 25
ctcaggataa acgctagcgg agggcttaac acatgcaagt cgaggggcag caaaaataat 60
tatttttggc gaccggcaaa cgggtgagta atacatacgt aactttcctt atgctgagga 120
atagcctgag gaaacttgga ttaatacctc ataatacaat tttttagaaa gaaaaattgt 180
taaagtttta ttatggcata agataggcgt atgtccaatt agttagttgg taaggtaatg 240
gcttaccaag acgatgattg gtagggggcc tgagaggggc gttcccccac attggtactg 300
agacacggac caaacttcta cggaaggctg cagtgaggaa tattggtcaa tggaggaaac 360
tctgaaccag ccactccgcg tgcaggatga aagaaagcct tattggttgt aaactgcttt 420
tgtatatgaa taaaaaattc taattataga aataattgaa ggtaatatac gaataagtat 480
cgactaactc tgtgccagca gtcgcggtaa gacagaggat acaagcgtta tccggattta 540
ttgggtttaa agggtgcgta ggcggttttt aaagtcagta gtgaaatctt aaagcttaac 600
tttaaaagtg ctattgatac tgaaaaacta gagtaaggtt ggagtaactg gaatgtgtgg 660
tgtagcggtg aaatgcatag atatcacaca gaacaccgat agcgaaagca agttactaac 720
cctatactga cgctgagtca cgaaagcatg gggagcaaac aggattagat accctggtag 780
tccatgccgt aaacgatgat cactaactat tgggttttat acgttgtaat tcagtggtga 840
agcgaaagtg ttaagtgatc cacctgagga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaat cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgata cacgaggaac 960
cttaccaaga cttaaatgta ctacgaataa attggaaaca atttagtcaa gcgacggagt 1020
acaaggtgct gcatggttgt cgtcagctcg tgccgtgagg tgtaaggtta agtcctttaa 1080
acgagcgcaa cccttattat tagttgccat cgagtaatgt caggggactc taataagact 1140
gccggcgcaa gccgagagga aggtggggat gacgtcaaat catcacggcc cttacgtctt 1200
gggccacaca cgtgctacaa tgatcggtac aaaagggagc gactgggtga ccaggagcaa 1260
atccagaaag ccgatctaag ttcggattgg agtctgaaac tcgactccat gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgtgcatca gccatggcac ggtgaatatg ttcccgggcc ttgtacacac 1380
cgcccgtcaa gccatggaag ttggaagtac ctaaagttgg ttcgctacct aaggtaagtc 1440
taataactgg ggctaagtcg taacaaggta 1470
<210> 26
<211> 1761
<212> DNA
<213> Symbiotaphrina buchneri 凭证标本（voucher） JCM9740
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (30)..(30)
<223> n是a、g、c、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (40)..(40)
<223> n是a、g、c、或t
<400> 26
agattaagcc atgcaagtct aagtataagn aatctatacn gtgaaactgc gaatggctca 60
ttaaatcagt tatcgtttat ttgatagtac cttactacat ggataaccgt ggtaattcta 120
gagctaatac atgctaaaaa ccccgacttc ggaaggggtg tatttattag ataaaaaacc 180
aatgcccttc ggggctcctt ggtgattcat gataacttaa cgaatcgcat ggccttgcgc 240
cggcgatggt tcattcaaat ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat agtggcctac 300
catggtttta acgggtaacg gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac 360
ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg 420
tagtgacaat aaatactgat acagggctct tttgggtctt gtaattggaa tgagtacaat 480
ttaaatccct taacgaggaa caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt 540
ccagctccaa tagcgtatat taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg 600
gcctggctgg ccggtccgcc taaccgcgtg tactggtccg gccgggcctt tccttctggg 660
gagccgcatg cccttcactg ggtgtgtcgg ggaaccagga cttttacttt gaaaaaatta 720
gagtgttcaa agcaggccta tgctcgaata cattagcatg gaataataga ataggacgtg 780
cggttctatt ttgttggttt ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggata gtcgggggca 840
tcagtattca attgtcagag gtgaaattct tggatttatt gaagactaac tactgcgaaa 900
gcatttgcca aggatgtttt cattaatcag tgaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc 960
agataccgtc gtagtcttaa ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg atgttattat 1020
tttgactcgc tcggcacctt acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt 1080
cgcaaggctg aaacttaaag aaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc 1140
ttaatttgac tcaacacggg gaaactcacc aggtccagac acattaagga ttgacagatt 1200
gagagctctt tcttgattat gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga 1260
tttgtctgct taattgcgat aacgaacgag accttaacct gctaaatagc ccggtccgct 1320
ttggcgggcc gctggcttct tagagggact atcggctcaa gccgatggaa gtttgaggca 1380
ataacaggtc tgtgatgccc ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacagagc 1440
caacgagtaa atcaccttgg ccggaaggtc tgggtaatct tgttaaactc tgtcgtgctg 1500
gggatagagc attgcaatta ttgctcttca acgaggaatt cctagtaagc gcaagtcatc 1560
agcttgcgct gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga 1620
atggctcagt gaggccttcg gactggcaca gggacgttgg caacgacgac ccagtgccgg 1680
aaagttggtc aaacttggtc atttagagga agtaaaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt 1740
gaacctgcgg aaggatcatt a 1761
<210> 27
<211> 1801
<212> DNA
<213> Symbiotaphrina kochii 凭证标本（voucher） CBS 589.63
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (1753)..(1755)
<223> n是a、g、c、或t
<400> 27
tacctggttg attctgccag tagtcatatg cttgtctcaa agattaagcc atgcaagtct 60
aagtataagc aatctatacg gtgaaactgc gaatggctca ttaaatcagt tatcgtttat 120
ttgatagtac cttactacat ggataaccgt ggtaattcta gagctaatac atgctaaaaa 180
cctcgacttc ggaaggggtg tatttattag ataaaaaacc aatgcccttc ggggctcctt 240
ggtgattcat gataacttaa cgaatcgcat ggccttgcgc cggcgatggt tcattcaaat 300
ttctgcccta tcaactttcg atggtaggat agtggcctac catggtttca acgggtaacg 360
gggaattagg gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag 420
gcagcaggcg cgcaaattac ccaatcccga cacggggagg tagtgacaat aaatactgat 480
acagggctct tttgggtctt gtaattggaa tgagtacaat ttaaatccct taacgaggaa 540
caattggagg gcaagtctgg tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat 600
taaagttgtt gcagttaaaa agctcgtagt tgaaccttgg gcctggctgg ccggtccgcc 660
taaccgcgtg tactggtccg gccgggcctt tccttctggg gagccgcatg cccttcactg 720
ggtgtgtcgg ggaaccagga cttttacttt gaaaaaatta gagtgttcaa agcaggccta 780
tgctcgaata cattagcatg gaataataga ataggacgtg tggttctatt ttgttggttt 840
ctaggaccgc cgtaatgatt aatagggata gtcgggggca tcagtattca attgtcagag 900
gtgaaattct tggatttatt gaagactaac tactgcgaaa gcatttgcca aggatgtttt 960
cattaatcag tgaacgaaag ttaggggatc gaagacgatc agataccgtc gtagtcttaa 1020
ccataaacta tgccgactag ggatcgggcg atgttattat tttgactcgc tcggcacctt 1080
acgagaaatc aaagtctttg ggttctgggg ggagtatggt cgcaaggctg aaacttaaag 1140
aaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg 1200
gaaactcacc aggtccagac acattaagga ttgacagatt gagagctctt tcttgattat 1260
gtgggtggtg gtgcatggcc gttcttagtt ggtggagtga tttgtctgct taattgcgat 1320
aacgaacgag accttaacct gctaaatagc ccggtccgct ttggcgggcc gctggcttct 1380
tagagggact atcggctcaa gccgatggaa gtttgaggca ataacaggtc tgtgatgccc 1440
ttagatgttc tgggccgcac gcgcgctaca ctgacagagc caacgagtac atcaccttgg 1500
ccggaaggtc tgggtaatct tgttaaactc tgtcgtgctg gggatagagc attgcaatta 1560
ttgctcttca acgaggaatt cctagtaagc gcaagtcatc agcttgcgct gattacgtcc 1620
ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctac taccgattga atggctcagt gaggccttcg 1680
gactggcaca gggacgttgg caacgacgac ccagtgccgg aaagttcgtc aaacttggtc 1740
atttagagga agnnnaagtc gtaacaaggt ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt 1800
a 1801
<210> 28
<211> 1490
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌属物种（Burkholderia sp.） SFA1
<400> 28
agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcatgcct tacacatgca agtcgaacgg 60
cagcacgggg gcaaccctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgt 120
cctgtagtgg gggatagccc ggcgaaagcc ggattaatac cgcatacgac ctaagggaga 180
aagcggggga tcttcggacc tcgcgctata ggggcggccg atggcagatt agctagttgg 240
tggggtaaag gcctaccaag gcgacgatct gtagctggtc tgagaggacg accagccaca 300
ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat 360
gggggcaacc ctgatccagc aatgccgcgt gtgtgaagaa ggcttcgggt tgtaaagcac 420
ttttgtccgg aaagaaaact tcgtccctaa tatggatgga ggatgacggt accggaagaa 480
taagcaccgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtagggtgcg agcgttaatc 540
ggaattactg ggcgtaaagc gtgcgcaggc ggtctgttaa gaccgatgtg aaatccccgg 600
gcttaacctg ggaactgcat tggtgactgg caggctttga gtgtggcaga ggggggtaga 660
attccacgtg tagcagtgaa atgcgtagag atgtggagga ataccgatgg cgaaggcagc 720
cccctgggcc aactactgac gctcatgcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata 780
ccctggtagt ccacgcccta aacgatgtca actagttgtt ggggattcat ttccttagta 840
acgtagctaa cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa 900
ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa 960
aaaccttacc tacccttgac atggtcggaa ccctgctgaa aggtgggggt gctcgaaaga 1020
gaaccggcgc acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa 1080
gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttgctacgc aagagcactc taaggagact 1140
gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta 1200
gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggaac agagggttgc caagccgcga ggtggagcca 1260
atcccagaaa accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga 1320
atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac 1380
cgcccgtcac accatgggag tgggtttcac cagaagtagg tagcctaacc gcaaggaggg 1440
cgcttaccac ggtgggattc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 1490
<210> 29
<211> 1408
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌属物种（Burkholderia sp.） KM-A
<400> 29
gcaaccctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgt cctgtagtgg 60
gggatagccc ggcgaaagcc ggattaatac cgcatacgat ctacggaaga aagcggggga 120
tccttcggga cctcgcgcta taggggcggc cgatggcaga ttagctagtt ggtggggtaa 180
aggcctacca aggcgacgat ctgtagctgg tctgagagga cgaccagcca cactgggact 240
gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttggaca atgggggcaa 300
ccctgatcca gcaatgccgc gtgtgtgaag aaggccttcg ggttgtaaag cacttttgtc 360
cggaaagaaa acgtcttggt taatacctga ggcggatgac ggtaccggaa gaataagcac 420
cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcgagcgtta atcggaatta 480
ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggtctgt taagaccgat gtgaaatccc cgggcttaac 540
ctgggaactg cattggtgac tggcaggctt tgagtgtggc agaggggggt agaattccac 600
gtgtagcagt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc agccccctgg 660
gccaacactg acgctcatgc acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta 720
gtccacgccc taaacgatgt caactagttg ttggggattc atttccttag taacgtagct 780
aacgcgtgaa gttgaccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga 840
cggggacccg cacaagcggt ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg aaaaacctta 900
cctacccttg acatggtcgg aagtctgctg agaggtggac gtgctcgaaa gagaaccggc 960
gcacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020
acgagcgcaa cccttgtcct tagttgctac gcaagagcac tctaaggaga ctgccggtga 1080
caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatggg tagggcttca 1140
cacgtcatac aatggtcgga acagagggtt gccaagccgc gaggtggagc caatcccaga 1200
aaaccgatcg tagtccggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1260
taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc 1320
acaccatggg agtgggtttc accagaagta ggtagcctaa ccgcaaggag ggcgcttacc 1380
acggtgggat tcatgactgg ggtgaagt 1408
<210> 30
<211> 1383
<212> DNA
<213> 伯克霍尔德氏菌属物种（Burkholderia sp.） KM-G
<400> 30
gcaaccctgg tggcgagtgg cgaacgggtg agtaatacat cggaacgtgt cctgtagtgg 60
gggatagccc ggcgaaagcc ggattaatac cgcatacgac ctaagggaga aagcggggga 120
tcttcggacc tcgcgctata ggggcggccg atggcagatt agctagttgg tggggtaaag 180
gcctaccaag gcgacgatct gtagctggtc tgagaggacg accagccaca ctgggactga 240
gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat tttggacaat gggggcaacc 300
ctgatccagc aatgccgcgt gtgtgaagaa ggccttcggg ttgtaaagca cttttgtccg 360
gaaagaaaac ttcgaggtta atacccttgg aggatgacgg taccggaaga ataagcaccg 420
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc gagcgttaat cggaattact 480
gggcgtaaag cgtgcgcagg cggtctgtta agaccgatgt gaaatccccg ggcttaacct 540
gggaactgca ttggtgactg gcaggctttg agtgtggcag aggggggtag aattccacgt 600
gtagcagtga aatgcgtaga gatgtggagg aataccgatg gcgaaggcag ccccctgggc 660
caacactgac gctcatgcac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 720
ccacgcccta aacgatgtca actagttgtt ggggattcat ttccttagta acgtagctaa 780
cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg 840
gggacccgca caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc 900
tacccttgac atggtcggaa gtctgctgag aggtggacgt gctcgaaaga gaaccggcgc 960
acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac 1020
gagcgcaacc cttgtcctta gttgctacgc aagagcactc taaggagact gccggtgaca 1080
aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca 1140
cgtcatacaa tggtcggaac agagggttgc caagccgcga ggtggagcca atcccagaaa 1200
accgatcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1260
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac 1320
accatgggag tgggtttcac cagaagtagg tagcctaacc tgcaaaggag ggcgcttacc 1380
acg 1383
<210> 31
<400> 31
000
<210> 32
<400> 32
000
<210> 33
<211> 1505
<212> DNA
<213> Snodgrassella alvi
<400> 33
gagagtttga tcctggctca gattgaacgc tggcggcatg ccttacacat gcaagtcgaa 60
cggcagcacg gagagcttgc tctctggtgg cgagtggcga acgggtgagt aatgcatcgg 120
aacgtaccga gtaatggggg ataactgtcc gaaaggatgg ctaataccgc atacgccctg 180
agggggaaag cgggggatcg aaagacctcg cgttatttga gcggccgatg ttggattagc 240
tagttggtgg ggtaaaggcc taccaaggcg acgatccata gcgggtctga gaggatgatc 300
cgccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt 360
ggacaatggg gggaaccctg atccagccat gccgcgtgtc tgaagaaggc cttcgggttg 420
taaaggactt ttgttaggga agaaaagccg ggtgttaata ccatctggtg ctgacggtac 480
ctaaagaata agcaccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcgag 540
cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcga gcgcagacgg ttaattaagt cagatgtgaa 600
atccccgagc tcaacttggg acgtgcattt gaaactggtt aactagagtg tgtcagaggg 660
aggtagaatt ccacgtgtag cagtgaaatg cgtagagatg tggaggaata ccgatggcga 720
aggcagcctc ctgggataac actgacgttc atgctcgaaa gcgtgggtag caaacaggat 780
tagataccct ggtagtccac gccctaaacg atgacaatta gctgttggga cactagatgt 840
cttagtagcg aagctaacgc gtgaaattgt ccgcctgggg agtacggtcg caagattaaa 900
actcaaagga attgacgggg acccgcacaa gcggtggatg atgtggatta attcgatgca 960
acgcgaagaa ccttacctgg tcttgacatg tacggaatct cttagagata ggagagtgcc 1020
ttcgggaacc gtaacacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cattagttgc catcattaag ttgggcactc 1140
taatgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc 1200
cttatgacca gggcttcaca cgtcatacaa tggtcggtac agagggtagc gaagccgcga 1260
ggtgaagcca atctcagaaa gccgatcgta gtccggattg cactctgcaa ctcgagtgca 1320
tgaagtcgga atcgctagta atcgcaggtc agcatactgc ggtgaatacg ttcccgggtc 1380
ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag tgggggatac cagaattggg tagactaacc 1440
gcaaggaggt cgcttaacac ggtatgcttc atgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc 1500
cgtag 1505
<210> 34
<211> 1541
<212> DNA
<213> Gilliamella apicola
<400> 34
ttaaattgaa gagtttgatc atggctcaga ttgaacgctg gcggcaggct taacacatgc 60
aagtcgaacg gtaacatgag tgcttgcact tgatgacgag tggcggacgg gtgagtaaag 120
tatggggatc tgccgaatgg agggggacaa cagttggaaa cgactgctaa taccgcataa 180
agttgagaga ccaaagcatg ggaccttcgg gccatgcgcc atttgatgaa cccatatggg 240
attagctagt tggtagggta atggcttacc aaggcgacga tctctagctg gtctgagagg 300
atgaccagcc acactggaac tgagacacgg tccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 360
aatattgcac aatgggggaa accctgatgc agccatgccg cgtgtatgaa gaaggccttc 420
gggttgtaaa gtactttcgg tgatgaggaa ggtggtgtat ctaataggtg catcaattga 480
cgttaattac agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 540
tgcgagcgtt aatcggaatg actgggcgta aagggcatgt aggcggataa ttaagttagg 600
tgtgaaagcc ctgggctcaa cctaggaatt gcacttaaaa ctggttaact agagtattgt 660
agaggaaggt agaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaataccgg 720
tggcgaaggc ggccttctgg acagatactg acgctgagat gcgaaagcgt ggggagcaaa 780
caggattaga taccctggta gtccacgctg taaacgatgt cgatttggag tttgttgcct 840
agagtgatgg gctccgaagc taacgcgata aatcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 900
gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 960
gatgcaacgc gaagaacctt acctggtctt gacatccaca gaatcttgca gagatgcggg 1020
agtgccttcg ggaactgtga gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 1080
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttatcctt tgttgccatc ggttaggccg 1140
ggaactcaaa ggagactgcc gttgataaag cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat 1200
catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg cgtatacaaa gggaggcgac 1260
ctcgcgagag caagcggacc tcataaagta cgtctaagtc cggattggag tctgcaactc 1320
gactccatga agtcggaatc gctagtaatc gtgaatcaga atgtcacggt gaatacgttc 1380
ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagtgg gttgcaccag aagtagatag 1440
cttaaccttc gggagggcgt ttaccacggt gtggtccatg actggggtga agtcgtaaca 1500
aggtaaccgt aggggaacct gcggttggat cacctcctta c 1541
<210> 35
<211> 1528
<212> DNA
<213> 巴尔通体属（Bartonella apis）
<400> 35
aagccaaaat caaattttca acttgagagt ttgatcctgg ctcagaacga acgctggcgg 60
caggcttaac acatgcaagt cgaacgcact tttcggagtg agtggcagac gggtgagtaa 120
cgcgtgggaa tctacctatt tctacggaat aacgcagaga aatttgtgct aataccgtat 180
acgtccttcg ggagaaagat ttatcggaga tagatgagcc cgcgttggat tagctagttg 240
gtgaggtaat ggcccaccaa ggcgacgatc catagctggt ctgagaggat gaccagccac 300
attgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 360
tgggcgcaag cctgatccag ccatgccgcg tgagtgatga aggccctagg gttgtaaagc 420
tctttcaccg gtgaagataa tgacggtaac cggagaagaa gccccggcta acttcgtgcc 480
agcagccgcg gtaatacgaa gggggctagc gttgttcgga tttactgggc gtaaagcgca 540
cgtaggcgga tatttaagtc aggggtgaaa tcccggggct caaccccgga actgcctttg 600
atactggata tcttgagtat ggaagaggta agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc 660
gtagatattc ggaggaacac cagtggcgaa ggcggcttac tggtccatta ctgacgctga 720
ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga 780
tgaatgttag ccgttggaca gtttactgtt cggtggcgca gctaacgcat taaacattcc 840
gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagccc ttgacatccc 960
gatcgcggat ggtggagaca ccgtctttca gttcggctgg atcggtgaca ggtgctgcat 1020
ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc 1080
gcccttagtt gccatcattt agttgggcac tctaagggga ctgccggtga taagccgaga 1140
ggaaggtggg gatgacgtca agtcctcatg gcccttacgg gctgggctac acacgtgcta 1200
caatggtggt gacagtgggc agcgagaccg cgaggtcgag ctaatctcca aaagccatct 1260
cagttcggat tgcactctgc aactcgagtg catgaagttg gaatcgctag taatcgtgga 1320
tcagcatgcc acggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1380
agttggtttt acccgaaggt gctgtgctaa ccgcaaggag gcaggcaacc acggtagggt 1440
cagcgactgg ggtgaagtcg taacaaggta gccgtagggg aacctgcggc tggatcacct 1500
cctttctaag gaagatgaag aattggaa 1528
<210> 36
<211> 1390
<212> DNA
<213> Parasaccharibacter apium
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (643)..(756)
<223> n是a、g、c、或t
<400> 36
ctaccatgca agtcgcacga aacctttcgg ggttagtggc ggacgggtga gtaacgcgtt 60
aggaacctat ctggaggtgg gggataacat cgggaaactg gtgctaatac cgcatgatgc 120
ctgagggcca aaggagagat ccgccattgg aggggcctgc gttcgattag ctagttggtt 180
gggtaaaggc tgaccaaggc gatgatcgat agctggtttg agaggatgat cagccacact 240
gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg 300
gggcaaccct gatccagcaa tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact 360
ttcactaggg aagatgatga cggtacctag agaagaagcc ccggctaact tcgtgccagc 420
agccgcggta atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatg actgggcgta aagggcgcgt 480
aggctgtttg tacagtcaga tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggaact gcatttgata 540
cgtgcagact agagtccgag agagggttgt ggaattccca gtgtagaggt gaaattcgta 600
gatattggga agaacaccgg ttgcgaaggc ggcaacctgg ctnnnnnnnn nnnnnnnnnn 660
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnngagc taacgcgtta agcacaccgc 780
ctggggagta cggccgcaag gttgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 840
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt accagggctt gcatggggag 900
gctgtattca gagatggata tttcttcgga cctcccgcac aggtgctgca tggctgtcgt 960
cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgtctttagt 1020
tgccatcacg tctgggtggg cactctagag agactgccgg tgacaagccg gaggaaggtg 1080
gggatgacgt caagtcctca tggcccttat gtcctgggct acacacgtgc tacaatggcg 1140
gtgacagagg gatgctacat ggtgacatgg tgctgatctc aaaaaaccgt ctcagttcgg 1200
attgtactct gcaactcgag tgcatgaagg tggaatcgct agtaatcgcg gatcagcatg 1260
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt 1320
tgaccttaag ccggtgagcg aaccgcaagg aacgcagccg accaccggtt cgggttcagc 1380
gactggggga 1390
<210> 37
<211> 1583
<212> DNA
<213> 昆仑乳杆菌（Lactobacillus kunkeei）
<400> 37
ttccttagaa aggaggtgat ccagccgcag gttctcctac ggctaccttg ttacgacttc 60
accctaatca tctgtcccac cttagacgac tagctcctaa aaggttaccc catcgtcttt 120
gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca 180
ccgtggcatg ctgatccacg attactagtg attccaactt catgcaggcg agttgcagcc 240
tgcaatccga actgagaatg gctttaagag attagcttga cctcgcggtt tcgcgactcg 300
ttgtaccatc cattgtagca cgtgtgtagc ccagctcata aggggcatga tgatttgacg 360
tcgtccccac cttcctccgg tttatcaccg gcagtctcac tagagtgccc aactaaatgc 420
tggcaactaa taataagggt tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg 480
agctgacgac aaccatgcac cacctgtcat tctgtccccg aagggaacgc ccaatctctt 540
gggttggcag aagatgtcaa gagctggtaa ggttcttcgc gtagcatcga attaaaccac 600
atgctccacc acttgtgcgg gcccccgtca attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta 660
ctccccaggc ggaatactta atgcgttagc tgcggcactg aagggcggaa accctccaac 720
acctagtatt catcgtttac ggcatggact accagggtat ctaatcctgt tcgctaccca 780
tgctttcgag cctcagcgtc agtaacagac cagaaagccg ccttcgccac tggtgttctt 840
ccatatatct acgcatttca ccgctacaca tggagttcca ctttcctctt ctgtactcaa 900
gttttgtagt ttccactgca cttcctcagt tgagctgagg gctttcacag cagacttaca 960
aaaccgcctg cgctcgcttt acgcccaata aatccggaca acgcttgcca cctacgtatt 1020
accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg gctttctggt taaataccgt caaagtgtta 1080
acagttactc taacacttgt tcttctttaa caacagagtt ttacgatccg aaaaccttca 1140
tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt tcgtccattg tggaagattc cctactgctg 1200
cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccaatgtg gccgattacc ctctcaggtc 1260
ggctacgtat catcgtcttg gtgggctttt atctcaccaa ctaactaata cggcgcgggt 1320
ccatcccaaa gtgatagcaa agccatcttt caagttggaa ccatgcggtt ccaactaatt 1380
atgcggtatt agcacttgtt tccaaatgtt atcccccgct tcggggcagg ttacccacgt 1440
gttactcacc agttcgccac tcgctccgaa tccaaaaatc atttatgcaa gcataaaatc 1500
aatttgggag aactcgttcg acttgcatgt attaggcacg ccgccagcgt tcgtcctgag 1560
ccaggatcaa actctcatct taa 1583
<210> 38
<211> 1395
<212> DNA
<213> 乳杆菌属Firm -4
<400> 38
acgaacgctg gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgagcg cgggaagtca gggaagcctt 60
cgggtggaac tggtggaacg agcggcggat gggtgagtaa cacgtaggta acctgcccta 120
aagcggggga taccatctgg aaacaggtgc taataccgca taaacccagc agtcacatga 180
gtgctggttg aaagacggct tcggctgtca ctttaggatg gacctgcggc gtattagcta 240
gttggtggag taacggttca ccaaggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg 300
ccacattggg actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc 360
acaatggacg caagtctgat ggagcaacgc cgcgtggatg aagaaggtct tcggatcgta 420
aaatcctgtt gttgaagaag aacggttgtg agagtaactg ctcataacgt gacggtaatc 480
aaccagaaag tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg 540
ttgtccggat ttattgggcg taaagggagc gcaggcggtc ttttaagtct gaatgtgaaa 600
gccctcagct taactgagga agagcatcgg aaactgagag acttgagtgc agaagaggag 660
agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720
ggcggctctc tggtctgtta ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 780
agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttgggag gtttccgcct 840
ctcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tcctgcaagc ctaagagatt aggggttccc 1020
ttcggggaca ggaagacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt tactagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140
tagtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcaaat catcatgccc 1200
cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aatgagaagc gaactcgcga 1260
ggggaagctg atctctgaaa accattctca gttcggattg caggctgcaa ctcgcctgca 1320
tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380
ttgtacacac cgccc 1395
<210> 39
<211> 1549
<212> DNA
<213> 肠球菌属（Enterococcus）
<400> 39
aggtgatcca gccgcacctt ccgatacggc taccttgtta cgacttcacc ccaatcatct 60
atcccacctt aggcggctgg ctccaaaaag gttacctcac cgacttcggg tgttacaaac 120
tctcgtggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg cggcgtgctg 180
atccgcgatt actagcgatt ccggcttcat gcaggcgagt tgcagcctgc aatccgaact 240
gagagaagct ttaagagatt tgcatgacct cgcggtctag cgactcgttg tacttcccat 300
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tttgacgtca tccccacctt 360
cctccggttt gtcaccggca gtctcgctag agtgcccaac taaatgatgg caactaacaa 420
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacaac 480
catgcaccac ctgtcacttt gtccccgaag ggaaagctct atctctagag tggtcaaagg 540
atgtcaagac ctggtaaggt tcttcgcgtt gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct 600
tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcaaccttgc ggtcgtactc cccaggcgga 660
gtgcttaatg cgtttgctgc agcactgaag ggcggaaacc ctccaacact tagcactcat 720
cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgtttg ctccccacgc tttcgagcct 780
cagcgtcagt tacagaccag agagccgcct tcgccactgg tgttcctcca tatatctacg 840
catttcaccg ctacacatgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtc tcccagtttc 900
caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa ccgcctgcgc 960
tcgctttacg cccaataaat ccggacaacg cttgccacct acgtattacc gcggctgctg 1020
gcacgtagtt agccgtggct ttctggttag ataccgtcag gggacgttca gttactaacg 1080
tccttgttct tctctaacaa cagagtttta cgatccgaaa accttcttca ctcacgcggc 1140
gttgctcggt cagactttcg tccattgccg aagattccct actgctgcct cccgtaggag 1200
tctgggccgt gtctcagtcc cagtgtggcc gatcaccctc tcaggtcggc tatgcatcgt 1260
ggccttggtg agccgttacc tcaccaacta gctaatgcac cgcgggtcca tccatcagcg 1320
acacccgaaa gcgcctttca ctcttatgcc atgcggcata aactgttatg cggtattagc 1380
acctgtttcc aagtgttatc cccctctgat gggtaggtta cccacgtgtt actcacccgt 1440
ccgccactcc tctttccaat tgagtgcaag cactcgggag gaaagaagcg ttcgacttgc 1500
atgtattagg cacgccgcca gcgttcgtcc tgagccagga tcaaactct 1549
<210> 40
<211> 1541
<212> DNA
<213> 戴尔福特菌属（Delftia）
<400> 40
cagaaaggag gtgatccagc cgcaccttcc gatacggcta ccttgttacg acttcacccc 60
agtcacgaac cccgccgtgg taagcgccct ccttgcggtt aggctaccta cttctggcga 120
gacccgctcc catggtgtga cgggcggtgt gtacaagacc cgggaacgta ttcaccgcgg 180
catgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcacgca gtcgagttgc agactgcgat 240
ccggactacg actggtttta tgggattagc tccccctcgc gggttggcaa ccctctgtac 300
cagccattgt atgacgtgtg tagccccacc tataagggcc atgaggactt gacgtcatcc 360
ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcattagagt gctcaactga atgtagcaac 420
taatgacaag ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac 480
gacagccatg cagcacctgt gtgcaggttc tctttcgagc acgaatccat ctctggaaac 540
ttcctgccat gtcaaaggtg ggtaaggttt ttcgcgttgc atcgaattaa accacatcat 600
ccaccgcttg tgcgggtccc cgtcaattcc tttgagtttc aaccttgcgg ccgtactccc 660
caggcggtca acttcacgcg ttagcttcgt tactgagaaa actaattccc aacaaccagt 720
tgacatcgtt tagggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc 780
gtgcatgagc gtcagtacag gtccagggga ttgccttcgc catcggtgtt cctccgcata 840
tctacgcatt tcactgctac acgcggaatt ccatccccct ctaccgtact ctagccatgc 900
agtcacaaat gcagttccca ggttgagccc ggggatttca catctgtctt acataaccgc 960
ctgcgcacgc tttacgccca gtaattccga ttaacgctcg caccctacgt attaccgcgg 1020
ctgctggcac gtagttagcc ggtgcttatt cttacggtac cgtcatgggc cccctgtatt 1080
agaaggagct ttttcgttcc gtacaaaagc agtttacaac ccgaaggcct tcatcctgca 1140
cgcggcattg ctggatcagg ctttcgccca ttgtccaaaa ttccccactg ctgcctcccg 1200
taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt gtggctggtc gtcctctcag accagctaca 1260
gatcgtcggc ttggtaagct tttatcccac caactaccta atctgccatc ggccgctcca 1320
atcgcgcgag gcccgaaggg cccccgcttt catcctcaga tcgtatgcgg tattagctac 1380
tctttcgagt agttatcccc cacgactggg cacgttccga tgtattactc acccgttcgc 1440
cactcgtcag cgtccgaaga cctgttaccg ttcgacttgc atgtgtaagg catgccgcca 1500
gcgttcaatc tgagccagga tcaaactcta cagttcgatc t 1541
<210> 41
<211> 1502
<212> DNA
<213> Pelomonas
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (192)..(193)
<223> n是a、g、c、或t
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (832)..(833)
<223> n是a、g、c、或t
<400> 41
atcctggctc agattgaacg ctggcggcat gccttacaca tgcaagtcga acggtaacag 60
gttaagctga cgagtggcga acgggtgagt aatatatcgg aacgtgccca gtcgtggggg 120
ataactgctc gaaagagcag ctaataccgc atacgacctg agggtgaaag cgggggatcg 180
caagacctcg cnngattgga gcggccgata tcagattagg tagttggtgg ggtaaaggcc 240
caccaagcca acgatctgta gctggtctga gaggacgacc agccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatttt ggacaatggg cgcaagcctg 360
atccagccat gccgcgtgcg ggaagaaggc cttcgggttg taaaccgctt ttgtcaggga 420
agaaaaggtt ctggttaata cctgggactc atgacggtac ctgaagaata agcaccggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg 540
cgtaaagcgt gcgcaggcgg ttatgcaaga cagaggtgaa atccccgggc tcaacctggg 600
aactgccttt gtgactgcat agctagagta cggtagaggg ggatggaatt ccgcgtgtag 660
cagtgaaatg cgtagatatg cggaggaaca ccgatggcga aggcaatccc ctggacctgt 720
actgacgctc atgcacgaaa gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac 780
gccctaaacg atgtcaactg gttgttggga gggtttcttc tcagtaacgt anntaacgcg 840
tgaagttgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa ttgacgggga 900
cccgcacaag cggtggatga tgtggtttaa ttcgatgcaa cgcgaaaaac cttacctacc 960
cttgacatgc caggaatcct gaagagattt gggagtgctc gaaagagaac ctggacacag 1020
gtgctgcatg gccgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc 1080
gcaacccttg tcattagttg ctacgaaagg gcactctaat gagactgccg gtgacaaacc 1140
ggaggaaggt ggggatgacg tcaggtcatc atggccctta tgggtagggc tacacacgtc 1200
atacaatggc cgggacagag ggctgccaac ccgcgagggg gagctaatcc cagaaacccg 1260
gtcgtagtcc ggatcgtagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320
cggatcagct tgccgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380
tgggagcggg ttctgccaga agtagttagc ctaaccgcaa ggagggcgat taccacggca 1440
gggttcgtga ctggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta tcggaaggtg cggctggatc 1500
ac 1502
<210> 42
<211> 34
<212> PRT
<213> 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）
<400> 42
Ile Thr Ser Ile Ser Leu Cys Thr Pro Gly Cys Lys Thr Gly Ala Leu
1 5 10 15
Met Gly Cys Asn Met Lys Thr Ala Thr Cys His Cys Ser Ile His Val
20 25 30
Ser Lys
<210> 43
<211> 22
<212> PRT
<213> 表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis）
<400> 43
Ile Ala Ser Lys Phe Ile Cys Thr Pro Gly Cys Ala Lys Thr Gly Ser
1 5 10 15
Phe Asn Ser Tyr Cys Cys
20
<210> 44
<211> 44
<212> PRT
<213> 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）
<400> 44
Lys Tyr Tyr Gly Asn Gly Val Thr Cys Gly Lys His Ser Cys Ser Val
1 5 10 15
Asp Trp Gly Lys Ala Thr Thr Cys Ile Ile Asn Asn Gly Ala Met Ala
20 25 30
Trp Ala Thr Gly Gly His Gln Gly Asn His Lys Cys
35 40
<210> 45
<211> 44
<212> PRT
<213> 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<400> 45
Ala Thr Arg Ser Tyr Gly Asn Gly Val Tyr Cys Asn Asn Ser Lys Cys
1 5 10 15
Trp Val Asn Trp Gly Glu Ala Lys Glu Asn Ile Ala Gly Ile Val Ile
20 25 30
Ser Gly Trp Ala Ser Gly Leu Ala Gly Met Gly His
35 40
<210> 46
<211> 39
<212> PRT
<213> 乳酸链球菌（Streptococcus lactis）
<400> 46
Gly Thr Trp Asp Asp Ile Gly Gln Gly Ile Gly Arg Val Ala Tyr Trp
1 5 10 15
Val Gly Lys Ala Met Gly Asn Met Ser Asp Val Asn Gln Ala Ser Arg
20 25 30
Ile Asn Arg Lys Lys Lys His
35
<210> 47
<211> 48
<212> PRT
<213> 约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）
<400> 47
Asn Arg Trp Gly Asp Thr Val Leu Ser Ala Ala Ser Gly Ala Gly Thr
1 5 10 15
Gly Ile Lys Ala Cys Lys Ser Phe Gly Pro Trp Gly Met Ala Ile Cys
20 25 30
Gly Val Gly Gly Ala Ala Ile Gly Gly Tyr Phe Gly Tyr Thr His Asn
35 40 45
<210> 48
<211> 70
<212> PRT
<213> 粪肠球菌（Enterococcus faecalis）
<400> 48
Met Ala Lys Glu Phe Gly Ile Pro Ala Ala Val Ala Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Asn Val Val Glu Ala Gly Gly Trp Val Thr Thr Ile Val Ser Ile Leu
20 25 30
Thr Ala Val Gly Ser Gly Gly Leu Ser Leu Leu Ala Ala Ala Gly Arg
35 40 45
Glu Ser Ile Lys Ala Tyr Leu Lys Lys Glu Ile Lys Lys Lys Gly Lys
50 55 60
Arg Ala Val Ile Ala Trp
65 70
<210> 49
<211> 51
<212> PRT
<213> 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
<400> 49
Met Ser Trp Leu Asn Phe Leu Lys Tyr Ile Ala Lys Tyr Gly Lys Lys
1 5 10 15
Ala Val Ser Ala Ala Trp Lys Tyr Lys Gly Lys Val Leu Glu Trp Leu
20 25 30
Asn Val Gly Pro Thr Leu Glu Trp Val Trp Gln Lys Leu Lys Lys Ile
35 40 45
Ala Gly Leu
50
<210> 50
<211> 43
<212> PRT
<213> 格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）
<400> 50
Ile Gly Gly Ala Leu Gly Asn Ala Leu Asn Gly Leu Gly Thr Trp Ala
1 5 10 15
Asn Met Met Asn Gly Gly Gly Phe Val Asn Gln Trp Gln Val Tyr Ala
20 25 30
Asn Lys Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg Pro Tyr
35 40
<210> 51
<211> 103
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）
<400> 51
Met Arg Thr Leu Thr Leu Asn Glu Leu Asp Ser Val Ser Gly Gly Ala
1 5 10 15
Ser Gly Arg Asp Ile Ala Met Ala Ile Gly Thr Leu Ser Gly Gln Phe
20 25 30
Val Ala Gly Gly Ile Gly Ala Ala Ala Gly Gly Val Ala Gly Gly Ala
35 40 45
Ile Tyr Asp Tyr Ala Ser Thr His Lys Pro Asn Pro Ala Met Ser Pro
50 55 60
Ser Gly Leu Gly Gly Thr Ile Lys Gln Lys Pro Glu Gly Ile Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ala Trp Asn Tyr Ala Ala Gly Arg Leu Cys Asn Trp Ser Pro Asn
85 90 95
Asn Leu Ser Asp Val Cys Leu
100
<210> 52
<211> 339
<212> PRT
<213> Cp1
<400> 52
Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ser Ser His Asn Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Ile Thr Gly Ile Leu Glu Gln Met Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30
Ile Lys Ile Ser Glu Ser Thr Thr Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45
Gln Val Glu Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Arg Phe
50 55 60
Gly Gly Asp Val Ala Glu Ala Glu Arg Glu Ala Gln Phe Phe Leu Asp
65 70 75 80
Asn Val Pro Met Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp Asp
85 90 95
Pro Ser Gly Asp Ala Gln Ala Asn Thr Asn Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110
Gln Met Ile Ala Asp Ala Gly Tyr Lys Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys
115 120 125
Pro Phe Thr His Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe
130 135 140
Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala
145 150 155 160
Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175
Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Asp Asp Glu Glu
180 185 190
Asp Asp Lys Pro Lys Thr Ala Gly Thr Trp Lys Gln Asp Ser Lys Gly
195 200 205
Trp Trp Phe Arg Arg Asn Asn Gly Ser Phe Pro Tyr Asn Lys Trp Glu
210 215 220
Lys Ile Gly Gly Val Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Lys Gly Tyr Cys Leu
225 230 235 240
Thr Ser Glu Trp Leu Lys Asp Asn Glu Lys Trp Tyr Tyr Leu Lys Asp
245 250 255
Asn Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Val Leu Val Gly Ser Glu Trp Tyr
260 265 270
Tyr Met Asp Asp Ser Gly Ala Met Val Thr Gly Trp Val Lys Tyr Lys
275 280 285
Asn Asn Trp Tyr Tyr Met Thr Asn Glu Arg Gly Asn Met Val Ser Asn
290 295 300
Glu Phe Ile Lys Ser Gly Lys Gly Trp Tyr Phe Met Asn Thr Asn Gly
305 310 315 320
Glu Leu Ala Asp Asn Pro Ser Phe Thr Lys Glu Pro Asp Gly Leu Ile
325 330 335
Thr Val Ala
<210> 53
<211> 296
<212> PRT
<213> Dp-1
<400> 53
Met Gly Val Asp Ile Glu Lys Gly Val Ala Trp Met Gln Ala Arg Lys
1 5 10 15
Gly Arg Val Ser Tyr Ser Met Asp Phe Arg Asp Gly Pro Asp Ser Tyr
20 25 30
Asp Cys Ser Ser Ser Met Tyr Tyr Ala Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Ala Gly Trp Ala Val Asn Thr Glu Tyr Met His Ala Trp Leu Ile
50 55 60
Glu Asn Gly Tyr Glu Leu Ile Ser Glu Asn Ala Pro Trp Asp Ala Lys
65 70 75 80
Arg Gly Asp Ile Phe Ile Trp Gly Arg Lys Gly Ala Ser Ala Gly Ala
85 90 95
Gly Gly His Thr Gly Met Phe Ile Asp Ser Asp Asn Ile Ile His Cys
100 105 110
Asn Tyr Ala Tyr Asp Gly Ile Ser Val Asn Asp His Asp Glu Arg Trp
115 120 125
Tyr Tyr Ala Gly Gln Pro Tyr Tyr Tyr Val Tyr Arg Leu Thr Asn Ala
130 135 140
Asn Ala Gln Pro Ala Glu Lys Lys Leu Gly Trp Gln Lys Asp Ala Thr
145 150 155 160
Gly Phe Trp Tyr Ala Arg Ala Asn Gly Thr Tyr Pro Lys Asp Glu Phe
165 170 175
Glu Tyr Ile Glu Glu Asn Lys Ser Trp Phe Tyr Phe Asp Asp Gln Gly
180 185 190
Tyr Met Leu Ala Glu Lys Trp Leu Lys His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr
195 200 205
Trp Phe Asp Arg Asp Gly Tyr Met Ala Thr Ser Trp Lys Arg Ile Gly
210 215 220
Glu Ser Trp Tyr Tyr Phe Asn Arg Asp Gly Ser Met Val Thr Gly Trp
225 230 235 240
Ile Lys Tyr Tyr Asp Asn Trp Tyr Tyr Cys Asp Ala Thr Asn Gly Asp
245 250 255
Met Lys Ser Asn Ala Phe Ile Arg Tyr Asn Asp Gly Trp Tyr Leu Leu
260 265 270
Leu Pro Asp Gly Arg Leu Ala Asp Lys Pro Gln Phe Thr Val Glu Pro
275 280 285
Asp Gly Leu Ile Thr Ala Lys Val
290 295
<210> 54
<211> 233
<212> PRT
<213> γ
<400> 54
Met Glu Ile Gln Lys Lys Leu Val Asp Pro Ser Lys Tyr Gly Thr Lys
1 5 10 15
Cys Pro Tyr Thr Met Lys Pro Lys Tyr Ile Thr Val His Asn Thr Tyr
20 25 30
Asn Asp Ala Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Tyr Met Ile Ser Asn Asn
35 40 45
Asn Glu Val Ser Phe His Ile Ala Val Asp Asp Lys Lys Ala Ile Gln
50 55 60
Gly Ile Pro Leu Glu Arg Asn Ala Trp Ala Cys Gly Asp Gly Asn Gly
65 70 75 80
Ser Gly Asn Arg Gln Ser Ile Ser Val Glu Ile Cys Tyr Ser Lys Ser
85 90 95
Gly Gly Asp Arg Tyr Tyr Lys Ala Glu Asp Asn Ala Val Asp Val Val
100 105 110
Arg Gln Leu Met Ser Met Tyr Asn Ile Pro Ile Glu Asn Val Arg Thr
115 120 125
His Gln Ser Trp Ser Gly Lys Tyr Cys Pro His Arg Met Leu Ala Glu
130 135 140
Gly Arg Trp Gly Ala Phe Ile Gln Lys Val Lys Asn Gly Asn Val Ala
145 150 155 160
Thr Thr Ser Pro Thr Lys Gln Asn Ile Ile Gln Ser Gly Ala Phe Ser
165 170 175
Pro Tyr Glu Thr Pro Asp Val Met Gly Ala Leu Thr Ser Leu Lys Met
180 185 190
Thr Ala Asp Phe Ile Leu Gln Ser Asp Gly Leu Thr Tyr Phe Ile Ser
195 200 205
Lys Pro Thr Ser Asp Ala Gln Leu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Leu Asp
210 215 220
Arg Lys Gly Trp Trp Tyr Glu Val Lys
225 230
<210> 55
<211> 481
<212> PRT
<213> MR11
<400> 55
Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Thr
1 5 10 15
Ser Glu Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Leu Trp Tyr Gly Phe Gln Cys
20 25 30
Phe Asp Tyr Ala Asn Ala Gly Trp Lys Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Gly Leu Gly Ala Lys Asp Ile Pro Phe Ala Asn Asn Phe Asp Gly
50 55 60
Leu Ala Thr Val Tyr Gln Asn Thr Pro Asp Phe Leu Ala Gln Pro Gly
65 70 75 80
Asp Met Val Val Phe Gly Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Tyr Gly His Val
85 90 95
Ala Trp Val Ile Glu Ala Thr Leu Asp Tyr Ile Ile Val Tyr Glu Gln
100 105 110
Asn Trp Leu Gly Gly Gly Trp Thr Asp Arg Ile Glu Gln Pro Gly Trp
115 120 125
Gly Trp Glu Lys Val Thr Arg Arg Gln His Ala Tyr Asp Phe Pro Met
130 135 140
Trp Phe Ile Arg Pro Asn Phe Lys Ser Glu Thr Ala Pro Arg Ser Ile
145 150 155 160
Gln Ser Pro Thr Gln Ala Ser Lys Lys Glu Thr Ala Lys Pro Gln Pro
165 170 175
Lys Ala Val Glu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Val Val Lys Gly Tyr Asp
180 185 190
Leu Pro Lys Arg Gly Gly Asn Pro Lys Gly Ile Val Ile His Asn Asp
195 200 205
Ala Gly Ser Lys Gly Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Gly Leu Val
210 215 220
Asn Ala Pro Leu Ser Arg Leu Glu Ala Gly Ile Ala His Ser Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gly Asn Thr Val Trp Gln Ala Leu Asp Glu Ser Gln Val Gly Trp
245 250 255
His Thr Ala Asn Gln Leu Gly Asn Lys Tyr Tyr Tyr Gly Ile Glu Val
260 265 270
Cys Gln Ser Met Gly Ala Asp Asn Ala Thr Phe Leu Lys Asn Glu Gln
275 280 285
Ala Thr Phe Gln Glu Cys Ala Arg Leu Leu Lys Lys Trp Gly Leu Pro
290 295 300
Ala Asn Arg Asn Thr Ile Arg Leu His Asn Glu Phe Thr Ser Thr Ser
305 310 315 320
Cys Pro His Arg Ser Ser Val Leu His Thr Gly Phe Asp Pro Val Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Leu Pro Glu Asp Lys Gln Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe
340 345 350
Ile Lys Gln Ile Arg Val Tyr Met Asp Gly Lys Ile Pro Val Ala Thr
355 360 365
Val Ser Asn Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asn Thr Val Lys Pro Val Ala
370 375 380
Ser Ala Trp Lys Arg Asn Lys Tyr Gly Thr Tyr Tyr Met Glu Glu Asn
385 390 395 400
Ala Arg Phe Thr Asn Gly Asn Gln Pro Ile Thr Val Arg Lys Ile Gly
405 410 415
Pro Phe Leu Ser Cys Pro Val Ala Tyr Gln Phe Gln Pro Gly Gly Tyr
420 425 430
Cys Asp Tyr Thr Glu Val Met Leu Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly
435 440 445
Tyr Thr Trp Glu Gly Gln Arg Tyr Tyr Leu Pro Ile Arg Thr Trp Asn
450 455 460
Gly Ser Ala Pro Pro Asn Gln Ile Leu Gly Asp Leu Trp Gly Glu Ile
465 470 475 480
Ser
<210> 56
<211> 239
<212> PRT
<213> B30
<400> 56
Met Val Ile Asn Ile Glu Gln Ala Ile Ala Trp Met Ala Ser Arg Lys
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Tyr Ser Met Asp Tyr Arg Asn Gly Pro Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Cys Ser Ser Ser Val Tyr Phe Ala Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Asp Asn Gly Trp Ala Val Asn Thr Glu Tyr Glu His Asp Trp Leu Ile
50 55 60
Lys Asn Gly Tyr Val Leu Ile Ala Glu Asn Thr Asn Trp Asn Ala Gln
65 70 75 80
Arg Gly Asp Ile Phe Ile Trp Gly Lys Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ala
85 90 95
Phe Gly His Thr Gly Met Phe Val Asp Pro Asp Asn Ile Ile His Cys
100 105 110
Asn Tyr Gly Tyr Asn Ser Ile Thr Val Asn Asn His Asp Glu Ile Trp
115 120 125
Gly Tyr Asn Gly Gln Pro Tyr Val Tyr Ala Tyr Arg Tyr Ser Gly Lys
130 135 140
Gln Ser Asn Ala Lys Val Asp Asn Lys Ser Val Val Ser Lys Phe Glu
145 150 155 160
Lys Glu Leu Asp Val Asn Thr Pro Leu Ser Asn Ser Asn Met Pro Tyr
165 170 175
Tyr Glu Ala Thr Ile Ser Glu Asp Tyr Tyr Val Glu Ser Lys Pro Asp
180 185 190
Val Asn Ser Thr Asp Lys Glu Leu Leu Val Ala Gly Thr Arg Val Arg
195 200 205
Val Tyr Glu Lys Val Lys Gly Trp Ala Arg Ile Gly Ala Pro Gln Ser
210 215 220
Asn Gln Trp Val Glu Asp Ala Tyr Leu Ile Asp Ala Thr Asp Met
225 230 235
<210> 57
<211> 495
<212> PRT
<213> K
<400> 57
Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Val Lys Lys Ala Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly
35 40 45
Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp
50 55 60
Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile
65 70 75 80
Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser
85 90 95
Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr
100 105 110
Glu Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser
115 120 125
Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys
130 135 140
Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu
145 150 155 160
Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys
165 170 175
Ser Ala Ser Lys Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val
180 185 190
Ser Lys Asn His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro
195 200 205
Glu Gly Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln
210 215 220
Tyr Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly
225 230 235 240
Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile Asp
245 250 255
Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly Ala Asn
260 265 270
Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln Ser Met Ser
275 280 285
Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala Val Phe Gln Phe
290 295 300
Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr Pro Asn Arg Lys Thr
305 310 315 320
Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr Ala Cys Pro His Arg Ser
325 330 335
Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser
340 345 350
Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys
355 360 365
Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly
370 375 380
Lys Thr Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser
385 390 395 400
Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr
405 410 415
Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe
420 425 430
Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val
435 440 445
Tyr Asp Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn
450 455 460
Ala Tyr Asn Gly Asn Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly
465 470 475 480
Val Pro Pro Asn Gln Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys
485 490 495
<210> 58
<211> 281
<212> PRT
<213> A118
<400> 58
Met Thr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Arg Ser Leu Ala Asn Val Asn Lys Leu
1 5 10 15
Ala Asp Asn Thr Lys Ala Ala Ala Arg Lys Leu Leu Asp Trp Ser Glu
20 25 30
Ser Asn Gly Ile Glu Val Leu Ile Tyr Glu Thr Ile Arg Thr Lys Glu
35 40 45
Gln Gln Ala Ala Asn Val Asn Ser Gly Ala Ser Gln Thr Met Arg Ser
50 55 60
Tyr His Leu Val Gly Gln Ala Leu Asp Phe Val Met Ala Lys Gly Lys
65 70 75 80
Thr Val Asp Trp Gly Ala Tyr Arg Ser Asp Lys Gly Lys Lys Phe Val
85 90 95
Ala Lys Ala Lys Ser Leu Gly Phe Glu Trp Gly Gly Asp Trp Ser Gly
100 105 110
Phe Val Asp Asn Pro His Leu Gln Phe Asn Tyr Lys Gly Tyr Gly Thr
115 120 125
Asp Thr Phe Gly Lys Gly Ala Ser Thr Ser Asn Ser Ser Lys Pro Ser
130 135 140
Ala Asp Thr Asn Thr Asn Ser Leu Gly Leu Val Asp Tyr Met Asn Leu
145 150 155 160
Asn Lys Leu Asp Ser Ser Phe Ala Asn Arg Lys Lys Leu Ala Thr Ser
165 170 175
Tyr Gly Ile Lys Asn Tyr Ser Gly Thr Ala Thr Gln Asn Thr Thr Leu
180 185 190
Leu Ala Lys Leu Lys Ala Gly Lys Pro His Thr Pro Ala Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Tyr Tyr Thr Glu Asn Pro Arg Lys Val Lys Thr Leu Val Gln Cys
210 215 220
Asp Leu Tyr Lys Ser Val Asp Phe Thr Thr Lys Asn Gln Thr Gly Gly
225 230 235 240
Thr Phe Pro Pro Gly Thr Val Phe Thr Ile Ser Gly Met Gly Lys Thr
245 250 255
Lys Gly Gly Thr Pro Arg Leu Lys Thr Lys Ser Gly Tyr Tyr Leu Thr
260 265 270
Ala Asn Thr Lys Phe Val Lys Lys Ile
275 280
<210> 59
<211> 341
<212> PRT
<213> A511
<400> 59
Met Val Lys Tyr Thr Val Glu Asn Lys Ile Ile Ala Gly Leu Pro Lys
1 5 10 15
Gly Lys Leu Lys Gly Ala Asn Phe Val Ile Ala His Glu Thr Ala Asn
20 25 30
Ser Lys Ser Thr Ile Asp Asn Glu Val Ser Tyr Met Thr Arg Asn Trp
35 40 45
Lys Asn Ala Phe Val Thr His Phe Val Gly Gly Gly Gly Arg Val Val
50 55 60
Gln Val Ala Asn Val Asn Tyr Val Ser Trp Gly Ala Gly Gln Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Ser Tyr Ala Gln Val Glu Leu Cys Arg Thr Ser Asn Ala
85 90 95
Thr Thr Phe Lys Lys Asp Tyr Glu Val Tyr Cys Gln Leu Leu Val Asp
100 105 110
Leu Ala Lys Lys Ala Gly Ile Pro Ile Thr Leu Asp Ser Gly Ser Lys
115 120 125
Thr Ser Asp Lys Gly Ile Lys Ser His Lys Trp Val Ala Asp Lys Leu
130 135 140
Gly Gly Thr Thr His Gln Asp Pro Tyr Ala Tyr Leu Ser Ser Trp Gly
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Gln Phe Ala Ser Asp Leu Ala Lys Val Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ala Lys Pro Ser Thr Pro Ala Pro Lys
180 185 190
Pro Ser Thr Pro Ser Thr Asn Leu Asp Lys Leu Gly Leu Val Asp Tyr
195 200 205
Met Asn Ala Lys Lys Met Asp Ser Ser Tyr Ser Asn Arg Asp Lys Leu
210 215 220
Ala Lys Gln Tyr Gly Ile Ala Asn Tyr Ser Gly Thr Ala Ser Gln Asn
225 230 235 240
Thr Thr Leu Leu Ser Lys Ile Lys Gly Gly Ala Pro Lys Pro Ser Thr
245 250 255
Pro Ala Pro Lys Pro Ser Thr Ser Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Phe Pro
260 265 270
Pro Asn Lys Gly Asn Trp Ser Val Tyr Pro Thr Asn Lys Ala Pro Val
275 280 285
Lys Ala Asn Ala Ile Gly Ala Ile Asn Pro Thr Lys Phe Gly Gly Leu
290 295 300
Thr Tyr Thr Ile Gln Lys Asp Arg Gly Asn Gly Val Tyr Glu Ile Gln
305 310 315 320
Thr Asp Gln Phe Gly Arg Val Gln Val Tyr Gly Ala Pro Ser Thr Gly
325 330 335
Ala Val Ile Lys Lys
340
<210> 60
<211> 289
<212> PRT
<213> A500
<400> 60
Met Ala Leu Thr Glu Ala Trp Leu Ile Glu Lys Ala Asn Arg Lys Leu
1 5 10 15
Asn Ala Gly Gly Met Tyr Lys Ile Thr Ser Asp Lys Thr Arg Asn Val
20 25 30
Ile Lys Lys Met Ala Lys Glu Gly Ile Tyr Leu Cys Val Ala Gln Gly
35 40 45
Tyr Arg Ser Thr Ala Glu Gln Asn Ala Leu Tyr Ala Gln Gly Arg Thr
50 55 60
Lys Pro Gly Ala Ile Val Thr Asn Ala Lys Gly Gly Gln Ser Asn His
65 70 75 80
Asn Tyr Gly Val Ala Val Asp Leu Cys Leu Tyr Thr Asn Asp Gly Lys
85 90 95
Asp Val Ile Trp Glu Ser Thr Thr Ser Arg Trp Lys Lys Val Val Ala
100 105 110
Ala Met Lys Ala Glu Gly Phe Lys Trp Gly Gly Asp Trp Lys Ser Phe
115 120 125
Lys Asp Tyr Pro His Phe Glu Leu Cys Asp Ala Val Ser Gly Glu Lys
130 135 140
Ile Pro Ala Ala Thr Gln Asn Thr Asn Thr Asn Ser Asn Arg Tyr Glu
145 150 155 160
Gly Lys Val Ile Asp Ser Ala Pro Leu Leu Pro Lys Met Asp Phe Lys
165 170 175
Ser Ser Pro Phe Arg Met Tyr Lys Val Gly Thr Glu Phe Leu Val Tyr
180 185 190
Asp His Asn Gln Tyr Trp Tyr Lys Thr Tyr Ile Asp Asp Lys Leu Tyr
195 200 205
Tyr Met Tyr Lys Ser Phe Cys Asp Val Val Ala Lys Lys Asp Ala Lys
210 215 220
Gly Arg Ile Lys Val Arg Ile Lys Ser Ala Lys Asp Leu Arg Ile Pro
225 230 235 240
Val Trp Asn Asn Ile Lys Leu Asn Ser Gly Lys Ile Lys Trp Tyr Ala
245 250 255
Pro Asn Val Lys Leu Ala Trp Tyr Asn Tyr Arg Arg Gly Tyr Leu Glu
260 265 270
Leu Trp Tyr Pro Asn Asp Gly Trp Tyr Tyr Thr Ala Glu Tyr Phe Leu
275 280 285
Lys
<210> 61
<211> 239
<212> PRT
<213> λSa1原噬菌体·
<400> 61
Met Val Ile Asn Ile Glu Gln Ala Ile Ala Trp Met Ala Ser Arg Lys
1 5 10 15
Gly Lys Val Thr Tyr Ser Met Asp Tyr Arg Asn Gly Pro Ser Ser Tyr
20 25 30
Asp Cys Ser Ser Ser Val Tyr Phe Ala Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Asp Asn Gly Trp Ala Val Asn Thr Glu Tyr Glu His Asp Trp Leu Ile
50 55 60
Lys Asn Gly Tyr Val Leu Ile Ala Glu Asn Thr Asn Trp Asn Ala Gln
65 70 75 80
Arg Gly Asp Ile Phe Ile Trp Gly Lys Arg Gly Ala Ser Ala Gly Ala
85 90 95
Phe Gly His Thr Gly Met Phe Val Asp Pro Asp Asn Ile Ile His Cys
100 105 110
Asn Tyr Gly Tyr Asn Ser Ile Thr Val Asn Asn His Asp Glu Ile Trp
115 120 125
Gly Tyr Asn Gly Gln Pro Tyr Val Tyr Ala Tyr Arg Tyr Ala Arg Lys
130 135 140
Gln Ser Asn Ala Lys Val Asp Asn Gln Ser Val Val Ser Lys Phe Glu
145 150 155 160
Lys Glu Leu Asp Val Asn Thr Pro Leu Ser Asn Ser Asn Met Pro Tyr
165 170 175
Tyr Glu Ala Thr Ile Ser Glu Asp Tyr Tyr Val Glu Ser Lys Pro Asp
180 185 190
Val Asn Ser Thr Asp Lys Glu Leu Leu Val Ala Gly Thr Arg Val Arg
195 200 205
Val Tyr Glu Lys Val Lys Gly Trp Ala Arg Ile Gly Ala Pro Gln Ser
210 215 220
Asn Gln Trp Val Glu Asp Ala Tyr Leu Ile Asp Ala Thr Asp Met
225 230 235
<210> 62
<211> 468
<212> PRT
<213> λSa2原噬菌体
<400> 62
Met Glu Ile Asn Thr Glu Ile Ala Ile Ala Trp Met Ser Ala Arg Gln
1 5 10 15
Gly Lys Val Ser Tyr Ser Met Asp Tyr Arg Asp Gly Pro Asn Ser Tyr
20 25 30
Asp Cys Ser Ser Ser Val Tyr Tyr Ala Leu Arg Ser Ala Gly Ala Ser
35 40 45
Ser Ala Gly Trp Ala Val Asn Thr Glu Tyr Met His Asp Trp Leu Ile
50 55 60
Lys Asn Gly Tyr Glu Leu Ile Ala Glu Asn Val Asp Trp Asn Ala Val
65 70 75 80
Arg Gly Asp Ile Ala Ile Trp Gly Met Arg Gly His Ser Ser Gly Ala
85 90 95
Gly Gly His Val Val Met Phe Ile Asp Pro Glu Asn Ile Ile His Cys
100 105 110
Asn Trp Ala Asn Asn Gly Ile Thr Val Asn Asn Tyr Asn Gln Thr Ala
115 120 125
Ala Ala Ser Gly Trp Met Tyr Cys Tyr Val Tyr Arg Leu Lys Ser Gly
130 135 140
Ala Ser Thr Gln Gly Lys Ser Leu Asp Thr Leu Val Lys Glu Thr Leu
145 150 155 160
Ala Gly Asn Tyr Gly Asn Gly Glu Ala Arg Lys Ala Val Leu Gly Asn
165 170 175
Gln Tyr Glu Ala Val Met Ser Val Ile Asn Gly Lys Thr Thr Thr Asn
180 185 190
Gln Lys Thr Val Asp Gln Leu Val Gln Glu Val Ile Ala Gly Lys His
195 200 205
Gly Asn Gly Glu Ala Arg Lys Lys Ser Leu Gly Ser Gln Tyr Asp Ala
210 215 220
Val Gln Lys Arg Val Thr Glu Leu Leu Lys Lys Gln Pro Ser Glu Pro
225 230 235 240
Phe Lys Ala Gln Glu Val Asn Lys Pro Thr Glu Thr Lys Thr Ser Gln
245 250 255
Thr Glu Leu Thr Gly Gln Ala Thr Ala Thr Lys Glu Glu Gly Asp Leu
260 265 270
Ser Phe Asn Gly Thr Ile Leu Lys Lys Ala Val Leu Asp Lys Ile Leu
275 280 285
Gly Asn Cys Lys Lys His Asp Ile Leu Pro Ser Tyr Ala Leu Thr Ile
290 295 300
Leu His Tyr Glu Gly Leu Trp Gly Thr Ser Ala Val Gly Lys Ala Asp
305 310 315 320
Asn Asn Trp Gly Gly Met Thr Trp Thr Gly Gln Gly Asn Arg Pro Ser
325 330 335
Gly Val Thr Val Thr Gln Gly Ser Ala Arg Pro Ser Asn Glu Gly Gly
340 345 350
His Tyr Met His Tyr Ala Ser Val Asp Asp Phe Leu Thr Asp Trp Phe
355 360 365
Tyr Leu Leu Arg Ala Gly Gly Ser Tyr Lys Val Ser Gly Ala Lys Thr
370 375 380
Phe Ser Glu Ala Ile Lys Gly Met Phe Lys Val Gly Gly Ala Val Tyr
385 390 395 400
Asp Tyr Ala Ala Ser Gly Phe Asp Ser Tyr Ile Val Gly Ala Ser Ser
405 410 415
Arg Leu Lys Ala Ile Glu Ala Glu Asn Gly Ser Leu Asp Lys Phe Asp
420 425 430
Lys Ala Thr Asp Ile Gly Asp Gly Ser Lys Asp Lys Ile Asp Ile Thr
435 440 445
Ile Glu Gly Ile Glu Val Thr Ile Asn Gly Ile Thr Tyr Glu Leu Thr
450 455 460
Lys Lys Pro Val
465
<210> 63
<211> 236
<212> PRT
<213> (ATCC700407) 原噬菌体
<400> 63
Met Thr Asp Ser Ile Gln Glu Met Arg Lys Leu Gln Ser Ile Pro Val
1 5 10 15
Arg Tyr Asp Met Gly Asp Arg Tyr Gly Asn Asp Ala Asp Arg Asp Gly
20 25 30
Arg Ile Glu Met Asp Cys Ser Ser Ala Val Ser Lys Ala Leu Gly Ile
35 40 45
Ser Met Thr Asn Asn Thr Glu Thr Leu Gln Gln Ala Leu Pro Ala Ile
50 55 60
Gly Tyr Gly Lys Ile His Asp Ala Val Asp Gly Thr Phe Asp Met Gln
65 70 75 80
Ala Tyr Asp Val Ile Ile Trp Ala Pro Arg Asp Gly Ser Ser Ser Leu
85 90 95
Gly Ala Phe Gly His Val Leu Ile Ala Thr Ser Pro Thr Thr Ala Ile
100 105 110
His Cys Asn Tyr Gly Ser Asp Gly Ile Thr Glu Asn Asp Tyr Asn Tyr
115 120 125
Ile Trp Glu Ile Asn Gly Arg Pro Arg Glu Ile Val Phe Arg Lys Gly
130 135 140
Val Thr Gln Thr Gln Ala Thr Val Thr Ser Gln Phe Glu Arg Glu Leu
145 150 155 160
Asp Val Asn Ala Arg Leu Thr Val Ser Asp Lys Pro Tyr Tyr Glu Ala
165 170 175
Thr Leu Ser Glu Asp Tyr Tyr Val Glu Ala Gly Pro Arg Ile Asp Ser
180 185 190
Gln Asp Lys Glu Leu Ile Lys Ala Gly Thr Arg Val Arg Val Tyr Glu
195 200 205
Lys Leu Asn Gly Trp Ser Arg Ile Asn His Pro Glu Ser Ala Gln Trp
210 215 220
Val Glu Asp Ser Tyr Leu Val Asp Ala Thr Glu Met
225 230 235
<210> 64
<211> 481
<212> PRT
<213> Phi11和Phi12
<400> 64
Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys Asn Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Thr
1 5 10 15
Ser Glu Gly Lys Gln Phe Asn Val Asp Leu Trp Tyr Gly Phe Gln Cys
20 25 30
Phe Asp Tyr Ala Asn Ala Gly Trp Lys Val Leu Phe Gly Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Gly Leu Gly Ala Lys Asp Ile Pro Phe Ala Asn Asn Phe Asp Gly
50 55 60
Leu Ala Thr Val Tyr Gln Asn Thr Pro Asp Phe Leu Ala Gln Pro Gly
65 70 75 80
Asp Met Val Val Phe Gly Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Tyr Gly His Val
85 90 95
Ala Trp Val Ile Glu Ala Thr Leu Asp Tyr Ile Ile Val Tyr Glu Gln
100 105 110
Asn Trp Leu Gly Gly Gly Trp Thr Asp Gly Ile Glu Gln Pro Gly Trp
115 120 125
Gly Trp Glu Lys Val Thr Arg Arg Gln His Ala Tyr Asp Phe Pro Met
130 135 140
Trp Phe Ile Arg Pro Asn Phe Lys Ser Glu Thr Ala Pro Arg Ser Val
145 150 155 160
Gln Ser Pro Thr Gln Ala Pro Lys Lys Glu Thr Ala Lys Pro Gln Pro
165 170 175
Lys Ala Val Glu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Val Val Lys Gly Tyr Asp
180 185 190
Leu Pro Lys Arg Gly Ser Asn Pro Lys Gly Ile Val Ile His Asn Asp
195 200 205
Ala Gly Ser Lys Gly Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Gly Leu Val
210 215 220
Asn Ala Pro Leu Ser Arg Leu Glu Ala Gly Ile Ala His Ser Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gly Asn Thr Val Trp Gln Ala Leu Asp Glu Ser Gln Val Gly Trp
245 250 255
His Thr Ala Asn Gln Ile Gly Asn Lys Tyr Tyr Tyr Gly Ile Glu Val
260 265 270
Cys Gln Ser Met Gly Ala Asp Asn Ala Thr Phe Leu Lys Asn Glu Gln
275 280 285
Ala Thr Phe Gln Glu Cys Ala Arg Leu Leu Lys Lys Trp Gly Leu Pro
290 295 300
Ala Asn Arg Asn Thr Ile Arg Leu His Asn Glu Phe Thr Ser Thr Ser
305 310 315 320
Cys Pro His Arg Ser Ser Val Leu His Thr Gly Phe Asp Pro Val Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Leu Pro Glu Asp Lys Arg Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe
340 345 350
Ile Lys Gln Ile Arg Ala Tyr Met Asp Gly Lys Ile Pro Val Ala Thr
355 360 365
Val Ser Asn Glu Ser Ser Ala Ser Ser Asn Thr Val Lys Pro Val Ala
370 375 380
Ser Ala Trp Lys Arg Asn Lys Tyr Gly Thr Tyr Tyr Met Glu Glu Ser
385 390 395 400
Ala Arg Phe Thr Asn Gly Asn Gln Pro Ile Thr Val Arg Lys Val Gly
405 410 415
Pro Phe Leu Ser Cys Pro Val Gly Tyr Gln Phe Gln Pro Gly Gly Tyr
420 425 430
Cys Asp Tyr Thr Glu Val Met Leu Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly
435 440 445
Tyr Thr Trp Glu Gly Gln Arg Tyr Tyr Leu Pro Ile Arg Thr Trp Asn
450 455 460
Gly Ser Ala Pro Pro Asn Gln Ile Leu Gly Asp Leu Trp Gly Glu Ile
465 470 475 480
Ser
<210> 65
<211> 481
<212> PRT
<213> (Phi)H5
<400> 65
Met Gln Ala Lys Leu Thr Lys Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Thr
1 5 10 15
Ser Glu Gly Lys Gln Tyr Asn Ala Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Gln Cys
20 25 30
Phe Asp Tyr Ala Asn Ala Gly Trp Lys Ala Leu Phe Gly Leu Leu Leu
35 40 45
Lys Gly Val Gly Ala Lys Asp Ile Pro Phe Ala Asn Asn Phe Asp Gly
50 55 60
Leu Ala Thr Val Tyr Gln Asn Thr Pro Asp Phe Leu Ala Gln Pro Gly
65 70 75 80
Asp Met Val Val Phe Gly Ser Asn Tyr Gly Ala Gly Tyr Gly His Val
85 90 95
Ala Trp Val Ile Glu Ala Thr Leu Asp Tyr Ile Ile Val Tyr Glu Gln
100 105 110
Asn Trp Leu Gly Gly Gly Trp Thr Asp Gly Val Gln Gln Pro Gly Ser
115 120 125
Gly Trp Glu Lys Val Thr Arg Arg Gln His Ala Tyr Asp Phe Pro Met
130 135 140
Trp Phe Ile Arg Pro Asn Phe Lys Ser Glu Thr Ala Pro Arg Ser Val
145 150 155 160
Gln Ser Pro Thr Gln Ala Ser Lys Lys Glu Thr Ala Lys Pro Gln Pro
165 170 175
Lys Ala Val Glu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Val Val Lys Gly Tyr Asp
180 185 190
Leu Pro Lys Arg Gly Ser Asn Pro Asn Phe Ile Val Ile His Asn Asp
195 200 205
Ala Gly Ser Lys Gly Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Asn Gly Leu Val
210 215 220
Asn Ala Pro Leu Ser Arg Leu Glu Ala Gly Ile Ala His Ser Tyr Val
225 230 235 240
Ser Gly Asn Thr Val Trp Gln Ala Leu Asp Glu Ser Gln Val Gly Trp
245 250 255
His Thr Ala Asn Gln Ile Gly Asn Lys Tyr Gly Tyr Gly Ile Glu Val
260 265 270
Cys Gln Ser Met Gly Ala Asp Asn Ala Thr Phe Leu Lys Asn Glu Gln
275 280 285
Ala Thr Phe Gln Glu Cys Ala Arg Leu Leu Lys Lys Trp Gly Leu Pro
290 295 300
Ala Asn Arg Asn Thr Ile Arg Leu His Asn Glu Phe Thr Ser Thr Ser
305 310 315 320
Cys Pro His Arg Ser Ser Val Leu His Thr Gly Phe Asp Pro Val Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Leu Pro Glu Asp Lys Arg Leu Gln Leu Lys Asp Tyr Phe
340 345 350
Ile Lys Gln Ile Arg Ala Tyr Met Asp Gly Lys Ile Pro Val Ala Thr
355 360 365
Val Ser Asn Asp Ser Ser Ala Ser Ser Asn Thr Val Lys Pro Val Ala
370 375 380
Ser Ala Trp Lys Arg Asn Lys Tyr Gly Thr Tyr Tyr Met Glu Glu Ser
385 390 395 400
Ala Arg Phe Thr Asn Gly Asn Gln Pro Ile Thr Val Arg Lys Val Gly
405 410 415
Pro Phe Leu Ser Cys Pro Val Gly Tyr Gln Phe Gln Pro Gly Gly Tyr
420 425 430
Cys Asp Tyr Thr Glu Val Met Leu Gln Asp Gly His Val Trp Val Gly
435 440 445
Tyr Thr Trp Glu Gly Gln Arg Tyr Tyr Leu Pro Ile Arg Thr Trp Asn
450 455 460
Gly Ser Ala Pro Pro Asn Gln Ile Leu Gly Asp Leu Trp Gly Glu Ile
465 470 475 480
Ser
<210> 66
<211> 477
<212> PRT
<213> (Phi)WMY
<400> 66
Met Lys Thr Lys Ala Gln Ala Lys Ser Trp Ile Asn Ser Lys Ile Gly
1 5 10 15
Lys Gly Ile Asp Trp Asp Gly Met Tyr Gly Tyr Gln Cys Met Asp Glu
20 25 30
Ala Val Asp Tyr Ile His His Val Thr Asp Gly Lys Val Thr Met Trp
35 40 45
Gly Asn Ala Ile Asp Ala Pro Lys Asn Asn Phe Gln Gly Leu Cys Thr
50 55 60
Val Tyr Thr Asn Thr Pro Glu Phe Arg Pro Ala Tyr Gly Asp Val Ile
65 70 75 80
Val Trp Ser Tyr Gly Thr Phe Ala Thr Tyr Gly His Ile Ala Ile Val
85 90 95
Val Asn Pro Asp Pro Tyr Gly Asp Leu Gln Tyr Ile Thr Val Leu Glu
100 105 110
Gln Asn Trp Asn Gly Asn Gly Ile Tyr Lys Thr Glu Phe Ala Thr Ile
115 120 125
Arg Thr His Asp Tyr Thr Gly Val Ser His Phe Ile Arg Pro Lys Phe
130 135 140
Ala Asp Glu Val Lys Glu Thr Ala Lys Thr Val Asn Lys Leu Ser Val
145 150 155 160
Gln Lys Lys Ile Val Thr Pro Lys Asn Ser Val Glu Arg Ile Lys Asn
165 170 175
Tyr Val Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Asn Gly Glu His Tyr Glu Leu Tyr
180 185 190
Asn Arg Gly His Lys Pro Lys Gly Val Val Ile His Asn Thr Ala Gly
195 200 205
Thr Ala Ser Ala Thr Gln Glu Gly Gln Arg Leu Thr Asn Met Thr Phe
210 215 220
Gln Gln Leu Ala Asn Gly Val Ala His Val Tyr Ile Asp Lys Asn Thr
225 230 235 240
Ile Tyr Glu Thr Leu Pro Glu Asp Arg Ile Ala Trp His Val Ala Gln
245 250 255
Gln Tyr Gly Asn Thr Glu Phe Tyr Gly Ile Glu Val Cys Gly Ser Arg
260 265 270
Asn Thr Asp Lys Glu Gln Phe Leu Ala Asn Glu Gln Val Ala Phe Gln
275 280 285
Glu Ala Ala Arg Arg Leu Lys Ser Trp Gly Met Arg Ala Asn Arg Asn
290 295 300
Thr Val Arg Leu His His Thr Phe Ser Ser Thr Glu Cys Pro Asp Met
305 310 315 320
Ser Met Leu Leu His Thr Gly Tyr Ser Met Lys Asn Gly Lys Pro Thr
325 330 335
Gln Asp Ile Thr Asn Lys Cys Ala Asp Tyr Phe Met Lys Gln Ile Asn
340 345 350
Ala Tyr Ile Asp Gly Lys Gln Pro Thr Ser Thr Val Val Gly Ser Ser
355 360 365
Ser Ser Asn Lys Leu Lys Ala Lys Asn Lys Asp Lys Ser Thr Gly Trp
370 375 380
Asn Thr Asn Glu Tyr Gly Thr Leu Trp Lys Lys Glu His Ala Thr Phe
385 390 395 400
Thr Cys Gly Val Arg Gln Gly Ile Val Thr Arg Thr Thr Gly Pro Phe
405 410 415
Thr Ser Cys Pro Gln Ala Gly Val Leu Tyr Tyr Gly Gln Ser Val Asn
420 425 430
Tyr Asp Thr Val Cys Lys Gln Asp Gly Tyr Val Trp Ile Ser Trp Thr
435 440 445
Thr Ser Asp Gly Tyr Asp Val Trp Met Pro Ile Arg Thr Trp Asp Arg
450 455 460
Ser Thr Asp Lys Val Ser Glu Ile Trp Gly Thr Ile Ser
465 470 475
<210> 67
<211> 443
<212> PRT
<213> (Phi)NCTC 11261
<400> 67
Met Ala Thr Tyr Gln Glu Tyr Lys Ser Arg Ser Asn Gly Asn Ala Tyr
1 5 10 15
Asp Ile Asp Gly Ser Phe Gly Ala Gln Cys Trp Asp Gly Tyr Ala Asp
20 25 30
Tyr Cys Lys Tyr Leu Gly Leu Pro Tyr Ala Asn Cys Thr Asn Thr Gly
35 40 45
Tyr Ala Arg Asp Ile Trp Glu Gln Arg His Glu Asn Gly Ile Leu Asn
50 55 60
Tyr Phe Asp Glu Val Glu Val Met Gln Ala Gly Asp Val Ala Ile Phe
65 70 75 80
Met Val Val Asp Gly Val Thr Pro Tyr Ser His Val Ala Ile Phe Asp
85 90 95
Ser Asp Ala Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Phe Leu Gly Gln Asn Gln Gly
100 105 110
Gly Ala Asn Gly Ala Tyr Asn Ile Val Lys Ile Pro Tyr Ser Ala Thr
115 120 125
Tyr Pro Thr Ala Phe Arg Pro Lys Val Phe Lys Asn Ala Val Thr Val
130 135 140
Thr Gly Asn Ile Gly Leu Asn Lys Gly Asp Tyr Phe Ile Asp Val Ser
145 150 155 160
Ala Tyr Gln Gln Ala Asp Leu Thr Thr Thr Cys Gln Gln Ala Gly Thr
165 170 175
Thr Lys Thr Ile Ile Lys Val Ser Glu Ser Ile Ala Trp Leu Ser Asp
180 185 190
Arg His Gln Gln Gln Ala Asn Thr Ser Asp Pro Ile Gly Tyr Tyr His
195 200 205
Phe Gly Arg Phe Gly Gly Asp Ser Ala Leu Ala Gln Arg Glu Ala Asp
210 215 220
Leu Phe Leu Ser Asn Leu Pro Ser Lys Lys Val Ser Tyr Leu Val Ile
225 230 235 240
Asp Tyr Glu Asp Ser Ala Ser Ala Asp Lys Gln Ala Asn Thr Asn Ala
245 250 255
Val Ile Ala Phe Met Asp Lys Ile Ala Ser Ala Gly Tyr Lys Pro Ile
260 265 270
Tyr Tyr Ser Tyr Lys Pro Phe Thr Leu Asn Asn Ile Asp Tyr Gln Lys
275 280 285
Ile Ile Ala Lys Tyr Pro Asn Ser Ile Trp Ile Ala Gly Tyr Pro Asp
290 295 300
Tyr Glu Val Arg Thr Glu Pro Leu Trp Glu Phe Phe Pro Ser Met Asp
305 310 315 320
Gly Val Arg Trp Trp Gln Phe Thr Ser Val Gly Val Ala Gly Gly Leu
325 330 335
Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Ala Asp Asp Ser Ser Lys Met Asp Ile
340 345 350
Pro Lys Val Asp Lys Pro Gln Glu Leu Thr Phe Tyr Gln Lys Leu Ala
355 360 365
Thr Asn Thr Lys Leu Asp Asn Ser Asn Val Pro Tyr Tyr Glu Ala Thr
370 375 380
Leu Ser Thr Asp Tyr Tyr Val Glu Ser Lys Pro Asn Ala Ser Ser Ala
385 390 395 400
Asp Lys Glu Phe Ile Lys Ala Gly Thr Arg Val Arg Val Tyr Glu Lys
405 410 415
Val Asn Gly Trp Ser Arg Ile Asn His Pro Glu Ser Ala Gln Trp Val
420 425 430
Glu Asp Ser Tyr Leu Val Asn Ala Thr Asp Met
435 440
<210> 68
<211> 334
<212> PRT
<213> (Phi)FWLLm3
<400> 68
Met Val Lys Tyr Thr Val Glu Asn Lys Ile Ile Ala Gly Leu Pro Lys
1 5 10 15
Gly Lys Leu Lys Gly Ala Asn Phe Val Ile Ala His Glu Thr Ala Asn
20 25 30
Ser Lys Ser Thr Ile Asp Asn Glu Val Ser Tyr Met Thr Arg Asn Trp
35 40 45
Gln Asn Ala Phe Val Thr His Phe Val Gly Gly Gly Gly Arg Val Val
50 55 60
Gln Val Ala Asn Val Asn Tyr Val Ser Trp Gly Ala Gly Gln Tyr Ala
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Ser Tyr Ala Gln Val Glu Leu Cys Arg Thr Ser Asn Ala
85 90 95
Thr Thr Phe Lys Lys Asp Tyr Glu Val Tyr Cys Gln Leu Leu Val Asp
100 105 110
Leu Ala Lys Lys Ala Gly Ile Pro Ile Thr Leu Asp Ser Gly Ser Lys
115 120 125
Thr Ser Asp Lys Gly Ile Lys Ser His Lys Trp Val Ala Asp Lys Leu
130 135 140
Gly Gly Thr Thr His Gln Asp Pro Tyr Ala Tyr Leu Ser Ser Trp Gly
145 150 155 160
Ile Ser Lys Ala Gln Phe Ala Ser Asp Leu Ala Lys Val Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ala Lys Pro Ser Thr Pro Ser Thr Asn
180 185 190
Leu Asp Lys Leu Gly Leu Val Asp Tyr Met Asn Ala Lys Lys Met Asp
195 200 205
Ser Ser Tyr Ser Asn Arg Ala Lys Leu Ala Lys Gln Tyr Gly Ile Ala
210 215 220
Asn Tyr Ser Gly Thr Ala Ser Gln Asn Thr Thr Leu Leu Ser Lys Ile
225 230 235 240
Lys Gly Gly Ala Pro Lys Pro Ser Thr Pro Ala Pro Lys Pro Ser Thr
245 250 255
Ser Thr Ala Lys Lys Ile Tyr Phe Pro Pro Asn Lys Gly Asn Trp Ser
260 265 270
Val Tyr Pro Thr Asn Lys Ala Pro Val Lys Ala Asn Ala Ile Gly Ala
275 280 285
Ile Asn Pro Thr Lys Phe Gly Gly Leu Thr Tyr Thr Ile Gln Lys Asp
290 295 300
Arg Gly Asn Gly Val Tyr Glu Ile Gln Thr Asp Gln Phe Gly Arg Val
305 310 315 320
Gln Val Tyr Gly Ala Pro Ser Thr Gly Ala Val Ile Lys Lys
325 330
<210> 69
<211> 1278
<212> PRT
<213> (Phi)BPS13
<400> 69
Met Ala Lys Arg Glu Lys Tyr Ile Phe Asp Val Glu Ala Glu Val Gly
1 5 10 15
Lys Ala Ala Lys Ser Ile Lys Ser Leu Glu Ala Glu Leu Ser Lys Leu
20 25 30
Gln Lys Leu Asn Lys Glu Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asp Arg Thr Glu
35 40 45
Lys Glu Met Leu Ala Thr Leu Lys Ala Ala Lys Glu Val Asn Ala Glu
50 55 60
Tyr Gln Lys Met Gln Arg Ile Leu Lys Asp Leu Ser Lys Tyr Ser Gly
65 70 75 80
Lys Val Ser Arg Lys Glu Phe Asn Asp Ser Lys Val Ile Asn Asn Ala
85 90 95
Lys Thr Ser Val Gln Gly Gly Lys Val Thr Asp Ser Phe Gly Gln Met
100 105 110
Leu Lys Asn Met Glu Arg Gln Ile Asn Ser Val Asn Lys Gln Phe Asp
115 120 125
Asn His Arg Lys Ala Met Val Asp Arg Gly Gln Gln Tyr Thr Pro His
130 135 140
Leu Lys Thr Asn Arg Lys Asp Ser Gln Gly Asn Ser Asn Pro Ser Met
145 150 155 160
Met Gly Arg Asn Lys Ser Thr Thr Gln Asp Met Glu Lys Ala Val Asp
165 170 175
Lys Phe Leu Asn Gly Gln Asn Glu Ala Thr Thr Gly Leu Asn Gln Ala
180 185 190
Leu Tyr Gln Leu Lys Glu Ile Ser Lys Leu Asn Arg Arg Ser Glu Ser
195 200 205
Leu Ser Arg Arg Ala Ser Ala Ser Gly Tyr Met Ser Phe Gln Gln Tyr
210 215 220
Ser Asn Phe Thr Gly Asp Arg Arg Thr Val Gln Gln Thr Tyr Gly Gly
225 230 235 240
Leu Lys Thr Ala Asn Arg Glu Arg Val Leu Glu Leu Ser Gly Gln Ala
245 250 255
Thr Gly Ile Ser Lys Glu Leu Asp Arg Leu Asn Ser Lys Lys Gly Leu
260 265 270
Thr Ala Arg Glu Gly Glu Glu Arg Lys Lys Leu Met Arg Gln Leu Glu
275 280 285
Gly Ile Asp Ala Glu Leu Thr Ala Arg Lys Lys Leu Asn Ser Ser Leu
290 295 300
Asp Glu Thr Thr Ser Asn Met Glu Lys Phe Asn Gln Ser Leu Val Asp
305 310 315 320
Ala Gln Val Ser Val Lys Pro Glu Arg Gly Thr Met Arg Gly Met Met
325 330 335
Tyr Glu Arg Ala Pro Ala Ile Ala Leu Ala Ile Gly Gly Ala Ile Thr
340 345 350
Ala Thr Ile Gly Lys Leu Tyr Ser Glu Gly Gly Asn His Ser Lys Ala
355 360 365
Met Arg Pro Asp Glu Met Tyr Val Gly Gln Gln Thr Gly Ala Val Gly
370 375 380
Ala Asn Trp Arg Pro Asn Arg Thr Ala Thr Met Arg Ser Gly Leu Gly
385 390 395 400
Asn His Leu Gly Phe Thr Gly Gln Glu Met Met Glu Phe Gln Ser Asn
405 410 415
Tyr Leu Ser Ala Asn Gly Tyr His Gly Ala Glu Asp Met Lys Ala Ala
420 425 430
Thr Thr Gly Gln Ala Thr Phe Ala Arg Ala Thr Gly Leu Gly Ser Asp
435 440 445
Glu Val Lys Asp Phe Phe Asn Thr Ala Tyr Arg Ser Gly Gly Ile Asp
450 455 460
Gly Asn Gln Thr Lys Gln Phe Gln Asn Ala Phe Leu Gly Ala Met Lys
465 470 475 480
Gln Ser Gly Ala Val Gly Arg Glu Lys Asp Gln Leu Lys Ala Leu Asn
485 490 495
Gly Ile Leu Ser Ser Met Ser Gln Asn Arg Thr Val Ser Asn Gln Asp
500 505 510
Met Met Arg Thr Val Gly Leu Gln Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Val
515 520 525
Ala Ser Leu Gln Gly Thr Lys Gly Gly Ala Leu Met Glu Gln Leu Asp
530 535 540
Asn Gly Ile Arg Glu Gly Phe Asn Asp Pro Gln Met Arg Val Leu Phe
545 550 555 560
Gly Gln Gly Thr Lys Tyr Gln Gly Met Gly Gly Arg Ala Ala Leu Arg
565 570 575
Lys Gln Met Glu Lys Gly Ile Ser Asp Pro Asp Asn Leu Asn Thr Leu
580 585 590
Ile Asp Ala Ser Lys Ala Ser Ala Gly Gln Asp Pro Ala Glu Gln Ala
595 600 605
Glu Val Leu Ala Thr Leu Ala Ser Lys Met Gly Val Asn Met Ser Ser
610 615 620
Asp Gln Ala Arg Gly Leu Ile Asp Leu Gln Pro Ser Gly Lys Leu Thr
625 630 635 640
Lys Glu Asn Ile Asp Lys Val Met Lys Glu Gly Leu Lys Glu Gly Ser
645 650 655
Ile Glu Ser Ala Lys Arg Asp Lys Ala Tyr Ser Glu Ser Lys Ala Ser
660 665 670
Ile Asp Asn Ser Ser Glu Ala Ala Thr Ala Lys Gln Ala Thr Glu Leu
675 680 685
Asn Asp Met Gly Ser Lys Leu Arg Gln Ala Asn Ala Ala Leu Gly Gly
690 695 700
Leu Pro Ala Pro Leu Tyr Thr Ala Ile Ala Ala Val Val Ala Phe Thr
705 710 715 720
Ala Ala Val Ala Gly Ser Ala Leu Met Phe Lys Gly Ala Ser Trp Leu
725 730 735
Lys Gly Gly Met Ala Ser Lys Tyr Gly Gly Lys Gly Gly Lys Gly Gly
740 745 750
Lys Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala
755 760 765
Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Val Gly Ala Ala Ala
770 775 780
Ala Gly Glu Val Gly Ala Gly Val Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Gly
785 790 795 800
Ala Ala Ala Gly Gly Ser Lys Leu Ala Gly Val Gly Lys Gly Phe Met
805 810 815
Lys Gly Ala Gly Lys Leu Met Leu Pro Leu Gly Ile Leu Met Gly Ala
820 825 830
Ser Glu Ile Met Gln Ala Pro Glu Glu Ala Lys Gly Ser Ala Ile Gly
835 840 845
Ser Ala Val Gly Gly Ile Gly Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ala Ala Thr
850 855 860
Gly Ala Ile Ala Gly Ser Phe Leu Gly Pro Ile Gly Thr Ala Val Gly
865 870 875 880
Gly Ile Ala Gly Gly Ile Ala Gly Gly Phe Ala Gly Ser Ser Leu Gly
885 890 895
Glu Thr Ile Gly Gly Trp Phe Asp Ser Gly Pro Lys Glu Asp Ala Ser
900 905 910
Ala Ala Asp Lys Ala Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ala Ala Leu Ala Ala
915 920 925
Ala Ala Gly Thr Ser Gly Ala Val Gly Ser Ser Ala Leu Gln Ser Gln
930 935 940
Met Ala Gln Gly Ile Thr Gly Ala Pro Asn Met Ser Gln Val Gly Ser
945 950 955 960
Met Ala Ser Ala Leu Gly Ile Ser Ser Gly Ala Met Ala Ser Ala Leu
965 970 975
Gly Ile Ser Ser Gly Gln Glu Asn Gln Ile Gln Thr Met Thr Asp Lys
980 985 990
Glu Asn Thr Asn Thr Lys Lys Ala Asn Glu Ala Lys Lys Gly Asp Asn
995 1000 1005
Leu Ser Tyr Glu Arg Glu Asn Ile Ser Met Tyr Glu Arg Val Leu
1010 1015 1020
Thr Arg Ala Glu Gln Ile Leu Ala Gln Ala Arg Ala Gln Asn Gly
1025 1030 1035
Ile Met Gly Val Gly Gly Gly Gly Thr Ala Gly Ala Gly Gly Gly
1040 1045 1050
Ile Asn Gly Phe Thr Gly Gly Gly Lys Leu Gln Phe Leu Ala Ala
1055 1060 1065
Gly Gln Lys Trp Ser Ser Ser Asn Leu Gln Gln His Asp Leu Gly
1070 1075 1080
Phe Thr Asp Gln Asn Leu Thr Ala Glu Asp Leu Asp Lys Trp Ile
1085 1090 1095
Asp Ser Lys Ala Pro Gln Gly Ser Met Met Arg Gly Met Gly Ala
1100 1105 1110
Thr Phe Leu Lys Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Leu Asp Pro Arg Tyr
1115 1120 1125
Leu Ile Ala His Ala Ala Glu Glu Ser Gly Trp Gly Thr Ser Lys
1130 1135 1140
Ile Ala Arg Asp Lys Gly Asn Phe Phe Gly Ile Gly Ala Phe Asp
1145 1150 1155
Asp Ser Pro Tyr Ser Ser Ala Tyr Glu Phe Lys Asp Gly Thr Gly
1160 1165 1170
Ser Ala Ala Glu Arg Gly Ile Met Gly Gly Ala Lys Trp Ile Ser
1175 1180 1185
Glu Lys Tyr Tyr Gly Lys Gly Asn Thr Thr Leu Asp Lys Met Lys
1190 1195 1200
Ala Ala Gly Tyr Ala Thr Asn Ala Ser Trp Ala Pro Asn Ile Ala
1205 1210 1215
Ser Ile Met Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Gly Ser Gly Asn Val
1220 1225 1230
Thr Ala Thr Ile Asn Val Asn Val Lys Gly Asp Glu Lys Val Ser
1235 1240 1245
Asp Lys Leu Lys Asn Ser Ser Asp Met Lys Lys Ala Gly Lys Asp
1250 1255 1260
Ile Gly Ser Leu Leu Gly Phe Tyr Ser Arg Glu Met Thr Ile Ala
1265 1270 1275
<210> 70
<211> 495
<212> PRT
<213> (Phi)GH15
<400> 70
Met Ala Lys Thr Gln Ala Glu Ile Asn Lys Arg Leu Asp Ala Tyr Ala
1 5 10 15
Lys Gly Thr Val Asp Ser Pro Tyr Arg Ile Lys Lys Ala Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp Pro Ser Phe Gly Val Met Glu Ala Gly Ala Ile Asp Ala Asp Gly
35 40 45
Tyr Tyr His Ala Gln Cys Gln Asp Leu Ile Thr Asp Tyr Val Leu Trp
50 55 60
Leu Thr Asp Asn Lys Val Arg Thr Trp Gly Asn Ala Lys Asp Gln Ile
65 70 75 80
Lys Gln Ser Tyr Gly Thr Gly Phe Lys Ile His Glu Asn Lys Pro Ser
85 90 95
Thr Val Pro Lys Lys Gly Trp Ile Ala Val Phe Thr Ser Gly Ser Tyr
100 105 110
Gln Gln Trp Gly His Ile Gly Ile Val Tyr Asp Gly Gly Asn Thr Ser
115 120 125
Thr Phe Thr Ile Leu Glu Gln Asn Trp Asn Gly Tyr Ala Asn Lys Lys
130 135 140
Pro Thr Lys Arg Val Asp Asn Tyr Tyr Gly Leu Thr His Phe Ile Glu
145 150 155 160
Ile Pro Val Lys Ala Gly Thr Thr Val Lys Lys Glu Thr Ala Lys Lys
165 170 175
Ser Ala Ser Lys Thr Pro Ala Pro Lys Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val
180 185 190
Ser Lys Asn His Ile Asn Tyr Thr Met Asp Lys Arg Gly Lys Lys Pro
195 200 205
Glu Gly Met Val Ile His Asn Asp Ala Gly Arg Ser Ser Gly Gln Gln
210 215 220
Tyr Glu Asn Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Ala Arg Tyr Ala Asn Gly
225 230 235 240
Ile Ala His Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Tyr Val Trp Glu Ala Ile Asp
245 250 255
Ala Lys Asn Gln Ile Ala Trp His Thr Gly Asp Gly Thr Gly Ala Asn
260 265 270
Ser Gly Asn Phe Arg Phe Ala Gly Ile Glu Val Cys Gln Ser Met Ser
275 280 285
Ala Ser Asp Ala Gln Phe Leu Lys Asn Glu Gln Ala Val Phe Gln Phe
290 295 300
Thr Ala Glu Lys Phe Lys Glu Trp Gly Leu Thr Pro Asn Arg Lys Thr
305 310 315 320
Val Arg Leu His Met Glu Phe Val Pro Thr Ala Cys Pro His Arg Ser
325 330 335
Met Val Leu His Thr Gly Phe Asn Pro Val Thr Gln Gly Arg Pro Ser
340 345 350
Gln Ala Ile Met Asn Lys Leu Lys Asp Tyr Phe Ile Lys Gln Ile Lys
355 360 365
Asn Tyr Met Asp Lys Gly Thr Ser Ser Ser Thr Val Val Lys Asp Gly
370 375 380
Lys Thr Ser Ser Ala Ser Thr Pro Ala Thr Arg Pro Val Thr Gly Ser
385 390 395 400
Trp Lys Lys Asn Gln Tyr Gly Thr Trp Tyr Lys Pro Glu Asn Ala Thr
405 410 415
Phe Val Asn Gly Asn Gln Pro Ile Val Thr Arg Ile Gly Ser Pro Phe
420 425 430
Leu Asn Ala Pro Val Gly Gly Asn Leu Pro Ala Gly Ala Thr Ile Val
435 440 445
Tyr Asp Glu Val Cys Ile Gln Ala Gly His Ile Trp Ile Gly Tyr Asn
450 455 460
Ala Tyr Asn Gly Asp Arg Val Tyr Cys Pro Val Arg Thr Cys Gln Gly
465 470 475 480
Val Pro Pro Asn His Ile Pro Gly Val Ala Trp Gly Val Phe Lys
485 490 495
<210> 71
<211> 264
<212> PRT
<213> (Phi)8074-B1
<400> 71
Met Lys Ile Gly Ile Asp Met Gly His Thr Leu Ser Gly Ala Asp Tyr
1 5 10 15
Gly Val Val Gly Leu Arg Pro Glu Ser Val Leu Thr Arg Glu Val Gly
20 25 30
Thr Lys Val Ile Tyr Lys Leu Gln Lys Leu Gly His Val Val Val Asn
35 40 45
Cys Thr Val Asp Lys Ala Ser Ser Val Ser Glu Ser Leu Tyr Thr Arg
50 55 60
Tyr Tyr Arg Ala Asn Gln Ala Asn Val Asp Leu Phe Ile Ser Ile His
65 70 75 80
Phe Asn Ala Thr Pro Gly Gly Thr Gly Thr Glu Val Tyr Thr Tyr Ala
85 90 95
Gly Arg Gln Leu Gly Glu Ala Thr Arg Ile Arg Gln Glu Phe Lys Ser
100 105 110
Leu Gly Leu Arg Asp Arg Gly Thr Lys Asp Gly Ser Gly Leu Ala Val
115 120 125
Ile Arg Asn Thr Lys Ala Lys Ala Met Leu Val Glu Cys Cys Phe Cys
130 135 140
Asp Asn Pro Asn Asp Met Lys Leu Tyr Asn Ser Glu Ser Phe Ser Asn
145 150 155 160
Ala Ile Val Lys Gly Ile Thr Gly Lys Leu Pro Asn Gly Glu Ser Gly
165 170 175
Asn Asn Asn Gln Gly Gly Asn Lys Val Lys Ala Val Val Ile Tyr Asn
180 185 190
Glu Gly Ala Asp Arg Arg Gly Ala Glu Tyr Leu Ala Asp Tyr Leu Asn
195 200 205
Cys Pro Thr Ile Ser Asn Ser Arg Thr Phe Asp Tyr Ser Cys Val Glu
210 215 220
His Val Tyr Ala Val Gly Gly Lys Lys Glu Gln Tyr Thr Lys Tyr Leu
225 230 235 240
Lys Thr Leu Leu Ser Gly Ala Asn Arg Tyr Asp Thr Met Gln Gln Ile
245 250 255
Leu Asn Phe Ile Asn Gly Gly Lys
260
<210> 72
<211> 209
<212> PRT
<213> (Phi)SPN1S
<400> 72
Met Asp Ile Asn Gln Phe Arg Arg Ala Ser Gly Ile Asn Glu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Ala Arg Trp Phe Pro His Ile Thr Thr Ala Met Asn Glu Phe Gly
20 25 30
Ile Thr Lys Pro Asp Asp Gln Ala Met Phe Ile Ala Gln Val Gly His
35 40 45
Glu Ser Gly Gly Phe Thr Arg Leu Gln Glu Asn Phe Asn Tyr Ser Val
50 55 60
Asn Gly Leu Ser Gly Phe Ile Arg Ala Gly Arg Ile Thr Pro Asp Gln
65 70 75 80
Ala Asn Ala Leu Gly Arg Lys Thr Tyr Glu Lys Ser Leu Pro Leu Glu
85 90 95
Arg Gln Arg Ala Ile Ala Asn Leu Val Tyr Ser Lys Arg Met Gly Asn
100 105 110
Asn Gly Pro Gly Asp Gly Trp Asn Tyr Arg Gly Arg Gly Leu Ile Gln
115 120 125
Ile Thr Gly Leu Asn Asn Tyr Arg Asp Cys Gly Asn Gly Leu Lys Val
130 135 140
Asp Leu Val Ala Gln Pro Glu Leu Leu Ala Gln Asp Glu Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Arg Ser Ala Ala Trp Phe Phe Ser Ser Lys Gly Cys Met Lys Tyr Thr
165 170 175
Gly Asp Leu Val Arg Val Thr Gln Ile Ile Asn Gly Gly Gln Asn Gly
180 185 190
Ile Asp Asp Arg Arg Thr Arg Tyr Ala Ala Ala Arg Lys Val Leu Ala
195 200 205
Leu
<210> 73
<211> 290
<212> PRT
<213> (Phi)CN77
<400> 73
Met Gly Tyr Trp Gly Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Pro Asn Asp Lys Met
1 5 10 15
Ala Leu Tyr Arg Gly Cys Leu Leu Arg Ala Asp Ala Ala Ala Gln Ala
20 25 30
Tyr Ala Leu Gln Asp Ala Tyr Thr Arg Ala Thr Gly Lys Pro Leu Val
35 40 45
Ile Leu Glu Gly Tyr Arg Asp Leu Thr Arg Gln Lys Tyr Leu Arg Asn
50 55 60
Leu Tyr Leu Ser Gly Arg Gly Asn Ile Ala Ala Val Pro Gly Leu Ser
65 70 75 80
Asn His Gly Trp Gly Leu Ala Cys Asp Phe Ala Ala Pro Leu Asn Ser
85 90 95
Ser Gly Ser Glu Glu His Arg Trp Met Arg Gln Asn Ala Pro Leu Phe
100 105 110
Gly Phe Asp Trp Ala Arg Gly Lys Ala Asp Asn Glu Pro Trp His Trp
115 120 125
Glu Tyr Gly Asn Val Pro Val Ser Arg Trp Ala Ser Leu Asp Val Thr
130 135 140
Pro Ile Asp Arg Asn Asp Met Ala Asp Ile Thr Glu Gly Gln Met Gln
145 150 155 160
Arg Ile Ala Val Ile Leu Leu Asp Thr Glu Ile Gln Thr Pro Leu Gly
165 170 175
Pro Arg Leu Val Lys His Ala Leu Gly Asp Ala Leu Leu Leu Gly Gln
180 185 190
Ala Asn Ala Asn Ser Ile Ala Glu Val Pro Asp Lys Thr Trp Asp Val
195 200 205
Leu Val Asp His Pro Leu Ala Lys Asn Glu Asp Gly Thr Pro Leu Lys
210 215 220
Val Arg Leu Gly Asp Val Ala Lys Tyr Glu Pro Leu Glu His Gln Asn
225 230 235 240
Thr Arg Asp Ala Ile Ala Lys Leu Gly Thr Leu Gln Phe Thr Asp Lys
245 250 255
Gln Leu Ala Thr Ile Gly Ala Gly Val Lys Pro Ile Asp Glu Ala Ser
260 265 270
Leu Val Lys Lys Ile Val Asp Gly Val Arg Ala Leu Phe Gly Arg Ala
275 280 285
Ala Ala
290
<210> 74
<211> 185
<212> PRT
<213> (Phi)AB2
<400> 74
Met Ile Leu Thr Lys Asp Gly Phe Ser Ile Ile Arg Asn Glu Leu Phe
1 5 10 15
Gly Gly Lys Leu Asp Gln Thr Gln Val Asp Ala Ile Asn Phe Ile Val
20 25 30
Ala Lys Ala Thr Glu Ser Gly Leu Thr Tyr Pro Glu Ala Ala Tyr Leu
35 40 45
Leu Ala Thr Ile Tyr His Glu Thr Gly Leu Pro Ser Gly Tyr Arg Thr
50 55 60
Met Gln Pro Ile Lys Glu Ala Gly Ser Asp Ser Tyr Leu Arg Ser Lys
65 70 75 80
Lys Tyr Tyr Pro Tyr Ile Gly Tyr Gly Tyr Val Gln Leu Thr Trp Lys
85 90 95
Glu Asn Tyr Glu Arg Ile Gly Lys Leu Ile Gly Val Asp Leu Ile Lys
100 105 110
Asn Pro Glu Lys Ala Leu Glu Pro Leu Ile Ala Ile Gln Ile Ala Ile
115 120 125
Lys Gly Met Leu Asn Gly Trp Phe Thr Gly Val Gly Phe Arg Arg Lys
130 135 140
Arg Pro Val Ser Lys Tyr Asn Lys Gln Gln Tyr Val Ala Ala Arg Asn
145 150 155 160
Ile Ile Asn Gly Lys Asp Lys Ala Glu Leu Ile Ala Lys Tyr Ala Ile
165 170 175
Ile Phe Glu Arg Ala Leu Arg Ser Leu
180 185
<210> 75
<211> 262
<212> PRT
<213> (Phi)B4
<400> 75
Met Ala Met Ala Leu Gln Thr Leu Ile Asp Lys Ala Asn Arg Lys Leu
1 5 10 15
Asn Val Ser Gly Met Arg Lys Asp Val Ala Asp Arg Thr Arg Ala Val
20 25 30
Ile Thr Gln Met His Ala Gln Gly Ile Tyr Ile Cys Val Ala Gln Gly
35 40 45
Phe Arg Ser Phe Ala Glu Gln Asn Ala Leu Tyr Ala Gln Gly Arg Thr
50 55 60
Lys Pro Gly Ser Ile Val Thr Asn Ala Arg Gly Gly Gln Ser Asn His
65 70 75 80
Asn Tyr Gly Val Ala Val Asp Leu Cys Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Ser
85 90 95
Asp Val Ile Trp Thr Val Glu Gly Asn Phe Arg Lys Val Ile Ala Ala
100 105 110
Met Lys Ala Gln Gly Phe Lys Trp Gly Gly Asp Trp Val Ser Phe Lys
115 120 125
Asp Tyr Pro His Phe Glu Leu Tyr Asp Val Val Gly Gly Gln Lys Pro
130 135 140
Pro Ala Asp Asn Gly Gly Ala Val Asp Asn Gly Gly Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Thr Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Gly Gly
165 170 175
Gly Tyr Asp Ser Ser Trp Phe Thr Lys Glu Thr Gly Thr Phe Val Thr
180 185 190
Asn Thr Ser Ile Lys Leu Arg Thr Ala Pro Phe Thr Ser Ala Asp Val
195 200 205
Ile Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser Pro Val Asn Tyr Asn Gly Phe Gly
210 215 220
Ile Glu Tyr Asp Gly Tyr Val Trp Ile Arg Gln Pro Arg Ser Asn Gly
225 230 235 240
Tyr Gly Tyr Leu Ala Thr Gly Glu Ser Lys Gly Gly Lys Arg Gln Asn
245 250 255
Tyr Trp Gly Thr Phe Lys
260
<210> 76
<211> 274
<212> PRT
<213> (Phi)CTP1
<400> 76
Met Lys Lys Ile Ala Asp Ile Ser Asn Leu Asn Gly Asn Val Asp Val
1 5 10 15
Lys Leu Leu Phe Asn Leu Gly Tyr Ile Gly Ile Ile Ala Lys Ala Ser
20 25 30
Glu Gly Gly Thr Phe Val Asp Lys Tyr Tyr Lys Gln Asn Tyr Thr Asn
35 40 45
Thr Lys Ala Gln Gly Lys Ile Thr Gly Ala Tyr His Phe Ala Asn Phe
50 55 60
Ser Thr Ile Ala Lys Ala Gln Gln Glu Ala Asn Phe Phe Leu Asn Cys
65 70 75 80
Ile Ala Gly Thr Thr Pro Asp Phe Val Val Leu Asp Leu Glu Gln Gln
85 90 95
Cys Thr Gly Asp Ile Thr Asp Ala Cys Leu Ala Phe Leu Asn Ile Val
100 105 110
Ala Lys Lys Phe Lys Cys Val Val Tyr Cys Asn Ser Ser Phe Ile Lys
115 120 125
Glu His Leu Asn Ser Lys Ile Cys Ala Tyr Pro Leu Trp Ile Ala Asn
130 135 140
Tyr Gly Val Ala Thr Pro Ala Phe Thr Leu Trp Thr Lys Tyr Ala Met
145 150 155 160
Trp Gln Phe Thr Glu Lys Gly Gln Val Ser Gly Ile Ser Gly Tyr Ile
165 170 175
Asp Phe Ser Tyr Ile Thr Asp Glu Phe Ile Lys Tyr Ile Lys Gly Glu
180 185 190
Asp Glu Val Glu Asn Leu Val Val Tyr Asn Asp Gly Ala Asp Gln Arg
195 200 205
Ala Ala Glu Tyr Leu Ala Asp Arg Leu Ala Cys Pro Thr Ile Asn Asn
210 215 220
Ala Arg Lys Phe Asp Tyr Ser Asn Val Lys Asn Val Tyr Ala Val Gly
225 230 235 240
Gly Asn Lys Glu Gln Tyr Thr Ser Tyr Leu Thr Thr Leu Ile Ala Gly
245 250 255
Ser Thr Arg Tyr Thr Thr Met Gln Ala Val Leu Asp Tyr Ile Lys Asn
260 265 270
Leu Lys
<210> 77
<211> 628
<212> PRT
<213> 葡萄球菌属（Staphylococcus） 病毒 187
<400> 77
Met Ala Leu Pro Lys Thr Gly Lys Pro Thr Ala Lys Gln Val Val Asp
1 5 10 15
Trp Ala Ile Asn Leu Ile Gly Ser Gly Val Asp Val Asp Gly Tyr Tyr
20 25 30
Gly Arg Gln Cys Trp Asp Leu Pro Asn Tyr Ile Phe Asn Arg Tyr Trp
35 40 45
Asn Phe Lys Thr Pro Gly Asn Ala Arg Asp Met Ala Trp Tyr Arg Tyr
50 55 60
Pro Glu Gly Phe Lys Val Phe Arg Asn Thr Ser Asp Phe Val Pro Lys
65 70 75 80
Pro Gly Asp Ile Ala Val Trp Thr Gly Gly Asn Tyr Asn Trp Asn Thr
85 90 95
Trp Gly His Thr Gly Ile Val Val Gly Pro Ser Thr Lys Ser Tyr Phe
100 105 110
Tyr Ser Val Asp Gln Asn Trp Asn Asn Ser Asn Ser Tyr Val Gly Ser
115 120 125
Pro Ala Ala Lys Ile Lys His Ser Tyr Phe Gly Val Thr His Phe Val
130 135 140
Arg Pro Ala Tyr Lys Ala Glu Pro Lys Pro Thr Pro Pro Ala Gln Asn
145 150 155 160
Asn Pro Ala Pro Lys Asp Pro Glu Pro Ser Lys Lys Pro Glu Ser Asn
165 170 175
Lys Pro Ile Tyr Lys Val Val Thr Lys Ile Leu Phe Thr Thr Ala His
180 185 190
Ile Glu His Val Lys Ala Asn Arg Phe Val His Tyr Ile Thr Lys Ser
195 200 205
Asp Asn His Asn Asn Lys Pro Asn Lys Ile Val Ile Lys Asn Thr Asn
210 215 220
Thr Ala Leu Ser Thr Ile Asp Val Tyr Arg Tyr Arg Asp Glu Leu Asp
225 230 235 240
Lys Asp Glu Ile Pro His Phe Phe Val Asp Arg Leu Asn Val Trp Ala
245 250 255
Cys Arg Pro Ile Glu Asp Ser Ile Asn Gly Tyr His Asp Ser Val Val
260 265 270
Leu Ser Ile Thr Glu Thr Arg Thr Ala Leu Ser Asp Asn Phe Lys Met
275 280 285
Asn Glu Ile Glu Cys Leu Ser Leu Ala Glu Ser Ile Leu Lys Ala Asn
290 295 300
Asn Lys Lys Met Ser Ala Ser Asn Ile Ile Val Asp Asn Lys Ala Trp
305 310 315 320
Arg Thr Phe Lys Leu His Thr Gly Lys Asp Ser Leu Lys Ser Ser Ser
325 330 335
Phe Thr Ser Lys Asp Tyr Gln Lys Ala Val Asn Glu Leu Ile Lys Leu
340 345 350
Phe Asn Asp Lys Asp Lys Leu Leu Asn Asn Lys Pro Lys Asp Val Val
355 360 365
Glu Arg Ile Arg Ile Arg Thr Ile Val Lys Glu Asn Thr Lys Phe Val
370 375 380
Pro Ser Glu Leu Lys Pro Arg Asn Asn Ile Arg Asp Lys Gln Asp Ser
385 390 395 400
Lys Ile Asp Arg Val Ile Asn Asn Tyr Thr Leu Lys Gln Ala Leu Asn
405 410 415
Ile Gln Tyr Lys Leu Asn Pro Lys Pro Gln Thr Ser Asn Gly Val Ser
420 425 430
Trp Tyr Asn Ala Ser Val Asn Gln Ile Lys Ser Ala Met Asp Thr Thr
435 440 445
Lys Ile Phe Asn Asn Asn Val Gln Val Tyr Gln Phe Leu Lys Leu Asn
450 455 460
Gln Tyr Gln Gly Ile Pro Val Asp Lys Leu Asn Lys Leu Leu Val Gly
465 470 475 480
Lys Gly Thr Leu Ala Asn Gln Gly His Ala Phe Ala Asp Gly Cys Lys
485 490 495
Lys Tyr Asn Ile Asn Glu Ile Tyr Leu Ile Ala His Arg Phe Leu Glu
500 505 510
Ser Ala Asn Gly Thr Ser Phe Phe Ala Ser Gly Lys Thr Gly Val Tyr
515 520 525
Asn Tyr Phe Gly Ile Gly Ala Phe Asp Asn Asn Pro Asn Asn Ala Met
530 535 540
Ala Phe Ala Arg Ser His Gly Trp Thr Ser Pro Thr Lys Ala Ile Ile
545 550 555 560
Gly Gly Ala Glu Phe Val Gly Lys Gly Tyr Phe Asn Val Gly Gln Asn
565 570 575
Thr Leu Tyr Arg Met Arg Trp Asn Pro Gln Lys Pro Gly Thr His Gln
580 585 590
Tyr Ala Thr Asp Ile Ser Trp Ala Lys Val Gln Ala Gln Met Ile Ser
595 600 605
Ala Met Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Thr Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Asp
610 615 620
Gln Tyr Lys Lys
625
<210> 78
<211> 291
<212> PRT
<213> (Phi)P35
<400> 78
Met Ala Arg Lys Phe Thr Lys Ala Glu Leu Val Ala Lys Ala Glu Lys
1 5 10 15
Lys Val Gly Gly Leu Lys Pro Asp Val Lys Lys Ala Val Leu Ser Ala
20 25 30
Val Lys Glu Ala Tyr Asp Arg Tyr Gly Ile Gly Ile Ile Val Ser Gln
35 40 45
Gly Tyr Arg Ser Ile Ala Glu Gln Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Gly Arg
50 55 60
Thr Lys Pro Gly Asn Ile Val Thr Asn Ala Lys Gly Gly Gln Ser Asn
65 70 75 80
His Asn Phe Gly Val Ala Val Asp Phe Ala Ile Asp Leu Ile Asp Asp
85 90 95
Gly Lys Ile Asp Ser Trp Gln Pro Ser Ala Thr Ile Val Asn Met Met
100 105 110
Lys Arg Arg Gly Phe Lys Trp Gly Gly Asp Trp Lys Ser Phe Thr Asp
115 120 125
Leu Pro His Phe Glu Ala Cys Asp Trp Tyr Arg Gly Glu Arg Lys Tyr
130 135 140
Lys Val Asp Thr Ser Glu Trp Lys Lys Lys Glu Asn Ile Asn Ile Val
145 150 155 160
Ile Lys Asp Val Gly Tyr Phe Gln Asp Lys Pro Gln Phe Leu Asn Ser
165 170 175
Lys Ser Val Arg Gln Trp Lys His Gly Thr Lys Val Lys Leu Thr Lys
180 185 190
His Asn Ser His Trp Tyr Thr Gly Val Val Lys Asp Gly Asn Lys Ser
195 200 205
Val Arg Gly Tyr Ile Tyr His Ser Met Ala Lys Val Thr Ser Lys Asn
210 215 220
Ser Asp Gly Ser Val Asn Ala Thr Ile Asn Ala His Ala Phe Cys Trp
225 230 235 240
Asp Asn Lys Lys Leu Asn Gly Gly Asp Phe Ile Asn Leu Lys Arg Gly
245 250 255
Phe Lys Gly Ile Thr His Pro Ala Ser Asp Gly Phe Tyr Pro Leu Tyr
260 265 270
Phe Ala Ser Arg Lys Lys Thr Phe Tyr Ile Pro Arg Tyr Met Phe Asp
275 280 285
Ile Lys Lys
290
<210> 79
<211> 342
<212> PRT
<213> (Phi)CP-7
<400> 79
Met Val Lys Lys Asn Asp Leu Phe Val Asp Val Ala Ser His Gln Gly
1 5 10 15
Tyr Asp Ile Ser Gly Ile Leu Glu Glu Ala Gly Thr Thr Asn Thr Ile
20 25 30
Ile Lys Val Ser Glu Ser Thr Ser Tyr Leu Asn Pro Cys Leu Ser Ala
35 40 45
Gln Val Ser Gln Ser Asn Pro Ile Gly Phe Tyr His Phe Ala Trp Phe
50 55 60
Gly Gly Asn Glu Glu Glu Ala Glu Ala Glu Ala Arg Tyr Phe Leu Asp
65 70 75 80
Asn Val Pro Thr Gln Val Lys Tyr Leu Val Leu Asp Tyr Glu Asp His
85 90 95
Ala Ser Ala Ser Val Gln Arg Asn Thr Thr Ala Cys Leu Arg Phe Met
100 105 110
Gln Ile Ile Ala Glu Ala Gly Tyr Thr Pro Ile Tyr Tyr Ser Tyr Lys
115 120 125
Pro Phe Thr Leu Asp Asn Val Asp Tyr Gln Gln Ile Leu Ala Gln Phe
130 135 140
Pro Asn Ser Leu Trp Ile Ala Gly Tyr Gly Leu Asn Asp Gly Thr Ala
145 150 155 160
Asn Phe Glu Tyr Phe Pro Ser Met Asp Gly Ile Arg Trp Trp Gln Tyr
165 170 175
Ser Ser Asn Pro Phe Asp Lys Asn Ile Val Leu Leu Asp Asp Glu Lys
180 185 190
Glu Asp Asn Ile Asn Asn Glu Asn Thr Leu Lys Ser Leu Thr Thr Val
195 200 205
Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly Gln Glu Arg Tyr
210 215 220
Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala Val Gln Asp Lys
225 230 235 240
Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp Leu Thr Thr Val
245 250 255
Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly Gln Glu Arg Tyr
260 265 270
Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala Val Gln Asp Lys
275 280 285
Val Asn Glu Ile Leu Asn Ala Arg Glu Ile Ala Asp Leu Thr Thr Val
290 295 300
Ala Asn Glu Val Ile Gln Gly Leu Trp Gly Asn Gly Gln Glu Arg Tyr
305 310 315 320
Asp Ser Leu Ala Asn Ala Gly Tyr Asp Pro Gln Ala Val Gln Asp Lys
325 330 335
Val Asn Glu Leu Leu Ser
340
<210> 80
<211> 328
<212> PRT
<213> (Phi)EFAP-1
<400> 80
Met Lys Leu Lys Gly Ile Leu Leu Ser Val Val Thr Thr Phe Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Gly Ala Thr Asn Val Gln Ala Tyr Glu Val Asn Asn Glu Phe
20 25 30
Asn Leu Gln Pro Trp Glu Gly Ser Gln Gln Leu Ala Tyr Pro Asn Lys
35 40 45
Ile Ile Leu His Glu Thr Ala Asn Pro Arg Ala Thr Gly Arg Asn Glu
50 55 60
Ala Thr Tyr Met Lys Asn Asn Trp Phe Asn Ala His Thr Thr Ala Ile
65 70 75 80
Val Gly Asp Gly Gly Ile Val Tyr Lys Val Ala Pro Glu Gly Asn Val
85 90 95
Ser Trp Gly Ala Gly Asn Ala Asn Pro Tyr Ala Pro Val Gln Ile Glu
100 105 110
Leu Gln His Thr Asn Asp Pro Glu Leu Phe Lys Ala Asn Tyr Lys Ala
115 120 125
Tyr Val Asp Tyr Thr Arg Asp Met Gly Lys Lys Phe Gly Ile Pro Met
130 135 140
Thr Leu Asp Gln Gly Gly Ser Leu Trp Glu Lys Gly Val Val Ser His
145 150 155 160
Gln Trp Val Thr Asp Phe Val Trp Gly Asp His Thr Asp Pro Tyr Gly
165 170 175
Tyr Leu Ala Lys Met Gly Ile Ser Lys Ala Gln Leu Ala His Asp Leu
180 185 190
Ala Asn Gly Val Ser Gly Asn Thr Ala Thr Pro Thr Pro Lys Pro Asp
195 200 205
Lys Pro Lys Pro Thr Gln Pro Ser Lys Pro Ser Asn Lys Lys Arg Phe
210 215 220
Asn Tyr Arg Val Asp Gly Leu Glu Tyr Val Asn Gly Met Trp Gln Ile
225 230 235 240
Tyr Asn Glu His Leu Gly Lys Ile Asp Phe Asn Trp Thr Glu Asn Gly
245 250 255
Ile Pro Val Glu Val Val Asp Lys Val Asn Pro Ala Thr Gly Gln Pro
260 265 270
Thr Lys Asp Gln Val Leu Lys Val Gly Asp Tyr Phe Asn Phe Gln Glu
275 280 285
Asn Ser Thr Gly Val Val Gln Glu Gln Thr Pro Tyr Met Gly Tyr Thr
290 295 300
Leu Ser His Val Gln Leu Pro Asn Glu Phe Ile Trp Leu Phe Thr Asp
305 310 315 320
Ser Lys Gln Ala Leu Met Tyr Gln
325
<210> 81
<211> 48
<212> PRT
<213> 智人
<400> 81
Ser Ser Leu Leu Glu Lys Gly Leu Asp Gly Ala Lys Lys Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Leu Gly Lys Leu Gly Lys Asp Ala Val Glu Asp Leu Glu Ser Val
20 25 30
Gly Lys Gly Ala Val His Asp Val Lys Asp Val Leu Asp Ser Val Leu
35 40 45
<210> 82
<211> 37
<212> PRT
<213> 刻克罗普斯蚕蛾（Hyalophora cecropia）
<400> 82
Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg
1 5 10 15
Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala
20 25 30
Thr Gln Ile Ala Lys
35
<210> 83
<211> 62
<212> PRT
<213> Drosophila teissieri
<400> 83
Met Lys Tyr Phe Ser Val Leu Val Val Leu Thr Leu Ile Leu Ala Ile
1 5 10 15
Val Asp Gln Ser Asp Ala Phe Ile Asn Leu Leu Asp Lys Val Glu Asp
20 25 30
Ala Leu His Thr Gly Ala Gln Ala Gly Phe Lys Leu Ile Arg Pro Val
35 40 45
Glu Arg Gly Ala Thr Pro Lys Lys Ser Glu Lys Pro Glu Lys
50 55 60
<210> 84
<211> 66
<212> PRT
<213> 家蚕（Bombyx mori）
<400> 84
Met Asn Ile Leu Lys Phe Phe Phe Val Phe Ile Val Ala Met Ser Leu
1 5 10 15
Val Ser Cys Ser Thr Ala Ala Pro Ala Lys Ile Pro Ile Lys Ala Ile
20 25 30
Lys Thr Val Gly Lys Ala Val Gly Lys Gly Leu Arg Ala Ile Asn Ile
35 40 45
Ala Ser Thr Ala Asn Asp Val Phe Asn Phe Leu Lys Pro Lys Lys Arg
50 55 60
Lys His
65
<210> 85
<211> 71
<212> PRT
<213> 地中海实蝇（Ceratitis capitata）
<400> 85
Met Ala Asn Leu Lys Ala Val Phe Leu Ile Cys Ile Val Ala Phe Ile
1 5 10 15
Ala Leu Gln Cys Val Val Ala Glu Pro Ala Ala Glu Asp Ser Val Val
20 25 30
Val Lys Arg Ser Ile Gly Ser Ala Leu Lys Lys Ala Leu Pro Val Ala
35 40 45
Lys Lys Ile Gly Lys Ile Ala Leu Pro Ile Ala Lys Ala Ala Leu Pro
50 55 60
Val Ala Ala Gly Leu Val Gly
65 70
<210> 86
<211> 53
<212> PRT
<213> 蜜蜂（Apis mellifera）
<400> 86
Met Lys Val Val Ile Phe Ile Phe Ala Leu Leu Ala Thr Ile Cys Ala
1 5 10 15
Ala Phe Ala Tyr Val Pro Leu Pro Asn Val Pro Gln Pro Gly Arg Arg
20 25 30
Pro Phe Pro Thr Phe Pro Gly Gln Gly Pro Phe Asn Pro Lys Ile Lys
35 40 45
Trp Pro Gln Gly Tyr
50
<210> 87
<211> 283
<212> PRT
<213> 蜜蜂（Apis mellifera）
<400> 87
Lys Asn Phe Ala Leu Ala Ile Leu Val Val Thr Phe Val Val Ala Val
1 5 10 15
Phe Gly Asn Thr Asn Leu Asp Pro Pro Thr Arg Pro Thr Arg Leu Arg
20 25 30
Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr
35 40 45
Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu
50 55 60
Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro
65 70 75 80
Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Leu Glu Ala Glu
85 90 95
Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Ser Gln Pro Arg Pro Pro His
100 105 110
Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn
115 120 125
Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg
130 135 140
Arg Glu Ala Glu Leu Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr
145 150 155 160
Ile Ser Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu
165 170 175
Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro
180 185 190
Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Pro Glu Ala Glu
195 200 205
Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His
210 215 220
Pro Arg Leu Arg Arg Glu Ala Glu Pro Glu Ala Glu Pro Gly Asn Asn
225 230 235 240
Arg Pro Val Tyr Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Leu Arg
245 250 255
Arg Glu Ala Lys Pro Glu Ala Lys Pro Gly Asn Asn Arg Pro Val Tyr
260 265 270
Ile Pro Gln Pro Arg Pro Pro His Pro Arg Ile
275 280
<210> 88
<211> 228
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 88
Met Glu Thr Gln Arg Ala Ser Leu Cys Leu Gly Arg Trp Ser Leu Trp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Val Pro Ser Ala Ser Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Tyr Arg Glu Ala Val Leu Arg Ala Val Asp Arg Leu Asn Glu Gln
35 40 45
Ser Ser Glu Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Asp Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Ala Asp Glu Asp Pro Gly Thr Pro Lys Pro Val Ser Phe Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Pro Thr Arg Arg Pro Pro Glu Leu Cys
85 90 95
Asp Phe Lys Glu Asn Gly Arg Val Lys Gln Cys Val Gly Thr Val Thr
100 105 110
Leu Asp Gln Ile Lys Asp Pro Leu Asp Ile Thr Cys Asn Glu Gly Val
115 120 125
Arg Arg Phe Pro Trp Trp Trp Pro Phe Leu Arg Arg Pro Arg Leu Arg
130 135 140
Arg Gln Ala Phe Pro Pro Pro Asn Val Pro Gly Pro Arg Phe Pro Pro
145 150 155 160
Pro Asn Val Pro Gly Pro Arg Phe Pro Pro Pro Asn Phe Pro Gly Pro
165 170 175
Arg Phe Pro Pro Pro Asn Phe Pro Gly Pro Arg Phe Pro Pro Pro Asn
180 185 190
Phe Pro Gly Pro Pro Phe Pro Pro Pro Ile Phe Pro Gly Pro Trp Phe
195 200 205
Pro Pro Pro Pro Pro Phe Arg Pro Pro Pro Phe Gly Pro Pro Arg Phe
210 215 220
Pro Gly Arg Arg
225
<210> 89
<211> 144
<212> PRT
<213> 普通黄牛（Bos taurus）
<400> 89
Met Gln Thr Gln Arg Ala Ser Leu Ser Leu Gly Arg Trp Ser Leu Trp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Gly Leu Val Val Pro Ser Ala Ser Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Tyr Arg Glu Ala Val Leu Arg Ala Val Asp Gln Leu Asn Glu Leu
35 40 45
Ser Ser Glu Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Pro
50 55 60
Lys Asp Asn Glu Asp Leu Gly Thr Arg Lys Pro Val Ser Phe Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Thr Ile Gln Gln Pro Ala Glu Gln Cys
85 90 95
Asp Phe Lys Glu Lys Gly Arg Val Lys Gln Cys Val Gly Thr Val Thr
100 105 110
Leu Asp Pro Ser Asn Asp Gln Phe Asp Leu Asn Cys Asn Glu Leu Gln
115 120 125
Ser Val Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg Gly
130 135 140
<210> 90
<211> 149
<212> PRT
<213> 野猪（Sus scrofa）
<400> 90
Met Glu Thr Gln Arg Ala Ser Leu Cys Leu Gly Arg Trp Ser Leu Trp
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Ala Leu Val Val Pro Ser Ala Ser Ala Gln Ala Leu
20 25 30
Ser Tyr Arg Glu Ala Val Leu Arg Ala Val Asp Arg Leu Asn Glu Gln
35 40 45
Ser Ser Glu Ala Asn Leu Tyr Arg Leu Leu Glu Leu Asp Gln Pro Pro
50 55 60
Lys Ala Asp Glu Asp Pro Gly Thr Pro Lys Pro Val Ser Phe Thr Val
65 70 75 80
Lys Glu Thr Val Cys Pro Arg Pro Thr Arg Gln Pro Pro Glu Leu Cys
85 90 95
Asp Phe Lys Glu Asn Gly Arg Val Lys Gln Cys Val Gly Thr Val Thr
100 105 110
Leu Asp Gln Ile Lys Asp Pro Leu Asp Ile Thr Cys Asn Glu Val Gln
115 120 125
Gly Val Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val
130 135 140
Cys Val Gly Arg Gly
145
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 南方鲎 ( Tachypleus gigas)
<400> 91
Lys Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Arg Cys
1 5 10 15
Arg
<210> 92
<211> 102
<212> PRT
<213> 冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)
<400> 92
Met Lys Cys Ala Thr Ile Val Cys Thr Ile Ala Val Val Leu Ala Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Gly Ser Val Gln Ala Ala Pro Gln Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Leu Ser Gly Gly Ala Asn Leu Asn Thr Leu Leu Asp Glu Leu Pro Glu
35 40 45
Glu Thr His His Ala Ala Leu Glu Asn Tyr Arg Ala Lys Arg Ala Thr
50 55 60
Cys Asp Leu Ala Ser Gly Phe Gly Val Gly Ser Ser Leu Cys Ala Ala
65 70 75 80
His Cys Ile Ala Arg Arg Tyr Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Ser Lys Ala
85 90 95
Val Cys Val Cys Arg Asn
100
<210> 93
<211> 70
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）
<400> 93
Met Met Gln Ile Lys Tyr Leu Phe Ala Leu Phe Ala Val Leu Met Leu
1 5 10 15
Val Val Leu Gly Ala Asn Glu Ala Asp Ala Asp Cys Leu Ser Gly Arg
20 25 30
Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn Glu Thr Cys Arg Arg Val
35 40 45
Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His Cys Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Cys Trp Cys Glu Gly Cys
65 70
<210> 94
<211> 63
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 94
Met Thr Lys Ile Val Val Phe Ile Tyr Val Val Ile Leu Leu Leu Thr
1 5 10 15
Ile Phe His Val Ser Ala Lys Lys Lys Arg Tyr Ile Glu Cys Glu Thr
20 25 30
His Glu Asp Cys Ser Gln Val Phe Met Pro Pro Phe Val Met Arg Cys
35 40 45
Val Ile His Glu Cys Lys Ile Phe Asn Gly Glu His Leu Arg Tyr
50 55 60
<210> 95
<211> 76
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 95
Met Ala Lys Ile Met Lys Phe Val Tyr Asn Met Ile Pro Phe Leu Ser
1 5 10 15
Ile Phe Ile Ile Thr Leu Gln Val Asn Val Val Val Cys Glu Ile Asp
20 25 30
Ala Asp Cys Pro Gln Ile Cys Met Pro Pro Tyr Glu Val Arg Cys Val
35 40 45
Asn His Arg Cys Gly Trp Val Asn Thr Asp Asp Ser Leu Phe Leu Thr
50 55 60
Gln Glu Phe Thr Arg Ser Lys Gln Tyr Ile Ile Ser
65 70 75
<210> 96
<211> 76
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 96
Met Tyr Lys Val Val Glu Ser Ile Phe Ile Arg Tyr Met His Arg Lys
1 5 10 15
Pro Asn Met Thr Lys Phe Phe Lys Phe Val Tyr Thr Met Phe Ile Leu
20 25 30
Ile Ser Leu Phe Leu Val Val Thr Asn Ala Asn Ala His Asn Cys Thr
35 40 45
Asp Ile Ser Asp Cys Ser Ser Asn His Cys Ser Tyr Glu Gly Val Ser
50 55 60
Leu Cys Met Asn Gly Gln Cys Ile Cys Ile Tyr Glu
65 70 75
<210> 97
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 97
Met Val Glu Thr Leu Arg Leu Phe Tyr Ile Met Ile Leu Phe Val Ser
1 5 10 15
Leu Cys Leu Val Val Val Asp Gly Glu Ser Lys Leu Glu Gln Thr Cys
20 25 30
Ser Glu Asp Phe Glu Cys Tyr Ile Lys Asn Pro His Val Pro Phe Gly
35 40 45
His Leu Arg Cys Phe Glu Gly Phe Cys Gln Gln Leu Asn Gly Pro Ala
50 55 60
<210> 98
<211> 67
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 98
Met Ala Lys Ile Val Asn Phe Val Tyr Ser Met Ile Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Thr Lys Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Cys Val Thr
20 25 30
Asp Ser His Cys Pro Pro His Met Cys Pro Pro Gly Met Glu Pro Arg
35 40 45
Cys Val Arg Arg Met Cys Lys Cys Leu Pro Ile Gly Trp Arg Lys Tyr
50 55 60
Phe Val Pro
65
<210> 99
<211> 96
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 99
Met Gln Ile Gly Lys Asn Met Val Glu Thr Pro Lys Leu Asp Tyr Val
1 5 10 15
Ile Ile Phe Phe Phe Leu Tyr Phe Phe Phe Arg Gln Met Ile Ile Leu
20 25 30
Arg Leu Asn Thr Thr Phe Arg Pro Leu Asn Phe Lys Met Leu Arg Phe
35 40 45
Trp Gly Gln Asn Arg Asn Ile Met Lys His Arg Gly Gln Lys Val His
50 55 60
Phe Ser Leu Ile Leu Ser Asp Cys Lys Thr Asn Lys Asp Cys Pro Lys
65 70 75 80
Leu Arg Arg Ala Asn Val Arg Cys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Pro Ile
85 90 95
<210> 100
<211> 65
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 100
Met Leu Arg Leu Tyr Leu Val Ser Tyr Phe Leu Leu Lys Arg Thr Leu
1 5 10 15
Leu Val Ser Tyr Phe Ser Tyr Phe Ser Thr Tyr Ile Ile Glu Cys Lys
20 25 30
Thr Asp Asn Asp Cys Pro Ile Ser Gln Leu Lys Ile Tyr Ala Trp Lys
35 40 45
Cys Val Lys Asn Gly Cys His Leu Phe Asp Val Ile Pro Met Met Tyr
50 55 60
Glu
65
<210> 101
<211> 79
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 101
Met Ala Glu Ile Leu Lys Phe Val Tyr Ile Val Ile Leu Phe Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ile Val Val Ala Ser Glu Arg Glu Cys Val Thr Asp Asp
20 25 30
Asp Cys Glu Lys Leu Tyr Pro Thr Asn Glu Tyr Arg Met Met Cys Asp
35 40 45
Ser Gly Tyr Cys Met Asn Leu Leu Asn Gly Lys Ile Ile Tyr Leu Leu
50 55 60
Cys Leu Lys Lys Lys Lys Phe Leu Ile Ile Ile Ser Val Leu Leu
65 70 75
<210> 102
<211> 95
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 102
Met Ala Glu Ile Ile Lys Phe Val Tyr Ile Met Ile Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ile Glu Val Ala Gly Glu Glu Cys Val Thr Asp Ala Asp
20 25 30
Cys Asp Lys Leu Tyr Pro Asp Ile Arg Lys Pro Leu Met Cys Ser Ile
35 40 45
Gly Glu Cys Tyr Ser Leu Tyr Lys Gly Lys Phe Ser Leu Ser Ile Ile
50 55 60
Ser Lys Thr Ser Phe Ser Leu Met Val Tyr Asn Val Val Thr Leu Val
65 70 75 80
Ile Cys Leu Arg Leu Ala Tyr Ile Ser Leu Leu Leu Lys Phe Leu
85 90 95
<210> 103
<211> 100
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 103
Met Ala Glu Ile Leu Lys Asp Phe Tyr Ala Met Asn Leu Phe Ile Phe
1 5 10 15
Leu Ile Ile Leu Pro Ala Lys Ile Arg Gly Glu Thr Leu Ser Leu Thr
20 25 30
His Pro Lys Cys His His Ile Met Leu Pro Ser Leu Phe Ile Thr Glu
35 40 45
Val Phe Gln Arg Val Thr Asp Asp Gly Cys Pro Lys Pro Val Asn His
50 55 60
Leu Arg Val Val Lys Cys Ile Glu His Ile Cys Glu Tyr Gly Tyr Asn
65 70 75 80
Tyr Arg Pro Asp Phe Ala Ser Gln Ile Pro Glu Ser Thr Lys Met Pro
85 90 95
Arg Lys Arg Glu
100
<210> 104
<211> 78
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 104
Met Val Glu Ile Leu Lys Asn Phe Tyr Ala Met Asn Leu Phe Ile Phe
1 5 10 15
Leu Ile Ile Leu Ala Val Lys Ile Arg Gly Ala His Phe Pro Cys Val
20 25 30
Thr Asp Asp Asp Cys Pro Lys Pro Val Asn Lys Leu Arg Val Ile Lys
35 40 45
Cys Ile Asp His Ile Cys Gln Tyr Ala Arg Asn Leu Pro Asp Phe Ala
50 55 60
Ser Glu Ile Ser Glu Ser Thr Lys Met Pro Cys Lys Gly Glu
65 70 75
<210> 105
<211> 72
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 105
Met Phe His Ala Gln Ala Glu Asn Met Ala Lys Val Ser Asn Phe Val
1 5 10 15
Cys Ile Met Ile Leu Phe Leu Ala Leu Phe Phe Ile Thr Met Asn Asp
20 25 30
Ala Ala Arg Phe Glu Cys Arg Glu Asp Ser His Cys Val Thr Arg Ile
35 40 45
Lys Cys Val Leu Pro Arg Lys Pro Glu Cys Arg Asn Tyr Ala Cys Gly
50 55 60
Cys Tyr Asp Ser Asn Lys Tyr Arg
65 70
<210> 106
<211> 78
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 106
Met Gln Met Arg Gln Asn Met Ala Thr Ile Leu Asn Phe Val Phe Val
1 5 10 15
Ile Ile Leu Phe Ile Ser Leu Leu Leu Val Val Thr Lys Gly Tyr Arg
20 25 30
Glu Pro Phe Ser Ser Phe Thr Glu Gly Pro Thr Cys Lys Glu Asp Ile
35 40 45
Asp Cys Pro Ser Ile Ser Cys Val Asn Pro Gln Val Pro Lys Cys Ile
50 55 60
Met Phe Glu Cys His Cys Lys Tyr Ile Pro Thr Thr Leu Lys
65 70 75
<210> 107
<211> 71
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 107
Met Ala Thr Ile Leu Met Tyr Val Tyr Ile Thr Ile Leu Phe Ile Ser
1 5 10 15
Ile Leu Thr Val Leu Thr Glu Gly Leu Tyr Glu Pro Leu Tyr Asn Phe
20 25 30
Arg Arg Asp Pro Asp Cys Arg Arg Asn Ile Asp Cys Pro Ser Tyr Leu
35 40 45
Cys Val Ala Pro Lys Val Pro Arg Cys Ile Met Phe Glu Cys His Cys
50 55 60
Lys Asp Ile Pro Ser Asp His
65 70
<210> 108
<211> 57
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 108
Met Thr Thr Ser Leu Lys Phe Val Tyr Val Ala Ile Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Val Met Gly Gly Ile Arg Arg Phe Glu Cys Arg Gln
20 25 30
Asp Ser Asp Cys Pro Ser Tyr Phe Cys Glu Lys Leu Thr Val Pro Lys
35 40 45
Cys Phe Trp Ser Lys Cys Tyr Cys Lys
50 55
<210> 109
<211> 57
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 109
Met Thr Thr Ser Leu Lys Phe Val Tyr Val Ala Ile Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Leu Leu Val Val Met Gly Gly Ile Arg Lys Lys Glu Cys Arg Gln
20 25 30
Asp Ser Asp Cys Pro Ser Tyr Phe Cys Glu Lys Leu Thr Ile Ala Lys
35 40 45
Cys Ile His Ser Thr Cys Leu Cys Lys
50 55
<210> 110
<211> 66
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 110
Met Gln Ile Gly Lys Asn Met Val Glu Thr Pro Lys Leu Val Tyr Phe
1 5 10 15
Ile Ile Leu Phe Leu Ser Ile Phe Leu Cys Ile Thr Val Ser Asn Ser
20 25 30
Ser Phe Ser Gln Ile Phe Asn Ser Ala Cys Lys Thr Asp Lys Asp Cys
35 40 45
Pro Lys Phe Gly Arg Val Asn Val Arg Cys Arg Lys Gly Asn Cys Val
50 55 60
Pro Ile
65
<210> 111
<211> 57
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 111
Met Thr Ala Ile Leu Lys Lys Phe Ile Asn Ala Val Phe Leu Phe Ile
1 5 10 15
Val Leu Phe Leu Ala Thr Thr Asn Val Glu Asp Phe Val Gly Gly Ser
20 25 30
Asn Asp Glu Cys Val Tyr Pro Asp Val Phe Gln Cys Ile Asn Asn Ile
35 40 45
Cys Lys Cys Val Ser His His Arg Thr
50 55
<210> 112
<211> 74
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 112
Met Gln Lys Arg Lys Asn Met Ala Gln Ile Ile Phe Tyr Val Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Ile Ile Leu Phe Ser Pro Phe Leu Ala Ala Arg Leu Val Phe Val
20 25 30
Asn Pro Glu Lys Pro Cys Val Thr Asp Ala Asp Cys Asp Arg Tyr Arg
35 40 45
His Glu Ser Ala Ile Tyr Ser Asp Met Phe Cys Lys Asp Gly Tyr Cys
50 55 60
Phe Ile Asp Tyr His His Asp Pro Tyr Pro
65 70
<210> 113
<211> 76
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 113
Met Gln Met Arg Lys Asn Met Ala Gln Ile Leu Phe Tyr Val Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ile Leu Phe Thr Pro Phe Leu Val Ala Arg Ile Met Val Val
20 25 30
Asn Pro Asn Asn Pro Cys Val Thr Asp Ala Asp Cys Gln Arg Tyr Arg
35 40 45
His Lys Leu Ala Thr Arg Met Ile Cys Asn Gln Gly Phe Cys Leu Met
50 55 60
Asp Phe Thr His Asp Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Pro
65 70 75
<210> 114
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 114
Met Asn His Ile Ser Lys Phe Val Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Ile Tyr Leu Val Val Leu Asp Gly Leu Pro Ile Ser Cys Lys Asp His
20 25 30
Phe Glu Cys Arg Arg Lys Ile Asn Ile Leu Arg Cys Ile Tyr Arg Gln
35 40 45
Glu Lys Pro Met Cys Ile Asn Ser Ile Cys Thr Cys Val Lys Leu Leu
50 55 60
<210> 115
<211> 67
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 115
Met Gln Arg Glu Lys Asn Met Ala Lys Ile Phe Glu Phe Val Tyr Ala
1 5 10 15
Met Ile Ile Phe Ile Leu Leu Phe Leu Val Glu Lys Asn Val Val Ala
20 25 30
Tyr Leu Lys Phe Glu Cys Lys Thr Asp Asp Asp Cys Gln Lys Ser Leu
35 40 45
Leu Lys Thr Tyr Val Trp Lys Cys Val Lys Asn Glu Cys Tyr Phe Phe
50 55 60
Ala Lys Lys
65
<210> 116
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 116
Met Ala Gly Ile Ile Lys Phe Val His Val Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe His Val Val Lys Asn Asp Asp Gly Ser Phe Cys Phe Lys Asp
20 25 30
Ser Asp Cys Pro Asp Glu Met Cys Pro Ser Pro Leu Lys Glu Met Cys
35 40 45
Tyr Phe Leu Gln Cys Lys Cys Gly Val Asp Thr Ile Ala
50 55 60
<210> 117
<211> 59
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 117
Met Ala Asn Thr His Lys Leu Val Ser Met Ile Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Phe Leu Ala Ser Asn Asn Val Glu Gly Tyr Val Asn Cys Glu Thr Asp
20 25 30
Ala Asp Cys Pro Pro Ser Thr Arg Val Lys Arg Phe Lys Cys Val Lys
35 40 45
Gly Glu Cys Arg Trp Thr Arg Met Ser Tyr Ala
50 55
<210> 118
<211> 63
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 118
Met Gln Arg Arg Lys Lys Lys Ala Gln Val Val Met Phe Val His Asp
1 5 10 15
Leu Ile Ile Cys Ile Tyr Leu Phe Ile Val Ile Thr Thr Arg Lys Thr
20 25 30
Asp Ile Arg Cys Arg Phe Tyr Tyr Asp Cys Pro Arg Leu Glu Tyr His
35 40 45
Phe Cys Glu Cys Ile Glu Asp Phe Cys Ala Tyr Ile Arg Leu Asn
50 55 60
<210> 119
<211> 57
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 119
Met Ala Lys Val Tyr Met Phe Val Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Val Ser
1 5 10 15
Pro Phe Leu Leu Ala Thr Phe Arg Thr Arg Leu Pro Cys Glu Lys Asp
20 25 30
Asp Asp Cys Pro Glu Ala Phe Leu Pro Pro Val Met Lys Cys Val Asn
35 40 45
Arg Phe Cys Gln Tyr Glu Ile Leu Glu
50 55
<210> 120
<211> 77
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 120
Met Ile Lys Gln Phe Ser Val Cys Tyr Ile Gln Met Arg Arg Asn Met
1 5 10 15
Thr Thr Ile Leu Lys Phe Pro Tyr Ile Met Val Ile Cys Leu Leu Leu
20 25 30
Leu His Val Ala Ala Tyr Glu Asp Phe Glu Lys Glu Ile Phe Asp Cys
35 40 45
Lys Lys Asp Gly Asp Cys Asp His Met Cys Val Thr Pro Gly Ile Pro
50 55 60
Lys Cys Thr Gly Tyr Val Cys Phe Cys Phe Glu Asn Leu
65 70 75
<210> 121
<211> 73
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 121
Met Gln Arg Ser Arg Asn Met Thr Thr Ile Phe Lys Phe Ala Tyr Ile
1 5 10 15
Met Ile Ile Cys Val Phe Leu Leu Asn Ile Ala Ala Gln Glu Ile Glu
20 25 30
Asn Gly Ile His Pro Cys Lys Lys Asn Glu Asp Cys Asn His Met Cys
35 40 45
Val Met Pro Gly Leu Pro Trp Cys His Glu Asn Asn Leu Cys Phe Cys
50 55 60
Tyr Glu Asn Ala Tyr Gly Asn Thr Arg
65 70
<210> 122
<211> 85
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 122
Met Thr Ile Ile Ile Lys Phe Val Asn Val Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe His Val Ala Lys Asn Asp Asp Asn Lys Leu Leu Leu Ser Phe
20 25 30
Ile Glu Glu Gly Phe Leu Cys Phe Lys Asp Ser Asp Cys Pro Tyr Asn
35 40 45
Met Cys Pro Ser Pro Leu Lys Glu Met Cys Tyr Phe Ile Lys Cys Val
50 55 60
Cys Gly Val Tyr Gly Pro Ile Arg Glu Arg Arg Leu Tyr Gln Ser His
65 70 75 80
Asn Pro Met Ile Gln
85
<210> 123
<211> 69
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 123
Met Arg Lys Asn Met Thr Lys Ile Leu Met Ile Gly Tyr Ala Leu Met
1 5 10 15
Ile Phe Ile Phe Leu Ser Ile Ala Val Ser Ile Thr Gly Asn Leu Ala
20 25 30
Arg Ala Ser Arg Lys Lys Pro Val Asp Val Ile Pro Cys Ile Tyr Asp
35 40 45
His Asp Cys Pro Arg Lys Leu Tyr Phe Leu Glu Arg Cys Val Gly Arg
50 55 60
Val Cys Lys Tyr Leu
65
<210> 124
<211> 58
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 124
Met Ala His Lys Leu Val Tyr Ala Ile Thr Leu Phe Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Ile Ala Asn Asn Ile Glu Asp Asp Ile Phe Cys Ile Thr Asp Asn
20 25 30
Asp Cys Pro Pro Asn Thr Leu Val Gln Arg Tyr Arg Cys Ile Asn Gly
35 40 45
Lys Cys Asn Leu Ser Phe Val Ser Tyr Gly
50 55
<210> 125
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 125
Met Asp Glu Thr Leu Lys Phe Val Tyr Ile Leu Ile Leu Phe Val Ser
1 5 10 15
Leu Cys Leu Val Val Ala Asp Gly Val Lys Asn Ile Asn Arg Glu Cys
20 25 30
Thr Gln Thr Ser Asp Cys Tyr Lys Lys Tyr Pro Phe Ile Pro Trp Gly
35 40 45
Lys Val Arg Cys Val Lys Gly Arg Cys Arg Leu Asp Met
50 55 60
<210> 126
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 126
Met Ala Lys Ile Ile Lys Phe Val Tyr Val Leu Ala Ile Phe Phe Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Lys Asn Val Asn Gly Trp Thr Cys Val Glu Asp
20 25 30
Ser Asp Cys Pro Ala Asn Ile Cys Gln Pro Pro Met Gln Arg Met Cys
35 40 45
Phe Tyr Gly Glu Cys Ala Cys Val Arg Ser Lys Phe Cys Thr
50 55 60
<210> 127
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 127
Met Val Lys Ile Ile Lys Phe Val Tyr Phe Met Thr Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Met Leu Leu Val Thr Thr Lys Glu Asp Gly Ser Val Glu Cys Ile Ala
20 25 30
Asn Ile Asp Cys Pro Gln Ile Phe Met Leu Pro Phe Val Met Arg Cys
35 40 45
Ile Asn Phe Arg Cys Gln Ile Val Asn Ser Glu Asp Thr
50 55 60
<210> 128
<211> 67
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 128
Met Asp Glu Ile Leu Lys Phe Val Tyr Thr Leu Ile Ile Phe Phe Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Ala Ala Asn Asn Val Asp Ala Asn Ile Met Asn Cys Gln
20 25 30
Ser Thr Phe Asp Cys Pro Arg Asp Met Cys Ser His Ile Arg Asp Val
35 40 45
Ile Cys Ile Phe Lys Lys Cys Lys Cys Ala Gly Gly Arg Tyr Met Pro
50 55 60
Gln Val Pro
65
<210> 129
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 129
Met Gln Arg Arg Lys Asn Met Ala Asn Asn His Met Leu Ile Tyr Ala
1 5 10 15
Met Ile Ile Cys Leu Phe Pro Tyr Leu Val Val Thr Phe Lys Thr Ala
20 25 30
Ile Thr Cys Asp Cys Asn Glu Asp Cys Leu Asn Phe Phe Thr Pro Leu
35 40 45
Asp Asn Leu Lys Cys Ile Asp Asn Val Cys Glu Val Phe Met
50 55 60
<210> 130
<211> 65
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 130
Met Val Asn Ile Leu Lys Phe Ile Tyr Val Ile Ile Phe Phe Ile Leu
1 5 10 15
Met Phe Phe Val Leu Ile Asp Val Asp Gly His Val Leu Val Glu Cys
20 25 30
Ile Glu Asn Arg Asp Cys Glu Lys Gly Met Cys Lys Phe Pro Phe Ile
35 40 45
Val Arg Cys Leu Met Asp Gln Cys Lys Cys Val Arg Ile His Asn Leu
50 55 60
Ile
65
<210> 131
<211> 74
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 131
Met Ile Ile Gln Phe Ser Ile Tyr Tyr Met Gln Arg Arg Lys Leu Asn
1 5 10 15
Met Val Glu Ile Leu Lys Phe Ser His Ala Leu Ile Ile Phe Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Ala Leu Val Thr Asn Ala Asn Ile Phe Phe Cys Ser Thr Asp
35 40 45
Glu Asp Cys Thr Trp Asn Leu Cys Arg Gln Pro Trp Val Gln Lys Cys
50 55 60
Arg Leu His Met Cys Ser Cys Glu Lys Asn
65 70
<210> 132
<211> 58
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 132
Met Asp Glu Val Phe Lys Phe Val Tyr Val Met Ile Ile Phe Pro Phe
1 5 10 15
Leu Ile Leu Asp Val Ala Thr Asn Ala Glu Lys Ile Arg Arg Cys Phe
20 25 30
Asn Asp Ala His Cys Pro Pro Asp Met Cys Thr Leu Gly Val Ile Pro
35 40 45
Lys Cys Ser Arg Phe Thr Ile Cys Ile Cys
50 55
<210> 133
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 133
Met His Arg Lys Pro Asn Met Thr Lys Phe Phe Lys Phe Val Tyr Thr
1 5 10 15
Met Phe Ile Leu Ile Ser Leu Phe Leu Val Val Thr Asn Ala Asn Ala
20 25 30
Asn Asn Cys Thr Asp Thr Ser Asp Cys Ser Ser Asn His Cys Ser Tyr
35 40 45
Glu Gly Val Ser Leu Cys Met Asn Gly Gln Cys Ile Cys Ile Tyr Glu
50 55 60
<210> 134
<211> 69
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 134
Met Gln Met Lys Lys Met Ala Thr Ile Leu Lys Phe Val Tyr Leu Ile
1 5 10 15
Ile Leu Leu Ile Tyr Pro Leu Leu Val Val Thr Glu Glu Ser His Tyr
20 25 30
Met Lys Phe Ser Ile Cys Lys Asp Asp Thr Asp Cys Pro Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Val Leu Pro Asn Val Pro Lys Cys Ile Gly Ser Lys Cys His Cys
50 55 60
Lys Leu Met Val Asn
65
<210> 135
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 135
Met Val Glu Thr Leu Arg Leu Phe Tyr Ile Met Ile Leu Phe Val Ser
1 5 10 15
Leu Tyr Leu Val Val Val Asp Gly Val Ser Lys Leu Ala Gln Ser Cys
20 25 30
Ser Glu Asp Phe Glu Cys Tyr Ile Lys Asn Pro His Ala Pro Phe Gly
35 40 45
Gln Leu Arg Cys Phe Glu Gly Tyr Cys Gln Arg Leu Asp Lys Pro Thr
50 55 60
<210> 136
<211> 63
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 136
Met Thr Thr Phe Leu Lys Val Ala Tyr Ile Met Ile Ile Cys Val Phe
1 5 10 15
Val Leu His Leu Ala Ala Gln Val Asp Ser Gln Lys Arg Leu His Gly
20 25 30
Cys Lys Glu Asp Arg Asp Cys Asp Asn Ile Cys Ser Val His Ala Val
35 40 45
Thr Lys Cys Ile Gly Asn Met Cys Arg Cys Leu Ala Asn Val Lys
50 55 60
<210> 137
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 137
Met Arg Ile Asn Arg Thr Pro Ala Ile Phe Lys Phe Val Tyr Thr Ile
1 5 10 15
Ile Ile Tyr Leu Phe Leu Leu Arg Val Val Ala Lys Asp Leu Pro Phe
20 25 30
Asn Ile Cys Glu Lys Asp Glu Asp Cys Leu Glu Phe Cys Ala His Asp
35 40 45
Lys Val Ala Lys Cys Met Leu Asn Ile Cys Phe Cys Phe
50 55 60
<210> 138
<211> 54
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 138
Met Ala Glu Ile Leu Lys Ile Leu Tyr Val Phe Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ile Leu Ala Val Ile Ser Gln His Pro Phe Thr Pro Cys Glu Thr
20 25 30
Asn Ala Asp Cys Lys Cys Arg Asn His Lys Arg Pro Asp Cys Leu Trp
35 40 45
His Lys Cys Tyr Cys Tyr
50
<210> 139
<211> 65
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 139
Met Arg Lys Ser Met Ala Thr Ile Leu Lys Phe Val Tyr Val Ile Met
1 5 10 15
Leu Phe Ile Tyr Ser Leu Phe Val Ile Glu Ser Phe Gly His Arg Phe
20 25 30
Leu Ile Tyr Asn Asn Cys Lys Asn Asp Thr Glu Cys Pro Asn Asp Cys
35 40 45
Gly Pro His Glu Gln Ala Lys Cys Ile Leu Tyr Ala Cys Tyr Cys Val
50 55 60
Glu
65
<210> 140
<211> 58
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 140
Met Asn Thr Ile Leu Lys Phe Ile Phe Val Val Phe Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Ile Phe Leu Ser Ala Gly Asn Ser Lys Ser Tyr Gly Pro Cys Thr Thr
20 25 30
Leu Gln Asp Cys Glu Thr His Asn Trp Phe Glu Val Cys Ser Cys Ile
35 40 45
Asp Phe Glu Cys Lys Cys Trp Ser Leu Leu
50 55
<210> 141
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 141
Met Ala Glu Ile Ile Lys Phe Val Tyr Ile Met Ile Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ile Ala Glu Ala Ser Gly Lys Glu Cys Val Thr Asp Ala
20 25 30
Asp Cys Glu Asn Leu Tyr Pro Gly Asn Lys Lys Pro Met Phe Cys Asn
35 40 45
Asn Thr Gly Tyr Cys Met Ser Leu Tyr Lys Glu Pro Ser Arg Tyr Met
50 55 60
<210> 142
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 142
Met Ala Lys Ile Ile Lys Phe Val Tyr Ile Met Ile Leu Cys Val Ser
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ile Val Glu Ala Gly Gly Lys Glu Cys Val Thr Asp Val
20 25 30
Asp Cys Glu Lys Ile Tyr Pro Gly Asn Lys Lys Pro Leu Ile Cys Ser
35 40 45
Thr Gly Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Glu Glu Pro Pro Arg Tyr His Lys
50 55 60
<210> 143
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 143
Met Ala Lys Val Thr Lys Phe Gly Tyr Ile Ile Ile His Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Leu Ala Met Asn Val Ala Gly Gly Arg Glu Cys His Ala
20 25 30
Asn Ser His Cys Val Gly Lys Ile Thr Cys Val Leu Pro Gln Lys Pro
35 40 45
Glu Cys Trp Asn Tyr Ala Cys Val Cys Tyr Asp Ser Asn Lys Tyr Arg
50 55 60
<210> 144
<211> 55
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 144
Met Ala Lys Ile Phe Asn Tyr Val Tyr Ala Leu Ile Met Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Met Gly Thr Ser Gly Met Lys Asn Gly Cys Lys His Thr
20 25 30
Gly His Cys Pro Arg Lys Met Cys Gly Ala Lys Thr Thr Lys Cys Arg
35 40 45
Asn Asn Lys Cys Gln Cys Val
50 55
<210> 145
<211> 69
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 145
Met Thr Glu Ile Leu Lys Phe Val Cys Val Met Ile Ile Phe Ile Ser
1 5 10 15
Ser Phe Ile Val Ser Lys Ser Leu Asn Gly Gly Gly Lys Asp Lys Cys
20 25 30
Phe Arg Asp Ser Asp Cys Pro Lys His Met Cys Pro Ser Ser Leu Val
35 40 45
Ala Lys Cys Ile Asn Arg Leu Cys Arg Cys Arg Arg Pro Glu Leu Gln
50 55 60
Val Gln Leu Asn Pro
65
<210> 146
<211> 69
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 146
Met Ala His Ile Ile Met Phe Val Tyr Ala Leu Ile Tyr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Ile Phe Ser Ser Leu Phe Val Arg Asp Gly Ile Pro Cys Leu Ser Asp
20 25 30
Asp Glu Cys Pro Glu Met Ser His Tyr Ser Phe Lys Cys Asn Asn Lys
35 40 45
Ile Cys Glu Tyr Asp Leu Gly Glu Met Ser Asp Asp Asp Tyr Tyr Leu
50 55 60
Glu Met Ser Arg Glu
65
<210> 147
<211> 77
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 147
Met Tyr Arg Glu Lys Asn Met Ala Lys Thr Leu Lys Phe Val Tyr Val
1 5 10 15
Ile Val Leu Phe Leu Ser Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Ile Asp Gly
20 25 30
Arg Val Ser Tyr Asn Ser Phe Ile Ala Leu Pro Val Cys Gln Thr Ala
35 40 45
Ala Asp Cys Pro Glu Gly Thr Arg Gly Arg Thr Tyr Lys Cys Ile Asn
50 55 60
Asn Lys Cys Arg Tyr Pro Lys Leu Leu Lys Pro Ile Gln
65 70 75
<210> 148
<211> 56
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 148
Met Ala His Ile Phe Asn Tyr Val Tyr Ala Leu Leu Val Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Met Val Thr Asn Gly Ile His Ile Gly Cys Asp Lys Asp
20 25 30
Arg Asp Cys Pro Lys Gln Met Cys His Leu Asn Gln Thr Pro Lys Cys
35 40 45
Leu Lys Asn Ile Cys Lys Cys Val
50 55
<210> 149
<211> 77
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 149
Met Ala Glu Ile Leu Lys Cys Phe Tyr Thr Met Asn Leu Phe Ile Phe
1 5 10 15
Leu Ile Ile Leu Pro Ala Lys Ile Arg Glu His Ile Gln Cys Val Ile
20 25 30
Asp Asp Asp Cys Pro Lys Ser Leu Asn Lys Leu Leu Ile Ile Lys Cys
35 40 45
Ile Asn His Val Cys Gln Tyr Val Gly Asn Leu Pro Asp Phe Ala Ser
50 55 60
Gln Ile Pro Lys Ser Thr Lys Met Pro Tyr Lys Gly Glu
65 70 75
<210> 150
<211> 70
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 150
Met Ala Tyr Ile Ser Arg Ile Phe Tyr Val Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Val Val Ile Asn Gly Val Lys Ser Leu Leu Leu Ile Lys
20 25 30
Val Arg Ser Phe Ile Pro Cys Gln Arg Ser Asp Asp Cys Pro Arg Asn
35 40 45
Leu Cys Val Asp Gln Ile Ile Pro Thr Cys Val Trp Ala Lys Cys Lys
50 55 60
Cys Lys Asn Tyr Asn Asp
65 70
<210> 151
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 151
Met Ala Asn Val Thr Lys Phe Val Tyr Ile Ala Ile Tyr Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Ile Ala Lys Asn Asp Ala Thr Ala Thr Phe Cys His Asp
20 25 30
Asp Ser His Cys Val Thr Lys Ile Lys Cys Val Leu Pro Arg Thr Pro
35 40 45
Gln Cys Arg Asn Glu Ala Cys Gly Cys Tyr His Ser Asn Lys Phe Arg
50 55 60
<210> 152
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 152
Met Gly Glu Ile Met Lys Phe Val Tyr Val Met Ile Ile Tyr Leu Phe
1 5 10 15
Met Phe Asn Val Ala Thr Gly Ser Glu Phe Ile Phe Thr Lys Lys Leu
20 25 30
Thr Ser Cys Asp Ser Ser Lys Asp Cys Arg Ser Phe Leu Cys Tyr Ser
35 40 45
Pro Lys Phe Pro Val Cys Lys Arg Gly Ile Cys Glu Cys Ile
50 55 60
<210> 153
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 153
Met Gly Glu Met Phe Lys Phe Ile Tyr Thr Phe Ile Leu Phe Val His
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Val Ile Phe Glu Asp Ile Gly His Ile Lys Tyr Cys
20 25 30
Gly Ile Val Asp Asp Cys Tyr Lys Ser Lys Lys Pro Leu Phe Lys Ile
35 40 45
Trp Lys Cys Val Glu Asn Val Cys Val Leu Trp Tyr Lys
50 55 60
<210> 154
<211> 63
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 154
Met Ala Arg Thr Leu Lys Phe Val Tyr Ser Met Ile Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Asn Gly Leu Lys Ile Phe Cys Ile Asp Val Ala
20 25 30
Asp Cys Pro Lys Asp Leu Tyr Pro Leu Leu Tyr Lys Cys Ile Tyr Asn
35 40 45
Lys Cys Ile Val Phe Thr Arg Ile Pro Phe Pro Phe Asp Trp Ile
50 55 60
<210> 155
<211> 66
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 155
Met Ala Asn Ile Thr Lys Phe Val Tyr Ile Ala Ile Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Ile Gly Met Asn Asp Ala Ala Ile Leu Glu Cys Arg Glu
20 25 30
Asp Ser His Cys Val Thr Lys Ile Lys Cys Val Leu Pro Arg Lys Pro
35 40 45
Glu Cys Arg Asn Asn Ala Cys Thr Cys Tyr Lys Gly Gly Phe Ser Phe
50 55 60
His His
65
<210> 156
<211> 68
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 156
Met Gln Arg Val Lys Lys Met Ser Glu Thr Leu Lys Phe Val Tyr Val
1 5 10 15
Leu Ile Leu Phe Ile Ser Ile Phe His Val Val Ile Val Cys Asp Ser
20 25 30
Ile Tyr Phe Pro Val Ser Arg Pro Cys Ile Thr Asp Lys Asp Cys Pro
35 40 45
Asn Met Lys His Tyr Lys Ala Lys Cys Arg Lys Gly Phe Cys Ile Ser
50 55 60
Ser Arg Val Arg
65
<210> 157
<211> 72
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 157
Met Gln Ile Arg Lys Ile Met Ser Gly Val Leu Lys Phe Val Tyr Ala
1 5 10 15
Ile Ile Leu Phe Leu Phe Leu Phe Leu Val Ala Arg Glu Val Gly Gly
20 25 30
Leu Glu Thr Ile Glu Cys Glu Thr Asp Gly Asp Cys Pro Arg Ser Met
35 40 45
Ile Lys Met Trp Asn Lys Asn Tyr Arg His Lys Cys Ile Asp Gly Lys
50 55 60
Cys Glu Trp Ile Lys Lys Leu Pro
65 70
<210> 158
<211> 54
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 158
Met Phe Val Tyr Asp Leu Ile Leu Phe Ile Ser Leu Ile Leu Val Val
1 5 10 15
Thr Gly Ile Asn Ala Glu Ala Asp Thr Ser Cys His Ser Phe Asp Asp
20 25 30
Cys Pro Trp Val Ala His His Tyr Arg Glu Cys Ile Glu Gly Leu Cys
35 40 45
Ala Tyr Arg Ile Leu Tyr
50
<210> 159
<211> 69
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 159
Met Gln Arg Arg Lys Lys Ser Met Ala Lys Met Leu Lys Phe Phe Phe
1 5 10 15
Ala Ile Ile Leu Leu Leu Ser Leu Phe Leu Val Ala Thr Glu Val Gly
20 25 30
Gly Ala Tyr Ile Glu Cys Glu Val Asp Asp Asp Cys Pro Lys Pro Met
35 40 45
Lys Asn Ser His Pro Asp Thr Tyr Tyr Lys Cys Val Lys His Arg Cys
50 55 60
Gln Trp Ala Trp Lys
65
<210> 160
<211> 140
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 160
Met Phe Val Tyr Thr Leu Ile Ile Phe Leu Phe Pro Ser His Val Ile
1 5 10 15
Thr Asn Lys Ile Ala Ile Tyr Cys Val Ser Asp Asp Asp Cys Leu Lys
20 25 30
Thr Phe Thr Pro Leu Asp Leu Lys Cys Val Asp Asn Val Cys Glu Phe
35 40 45
Asn Leu Arg Cys Lys Gly Lys Cys Gly Glu Arg Asp Glu Lys Phe Val
50 55 60
Phe Leu Lys Ala Leu Lys Lys Met Asp Gln Lys Leu Val Leu Glu Glu
65 70 75 80
Gln Gly Asn Ala Arg Glu Val Lys Ile Pro Lys Lys Leu Leu Phe Asp
85 90 95
Arg Ile Gln Val Pro Thr Pro Ala Thr Lys Asp Gln Val Glu Glu Asp
100 105 110
Asp Tyr Asp Asp Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Val
115 120 125
Asp Met Trp Phe His Leu Pro Asp Val Val Cys His
130 135 140
<210> 161
<211> 60
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 161
Met Ala Lys Phe Ser Met Phe Val Tyr Ala Leu Ile Asn Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Glu Thr Ala Ile Thr Asn Ile Arg Cys Val Ser Asp
20 25 30
Asp Asp Cys Pro Lys Val Ile Lys Pro Leu Val Met Lys Cys Ile Gly
35 40 45
Asn Tyr Cys Tyr Phe Phe Met Ile Tyr Glu Gly Pro
50 55 60
<210> 162
<211> 58
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 162
Met Ala His Lys Phe Val Tyr Ala Ile Ile Leu Phe Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Val Ala Lys Asn Val Lys Gly Tyr Val Val Cys Arg Thr Val Asp
20 25 30
Asp Cys Pro Pro Asp Thr Arg Asp Leu Arg Tyr Arg Cys Leu Asn Gly
35 40 45
Lys Cys Lys Ser Tyr Arg Leu Ser Tyr Gly
50 55
<210> 163
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 163
Met Gln Arg Lys Lys Asn Met Gly Gln Ile Leu Ile Phe Val Phe Ala
1 5 10 15
Leu Ile Asn Phe Leu Ser Pro Ile Leu Val Glu Met Thr Thr Thr Thr
20 25 30
Ile Pro Cys Thr Phe Ile Asp Asp Cys Pro Lys Met Pro Leu Val Val
35 40 45
Lys Cys Ile Asp Asn Phe Cys Asn Tyr Phe Glu Ile Lys
50 55 60
<210> 164
<211> 57
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 164
Met Ala Gln Thr Leu Met Leu Val Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Thr Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Val Ile Ser Arg Gln Thr Asp Ile Pro Cys Lys Ser
20 25 30
Asp Asp Ala Cys Pro Arg Val Ser Ser His His Ile Glu Cys Val Lys
35 40 45
Gly Phe Cys Thr Tyr Trp Lys Leu Asp
50 55
<210> 165
<211> 77
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 165
Met Leu Arg Arg Lys Asn Thr Val Gln Ile Leu Met Phe Val Ser Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ile Tyr Ile Phe Leu Phe Leu Val Ile Thr Ser Ser Ala Asn
20 25 30
Ile Pro Cys Asn Ser Asp Ser Asp Cys Pro Trp Lys Ile Tyr Tyr Thr
35 40 45
Tyr Arg Cys Asn Asp Gly Phe Cys Val Tyr Lys Ser Ile Asp Pro Ser
50 55 60
Thr Ile Pro Gln Tyr Met Thr Asp Leu Ile Phe Pro Arg
65 70 75
<210> 166
<211> 59
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 166
Met Ala Val Ile Leu Lys Phe Val Tyr Ile Met Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Leu Tyr Val Val Asn Gly Thr Arg Cys Asn Arg Asp Glu Asp Cys
20 25 30
Pro Phe Ile Cys Thr Gly Pro Gln Ile Pro Lys Cys Val Ser His Ile
35 40 45
Cys Phe Cys Leu Ser Ser Gly Lys Glu Ala Tyr
50 55
<210> 167
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 167
Met Asp Ala Ile Leu Lys Phe Ile Tyr Ala Met Phe Leu Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Phe Val Thr Thr Arg Asn Val Glu Ala Leu Phe Glu Cys Asn Arg
20 25 30
Asp Phe Val Cys Gly Asn Asp Asp Glu Cys Val Tyr Pro Tyr Ala Val
35 40 45
Gln Cys Ile His Arg Tyr Cys Lys Cys Leu Lys Ser Arg Asn
50 55 60
<210> 168
<211> 67
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 168
Met Gln Ile Gly Arg Lys Lys Met Gly Glu Thr Pro Lys Leu Val Tyr
1 5 10 15
Val Ile Ile Leu Phe Leu Ser Ile Phe Leu Cys Thr Asn Ser Ser Phe
20 25 30
Ser Gln Met Ile Asn Phe Arg Gly Cys Lys Arg Asp Lys Asp Cys Pro
35 40 45
Gln Phe Arg Gly Val Asn Ile Arg Cys Arg Ser Gly Phe Cys Thr Pro
50 55 60
Ile Asp Ser
65
<210> 169
<211> 76
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 169
Met Gln Met Arg Lys Asn Met Ala Gln Ile Leu Phe Tyr Val Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Leu Ile Leu Phe Ser Pro Phe Leu Val Ala Arg Ile Met Val Val
20 25 30
Asn Pro Asn Asn Pro Cys Val Thr Asp Ala Asp Cys Gln Arg Tyr Arg
35 40 45
His Lys Leu Ala Thr Arg Met Val Cys Asn Ile Gly Phe Cys Leu Met
50 55 60
Asp Phe Thr His Asp Pro Tyr Ala Pro Ser Leu Pro
65 70 75
<210> 170
<211> 77
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 170
Met Tyr Val Tyr Tyr Ile Gln Met Gly Lys Asn Met Ala Gln Arg Phe
1 5 10 15
Met Phe Ile Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Leu Ser Gln Phe Phe Val Val
20 25 30
Ile Asn Thr Ser Asp Ile Pro Asn Asn Ser Asn Arg Asn Ser Pro Lys
35 40 45
Glu Asp Val Phe Cys Asn Ser Asn Asp Asp Cys Pro Thr Ile Leu Tyr
50 55 60
Tyr Val Ser Lys Cys Val Tyr Asn Phe Cys Glu Tyr Trp
65 70 75
<210> 171
<211> 67
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 171
Met Ala Lys Ile Val Asn Phe Val Tyr Ser Met Ile Ile Phe Val Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Thr Lys Gly Gly Ser Lys Pro Phe Leu Thr Arg
20 25 30
Pro Tyr Pro Cys Asn Thr Gly Ser Asp Cys Pro Gln Asn Met Cys Pro
35 40 45
Pro Gly Tyr Lys Pro Gly Cys Glu Asp Gly Tyr Cys Asn His Cys Tyr
50 55 60
Lys Arg Trp
65
<210> 172
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 172
Met Val Arg Thr Leu Lys Phe Val Tyr Val Ile Ile Leu Ile Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Lys Gly Gly Gly Lys Lys Ile Tyr Cys Glu Asn
20 25 30
Ala Ala Ser Cys Pro Arg Leu Met Tyr Pro Leu Val Tyr Lys Cys Leu
35 40 45
Asp Asn Lys Cys Val Lys Phe Met Met Lys Ser Arg Phe Val
50 55 60
<210> 173
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 173
Met Ala Arg Thr Leu Lys Phe Val Tyr Ala Val Ile Leu Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Lys Gly Asp Asp Val Lys Ile Lys Cys Val Val
20 25 30
Ala Ala Asn Cys Pro Asp Leu Met Tyr Pro Leu Val Tyr Lys Cys Leu
35 40 45
Asn Gly Ile Cys Val Gln Phe Thr Leu Thr Phe Pro Phe Val
50 55 60
<210> 174
<211> 65
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 174
Met Ser Asn Thr Leu Met Phe Val Ile Thr Phe Ile Val Leu Val Thr
1 5 10 15
Leu Phe Leu Gly Pro Lys Asn Val Tyr Ala Phe Gln Pro Cys Val Thr
20 25 30
Thr Ala Asp Cys Met Lys Thr Leu Lys Thr Asp Glu Asn Ile Trp Tyr
35 40 45
Glu Cys Ile Asn Asp Phe Cys Ile Pro Phe Pro Ile Pro Lys Gly Arg
50 55 60
Lys
65
<210> 175
<211> 76
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 175
Met Lys Arg Val Val Asn Met Ala Lys Ile Val Lys Tyr Val Tyr Val
1 5 10 15
Ile Ile Ile Phe Leu Ser Leu Phe Leu Val Ala Thr Lys Ile Glu Gly
20 25 30
Tyr Tyr Tyr Lys Cys Phe Lys Asp Ser Asp Cys Val Lys Leu Leu Cys
35 40 45
Arg Ile Pro Leu Arg Pro Lys Cys Met Tyr Arg His Ile Cys Lys Cys
50 55 60
Lys Val Val Leu Thr Gln Asn Asn Tyr Val Leu Thr
65 70 75
<210> 176
<211> 66
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 176
Met Lys Arg Gly Lys Asn Met Ser Lys Ile Leu Lys Phe Ile Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Leu Val Leu Tyr Leu Phe Leu Val Val Thr Lys Ala Ser Asp Asp
20 25 30
Glu Cys Lys Ile Asp Gly Asp Cys Pro Ile Ser Trp Gln Lys Phe His
35 40 45
Thr Tyr Lys Cys Ile Asn Gln Lys Cys Lys Trp Val Leu Arg Phe His
50 55 60
Glu Tyr
65
<210> 177
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 177
Met Ala Lys Thr Leu Asn Phe Met Phe Ala Leu Ile Leu Phe Ile Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ser Lys Asn Val Ala Ile Asp Ile Phe Val Cys Gln
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Cys Pro Lys Ser Glu Leu Ser Met Tyr Thr Trp Lys
35 40 45
Cys Ile Asp Asn Glu Cys Asn Leu Phe Lys Val Met Gln Gln Met Val
50 55 60
<210> 178
<211> 59
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 178
Met Ala Asn Thr His Lys Leu Val Ser Met Ile Leu Phe Ile Phe Leu
1 5 10 15
Phe Leu Val Ala Asn Asn Val Glu Gly Tyr Val Asn Cys Glu Thr Asp
20 25 30
Ala Asp Cys Pro Pro Ser Thr Arg Val Lys Arg Phe Lys Cys Val Lys
35 40 45
Gly Glu Cys Arg Trp Thr Arg Met Ser Tyr Ala
50 55
<210> 179
<211> 59
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 179
Met Ala His Phe Leu Met Phe Val Tyr Ala Leu Ile Thr Cys Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Glu Met Gly His Leu Ser Ile His Cys Val Ser Val
20 25 30
Asp Asp Cys Pro Lys Val Glu Lys Pro Ile Thr Met Lys Cys Ile Asn
35 40 45
Asn Tyr Cys Lys Tyr Phe Val Asp His Lys Leu
50 55
<210> 180
<211> 66
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 180
Met Asn Gln Ile Pro Met Phe Gly Tyr Thr Leu Ile Ile Phe Phe Ser
1 5 10 15
Leu Phe Pro Val Ile Thr Asn Gly Asp Arg Ile Pro Cys Val Thr Asn
20 25 30
Gly Asp Cys Pro Val Met Arg Leu Pro Leu Tyr Met Arg Cys Ile Thr
35 40 45
Tyr Ser Cys Glu Leu Phe Phe Asp Gly Pro Asn Leu Cys Ala Val Glu
50 55 60
Arg Ile
65
<210> 181
<211> 61
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 181
Met Arg Lys Asp Met Ala Arg Ile Ser Leu Phe Val Tyr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Ile Phe Phe Ser Leu Phe Phe Val Leu Thr Asn Gly Glu Leu Glu Ile
20 25 30
Arg Cys Val Ser Asp Ala Asp Cys Pro Leu Phe Pro Leu Pro Leu His
35 40 45
Asn Arg Cys Ile Asp Asp Val Cys His Leu Phe Thr Ser
50 55 60
<210> 182
<211> 60
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 182
Met Ala Gln Ile Leu Met Phe Val Tyr Phe Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Glu Ser Ile Lys Ile Phe Thr Glu His Arg Cys Arg
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Cys Pro Ala Arg Glu Leu Pro Glu Tyr Leu Lys Cys
35 40 45
Gln Gly Gly Met Cys Arg Leu Leu Ile Lys Lys Asp
50 55 60
<210> 183
<211> 56
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 183
Met Ala Arg Val Ile Ser Leu Phe Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ala Thr Asn Gly Asp Leu Ser Pro Cys Leu Arg Ser
20 25 30
Gly Asp Cys Ser Lys Asp Glu Cys Pro Ser His Leu Val Pro Lys Cys
35 40 45
Ile Gly Leu Thr Cys Tyr Cys Ile
50 55
<210> 184
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 184
Met Gln Arg Arg Lys Asn Met Ala Gln Ile Leu Leu Phe Ala Tyr Val
1 5 10 15
Phe Ile Ile Ser Ile Ser Leu Phe Leu Val Val Thr Asn Gly Val Lys
20 25 30
Ile Pro Cys Val Lys Asp Thr Asp Cys Pro Thr Leu Pro Cys Pro Leu
35 40 45
Tyr Ser Lys Cys Val Asp Gly Phe Cys Lys Met Leu Ser Ile
50 55 60
<210> 185
<211> 66
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 185
Met Asn His Ile Ser Lys Phe Val Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Val Tyr Leu Val Val Leu Asp Gly Arg Pro Val Ser Cys Lys Asp His
20 25 30
Tyr Asp Cys Arg Arg Lys Val Lys Ile Val Gly Cys Ile Phe Pro Gln
35 40 45
Glu Lys Pro Met Cys Ile Asn Ser Met Cys Thr Cys Ile Arg Glu Ile
50 55 60
Val Pro
65
<210> 186
<211> 86
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 186
Met Lys Ser Gln Asn His Ala Lys Phe Ile Ser Phe Tyr Lys Asn Asp
1 5 10 15
Leu Phe Lys Ile Phe Gln Asn Asn Asp Ser His Phe Lys Val Phe Phe
20 25 30
Ala Leu Ile Ile Phe Leu Tyr Thr Tyr Leu His Val Thr Asn Gly Val
35 40 45
Phe Val Ser Cys Asn Ser His Ile His Cys Arg Val Asn Asn His Lys
50 55 60
Ile Gly Cys Asn Ile Pro Glu Gln Tyr Leu Leu Cys Val Asn Leu Phe
65 70 75 80
Cys Leu Trp Leu Asp Tyr
85
<210> 187
<211> 62
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 187
Met Thr Tyr Ile Ser Lys Val Val Tyr Ala Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Ile Tyr Val Gly Val Asn Asp Cys Met Leu Val Thr Cys Glu Asp His
20 25 30
Phe Asp Cys Arg Gln Asn Val Gln Gln Val Gly Cys Ser Phe Arg Glu
35 40 45
Ile Pro Gln Cys Ile Asn Ser Ile Cys Lys Cys Met Lys Gly
50 55 60
<210> 188
<211> 63
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 188
Met Thr His Ile Ser Lys Phe Val Phe Ala Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Ile Tyr Val Gly Val Asn Asp Cys Lys Arg Ile Pro Cys Lys Asp Asn
20 25 30
Asn Asp Cys Asn Asn Asn Trp Gln Leu Leu Ala Cys Arg Phe Glu Arg
35 40 45
Glu Val Pro Arg Cys Ile Asn Ser Ile Cys Lys Cys Met Pro Met
50 55 60
<210> 189
<211> 60
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 189
Met Val Gln Thr Pro Lys Leu Val Tyr Val Ile Val Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Phe Leu Gly Met Thr Ile Cys Asn Ser Ser Phe Ser His Phe Phe
20 25 30
Glu Gly Ala Cys Lys Ser Asp Lys Asp Cys Pro Lys Leu His Arg Ser
35 40 45
Asn Val Arg Cys Arg Lys Gly Gln Cys Val Gln Ile
50 55 60
<210> 190
<211> 77
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 190
Met Thr Lys Ile Leu Met Leu Phe Tyr Ala Met Ile Val Phe His Ser
1 5 10 15
Ile Phe Leu Val Ala Ser Tyr Thr Asp Glu Cys Ser Thr Asp Ala Asp
20 25 30
Cys Glu Tyr Ile Leu Cys Leu Phe Pro Ile Ile Lys Arg Cys Ile His
35 40 45
Asn His Cys Lys Cys Val Pro Met Gly Ser Ile Glu Pro Met Ser Thr
50 55 60
Ile Pro Asn Gly Val His Lys Phe His Ile Ile Asn Asn
65 70 75
<210> 191
<211> 64
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 191
Met Ala Lys Thr Leu Asn Phe Val Cys Ala Met Ile Leu Phe Ile Ser
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Ser Lys Asn Val Ala Leu Tyr Ile Ile Glu Cys Lys
20 25 30
Thr Asp Ala Asp Cys Pro Ile Ser Lys Leu Asn Met Tyr Asn Trp Arg
35 40 45
Cys Ile Lys Ser Ser Cys His Leu Tyr Lys Val Ile Gln Phe Met Val
50 55 60
<210> 192
<211> 72
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 192
Met Gln Lys Glu Lys Asn Met Ala Lys Thr Phe Glu Phe Val Tyr Ala
1 5 10 15
Met Ile Ile Phe Ile Leu Leu Phe Leu Val Glu Asn Asn Phe Ala Ala
20 25 30
Tyr Ile Ile Glu Cys Gln Thr Asp Asp Asp Cys Pro Lys Ser Gln Leu
35 40 45
Glu Met Phe Ala Trp Lys Cys Val Lys Asn Gly Cys His Leu Phe Gly
50 55 60
Met Tyr Glu Asp Asp Asp Asp Pro
65 70
<210> 193
<211> 57
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 193
Met Ala Ala Thr Arg Lys Phe Ile Tyr Val Leu Ser His Phe Leu Phe
1 5 10 15
Leu Phe Leu Val Thr Lys Ile Thr Asp Ala Arg Val Cys Lys Ser Asp
20 25 30
Lys Asp Cys Lys Asp Ile Ile Ile Tyr Arg Tyr Ile Leu Lys Cys Arg
35 40 45
Asn Gly Glu Cys Val Lys Ile Lys Ile
50 55
<210> 194
<211> 75
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 194
Met Gln Arg Leu Asp Asn Met Ala Lys Asn Val Lys Phe Ile Tyr Val
1 5 10 15
Ile Ile Leu Leu Leu Phe Ile Phe Leu Val Ile Ile Val Cys Asp Ser
20 25 30
Ala Phe Val Pro Asn Ser Gly Pro Cys Thr Thr Asp Lys Asp Cys Lys
35 40 45
Gln Val Lys Gly Tyr Ile Ala Arg Cys Arg Lys Gly Tyr Cys Met Gln
50 55 60
Ser Val Lys Arg Thr Trp Ser Ser Tyr Ser Arg
65 70 75
<210> 195
<211> 102
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 195
Met Lys Phe Ile Tyr Ile Met Ile Leu Phe Leu Ser Leu Phe Leu Val
1 5 10 15
Gln Phe Leu Thr Cys Lys Gly Leu Thr Val Pro Cys Glu Asn Pro Thr
20 25 30
Thr Cys Pro Glu Asp Phe Cys Thr Pro Pro Met Ile Thr Arg Cys Ile
35 40 45
Asn Phe Ile Cys Leu Cys Asp Gly Pro Glu Tyr Ala Glu Pro Glu Tyr
50 55 60
Asp Gly Pro Glu Pro Glu Tyr Asp His Lys Gly Asp Phe Leu Ser Val
65 70 75 80
Lys Pro Lys Ile Ile Asn Glu Asn Met Met Met Arg Glu Arg His Met
85 90 95
Met Lys Glu Ile Glu Val
100
<210> 196
<211> 59
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 196
Met Ala Gln Phe Leu Met Phe Ile Tyr Val Leu Ile Ile Phe Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Phe Tyr Val Glu Ala Ala Met Phe Glu Leu Thr Lys Ser Thr Ile
20 25 30
Arg Cys Val Thr Asp Ala Asp Cys Pro Asn Val Val Lys Pro Leu Lys
35 40 45
Pro Lys Cys Val Asp Gly Phe Cys Glu Tyr Thr
50 55
<210> 197
<211> 70
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 197
Met Lys Met Arg Ile His Met Ala Gln Ile Ile Met Phe Phe Tyr Ala
1 5 10 15
Leu Ile Ile Phe Leu Ser Pro Phe Leu Val Asp Arg Arg Ser Phe Pro
20 25 30
Ser Ser Phe Val Ser Pro Lys Ser Tyr Thr Ser Glu Ile Pro Cys Lys
35 40 45
Ala Thr Arg Asp Cys Pro Tyr Glu Leu Tyr Tyr Glu Thr Lys Cys Val
50 55 60
Asp Ser Leu Cys Thr Tyr
65 70
<210> 198
<211> 41
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 198
Thr Arg Met Leu Thr Ile Pro Cys Thr Ser Asp Asp Asn Cys Pro Lys
1 5 10 15
Val Ile Ser Pro Cys His Thr Lys Cys Phe Asp Gly Phe Cys Gly Trp
20 25 30
Tyr Ile Glu Gly Ser Tyr Glu Gly Pro
35 40
<210> 199
<211> 69
<212> PRT
<213> 蒺藜状苜蓿（Medicago truncatula）
<400> 199
Met Ala Gln Phe Leu Leu Phe Val Tyr Ser Leu Ile Ile Phe Leu Ser
1 5 10 15
Leu Phe Phe Gly Glu Ala Ala Phe Glu Arg Thr Glu Thr Arg Met Leu
20 25 30
Thr Ile Pro Cys Thr Ser Asp Asp Asn Cys Pro Lys Val Ile Ser Pro
35 40 45
Cys His Thr Lys Cys Phe Asp Gly Phe Cys Gly Trp Tyr Ile Glu Gly
50 55 60
Ser Tyr Glu Gly Pro
65
<210> 200
<211> 78
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 200
Met Lys Leu Leu His Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Met His Leu
1 5 10 15
Ser Ile Gln Tyr Ala Tyr Gly Gly Pro Phe Leu Thr Lys Tyr Leu Cys
20 25 30
Asp Arg Val Cys His Lys Leu Cys Gly Asp Glu Phe Val Cys Ser Cys
35 40 45
Ile Gln Tyr Lys Ser Leu Lys Gly Leu Trp Phe Pro His Cys Pro Thr
50 55 60
Gly Lys Ala Ser Val Val Leu His Asn Phe Leu Thr Ser Pro
65 70 75
<210> 201
<211> 77
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 201
Met Lys Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Ile His Leu
1 5 10 15
Ser Val Gln Tyr Phe Glu Ser Pro Phe Glu Thr Lys Tyr Asn Cys Asp
20 25 30
Thr His Cys Asn Lys Leu Cys Gly Lys Ile Asp His Cys Ser Cys Ile
35 40 45
Gln Tyr His Ser Met Glu Gly Leu Trp Phe Pro His Cys Arg Thr Gly
50 55 60
Ser Ala Ala Gln Met Leu His Asp Phe Leu Ser Asn Pro
65 70 75
<210> 202
<211> 86
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 202
Met Ser Val Arg Lys Asn Val Leu Pro Thr Met Phe Val Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Met Ser Pro Val Thr Pro Thr Ser Val Phe Ile Ser Ala Val Cys
20 25 30
Tyr Ser Gly Cys Gly Ser Leu Ala Leu Val Cys Phe Val Ser Asn Gly
35 40 45
Ile Thr Asn Gly Leu Asp Tyr Phe Lys Ser Ser Ala Pro Leu Ser Thr
50 55 60
Ser Glu Thr Ser Cys Gly Glu Ala Phe Asp Thr Cys Thr Asp His Cys
65 70 75 80
Leu Ala Asn Phe Lys Phe
85
<210> 203
<211> 69
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 203
Met Arg Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Ile Tyr Leu
1 5 10 15
Ser Val Gln Asp Phe Asp Pro Thr Glu Phe Lys Gly Pro Phe Pro Thr
20 25 30
Ile Glu Ile Cys Ser Lys Tyr Cys Ala Val Val Cys Asn Tyr Thr Ser
35 40 45
Arg Pro Cys Tyr Cys Val Glu Ala Ala Lys Glu Arg Asp Gln Trp Phe
50 55 60
Pro Tyr Cys Tyr Asp
65
<210> 204
<211> 77
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 204
Met Arg Leu Leu Tyr Gly Phe Leu Ile Ile Met Leu Thr Ile His Leu
1 5 10 15
Ser Val Gln Asp Ile Asp Pro Asn Thr Leu Arg Gly Pro Tyr Pro Thr
20 25 30
Lys Glu Ile Cys Ser Lys Tyr Cys Glu Tyr Asn Val Val Cys Gly Ala
35 40 45
Ser Leu Pro Cys Ile Cys Val Gln Asp Ala Arg Gln Leu Asp His Trp
50 55 60
Phe Ala Cys Cys Tyr Asp Gly Gly Pro Glu Met Leu Met
65 70 75
<210> 205
<211> 108
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 205
Met Lys Leu Phe Val Val Val Val Leu Val Ala Val Gly Ile Met Phe
1 5 10 15
Val Phe Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Pro Thr Asp Tyr Glu Asp Thr
20 25 30
Asn Asp Met Ile Ser Leu Ser Ser Leu Val Gly Asp Asn Ser Pro Tyr
35 40 45
Val Arg Val Ser Ser Ala Asp Ser Gly Gly Ser Ser Lys Thr Ser Ser
50 55 60
Lys Asn Pro Ile Leu Gly Leu Leu Lys Ser Val Ile Lys Leu Leu Thr
65 70 75 80
Lys Ile Phe Gly Thr Tyr Ser Asp Ala Ala Pro Ala Met Pro Pro Ile
85 90 95
Pro Pro Ala Leu Arg Lys Asn Arg Gly Met Leu Ala
100 105
<210> 206
<211> 178
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 206
Met Val Ala Cys Lys Val Ile Leu Ala Val Ala Val Val Phe Val Ala
1 5 10 15
Ala Val Gln Gly Arg Pro Gly Gly Glu Pro Glu Trp Ala Ala Pro Ile
20 25 30
Phe Ala Glu Leu Lys Ser Val Ser Asp Asn Ile Thr Asn Leu Val Gly
35 40 45
Leu Asp Asn Ala Gly Glu Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Asn Asn Leu Asn
50 55 60
Ala Phe Ala Glu Ser Leu Lys Thr Glu Ala Ala Val Phe Ser Lys Ser
65 70 75 80
Phe Glu Gly Lys Ala Ser Ala Ser Asp Val Phe Lys Glu Ser Thr Lys
85 90 95
Asn Phe Gln Ala Val Val Asp Thr Tyr Ile Lys Asn Leu Pro Lys Asp
100 105 110
Leu Thr Leu Lys Asp Phe Thr Glu Lys Ser Glu Gln Ala Leu Lys Tyr
115 120 125
Met Val Glu His Gly Thr Glu Ile Thr Lys Lys Ala Gln Gly Asn Thr
130 135 140
Glu Thr Glu Lys Glu Ile Lys Glu Phe Phe Lys Lys Gln Ile Glu Asn
145 150 155 160
Leu Ile Gly Gln Gly Lys Ala Leu Gln Ala Lys Ile Ala Glu Ala Lys
165 170 175
Lys Ala
<210> 207
<211> 311
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 207
Met Lys Thr Ser Ser Ser Lys Val Phe Ala Ser Cys Val Ala Ile Val
1 5 10 15
Cys Leu Ala Ser Val Ala Asn Ala Leu Pro Val Gln Lys Ser Val Ala
20 25 30
Ala Thr Thr Glu Asn Pro Ile Val Glu Lys His Gly Cys Arg Ala His
35 40 45
Lys Asn Leu Val Arg Gln Asn Val Val Asp Leu Lys Thr Tyr Asp Ser
50 55 60
Met Leu Ile Thr Asn Glu Val Val Gln Lys Gln Ser Asn Glu Val Gln
65 70 75 80
Ser Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu
85 90 95
Gly Gln Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Ser Glu His Ser
100 105 110
Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Glu
115 120 125
Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Ser Glu His Ser Asn Glu Gly Gln Asn
130 135 140
Ser Glu Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Ser Glu His Ser Asn Glu Gly
145 150 155 160
Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn
165 170 175
Glu Val Gln Ser Ser Glu His Trp Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln
180 185 190
Ser Asn Glu Asp Gln Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser
195 200 205
Lys Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu Asp Gln
210 215 220
Asn Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser Asn Glu
225 230 235 240
Val Gln Ser Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys Gln Ser
245 250 255
Asn Glu Gly Gln Ser Ser Glu Gln Ser Asn Glu Gly Gln Asn Ser Lys
260 265 270
Gln Ser Asn Glu Val Gln Ser Pro Glu Glu His Tyr Asp Leu Pro Asp
275 280 285
Pro Glu Ser Ser Tyr Glu Ser Glu Glu Thr Lys Gly Ser His Glu Ser
290 295 300
Gly Asp Asp Ser Glu His Arg
305 310
<210> 208
<211> 431
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 208
Met Lys Thr Ile Ile Leu Gly Leu Cys Leu Phe Gly Ala Leu Phe Trp
1 5 10 15
Ser Thr Gln Ser Met Pro Val Gly Glu Val Ala Pro Ala Val Pro Ala
20 25 30
Val Pro Ser Glu Ala Val Pro Gln Lys Gln Val Glu Ala Lys Pro Glu
35 40 45
Thr Asn Ala Ala Ser Pro Val Ser Asp Ala Lys Pro Glu Ser Asp Ser
50 55 60
Lys Pro Val Asp Ala Glu Val Lys Pro Thr Val Ser Glu Val Lys Ala
65 70 75 80
Glu Ser Glu Gln Lys Pro Ser Gly Glu Pro Lys Pro Glu Ser Asp Ala
85 90 95
Lys Pro Val Val Ala Ser Glu Ser Lys Pro Glu Ser Asp Pro Lys Pro
100 105 110
Ala Ala Val Val Glu Ser Lys Pro Glu Asn Asp Ala Val Ala Pro Glu
115 120 125
Thr Asn Asn Asp Ala Lys Pro Glu Asn Ala Ala Ala Pro Val Ser Glu
130 135 140
Asn Lys Pro Ala Thr Asp Ala Lys Ala Glu Thr Glu Leu Ile Ala Gln
145 150 155 160
Ala Lys Pro Glu Ser Lys Pro Ala Ser Asp Leu Lys Ala Glu Pro Glu
165 170 175
Ala Ala Lys Pro Asn Ser Glu Val Pro Val Ala Leu Pro Leu Asn Pro
180 185 190
Thr Glu Thr Lys Ala Thr Gln Gln Ser Val Glu Thr Asn Gln Val Glu
195 200 205
Gln Ala Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Asp Pro Ala Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Ala Asp Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala Pro Val Ala Ala Glu Glu
225 230 235 240
Ala Lys Leu Ser Glu Ser Ala Pro Ser Thr Glu Asn Lys Ala Ala Glu
245 250 255
Glu Pro Ser Lys Pro Ala Glu Gln Gln Ser Ala Lys Pro Val Glu Asp
260 265 270
Ala Val Pro Ala Ala Ser Glu Ile Ser Glu Thr Lys Val Ser Pro Ala
275 280 285
Val Pro Ala Val Pro Glu Val Pro Ala Ser Pro Ser Ala Pro Ala Val
290 295 300
Ala Asp Pro Val Ser Ala Pro Glu Ala Glu Lys Asn Ala Glu Pro Ala
305 310 315 320
Lys Ala Ala Asn Ser Ala Glu Pro Ala Val Gln Ser Glu Ala Lys Pro
325 330 335
Ala Glu Asp Ile Gln Lys Ser Gly Ala Val Val Ser Ala Glu Asn Pro
340 345 350
Lys Pro Val Glu Glu Gln Lys Pro Ala Glu Val Ala Lys Pro Ala Glu
355 360 365
Gln Ser Lys Ser Glu Ala Pro Ala Glu Ala Pro Lys Pro Thr Glu Gln
370 375 380
Ser Ala Ala Glu Glu Pro Lys Lys Pro Glu Ser Ala Asn Asp Glu Lys
385 390 395 400
Lys Glu Gln His Ser Val Asn Lys Arg Asp Ala Thr Lys Glu Lys Lys
405 410 415
Pro Thr Asp Ser Ile Met Lys Lys Gln Lys Gln Lys Lys Ala Asn
420 425 430
<210> 209
<211> 160
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 209
Met Asn Gly Lys Ile Val Leu Cys Phe Ala Val Val Phe Ile Gly Gln
1 5 10 15
Ala Met Ser Ala Ala Thr Gly Thr Thr Pro Glu Val Glu Asp Ile Lys
20 25 30
Lys Val Ala Glu Gln Met Ser Gln Thr Phe Met Ser Val Ala Asn His
35 40 45
Leu Val Gly Ile Thr Pro Asn Ser Ala Asp Ala Gln Lys Ser Ile Glu
50 55 60
Lys Ile Arg Thr Ile Met Asn Lys Gly Phe Thr Asp Met Glu Thr Glu
65 70 75 80
Ala Asn Lys Met Lys Asp Ile Val Arg Lys Asn Ala Asp Pro Lys Leu
85 90 95
Val Glu Lys Tyr Asp Glu Leu Glu Lys Glu Leu Lys Lys His Leu Ser
100 105 110
Thr Ala Lys Asp Met Phe Glu Asp Lys Val Val Lys Pro Ile Gly Glu
115 120 125
Lys Val Glu Leu Lys Lys Ile Thr Glu Asn Val Ile Lys Thr Thr Lys
130 135 140
Asp Met Glu Ala Thr Met Asn Lys Ala Ile Asp Gly Phe Lys Lys Gln
145 150 155 160
<210> 210
<211> 415
<212> PRT
<213> 蚜虫内共生菌（Buchnera aphidicola）
<400> 210
Met His Leu Phe Leu Ala Leu Gly Leu Phe Ile Val Cys Gly Met Val
1 5 10 15
Asp Ala Thr Phe Tyr Asn Pro Arg Ser Gln Thr Phe Asn Gln Leu Met
20 25 30
Glu Arg Arg Gln Arg Ser Ile Pro Ile Pro Tyr Ser Tyr Gly Tyr His
35 40 45
Tyr Asn Pro Ile Glu Pro Ser Ile Asn Val Leu Asp Ser Leu Ser Glu
50 55 60
Gly Leu Asp Ser Arg Ile Asn Thr Phe Lys Pro Ile Tyr Gln Asn Val
65 70 75 80
Lys Met Ser Thr Gln Asp Val Asn Ser Val Pro Arg Thr Gln Tyr Gln
85 90 95
Pro Lys Asn Ser Leu Tyr Asp Ser Glu Tyr Ile Ser Ala Lys Asp Ile
100 105 110
Pro Ser Leu Phe Pro Glu Glu Asp Ser Tyr Asp Tyr Lys Tyr Leu Gly
115 120 125
Ser Pro Leu Asn Lys Tyr Leu Thr Arg Pro Ser Thr Gln Glu Ser Gly
130 135 140
Ile Ala Ile Asn Leu Val Ala Ile Lys Glu Thr Ser Val Phe Asp Tyr
145 150 155 160
Gly Phe Pro Thr Tyr Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Asp Ser Val Trp Asn
165 170 175
Phe Gly Ser Lys Ile Pro Asn Thr Val Phe Glu Asp Pro Gln Ser Val
180 185 190
Glu Ser Asp Pro Asn Thr Phe Lys Val Ser Ser Pro Thr Ile Lys Ile
195 200 205
Val Lys Leu Leu Pro Glu Thr Pro Glu Gln Glu Ser Ile Ile Thr Thr
210 215 220
Thr Lys Asn Tyr Glu Leu Asn Tyr Lys Thr Thr Gln Glu Thr Pro Thr
225 230 235 240
Glu Ala Glu Leu Tyr Pro Ile Thr Ser Glu Glu Phe Gln Thr Glu Asp
245 250 255
Glu Trp His Pro Met Val Pro Lys Glu Asn Thr Thr Lys Asp Glu Ser
260 265 270
Ser Phe Ile Thr Thr Glu Glu Pro Leu Thr Glu Asp Lys Ser Asn Ser
275 280 285
Ile Thr Ile Glu Lys Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ser Asn Ser Ile Glu
290 295 300
Phe Asn Ser Ile Arg Thr Glu Glu Lys Ser Asn Ser Ile Thr Thr Glu
305 310 315 320
Glu Asn Gln Lys Glu Asp Asp Glu Ser Met Ser Thr Thr Ser Gln Glu
325 330 335
Thr Thr Thr Ala Phe Asn Leu Asn Asp Thr Phe Asp Thr Asn Arg Tyr
340 345 350
Ser Ser Ser His Glu Ser Leu Met Leu Arg Ile Arg Glu Leu Met Lys
355 360 365
Asn Ile Ala Asp Gln Gln Asn Lys Ser Gln Phe Arg Thr Val Asp Asn
370 375 380
Ile Pro Ala Lys Ser Gln Ser Asn Leu Ser Ser Asp Glu Ser Thr Asn
385 390 395 400
Gln Gln Phe Glu Pro Gln Leu Val Asn Gly Ala Asp Thr Tyr Lys
405 410 415
<210> 211
<211> 126
<212> PRT
<213> 玉米象（Sitophilus zeamais）
<400> 211
Met Thr Arg Thr Met Leu Phe Leu Ala Cys Val Ala Ala Leu Tyr Val
1 5 10 15
Cys Ile Ser Ala Thr Ala Gly Lys Pro Glu Glu Phe Ala Lys Leu Ser
20 25 30
Asp Glu Ala Pro Ser Asn Asp Gln Ala Met Tyr Glu Ser Ile Gln Arg
35 40 45
Tyr Arg Arg Phe Val Asp Gly Asn Arg Tyr Asn Gly Gly Gln Gln Gln
50 55 60
Gln Gln Gln Pro Lys Gln Trp Glu Val Arg Pro Asp Leu Ser Arg Asp
65 70 75 80
Gln Arg Gly Asn Thr Lys Ala Gln Val Glu Ile Asn Lys Lys Gly Asp
85 90 95
Asn His Asp Ile Asn Ala Gly Trp Gly Lys Asn Ile Asn Gly Pro Asp
100 105 110
Ser His Lys Asp Thr Trp His Val Gly Gly Ser Val Arg Trp
115 120 125
<210> 212
<211> 220
<212> PRT
<213> 豌豆长管蚜（Acyrthosiphon pisum）
<400> 212
Met Lys Glu Thr Thr Val Val Trp Ala Lys Leu Phe Leu Ile Leu Ile
1 5 10 15
Ile Leu Ala Lys Pro Leu Gly Leu Lys Ala Val Asn Glu Cys Lys Arg
20 25 30
Leu Gly Asn Asn Ser Cys Arg Ser His Gly Glu Cys Cys Ser Gly Phe
35 40 45
Cys Phe Ile Glu Pro Gly Trp Ala Leu Gly Val Cys Lys Arg Leu Gly
50 55 60
Thr Pro Lys Lys Ser Asp Asp Ser Asn Asn Gly Lys Asn Ile Glu Lys
65 70 75 80
Asn Asn Gly Val His Glu Arg Ile Asp Asp Val Phe Glu Arg Gly Val
85 90 95
Cys Ser Tyr Tyr Lys Gly Pro Ser Ile Thr Ala Asn Gly Asp Val Phe
100 105 110
Asp Glu Asn Glu Met Thr Ala Ala His Arg Thr Leu Pro Phe Asn Thr
115 120 125
Met Val Lys Val Glu Gly Met Gly Thr Ser Val Val Val Lys Ile Asn
130 135 140
Asp Arg Lys Thr Ala Ala Asp Gly Lys Val Met Leu Leu Ser Arg Ala
145 150 155 160
Ala Ala Glu Ser Leu Asn Ile Asp Glu Asn Thr Gly Pro Val Gln Cys
165 170 175
Gln Leu Lys Phe Val Leu Asp Gly Ser Gly Cys Thr Pro Asp Tyr Gly
180 185 190
Asp Thr Cys Val Leu His His Glu Cys Cys Ser Gln Asn Cys Phe Arg
195 200 205
Glu Met Phe Ser Asp Lys Gly Phe Cys Leu Pro Lys
210 215 220
<210> 213
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穿膜肽
<400> 213
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 214
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类免疫缺陷病毒1型
<400> 214
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1 5 10
<210> 215
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pVEC
<400> 215
Leu Leu Ile Ile Leu Arg Arg Arg Ile Arg Lys Gln Ala His Ala His
1 5 10 15
Ser Lys
<210> 216
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 运输蛋白
<400> 216
Gly Trp Thr Leu Asn Ser Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Lys Ile Asn Leu
1 5 10 15
Lys Ala Leu Ala Ala Leu Ala Lys Lys Ile Leu
20 25
<210> 217
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MPG
<400> 217
Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly
1 5 10 15
Ala Trp Ser Gln Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25
<210> 218
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pep-1
<400> 218
Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Pro Lys
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Val
20
<210> 219
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MAP
<400> 219
Lys Leu Ala Leu Lys Leu Ala Leu Lys Ala Leu Lys Ala Ala Leu Lys
1 5 10 15
Leu Ala
<210> 220
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R6W3
<400> 220
Arg Arg Trp Trp Arg Arg Trp Arg Arg
1 5
<210> 221
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asaia正向引物
<400> 221
gtgccgatct ctaaaagccg tctca 25
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Asaia反向引物
<400> 222
ttcgctcacc ggcttcgggt 20
<210> 223
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S7正向引物
<400> 223
gtgcgcgagt tggagaaga 19
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S7反向引物
<400> 224
atcggtttgg gcagaatgc 19
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 沃尔巴克氏体属（Wolbachia）正向引物
<400> 225
tcagccacac tggaactgag 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 沃尔巴克氏体属（Wolbachia）反向引物
<400> 226
taacgctagc cctctccgta 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S7正向引物
<400> 227
aaggtcgaca ccttcacgtc 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> S7反向引物
<400> 228
ccgtttggtg agggtcttta 20
<210> 229
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 立克次体属（Rickettsia）正向引物
<400> 229
tacgccactc cctgtgtca 19
<210> 230
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 立克次体属（Rickettsia）反向引物
<400> 230
gatgtaacgg tattacacca acag 24
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 芽孢杆菌属（Bacillus）正向引物
<400> 231
gaggtagacg aagcgacctg 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 芽孢杆菌属（Bacillus）反向引物
<400> 232
ttccctcacg gtactggttc 20
<210> 233
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 布赫纳氏菌属（Buchnera）正向引物
<400> 233
gtcggctcat cacatcc 17
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 布赫纳氏菌属（Buchnera）反向引物
<400> 234
ttccgtctgt attatctcct 20
<210> 235
<211> 390
<212> DNA
<213> 玉米象（Sitophilus zeamais）
<400> 235
catatgatga cccgcaccat gctgtttctg gcgtgcgtgg cggcgctgta tgtgtgcatt 60
agcgcgaccg cgggcaaacc ggaagaattt gcgaaactga gcgatgaagc gccgagcaac 120
gatcaggcga tgtatgaaag cattcagcgc tatcgccgct ttgtggatgg caaccgctat 180
aacggcggcc agcagcagca gcagcagccg aaacagtggg aagtgcgccc ggatctgagc 240
cgcgatcagc gcggcaacac caaagcgcag gtggaaatta acaaaaaagg cgataaccat 300
gatattaacg cgggctgggg caaaaacatt aacggcccgg atagccataa agatacctgg 360
catgtgggcg gcagcgtgcg ctggctcgag 390
<210> 236
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ColA正向引物
<400> 236
gtatctattc ccgtctacga acatatggaa ttcc 34
<210> 237
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ColA反向引物
<400> 237
ccgctcgagc catctgacac ttcctccaa 29
<210> 238
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Buch_groES_18F正向引物
<400> 238
catgatcgtg tgcttgttaa g 21
<210> 239
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Buch_groES_98R反向引物
<400> 239
ctgttcctcg agtcgatttc c 21
<210> 240
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApEF1a 107F正向引物
<400> 240
ctgattgtgc cgtgcttatt g 21
<210> 241
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ApEF1a 246R反向引物
<400> 241
tatggtggtt cagtagagtc c 21
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sod_F正向引物
<400> 242
atagctgtcc agacgcttcg 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Sod_R反向引物
<400> 243
atgtcgtcga ggcgattacc 20
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SACT144_FOR正向引物
<400> 244
ggtgttggcg tacaagtcct 20
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SACT314_REV反向引物
<400> 245
gaattgcctg atggacaggt 20

Claims (9)

1.一种降低针对人病原体的媒介的适合度的方法，该方法包括：
向该媒介递送抗微生物肽，该抗微生物肽与以下的一种或多种具有至少90％序列同一性：杀菌肽(SEQ ID NO：82)、蜂毒素、copsin、果蝇抗真菌肽(SEQ ID NO：93)、皮离蛋白(SEQID NO：81)、果蝇抗菌肽(SEQ ID NO：83)、家蚕抗菌肽(SEQ ID NO：84)、无锡亚肽(SEQ IDNO：85)、蜜蜂肽(SEQ ID NO：86)、蜜蜂抗菌肽(SEQ ID NO：87)、猪抗菌肽(SEQ ID NO：88)、吲哚力西丁(SEQ ID NO：89)、抗菌肽(SEQ ID NO：90)、速普肽(SEQ ID NO：91)、或防御素(SEQ ID NO：92)。
2.如权利要求1所述的方法，其中该递送包括向该媒介生长、生活、繁殖、进食或侵染的至少一个生境递送该抗微生物肽。
3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中将该抗微生物肽以昆虫可食用组合物进行递送，从而被该媒介摄取。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中将该抗微生物肽配制为液体、固体、气溶胶、膏剂、凝胶、或气体组合物。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该昆虫是蚊子、蠓、虱子、白蛉、蜱、锥蝽臭虫、采采蝇、或跳蚤中的至少一种。
6.一种组合物，该组合物包含抗微生物肽，该抗微生物肽与以下的一种或多种具有至少90％序列同一性：杀菌肽、蜂毒素、copsin、果蝇抗真菌肽、皮离蛋白、果蝇抗菌肽、家蚕抗菌肽、无锡亚肽、蜜蜂肽、蜜蜂抗菌肽、猪抗菌肽、吲哚力西丁、抗菌肽、速普肽、或防御素，该组合物被配制用于靶向针对人病原体的媒介中的微生物。
7.如权利要求6所述的组合物，其中该抗微生物肽在该组合物中的浓度为约0.1ng/g至约100mg/g。
8.如权利要求6-7中任一项所述的组合物，其中该抗微生物肽进一步包含靶向结构域。
9.如权利要求6-8中任一项所述的组合物，其中该抗微生物肽进一步包含细胞穿透肽。
CN201880008104.3A 2017-01-24 2018-01-24 用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法 Pending CN111148523A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762450057P 2017-01-24 2017-01-24
US62/450,057 2017-01-24
US201762583912P 2017-11-09 2017-11-09
US62/583,912 2017-11-09
PCT/US2018/015065 WO2018140507A1 (en) 2017-01-24 2018-01-24 Compositions and related methods for controlling vector-borne diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111148523A true CN111148523A (zh) 2020-05-12

Family

ID=62978713

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880008104.3A Pending CN111148523A (zh) 2017-01-24 2018-01-24 用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20190365853A1 (zh)
EP (1) EP3573638A4 (zh)
JP (2) JP2020509078A (zh)
CN (1) CN111148523A (zh)
AU (1) AU2018212575B2 (zh)
BR (1) BR112019014958A2 (zh)
CA (1) CA3047357A1 (zh)
UA (1) UA126575C2 (zh)
WO (1) WO2018140507A1 (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018213306A1 (en) * 2017-01-24 2019-07-04 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and related methods for controlling vector-borne diseases
CN111690587B (zh) * 2019-03-13 2022-10-25 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种离心筛选具有高含油率油脂酵母菌株的方法及其应用
US20220227817A1 (en) * 2021-01-21 2022-07-21 The Chinese University Of Hong Kong Engineered globular endolysin, a highly potent antibacterial enzyme for multidrug resistant gram-negative bacteria
FR3128117A1 (fr) * 2021-10-15 2023-04-21 Institut National De Recherche Pour L'agriculture L'alimentation Et L'environnement Combinaison d’E . faecalis et d’un agent anti-inflammatoire et ses utilisations dans la prévention et/ou traitement des maladies respiratoires

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005034863A2 (en) * 2003-10-03 2005-04-21 Jarikuma Corporation Countermeasures against malaria
CN102405053A (zh) * 2009-01-06 2012-04-04 C3剑股份有限公司 靶向抗微生物部分
US8334366B1 (en) * 2009-04-29 2012-12-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Mutant lycotoxin-1 peptide sequences for insecticidal and cell membrane altering properties

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6503881B2 (en) * 1996-08-21 2003-01-07 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics
WO2009108180A2 (en) * 2007-12-20 2009-09-03 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Plant production and delivery system for recombinant proteins as protein-flour or protein-oil compositions
US20110209228A1 (en) * 2008-03-13 2011-08-25 Benjamin Cocks Method of treatment using antimicrobial composition
BR112017028413A2 (pt) * 2015-07-02 2018-08-28 Dana Farber Cancer Inst Inc peptídeos antimicrobianos estabilizados
AU2018213306A1 (en) * 2017-01-24 2019-07-04 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Compositions and related methods for controlling vector-borne diseases

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005034863A2 (en) * 2003-10-03 2005-04-21 Jarikuma Corporation Countermeasures against malaria
CN102405053A (zh) * 2009-01-06 2012-04-04 C3剑股份有限公司 靶向抗微生物部分
US8334366B1 (en) * 2009-04-29 2012-12-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Mutant lycotoxin-1 peptide sequences for insecticidal and cell membrane altering properties

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAREN LUNA-RAMIREZ等: "Orally Delivered Scorpion Antimicrobial Peptides Exhibit Activity against Pea Aphid (Acyrthosiphon pisum) and Its Bacterial Symbionts", 《TOXINS》, vol. 9, pages 4 *
S. EL CHAMY MALUF ET AL.: "Inhibition of malaria parasite Plasmodium falciparum development by crotamine, a cell penetrationg peptide from the snake venom", vol. 78, pages 11 - 16 *
SIBAO WANG ET AL.: "Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes", vol. 106, no. 106, pages 12734 - 12739 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2018140507A8 (en) 2018-10-18
EP3573638A4 (en) 2020-12-23
BR112019014958A2 (pt) 2020-04-14
JP2020509078A (ja) 2020-03-26
WO2018140507A1 (en) 2018-08-02
US20190365853A1 (en) 2019-12-05
RU2019126318A (ru) 2021-02-26
CA3047357A1 (en) 2018-08-02
UA126575C2 (uk) 2022-11-02
AU2018212575A1 (en) 2019-07-04
RU2019126318A3 (zh) 2021-11-16
JP2023052111A (ja) 2023-04-11
US20200261536A1 (en) 2020-08-20
AU2018212575B2 (en) 2022-07-07
US20210275635A1 (en) 2021-09-09
EP3573638A1 (en) 2019-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210195917A1 (en) Compositions and related methods for agriculture
CN110869038A (zh) 用于控制媒介传播的疾病的组合物和相关方法
CN111148434B (zh) 用于制造食物和饲料的方法和相关组合物
CN111315393A (zh) 用于农业的组合物和相关方法
US20210275635A1 (en) Compositions and related methods for controlling vector-borne diseases
RU2804136C2 (ru) Композиции и соответствующие способы контроля заболеваний, передаваемых переносчиками
RU2777518C2 (ru) Композиции и соответствующие способы контроля заболеваний, передаваемых переносчиками
RU2780586C2 (ru) Способы и соответствующие композиции для изготовления продуктов питания и кормов
RU2805081C2 (ru) Композиции и соответствующие способы для сельского хозяйства
BR112019014730B1 (pt) Método para aumentar a aptidão de uma abelha melífera

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination