JP2020509078A - ベクター媒介性疾患を防除するための組成物及び関連する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年1月24日に出願された米国仮特許出願第62/450,032号明細書及び2017年11月9日に出願された米国仮特許出願第62/583,925号明細書に対する優先権を主張し、これらの仮特許出願の内容は、本明細書によって全体として参照により本明細書に援用される。
本明細書で使用されるとき、用語「バクテリオシン」は、抗微生物特性を備えたペプチド又はポリペプチドを指す。天然に存在するバクテリオシンは、ある種の原核生物によって生産されるものであり、その生産株に関連する生物に対抗して作用するが、生産株自体に対抗しない。本明細書で企図されるバクテリオシンとしては、限定はされないが、天然に存在するバクテリオシン、例えば細菌によって生産されるバクテリオシン及びその誘導体、例えば改変バクテリオシン、組換え発現バクテリオシン及び化学合成バクテリオシンが挙げられる。一部の例では、バクテリオシンは、本明細書に記載されるバクテリオシンの機能的に活性な変異体である。一部の例では、バクテリオシンの変異体は、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるバクテリオシン又は天然に存在するバクテリオシンの配列と少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する。
i.昆虫
本明細書に提供される方法及び組成物は、ヒトに疾患を引き起こす能力を有する病原体のベクターと考えられる任意の昆虫宿主で用いられ得る。
本明細書に提供される方法及び組成物を使用して、本明細書に記載される任意の宿主の適応度を低下させることができる。適応度の低下は、宿主に常在する微生物の任意の変化によって生じ得、ここで、変化は、調節薬剤の投与がもたらす結果であり、宿主に有害な効果を有し得る。
本明細書に提供される調節薬剤は、ヒト病原体を保有する宿主昆虫の適応度を低下させることにより、ベクター媒介性疾患の蔓延を低減するのに有効である。調節薬剤は、本明細書に記載される任意の製剤及び送達方法を用いて、疾患の伝播を低減する、例えばベクター間の垂直又は水平伝播を低減する及び/又はヒトへの伝播を低減するのに有効な量で且つ有効な持続期間にわたって昆虫に送達され得る。例えば、本明細書に記載される調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、ベクター媒介性病原体の垂直又は水平伝播を約2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又はそれを超えて低減することができる。別の例として、本明細書に記載される調節薬剤は、調節薬剤を投与されていない宿主生物と比較して、ベクター昆虫の媒介能力を約2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又はそれを超えて低減することができる。
本明細書に記載される調節薬剤の標的となる微生物には、限定はされないが、本明細書に記載される任意の細菌及び/又は真菌を含め、宿主内又は宿主上に常在する任意の微生物が含まれ得る。宿主に常在する微生物には、例えば、共生微生物(例えば、宿主に有益な栄養素又は酵素を提供する内部共生微生物)、片利共生微生物、病原性微生物又は寄生性微生物が含まれ得る。内部共生微生物は、一次内部共生体又は二次内部共生体であり得る。共生微生物(例えば、細菌又は真菌)は、宿主の偏性共生体又は宿主の通性共生体であり得る。宿主に常在する微生物は、垂直伝播、水平伝播又は複数の伝播起源を含め、任意の伝播様式によって獲得され得る。
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的細菌としては、限定はされないが、ゼノラブダス属種(Xenorhabdus spp)、フォトラブダス属種(Photorhabdus spp)、カンディダトゥス属種(Candidatus spp)、ブフネラ属種(Buchnera spp)、ブラッタバクテリウム属種(Blattabacterium spp)、バウマンニア属種(Baumania spp)、ウィグルスウォーチア属種(Wigglesworthia spp)、ボルバキア属種(Wolbachia spp)、リケッチア属種(Rickettsia spp)、オリエンティア属種(Orientia spp)、ソーダリス属種(Sodalis spp)、バークホルデリア属種(Burkholderia spp)、カプリアビダス属種(Cupriavidus spp)、フランキア属種(Frankia spp)、シノリゾビウム属種(Snirhizobium spp)、ストレプトコッカス属種(Streptococcus spp)、ウォリネラ属種(Wolinella spp)、キシレラ属種(Xylella spp)、エルウィニア属種(Erwinia spp)、アグロバクテリウム属種(Agrobacterium spp)、バチルス属種(Bacillus spp)、パエニバチルス属種(Paenibacillus spp)、ストレプトミセス属種(Streptomyces spp)、ミクロコッカス属種(Micrococcus spp)、コリネバクテリウム属種(Corynebacterium spp)、アセトバクター属種(Acetobacter spp)、シアノバクテリア属種(Cyanobacteria spp)、サルモネラ属種(Salmonella spp)、ロドコッカス属種(Rhodococcus spp)、シュードモナス属種(Pseudomonas spp)、ラクトバチルス属種(Lactobacillus spp)、エンテロコッカス属種(Enterococcus spp)、アルカリゲネス属種(Alcaligenes spp)、クレブシエラ属種(Klebsiella spp)、パエニバチルス属種(Paenibacillus spp)、アルスロバクター属種(Arthrobacter spp)、コリネバクテリウム属種(Corynebacterium spp)、ブレビバクテリウム属種(Brevibacterium spp)、サーマス属種(Thermus spp)、シュードモナス属種(Pseudomonas spp)、クロストリジウム属種(Clostridium spp)及び大腸菌属種(Escherichia spp)が挙げられる。本明細書に提供される方法及び組成物による標的となり得る細菌の非限定的な例を表1に示す。一部の例では、調節薬剤が標的とする細菌の16S rRNA配列は、表1に挙げる配列と少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、99%、99.9%又は100%の同一性を有する。
本明細書に提供される方法及び組成物において標的となり得る例示的真菌としては、限定はされないが、アミロステレウム・アレオラツム(Amylostereum areolatum)、エピクロエ属種(Epichloe spp)、ピキア・ピヌス(Pichia pinus)、ハンゼヌラ・カプスラタ(Hansenula capsulate)、ダルディニア・デシピエンス(Daldinia decipien)、セラトシスチス属種(Ceratocytis spp)、オフィオストマ属種(Ophiostoma spp)及びアッタマイセス・ブロマティフィカス(Attamyces bromatificus)が挙げられる。昆虫に見られる酵母及び酵母様共生体の非限定的な例としては、カンジダ属(Candida)、メチニコウイア属(Metschnikowia)、デバロマイセス属(Debaromyces)、シェフェルソマイセス・シェハテ(Scheffersomyces shehatae)及びシェフェルソマイセス・スティピティス(Scheffersomyces stipites)、スターメレラ属(Starmerella)、ピキア属(Pichia)、トリコスポロン属(Trichosporon)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、シュードジマ属(Pseudozyma)及びチャワンタケ亜門(Pezizomycotina)からの酵母様共生者(例えば、シンビオタフリナ・ブクネリ(Symbiotaphrina bucneri)及びシンビオタフリナ・コッホイ(Symbiotaphrina kochii))が挙げられる。本明細書の方法及び組成物による標的となり得る酵母の非限定的な例を表2に挙げる。
本明細書に提供される方法及び組成物の調節薬剤には、ファージ、ポリペプチド、小分子、抗生物質、二次代謝産物、細菌若しくは真菌又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。
本明細書に記載される調節薬剤は、ファージ(例えば、溶菌性ファージ又は非溶菌性ファージ)を含み得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のファージの有効濃度は、本明細書に記載される宿主(例えば、ヒト病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ)に常在する1つ以上の微生物(本明細書に記載されるとおり)のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この調節は、宿主の適応度(例えば、本明細書に概説されるとおりの)の低下をもたらし得る。一部の例では、調節薬剤には、テクティウイルス科(Tectiviridae)、マイオウイルス科(Myoviridae)、サイフォウイルス科(Siphoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、カウドウイルス目(Caudovirales)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)又はリガメンウイルス目(Ligamenvirales)の目から選択される少なくとも1つのファージが含まれる。一部の例では、本組成物は、マイオウイルス科(Myoviridae)、サイフォウイルス科(Siphoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、リポスリクスウイルス科(Lipothrixviridae)、ルディウイルス科(Rudiviridae)、アンピュラウイルス科(Ampullaviridae)、ビカウダウイルス科(Bicaudaviridae)、クラバウイルス科(Clavaviridae)、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、フセロウイルス科(Fuselloviridae)、グロブロウイルス科(Gluboloviridae)、グッタウイルス科(Guttaviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、プラズマウイルス科(Plasmaviridae)及びテクティウイルス科(Tectiviridae)から選択される少なくとも1つのファージを含む。本方法及び組成物において有用なファージの更なる非限定的な例を表3に挙げる。
本明細書に記載される組成物及び方法では、多くのポリペプチド(例えば、バクテリオシン、R型バクテリオシン、根粒Cリッチペプチド、抗微生物ペプチド、溶解素又はバクテリオサイト調節性ペプチド)を使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される任意のペプチド又はポリペプチドの有効濃度は、宿主(例えば、ヒト病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ)に常在する1つ以上の微生物(本明細書に記載されるとおりの、例えばボルバキア属種(Wolbachia spp.)又はリケッチア属種(Rickettsia spp.))のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この調節は、宿主の適応度(例えば、本明細書に概説されるとおりの)の低下をもたらし得る。本明細書に含まれるポリペプチドには、天然に存在するポリペプチド又は組換え産生された変異体が含まれ得る。例えば、ポリペプチドは、例えば、特定の領域にわたり又は配列全体にわたり、本明細書に記載されるポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドの配列と少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有する本明細書に記載される任意のポリペプチドの機能的に活性な変異体であり得る。
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオシンを含み得る。一部の例では、バクテリオシンは、シュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、バチルス属(Bacillus)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)又は乳酸菌(LAB、例えばラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis))などのグラム陽性細菌によって天然に生産される。一部の例では、バクテリオシンは、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)、シトロバクター・フロインディ(Citrobacter freundii)、クレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)、セラチア・プリミチクム(Serratia plymithicum)、キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)、エルウィニア・カロトボラ(Erwinia carotovora)、ラルストニア・ソラナケアルム(Ralstonia solanacearum)又は大腸菌(Escherichia coli)などのグラム陰性細菌によって天然に生産される。例示的バクテリオシンとしては、限定はされないが、クラスI〜IV LAB抗生物質(ランチビオティックなど)、コリシン、ミクロシン及びピオシンが挙げられる。バクテリオシンの非限定的な例を表4に挙げる。
本明細書に記載される調節薬剤は、溶解素(例えば、ムレイン加水分解酵素又はペプチドグリカン自己溶解素としても知られる)を含み得る。宿主に常在する細菌の阻害に好適な任意の溶解素を使用し得る。一部の例では、溶解素は、細菌細胞によって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、バクテリオファージによって天然に生産され得るものである。一部の例では、溶解素は、宿主に常在する細菌を阻害するファージから入手される。一部の例では、溶解素は、天然に存在する溶解素をベースとして改変される。一部の例では、溶解素は、例えば、溶解素にシグナルペプチドを導入することにより、宿主細菌によって分泌されるように改変される。一部の例では、溶解素は、ファージホリンとの組み合わせで使用される。一部の例では、溶解素は、溶解素に敏感でない組換え細菌宿主によって発現される。一部の例では、溶解素を使用して、宿主に常在するグラム陽性又はグラム陰性細菌が阻害される。
本明細書に記載される調節薬剤は、抗微生物ペプチド(AMP)を含み得る。宿主に常在する微生物を阻害するのに好適な任意のAMPを使用し得る。AMPは、多様な分子の群であり、そのアミノ酸組成及び構造に基づいてサブ群に分けられる。AMPは、植物(例えば、コプシン)、昆虫(例えば、ドロソシン、サソリペプチド(例えば、Uy192、UyCT3、D3、D10、Uy17、Uy192)、マストパラン、ポネラトキシン、セクロピン、モリシン、メリチン)、カエル(例えば、マガイニン、ダーマセプチン、オーレイン)及び哺乳類(例えば、カテリシジン類、デフェンシン類及びプロテグリン類)に由来するAMPを含め、天然でAMPを生産する任意の生物に由来するか又はそれから生産され得る。例えば、AMPは、Uy192(5’−FLSTIWNGIKGLL−3’;配列番号227)、UyCT3(5’−LSAIWSGIKSLF−3;配列番号228)、D3(5’−LWGKLWEGVKSLI−3’;配列番号229)及びD10(5’−FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL−3’;配列番号230)、Uy17(5’−ILSAIWSGIKGLL−3’;配列番号231)又はこれらの組み合わせなどのサソリペプチドであり得る。一部の例では、抗微生物ペプチドは、ヒト病原体のベクターに対する、以下:セクロピン(配列番号82)、メリチン、コプシン、ドロソマイシン(配列番号93)、ダームシジン(配列番号81)、アンドロピン(配列番号83)、モリシン(配列番号84)、セラトトキシン(配列番号85)、アバエシン(配列番号86)、アピダエシン(配列番号87)、プロフェニン(配列番号88)、インドリシジン(配列番号89)、プロテグリン(配列番号90)、タキプレシン(配列番号91)又はデフェンシン(配列番号92)の1つ以上と少なくとも90%の配列同一性(例えば、少なくとも90%、92%、94%、96%、98%又は100%の配列同一性)を有するものであり得る。AMPの非限定的な例を表6に挙げる。
本明細書に記載される調節薬剤は、根粒Cリッチペプチド(NCRペプチド)を含み得る。NCRペプチドは、ある種のマメ科植物で生産され、植物細胞が何千もの細胞内内部共生体を含有する根粒の形成をもたらすリゾビウム科(Rhizobiaceae)の細菌(根粒菌)との植物の相利共生的窒素固定共生において重要な役割を果たす。NCRペプチドは、細菌の不可逆的な最終分化過程を指図する抗微生物特性を備え、それにより例えば細菌膜を透過処理し、細胞分裂を破綻させるか又はタンパク質合成を阻害する。例えば、アルファルファ根粒菌(Sinorhizobium meliloti)に感染したメディカゴ・トルンカトゥラ(Medicago truncatula)根粒細胞では、高い倍数性の窒素固定バクテロイドへの細菌の不可逆的な分化を指図する何百ものNCRペプチドが生産される)。NCRペプチドの非限定的な例を表7に挙げる。
本明細書に記載される調節薬剤は、バクテリオサイト調節性ペプチド(BRP)を含み得る。BRPは、昆虫のバクテリオサイトに発現するペプチドである。この遺伝子は、初めに発育時点で共生体の取り込みと同時に発現し、そのバクテリオサイト特異的発現が昆虫の生涯にわたって維持される。一部の例では、BRPは、疎水性アミノ末端ドメインを有し、これは、シグナルペプチドであると予想されている。加えて、一部のBRPは、システインリッチドメインを有する。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、バクテリオサイト特異的システインリッチ(BCR)タンパク質である。バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約40〜150アミノ酸である。一部の例では、バクテリオサイト調節性ペプチドは、長さが約45〜約145、約50〜約140、約55〜約135、約60〜約130、約65〜約125、約70〜約120、約75〜約115、約80〜約110、約85〜約105の範囲又はその間にある任意の範囲である。BRP及びその活性の非限定的な例を表8に挙げる。
多くの小分子(例えば、抗生物質又は代謝産物)を、本明細書に記載される組成物及び方法において使用し得る。一部の例では、本明細書に記載される小分子の有効濃度は、宿主に常在する1つ以上の微生物(本明細書に記載されるとおり)のレベル、活動又は代謝を変化させることができ、この変化が宿主の適応度の減少をもたらし得る。
本明細書に記載される調節薬剤は、抗生物質を含み得る。当該技術分野において公知の任意の抗生物質を使用し得る。抗生物質は、通常、その作用機構、化学構造又は活性スペクトルに基づいて分類される。
一部の例では、本明細書に記載される組成物及び方法の調節薬剤は、二次代謝産物を含む。二次代謝産物は、生物によって生産される有機分子に由来する。二次代謝産物は、(i)細菌、真菌、アメーバ、植物、昆虫及び大型動物に対して使用される競合薬剤;(ii)金属運搬薬剤;(iii)微生物と植物、昆虫及び高等動物との間の共生薬剤;(iv)性ホルモン;及び(v)分化エフェクターとして作用し得る。二次代謝産物の非限定的な例を表10に掲載する。
一部の例では、本明細書に記載される調節薬剤は、1つ以上の細菌を含む。多くの細菌は、本明細書に記載される組成物及び方法に有用である。一部の例では、薬剤は、宿主に内因的に見られる細菌種である。一部の例では、細菌性調節薬剤は、内部共生細菌種である。調節薬剤として使用し得る細菌の非限定的な例としては、本明細書で詳細な説明の第II節に記載されるあらゆる細菌種及び表1に挙げられるものが含まれる。例えば、調節薬剤は、ガンマプロテオバクテリア綱(Gammaproteobacteria)、アルファプロテオバクテリア(Alphaproteobacteria)、ベータプロテオバクテリア(Betaproteobacteria)、バクテロイデス門(Bacteroidetes)、フィルミクテス門(Firmicutes)(例えば、ラクトバチルス属(Lactobacillus)及びバチルス属種(Bacillus spp.))、クロストリジウム綱(Clostridia)、放線菌類(Actinomycetes)、スピロヘータ門(Spirochetes)、ウェルコミクロビウム門(Verrucomicrobia)及び放線菌門(Actinobacteria)を含め、昆虫の腸に存在する任意の細菌門からの細菌種であり得る。
(a)融合
本明細書に記載される調節薬剤のいずれも追加的な部分に融合又は連結し得る。一部の例では、調節薬剤には、1つ以上の追加的な部分(例えば、1つの追加的な部分、2、3、4、5、6、7、8、9、10又はそれを超える追加的な部分)の融合物が含まれる。一部の例では、追加的な部分は、本明細書に記載される調節薬剤(例えば、ペプチド、ポリペプチド、小分子又は抗生物質)のいずれか1つである。或いは、追加的な部分は、調節薬剤自体として作用しなくてもよく、代わりに二次的機能を果たし得る。例えば、追加的な部分は、宿主の標的部位(例えば、宿主の腸又は宿主バクテリオサイト)において又は宿主(例えば、ヒト病原体のベクター、例えばカ、コダニ、ハジラミ又はマダニ)に常在する標的微生物において調節薬剤が到達するか、結合するか、又は活性化された状態になることを促進し得る。
一部の例では、調節薬剤は、プレ又はプロアミノ酸配列を含み得る。例えば、調節薬剤は、プレ配列又はプロ配列の切断又は翻訳後修飾によって活性化され得る不活性なタンパク質又はペプチドであり得る。一部の例では、調節薬剤は、不活性化プレ配列又はプロ配列によって操作される。例えば、プレ配列又はプロ配列は、調節薬剤上の活性化部位、例えば受容体結合部位を隠し得るか又は調節薬剤のコンホメーション変化を誘導し得る。従って、プレ配列又はプロ配列の切断を受けると、調節薬剤が活性化される。
調節薬剤が追加的な部分に結び付いている例では、調節薬剤は、リンカーを更に含み得る。例えば、リンカーは、化学結合、例えば1つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。一部の例では、リンカーは、ペプチドリンカー(例えば、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40アミノ酸又はそれを超えて長い)であり得る。リンカーには、本明細書に記載される任意のフレキシブルリンカー、リジッドリンカー又は切断可能リンカーが含まれ得る。
本明細書に記載される組成物は、純粋な形態で製剤化されるか(例えば、組成物は調節薬剤のみを含む)、又は組成物の施用若しくは送達を促進するため1つ以上の追加的な薬剤(賦形剤、送達媒体、担体、希釈剤、安定剤など)と共に製剤化され得る。好適な賦形剤及び希釈剤の例としては、限定はされないが、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱油が挙げられる。
本明細書に提供される組成物は、液体製剤であり得る。液体製剤は、概して水と混合されるが、一部の例では、担体としての作物油、ディーゼル燃料、灯油又は他の軽油と共に使用され得る。活性成分の量は、多くの場合に約0.5〜約80重量パーセントの範囲である。
乾燥製剤は、2つのタイプ:即時使用型及び散布剤として施用するために水と混合しなければならない濃縮物に分けることができる。ほとんどのダスト製剤は、即時使用型であり、低率の活性成分(約10重量パーセント未満)と、加えてタルク、チョーク、粘土、堅果の殻又は火山灰で作られた超微細な乾燥不活性担体とを含有する。個々のダスト粒子のサイズは、様々である。少数のダスト製剤は、濃縮物であり、高率の活性成分を含有する。これらを施用前に乾燥不活性担体と混合する。ダストは、常に乾燥して使用され、標的外の部位にドリフトし易い。
一部の例では、本組成物は、顆粒として製剤化される。顆粒状製剤は、ダスト製剤と同様であり、但し顆粒状粒子の方が大きくて重い。粗粒子は、粘土、トウモロコシの穂軸又はクルミ殻などの材料から作られ得る。活性成分は、顆粒の外面を被覆するか、又はその中に吸収されるかのいずれかである。活性成分の量は、比較的少ないことができ、通常、約0.5〜約15重量パーセントの範囲である。顆粒状製剤は、ほとんどの場合、土壌、土壌中で生活する昆虫への施用に使用されるか、又は根から植物中に吸収される。顆粒状製剤は、時に、ドリフトを最小限に抑えるか、又は高密度の植生に浸透させるため、飛行機又はヘリコプターによって施用される。施用後、顆粒は、活性成分を徐々に放出し得る。一部の顆粒は、活性成分の放出に土壌水分を必要とする。顆粒状製剤は、幼虫のカ及び他の水生病害虫の防除にも使用される。顆粒は、農業、構造物、鑑賞植物、芝生、水生、道路用地及び公衆衛生(刺咬昆虫)のための病害虫防除活動において使用される。
一部の例では、本組成物は、粉末として製剤化される。一部の例では、本組成物は、水和性粉末として製剤化される。水和性粉末は、ダストに類似した微粉砕された乾燥製剤である。これは、通常、散布剤として施用するため、水と混合しなければならない。しかしながら、少数の製品は、ダストとしても、又は水和性粉末としても施用し得る − その選択は、施用者次第である。水和性粉末は、活性成分を約1〜約95重量パーセント;場合により約50パーセント超有する。粒子は、水に溶解しない。粒子は、絶えず撹拌して懸濁しない限り直ちに沈降する。粒子は、ほとんどの病害虫問題及び撹拌が可能なほとんどのタイプの散布機器で使用することができる。水和性粉末は、優れた残効性を有する。その物理的特性を理由として、大部分の製剤は、加工された多孔質材料、例えばコンクリート、石膏及び未加工木材などの表面上に留まる。そのような場合、水のみが材料に浸透する。
一部の例では、本組成物は、ベイトを含む。ベイトは、固体、ペースト、ペレット又は粉末状形態など、任意の好適な形態であり得る。ベイトは、宿主によって運び去られ、前記宿主の個体群(例えば、コロニー又は巣箱)に持ち帰られることもある。ベイトは、次にコロニーの他のメンバーの飼料供給源としての役割を果たすことができ、従って多数の宿主、潜在的に宿主のコロニー全体に有効な調節薬剤を付与し得る。
一部の例では、本組成物は、誘引剤(例えば、化学誘引剤)を含む。誘引剤は、組成物の近傍に成虫宿主又は幼若宿主(例えば、幼虫)を誘引し得る。誘引剤としては、動物、特に昆虫によって分泌される、同じ種の他の動物の行動又は発育に影響を及ぼす化学物質であるフェロモン類が挙げられる。他の誘引剤としては、糖及びタンパク質加水分解物のシロップ、酵母及び腐りかけの肉が挙げられる。誘引剤は、活性成分と組み合わされ、茎葉又は処理範囲にある他の物品にも噴霧され得る。
一部の例では、本組成物は、マイクロカプセル化製剤で提供される。マイクロカプセル化製剤は、水と混合され、他の噴霧可能製剤と同じように噴霧される。噴霧後、プラスチックコーティングが破れ、活性成分が徐々に放出される。
本明細書に記載される組成物のいずれも、本明細書に記載される調節薬剤と不活性担体とを含むように製剤化され得る。かかる担体は、固体担体、液体担体、ゲル担体及び/又はガス担体であり得る。特定の例では、担体は、種子コーティングであり得る。種子コーティングは、種子の表面に全面的に又は部分的に付着する任意の天然に存在しない製剤である。製剤は、アジュバント又は界面活性剤を更に含み得る。製剤は、作用域を拡大するために1つ以上の調節薬剤も含み得る。
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、アジュバントを含み得る。アジュバントは、活性を有しない化学物質である。アジュバントは、混合又は施用の向上のため、又はパフォーマンスの増強のため、製剤中に予め混合されるか又は噴霧タンクに加えられるかのいずれかである。アジュバントは、葉面施用向けに設計された製品に広く使用されている。アジュバントを使用すると、製剤を具体的な必要性に合わせてカスタマイズし、局所的条件を補うことができる。アジュバントは、濡れ、展着、粘着、蒸発の低減、揮発の低減、緩衝、乳化、分散、散布ドリフトの低減及び起泡の低減を含め、特定の機能を果たすように設計され得る。単一のアジュバントがこれらの全ての機能を果たすことはできず、多くの場合、適合性のあるアジュバントが組み合わされて複数の機能を同時に果たし得る。
一部の例では、本明細書に提供される組成物は、界面活性剤を含む。界面活性剤は、濡れ剤及び展着剤とも称され、噴霧液滴の表面張力を物理的に変化させる。製剤がその機能を正しく果たすには、噴霧液滴が茎葉を濡らし、葉の全面にわたって均一に広がることが可能でなければならない。界面活性剤は、製剤被覆面積を拡大し、それにより病害虫の化学物質への曝露を増加させる。界面活性剤は、製剤を蝋質の葉又は有毛の葉に施用するときに特に重要である。適切な濡れ性及び展着性がないと、往々にして噴霧液滴が流亡するか、又は葉の表面を十分に被覆することができない。しかしながら、界面活性剤が多過ぎると過剰な流亡が引き起こされ、有効性が低下し得る。
製剤において及びこれらの製剤から調製される使用形態において、調節薬剤は、農薬用薬剤(例えば、殺虫剤、滅菌剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、殺軟体動物剤又は殺真菌剤;例えば、表12に挙げる農薬を参照されたい)、誘引剤、成長調整物質又は除草剤など、他の活性化合物との混合物であり得る。本明細書で使用されるとき、用語「農薬用薬剤」は、任意の病害虫を予防、駆逐、忌避又は軽減することを意図した任意の物質又は物質の混合物を指す。農薬は、食物に関してヒトと競合するか、所有物を破壊するか、疾患を蔓延させるか、又は不快害虫である昆虫、病原体、雑草及び微生物を含め、病害虫に対して使用される化学的物質又は生物学的薬剤であり得る。用語「農薬用薬剤」は、抗生物質、抗ウイルス薬 農薬、抗真菌薬、駆虫薬、栄養素、花粉、ショ糖及び/又は昆虫の動きを止める又は遅くする薬剤など、他の生物活性分子を更に包含し得る。
本明細書に記載される宿主は、昆虫への組成物の送達又は投与を可能にする任意の好適な方法において、本明細書に記載される組成物のいずれかに曝露され得る。調節薬剤は、単独で送達され得るか、或いは他の活性又は不活性物質と組み合わせて送達され得、有効濃度の調節薬剤を送達するように製剤化された濃縮液、ゲル、溶液、懸濁液、散布液、粉末、ペレット、ブリケット、ブリックなどの形態で例えば噴霧、マイクロインジェクション、植物経由、注入、浸漬によって施用され得る。本明細書に記載される組成物の施用量及び施用部位は、概して、宿主の習性、宿主の微生物が調節薬剤の標的となり得るのがいずれの生活環ステージであるか、施用が行われる部位並びに調節薬剤の物理的及び機能的特性によって決まる。本明細書に記載される調節薬剤は、昆虫に経口摂取によって投与され得るが、クチクラを通じた浸透又は昆虫の呼吸器系への浸透を可能にする手段によっても投与され得る。
本明細書では、宿主(例えば、昆虫)の微生物叢を変化させ、且つそれにより宿主適応度を低下させるのに有効な調節薬剤のスクリーニング方法が含まれる。本明細書に提供されるスクリーニングアッセイは、宿主に常在する共生微生物を標的とし、且つそれにより宿主の適応度を低下させる1つ以上の調節薬剤(例えば、ファージ)を同定するのに有効であり得る。例えば、同定された調節薬剤(例えば、ファージ)は、農薬分解性又はアレロケミカル分解性微生物(例えば、細菌、例えば表12に挙げられる農薬を分解する細菌)の生存能を低下させ、且つそれにより宿主の農薬に対する感度(例えば、表12に挙げられる農薬に対する感度)又はアレロケミカル薬剤に対する感度を増加させるのに有効であり得る。
本実施例は、比較的広域であるが、浅い抗細菌活性であるアジスロマイシンでの処理により、アノフェレス・コルッツィ(Anopheles coluzzii)蚊を死滅させるか又はその適応度を低下させ、及び寄生虫の伝播率を低下させることが可能であることを実証する。アジスロマイシンは、一部のグラム陽性細菌、一部のグラム陰性細菌及び多くの非定型細菌を阻害する。アジスロマイシンが蚊に及ぼす効果は、アジスロマイシンに敏感である、蚊にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介される。1つの標的となる細菌株は、アサイア属(Asaia)である。
処理の準備のため、蚊を実験室環境及び培地中で成長させる。実験は、アノフェレス・コルッツィ(Anopheles coluzzii)のゴウッソ(Ngousso)コロニーからの雌蚊で実施し、これは、当初、カメルーンで採集された野外蚊から樹立されたものであり、ヒト血液に維持し、成虫として5%フルクトースを供給する。幼虫にはテトラミン(tetramin)魚用飼料を与える。12時間明期/暗期サイクル下70〜80%湿度において温度を28℃(±1℃)に維持する。
抗生物質不含の、50mg/Lヒポキサンチン、25mM HEPES+10%熱失活ヒト血清を補充した300mg L−1 L−グルタミンを含むRPMI培地(GIBCO)で熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)NF54生殖母細胞を培養する。6%v/v洗浄O+赤血球(RBC)中0.5%寄生虫血で感染させる17及び14日前に2つの25mL培養を開始する。培地は、毎日交換する。蚊を感染させる前に、遠心したRBCをプールし、20%の新鮮な洗浄RBC及びヒト血清(RBCと血清との間で2:3v/v比)を補充する。パラフィルムで覆い37℃に保ったメンブレン供給装置(2mlエッペンドルフ試験管)から蚊に血液ミールを与える。
解剖前に蚊を70%エタノールに5分間浸漬し、次に滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回リンスして、表在細菌を死滅させて取り除き、従って解剖中のサンプルのクチクラ細菌による汚染を最小限に抑える。各蚊(対照及びアジスロマイシン処理)の中腸を取り出し、直ちにドライアイスで凍結し、処理まで20℃で保存する。中腸が破裂して相当量の腸内容物が失われた場合に限り、それを分析から除外する。Precellys 24ホモジナイザー(Bertin)において、0.5mm幅ガラスビーズ(Bertin)を使用してサンプルをフェノール−クロロホルム中で6800rpmにおいて30秒間ホモジナイズし、デオキシリボ核酸(DNA)をフェノール−クロロホルムで抽出する。アサイア属(Asaia)の定量化に16SリボソームDNA(rDNA)を使用し、これは、ハマダラカ属(Anopheles)ハウスキーピング遺伝子40Sリボソームタンパク質S7(Vector−Base遺伝子ID AGAP010592)の比として示される。アサイア属(Asaia)のプライマー配列は、フォワード5’−GTGCCGATCTCTAAAAGCCGTCTCA−3’(配列番号219)及びリバース5’−TTCGCTCACCGGCTTCGGGT−3’(配列番号220)及びS7について:フォワード5’−GTGCGCGAGTTGGAGAAGA−3’(配列番号221)及びリバース5’−ATCGGTTTGGGCAGAATGC−3’(配列番号222)である。SYBR Premix Ex Taqキット(Takara)を製造者の指示に従って使用して、7500 Fastリアルタイムサーモサイクラー(Applied Biosystems)で定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を実施する。アジスロマイシン処理した蚊は、アサイア属(Asaia)特異的遺伝子の減少を示す。
この実施例は、タンパク質生成を阻害する広域スペクトル抗生物質であるドキシサイクリンを用いた処理によるアエデス・ベクサンス(Aedes vexans)を死滅させるか、又はその適応度を低下させる能力を実証する。カに対するドキシサイクリンの作用は、ドキシサイクリンに対して感受性であるカに内在性の細菌集団の修飾作用により媒介される。1つの標的となる細菌株は、ボルバキア属(Wolbachia)である。
処理の準備のために、実験室環境及び培地中でカを成長させる。実験は、アエデス・ベクサンス(Aedes vexans)の雌のカを用いて実施し、これは、当初、ミネソタ大学セントポールキャンパス(University of Minnesota St.Paul campus)の野外で採集した野外のカから樹立されたものであり、ヒト血液に維持し、成虫として5%フルクトースを供給する。ドキシサイクリン溶液は、ドキシサイクリン(SIGMA−ALDRICH,D9891)を滅菌水に溶解させることにより調製する。血液ミールの調製には、種々の容積のドキシサイクリン溶液を新鮮な血液に合計1mLとなるように添加する。最終的な血中ドキシサイクリン濃度は、約0(対照)、1、10又は50μg/mlである。
解剖前にカを70%エタノールに5分間浸漬し、次に滅菌リン酸緩衝食塩水(PBS)で3回すすいで、表面の細菌を死滅させて取り除き、このようにして解剖中のサンプルへのクチクラ細菌の混入を最小限に抑える。各カ(対照及びドキシサイクリン処理)の中腸を取り出し、直ちにドライアイス上で凍結させてから、処理まで20℃で保存する。中腸は、それらが破裂して腸内容物の実質的な量が失われた場合に限り、それらを分析から除外する。0.5mm幅のガラスビーズ(Bertin)を用い、サンプルをPrecelly24ホモジナイザー(Bertin)中のフェノール−クロロホルム中において6800rpmで30秒間ホモジナイズしてから、フェノール−クロロホルムでデオキシリボ核酸(DNA)を抽出する。ボルバキア属(Wolbachia)の定量のために16SリボソームDNA(rDNA)を使用し、これは、ヤブカ属(Aedes)ハウスキーピング遺伝子40Sリボソームタンパク質S7(Vector−Base遺伝子ID AAEL009496)の比として示す。ボルバキア属(Wolbachia)のプライマー配列は、次のとおりである:フォワードプライマー5’−TCAGCCACACTGGAACTGAG−3’(配列番号225)及びリバースプライマー5’−TAACGCTAGCCCTCTCCGTA−3’(配列番号226)並びにS7について:フォワード5’−AAGGTCGACACCTTCACGTC−3’(配列番号227)及びリバース5’−CCGTTTGGTGAGGGTCTTTA−3’(配列番号228)。定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)は、製造者の指示に従い、SYBR Premix Ex Taqキット(Takara)を用いて、7500 Fast Real−Timeサーモサイクラー(Applied Biosystems)で実施する。ドキシサイクリンで処理したカは、ボルバキア属(Wolbachia)特異的遺伝子の減少を示す。
本実施例は、ウシにおける広範囲の細菌感染の治療によく使用される広域スペクトル抗生物質であるリカマイシンLA−200オキシテトラサイクリンで処理することにより、マダニのデルマセントル・アンデルソニ(Dermacentor andersoni)を死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。リカマイシンLA−200オキシテトラサイクリンがマダニに及ぼす効果は、リカマイシンLA−200オキシテトラサイクリンに敏感である、マダニにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介される。1つの標的となる細菌株は、リケッチア属(Rickettsia)である。
オレゴン州バーンズ(Burns)及びモンタナ州コモ湖(Lake Como)の現地において、(Scoles et al.,J.Med.Entomol.42:153−162,2005)に記載されるとおり、対象の成虫D.アンデルソニ(D.andersoni)をフランネル法によって採集する。野外採集したマダニを使用して実験室コロニーを樹立する。マダニ細菌分析のため、各コロニーからの成虫F1又はF2雄マダニのコホートをホルスタイン仔ウシで育て、以下のとおりゲノムDNA単離及び細菌定量化のため、解剖して中腸(MG)及び唾液腺(SG)を採取する。
リケッチア属(Rickettsia)を定量化するため、未処理の及び抗生物質処理したF1及びF2マダニのSYBR Green定量的PCRを用いてrickA遺伝子コピー数を測定する。リケッチア属(Rickettsia)の定量化は、フォワード(5’−TACGCCACTCCCTGTGTCA−3’;配列番号229)及びリバース(5’−GATGTAACGGTATTACACCAACAG−3’;配列番号230)プライマーを使用して決定する。細菌定量化は、プールサンプルのF1及びF2 MG及びSGで測定する。SYBR Premix Ex Taqキット(Takara)を製造者の指示に従って使用して、7500 Fastリアルタイムサーモサイクラー(Applied Biosystems)で定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を実施する。リカマイシンLA−200オキシテトラサイクリン処理したマダニは、リケッチア属(Rickettsia)特異的遺伝子の減少を示す。
本実施例は、抗生物質溶液で処理することによりコダニを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、オキシテトラサイクリンがコダニに及ぼす効果は、オキシテトラサイクリンに敏感である、バチルス属(Bacillus)などのコダニにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。
繁殖期の成虫コダニが、便乗性ダニ又はその子孫と比較して、そのクチクラが硬化していないことに起因して異なる感受性を有するかどうかを決定するため、家畜に寄生しているコダニ並びに幼虫及び蛹に関連するコダニを採集する。このアッセイは、異なる種類のコダニで抗生物質溶液を試験し、バチルス属(Bacillus)などの内因性微生物を標的とすることによりその適応度がどのように変化するかを決定する。
・可動:その脚上を針でつつかれた後かどうかに関わらず、コダニは歩き回る。
・麻痺:コダニは、1つ以上の付属器を未刺激で又は刺激後に動かすが、歩き回ることはできない。
・死亡:動けず、3回の連続した刺激に反応しない。
本実施例は、環境サンプルからのファージコレクションの取得を実証する。
2週間にわたって複数の環境サンプル(土壌、池底質、下水)を滅菌1Lフラスコに採取し、採取後直ちに以下に記載するとおり処理し、その後、4℃で保存する。土壌サンプルは、最終容積が100mLになるように2mM CaCl2を補充した滅菌2倍濃度ディフコルリアブロス(LB)又はトリプトソイブロス(TSB)中でホモジナイズする。リン酸塩試験ストリップを使用してpH及びリン酸塩レベルを測定する。精製のため、全てのサンプルをMegafuge 1.0R、Heraeus又はEppendorf遠心機5702 Rにおいて3000〜6000g、+4℃で10〜15分間遠心し、0.2μm低タンパク質フィルタでろ過することにより、全ての残留細菌細胞を除去する。上清をガラスボトルに入れてクロロホルムの存在下において4℃で保存する。
本実施例は、異種ファージライブラリからの単一の標的特異的ファージの分離、精製及び同定を実証する。
20〜30mlの実施例5に記載されるファージライブラリをLBブロスで30〜40mlの容積に希釈する。標的細菌株、例えばブフネラ属(Buchnera)を加えて(LBブロスで成長させた50〜200μl一晩培養物)、培養物中におけるこの特異的細菌株を標的とするファージを集積する。この培養物を230rpmで振盪して+37℃で一晩インキュベートする。この集積培養物から細菌を遠心(Megafuge 1.0R、Heraeus又はEppendorf遠心機5702 Rにおいて3000〜6000g、15〜20分、+4℃)及びろ過(0.2又は0.45μmフィルタ)によって除去する。2.5mlの細菌不含培養物を2.5mlのLBブロス及び50〜100μlの標的細菌に加えてファージを集積する。集積培養物を上記のとおり一晩成長させる。この集積培養物からのサンプルを室温において13,000gで15分間遠心し、100〜300μlの標的細菌及び3mlの融解した0.7%軟寒天と共にLB寒天が入ったペトリ皿に10μlの上清をプレーティングする。プレートを+37℃で一晩インキュベートする。菌叢に観察されるプラークの各々をピッキングし、500μlのLBブロスに移す。このプラークストックからのサンプルを標的細菌上に更にプレーティングする。見出される全てのファージについてプラーク精製を3回実施し、それにより不均質なファージ混合物から単一の均質なファージを分離する。
本実施例は、アブラムシをファージ溶液で処理することによりそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、ファージがアブラムシに及ぼす効果が、ファージに敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。1つの標的となる細菌株は、実施例6で同定されたファージによるブフネラ属(Buchnera)である。
0.5%ショ糖及び必須アミノ酸を含有する10mLの滅菌水中に0(陰性対照)、102、105又は108プラーク形成単位(pfu)/mlの実施例6からのファージでファージ溶液を製剤化する。
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において(16時間光周期;60±5%RH;20±2℃)、ソラマメ植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物において16時間明期及び8時間暗期として24℃で成長させる。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させる。実験のため、健康植物から2齢及び3齢アブラムシを採集し、各処理が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取るように処理に分ける。
上流(NdeI)及び下流(XhoI)制限部位を有する特異的プライマーによるPCRによってDNAを作成する。フォワードプライマーGTATCTATTCCCGTCTACGAACATATGGAATTCC(配列番号236)及びリバースプライマーCCGCTCGAGCCATCTGACACTTCCTCCAA(配列番号237)。精製したPCR断片(Nucleospin Extract II−Macherey Nagel)をNdeI又はXhoIで消化し、次に断片をライゲートする。colAクローニングのため、ライゲートしたDNA断片をpcr2.1(GenBankデータベース受託番号EY122872)ベクターにクローニングする(Anselme et al.,BMC Biol.6:43,2008)。ヌクレオチド配列を系統的に確認する(Cogenics)。
ColAタンパク質配列:
本実施例は、アブラムシをバクテリオシン溶液で処理することによりそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、バクテリオシンがアブラムシに及ぼす効果が、ColAバクテリオシンに敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。1つの標的となる細菌株は、実施例8で作製されたバクテリオシンによるブフネラ属(Buchnera)である。
0.5%ショ糖及び必須アミノ酸を含有する10mLの滅菌水中に0(陰性対照)、0.6、1、50又は100mg/mlの実施例8からのColAでColA溶液を製剤化する。
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において(16時間光周期;60±5%RH;20±2℃)、植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物で成長させて、アブラムシを寄生させる。同じ環境条件でホソヒラタアブ(E.balteatus)幼虫を大量生産から入手する。ハナアブは、糖、花粉及び水で育て;及び3時間中に飼育箱に寄生を受けた宿主植物を導入することにより産卵を誘発する。完全なライフサイクルが宿主植物上で行われ、植物は、毎日新しくアブラムシの寄生を受ける。
本実施例は、細菌RNAポリメラーゼの阻害によってDNA依存性RNA合成を阻害する狭域スペクトル抗生物質であるリファンピシンでアブラムシを処理することによりそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。本実施例は、リファンピシンがアブラムシに及ぼす効果が、リファンピシンに敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ属(Buchnera)である。
0.5%ショ糖及び必須アミノ酸を含有する10mLの滅菌水中に0(陰性対照)、1、10又は50μg/mlリファンピシンで抗生物質溶液を製剤化する。
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において(16時間光周期;60±5%RH;20±2℃)、ソラマメ植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物において16時間明期及び8時間暗期として24℃で成長させる。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させる。実験のため、健康植物から2齢及び3齢アブラムシを採集し、各処理が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取るように処理に分ける。
本実施例は、ブフネラ属(Buchnera)を標的とする分子の同定を実証する。
本実施例は、ブフネラ属(Buchnera)のショ糖発酵を遮断し且つ細胞成長を阻害する、実施例11に記載される画分からの分離株の分離及び同定を実証する。
実施例11に記載される画分を90%水/メタノール中に再懸濁し、C18 SPEカラムに通して画分Iを得る。次に、このカラムをメタノールで洗浄して画分IIを得る。画分IIを、Agilent 1100シリーズHPLCで分取用フェニルヘキシルカラム(Phenomenex、Luna、25cm610mm、5mm粒径)により20%アセトニトリル/0.1%ギ酸含有水の溶出緩衝液を使用して2mL/分の流速で50分間分離する。これにより、異なる溶出時間で複数の化合物が得られる。Alpha FT−IR質量分析計(Bruker)、Ultrospec(商標)5300 pro紫外/可視光分光光度計(Amersham Biosciences)及びINOVA 600MHz核磁気共鳴分光計(Varian)で各化合物のスペクトルを入手する。
本実施例は、実施例12で同定された化合物の1つでアブラムシを処理することにより、その化合物に敏感である、アブラムシにとって内因性の細菌個体群の調節を通じてそれを死滅させるか又はその適応度を低下させることが可能であることを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ属(Buchnera)である。
0.5%ショ糖及び必須アミノ酸を含有する10mLの滅菌水中に実施例12からの各化合物を0(陰性対照)、0.6、1、20又は80μg/mlで製剤化する。
処理の準備のため、アブラムシを実験室環境及び培地中で成長させる。環境制御された室内において(16時間光周期;60±5%RH;20±2℃)、ソラマメ植物をバーミキュライトとパーライトとの混合物において16時間明期及び8時間暗期として24℃で成長させる。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させる。実験のため、健康植物から2齢及び3齢アブラムシを採集し、各処理が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取るように処理に分ける。
本実施例は、細菌RNAポリメラーゼの阻害によってDNA依存性RNA合成を阻害する狭域スペクトル抗生物質であるリファンピシンによるアブラムシの処理を実証する。本実施例は、リファンピシンがモデル昆虫種のアブラムシに及ぼす効果が、リファンピシンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ属(Buchnera)である。
以下のとおり、送達手段に応じて抗生物質溶液を製剤化した(図1A〜図1G):
1)経植物:必須アミノ酸(2mg/mlヒスチジン、2mg/mlイソロイシン、2mg/mlロイシン、2mg/mlリジン、1mg/mlメチオニン、1.62mg/mlフェニルアラニン、2mg/mlスレオニン、1mg/mlトリプトファン及び2mg/mlバリン)含有及び不含の人工食(Akey and Beck,1971をベースとする;実験計画を参照されたい)に製剤化した0(陰性対照)又は100μg/mlのリファンピシン含有。
2)葉面塗布:水中100μlの0.025%非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Silwet L−77(陰性対照)又は溶媒溶液中に製剤化した100μlの50μg/mlのリファンピシンを葉の表面に直接塗って乾燥させた。
3)マイクロインジェクション:注入溶液は、水中0.025%非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Silwet L−77(陰性対照)又は溶媒溶液中に製剤化した50μg/mlのリファンピシンのいずれかであった。
4)局所送達:30mL噴霧ボトルを使用して、100μlの0.025%非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Silwet L−77(陰性対照)又は溶媒溶液中に製剤化した50μg/mlのリファンピシンを噴霧した。
5)葉への注入法A − 葉の灌流及び切断:食品着色料を含有する水中約1mlの50μg/mlのリファンピシン又は水及び食品着色料を含む約1mlの陰性対照を葉に注入した。葉を2×2cm四方の断片に切断し、葉の断片上にアブラムシを置いた。
6)葉の灌流及び経植物送達:水+食品着色料中約1mlの100μg/mlのリファンピシン又は水及び食品着色料を含む約1mlの陰性対照を葉に注入した。次に、1mlの100μg/mlのリファンピシン+水及び食品着色料又は水及び食品着色料のみを含む1mlの陰性対照が入ったエッペンドルフ試験管に、注入した葉の茎を入れた。
7)併用送達方法:a)アブラムシ及び植物への局所送達:水中0.025%非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Silwet L−77(陰性対照)又は溶媒溶液中に製剤化した100μg/mlのリファンピシンを、30mLを使用してアブラムシ及び植物の両方に噴霧することによる、b)経植物送達:水のみ(陰性対照)又は水中に製剤化した100μg/mlのリファンピシン。
アブラムシ(LSR−1系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、3つの異なる処理群に分割した:1)必須アミノ酸不含の人工食単独、2)必須アミノ酸不含の人工食単独及び100μg/mlリファンピシン、及び3)必須アミノ酸含有人工食及び100μg/mlリファンピシン)。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
LSR−1 1齢アブラムシを実験計画(上記)に定義されるとおりの3つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図2A)。リファンピシンで処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理6日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、12日後であっても3齢期より先に進まなかったと共に、そのサイズが劇的に影響を受ける(図2A〜図2C)。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシの大多数が処理後5日の時点で生存していた(図3)。5日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後13日を超えて生き延びた。
処理下のアブラムシにおいて、繁殖力もモニタした。処理後7日目及び8日目までに、必須アミノ酸不含の人工食で処理した成虫アブラムシの大多数が繁殖し始めた。必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシによって成虫になった後に1日に産生される子孫の数の平均値は、約4であった(図4)。対照的に、必須アミノ酸含有又は不含のリファンピシンで処理したアブラムシは、成虫期に達して子孫を産生することができなかった。これらのデータは、リファンピシン処理がアブラムシの繁殖の消失を引き起こしたことを示している。
リファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、7日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、リファンピシンで処理したアブラムシは、約4分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーを有し(図5)、リファンピシン処理がブフネラ属(Buchnera)レベルを低下させたことが示された。
0.025%の非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒、Silwet L−77に、50μg/mlリファンピシンの終濃度に達するようにリファンピシンストック溶液を加えた。前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ(eNASCO系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))をソラマメ植物上で育てた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:葉に1)陰性対照(溶媒溶液のみ)、2)溶媒中50μg/mlリファンピシンを噴霧した。溶液を2×2cm断片のソラマメの葉に吸収させた。
LSR−1 1齢アブラムシを本明細書に記載される実験計画に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照で処理した塗布した葉に置いたアブラムシは、約6日で成虫期(5齢繁殖期;5R)に達し始めた(図6A)。リファンピシンを塗布した葉に置いたアブラムシでは発育が遅れ、処理6日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、12日後であっても3齢期より先に進まなかったと共に、そのサイズが劇的に影響を受ける(図6A及び6B)。
葉面塗布処理時のアブラムシの生存率も測定した。リファンピシンを塗布した葉に置いたアブラムシは、対照を塗布した葉に置いたアブラムシよりも生存率が低かった(図7)。これらのデータは、リファンピシン処理を葉面塗布によって送達すると、アブラムシの生存が影響を受けたことを示している。
葉面塗布によって送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、6日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
NanoJet IIIオートナノリットルインジェクタを使用して、インハウスの熱引きしたホウケイ酸ニードル(Drummond Scientific;カタログ番号3−000−203−G/XL)でマイクロインジェクションを実施した。前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ(eNASCO系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))をソラマメ植物上で育てた。アブラムシを、絵筆を使用して、真空に接続されたチュービングシステムに移す(図1C)。注入部位は、アブラムシの腹側胸部であった。注入溶液は、水中の有機ケイ素系界面活性剤溶媒0.025%Silwet L−77(Lehle Seeds、カタログ番号VIS−01)(陰性対照)又は溶媒溶液中に製剤化した50μg/mlのリファンピシンのいずれかであった。注入容積は、若虫が10nl及び成虫が20nl(両方とも2nl/secの速度)であった。各処理群は、採集植物の各々からほぼ同じ数の注入された個体を有した。注入後、茎が2%寒天中にあるソラマメの葉が入ったペトリ皿にアブラムシを放した。
マイクロインジェクションによって送達されたリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、4日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、前の実施例に記載されるとおりqPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ(LSR−1系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))をソラマメ植物上で育てた。噴霧ボトルに2mlの対照(0.025%Silwet L−77)又はリファンピシン溶液(溶媒溶液中50μg/ml)を充填した。清浄なペトリ皿の底にアブラムシ(n=10)を移し、絵筆を使用してペトリ皿の隅に集めた。続いて、アブラムシを2つのコホートに分け、約100μlの対照又はリファンピシン溶液のいずれかを噴霧した。噴霧後直ちにペトリ皿を蓋で覆った。噴霧5分後、2%寒天中に茎があるソラマメの葉が入ったペトリ皿にアブラムシを放した。
局所送達によって送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、3日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、前の実施例に記載されるとおりqPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
実験計画:
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水+青色食品着色料を注入した葉)、及び2)水+青色食品着色料中50μg/mlリファンピシンを注入した葉。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。処理のため、リファンピシンストック溶液(100%メタノール中25mg/ml)を水+青色食品着色料中50μg/mlに希釈した。次に、この溶液で灌流したソラマメ茎が入った1.5mlエッペンドルフ試験管に溶液を入れ、パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿(Fisher Scientific、カタログ番号FB0875711)内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。各処理につき74〜81匹のアブラムシを各葉の上に置いた。給餌システムは、実験全体を通じて2〜3日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。加えて、実験全体を通じて発育段階(1齢、2齢、3齢、4齢、5齢及び5R(繁殖済みの5齢))を毎日決定した。
LSR−1 1齢及び2齢アブラムシを葉への注入法A − 葉の灌流及び切断実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水+食品着色料で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図11)。リファンピシンを注入した葉を摂餌するアブラムシでは発育が遅れ、処理6日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、4齢期より先に進まなかった。8日後でもなお、リファンピシンを注入した葉を摂餌するアブラムシの発育は、劇的に遅れていた(図11)。これらのデータは、葉の灌流によるリファンピシン処理がアブラムシの発育を妨げたことを示している。
葉の灌流実験時にアブラムシの生存率も測定した。リファンピシンを注入した葉上に置いたアブラムシは、対照溶液を注入した葉上に置いたアブラムシよりも生存率が低かった(図12)。これらのデータは、葉への注入によって送達されるリファンピシン処理がアブラムシの生存に影響を及ぼしたことを示している。
葉の灌流を用いて送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、8日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、前の実施例に記載されるとおりqPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
実験計画:
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。
LSR−1 1齢及び2齢アブラムシを葉の灌流及び経植物送達実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照溶液(水+食品着色料のみ)で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図14)。
葉の灌流及び経植物で送達される対照溶液又はリファンピシンのいずれかでアブラムシを処理した実験中にアブラムシの生存率も測定した。リファンピシンで灌流及び処理した葉を摂餌するアブラムシは、対照溶液で灌流及び処理した葉を摂餌するアブラムシよりも生存率が低かった(図15)。これらのデータは、葉の灌流及び経植物でリファンピシン処理を送達すると、アブラムシの生存に負の影響があったことを示している。
葉の灌流及び経植物を用いて送達されるリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、6及び8日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、前出の実施例に記載されるとおり、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
実験計画:
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;20±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。
LSR−1 1齢及び2齢アブラムシを併用送達方法実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図17)。リファンピシンで処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理6日まで、ほとんどのアブラムシの成熟は、3齢期より先に進まず、7日後であっても、その発育は、劇的に遅れていた(図17)。これらのデータは、リファンピシン処理の併用がアブラムシの発育を妨げたことを示している。
アブラムシをリファンピシン処理の併用で処理した実験中、アブラムシの生存率も測定した。リファンピシンで処理したアブラムシは、対照溶液で処理したアブラムシと比べて生存率がやや低かった(図18)。これらのデータは、処理の併用によって送達されたリファンピシン処理がアブラムシの生存に影響を及ぼしたことを示している。
方法の併用によって送達されたリファンピシンがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、7日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、前の実施例に記載されるとおりqPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
本実施例は、キチンに由来する脱アセチル化β−1,4−D−グルコサミンの天然カチオン性線状多糖であるキトサンによるアブラムシの処理を実証する。キチンは、昆虫、甲殻類(主にエビ及びカニ)の外骨格及び真菌の細胞壁の構造要素であり、セルロースに次いで2番目に最も豊富な天然多糖である。本実施例は、キトサンが昆虫に及ぼす効果が、キトサンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてキトサン溶液を製剤化した(図20)。対照溶液は、水+青色食品着色料を注入した葉及び試験管内の水であった。葉への注入(青色食品着色料を含む)及び経植物(エッペンドルフ試験管内)を用いた水中300ug/mlキトサン(低分子量)による処理溶液。
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、2)処理溶液が水中300ug/mlキトサン(低分子量)を含んだ。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
LSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(上記)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照単独で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図21)。キトサン溶液で処理したアブラムシでは発育が遅れ、キトサンによる処理6日までに、ほとんどのアブラムシの成熟は、4齢期より先に進まなかった。これらのデータは、キトサンによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたことを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの大多数が処理後3日の時点で生存していた(図22)。4日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後7日を超えて生き延びた。
キトサン溶液処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、8日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、水中300ug/mlキトサンで処理したアブラムシは、約5分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーとなり(図23)、キトサン処理がブフネラ属(Buchnera)レベルを低下させたことが示された。
本実施例は、食品保存剤としてよく使用される細菌ラクトコッカス・ラクチス(Lactococcus lactis)によって産生される天然の「広域スペクトル」多環式抗細菌性ペプチドによるアブラムシの処理を実証する。ナイシンの抗細菌活性は、細菌細胞膜に孔を開け、特異的リピドII相互作用によって細菌細胞壁の生合成を妨害するその能力を通じて媒介される。本実施例は、ナイシンが昆虫適応度に及ぼす負の効果が、ナイシンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されることを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてナイシンを製剤化した。対照溶液(水)又は処理溶液(ナイシン)を葉に注入し、エッペンドルフ試験管に入れた。処理溶液は、水中1.6又は7mg/mlナイシンからなった。
LSR−1アブラムシ、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、2)水中1.6mg/ml又は7mg/mlのいずれかのナイシンによるナイシン処理。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
LSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(上記)に定義されるとおりの3つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照溶液(水)で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始め、7日までに繁殖(5R期)し始めた(図24)。7mg/mlナイシンで処理したアブラムシでは、発育が重度に遅れた。7mg/mlナイシンで処理したアブラムシは、3日目までに2齢期までのみ発育し、6日目までに群内の全てのアブラムシが死亡した(図24)。低濃度のナイシン(1.6mg/ml)で処理したアブラムシでは生育がやや遅れ、評価したいずれの時点においても、水で処理した対照と比較して、発育しにくいアブラムシが多かった(図24)。これらのデータは、ナイシンによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたと共に、この発育の遅れが投与したナイシンの用量に依存したことを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの約50%が8日間の実験を生き延びた(図25)。対照的に、7mg/mlナイシンで処理したアブラムシについては、生存率は、有意に低く(p<0.0001、ログ・ランク・マンテル・コックス検定による)、この群の全てのアブラムシが6日までに処理で死亡した(図25)。低用量のナイシン(1.6mg/ml)で処理したアブラムシは、対照処理のアブラムシと比較して死亡率が高かったが、この差は、統計的有意性に達しなかった(p=0.0501 ログ・ランク・マンテル・コックス検定による)。これらのデータは、ナイシンで処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
ナイシンによる処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、8日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、1.6mg/mlナイシンで処理したアブラムシは、約8日間の処理後に約1.4分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーを有した(図26)。7mg/mlナイシンで処理した群に生きているアブラムシはなく、従って、この群ではブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーを評価しなかった。これらのデータは、ナイシン処理がブフネラ属(Buchnera)レベルを低下させたことを示している。
本実施例は、炭水化物をヘキソース(例えば、木、デンプン、コムギ、麦わら又はショ糖)と共に希鉱酸を加えて加熱することにより生じるケト酸であるレブリン酸でアブラムシを処理すると、昆虫の適応度が低下することを実証する。レブリン酸は、食肉生産において、大腸菌(Escherichia coli)及びサルモネラ属(Salmonella)に対する抗微生物剤として既に試験されている(Carpenter et al.,2010,Meat Science;Savannah G.Hawkins,2014,University of Tennessee Honors Thesis)。本実施例は、レブリン酸が昆虫に及ぼす効果が、レブリン酸に敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてレブリン酸を製剤化した。対照溶液は、水を注入した葉であり、及びエッペンドルフ試験管に水を入れた。処理溶液は、(エッペンドルフ試験管内に)葉への注入及び経植物による水中0.03又は0.3%レブリン酸を含んだ。
実験計画:
eNASCOアブラムシ、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、2)処理溶液は、水中0.03又は0.3%レブリン酸を含んだ。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
eNASCO A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(上記)に定義されるとおりの3つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照単独で処理したアブラムシは、約7日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図27)。レブリン酸で処理したアブラムシでは発育が遅れ、処理後11日までにほぼ全ての対照処理のアブラムシが成熟期に達した一方、0.03及び0.3%レブリン酸で処理したアブラムシのそれぞれ約23及び63%の成熟は、4齢期より先に進まなかった。これらのデータは、レブリン酸での処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたと共に、この発育の遅れがレブリン酸の投与用量に依存することを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの約50%が11日間の実験を生き延びた(図28)。対照的に、0.3%レブリン酸(p<0.01)で処理したアブラムシについては、生存率は、有意に低かった。低用量のレブリン酸(0.03%)で処理したアブラムシは、対照処理のアブラムシと比較して死亡率が高かったが、この差は、統計的有意性に達しなかった。これらのデータは、レブリン酸で処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
レブリン酸での処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、7日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、水中0.03又は0.3%レブリン酸で処理したアブラムシは、7日間の処理後に約6分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーを有した(図29、左側のパネル)。これらのデータは、レブリン酸処理によりブフネラ属(Buchnera)レベルが低下したことを示している。
本実施例は、細胞に透過し、且つ幾つかのデヒドロゲナーゼ酵素の阻害薬としての役割を果たす綿植物(ワタ属(Gossypium))に由来する天然フェノール、ゴシポール酢酸によるアブラムシの処理を実証する。本実施例は、ゴシポールが昆虫に及ぼす効果が、ゴシポールに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
1)経植物:必須アミノ酸(ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン及びバリン)不含の人工食(Akey and Beck,1971をベースとする;実験計画を参照されたい)に製剤化した0(陰性対照)又は0.5%、0.25%及び0.05%のゴシポール。
2)マイクロインジェクション:注入溶液は、0.5%のゴシポール又は人工食のみ(陰性対照)のいずれかであった。
アブラムシ(eNASCO(ブフネラ属(Buchnera)及びセラチア属(Serratia)一次及び二次共生者の両方をそれぞれ含む)又はLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)のいずれかの株、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、4つの異なる処理群に分割した:1)必須アミノ酸不含の人工食単独、2)必須アミノ酸不含の人工食単独及び0.05%のゴシポール、3)必須アミノ酸不含の人工食単独及び0.25%のゴシポール、及び4)必須アミノ酸不含の人工食単独及び0.5%のゴシポール。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
eNASCO及びLSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり4つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。人工食単独で処理したアブラムシは、約3日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図30A)。ゴシポールで処理したアブラムシでは発育が遅れ、0.5%のゴシポールによる5日間の処理までに、ほとんどのアブラムシの成熟は、3齢期より先に進まなかったと共に、そのサイズも影響を受ける(図30A及び図30B)。これらのデータは、ゴシポールによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたこと、及びこの応答が用量依存的であったことを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシの大多数は、処理後2日の時点で生存していた(図31)。4日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後7日を超えて生き延びた。
処理下のアブラムシにおいて、繁殖力もモニタした。処理後7日目及び8日目までに、必須アミノ酸不含の人工食で処理した成虫アブラムシの大多数が繁殖し始めた。必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシによって成虫になった後に1日に産生される子孫の数の平均値は、約5であった(図32A及び図32B)。
種々の濃度のゴシポールがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、5又は13日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシ(対照)は、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、0.25及び0.5%のゴシポールで処理したアブラムシは、約4分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーを有し(図33)、ゴシポール処理がブフネラ属(Buchnera)レベルを低下させたこと、及びこの低下が濃度依存的であったことが示された。
NanoJet IIIオートナノリットルインジェクタを使用してインハウスの熱引きしたホウケイ酸ニードル(Drummond Scientific;カタログ番号3−000−203−G/XL)でマイクロインジェクションを実施した。アブラムシ(LSR−1系統、A.ピスム(A.pisum))を前の実施例に記載されるとおりソラマメ植物上で育てた。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の注入された個体を有した。若虫アブラムシ(<3齢期)を、絵筆を使用して、真空に接続されたチュービングシステムに移し、必須アミノ酸不含の人工食(陰性対照)又は必須アミノ酸不含の人工食中0.05%のゴシポール溶液のいずれか20nlを腹側胸部にマイクロインジェクションした。注入後、アブラムシは、茎が2%寒天中にあるソラマメの葉が入った深底ペトリ皿に置いた。
マイクロインジェクションによって送達されたゴシポールがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失をもたらすかどうか、及び前出の実施例で実証されたとおり、この消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼすことを試験するため、4日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、前の実施例に記載されるとおりqPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。
本実施例は、桂皮(シナモマム・ゼイラニクム(Cinnamomum zeylandicum))の樹皮抽出物の主成分である天然芳香族アルデヒド、trans−シンナムアルデヒドによるアブラムシの処理により適応度の低下が引き起こされることを実証する。trans−シンナムアルデヒドは、グラム陰性生物及びグラム陽性生物の両方に対して抗微生物活性を有することが示されているが、しかし、その抗微生物活性の正確な作用機構は、依然として不明である。trans−シンナムアルデヒドは、細菌細胞膜に損傷を与え、特異的細胞過程又は酵素を阻害し得る(Gill and Holley,2004 Applied Environmental Microbiology)。本実施例は、trans−シンナムアルデヒドが昆虫に及ぼす効果が、trans−シンナムアルデヒドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
trans−シンナムアルデヒドを水中0.05%、0.5%又は5%に希釈し、葉の灌流(約1mlを葉に注入した)及び経植物によって送達した。
アブラムシ(LSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、4つの異なる処理群に分割した:1)水で処理した対照、2)水中0.05%trans−シンナムアルデヒド、3)水中0.5%trans−シンナムアルデヒド、及び4)水中5%trans−シンナムアルデヒド。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
LSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり4つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水単独で処理したアブラムシは、処理後3日で3齢期に達し始めた(図35)。trans−シンナムアルデヒドで処理したアブラムシでは発育が遅れ、3つのtrans−シンナムアルデヒド濃度の各々による3日間の処理までに、第2の齢期を超えて成熟したアブラムシはなかった(図35)。更に、最も高い濃度のtrans−シンナムアルデヒド(5%)で処理したアブラムシの全ては、実験の経過全体を通じて1齢期に留まった。これらのデータは、trans−シンナムアルデヒドによる処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めること、及びこの応答が用量依存的であることを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。水単独で処理したアブラムシの約75パーセントが処理後3日の時点で生きていた(図36)。対照的に、0.05%、0.5%及び5%trans−シンナムアルデヒドで処理したアブラムシは、水単独で処理したアブラムシと比べて生存率が有意に低かった(水で処理した対照と比較した各処理群についてp<0.0001)。これらのデータは、天然抗微生物性trans−シンナムアルデヒドで処理したときに生存の用量依存的低下があったことを示している。
種々の濃度のtrans−シンナムアルデヒドがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、3日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。水単独で処理したアブラムシ(対照)は、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。同様に、最も低い濃度のtrans−シンナムアルデヒド(0.5%)で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。
本実施例は、そのうちの幾つかがサソリのウロダクス・ヤシェンコイ(Urodacus yaschenkoi)の毒腺トランスクリプトームにおけるAMPと同定される(Luna−Ramirez et al.,2017,Toxins)、複数のサソリ抗微生物ペプチド(AMP)によるアブラムシの処理を実証する。AMPは、典型的には正味正電荷を有し、従って細菌膜に対して高親和性を有する。本実施例は、AMPが昆虫に及ぼす効果が、AMPペプチドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、アブラムシの偏性共生者であるブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いてUy192溶液を製剤化した。対照溶液は、水+青色食品着色料を注入した葉及び試験管内の水であった。処理溶液は、葉への注入(青色食品着色料を含む)及び経植物(エッペンドルフ試験管内)による水中100ug/ml Uy192からなった。
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;20±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、2)水中100ug/ml AMPの処理溶液。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
LSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(上記)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。陰性対照単独で処理したアブラムシは、約6日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図38)。Uy192で処理したアブラムシでは発育が遅れ、8日間の処理後、アブラムシの成熟は、4齢期より先に進まなかった。これらのデータは、Uy192による処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたことを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの大多数が処理後3日の時点で生存していた(図39)。4日以降、アブラムシは、徐々に死に始め、一部が処理後7日を超えて生き延びた。
Uy192による処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、8日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。対照単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、水中100ug/ml Uy192で処理したアブラムシは、約7分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーであったことから(図40)、Uy192処理がブフネラ属(Buchnera)レベルを低下させたことが示される。
本実施例は、最近になってサソリのウロダクス・ヤシェンコイ(Urodacus yaschenkoi)の毒腺トランスクリプトームにおいてAMPと同定された(Luna−Ramirez et al.,2017,Toxins)幾つかのサソリ抗微生物ペプチド(AMP)D10、D3、Uyct3及びUy17によるアブラムシの処理を実証する。AMPは、典型的には正味正電荷を有し、従って細菌膜に対して高親和性を有する。本実施例は、AMPが昆虫に及ぼす効果が、AMPペプチドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、アブラムシの偏性共生者、ブフネラ・アフィディコラ(Buchnera aphidicola)である。
指示されるペプチド又はペプチドカクテル(詳細については以下のアブラムシマイクロインジェクション実験計画及び葉の灌流 − 植物実験計画の節を参照されたい)をアブラムシに直接マイクロインジェクションするか、又は葉の灌流と経植物送達との組み合わせを用いて送達した。陰性対照として、アブラムシに水をマイクロインジェクションするか(マイクロインジェクション実験について)、又は水を注入した葉上及び管内の水に置いた(葉の灌流及び植物送達実験について)。処理溶液は、水中に溶解した20nlの5μg/μlのD3又はD10(アブラムシマイクロインジェクションについて)、又は葉への注入及び経植物による水中40μg/mlのD10、Uy17、D3及びUyCt3のカクテル(エッペンドルフ試験管内)からなった。
NanoJet IIIオートナノリットルインジェクタを使用してインハウスの熱引きしたホウケイ酸ニードル(Drummond Scientific;カタログ番号3−000−203−G/XL)でマイクロインジェクションを実施した。アブラムシ(LSR−1系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の注入された個体を有した。成虫アブラムシの腹側胸部に20nlの水又は100ng(20ulの5ug/mlペプチドD3又はD10溶液のいずれかをマイクロインジェクションした。マイクロインジェクション速度は、5nl/secであった。注入後、茎が2%寒天中にあるソラマメの葉が入った深底ペトリ皿にアブラムシを置いた。
LSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢及び2齢アブラムシを実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり3つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、生存率を決定した。5日間の処理後、サソリペプチドを注入したアブラムシは、水を注入した対照と比較して生存率が低かった(D3、D10及び水の注入について、それぞれ9、35及び45%の生存)(図41)。これらのデータは、サソリAMP D3及びD10で処理したときに生存の低下があったことを示している。
サソリAMP D3及びD10の注入がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、注入後5日で各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。水単独を注入したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNA(47.4)比を有する一方、D3及びD10を注入したアブラムシは、低いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNA比を有した(それぞれ25.3及び30.9)(図42)。これらのデータは、サソリペプチドD3及びD10による処理が細菌共生者ブフネラ属(Buchnera)のレベルの低下を引き起こしたことを示している。
eNASCOアブラムシ(ブフネラ属(Buchnera)及びセラチア属(Serratia)を含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を上記に記載したとおりソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、2)処理溶液は、水中各40μg/mlのD10、Uy17、D3及びUyCt3からなった。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。6日間の処理後、ペプチドカクテルで処理したアブラムシは、水で処理したアブラムシと比較して生存率が低かった。9日後には、この効果が一層明らかである(ペプチドカクテル処理及び水処理について、それぞれ16及び29%生存)(図43)。これらのデータは、サソリAMPのカクテルで処理したときに生存の低下があったこと、及び前出の実施例に示されるとおり、これらのAMPがアブラムシの内部共生体レベルを低下させたことを示している。
本実施例は、ウイルスに由来する細胞透過性ペプチドとの融合サソリ抗微生物ペプチド(AMP)(Uy192)によるアブラムシの処理を実証する。AMP Uy192は、サソリのウロダクス・ヤシェンコイ(Urodacus yaschenkoi)の毒腺トランスクリプトームにおける幾つかの近年同定されたAMPの1つである(Luna−Ramirez et al.,2017,Toxins)。AMPは、典型的には正味正電荷を有し、従って細菌膜に対して高親和性を有する。アブラムシ細胞へのサソリペプチドUy192の送達を増強するため、ヒト免疫不全ウイルスI型(HIV−1)のトランス活性化転写因子(TAT)タンパク質の一部分に融合したペプチドを合成した。先行研究では、この細胞透過性ペプチド(CPP)を他の分子にコンジュゲートすると、形質導入を介した細胞への取り込みが増加したことが示されている(Zhou et al.,2015 Journal of Insect Science and Cermenati et al.,2011 Journal of Insect Physiology)。本実施例は、融合ペプチドが昆虫に及ぼす効果が、抗微生物ペプチドに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ属(Buchnera)である。
細胞透過性ペプチドにコンジュゲートし、且つ6FAMで蛍光タグを付加したサソリペプチド(Uy192+CPP+FAM)を、葉の灌流及び経植物送達の組み合わせを用いて製剤化した。対照溶液(水)又は処理溶液(Uy192+CPP+FAM)を葉に注入し、エッペンドルフ試験管に入れた。処理溶液は、水中100μg/ml Uy192+CPP+FAMを含んだ。
LSR−1アブラムシ、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、2)水中100μg/ml Uy192+CPP+FAMで処理したUy192+CPP+FAM。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
LSR−1 A.ピスム(A.pisum)1齢アブラムシを実験計画(上記)に定義されるとおり3つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。0日目及び1日目について、水で処理したアブラムシ及び細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理したアブラムシの両方とも同様の発育であった(図44)。しかしながら、2日目までに対照処理のアブラムシは、2齢期又は3齢期のいずれかにまで発育した一方、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理した一部のアブラムシは、初齢期のままであった(図44)。処理後3日においてもなお、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理した一部のアブラムシは、初齢期のままであった(図44)。処理後7日までに、水で処理したアブラムシの大多数が5齢期又は5齢繁殖期まで発育した。対照的に、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理したアブラムシは、50パーセントのみが5齢期まで発育した一方、約42及び約8パーセントのアブラムシは、それぞれ3齢期又は4齢期に留まった(図44)。これらのデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドUy192による処理がアブラムシの発育の進行を遅らせ且つ止めたことを示している。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。対照単独で処理したアブラムシの約40%が7日間の実験を生き延びた(図45)。対照的に、100μg/ml Uy192+CPP+FAMで処理したアブラムシについて、生存率は、有意に低く(p=0.0036、ログ・ランク・マンテル・コックス検定による)、僅か16%のアブラムシのみが7日目まで生き延びた(図45)。これらのデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドUy192で処理したときに生存の低下があったことを示している。
Uy192+CPP+FAMによる処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、5日間の処理後に各群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。水で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNA比(約134)を有した。対照的に、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドで処理したアブラムシは、5日間の処理後に約1.8分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーであった(図46)。これらのデータは、細胞透過性ペプチドに融合したサソリペプチドによる処理が内部共生体レベルを低下させたことを示している。
細胞透過性ペプチドがバクテリオサイトへのサソリペプチドの直接的な送達に役立つかどうかを試験するため、分離したバクテリオサイトを融合タンパク質に直接曝露し、イメージングした。1%w/v BSAを補充したシュナイダー培地(Schneider−BSA培地)でアブラムシからバクテリオサイトを解離し、20ulのシュナイダー培地が入ったイメージングウェルに置いた。サソリペプチドの100ug凍結乾燥アリコートを100ulのシュナイダー培地に再懸濁して1mg/ml溶液を作製し、バクテリオサイトが入ったウェルに5ulのこの溶液を混合した。室温で30分間インキュベートした後、バクテリオサイトを徹底的に洗浄して、溶液中のいかなる過剰な遊離ペプチドも除去した。インキュベーション前及びその後にバクテリオサイトの画像を取得した(図47)。融合ペプチドは、バクテリオサイト膜を通過し、ブフネラ属(Buchnera)に直接利用可能となった。
本実施例は、パントテン酸(ビタミンB5)のアルコール類似体であるプロビタミンのパントテノールによるアブラムシの処理を実証する。アブラムシは、偏性内部共生細菌、ブフネラ属(Buchnera)を有し、これは、アブラムシが必須アミノ酸及びビタミンB5を含めたビタミン類を作り出すことを促進する。先行研究では、パントテノールが特異的寄生虫キナーゼの阻害によって熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparium)の成長を阻害することが示されている(Saliba et al.,2005)。昆虫をパントテノールで処理すれば、細菌−昆虫共生にとって有害であり、従って昆虫適応度に影響するであろうと仮定された。本実施例は、パントテノールによる処理が昆虫適応度を低下させたことを実証する。
パントテノール溶液を送達方法に応じて製剤化した:
1)経植物人工食中:必須アミノ酸(2mg/mlヒスチジン、2mg/mlイソロイシン、2mg/mlロイシン、2mg/mlリジン、1mg/mlメチオニン、1.62mg/mlフェニルアラニン、2mg/mlスレオニン、1mg/mlトリプトファン及び2mg/mlバリン)不含の人工食(Akey and Beck,1971をベースとする;実験計画を参照されたい)に製剤化した0(陰性対照)又は10若しくは100uMパントテノール含有。
2)葉面塗布:水中100μlの0.025%非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒Silwet L−77(陰性対照)又は100μlの溶媒溶液中に製剤化した50μg/mlのリファンピシンを葉の表面に直接塗って乾燥させた。
アブラムシ(eNASCO、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から1齢及び2齢アブラムシを採集し、3つの異なる処理群に分割した:1)必須アミノ酸不含の人工食単独、2)必須アミノ酸不含の人工食単独及び10uMパントテノール、及び3)必須アミノ酸不含の人工食単独及び100uMパントテノール。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。
eNASCO1齢及び2齢アブラムシを植物送達実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり3つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、約5日で成虫期(5齢期)に達し始めた(図48A)。パントテノールで処理したアブラムシでは、特に処理後2及び3日目の時点で発育が遅れたことから(図48A)、パントテノールによる処理がアブラムシの発育を妨げることが指摘される。最終的には、各処理群のほとんどのアブラムシが成虫になり、繁殖し始めた。時間の経過に伴うアブラムシの発育段階をモニタすることに加えて、アブラムシをまたイメージングして、アブラムシの表面積を決定した。1日間の処理後は、全てのアブラムシが同じサイズであったが、しかしながら、処理後3日までに、パントテノールで処理したアブラムシは、未処理対照と比べて表面積が小さかった。更に、パントテノールで処理したアブラムシは、実験の経過にわたって必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシと比較して体のサイズ(表面積によって決定したとき)の増加が大幅に少なかった(図48B)。
処理時にアブラムシの生存率も測定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で飼育したアブラムシは、10又は100uMパントテノールで処理したアブラムシと比較してより高い生存率を有したことから(図49)、パントテノール処理がアブラムシ適応度に負の影響を及ぼしたことが指摘される。
処理下のアブラムシにおいて繁殖力もモニタした。成虫まで生き延びて繁殖するアブラムシの割合を決定した。必須アミノ酸不含の人工食で処理したアブラムシは、約4分の1が生き延びて処理後8日までに成虫になった(図50A)。対照的に、10又は100uMパントテノールで処理したうちの10分の1をごく僅かに超えるアブラムシが生き延びて処理後8日までに成虫になり、繁殖した。各処理群のアブラムシが繁殖し始める平均日数も測定し、全ての処理群について、アブラムシが繁殖し始める平均日数は、7日であった(図50B)。加えて、成虫の繁殖アブラムシによって産生される1日当たりの子孫の数の平均値もモニタした。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、約7子孫/日を産生した。対照的に、10及び100uMパントテノールで処理したアブラムシは、図50Cに示される、それぞれ約4及び5子孫/日を産生するに過ぎなかった。まとめると、これらのデータは、パントテノール処理がアブラムシの繁殖の消失を引き起こしたことを示している。
パントテノールがアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、8日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。必須アミノ酸不含の人工食単独で処理したアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有し、2つの濃度のパントテノールの各々で処理したアブラムシも同じであった(図51)。これらのデータは、パントテノール処理がブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー数に直接的な影響を及ぼさないことを示している。
0.025%の非イオン性有機ケイ素系界面活性剤溶媒、Silwet L−77に、10uMパントテノールの終濃度に達するようにパントテノール粉末を加えた。この処理液を、0.22umフィルタを使用してろ過滅菌し、4℃で保存した。前の実施例に記載されるとおり、アブラムシ(eNASCO系統、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum))をソラマメ植物上で育てた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(溶媒溶液のみ)、及び2)溶媒中10uMパントテノール。100ulの溶液を2×2cm断片のソラマメの葉に吸収させた。
eNASCO 1齢アブラムシを本明細書に記載される実験計画に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。対照又はパントテノール溶液のいずれかで処理した塗布した葉に置いたアブラムシは、処理後2日まで同じ速度で成熟した(図52)。これらのデータは、パントテノールの葉面塗布がアブラムシの発育に影響を及ぼさなかったことを示している。
葉面塗布処理時にアブラムシの生存率も測定した。パントテノールを塗布した葉に置いたアブラムシは、対照溶液を塗布した葉に置いたアブラムシよりも生存率が低かった(図53)。これらのデータは、葉面塗布によって送達されるパントテノール処理がアブラムシの生存に有意に(p=0.0019)影響を及ぼしたことを示している。この実験では、全てのアブラムシが死亡し、DNAを抽出してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNA比を決定するためにとっておくアブラムシは残っていなかった。
本実施例は、アミノ酸類似体のカクテルによるアブラムシの処理を実証する。この処理の目的は、ApGLNT1グルタミントランスポーターを介したバクテリオサイトへのグルタミンの取り込みを阻害することであった。以前、アルギニンがグルタミントランスポーターによるグルタミン取り込みを阻害することが示されており(Price et al.,2014 PNAS)、本発明者らは、アルギニンの類似体又は他のアミノ酸類似体による処理もアブラムシバクテリオサイトへの必須アミノ酸の取り込みを阻害し得ると仮定した。本実施例は、処理時の適応度の低下が、アミノ酸類似体に敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、ブフネラ属(Buchnera)である。
葉の灌流及び経植物による送達のためにアミノ酸カクテルを製剤化した。この送達方法は、葉に水中約1mlのアミノ酸カクテル(カクテル中の成分のリストについては以下を参照されたい)又は水のみを含有する1mlの陰性対照溶液を注入することからなった。
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)、及び2)アミノ酸カクテル処理。アミノ酸カクテルは、以下の薬剤の各々を指示される終濃度で含有した:330μM L−NNA(N−ニトロ−L−アルギニン;Sigma)、0.1mg/ml L−カナバニン(Sigma)、0.5mg/ml D−アルギニン(Sigma)、0.5mg/ml D−フェニルアラニン(Sigma)、0.5mg/ml D−ヒスチジン(Sigma)、0.5mg/ml D−トリプトファン(Sigma)、0.5mg/ml D−スレオニン(Sigma)、0.5mg/ml D−バリン(Sigma)、0.5mg/ml D−メチオニン(Sigma)、0.5mg/ml D−ロイシン及び6μM L−NMMA(クエン酸塩)(Cayman Chemical)。約1mlの処理溶液を注入によってソラマメの葉に灌流し、植物の茎を、処理溶液が入った1.5mlエッペンドルフ試験管に入れた。パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この給餌システムを深底ペトリ皿(Fisher Scientific、カタログ番号FB0875711)内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。各処理につき合計56〜58匹のアブラムシを各葉の上に置いた(各処理は28〜31匹のアブラムシの2レプリケートからなった)。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。給餌システムは、実験全体を通じて2〜3日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。実験全体を通じてアブラムシの発育段階(1齢、2齢、3齢、4齢及び5齢)を毎日決定し、5日目にアブラムシの顕微鏡画像を撮影してアブラムシの面積測定値を決定した。
LSR−1 1齢アブラムシを葉の灌流及び経植物送達実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水で処理したアブラムシは処理後5日目に成虫期(5齢期)に達し始めた(図54A)。処理後6日までに、水で処理したアブラムシの約20パーセントが5齢期に達した。対照的に、アミノ酸カクテルで処理したアブラムシのうち、5齢期に達したのは、6日後であっても3パーセント未満であった(図54A)。アミノ酸カクテルで処理したときのこの発育の遅れは、処理後5日で取ったアブラムシのサイズ測定値により更に例証された。水単独で処理したアブラムシは、約0.45mm2であった一方、アミノ酸カクテルで処理したアブラムシは、約0.33mm2であった(図54B)。これらのデータは、アミノ酸カクテルによる処理がアブラムシの発育を遅らせ、アブラムシ適応度に負の影響を与えたことを示している。
アミノ酸類似体カクテルによる処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、6日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。対照溶液に置いたアブラムシは、高いブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピー比を有した。対照的に、AAカクテル処理に置いたアブラムシは、ブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNAコピーが劇的に減少したことから(図55)、AA類似体カクテル処理が内部共生体ブフネラ属(Buchnera)を除去したことが示される。
本実施例は、3つの抗微生物剤の併用−抗生物質(リファンピシン)、ペプチド(サソリペプチドUy192)及び天然抗微生物薬(低分子量キトサン)による昆虫の処理を実証する。他の実施例において、これらの薬剤の各々を個別に投与したところ、アブラムシ適応度が低下し、内部共生体レベルが減少した。本実施例は、併用処理を送達することにより、各個別の薬剤単独による処理と同様に又はそれよりも良好に昆虫適応度及び内部共生体レベルが減少したことを実証する。
葉の灌流及び経植物による送達のために併用処理を製剤化した。この送達方法は、水中約1mlの併用処理液(100μg/mlリファンピシン、100μg/ml Uy192及び300μg/mlキトサンの終濃度で)又は水のみを含有する1mlの陰性対照溶液を葉に注入することからなった。
アブラムシLSR−1(これは、ブフネラ属(Buchnera)のみを含む)、アキルトシフォン・ピスム(Acyrthosiphon pisum)を、環境制御されたインキュベーター(16時間明期/8時間暗期の光周期;60±5%RH;25±2℃)においてソラマメ植物(Johnny’s Selected Seedsからのブロマソラマメ(Vroma vicia faba))上で育てた。アブラムシの飼育に使用する前に、ソラマメ植物は、鉢植えのための土において24℃で16時間明期及び8時間暗期で成長させた。母性効果又は植物間の健康の差を抑制するため、異なる植物からの5〜10匹の成虫を10本の2週齢植物に分配し、高密度になるまで5〜7日間増殖させた。実験のため、健康植物から初齢アブラムシを採集し、2つの異なる処理群に分割した:1)陰性対照(水処理)及び2)100μg/mlリファンピシン、100μg/ml Uy192及び300μg/mlキトサン処理の併用。約1mlの処理溶液を注入によってソラマメの葉に灌流し、処理溶液が入った1.5mlエッペンドルフ試験管に植物の茎を入れた。パラフィルムを使用して管の口を閉じた。次に、この処理システムを深底ペトリ皿(Fisher Scientific、カタログ番号FB0875711)内に置き、植物の葉にアブラムシを当てがった。各処理につき合計56匹のアブラムシを各葉の上に置いた(各処理は28匹のアブラムシの2レプリケートからなった)。各処理群が採集植物の各々からほぼ同じ数の個体を受け取った。給餌システムは、実験全体を通じて2〜3日毎に交換した。毎日生存に関してアブラムシをモニタし、死亡したアブラムシは、見付け次第、深底ペトリ皿から取り除いた。実験全体を通じてアブラムシの発育段階(1齢、2齢、3齢、4齢及び5齢)を毎日決定し、5日目にアブラムシの顕微鏡画像を撮影してアブラムシの面積測定値を決定した。
LSR−1 1齢アブラムシを葉の灌流及び経植物送達実験計画(本明細書に記載される)に定義されるとおり2つの別個の処理群に分割した。アブラムシを毎日モニタして、各発育段階にあるアブラムシの数を決定した。水で処理したアブラムシは処理後5日目で成虫期(5齢期)に達し始めた(図56A)。処理後6日までに、水で処理したアブラムシの約20パーセントが5齢期に達した。対照的に、3つの薬剤の併用で処理したアブラムシは、6日後であっても5齢期に達しなかった(図56A)。併用処理時のこの発育の遅れは、処理後5日で取ったアブラムシのサイズ測定値により更に例証された。水単独で処理したアブラムシは、約0.45mm2であった一方、3剤併用で処理したアブラムシは、約0.26mm2であった(図56B)。これらのデータは、薬剤の併用による処理がアブラムシの発育を遅らせ、アブラムシ適応度に負の影響を与えたことを示している。
処理後に生存も毎日モニタした。処理後2日で、水で処理したアブラムシの約75パーセントが生存していた一方、薬剤の併用で処理したアブラムシのうち、生存していたのは62パーセントのみであった。対照(水で処理した)群でより多くのアブラムシが処理を生き延びるというこの傾向は、実験の継続期間中にわたって続いた。処理後6日で、対照(水で処理した)アブラムシの64パーセントが生存した一方、リファンピシン、Uy192及びキトサンの併用で処理したアブラムシの58パーセントが生存した(図57)。これらのデータは、処理の併用がアブラムシの生存に負の影響を与えたことを示している。
ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物性の併用による処理がアブラムシ内のブフネラ属(Buchnera)の消失を特異的に引き起こしたかどうか、及びこの消失がアブラムシの適応度に影響を及ぼしたことを試験するため、6日間の処理後に各処理群のアブラムシからDNAを抽出し、qPCRを実施してブフネラ属(Buchnera)/アブラムシコピー数を決定した。水単独で処理したアブラムシ、約2.3の比のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNA(図58)。対照的に、ペプチド、抗生物質及び天然抗微生物性の併用で処理したアブラムシは、約2分の1のブフネラ属(Buchnera)/アブラムシDNA比であった(図58)。これらのデータは、併用処理により内部共生体レベルが減少し、そのためアブラムシ適応度の低下が引き起こされたことを示している。
本実施例は、DNA複製に必須の2つの酵素、DNAジャイレース及びトポイソメラーゼの活性を阻害する殺菌性抗生物質であるシプロフロキサシンによるゾウムシの処理の効果を実証する。本実施例は、シプロフロキサシンが別のモデル昆虫ゾウムシに及ぼす表現型効果が、シプロフロキサシンに敏感である、昆虫にとって内因性の細菌個体群の調節を通じて媒介されたことを実証する。1つの標的となる細菌株は、コクゾウムシ属(Sitophilus)一次内部共生体(SPE、カンディダトゥス・ソダリス・ピエラントニウス(Candidatus Sodalis pierantonius))である。
コクゾウムシ属(Sitophilus)のコクゾウムシ(シトフィルス・ゼアマイス(Sitophilus zeamais))を有機トウモロコシ上、27.5℃及び70%相対湿度で飼育した。ゾウムシ飼育に使用する前に、トウモロコシは、7日間凍結し、次に滅菌水で10%湿度に調湿した。実験のため、成虫雄/雌交配対を3つの異なる処理群に分割し、これは、トリプリケートで行った:1)水対照、2)250μg/mlシプロフロキサシン、及び3)2.5mg/mlシプロフロキサシン。シプロフロキサシン(Sigma)ストック溶液を0.1N HCl中25mg/mlで作成し、0.22μmシリンジフィルタに通して滅菌し、−20℃で保存した。処理のため、適量のストック溶液を滅菌水で希釈した。
1.第1の処理は、25gのトウモロコシを上記に挙げた3つの処理群:1)水対照、2)250μg/mlシプロフロキサシン、及び3)2.5mg/mlシプロフロキサシンの各々に浸漬することを含んだ。簡潔に言えば、25gのトウモロコシを50mlコニカルチューブに入れ、処理の各々を加えてチューブを完全に満たした。チューブを振盪機に1.5時間かけ、その後、トウモロコシを取り出して深底ペトリ皿に置き、風乾させた。次に、各処理群に雄/雌交配対を加え、4日間摂餌させた。
2.4日後、交配対を取り出し、1)水対照、2)250μg/mlシプロフロキサシン、及び3)2.5mg/mlシプロフロキサシンで処理した25gの新しいトウモロコシに置くことにより第2の処理に供した。交配対は、このトウモロコシ上で7日間摂餌し、産卵した。第2の処理からのトウモロコシを子孫の羽化に関して評価した(以下の子孫の評価を参照されたい)
3.交配対を最終処理に供し、これには、交配対を処理液(1)水対照、2)250μg/mlシプロフロキサシン、及び3)2.5mg/mlシプロフロキサシンに5秒間沈めること、及び次に1mlの1)水対照、2)250μg/mlシプロフロキサシン、及び3)2.5mg/mlシプロフロキサシンでコーティングしておいた10粒のトウモロコシカーネルが入ったバイアルに入れることの組み合わせが含まれた。
25日後、成虫交配対の第2の処理からのトウモロコシカーネルの1つのレプリケートを切開し(上記の実験計画を参照されたい)、発育中の幼虫、蛹又は成虫ゾウムシの存在について確認した。コクゾウムシ属(Sitophilus)ゾウムシの発育のほとんどは、穀粒/コメ/トウモロコシの中で行われ、その発育が完了し次第、成虫は、カーネルから羽化する。トウモロコシカーネルをメスで静かに切開し、発育中のゾウムシを全て採集し、成虫、蛹及び幼虫の割合を決定した。次に、切開からのゾウムシを表面滅菌し、SPEのレベルをqPCRによって決定した。第2の処理からの群の各々の残りの2レプリケートのトウモロコシカーネルは、切開しなかったが、成虫ゾウムシの羽化に関して毎日確認した。
25mgのトウモロコシカーネルを50mlコニカルチューブに入れ、水又は水中2.5mg/ml若しくは0.25mg/mlシプロフロキサシンを加えてチューブを満たした。カーネルを本明細書に記載されるとおり1.5時間浸漬した。浸漬後、カーネルを風乾し、抗生物質がカーネルを被覆してそれに透過することが可能であったかどうかを決定するために評価した。これを試験するため、水中の大腸菌(Escherichia coli)DH5αの濃縮サンプルを5つのルリアブロス(LB)プレートに塗沫した。各プレートに対し、以下を行った、1)水中に浸漬したトウモロコシカーネルを加え、2)2.5又は0.25mg/mlシプロフロキサシンに浸漬しておいたトウモロコシカーネル全体を加え、及び3)2.5又は0.25mg/mlシプロフロキサシンに浸漬しておいたトウモロコシカーネルの半分を加え、内側を下にプレートに付けて置いた。プレートを37℃で一晩インキュベートし、翌日、細菌の成長及び/又は阻害領域を評価した。
シプロフロキサシンがカーネル後にトウモロコシカーネルの表面をコーティングすることができたかどうかを試験するため、トウモロコシカーネルを抗生物質不含の水又は2.5若しくは0.25mg/mlシプロフロキサシンを含有する水に(上記に記載したとおり)浸漬した。次に、大腸菌(E.coli)の濃縮培養物をLBプレートに塗り広げ、次にコーティングされたカーネルの1つをプレートの中央に置いた。プレートを一晩インキュベートし、翌日細菌の成長を評価した。
S.ゼアマイス(S.zeamais)交配対を実験計画(上記)に定義されるとおり3つの別個の処理群に分割した。ゾウムシを毎日モニタし、実験の経過中、全てのゾウムシが生き残った。18日間の処理後、ゾウムシを表面滅菌し、ゲノムDNAを抽出し、qPCRによってSPEレベルを測定した。水のみで処理したゾウムシは、250ug/ml及び2.5mg/mlシプロフロキサシンで処理したゾウムシと比較してSPE量がそれぞれ約4倍及び8倍であった(図57)。これらのデータは、ゾウムシをシプロフロキサシンで処理することによりSPEレベルが低下したことを示している。
7日間にF0交配対が卵を産み付け、続いて取り出されたトウモロコシカーネルを切開することにより、F1世代のゾウムシの発育を評価した。25日後、水/対照処理のトウモロコシには12の子孫が見られ、大多数(約67%)の子孫が蛹の形態であった(図58A)。250ug/ml及び2.5mg/mlシプロフロキサシンで処理したゾウムシでは、それぞれ13及び20の子孫が見られた。興味深いことに、抗生物質で処理したゾウムシは、対照処理のゾウムシと比較して発育の遅れを示し、大多数(250ug/ml及び2.5mg/mlシプロフロキサシンについて、それぞれ38及び65%)の子孫が幼虫の形態であった(図58A)。
第2の処理から当初の交配対を取り除いた後43日の間に羽化したゾウムシの数を繁殖力の尺度として使用した(図59A及び図59B)。最初のゾウムシは、29日目に羽化し、43日目までに羽化したゾウムシの総数をカウントした。水及び250ug/mlで処理したゾウムシは、同程度の量のF1子孫を有したが、2.5mg/ml処理群から羽化した子孫は、はるかに少なかったことから、抗生物質処理がSPEレベルを低下させ、ゾウムシの繁殖力に影響を及ぼしたことが示される。
本実施例は、細菌RNAポリメラーゼの阻害によってDNA依存性RNA合成を阻害する狭域スペクトル抗生物質、リファンピシン及びタンパク質合成の阻害によって細菌の繁殖を妨げる広域スペクトル抗生物質、ドキシサイクリンで処理することにより、ナミハダニを死滅させ、その適応度を低下させることが可能であることを実証する。リファンピシン及びドキシサイクリンがダニに及ぼす効果は、抗生物質に敏感である、ダニにとって内因性の細菌個体群の調節によって媒介された。
これらの実験には2つの処理、1)0.025%Silwet L−77(陰性対照)又は2)250μg/mlリファンピシンと500μg/mlドキシサイクリンとを含有する抗生物質のカクテルを用いた。リファンピシン(東京化成工業株式会社)ストック溶液は、メタノール中に25mg/mlで作成し、0.22μmシリンジフィルタに通して滅菌し、−20℃で保存した。ドキシサイクリン(製造者)ストック溶液は、水中50mg/mlで作成し、0.22μmシリンジフィルタに通して滅菌し、−20℃で保存した。
このアッセイでは、ナミハダニに対する抗生物質溶液を試験し、内因性微生物を標的とすることによりその適応度がどのように変化したかを決定した。
・生存:元気に歩き回り、又は絵筆でつつかれた後に動く。
・死亡:動かず、絵筆による刺激に反応しない。
抗生物質カクテルで処理したナミハダニの生存率を、陰性対照で処理したダニと比較した。カクテルで処理したダニの生存率は、対照と比較して低下した(図60)。
本実施例は、特定の昆虫細菌を標的とした環境サンプルからのファージの分離及び精製を実証する。本実施例は、プラークアッセイにより、その酸素消費速度及び細胞外酸性化速度を測定することにより、分離されたファージのインビトロでの標的細菌に対する有効性も実証する。最後に、本実施例は、細菌に対して分離されたファージでハエを処理することによるハエからの標的細菌に対するファージの能力を測定することにより、インビボでのファージの有効性を実証する。本実施例は、昆虫の適応度を低下させた病原性細菌の標的化にファージを使用してその細菌を除去し得ることを実証する。具体的には、園芸コンポストから分離されたファージを使用して、ハエの病原性細菌であるセラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)を除去することができる。
天然サンプルからの特異的バクテリオファージの分離:
標的細菌に対するバクテリオファージを環境由来材料から分離した。簡潔に言えば、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)の飽和培養物を新鮮な2倍濃度トリプトソイブロス(TSB)に希釈して24〜26℃で対数期初期まで約120分間成長させるか、又は2倍濃度ルリア−ベルターニ(LB)ブロスに希釈して37℃で約90分間成長させた。園芸コンポストをPBS中にホモジナイズすることにより調製し、0.2μmろ過によって滅菌した。未処理の下水を0.2μmろ過によって滅菌した。1容積のろ過した原材料を対数期細菌培養物に加え、インキュベーションを24時間継続した。培養物をペレット化し、上清液を0.45μmメンブレンでろ過することにより、集積原材料を調製した。
上記のとおり分離及び精製したバクテリオファージを使用して、後続の実験に用いるファージライセートの増殖及び生成を実施した。簡潔に言えば、飽和細菌培養物を新鮮培地に100倍希釈し、60〜120分間成長させて、有効なファージ感染のための初期対数増殖状態を実現した。対数期初期培養物にファージ懸濁液又はライセートを加え、ファージ増殖及び溶菌の指標である澄明なブロスが観察されるまで又は感染後最長24時間までインキュベーションを継続した。細胞を7,197×gで20分間ペレット化し、次に0.45又は0.2μmメンブレンで上清液をろ過することによりライセートを回収した。ろ過したライセートを4℃で保存した。
Seahorse XFe96アナライザー(Agilent)を使用して、感染中に酸素消費速度(OCR)及び細胞外酸性化速度(ECAR)をモニタすることによりファージが細菌に及ぼす効果を測定した。実験前日に、1ウェル当たり15μLの1mg/mL ポリ−L−リジンストックでXFe96プレートをコーティングし、28℃で一晩乾燥させ、及び200μLのXF Calibrantが入ったウェルに入れて暗所下室温でインキュベートすることによりXFe96プローブを平衡化した。翌日、ポリ−L−リジンでコートしたプレートをddH2Oで2回洗浄した。大腸菌(E.coli)BL21(LB、37℃)又はS.マルセセンス(S.marcescens)(TSB、25℃)の飽和一晩培養物を同じ培地に1:100で継代培養し、曝気しながら30℃で約2.5時間成長させた。次に、同じ培地を使用して培養物をO.D.600nm 約0.02に希釈した。処理液は、ストックをSM緩衝液に10×最終濃度で希釈し、20μLの10×溶液をプローブプレートの適切な注入ポートにロードすることにより調製した。XFe96フラックスアナライザーでプローブを平衡化している間、90μLの細菌懸濁液又は培地対照を加えることにより細菌プレートを調製し、3,000rpmで10分間スピンした。遠心後、ウェルに更なる90μLの適切な培地を、細菌付着を妨げないように静かに加え、1ウェル当たりの総容積を180μLにした。
ヌクレアーゼで前処理して、蛍光シグナル解釈を妨げ得るウイルス外核酸を取り除くことにより、バクテリオファージ調製物を染色のため調製した。簡潔に言えば、10mLのファージライセートに10mMの最終濃度でMgCl2を加え、RNase A(Qiagen)及びDNase I(Sigma)を両方とも10μg/mLの最終濃度となるように加えた。サンプルを室温で1時間インキュベートした。ヌクレアーゼ処理後、5mLのライセートを1μLのSYBR Gold(Thermo、10,000×)と合わせ、室温で約1.5時間インキュベートした。続いて、Amicon限外ろ過カラムを使用してサンプルから過剰な色素を取り除いた。簡潔に言えば、10mLのSM緩衝液を加え、5,000×g、4℃で5分間スピンすることにより、Amiconカラム(15mL、10k MWCO)を洗浄した。次に、標識したファージサンプルを、カラムを通じて5,000×g、4℃でスピンして、最終的に容積を約10倍低下させた(15〜30分)。サンプルを洗浄するため、各リザーバに5mL SM緩衝液を加えてスピンを繰り返し、続いて更に2回洗浄した。3回目の洗浄後、Amiconリザーバから保持サンプルをピペッティングにより取り除き、SM緩衝液を使用して約1mLにした。より大きい夾雑物を取り除くため、洗浄及び標識したファージサンプルを10,000×gで2分間スピンし、続いて上清を0.2μmメンブレンでろ過して黒色マイクロチューブに入れ、4℃で保存した。
S.マルセセンス(S.marcescens)培養物をトリプトソイブロス(TSB)中30℃において200rpmで絶えず振盪しながら成長させた。
前述の本発明は、理解を明確にするために説明及び例として幾らか詳細に記載されているが、そうした記載及び例が本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。本明細書に引用される全ての特許及び科学文献の開示は、全体として参照により明示的に援用される。
Claims (9)
- ヒト病原体のベクターの適応度を低下させる方法であって、
以下:セクロピン(配列番号82)、メリチン、コプシン、ドロソマイシン(配列番号93)、ダームシジン(配列番号81)、アンドロピン(配列番号83)、モリシン(配列番号84)、セラトトキシン(配列番号85)、アバエシン(配列番号86)、アピダエシン(配列番号87)、プロフェニン(配列番号88)、インドリシジン(配列番号89)、プロテグリン(配列番号90)、タキプレシン(配列番号91)又はデフェンシン(配列番号92)の1つ以上と少なくとも90%の配列同一性を有する抗微生物ペプチドを前記ベクターに送達すること
を含む方法。 - 前記送達は、前記ベクターが成長、生活、繁殖、摂餌又は寄生する少なくとも1つの生息場所に前記抗微生物ペプチドを送達することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記抗微生物ペプチドは、前記ベクターによる摂取のための、昆虫が摂食可能な組成物で送達される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記抗微生物ペプチドは、液体、固体、エアロゾル、ペースト、ゲル又は気体組成物として製剤化される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 昆虫は、カ、小昆虫類、シラミ、スナバエ、マダニ、サシガメ、ツェツェバエ又はノミの少なくとも1つである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ヒト病原体病原体のベクター内の微生物を標的とするように製剤化される、以下:セクロピン、メリチン、コプシン、ドロソマイシン、ダームシジン、アンドロピン、モリシン、セラトトキシン、アバエシン、アピダエシン、プロフェニン、インドリシジン、プロテグリン、タキプレシン又はデフェンシンの1つ以上と少なくとも90%の配列同一性を有する抗微生物ペプチドを含む組成物。
- 前記抗微生物ペプチドは、前記組成物中において約0.1ng/g〜約100mg/gの濃度である、請求項6に記載の組成物。
- 前記抗微生物ペプチドは、ターゲティングドメインを更に含む、請求項6又は7に記載の組成物。
- 前記抗微生物ペプチドは、細胞透過性ペプチドを更に含む、請求項6〜8のいずれか一項に記載の組成物。
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