ES2963455T3

ES2963455T3 - Nuevos bioplaguicidas para el control de plagas en plantas

Info

Publication number: ES2963455T3
Application number: ES17784590T
Authority: ES
Inventors: Anastasija Panevska; Jaka Razinger; Kristina Sepcic; Peter Macek; Matej Skocaj; Spela Modic; Marusa Novak; Matej Butala; Vesna Hodnik; Maja Grundner; Tom Turk
Original assignee: KMETIJSKI INST SLOVENIJE; LJUBLJANI, University of; Univerza v Ljubljani
Current assignee: KMETIJSKI INST SLOVENIJE; LJUBLJANI, University of; Univerza v Ljubljani
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2024-03-27
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: PL3662069T3; HRP20231266T1; US20200245628A1; BR112020005331A2; CN111164212A; EP3662069A1; EP3662069C0; CA3077263A1; WO2019063101A1; EP3662069B1

Abstract

La presente invención se refiere a complejos proteicos citolíticos de dos componentes que consisten en una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de la aegerolisina y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, y particularmente a su uso para controlar una plaga de plantas, tal como para controlar el escarabajo de la patata de Colorado (Leptinotarsa decemlineata) o el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera). Más específicamente, la invención se refiere a complejos proteicos citolíticos de dos componentes formados por una pluralidad de moléculas de una de las aegerolisinas ostreolisina A6 (OlyA6), pleurotolisina A2 (PlyA2) y erilisina A (EryA) con una pluralidad de moléculas de pleurotolisina B (PlyB) o proteínas similares, que han demostrado ser tóxicas para los insectos plaga agrícolas antes mencionados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos bioplaguicidas para el control de plagas en plantas

Campo técnico de la invención

La presente invención entra dentro del ámbito de la protección de plantas y se refiere a complejos proteicos citolíticos de dos componentes que consisten en una pluralidad de moléculas, tal como al menos 20 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas, y una pluralidad de moléculas, tal como al menos 10 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, y en particular a su uso para controlar una plaga en plantas, tal como para controlar el escarabajo de la patata de Colorado(Leptinotarsa decemlineata)o el gusano de la raíz del maíz occidental(Diabrotica virgifera virgifera).De manera más específica, la invención se refiere a complejos proteicos citolíticos de dos componentes formados por una pluralidad de moléculas de una de las aegerolisinas ostreolisina A6 (OlyA6), pleurotolisina A2 (PlyA2) y erilisina A (EryA) con una pluralidad de moléculas de pleurotolisina B (PlyB) o proteínas similares, que se ha demostrado que son tóxicos para los insectos plaga agrícolas antes mencionados.

Problema técnico

Los plaguicidas químicos sintéticos han sido las principales herramientas utilizadas para controlar el escarabajo de la patata de Colorado (CPB, del inglésColorado potato beetle)y el gusano de la raíz del maíz occidental (w Cr , del inglésWestern corn rootworm).Los plaguicidas biológicos, tales como las proteínas insecticidas procedentes deBacillus thuringiensishan jugado un papel importante como alternativa a los plaguicidas químicos. Sin embargo, debido a la constante evolución de la resistencia a los plaguicidas, existe una necesidad continua de nuevos bioplaguicidas que se dirijan a dianas moleculares específicas de las plagas.

Estado de la técnica

El CPB y el WCR tienen el mayor impacto económico y provocan enormes daños a los cultivos de patatas y maíz (Alyokhinet al.,2008; Gassmannet al.,2011; Jakkaet al.,2016). Los métodos actuales para controlar el<c>P<b>y el WCR incluyen plaguicidas químicos que enfrentan serios problemas debido a la constante evolución de la resistencia a los plaguicidas (Meinkeet al.,1998; Alyokhinet al.,2008; Pereiraet al.,2015; Alyokhinet al.,2015; Jakkaet al.,2016). Otros problemas son los residuos de plaguicidas químicos en los alimentos o piensos, problemas medioambientales (Devineet al.,2007) y cuestiones de salud humana. Por tanto, la búsqueda de bioplaguicidas alternativos es de suma importancia.

El CPB ha estado impulsando el desarrollo de la industria insecticida moderna desde sus inicios (Casagrande, 1987). Los plaguicidas químicos, así como algunas endotoxinas deBacillus thuringiensissubsp.tenebrionis,generalmente se utilizan para el control del CPB. A pesar del constante desarrollo de nuevos plaguicidas, el problema debido al desarrollo de la resistencia a través de diferentes mecanismos persiste (Alyokhinet al.,2008).

Para el control del WCR, los agricultores europeos y americanos aplican insecticidas granulados o utilizan semillas tratadas con insecticidas. En ocasiones también se aplican insecticidas foliares contra adultos (Meissleet al.,2009). Sin embargo, estas prácticas pueden provocar graves problemas de salud y ambientales. Como alternativa, el WCR está controlado mediante maíz genéticamente modificado que expresa toxinas Cry deBacillus thuringiensis(maíz Bt) o mediante prácticas agronómicas, tales como la rotación de cultivos (Meissleet al.,2009). Sin embargo, el WCR ha desarrollado resistencia al maíz Bt y se ha adaptado a la rotación de cultivos (Gassmanet al.,2012; Chuet al.,2014; Jakkaet al.,2016). En 1998 se recomendaron opciones de control biológico para el WCR en el sudeste de Europa (Kuhlmann y Burgt, 1998).

Las aegerolisinas son proteínas de estructura beta, ácidas y de bajo peso molecular (~15-20 kDa), que se encuentran en varios taxones eucariotas y bacterianos (Berneet al.,2009; Novaket al.,2015; Butalaet al.,2017). La característica común de las aegerolisinas es su interacción con lípidos específicos en las membranas biológicas (Sepcicet al.,2004; Otaet al.,2013; Skocajet al.,2014; Bhatet al.,2015). Las aegerolisinas del género de hongosPleurotusse dirigen específicamente a las ceramidas fosfoetanolaminas (CPE, del inglésceramide phosphoethanolamines)(Figura 1),que son los principales esfingolípidos de membrana de los invertebrados (en particular de insectos y moluscos), pero que están presentes sólo en cantidades mínimas en taxones superiores (Crone y Bridges, 1963; Itasakaet al.,1973; Vacaruet al.,2013; Bhatet al.,2015). Asimismo, estas aegerolisinas pueden funcionar como complejos líticos de dos componentes en combinación con una proteína MACPF (complejo de ataque a la membrana/perforina) de 59 kDa que se dirige a las membranas celulares (Tomitaet al.,2004; Shibataet al.,2010; Otaet al.,2013; Lukoyanovaet al.,2015). También se han encontrado complejos citolíticos binarios y cuaternarios similares en los que las aegerolisinas se combinan con proteínas más grandes distintas de la aegerolisina en bacteriasClostridium bifermentassubsp.malaysia(Quareshiet al.,2014),Bacillus thuringiensis(Massonet al.,2004, Kelkeret al.,2014) yAlcaligenes faecalis(Yalpaniet al.,2017). Estos complejos citolíticos bacterianos heteroméricos basados en aegerolisina se están explotando como posibles insecticidas para plagas específicas. Cry34Abl, una proteína aegerolisina que pertenece al grupo más amplio de toxinas Cry específicas de insectos y su proteína asociada Cry35Abl ya se están utilizando (maíz Bt) como herramientas para controlar las larvas de<w>C<r>. Cry34Abl y su compañero se unen específicamente a receptores de (gluco)proteínas en la membrana de las células epiteliales del intestino medio de los insectos, donde ocurre el daño (Massonet al.,2004; Kaiser-Alexantet al.,2009; Gassmanet al.,2011). Sin embargo, las larvas de WCR han desarrollado recientemente resistencia al maíz Bt que produce Cry34Abl/Cry35Abl (Ludwicket al.,2017).

Las aegerolisinas del género de hongosPleurotus(OlyA6, PlyA2 y EryA) (SEQ ID NO: 1 a 3 en lafigura 2) en combinación con su compañero proteico específico, PlyB (SEQ ID NO: 4 en lafigura 2), representan nuevos bioplaguicidas prometedores para controlar CPB y WCR. La capacidad de las aegerolisinas del género de hongosPleurotuspara dirigirse al CPE y formar poros transmembrana en combinación con PlyB significa que se pueden utilizar como agentes de control de plagas. Asimismo, las posibilidades de que se desarrolle resistencia a ellos deberían ser mínimas, debido al hecho de que interactúan con el receptor de lípidos de membrana y no con proteínas de plagas que son propensas a variar y, por lo tanto, a desarrollar resistencia a un plaguicida.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de un complejo proteico de dos componentes que consiste en una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) para controlar una plaga en plantas;

en donde la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1;

en donde la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; y

en donde la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para proteger una planta contra una plaga en plantas o para controlar una plaga en plantas, que comprende la etapa de: aplicar una composición que comprende una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) y un vehículo adecuado, tal como una solución tampón, a una planta que lo necesite;

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una planta transgénica o su progenie que expresa o es capaz de expresar un complejo proteico de dos componentes como se define en el primer aspecto; comprendiendo dicha planta transgénica o su progenie una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican dicho complejo proteico de dos componentes, estando dichas secuencias de nucleótidos operativamente unidas a al menos un promotor que es funcional en dicha célula vegetal para provocar la producción de moléculas de ARNm.

La presente divulgación se puede resumir en los siguientes puntos:

1. El uso de un complejo proteico de dos componentes que consiste en una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) para controlar una plaga en plantas;

2. El uso de acuerdo con el punto 1, donde el complejo proteico de dos componentes consiste en 20 a 30 moléculas de un miembro de la familia aegerolisina y en 10 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF.

3. El uso de acuerdo con el punto 1 o 2, en donde la proporción de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas a moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF es 2:1.

4. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en donde el complejo proteico de dos componentes consiste en 20 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 10 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 22 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 11 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 24 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 12 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 26 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 13 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 28 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 14 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF.

5. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 4, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas es una aegerolisina procedente de un hongo del géneroPleurotus.

6. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 5, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas se selecciona del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A.

7. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas es ostreolisina, tal como la ostreolisina A6.

8. El uso de acuerdo con el punto 7, en donde la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

9. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 6, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas es pleurotolisina A, tal como la pleurotolisina A2.

10. El uso de acuerdo con el punto 9, en donde la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

11. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 10, en donde el miembro de la superfamilia MACPF es pleurotolisina B (PlyB).

12. El uso de acuerdo con el punto 11, en donde la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

13. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 12, en donde la plaga de la planta es un insecto. 14. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 13, en donde la plaga de la planta es un insecto herbívoro.

15. El uso de acuerdo con el punto 13 o 14, en donde la plaga de la planta es una larva del insecto.

16. El uso de acuerdo con el punto 13 o 14, en donde la plaga de la planta es un imago del insecto.

17. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 16, en donde el insecto es del orden Coleoptera. 18. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 17, en donde el insecto es de la familia Chrysomelidae.

19. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 18, en donde el insecto es del géneroLeptinotarsa.

20. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 18, en donde el insecto esLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado).

21. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 18, en donde el insecto es del géneroDiabrotica.

22. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 18, en donde el insecto esDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

23. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 13 a 18, en donde el insecto se selecciona del grupo que consiste enLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado) yDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

24. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 18, en donde la plaga de la planta se selecciona entre el escarabajo de la patata de Colorado y el gusano de la raíz del maíz occidental.

25. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 18, en donde la plaga de la planta es el escarabajo de la patata de Colorado, tal como las larvas del escarabajo de la patata de Colorado.

26. El uso de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 18, en donde la plaga de la planta es el gusano de la raíz del maíz occidental.

27. Un método para proteger una planta contra una plaga en la planta, que comprende la etapa de: aplicar una composición que comprende una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) y un vehículo adecuado, tal como una solución tampón, a una planta que lo necesite;

28. Un método para controlar una plaga en plantas, que comprende la etapa de: aplicar una composición que comprende una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) y un vehículo adecuado, tal como una solución tampón, a una planta que lo necesite;

29. El método de acuerdo con el punto 27 o 28, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas es una aegerolisina procedente de un hongo del géneroPleurotus.

30. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 29, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas es ostreolisina, tal como la ostreolisina A6.

31. El método de acuerdo con el punto 30, en donde la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 1.

32. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 29, en donde el miembro de la familia de las aegerolisinas es pleurotolisina A, tal como la pleurotolisina A2.

33. El método de acuerdo con el punto 32, en donde la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2.

34. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 33, en donde la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

35. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 34, en donde la proporción molar entre el miembro de la familia de las aegerolisinas y el miembro de la superfamilia Ma Cp F está en el intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1000:1, tal como aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 90:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1, aproximadamente 300:1, aproximadamente 400:1, aproximadamente 500:1, aproximadamente 600:1, aproximadamente 700:1, aproximadamente 800:1, aproximadamente 900:1 o aproximadamente 1000:1.

36. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 35, en donde la plaga de la planta es un insecto.

37. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 36, en donde la plaga de la planta es un insecto herbívoro.

38. El método de acuerdo con el punto 36 o 37, en donde la plaga de la planta es una larva del insecto.

39. El método de acuerdo con el punto 36 o 37, en donde la plaga de la planta es un imago del insecto.

40. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 39, en donde el insecto es del orden Coleoptera.

41. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 40, en donde el insecto es de la familia Chrysomelidae.

42. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 41, en donde el insecto es del géneroLeptinotarsa.

43. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 41, en donde el insecto esLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado).

44. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 41, en donde el insecto es del géneroDiabrotica.

45. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 41, en donde el insecto esDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

46. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 36 a 41, en donde el insecto se selecciona del grupo que consiste enLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado) yDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

47. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 35, en donde la plaga de la planta se selecciona entre el escarabajo de la patata de Colorado y el gusano de la raíz del maíz occidental.

48. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 35, en donde la plaga de la planta es el escarabajo de la patata de Colorado, tal como el escarabajo de la patata de Colorado.

49. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 27 a 35, en donde la plaga de la planta es el gusano de la raíz del maíz occidental.

50. Uso de un complejo proteico de dos componentes como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 12 o una composición como se define en uno cualquiera de los puntos 27 a 35 para la preparación de un agente fitosanitario.

51. Una planta transgénica o su progenie que expresa o es capaz de expresar un complejo proteico de dos componentes como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 12.

52. La planta transgénica o su progenie de acuerdo con el punto 51, que comprende (tal como transformada de manera estable con) una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un complejo proteico de dos componentes como se define en uno cualquiera de los puntos 1 a 12, estando dichas secuencias de nucleótidos operativamente unidas a al menos un promotor que es funcional en dicha célula vegetal para provocar la producción de moléculas de ARNm.

53. La planta transgénica o su progenie de acuerdo con el punto 51 o 52, en donde dicha planta transgénica o su progenie es una planta de cultivo.

54. La planta transgénica o su progenie de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 51 a 53, en donde dicha planta transgénica o su progenie es una planta de patata o una planta de maíz.

55. La planta transgénica o su progenie de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 51 a 54, en donde dicha planta transgénica o su progenie es una planta de patata.

56. La planta transgénica o su progenie de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 51 a 54, en donde dicha planta transgénica o su progenie es una planta de maíz.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1.Estructura de las ceramidas fosfoetanolaminas (CPE). Las CPE están compuestos por un resto de ceramida (base nitrogenada de cadena larga, que está unida por un enlace amida a un ácido graso de 12 a 24 átomos de C, denominado R2) unidaa través deun grupo 1-hidroxi por un enlace fosfodiéster a etanolamina. La base nitrogenada de cadena larga es 1,3-dihidroxi C14:1, 1,3-dihidroxi C16:1 o 1,3-dihidroxi C18:1, indicado por R1.

Figura 2.Secuencias de aminoácidos de OlyA6 (SEQ ID NO: 1), PlyA2 (SEQ ID NO: 2), EryA (SEQ ID NO: 3), PlyB (SEQ ID NO: 4) y EryB (SEQ ID NO: 5).

Figura 3.Bioensayo de alimentación del escarabajo de la patata de Colorado (CPB). Cada disco de hoja de patata se empapó en una mezcla de OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB o EryA/PlyB (0,5 mg/ml para OlyA6, PlyA2 o EryA y 0,04 mg/ml para PlyB) durante 5 min y después se transfirió en cada pocillo de la microplaca, al que se le añadió una larva de escarabajo de la patata de Colorado. La tasa de supervivencia se midió diariamente durante 5 días. El peso de las larvas se midió el día 1 y el día 5.

Figura 4.Bioensayo de alimentación del gusano de la raíz del maíz occidental. Se mezclaron mezclas de proteínas (PlyA2/PlyB) y dieta artificial (1:1, v:v) y se aplicó en cada pocillo. La concentración final de proteína fue de 0,5 mg/ml de PlyA2 y 0,04 mg/ml de PlyB. Se transfirió un único el gusano de la raíz del maíz occidental a cada pocillo y se observó durante 7 días.

Figura 5.Comparación del desarrollo entre las larvas del escarabajo de la patata de Colorado (CPB) tratadas con OlyA6/PlyB y las larvas tratadas con tampón (día 5). Las larvas jóvenes de CPB tratadas con tampón mostraron un aumento constante en peso y desarrollo (A), mientras que las larvas de CPB tratadas con OlyA6/PlyB no mostraron cambios de peso entre el día 1 y el día 5, probablemente como resultado de un cambio en el comportamiento alimentario después del día 1 (B).

Figura 6.Tasa de supervivencia y cambio de peso del escarabajo de la patata de Colorado (CPB) durante el bioensayo de alimentación. La alimentación de larvas de CPB con discos foliares tratados con mezclas proteicas de OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB o EryA/PlyB (0,5 mg/ml para OlyA6, PlyA2, EryA y 0,04 mg/ml para PlyB) provocaron una mortalidad larvaria significativa el día 5 después del inicio de la alimentación en el grupo de larvas jóvenes (L1 L2) (A). Sólo EryA/PlyB provocó un cambio de peso significativo en el grupo de larvas jóvenes (B). EryA/PlyB no provocó una mortalidad larvaria significativa en el grupo de larvas de edad avanzada (L3 L4) (C), mientras muestra un cambio de peso significativo (D). OlyA6/PlyB y PlyA2/PlyB provocaron una mortalidad larvaria significativa (C) en el grupo de edad avanzada, así como un cambio de peso significativo (D). En L1 y L2, el pronoto es completamente negro. En L3, el margen anterior del pronoto aparece de color marrón anaranjado. En L4, aproximadamente la mitad del pronoto es de color marrón claro en la parte anterior. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las mezclas de proteínas probadas y el tampón, que se utilizó como control negativo(p<0,05).

Figura 7.Bioensayo de alimentación del gusano de la raíz del maíz occidental (WCR). Se mezclaron mezclas de proteínas (OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB o EryA/PlyB) y dieta artificial (1:1, v:v) y se aplicaron a cada pocillo. La concentración final de OlyA6, EryA o PlyA2 fue 0,5 mg/ml y 0,04 mg/ml de PlyB. Se transfirió un único escarabajo del gusano de la raíz del maíz occidental a cada pocillo y se observó durante 7 días. OlyA6/PlyB provocó una mortalidad significativa en WCR adultos, lo que da como resultado una mediana de supervivencia de 5 días. Los asteriscos indican diferencias significativas entre las mezclas de proteínas probadas y el tampón, que se utilizó como control negativo (p <0,05).

Figura 8.La interacción de OlyA6, PlyA2 o EryA, en solitario o en combinación con PlyB, con vesículas lipídicas compuestas de CPE:POPC:Col (5:47,5:47,5, mol:mol:mol). Se inyectaron OlyA6 y PlyA2 a una concentración de 0,25 |jM y EryA a una concentración de 5 j M. PlyB se inyectó a una concentración de 20 nM cuando se combinó con OlyA6 y PlyA2, y a 0,4<j>M cuando se combinó con EryA. OlyA6 (A), PlyA2 (B) y EryA (C) interactúan específicamente con membranas que contienen CPE y su interacción se estabiliza en presencia de PlyB. CPE, ceramida fosfoetanolamina; POPC, palmitoíl-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina; Col, colesterol.

Figura 9.Actividad lítica de OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB y EryA/PlyB. Las mezclas de proteínas probadas OlyA6/PlyB y PlyA2/PlyB (10 jg/m l para OlyA6, PlyA2 o EryA y 0,8 jg/m l para PlyB) muestran permeabilización de vesículas lipídicas artificiales que contienen CPE (A), así como vesículas compuestas de SM:Col (1:1, mol:mol) (B), mientras que EryA/PlyB (10 jg/m l para EryA y 0,8 jg/m l para PlyB) es lítico sólo para vesículas que contienen CPE. CPE, ceramida fosfoetanolamina; POPC, palmitoíl-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina; Col, colesterol; SM, esfingomielina.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a complejos proteicos citolíticos de dos componentes que consisten en una pluralidad de moléculas, tal como al menos 20 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas, y una pluralidad de moléculas, tal como al menos 10 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, y en particular a su uso para controlar una plaga en plantas, tal como para controlar el escarabajo de la patata de Colorado(Leptinotarsa decemlineata)o el gusano de la raíz del maíz occidental(Diabrotica virgifera virgifera).Por lo tanto, la presente invención proporciona complejos proteicos citolíticos de dos componentes que consisten en una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que son útiles como plaguicidas.

Como se describe en los ejemplos, los complejos proteicos citolíticos de dos componentes compuestos por moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF muestran efectos tóxicos cuando son ingeridos por invertebrados, en particular, por insectos. Estos resultados indican que los complejos proteicos de dos componentes dañan las membranas intestinales. Por lo tanto, el objeto de la invención indica que los complejos proteicos de dos componentes que consisten en varias moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas, tales como OlyA6, PlyA2 o EryA, y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, tal como PlyB, pueden servir como bioplaguicidas alternativos que pueden reducir el riesgo para el medio ambiente y la salud humana.

De acuerdo con un aspecto, la presente invención proporciona el uso de un complejo proteico de dos componentes que consiste en una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) para controlar una plaga en plantas;

Por "pluralidad de moléculas" se entiende cualquier número de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y cualquier número de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que permite la formación de poros transmembrana.

El complejo proteico de dos componentes puede, por ejemplo, consistir en 20 a 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y en 10 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF.

Por lo tanto, de acuerdo con determinadas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 20 a 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y en 10 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF. De acuerdo con determinadas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 22 a 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y en 11 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF. De acuerdo con determinadas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 24 a 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y de 12 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF. De acuerdo con determinadas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 26 a 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y de 13 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF. De acuerdo con determinadas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 28 a 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y de 14 a 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF. De acuerdo con determinadas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 22 a 28 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y en 11 a 14 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF.

En general, el complejo proteico de dos componentes está formado por una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF en una proporción de 2:1. Dicho de otra manera, la proporción de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y las moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF es 2:1.

De acuerdo con algunas realizaciones, el complejo proteico de dos componentes consiste en 20 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 10 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 22 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 11 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 24 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 12 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 26 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 13 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 28 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 14 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 30 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 15 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF.

De acuerdo con realizaciones particulares, el complejo proteico de dos componentes consiste en 26 moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas y 13 moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF.

Dado que el complejo proteico de dos componentes se puede formar (o se forma)in situ,se entenderá que la composición molecular y la frecuencia pueden variar, lo que significa que diferentes complejos proteicos de dos componentes formados por los mismos componentes pueden estar presentes en el plano de la bicapa lipídica, variando en su composición molecular y frecuencia. Como ejemplo no limitante, Lukoyanovaet al.(2015) y Otaet al.(2013), que tratan de estructuras de complejos basados en PlyA/PlyB y OlyA6/PlyB, han demostrado que los poros formados por aegerolisinas y PlyBin situsuelen presentar las siguientes composiciones moleculares (el % indica la frecuencia de diferente composición molecular en el plano de la bicapa lipídica): 26 PlyA : 13 PlyB (75 %), 24 PlyA : 12 PlyB (15 %), 22 PlyA : 11 PlyB (5 %) y 28 PlyA : 14 PlyB (5 %). Por tanto, el complejo proteico de dos componentes puede ser una mezcla de complejos proteicos formados por los mismos componentes que varían en su composición molecular.

En la bibliografía científica se han descrito miembros de la familia de las aegerolisinas, así como miembros de la superfamilia MACPF de una variedad de hongos y bacterias (por ejemplo, Otaet al.,2014; Butalaet al.,2017; Anderluhet al.,2014). La familia de las aegerolisinas es una familia de proteínas que se caracterizan porque contienen un dominio de aegerolisina. La superfamilia MACPF es una familia de proteínas que se caracterizan porque contienen un dominio MACPF (Complejo de ataque a la membrana/perforina, del inglésMembrane Attack Complex/Perforin).Los miembros de la familia de las aegerolisinas se dirigen específicamente a las ceramidas fosfoetanolaminas, que son los principales esfingolípidos de membrana de los invertebrados (en particular de insectos y moluscos). Algunos miembros de la superfamilia MACPF tienen actividad citolítica y son útiles de acuerdo con la presente invención.

Los miembros de la familia de las aegerolisinas así como los miembros de la superfamilia MACPF para su uso de acuerdo con la presente invención pueden ser de origen fúngico o bacteriano. Los ejemplos no limitantes de miembros de la familia de las aegerolisinas incluyen aegerolisinas procedentes de un hongo del géneroPleurotus,tal como, por ejemplo, dePleurotus ostreatusoPleurotus eryngii.Los ejemplos no limitantes de miembros de la superfamilia MACPF incluyen proteínas que contienen MACPF procedentes de un hongo del géneroPleurotus,tal como, por ejemplo, dePleurotus ostreatusoPleurotus eryngii.

Por consiguiente, de acuerdo con determinadas realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es una aegerolisina procedente de un hongo del géneroPleurotus.

De acuerdo con algunas realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es una aegerolisina procedente del hongoPleurotus ostreatus.De acuerdo con algunas otras realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es una aegerolisina procedente del hongoPleurotus eryngii.

De acuerdo con determinadas realizaciones, el miembro de la superfamilia MACPF es una proteína que contiene MACPF procedente de un hongo del géneroPleurotus.

De acuerdo con algunas realizaciones, el miembro de la superfamilia MACPF es una proteína que contiene MACPF procedente del hongoPleurotus ostreatus.De acuerdo con algunas otras realizaciones, el miembro de la superfamilia MACPF es una proteína que contiene MACPF procedente del hongoPleurotus eryngii.

Los ejemplos no limitantes de aegerolisinas incluyen ostreolisina, pleurotolisina A y erilisina A.

De acuerdo con algunas realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es la ostreolisina, tal como la ostreolisina A6. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, tal como al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95%, al menos un 97% o al menos un 99% de identidad con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 55 % de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la<s>E<q>ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1. Dicho(s) polipéptido(s) adecuadamente tiene(n) la misma propiedad o una similar que el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 1, es decir, que se une(n) a CPE y forma(n) un complejo citolítico con la pleurotolisina B y proteínas similares. La propiedad se puede determinar de acuerdo con la siguiente prueba de permeabilización de membrana:

Prueba de permeabilización de membrana

1. Principio:

Se utilizan vesículas unilaminares pequeñas (SUV, del ingléssmall unilamellar vesicles)cargadas con calceína que contienen CPE para confirmar la actividad lítica de un polipéptido que se va a analizar (es decir, un polipéptido que tiene el % de identidad de secuencia indicado con una aegerolisina, tal como ostreolisina de SEQ ID NO: 1, en el presente documento "polipéptido de prueba") con la proteína asociada PlyB (SEQ ID NO: 4).

Para preparar las SUV, se preparan películas lipídicas con proporciones molares definidas de lípidos (CPE:POPC:Col [5:47,5:47,5, mol:mol:mol]) mediante la eliminación del disolvente orgánico de las soluciones lipídicas mediante evaporación rotatoria y secado al vacío. Los lípidos, a una concentración final de 5 mg/ml, se hinchan en calceína 80 mM y se agitan vigorosamente para dar liposomas multilaminares (MLV). La suspensión de los MLV se somete a tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos en hielo con ciclos de encendido/apagado de 10 segundos para preparar las SUV. La calceína extravesicular se elimina de la suspensión de SUV mediante filtración en gel en una columna Sephadex G-50 (mediana), donde se utiliza el tampón de vesículas compuesto por NaCI 140 mM, TRIS.HCI de 20 mM, pH 8,0 como fase móvil. La actividad lítica del complejo proteico se analiza con un lector de microplacas de fluorescencia a 25 °C.

2. Procedimiento:

Las mezclas de proteínas que comprenden el polipéptido de prueba y PlyB (12,5:1, mol:mol) se dispensan en una microplaca multipocillo en las siguientes concentraciones: 10 pg/ml de polipéptido de prueba combinado con 0,8 pg/ml de PlyB. El volumen final de las proteínas en cada pocillo de la placa de microtitulación, diluidas en tampón de vesículas (NaCl 140 mM, TRIS.HCI de 20 mM, pH 8,0), es de 100 pl. A las mezclas de proteínas se añaden s Uv cargadas con calceína (5 pg/ml). Las SUV se vuelven a excitar a 485 nm y la intensidad de la fluorescencia emitida de la calceína liberada se controla a 535 nm durante 30 min con intervalos de 20 s. La intensidad de la fluorescencia emitida ent= 30 se determina como F. Las SUV se lisan completamente con Triton X-100 1 mM (control positivo), donde Fmáx se determina como una intensidad de fluorescencia máxima después de la lisis de todas las SUV. F<0>es la fluorescencia de las SUV ent=30 en ausencia de las mezclas de proteínas líticas o en ausencia de Triton X-100. El porcentaje de liberación de calceína R (%) se calcula como:

P_P

R(%)= U“m--á--x- t V-*0* 100

El complejo proteico se puede considerar lítico cuando el valor de R es >5 % del control positivo.

De acuerdo con algunas realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es la pleurotolisina A, tal como la pleurotolisina A2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, tal como al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 55 % de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la s Eq ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2. Dicho(s) polipéptido(s) adecuadamente tiene(n) la misma propiedad o una similar que el polipéptido de referencia de la SEQ ID NO: 2, es decir, que se une(n) a CPE y forma(n) un complejo citolítico con la pleurotolisina B y proteínas similares. La propiedad se puede determinar de acuerdo con la prueba de permeabilización de membrana descrita anteriormente.

Un miembro de la superfamilia MACPF incluye la pleurotolisina B (PlyB) de uno de los hongosSphaerobolus stellatus, Moniliophtora perniciosa, Trametes pubescensyHeterobasidion irregulare.

De acuerdo con algunas realizaciones, el miembro de la superfamilia MACPF es la pleurotolisina B (PlyB). De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, tal como al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 55 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 % de identidad de secuencia con la<s>E<q>ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 65 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la<s>E<q>ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. De acuerdo con algunas realizaciones específicas, la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. Dicho(s) polipéptido(s) tiene(n) adecuadamente la misma actividad citolítica o similar que la ostreolisina, pleurotolisina A, erilisina A o una proteína similar al polipéptido de referencia de SEQ ID NO: 4. En particular, dichos polipéptidos contienen un dominio MACPF funcional. La actividad citolítica se puede determinar mediante pruebas adecuadas disponibles para el experto en la materia, tal como mediante ensayo de hemólisis o mediante el control de la liberación de calceína de los liposomas. La actividad citolítica puede, por ejemplo, determinarse de acuerdo con la siguiente prueba de permeabilización de membrana:

Prueba de permeabilización de membrana

1. Principio:

Se utilizan vesículas unilaminares pequeñas (SUV) cargadas con calceína que contienen CPE para confirmar la actividad lítica de un polipéptido que se va a analizar (es decir, un polipéptido que tiene el % de identidad de secuencia indicado con un miembro de la superfamilia MACPF, tal como pleurotolisina B de SEQ ID NO: 4, en adelante "polipéptido de prueba") con uno de los socios proteicos de ostreolisina (SEQ ID NO: 1), pleurotolisina A (SEQ ID NO: 2) u orerilisina A (SEQ ID NO: 3).

Para preparar las SUV, se preparan películas lipídicas con proporciones molares definidas de lípidos (CPE:POPC:Col [5:47,5:47,5, mol:mol:mol]) mediante la eliminación del disolvente orgánico de las soluciones lipídicas mediante evaporación rotatoria y secado al vacío. Los lípidos, a una concentración final de 5 mg/ml, se hinchan en calceína 80 mM y se agitan vigorosamente para dar liposomas multilaminares (MLV). La suspensión de los MLV se somete a tratamiento con ultrasonidos durante 15 minutos en hielo con ciclos de encendido/apagado de 10 segundos para preparar las SUV. La calceína extravesicular se elimina de la suspensión de SUV mediante filtración en gel en una columna Sephadex G-50 (mediana), donde se utiliza el tampón de vesículas compuesto por NaCI 140 mM, TRIS.HCI de 20 mM, pH 8,0, como fase móvil. La actividad lítica del complejo proteico se analiza con un lector de microplacas de fluorescencia a 25 °C.

2. Procedimiento:

Se dispensan mezclas de proteínas que comprenden el polipéptido de prueba y ostreolisina, pleurotolisina A o erilisina A (1:12,5, mol:mol) en una microplaca de varios pocillos en las siguientes concentraciones: 10 pg/ml de aegerolisina de prueba combinada con 0,8 pg/ml de PlyB. El volumen final de las proteínas en cada pocillo de la placa de microtitulación, diluidas en tampón de vesículas (NaCl 140 mM, TRIS.<h>C<i>de 20 mM, pH 8,0), es de 100 pl. A las mezclas de proteínas se añaden SUV cargadas con calceína (5 pg/ml). Las SUV se vuelven a excitar a 485 nm y la intensidad de la fluorescencia emitida de la calceína liberada se controla a 535 nm durante 30 min con intervalos de 20 s. La intensidad de la fluorescencia emitida ent= 30 se determina F. Las SUV se lisan completamente con Triton X-100 1 mM (control positivo), donde Fmáx se determina como una intensidad de fluorescencia máxima después de la lisis de todas las SUV. F<0>es la fluorescencia de las SUV ent= 30 en ausencia de las mezclas de proteínas líticas o en ausencia de Triton X-100. El porcentaje de liberación de calceína R (%) se calcula como:

P_P

R(%)= U“m--á--x- t V-*0* 100

De acuerdo con determinadas realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es la ostreolisina, tal como la ostreolisina A6, y el miembro de la superfamilia MACPF es la pleurotolisina B.

De acuerdo con determinadas realizaciones, el miembro de la familia de las aegerolisinas es la pleurotolisina A, tal como la pleurotolisina A2, y el miembro de la superfamilia MACPF es la pleurotolisina B.

El complejo proteico de dos componentes se puede utilizar en general a una concentración que varía de aproximadamente 1,5 pg/ml (0,1 pM de un miembro de la familia de las aegerolisinas en una proporción molar de 1000:1 con un miembro de la superfamilia MACPF) a 34,5 mg/ml (1 mM de un miembro de la familia de las aegerolisinas en una proporción molar de 3:1 con un miembro de la superfamilia MACPF). Es decir, la concentración del miembro de la familia de las aegerolisinas utilizada suele estar en el intervalo de 0,1 pM a aproximadamente 1 mM, tal como de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 mM o de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 0,1 pM a 500 pM, de 0,5 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 500 pM, de 0,5 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 100 pM o de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 100 pM. El miembro de la superfamilia MACPF se utiliza en cantidades adecuadas para obtener la proporción molar deseada que generalmente está en el intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1000:1.

La plaga de la planta a controlar mediante el uso de un complejo proteico de dos componentes de acuerdo con la invención puede ser un insecto, tal como un insecto herbívoro. Por consiguiente, de acuerdo con determinadas realizaciones, la plaga de la planta es un insecto. De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es un insecto herbívoro.

La plaga de la planta puede ser una larva y/o un imago del insecto. De acuerdo con determinadas realizaciones, la plaga de la planta es una larva del insecto. De acuerdo con determinadas realizaciones, la plaga de la planta es un imago del insecto.

La larva puede estar en cualquier etapa de desarrollo larvario. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva se encuentra en un estadio larvario seleccionado del grupo formado por L1, L2, L3, L4 y L5. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva está en un estadio larvario seleccionado de L1, L2, L3 y L4. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva está en un estadio larvario seleccionado de L1, L2 y L3. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva se encuentra en un estadio larvario seleccionado entre L1 y L2. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva se encuentra en un estadio larvario seleccionado del grupo formado por L2, L3, L4 y L5. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva se encuentra en un estadio larvario seleccionado del grupo formado por L2, L3 y L4. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva se encuentra en un estadio larvario seleccionado del grupo formado por L2 y L3. De acuerdo con determinadas realizaciones, la larva se encuentra en un estadio larvario seleccionado del grupo formado por L3 y L4. De acuerdo con algunas realizaciones, la larva se encuentra en el estadio larvario L1. De acuerdo con algunas realizaciones, la larva se encuentra en el estadio larvario L2. De acuerdo con algunas realizaciones, la larva se encuentra en el estadio larvario L3. De acuerdo con algunas realizaciones, la larva se encuentra en el estadio larvario L4. De acuerdo con algunas realizaciones, la larva se encuentra en el estadio larvario L5.

De acuerdo con determinadas realizaciones, el insecto es del orden Coleoptera.

De acuerdo con algunas realizaciones, el insecto es de la familia Chrysomelidae.

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroLeptinotarsa.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado).

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroDiabrotica.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroPhyllotreta.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esPhyllotreta spp.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esPhyllotreta cruciferae.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esPhyllotreta striolata.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto se selecciona del grupo que consiste enLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado) yDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroLilioceris.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esLilioceris merdigera.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esLilioceris lilii.

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroCrioceris.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esCrioceris duodecimpunctata.

De acuerdo con algunas realizaciones, el insecto es de la familia Scarabeidae.

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroMelolontha.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esMelolontha melolontha.

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroPopillia.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esPopillia japonica(escarabajo japonés).

De acuerdo con algunas realizaciones, el insecto es de la familia Elateridae.

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroAgriotes.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esAgriotes spp.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esAgriotes lineatus.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esAgriotes obscurus.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esAgriotes ustulatus.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esAgriotes sputator.

De acuerdo con algunas realizaciones, el insecto es de la familia Byturidae.

De acuerdo con algunas realizaciones particulares, el insecto es del géneroByturus.

De acuerdo con algunas realizaciones específicas, el insecto esByturus tomentosus.

De acuerdo con determinadas realizaciones, la plaga de la planta es una plaga de insectos coleópteros.

De acuerdo con realizaciones particulares, la plaga de la planta se selecciona del escarabajo de la patata de Colorado, el gusano de la raíz del maíz occidental y otras plagas de insectos coleópteros.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es un escarabajo de la patata de Colorado.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es el gusano de la raíz del maíz occidental.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es el escarabajo pulga de la col.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es el escarabajo japonés.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es el escarabajo de mayo.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es el gusano alambre.

De acuerdo con algunas realizaciones, la plaga de la planta es el escarabajo de la frambuesa.

La presente invención proporciona además un método para proteger una planta contra una plaga en la planta o para controlar una plaga en la planta, que comprende la etapa de: aplicar una composición que comprende una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) y un vehículo adecuado, tal como una solución tampón, a una planta que lo necesite;

En general, el miembro de la familia de las aegerolisinas y el miembro de la superfamilia MACPF están presentes en la composición de forma libre, sin formar complejos. Una vez que la composición se aplica a una planta de interés y las moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y las moléculas del miembro de la superfamilia MACPF son ingeridas por el insecto, se forman complejos proteicos de dos componentes como se describe en el presente documentoin situen el plasmalema de las células epiteliales del intestino medio, lo que provoca la perforación del intestino y posteriormente la muerte del insecto.

Se entiende que todos los detalles proporcionados en el presente documento con respecto a los complejos proteicos de dos componentes, en particular con respecto al miembro de la familia de las aegerolisinas y al miembro de la superfamilia MACPF, y a la plaga de la planta, incluidas todas las realizaciones, se aplican, cambiando lo que sea necesario, a los métodos de la presente invención.

En general, la composición se puede aplicar a una planta que lo necesite en cualquier dosis, frecuencia y método de administración adecuados.

La composición puede estar adecuadamente en forma líquida y puede aplicarse mediante pulverización, empapado o gota a gota sobre la planta. De acuerdo con determinadas realizaciones, la composición se aplica mediante empapado. De acuerdo con determinadas realizaciones, la bicomposición se aplica mediante pulverización. De acuerdo con determinadas realizaciones, la composición se aplica gota a gota.

De manera adecuada, el vehículo es un vehículo líquido, y de manera más particular, un vehículo acuoso, y el miembro de la familia de las aegerolisinas y el miembro de la superfamilia MACPF están disueltos en el mismo. El experto en la materia conoce bien dichos vehículos apropiados. Un vehículo acuoso adecuado puede ser, por ejemplo, una solución tampón y de manera más particular una solución tampón fisiológica. Los sistemas tampón adecuados son bien conocidos por el experto e incluyen, como ejemplos no limitantes, Tris, TABS, Bicina, Tricina, HEPES, TES, MOPS y PIPES. El pH de la solución tampón suele estar en el intervalo de aproximadamente 6,5 a aproximadamente 9, tal como en el intervalo de aproximadamente 7,5 a aproximadamente 8,5, tal como aproximadamente 8. La solución tampón puede contener otros aditivos tales como NaCl y/o glicerol. Un ejemplo no limitante de una solución tampón útil de acuerdo con la presente invención es una solución tampón que comprende Tris 20 a 50 mM, NaCI 0 a 200 mM y glicerol del 0 al 1 % en agua desionizada. Un ejemplo no limitante más específico de una solución tampón útil de acuerdo con la presente invención es Tris 20 mM, glicerol al 0,5 %, pH 8,0, en agua desionizada.

La concentración del miembro de la familia de las aegerolisinas utilizado puede estar generalmente en el intervalo de 0,1 pM a aproximadamente 1 mM, tal como de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 1 mM o de aproximadamente 500 pM a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 0,1 pM a 500 pM, de 0,5 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 500 pM, de aproximadamente 100 pM a aproximadamente 500 pM, de 0,5 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 pM, de aproximadamente 10 pM a aproximadamente 100 pM o de aproximadamente 50 pM a aproximadamente 100 pM. El miembro de la superfamilia MACPF se utiliza en cantidades adecuadas para obtener la proporción molar deseada en el intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1000:1.

La proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF puede estar generalmente en el intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1000:1, tal como aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 90:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1, aproximadamente 300:1, aproximadamente 400:1, aproximadamente 500:1, aproximadamente 600:1, aproximadamente 700:1, aproximadamente 800:1, aproximadamente 900:1 o aproximadamente 1000:1.

De acuerdo con determinadas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF está en el intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1000:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 3:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 5:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 10:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 20:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 25:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 30:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 40:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 50:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 60:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 70:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 80:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 90:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 100:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 200:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 300:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 400:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 500:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 600:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 700:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 800:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 900:1. De acuerdo con algunas realizaciones, la proporción molar entre un miembro de la familia de las aegerolisinas y un miembro de la superfamilia MACPF es de aproximadamente 1000:1.

La composición se puede aplicar al menos una vez por semana. Por ejemplo, se puede aplicar de 1 a 3 veces por semana, tal como dos veces a la semana. El complejo proteico de dos componentes se puede aplicar al menos una vez al día. Por ejemplo, se puede aplicar de 1 a 3 veces al día, tal como dos veces al día.

La presente invención también proporciona el uso de un complejo proteico de dos componentes o una composición como se describe en el presente documento para la preparación de un agente fitosanitario.

Se entiende que todos los detalles proporcionados en el presente documento con respecto al complejo proteico de dos componentes, en particular con respecto al miembro de la familia de las aegerolisinas y al miembro de la superfamilia MACPF, y a la plaga de plantas, incluidas todas las realizaciones, se aplican, cambiando lo que sea necesario, al uso para la preparación de un agente fitosanitario.

La presente invención también proporciona una planta transgénica o su progenie que expresa o es capaz de expresar un complejo proteico de dos componentes como se describe en el presente documento; comprendiendo dicha planta transgénica o su progenie una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican dicho complejo proteico de dos componentes, estando dichas secuencias de nucleótidos operativamente unidas a al menos un promotor que es funcional en dicha célula vegetal para provocar la producción de moléculas de ARNm.

Se entiende que todos los detalles proporcionados en el presente documento con respecto a los complejos proteicos de dos componentes, en particular con respecto al miembro de la familia de las aegerolisinas y al miembro de la superfamilia MACPF, incluidas todas las realizaciones, se aplican, cambiando lo que sea necesario, a la planta transgénica.

Una planta transgénica o su progenie de la presente invención comprende adecuadamente (tal como transformada de manera estable con) una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes (tales como ADN) que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un complejo proteico de dos componentes como se describe en el presente documento, estando dichas secuencias de nucleótidos operativamente unidas a al menos un promotor que es funcional en dicha célula vegetal para provocar la producción de moléculas de ARNm. La planta transgénica o su progenie puede, por ejemplo, comprender una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes (tales como ADN) que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de la familia de las aegerolisinas, y una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de la superfamilia MACPF, estando dichas secuencias de nucleótidos operativamente unidas a al menos un promotor que es funcional en dicha célula vegetal para provocar la producción de moléculas de ARNm. Las secuencias codificantes pueden estar compuestas por las mismas moléculas de ácido nucleico recombinantes o diferentes. Por tanto, los ARNm resultantes pueden ser mono o policistrónicos.

La una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes pueden ser episomal (no contenidas dentro de un cromosoma) o pueden estar integradas de manera estable en un cromosoma del genoma de la planta. De acuerdo con determinadas realizaciones, la una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes pueden ser episomales, tal como en forma de vector (tal como en forma de vector de expresión). De acuerdo con determinadas realizaciones, la una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes están integradas de manera estable en un cromosoma del genoma de la planta.

Los promotores útiles de acuerdo con la invención son cualquier promotor conocido que sea funcional en una célula vegetal para provocar la producción de una molécula de ARNm. La persona experta conoce muchos de estos promotores. Los expertos en la materia de biología molecular conocen generalmente el uso de promotores para la expresión de proteínas, por ejemplo, véase Sambrooket al.,Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. El promotor empleado puede ser inducible o constitutivo.

Ejemplos no limitantes de promotores funcionales de plantas son el promotor psbA deLactuca sativa,el promotor psbA del tabaco, el promotor rrnl6 PEP+NEP del tabaco, el promotor 35S de CaMV, el promotor 19S, el promotor E8 del tomate, el promotor nos, el promotor Mac, el promotor pet E o el promotor ACT1.

La(s) molécula(s) de ácido nucleico recombinante(s) pueden comprender además al menos un elemento regulador seleccionado del grupo que consiste en una región no traducida en 5' (5' UTR, del inglés5' untranslated región),una región no traducida en 3' (3' UTR, del inglés3' untranslated región)y una región peptídica de tránsito.

De acuerdo con determinadas realizaciones, la molécula de ácido nucleico recombinante se integra de manera estable en el genoma de la planta transgénica o de su progenie.

La planta transgénica puede ser (o proceder de) cualquier planta de interés. La planta transgénica puede ser una angiosperma o una gimnosperma. De acuerdo con determinadas realizaciones, la planta transgénica es una angiosperma. De acuerdo con determinadas realizaciones, la planta transgénica es una gimnosperma.

La planta transgénica puede ser una dicotiledónea o monocotiledónea. De acuerdo con determinadas realizaciones, la planta es una dicotiledónea. De acuerdo con determinada realización, la planta es monocotiledónea.

La planta transgénica puede ser una planta alimenticia (es decir, una planta cuyas partes proporcionan alimento para el consumo animal o humano), tal como, por ejemplo, plantas frutales.

La planta transgénica puede ser una planta de cultivo, tal como una planta de cultivo alimenticio. De acuerdo con determinadas realizaciones, la planta transgénica es una planta de cultivo alimenticio, tal como una planta de patata o una planta de maíz. De acuerdo con algunas realizaciones, la planta transgénica es una planta de patata, tal comoSolanum tuberosum.De acuerdo con algunas realizaciones, la planta es una planta de maíz. De acuerdo con algunas realizaciones, la planta es repollo. De acuerdo con algunas realizaciones, la planta es espárrago.

DETERMINADAS DEFINICIONES

Como se utiliza en el presente documento, "controlar una plaga en plantas" o "control de plagas en plantas" significa reducir o eliminar la plaga de la planta, tal como el insecto plaga.

Como se utiliza en el presente documento, un "plaguicida" es un compuesto o composición utilizada para reducir o eliminar insectos dañinos para las plantas cultivadas.

Como se utiliza en el presente documento, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle circular de ácido nucleico bicatenario en donde se pueden ligar segmentos adicionales de ácido nucleico. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de expresión". Ciertos otros vectores son capaces de facilitar la inserción de una molécula de ADN recombinante en el genoma de una planta. En el presente documento dichos vectores se denominan "vectores de transformación". En general, los vectores de utilidad en las técnicas de ácido nucleico recombinante a menudo están en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente utilizada de un vector. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores adecuados que están disponibles comercialmente.

Como se utiliza en el presente documento, "promotor" se refiere a una secuencia de ADN, generalmente cadena arriba (5') de la región codificante de un gen estructural, que controla la expresión de la región codificante proporcionando sitios de reconocimiento y unión para la ARN polimerasa y otros factores que pueden ser necesarios para el inicio de la transcripción. La selección del promotor dependerá de la secuencia de ácido nucleico de interés. Un "promotor funcional en una célula vegetal" se refiere a un "promotor" que es capaz de soportar el inicio de la transcripción en células vegetales, lo que permite la síntesis de una molécula de ARNm.

Como se utiliza en el presente documento, "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que les permite funcionar de su modo previsto. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante se une de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control. Una secuencia promotora está "unida operativamente" a un gen cuando está suficientemente cerca del sitio de inicio de la transcripción de un gen para regular la transcripción del gen.

"% de identidad de secuencia" de una secuencia de aminoácidos con respecto a una secuencia de aminoácidos de referencia, como se utiliza en el presente documento, define el % de identidad calculado a partir de las dos secuencias de aminoácidos de la siguiente manera: Las secuencias se alinean usando la versión 9 del GAP (programa de alineación global) del Genetic Computing Group, mediante la matriz BLOSUM62 predeterminada con una penalización de apertura de hueco de -12 (para el primer nulo de un hueco) y una penalización de extensión de hueco de -4 (para cada nulo adicional en el hueco). Después de la alineación, el % de identidad se calcula mediante la expresión del número de coincidencias como un porcentaje del número de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia.

Cuando se indique un límite o intervalo numérico en el presente documento, se incluyen los valores extremos. Igualmente, todos los valores y subintervalos dentro de un límite o intervalo numérico se incluyen específicamente como si estuvieran escritos explícitamente.

Habiendo descrito de manera general la presente invención, se puede obtener una mayor comprensión haciendo referencia a determinados ejemplos específicos, que se proporcionan en el presente documento solo con fines ilustrativos y no se pretende que sean limitantes, a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplos

Ensayos biológicos

I. Bioensayo de alimentación con hojas de patata tratadas con proteínas recombinantes del género fúngicoPleurotuspara evaluar la toxicidad del CPB

1. Principio:

Este bioensayo se utilizó para evaluar el impacto de las proteínas recombinantes del género fúngicoPleurotusen la supervivencia de las larvas de CPB. Se utilizaron hojas de patata tratadas con proteínas recombinantes. El bioensayo se llevó a cabo durante 5 días. La tasa de supervivencia se registró diariamente. Las mediciones de peso se registraron el día 1 y el día 5.

2. Proteínas recombinantes:

Se prepararon las proteínas del género fúngicoPleurotus,OlyA6, PlyA2, EryA y PlyB, en forma recombinante mediante el uso de un sistema de expresión heterólogo para la producción de proteínas enEscherichia coli.Las proteínas se purificaron con procedimientos cromatográficos y se almacenaron en soluciones tampón a -20 °C. Se prepararon mezclas de proteínas de trabajo adecuadas, que contienen una aegerolisina y su compañero proteico. Las concentraciones de aegerolisina fúngica y PlyB fueron de 0,5 mg/ml y 0,04 mg/ml, respectivamente.

3. Insectos:

Las larvas de CPB, recogidas de campos de patata un día antes de los experimentos, se dividieron en dos grupos: larvas jóvenes (L1 L2) y larvas de edad avanzada (L3 L4). En L1 y L2, el pronoto es completamente negro. En L3, el margen anterior del pronoto aparece de color marrón anaranjado. En L4, aproximadamente la mitad del pronoto es de color marrón claro en la parte anterior.

4. Procedimiento:

Se remojaron discos de hojas de patata, de 14 mm de diámetro, en 5 ml de cada mezcla de proteínas durante 5 min, antes de colocarlos en una microplaca de 6 pocillos. Se transfirió una única larva de CPB a cada pocillo(Figura 3).

Se añadieron hojas de disco de patata frescas, tratadas con proteínas, cada dos días. Se realizaron tres réplicas de placas de 6 pocillos por tratamiento y el experimento se repitió dos veces de forma independiente, dando un total de 36 larvas por cada tratamiento. El bioensayo se realizó en una incubadora a 22 °C 1, HR 70 % y un fotoperiodo de 16:8 (L:O). Se utilizaron discos de hojas tratados con tampón (Tris 20 mM, glicerol al 0,5%, pH 8,0) como control negativo y discos de hojas tratados con insecticida Actara 25 WG (p.a. tiametoxam) como control positivo. La mortalidad de las larvas basada en el tiempo se analizó mediante el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier y el efecto de las mezclas de proteínas en el cambio de peso de las larvas mediante la prueba de Kruskal-Wallis, seguido de la pruebaa posterioride Dunn.

II. Bioensayo de alimentación con dieta artificial para WCR adultos mezclada con proteínas recombinantes del género fúngicoPleurotuspara evaluar la toxicidad del WCR

1. Principio

Este bioensayo se utilizó para evaluar el impacto de las proteínas recombinantes del género fúngicoPleurotusen la supervivencia de los escarabajos WCR. Se utilizó dieta artificial mezclada con proteínas recombinantes. El bioensayo se llevó a cabo durante 7 días. La tasa de supervivencia se registró diariamente.

2. Proteínas recombinantes

Se prepararon las proteínas del género fúngicoPleurotus,OlyA6, PlyA2, EryA y PlyB, en forma recombinante mediante el uso de un sistema de expresión heterólogo para la producción de proteínas enEscherichia coli.Las proteínas se purificaron con procedimientos cromatográficos y se almacenaron en soluciones tampón a -20 °C. Se prepararon mezclas de proteínas de trabajo adecuadas, que contienen una aegerolisina y su compañero proteico. Las concentraciones finales de aegerolisina fúngica y PlyB en la mezcla con alimento artificial fueron 0,5 mg/ml y 0,04 mg/ml, respectivamente.

3. Insectos:

Los escarabajos, utilizados para los experimentos, se recogieron de campos de maíz un día antes de los experimentos.

4. Procedimiento:

Una dieta artificial (pH 7,0) que comprende: sacarosa (33 g), alfacel (18,6 g), caseína (15,9 g), harina de soja (12,4 g), germen de trigo (12,4 g), levadura de cerveza (5 g), mezcla de vitaminas (Vanderzant, 1,2 g), mezcla de sal (Wesson, 1,2 g), colesterol (0,3 g), glicerol (11 ml) y dH<2>O (82,5 ml) se mezcló para WCR. Se pipetearon 30 pl de mezcla, compuesta de dieta artificial y complejos proteicos (15 pl cada uno) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Se colocó un WCR adulto en cada pocillo (Figura 4). Se realizaron tres réplicas de placas de 6 pocillos por tratamiento y el experimento se repitió dos veces de forma independiente, dando un total de 36 insectos adultos por cada tratamiento. El bioensayo se realizó en una incubadora a 22 °C ± 1, HR 70 % y un fotoperiodo de 16:8 (L:O). Se utilizó tampón (Tris 20 mM, glicerol al 0,5 %, pH 8,0) mezclado con alimento artificial (1:1, v:v) como control negativo y una mezcla de Decis al 0,5 % (p.a. deltametrina) como control positivo.

Pruebas biofísicas

III. Mediciones de resonancia de plasmón superficial

1. Principio:

Se utilizó resonancia de plasmón superficial para determinar las interacciones de proteínas del género fúngicoPleurotuscon vesículas lipídicas artificiales que contienen CPE. Se inmovilizaron vesículas unilaminares grandes (LUV, del ingléslarge unilamellar vesicles)que contienen CPE en la superficie del chip sensor. Se inyectaron soluciones de la aegerolisina adecuada, sola o en combinación con PlyB, a través de la superficie del chip sensor.

2. Reactivos:

Las interacciones se controlaron en un refractómetro basado en resonancia de plasmón superficial (SPR, del ingléssurface plasmon resonance)Biacore X, utilizando el chip L1. Para la inmovilización de LUV compuestas por una mezcla de lípidos (CPE: palmitoíl-2-oleoíl-sn-glicero-3-fosfocolina [POPC]: Col [5:47,5:47,5, mol:mol:mol]) y como tampón de ejecución se utilizó Tris 20 mM, NaCl 140 mM, EDTA 5<j>M, pH 7,4. Como analitos se utilizaron proteínas recombinantes del género fúngicoPleurotus:OlyA6, EryA, PlyA2 y PlyB. Los experimentos se realizaron a 25 °C. Los datos se procesaron con el programa informático BIAevaluation (GE Healthcare).

3. Procedimiento:

Después de la limpieza inicial del chip con soluciones de regeneración (dodecilsulfato de sodio [SDS] y octil p-D-glucopiranósido [OG], inyección de 1 minuto, caudal de 10 pl/min), las LUV que contenían CPE se unieron a la segunda cubeta de flujo del chip sensor L1 para alcanzar una respuesta de aproximadamente 7000 UR. La primera cubeta de flujo se dejó vacía y se utilizó para controlar la posible unión no específica de proteínas a la matriz de dextrano. Las LUV ligeramente unidas se lavaron de la superficie con una inyección de 1 min de NaOH 100 mM. La unión no específica de las proteínas se minimizó con una inyección de 1 minuto de 0,1 mg/ml de albúmina sérica bovina a un caudal de 30 pl/min. Se inyectaron soluciones apropiadas adecuadas de proteínas y complejos de proteínas a un caudal de 10 pl/min. Se probaron las interacciones de OlyA6, PlyA2 o EryA con LUV que contenían CPE. Además, se analizaron las interacciones de los complejos proteicos OlyA6/PlyB, PlyA2/PlyB o EryA/PlyB con LUV. La regeneración entre inyecciones se logró con una inyección de 1 min de SDS al 0,5 % y OG 40 mM con un caudal de 10 pl/min.

IV. Actividad lítica de aegerolisinas fúngicas con su compañero PlyB

1. Principio:

Se utilizaron pequeñas vesículas unilaminares (SUV) cargadas de calceína que contenían CPE para confirmar la actividad lítica de OlyA6, PlyA2 o EryA con su compañero proteico PlyB.

2. Reactivos:

La actividad lítica de los complejos proteicos se analizó en un lector de microplacas de fluorescencia a 25 °C. Se utilizaron SUV cargadas de calceína compuestas por una mezcla de lípidos (CPE:POPC:Col [5:47,5:47,5, mol:mol:mol]).

3. Procedimiento:

Se dispensaron mezclas de proteínas que comprenden aegerolisinas fúngicas OlyA6, PlyA2 o EryA y PlyB (12,5:1, mol:mol) en una microplaca de múltiples pocillos en las siguientes concentraciones: 10 pg/ml de OlyA6, PlyA2 o EryA combinados con 0,8 pg/ml de PlyB. Se añadieron SUV cargadas con calceína a las mezclas de proteínas (5 pg/ml). Las SUV se excitaron a 485 nm y la intensidad de la fluorescencia emitida de la calceína liberada se controló a 535 nm durante 30 min con intervalos de 20 s. Las intensidades de la fluorescencia emitida ent= 0 yt= 30 se determinaron como F<0>y F, respectivamente, las SUV se lisaron completamente con Triton X-100 1 mM y la fluorescencia medida se determinó como intensidad de fluorescencia máxima (Fmáx). El porcentaje de liberación de calceína R (%) se calculó como:

100

RESULTADOS

I. Bioensayo de alimentación de CPB con hojas de patata tratadas con proteínas recombinantes del género fúngicoPleurotus

Se probó el efecto de los complejos plaguicidas de dos componentes, que comprenden aegerolisina fúngica y PlyB, en las larvas de CPB. Se analizó la mortalidad larvaria y el peso corporal. La exposición de larvas de CPB a discos foliares tratados con mezclas de proteínas OlyA6/PlyB o PlyA2/PlyB provocó una mortalidad larvaria significativa el día 5 después del inicio de la alimentación en ambos grupos.(Figuras 5 y 6).La mezcla de proteínas EryA/PlyB provocó una mortalidad larvaria significativa también en larvas jóvenes (L1 L2). El comportamiento alimentario de las larvas expuestas fue significativamente diferente al de las larvas de control.(Figuras 5 y 6).Después del día 1, las larvas expuestas mostraron una disminución en el consumo de alimento. L1 L2 tratadas con EryA/PlyB mostraron un aumento de peso significativamente menor en comparación con los pesos de las larvas de control, mientras que todas las mezclas de proteínas redujeron significativamente el aumento de peso de las larvas en el caso de L3 L4. Las aegerolisinas individuales (OlyA6, PlyA2 o EryA) o solo el componente B (PlyB) por sí solo no mostraron un efecto significativo en el cambio de peso de las larvas en L1 L2 o L3 L4.

II. Bioensayo de alimentación con dieta artificial mezclada con proteínas recombinantes de género fúngicoPleurotusdirigido a WCR adultos

Se probó el efecto de los complejos plaguicidas de dos componentes, que comprenden aegerolisina fúngica y PlyB, en escarabajos WCR. La mortalidad de los insectos se evaluó diariamente. La exposición de WCR a alimentos artificiales mezclados con OlyA6/PlyB dio como resultado un aumento significativo de la mortalidad el día 5 después del inicio de la alimentación. El comportamiento alimentario de las larvas expuestas fue diferente al de las larvas control. Después del día 4, las larvas expuestas mostraron una disminución en el consumo de alimentos(Figura 7).

III. Mediciones de resonancia de plasmón superficial

Se controló la unión de las aegerolisinas fúngicas OlyA6, PlyA2 o EryA (con o sin pleurotolisina B) a vesículas unilaminares grandes que contenían CPE mediante resonancia de plasmón superficial. Los resultados muestran claramente que todas las aegerolisinas probadas interactúan específicamente con membranas artificiales que contienen CPE y que esta interacción se estabiliza en presencia de PlyB(Figura 8).

IV. Actividad lítica de aegerolisinas fúngicas con su compañero PlyB

Los resultados muestran que las membranas artificiales se permeabilizaron con las aegerolisinas OlyA6, PlyA2 o EryA en combinación con PlyB, si las membranas contenían c Pe . Los complejos proteicos OlyA6/PlyB y PlyA2/PlyB son más líticos que EryA/PlyB(Figura 9).

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un complejo proteico de dos componentes que consiste en una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, y una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) para controlar una plaga en plantas;

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el complejo proteico de dos componentes consiste en 20 a 30 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y en 10 a 15 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la proporción de moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas a moléculas del miembro de la superfamilia MACPF es 2:1.

4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el complejo proteico de dos componentes consiste en 20 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y 10 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 22 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y 11 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 24 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y 12 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 26 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y 13 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 28 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y 14 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF, o consiste en 30 moléculas del miembro de la familia de las aegerolisinas y 15 moléculas del miembro de la superfamilia MACPF.

5. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; en donde la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; y en donde la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

6. Un método para proteger una planta contra una plaga en la planta o para controlar una plaga en la planta, que comprende la etapa de: aplicar una composición que comprende una pluralidad de moléculas de un miembro de la familia de las aegerolisinas seleccionado del grupo que consiste en ostreolisina y pleurotolisina A, una pluralidad de moléculas de un miembro de la superfamilia MACPF que es pleurotolisina B (PlyB) y un vehículo adecuado, tal como una solución tampón, a una planta que lo necesite;

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la ostreolisina es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1; en donde la pleurotolisina A es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2; y en donde la pleurotolisina B es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, al menos un 97 % o al menos un 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 4.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en donde la proporción molar entre el miembro de la familia de las aegerolisinas y el miembro de la superfamilia MACPF está en el intervalo de aproximadamente 3:1 a aproximadamente 1000:1, tal como aproximadamente 5:1, aproximadamente 10:1, aproximadamente 20:1, aproximadamente 25:1, aproximadamente 30:1, aproximadamente 40:1, aproximadamente 50:1, aproximadamente 60:1, aproximadamente 70:1, aproximadamente 80:1, aproximadamente 90:1, aproximadamente 100:1, aproximadamente 200:1, aproximadamente 300:1, aproximadamente 400:1, aproximadamente 500:1, aproximadamente 600:1, aproximadamente 700:1, aproximadamente 800:1, aproximadamente 900:1 o aproximadamente 1000:1.

9. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la plaga de la planta es un insecto.

10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la plaga de la planta es un insecto herbívoro.

11. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el insecto es del géneroLeptinotarsaoDiabrotica.

12. El uso o método de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el insecto se selecciona del grupo que consiste enLeptinotarsa decemlineata(Escarabajo de la patata de Colorado) yDiabrotica virgifera virgifera(Gusano de la raíz del maíz occidental).

13. Uso de un complejo proteico de dos componentes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o una composición como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 para la preparación de un agente fitosanitario.

14. Una planta transgénica o su progenie que expresa o es capaz de expresar un complejo proteico de dos componentes como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; comprendiendo dicha planta transgénica o su progenie una o más moléculas de ácido nucleico recombinantes que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican dicho complejo proteico de dos componentes, estando dichas secuencias de nucleótidos operativamente unidas a al menos un promotor que es funcional en dicha célula vegetal para provocar la producción de moléculas de ARNm.

15. La planta transgénica o su progenie de acuerdo con la reivindicación 14, en donde dicha planta transgénica o su progenie es una planta de cultivo, tal como una planta de patata o una planta de maíz.