BR112019027583A2 - polipeptídeos de serina protease 1 tipo membrana (mtsp-1) modificados e métodos de uso - Google Patents
polipeptídeos de serina protease 1 tipo membrana (mtsp-1) modificados e métodos de uso Download PDFInfo
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Abstract
Proporcionam-se MTSP-1 polipeptídeos modificados para ter atividade alterada e / ou especificidade de modo que eles clivar uma proteína de complemento, tais como proteína de complemento C3, para inibir a sua atividade e deste modo inibir a ativação do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados que inibem a ativação do complemento pode ser utilizado para o tratamento de doenças e condições em que a ativação do complemento desempenha um papel. Tais doenças e condições incluem doenças inflamatórias e doenças com um componente inflamatório. Exemplos de tais distúrbios são distúrbios isquémicos e de reperfusão, incluindo o enfarte do miocárdio e acidente vascular cerebral, sepsia, doenças auto-imunes, desordens oftálmicas, tais como retinopatias diabéticas e degeneração macular, incluindo degeneração macular relacionada com a idade (AMD), e rejeição de órgãos transplantados, tais como enxerto de função renal retardada (DGF).
Description
POLIPEPTÍDEOS DE SERINA PROTEASE 1 TIPO MEMBRANA (MTSP-1)
[001] É reivindicado benefício de prioridade ao pedido provisório US N° de série 62/523.735, depositado em 22 de junho de 2017, a Madison, Edwin L., Soros, Vanessa e Popkov, Mikhail, intitulado “MODIFIED MEMBRANE TYPE SERINE PROTEASE 1 (MT-SP1) POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE”. O benefício de prioridade também é reivindicado no pedido provisório US N° de série 62/664.051, depositado em 27 de abril de 2018, a Madison, Edwin L., Soros, Vanessa e Popkov, Mikhail, intitulado “MODIFIED MEMBRANE TYPE SERINE PROTEASE 1 (MTSP- 1) POLYPEPTIDES AND METHODS OF USE”. Onde permitido, o objeto de cada um desses pedidos é incorporado por referência em sua totalidade.
[002] Uma versão eletrônica da Listagem de Sequência é depositada com a presente invenção, cujo conteúdo é incorporado por referência na sua totalidade. O arquivo eletrônico foi criado em 18 de junho de 2018, tem 1,4 megabytes de tamanho e é intitulado 4939SEQPC001.txt.
[003] São providos polipeptídeos MTSP-1 modificados que clivam uma proteína do complemento, inibindo assim a ativação do complemento. Em virtude desta inibição, os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser usados para o tratamento de doenças e condições mediadas por complemento ou nas quais a ativação do complemento desempenha um papel. Essas doenças e condições incluem, mas não são limitadas a,
indicações oftalmológicas, incluindo degeneração macular, tal como degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinopatias diabéticas, e doença de Stargardt, função tardia de enxerto renal (DGF), distúrbios isquêmicos e de reperfusão, incluindo infarto do miocárdio e acidente vascular cerebral, sepse, doenças autoimunes, doenças inflamatórias e doenças com um componente inflamatório, incluindo a doença de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas.
[004] O sistema do complemento (C) faz parte do sistema imunológico e desempenha um papel na eliminação de patógenos invasores e no início da resposta inflamatória. O sistema do complemento de humanos e outros mamíferos envolve mais de 30 proteínas solúveis e ligadas à membrana que participam de uma sequência ordenada de reações, resultando na ativação do complemento. O sistema do complemento sanguíneo tem uma ampla matriz de funções associadas a um amplo espectro de mecanismos de defesa do hospedeiro, incluindo ações antimicrobianas e antivirais. Os produtos derivados da ativação dos componentes C incluem as moléculas sem auto- reconhecimento C3b, C4b e C5b, bem como as anafilatoxinas C3a, C4a e C5a que influenciam uma variedade de respostas imunes celulares. Essas anafilatoxinas também atuam como agentes pró-inflamatórios.
[005] O sistema do complemento é composto por uma matriz de enzimas e proteínas e receptores não enzimáticos. A ativação do complemento ocorre por um dos três modos principais, conhecidos como a via “clássica”, a via “alternativa” e a via da “lectina” (ver a FIGURA 1). O complemento normalmente é ativado ou acionado por 1 dessas 3 vias, que, como mostrado na FIGURA 1, convergem na ativação de C3. Em um quarto mecanismo de ativação do complemento, conhecido como via intrínseca, as serina proteases associadas à cascata de coagulação/fibrinolítica ativam o sistema do complemento diretamente por meio da clivagem de C3 ou C5, independentemente das vias clássica, alternativa e da lectina. Essas vias podem ser distinguidas pelo processo que inicia a ativação do complemento. A via clássica é iniciada por complexos anticorpo-antígeno ou formas agregadas de imunoglobulinas; a via alternativa é iniciada pelo reconhecimento de estruturas nas superfícies microbiana e celular; e a via da lectina, que é uma via independente do anticorpo, é iniciada pela ligação da lectina de ligação manano (MBL, também designada proteína de ligação à manose) a carboidratos, tais como aqueles que são exibidos na superfície de bactérias ou vírus. A ativação das cascatas resulta na produção de complexos envolvidos na proteólise ou lise celular e peptídeos envolvidos na opsonização, anafilaxia e quimiotaxia.
[006] A cascata do complemento, que é um componente central de uma resposta imune de um animal, é uma cascata irreversível. Inúmeros cofatores de proteínas regulam o processo. A regulação inadequada, tipicamente a ativação inadequada, do processo pode ser uma faceta ou pode ocorrer em uma variedade de distúrbios que envolvem respostas inflamatórias e imunes inadequadas, tais como aquelas observadas em doenças inflamatórias agudas e crônicas e outras condições que envolvem uma resposta imune inadequada. Essas doenças e distúrbios incluem doenças autoimunes, tais como artrite reumatoide e lúpus, distúrbios cardíacos e outras doenças inflamatórias, tais como sepse e lesão de isquemia-reperfusão.
[007] Devido ao envolvimento das vias do complemento em uma variedade de doenças e condições, os componentes das vias do complemento são alvos para intervenção terapêutica, particularmente para inibição da via. Exemplos de tais terapias incluem terapias sintéticas e naturais de moléculas pequenas, inibidores de anticorpos e formas solúveis recombinantes de reguladores de complemento de membrana. Existem limitações para estratégias de preparação de tais terapias. As moléculas pequenas têm meia-vida curta in vivo e precisam ser infundidas continuamente para manter a inibição do complemento, limitando assim seu papel, especialmente em doenças crônicas. Os anticorpos terapêuticos podem resultar em uma resposta imune em um indivíduo e, portanto, podem levar a complicações no tratamento, particularmente tratamentos projetados para modular as respostas imunes. Assim, existe uma necessidade de terapia para o tratamento de doenças mediadas por complemento e doenças nas quais a ativação do complemento desempenha um papel. Essas incluem doenças inflamatórias agudas e crônicas. Por conseguinte, entre os objetivos apresentados na presente invenção, é um objetivo prover tais terapias para ter como alvo a ativação da cascata do complemento e prover terapias e métodos de tratamento de doenças.
[008] Polipeptídeos MTSP-1 modificados, compreendendo uma ou mais de modificações de aminoácidos I41S, Q38H, D60bT,
F60eS ou R, Y60gW, ins97aV, D96K, F97G, G151H ou N e Q192T, pelos quais o polipeptídeo MTSP-1 modificado aumentou a atividade e/ou especificidade para uma proteína do complemento em comparação com a forma ativa não modificada do polipeptídeo MTSP-1, em que as modificações de aminoácidos são selecionadas de trocas, inserções e eliminações na sequência primária de aminoácidos do polipeptídeo MTSP-1 não modificado; o polipeptídeo MTSP-1 modificado cliva uma proteína do complemento para assim inibir ou reduzir a ativação do complemento em comparação com uma forma ativa do polipeptídeo MTSP-1 não modificado que não contém a(s) modificação(ões) de aminoácidos; os resíduos são numerados pela numeração de quimotripsina; os resíduos correspondentes são determinados pelo(a) alinhamento e numeração de quimotripsina; o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs.: 1-4 (MTSP-1 de comprimento completo tipo selvagem, MTSP-1 do domínio da protease tipo selvagem, MTSP-1 maduro tipo selvagem, MTSP-1 de comprimento completo com C122S, domínio da protease MTSP-1 com C122S, MTSP-1 maduro com C122S) ou um(a) fragmento ou forma cataliticamente ativo(a) ou forma que inclui a(s) modificação(ões) de aminoácidos.
As modificações estão na sequência principal e incluem inserções, trocas e eliminações.
Os polipeptídeos MTSP-1 modificados incluem modificações que melhoram ou alteram a atividade, e outras propriedades, incluindo propriedades que melhoram seu uso como produtos farmacêuticos.
Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser conjugados com porções que aumentam a estabilidade, a meia-vida no soro, o prazo de validade e outras propriedades. Essas modificações incluem conjugação com polímeros, tais como porções de PEGuilação, outros polipeptídeos para direcionar, identificar e purificar, para o MTPS-1 modificado.
[009] A proteína do complemento para a qual os polipeptídeos MTSP-1 modificados aqui providos são modificados para inativar é C3, de modo que os polipeptídeos MTSP-1 modificados clivam um local que inativa C3. Em virtude da inativação de C3, a ativação do complemento é reduzida ou inibida. Em virtude da inibição ou redução da ativação do complemento, qualquer doença, condição ou distúrbio em que o complemento desempenhe um papel ou em que uma redução da ativação do complemento possa tratar ou reduzir sintomas ou patologia da doença ou do distúrbio, pode ser tratada(o) com polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Os sítios alvo em C3 para clivagem por inativação incluem os resíduos 737-744; a clivagem dentro destes resíduos, tal como entre os resíduos 740 e 741 da SEQ ID NO: 9 (Q H A R ↓ A S H L), inativa C3. A atividade/especificidade para a clivagem de C3 pode ser aumentada em comparação com uma forma ativa do polipeptídeo MTSP-1 não modificado que não contém a(s) modificação(ões) de aminoácidos. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são projetados para aumentar a atividade de clivagem de C3 que é pelo menos 1 vez maior ou mais que 1 vez maior que uma forma ativa, tal como o comprimento completo ou domínio da protease, do polipeptídeo MTSP-1 não modificado da SEQ ID NO: 4 (o domínio da protease com a cisteína livre, C122 por numeração de quimotripsina, trocado por S). A atividade de clivagem para inativar C3 pode ser aumentada em qualquer quantidade, tais como, pelo menos 0,5 vezes, 1 vez, 1,2 vezes, 1,5 vezes, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes ou mais do que o polipeptídeo MTSP-1 modificado não modificado da SEQ ID NO: 4. O polipeptídeo MTSP-1 não modificado é selecionado dentre os polipeptídeos da SEQ ID NOs: 1-4 e porções cataliticamente ativas dos mesmos.
[0010] O polipeptídeo MTSP-1 modificado, que inclui pelo menos uma modificação, tal como I41S, Q38H, D60bT, F60eS ou R, Y60gW, ins97aV, D96K, F97G, G151H ou N e Q192T, ou combinações dessas ou outras trocas, como descrito na presente invenção, tem pelo menos sequência de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade com os polipeptídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. O polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 modificações, incluindo inserções, eliminações e trocas na sequência primária nos polipeptídeos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4 e porções cataliticamente ativas dos mesmos.
[0011] Por exemplo, são providos os polipeptídeos MTSP- 1 modificados que compreendem uma modificação correspondente a qualquer um ou mais de I41S, Q38H, D60bT, F60eS, oY60gW, ins97aV, D96K, F97G, G151H, G151N, Q192T, Q192D e/ou Q192E.
[0012] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ainda incluir trocas adicionais correspondentes a e selecionadas de um ou mais de F60eR, Y59F, F99L, T98P, Q175L ou selecionadas de uma ou mais modificação(ões) em uma posição correspondente a D217, tal como D217V, I, L, W ou M, I41D, E, T, G ou R. Como acima, as posições correspondentes são determinadas pela numeração de quimotripsina. Polipeptídeos
MTSP-1 modificados de exemplo incluem polipeptídeos MTSP-1 modificados que contêm I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T; I41D/C122S/G151N/Q192T; I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V; ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T ou as mesmas modificações, exceto que C122S é C122C. Outros polipeptídeos MTSP-1 modificados de exemplo incluem modificações correspondentes a qualquer um dos seguintes: I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E ou I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D, I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T ou I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T.
[0013] Também são fornecidos polipeptídeos MTSP-1 modificados que incluem modificações correspondentes a qualquer um dos seguintes: I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97Y/ins97aN/T98G/F99L
/C122S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/F97W/ins97aN/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97E/ins97aV/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/F97D/ins97aG/T98N/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L, ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/C122S/G151N/Q192T, ou I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V, ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T, ou I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou
Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G 151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q192D, ou Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D, ou Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , ou Q38H/I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D /D217V, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V, ou I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D/D217 V, ou I41S/D96M/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192V/D217I, ou
I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192H, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192N/D217V, ou I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192 D, ou Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V , ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192V, ou I41S/P49S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V , ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192N/I217 V, ou I41T/F97W/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217L, ou I41G/F97L/F99L/C122S/Q175A/Q192T/D217V, ou I41G/F97V/F99L/C122S/G151Q/Q175M/Q192A/D217L, ou I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V, ou I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G/D217I, ou I41T/F97L/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192S/D217W, ou I41D/F97T/F99M/C122S/Q192V/D217M, ou as mesmas modificações, exceto C122S, não é modificado e é C122C.
[0014] Também são providos polipeptídeos MTSP-1 modificados que incluem modificações selecionadas das combinações que incluem uma ou mais das modificações Q38H, I41S, D60bT, F60eS, Y60gW, D96K, F97G, Ins97aV e G151H como segue: G151H, Ins97aV, Ins97aV/G151H, F97G, F97G/G151H, F97G/Ins97aV, F97G/Ins97aV/G151H, D96K, D96K/G151H, D96K/Ins97aV, D96K/Ins97aV/G151H, D96K/F97G, D96K/F97G/G151H, D96K/F97G/Ins97aV, D96K/F97G/Ins97aV/G151H, Y60gW, Y60gW/G151H, Y60gW/Ins97aV, Y60gW/Ins97aV/G151H, Y60gW/F97G, Y60gW/F97G/G151H,
Y60gW/F97G/Ins97aV, Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, Y60gW/D96K, Y60gW/D96K/G151H, Y60gW/D96K/Ins97aV, Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, Y60gW/D96K/F97G, Y60gW/D96K/F97G/G151H, Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS, F60eS/G151H, F60eS/Ins97aV, F60eS/Ins97aV/G151H, F60eS/F97G, F60eS/F97G/G151H, F60eS/F97G/Ins97aV, F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS/D96K, F60eS/D96K/G151H, F60eS/D96K/Ins97aV, F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, F60eS/D96K/F97G, F60eS/D96K/F97G/G151H, F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW, F60eS/Y60gW/G151H, F60eS/Y60gW/Ins97aV, F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW/F97G, F60eS/Y60gW/F97G/G151H, F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW/D96K, F60eS/Y60gW/D96K/G151H, F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW/D96K/F97G, F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT, D60bT/G151H, D60bT/Ins97aV, D60bT/Ins97aV/G151H, D60bT/F97G, D60bT/F97G/G151H, D60bT/F97G/Ins97aV, D60bT/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/D96K, D60bT/D96K/G151H, D60bT/D96K/Ins97aV, D60bT/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/D96K/F97G, D60bT/D96K/F97G/G151H, D60bT/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW, D60bT/Y60gW/G151H, D60bT/Y60gW/Ins97aV, D60bT/Y60gW/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW/F97G, D60bT/Y60gW/F97G/G151H, D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV, D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW/D96K, D60bT/Y60gW/D96K/G151H, D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV,
D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW/D96K/F97G, D60bT/Y60gW/D96K/F97G/G151H, D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS, D60bT/F60eS/G151H, D60bT/F60eS/Ins97aV, D60bT/F60eS/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/F97G, D60bT/F60eS/F97G/G151H, D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/D96K, D60bT/F60eS/D96K/G151H, D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV, D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/D96K/F97G, D60bT/F60eS/D96K/F97G/G151H, D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW, D60bT/F60eS/Y60gW/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S, I41S/G151H, I41S/Ins97aV, I41S/Ins97aV/G151H, I41S/F97G, I41S/F97G/G151H, I41S/F97G/Ins97aV, I41S/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/D96K, I41S/D96K/G151H, I41S/D96K/Ins97aV, I41S/D96K/Ins97aV/G151H, I41S/D96K/F97G, I41S/D96K/F97G/G151H, I41S/D96K/F97G/Ins97aV, I41S/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/Y60gW, I41S/Y60gW/G151H, I41S/Y60gW/Ins97aV, I41S/Y60gW/Ins97aV/G151H,
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Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, e as mesmas modificações, exceto C122S não é modificado e é C122C.
[0015] Também são providos polipeptídeos MTSP-1 modificados que incluem modificações correspondentes a qualquer um de: T98P/F99LQ175L/Q192D, opcionalmente C122S e uma ou mais selecionadas de: Q38H, I41S, D60bT, F60eS, Y60gW, D96K, F97G, Ins97aV e G151H como a seguir: T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D,
Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D,
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Q38H/I41S/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q19 2D, Q38H/I41S/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q 192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15
1H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q19 2D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q 192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D,
Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q 192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D,
Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q19 2D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q 192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q 175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175 L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q1 75L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99 L/C122S/G151H/Q175L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96 K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y
60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D,Q38H/I41S/D60 bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q19 2D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q1 75L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C 122S/G151H/Q175L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97 G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D,Q38H/I41S/D60bT/F60eS /Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, e as mesmas modificações, exceto C122S não é modificado e é C122C.
[0016] Outros polipeptídeos MTSP-1 modificados de exemplo podem conter trocas, inserções e/ou eliminações correspondentes a: Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/G15 1H/Q175L/Q192D, incluindo aqueles em que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende ou é o domínio da protease da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:4. Outros exemplos de polipeptídeos MTSP-1 modificados incluem, mas não estão limitados a: polipeptídeos MTSP-1 modificados compreendendo modificações selecionadas de combinações de modificações nas quais o domínio da protease cliva C3 humano in vitro com uma EC50 de menos que 10 nM: ins97aA/F97G/T98L/C122S/Q175M/Q192A/D217I/K224R, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, Q38G/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G,
Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98S/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192A, Q38F/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192E, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eT/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192E, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192E, Q38Y/I41A/D60bL/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151 N/Q175M/Q192A, Q38H/I41S/D60bF/F60eV/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151 N/Q175L/Q192A, Q38H/I41A/D60bV/F60eA/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192V, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/ins97aG/F97D/T98N/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D,
Q38F/I41S/D60bF/F60eR/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192V, Q38H/I41S/D60bY/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/L106M/C122S /I136M/Q192G/Q209L/D217T, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96S/ins97aR/F97A/T98S/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192T, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192D, ins97aY/F97G/T98V/C122S/Q175M/Q192S/D217V, Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117L/C122S/I136 T/Q192G/D217I, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192A, H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217V/K224Y, I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/T150S/G151H/Q175L/Q192D/Q209L, Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122
S/G151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136M/Q192 G/D217N, Q38H/I41S/D60bF/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H143 Q/G151N/Q175L/Q192G, Q38Y/I41S/D60bT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q 175L/Q192D, Q38H/I41A/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175 L/Q192A, I41T/D60bW/F60eH/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q17 5L/Q192G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aD/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97S/ins97aH/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192E, I41S/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217V, Q38R/I41S/D60bY/F60eD/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151 N/Q175M/Q192A, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/T98G/F99L/C122S/G151N/ Q175L/Q192D, H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/K224L , Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/Q 175L/Q192D,
Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aN/T98G/F99M /C122S/G151N/Q175L/Q192G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97N/ins97aE/T98S/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, e as mesmas modificações exceto C122S, não é modificado e é C122C.
[0017] Exemplos de polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são aqueles que contêm ou têm as sequências apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs.: 6, 8, 21-59 e 63-81. Isso inclui o polipeptídeo MTSP-1 modificado cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 35 ou na SEQ ID NO: 42. Polipeptídeos MTSP-1 que contêm as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/G151H/Q175L/Q192D (com ou sem o C122S) são exemplos de tais polipeptídeos.
[0018] Para todos os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção, os polipeptídeos MTSP-1 não modificados incluem aqueles que contêm ou têm a sequência de resíduos de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 4 (domínio da protease). Estão incluídas duas formas em cadeia de comprimento completo, duas formas ativadas em cadeia, e formas de cadeia única que contêm o domínio da protease ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo.
[0019] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados são selecionados para clivar e inativar C3 de modo que, in vivo, a ativação do complemento seja reduzida. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção incluem aqueles que clivam dentro dos resíduos QHARASHL (resíduos
737-744) do C3 humano (SEQ ID NO: 9), como aqueles em que P1-P1’ é RA.
[0020] Todo ou qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção pode incluir modificações estruturais e modificações pós-traducionais, tais como adições de um polímero(s) para aumentar a meia- vida no soro e/ou reduzir a imunogenicidade ou ambos. As modificações estruturais incluem alterações na glicosilação, tal como adição de sítios de glicosilação ou tipos de glicosilação, e adições de polímeros, tais como, dextrano, sialilação e PEGuilação. Qualquer um dos polipeptídeos MTSP- 1 modificados pode ser PEGuilado para aumentar a meia-vida e/ou a estabilidade no soro, particularmente para indicações nas quais é desejada uma duração prolongada da ação. O polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser adicionalmente modificado, tal como por adição ou eliminação de lisinas ou outros resíduos para alterar a PEGuilação ou por adição ou eliminação de sítios de glicosilação.
[0021] Além disso, são providas proteínas de fusão, contendo um polipeptídeo MTSP-1 modificado ou uma porção cataliticamente ativa de um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção fundido ou de outro modo conjugado através de um ligante químico ou físico ou de ligação a um polipeptídeo MTSP-1 não protease ou uma porção do mesmo. Exemplo de tais polipeptídeos não protease é um domínio de multimerização, tal como um domínio Fc, ou um domínio de transdução de proteínas (PTD).
[0022] Também são providas moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 modificados e proteínas de fusão providas na presente invenção. Também são providos vetores contendo as moléculas de ácido nucleico. Os vetores podem ser vetores procarióticos ou vetores eucarióticos, e incluem vetores de expressão, vetores virais e vetores para terapia genética. Os vetores virais incluem, mas não estão limitados a, um vetor do vírus do herpes simplex ou um vetor do vírus vaccinia, ou um vetor adenoviral ou um vetor retroviral ou um vetor de inseto.
[0023] São providas células isoladas, células não humanas isoladas (que não podem se desenvolver em zigotos ou em um humano por qualquer método disponível para os técnicos no assunto) e culturas de células que contêm a molécula de ácido nucleico ou moléculas ou vetores de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Os métodos para preparar os polipeptídeos MTSP-1 modificados são providos, e incluem métodos de síntese de aminoácidos, e métodos de DNA recombinante. Estes incluem a introdução de um ácido nucleico ou vetor que codifica um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção em uma célula; cultivar a célula sob condições, em que o polipeptídeo é expressado; e opcionalmente, isolar ou purificar o polipeptídeo MTSP-1 modificado expressado. As células incluem quaisquer células ou linhas celulares adequadas, incluindo células eucarióticas ou células procarióticas. Isso inclui células bacterianas, células de mamíferos e células de levedura. Por exemplo, a célula pode ser uma célula CHO, uma célula BHK, saccharomyces, Pichia e essas células de mamíferos. As células e métodos para a produção de polipeptídeos terapêuticos recombinantes são bem conhecidos dos técnicos no assunto.
[0024] Os ácidos nucleicos, vetores e polipeptídeos podem ser usados para o tratamento ou nos métodos de uma doença ou condição mediada por ou envolvendo a ativação do complemento, em que a inibição da ativação do complemento afeta o tratamento ou a melhora da doença ou condição. Os ácidos nucleicos e vetores podem ser usados para terapia genética, ou os polipeptídeos podem ser administrados. As vias de administração adequadas incluem vias parenterais, locais, sistémicas e transdérmicas. Essas incluem administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intravítrea.
[0025] São providos métodos de tratamento de uma doença ou condição mediada por ou envolvendo a ativação do complemento, quando a inibição ou redução dos efeitos de ativação do tratamento ou alguma melhora dos sintomas ou previne (reduz o risco) de tal doença ou condição. O ácido nucleico ou vetor ou polipeptídeo é administrado a um indivíduo para tratar ou prevenir (reduzir o risco ou sintomas) da doença ou condição. As doenças ou distúrbios ou condições mediada(o)s por complemento incluem, mas não estão limitados a, doenças e condições inflamatórias, sepse, artrite reumatoide (AR), uma doença oftálmica ou ocular, uma doença cardiovascular, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), doenças ou distúrbios oftálmica(o)s ou oculares, esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA), rejeição de órgãos transplantados e lesão de isquemia-reperfusão.
[0026] A doença ou condição pode ser uma doença ocular ou oftálmica ou rejeição ou inflamação devido a um órgão transplantado. Exemplo de tais doenças, distúrbios ou condições é uma retinopatia diabética ou uma degeneração macular, incluindo degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e função tardia de enxerto renal (DGF).
[0027] Os polipeptídeos providos na presente invenção podem ser usados para inibir a ativação do complemento ao contactar um polipeptídeo MTSP-1 modificado com uma proteína C3 do complemento, em que a proteína C3 do complemento é clivada de modo que a ativação do complemento seja reduzida ou inibida. Os indivíduos para tratamento com os polipeptídeos, métodos e usos mencionados na presente invenção podem ser qualquer animal, incluindo humanos, e animais domesticados, particularmente cães, gatos e outros animais de estimação e animais de fazenda. A inibição da ativação do complemento pode reduzir o risco de desenvolver (prevenir) uma doença, condição ou distúrbio ou diminuir a doença, condição ou distúrbio se ela(e) se desenvolver, ou tratar a doença ou distúrbio ou condição. A inibição da ativação do complemento, entre seus efeitos, leva a uma redução dos sintomas inflamatórios associados a uma doença ou um distúrbio mediada(o) por complemento selecionada(o) de um distúrbio inflamatório, um distúrbio neurodegenerativo e um distúrbio cardiovascular. Como observado acima, doenças ou distúrbios ou condições mediada(o)s por complemento incluem, mas não estão limitados a, sepse, artrite reumatoide (AR), distúrbios oculares ou oftálmicos, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), esclerose múltipla (EM), rejeição tardia ou inflamação de órgãos ou tecidos transplantados, miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), Doença de Alzheimer (DA) e lesão de isquemia-reperfusão e quaisquer outras conhecidas pelos técnicos no assunto.
[0028] A doença, a condição ou o distúrbio mediada(o) por complemento pode resultar de um tratamento de um indivíduo. Por exemplo, a lesão de isquemia-reperfusão pode ser causada por um evento ou tratamento selecionado de infarto do miocárdio (IM), acidente vascular cerebral, angioplastia, ponte aorto-coronária, circulação extracorpórea (CEC), e hemodiálise. O tratamento com um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção pode ser efetuado antes do tratamento de um indivíduo que resulta em, ou tem risco de causar um distúrbio, uma condição ou uma doença mediado(a) por complemento.
[0029] São providos os usos dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção e métodos de tratamento de uma doença ou condição mediada por ou envolvendo a ativação do complemento, administrando um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção, em que a inibição da ativação do complemento afeta o tratamento ou a melhora da doença ou condição. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados também podem ser administrados para reduzir o risco (impedir) de desenvolver uma doença ou condição ou reduzir os sintomas dessa(e) doença, distúrbio ou desenvolvimento de condição. As doenças, as condições ou os distúrbios mediada(o)s por complemento incluem os mencionados acima ou abaixo. Incluem- se doenças oculares ou oftálmicas ou rejeição ou inflamação devido a um órgão transplantado. Tais doenças e condições incluem retinopatia diabética e degeneração macular, tal como DMRI, e função tardia de enxerto renal (DGF). O polipeptídeo MTSP-1 modificado (ou molécula ou vetor de ácido nucleico de codificação) pode ser administrado por qualquer via adequada, incluindo aqueles discutidos acima e em outros lugares na presente invenção, tal como parenteralmente, tal como administrado por via intravenosa ou subcutânea. Para o tratamento de distúrbios oftálmicos, os polipeptídeos MTSP- 1 modificados podem ser administrados localmente, tal como por injeção intravítrea ou por aplicação tópica no olho. O polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser modificado para introdução no olho, tal como por fusão a um domínio de transdução de proteína para facilitar a transdução para o humor vítreo. Para qualquer aplicação, método ou uso, o polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser modificado para aumentar a meia-vida no soro, tal como por PEGuilação.
[0030] Também são providos combinações e kits, que incluem: (a) um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção; e (b) um segundo agente ou agentes para o tratamento de uma doença ou um distúrbio mediada(o) por complemento. Os segundos agentes incluem, mas não estão limitados a, agente(s) anti-inflamatório(s) e anticoagulante(s), tais como, mas não limitados a, um ou mais fármacos anti-inflamatórios não esteróides (AINE), antimetabólito, corticosteróide, analgésico, agente citotóxico, inibidor de citocina pró-inflamatória, citocinas anti-inflamatórias, agentes direcionadores de células B, compostos direcionados a antígenos T, bloqueadores de moléculas de adesão, antagonistas de receptores de quimiocinas, inibidores de quinase, inibidores de quinase, ligandos de PPAR-γ (gama), inibidores do complemento,
heparina, varfarina, acenocumarol, fenindiona, EDTA, citrato, oxalato, argatrobana, lepirudina, bivalirudina e ximelagatrana.
[0031] Os métodos, os usos ou as combinações incluem aqueles em que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a modificação I41D ou I41S, particularmente I41S, e polipeptídeos MTSP-1 particularmente modificados que contêm as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L //G151H/Q175L/Q192D ou I41D/C122S/G151N/Q192T ou I41D/G151N/Q192T. O C122S de troca (com referência ao domínio da protease) é incluído para eliminar uma cisteína livre para reduzir a agregação. O polipeptídeo MTSP-1 não modificado inclui o domínio da protease, tal como a sequência de resíduos de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4, tal como um polipeptídeo MTSP-1 modificado que contém a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados em qualquer um dos SEQ ID NOs: 35 e 42.
[0032] São providos métodos de tratamento de DGF por administração intravenosa de um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção, tal como um polipeptídeo MTSP-1 modificado que contém a sequência de resíduos de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 e 42 ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo, tal como um polipeptídeo MTSP-1 modificado que compreende as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/G151H/Q175L/Q192D. As dosagens incluem qualquer dose adequada e qualquer regime de dosagem adequado. Uma dose única inclui 0,1 mg a 1 mg. O tratamento pode ser uma vez ou repetido várias vezes, tais como, a cada 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser modificados, tal como por PEGuilação ou multimerização, para efetuar meia-vida aumentada ou biodisponibilidade aumentada.
[0033] São providos os usos dos polipeptídeos MTSP-1 modificados e/ou métodos de tratamento de um distúrbio oftálmico ou ocular, administrando um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção, tal como sistemicamente ou para os olhos. Os distúrbios oftálmicos incluem retinopatia diabética e degeneração macular, tal como DMRI. Dosagens adequadas podem ser determinadas empiricamente, e incluem uma dosagem única que é de 0,1 a 1 mg. Exemplos de polipeptídeos MTSP-1 modificados para uso nessas indicações são quaisquer providos na presente invenção que clivam C3. Estes incluem polipeptídeos MTSP-1 modificados que contêm a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 e 42 ou uma porção cataliticamente ativa dos mesmos, tal como, mas não limitados a, um polipeptídeo MTSP-1 modificado que compreende as trocas ou inserções e/ou eliminações: Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/G15 1H/Q175L/Q192D ou o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as trocas: I41D/G151N/Q192T ou I41D/C122S/G151N/Q192T. Os polipeptídeos podem ser administrados ao olho como descrito acima, tal como por injeção intravítrea ou outro método local. O tratamento pode ser repetido uma vez ou várias vezes, tais como, a cada 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados incluem os da SEQ ID NO: 35 ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo ou formas de comprimento completo ou porções cataliticamente ativas dos mesmos. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser modificados, tal como por PEGuilação ou multimerização, para efetuar meia-vida aumentada ou biodisponibilidade aumentada.
[0034] Para qualquer aplicação, o polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser uma forma de cadeia única ou de duas cadeias do polipeptídeo MTSP-1 modificado ou uma forma de zimogênio que é ativada in vivo. Os domínios de protease são ativos como cadeias únicas. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem incluir outras modificações, tais como PEGuilação para alterar ou melhorar as propriedades farmacológicas.
[0035] A Figura 1 mostra uma visão geral das vias do complemento clássica, da lectina e alternativa e a ativação do complexo terminal do complemento, o complexo de ataque à membrana (MAC). A figura representa muitas das mais de 30 proteínas que participam da cascata do complemento, sua ação dentro da cascata e, quando aplicável, seus pontos de convergência entre as vias do complemento. Por exemplo, as três vias convergem após a geração de uma C3 convertase, que cliva C3 para formar uma C5 convertase produzindo a formação do complexo MAC. A figura também representa a geração de muitos dos produtos de clivagem do complemento.
DESCRIÇÃO DETALHADA Esboço A. DEFINIÇÕES B. ESTRUTURA E FUNÇÃO DO MTSP-1
1. Serinas Proteases
2. Estrutura
3. Função/Atividade C. INIBIÇÃO DE COMPLEMENTOS POR DIRECIONAMENTO DE C3
1. Proteína de complemento C3 e seu papel na iniciação do complemento a. Via clássica b. Via Alternativa c. Via da Lectina d. Funções efetoras mediadas por complemento i. Lise Mediada por Complemento: Complexo de Ataque à Membrana ii. Inflamação iii. Quimiotaxia iv. Opsonização v. Ativação da Resposta Imune Humoral
2. Estrutura e Função de C3 a. C3a b. C3b i. Inibidores de C3b D. POLIPEPTÍDEOS MTSP-1 MODIFICADOS QUE CLIVAM C3
1. Polipeptídeos MTSP-1 modificados de exemplo
2. Modificações adicionais a. Imunogenicidade Diminuída b. Domínios Fc c. Conjugação a polímeros d. Domínios de Transdução de Proteínas E. ENSAIOS PARA AVALIAR E/OU MONITORAR A ATIVIDADE DE MTSP-1 EM FUNÇÕES MEDIADAS POR COMPLEMENTO
1. Métodos para Avaliar a Atividade e a Especificidade de MTSP-1 para Clivar a Proteína de Complemento C3 Para Desativá-lo a. Detecção de Proteína i. Análise por SDS-PAGE ii. Imunoensaio enzimático iii. Imunodifusão Radial (RID) b. Ensaios Hemolíticos c. Métodos para determinar Sítios de Clivagem
2. Métodos para Avaliar a Atividade de MTSP-1 do Tipo Selvagem a. Clivagem de Substratos de MTSP-1 b. Ensaios de Ligação de Substrato de MTSP-1 c. Ensaios de clivagem de C3
3. Especificidade
4. Modelos de Doenças F. MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM POLIPEPTÍDEOS MTSP-1 MODIFICADOS
1. Isolamento ou Preparação de Ácidos Nucleicos que Codificam Polipeptídeos MTSP-1
2. Geração de Ácidos Nucleicos Mutantes ou Modificados e Polipeptídeos Codificadores
3. Vetores e Células
4. Expressão a. Células procarióticas b. Células de levedura c. Insetos e células de insetos d. Expressão de mamíferos e. Plantas
5. Purificação
6. Modificações adicionais a. PEGuilação b. Proteínas de Fusão
7. Moléculas de Ácido Nucleico G. COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E DOSAGENS
1. Administração de polipeptídeos MTSP-1 modificados
2. Administração de Ácidos Nucleicos que Codificam Polipeptídeos MTSP-1 Modificados (Terapia Gênica) H. USOS TERAPÊUTICOS E MÉTODOS DE TRATAMENTO
1. Doença Mediada por Ativação De Complemento a. Artrite Reumatoide b. Sepse c. Esclerose múltipla d. Doença de Alzheimer e Lesão de isquemia-reperfusão f. Distúrbios oculares Degeneração macular relacionada à idade (DMRI) g. Transplante de órgãos e Função Tardia do Enxerto (DGF)
2. Usos terapêuticos a. Doenças inflamatórias imunomediadas b. Doença Neurodegenerativa c. Doença Cardiovascular d. Degeneração macular relacionada à idade (DMRI) e. Transplante de órgão Função Tardia do Enxerto
3. Terapias combinadas
[0036] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados na presente invenção têm o mesmo significado que é comumente entendido por um técnico no assunto à qual a(s) invenção(ões) pertence(m). Todas as patentes, os pedidos de patentes, pedidos publicados e publicações, sequências do BANCO DE GENES, sites e outros materiais publicados mencionados em toda a divulgação contida na presente invenção, a menos que indicado de outra forma, são incorporados por referência em sua totalidade. No caso de existir uma pluralidade de definições para os termos na presente invenção, que prevalecerão nesta seção. Quando é feita referência a um URL ou outro identificador ou endereço, entende-se que esses identificadores podem mudar e informações específicas na Internet podem ir e vir, mas informações equivalentes são conhecidas e podem ser facilmente acessadas, como pesquisando na Internet e/ou bancos de dados apropriados. As referências a eles evidenciam a disponibilidade e a disseminação pública de tais informações.
[0037] Como usado na presente invenção, a clivagem refere-se à quebra de ligações peptídicas por uma protease. O motivo do sítio de clivagem para uma protease envolve os resíduos N e C-terminais da ligação cindível (os lados não iniciado e iniciado, respectivamente, com o sítio de clivagem para uma protease definida como ... P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’ ..., e ocorre a clivagem entre os resíduos P1 e P1’). No C3 humano, a clivagem por uma C3 convertase ocorre entre os resíduos R e S (ver resíduos 746-751 da SEQ ID NO: 9, clivagem entre os resíduos 748 e 749 da sequência no C3 humano) de C3: P3 P2 P1 P1’ P2’ P3’ Leu Ala Arg ↓ Ser Asn Leu.
[0038] Tipicamente, a clivagem de um substrato em uma via bioquímica é uma clivagem de ativação ou uma clivagem inibitória. Uma clivagem de ativação refere-se à clivagem de um polipeptídeo de uma forma inativa para uma forma ativa. Isso inclui, por exemplo, a clivagem de um zimogênio em uma enzima ativa. Uma clivagem de ativação também é uma clivagem pela qual uma proteína é clivada em uma ou mais proteínas que têm atividade. Por exemplo, o sistema do complemento é uma cascata irreversível de eventos de clivagem proteolítica cuja terminação resulta na formação de múltiplas moléculas efetoras que estimulam a inflamação, facilitam a fagocitose de antígenos, e lisam algumas células diretamente. Assim, a clivagem de C3 por uma C3 convertase em C3a e C3b é uma clivagem de ativação. Em contraste, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção efetuam a clivagem inibitória de C3, tal como por clivagem em um sítio alvo que inativa C3.
[0039] Como usado na presente invenção, uma clivagem inibitória ou clivagem de inativação é a clivagem de uma proteína em um ou mais de produtos de degradação que não são funcionais. A clivagem inibitória resulta na diminuição ou redução de uma atividade de uma proteína. Tipicamente, uma redução de uma atividade de uma proteína reduz a via ou o processo pelo qual a proteína está envolvida. Em um exemplo, a clivagem de qualquer de uma ou mais de proteínas de complemento que é uma clivagem inibitória resulta na redução ou inibição concomitante de qualquer de uma ou mais das vias funcionais clássicas, lectinas ou alternativas do complemento. Para ser inibitória, a clivagem reduz a atividade em pelo menos cerca de 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou mais em comparação com uma forma nativa da proteína. A percentagem de clivagem de uma proteína que é necessária para que a clivagem seja inibitória varia entre as proteínas, mas pode ser determinada ensaiando uma atividade da proteína.
[0040] Como usado na presente invenção, “ativação do complemento” refere-se à ativação de vias do complemento, por exemplo, a ativação do complemento refere-se a um aumento nas funções ou atividades de qualquer de uma ou mais vias do complemento por uma protease ou um aumento na atividade de qualquer uma das proteínas na via do complemento. A ativação do complemento pode levar à lise celular mediada por complemento ou à destruição de células ou tecidos. A ativação inadequada do complemento no tecido hospedeiro desempenha um papel importante na patologia de muitas doenças autoimunes e inflamatórias, e também é responsável por ou associada a muitos estados de doença associados à bioincompatibilidade. Entende-se que a ativação pode significar um aumento na atividade existente, bem como a indução de uma nova atividade. Uma ativação do complemento pode ocorrer in vitro ou in vivo. Funções de exemplo do complemento que podem ser ensaiadas e que são descritas na presente invenção incluem ensaios hemolíticos, e ensaios para medir qualquer de uma ou mais das moléculas efetoras do complemento, tal como por SDS PAGE, seguida por Western Blot ou pela coloração com Azul de Coomassie Brilhante ou por ELISA. Em algumas modalidades, a ativação do complemento é inibida por uma protease, tal como uma protease descrita na presente invenção, em 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais em comparação com a atividade do complemento na ausência de uma protease.
[0041] Como usado na presente invenção, “inibir a ativação do complemento” ou “inativação do complemento” refere-se à redução ou diminuição de uma função ou atividade mediada por complemento de qualquer de uma ou mais das vias do complemento por uma protease ou na atividade de qualquer uma das proteínas em uma via. Uma função ou atividade do complemento pode ocorrer in vitro ou in vivo. Funções de exemplo do complemento que podem ser ensaiadas e que são descritas na presente invenção incluem ensaios hemolíticos, e ensaios para medir qualquer de uma ou mais das moléculas efetoras do complemento, tal como por SDS PAGE, seguida por Western Blot ou pela coloração com Azul de Coomassie Brilhante ou por ELISA. Uma protease pode inibir a ativação do complemento em 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais. Em outras modalidades, a ativação do complemento é inibida por uma protease em 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% ou mais em comparação com a atividade do complemento na ausência de uma protease.
[0042] Como usado na presente invenção, uma “proteína do complemento” ou um “componente do complemento” é uma proteína do sistema do complemento que funciona na defesa do hospedeiro contra infecções e no processo inflamatório. As proteínas do complemento incluem aquelas que funcionam na via clássica, aquelas que funcionam na via alternativa, e aquelas que funcionam na via da lectina. Entre as proteínas do complemento estão as proteases que participam das vias do complemento. Além disso, como usado na presente invenção, as proteínas do complemento incluem qualquer um dos “produtos de clivagem” (também chamados de “fragmentos”) que são formados após a ativação da cascata do complemento. Também estão incluídas entre as proteínas do complemento as formas inativas ou alteradas de proteínas do complemento, tal como iC3b e C3a-desArg. Assim, as proteínas do complemento incluem, mas não estão limitadas a: C1q, C1r, C1s, C2, C3, C3a, C3b, C3c, C3dg, C3g, C3d, C3f, iC3, C3a-desArg, C4, C4a, C4b, iC4, C4a-desArg, C5, C5a, C5a-des-Arg, C6, C7, C8, C9, MASP-1, MASP-2, MBL, Fator B, Fator D, Fator H, Fator I, CR1, CR2, CR3, CR4, properdina, C1Inh, C4bp, MCP, DAF, CD59 (MIRL), clusterina e HRF e variantes alélicas e de espécies de qualquer proteína do complemento.
[0043] Como usado na presente invenção, uma forma “nativa” de uma proteína do complemento é aquela que pode ser isolada de um organismo, tal como um vertebrado na ausência de ativação do complemento, e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório. Exemplos de proteínas do complemento nativas incluem C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, Fator B, Fator D, properdina, C5, C6, C7, C8 e C9.
[0044] Geralmente, “proteínas do complemento nativas” são inativas e adquirem atividade após a ativação. A ativação pode exigir clivagem de ativação, clivagem de maturação e/ou formação de complexo com outras proteínas. Uma exceção a isso é o Fator I e o Fator D, que têm atividade enzimática em sua forma nativa. Em alguns exemplos, a ativação de uma proteína do complemento nativa ocorre após a clivagem da proteína. Por exemplo, zimogênios do complemento, tal como
C3 são proteases que são ativadas por clivagem de protease, de modo que a clivagem de C3 pela C3 convertase C4b2b gera os fragmentos ativos C3a e C3b. Em um outro exemplo, a clivagem de uma proteína inativa do complemento nativo resulta em mudanças na estabilidade estrutural de uma proteína que resulta na ativação da proteína. Por exemplo, C3 contém uma ligação tioéster interna que na proteína nativa é estável, mas pode se tornar altamente reativa e ativada após mudanças conformacionais que resultam da clivagem da proteína. Assim, os produtos de clivagem de C3 são biologicamente ativos. A ativação de C3 também pode ocorrer espontaneamente na ausência de clivagem. É a conversão espontânea da ligação tioéster no C3 nativo que é um evento inicial da via alternativa do complemento. Em outros exemplos, a ativação de uma proteína do complemento nativa ocorre após a liberação de uma molécula reguladora complexada que inibe a atividade de uma proteína do complemento nativa de outra forma ativa. Por exemplo, C1in se liga e inativa C1s e C1r, a menos que estejam em complexo com C1q.
[0045] Como usado na presente invenção, “clivagem de maturação” é um termo geral que se refere a qualquer clivagem necessária para a ativação de um zimogênio. Isso inclui clivagem que leva a uma mudança conformacional que resulta em atividade (isto é, clivagem de ativação). Também inclui clivagem na qual um sítio de ligação crítico é exposto ou um impedimento estérico é exposto ou um segmento inibidor é removido ou movido.
[0046] Como usado na presente invenção, “forma alterada” de uma proteína do complemento refere-se a uma proteína do complemento que está presente em uma forma não nativa resultante de modificações em sua estrutura molecular. Por exemplo, a reação de C3 do tioéster com água pode ocorrer na ausência de clivagem da convertase, resultando em uma forma inativa hidrolisada de C3 denominada iC3. Em outro exemplo, anafilatoxinas incluindo C3a, C5a e C4a podem ser desarginadas por carboxipeptidase N em formas mais estáveis e menos ativas.
[0047] Como usado na presente invenção, um “fragmento” ou “produto de clivagem” de uma proteína do complemento é uma região ou um segmento de uma proteína do complemento que contém uma porção da sequência de polipeptídeos de uma proteína do complemento nativa. Um fragmento de uma proteína do complemento geralmente resulta após a ativação de uma cascata do complemento. Geralmente, um fragmento resulta da clivagem proteolítica de uma proteína do complemento nativa. Por exemplo, a proteína C3 do complemento é clivada enzimaticamente por uma C3 convertase, resultando em dois fragmentos: C3a que constitui a porção N-terminal de C3; e C3b, que constitui a porção C-terminal e contém o sítio da serina protease. Um fragmento de uma proteína do complemento também resulta da clivagem proteolítica de outro fragmento de uma proteína do complemento. Por exemplo, C3b, um fragmento gerado a partir da clivagem de C3, é clivado pelo Fator I para gerar os fragmentos iC3b e C3f. Geralmente os produtos de clivagem de proteínas do complemento são produtos biologicamente ativos e funcionam como moléculas efetoras de clivagem do sistema do complemento. Portanto, um fragmento ou uma porção de proteína do complemento inclui produtos de clivagem de proteínas do complemento, e também porções das proteínas que retêm ou exibem pelo menos uma atividade de uma proteína do complemento.
[0048] Como usado na presente invenção, “moléculas efetoras de clivagem” ou “proteínas efetoras de clivagem” refere-se aos produtos de clivagem ativos gerados como um resultado da cascata de enzimas desencadeada do sistema do complemento. Uma molécula efetora de clivagem, um fragmento ou um produto de clivagem resultante da ativação do complemento pode contribuir para qualquer de uma ou mais das funções ou atividades mediadas por complemento, que incluem opsonização, anafilaxia, lise celular e inflamação. Exemplos de moléculas de clivagem ou efetoras incluem, mas não estão limitados a, C3a, C3b, C4a, C4b, C5a, C5b-9 e Bb. As moléculas efetoras de clivagem do sistema do complemento, em virtude da participação na cascata, exibem atividades que incluem estimular a inflamação, facilitar a fagocitose do antígeno, e lisar diretamente algumas células. Os produtos de clivagem do complemento promovem ou participam da ativação das vias do complemento.
[0049] Como usado na presente invenção, “anafilatoxinas” são proteínas efetoras da clivagem que desencadeiam a degranulação ou liberação de substâncias de mastócitos ou basófilos, que participam da resposta inflamatória, particularmente como parte da defesa contra parasitas. Se a degranulação for muito forte, pode causar reações alérgicas. As anafilatoxinas incluem, por exemplo, C3a, C4a e C5a. As anafilatoxinas também mediam indiretamente espasmos de células musculares lisas (tal como broncoespasmos), aumento da permeabilidade dos capilares sanguíneos e quimiotaxia.
[0050] Como usado na presente invenção, “quimiotaxia”
refere-se ao movimento de leucócitos mediado por receptor em direção a um quimioatraente tipicamente na direção da concentração crescente do mesmo, tal como na direção do aumento da concentração de uma anafilatoxina.
[0051] Como usado na presente invenção, “opsonização” refere-se à alteração da superfície de um patógeno ou outra partícula para que possa ser ingerida por fagócitos. Uma proteína que se liga ou altera a superfície de um patógeno é denominada opsonina. Anticorpo e proteínas do complemento opsonizam bactérias extracelulares para captação e destruição por fagócitos, tais como neutrófilos e macrófagos.
[0052] Como usado na presente invenção, “lise celular” refere-se à quebra da abertura de uma célula pela destruição de sua parede ou membrana. A hemólise dos glóbulos vermelhos é uma medida da lise celular.
[0053] Como usado na presente invenção, “proteína C3 do complemento” ou “C3” refere-se à proteína C3 do complemento do sistema do complemento que funciona na defesa do hospedeiro contra infecções e no processo inflamatório. A proteína C3 do complemento humana é uma pré-proproteína ou um zimogênio de cadeia simples de 1663 aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9 que contém um peptídeo sinal de 22 aminoácidos (aminoácidos 1-22 da SEQ ID NO: 9) e uma sequência de tetra-arginina (aminoácidos 668-671 da SEQ ID NO: 9) que é removida por uma enzima semelhante à furina, resultando em uma proteína madura de duas cadeias contendo uma cadeia beta (aminoácidos 23-667 da SEQ ID NO: 9) e uma cadeia alfa (aminoácidos 672-1663 da SEQ ID NO: 9) ligada por uma ligação dissulfeto entre os resíduos C559 e C816. A proteína C3 do complemento é adicionalmente ativada por clivagem proteolítica por uma C3 convertase (C4b2b ou C3bBb) entre os aminoácidos 748 e 749 da SEQ ID NO: 9, gerando a anafilatoxina C3a e a opsonina C3b.
[0054] Como usado na presente invenção, um “zimogênio” refere-se a uma proteína que é ativada por clivagem proteolítica, incluindo clivagem de maturação, como clivagem de ativação e/ou formação de complexo com outras proteínas e/ou cofator(es). Um zimogênio é um precursor inativo de uma proteína. Tais precursores são geralmente maiores, embora não necessariamente maiores, do que a forma ativa. Com referência ao MTSP-1 ou à proteína C3 do complemento, os zimogênios são convertidos em enzimas ativas por clivagem específica, incluindo clivagem catalítica e autocatalítica, ou pela ligação de um cofator ativador, que gera uma enzima ativa. Um zimogênio, portanto, é uma proteína enzimaticamente inativa que é convertida em uma enzima proteolítica pela ação de um ativador. A clivagem pode ser efetuada autocataliticamente. Várias proteínas do complemento são zimogênios; elas são inativas, mas tornam- se clivados e ativados após o início do sistema do complemento após a infecção. Os zimogênios, geralmente, são inativos e podem ser convertidos em polipeptídeos ativos maduros por clivagem catalítica ou autocatalítica da pró- região do zimogênio.
[0055] Como usado na presente invenção, uma “pró- região”, “pró-peptídeo” ou “pró-sequência”, refere-se a uma região ou um segmento de uma proteína que é clivada para produzir uma proteína madura. Isso pode incluir segmentos que funcionam para suprimir a atividade enzimática mascarando a usina catalítica e, assim, impedindo a formação do intermediário catalítico (isto é, ocluindo estericamente o sítio de ligação do substrato). Uma pró-região é uma sequência de aminoácidos posicionada no terminal amino de um polipeptídeo maduro biologicamente ativo e pode ter apenas alguns aminoácidos ou pode ser uma estrutura de múltiplos domínios.
[0056] Como usado na presente invenção, uma “sequência de ativação” refere-se a uma sequência de aminoácidos em um zimogênio que é o sítio necessário para a clivagem de ativação ou clivagem de maturação para formar uma protease ativa. A clivagem de uma sequência de ativação pode ser catalisada autocataliticamente ou pela ativação de parceiros.
[0057] A clivagem de ativação é um tipo de clivagem de maturação na qual ocorre uma mudança conformacional necessária para a atividade. Esta é uma via de ativação clássica, por exemplo, para serina proteases, na qual uma clivagem gera um novo terminal N que interage com as regiões conservadas da usina catalítica, tais como resíduos catalíticos, para induzir mudanças conformacionais necessárias para a atividade. A ativação pode resultar na produção de formas de múltiplas cadeias das proteases. Em alguns casos, as formas de cadeia única da protease podem exibir atividade proteolítica.
[0058] Como usado na presente invenção, “domínio” refere-se a uma porção de uma molécula, tais como proteínas ou ácidos nucleicos codificadores, que é estruturalmente e/ou funcionalmente distinta de outras porções da molécula e é identificável. Um domínio polipeptídico de exemplo é uma parte do polipeptídeo que pode formar uma estrutura dobrada independentemente dentro de um polipeptídeo constituído de um ou mais dos motivos estruturais (por exemplo, combinações de hélices alfa e/ou fitas beta conectadas por regiões de enovelamento) e/ou que é reconhecido por uma atividade funcional específica, tal como atividade enzimática, dimerização ou ligação ao substrato. Um polipeptídeo pode ter um ou mais, tipicamente mais de um, domínios distintos. Por exemplo, o polipeptídeo pode ter um ou mais de domínios estruturais e um ou mais de domínios funcionais. Um único domínio polipeptídico pode ser distinguido com base na estrutura e na função. Um domínio pode abranger uma sequência linear contígua de aminoácidos. Alternativamente, um domínio pode abranger uma pluralidade de porções de aminoácidos não contíguas, que não são contíguas ao longo da sequência linear de aminoácidos do polipeptídeo. Tipicamente, um polipeptídeo contém uma pluralidade de domínios. Por exemplo, as serina proteases podem ser caracterizadas com base na sequência do(s) domínio(s) da protease. Os técnicos no assunto estão familiarizados com os domínios de polipeptídeos e podem identificá-los em virtude da homologia estrutural e/ou funcional com outros domínios. Para exemplificação na presente invenção, são providas definições, mas entende-se que é parte da técnica no assunto reconhecer domínios específicos por nome. Se necessário, um software apropriado pode ser empregado para identificar domínios.
[0059] Como usado na presente invenção, uma “região estrutural” de um polipeptídeo é uma região do polipeptídeo que contém pelo menos um domínio estrutural.
[0060] Como usado na presente invenção, um “domínio da protease” é a porção cataliticamente ativa de uma protease. A referência a um domínio da protease de uma protease inclui as formas únicas, de duas e de múltiplas cadeias de qualquer uma dessas proteínas. Um domínio da protease de uma proteína contém todas as propriedades necessárias dessa proteína necessárias para sua atividade proteolítica, tal como por exemplo, seu centro catalítico.
[0061] Como usado na presente invenção, uma “porção cataliticamente ativa” ou “domínio cataliticamente ativo” de uma protease, por exemplo, um polipeptídeo MTSP-1, refere- se ao domínio da protease ou a qualquer fragmento ou porção da mesma que retenha a atividade da protease. Por exemplo, uma porção cataliticamente ativa de um polipeptídeo MTSP-1 pode ser um domínio da protease MTSP-1 incluindo uma forma de cadeia única isolada do domínio da protease ou uma forma de duas cadeias ativada. A forma zimogênica de cada proteína é a forma de cadeia única, que pode ser convertida na forma ativa de duas cadeias por clivagem. O domínio da protease também pode ser convertido para uma forma de duas cadeias. Significativamente, pelo menos in vitro, as formas de cadeia única das proteases e domínios catalíticos ou suas porções proteoliticamente ativas (tipicamente truncamentos C- terminais) exibem atividade de protease.
[0062] Como usado na presente invenção, um “ácido nucleico que codifica um domínio da protease ou porção cataliticamente ativa de uma protease” refere-se a um ácido nucleico que codifica apenas o domínio da protease de cadeia única indicado ou porção ativa do mesmo, e não as outras porções contíguas da protease como uma sequência contínua.
[0063] Como usado na presente invenção, recitar que um polipeptídeo consiste essencialmente no domínio da protease significa que apenas a porção do polipeptídeo é um domínio da protease ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo. O polipeptídeo pode opcionalmente, e geralmente irá, incluir sequências adicionais de aminoácidos não derivados de protease.
[0064] Como usado na presente invenção, um “sítio ativo de uma protease” refere-se ao sítio de ligação do substrato onde ocorre a catálise do substrato. A estrutura e as propriedades químicas do sítio ativo permitem o reconhecimento e a ligação do substrato e a subsequente hidrólise e a clivagem da ligação cindível no substrato. O sítio ativo de uma protease contém aminoácidos que contribuem para o mecanismo catalítico da clivagem de peptídeos, bem como aminoácidos que contribuem para o reconhecimento da sequência do substrato, tais como aminoácidos que contribuem para a especificidade estendida de ligação ao substrato.
[0065] Como usado na presente invenção, o sítio alvo em C3 refere-se a um sítio que, quando clivado, inativa C3. Exemplo desse sítio é: Q H A R ↓ A S H L (resíduos 737-744 de SEQ ID NO:9) P4P3P2P1 ↓ P1’ P4’.
[0066] Como usado na presente invenção, o “sítio de reconhecimento do substrato” ou “sequência de clivagem” refere-se à sequência reconhecida pelo sítio ativo de uma protease que é clivada por uma protease. Tipicamente, uma sequência de clivagem para uma serina protease tem seis resíduos de comprimento para corresponder à especificidade do substrato estendida de muitas proteases, mas pode ser mais longa ou mais curta, dependendo da protease.
Tipicamente, por exemplo, para uma serina protease, uma sequência de clivagem é composta dos aminoácidos P1-P4 e P1’-P4’ em um substrato, onde a clivagem ocorre após a posição P1. Tipicamente, uma sequência de clivagem para uma serina protease tem seis resíduos de comprimento para corresponder à especificidade do substrato estendida de muitas proteases, mas pode ser mais longa ou mais curta, dependendo da protease.
[0067] Como usado na presente invenção, “substrato alvo” refere-se a um substrato que é clivado por uma protease. Tipicamente, o substrato alvo é especificamente clivado no seu sítio de reconhecimento de substrato por uma protease. No mínimo, um substrato alvo inclui os aminoácidos que compõem a sequência de clivagem. Opcionalmente, um substrato alvo inclui um peptídeo contendo a sequência de clivagem e quaisquer outros aminoácidos. Uma proteína de comprimento completo, variante alélica, isoforma, ou qualquer parte da mesma, contendo uma sequência de clivagem reconhecida por uma protease, é um substrato alvo para essa protease. Por exemplo, para as finalidades mencionadas na presente invenção nas quais a inativação do complemento é pretendida, um substrato alvo é a proteína C3 do complemento, ou qualquer porção ou fragmento do mesmo contendo uma sequência de clivagem reconhecida por um polipeptídeo MTSP-
1. Tais substratos alvo podem ser proteínas purificadas, ou podem estar presentes em uma mistura, tal como uma mistura in vitro ou uma mistura in vivo. As misturas podem incluir, por exemplo, sangue ou soro ou leite materno ou outros fluidos de tecido. Adicionalmente, um substrato alvo inclui um peptídeo ou uma proteína contendo uma porção adicional que não afeta a clivagem do substrato por uma protease. Por exemplo, um substrato alvo pode incluir um peptídeo de quatro aminoácidos ou uma proteína de comprimento completo quimicamente ligada a uma porção fluorogênica. As proteases podem ser modificadas para exibir maior especificidade do substrato para um substrato alvo.
[0068] Como usado na presente invenção, “MTSP-1” ou “MTSP1” ou “serina protease tipo membrana” “polipeptídeo MTSP-1” refere-se a qualquer polipeptídeo MTSP-1 incluindo, mas não limitado a, um polipeptídeo produzido de forma recombinante, um polipeptídeo produzido sinteticamente e um polipeptídeo MTSP-1 extraído ou isolado de células ou tecidos incluindo, mas não limitada(o)s a, células epiteliais, células cancerígenas, fígado e sangue. Nomes alternativos usados de forma intercambiável para MTSP-1 incluem serina protease tipo membrana e matriptase e Epitina e TMPRSS1 e proteína supressora da tumorigenicidade 14 e Prostamina e Serina protease 14 (ST14) e Serina protease TADG-15 e proteína de gene diferencialmente expressado associado a tumor 15 (TADG-15). O MTSP-1 inclui polipeptídeos relacionados de diferentes espécies, incluindo, mas não limitado a, animais de origem humana e não humana. MTSP-1 humano inclui MTSP-1, variantes alélicas, isoformas, moléculas sintéticas de ácidos nucleicos, proteína isolada de células e tecidos humanos e formas modificadas dos mesmos.
[0069] Os polipeptídeos MTSP-1 humanos não modificados de exemplo incluem, mas não estão limitados a, polipeptídeos MTSP-1 não modificados e tipo selvagem (SEQ ID NO: 1) e o domínio da protease (tal como o domínio da protease de cadeia única de MTSP-1 apresentado na SEQ ID NO: 2). Um técnico no assunto reconheceria que as posições referenciadas do polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) diferem em 614 resíduos de aminoácidos quando em comparação com o domínio da protease MTSP-1 (SEQ ID NO: 2). Assim, o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 2 “corresponde” ao seiscentésimo décimo quinto resíduo de aminoácido (615º) da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser qualquer de uma ou mais das variantes alélicas de MTSP-1, como apresentado na SEQ ID NO:
99.
[0070] Uma protease MTSP-1 ocorre como um zimogênio de cadeia única e como um polipeptídeo de duas cadeias ativado. A referência ao MTSP-1 inclui formas ativas de cadeia única e de duas cadeias. Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção podem ser adicionalmente modificados, tal como por modificação química ou modificação pós-tradução. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, glicosilação, PEGuilação, albuminação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, HESilação, PASilação e outras modificações polipeptídicas conhecidas na técnica.
[0071] MTSP-1 inclui MTSP-1 de qualquer espécie, incluindo espécies humanas e não humanas. Os polipeptídeos MTSP-1 de origem não humana incluem, mas não estão limitados a, polipeptídeos MTSP-1 de murino e de rato. Os polipeptídeos MTSP-1 de exemplo de origem não humana incluem, por exemplo, camundongo (Mus musculus, SEQ ID NO: 12) e rato (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 13).
[0072] A referência aos polipeptídeos MTSP-1 também inclui polipeptídeos precursores e polipeptídeos MTSP-1 maduros em formas de cadeia única ou de duas cadeias, formas truncadas dos mesmos que têm atividade, o domínio da protease isolado e inclui variantes alélicas e variantes de espécies, variantes codificadas por variantes de splicing, e outras variantes, incluindo polipeptídeos que têm pelo menos, ou pelo menos cerca de, 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a forma completa (SEQ ID NO: 1 ou 3) ou o domínio da protease dos mesmos (SEQ ID NO: 2 ou 4). Os polipeptídeos MTSP-1 incluem, mas não estão limitados a, isoformas específicas de tecidos e variantes alélicas dos mesmos, moléculas sintéticas preparadas pela tradução de ácidos nucleicos, proteínas geradas por síntese química, tal como sínteses que incluem a ligação de polipeptídeos mais curtos, através de métodos recombinantes, proteínas isoladas de tecidos e células humano(a)s e não humano(a)s, polipeptídeos quiméricos de MTSP-1 e formas modificadas dos mesmos.
Os polipeptídeos MTSP-1 também incluem fragmentos ou porções de MTSP-1 que são de comprimento suficiente ou incluem regiões apropriadas para reter pelo menos uma atividade (mediante ativação, se necessário) de um polipeptídeo maduro de comprimento completo.
Em um exemplo, a porção de MTSP-1 é o domínio da protease, tal como, por exemplo, o domínio da protease apresentado na SEQ ID NO: 2, que corresponde aos aminoácidos 615-855 da sequência de MTSP- 1 WT apresentada em SEQ ID NO: 1. Os polipeptídeos MTSP-1 também incluem aqueles que contêm modificações químicas ou pós-traducionais e aqueles que não contêm modificações químicas ou pós-traducionais.
Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, PEGuilação, albuminação,
glicosilação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, HESilação, PASilação e outras modificações polipeptídicas conhecidas na técnica.
[0073] Como usado na presente invenção, “protease MTSP- 1” ou “domínio da protease MTSP-1” refere-se a qualquer polipeptídeo MTSP-1, incluindo, mas não limitado a, um polipeptídeo produzido de forma recombinante, um polipeptídeo produzido sinteticamente e um polipeptídeo MTSP-1 extraído ou isolado de células ou tecidos incluindo, mas não limitado a, fígado e sangue. A protease MTSP-1 inclui polipeptídeos relacionados de diferentes espécies, incluindo, mas não se limitando a, animais de origem humana e não humana. Uma protease MTSP-1 e um domínio da protease MTSP-1 humano inclui MTSP-1, variantes alélicas, isoformas, moléculas sintéticas de ácidos nucleicos, proteína isolada de células e tecidos humanos e formas modificadas dos mesmos. Os domínios de exemplo de protease MTSP-1 humana de referência incluem, mas não estão limitados a, domínio da protease MTSP-1 não modificado e tipo selvagem (SEQ ID NO: 2) e um domínio da protease alternativo (tal como o domínio da protease MTSP-1 apresentado em SEQ ID NO: 4). Um técnico no assunto reconheceria que as posições referenciadas do domínio da protease MTSP-1 (SEQ ID NO: 2) diferem em 614 resíduos de aminoácidos quando em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 de comprimento completo (SEQ ID NO: 1), que é o polipeptídeo MTSP-1 que contém a sequência WT de comprimento completo. Assim, o primeiro resíduo de aminoácido da SEQ ID NO: 2 “corresponde” ao seiscentésimo décimo quinto resíduo de aminoácido (615º) da SEQ ID NO: 1.
[0074] Como usado na presente invenção, uma
“modificação” é em referência à modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou uma sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico e inclui eliminações, inserções e trocas de aminoácidos ou nucleotídeos, respectivamente. Os polipeptídeos MT-SP1 modificados se referem aos polipeptídeos MT-SP1 contendo alterações na sequência primária do polipeptídeo. Os métodos de modificação de um polipeptídeo são rotineiros para os técnicos no assunto, tal como usando metodologias de DNA recombinante. A referência a outras modificações, tais como modificações pós-traducionais e conjugação com porções, tais como polímeros, tais como porções de PEG, e etiquetas para detecção ou isolamento, são especificadas como tais.
[0075] Como usado na presente invenção, “substituição” ou “troca” refere-se à troca de um ou mais de nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência nativa, alvo, tipo selvagem ou outro ácido nucleico ou polipeptídeo por um nucleotídeo ou aminoácido alternativo, sem mudar o comprimento (como descrito no número de resíduos) da molécula. Assim, uma ou mais substituição(ões) em uma molécula não muda o número de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos da molécula. As trocas de aminoácidos em comparação com um polipeptídeo específico podem ser expressadas em termos do número do resíduo de aminoácido ao longo do comprimento da sequência de polipeptídeos. Por exemplo, um polipeptídeo modificado tendo uma modificação no aminoácido na 35a posição da sequência de aminoácidos que é uma substituição/troca de Arginina (Arg; R) por glutamina (Gln; Q) pode ser expressada como R35Q, Arg35Gln, ou 35Q. Simplesmente R35 pode ser usado para indicar que o aminoácido na 35ª posição modificada é uma arginina.
[0076] Como usado na presente invenção, um “MTSP-1 modificado” ou “polipeptídeo MTSP-1 modificado” refere-se a uma protease MTSP-1 que exibe atividade alterada, tal como especificidade do substrato alterada, em comparação com a forma não modificada. Tais proteases incluem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais modificações (isto é, mudanças em aminoácidos) em comparação com um MTSP-1 tipo selvagem, de modo que uma atividade, tal como especificidade ou seletividade do substrato, da protease MTSP-1 para clivar a proteína C3 do complemento seja alterada. Um MTSP-1 modificado pode ser uma protease MTSP-1 de comprimento completo, ou pode ser uma porção da mesma de uma protease de comprimento completo, tal como o domínio da protease MTSP-1, desde que a protease MTSP- 1 modificada contenha modificações em regiões que alteram a atividade ou a especificidade do substrato da protease e a protease é proteoliticamente ativa. Uma protease MTSP-1 modificada, ou um domínio da protease MTSP-1 modificada, também pode incluir outras modificações em regiões que não impactam na especificidade do substrato da protease. Portanto, um polipeptídeo MTSP-1 modificado tem tipicamente 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com uma sequência correspondente de aminoácidos de um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem. Um polipeptídeo MTSP-1 de comprimento completo modificado ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo ou um domínio da protease do mesmo de um polipeptídeo MTSP-1 modificado pode incluir polipeptídeos que são proteínas de fusão, desde que a proteína de fusão tenha a especificidade alvo.
[0077] Como usado na presente invenção, a numeração de quimotripsina refere-se à numeração de aminoácidos de um polipeptídeo quimotripsina maduro da SEQ ID NO: 1. O alinhamento de um domínio da protease de outra protease, tal como, por exemplo, o domínio da protease MTSP-1, pode ser preparado com quimotripsina. Nesse caso, os aminoácidos de MTSP-1 que correspondem aos aminoácidos da quimotripsina recebem a numeração dos aminoácidos da quimotripsina. As posições correspondentes podem ser determinadas por esse alinhamento por um técnico no assunto usando alinhamentos manuais ou usando os vários programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP). As posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, usando alinhamentos simulados por computador da estrutura da proteína. A recitação de que os aminoácidos de um polipeptídeo correspondem aos aminoácidos em uma sequência divulgada refere-se aos aminoácidos identificados após o alinhamento do polipeptídeo com a sequência divulgada para maximizar a identidade ou homologia (onde os aminoácidos conservados estão alinhados) usando um algoritmo de alinhamento padrão, tal como o algoritmo GAP. Os números correspondentes de quimotripsina das posições de aminoácidos 615-855 do polipeptídeo MTSP-1 apresentadas na SEQ ID NO: 1 são providos na Tabela 1. As posições de aminoácidos relativas à sequência apresentada na SEQ ID NO: 1 estão em fonte normal, os resíduos de aminoácidos nessas posições estão em negrito, e os números correspondentes da quimotripsina estão em itálico. Por exemplo, após o alinhamento do domínio serina protease MTSP-1 (SEQ ID NO: 2)
com quimotripsina madura, V na posição 1 no domínio da protease MTSP-1 recebe a numeração de quimotripsina de V16. Os aminoácidos subsequentes são numerados de acordo. Em um exemplo, um F na posição de aminoácido 708 do MTSP-1 de comprimento completo (SEQ ID NO: 1) ou na posição 94 do domínio da protease MTSP-1 (SEQ ID NO: 2) corresponde a F99 com base em numeração de quimotripsina. Quando um resíduo existe em uma protease, mas não está presente na quimotripsina, o resíduo de aminoácido recebe uma notação por letra. Por exemplo, resíduos na quimotripsina que fazem parte de um enovelamento com o aminoácido 60 com base na numeração de quimotripsina, mas são inseridos na sequência de MTSP-1 em comparação com a quimotripsina, são referidos, por exemplo, como D60b ou R60c. Estes resíduos correspondem a D661 e R662, respectivamente, por numeração relativa à sequência madura de MTSP-1 (humana) apresentada na SEQ ID NO: 1. Tabela 1. Numeração de quimotripsina de MTSP-1 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625 626 627 628
V V G G T D A D E G E W P W Q 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 630 631 632 633 634 635 636 637 638 639 640 641 642 643 644
V S L H A L G Q G H I C G A S 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 645 646 647 648 649 650 651 652 653 654 655 656 657 658 659
L I S P N W L V S A A H C Y I 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 660 661 662 663 664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674
D D R G F R Y S D P T Q W T A 60a 60b 60c 60d 60e 60f 60g 60h 60i 61 62 63 64 65 66 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689
F L G L H D Q S Q R S A P G V 67 68 69 70 71 72 73 74 74a 75 76 77 78 79 80 690 691 692 693 694 695 696 697 698 699 700 701 702 703 704
Q E R R L K R I I S H P F F N 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715 716 717 718
D F T F D Y D I A L L E L E 96 97 97a 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 719 720 721 722 723 724 725 726 727 728 729 730 731 732 733
K P A E Y S S M V R P I C L P 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 734 735 736 737 738 739 740 741 742 743 744 745 746 747 748
D A S H V F P A G K A I W V T 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 749 750 751 752 753 754 755 756 757 758 759 760 761 762
G W G H T Q Y G G T G A L I 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 763 764 765 766 767 768 769 770 771 772 773 774 775 776 777
L Q K G E I R V I N Q T T C E 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 778 779 780 781 782 783 784 785 786 787 788 789 790 791 792
N L L P Q Q I T P R M M C V G 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 793 794 795 796 797 798 799 800 801 802 803 804 805 806 807
F L S G G V D S C Q G D S G G 184a 185 186 186a 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 808 809 810 811 812 813 814 815 816 817 818 819 820 821 822
P L S S V E A D G R I F Q A G 198 199 200 201 202 203 204 204a 205 206 207 208 209 210 211 823 824 825 826 827 828 829 830 831 832 833 834 835 836 837
V V S W G D G C A Q R N K P G 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 838 839 840 841 842 843 844 845 846 847 848 849 850 851 852
V Y T R L P L F R D W I K E N 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 853 854 855
T G V 242 243 244
[0078] Como usado na presente invenção, kcat é uma medida da atividade catalítica de uma enzima; as unidades do kcat são segundos-1. O recíproco de kcat é o tempo necessário para uma molécula de enzima “renovar” uma molécula de substrato; o kcat mede o número de moléculas de substrato renovadas por molécula de enzima por segundo. O kcat também é chamado de número de renovação.
[0079] Como usado na presente invenção, a especificidade para um substrato alvo refere-se a uma preferência pela clivagem de um substrato alvo por uma protease em comparação com um outro substrato, referido como um substrato não alvo. A especificidade é refletida na constante de especificidade (kcat/Km), que é uma medida da afinidade de uma protease por seu substrato e da eficiência da enzima. kcat/Km é uma medida de eficiência enzimática; um grande valor de kcat (renovação rápida) ou um pequeno valor de Km (alta afinidade pelo substrato) torna o kcat/Km grande.
[0080] Como usado na presente invenção, uma constante de especificidade para a clivagem é (kcat/Km), em que Km é a constante de Michaelis-Menton ([S] a meio Vmax) e kcat é o Vmax/[ET], onde ET é a concentração final da enzima. Os parâmetros kcat, Km e kcat/Km podem ser calculados fazendo gráfico do inverso da concentração do substrato versus o inverso da velocidade de clivagem do substrato, e ajustando- se à equação de Lineweaver-Burk (1/velocidade = (Km/Vmax) (1/[S]) + 1/Vmax; em que Vmax = [ET]kcat). Qualquer método para determinar a taxa de aumento da clivagem ao longo do tempo na presença de várias concentrações de substrato pode ser usado para calcular a constante de especificidade. Por exemplo, um substrato está ligado a uma porção fluorogênica, que é liberada após a clivagem por uma protease. Ao determinar a taxa de clivagem em diferentes concentrações enzimáticas, o kcat pode ser determinado para uma protease específica. A constante de especificidade pode ser usada para determinar a preferência de uma protease por um substrato alvo em relação a outro substrato.
[0081] Como usado na presente invenção, a especificidade do substrato refere-se à preferência de uma protease por um substrato alvo sobre o outro. A especificidade do substrato pode ser medida como uma razão de constantes de especificidade.
[0082] Como usado na presente invenção, uma razão de especificidade do substrato é a razão de constantes de especificidade e pode ser usada para comparar especificidades de duas ou mais proteases ou uma protease para mais dois substratos. Por exemplo, a especificidade do substrato de uma protease para substratos concorrentes ou de proteases concorrentes para um substrato pode ser comparada comparando kcat/Km. Por exemplo, uma protease que tem uma constante de especificidade de 2 X 106 M-1s-1 para um substrato alvo e 2 X 104 M-1s-1 para um substrato não alvo é mais específica para o substrato alvo. Usando as constantes de especificidade acima, a protease tem uma razão de especificidade do substrato de 100 para o substrato alvo.
[0083] Como usado na presente invenção, a preferência ou especificidade do substrato para um substrato alvo pode ser expressada como uma razão de especificidade do substrato. O valor particular da razão que reflete uma preferência é uma função dos substratos e proteases em questão. Uma razão de especificidade do substrato maior que 1 significa uma preferência por um substrato alvo e uma especificidade do substrato menor que 1 significa uma preferência por um substrato não alvo. Geralmente, uma razão de pelo menos ou cerca de 1 reflete uma diferença suficiente para uma protease ser considerada uma terapia candidata.
[0084] Como usado na presente invenção, a especificidade alterada refere-se a uma mudança na especificidade do substrato de uma protease modificada em comparação com uma protease tipo selvagem inicial. Geralmente, a alteração na especificidade é um reflexo da mudança na preferência de uma protease modificada para um substrato alvo em comparação com um substrato tipo selvagem da protease (aqui referido como um substrato não alvo). Tipicamente, as proteases MTSP-1 modificadas providas na presente invenção exibem especificidade aumentada de substrato para a proteína C3 do complemento em comparação com a especificidade do substrato da protease MTSP-1 tipo selvagem. Por exemplo, uma protease modificada que tem uma razão de especificidade do substrato de 100 para um substrato alvo versus um substrato não alvo exibe uma especificidade aumentada em 10 vezes em comparação com uma protease de andaime com uma razão de especificidade do substrato de 10. Em outro exemplo, uma protease modificada que tem uma razão de especificidade do substrato de 1 em comparação com uma razão de 0,1, exibe um aumento de 10 vezes na especificidade do substrato. Para exibir especificidade aumentada em comparação com uma protease de andaime, uma protease modificada tem 1,5 vezes, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes ou maior de especificidade do substrato para qualquer uma das proteínas do complemento.
[0085] Como usado na presente invenção, “seletividade” pode ser usada de forma intercambiável com especificidade quando se refere à capacidade de uma protease de escolher e clivar um substrato alvo dentre uma mistura de substratos concorrentes. A seletividade aumentada de uma protease para um substrato alvo em comparação com qualquer outro substrato ou mais substratos alvo pode ser determinada, por exemplo, comparando as constantes de especificidade de clivagem dos substratos alvo por uma protease. Por exemplo, se uma protease tem uma constante de especificidade de clivagem de 2 X 106 M-1s-1 para um substrato alvo e 2 X 104 M-1s-1 para qualquer outro de um ou mais substrato(s), a protease é mais seletiva para o substrato alvo.
[0086] Como usado na presente invenção, uma “atividade” ou uma “atividade funcional” de um polipeptídeo, tal como uma protease, refere-se a qualquer atividade exibida pelo polipeptídeo. Tais atividades podem ser determinadas empiricamente. Atividades exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, capacidade de interagir com uma biomolécula, por exemplo, através da ligação ao substrato, ligação ao DNA ou dimerização, atividade enzimática, por exemplo, atividade de quinase ou atividade proteolítica. Para uma protease (incluindo fragmentos de protease), as atividades incluem, mas não estão limitadas a, a capacidade de se ligar especificamente a um substrato específico, afinidade e/ou especificidade da ligação ao substrato (por exemplo, afinidade e/ou especificidade alta ou baixa), funções efetoras, tal como a capacidade de promover a inibição, neutralização, clivagem ou depuração do substrato (por exemplo, proteína, ou seja, C3) e atividades in vivo, tal como a capacidade de promover a clivagem ou depuração da proteína. A atividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo usando ensaios reconhecidos, tal como ELISA, citometria de fluxo, ressonância de plasmon de superfície ou ensaios equivalentes para medir taxa de associação e taxa de dissociação, imuno-histoquímica e histologia e microscopia de imunofluorescência, ensaios com base em células e ensaios de ligação. Por exemplo, para uma protease, por exemplo, uma protease MTSP-1 modificada, as atividades podem ser avaliadas medindo a clivagem de proteínas do substrato, renovação, atividade residual, estabilidade e/ou níveis in vitro e/ou in vivo. Os resultados de tais ensaios in vitro que indicam que um polipeptídeo exibe uma atividade podem ser correlacionados com a atividade do polipeptídeo in vivo, em que a atividade in vivo pode ser referida como atividade terapêutica ou atividade biológica. A atividade de um polipeptídeo modificado pode ser qualquer nível de porcentagem de atividade do polipeptídeo não modificado, incluindo, mas não limitado a, aproximadamente 1% da atividade, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais de atividade em comparação com o polipeptídeo não modificado. Os ensaios para determinar a funcionalidade ou a atividade de proteases modificadas (ou variantes) são bem conhecidos na técnica.
[0087] As atividades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, atividade biológica, atividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (capacidade de se ligar ou concorrer com um polipeptídeo pela ligação a um anticorpo antipolipeptídeo), imunogenicidade, capacidade de formar multímeros, e a capacidade de se ligar especificamente a um receptor ou ligando do polipeptídeo.
[0088] Como usado na presente invenção, uma atividade funcional com referência a uma proteína do complemento refere-se a uma função mediada por complemento incluindo, mas não se limitando a, anafilaxia, opsonização, quimiotaxia ou lise celular. Os ensaios não limitativos para testar as atividades do complemento incluem hemólise dos glóbulos vermelhos e detecção de moléculas efetoras do complemento, tal como por ELISA ou SDS-PAGE.
[0089] Como usado na presente invenção, atividade catalítica ou atividade de clivagem refere-se à atividade de uma protease como avaliada em ensaios proteolíticos in vitro que detectam a proteólise de um substrato selecionado. A atividade de clivagem pode ser medida avaliando a eficiência catalítica de uma protease.
[0090] Como usado na presente invenção, a atividade em relação a um substrato alvo refere-se à atividade de clivagem e/ou atividade funcional, ou outra medição que reflete a atividade de uma protease sobre ou em direção a um substrato alvo. Uma atividade funcional de um substrato alvo da proteína do complemento por uma protease pode ser medida avaliando uma IC50 em um ensaio de complemento, tal como a lise de glóbulos vermelhos, ou outros ensaios conhecidos por um técnico no assunto ou providos na presente invenção para avaliar a atividade do complemento. A atividade de clivagem pode ser medida avaliando a eficiência catalítica de uma protease. Para as finalidades da presente invenção, uma atividade é aumentada se uma protease exibir maior proteólise ou clivagem de um substrato alvo e/ou modula (isto é, ativa ou inibe) uma atividade funcional de uma proteína do complemento em comparação com a ausência da protease.
[0091] Como usado na presente invenção, “atividade aumentada” com referência a um polipeptídeo MTSP-1 modificado significa que, quando testado nas mesmas condições, o polipeptídeo MTSP-1 modificado exibe maior atividade em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 não modificado que não contém a(s) troca(s) de aminoácidos. Por exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 modificado exibe pelo menos ou cerca de 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais da atividade do polipeptídeo MTSP-1 não modificado ou de referência.
[0092] Como usado na presente invenção, o termo “o mesmo”, quando usado em referência à afinidade de ligação ao anticorpo, significa que a EC50, a constante de associação (Ka) ou a constante de dissociação (Kd) está dentro de cerca de 1 a 100 vezes ou 1 a 10 vezes do anticorpo de referência (1-100 vezes mais afinidade ou 1-100 vezes menos afinidade, ou qualquer valor ou faixa numérico(a) ou valor dentro dessas faixas, que o anticorpo de referência).
[0093] Como usado na presente invenção, a atividade de ligação refere-se às características de uma molécula, por exemplo, um polipeptídeo, relacionado a se deve ou não, e como ele se liga a um ou mais parceiros de ligação. As atividades de ligação incluem a capacidade de ligar o(s) parceiro(s) de ligação, a afinidade com a qual ele se liga ao parceiro de ligação (por exemplo, alta afinidade), a força da ligação com o parceiro de ligação e/ou a especificidade para a ligação com o parceiro de ligação.
[0094] Como usado na presente invenção, EC50, também chamada de Kd aparente, é a concentração (por exemplo, nM)
de protease, onde 50% da atividade máxima é observada em uma quantidade fixa de substrato (por exemplo, a concentração de polipeptídeo MTSP-1 modificado necessária para clivar por 50% do hC3 disponível). Tipicamente, os valores de EC50 são determinados a partir de curvas sigmoidais de dose-resposta, em que a EC50 é a concentração no ponto de inflexão. Uma alta afinidade de protease para seu substrato correlaciona-se com um baixo valor de EC50 e uma baixa afinidade corresponde a um alto valor de EC50. As constantes de afinidade podem ser determinadas pela metodologia cinética padrão para reações de protease, por exemplo, imunoensaios, tal como ELISA, seguidos por análise de ajuste de curva.
[0095] Como usado na presente invenção, “constante de afinidade” refere-se a uma constante de associação (Ka) usada para medir a afinidade ou força de ligação molecular entre uma protease e um substrato. Quanto maior a constante de afinidade, maior a afinidade da protease para o substrato. As constantes de afinidade são expressadas em unidades de molaridade recíproca (isto é, M-1) e podem ser calculadas a partir da constante de taxa para a reação de associação- dissociação, medida pela metodologia cinética padrão para reações de protease-substrato (por exemplo, imunoensaios, ressonância de plasmon de superfície, ou outros ensaios de interação cinética conhecidos na técnica). A afinidade de ligação de uma protease também pode ser expressada como uma constante de dissociação, ou Kd. A constante de dissociação é recíproca da constante de associação, Kd = 1/Ka. Portanto, uma constante de afinidade também pode ser representada pelo Kd. As constantes de afinidade podem ser determinadas pela metodologia cinética padrão para reações de protease, por exemplo, imunoensaios, ressonância de plasmon de superfície (SPR) (Rich e Myszka (2000) Curr. Opin. Biotechnol 11:54; Englebienne (1998) Analyst. 123: 1599), calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ou outros ensaios de interação cinética conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Paul, ed., Fundamental Immunology, 2a ed., Raven Press, Nova Iorque, páginas 332-336 (1989)). Os instrumentos e métodos para detecção e monitoramento em tempo real das taxas de ligação são conhecidos e estão disponíveis comercialmente (por exemplo, BIAcore 2000, BIAcore AB, Uppsala, Sweden e GE Healthcare Life Sciences; Malmqvist (2000) Biochem. Soc. Trans. 27:335).
[0096] Os métodos para calcular a afinidade são bem conhecidos, tais como métodos para determinar valores de EC50 ou métodos para determinar constantes de associação/dissociação. Por exemplo, em termos de EC50, alta afinidade de ligação significa que a protease se liga especificamente a uma proteína alvo com uma EC50 menor que cerca de 10 ng/mL, 9 ng/mL, 8 ng/mL, 7 ng/mL, 6 ng/mL, 5 ng/mL, 4 ng/mL, 3 ng/mL, 2 ng/mL, 1 ng/mL ou menos. A alta afinidade de ligação também pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio (Kd) de 10-6 M ou menor, tal como 10-7 M, 10-8 M, 10-10 M, 10-11 M ou 10-12 M ou mais baixa. Em termos de constante de associação de equilíbrio (Ka), a alta afinidade de ligação é geralmente associada a valores de Ka maiores ou iguais a cerca de 106 M-1, maiores ou iguais a cerca de 107 M-1, maiores ou iguais a cerca de 108 M-1, ou maior ou igual a cerca de 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 ou 1012 M-1. A afinidade pode ser estimada empiricamente ou as afinidades podem ser determinadas comparativamente, por exemplo, comparando a afinidade de dois ou mais anticorpos para um antígeno específico, por exemplo, calculando as razões em pares das afinidades dos anticorpos testados. Por exemplo, essas afinidades podem ser prontamente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por ELISA; diálise de equilíbrio; ressonância de plasmon de superfície; por radioimunoensaio usando antígeno alvo radiorrotulado; ou por outro método conhecido pelo técnico no assunto. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949) ou por análise de ajuste de curva, por exemplo, usando um modelo de regressão não linear logístico de 4 parâmetros usando a equação: y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D, em que A é a assíntota mínima, B é o fator de inclinação, C é o ponto de inflexão (EC50) e D é a assíntota máxima.
[0097] Como usado na presente invenção, “ED50” é a dose (por exemplo, mg/kg ou nM) de uma protease (por exemplo, uma protease MTSP-1 modificada) que produz um resultado especificado (por exemplo, clivagem da proteína C3 do complemento) em 50% da população total (por exemplo, quantidade total de C3 presente na amostra).
[0098] Como usado na presente invenção, “substancialmente o mesmo” quando usado em referência a EC50, constante de associação (Ka) ou constante de dissociação (Kd) ou ED50 dose eficaz significa que a Ka, Kd, EC50 ou ED50 está dentro de cerca de 5 a 5000 vezes maior ou menor que a Ka, Kd, EC50 ou ED50 do MTSP-1 de referência (5-5000 vezes maior ou 5-5000 vezes menor que a referência MTSP-1, isto é, MTSP-1 tipo selvagem).
[0099] Como usado na presente invenção, o termo
“ressonância de plasmon de superfície” refere-se a um fenômeno óptico que permite a análise de interações em tempo real pela detecção de alterações nas concentrações de proteínas dentro de uma matriz de biossensores, por exemplo, usando o sistema BIAcore (GE Healthcare Life Sciences).
[00100] Como usado na presente invenção, uma proteína humana é aquela codificada por uma molécula de ácido nucleico, tal como DNA, presente no genoma de um humano, incluindo todas as variantes alélicas e variações conservadoras das mesmas. Uma variante ou modificação de uma proteína é uma proteína humana se a modificação for baseada na sequência tipo selvagem ou proeminente de uma proteína humana.
[00101] Como usado na presente invenção, os resíduos de α-aminoácidos de ocorrência natural são os resíduos dos 20 α-aminoácidos encontrados na natureza que são incorporados na proteína pelo reconhecimento específico da molécula de tRNA carregada com seu códon de mRNA cognato em humanos.
[00102] Como usado na presente invenção, aminoácidos de ocorrência não natural referem-se a aminoácidos que não são codificados geneticamente.
[00103] Como usado na presente invenção, “ácido nucleico” refere-se a pelo menos dois nucleotídeos ou derivados nucleotídicos ligados, incluindo um ácido desoxirribonucleico (DNA) e um ácido ribonucleico (RNA) e análogos dos mesmos, unidos, tipicamente por ligações fosfodiéster. Também incluídos no termo “ácido nucleico” estão os análogos de ácidos nucleicos, tal como ácido nucleico peptídico (PNA), DNA de fosforotioato, e outros análogos e derivados ou combinações dos mesmos. Os ácidos nucleicos também incluem derivados de DNA e RNA contendo, por exemplo, um análogo de nucleotídeo ou uma ligação “esqueleto” diferente de uma ligação fosfodiéster, por exemplo, uma ligação fosfotriéster, uma ligação fosforamidato, uma ligação fosforotioato, uma ligação tioéster ou uma ligação peptídica (ácido nucleico peptídico). O termo também inclui, como equivalentes, derivados, variantes e análogos de RNA ou DNA feitos a partir de análogos de nucleotídeos, ácidos nucleicos (sentido ou anti-sentido) de fitas única e dupla. Desoxirribonucleotídeos incluem desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiganosina e desoxitimidina. Para o RNA, a base de uracila é a uridina. Os ácidos nucleicos podem ser de fita única ou dupla. Quando se refere a sondas ou iniciadores, opcionalmente rotulados, tal como com um rotulador detectável, tal como um rotulador fluorescente ou radiorrotulador, são contempladas moléculas de fita única. Tais moléculas são tipicamente de um comprimento tal que seu alvo é estatisticamente único ou de baixo número de cópias (tipicamente menor que 5, geralmente menor que 3) para sondar ou iniciar uma biblioteca. Geralmente uma sonda ou iniciador contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleotídeos contíguos de sequência complementares ou idênticos a um gene de interesse. As sondas e os iniciadores podem ter 10, 20, 30, 50, 100 ou mais nucleotídeos.
[00104] Como usado na presente invenção, uma molécula de ácido nucleico isolada é aquela que é separada de outras moléculas de ácido nucleico que estão presentes na fonte natural da molécula de ácido nucleico. Uma molécula de ácido nucleico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode estar substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Moléculas de ácido nucleico isoladas de exemplo providas na presente invenção incluem moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam uma protease MTSP-1 provida.
[00105] Como usado na presente invenção, “sintético”, com referência a, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico sintético ou um gene sintético ou um peptídeo sintético refere-se a uma molécula de ácido nucleico ou molécula de polipeptídeo produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.
[00106] Como usado na presente invenção, “polipeptídeo” refere-se a dois ou mais aminoácidos unidos covalentemente. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” são usados na presente invenção de forma intercambiável.
[00107] Como usado na presente invenção, um “peptídeo” refere-se a um polipeptídeo que tem de 2 a cerca de 40 aminoácidos de comprimento.
[00108] Como usado na presente invenção, os aminoácidos que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos providos na presente invenção são identificados de acordo com suas abreviaturas conhecidas de três ou uma letra (Tabela 2). Os nucleotídeos que ocorrem nos vários fragmentos de ácido nucleico são designados com as designações de letra única padrão usadas rotineiramente na técnica.
[00109] Como usado na presente invenção, um “aminoácido” é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo ácido carboxílico. Um polipeptídeo contém dois ou mais aminoácidos. Para as finalidades mencionadas na presente invenção, os aminoácidos incluem os vinte aminoácidos de ocorrência natural (Tabela 2), aminoácidos não naturais e análogos de aminoácidos (isto é, aminoácidos em que o carbono α tem uma cadeia lateral).
[00110] Como usado na presente invenção, os aminoácidos, que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos dos polipeptídeos mencionados na presente invenção, são identificados de acordo com suas abreviaturas bem conhecidas de três ou uma letra (ver Tabela 2). Os nucleotídeos, que ocorrem nas várias moléculas e nos fragmentos de ácido nucleico, são designados com as designações padrão de letra única usadas rotineiramente na técnica.
[00111] Como usado na presente invenção, “resíduo de aminoácido” refere-se a um aminoácido formado após digestão química (hidrólise) de um polipeptídeo em suas ligações peptídicas. Presume-se que os resíduos de aminoácidos descritos na presente invenção estejam na forma isomérica “L”. Os resíduos na forma isomérica “D”, assim designados, podem ser substituídos por qualquer resíduo de aminoácido L, desde que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipeptídeo. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipeptídeo. COOH refere-se ao grupo carboxi livre presente no terminal carboxila de um polipeptídeo. De acordo com a nomenclatura polipeptídica padrão descrita em J. Biol. Chem., 243: 3557-3559 (1968), e adotado em 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, as abreviações para resíduos de aminoácidos são mostradas na Tabela 2: Tabela 2 - Tabela de Correspondência
SÍMBOLO 1 Letra 3 Letras AMINOÁCIDOS Y Tyr Tirosina G Gly Glicina F Phe Fenilalanina M Met Metionina A Ala Alanina S Ser Serina I Ile Isoleucina L Leu Leucina T Thr Treonina V Val Valina P Pro Prolina K Lys Lisina H His Histidina Q Gln Glutamina E Glu Ácido glutâmico Z Glx Glu e/ou Gln W Trp Triptofano R Arg Arginina D Asp Ácido Aspártico N Asn Asparagina B Asx Asn e/ou Asp C Cys Cisteína X Xaa Desconhecido ou outro
[00112] Todas as sequências de resíduos de aminoácidos representadas na presente invenção por uma fórmula têm uma orientação da esquerda para a direita na direção convencional do terminal amino para o terminal carboxila. Adicionalmente, a expressão “resíduo de aminoácido” é definida para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 2), aminoácidos modificados, não naturais e incomuns. Além disso, um traço no início ou no final de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais de resíduos de aminoácidos ou a um grupo terminal amino, tal como NH2, ou a um grupo terminal carboxila tal como COOH.
[00113] Como usado na presente invenção, “aminoácidos de ocorrência natural” refere-se aos 20 L-aminoácidos que ocorrem nos polipeptídeos. Como usado na presente invenção,
os resíduos de α-aminoácidos de ocorrência natural são os resíduos dos 20 α-aminoácidos encontrados na natureza que são incorporados na proteína pelo reconhecimento específico da molécula de tRNA carregada com seu códon de mRNA cognato em humanos.
[00114] Como usado na presente invenção, “aminoácido não natural” refere-se a um composto orgânico que tem uma estrutura semelhante a um aminoácido natural, mas foi modificado estruturalmente para simular a estrutura e a reatividade de um aminoácido natural. Os aminoácidos de ocorrência não natural, incluem, por exemplo, aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferente de 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem, mas não estão limitados aos, estereoisômeros D dos aminoácidos. Aminoácidos não naturais de exemplo são conhecidos dos técnicos no assunto e incluem, mas não estão limitados a, para-acetil Fenilalanina, para- azido Fenilalanina, ácido 2-Aminoadípico (Aad), ácido 3- Aminoadípico (bAad) , ácido β-alanina/β-amino-propiônico (Bala), ácido 2-aminobutírico (Abu), ácido 4- aminobutírico/ácido piperidínico (4Abu), ácido 6- aminocapróico (Acp), ácido 2-amino-heptanóico (Ahe), Ácido 2-aminoisobutírico (Aib), ácido 3-aminoisobutírico (Baib), ácido 2-aminopimélico (Apm), ácido 2,4-diaminobutírico (Dbu), desmosina (Des), ácido 2,2’-diaminopimélico (Dpm), Ácido 2,3-diaminopropiônico (Dpr), N-etilglicina (EtGly), N- etilasparagina (EtAsn), hidroxilisina (Hyl), alo- hidroxilisina (Ahyl), 3-hidroxiprolina (3Hyp), 4- hidroxiprolina (4Hyp), Isodesmosina (Ide), alo-isoleucina (Aile), N-metilglicina, sarcosina (MeGly), N-metilisoleucina (MeIle), 6-N-metilisina (MeLys), N-metilvalina (MeVal),
Norvalina (Nva), Norleucina (Nle) e Ornitina (Orn). Aminoácidos não naturais de exemplo são descritos na presente invenção e são conhecidos dos técnicos no assunto.
[00115] Como usado na presente invenção, uma mistura isocinética é aquela em que as razões molares de aminoácidos foram ajustadas com base nas taxas de reação relatadas (ver, por exemplo, Ostresh et al. (1994) Biopolymers 34: 1681).
[00116] Como usado na presente invenção, uma construção de DNA é uma molécula de DNA linear ou circular de fita única ou dupla que contém segmentos de DNA combinados e justapostos de uma maneira não encontrada na natureza. As construções de DNA existem como resultado da manipulação humana e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.
[00117] Como usado na presente invenção, um segmento de DNA é uma porção de uma molécula de DNA maior tendo atributos especificados. Por exemplo, um segmento de DNA que codifica um polipeptídeo especificado é uma porção de uma molécula de DNA mais longa, tal como um plasmídeo ou fragmento de plasmídeo, que, quando lido da direção 5’ para 3’, codifica a sequência de aminoácidos do polipeptídeo especificado.
[00118] Como usado na presente invenção, o termo ortólogo significa um polipeptídeo ou uma proteína obtida de uma espécie que é a contrapartida funcional de um polipeptídeo ou uma proteína de uma espécie diferente. As diferenças de sequência entre os ortólogos são o resultado da especiação.
[00119] Como usado na presente invenção, o termo polinucleotídeo significa um polímero de fita única ou dupla de desoxirribonucleotídeos ou bases de ribonucleotídeos lidas da extremidade 5’ para a 3’. Os polinucleotídeos incluem RNA e DNA, e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. O comprimento de uma molécula de polinucleotídeo é dado aqui em termos de nucleotídeos (abreviado “nt”) ou pares de bases (abreviado “bp”). O termo nucleotídeos é usado para moléculas de fita única e dupla, onde o contexto permite. Quando o termo é aplicado a moléculas de fita dupla, ele é usado para indicar o comprimento completo e será entendido como equivalente ao termo pares de bases. Será reconhecido pelos técnicos no assunto que as duas fitas de um polinucleotídeo de fita dupla podem diferir ligeiramente em comprimento e que as suas extremidades podem ser escalonadas; assim, todos os nucleotídeos dentro de uma molécula de polinucleotídeo de fita dupla não podem ser pareados. Tais fins não pareados, em geral, não excederão 20 nucleotídeos de comprimento.
[00120] Como usado na presente invenção, o alinhamento de uma sequência refere-se ao uso de homologia para alinhar duas ou mais sequências de nucleotídeos ou aminoácidos. Tipicamente, duas ou mais sequências relacionadas por 50% ou mais de identidade são alinhadas. Um conjunto alinhado de sequências refere-se a 2 ou mais sequências que estão alinhadas nas posições correspondentes e podem incluir sequências de alinhamento derivadas de RNAs, tais como ESTs e outros cDNAs, alinhados com a sequência de DNA genômico. Polipeptídeos ou moléculas de ácido nucleico relacionado(a)s ou variantes podem ser alinhado(a)s por qualquer método conhecido pelos técnicos no assunto. Tais métodos tipicamente maximizam as correspondências, e incluem métodos, tal como o uso de alinhamentos manuais e o uso dos inúmeros programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos pelos habilitados na técnica. Alinhando as sequências de polipeptídeos ou ácidos nucleicos, um técnico no assunto pode identificar porções ou posições análogas, usando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Além disso, um técnico no assunto também pode empregar resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos correspondentes entre e dentre sequências humanas e não humanas. As posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, usando alinhamentos simulados por computador da estrutura da proteína. Em outros casos, as regiões correspondentes podem ser identificadas. Um técnico no assunto também pode empregar resíduos de aminoácidos conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos correspondentes entre e dentre sequências humanas e não humanas.
[00121] Como usado na presente invenção, “identidade de sequência” refere-se ao número de aminoácidos ou bases de nucleotídeos idênticos ou semelhantes em uma comparação entre um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e de referência. A identidade da sequência pode ser determinada pelo alinhamento da sequência de ácidos nucleicos ou sequência de proteínas para identificar regiões de similaridade ou identidade. Para as finalidades da presente invenção, a identidade de sequência é geralmente determinada por alinhamento para identificar resíduos idênticos. O alinhamento pode ser local ou global. Correspondências, incompatibilidades e lacunas podem ser identificadas entre as sequências comparadas. Lacunas são aminoácidos nulos ou nucleotídeos inseridos entre os resíduos de sequências alinhadas, de modo que caracteres idênticos ou semelhantes sejam alinhados. Geralmente, pode haver lacunas internas e terminais. A identidade da sequência pode ser determinada levando-se em consideração as lacunas como o número de resíduos/comprimento idênticos da sequência mais curta x
100. Ao usar penalidades para lacunas, a identidade da sequência pode ser determinada sem penalidades para lacunas finais (por exemplo, lacunas terminais não são penalizadas). Alternativamente, a identidade da sequência pode ser determinada sem levar em conta as lacunas como o número de posições/comprimento idênticos da sequência total alinhada x 100.
[00122] Como usado na presente invenção, “em uma posição correspondente a” ou recitação de que as posições de nucleotídeos ou aminoácidos “correspondam a” posições de nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência divulgada, como apresentado na listagem de Sequências, refere-se a posições de nucleotídeos ou aminoácidos identificadas após o alinhamento com a sequência divulgada para maximizar a identidade usando um algoritmo de alinhamento padrão, tal como algoritmo GAP. Para as finalidades da presente invenção, o alinhamento de uma sequência de MTSP-1 é a sequência de aminoácidos do domínio da protease MTSP-1 humana apresentada na SEQ ID NO: 2, ou particularmente um MTSP-1 de referência da SEQ ID NO: 4. Alinhando as sequências, um técnico no assunto pode identificar resíduos correspondentes, por exemplo, usando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Em geral, para identificar posições correspondentes, as sequências de aminoácidos são alinhadas para que seja obtida a correspondência de mais alta ordem (ver, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nova Jérsei, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova York, 1991; e Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Alternativamente, o técnico pode numerar os resíduos pelo número de quimotripsina, identificando assim os resíduos correspondentes. Para sequências estreitamente relacionadas, não é necessário um algoritmo de computador; o alinhamento pode ser feito visualmente.
[00123] Como usado na presente invenção, um “alinhamento global” é um alinhamento que alinha duas sequências do começo ao fim, alinhando cada letra em cada sequência apenas uma vez. Um alinhamento é produzido, independentemente de haver ou não similaridade ou identidade entre as sequências. Por exemplo, 50% de identidade de sequência com base no “alinhamento global” significa que, em um alinhamento da sequência completa de duas sequências comparadas, cada uma com 100 nucleotídeos de comprimento, 50% dos resíduos são iguais. Entende-se que o alinhamento global também pode ser usado na determinação da identidade da sequência, mesmo quando o comprimento das sequências alinhadas não é o mesmo. As diferenças nas extremidades terminais das sequências serão levadas em consideração na determinação da identidade da sequência, a menos que a opção “nenhuma penalidade para lacunas finais” seja selecionada. Geralmente, um alinhamento global é usado em sequências que compartilham similaridades significativas durante a maior parte de seu comprimento. Algoritmos de exemplo para realizar o alinhamento global incluem o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443). Programas de exemplo para realizar o alinhamento global estão disponíveis ao público e incluem a Ferramenta de Alinhamento de Sequência Global, disponível no site do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov/), e o programa disponível em deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html.
[00124] Como usado na presente invenção, um “alinhamento local” é um alinhamento que alinha duas sequências, mas apenas alinha aquelas porções das sequências que compartilham similaridade ou identidade. Portanto, um alinhamento local determina se subsegmentos de uma sequência estão presentes em outra sequência. Se não houver similaridade, nenhum alinhamento será retornado. Os algoritmos de alinhamento local incluem o algoritmo BLAST ou Smith-Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Por exemplo, 50% de identidade de sequência com base em “alinhamento local” significa que, em um alinhamento da sequência completa de duas sequências comparadas de qualquer comprimento, uma região de similaridade ou identidade de 100 nucleotídeos de comprimento possui 50% dos resíduos que são os mesmos na região de similaridade ou identidade.
[00125] Para as finalidades da presente invenção, a identidade de sequência pode ser determinada por programas padrão de algoritmo de alinhamento usados com as penalidades para lacunas padrão estabelecidas por cada fornecedor.
Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl.
Acids Res. 14: 6745, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, págs. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalidade para lacunas finais.
Se duas moléculas de ácido nucleico possuem sequências de nucleotídeos ou de quaisquer dois polipeptídeos têm sequências de aminoácidos que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% “idênticas”, ou outras variações semelhantes que recitem uma porcentagem de identidade podem ser determinadas usando algoritmos de computador conhecidos com base em alinhamento local ou global (ver por exemplo, wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software, provendo links para dezenas de programas e bancos de dados de alinhamento conhecidos e disponíveis ao público). Geralmente, para as finalidades da presente invenção, a identidade de sequência é determinada usando algoritmos de computador com base no alinhamento global, tal como a ferramenta de alinhamento global de sequências Needleman- Wunsch, disponível na NCBI/BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&Page_TYPE=BlastHo me); LAlign (William Pearson implementando o algoritmo Huang e Miller (Adv.
Appl.
Math. (1991) 12:337-357)); e o programa de Xiaoqui Huang, disponível em deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html. Geralmente, ao comparar sequências de nucleotídeos na presente invenção, é usado um alinhamento com penalidade para as lacunas finais. O alinhamento local também pode ser usado quando as sequências comparadas são substancialmente do mesmo comprimento.
[00126] Portanto, como usado na presente invenção, o termo “identidade” representa uma comparação ou um alinhamento entre um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e de referência. Em um exemplo não limitativo, “pelo menos 90% idêntico a” refere-se a identidades percentuais de 90% a 100% em relação ao polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. A identidade em um nível de 90% ou mais é indicativa do fato de que, assumindo para finalidades de exemplificação, um polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste e de referência de 100 aminoácidos ou nucleotídeos é comparado, não mais que 10% (isto é, 10 em 100) de aminoácidos ou nucleotídeos no polipeptídeo ou polinucleotídeo de teste difere daquele dos polipeptídeos de referência. Comparações semelhantes podem ser feitas entre polinucleotídeos de teste e de referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente por todo o comprimento de uma sequência de aminoácidos ou podem ser agrupadas em uma ou mais localizações de comprimento variável até o máximo permitido, por exemplo, diferença de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças também podem ser devidas a eliminações ou truncamentos de resíduos de aminoácidos. As diferenças são definidas como substituições, inserções ou eliminações de ácidos nucleicos ou aminoácidos. Dependendo da duração das sequências comparadas, no nível de homologias ou identidades acima de 85-90%, o resultado pode ser independente do programa e dos parâmetros de lacuna definidos; esses altos níveis de identidade podem ser avaliados prontamente, geralmente sem depender de software.
[00127] Como usado na presente invenção, uma ligação dissulfeto (também chamada de ligação S-S ou ponte dissulfeto) é uma ligação covalente única derivada do acoplamento de grupos tiol. As ligações dissulfeto nas proteínas são formadas entre os grupos tiol dos resíduos de cisteína, e estabilizam as interações entre os domínios de polipeptídeos.
[00128] Como usado na presente invenção, “acoplado” ou “conjugado” significa afixado por meio de uma interação covalente ou não covalente.
[00129] Como usado na presente invenção, “iniciador” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que pode atuar como um ponto de iniciação da síntese de DNA direcionada a moldes sob condições apropriadas (por exemplo, na presença de quatro trifosfatos de nucleosídeo diferentes e um agente de polimerização, tal como DNA polimerase, RNA polimerase ou transcriptase reversa) em um tampão apropriado e a uma temperatura adequada. É apreciado que certas moléculas de ácido nucleico possam servir como uma “sonda” e como um “iniciador”. Um iniciador, no entanto, tem um grupo hidroxila 3’ para extensão. Um iniciador pode ser usado em uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR), transcriptase reversa (RT)-PCR, PCR DE RNA, LCR, PCR multiplex, PCR panhandle, PCR de captura, PCR de expressão, RACE 3’ e 5’, PCR in situ, PCR mediado por ligação e outros protocolos de amplificação.
[00130] Como usado na presente invenção, “iniciador” refere-se a um oligonucleotídeo contendo dois ou mais desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos, tipicamente mais do que três, a partir dos quais a síntese de um produto de extensão do iniciador pode ser iniciada. As condições experimentais favoráveis à síntese incluem a presença de trifosfatos de nucleosídeos e um agente para polimerização e extensão, tal como DNA polimerase, e um tampão, temperatura e pH adequados.
[00131] Como usado na presente invenção, “par de iniciadores” refere-se a um conjunto de iniciadores que inclui um iniciador 5’ (a montante) que hibridiza com a extremidade 5’ de uma sequência a ser amplificada (por exemplo, por PCR) e um iniciador 3’ (a jusante) que hibridiza com o complemento da extremidade 3’ da sequência a ser amplificada.
[00132] Como usado na presente invenção, “hibridiza especificamente” refere-se ao anelamento, por pareamento de bases complementares, de uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, um oligonucleotídeo) a uma molécula de ácido nucleico alvo. Os técnicos no assunto estão familiarizados com parâmetros in vitro e in vivo que afetam a hibridização específica, tais como comprimento e composição da molécula em particular. Os parâmetros particularmente relevantes para a hibridização in vitro incluem adicionalmente a temperatura de anelamento e lavagem, composição do tampão e concentração de sal. Exemplos de condições de lavagem para remover moléculas de ácido nucleico não especificamente ligadas em alta estringência são 0,1 x SSPE, SDS a 0,1%, 65°C, e na estringência média são 0,2 x SSPE, SDS a 0,1%, 50°C. Condições de estringência equivalentes são conhecidas na técnica. O técnico no assunto pode prontamente ajustar esses parâmetros para obter hibridização específica de uma molécula de ácido nucleico com uma molécula de ácido nucleico alvo apropriada para uma aplicação específica.
[00133] Como usado na presente invenção, substancialmente idêntico a um produto significa suficientemente semelhante de modo que a propriedade de interesse seja suficientemente inalterada, de modo que o produto substancialmente idêntico possa ser usado no lugar do produto.
[00134] Como usado na presente invenção, também é entendido que os termos “substancialmente idênticos” ou “semelhantes” variam com o contexto, como entendido pelos técnicos no assunto relevante.
[00135] Como usado na presente invenção, a forma tipo selvagem de uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico é uma forma codificada por um gene ou por uma sequência de codificação codificada pelo gene. Tipicamente, uma forma tipo selvagem de um gene, ou uma molécula codificada pelo mesmo, não contém mutações ou outras modificações que alteram a função ou a estrutura. O termo tipo selvagem também abrange formas com variação alélica, como ocorre entre e dentre as espécies.
[00136] Como usado na presente invenção, uma forma predominante de uma molécula de polipeptídeo ou ácido nucleico refere-se a uma forma da molécula que é a principal forma produzida a partir de um gene. Uma “forma predominante” varia de fonte para fonte. Por exemplo, diferentes células ou tipos de tecido podem produzir diferentes formas de polipeptídeos, por exemplo, por splicing alternativo e/ou processamento alternativo de proteínas. Em cada tipo de célula ou tecido, um polipeptídeo diferente pode ser uma “forma predominante”.
[00137] Como usado na presente invenção, uma variante alélica ou variação alélica faz referência a qualquer uma das duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutações e pode resultar em polimorfismo fenotípico nas populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequência de aminoácidos alterada. O termo “variante alélica” também é usado na presente invenção para indicar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. Tipicamente, a forma de referência do gene codifica uma forma tipo selvagem e/ou forma predominante de um polipeptídeo de uma população ou um único membro de referência de uma espécie. Tipicamente, variantes alélicas, que incluem variantes entre e dentre as espécies, têm pelo menos 80%, 90% ou mais de identidade de aminoácidos com uma forma tipo selvagem e/ou predominante da mesma espécie; o grau de identidade depende do gene e se a comparação é interespécies ou intraespécies. Geralmente, as variantes alélicas intraespécies têm pelo menos, ou pelo menos cerca de, 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ou mais com uma forma tipo selvagem e/ou predominante, incluindo pelo menos ou pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com uma forma tipo selvagem e/ou predominante de um polipeptídeo.
[00138] Como usado na presente invenção, “alelo”, que é usado de forma intercambiável na presente invenção com “variante alélica” refere-se a formas alternativas de um gene ou porções dos mesmos. Os alelos ocupam o mesmo local ou posição nos cromossomos homólogos. Quando um indivíduo tem dois alelos idênticos de um gene, diz-se que o indivíduo é homozigoto para esse gene ou alelo. Quando um indivíduo tem dois alelos diferentes de um gene, diz-se que o indivíduo é heterozigoto para o gene. Os alelos de um gene específico podem diferir um do outro em um único nucleotídeo ou em vários nucleotídeos, e podem incluir substituições, eliminações e inserções de nucleotídeos. Um alelo de um gene também pode ser uma forma de um gene contendo uma mutação.
[00139] Como usado na presente invenção, variantes de espécies referem-se a variantes de polipeptídeos entre diferentes espécies, incluindo diferentes espécies de mamíferos, tais como camundongo e humano. Geralmente, as variantes de espécies têm aproximadamente ou pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% ou mais identidade de sequência. Os resíduos correspondentes entre e dentre as variantes de espécies podem ser determinados comparando sequências de alinhamento para maximizar o número de nucleotídeos ou resíduos correspondentes, por exemplo, de modo que a identidade entre as sequências seja igual ou maior que 95%, igual ou maior que 96%, igual ou maior que 97%, igual ou maior que 98% ou igual a maior que 99%. A posição de interesse é então dada o número atribuído na molécula de ácido nucleico de referência. O alinhamento pode ser efetuado manualmente ou pelo olho, principalmente quando a identidade da sequência for maior que 80%.
[00140] Como usado na presente invenção, uma variante de splicing refere-se a uma variante produzida pelo processamento diferencial de um transcrito primário de DNA genômico que resulta em mais de um tipo de mRNA.
[00141] Como usado na presente invenção, a modificação refere-se à modificação de uma sequência de aminoácidos de uma sequência de polipeptídeos ou de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico e inclui eliminações, inserções e trocas de aminoácidos e nucleotídeos, respectivamente.
[00142] Para as finalidades da presente invenção, substituições, eliminações e/ou inserções de aminoácidos podem ser feitas em qualquer polipeptídeo MTSP-1 ou fragmento cataliticamente ativo, desde que a proteína resultante exiba atividade de protease ou outra atividade (ou, se desejado, tais mudanças podem ser feitas para eliminar a atividade). Podem ser feitas modificações fazendo substituições de aminoácidos conservadoras e também substituições de aminoácidos não conservadoras. Por exemplo, podem ser feitas substituições de aminoácidos que alteram de forma desejável ou vantajosa as propriedades das proteínas. Em uma modalidade, mutações que impedem a degradação do polipeptídeo podem ser feitas. Muitas proteases clivam após resíduos básicos, tais como R e K; para eliminar essa clivagem, o resíduo básico é trocado por um resíduo não básico. A interação da protease com um inibidor pode ser bloqueada, mantendo a atividade catalítica, efetuando uma mudança não conservadora no sítio de interação do inibidor com a protease. Outras atividades também podem ser alteradas. Por exemplo, a ligação ao receptor pode ser alterada sem alterar a atividade catalítica.
[00143] As substituições de aminoácidos contempladas incluem substituições conservadoras, tais como as apresentadas na Tabela 3, que não eliminam a atividade proteolítica. Como descrito na presente invenção, também são contempladas substituições que alteram propriedades das proteínas, tal como remoção de sítios de clivagem e outros sítios; tais substituições são geralmente não conservadoras, mas podem ser prontamente efetuadas por aqueles técnicos no assunto.
[00144] Como usado na presente invenção, as substituições conservadoras adequadas de aminoácidos são conhecidas dos técnicos neste assunto e podem ser feitas geralmente sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Os técnicos neste assunto reconhecem que, em geral, as substituições únicas de aminoácidos em regiões não essenciais de um polipeptídeo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4ª Edição, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224). Tais substituições podem ser feitas de acordo com as apresentadas na Tabela 3 da seguinte maneira: Tabela 3 Resíduo Original Substituição Conservativa de Exemplo Ala (A) Gly; Ser Arg (R) Lys Asn (N) Gln; His Cys (C) Ser Gln (Q) Asn Glu (E) Asp
Tabela 3 Resíduo Original Substituição Conservativa de Exemplo Gly (G) Ala; Pro His (H) Asn; Gln Ile (I) Leu; Val Leu (L) Ile; Val Lys (K) Arg; Gln; Glu Met (M) Leu; Tyr; Ile Phe (F) Met; Leu; Tyr Ser (S) Thr Thr (T) Ser Trp (W) Tyr Tyr (Y) Trp; Phe Val (V) Ile; Leu
[00145] Outras substituições também são permitidas e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com substituições conservadoras conhecidas.
[00146] Como usado na presente invenção, o termo promotor significa uma porção de um gene contendo sequências de DNA que proporcionam a ligação da RNA polimerase e o início da transcrição. As sequências promotoras são comumente, mas nem sempre, encontradas na região não codificadora 5’ de genes.
[00147] Como usado na presente invenção, o polipeptídeo ou proteína isolada ou purificada ou porção biologicamente ativa do mesmo é substancialmente livre de material celular ou de outras proteínas contaminantes da célula do tecido da qual a proteína é derivada, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. As preparações podem ser determinadas como substancialmente livres se parecerem livres de impurezas prontamente detectáveis, como determinado por métodos padrão de análise, tais como, cromatografia em camada fina (TLC), eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), usados por aqueles técnicos no assunto para avaliar tal pureza, ou suficientemente pura de modo que uma purificação adicional não altere de maneira detectável as propriedades físicas e químicas, tais como atividades enzimáticas e biológicas da substância. Os métodos para purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos dos técnicos no assunto. Um composto substancialmente quimicamente puro, no entanto, pode ser uma mistura de estereoisômeros. Em tais casos, uma purificação adicional pode aumentar a atividade específica do composto.
[00148] O termo substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas nas quais a proteína é separada dos componentes celulares das células das quais é isolada ou produzida de forma recombinante. Em uma modalidade, o termo substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas de protease tendo menos que cerca de 30% (em peso seco) de proteínas não protease (também aqui referidas como proteína contaminante), geralmente menores que cerca de 20% de proteínas não protease ou 10% de proteínas não protease ou menos que cerca de 5% de proteínas não protease. Quando a proteína protease ou porção ativa da mesma é produzida de modo recombinante, ela também é substancialmente livre de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos do que, cerca de ou igual a 20%, 10% ou 5% do volume da preparação da proteína de protease.
[00149] Como usado na presente invenção, o termo substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos inclui preparações de proteínas de protease nas quais a proteína é separada de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. O termo inclui preparações de proteínas de protease tendo menos que cerca de 30% (em peso seco), 20%, 10%, 5% ou menos de precursores químicos ou componentes ou produtos químicos não protease.
[00150] Como usado na presente invenção, a produção por meios recombinantes usando métodos de DNA recombinante refere-se ao uso dos métodos bem conhecidos da biologia molecular para expressar proteínas codificadas pelo DNA clonado.
[00151] Como usado na presente invenção, “expressão” refere-se ao processo pelo qual os polipeptídeos são produzidos por transcrição e tradução de polinucleotídeos. O nível de expressão de um polipeptídeo pode ser avaliado usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, métodos para determinar a quantidade do polipeptídeo produzido a partir da célula hospedeira. Tais métodos podem incluir, mas não estão limitados à, quantificação do polipeptídeo no lisado celular por ELISA, coloração com Coomassie Blue após eletroforese em gel, ensaio de proteína Lowry e ensaio de proteína Bradford.
[00152] Como usado na presente invenção, uma “célula hospedeira” é uma célula usada para receber, manter, reproduzir e/ou amplificar um vetor. As células hospedeiras também podem ser usadas para expressar o polipeptídeo codificado pelo vetor. O ácido nucleico contido no vetor é replicado quando a célula hospedeira se divide, amplificando assim os ácidos nucleicos.
[00153] Como usado na presente invenção, um “vetor” ou “plasmídeo” é um ácido nucleico replicável a partir do qual uma ou mais de proteínas heterólogas pode(m) ser expressada(s) quando o vetor é transformado em uma célula hospedeira apropriada. A referência a um vetor inclui elementos discretos que são usados para introduzir ácido nucleico heterólogo nas células para expressão ou replicação dos mesmos. A referência a um vetor também inclui aqueles vetores nos quais um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou fragmento do mesmo pode ser introduzido, tipicamente por digestão e ligação por restrição. A referência a um vetor também inclui os vetores que contêm ácido nucleico que codifica uma protease, tal como um MTSP- 1 modificado. O vetor é usado para introduzir o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo na célula hospedeira para amplificação do ácido nucleico ou para expressão/exibição do polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico. Os vetores tipicamente permanecem epissomais, mas podem ser projetados para efetuar a integração de um gene ou parte do mesmo em um cromossomo do genoma. Também são contemplados vetores que são cromossomos artificiais, tais como cromossomos artificiais de levedura e cromossomos artificiais de mamíferos. A seleção e o uso de tais veículos são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Um vetor também inclui “vetores de vírus” e “vetores virais”.
[00154] Como usado na presente invenção, um “vetor de expressão” inclui vetores capazes de expressar DNA que é operacionalmente ligado a sequências reguladoras, tais como regiões promotoras, capazes de efetuar a expressão de tais fragmentos de DNA. Esses segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e terminadoras e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origem(ns) de replicação, um ou mais marcador(es) selecionável(eis), um intensificador, um sinal de poliadenilação e similares. Os vetores de expressão são geralmente derivados de plasmídeo ou DNA viral, ou podem conter elementos de ambos. Assim, um vetor de expressão refere-se a uma construção de DNA ou RNA recombinante, tal como um plasmídeo, um fago, um vírus recombinante ou outro vetor que, após a introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do DNA clonado. Os vetores de expressão apropriados são bem conhecidos pelos técnicos no assunto e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem epissomais ou aqueles que se integram no genoma da célula hospedeira.
[00155] Como usado na presente invenção, o vetor também inclui “vetores de vírus” ou “vetores virais”. Os vetores virais são vírus manipulados, eucarióticos e procarióticos, que podem conter ácido nucleico heterólogo, para efetuar a transferência e expressão dos mesmos nas células hospedeiras. Os vetores virais são caracterizados como eucarióticos e procarióticos com base no hospedeiro infectado pelo vírus do qual o vetor é derivado, e no tipo de RNA polimerase (eucariótico ou procariótico) que reconhece os promotores virais. Portanto, por exemplo, um vetor derivado de adenovírus é um vetor eucariótico.
[00156] Como usado na presente invenção, um adenovírus refere-se a qualquer um de um grupo de vírus que contêm DNA que causam conjuntivite e infecções do trato respiratório superior em humanos. Como usado na presente invenção, DNA nu refere-se a DNA livre de histona que pode ser usado para vacinas e terapia gênica. O DNA nu é o material genético que é passado de célula para célula durante uma transferência de genes processados chamada transformação. Na transformação, o DNA purificado ou nu é absorvido pela célula receptora, o que dará à célula receptora uma nova característica ou fenótipo.
[00157] Como usado na presente invenção, “operacionalmente ligado” com referência a sequências de ácidos nucleicos, regiões, elementos ou domínios significa que as regiões de ácidos nucleicos estão funcionalmente relacionadas entre si. Por exemplo, o ácido nucleico que codifica um peptídeo líder pode ser operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo qual os ácidos nucleicos podem ser transcritos e traduzidos para expressar uma proteína de fusão funcional, em que o peptídeo líder efetua a secreção do polipeptídeo de fusão. Em alguns casos, o ácido nucleico que codifica um primeiro polipeptídeo (por exemplo, um peptídeo líder) é operacionalmente ligado ao ácido nucleico que codifica um segundo polipeptídeo e os ácidos nucleicos são transcritos como um único transcrito de mRNA, mas a tradução do transcrito de mRNA pode resultar em um de dois polipeptídeos sendo expressados. Por exemplo, um códon de parada amber pode ser localizado entre o ácido nucleico que codifica o primeiro polipeptídeo e o ácido nucleico que codifica o segundo polipeptídeo, de modo que, quando introduzido em uma célula supressora amber parcial, o transcrito de mRNA único resultante pode ser traduzido para produzir uma proteína de fusão contendo o primeiro e o segundo polipeptídeos, ou pode ser traduzido para produzir apenas o primeiro polipeptídeo. Em outro exemplo, um promotor pode ser operacionalmente ligado a ácido nucleico que codifica um polipeptídeo, pelo qual o promotor regula ou medeia a transcrição do ácido nucleico.
[00158] Como usado na presente invenção, “sequência primária” refere-se à sequência de resíduos de aminoácidos em um polipeptídeo ou à sequência de nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico.
[00159] Como aqui usada, a sequência de ligação à proteína refere-se a uma sequência de proteína ou peptídeo que é capaz de ligação específica a outras sequências de proteínas ou peptídeos em geral, a um conjunto de sequências de proteínas ou peptídeos ou a uma sequência específica de proteína ou peptídeo.
[00160] Como usado na presente invenção, uma “etiqueta” ou uma “etiqueta de epítopo” refere-se a uma sequência de aminoácidos, tipicamente adicionada ao terminal N ou C de um polipeptídeo, tal como um MTSP-1 provido na presente invenção. A inclusão de rotuladores fundidos com um polipeptídeo pode facilitar a purificação e/ou detecção do polipeptídeo. Tipicamente, uma etiqueta ou polipeptídeo etiqueta refere-se a um polipeptídeo que tem resíduos suficientes para prover um epítopo reconhecido por um anticorpo ou pode servir para detecção ou purificação, mas é curto o suficiente para não interferir na atividade do polipeptídeo ao qual está ligado. O polipeptídeo etiqueta tipicamente é suficientemente único, de modo que um anticorpo que se liga especificamente a ele não reage substancialmente de maneira cruzada com epítopos no polipeptídeo ao qual está ligado. As proteínas etiquetadas com epítopo podem ser purificadas por afinidade usando anticorpos altamente específicos criados contra as etiquetas.
[00161] Os polipeptídeos etiqueta adequados geralmente têm pelo menos 5 ou 6 resíduos de aminoácidos e usualmente entre cerca de 8-50 resíduos de aminoácidos, tipicamente entre 9-30 resíduos. As etiquetas podem ser ligadas a uma ou mais proteína(s) e permitem a detecção da proteína ou a sua recuperação a partir de uma amostra ou mistura. Tais etiquetas são bem conhecidas e podem ser prontamente sintetizadas e projetadas. Os polipeptídeos etiqueta de exemplo incluem aqueles usados para purificação por afinidade e incluem, etiquetas modificadoras pequenas tipo Ubiquitina (SUMO), etiquetas FLAG, etiquetas His, o polipeptídeo etiqueta hemaglutinina de influenza (HA) e seu anticorpo 12CA5 (Field et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:2159- 2165); a etiqueta c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 (ver, por exemplo, Evan et al. (1985) Molecular and Cellular Biology 5: 3610-3616); e a etiqueta da glicoproteína D (gD) do vírus Herpes Simplex e seu anticorpo (Paborsky et al. (1990) Protein Engineering 3:547-553). Um anticorpo usado para detectar um anticorpo etiquetado com epítopo é normalmente referido na presente invenção como um anticorpo secundário.
[00162] Como usado na presente invenção, a sequência de ligação de metal refere-se a uma sequência de proteína ou peptídeo que é capaz de ligação específica a íons de metal em geral, a um conjunto de íons de metal ou a um íon de metal específico.
[00163] Como usado na presente invenção, o termo avaliação visa incluir determinações quantitativa e qualitativa no sentido de obter um valor absoluto para a atividade de uma protease, ou um domínio da mesma, presente na amostra, e também de obter um valor de índice, de razão,
de porcentagem, visual ou outro valor indicativo do nível da atividade. A avaliação pode ser direta ou indireta e as espécies químicas realmente detectadas não precisam, é claro, ser o próprio produto de proteólise, mas podem, por exemplo, ser um derivado do mesmo ou alguma outra substância. Por exemplo, detecção de um produto de clivagem de uma proteína do complemento, tal como por SDS-PAGE e coloração de proteínas com azul de Coomassie.
[00164] Como usado na presente invenção, atividade biológica refere-se às atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam da administração in vivo de um composto, uma composição ou outra mistura. A atividade biológica, portanto, abrange efeitos terapêuticos e atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As atividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro projetados para testar ou usar essas atividades. Assim, para as finalidades da presente invenção, uma atividade biológica de uma protease é sua atividade catalítica na qual um polipeptídeo é hidrolisado.
[00165] Como usado na presente invenção, equivalente, quando se refere a duas sequências de ácidos nucleicos, significa que as duas sequências em questão codificam a mesma sequência de aminoácidos ou proteínas equivalentes. Quando equivalente é usado para se referir a duas proteínas ou peptídeos, significa que as duas proteínas ou peptídeos têm substancialmente a mesma sequência de aminoácidos com apenas substituições de aminoácidos (tais como, mas não limitado a, mudanças conservadoras, como as apresentadas na Tabela 3, acima) que não alteram substancialmente a atividade ou função da proteína ou peptídeo. Quando equivalente se refere a uma propriedade, a propriedade não precisa estar presente na mesma extensão (por exemplo, dois peptídeos podem exibir taxas diferentes do mesmo tipo de atividade enzimática), mas as atividades são geralmente substancialmente as mesmas. Complementarmente, quando se refere a duas sequências de nucleotídeos, significa que as duas sequências de nucleotídeos são capazes de hibridizar, tipicamente com menos que 25%, 15% ou 5% de incompatibilidades entre nucleotídeos opostos. Se necessário, a porcentagem de complementaridade será especificada. Tipicamente, as duas moléculas são selecionadas de modo a hibridizar sob condições de alta estringência.
[00166] Como usado na presente invenção, um agente que modula a atividade de uma proteína ou expressão de um gene ou ácido nucleico diminui ou aumenta ou de outra forma altera a atividade da proteína ou, de alguma maneira, regula positivamente e negativamente a expressão do ácido nucleico em uma célula.
[00167] Como usado na presente invenção, uma protease de “proteína quimérica” ou “proteína de fusão” refere-se a um polipeptídeo operacionalmente ligado a um polipeptídeo diferente. Uma proteína quimérica ou de fusão provida na presente invenção pode incluir uma ou mais protease(s) ou uma porção da(s) mesma(s), tais como domínios de protease de cadeia única, e um ou mais outros polipeptídeo(s) para qualquer um ou mais de sinais de controle de transcrição/tradução, sequências sinais, uma etiqueta para localização, uma etiqueta para purificação, parte de um domínio de uma imunoglobulina G e/ou um agente de direcionamento. Essas proteínas quiméricas ou de fusão incluem aquelas produzidas por meios recombinantes como proteínas de fusão, e aquelas produzidas por meios químicos, tal como por acoplamento químico, através de, por exemplo, acoplamento a grupos sulfidrila e aquelas produzidas por qualquer outro método pelo qual pelo menos uma protease, ou uma porção da mesma, é ligada, direta ou indiretamente, via ligante(s), a outro polipeptídeo.
[00168] Como usado na presente invenção, ligado operacionalmente quando se refere a uma proteína de fusão refere-se a um polipeptídeo de protease e um polipeptídeo não protease que são fundidos em estrutura um ao outro. O polipeptídeo não protease pode ser fundido ao terminal N ou terminal C do polipeptídeo de protease.
[00169] Como usado na presente invenção, um agente de direcionamento é qualquer porção, tal como uma proteína ou porção eficaz da mesma, que provê a ligação específica do conjugado a um receptor da superfície celular, que em alguns casos pode internalizar conjugados ou porções ligado(a)s do mesmo. Um agente de direcionamento também pode ser aquele que promove ou facilita, por exemplo, isolamento por afinidade ou purificação do conjugado; ligação do conjugado a uma superfície; ou detecção do conjugado ou complexos que contêm o conjugado.
[00170] Como usado na presente invenção, “ligante” refere-se a sequências curtas de aminoácidos que se unem a dois polipeptídeos (ou ácido nucleico que codifica esses polipeptídeos). “Ligante peptídico” refere-se à sequência curta de aminoácidos que une as duas sequências de polipeptídeos. Exemplos de ligantes polipeptídicos são ligantes que unem duas cadeias de anticorpos em um fragmento de anticorpo sintético, tal como um fragmento scFv. Os ligantes são bem conhecidos e qualquer ligante conhecido pode ser usado nos métodos providos. Exemplos de ligantes polipeptídicos são sequências de aminoácidos (Gly-Ser)n, com alguns resíduos de Glu ou Lys dispersados para aumentar a solubilidade. Outros ligantes de exemplo são descritos na presente invenção; qualquer um desses e outros ligantes conhecidos pode(m) ser usado(s) com as composições e os métodos providos.
[00171] Como usado na presente invenção, derivado ou análogo de uma molécula refere-se a uma porção derivada ou uma versão modificada da molécula.
[00172] Como usado na presente invenção, “doença ou distúrbio” refere-se a uma condição patológica em um organismo resultante de causa ou condição incluindo, mas não limitada a, infecções, condições adquiridas, condições genéticas, condições relacionadas a exposições ambientais e comportamentos humanos, e condições caracterizadas por sintomas identificáveis. As doenças ou distúrbios incluem doenças diagnosticadas clinicamente, bem como rupturas no estado normal do organismo que não foram diagnosticadas como doenças clínicas. As doenças e os distúrbios de interesse aqui mencionados são aqueles que envolvem a ativação do complemento, incluindo aqueles mediados pela ativação do complemento e aqueles nos quais a ativação do complemento desempenha um papel na etiologia ou patologia. As doenças e os distúrbios de interesse na presente invenção incluem aqueles caracterizados por ativação do complemento (por exemplo, degeneração macular relacionada à idade e função tardia de enxerto renal).
[00173] Como usado na presente invenção, a degeneração macular ocorre quando a pequena porção central da retina, conhecida como mácula, se deteriora. Existem dois tipos de DMRI: de forma seca (atrófica) e de forma úmida (neovascular ou exsudativa). A maioria das DMRI começa como do tipo seco e, em 10 a 20% dos indivíduos, progride para o tipo de forma úmida. A degeneração macular relacionada à idade é sempre bilateral (isto é, ocorre nos dois olhos), mas não necessariamente progride no mesmo ritmo nos dois olhos.
[00174] Como aqui usada, a degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença inflamatória que causa deficiência visual e cegueira em pessoas idosas. As proteínas do sistema do complemento são centrais para o desenvolvimento desta doença. A inflamação local e sistêmica na DMRI é mediada pela ação desregulada da via alternativa do sistema do complemento.
[00175] Como aqui usada, a função tardia do enxerto (DGF) é uma manifestação de lesão renal aguda (LRA) com atributos únicos para o processo de transplante. Ocorre após a cirurgia de transplante. A função tardia do enxerto (DGF) é uma complicação comum frequentemente definida como a necessidade de diálise durante a primeira semana pós-transplante. A síntese renal intrínseca do terceiro componente do complemento C3 (C3) contribui para a rejeição aguda iniciando uma resposta mediada por células T. Por exemplo, em doadores com morte encefálica, os níveis renais locais de C3 são mais altos na aquisição e inversamente relacionados à função renal 14 dias após o transplante.
[00176] Como usado na presente invenção, uma doença ou um distúrbio mediada(o) por complemento é qualquer distúrbio no qual qualquer de uma ou mais das proteínas do complemento desempenha um papel na doença, devido à ausência ou presença de uma proteína do complemento ou proteína ou ativação ou inativação relacionada ao complemento de um complemento ou proteína relacionada ao complemento.
Em algumas modalidades, um distúrbio mediado por complemento é aquele que é devido a uma deficiência em uma(s) proteína(s) do complemento.
Em outras modalidades, como descrito na presente invenção, um distúrbio mediado por complemento é aquele que é devido à ativação ou superativação de uma ou mais proteína(s) do complemento.
Um distúrbio mediado por complemento também é aquele que se deve à presença de qualquer de uma ou mais proteína(s) do complemento e/ou à ativação contínua da via do complemento.
Conforme usado na presente invenção, “distúrbio relacionado à degeneração macular” refere-se a várias condições nas quais a mácula retiniana degenera ou se torna disfuncional (por exemplo, como consequência da diminuição do crescimento das células da mácula, aumento da morte ou do rearranjo das células da mácula (por exemplo, células RPE), perda da função biológica normal ou uma combinação desses eventos). A degeneração macular resulta na perda de integridade da histoarquitetura das células e/ou da matriz extracelular da mácula normal e/ou na perda de função das células da mácula.
Exemplos de distúrbio relacionado à degeneração macular incluem degeneração macular relacionada à idade (DMRI), atrofia geográfica (GA), distrofia macular da Carolina do Norte, distrofia de fundo de Sorsby, doença de Stargardt, distrofia padrão, doença de Best, doença dominante e malattia leventinese (doenças radiais). O distúrbio relacionado à degeneração macular também abrange alterações extramaculares que ocorrem antes ou após a disfunção e/ou degeneração da mácula. Assim, o termo “distúrbio relacionado à degeneração macular” também inclui amplamente qualquer condição que altera ou danifica a integridade ou a função da mácula (por exemplo, dano ao RPE ou à membrana de Bruch). Por exemplo, o termo abrange descolamento de retina, degenerações coriorretinianas, degenerações retinianas, degenerações por fotorreceptores, degenerações do RPE, mucopolissacaridoses, distrofias de cone-bastonete, distrofias de bastonete-cone e degenerações de cone.
[00177] Um distúrbio relacionado à degeneração macular descrito na presente invenção inclui DMRI, tal como, por exemplo, um distúrbio relacionado à degeneração macular tratado por tratamento anti-VEGF, tal como, por exemplo, anticorpos anti-VEGF ou tratamento a laser ou um telescópio implantável.
[00178] Como usado na presente invenção, “tratar” um indivíduo com uma doença ou condição significa que os sintomas do indivíduo são parcial ou totalmente aliviados, ou permanecem estáticos após o tratamento. Portanto, o tratamento abrange profilaxia, terapia e/ou cura. Profilaxia refere-se à prevenção de uma doença potencial e/ou à prevenção de agravamento dos sintomas ou progressão de uma doença. O tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico de um polipeptídeo MTSP-1 modificado e composições providas na presente invenção.
[00179] Como usado na presente invenção, “prevenção” ou profilaxia refere-se a métodos nos quais o risco ou a probabilidade de desenvolver uma doença ou condição é reduzido(a).
[00180] Como usado na presente invenção, um “agente terapêutico”, regime terapêutico, radioprotetor ou quimioterapêutico significa fármacos convencionais e terapias farmacológicas, incluindo vacinas, que são conhecidas pelos técnicos no assunto. Os agentes radioterapêuticos são bem conhecidos na técnica.
[00181] Como usado na presente invenção, “tratamento” significa qualquer maneira pela qual os sintomas de uma condição, um distúrbio ou uma doença sejam melhorados ou de outra forma beneficiados. O tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico das composições na presente invenção.
[00182] Conforme usado na presente invenção, “melhora dos sintomas” de uma doença ou um distúrbio específica(o) por meio de um tratamento, tal como por administração de uma composição farmacêutica ou outra terapia, refere-se a qualquer diminuição, permanente ou temporária, duradoura ou transitória, dos sintomas que pode ser atribuído ou associado à administração da composição ou terapia.
[00183] Como usado na presente invenção, um “agente farmaceuticamente eficaz” inclui qualquer agente terapêutico ou agentes bioativos, incluindo, mas não limitados a, por exemplo, anestésicos, vasoconstritores, agentes dispersantes e fármacos terapêuticos convencionais, incluindo fármacos de moléculas pequenas e proteínas terapêuticas.
[00184] Como usado na presente invenção, uma “quantidade eficaz” de um composto ou uma composição para o tratamento de uma doença específica é uma quantidade que é suficiente para melhorar ou, de alguma maneira, reduzir os sintomas associados à doença. Essa quantidade pode ser administrada como uma dosagem única ou pode ser administrada de acordo com um regime, pelo qual é eficaz. A quantidade pode curar a doença, mas, tipicamente, é administrada a fim de melhorar os sintomas da doença. Tipicamente, é necessária uma administração repetida para obter uma melhora desejada dos sintomas.
[00185] Como usado na presente invenção, uma “quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma “dose terapeuticamente eficaz” refere-se à quantidade de um(a) agente, composto, material ou composição contendo um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico após a administração a um indivíduo. Portanto, é a quantidade necessária para prevenir, curar, melhorar, interromper ou interromper parcialmente um sintoma de uma doença ou um distúrbio.
[00186] Como usado na presente invenção, um “efeito terapêutico” significa um efeito resultante do tratamento de um indivíduo que altera, tipicamente melhora ou melhora os sintomas de uma doença ou condição ou que cura uma doença ou condição.
[00187] Como usado na presente invenção, uma “quantidade profilaticamente eficaz” ou uma “dose profilaticamente eficaz” refere-se à quantidade de um(a) agente, composto, material ou composição contendo um composto que, quando administrado a um indivíduo, tem o efeito profilático pretendido, por exemplo, impedindo ou atrasando o início, ou reincidência, de doença ou sintomas, reduzindo a probabilidade do início ou da recorrência, de doença ou sintomas, ou reduzindo a incidência de infecção viral. O efeito profilático total não ocorre necessariamente pela administração de uma dose, e só pode ocorrer após a administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade profilaticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administração(ões).
[00188] Como usado na presente invenção, “administração de uma protease não complementar”, tal como uma protease MTSP-1 modificada, refere-se a qualquer método no qual a protease não complementar seja contatada com seu substrato. A administração pode ser efetuada in vivo ou ex vivo ou in vitro. Por exemplo, para administração ex vivo, um fluido corporal, tal como sangue, é removido de um indivíduo e contactado fora do corpo com a protease modificada de não complemento, tal como uma protease MTSP-1 modificada. Para administração in vivo, a protease modificada de não complemento, tal como uma protease MTSP-1 modificada, pode ser introduzida no corpo, tal como por via local, tópica, sistêmica e/ou outra via de introdução. A administração in vitro abrange métodos, tais como métodos de cultura de células.
[00189] Como usado na presente invenção, “forma de dose unitária” refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas para indivíduos humanos e animais e acondicionadas individualmente, como é conhecido na técnica.
[00190] Como usado na presente invenção, “paciente” ou “indivíduo” a ser tratado inclui humanos e animais humanos ou não humanos. Mamíferos incluem; primatas, tais como, humanos, chimpanzés, gorilas e macacos; animais domesticados, tais como, cães, cavalos, gatos, porcos, cabras e vacas; e roedores, tais como, camundongos, ratos,
hamsters e gerbis.
[00191] Como usado na presente invenção, uma “combinação” refere-se a qualquer associação entre ou dentre dois ou mais itens. A associação pode ser espacial ou referir-se ao uso de dois ou mais itens para um propósito comum. A combinação pode ser dois ou mais itens separados, tais como duas composições ou duas coleções, uma mistura dos mesmos, tal como uma única mistura dos dois ou mais itens, ou qualquer variação dos mesmos. Os elementos de uma combinação geralmente são funcionalmente associados ou relacionados.
[00192] Como usado na presente invenção, uma “composição” refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos ou compostos (por exemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.). Pode ser uma solução, uma suspensão, um líquido, um pó, uma pasta, formulações aquosas ou não aquosas ou qualquer combinação das mesmas.
[00193] Como usado na presente invenção, um agente estabilizante refere-se ao composto adicionado à formulação para proteger o anticorpo ou o conjugado, tal como nas condições (por exemplo, temperatura) nas quais as formulações são armazenadas ou usadas na presente invenção. Assim, estão incluídos agentes que impedem a degradação de proteínas de outros componentes nas composições. Exemplos de tais agentes são aminoácidos, derivados de aminoácidos, aminas, açúcares, polióis, sais e tampões, tensoativos, inibidores ou substratos e outros agentes, como descritos na presente invenção.
[00194] Como usado na presente invenção, “fluido” refere-se a qualquer composição que possa fluir. Os fluidos abrangem assim composições que estão na forma de semissólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras composições desse tipo.
[00195] Como usado na presente invenção, um “artigo de fabricação” é um produto que é fabricado e vendido. Como usado ao longo deste pedido, o termo pretende abranger um agente terapêutico com um polipeptídeo MTSP-1 modificado ou molécula de ácido nucleico contida no mesmo ou em artigos de embalagem separados.
[00196] Como usado na presente invenção, um “kit” refere-se a uma combinação acondicionada, incluindo opcionalmente reagentes e outros produtos e/ou componentes para a prática de métodos usando os elementos da combinação. Por exemplo, kits contendo um polipeptídeo de protease modificado, tal como uma protease MTSP-1 modificada provida na presente invenção, ou molécula de ácido nucleico provida na presente invenção e outro item para uma finalidade que inclui, mas não se limita à(a), administração, diagnóstico e avaliação de uma atividade biológica ou propriedade são providos. Os kits incluem opcionalmente instruções de uso.
[00197] Como usado na presente invenção, um “extrato celular” refere-se a uma preparação ou fração que é feita a partir de uma célula lisada ou rompida.
[00198] Como usado na presente invenção, “animal” inclui qualquer animal, tal como, mas não limitado a; primatas, incluindo humanos, gorilas e macacos; roedores, tais como camundongos e ratos; aves, tais como galinhas; ruminantes, tais como cabras, vacas, veados e ovelhas. Animais não humanos excluem humanos tal como animal contemplado. As proteases providas na presente invenção são de qualquer fonte, animal, vegetal, procariótica e fúngica. A maioria das proteases é de origem animal, incluindo origem de mamíferos.
[00199] Como usado na presente invenção, uma formulação de “dose única” refere-se a uma formulação que contém uma dose única de agente terapêutico para administração direta. As formulações de dosagem única geralmente não contêm conservantes.
[00200] Como usado na presente invenção, uma formulação de doses múltiplas refere-se a uma formulação que contém doses múltiplas de um agente terapêutico e que pode ser administrada diretamente para prover várias doses únicas do agente terapêutico. As doses podem ser administradas ao longo de minutos, horas, semanas, dias ou meses. As formulações de multidoses podem permitir o ajuste da dose, o agrupamento da dose e/ou a divisão da dose. Como as formulações de multidoses são usadas ao longo do tempo, elas geralmente contêm um ou mais conservantes para impedir o crescimento microbiano.
[00201] Como usado na presente invenção, um “controle” ou “padrão” refere-se a uma amostra que é substancialmente idêntica à amostra de teste, exceto que não é tratada com um parâmetro de teste ou, se for uma amostra de plasma, pode ser de um voluntário normal não afetado pela condição de interesse. Um controle também pode ser um controle interno. Por exemplo, um controle pode ser uma amostra, tal como um vírus, que tem uma propriedade ou atividade conhecida.
[00202] Como usado na presente invenção, as formas singulares “um”, “uma” e “a” e “o” incluem referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um” agente inclui um ou mais agentes.
[00203] Como usado na presente invenção, o termo “ou” é usado para significar “e/ou”, a menos que explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou se as alternativas forem mutuamente exclusivas.
[00204] Como usado na presente invenção, faixas e quantidades podem ser expressados como “cerca de” um valor ou faixa específico(a). Cerca de também inclui a quantidade exata. Portanto, “cerca de 5 bases” significa “cerca de 5 bases” e também “5 bases”.
[00205] Como usado na presente invenção, “opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou a circunstância descrito(a) posteriormente ocorre ou não, e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo não é substituído ou é substituído.
[00206] Como usado na presente invenção, as abreviações de quaisquer grupos protetores, aminoácidos e outros compostos são, a menos que indicado de outra forma, de acordo com seu uso comum, abreviações reconhecidas ou a Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (ver, (1972) Biochem. 11:1726).
[00207] Para maior clareza da divulgação, e não como limitação, a descrição detalhada é dividida nas subseções a seguir. B. ESTRUTURA E FUNÇÃO DO MTSP-1
[00208] MTSP-1 (também chamada matriptase, TADG-15, supressor de tumorigenicidade 14, ST14; ver SEQ ID NOS: 1,
2 e Nos de acesso ao Banco de Genes: AF118224 e AAD42765; Patente US nº 5.792.616; ver também Takeuchi (1999) Proc Natl. Acad. Sci. EUA 96: 11054-1161) é uma serina protease que cliva proteínas contendo a sequência de aminoácidos P4(Arg/Lys)-P3(X)-P2(Ser)-P1(Arg)-P1’(Ala) e P4(X)- P3(Arg/Lys)-P2(Ser)-P1(Arg)-P1’(Ala), em que X corresponde a aminoácidos não básicos (Takeuchi (2000) J Biol Chem 275 (34):26333-42) e pode clivar vários substratos sintéticos com resíduos de arginina ou lisina em seus sítios P1. O MTSP- 1 tem pelo menos três substratos fisiológicos conhecidos, incluindo ativador do plasminogênio do tipo uroquinase (u- PA), fator de crescimento de hepatócitos (HGF)/fator de dispersão e receptor-2 ativado por protease (PAR-2) (Takeuchi (2000) J Biol Chem 275 (34):26333-42; Lee et al. (2000) J Biol Chem 275:36720-36725). O MTSP-1 é encontrado nas células epiteliais, e em muitos tecidos cancerígenos. O MTSP-1 é envolvido no desenvolvimento embrionário normal. O MTSP-1 colocaliza-se com a E-aderina, uma molécula de zona de oclusão que é necessária para o desenvolvimento embrionário normal em camundongos.
[00209] São providos na presente invenção polipeptídeos de serina protease 1 tipo membrana modificada (MTSP-1) que são modificados para que clivem sequências inibitórias em C3, de modo que a ativação de C3 nos fragmentos C3a e C3b seja inibida. A atividade/especificidade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção é tal que cliva C3 com maior atividade e/ou especificidade ou kcat/Km em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 não modificado, particularmente com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados também podem ter atividade ou especificidade reduzida ou ambas para um substrato fisiológico do polipeptídeo MTSP-1 não modificado, tal como, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase(PAR-2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Assim, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção inibem a ativação do complemento em uma via do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados também exibem seletividade aumentada para clivar C3 em comparação com outros substratos de MTSP-1, tais como, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA) e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Portanto, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção não exibem atividades de clivagem indesejadas contra substratos de MTSP-1 nativos fisiológicos, de modo que não exibam efeitos colaterais indesejáveis.
1. Serinas Proteases
[00210] As serina proteases (SPs), que incluem enzimas secretadas e enzimas sequestradas em organelas de armazenamento citoplasmáticas, têm uma variedade de papéis fisiológicos, incluindo coagulação sanguínea, cicatrização de feridas, digestão, respostas imunes e invasão e metástase de tumores. Por exemplo, quimotripsina, tripsina e elastase funcionam no trato digestivo; Fator 10, Fator 11, Trombina e Plasmina estão envolvidos na coagulação e na cicatrização de feridas; e C1r, C1s e C3 converstase desempenham um papel na ativação do complemento.
[00211] Uma classe de proteínas da superfície celular designadas serina proteases transmembranares do tipo II são proteases que são proteínas ancoradas na membrana com domínios extracelulares. Como proteínas da superfície celular, elas desempenham um papel na transdução de sinal intracelular e na mediação de eventos proteolíticos da superfície celular. Outras serina proteases são ligadas à membrana e funcionam de maneira semelhante. Outras são secretadas. Muitas serina proteases exercem sua atividade mediante ligação aos receptores da superfície celular e, portanto, atuam nas superfícies celulares. A proteólise da superfície celular é um mecanismo para a geração de proteínas biologicamente ativas que mediam uma variedade de funções celulares.
[00212] As serina proteases, incluindo as serina proteases secretadas transmembranares, estão envolvidas em processos que incluem o desenvolvimento e a progressão neoplásicos. Embora o papel preciso dessas proteases não tenha sido totalmente elaborado, as serina proteases e inibidores das mesmas estão envolvidas no controle de muitos processos fisiológicos intra e extracelulares, incluindo ações degradantes na invasão de células cancerígenas e disseminação metastática, e neovascularização de tumores que são envolvidos na progressão tumoral. As proteases estão envolvidas na degradação e na remodelação da matriz extracelular (MEC) e contribuem para a remodelação tecidual, e são necessárias para invasão e metástase do câncer. Demonstrou-se que a atividade e/ou expressão de algumas proteases se correlacionam com a progressão e desenvolvimento do tumor.
[00213] Mais de 20 famílias (designadas S1-S27) de serina protease foram identificadas, e agrupadas em 6 clãs
(SA, SB, SC, SE, SF e SG) com base na similaridade estrutural e outras evidências funcionais (Rawlings ND et al. (1994) Meth. Enzymol. 244: 19-61). Existem similaridades nos mecanismos de reação de várias serina peptidases. Os clãs da quimotripsina, subtilisina e carboxipeptidase C têm uma tríade catalítica de serina, aspartato e histidina em comum: a serina atua como um nucleófilo, o aspartato como um eletrófilo e a histidina como uma base. As orientações geométricas dos resíduos catalíticos são semelhantes entre as famílias, apesar dos diferentes enovelamentos de proteínas. Os arranjos lineares dos resíduos catalíticos geralmente refletem as relações dos clãs. Por exemplo, a tríade catalítica no clã da quimotripsina (SA) é ordenada HDS, mas é ordenada DHS no clã subtilisina (SB) e SDH no clã de carboxipeptidase (SC).
[00214] Exemplos de serina proteases da superfamília da quimotripsina incluem ativador de plasminogênio do tipo tecido (tPA), tripsina, protease do tipo tripsina, quimotripsina, plasmina, elastase, uroquinase (ou ativador do plasminogênio do tipo urinário, u-PA), acrosina, proteína C ativada, C1 esterase, catepsina G, quimase, e as proteases da cascata de coagulação sanguínea, incluindo calicreína, trombina e fatores VIIa, IXa, Xa, XIa e XIIa (Barret, A.J., In: Proteinase Inhibitors, Ed. Barrett, A.J., Et al., Elsevier, Amsterdam, Páginas 3-22 (1986); Strassburger, W. et al., (1983) FEBS Lett., 157 :219-223; Dayhoff, M.O., Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol 5, National Biomedical Research Foundation, Silver Spring, Md. (1972); e Rosenberg, R.D. et al. (1986) Hosp. Prac., 21: 131-137).
[00215] A atividade das proteases na família da serina protease depende de um conjunto de resíduos de aminoácidos que formam seu sítio ativo. Um dos resíduos é sempre uma serina; daí a sua designação como serina proteases. Por exemplo, quimotripsina, tripsina e elastase compartilham uma estrutura semelhante e seu resíduo de serina ativo está na mesma posição (Ser-195) nos três. Apesar de suas similaridades, eles têm diferentes especificidades de substrato; eles clivam diferentes ligações peptídicas durante a digestão de proteínas. Por exemplo, a quimotripsina prefere uma cadeia lateral aromática no resíduo cujo carbono de carbonila faz parte da ligação peptídica a ser clivada. A tripsina prefere um resíduo Lys ou Arg carregado positivamente nesta posição. As serina proteases diferem acentuadamente em suas propriedades de reconhecimento de substrato: algumas são altamente específicas (isto é, as proteases envolvidas na coagulação sanguínea e no sistema do complemento imune); alguns são apenas parcialmente específicos (isto é, as proteases digestivas de mamíferos tripsina e quimotripsina); e outros, semelhante a subtilisina, uma protease bacteriana, são completamente inespecíficos. Apesar dessas diferenças de especificidade, o mecanismo catalítico das serina proteases é bem conservado.
[00216] O mecanismo de clivagem de uma proteína alvo por uma serina protease é baseado no ataque nucleofílico da ligação peptídica alvo por uma serina. As moléculas de cisteína, treonina ou água associadas ao aspartato ou metais também podem desempenhar esse papel. Em muitos casos, a propriedade nucleofílica do grupo é melhorada pela presença de uma histidina, mantida em um “estado aceitador de prótons” por um aspartato. Cadeias laterais alinhadas de serina,
histidina e aspartato acumulam a tríade catalítica comum à maioria das serina proteases. Por exemplo, os resíduos do sítio ativo de quimotripsina, e serina proteases que são membros da mesma família que a quimotripsina, tal como, por exemplo MTSP-1, são Asp102, His57 e Ser195.
[00217] Os domínios catalíticos de todas as serina proteases da superfamília da quimotripsina têm homologia de sequência e homologia estrutural. A homologia de sequência inclui a conservação de: 1) os resíduos característicos do sítio ativo (por exemplo, Ser195, His57 e Asp102 no caso de tripsina); 2) o orifício de oxiânion (por exemplo, Gly193, Asp194 no caso de tripsina); e 3) os resíduos de cisteína que formam pontes dissulfeto na estrutura (Hartley, B.S., (1974) Symp. Soc. Gen. Microbiol., 24: 152-182). A homologia estrutural inclui 1) um enovelamento comum caracterizado por duas estruturas chave Gregas (Richardson, J. (1981) Adv. Prot. Chem., 34: 167-339); 2) uma disposição comum de resíduos catalíticos; e 3) preservação detalhada da estrutura dentro do núcleo da molécula (Stroud, R.M. (1974) Sci. Am., 231: 24-88).
[00218] Em toda a família da quimotripsina de serina proteases, a interação da espinha dorsal entre o substrato e a enzima é completamente conservada, mas as interações da cadeia lateral variam consideravelmente. A identidade dos aminoácidos que contêm as cavidades S1-S4 do sítio ativo determina a especificidade do substrato dessa cavidade específica. O enxerto de aminoácidos de uma serina protease em outro do mesmo enovelamento modifica a especificidade de um para o outro. Tipicamente, os aminoácidos da protease que contêm as cavidades S1-S4 são aqueles que têm cadeias laterais dentro de 4 a 5 angstroms do substrato.
As interações que esses aminoácidos têm com o substrato de protease são geralmente chamadas de interações de “primeiro invólucro” porque entram em contato direto com o substrato.
Entretanto, pode haver interações de “segundo invólucro” e “terceiro invólucro” que finalmente posicionam os aminoácidos do primeiro invólucro.
Os efeitos de ligação do substrato do primeiro invólucro e do segundo invólucro são determinados principalmente por enovelamentos entre os domínios do barril beta.
Como esses enovelamentos não são elementos centrais da proteína, a integridade da dobra é mantida enquanto variantes de enovelamento com novas especificidades de substrato podem ser selecionadas durante o curso da evolução para atender a nichos metabólicos ou regulatórios necessários no nível molecular.
Tipicamente para serina proteases, os seguintes aminoácidos na sequência primária são determinantes da especificidade: 195, 102, 57 (a tríade catalítica); 189, 190, 191, 192 e 226 (S1); 57, o enovelamento entre 58 e 64, e 99 (S2); 192, 217, 218 (S3); o enovelamento entre Cys168 e Cys180, 215 e 97 a 100 (S4); e 41 e 151 (S2’), com base na numeração de quimotripsina, em que um aminoácido na posição S1 afeta a especificidade de P1, um aminoácido na posição S2 afeta a especificidade de P2, um aminoácido na posição S3 afeta a especificidade de P3, e um aminoácido na posição S4 afeta a especificidade de P4. A posição 189 em uma serina protease é um resíduo incorporado no fundo da cavidade que determina a especificidade de S1. Os determinantes estruturais para MTSP-1 estão listados na Tabela 4, com domínios de protease para cada uma das proteases designadas alinhadas com a do domínio da protease da quimotripsina. O número abaixo dos cabeçalhos da coluna de enovelamento de 60 de Cys168-Cys182 indica o número de aminoácidos no enovelamento entre os dois aminoácidos e no enovelamento. A designação sim/não sob os cabeçalhos da coluna de Cys191-Cys220 indica se a ponte dissulfeto está presente na protease. Estas regiões são variáveis na família das serina proteases do tipo quimotripsina e representam por si mesmas determinantes estruturais.
2. Estrutura
[00219] O cDNA de MTSP-1 foi clonado de várias espécies de mamíferos. Os polipeptídeos precursores de MTSP-1 de exemplo incluem, mas não estão limitados a, polipeptídeos MTSP-1 humano (SEQ ID NO: 1 e codificado por SEQ ID NO: 5), camundongo (SEQ ID NO: 12), e rato (SEQ ID NO: 13). O transcrito de mRNA de MTSP-1 humano é normalmente traduzido para formar uma proteína tipo selvagem de 855 aminoácidos (SEQ ID NO: 1). A molécula de ácido nucleico cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 5 (ver também o Banco de Genes AF118224) codifica o MTSP-1 de 855 aminoácidos (SEQ ID NO: 1, Banco de Genes AAD42765). MTSP-1 é proteinase de múltiplos domínios com um domínio de serina proteinase C-terminal (Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277 (3): 2160). Uma variante de 683 aminoácidos da protease foi isolada, mas esta proteína parece ser uma forma truncada ou uma forma de ectodomínio. Como descrito em mais detalhes abaixo, o MTSP- 1 é um zimogênio ou pró-enzima que é posteriormente processada(o) por clivagem proteolítica em um motivo de ativação canônico para gerar um polipeptídeo MTSP-1 maduro de duas cadeias.
[00220] Existem pelo menos cinco isoformas, produzidas por splicing alternativo, do MTSP-1 humano. Formas de MTSP- 1 com uma massa molecular de aproximadamente 95, 78, 74, 45 e 25 kDa (1,578x10-22, 1,295x10-22, 1,229x10-22, 7,472x10-23 e 4,151x10-23 kg) correspondentes à proteína de comprimento completo (95kDa) (1,578x10-22 kg), resíduos 149-855 da SEQ ID NO: 1 (78 kDa) (1,295x10-22 kg), resíduos 190-855 da SEQ ID NO: 1 (73 kDa) (1,212x10-22 kg) ou 205-855 da SEQ ID NO: 1 (74 kDa) ( 1,229x10-22 kg), resíduos 190-614 da SEQ ID NO: 1 (45,7 kDa) (7,589x10-23 kg) e resíduos 615-855 da SEQ ID NO: 1 (26 kDa) (4,317x10-23 kg), respectivamente, foram detectadas (Ge et al., (2006) J Biol Chem 281: 7406-7412). São conhecidas variantes alélicas e outras variantes do MTSP- 1 humano. Por exemplo, uma variante G827R de ocorrência natural está associada a ictiose com síndrome de hipotricose, caracterizada por hiperqueratose cutânea (Basel-Vanagaite et al., (2007) Am J Hum Genet 80: 467-477). Em outro exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 modificado contendo a modificação de aminoácido C299S (C122S pela numeração de quimotripsina) na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (correspondente à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO : 2) é conhecido; a troca da cisteína livre reduz a agregação da proteína codificada. Variantes adicionais incluem aquelas que contêm modificações de aminoácidos M285I, R381S, H656A, D711A e S805A em MTSP-1 de comprimento completo apresentadas na SEQ ID NO: 1.
[00221] O MTSP-1 é altamente expressado ou ativo nos cânceres de próstata, de mama e colorretal, e diz-se que desempenha um papel na metástase do câncer de mama e de próstata. O MTSP-1 também é expressado em uma variedade de tecidos epiteliais com altos níveis de atividade e/ou expressão no trato gastrointestinal humano e na próstata. Outras espécies de MTSP-1 são conhecidas. Por exemplo, um homólogo de camundongo de MTSP-1 foi identificado e é chamado epitina. O MTSP-1 contém um domínio transmembranar, dois domínios CUB, quatro repetições LDLR, e um domínio serina protease (ou domínio peptidase S1) entre os aminoácidos 615- 854 (apresentados como SEQ ID NOS: 2 e 7), que é altamente conservada entre todos os membros da família peptidase S1 de serina proteases, tal como, por exemplo, com quimotripsina (SEQ ID NOS: 14 e 15). O MTSP-1 é sintetizado como um zimogênio de 855 aminoácidos, e ativada para uma forma enzimática de fita dupla ativa por clivagem entre Arg614 e Val615. Além disso, o domínio proteolítico de cadeia única sozinho é cataliticamente ativo e funcional.
[00222] O MTSP-1 pertence à família peptidase S1 das serina proteases (também referida como família da quimotripsina), que também inclui quimotripsina e tripsina. Geralmente, os membros da família da quimotripsina compartilham homologia estrutural e sequencial com a quimotripsina. O MTSP-1 é numerado na presente invenção de acordo com a numeração de quimotripsina madura, com seu domínio da protease alinhado com o domínio da protease da quimotripsina e seus resíduos numerados de acordo. Com base na numeração de quimotripsina, os resíduos do sítio ativo são Asp102, His57 e Ser195. A sequência linear de aminoácidos pode ser alinhada com a da quimotripsina e numerada de acordo com as folhas β da quimotripsina. Inserções e eliminações ocorrem nos enovelamentos entre as folhas beta, mas em toda a família estrutural, as folhas principais são conservadas.
As serina proteases interagem com um substrato de maneira conservada em folha beta. Podem ocorrer até 6 ligações de hidrogênio conservadas entre o substrato e a enzima. Todas as serina proteases da família da quimotripsina têm uma região conservada no terminal N do domínio da protease, necessária para a atividade catalítica (isto é, IIGG, VVGG ou IVGG, em que o primeiro aminoácido nesse quarteto é numerado de acordo com a numeração de quimotripsina e dada a designação Ile 16. Essa numeração não reflete o comprimento da sequência precursora).
[00223] A especificidade do substrato de MTSP-1 no domínio da protease foi mapeada usando uma biblioteca combinatória sintética de varredura posicional e exibição de fagos de substrato (Takeuchi et al. (2000) J Biol Chem 275: 26333). Os resíduos de clivagem em substratos reconhecidos por MTSP-1 contêm Arg/Lys em P4 e resíduos básicos ou Gln em P3, pequenos resíduos em P2, Arg ou Lys em P1 e Ala em P1’. Os substratos eficazes contêm Lys-Arg-Ser-Arg nos sítios P4 a P1, respectivamente. Geralmente, a especificidade do substrato para MTSP-1 revela uma tendência pela qual se P3 é básico, P4 tende a não ser básico; e se P4 é básico, P3 tende a não ser básico. Os substratos conhecidos para MTSP- 1, incluindo, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA) e fator de crescimento de hepatócitos (HGF), estão em conformidade com a sequência de clivagem para substratos específicos de MTSP-1.
[00224] O MTSP-1 pode clivar substratos sintéticos selecionados tão eficientemente quanto a tripsina, mas exibe uma especificidade mais restrita para substratos do que a tripsina. O domínio catalítico do MTSP-1 possui a dobra estrutural geral de uma serina protease do tipo quimio(tripsina), mas exibe propriedades únicas, tais como subsítios S2/S4 hidrofóbicos/ácidos e um enovelamento 60 exposto. De forma similar, o MTSP-1 não cliva indiscriminadamente substratos peptídicos em resíduos acessíveis de Lys ou Arg, mas requer o reconhecimento de resíduos adicionais ao redor da ligação peptídica cindível. Este requisito para uma sequência primária estendida destaca a especificidade do MTSP-1 para seus substratos. Por exemplo, embora o MTSP-1 cliva o receptor 2 ativado por proteinase (PAR-2) (exibindo uma sequência alvo de P4 a P1 de Ser-Lys- Gly-Arg), a enzima não ativa proteínas intimamente relacionadas a esse substrato, tais como, PAR-1, PAR-3 e PAR-4 que não exibem sequências alvo que correspondem à especificidade estendida de MTSP-1 perto da ligação cindível (ver Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277: 2160).
[00225] O domínio da protease MTSP-1 (ver, por exemplo, SEQ ID NOS: 2, 4) é composto por uma pró-região e um domínio catalítico. A porção cataliticamente ativa do polipeptídeo começa após o sítio de autoativação no resíduo de aminoácido 611 da proteína madura (ver, por exemplo, SEQ ID NOS: 1, 3 em RQAR, seguida pelos resíduos VVGG). A cavidade S1 do MTSP- 1 e da tripsina são semelhantes com boa complementaridade para os resíduos P1 Lys e Arg, respondendo assim por algumas similaridades na clivagem do substrato com a tripsina. A acomodação dos resíduos P1-Lys é mediada por Ser190 cuja cadeia lateral provê um aceitador de ligação de hidrogênio adicional para estabilizar o grupo α-amônio incorporado (ver Friedrich et al. (2002) J Biol Chem 277: 2160). A cavidade
S2 é formada para acomodar cadeias laterais hidrofóbicas pequenas e médias de aminoácidos P2 e geralmente aceita uma ampla faixa de aminoácidos na posição P2. Após a ligação do substrato, o subsítio S2 não é rígido, como evidenciado pela rotação do grupo benzil Phe99. A associação dos aminoácidos do substrato nas posições P3 (para resíduos Gln ou básicos) e P4 (para resíduos Arg ou Lys) parece ser mediada por interações eletrostáticas nas cavidades S3 e S4 com as cadeias laterais ácidas do Asp-217 e/ou Asp-96, que pode pré-orientar favoravelmente substratos peptídicos básicos específicos à medida que se aproximam da fenda do sítio ativo da enzima.
A cadeia lateral de um resíduo P3 também é capaz de ligar hidrogênio ao grupo carboxamida de Gln192 ou, alternativamente, a cadeia lateral P3 pode se estender para o subsítio S4 para formar uma ligação de hidrogênio com Phe97, enfraquecendo as ligações de hidrogênio intercadeia principal com Gly216. Em qualquer uma das conformações, uma cadeia lateral básica P3 é capaz de interagir favoravelmente com o potencial negativo da cavidade S4 de MTSP-1. A compensação mútua de carga e exclusão do mesmo sítio S4 explica a baixa probabilidade da ocorrência simultânea de resíduos Arg/Lys em P3 e P4 em bons substratos de MTSP-1. Geralmente, as posições de aminoácidos do MTSP-1 (com base na numeração de quimotripsina) que contribuem para uma maior especificidade para a ligação ao substrato incluem: 146 e 151 (S1’); 189, 190, 191, 192, 216, 226 (S1); 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 99 (S2); 192, 217, 218, 146 (S3); 96, 97, 98, 99, 100, 168, 169, 170, 170A, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 178, 179, 180, 215, 217, 224 (S4). A Tabela 4 resume os resíduos em MTSP-1 para algumas das posições de aminoácidos importantes para interações de especificidade com um substrato direcionado. Tipicamente, a modificação de uma protease MTSP-1 para alterar qual(ais)quer um ou mais aminoácido(s) na cavidade de ligação de especificidade estendida ou outros sítios secundários de interação afeta a especificidade ou seletividade de uma protease para um substrato alvo. Tabela 4: Determinantes Estruturais da Clivagem do Substrato de MTSP- 1 (numeração de quimotripsina) Resíduos que determinam a especificidade S4 S3 S2 S1 171 174 180 215 Cys168 192 218 99 57 Enovela- 189 190 226 Cys191 Cys182 mento de Cys220 60 (58-64) Leu Gln Met Trp 13 * Gln Asp Phe His 16* Asp Ser Gly sim * número de resíduos
3. Função/Atividade
[00226] A serina protease 1 tipo membrana (MTSP-1) é uma serina protease normalmente expressada em tecidos epiteliais, incluindo a pele, e nos rins, no pulmão, na próstata e no epitélio mamário (Kim et al. (1999) Immunogenetics 49: 420-428; Oberst et al. (2001) Am J Pathol 158: 1301-1311; Takeguchi et al. (1999) Proc Natl Acad Sci 96: 11054-11061) e expressados em uma variedade de tipos de tumores (Oberst et al. (2001) Am J Pathol 158: 1301-1311). MTSP-1 é essencial para a sobrevivência pós-natal; camundongos deficientes em MTSP-1 se desenvolveram até nascer, mas morreram logo em seguida e foram caracterizados pelo desenvolvimento aberrante da pele, implicando um papel para o MTSP-1 na função da barreira epitelial e epidérmica e como importante para o desenvolvimento normal da pele e do cabelo (List et al. (2002) Oncogene 23 (23): 2765-3779). A ablação pós-natal de MTSP-1 causou perda de formação de zona de oclusão e proteínas mal localizadas associadas à zona de oclusão em animais mutantes (List et al. (2009) Am J Pathology 175: 1453-1463), implicando MTSP-1 como essencial na manutenção de epitélio do rato. Também é relatado que o MTSP-1 promove a migração de células progenitoras neurais (Kendall et al., (2008) Stem Cells 26(6):1575-86).
[00227] O MTSP-1 é altamente expressado ou ativo nos cânceres de próstata, de mama, de pulmão, de ovário e colorretal e pode desempenhar um papel na metástase do câncer de mama e próstata. O MTSP-1 também pode ser identificado em vasos sanguíneos associados a tumores. O MTSP-1 também é expressado em uma variedade de tecidos epiteliais com altos níveis de atividade e/ou expressão no trato gastrointestinal humano e na próstata. A presença de MTSP-1 na superfície do tumor ou da célula epitelial permite a interação com vários fatores e a digestão proteolítica de uma ampla faixa de substratos.
[00228] O papel do MTSP-1 na migração celular na atividade tumoral pode induzir alterações no ambiente extracelular e nas células circundantes, contribuindo para a migração celular, progressão e metástase. Devido ao papel de MTSP-1 em doenças vasculares e câncer, os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção são alterados de modo a exibir seletividade reduzida em relação a essas proteínas. C. INIBIÇÃO DE COMPLEMENTO DIRECIONADA A C3
[00229] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem especificidade e/ou atividade aumentadas para uma sequência de clivagem inibitória na proteína C3 do complemento em comparação com os polipeptídeos MTSP-1 que não contêm as modificações de aminoácidos (por exemplo, MTSP-1 humano tipo selvagem (ver SEQ ID NO: 1) ou um MTSP-1 humano de comprimento completo de referência (ver, SEQ ID NO: 3) ou o domínio catalítico ou domínio da protease da mesma (ver SEQ ID NO: 2 ou 4)). Os polipeptídeos MTSP-1 de referência incluem a troca de C122S, por numeração de quimotripsina.
A troca por S no resíduo 122 não altera a especificidade ou a atividade em C3, mas reduz a agregação.
Uma vez que C3 está envolvido nas 3 vias de iniciação do complemento (ver, por exemplo, FIG. 1), o direcionamento de C3 por inibição proteolítica provê um alvo terapêutico geral e amplo para a inativação da cascata do complemento.
A clivagem de inativação de C3 bloqueia a atividade terminal do complemento, bem como o enovelamento de amplificação da via alternativa.
Todas as três vias convergem em C3 (veja, por exemplo, Figura 1). Em virtude da capacidade de inibir a ativação do complemento, esses polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser usados para tratar várias doenças, condições e patologias associadas à ativação do complemento, tais como respostas inflamatórias e doenças autoimunes.
A ativação do complemento é associada ao desenvolvimento de doenças e condições, promovendo inflamação local e danos aos tecidos causados em parte pela geração de moléculas efetoras e um complexo de ataque à membrana.
Em um exemplo, tal como em muitas doenças autoimunes, o complemento produz danos nos tecidos porque é ativado em circunstâncias inadequadas, tal como por anticorpo para os tecidos hospedeiros.
Em outras situações, o complemento pode ser ativado normalmente, tal como por septicemia, mas ainda contribui para a progressão da doença, tal como na síndrome do desconforto respiratório.
Patologicamente, o complemento pode causar danos substanciais aos vasos sanguíneos (vasculite), membrana basal dos rins e células endoteliais e epiteliais anexadas (nefrite), junta sinovial (artrite), e eritrócitos (hemólise) se não for adequadamente controlado. O papel do C3 na ativação do complemento é discutido em mais detalhes abaixo.
[00230] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados na presente invenção podem clivar C3. Por exemplo, uma única injeção intravenosa de variantes de MTSP-1 anti-C3 pode eliminar C3 do plasma in vivo; e de forma similar, uma única injeção intravítrea pode clivar todos os C3 presentes no humor vítreo. Como C3 é o primeiro componente da via de complemento comum necessária para a ativação do complemento por todas as três vias de “iniciação” (clássica, alterativa e lectina), a inativação/eliminação de C3 é funcionalmente relevante para todas as três vias de complemento.
1. Proteína C3 do Complemento e seu Papel na Iniciação do Complemento
[00231] O sistema do complemento envolve mais de 30 proteínas solúveis e ligadas à membrana celular que funcionam não apenas na resposta imune mediada por anticorpos, mas também na resposta imune inata para reconhecer e matar patógenos, tais como, bactérias, células infectadas por vírus e parasitas. A ativação do complemento é iniciada nas superfícies do patógeno através de três vias distintas: a via clássica, a via alternativa e a via da lectina. Essas vias são distintas, pois os componentes necessários para sua iniciação são diferentes, mas as vias geram o mesmo conjunto de moléculas efetoras (por exemplo, C3 convertases) que clivam a proteína C3 do complemento para desencadear a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) (ver, por exemplo, a Figura 1). Assim, a proteína C3 do complemento é um alvo atraente para uma terapia, uma vez que a modulação da C3 resulta na modulação de várias opsoninas, anafilatoxinas e MAC. Além disso, proteínas inibitórias de complemento de ocorrência natural, incluindo fator H (FH), CR1, receptor Ig de complemento (CR1g), DAF e MCP inibem no nível C3.
[00232] Existem três (3) vias de ativação do complemento (ver a Figura 1, que descreve essas vias). Os caminhos do complemento são distintos; cada um depende de diferentes moléculas e mecanismos de iniciação. As vias são semelhantes, pois convergem para gerar o mesmo conjunto de moléculas efetoras, isto é, C3 convertases. Nas vias clássica e de lectina, C4b2b atua como uma C3 convertase; na via alternativa, C3bBb é uma C3 convertase (ver a Tabela 5). A clivagem de C3 gera C3b, que atua como uma opsonina e como a principal molécula efetora do sistema do complemento para reações subsequentes ao complemento, e C3a, que é um mediador peptídico da inflamação. A adição de C3b a cada C3 convertase forma uma C5 convertase que gera C5a e C5b. C5a, como C3a, é um mediador peptídico da inflamação. C5b media os eventos “tardios” da ativação do complemento, iniciando a sequência de reações que culminam na geração do complexo de ataque à membrana (MAC). Embora as três vias produzam diferentes C3 e C5 convertases, todas as vias produzem os produtos divididos de C3 e C5 e formam MAC. Alternativamente, o C3 pode ser clivado e ativado por proteases extrínsecas, tais como enzimas lisossômicas e elastase (Markiewski e Lambris (2007) Am J Pathology 171: 715-727; Ricklin e Lambris (2007)
Nat Biotechnol 25: 1265-1275). Tabela 5. Cascatas do Complemento Via Alternativa Via Clássica Via de Lectina Ativadores Moléculas de IgM e IgG Patógenos superfície ligadas ao através do patogênicas antígeno; reconhecimento LPS, ácido moléculas não de carboidratos teicóico, imunes na superfície zimosan C3 convertase C3bBb C4b2b C4b2b C5 convertase C3bBb3b C4b2b3b C4b2b3b MAC C5678poly9 C5678poly9 C5678poly9 anafilatoxinas C3a, C5a C3a, C4a, C5a C3a, C4a, C5a a. Via clássica
[00233] C1q é o primeiro componente da via clássica do complemento. C1q é uma proteína de ligação dependente de cálcio associada à família de proteínas colectina devido a uma homologia estrutural geral compartilhada (Malhotra et al., (1994) Clin Exp Immunol. 97 (2): 4-9; Holmskov et al. (1994) Immunol Today 15 (2): 67-74). As colectinas, geralmente chamadas de moléculas de reconhecimento padrão, geralmente funcionam como opsoninas para direcionamento a patógenos para fagocitose por células imunes. Em contraste com as colectinas convencionais, tal como MBL, o domínio de reconhecimento globular carboxi-terminal de C1q não tem atividade de lectina, mas pode servir como uma molécula de reconhecimento padrão “carregada” devido a diferenças marcantes no potencial de superfície eletrostática de seus domínios globulares (Gaboriaud et al. (2003) J. Biol. Chem. 278 (47): 46974-46982).
[00234] C1q inicia a via clássica do complemento de duas maneiras diferentes. Primeiro, a via clássica é ativada pela interação de C1q com complexos imunes (isto é, complexos antígeno-anticorpo ou anticorpo IgG ou IgM agregado), ligando assim a resposta imune humoral mediada por anticorpos com ativação do complemento. Quando a porção Fab (a região variável) de IgM ou IgG se liga ao antígeno, a conformação da região Fc (constante) é alterada, permitindo que C1q se ligue. C1q deve ligar pelo menos 2 regiões Fc para ser ativado. C1q, no entanto, também é capaz de ativar o complemento na ausência de anticorpo, funcionando assim na resposta imune inata ou imediata à infecção. Além da iniciação por um anticorpo, a ativação do complemento também é obtida pela interação de C1q com moléculas não imunes, tais como poliânions (lipopolissacarídeos bacterianos, DNA e RNA), certos pequenos polissacarídeos, membranas virais, proteína C reativa (CRP), Componente amilóide P no soro (SAP) e componentes bacterianos, fúngicos e da membrana viral.
[00235] C1q faz parte do complexo C1 que contém uma única molécula C1q ligada a duas moléculas, cada um dos zimogênios C1r e C1s. A ligação de mais de um dos domínios globulares C1q a uma superfície alvo (tal como anticorpo ou patógeno agregado) causa uma mudança conformacional no complexo (C1r:C1s)2, que resulta na ativação da C1r protease para clivar C1s para gerar uma serina protease ativa. C1s ativos clivam os componentes subsequentes C4 e C2 do complemento para gerar C4b e C2b, que juntos formam a C3 convertase da via clássica. A C3 convertase cliva C3 em C3b, que se liga covalentemente à superfície do patógeno e atua como opsonina, e C3a, que estimula a inflamação. Algumas moléculas de C3b associam-se a complexos de C4b2b que produzem C4b2b3b, que é a C5 convertase em cascata clássica. A Tabela 6 resume as proteínas envolvidas na via clássica do complemento. Tabela 6. Proteínas da Via Clássica Componente Forma Função da Forma Ativa Nativo Ativa
Liga-se diretamente às superfícies do C1 C1q patógeno ou indiretamente ao anticorpo (C1q:(C1r: ligado a patógenos C1s)2) C1r Cliva C1s a uma protease ativa C1s Cliva C4 e C2 Liga-se ao patógeno e atua como C4b opsonina; liga C2 à clivagem por C1s C4 C4a Mediador peptídico da inflamação Enzima ativa da via clássica C3/C5 C2b convertase; cliva C3 e C5 C2 C2a Precursor de C2 quinina vasoativa Liga-se a superfícies de patógenos e atua como opsonina; inicia a amplificação através da via C3b C3 alternativa; liga C5 para clivagem por C2b C3a Mediador peptídico da inflamação b. Via Alternativa
[00236] A via alternativa é iniciada por patógenos estranhos na ausência de anticorpo. A iniciação do complemento pela via alternativa ocorre através da hidrólise espontânea de C3 em C3b. Uma pequena quantidade de C3b está sempre presente nos fluidos corporais, devido à atividade da protease no soro e no tecido. As autocélulas do hospedeiro normalmente contêm altos níveis de ácido siálico da membrana que inativam C3b se ele se ligar, mas as bactérias contêm baixos níveis externos de ácido siálico e, assim, se ligam a C3b sem inativá-lo. C3b nas superfícies de patógenos é reconhecido pelo Fator B de zimogênio da protease. O fator B é clivado pelo Fator D. O fator D é a única protease ativadora do sistema do complemento que circula como uma enzima ativa e não como um zimogênio, mas desde que o fator B é o somente substrato para Fator D, a presença de baixos níveis de uma protease ativa no soro normal é geralmente segura para o hospedeiro. A clivagem do Fator B pelo Fator D produz o produto ativo Bb que pode ser associado a C3b para formar C3bBb, a C3 convertase da via alternativa.
Semelhante à via clássica, a C3 convertase produz mais C3b e C3a a partir de C3. C3b liga-se covalentemente à superfície do patógeno e atua como opsonina e inicia adicionalmente a via alternativa, enquanto C3a estimula a inflamação. Alguns C3b se unem ao complexo para formar C3bBb3b, a via alternativa C5 convertase. O C3bBb3b é estabilizado pela proteína plasmática adequada ou pelo Fator P, que se liga às superfícies microbianas e estabiliza a convertase. A Tabela 7 resume as proteínas envolvidas na via alternativa do complemento. Tabela 7. Proteínas da Via Alternativa Componente Forma Função da forma ativa Nativo Ativa Liga-se à superfície do patógeno, liga C3 C3b o fator B à clivagem pelo fator D Pequeno fragmento do fator B, função Ba desconhecida Fator B Enzima ativa da C3 convertase e C5 Bb convertase A serina protease no plasma cliva o Fator D D fator B quando está ligada a C3b a Ba e Bb Proteínas no plasma com afinidade pela Fator P P C3bBb convertase em células (properdina) bacterianas; estabiliza convertase c. Via da Lectina
[00237] A via da lectina (também referida como a via MBL) é iniciada após o reconhecimento e a ligação de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs; isto é, porções de carboidratos) pelas proteínas da lectina. Exemplos de proteínas de lectina que ativam a via de complemento de lectina incluem a lectina de ligação à manose (MBL) e ficolinas (isto é, L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina). A MBL é um membro da família das proteínas colectina e, portanto, existe como um oligômero de subunidades compostas por cadeias polipeptídicas idênticas, cada uma das quais contém um domínio rico em cisteína, domínio semelhante a colágeno, um domínio de estrangulamento e um domínio de reconhecimento de carboidrato ou um domínio de lectina. A MBL atua como uma molécula de reconhecimento padrão para reconhecer porções de carboidratos, açúcares particularmente neutros, tal como manose ou N-acetilglucosamina (GlcNAc), na superfície de patógenos por meio de seu domínio globular de lectina de maneira dependente de cálcio. A MBL também atua como uma opsonina para facilitar a fagocitose de patógenos bacterianos, virais e fúngicos pelas células fagocíticas. Iniciadores adicionais da via da lectina incluem as ficolinas incluindo L-ficolina, M-ficolina e H-ficolina (ver, por exemplo, Liu et al. (2005) J Immunol. 175: 3150-3156). Semelhante à MBL, as ficolinas reconhecem porções de carboidratos, tais como, por exemplo, N-acetil-glucosamina e estruturas de manose.
[00238] A ativação da via alternativa por MBL ou ficolinas é análoga à ativação da via clássica por C1q, na qual uma única molécula de lectina interage com dois zimogênios de protease. No caso das proteínas da lectina, os zimogênios são serina proteases associadas às MBL, MASP-1 e MASP-2, que são intimamente homólogos aos zimogênios C1r e C1s da via clássica. Após o reconhecimento de um PAMP por uma proteína lectina, tal como por exemplo, a ligação a uma superfície patogênica, MASP-1 e o MASP-2 são ativadas para clivar C4 e C2 para formar a cascata de MBL C3 convertase. C3b junta-se ao complexo para formar a C5 convertase de cascata de MBL. A ativação da MASP é implicada não apenas nas respostas aos microrganismos, mas em qualquer resposta que envolva a exposição de açúcares neutros, incluindo mas não se limitando a, lesões nos tecidos, tal como a observada nos transplantes de órgãos. Como a cascata alternativa, a cascata de MBL é ativada independentemente do anticorpo; como a cascata clássica, a cascata de MBL utiliza C4 e C2 para formar C3 convertase. A tabela 8 resume as proteínas envolvidas na via da lectina do complemento. Tabela 8. Proteínas da Via de Lectina Componente Forma Ativa Função da Forma Ativa Nativo Reconhece PAMPs, tais como em superfícies de patógenos (por
MBL MBL exemplo, via reconhecimento de carboidratos) L-Ficolina; Reconhece PAMPs, como em M- Ficolina, superfícies de patógenos (por Ficolinas ou H- exemplo, via reconhecimento de Ficolina carboidratos) MASP-1 MASP-1 Cliva C4 e C2 MASP-2 MASP-2 Cliva C4 e C2 d. Funções Efetoras Mediadas por Complemento
[00239] Independentemente de qual via de iniciação é usada, o resultado final é a formação de fragmentos ativados de proteínas do complemento (por exemplo, anafilatoxinas C3a, C4a e C5a e complexos de ataque à membrana C5b-9), que atuam como moléculas efetoras para mediar diversas funções efetoras. O reconhecimento de moléculas efetoras de complemento por células para o início de funções efetoras (por exemplo, quimiotaxia e opsonização) é mediado por um grupo diversificado de receptores de complemento. Os receptores do complemento estão distribuídos em uma ampla faixa de tipos de células, incluindo eritrócitos, macrófagos, células B, neutrófilos e mastócitos. Após a ligação de um componente do complemento ao receptor, os receptores iniciam uma cascata de sinalização intracelular, resultando em respostas celulares, tal como estimular a fagocitose de bactérias e secretar moléculas inflamatórias da célula. Por exemplo, os receptores de complemento CR1 e CR2 que reconhecem C3b, C4b e seus produtos são importantes para estimular a quimiotaxia. CR3 (CD11b/CD18) e CR4 (CD11c/CD18) são integrinas que são igualmente importantes nas respostas fagocíticas, mas também desempenham um papel na adesão e migração de leucócitos em resposta a iC3b. Os receptores C5a e C3a são receptores acoplados à proteína G que desempenham um papel em muitas das funções mediadas por pró-inflamatórios das anafilatoxinas C5a e C3a. Por exemplo, os receptores para C3a, C3aR existem nos mastócitos, eosinófilos, neutrófilos, basófilos e monócitos e estão diretamente envolvidos nos efeitos pró-inflamatórios da C3a.
[00240] Assim, por meio de receptores de complemento, esses fragmentos de moléculas efetoras do complemento mediam várias funções, incluindo quimiotaxia de leucócitos, ativação de macrófagos, permeabilidade vascular e lise celular (Frank, M. e Fries, L. Complement. In Paul, W. (ed.) Fundamental Immunology, Raven Press, 1989). Um resumo de algumas funções efetoras de produtos complementares é listado na Tabela 9. Tabela 9: Moléculas Efetora do Complemento e Funções Produto Atividade C2b (proquinina) acúmulo de fluido corporal C3a degranulação de basófilos e mastócitos; (anafilatoxina) permeabilidade vascular intensificada; contração do músculo liso; Indução de células T supressoras C3b e seus opsonização; ativação de fagócito produtos C4a ativação de basófilos e mastócitos; contração do (anafilatoxina) músculo liso; permeabilidade vascular intensificada C4b opsonização C5a ativação de basófilos e mastócitos; permeabilidade (anafilatoxina; vascular intensificada; contração do músculo liso; fator quimiotaxia; agregação de neutrófilos; estimulação quimiotático) do metabolismo oxidativo; estimulação da liberação de leucotrieno; indução de células T auxiliares C5b67 quimiotaxia; ligação a outras membranas celulares e lise das células espectadoras C5b6789 (C5b-9) lise de células alvo i. Lise Mediada por Complemento: Complexo de Ataque à Membrana
[00241] A etapa final da cascata do complemento pelas três vias é a formação do complexo de ataque à membrana (MAC) (Figura 1). C5 pode ser clivado por qualquer C5 convertase em C5a e C5b. C5b combina-se com C6 e C7 em solução, e o complexo C5b67 se associa à membrana lipídica do patógeno por meio de sítios hidrofóbicos em C7. C8 e várias moléculas de C9, que também possuem sítios hidrofóbicos, se juntam para formar o complexo de ataque à membrana, também chamado C5b6789 ou C5b-9. C5b-9 forma um poro na membrana através da qual a água e os solutos podem passar, resultando em lise osmótica e morte celular. Se o complemento for ativado em um antígeno sem uma membrana lipídica à qual o C5b67 possa se afixar, o complexo C5b67 poderá se ligar a células próximas e iniciar a lise espectadora. Um único MAC pode lisar um eritrócito, mas as células nucleadas podem endocitar o MAC e reparar o dano, a menos que vários MACs estejam presentes. As bactérias gram-negativas, com sua membrana externa exposta e vírus envolvidos, geralmente são suscetíveis à lise mediada por complemento. Menos suscetíveis são bactérias Gram-positivas, cuja membrana plasmática é protegida por sua espessa camada de peptidoglicano, bactérias com uma cápsula ou camada de lodo em torno de sua parede celular, ou vírus que não possuem envelope lipídico. Da mesma forma, o MAC pode ser interrompido por proteínas que se ligam ao complexo antes da inserção da membrana, tal como o inibidor de estreptococos do complemento (SIC) e clusterina. Tipicamente, o MAC ajuda a destruir bactérias gram-negativas, bem como células humanas que exibem antígenos estranhos (células infectadas por vírus, células tumorais etc.) causando sua lise, e também podem danificar o envelope de vírus envolvidos. ii. Inflamação
[00242] A inflamação é um processo no qual os vasos sanguíneos se dilatam e se tornam mais permeáveis, permitindo assim que as células de defesa do corpo e os produtos químicos de defesa saiam do sangue e entrem nos tecidos. A ativação do complemento resulta na formação de vários mediadores pró-inflamatórios, tais como C3a, C4a e C5a. As anafilatoxinas intactas no soro ou no plasma são rapidamente convertidas nas formas C3a-desArg, C4a-desArg ou C5a-desArg mais estáveis e menos ativas, pela carboxipeptidase N. C3a, C4a e C5a e, em menor grau, seus derivados desArg, são polipeptídeos bioativos potentes, denominados anafilatoxinas devido à sua atividade inflamatória. As anafilatoxinas se ligam a receptores em vários tipos de células para estimular a contração do músculo liso, aumentar a permeabilidade vascular, e ativar mastócitos para liberar mediadores inflamatórios. C5a, a anafilatoxina mais potente, atua principalmente nos glóbulos brancos, particularmente nos neutrófilos. C5a estimula a aderência de leucócitos às paredes dos vasos sanguíneos no sítio da infecção, estimulando a expressão aumentada de moléculas de adesão, de modo que os leucócitos possam espremer para fora dos vasos sanguíneos e para dentro dos tecidos, um processo chamado diapedese. C5a também estimula os neutrófilos a produzir espécies reativas de oxigênio para morte extracelular,
enzimas proteolíticas e leucotrienos. C5a também pode amplificar adicionalmente o processo inflamatório indiretamente, induzindo a produção de quimiocinas, citocinas e outros mediadores pró-inflamatórios. C5a também interage com mastócitos para liberar vasodilatadores, tal como histamina, de modo que os vasos sanguíneos se tornem mais permeáveis. O C3a também interage com os glóbulos brancos, com efeitos importantes nos eosinófilos, indicando um papel para C3a na inflamação alérgica. C3a induz contração muscular lisa, intensifica a permeabilidade vascular, e causa degranulação de basófilos e liberação de histamina e outras substâncias vasoativas. C2a pode ser convertido em quinina C2, que regula a pressão sanguínea, causando a dilatação dos vasos sanguíneos.
[00243] Embora tecnicamente não seja considerado uma anafilatoxina, o iC3b, um derivado inativo do C3b, funciona para induzir a adesão de leucócitos ao endotélio vascular e induzir a produção da citocina pró-inflamatória IL-1 via ligação aos seus receptores de integrina da superfície celular. C5b-9 também indiretamente estimula a adesão, a ativação e a quimiotaxia de leucócitos, induzindo a expressão de moléculas de adesão celular, tal como E-selectina, e induzindo a secreção de interleucina-8 (Bhole et al. (2003) Crit Care Med 31(1):97-104). O C5b-9 também estimula a liberação de mediadores secundários que contribuem para a inflamação, tais como, por exemplo, prostaglandina E2, leucotrieno B4 e tromboxano.
[00244] A conversão dos componentes do complemento humano C3 e C5 para produzir seus respectivos produtos de anafilatoxina foi implicada em certos estados patológicos de ocorrência natural, incluindo: distúrbios autoimunes, tal como, lupus eritematoso sistêmico, artrite reumatoide, malignidade, infarto do miocárdio, retinopatia de Purtscher, sepse e síndrome da dificuldade respiratória do adulto. Além disso, níveis aumentados de circulação de C3a e C5a foram detectados em certas condições associadas à ativação iatrogênica do complemento, tais como: cirurgia de circulação extracorpórea, diálise renal e leucoforese em fibra de náilon. iii. Quimiotaxia
[00245] A quimiotaxia é um processo pelo qual as células são direcionadas a migrar em resposta a substâncias químicas em seu ambiente. Na resposta imune, uma variedade de quimiocinas direciona o movimento das células, tais como as células fagocíticas, para os sítios de infecção. Por exemplo, C5a é o principal fator quimiotático para neutrófilos em circulação, mas também pode induzir quimiotaxia de monócitos. Os fagócitos avançam em direção a concentrações crescentes de C5a e subsequentemente se ligam, por meio de seus receptores CR1, às moléculas de C3b ligadas ao antígeno. O efeito quimiotático de C5a, observado com basófilos, eosinófilos, neutrófilos e fagócitos mononucleares, é ativo em concentrações tão baixas quanto 10-10 M. iv. Opsonização
[00246] Uma ação importante do complemento é facilitar a captação e destruição de patógenos pelas células fagocíticas. Isto ocorre por um processo denominado opsonização, pelo qual os componentes do complemento ligados às bactérias alvo interagem com os receptores do complemento na superfície das células fagocíticas, tais como neutrófilos ou macrófagos. Neste caso, as moléculas efetoras do complemento são denominadas opsoninas. A oponização de patógenos é uma das principais funções de C3b e C4b. iC3b também funciona como opsonina. C3a e C5a aumentam a expressão de receptores C3b nos fagócitos e aumentam sua atividade metabólica.
[00247] C3b e, em menor grau, C4b ajudam a remover complexos imunes prejudiciais do corpo. C3b e C4b ligam os complexos imunes aos receptores CR1 nos eritrócitos. Os eritrócitos dispensam os complexos aos macrófagos fixos no baço e no fígado para destruição. Complexos imunológicos podem levar a uma hipersensibilidade prejudicial Tipo III. v. Ativação da Resposta Imune Humoral
[00248] A ativação das células B requer a ligação do receptor de células B (BCR) pelo antígeno. Foi demonstrado, no entanto, que o complemento desempenha um papel na redução do limiar para respostas de células B ao antígeno em até 1000 vezes. Isso ocorre pela ligação de C3d ou C3dg, produtos complementares gerados a partir dos fragmentos de decomposição de C3, a receptores CR2 nos linfócitos B que podem se coligar a BCR. A coligação ocorre quando partículas antigênicas, tais como, por exemplo, complexos imunológicos, opsonizados com C3d se ligam ao receptor CR2 via C3d, bem como ao BCR através do antígeno. A coligação de complexos de antígenos também pode ocorrer quando C3d se liga a antígenos, intensificando sua captação por células apresentadoras de antígenos, tais como células dendríticas, que podem apresentar o antígeno às células B para intensificar a resposta do anticorpo. Os camundongos deficientes em CR2 apresentam defeitos na função das células B que resultam em níveis reduzidos de anticorpos naturais e respostas imunológicas humorais prejudicadas.
2. Estrutura e Função C3
[00249] Os polipeptídeos MTSP-1 variantes providos na presente invenção clivam a proteína C3 do complemento ou seus fragmentos proteolíticos, inibindo desse modo o complemento. A proteína C3 do complemento humana (Nº de Acesso Uniprot P01024) é uma pré-pró-proteína de cadeia única de 1663 aminoácidos tendo uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 9. A proteína é codificada por um gene de 41 kb localizado no cromossomo 19 (sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 10). A pré-pró- proteína contém um peptídeo sinal de 22 aminoácidos (aminoácidos 1-22 da SEQ ID NO: 9) e uma sequência de tetra- arginina (aminoácidos 668-671 da SEQ ID NO: 9) que é removida por uma enzima semelhante a furina que resulta na formação de uma proteína madura de duas cadeias contendo uma cadeia beta (aminoácidos 23-667 da SEQ ID NO: 9) e uma cadeia alfa (aminoácidos 672-1663 da SEQ ID NO: 9), que são ligadas por uma ligação dissulfeto intercadeia entre os resíduos de aminoácidos Cys559 e Cys816. A proteína madura de 2 cadeias tem uma sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:
16.
[00250] Durante a cascata do complemento, a proteína C3 do complemento é posteriormente processada por clivagem proteolítica para formar vários fragmentos proteolíticos C3. Como descrito acima, todas as três vias de iniciação do complemento convergem nas C3 convertases C4b2b e C3bBb. As C3 convertases clivam C3 entre os resíduos 748 e 749 da SEQ ID NO: 9 (ver Tabela 10 abaixo) gerando a anafilatoxina C3a
(aminoácidos 672-748 da SEQ ID NO: 9) e a opsonina C3b (cadeia C3b alfa’; aminoácidos 749-1663 da SEQ ID NO: 9). C3a está envolvido na inflamação e C3b forma as C5 convertases, levando à anafilatoxina C5a e ao MAC. Os polipeptídeos MTSP-1 variantes providos na presente invenção inibem o complemento e, como tal, não clivam C3 neste sítio de clivagem GLAR.
[00251] C3b possui sítios de ligação para vários componentes do complemento, incluindo C5, properdina (P), fatores H, B e I, receptor 1 do complemento (CR1) e a proteína do cofator de membrana (MCP) (ver Sahu e Lambris (2001) Immunological Reviews 180: 35-48). A ligação do fator I, uma protease plasmática, na presença dos cofatores H, CR1 e MCP resulta na inativação de C3b, enquanto a ligação dos fatores B e P na presença do fator D resulta na amplificação da C3 convertase e no início de MAC. O fator I cliva C3b na presença de cofatores entre os resíduos 1303-1304, 1320-1321 e 954- 955 da SEQ ID NO: 9 (ver Tabela 10 abaixo) gerando fragmentos iC3b (aminoácidos 749-1303 da SEQ ID NO: 9) e C3f (aminoácidos 1304-1320 de SEQ ID NO: 9). O fator I subsequentemente cliva o iC3b, gerando C3c (fragmento 1 da cadeia C3c alfa’; aminoácidos 749-954 da SEQ ID NO: 9) e C3dg (aminoácidos 955-1303 da SEQ ID NO: 9). O resultado final é que C3b é permanentemente inativado (ver Sahu e Lambris (2001) Immunological Reviews 180: 35-48). Uma vez que o fator I inativa C3b, os sítios de clivagem do fator I são candidatos ideais à clivagem pelos polipeptídeos MTSP-1 variantes providos na presente invenção. Fragmentos proteolíticos C3b adicionais incluem C3g (aminoácidos 955- 1001 da SEQ ID NO: 9), C3d (aminoácidos 1002-1303 da SEQ ID
NO: 9) e fragmento 2 da cadeia alfa’ C3c (aminoácidos 1321- 1663 da SEQ ID NO: 9). As sequências de clivagem na proteína C3 do complemento são apresentadas na Tabela 10 abaixo, que lista os resíduos de P4-P1, os resíduos de aminoácidos do sítio de clivagem (local de P1-P1’) e a protease responsável pela clivagem. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção não clivam nesses locais. TABELA 10: Sequências de Clivagem da Proteína C3 do Complemento Sítio de Resíduos P4-P1 Clivagem Protease SEQ ID NO (in SEQ ID NO:9) GLAR 748-749 C3 convertase 17 RLGR 954-955 Fator I 18 LPSR 1303-1304 Fator I 19 SLLR 1320-1321 Fator I 20 a. C3a
[00252] C3a (aminoácidos 672-748 da SEQ ID NO: 9) é uma anafilatoxina que está envolvida na inflamação, degranulação de basófilos e mastócitos, permeabilidade vascular intensificada, contração do músculo liso e indução de células T supressoras. b. C3b
[00253] C3b (aminoácidos 749-1663 da SEQ ID NO: 9) tem vários papéis na cascata do complemento. C3b é uma opsonina que facilita a captação e a destruição de patógenos pelas células fagocíticas. Adicionalmente, C3b combina-se com as C3 convertases para gerar as C5 convertases que ativam a proteína C5 do complemento, gerando assim a anafilatoxina C5a e C5b, que combina com C6, C7, C8 e C9 para formar o complexo de ataque à membrana. Além disso, como descrito na seção 1b acima, C3b está envolvido na via alternativa de iniciação do complemento. O C3b é regulado pelo Fator I de proteína reguladora do complemento, uma protease plasmática que degrada o C3b em vários fragmentos, incluindo iC3b, C3c, C3d, C3f e C3dg, inativando permanentemente o C3b.
[00254] C3b desempenha um papel crítico nas funções efetoras mediadas por complemento em virtude de sua capacidade de se ligar às C3 convertases C4b2b e C3bBb, gerando assim as C5 convertases C4b2b3b e C3bBb3b. As C5 convertases clivam o zimogênio C5 em fragmentos ativos dos mesmos, ou seja, a anafilatoxina C5a e C5b. C5a está envolvido em quimiotaxia e inflamação e C5b está envolvido na formação de MAC. i. Inibidores de C3b
[00255] C3b tem sítios de ligação para vários componentes do complemento, incluindo C5, properdina (P), fatores H, B e I, receptor 1 do complemento (CR1) e a proteína do cofator de membrana (MCP) (ver Sahu e Lambris (2001) Immunological Reviews 180: 35-48). A ligação do fator I, uma protease plasmática, na presença dos cofatores H, CR1 e MCP resulta na inativação de C3b, enquanto a ligação dos fatores B e P na presença do fator D resulta na amplificação da C3 convertase e no início do MAC. O fator I cliva C3b na presença de cofatores entre os resíduos 1303-1304, 1320-1321 e 954- 955 da SEQ ID NO: 9 gerando fragmentos iC3b (aminoácidos 749-1303 da SEQ ID NO: 9) e C3f (aminoácidos 1304 -1320 da SEQ ID NO: 9). Embora tecnicamente não seja considerado uma anafilatoxina, o iC3b, um derivado inativo do C3b, funciona para induzir a adesão de leucócitos ao endotélio vascular e induzir a produção da citocina pró-inflamatória IL-1 via ligação aos seus receptores de integrina da superfície celular. Adicionalmente, o iC3b funciona como uma opsonina. O fator I subsequentemente cliva os fragmentos C3c geradores de iC3b (fragmento 1 da cadeia alfa’ C3c: aminoácidos 749- 954 da SEQ ID NO: 9 e fragmento 2 da cadeia alfa’ C3c: aminoácidos 1321-1663 da SEQ ID NO: 9) e C3dg (aminoácidos 955-1303 da SEQ ID NO: 9). O resultado final é que C3b é permanentemente inativado (ver Sahu e Lambris (2001) Immunological Reviews 180: 35-48). C3dg pode ser clivado adicionalmente para gerar os fragmentos C3g (aminoácidos 955-1001 da SEQ ID NO: 9) e C3d (aminoácidos 1002-1303 da SEQ ID NO: 9). D. POLIPEPTÍDEOS MTSP-1 MODIFICADOS QUE CLIVAM C3
[00256] São providos na presente invenção polipeptídeos de serina-protease 1 tipo membrana (MTSP-1) modificada ou variante. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem atividades ou propriedades alteradas em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem, nativo ou de referência. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção contêm modificações em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem, nativo ou de referência apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-4, ou em um polipeptídeo que tenha pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, particularmente pelo menos 95%, identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-4, tal como o domínio da protease MTSP-1 de referência apresentado na SEQ ID NO: 4. Incluídos entre os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção estão os polipeptídeos MTSP-1 que alteram (inibem) a ativação do complemento efetuando a clivagem inibitória da proteína C3 do complemento. Entre os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção estão aqueles que afetam a clivagem inibitória da proteína C3 do complemento. Estão incluídos aqueles que efetuam a clivagem inibitória de C3 com maior atividade ou especificidade, kcat/Km, em comparação com uma forma correspondente do MTSP-1 que não contém a modificação (troca, eliminação e/ou inserção) ou em comparação com a forma correspondente de MTSP-1 não modificado cujas sequências são apresentadas em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados também podem ter especificidade e/ou seletividade diminuídas para substratos e alvos clivados ou reconhecidos por MTSP-1 não modificada em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 que não contém a(s) modificação(ões) de aminoácidos, tal como, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA) e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF).
[00257] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção inibem ou inativam o complemento através da clivagem inibitória ou de inativação da proteína C3 do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção inibem ou inativam o complemento por clivagem da proteína C3 do complemento em um sítio de clivagem que resulta em inibição ou inativação de C3. A clivagem por inativação ou inibição da proteína C3 do complemento pode estar em qualquer sequência em C3, desde que a clivagem resultante de C3 resulte em inativação ou inibição da ativação do complemento. Uma vez que os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção inibem a ativação do complemento, os polipeptídeos MTSP-1 modificados não efetuam a clivagem da forma zimogênica de C3 para gerar os fragmentos C3a e C3b ativados. Assim, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção não clivam C3 entre os resíduos 748-749 da SEQ ID NO: 9, o que resultaria na geração de C3a e C3b. Os sítios de clivagem por inibição ou inativação da proteína C3 do complemento podem ser determinados ou identificados empiricamente. Se necessário, um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção pode ser testado quanto à sua capacidade de inibir o complemento como descrito na seção E abaixo e como exemplificado nos Exemplos.
[00258] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são domínios de protease isolados de MTSP-
1. Também são contempladas porções menores que retêm a atividade da protease. Os domínios de protease providos na presente invenção são polipeptídeos de cadeia única com um terminal N gerado no sítio de clivagem (geralmente tendo a sequência de consenso R↓VVGG, R↓IVGG, R↓IVNG, R↓ILGG, R↓VGLL, R↓ILGG ou uma variação do mesmo; um terminal R↓V ou R↓I, onde a seta representa o ponto de clivagem) quando o zimogênio é ativado.
[00259] Os domínios de protease gerados na presente invenção, no entanto, não resultam da ativação, que produz um produto ativado de duas cadeias, mas são polipeptídeos de cadeia única com o terminal N que incluem a sequência de consenso ↓VVGG, ↓IVGG, ↓VGLL, ↓ILGG ou ↓IVNG ou outro motivo semelhante no terminal N. Como mostrado na presente invenção, esses polipeptídeos, embora não sejam resultado da ativação e não de formas de cadeia dupla, exibem atividade proteolítica (catalítica). Esses polipeptídeos do domínio da protease são usados em ensaios para triar agentes que modulam a atividade do MT-SP. Tais ensaios também são providos na presente invenção. Em ensaios de exemplo, são avaliados os efeitos dos compostos de teste na capacidade dos domínios de uma protease de clivar proteoliticamente um substrato conhecido, tipicamente um substrato rotulado com fluorescência, cromogenicamente ou de outro modo detectável. Agentes, geralmente compostos, particularmente moléculas pequenas, que modulam a atividade do domínio da protease são compostos candidatos para modular a atividade do MT-SP. Os domínios de protease também podem ser usados para produzir anticorpos específicos de protease de cadeia única. Os domínios de protease providos na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, a região de cadeia única tendo um terminal N no sítio de clivagem para a ativação do zimogênio, através do terminal C ou porções truncadas no terminal C que exibem atividade proteolítica como um polipeptídeo de cadeia única em ensaios proteolíticos in vitro, de qualquer membro da família MT-SP, de preferência de um mamífero, incluindo e mais de preferência humano, tal como, por exemplo, MTSP-
1.
[00260] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são mutantes do domínio da protease de cadeia única do MTSP-1, particularmente polipeptídeos MTSP- 1 modificados nos quais o resíduo Cys no domínio da protease é livre (isto é, não forma ligações dissulfeto com nenhum outro resíduo Cys na proteína) é substituído por outra substituição de aminoácidos, de preferência por uma substituição conservadora de aminoácidos ou por uma substituição que não elimine a atividade, tal como, por exemplo, a substituição com Serina, e os polipeptídeos MTSP-
1 modificados nos quais os sítios de glicosilação são eliminados. Também são contemplados polipeptídeos MTSP-1 modificados nos quais outras substituições conservadoras de aminoácidos em que a atividade catalítica é retida (ver, por exemplo, Tabela 3, para substituições de aminoácidos de exemplo).
[00261] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção catalisam a clivagem inibitória ou de inativação da proteína C3 do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção clivam a proteína C3 do complemento em qualquer sequência de clivagem, desde que os fragmentos C3 resultantes estejam inativos ou incapazes de ativar uma função efetora mediada por complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção incluem aqueles que possuem especificidade e/ou seletividade alteradas (isto é, diminuídas) para alvos naturais de MTSP-1. Em um exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção têm seletividade reduzida para PAR-2, uPA e/ou HGF. Em outros exemplos, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção têm especificidade aumentada para a clivagem da proteína C3 do complemento e especificidade reduzida para PAR-2, uPA e/ou HGF.
[00262] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção contêm uma ou mais modificação(ões) de aminoácidos, de modo que clivam a proteína C3 do complemento de uma maneira que resulta na inativação ou inibição do complemento. As modificações podem ser uma única modificação de aminoácido, tais como, trocas únicas de aminoácidos (substituições), inserções ou eliminações, ou múltiplas modificações de aminoácidos, tais como múltiplas trocas, inserções ou eliminações de aminoácidos. Modificações de exemplo são trocas de aminoácidos, incluindo trocas de aminoácidos únicas ou múltiplas. A troca de aminoácidos pode ser uma substituição conservadora, como apresentado na Tabela 3, ou uma substituição não conservadora, como qualquer descrito na presente invenção. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem conter pelo menos ou 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais posições modificadas em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 que não contém a modificação.
[00263] As modificações descritas na presente invenção podem ser preparadas em qualquer polipeptídeo MTSP-1. Por exemplo, as modificações são preparadas em um polipeptídeo MTSP-1 humano tendo uma sequência de aminoácidos incluindo ou apresentado nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4; um polipeptídeo MTSP-1 de camundongo tendo uma sequência de aminoácidos incluindo ou apresentado na SEQ ID NO: 12; ou um polipeptídeo MTSP-1 de rato tendo uma sequência de aminoácidos incluindo ou apresentado na SEQ ID NO: 13; ou em variantes de sequência ou fragmentos cataliticamente ativos que exibem pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-4, 12 e 13.
[00264] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser modificados em qualquer região ou domínio de um polipeptídeo MTSP-1 provido na presente invenção, desde que o polipeptídeo MTSP-1 modificado retenha sua capacidade de efetuar a inativação ou clivagem inibitória da proteína C3 do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser polipeptídeos de cadeia única ou de duas cadeias, variantes de espécies, variantes de splicing, variantes alélicas, isoformas ou fragmentos cataliticamente ativos dos mesmos, tais como, por exemplo, o domínio da protease dos mesmos. Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção podem ser polipeptídeos MTSP-1 truncados ou de comprimento completo. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser o domínio da protease MTSP-1 ou uma forma modificada do domínio da protease MTSP-1. Também são contemplados para uso na presente invenção o zimogênio, precursor ou formas maduras de polipeptídeos MTSP-1 modificados, desde que os polipeptídeos MTSP-1 mantenham sua capacidade de efetuar clivagem inibitória ou de inativação da proteína C3 do complemento. Modificações em um polipeptídeo MTSP-1 também podem ser preparadas em um polipeptídeo MTSP-1 que também contém outras modificações, incluindo modificações da sequência primária e modificações que não estão na sequência primária do polipeptídeo. Por exemplo, as modificações descritas na presente invenção podem estar em um polipeptídeo MTSP-1 que é um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo quimérico. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção também incluem polipeptídeos que são conjugados com um polímero, tal como um reagente de PEG.
[00265] Para finalidades na presente invenção, a referência a posições e aminoácidos para modificação, incluindo troca ou trocas de aminoácidos, é feita referência na presente invenção ao polipeptídeo MTSP-1 apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Está dentro do nível de um técnico no assunto fazer qualquer uma das modificações providas na presente invenção em outro polipeptídeo MTSP-1, identificando o resíduo de aminoácido correspondente em outro polipeptídeo MTSP-1, tal como polipeptídeo MTSP-1 apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4 ou uma variante do mesmo que exiba pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com um polipeptídeo MTSP-1 apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. As posições correspondentes em outro polipeptídeo MTSP-1 podem ser identificadas pelo alinhamento do polipeptídeo MTSP-1 com a referência de um polipeptídeo MTSP- 1 apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Para finalidades de modificação (por exemplo, troca de aminoácidos), o resíduo de aminoácido correspondente pode ser qualquer resíduo de aminoácido, e não precisa ser idêntico ao resíduo apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Tipicamente, o resíduo de aminoácido correspondente identificado por alinhamento com, por exemplo, resíduos na SEQ ID NO: 4 é um resíduo de aminoácidos que é idêntico à SEQ ID NO: 4, ou é um resíduo de aminoácido conservador ou semiconservador.
Entende-se também que as trocas de exemplo providas na presente invenção podem ser preparadas no resíduo correspondente em um polipeptídeo MTSP-1, tal como o domínio da protease MTSP-1, desde que a troca seja diferente da existente na forma não modificada ou de referência do polipeptídeo MTSP-1, tal como o domínio da protease MTSP-1. Com base nesta descrição e na descrição em outras partes da presente invenção, está dentro do nível de um técnico no assunto gerar um polipeptídeo MTSP-1 modificado contendo uma ou mais das mutações descritas, e testar cada uma para uma propriedade ou atividade, como descrito na presente invenção.
[00266] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção alteram a atividade do complemento por inibição mediada por proteólise ou inativação da proteína C3 do complemento. O MTSP-1 modificado provido na presente invenção pode ter especificidade reduzida para um substrato de MTSP-1, tal como, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem menos que 100% da atividade tipo selvagem de um polipeptídeo MTSP-1 para clivagem do receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA), e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF), tais como menos que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos que a atividade de clivagem do receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF) de um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem ou de referência, tal como o polipeptídeo correspondente que não contém a modificação de aminoácidos. Em outro exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem menos que 100% da atividade de ligação tipo selvagem de um polipeptídeo MTSP-1 para PAR-2, uPA e/ou HGF, tais como menos que 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou menos que a atividade de ligação a PAR-2, uPA e/ou HGF de um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem ou de referência, tal como polipeptídeo correspondente que não contém a modificação de aminoácidos.
[00267] Também são providas na presente invenção moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Também são providas moléculas de ácido nucleico que codificam um domínio da protease de cadeia única ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo. Em alguns exemplos, as moléculas de ácido nucleico codificadoras também podem ser modificadas para conter uma sequência sinal heteróloga para alterar (por exemplo, aumentar) a expressão e secreção do polipeptídeo. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados e moléculas de ácido nucleico codificadoras providos na presente invenção podem ser produzidos ou isolados por qualquer método conhecido na técnica, incluindo isolamento de fontes naturais, isolamento de proteínas produzidas de forma recombinante em células, tecidos e organismos, e por métodos recombinantes e por métodos incluindo etapas in silico, métodos sintéticos e quaisquer métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Os polipeptídeos modificados e moléculas de ácido nucleico codificadoras provido(a)s na presente invenção podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante padrão conhecidas por um técnico no assunto. Qualquer método conhecido na técnica para efetuar a mutação de qualquer um ou mais aminoácido(s) em uma proteína alvo pode ser empregado. Os métodos incluem mutagênese direcionada ao sítio ou aleatória padrão de moléculas de ácido nucleico codificadoras, ou métodos de síntese de polipeptídeos em fase sólida. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo MTSP-1 podem ser submetidas à mutagênese, tal como mutagênese aleatória do ácido nucleico de codificação, PCR propensa a erros, mutagênese direcionada ao sítio, PCR de sobreposição, embaralhamento de genes ou outros métodos recombinantes. O ácido nucleico que codifica os polipeptídeos pode então ser introduzido em uma célula hospedeira para ser expressado heterologicamente. Portanto, também são providas na presente invenção moléculas de ácido nucleico que codificam qualquer um dos polipeptídeos modificados providos na presente invenção. Em alguns exemplos, os polipeptídeos MTSP-1 modificados são produzidos sinteticamente, tal como o uso de síntese de peptídeos em fase sólida ou em fase de soluções.
[00268] Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção foram modificados para ter especificidade e/ou seletividade aumentadas para a clivagem de uma sequência de clivagem inibitória ou de inativação da proteína C3 do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser modificados usando qualquer método conhecido na técnica para modificação de proteínas. Tais métodos incluem mutagênese aleatória e direcionada ao sítio. Ensaios, tais como, ensaios para a função biológica de ativação do complemento providos na presente invenção e conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar a função biológica de um polipeptídeo MTSP-1 modificado para determinar se o polipeptídeo MTSP-1 modificado tem como alvo a proteína C3 do complemento para clivagem e inativação. Métodos de exemplo para identificar um polipeptídeo MTSP-1 e os polipeptídeos MTSP-1 modificados são providos na presente invenção.
1. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados de Exemplo
[00269] São providos na presente invenção os polipeptídeos MTSP-1 modificados que contêm mais um, incluindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 e mais modificações de aminoácidos em um polipeptídeo MTSP-1 e que clivam a proteína C3 do complemento, de modo que o complemento seja inibido ou inativado. As modificações estão na sequência primária de aminoácidos e incluem trocas, eliminações e inserções de resíduos de aminoácidos. A modificação altera a especificidade/atividade do polipeptídeo MTSP-1. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados na presente invenção são projetados ou selecionados para reconhecer e clivar um sítio alvo em uma proteína do complemento, particularmente C3 em um sítio que inativa C3. Eles também podem ser modificados e triados para ter especificidade/atividade reduzida em substratos naturais in vivo e/ou clivar esses substratos menos que um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem não modificado. Eles podem ser selecionados e identificados por qualquer método de triagem de protease adequado. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados inicialmente na presente invenção foram identificados usando o método de triagem descrito na Patente US N° 8.211.428, na qual uma biblioteca de proteases modificadas é reagida com um cognato ou outra serpina inibitória, tal como ATIII que é modificado para incluir uma sequência alvo no enovelamento do sítio reativo para capturar proteases modificadas que clivariam esse alvo.
[00270] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem atividade ou especificidade aumentada ou kcat/Km para a proteína C3 do complemento em um sítio que inativa C3, e também podem ter atividade ou especificidade reduzida e/ou exibir seletividade, especificidade e/ou atividade aumentada(s) para um sítio alvo na proteína C3 do complemento, em que o polipeptídeo MTSP-1 modificado inativa C3. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados exibem atividade aumentada para clivar e inativar C3 em comparação com a forma correspondente de tipo selvagem ou tipo selvagem com troca de C122S (por numeração de quimotripsina). Em particular, o domínio da protease do polipeptídeo modificado exibe atividade de clivagem de inativação aumentada de C3 em comparação com o domínio da protease MTSP-1 da SEQ ID NO: 4 (domínio da protease MTSP-1 com C122S). O aumento da atividade pode ser 10%, 20%, 50%, 100%, 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes e mais em comparação com o MTSP-1 não modificado.
[00271] Por exemplo, o polipeptídeo MTSP-1 modificado pode exibir 110-1000% ou mais da atividade MTSP-1 de um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem ou de referência, tal como o polipeptídeo MTSP-1 apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4 para inativar C3. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, 1000% ou mais da atividade do polipeptídeo MTSP-1 não modificado ou de referência, tal como o polipeptídeo correspondente que não contém a modificação de aminoácidos (por exemplo, troca de aminoácidos), por exemplo, um domínio da protease MTSP-1 apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Por exemplo, posições de exemplo que podem ser modificadas, por exemplo, por troca ou substituição de aminoácidos, incluem, mas não se limitam a, qualquer uma das posições correspondentes às posições 637, 640, 658, 661, 664, 666, 705, 706, 707 , 708, 731, 759, 783 ou 801 com referência à sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 1 (correspondente às posições 38, 41, 59, 60b, 60e, 60g, 96, 97, ins97a, 98, 99, 122, 151, 175, 192 de acordo com a numeração de quimotripsina). Por exemplo, as posições de aminoácidos podem ser trocas nas posições correspondentes à troca da glutamina (Q) nas posições 637, I640, Y658, D661, F664, Y666, D705, F706, T707, F708, C731, G759, Q783 ou C801 com referência às posições de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 1 (correspondente a Q38, I41, Y59, D60b, F60e, Y60g, D96, F97, T98, F99, C122, G151, Q175, C191 de acordo com a numeração de quimotripsina).
[00272] Exemplos de trocas de aminoácidos em qualquer uma das posições acima estão apresentados na Tabela 11. A referência à posição correspondente na Tabela 11 é com referência às posições apresentadas na SEQ ID NO: 1. Entende- se que as trocas podem ser feitas na posição correspondente em outro polipeptídeo MTSP-1 por alinhamento com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1, em que a posição correspondente é a posição alinhada. Por exemplo, a troca pode ser feita no domínio da protease MTSP-1 com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 ou um domínio da protease MTSP-1 de referência com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 4. Em alguns exemplos, a(s) troca(s) de aminoácidos (m) estar na posição correspondente em um polipeptídeo MTSP-1, como apresentado na SEQ ID NO: 4 ou uma variante do mesmo, tendo pelo menos ou pelo menos cerca de 75%, 80%, 81%, 82% , 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, particularmente 95%, ou mais de identidade de sequência, desde que o polipeptídeo MTSP-1 modificado resultante exiba especificidade alterada (isto é, intensificada) para a proteína C3 do complemento em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 de referência. Em um exemplo, qualquer de uma ou mais das trocas estão em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4, desde que o polipeptídeo MTSP-1 modificado resultante exiba especificidade alterada (isto é, intensificada) para a proteína C3 do complemento em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 de referência, tal como, por exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 de referência apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Tabela 11. Variantes Ativos Posição Posição Correspondente Correspondente (numeração de Troca (na SEQ ID NO:1) de quimotripsina) 637 38 H 640 41 S, R, A, D 658 59 F 661 60b T, V 664 60e S, R, K 666 60g W K, V, Y, L, I, 705 96 P, E G, T, E, D, N, 706 97 Y, W Inserção de V, 97a E, A, G, N 707 98 P, G, N 708 99 L 731 122 S 759 151 H, N 783 175 L 801 192 D, E, T
[00273] Exemplos de modificações de aminoácidos nos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, troca com histidina (H) em uma posição correspondente à posição 38; S em uma posição correspondente à posição 41; R em uma posição correspondente à posição 41; A em uma posição correspondente à posição 41; D em uma posição correspondente à posição 41; F em uma posição correspondente à posição 59; T em uma posição correspondente à posição 60b; V em uma posição correspondente à posição 60b; S em uma posição correspondente à posição 60e; R em uma posição correspondente à posição 60e; K em uma posição correspondente à posição 60e; W em uma posição correspondente à posição 60g; K em uma posição correspondente à posição 96; V em uma posição correspondente à posição 96; Y em uma posição correspondente à posição 96; L em uma posição correspondente à posição 96; I em uma posição correspondente à posição 96; P em uma posição correspondente à posição 96; E em uma posição correspondente à posição 96; G em uma posição correspondente à posição 97; T na posição correspondente à posição 97; E em uma posição correspondente à posição 97; D em uma posição correspondente à posição 97; N na posição correspondente à posição 97; Y em uma posição correspondente à posição 97; W em uma posição correspondente à posição 97; V em uma posição correspondente à posição 97a; E em uma posição correspondente à posição 97a; A em uma posição correspondente à posição 97a; G em uma posição correspondente à posição 97a; N em uma posição correspondente à posição 97a; P em uma posição correspondente à posição 98; G em uma posição correspondente à posição 98; N em uma posição correspondente à posição 98; L em uma posição correspondente à posição 99; S em uma posição correspondente à posição 122; H em uma posição correspondente à posição 151; N em uma posição correspondente à posição 151; L em uma posição correspondente à posição 175; D em uma posição correspondente à posição 192; E em uma posição correspondente à posição 192; T em uma posição correspondente à posição 192, de acordo com a numeração de quimotripsina, cada uma com referência às posições de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NOs: 1 ou 3. S na posição correspondente à posição 731 (122 S em uma posição correspondente à posição 731) substitui um Cys livre para reduzir a tendência de agregação.
[00274] Exemplos de polipeptídeos MTSP-1 modificados contendo modificações de aminoácidos são apresentados na Tabela 12a abaixo. A Tabela 12b inclui numeração madura para exemplos de polipeptídeos MTSP-1 modificados. O N° de ID da Sequência faz referência a um domínio da protease MTSP-1 de exemplo que contém as trocas indicadas, que incluem a troca de C122S para reduzir ou eliminar a agregação. C122 é uma cisteína livre, que pode resultar em reticulação entre os polipeptídeos de protease; essa troca, embora vantajosa, é opcional. Entende-se que o domínio da protease referenciado (pela SEQ ID NO.) é exemplificativo, e moléculas precursoras e de comprimento completo, bem como outras porções cataliticamente ativas do domínio da protease, polipeptídeo precursor e de comprimento completo podem incluir as trocas indicadas. Tabela 12a. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 21 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 22 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 23 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 24 51H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 25 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 26 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 27
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 28 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97Y/ins97aN/T98G/F99L/C12 29 2S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L/C12 30 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/F97W/ins97aN/T98G/F99L/C12 31 2S/G151N/Q175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 32 /Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97E/ins97aV/T98G/F99L/C12 33 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/F97D/ins97aG/T98N/F99L/C12 34 2S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 35 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 36 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L/C12 37 2S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 38 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 39 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 40 2S/G151H/Q175L I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T 41 I41D/C122S/G151N/Q192T 42 I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V 43 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T 44 I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 45 I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T 46 I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 47 51H/Q175L/Q192D Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 48 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 49 1H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 50 1H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 51 1H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H 52 /Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/F99L/C122S/G1 53 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/C122S/G1 54 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 55
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO 2S/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 56 2S/G151H/Q192D Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D 57 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D 58 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D 59 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D 63 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D 64 Q38H/I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D/D21 65 7V I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V 66 I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D/D217V 67 I41S/D96M/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V 68 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192V/D217I 69 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192H 70 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192N/D217V 71 I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D 72 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V 73 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192V 74 I41S/P49S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V 75 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192N/I217V 76 I41T/F97W/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217L 77 I41G/F97L/F99L/C122S/Q175A/Q192T/D217V 78 I41G/F97V/F99L/C122S/G151Q/Q175M/Q192A/D217L 79 I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V 80 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G/D217I 81 F97E/F99L/C122S/D217I/K224N 154 C122S/G193A 155 C122S/G193E 156 D96_F97delinsWYY/T98P/F99L/C122S 157 F97D/F99L/C122S/Q192G 158 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G 159 C122S/G151N/G193A 160 H40R/I41H/C122S/G151N 161 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N 162 H40R/I41H/F97E/C122S 163 F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 164 H40R/I41H/Y60gL/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/D217I/K224S 165 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151D/Q192G 166 H40R/I41H/F97D/F99L/Q192G 167 H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175A/Q192H/D217I/K22 168 4R H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217M/K224R 169 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217R/K224A 170 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G/D217K/K224A 171 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217V/K224Y 172 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175K/Q192G/D217I/K224H 173 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217S 174 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217W/K224R 175
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO H40R/I41H/Y60gN/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175K/Q192S/D217S/K22 176 4L H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/K224L 177 H40K/I41L/Y60gF/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175R 178 H40R/I41H/Y60gL/F97D/F99L/C122S/G151N 179 H40K/I41M/Y60gG/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192R/D217V/K22 180 4S H40K/I41M/Y60gF/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 181 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N/Q175M/Q192A/D217S/K224R 182 H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/K224R 183 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151D/Q175M/Q192G/D217V 184 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192A/D217N/K224R 185 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A/D217N/K224R 186 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192D/D217N/K224R 187 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A/D217N/K224R 188 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192D/D217N/K224R 189 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/D217N/K224R 190 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192D/D217N/K224R 191 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192A/D217N/K224R 192 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/Q175M/D217N/K224R 193 H40R/I41H/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 194 H40R/I41H/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 195 H40R/I41H/F97E/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 196 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192H 197 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/L153R 198 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N/L153R/V202M 199 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192H/P232S 200 H40R/I41H/F97D/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 201 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N/L153R 202 H40K/I41M/F99L/C122S/T150A/G151R/Q192G 203 H40R/I41H/F97D/C122S/G133D/G151N 204 I41R/F99L/C122S/Q192G 205 H40R/I41H/F99L/C122S/G151K/Q192G 206 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151E/Q175L/Q192E 207 K86R/K110R/C122S/K134R/K157R/K224R/K239R 208 H40R/I41H/K86R/F97D/K110R/C122S/K134R/G151N/K157R/K224R/K23 209 9R K86R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/K110R/C122S/K134R/K157R/Q175L/Q 210 192E/K224R/K239R H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217H/K224S 211 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217I/K224S 212 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217K/K224A 213 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217E/K224R 214 H40R/I41H/F97D/C122S/Q175R/Q192G/D217I/K224Q 215 H40P/I41R/F99L/C122S/Q192G 216 H40P/I41R/F99L/C122S/G151K/Q192G 217 H40R/I41H/F99L/C122S/G151E/Q192G 218 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175L/Q192E 219 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175T/Q192E 220
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175T/Q192D 221 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151E/Q175T/Q192D 222 H40P/I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 223 H40P/I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175L/Q192E 224 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 225 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 226 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175T/Q192E 227 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175T/Q192D 228 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 229 H40P/I41R/F99L/C122S/G151E/Q192G 230 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151E/Q175T/Q192E 231 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192E 232 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192E 233 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q175K/Q192G/D217R/K224Q 234 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G/D217Q/K224R 235 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192N/D217L/K224R 236 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192H/D217K/K224A 237 ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G 238 F97N/ins97aT/T98Y/F99N/C122S 239 F97M/ins97aD/T98D/F99L/C122S/Q192T 240 ins97aV/F97Q/T98P/F99L/C122S/Q175F/Q192D 241 ins97aD/F97T/T98S/F99L/C122S/Q192E/D217Y/K224R 242 ins97aN/F97H/T98D/F99L/C122S/Q192E/D217Q/K224S 243 F97Q/ins97aT/T98M/C122S/Q192E/D217R/K224L 244 ins97aD/F97Q/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E/D217F/K224S 245 ins97aD/F97G/T98N/F99L/C122S/Q192E/D217Y/K224R 246 ins97aE/F97Y/T98S/F99L/C122S/Q192T/D217Q/K224R 247 ins97aG/F97N/T98D/F99L/C122S/Q192E/D217H/K224A 248 ins97aA/F97G/T98N/F99L/C122S/Q175M/Q192T/K224A 249 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192D 250 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192D 251 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175I/Q192E 252 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175I/Q192D 253 S90T/D96A/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 254 Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 255 ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E/Q209L 256 Y59F/D96V/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 257 D96V/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 258 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151S/Q175L/Q192E 259 E24K/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/A152S/Q175L/Q192D 260 ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/L153Q/Q175L/Q192D 261 ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/I136M/L155M/N170D/Q175L/Q192E 262 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/A112V/C122S/Q175L/Q192E 263 Y59F/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 264 Y59F/G60dS/R84H/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E/V2 265 12I Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/L153Q/Q175L/Q192E 266 I41R/Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 267 I41R/Y59F/G60dS/R84H/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q19 268
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO 2E/V212I I41R/Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/L153Q/Q175L/Q192E 269 I41R/F97W/F99L/C122S/G151N/Q192G 270 F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q192G 271 I41D/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 272 I41D/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 273 Q38E/H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G 274 H40R/I41H/F97D/F99L/Q175R/Q192G/D217E/K224R 275 I41R/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q192G 276 ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192E 277 I41R/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 278 Q38E/H40R/I41H/D60bE/F97D/F99L/C122S/Q192G 279 Q38E/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q192G 280 Q38E/H40R/I41H/D60bK/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 281 Q38E/H40R/I41H/D60bN/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 282 Q38R/I41S/D60bH/F60eV/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 283 92E Q38G/H40R/I41H/D60bK/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 284 I41D/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E/Q209L 285 Q38G/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 286 Q38R/I41S/D60bH/F60eV/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 287 75L/Q192E H40R/I41H/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217E/K2 288 24R Q38H/I41S/D60bA/F60eV/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q1 289 75L/Q192T Q38E/I41S/D60bH/F60eI/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 290 92V Q38R/I41S/D60bH/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 291 92E Q38E/I41S/D60bV/F60eK/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 292 92I Q38R/I41E/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192T 293 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 294 75L/Q192D Q38H/I41A/D60bA/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 295 92E F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 296 ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 297 Q38G/H40R/I41H/D60bN/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 298 Q38G/H40R/I41H/D60bK/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 299 Q38E/H40R/I41H/D60bK/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 300 Q38H/I41S/D60bA/F60eV/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 301 51N/Q175L/Q192T Q38E/I41S/D60bH/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 302 75L/Q192V Q38R/I41S/D60bH/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 303 75L/Q192E Q38E/I41S/D60bV/F60eK/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 304 75L/Q192I
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO Q38R/I41E/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192T 305 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 306 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bA/F60eR/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 307 75L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 308 75L/Q192E Q38H/I41S/D60bV/F60eQ/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 309 75L/Q192I Q38H/I41A/D60bV/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 310 92E Q38H/I41A/D60bV/F60eT/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 311 75L/Q192E Q38H/I41A/F60eA/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 312 92E Q38H/I41A/D60bE/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 313 75L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 314 75L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 315 75L/Q192D Q38H/I41S/D60bS/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q1 316 75L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 317 75L/Q192D Q38R/I41T/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 318 Q38S/I41S/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q1 319 92S Q38H/I41T/D60bV/F60eQ/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 320 92G Q38G/H40R/I41H/D60bH/F60eK/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q17 321 5L/V183A/Q192G Q38H/I41A/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 322 Q38L/I41T/D60bR/F60eL/Y60gM/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 323 51N/Q175L/Q192G Q38F/I41S/D60bF/F60eR/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 324 51N/Q175L/Q192V Q38V/I41S/D60bT/F60eT/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 325 75H/Q192S Q38W/I41A/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151T/Q175S/Q192D 326 Q38T/I41S/D60bV/F60eR/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 327 75R/Q192V Q38H/I41S/D60bT/F60eS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 328 75A/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eT/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 329 75L/Q192V Q38Y/I41A/D60bL/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 330 75M/Q192A Q38L/I41T/D60bA/F60eL/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 331 75M/Q192T
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO Q38R/I41S/D60bY/F60eD/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 332 75M/Q192A Q38W/I41S/D60bG/F60eI/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 333 75A/Q192D Q38T/I41S/D60bG/F60eM/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 334 75S/Q192S I41T/D60bW/F60eH/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q 335 192G Q38D/I41S/D60bT/F60eR/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151K/Q1 336 75S/Q192V Q38H/I41S/D60bF/F60eV/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q1 337 75L/Q192A Q38L/I41A/D60bH/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151Q/Q1 338 75A/Q192G Q38H/I41A/D60bE/F60eH/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 339 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 340 51N/Q175L/Q192D Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 341 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 342 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 343 51H/Q175A/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 344 75L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G1 345 51N/Q175L/Q192D D60bY/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 346 I41T/D60bY/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 347 Q38E/I41S/D60bT/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 348 92V Q38H/I41A/D60bK/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q1 349 75L/Q192D Q38H/I41S/D60bA/F60eV/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 350 92E/Q209L Q38H/I41A/D60bT/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 351 92V Q38K/I41S/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192V 352 Q38F/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 353 75L/Q192E Q38H/I41A/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 354 92A Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q1 355 75L/Q192A Q38H/I41A/D60bV/F60eA/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q1 356 75L/Q192V Q38E/I41V/D60bF/F60eK/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q1 357 75L/Q192G Q38H/H40P/I41A/F60eQ/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q17 358
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO 5L/Q192D Q38R/I41V/D60bV/F60eV/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 359 75L/Q192G Q38L/H40P/I41T/D60bV/F60eH/Y60gL/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C12 360 2S/Q175L/Q192A Q38H/I41A/D60bV/F60eH/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 361 92D Q38H/I41S/D60bA/F60eV/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 362 92V Q38R/I41T/D60bH/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 363 Q38H/I41S/D60bT/F60eR/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 364 92E Q38K/I41T/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192A 365 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 366 92E Q38L/I41T/D60bV/F60eH/Y60gL/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 367 75L/Q192S ins97aA/F97G/T98L/C122S/Q175M/Q192A/D217I/K224R 368 Q38H/I41A/D60bY/F60eT/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q1 369 92D ins97aY/F97H/F99L/C122S/Q175M/Q192A/D217V 370 ins97aL/F97Q/T98G/F99L/C122S/Q175M/Q192S/D217I 371 ins97aY/F97G/T98V/C122S/Q175M/Q192S/D217V 372 Q38Y/I41S/D60bR/F60eE/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q1 373 75L/Q192V Q38H/I41S/D60bT/F60eS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 374 75L/Q192V Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 375 51H/Q175L/Q192V Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 376 51N/Q175A/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 377 51N/Q175L/Q192E Q38H/I41A/D60bE/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 378 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 379 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 380 51H/Q175L/Q192D Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 381 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/L52M/D60bG/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117K/C122S/I13 382 6L/Q192G/D217A Q38E/I41A/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G/Q209L/D2 383 17H I41S/D60bT/F93L/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217H 384 I41T/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217I 385 Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117L/C122S/I136T/Q1 386 92G/D217I Q38R/I41T/D60bT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V/Q192G/D2 387
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO 17N/L233Q Q38H/I41A/D60bW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136M/Q192G/D2 388 17N Q38H/I41S/P49Q/D60bS/F93L/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192 389 G/D217Q Q38H/I41S/D60bT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V/Q192G/D2 390 17S Q38H/I41S/D60bS/F93L/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136 391 F/Q192G/D217V Q38H/I41T/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136F/L153P/Q1 392 92G/D217Y Q38H/I41S/D60bT/F93L/ins97aV/F97D/T98P/F99L/S115N/C122S/Q19 393 2V/F208L/D217Q Q38K/I41T/D60bY/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136T/Q192G/F2 394 08V/D217R Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V/Q192G/D2 395 17V Q38H/I41S/D60bG/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117T/C122S/N164D/Q1 396 92G/D217E Q38K/I41S/D60bV/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117T/C122S/Q145E/Q1 397 75L/Q192G Q38H/I41S/D60bT/F60eT/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 398 51H/Q175L/Q192V Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 399 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G1 400 51H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/L52M/D60bH/D96V/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/T150 401 A/Q192G/Q209L/D217T I41S/D60bS/D96V/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G/F208L/D2 402 17N Q38H/I41S/D60bT/S90T/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/S127N/I13 403 6F/Q192G/D217Q Q38H/I41S/D60bT/F93S/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136L/Q19 404 2G/D217A I41S/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V/Q192G/D217N 405 L33M/Q38H/I41A/D60bA/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G/D21 406 7N Q38H/I41S/D60bY/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/L106M/C122S/I13 407 6M/Q192G/Q209L/D217T Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L/C12 408 2S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aA/F97D/T98P/F99L/C12 409 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41T/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L/C12 410 2S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96Y/ins97aI/F97E/T98N/F99M/C12 411 2S/G151N/Q175L/Q192V Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96S/ins97aR/F97A/T98S/F99L/C12 412 2S/G151N/Q175L/Q192T
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L/C12 413 2S/G151N/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q19 414 2D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/ins97aV/F97E/T98G/F99L/C12 415 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bA/Y60gG/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H143T/G1 416 51N/Q175L/Q192A Q38H/I41S/D60bT/F60eH/Y60gF/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H1 417 43R/G151N/Q175L/Q192S Q38H/I41S/D60bS/F60eQ/Y60gF/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H1 418 43R/G151N/Q175L/Q192T Q38H/I41S/D60bF/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H143Q/G1 419 51N/Q175L/Q192G Q38H/I41S/D60bF/F60eQ/Y60gF/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H1 420 43A/G151N/Q175L/Q192A Q38H/I41S/D60bT/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H143Q/G1 421 51Q/Q175L/Q192G Q38H/I41S/D60bQ/F60eQ/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/H143Q/G1 422 51Q/Q175L/Q192G Q38H/I41S/D60bS/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H143A/G1 423 51N/Q175L/Q192G Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96Q/F97E/ins97aD/T98S/F99L/C12 424 2S/G151N/Q175L/Q192R Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98S/F99L/C12 425 2S/G151H/Q175L/Q192A Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/ins97aG/F97D/T98N/F99L/C12 426 2S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/F97G/T98P/F99L/C12 427 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L/C12 428 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G151H 429 /Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q19 430 2D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/ins97aV/F97E/T98G/F99L/C12 431 2S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L/C12 432 2S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L/C12 433 2S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L/C12 434 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q19 435 2D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 436 /Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q19 437 2D
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q 438 175L/Q192E Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q 439 175L/Q192E Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 440 75L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q 441 175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175 442 L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/F99L/C122S/G151H/Q 443 175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/C122S/G151H/Q 444 175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q1 445 75L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 446 51H/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G1 447 51H/Q175L Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aA/T98P/F99L/C122S/G1 448 51H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 449 75L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eG/Y60gW/D96V/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 450 /Q175L/Q192D Q38K/I41G/F60eG/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 451 /Q192D Q38Y/I41E/D60bS/F60eV/Y60gF/D96W/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 452 /Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eG/D96Y/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 453 /Q192D Q38V/I41G/F60eG/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 454 /Q192D Q38Y/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/D96V/F97N/T98G/F99L/C122S/G151H 455 /Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eG/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G151Q/Q175L 456 /Q192D Q38K/I41G/D60bT/F60eG/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 457 /Q175L/Q192D Q38K/I41G/D60bT/F60eG/Y60gW/D96L/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 458 /Q175L/Q192D Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 459 /Q175L/Q192D Q38E/I41S/D60bW/F60eG/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 460 /Q192D Q38M/I41S/F60eH/Y60gW/D96Y/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 461 /Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98G/F99M/C12 462 2S/G151N/Q175L/Q192R
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97E/ins97aT/T98G/F99M/C12 463 2S/G151N/Q175L/Q192G Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97E/ins97aS/T98G/F99M/C12 464 2S/G151N/Q175L/Q192G Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96W/F97D/ins97aD/T98G/F99L/C12 465 2S/G151N/Q175L/Q192G Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aE/T98G/F99M/C12 466 2S/G151N/Q175L/Q192R Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96W/F97D/ins97aT/T98G/F99L/C12 467 2S/G151N/Q175L/Q192G Q38H/I41S/D60bT/F60eK/Y60gF/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 468 /Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97S/ins97aH/T98G/F99L/C12 469 2S/G151N/Q175L/Q192G Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aN/T98G/F99M/C12 470 2S/G151N/Q175L/Q192G Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97S/ins97aD/T98G/F99L/C12 471 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aD/T98G/F99L/C12 472 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97N/ins97aE/T98S/F99L/C12 473 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97R/ins97aD/T98G/F99L/C12 474 2S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/H1 475 43R/G151N/Q175L/Q192V Q38Y/I41S/D60bV/F60eR/Y60gF/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 476 /Q175L/Q192D Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 477 /Q175L/Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 478 /Q175L/Q192D Q38H/I41S/F60eT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 479 /Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eK/D96V/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 480 /Q192D I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175 481 L/Q192D Q38Y/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175 482 L/Q192D Q38Y/I41S/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 483 /Q192D Q38Y/I41S/D60bT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 484 /Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L 485 /Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175 486 L/Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175 487 L/Q192D
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/F99L/C122S/G151N/Q175 488 L/Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/C122S/G151N/Q175 489 L/Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 490 /Q192D Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N 491 /Q175L Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/Q175L 492 /Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/M11 493 7K/C122S/G151H/Q175L/Q192D L36Q/Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99 494 L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 495 2S/T150S/G151H/Q175L/Q192D/Q209L Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aA/T98P/F99L/C12 496 2S/G151H/Q175L/Q192D I41G/F97A/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192G/D217L 497 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 498 I41R/F97A/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192G/D217Q 499 I41S/F97E/F99L/C122S/G151N/Q175G/Q192R/D217A 500 I41G/F97S/F99L/C122S/G151T/Q175R/Q192A/D217Y 501 I41G/F97L/F99L/C122S/G151N/Q175A/Q192V/D217R 502 I41G/F97T/F99M/C122S/G151D/Q175T/Q192T/D217V 503 I41G/F97L/F99L/C122S/G151T/Q175M/Q192D/D217M 504 F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 505 I41G/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 506 I41G/F97S/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 507 I41G/F97S/F99L/C122S/Q175I/Q192T/D217T 508 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217T 509 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/D217T 510 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T 511 F97R/ins97aT/T98V/C122S/Q175M/Q192T/D217S 512 F97V/ins97aH/T98R/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217S 513 F97Q/F99L/C122S/Q175N/Q192V/D217G 514 F97L/ins97aM/T98N/F99L/C122S/Q175T/Q192T/D217S 515 F97S/ins97aN/T98G/F99M/C122S/Q175T/Q192T/D217S 516 I41T/F97H/F99L/C122S/G151N/Q175H/Q192V/D217L 517 I41R/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175T/Q192T/D217I 518 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217H 519 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V/D217L 520 I41E/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175G/Q192T/D217V 521 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T/D217A 522 I41E/F97A/F99M/C122S/G151N/Q175R/Q192S/D217E 523 I41G/F99L/C122S/Q175I/Q192T/D217T 524 I41G/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217T 525 I41G/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T 526 F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217H 527 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217H 528
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41E/F97V/F99L/C122S/Q175L/Q192S/D217H 529 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q192S/D217H 530 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/D217H 531 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S 532 F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V/D217L 533 I41D/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V/D217L 534 I41D/F97R/F99L/C122S/Q175R/Q192V/D217L 535 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q192V/D217L 536 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/D217L 537 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V 538 I41E/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175G/Q192T 539 I41D/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T/D217A 540 I41D/F97T/F99L/C122S/Q175S/Q192T/D217A 541 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217A 542 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/D217A 543 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T 544 F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T/D217A 545 I41S/F97Q/F99L/C122S/Q175W/Q192V/D217R 546 I41G/F97L/F99L/C122S/G151N/Q192V/D217L 547 I41G/F97A/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192S 548 I41G/F97V/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217V 549 I41D/F97R/F99L/C122S/Q175L/Q192T/D217I 550 I41E/F97S/F99L/C122S/Q175L/Q192V/D217A 551 F97L/F99L/C122S/Q175K/Q192V/D217M 552 F97E/F99L/C122S/G151A/Q192V 553 F97E/F99L/C122S/Q175H/Q192V/D217P 554 F97R/ins97aI/T98P/C122S/Q175M/Q192V/D217I 555 I41D/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217A 556 I41D/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T 557 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q192T 558 I41D/F99L/C122S/G151N/Q192T 559 I41D/F99L/C122S/Q175S/Q192T 560 I41D/F99L/C122S/Q192T 561 Q38R/I41G/Y60gG/F99M/C122S/G151N/Q192R 562 Q38K/I41G/Y60gG/F99L/C122S/G151N/Q192H 563 Q38L/I41R/Y60gF/F99L/C122S/G151N/Q192A 564 Q38K/I41D/Y60gG/F99L/C122S/G151N 565 Q38R/I41R/Y60gF/F99L/C122S/G151N/Q192G 566 Q38S/I41S/Y60gW/F99L/C122S/G151D/Q192T 567 Q38K/I41G/Y60gW/F99L/C122S/G151N/Q192A 568 Q38H/I41S/Y60gW/C122S/G151H/Q192A 569 Q38K/I41S/Y60gW/F99L/C122S/G151N/Q192G 570 Q38F/I41S/Y60gA/C122S/G151N/Q192R 571 Q38R/I41S/Y60gW/F99L/C122S/G151N/Q192E 572 Q38K/I41R/Y60gG/F99L/C122S/G151N/Q192G 573 Q38R/I41R/F99L/C122S/G151N/Q192G 574 Q38R/I41R/Y60gL/F99L/C122S/G151N/Q192G 575 I41E/C122S/G151N/Q175L/Q192A 576 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192G 577
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41E/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A 578 I41S/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192V 579 I41G/F99L/C122S/G151N/Q192A 580 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175G/Q192R 581 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192H 582 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175E/Q192R 583 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192V 584 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192S 585 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175P/Q192V 586 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175G/Q192T 587 I41S/C122S/G151N/Q175R/Q192R 588 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175P/Q192S 589 I41S/C122S/G151N/Q175D/Q192R 590 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192T 591 I41G/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192A 592 F99L/C122S/G151N/Q192T 593 I41D/F99L/C122S/G151N 594 I41S/F99L/C122S/Q175P/Q192V 595 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175P 596 I41E/F99L/C122S/Q175G/Q192T 597 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175G 598 I41D/Y59F/F99L/C122S/G151N/Q192T/V213A 599 I41D/G43A/F99L/C122S/G151N/Q192T/P232S/K239R 600 I41D/G43A/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 601 I41D/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 602 I41D/D96E/C122S/G151N/Q192T 603 I41D/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217E 604 I41D/F99L/M117T/C122S/G151N/Q192T/A204D/D217E 605 I41D/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217E 606 I41D/F99L/C122S/I136M/G151N/Q192T/D217L/K224R 607 I41D/F60eI/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 608 I41D/C122S/G151N/Q192T/D217E 609 D96E/C122S/G151N/Q192T 610 Y59F/C122S/G151N/Q192T 611 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/F99L/C122S/G151H/Q175 612 L/Q192D I41S/ins97aV/C122S/Q192D 613 I41S/F97L/F99L/C122S/Q192S 614 I41T/F97R/ins97aV/T98L/C122S/Q192S 615 I41S/F97V/T98N/F99L/C122S/Q192S 616 I41S/F97G/ins97aA/T98L/C122S/Q192A 617 I41S/F97D/F99L/C122S/Q192V 618 I41E/F97L/F99L/C122S/Q192A 619 I41S/F97A/ins97aV/T98L/C122S/Q192A 620 I41S/F97del/T98S/F99L/C122S/Q192S 621 I41A/Y60gW/D96F/F97G/F99M/C122S/Q175W/Q192A 622 I41G/Y60gW/F99L/C122S/Q175R/Q192S 623 I41A/Y60gW/ins97aE/F99L/C122S/Q175M/Q192T 624 I41T/ins97aA/F99Y/C122S/Q175L/Q192A 625
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41A/ins97aY/F99L/C122S/Q175R/Q192H 626 I41S/ins97aT/F99L/C122S/Q175R/Q192H 627 I41S/Y60gW/ins97aN/F99L/C122S/Q175R/Q192T 628 Q38H/I41S/D96S/ins97aK/C122S/G151N/Q192A 629 Q38H/I41A/D96A/ins97aA/C122S/G151D/Q192T 630 Q38H/I41S/D96Q/ins97aT/C122S/G151N/Q192A 631 Q38H/I41T/D96M/ins97aA/C122S/G151D 632 Q38Y/I41A/D96I/ins97aQ/C122S 633 Q38H/I41S/D96K/ins97aT/C122S/G151K/Q192A 634 Q38W/I41S/D96R/ins97aA/C122S/G151N/Q192A 635 Q38H/I41A/D96R/ins97aQ/C122S 636 Q38F/I41V/D96Q/ins97aT/C122S/G151D 637 L33M/Q38F/I41S/D96A/ins97aW/C122S/G151N/Q192S 638 Q38H/I41S/D96V/ins97aA/C122S/G151N/Q192A 639 Q38H/I41T/D96K/ins97aL/C122S/G151N/Q192A 640 Q38H/I41S/D96Q/ins97aA/C122S/Q192T 641 Q38W/I41V/D96R/ins97aA/C122S/G151N 642 Q38Y/I41T/D96M/ins97aS/C122S/G151N 643 Q38H/I41S/D96K/ins97aS/C122S/G151P/Q192S 644 Q38H/I41S/D96G/ins97aG/C122S/G151N/Q192A 645 Q38H/I41S/D96K/ins97aD/C122S/G151N/Q192S 646 I41S/D96E/ins97aG/C122S/G151Q/Q192A 647 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/G187D/Q192V/D217V 648 A35V/I41S/Y59F/C122S/Q192D/D217V 649 I41S/F93L/ins97aV/C122S/Q192V/D217V 650 I41S/S90P/ins97aV/C122S/Y146E/Q192N/D217V 651 I41S/S90T/ins97aV/C122S/Q192N/D217V 652 I41S/S90T/ins97aV/C122S/Q192V/D217V 653 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Q192G 654 I41S/Y59F/F97S/ins97aV/S116Y/C122S/Q192G/D217V 655 I41S/ins97aV/C122S/Q192G/Q209L 656 Q38H/I41S/ins97aV/A112V/C122S/Q192A/Q209L 657 I41S/ins97aV/C122S/Q192V/D217V 658 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Q192A 659 I41A/F97G/ins97aM/T98L/C122S 660 I41G/F97E/F99L/C122S/Q192A 661 I41S/F97V/ins97aV/T98P/C122S 662 I41S/T98S/F99L/C122S/Q192A 663 I41S/F97Q/F99L/C122S/Q192S 664 I41G/F97L/F99L/C122S/Q192S 665 I41S/F97G/ins97aA/T98P/C122S/Q192A 666 I41A/F97G/ins97aV/T98E/C122S 667 I41A/F97S/ins97aA/C122S 668 I41A/F97W/T98S/F99L/C122S/Q192A 669 I41L/N95D/D96T/F97W/F99L/C122S/Q192A 670 I41T/Y60gL/N95D/D96F/F97S/F99L/C122S/Q175S/Q192A 671 I41A/Y60gW/N95D/D96F/F97G/F99L/C122S/Q175H/Q192A 672 I41A/Y60gW/F99L/C122S/Q175T/Q192A 673 Q38M/I41T/D96M/ins97aH/C122S/G151E 674
Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO Q38H/I41T/D96R/ins97aG/C122S/G151S 675 I41S/D60bY/ins97aV/T98N/C122S/Q192H 676 I41S/Y59F/D60bY/ins97aV/C122S/Q192G 677 I41S/D60bY/ins97aV/A112V/C122S/Q192G/Q209L 678 A35T/I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Y146F/V183A/Q192G/R235H 679 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175H/Q192D 680 I41S/ins97aV/C122S/N164D/Q192G/R235H 681 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Q192G/N223D 682 I41S/ins97aV/C122S/N164D/Q192G/R235L 683 I41S/Y59F/F97Y/ins97aV/C122S/Q192G 684 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192V 685 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217V 686 I41S/F97L/F99L/C122S/G151N/Q192G/D217V 687 I41S/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A/D217L 688 I41G/F97R/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217V 689 I41T/F97L/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192S/D217W 690 I41D/F97T/F99M/C122S/Q192V/D217M 691 Tabela 12b. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I640R/F706T/InsE/T707G/F708G/ I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99 C731S/G759N/Q783L/Q802E L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 21 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S/ W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C G759N/Q783L/Q802D 122S/G151N/Q175L/Q192D 22 Q637H/I640A/D661T/F664K/Y666W Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S/ W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C G759N/Q783L/Q802D 122S/G151N/Q175L/Q192D 23 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706D/InsV/T707P/F708L/C731S/ W/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C G759H/Q783L/Q802E 122S/G151H/Q175L/Q192E 24 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706D/InsV/T707P/F708L/C731S/ W/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 25 Q637H/I640A/D661T/F664K/Y666W Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S/ W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 26 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706D/InsV/T707P/F708L/C731S/ W/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C G759N/Q783L/Q802D 122S/G151N/Q175L/Q192D 27 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S/ W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 28 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666G W/D96I/F97Y/ins97aN/T98G/F /D705I/F706Y/InsN/T707G/F708L/ 99L/C122S/G151N/Q175L/Q192 C731S/G759N/Q783L/Q802D D 29 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g 30
Tabela 12b. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO /D705K/F706D/InsA/T707P/F708L/ W/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F C731S/G759H/Q783L/Q802D 99L/C122S/G151H/Q175L/Q192
D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W W/D96P/F97W/ins97aN/T98G/F /D705P/F706W/InsN/T707G/F708L/ 99L/C122S/G151N/Q175L/Q192 C731S/G759N/Q783L/Q802E E 31 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /D705I/F706N/T707G/F708L/C731S W/D96I/F97N/T98G/F99L/C122 /G759N/Q783L/Q802D S/G151N/Q175L/Q192D 32 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W W/D96Y/F97E/ins97aV/T98G/F /D705Y/F706E/InsV/T707G/F708L/ 99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 C731S/G759H/Q783L/Q802D D 33 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W W/D96L/F97D/ins97aG/T98N/F /D705L/F706D/InsG/T707G/F708L/ 99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 C731S/G759H/Q783L/Q802E E 34 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L/ 35 99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 C731S/G759H/Q783L/Q802D
D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W W/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F /D705V/F706G/InsV/T707P/F708L/ 99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 C731S/G759H/Q783L/Q802D D 36 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W W/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F /D705K/F706D/InsA/T707P/F708L/ 99L/C122S/G151N/Q175L/Q192 C731S/G759N/Q783L/Q802D D 37 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S/ W/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 38 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/InsV/T707P/F708L/C731S/ W/D96K/ins97aV/T98P/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 39 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L/ W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F C731S/G759H/Q783L 99L/C122S/G151H/Q175L 40 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192 I640E/F708L/C731S/G759N/Q802T 41
T I640D/C731S/G759N/Q802T I41D/C122S/G151N/Q192T 42 I41S/F99L/C122S/G151N/Q192 I640S/F708L/C731S/G759N/Q802V 43
V I640E/F708L/C731S/G759N/Q802T I41E/F99L/C122S/G151N/Q192 44
T I640D/Y658F/D705E/F708L/C731S I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/ 45 /G759N/Q802T G151N/Q192T
Tabela 12b. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192 I640D/Y658F/C731S/G759N/Q802T 46
T I640S/D661T/F664S/Y666W/D705K I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96 /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S/ K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 47 Q637H/D661T/F664S/Y666W/D705K Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96 /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S/ K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 48 Q637H/I640S/F664S/Y666W/D705K Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S/ /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C1 G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 49 Q637H/I640S/D661T/Y666W/D705K Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S/ /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C1 G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 50 Q637H/I640S/D661T/F664S/D705K Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S/ /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C1 G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 51 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/T707P/F708L/C731S W/D96K/F97G/T98P/F99L/C122 /G759H/Q783L/Q802D S/G151H/Q175L/Q192D 52 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/F708L/C731S/ W/D96K/F97G/ins97aV/F99L/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 53 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/C731S/ W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/C G759H/Q783L/Q802D 122S/G151H/Q175L/Q192D 54 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L/ W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F C731S/Q783L/Q802D 99L/C122S/Q175L/Q192D 55 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L/ W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F C731S/G759H/Q802D 99L/C122S/G151H/Q192D 56 Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a 57 T707P/F708L/C731S/Q802D V/T98P/F99L/C122S/Q192D I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 58 F708L/C731S/Q783L/Q802D P/F99L/C122S/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ V/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 T707P/F708L/C731S/Q783L/Q802D 92D 59 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/Q802D P/F99L/C122S/Q192D 63 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ V/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 T707P/F708L/C731S/Q783L/Q802D 92D 64 Q637H/I640S/D661Y/D705K/F706G Q38H/I41S/D60bY/D96K/F97G/ /InsV/T707P/F708L/C731S/Q802D/ ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q1 D828V 92D/D217V 65 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/Q802D/D828V P/F99L/C122S/Q192G/D217V 66
Tabela 12b. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ
ID NO I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97 I640S/D661T/D705K/F706G/InsV/ aV/T98P/F99L/C122S/Q192D/D T707P/F708L/C731S/Q802D/D828V 217V 67 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96M/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q802G/D828V P/F99L/C122S/Q192G/D217V 68 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q802V/D828I P/F99L/C122S/Q192V/D217I 69 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q802H P/F99L/C122S/Q192H 70 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q802N/D828V P/F99L/C122S/Q192N/D217V 71 I640S/D661Y/ I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97 D705K/F706G/InsV/T707P/F708L/C aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q 731S/ Q783L/ Q802D 192D 72 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ V/T98P/F99L/C122S/Q192G/D2 T707P/F708L/C731S/Q802G/ D828V 17V 73 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q783L/ Q802V P/F99L/C122S/Q175L/Q192V 74 I640S/P648S/D705K/F706G/InsV/ I41S/P49S/D96K/F97G/ins97a T707P/F708L/C731S/Q783L/ V/T98P/F99L/C122S/Q192G/D2 Q802G/ D828V 17V 75 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q783L/ Q802V/ P/F99L/C122S/Q175L/Q192N/I D828V 217V 76 I640T/F706W/F708L/ I41T/F97W/F99L/C122S/G151N C731S/G759N/Q783M/Q802G/ D828L /Q175M/Q192G/D217L 77 I640G/F706L/F708L/ I41G/F97L/F99L/C122S/Q175A C731S/Q783A/ Q802T/ D828V /Q192T/D217V 78 I640G/F706L/F708L/ I41G/F97V/F99L/C122S/G151Q C731S/G759N/Q783M/ Q802A/ /Q175M/Q192A/D217L D828L 79 I640G/F706I/F708L/ I41G/F97I/F99L/C122S/G151L C731S/G759L/Q783M/ Q802S/ /Q175M/Q192S/D217V D828V 80 I640G/F706S/F708L/ I41G/F97S/F99L/C122S/G151N C731S/G759N/Q783L/ Q802G/ /Q175L/Q192G/D217I D828I 81
2. Modificações Adicionais
[00275] Qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção pode conter uma ou mais modificação(ões) adicional(ais). As modificações adicionais podem incluir, por exemplo, qualquer substituição, eliminação ou inserção de aminoácido conhecida na técnica,
tipicamente qualquer que aumente a especificidade de um polipeptídeo MTSP-1 modificado para clivagem de inativação da proteína C3 do complemento em comparação com uma polipeptídeo MTSP-1 não modificada ou de referência, tal como o domínio da protease. Qualquer polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou modificações adicionais de aminoácidos. Além disso, são contempladas modificações que alteram qualquer outra atividade de interesse. É conhecido na técnica que as modificações de aminoácidos da sequência primária são aditivas (ver, por exemplo, Wells (1990) Biochem 29: 8509- 8517). Exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas nos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção incluem, mas não estão limitados, aos descritos nas Patentes US Nos 7.939.304; 8.211.428;
8.445.245; 9.290.757; 9.359.598; 8.663.633; Publicações de Patente U.S. Nos 2003/0119168; 2007/0093443; 2010/0189652; 2010/0105121; 2012/0244139; 2014/0242062; 2004/0146938; e 2009/0136477; Miyake et al. (2010) Biochim BioPhys Acta 1804(1):156-165; List et al. (2007) J. Biol. Chem. 282(50):36714-23; Desilets et al. (2008) J. Biol. Chem. 283(16):10535-10542; Szabo (2009) Am J Pathol. 174(6):2015; Vanagaite et al. (2007) Am J Hum Genet. 80(3):467; Alef et al. (2009) J Invest Dermatol. 129(4):862; Ge et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:7406; Takeuchi et al. (1999) PNAS 96(20):11054-61; Oberst et al. (2003) J. Biol. Chem. 29(18):26773; e Publicações de Patente Internacional Nos WO 2015/166427 e WO 2015/085395. Exemplos não limitativos de modificações de exemplo de aminoácidos descritas na técnica incluem qualquer de uma ou mais de R85H, N109Q, G149N, D251E, N302Q, Q348H, G349Y, R381S, P452R, D482Y, N485Q, D519Y, S524M, D555Y, C574R, D598Y, K600R, C602S, C604S, V615I, V616L, V616G, G617N, G617L, G618L, D622E, Q637D, I640T, I640A, I640L, I640F, I640D, I640E, C641S, L651M, H656A, C657S, D661I, D661F, D661R, D661A, R662F, R662D, R662A, R662W, Y666S, T673K, A674V, H679R, S685R, F702L, N704K, D705A, D705V, D705F, D705S, D705T, F706N, F706D, F706E, F706A, F706W, F706R, F706Y, F706L, T707P, F708Y, F708W, F708N, F708D, F708E, F708A, F708V, F708R, F708I, F708L, F708T, F708S, F708G, D711A, C731S, A735T, V738D, P740S, I745T, I745V, H752R, T753I, T755F, T755N, T755D, T755E, T755A, T755W, T755R, G756E, G759L, I762V, N772Q, N772D, T774A, T775P, C776S, L779F, L780N, L780D, L780E, L780A, L780V, L780F, L780R, P781S, Q780N, Q780D, Q780E, Q780A, Q780V, Q780F, Q780R, P781S, Q782H, Q782A, Q782V, Q782F, Q782R, Q782K, Q782L, Q782Y, Q783D, Q783E, Q783A, Q783V, Q783H, Q783H, Q783L, Q783F, Q783W, Q783Y, Q783R, Q783K, M788E, M788Y, M788R, M788A, C790S, F793L, C801S, Q802A, Q802V, Q802D, Q802R, Q802F, Q802X, Q802L, Q802I, Q802E, Q802K, Q802Y, Q802H, S805A, S811I, Q820L, W826F, W826Y, W826I, W826D, W826R, W826X, G827R, D828A, D828V, D828F, D828E, D828R, D828Q, D828N, D828H, C830S, Q832D, Q832L, Q832E, K835A, K835F, K835V, K835D, K835L, K835R, K835N, K835T, K835Y, K835S, K835F, R841W, F845L e V855G, de acordo com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:1. Modificações adicionais incluem trocas de aminoácidos que introduzem um sítio de glicosilação.
[00276] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados incluem aqueles que contêm modificações químicas ou pós-
traducionais. Em alguns exemplos, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção não contêm modificações químicas ou pós-traducionais. Modificações químicas e pós-traducionais incluem, mas não estão limitadas a, PEGuilação, sialilação, albuminação, glicosilação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação e outras modificações polipeptídicas conhecidas na técnica. Além disso, além de qualquer de uma ou mais modificação(ões) de aminoácidos, tais como trocas de aminoácidos, providas na presente invenção, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser conjugados ou fundidos a qualquer porção usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo métodos químicos e recombinantes, desde que o polipeptídeo resultante retenha a capacidade de efetuar a clivagem inibitória ou de inativação da proteína C3 do complemento.
[00277] Por exemplo, além de qualquer de uma ou mais modificação(ões) de aminoácidos, tais como trocas de aminoácidos, providas na presente invenção, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção também podem conter outras modificações que estão ou não na sequência primária do polipeptídeo, incluindo, mas não se limitando à, modificação com uma porção de carboidrato, uma porção de polietilenoglicol (PEG), uma porção de sialilação, um domínio Fc da imunoglobulina G ou qualquer outro domínio ou porção. Por exemplo, essas modificações adicionais podem ser preparadas para aumentar a estabilidade ou a meia-vida no soro da proteína. a. Imunogenicidade Diminuída
[00278] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser modificados para terem imunogenicidade reduzida. A imunogenicidade reduzida pode ser efetuada por mudanças na sequência que eliminam epítopos antigênicos do polipeptídeo ou alterando modificações pós- traducionais. Um técnico no assunto está familiarizado com os métodos de identificação de epítopos antigênicos em um polipeptídeo (ver, por exemplo, Liang et al. (2009) BMC Bioinformatics, 10:302; Yang et al. (2009) Rev. Med. Virol., 19:77-96). Em alguns exemplos, um ou mais aminoácido(s) pode(m) ser modificado(s) para remover ou alterar um epítopo antigênico. Em outro exemplo, alterar a glicosilação de uma proteína também pode afetar a imunogenicidade. Por exemplo, é contemplada a alteração da glicosilação do peptídeo, desde que os polipeptídeos mantenham a capacidade de efetuar a clivagem inibitória ou de inativação da proteína C3 do complemento. Os sítios de glicosilação podem ser removidos por mutações únicas. Os sítios de glicosilação podem ser adicionados através da introdução de uma sequência canônica, tal como por inserção ou mutação única ou várias mutações, tal como NXS(T), em que X não é uma prolina. Os sítios de glicosilação também podem aumentar a meia-vida no soro. b. Domínios Fc
[00279] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser ligados à região Fc de um polipeptídeo de imunoglobulina. Tipicamente, essa fusão retém pelo menos uma dobradiça funcionalmente ativa, domínios CH2 e CH3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Por exemplo, uma sequência Fc de comprimento completo de IgG1 inclui os aminoácidos 99-330 da sequência apresentada na SEQ ID NO:
100. Uma sequência Fc de exemplo para hIgG1 é apresentada na
SEQ ID NO: 101. Ela contém quase todos os da sequência de dobradiça correspondente aos aminoácidos 100-110 da SEQ ID NO: 100; a sequência completa para o domínio CH2 e CH3, como apresentado na SEQ ID NO: 100.
[00280] Outro polipeptídeo Fc de exemplo é apresentado na Publicação de Patente Internacional Nº WO 93/10151, e é um polipeptídeo de cadeia única que se estende da região de dobradiça do terminal N até o terminal C nativo da região Fc de um anticorpo IgG1 humano (SEQ ID NO:100). O sítio preciso no qual a ligação é feita não é crítico: sítios específicos são bem conhecidos e podem ser selecionados para otimizar a atividade biológica, secreção ou características de ligação do polipeptídeo HABP. Por exemplo, outras sequências de polipeptídeo Fc exemplares começam no aminoácido C109 ou P113 da sequência apresentada na SEQ ID NO: 101 (ver, por exemplo, Pub U.S. N° 2006/0024298).
[00281] Além da hIgG1 Fc, outras regiões Fc também podem ser usadas. Por exemplo, onde funções efetoras mediadas por interações Fc/FcγR devem ser minimizadas, é contemplada a fusão com isotipos de IgG que mal recrutam células complemento ou efetoras, tal como por exemplo, o Fc de IgG2 ou IgG4. Adicionalmente, as fusões Fc podem conter sequências de imunoglobulinas que são substancialmente codificadas por genes de imunoglobulina pertencentes a qualquer uma das classes de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a IgG (incluindo subclasses humanas IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), classes de anticorpos IgA (incluindo subclasses humanas IgA1 e IgA2), IgD, IgE e IgM. Os ligantes podem ser usados para ligar covalentemente Fc a outro polipeptídeo para gerar uma Fc quimera.
[00282] Os domínios Fc modificados também são bem conhecidos. Em alguns exemplos, a região Fc é modificada de modo a exibir uma ligação alterada a um FcR, resultando em função efetora alterada (isto é, mais ou menos) do que a função efetora de uma região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina tipo selvagem. Assim, um domínio Fc modificado pode ter afinidade alterada, incluindo, mas não limitada à, afinidade aumentada ou baixa ou inexistente para o receptor Fc. Por exemplo, as diferentes subclasses de IgG têm afinidades diferentes para os FcγRs, com IgG1 e IgG3 tipicamente se ligando substancialmente melhor aos receptores que IgG2 e IgG4. Além disso, diferentes FcγRs mediam diferentes funções efetoras. FcγR1, FcγRIIa/c, e FcγRIIIa são reguladores positivos da ativação desencadeada pelo complexo imune, caracterizado por ter um domínio intracelular que tem um motivo de ativação baseado em tirosina imunoreceptora (ITAM). O FcγRIIb, no entanto, tem um motivo de inibição à base de tirosina imunoreceptora (ITIM) e, portanto, é inibidor. Alterar a afinidade de uma região Fc para um receptor pode modular as funções efetoras e/ou propriedades farmacocinéticas associadas ao domínio Fc. Os domínios Fc modificados são conhecidos por um técnico no assunto e descritos na literatura, ver, por exemplo, Patente U.S. N° 5.457.035; Publicação de Patente U.S. N° 2006/0024298; e Publicação Internacional de Patente N° WO 2005/063816 para modificações de exemplo.
[00283] Os polipeptídeos quiméricos resultantes contendo porções Fc e multímeros formados a partir dos mesmos, podem ser facilmente purificados por cromatografia por afinidade em colunas de Proteína A ou Proteína G.
c. Conjugação de polímeros
[00284] Em alguns exemplos, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são conjugados com polímeros. Os polímeros podem aumentar o tamanho do polipeptídeo para reduzir a depuração renal e, assim, aumentar a meia-vida ou modificar a estrutura do polipeptídeo para aumentar a meia-vida ou reduzir a imunogenicidade. Exemplos de polímeros que podem ser conjugados com os polipeptídeos MTSP-1 incluem homopolímeros naturais e sintéticos, tais como polióis (isto é, poli-OH), poliaminas (isto é, poli-NH2) e ácidos policarboxílicos (isto é, poli- COOH) e outros heteropolímeros, isto é, polímeros compreendendo um ou mais grupo(s) de acoplamento diferente(s), por exemplo, um grupo hidroxila e grupos amina. Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem moléculas poliméricas selecionadas de óxidos de polialquileno (PAO), tal como polialquileno glicóis (PAG), incluindo polietileno glicóis (PEG), metoxipolietileno glicóis (mPEG) e polipropileno glicóis, éteres PEG- glicidílicos (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), polietileno glicóis ramificados (PEGs), álcool polivinílico (PVA), policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L- aminoácidos, anidrido do ácido polietileno-co-maleico, anidrido do ácido poliestireno-co-maleico, dextranos incluindo carboximetil-dextranos, heparina, albumina homóloga, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisados de quitosana, amidos, tais como hidroxietil-amidos e hidroxipropil-amidos, glicogênio, agaroses e derivados dos mesmos, goma guar, pululano, inulina, goma xantana, carragenano, pectina, hidrolisados de ácido algínico e biopolímeros.
[00285] Tipicamente, os polímeros são óxidos de polialquileno (PAO), tais como óxidos de polietileno, tal como PEG, tipicamente mPEG, que possuem poucos grupos reativos capazes de reticulação. Tipicamente, os polímeros são moléculas poliméricas não tóxicas, tais como (metoxi)polietilenoglicol (mPEG), que podem ser covalentemente conjugadas com os polipeptídeos MTSP-1 (por exemplo, para grupos de ligação na superfície da proteína) usando uma química relativamente simples.
[00286] Moléculas poliméricas adequadas para ligação aos polipeptídeos MTSP-1 incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG) e derivados de PEG, tais como, metoxi-polietileno glicóis (mPEG), éteres de PEG-glicidila (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), PEGs ramificados e óxido de polietileno (PEO) (ver, por exemplo, Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery Review 54: 459- 476; Harris e Zalipsky (eds.) “Poly(ethylene glycol), Chemistry and Biological Applications” ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al. (2000) J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):-136; Harris e Chess (2003) Nat Rev Drug Discov. 2(3):214-21; e Tsubery (2004), J Biol. Chem 279(37):38118- 24). A molécula polimérica pode ter um peso molecular tipicamente variando entre cerca de 3 kDa (4,982x10-24 kg) e cerca de 60 kDa (9,963x10-23 kg). Em algumas modalidades, a molécula polimérica que é conjugada a um polipeptídeo MTSP- 1 provido na presente invenção tem um peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 (8,303x10-24,
1,661x10-23, 2,491x10-23, 3,321x10-23, 4,151x10-23, 4,982x10-23, 5,812x10-23, 6,642x10-23, 7,472x10-23, 8,303x10-23, 9,133x10-23, 9,963x10-23 kg) ou mais de 60 kDa (9,963x10-23 kg).
[00287] Métodos de modificação de polipeptídeos por ligação covalente (conjugação) de um PEG ou derivado de PEG (isto é, “PEGuilação”) são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, U.S. 2006/0104968; U.S. 5.672.662; U.S.
6.737.505; e U.S. 2004/0235734). As técnicas para PEGuilação incluem, mas não estão limitadas a, ligantes especializados e químicas de acoplamento (ver, por exemplo, Harris (2002) Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476), ligação de várias porções de PEG a um único sítio de conjugação (tal como como via uso de PEGs ramificados; ver, por exemplo, Veronese et al. (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 177-180), PEGuilação específica do local e/ou mono-PEGuilação (ver, por exemplo, Chapman et al. (1999) Nature Biotech. 17: 780-783) e PEGuilação enzimática direcionada ao sítio (ver, por exemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54: 487-504, 2002) (ver, também, por exemplo, Lu e Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138; Lu e Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J. Immunol. 154:3088-95; ver também Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (10): 1261-77 e Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt2): 3S-8S). Os métodos e técnicas descritos na técnica podem produzir proteínas tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de 10 PEG ou derivados de PEG ligados a uma única molécula de proteína (ver, por exemplo, US 2006/0104968).
[00288] Inúmeros reagentes para PEGuilação foram descritos na técnica. Tais reagentes incluem, mas não estão limitados a, PEG ativado por N-hidroxissuccinimidila (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxissuccinimida, mPEG succinimidil alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidil butanoato, éster succinimidílico de ácido mPEG carboximetil 3- hidroxibutanoico, PEG-succinimidil propionato homobifuncional, PEG propionaldeído homobifuncional, PEG butiraldeído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, p-nitrofenil-carbonato PEG, mEGEG-benzotriazol carbonato, propionaldeído PEG, mEGP-butiraldeído, mEGP-2 butiraldeído ramificado, mPEG acetil, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG maleimida “sem ligação”, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil dissulfeto, Fmoc- PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilssulfona PEG-NHS, acrilato PEG- NHS, fluoresceína PEG-NHS, e biotina PEG-NHS (ver, por exemplo, Monfardini et al., (1995) Bioconjugate Chem. 6:62- 69; Veronese et al. (1997), J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207; Patente U.S. Nos 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S.
6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S. 5.122.614; U.S. 5.183.550; U.S. 5.324.844; U.S.
5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S. 5.795.569; U.S. 5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S.
5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990.237; U.S. 6.113.906; U.S. 6.214.966; U.S. 6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S.
6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S. 6.461.802; U.S. 6.828.401; e U.S. 6.858.736; Publicação de Patente U.S. Nos 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S.
2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; e U.S. 2005/0209416; Patente Europeia Nos EP 01064951 e EP 0822199; e Publicações de Patentes Internacionais Nos WO 00/176640; WO 00/02017; WO 02/49673; WO 94/28024; e WO 01/87925). d. Domínios de Transdução de Proteínas
[00289] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser ligados, tal como uma proteína de fusão contendo um anticorpo, ou um fragmento de ligação a antígeno do mesmo, conjugado com um domínio de transdução de proteína (PTD) que aumenta a retenção do anticorpo no sítio alvo para terapia, tal como um sítio da mucosa, tal como o olho. Qualquer PTD pode ser empregado desde que o PTD promova a ligação às superfícies celulares alvo no sítio terapêutico (por exemplo, sítio da mucosa) e/ou captação do polipeptídeo MTSP-1 modificado pelas células alvo no sítio terapêutico (por exemplo, sítio mucoso, tal como como o olho).
[00290] Geralmente, os PTDs incluem peptídeos catiônicos curtos que podem se ligar à superfície celular por meio de ligação eletrostática à membrana celular e podem ser absorvidos pela célula por translocação da membrana (Kabouridis (2003) TRENDS Biotech 21(11) 498-503). Os PTDs providos geralmente interagem com uma célula alvo via ligação a glicosaminoglicanos (GAGs), tais como, por exemplo, ácido hialurônico, heparina, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, sulfato de queratina ou sulfato de condroitina e derivados dos mesmos.
[00291] O domínio de transdução de proteínas pode ter qualquer comprimento. Geralmente o comprimento do PTD varia de 5 ou cerca de 5 a 100 ou cerca de 100 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, o comprimento do PTD pode variar de 5 ou cerca de 5 a 25 ou cerca de 25 aminoácidos de comprimento. Em alguns exemplos, o PTD é de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 aminoácidos de comprimento.
[00292] Um único PTD ou uma pluralidade do mesmo pode ser conjugado com um polipeptídeo MTSP-1 modificado. Estes são vantajosamente empregados no tratamento de distúrbios oculares ou oftálmicos, tais como retinopatias diabéticas ou degeneração macular, incluindo DMRI. Por exemplo, várias cópias do mesmo PTD (por exemplo, dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero, hexâmero, heptâmero, octâmero, nonâmero, decâmero ou multímero maior) ou PTDs diferentes podem ser conjugadas ao polipeptídeo MTSP-1 modificado.
[00293] Várias proteínas e seus derivados peptídicos possuem propriedades de internalização celular. PTDs de exemplo são conhecidos na técnica e incluem, mas não limitados a, PTDs listados na Tabela 13 abaixo, incluindo, por exemplo, PTDs derivados do vírus da imunodeficiência humana 1 (HIV-1) TAT (SEQ ID NOS:-135; Ruben et al. (1989) J. Virol. 63:1-8), a proteína tegumento do vírus do herpes VP22 (SEQ ID NO: 140; Elliott e O'Hare (1997) Cell 88:223- 233), a proteína homeótica de Proteína Antennapedia (Antp) de Drosophila melanogaster (Penetratin PTD; SEQ ID NO: 112; Derossi et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 18188-18193), o peptídeo antimicrobiano protegrina 1 (PG-1) SynB (por exemplo, SynB1 (SEQ ID NO: 121), SynB3 (SEQ ID NO: 122) e Syn B4 (SEQ ID NO: 123); Kokryakov et al. (1993) FEBS Lett.
327: 231-236) e o Fator de crescimento de fibroblastos de Kaposi (SEQ ID NO: 105; Lin et al. (1995) J.
Biol.
Chem. 270-14255-14258). Verificou-se que outras proteínas e seus derivados peptídicos têm propriedades semelhantes de internalização celular.
Os peptídeos carreadores que foram derivados dessas proteínas mostram pouca homologia de sequência entre si, mas são todos altamente catiônicos e ricos em arginina ou lisina.
De fato, os peptídeos sintéticos de poli-arginina demonstraram ser internalizados com um alto nível de eficiência e podem ser selecionados para conjugação com um anticorpo provido (Futaki et al. (2003) J.
Mol.
Recognit. 16:260-264; Suzuki et al. (2001) J.
Biol.
Chem. 276:5836-5840). O PTD também pode ser selecionado de um ou mais PTDs sintéticos, incluindo, mas não limitado a, transportana (SEQ ID NO: 136; Pooga et al. (1988) FASEB J. 12:67–77; Pooga et al. (2001) FASEB J. 15:1451–1453), MAP (SEQ ID NO: 103; Oehlke et al. (1998) Biochim.
Biophys.
Acta. 1414:127–139), KALA (SEQ ID NO: 101; Wyman et al. (1997) Biochemistry 36:3008–3017) e outros peptídeos catiônicos, tais como, por exemplo, vários peptídeos β-catiônicos ((Akkarawongsa et al. (2008) Antimicrob.
Agents and Chemother. 52(6): 2120-2129). Peptídeos PTD adicionais e PTDs variantes também são providos em, por exemplo, Publicações de Patentes US Nos 2005/0260756, US 2006/0178297, US 2006/0100134, US 2006/0222657, US 2007/0161595, US 2007/0129305, Publicação de Patente Europeia N° EP 1867661, Publicações PCT Nos WO 2000/062067, WO 2003/035892, WO 2007/097561, WO 2007/053512 e Tabela 13 na presente invenção (abaixo). Quaisquer PTDs providos na presente invenção ou conhecidos na técnica podem ser conjugados com um anticorpo terapêutico provido.
Tabela 13: Domínios Conhecidos de Transdução de Proteínas Proteína de SEQ ID Domínio de Transdução de Proteínas (PTD) Fonte NO TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK Buforina II 82 RKKRRRESRKKRRRES DPV3 83 GRPRESGKKRKRKRLKP DPV6 84 GKRKKKGKLGKKRDP DPV7 85 GKRKKKGKLGKKRPRSR DPV7b 86 RKKRRRESRRARRSPRHL DPV3/10 87 SRRARRSPRESGKKRKRKR DPV10/6 88 VKRGLKLRHVRPRVTRMDV DPV1047 89 VKRGLKLRHVRPRVTRDV DPV1048 90 SRRARRSPRHLGSG DPV10 91 LRRERQSRLRRERQSR DPV15 92 GAYDLRRRERQSRLRRRERQSR DPV15b 93 WEAALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAA GALA 94 KGSWYSMRKmSMKIRPFFPQQ Cadeia beta de 95 fibrinogênio KTRYYSMKKTTMKIIPFNRL Precursor de 96 cadeia gama de fibrinogênio RGADYSLRAVRMKIRPLVTQ Cadeia alfa de 97 fibrinogênio LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP hCT(9-32) 98 TSPLNIHNGQKL HN-1 99 NSAAFEDLRVLS Nucleoproteína 100 do vírus Influenza (NLS) WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA KALA 101 VPMLKPMLKE Ku70 102 KLALKLALKALKAALKLA MAP 103 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV MPG 104 AAVALLPAVLLALLAP Fator de 105 Crescimento de Fibroblasto Humano 4 (Fator de Crescimento de Fibroblasto Kaposi) VQRKRQKLM N50 (NLS de NF- 106 kB P50) KETWWETWWTEWSQPKKKRKV Pep-1 107 SDLWEMMMVSLACQY Pep-7 108 RQIKIWFQNRRMKWKK Penetratina 109 GRQIKIWFQNRRMKWKK Variante de 110 penetratina RRMKWKK Penetratina 111 Curta ERQIKIWFQNRRMKWKK Penetratina 42- 112 58
Tabela 13: Domínios Conhecidos de Transdução de Proteínas Proteína de SEQ ID Domínio de Transdução de Proteínas (PTD) Fonte NO RRRRRRR Poli Arginina - 113 R7 RRRRRRRRR Poli Arginina - 114 R9 RVIRVWFQNKRCKDKK pISL 115 MANLGYWLLALFVTMWTDVGLCKKRPKP Príon de 116 camundongo PrPc1-28 LLIILRRRIRKQAHAHSK pVEC 117 LLIILRRRIRKQAHAH Variante de pVEC 118 VRLPPPVRLPPPVRLPPP SAP 119 PKKKRKV SV-40 (NLS) 120 RGGRLSYSRRRFSTSTGR SynB1 121 RRLSYSRRRF SynB3 122 AWSFRVSYRGISYRRSR SynB4 123 YGRKKRRQRRRPPQ Tat 47-60 124 YGRKKRRQRRR Tat 47-57 YGRKKRRQRR Tat 47-56 126 GRKKRRQRR Tat 48-56 127 GRKKRRQRRR Tat 48-57 128 RKKRRQRRR Tat 49-57 129 RKKRRQRR Tat 49-56 130 GRKKRRQRRRPPQ Tat 48-60 131 GRKKR Tat 48-52 132 CFITKALGISYGRKKRRQRRRPPQFSQTHQVSLSKQ Tat 37-72 133 FITKALGISYGRKKRRQRRRPQFSQTHQVSLSKQ Tat 38-72 134 YGRKKRRQRRRPP Tat 47-59 135 GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL Transportana 136 AGYLLGKINLKALAALAKKIL Transportana 10 137 GWTLNSAGYLLG Derivado de 138 transportana INLKALAALAKKIL Derivado de 139 transportana DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD VP22 140 DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD VT5 141 GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV Peptídeo com 142 base em Sequência Sinal KLALKLALKALKAALKLA Peptídeo de 143 Modelo Anfifílico KFFKFFKFFK Permeação 144 bacteriana em parede celular LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTES LL-37 145 SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR Cecropina P1 146 ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC alfa defensina 147 DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYRGKAKCCK beta defensina 148 RKCRIWIRVCR Bactenecina 149
Tabela 13: Domínios Conhecidos de Transdução de Proteínas Proteína de SEQ ID Domínio de Transdução de Proteínas (PTD) Fonte NO RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPRFPGKR PR-39 150 ILPWKWPWWPWRR Indolicidina 151 GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV MPS 152 PVIRRVWFQNKRCKDKK pIs1 153
[00294] Em alguns exemplos, os PTDs podem ser modificados pela troca de uma lisina ou arginina por outro aminoácido básico, tal como a troca de uma lisina por uma arginina ou a troca de uma arginina por uma lisina. E. ENSAIOS PARA AVALIAR E/OU MONITORAR A ATIVIDADE DE MTSP-1 EM FUNÇÕES MEDIADAS POR COMPLEMENTO
[00295] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção exibem especificidade e/ou seletividade alteradas para a proteína C3 do complemento. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados de exemplo clivam especificamente a proteína C3 do complemento e, assim, alteram a ativação do complemento. Adicionalmente, os polipeptídeos MTSP-1 modificados de exemplo providos na presente invenção podem ter especificidade e/ou seletividade alteradas ou reduzidas para a clivagem de substratos de MTSP-1, tais como, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio tipo uroquinase (uPA) e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF).
[00296] Vários ensaios in vitro e in vivo podem ser usados para monitorar ou triar polipeptídeos MTSP-1 quanto à sua capacidade de clivar a proteína C3 do complemento e por seus efeitos na ativação do complemento e em doenças e distúrbios mediada(o)s por complemento. Tais ensaios são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Um técnico no assunto pode testar um polipeptídeo MTSP-1 específico para clivagem da proteína C3 do complemento e/ou testar para avaliar qualquer mudança nos efeitos de um MTSP-1 em uma atividade mediada por complemento em comparação com a ausência de uma protease. Alguns desses ensaios são exemplificados na presente invenção.
[00297] Ensaios in vitro e in vivo de exemplo são providos na presente invenção para comparação de uma atividade de um polipeptídeo MTSP-1 modificado na função da proteína C3 do complemento. Além disso, numerosos ensaios, tais como ensaios para medir a ativação do complemento, são conhecidos dos técnicos no assunto. Os ensaios para atividades de complemento incluem, mas não estão limitados a, ensaios que medem produtos de ativação de ativação do complemento, tal como por exemplo, o complexo MAC C5b-9 e geração de qualquer um ou mais de produtos de clivagem do complemento, tais como C5a, C3b e C3d. Os ensaios para medir a ativação do complemento também incluem ensaios funcionais que medem a atividade funcional de componentes específicos das vias do complemento, tais como, por exemplo, ensaios hemolíticos usados para medir a ativação de qualquer uma das vias clássica, de lectina ou alternativa. Os ensaios para avaliar os efeitos dos polipeptídeos MTSP-1 nas proteínas do complemento e/ou nas funções mediadas por complemento incluem, mas não estão limitados a, análise de SDS-PAGE seguida por Western Blot ou coloração com Azul de Coomassie Brilhante, imunoensaios enzimáticos e ensaios hemolíticos. Em um exemplo, os ensaios in vitro podem ser realizados usando a proteína C3 do complemento purificado, como exemplificado no Exemplo 2. Em outro exemplo, os ensaios in vivo podem ser realizados testando o soro de uma espécie, incluindo espécies de mamíferos ou humanos, para ativação funcional de complemento, como exemplificado nos exemplos 8 e 10. Em outro exemplo, ensaios in vitro podem ser realizados testando o soro de uma espécie, incluindo espécies de mamíferos ou humanos, para ativação funcional do complemento, como exemplificado nos Exemplos 4-6. Em outro exemplo, os ensaios in vitro podem ser realizados usando bibliotecas de peptídeos, como exemplificado nos Exemplos 5-
7. Vários modelos de doenças conhecidos por um técnico no assunto podem ser usados para testar a eficácia de polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção em vária(o)s doenças e distúrbios mediada(o)s por complemento.
[00298] Também são providos na presente invenção ensaios de exemplo para determinar a atividade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados para atividades de MTSP-1 tipo selvagem, tal como clivagem do receptor-2 ativado por proteinase (PAR- 2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Também são providos ensaios para determinar a especificidade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados para a proteína C3 do complemento. Ensaios de exemplo são descritos abaixo.
1. Métodos para Avaliar a Atividade e a Especificidade do MTSP-1 para Clivar a Proteína C3 do Complemento para Inativá-la
[00299] Uma protease MTSP-1 modificada pode exibir alterações na especificidade e/ou seletividade para a inativação de C3, em comparação com o domínio de protease ou tipo selvagem de comprimento completo correspondente ou forma correspondente da protease MTSP-1 não modificada (isto é, os polipeptídeos MTSP-1 de SEQ ID NOs: 1-4). As proteases MTSP-1 modificadas providas na presente invenção podem reter a atividade da protease, mas exibem uma especificidade e/ou seletividade ou atividade aumentada para clivar C3 para inibir a ativação do complemento. Todas essas proteases MTSP- 1 modificadas com especificidade e/ou seletividade aumentadas para qualquer de uma ou mais proteína(s) do complemento são terapias candidatas para o tratamento de qualquer distúrbio no qual a ativação do complemento desempenhe um papel ou esteja envolvida.
[00300] Onde a protease MTSP-1 modificada exibe uma especificidade e/ou seletividade aumentadas para qualquer de uma ou mais proteína(s) de complemento, ensaios in vitro e in vivo podem ser usados para monitorar ou triar proteases quanto a efeitos em funções mediadas por complemento. Tais ensaios são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Um técnico no assunto pode testar uma protease MTSP-1 modificada para clivagem de C3 e/ou testar para avaliar qualquer mudança nos efeitos de uma protease MTSP-1 modificada em uma atividade mediada por complemento em comparação à ausência de uma protease MTSP-1 modificada. Alguns desses ensaios são exemplificados na presente invenção.
[00301] Ensaios in vitro e in vivo de exemplo são providos na presente invenção para comparação de uma atividade de uma protease MTSP-1 modificada na função de qualquer de uma ou mais proteína(s) complementar(es) direcionada(s). Muitos dos ensaios são aplicáveis a outras proteases e proteases modificadas. Adicionalmente, numerosos ensaios, tais como ensaios para medir a ativação do complemento, são conhecidos dos técnicos no assunto. Os ensaios para atividades de complemento incluem, mas não estão limitados a, ensaios que medem produtos de ativação de ativação do complemento, como por exemplo o complexo MAC C5b-9, e geração de qualquer um ou mais dos produtos de clivagem do complemento, tais como C4a, C5a, C3b e C3d. Os ensaios para medir a ativação do complemento também incluem ensaios funcionais que medem a atividade funcional de componentes específicos das vias do complemento, tais como, por exemplo, ensaios hemolíticos usados para medir a ativação de qualquer uma das vias clássica, de lectina ou alternativa. Os ensaios para avaliar os efeitos das proteases e proteases modificadas nas proteínas do complemento e/ou nas funções mediadas por complemento incluem, mas não estão limitados a, análise de SDS seguida por Western Blot ou coloração Azul de Coomassie Brilhante, imunoensaios enzimáticos e ensaios hemolíticos. Em um exemplo, os ensaios in vitro podem ser realizados usando proteínas do complemento purificadas. Em outro exemplo, ensaios in vivo podem ser realizados testando o soro de uma espécie, incluindo espécies de mamíferos ou humanos, para ativação funcional do complemento. Ensaios de exemplo são descritos abaixo. a. Detecção de proteínas
[00302] A detecção de proteínas é um meio de medir componentes individuais do complemento em uma amostra. As proteínas do complemento podem ser detectadas para avaliar diretamente os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1 na clivagem da proteína C3 do complemento ou, alternativamente, as proteínas do complemento podem ser medidas como um meio para avaliar a ativação do complemento. A proteína C3 do complemento, tratada na presença ou na ausência de um polipeptídeo MTSP-1, pode ser analisada por qualquer um ou mais ensaio(s), incluindo SDS-PAGE, seguido de coloração com
Coomassie ou Western Blot, imunoensaio enzimático, imunoistoquímica, citometria de fluxo, nefelometria, difusão em gel de ágar ou imunodifusão radial. Ensaios de exemplo para detecção de proteínas são descritos abaixo. i. Análise SDS-PAGE
[00303] A análise de proteínas do complemento na presença ou ausência de concentrações crescentes do polipeptídeo MTSP-1 pode ser realizada por análise de proteínas em SDS-PAGE, seguida pela detecção dessas proteínas. Nesses exemplos, as proteínas do complemento podem ser detectadas pela coloração da proteína total, tal como por coloração com Azul de Coomassie Brilhante, coloração com Prata ou por qualquer outro método conhecido dos técnicos no assunto, ou por Western Blot usando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para uma proteína especificada. Tipicamente, uma proteína do complemento purificada, tal como, por exemplo, a proteína C3 do complemento, pode ser incubada na presença ou na ausência de um polipeptídeo MTSP-
1. A proteína do complemento tratada pode ser resolvida em um gel de SDS-PAGE seguido por um método para detectar proteínas no gel, por exemplo, por coloração com Azul de Coomassie Brilhante. A proteína tratada pode ser comparada à sua proteína cognata de comprimento completo e os produtos de degradação formados por clivagem de protease da proteína podem ser determinados.
[00304] Em outra modalidade, uma amostra, como por exemplo soro humano ou plasma ou leite materno, pode ser tratada na presença ou ausência de um polipeptídeo MTSP-1 ou pode ser coletada após o tratamento de um animal ou humano com ou sem polipeptídeo MTSP-1. A amostra tratada com MTSP-
1 pode ser analisada em SDS-PAGE e uma proteína específica do complemento pode ser detectada, tais como, por exemplo, C3, C5 ou Fator B, por Western Blot usando anticorpos monoclonais ou policlonais contra a proteína. A clivagem da proteína do complemento pode ser comparada com uma amostra que não foi tratada com um polipeptídeo MTSP-1. Adicionalmente, a amostra pode ser estimulada para iniciar a ativação do complemento, tal como por incubação com IgG que estimula a ativação da via clássica ou por LPS que estimula a ativação da via alternativa. A amostra pode ser resolvida por SDS-PAGE para detecção de qualquer de uma ou mais das proteínas do complemento nativas para determinar a presença ou ausência de produtos de clivagem de uma proteína especificada em comparação com uma amostra da proteína não tratada com um polipeptídeo MTSP-1. Em tais exemplos, moléculas efetoras de clivagem de proteínas de complemento nativas também podem ser analisadas por Western Blot usando anticorpos monoclonais e policlonais para avaliar a ativação de uma ou mais das vias do complemento. Exemplos de moléculas efetoras de complemento podem incluir, mas não estão limitados a, C3a, C3d, iC3b, Bb e C5-b9. Por exemplo, a expressão diminuída em uma amostra de Bb pode indicar que um polipeptídeo MTSP-1 inibiu a ativação da via alternativa do complemento. Os produtos de clivagem das moléculas efetoras também podem ser determinados para avaliar os efeitos de concentrações crescentes de um polipeptídeo MTSP-1 na clivagem das próprias moléculas efetoras do complemento. ii. Imunoensaio enzimático
[00305] O imunoensaio enzimático (IEE; também chamado ensaio imunossorvente ligado a enzima; ELISA) é um ensaio usado para medir a presença de uma proteína em uma amostra. Tipicamente, a medição da proteína é uma medição indireta da ligação da proteína a um anticorpo, que é quimicamente rotulado com um substrato detectável, tal como uma enzima ou um composto fluorescente. Os ensaios de IEE podem ser usados para medir os efeitos dos polipeptídeos MTSP-1 na ativação do complemento medindo a presença de uma molécula efetora do complemento gerada após a ativação do complemento. Em tais exemplos, uma amostra, tal como, por exemplo, soro ou plasma humano, pode ser pré-tratada na presença ou na ausência de concentrações crescentes de um polipeptídeo MTSP-1 e subsequentemente ativada para induzir a ativação do complemento por incubação com moléculas iniciadoras, ou pode ser coletada após tratamento de um animal ou humano com um polipeptídeo MTSP-1. Por exemplo, a via clássica pode ser ativada por incubação com IgG e a via alternativa pode ser ativada por incubação da amostra com LPS. Um ensaio de ativação do complemento específico para a via da lectina requer que a via clássica do complemento seja inibida, uma vez que a atividade de clivagem C4/C2 da via da lectina é compartilhada com a via clássica do complemento. A inibição da via clássica pode ser alcançada usando um tampão de alta força iônica que inibe a ligação de C1q a complexos imunológicos e rompe o complexo C1, enquanto um tampão de alta força iônica não afeta a atividade de ligação a carboidratos de MBL. Consequentemente, a ativação da via da lectina pode ser induzida por incubação de uma amostra, tal como soro ou plasma humano, com uma superfície revestida com manano na presença de NaCl 1 M.
[00306] Após a ativação, a amostra pode ser extinta com a adição de Pefabloc (Roche) e EDTA para minimizar a ativação contínua das vias. As amostras podem ser analisadas quanto à presença de moléculas efetoras do complemento por um ensaio IEE ou ELISA. Os ensaios de IEE e ELISA para medir proteínas do complemento são bem conhecidos dos técnicos no assunto. Qualquer produto de ativação do complemento pode ser avaliado. Exemplos de produtos de ativação do complemento para medição da ativação do complemento incluem iC3b, Bb, C5b-9, C3a, C3a-desArg e C5a-desArg. A via do complemento ativada pode ser determinada dependendo do produto de ativação do complemento medido. Por exemplo, a medição do produto de clivagem Bb é um marcador único da via alternativa.
[00307] Em alguns exemplos, o IEE pode ser pareado com a detecção das proteínas do complemento clivadas por análise da amostra estimulada por complemento e tratada com protease por SDS-PAGE seguida de análise de Western blot para identificação de componentes específicos do complemento. Usando o software de densitometria, a clivagem do produto do complemento pode ser comparada com o componente do complemento de comprimento completo clivado ao longo do ensaio e a aparência de todos os principais produtos de degradação e a porcentagem de clivagem podem ser determinados. iii. Imunodifusão Radial (RID)
[00308] A imunodifusão radial (RID) é uma técnica que se baseia na precipitação de complexos imunes formados entre anticorpos incorporados nos géis de agarose quando são derramados, e o antígeno presente em uma amostra de teste, resultando em uma linha circular de precipitina em torno do poço de amostra. O diâmetro do anel precipitina é proporcional à concentração do anticorpo (ou antígeno) presente na amostra de teste. Ao comparar o diâmetro do anel de precipitina da amostra de teste com os padrões conhecidos, pode ser obtida uma estimativa relativamente insensível da concentração de anticorpo ou antígeno específico. A RID pode ser usada para medir a quantidade de uma proteína do complemento em uma amostra. Por exemplo, uma amostra, tal como, por exemplo, soro ou plasma humano, pode ser tratada na presença ou na ausência de concentrações crescentes de um polipeptídeo MTSP-1. A amostra tratada com protease pode ser adicionada a um poço de um gel de agarose que foi feito para incorporar um anticorpo policlonal ou monoclonal contra qualquer uma das proteínas do complemento, tal como incluindo, sem limitação, C3, C5, C6, C7, C9, ou Fator B. Após a remoção de proteínas não precipitadas por exposição a NaCl 0,15 M, os anéis de proteínas precipitados podem ser avaliados pela coloração com um corante de proteína, tal como, por exemplo, Azul de Coomassie Brilhante ou coloração dupla de Crowles. b. Ensaios Hemolíticos
[00309] Os ensaios hemolíticos funcionais provêm informações sobre a função do complemento como um todo. Este tipo de ensaio usa eritrócitos de ovelha sensibilizados ou não sensibilizados por anticorpos. Os ensaios hemolíticos incluem o ensaio total do complemento hemolítico (CH50), que mede a capacidade da via clássica e do MAC de lisar hemácias de ovelha. Depende da ativação sequencial dos componentes da via clássica (C1 a C9) para lisar os eritrócitos de ovelhas que foram sensibilizados com quantidades ideais de anticorpos de coelho anti-eritócitos de ovelhas para preparar complexos celulares de antígeno-anticorpo. Os ensaios hemolíticos também podem incluir um ensaio CH50 da via alternativa (coelho CH50 ou APCH50), que mede a capacidade da via alternativa e do MAC para lisar uma hemácia de coelho. Uma unidade de CH50 e/ou APCH50 é definida como a quantidade ou diluição de soro necessária para lisar 50% dos glóbulos vermelhos no teste. Tipicamente, para avaliar a ativação do complemento, uma amostra, tal como, por exemplo, soro humano ou plasma humano, pode ser tratada na presença ou ausência de concentrações crescentes de um polipeptídeo MTSP-1, ou pode ser coletada após o tratamento de um animal ou humano na presença ou ausência de um polipeptídeo MTSP-1. A amostra tratada com protease pode ser subsequentemente misturada com hemácias de ovelha que foram ativadas ou sensibilizadas com IgG. Uma amostra apenas de água misturada com hemácias de ovelha pode atuar como um controle total da lise para avaliar com precisão a porcentagem de lise das amostras analisadas. A adição de NaCl 0,15M à amostra pode ser adicionada para interromper a reação de lise. A lise das hemácias, induzida pela ativação dos componentes terminais da via do complemento, pode ser avaliada medindo-se a liberação de hemoglobina. A medição pode ser feita por leituras de densidade óptica (DO) das amostras usando um espectrofotômetro a um OD de 415 nm.
[00310] Em uma modalidade, os ensaios hemolíticos de diluição limitante podem ser usados para medir a atividade funcional de componentes específicos de qualquer via. Nesse ensaio, é usada uma fonte de soro que tem um excesso de todos os componentes do complemento, mas é deficiente para o que está sendo medido na amostra, isto é, um meio ou uma fonte de soro é esgotado por complemento para uma proteína específica. A extensão da hemólise depende, portanto, da presença do componente medido na amostra de teste. Nesse ensaio, uma proteína do complemento purificada, tal como, por exemplo, qualquer uma das proteínas de complemento nativas, incluindo, mas não se limitando a C3, pode ser incubada na presença ou na ausência de concentrações crescentes de um polipeptídeo MTSP-1. A proteína do complemento purificada tratada com protease pode então ser misturada com meio ou plasma esgotado(a) de complemento e hemácias de ovelha ativadas por IgG e a hemólise da amostra pode ser avaliada como descrito acima. Em outra modalidade, a clivagem de protease pode ser correlacionada com a ativação do complemento, analisando a atividade hemolítica de uma amostra tratada com protease, e analisando subsequentemente a amostra no gel de SDS-PAGE, seguida de coloração com uma coloração de proteína, tal como, por exemplo, o Azul de Coomassie. A proteína do complemento purificado tratada com as proteases pode ser avaliada quanto à clivagem e a porcentagem do componente completo do complemento clivada ao longo do ensaio e a aparência de todos os principais produtos de degradação podem ser calculadas. Alternativamente, a análise da proteína do complemento tratada com protease pode ser realizada por Western blot.
[00311] Uma alternativa ao ensaio hemolítico, chamado imunoensaio lipossômico (IEL), pode ser usada para avaliar a ativação da via clássica. O IEL (Waco Chemicals EUA, Richmond, Va.) utiliza lipossomas revestidos com dinitrofenila (DNP) que contêm a enzima glicose-6-fosfato desidrogenase. Quando o soro é misturado com os lipossomas e um substrato contendo anticorpo anti-DNP, glicose-6- fosfato e nicotinamida adenina dinucleotídeo, ativa a lise de lipossomas, e uma reação colorimétrica enzimática ocorre, o que é proporcional à atividade total do complemento clássico. c. Métodos para Determinar Sítios De Clivagem
[00312] As sequências de clivagem na proteína C3 do complemento podem ser identificadas por qualquer método conhecido na técnica (ver, por exemplo, Publicação U.S. N° 2004/0146938 publicada). Em um exemplo, uma sequência de clivagem é determinada incubando a proteína C3 do complemento com qualquer polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção. Após a incubação com o polipeptídeo MTSP- 1, a proteína C3 pode ser separada por SDS-PAGE e os produtos degradantes podem ser identificados por coloração com um corante de proteína, como o Azul de Coomassie Brilhante. Os fragmentos proteolíticos podem ser sequenciados para determinar a identidade das sequências de clivagem. Após a identificação, os substratos de peptídeos fluorogênicos projetados com base na sequência de clivagem de um substrato alvo desejado podem ser usados para avaliar a atividade, como descrito abaixo.
2. Métodos para Avaliar a Atividade de MTSP-1 Tipo Selvagem
[00313] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ter especificidade alterada ou reduzida para seus substratos normais, tal como, por exemplo, receptor-2 ativado por proteinase (PAR-2), ativador de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), e/ou fator de crescimento de hepatócitos (HGF). Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser testados para determinar se eles retêm a eficiência catalítica e/ou a especificidade do substrato para seu substrato nativo. Por exemplo, a clivagem de PAR-2 pode ser avaliada por incubação de um polipeptídeo MTSP-1 com PAR-2 e pela detecção de produtos de clivagem de proteínas. Em outro exemplo, a clivagem de PAR-2 pode ser determinada in vitro medindo a clivagem de um tetrapeptídeo etiquetado fluorogenicamente do substrato peptídico, por exemplo, um substrato fluorogênico, tais como fluoróforos ACC (7-amino-4-carbamoil-metil-cumarina)- ou AMC-(7-amino- 4-metilcumarina) ligado a um tetrapeptídeo. Em alguns exemplos, os ensaios de ativação de PAR-2 são usados para determinar a especificidade dos polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção.
[00314] Em outro exemplo, a clivagem de C3 pode ser avaliada por incubação de um polipeptídeo MTSP-1 com C3 e pela detecção de produtos de clivagem de proteínas. Em outro exemplo, a clivagem de C3 pode ser determinada in vitro medindo a clivagem de um tetrapeptídeo rotulado fluorogenicamente do substrato peptídico, por exemplo, um tetrapeptídeo ACC ou AMC. Em alguns exemplos, os ensaios de ativação C3 são usados para determinar a especificidade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Em outro exemplo, a clivagem de HGF pode ser avaliada por incubação de um polipeptídeo MTSP-1 modificado com HGF e pela detecção de produtos de clivagem de proteínas. Em outro exemplo, a clivagem de HGF pode ser determinada in vitro medindo a clivagem de um tetrapeptídeo etiquetado fluorogenicamente do substrato peptídico, por exemplo, um tetrapeptídeo ACC ou AMC. Em alguns exemplos, os ensaios de ativação de HGF são usados para determinar a especificidade dos polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção. Em outros exemplos, a capacidade dos polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção para formar um complexo com o inibidor de serina protease do tipo Kunitz, é determinada pelo inibidor-1 ativador do fator de crescimento do hepatócito (HAI-1). a. Clivagem de Substratos de MTSP-1
[00315] Em um exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser analisados usando substratos peptídicos fluorogênicos individuais correspondentes à sequência de clivagem desejada. Por exemplo, um método de ensaio para uma protease MTSP-1 modificada que pode clivar qualquer de uma ou mais das sequências de clivagem desejadas inclui: (a) contactar uma amostra fluorogênica de peptídeo (contendo uma sequência de clivagem alvo desejada) com uma protease, de uma tal maneira pela qual uma porção fluorogênica é liberada a partir de uma sequência de substrato peptídico após a ação da protease, produzindo assim uma porção fluorescente; e (b) observar se a amostra sofre uma mudança detectável na fluorescência, a mudança detectável sendo uma indicação da presença da protease enzimaticamente ativa na amostra. Nesse exemplo, a sequência de clivagem desejada é transformada em um peptídeo fluorogênico por métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as sequências individuais de clivagem de peptídeos podem ser ligadas a um substrato etiquetado com fluorogenicamente, tal como, por exemplo, um grupo de saída fluorogênico ACC ou AMC, e a liberação da porção fluorogênica pode ser determinada como uma medida da especificidade de uma protease para uma sequência de clivagem de peptídeos. A taxa de aumento na fluorescência da sequência de clivagem alvo pode ser medida, tal como usando um espectrofotômetro de fluorescência. A taxa de aumento da fluorescência pode ser medida ao longo do tempo. As constantes cinéticas de Michaelis-Menton podem ser determinadas pelos métodos cinéticos padrão. As constantes cinéticas kcat, Km e kcat/Km podem ser calculadas demonstrando em gráfico o inverso da concentração do substrato versus o inverso da velocidade de clivagem do substrato, e ajustando-se à equação de Lineweaver-Burk (1/velocidade = (Km/Vmax) (1/[S]) + 1/Vmax; em que Vmax = [ET]kcat). A constante de taxa de segunda ordem ou constante de especificidade (kcat/Km) é uma medida de quão bem um substrato é cortado por uma protease específica. Por exemplo, um tetrapeptídeo ACC ou AMC, tal como Ac-CPGR-AMC ou pode ser preparado e incubado com um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção e a atividade do polipeptídeo MTSP-1 pode ser avaliada ensaiando a liberação da porção fluorogênica. A escolha do tetrapeptídeo depende da sequência de clivagem desejada a ser testada e pode ser determinada empiricamente.
[00316] Em outras modalidades, os polipeptídeos MTSP-1 também podem ser ensaiados para verificar se eles clivam a sequência desejada quando apresentados no contexto da proteína de comprimento completo. Em um exemplo, uma proteína alvo purificada, isto é, PAR-2, uPA ou HGF, pode ser incubada na presença ou ausência de um polipeptídeo MTSP-1 selecionado e o evento de clivagem pode ser monitorado por SDS-PAGE seguido por coloração com Azul de Coomassie Brilhante para proteínas e análise de produtos de clivagem usando densitometria. b. Ensaios de Ligação a Substrato de MTSP-1
[00317] A ligação dos polipeptídeos MTSP-1 a um substrato de MTSP-1 pode ser avaliada por qualquer ensaio conhecido por um técnico no assunto para detectar interações proteína-proteína, incluindo, mas não limitadas a, ensaios de ligação em fase sólida, ELISA, ressonância de plasmon de superfície e FACS. Em um exemplo, o ELISA pode ser usado. A proteína do substrato recombinante é imobilizada em uma placa de microtitulação e a ligação a polipeptídeo MTSP-1 é medida pela adição de um reagente que se liga especificamente o MTSP-1, tal como, por exemplo, um anticorpo de ligação o MTSP-1. Em outro exemplo, a ligação pode ser determinada em um ensaio baseado em células usando uma linha celular que expressa o substrato. Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser rotulados, por exemplo, com um substrato cromogênico, fluorogênico ou radioativo para efetuar a detecção da ligação. c. Ensaios de Clivagem C3
[00318] A atividade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados pode ser avaliada por clivagem da proteína C3 humano do complemento do substrato medindo a quantidade de C3 humano intacta remanescente após a incubação com várias concentrações da protease MTSP-1 modificada. De acordo com este ensaio, o sinal é gerado na presença de C3 humano intacta, e é perdido à medida que o C3 é clivado.
[00319] A proteína C3 purificada pode ser incubada com os polipeptídeos MTSP-1 modificados e os níveis residuais de C3 humano não digerida podem ser quantificados por qualquer ensaio conhecido na técnica para avaliar a concentração de proteínas, tal como, por exemplo, usando uma Tela de Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificada (AlphaScreen; Perkin Elmer). A mistura de polipeptídeos C3/MTSP-1 é incubada com grânulos aceitadores revestidos com IgG de α-camundongo e, após a incubação, a mistura de grânulos aceitadores/mAb α-hC3 é incubada com um pAb α-hC3 biotinilado. São adicionados grânulos doadores revestidos com estreptavidina à mistura e o sinal ‘alphascreen’ (Excitação = 680 nm, Emissão = 570 nm) é então medido. Este sinal corresponde à concentração da proteína C3 restante. A concentração do polipeptídeo MTSP-1 necessária para clivar através de 50% do hC3 disponível (EC50) pode ser calculada.
3. Especificidade
[00320] A constante de especificidade de clivagem do substrato alvo, por exemplo, a proteína C3 do complemento ou um substrato de MTSP-1, tal como, por exemplo, PAR-2, uPA ou HGF, por um polipeptídeo MTSP-1 modificado, pode ser determinada usando densitometria em gel para avaliar mudanças na densitometria ao longo do tempo de um substrato alvo de comprimento completo incubado na presença de um polipeptídeo MTSP-1. Em modalidades específicas, a comparação das especificidades de um polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser usada para determinar se o polipeptídeo MTSP-1 modificado exibe especificidade para C3 alterada, por exemplo, aumentada em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem ou de referência. A especificidade de um polipeptídeo MTSP-1 para um substrato alvo, por exemplo, a proteína C3 do complemento, pode ser determinada a partir da constante de especificidade de clivagem de um substrato alvo em comparação com um substrato não alvo (por exemplo, o substrato nativo tipo selvagem de MTSP-1). Uma razão das constantes de especificidade de um polipeptídeo MTSP-1 modificado para o substrato alvo C3 versus um substrato não alvo, tal como, por exemplo, PAR-2, uPA ou HGF, pode ser preparada para determinar uma razão da eficiência de clivagem do polipeptídeo MTSP-1 modificado. A comparação da razão da eficiência da clivagem entre um polipeptídeo MTSP-1 modificado e um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem ou de referência pode ser usada para avaliar a quantidade em vezes de variação na especificidade de um substrato alvo. A especificidade pode ser pelo menos 2 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 vezes ou mais quando comparados à especificidade de um polipeptídeo MTSP- 1 tipo selvagem para um substrato alvo versus um substrato não alvo.
[00321] A análise cinética da clivagem de substratos nativos de um polipeptídeo MTSP-1 pode ser comparada com a análise da clivagem dos substratos alvo desejados na proteína C3 do complemento para avaliar a especificidade do polipeptídeo MTSP-1 modificado para a proteína C3 do complemento. Além disso, constantes de inibição de taxa de segunda ordem (ki) podem ser avaliadas para monitorar a eficiência e a reatividade de um polipeptídeo MTSP-1 modificado para a proteína C3 do complemento. Para as finalidades na presente invenção apresentadas, os polipeptídeos MTSP-1 modificados clivam C3 de modo que a ativação do complemento seja inibida e, como mostrado nos
Exemplos, eles o fazem com atividade significativamente maior, tal como pelo menos 5 vezes mais atividade, do que o polipeptídeo MTSP-1 modificado não modificado (ou polipeptídeo MTSP-1 modificado com a troca de C122S, que elimina uma cisteína livre para reduzir assim a agregação. Por exemplo, o polipeptídeo MTSP-1 modificado da SEQ ID NO: 35, cliva C3 humano no ensaio descrito na presente invenção com uma ED50 de 2 nM, em comparação com 11 nM para o domínio da protease tipo selvagem da SEQ ID NO: 4.
4. Modelos de Doenças
[00322] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser usados em qualquer modelo de doença clinicamente relevante conhecido por um técnico no assunto para determinar seus efeitos em doenças ou distúrbios mediada(o)s por complemento. Ensaios de exemplo incluem, mas não estão limitados a, ensaios para transplante, incluindo ensaios in vitro com células de ilhotas humanas (Tjernberg et al. (2008) Transplantation 85:1193-1199) e ensaios ex vivo com rins de porco (Fiane et al. (1999) Xenotransplantation 6:52-65); a bioincompatibilidade, incluindo inflamação induzida por superfície artificial in vitro (Lappegard et al. (2008) J Biomed Mater Res A 87:129- 135; Lappegard et al. (2005) Ann Thorac Surg 79:917-923; Nilsson et al. (1998) Blood 92:1661-1667; Schmidt et al. (2003) J Biomed Mater Res A 66:491-499); inflamação, incluindo inflamação induzida in vitro por E. coli (Mollnes et al. (2002) Blood 100:1867-1877) e inflamação induzida por complexo de heparina/protamina em babuínos (Soulika et al. (2000) Clin Immunol 96:212-221); degeneração macular relacionada à idade em coelhos, macacos e roedores (Chi et al. (2010) Adv Exp Med Biol 703:127-135; Pennesi et al. (2012) Mol. Aspects Med. 33(4):487-509; Fletcher et al. (2014) Optm. Vis. Sci. 91(8):878-886; Forest et al. (2015) Disease Models and Mechanisms 8:421-427); e função tardia do enxerto em porcos (Hanto et al., (2010) Am J Transplant 10(11):2421-2430) e cães (Petrinec et al. (1996) Surgery 61:1331-1337). F. MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAM POLIPEPTÍDEOS MTSP-1 MODIFICADOS
[00323] Os polipeptídeos de um polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentados na presente invenção podem ser obtidos por métodos bem conhecidos na técnica para purificação de proteínas e expressão de proteínas recombinantes. Os polipeptídeos também podem ser sintetizados quimicamente. Formas modificadas ou variantes, incluindo formas truncadas, podem ser manipuladas de um polipeptídeo tipo selvagem usando métodos padrão de DNA recombinante. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser manipulados a partir de um polipeptídeo tipo selvagem, tal como por mutagênese direcionada ao sítio.
1. Isolamento ou Preparação de Ácidos Nucleicos que Codificam Polipeptídeos MTSP-1
[00324] Os polipeptídeos podem ser clonados ou isolados usando quaisquer métodos disponíveis conhecidos na técnica para clonar e isolar moléculas de ácido nucleico. Tais métodos incluem amplificação por PCR de ácidos nucleicos e triagem de bibliotecas, incluindo triagem de hibridização de ácido nucleico, triagem baseada em anticorpos e triagem baseada em atividades. Por exemplo, quando os polipeptídeos são produzidos por meios recombinantes, pode ser usado qualquer método conhecido dos técnicos no assunto para identificação de ácidos nucleicos que codificam os genes desejados. Qualquer método disponível na técnica pode ser usado para obter um cDNA de comprimento completo ou parcial (isto é, abrangendo toda a região codificante) ou clone de DNA genômico que codifica um MTSP-1, tal como de uma célula ou fonte de tecido.
[00325] Os métodos para amplificação de ácidos nucleicos podem ser usados para isolar moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo desejado, incluindo, por exemplo, métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR). Exemplos de tais métodos incluem o uso de um termociclador Perkin-Elmer Cetus e da Taq polimerase (Gene Amp). Um material contendo ácido nucleico pode ser usado como material de partida a partir do qual uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo desejada pode ser isolada. Por exemplo, preparações de DNA e mRNA, extratos celulares, extratos de tecido, amostras de fluidos (por exemplo, sangue, soro, saliva, leite materno), amostras de indivíduos saudáveis e/ou doentes podem ser usadas em métodos de amplificação. A fonte pode ser de qualquer espécie eucariótica, incluindo, mas não se limitando a, vertebrados, mamíferos, humanos, suínos, bovinos, felinos, aviários, equinos, caninos e outras fontes de primatas. As bibliotecas de ácido nucleico também podem ser usadas como fonte de material de partida. Os iniciadores podem ser projetados para amplificar um polipeptídeo desejado. Por exemplo, os iniciadores podem ser projetados com base em sequências expressadas a partir das quais um polipeptídeo desejado é gerado. Os iniciadores podem ser projetados com base na retrotradução de uma sequência de aminoácidos de polipeptídeos. Se desejado, podem ser usados iniciadores degenerados para amplificação. Os iniciadores oligonucleotídicos que hibridizam para sequências nos terminais 3’ e 5’ da sequência desejada podem ser usados como iniciadores para amplificar por sequências de PCR a partir de uma amostra de ácido nucleico. Os iniciadores podem ser usados para amplificar o MTSP-1 de comprimento completo, ou uma sequência truncada do mesmo, tal como um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos solúveis de MTSP-1 providos na presente invenção. As moléculas de ácido nucleico geradas por amplificação podem ser sequenciadas e confirmadas para codificar um polipeptídeo desejado.
[00326] Sequências de nucleotídeos adicionais podem ser unidas a uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo, incluindo sequências ligantes contendo sítios de endonuclease de restrição com o objetivo de clonar o gene sintético em um vetor, por exemplo, um vetor de expressão de proteína ou um vetor projetado para a amplificação da proteína central que codifica sequências de DNA. Além disso, sequências de nucleotídeos adicionais que especificam elementos de DNA funcionais podem ser operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico que codifica polipeptídeo. Exemplos de tais sequências incluem, mas não estão limitados a, sequências promotoras projetadas para facilitar a expressão intracelular de proteínas e sequências de secreção, por exemplo, sequências sinais heterólogas, projetadas para facilitar a secreção de proteínas. Tais sequências são conhecidas dos técnicos no assunto. Sequências adicionais de resíduos de nucleotídeos, tais como sequências de bases que especificam regiões de ligação a proteínas, também podem ser ligadas a moléculas de ácido nucleico que codificam enzima. Tais regiões incluem, mas não estão limitadas a, sequências de resíduos que facilitam ou codificam proteínas que facilitam a captação de uma enzima em células alvo específicas, ou de outra forma alteram a farmacocinética de um produto de um gene sintético.
[00327] Além disso, etiquetas ou outras porções podem ser adicionadas, por exemplo, para auxiliar na detecção ou purificação por afinidade do polipeptídeo. Por exemplo, sequências adicionais de resíduos de nucleotídeos, tais como sequências de bases que especificam uma etiqueta de epítopo ou outro marcador detectável, também podem ser ligadas a moléculas de ácido nucleico que codificam enzima. Exemplos de tais sequências incluem sequências de ácidos nucleicos que codificam uma etiqueta SUMO ou etiqueta His ou etiqueta Flag.
[00328] Os ácidos nucleicos identificados e isolados podem então ser inseridos em um vetor de clonagem apropriado. Pode ser usado um grande número de sistemas hospedeiros de vetores conhecidos na técnica. Os vetores possíveis incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vetores deve ser compatível com a célula hospedeira usada. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos, tais como, derivados lambda, ou plasmídeos, tais como, pCMV4, pBR322 ou derivados de plasmídeo pUC ou o vetor Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA). A inserção em um vetor de clonagem pode, por exemplo, ser realizada ligando o fragmento de DNA a um vetor de clonagem que tem terminais coesivos complementares. A inserção pode ser efetuada usando vetores de clonagem TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[00329] Se os sítios de restrição complementares usados para fragmentar o DNA não estiverem presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas. Alternativamente, qualquer sítio desejado pode ser produzido ligando sequências de nucleotídeos (ligantes) aos terminais de DNA; estes ligantes ligados podem conter oligonucleotídeos quimicamente sintetizados específicos que codificam sequências de reconhecimento de endonucleases de restrição. Em um método alternativo, o gene da proteína e do vetor clivado pode ser modificado por terminação homopolimérica.
[00330] As moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras via, por exemplo, transformação, transfecção, infecção, eletroporação e sonoporação, de modo que muitas cópias da sequência do gene sejam geradas. Em modalidades específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas de DNA recombinante que incorporam o gene isolado da proteína, cDNA ou sequência de DNA sintetizada permite a geração de várias cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades cultivando transformantes, isolando as moléculas de DNA recombinante dos transformantes e, quando necessário, recuperando o gene inserido do DNA recombinante isolado.
[00331] Além da produção recombinante, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção, podem ser produzidos por síntese direta de peptídeos usando técnicas de fase sólida (ver, por exemplo, Stewart et al. (1969) Solid-Phase Peptide Synthesis, WH Freeman Co., San
Francisco; Merrifield J (1963) J Am Chem Soc., 85:2149-2154). A síntese de proteína in vitro pode ser realizada usando técnicas manuais ou por automação. A síntese automatizada pode ser alcançada, por exemplo, usando o sintetizador de peptídeos 431A da Applied Biosystems (Perkin Elmer, Foster City CA) de acordo com as instruções providas pelo fabricante. Vários fragmentos de um polipeptídeo podem ser quimicamente sintetizados separadamente e combinados usando métodos químicos.
2. Geração de Ácidos Nucleicos Mutantes ou Modificados e Polipeptídeos Codificadores
[00332] As modificações providas na presente invenção podem ser feitas por técnicas padrão de DNA recombinante, como as que são rotineiras para um técnico no assunto. Qualquer método conhecido na técnica para efetuar a mutação de qualquer um ou mais aminoácido(s) em uma proteína alvo pode ser empregado. Os métodos incluem mutagênese direcionada ao sítio padrão (usando, por exemplo, um kit, como o QuikChange disponível na Stratagene) de codificar moléculas de ácido nucleico, ou por métodos de síntese de polipeptídeo em fase sólida.
3. Vetores e Células
[00333] Para expressão recombinante de uma ou mais das proteínas desejadas, como qualquer polipeptídeo MTSP-1 modificado descrito na presente invenção, o ácido nucleico contendo toda ou uma porção da sequência de nucleotídeos que codifica a proteína pode ser inserido em um vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e a tradução da sequência de codificação da proteína inserida. Os sinais transcricionais e de tradução necessários também podem ser fornecidos pelo promotor nativo para genes de enzima e/ou suas regiões flanqueadoras.
[00334] Também são providos vetores que contêm um ácido nucleico que codifica a enzima. As células contendo os vetores também são providas. As células incluem células eucarióticas e procarióticas, e os vetores são adequados para uso nas mesmas. Geralmente, a célula é uma célula capaz de afetar a glicosilação da proteína codificada.
[00335] São providas células procarióticas e eucarióticas contendo os vetores. Tais células incluem células bacterianas, células de levedura, células fúngicas, Archea, células vegetais, células de insetos e células animais. As células são usadas para produzir uma proteína das mesmas, cultivando as células descritas acima sob condições nas quais a proteína codificada é expressada pela célula, e recuperando a proteína expressada. Para finalidades aqui mencionadas, por exemplo, a enzima pode ser secretada no meio.
[00336] Uma cepa de célula hospedeira pode ser escolhida por sua capacidade de modular a expressão das sequências inseridas ou de processar a proteína expressada da maneira desejada. Tais modificações do polipeptídeo incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. O processamento pós- tradução pode impactar o dobramento e/ou a função do polipeptídeo. Diferentes células hospedeiras, tais como, sem limitação, CHO (DG44, DXB11, CHO-K1), HeLa, MCDK, 293 e WI38 têm mecanismo celular específico e mecanismos característicos para essas atividades pós-traducionais e podem ser escolhidas para garantir a modificação e processamento corretos da proteína introduzida. Geralmente, a escolha da célula é aquela que é capaz de introduzir glicosilação ligada ao N no polipeptídeo expresso. Portanto, são providas células eucarióticas contendo os vetores. Exemplos de células eucarióticas são células de ovário de hamster chinês (CHO) de mamífero. Por exemplo, células CHO deficientes em di-hidrofolato redutase (por exemplo, células DG44) são usadas para produzir polipeptídeos providos na presente invenção.
[00337] São providos vetores que contêm uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo MTSP-1 modificado, tal como o domínio da protease MTSP-1 modificada, acoplado à sequência sinal nativa ou heteróloga, bem como várias cópias dele. Os vetores podem ser selecionados para expressão da proteína enzimática na célula ou de modo que a proteína enzimática seja expressada como uma proteína secretada.
[00338] Em uma modalidade, são providos vetores contendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem atividade de protease e contém todo ou uma porção do domínio da protease, ou várias cópias dele. Também são providos vetores que contêm uma sequência de nucleotídeos que codifica o domínio da protease e porções adicionais de uma proteína de protease até e incluindo uma proteína de protease de comprimento completo, bem como várias cópias do mesmo. Os vetores podem ser selecionados para expressão do andaime ou da proteína de protease modificada ou do domínio da protease dos mesmos na célula ou de modo que a proteína protease seja expressada como uma proteína secretada. Quando o domínio da protease é expressado, o ácido nucleico é ligado ao ácido nucleico que codifica um sinal de secreção, tal como a sequência sinal do fator de associação α de Saccharomyces cerevisiae ou uma porção da mesma, ou a sequência sinal nativa.
[00339] Uma variedade de sistemas de vetores hospedeiros pode ser usada para expressar a sequência de codificação da proteína. Estes incluem, mas não estão limitados a, sistemas de células de mamíferos infectados com vírus (por exemplo, vírus vaccinia, adenovírus e outros vírus); sistemas de células de inseto infectados com vírus (por exemplo, baculovírus); microrganismos tais como leveduras contendo vetores de leveduras; ou bactérias transformadas com bacteriófago, DNA, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo. Os elementos de expressão dos vetores variam em seus pontos fortes e especificidades. Dependendo do sistema de vetor hospedeiro usado, qualquer um de vários elementos de transcrição e tradução adequados pode ser usado.
[00340] Quaisquer métodos conhecidos dos técnicos no assunto para a inserção de fragmentos de DNA em um vetor podem ser usados para construir vetores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controle transcricionais/traducionais apropriados e sequências de codificação de proteínas. Estes métodos podem incluir DNA recombinante in vitro e técnicas sintéticas e recombinantes in vivo (recombinação genética). A expressão de sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas, ou domínios, derivados, fragmentos ou homólogos dos mesmos, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácidos nucleicos, de modo que os genes ou fragmentos dos mesmos sejam expressados em um hospedeiro transformado com a(s) molécula(s) de DNA recombinante.
Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promotor/intensificador conhecido na técnica.
Em uma modalidade específica, o promotor não é nativo dos genes para uma proteína desejada.
Os promotores que podem ser usados incluem, mas não limitados ao, promotor inicial do SV40 (Benoist e Chambon (1981) Nature 290:304-310), o promotor contido na repetição terminal longa em 3’ do vírus do sarcoma Rous (Yamamoto et al. (1980) Cell 22:787-797), o promotor timidina quinase da herpes (Wagner et al. (1981) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 78:1441-1445), as sequências reguladoras do gene da metalotioneína (Brinster et al. (1982) Nature 296:39-42); vetores de expressão procarióticos, tais como, o promotor β-lactamase (Jay et al., (1981) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et al. (1983) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 80:21- 25); ver também “Useful Proteins from Recombinant Bacteria”: em Scientific American 242:79-94 (1980); vetores de expressão de plantas contendo o promotor de nopalina sintetase (Herrara-Estrella et al.(1984) Nature 303:209-213) ou o promotor de RNA 35S do vírus do mosaico de couve-flor (Garder et al. (1981) Nucleic Acids Res. 9:2871), e o promotor da enzima fotossintética ribulose bisfosfato carboxilase (Herrera-Estrella et al.(1984) Nature 310:115- 120); elementos promotores de leveduras e outros fungos, tal como o promotor Gal4, o promotor de álcool desidrogenase, o promotor de fosfoglicerol quinase, o promotor de fosfatase alcalina, e as seguintes regiões de controle de transcrição animal que exibem especificidade tecidual e foram usadas em animais transgênicos: região de controle de gene da elastase I que é ativa nas células acinares pancreáticas (Swift et al.(1984) Cell 38:639-646; Ornitz et al.(1986) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald (1987) Hepatology 7:425-515); região de controle do gene da insulina que é ativa nas células beta pancreáticas (Hanahan et al.(1985) Nature 315:115-122), região de controle do gene da imunoglobulina que é ativa nas células linfóides (Grosschedl et al. (1984) Cell 38:647-658; Adams et al. (1985) Nature 318:533-538; Alexander et al. (1987) Mol. Cell Biol. 7:1436- 1444), região de controle de vírus de tumor mamário de camundongo que é ativa nas células testiculares, de mama, linfóides e mastócitos (Leder et al. (1986) Cell 45:485- 495), região de controle do gene da albumina que é ativo no fígado (Pinckert et al. (1987) Genes and Devel. 1:268-276), região de controle de gene de alfa-fetoproteína que é ativo no fígado (Krumlauf et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1639- 1648; Hammer et al. (1987) Science 235:53-58), região de controle de gene de alfa-1 antitripsina que é ativo no fígado (Kelsey et al. (1987) Genes and Devel. 1:161-171), região de controle do gene de beta globina que é ativo nas células mielóides (Magram et al., (1985) Nature 315:338-340; Kollias et al. (1986) Cell 46:89-94), região de controle de gene de proteína básica de mielina que é ativo em células de oligodendrócitos do cérebro (Readhead et al. (1987) Cell 48:703-712), região de controle de gene da cadeia leve 2 da miosina, que é ativo no músculo esquelético (Shani (1985), Nature 314:283-286), e região de controle de gene do hormônio liberador gonadotrófico, que é ativo em gonadotrofinas do hipotálamo (Mason et al. (1986) Science 234:1372-1378).
[00341] Em uma modalidade específica, é usado um vetor que contém um promotor operacionalmente ligado a ácidos nucleicos que codificam uma proteína desejada, ou um domínio, um fragmento, um derivado ou um homólogo, uma ou mais origem(ns) de replicação e, opcionalmente, um ou mais marcador(es) selecionável(eis) (por exemplo, um gene de resistência a antibióticos). Dependendo do sistema de expressão, sinais de iniciação específicos também são necessários para a tradução eficiente de uma sequência de MTSP-1. Estes sinais incluem o códon de iniciação ATG e sequências adjacentes. Nos casos em que o códon de iniciação e as sequências a montante do MTSP-1 ou fragmentos cataliticamente ativos das mesmas são inseridos no vetor de expressão apropriado, não são necessários sinais de controle de tradução adicionais. Nos casos em que apenas a sequência de codificação, ou uma porção da mesma, é inserida, devem ser providos sinais de controle transcricionais exógenos, incluindo o códon de iniciação de ATG. Além disso, o códon de iniciação deve estar no quadro de leitura correto para garantir a transcrição de todo o inserto. Elementos transcricionais exógenos e códons de iniciação podem ser de várias origens, naturais e sintéticas. A eficiência da expressão pode ser intensificada pela inclusão de intensificadores apropriados ao sistema celular em uso (Scharf et al. (1994) Results Probl Cell Differ 20:-62; Bittner et al. (1987) Methods in Enzymol 153:516-544).
[00342] Exemplos de vetores de plasmídeo para transformação de células de E. coli incluem, por exemplo, os vetores de expressão pQE (disponíveis em Qiagen, Valencia, CA; ver também literatura publicada por Qiagen que descreve o sistema). Os vetores pQE têm um promotor do fago T5 (reconhecido pela RNA polimerase de E. coli) e um módulo de repressão de operador duplo lac para prover uma expressão altamente regulada e de alto nível de proteínas recombinantes em E. coli, um sítio sintético de ligação ribossômica (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência de codificação de etiqueta 6XHis, terminadores transcricionais t0 e T1, origem de replicação ColE1, e um gene de beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vetores pQE permitem a colocação de uma etiqueta 6xHis no terminal N ou C da proteína recombinante. Tais plasmídeos incluem pQE 32, pQE 30 e pQE 31 que provêm múltiplos sítios de clonagem para todos os três quadros de leitura e provêm a expressão de proteínas etiquetadas com 6xHis no terminal N. Outros vetores de plasmídeo de exemplo para transformação de células de E. coli incluem, por exemplo, os vetores de expressão pET (ver Patente U.S. N° 4.952.496; disponível em Novagen, Madison, WI; ver também literatura publicada por Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmídeos incluem o pET 11a, que contém o promotor T7lac, o terminador T7, o operador lac de E. coli induzível, e o gene repressor lac; pET 12a-c, que contém o promotor T7, o terminador T7, e o sinal de secreção ompT de E. coli; e pET 15b e pET19b (Novagen, Madison, WI), que contêm uma sequência líder His-Tag™ para uso na purificação com uma coluna His e um sítio de clivagem de trombina que permite a clivagem após a purificação sobre a coluna, a região promotora de T7-lac e o terminador T7.
[00343] Tipicamente, os vetores podem ser plasmídeos, virais ou outros conhecidos na técnica, usados para a expressão do polipeptídeo MTSP-1 modificado in vivo ou in vitro. Por exemplo, o polipeptídeo MTSP-1 modificado é expressado em células de mamíferos, incluindo, por exemplo,
células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).
[00344] Vetores virais, tais como, vetores de adenovírus, retrovírus ou vírus vaccinia, podem ser empregados. Em alguns exemplos, o vetor é um retroviral com defeito ou atenuado ou outro vetor viral (ver Patente U.S. N° 4.980.286). Por exemplo, pode ser usado um vetor retroviral (ver Miller et al. (1993) Meth. Enzymol. 217: 581-599). Estes vetores retrovirais foram modificados para excluir sequências retrovirais que não são necessárias para empacotamento do genoma viral e integração no DNA da célula hospedeira. Em alguns exemplos, vírus armados com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo MTSP-1 modificado podem facilitar sua replicação e se espalhar dentro de um tecido alvo. O vírus também pode ser um vírus lítico ou um vírus não lítico, em que o vírus se replica seletivamente sob um promotor específico de tecido. À medida que os vírus se replicam, a coexpressão do polipeptídeo MTSP-1 com genes virais facilitará a disseminação do vírus in vivo.
4. Expressão
[00345] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser produzidos por qualquer método conhecido dos técnicos no assunto, incluindo métodos in vivo e in vitro. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser expressados em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades e formas necessárias das proteínas, tal como por exemplo, necessárias para administração e tratamento. Os hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos, tais como, E. coli, leveduras, plantas, células de insetos, células de mamíferos, incluindo linhas celulares humanas e animais transgênicos. Os hospedeiros de expressão podem diferir em seus níveis de produção de proteínas, bem como nos tipos de modificações pós- traducionais presentes nas proteínas expressadas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nesses e em outros fatores, tais como considerações regulatórias e de segurança, custos de produção e necessidade e métodos de purificação. O especialista está bem equipado para selecionar hospedeiros e vetores apropriados.
[00346] Muitos vetores de expressão estão disponíveis e são conhecidos dos técnicos no assunto e podem ser usados para expressão de proteínas. A escolha do vetor de expressão será influenciada pela escolha do sistema de expressão do hospedeiro. Em geral, os vetores de expressão podem incluir promotores de transcrição e, opcionalmente, intensificadores, sinais de tradução e sinais de terminação de transcrição e tradução. Os vetores de expressão que são usados para transformação estável tipicamente têm um marcador selecionável que permite a seleção e a manutenção das células transformadas. Em alguns casos, uma origem de replicação pode ser usada para amplificar o número de cópias do vetor.
[00347] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados também podem ser utilizados ou expressados como fusões de proteínas. Por exemplo, uma fusão enzimática pode ser gerada para adicionar funcionalidade adicional a uma enzima. Exemplos de proteínas de fusão enzimática incluem, mas não estão limitados a, fusões de uma sequência sinal, uma etiqueta, tal como para localização, por exemplo, uma etiqueta his6 ou uma etiqueta myc, ou uma etiqueta para purificação, por exemplo, uma fusão GST e uma sequência para direcionar a secreção de proteínas e/ou associação de membrana.
[00348] Por exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 modificado descrito na presente invenção é aquele que é gerado pela expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica o domínio da protease apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-4, 11-13 e 21-59 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 84%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência com uma sequência apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-4, 11-13 e 21-59.
[00349] Para a produção a longo prazo e de alto rendimento de proteínas recombinantes, é desejável uma expressão estável. Por exemplo, linhas celulares que expressam estavelmente um polipeptídeo MTSP-1 modificado podem ser transformadas usando vetores de expressão que contêm origens virais de replicação ou elementos de expressão endógenos e um gene marcador selecionável. Após a introdução do vetor, as células podem crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meio seletivo. A finalidade do marcador selecionável é conferir resistência à seleção, e sua presença permite o crescimento e a recuperação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. As células resistentes de células estavelmente transformadas podem ser proliferadas usando técnicas de cultura de tecidos apropriadas aos tipos de células.
[00350] Qualquer número de sistemas de seleção pode ser usado para recuperar linhas de células transformadas. Isso inclui, mas não limitado a, genes de timidina quinase do vírus do herpes simplex (Wigler et al., (1977) Cell 11:223-
232) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy I et al. (1980) Cell 22:817-23), que podem ser empregados em células TK ou APRT, respectivamente. Além disso, a resistência a antimetabólitos, antibióticos ou herbicidas pode ser usada como base para a seleção. Por exemplo, DHFR, que confere resistência ao metotrexato (Wigler M et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, 77:3567-70); npt, que confere resistência a aminoglicosídeos neomicina e G-418 (Colbere-Garapin F et al. (1981) J. Mol. Biol., 150:1-14); e als ou pat, que conferem resistência a clorossulfuron e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente, podem ser usados. Genes selecionáveis adicionais foram descritos, por exemplo, trpB, que permite que as células utilizem indol em vez de triptofano ou hisD, o que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina (Hartman SC e RC Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci, 85:8047-8051). Marcadores visíveis, tais como mas não limitados a, antocianinas, beta glucuronidase e seu substrato, GUS e luciferase e seu substrato luciferina, também podem ser usados para identificar transformantes e também para quantificar a quantidade de expressão de proteína transitória ou estável atribuível a um determinado sistema vetorial (Rhodes CA et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
[00351] A presença e a expressão de polipeptídeos MTSP- 1 podem ser monitoradas. Por exemplo, a detecção de um polipeptídeo funcional pode ser determinada testando o meio condicionado quanto à atividade da enzima hialuronidase sob condições apropriadas. Ensaios de exemplo para avaliar a solubilidade e a atividade de proteínas expressadas são providos na presente invenção.
a. Células Procarióticas
[00352] Os procariotas, especialmente E. coli, provêm um sistema para a produção de grandes quantidades de proteínas. A transformação de E. coli é uma técnica simples e rápida bem conhecida dos técnicos no assunto. Os vetores de expressão para E. coli podem conter promotores induzíveis, tais promotores são úteis para induzir altos níveis de expressão de proteínas e para expressar proteínas que exibem alguma toxicidade para as células hospedeiras. Exemplos de promotores induzíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor híbrido tac, os promotores de RNA T7 e SP6 e o promotor λPL regulado pela temperatura.
[00353] Proteínas, tais como as providas na presente invenção, podem ser expressadas no ambiente citoplasmático de E. coli. O citoplasma é um ambiente redutor e, para algumas moléculas, isso pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Agentes redutores, tais como, ditiotreotol e β-mercaptoetanol e desnaturantes, tais como, guanidina-HCl e uréia, podem ser usados para ressolubilizar as proteínas. Uma abordagem alternativa é a expressão de proteínas no espaço periplásmico de bactérias que provê um ambiente oxidante e semelhantes a chaperonina e isomerases dissulfeto e pode levar à produção de proteína solúvel. Tipicamente, uma sequência líder é fundida à proteína a ser expressada, que direciona a proteína para o periplasma. O líder é então removido por peptidases sinal no interior do periplasma. Exemplos de sequências líderes de direcionamento periplásmico incluem o líder pelB do gene da pectato liase e o líder derivado do gene da fosfatase alcalina. Em alguns casos, a expressão periplásmica permite o vazamento da proteína expressada no meio de cultura. A secreção de proteínas permite a purificação rápida e simples do sobrenadante da cultura. Proteínas que não são secretadas podem ser obtidas no periplasma por lise osmótica. Semelhante à expressão citoplasmática, em alguns casos as proteínas podem se tornar insolúveis e desnaturantes e agentes redutores podem ser usados para facilitar a solubilização e redobramento. A temperatura de indução e crescimento também pode influenciar os níveis de expressão e a solubilidade, tipicamente são usadas temperaturas entre 25°C e 37°C. Tipicamente, as bactérias produzem proteínas aglicosiladas. Assim, se as proteínas exigirem glicosilação para a função, a glicosilação pode ser adicionada in vitro após purificação das células hospedeiras. b. Células de Levedura
[00354] Leveduras, tais como, Saccharomyces cerevisae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiros de expressão de levedura bem conhecidos que podem ser usados para a produção de proteínas, tal como descrito na presente invenção. A levedura pode ser transformada com vetores replicantes epissomais ou por integração cromossômica estável por recombinação homóloga. Tipicamente, promotores induzíveis são usados para regular a expressão de genes. Exemplos de tais promotores incluem os promotores GAL1, GAL7 e GAL5 e metalotioneína, tais como, CUP1, AOX1 ou outro Pichia ou outro promotor de levedura. Os vetores de expressão geralmente incluem um marcador selecionável, tais como, LEU2, TRP1, HIS3 e URA3 para seleção e manutenção do DNA transformado. Proteínas expressadas em leveduras são frequentemente solúveis. A coexpressão com chaperoninas, tal como BiP e proteína dissulfeto isomerase, pode melhorar os níveis de expressão e solubilidade. Adicionalmente, proteínas expressadas em levedura podem ser direcionadas para secreção usando fusões peptídicas de sinal de secreção, tal como o sinal de secreção de fator alfa do tipo associação de levedura de Saccharomyces cerevisae e fusões com proteínas da superfície celular de leveduras, tal como o receptor de adesão de associação Aga2p ou a glucoamilase de Arxula adeninivorans. Um sítio de clivagem de protease, tal como a Kex-2 protease, pode ser manipulado para remover as sequências fundidas dos polipeptídeos expressados à medida que saem da via de secreção. A levedura também é capaz de glicosilação nos motivos Asn-X-Ser/Thr. c. Insetos e Células de Insetos
[00355] As células de insetos, particularmente usando a expressão de baculovírus, são úteis para expressar polipeptídeos, tais como polipeptídeos MTSP-1. As células de insetos expressam altos níveis de proteína e são capazes da maioria das modificações pós-traducionais usadas pelos eucariotas superiores. Os baculovírus têm uma faixa restrita de hospedeiros que melhora a segurança e reduz as preocupações regulatórias da expressão eucariótica. Os vetores de expressão típicos usam um promotor para expressão de alto nível, tal como o promotor da poliedrina do baculovírus. Os sistemas de baculovírus comumente usados incluem os baculovírus, tal como vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV), e o vírus da poliedrose nuclear Bombyx mori (BmNPV) e uma linha de células de insetos, tal como Sf9, derivada de Spodoptera frugiperda,
Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpN1). Para expressão de alto nível, a sequência de nucleotídeos da molécula a ser expressada é fundida imediatamente a jusante do códon de iniciação da poliedrina do vírus. Os sinais de secreção de mamíferos são processados com precisão nas células de insetos e podem ser usados para secretar a proteína expressa no meio de cultura. Adicionalmente, as linhas celulares Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpN1) produzem proteínas com padrões de glicosilação semelhantes aos sistemas celulares de mamíferos. Células de inseto de exemplo são aquelas que foram alteradas para reduzir a imunogenicidade, incluindo aquelas com vetores de expressão de baculovírus “mamíferos” e aquelas que não possuem a enzima FT3.
[00356] Um sistema de expressão alternativo nas células de insetos é o uso de células estavelmente transformadas. Linhas de células, tais como as células Schnieder 2 (S2) e Kc (Drosophila melanogaster) e células C7 (Aedes albopictus) podem ser usadas para expressão. O promotor de metalotioneína de Drosophila pode ser usado para induzir altos níveis de expressão na presença de indução de metais pesados com cádmio ou cobre. Os vetores de expressão são tipicamente mantidos pelo uso de marcadores selecionáveis, tais como neomicina e higromicina. d. Expressão de Mamíferos
[00357] Os sistemas de expressão em mamíferos podem ser usados para expressar proteínas incluindo polipeptídeos MTSP-1. As construções de expressão podem ser transferidas para células de mamíferos por infecção viral, tal como adenovírus, ou por transferência direta de DNA, tais como,
lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e por meios físicos, tais como, eletroporação e microinjeção.
Os vetores de expressão para células de mamífero incluem tipicamente um sítio de capa de mRNA, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação de tradução (sequência de consenso de Kozak) e elementos de poliadenilação.
Os elementos IRES também podem ser adicionados para permitir a expressão bicistrônica com outro gene, tal como um marcador selecionável.
Tais vetores incluem frequentemente intensificadores de promotores de transcrição para expressão de alto nível, por exemplo, o intensificador de promotor SV40, o promotor do citomegalovírus humano (CMV) e a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Esses intensificadores de promotores são ativos em muitos tipos de células.
Também podem ser usados promotores de tipo tecidos e célula e regiões intensificadoras.
As regiões promotoras/intensificadoras de exemplo incluem, mas não estão limitadas a, de genes, tais como, elastase I, insulina, imunoglobulina, vírus de tumor mamário em camundongos, albumina, alfa-fetoproteína, alfa-1 antitripsina, beta globina, proteína básica de mielina, cadeia leve da miosina 2, e controle de gene do hormônio liberador gonadotrópico.
Marcadores selecionáveis podem ser usados para selecionar e manter células com a construção de expressão.
Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, higromicina B fosfotransferase, adenosina desaminase, xantina guanina fosforibosil transferase, aminoglicosídeo fosfotransferase, diidrofolato redutase (DHFR) e timidina quinase.
Por exemplo, a expressão pode ser realizada na presença de metotrexato para selecionar apenas as células que expressam o gene DHFR. A fusão com moléculas de sinalização da superfície celular, tais como TCR-ζ e FcεRI-γ, pode direcionar a expressão das proteínas em um estado ativo na superfície celular.
[00358] Muitas linhas celulares estão disponíveis para expressão em mamíferos, incluindo células de camundongo, rato, humano, macaco, galinha e hamster. Exemplos de linhas celulares incluem, mas não estão limitadas a, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, camundongo NS0 (não secretável) e outras linhas celulares de mieloma, linhas celulares de hibridoma e hetero- hibridoma, linfócitos, fibroblastos, células Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8 e HKB. Também estão disponíveis linhas celulares adaptadas a meios isentos de soro, o que facilita a purificação de proteínas secretadas dos meios de cultura de células. Os exemplos incluem células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, número de catálogo 11619-012) e a linha celular EBNA-1 livre de soro (Pham et al. (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.). Também estão disponíveis linhas celulares adaptadas para crescer em meios especiais otimizados para expressão máxima. Por exemplo, as células DG44 CHO são adaptadas para crescer em cultura de suspensão em um meio quimicamente definido, livre de produtos de origem animal. e. Plantas
[00359] Células vegetais transgênicas e plantas podem ser usadas para expressar proteínas, tais como as descritas na presente invenção. As construções de expressão são tipicamente transferidas para plantas usando transferência direta de DNA, tal como bombardeio de microprojetos e transferência mediada por PEG em protoplastos, e com transformação mediada por agrobactérias. Os vetores de expressão podem incluir sequências promotoras e intensificadoras, elementos de terminação transcricional e elementos de controle de tradução. Os vetores de expressão e as técnicas de transformação são geralmente divididos entre hospedeiros dicotiledôneas, tais como Arabidopsis e tabaco, e hospedeiros monocotiledôneas, tais como milho e arroz. Exemplos de promotores de plantas usados para expressão incluem o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, o promotor da nopalina sintase, o promotor da ribose bisfosfato carboxilase e os promotores de ubiquitina e UBQ3. Marcadores selecionáveis, tais como, higromicina, fosfomanose isomerase e neomicina fosfotransferase são frequentemente usados para facilitar a seleção e a manutenção de células transformadas. As células vegetais transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido caloso) ou regeneradas em plantas inteiras. As células vegetais transgênicas também podem incluir algas manipuladas para produzir polipeptídeos de hialuronidase. Como as plantas têm padrões de glicosilação diferentes das células dos mamíferos, isso pode influenciar a escolha da proteína produzida nesses hospedeiros.
5. Purificação
[00360] As células hospedeiras transformadas com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo MTSP-1 modificado podem ser cultivadas em condições adequadas para a expressão e a recuperação da proteína codificada a partir da cultura de células. A proteína produzida por uma célula recombinante é geralmente projetada para ser secretada, mas pode ser contida intracelularmente,
dependendo da sequência e/ou do vetor usada(o). Como será entendido pelos técnicos no assunto, os vetores de expressão contendo ácido nucleico que codificam MTSP-1 podem ser projetados com sequências sinais que facilitam a secreção direta de MTSP-1 através da membrana celular procariótica ou eucariótica.
[00361] Assim, o método para purificação de polipeptídeos a partir de células hospedeiras depende das células hospedeiras e dos sistemas de expressão escolhidos. Para moléculas secretadas, as proteínas são geralmente purificadas do meio de cultura após a remoção das células. Para expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteínas purificadas a partir do extrato. Quando organismos transgênicos, tais como plantas e animais transgênicos, são usados para expressão, tecidos ou órgãos podem ser usados como material de partida para preparar um extrato celular lisado. Adicionalmente, a produção animal transgênica pode incluir a produção de polipeptídeos no leite ou nos ovos, que podem ser coletados e, se necessário, as proteínas podem ser extraídas e adicionalmente purificadas usando métodos padrão na técnica.
[00362] Proteínas, tais como, polipeptídeos MTSP-1 modificados, podem ser purificadas usando técnicas padrão de purificação de proteínas conhecidas na técnica, incluindo, mas não se limitando a, SDS-PAGE, cromatografia por fracionamento e exclusão de tamanho, precipitação de sulfato de amônio e cromatografia de troca iônica, tal como troca aniônica. As técnicas de purificação por afinidade também podem ser utilizadas para melhorar a eficiência e a pureza das preparações. Por exemplo, anticorpos, receptores e outras moléculas que se ligam às proteínas MTSP-1 podem ser usados na purificação por afinidade.
[00363] As construções de expressão também podem ser projetadas para adicionar uma etiqueta de afinidade a uma proteína, tal como uma etiqueta modificadora pequena Semelhante à Ubiquitina (SUMO), epítopo myc, fusão GST ou His6 e afinidade purificada com anticorpo SUMO ou myc, resina de glutationa e resina de Ni, respectivamente. Tais etiquetas podem ser unidas à sequência de nucleotídeos que codifica um MTSP-1 como descrito em outro lugar na presente invenção, o que pode facilitar a purificação de proteínas solúveis. Por exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser expressado como uma proteína recombinante com um ou mais domínio(s) de polipeptídeos adicional(ais) adicionado(s) para facilitar a purificação da proteína. Tais domínios facilitadores da purificação incluem, mas não estão limitados a, peptídeos quelantes de metais, tais como módulos de histidina-triptofano que permitem a purificação em metais imobilizados, domínios de proteína A que permitem a purificação de imunoglobulinas imobilizadas e o domínio utilizado no sistema de purificação de extensão/afinidade FLAGS (Immunex Corp., Seattle Wash.). A inclusão de uma sequência ligante clivável, tal como Fator XA ou a enteroquinase (Invitrogen, San Diego, CA) entre o domínio de purificação e o polipeptídeo MTSP-1 expressado é útil para facilitar a purificação. Um desses vetores de expressão provê a expressão de uma proteína de fusão contendo um polipeptídeo MTSP-1 e um sítio de clivagem de enteroquinase. A etiqueta de Modificador semelhante à Ubiquinina Pequena (SUMO) facilita a purificação em IMIAC (cromatografia por afinidade por íons de metal imobilizados), enquanto o sítio de clivagem da enteroquinase provê um meio para purificar o polipeptídeo da proteína de fusão.
[00364] A pureza pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo eletroforese em gel, métodos HPLC ortogonais, técnicas de coloração e espectrofotometria. A proteína expressada e purificada pode ser analisada usando qualquer ensaio ou método conhecido por um técnico no assunto, por exemplo, qualquer descrito na Seção 5. Isso inclui ensaios com base nas propriedades físicas e/ou funcionais da proteína, incluindo, mas não limitado a, análise por eletroforese em gel, imunoensaio e ensaios de atividade de MTSP-1.
6. Modificações adicionais
[00365] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser modificados para melhorar ou alterar as propriedades farmacocinéticas e farmacológicas. Em particular, os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser conjugados com um polímero, como uma porção PEG ou dextrano ou sialilação para reduzir a imunogenicidade e/ou aumentar a meia-vida no soro e outros fluidos corporais, incluindo humor vítreo. a. PEGuilação
[00366] O polietilenoglicol (PEG) é usado em biomateriais, biotecnologia e medicina, principalmente porque o PEG é um polímero biocompatível, não tóxico e solúvel em água que é tipicamente não imunogênico (Zhao e Harris, ACS Symposium Series 680: 458-72, 1997). Na área de dispensação de medicamentos, os derivados de PEG têm sido amplamente usados na ligação covalente (isto é,
“PEGuilação”) a proteínas para reduzir a imunogenicidade, a proteólise e a depuração renal para aumentar a meia-vida no soro e intensificar a solubilidade (Zalipsky (1995) Adv. Drug Del. Rev. 16:157-82). De forma similar, o PEG foi ligado a fármacos de baixo peso molecular e relativamente hidrofóbicos para intensificar a solubilidade, reduzir a toxicidade e alterar a biodistribuição. Tipicamente, os fármacos PEGuilados são injetados como soluções.
[00367] Uma aplicação relacionada é a síntese de redes ou formulações de PEG degradáveis e reticuladas para uso na dispensação de fármacos, uma vez que grande parte da mesma química usada no projeto de carreadores de fármacos solúveis e degradáveis também pode ser usada no projeto de géis degradáveis (Sawhney et al. (1993) Macromolecules 26: 581- 87). Sabe-se também que complexos intermacromoleculares podem ser formados misturando soluções de dois polímeros complementares. Tais complexos são geralmente estabilizados por interações eletrostáticas (poliânion-policátion) e/ou ligações de hidrogênio (poliácido-polibase) entre os polímeros envolvidos e/ou por interações hidrofóbicas entre os polímeros em um ambiente aquoso (Krupers et al. (1996) Eur. Polym J. 32:785-790). Por exemplo, a mistura de soluções de ácido poliacrílico (PAAc) e óxido de polietileno (PEO) sob condições adequadas resulta na formação de complexo baseados principalmente na ligação de hidrogênio. A dissociação destes complexos em condições fisiológicas tem sido usada para a dispensação de fármacos livres (isto é, não PEGuilados). Adicionalmente, complexos de polímeros complementares foram formados a partir de homopolímeros e copolímeros.
[00368] Numerosos reagentes para PEGuilação são conhecidos como porções de PEG para proteínas terapêuticas. Reagentes e porções de PEG estão disponíveis comercialmente. Tais reagentes incluem, mas não estão limitados a, reação do polipeptídeo com PEG ativado por N-hidroxissuccinimidil (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxissuccinimida, mPEG succinimidil alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidil mPEG butanoato, éster succinimidílico de ácido mPEG carboximetil 3- hidroxibutanoico, PEG-succinimidil propionato homobifuncional, PEG propionaldeído homobifuncional, PEG butiraldeído homobifuncional, PEG maleimida, PEG hidrazida, p-nitrofenil-carbonato PEG, mPEG-benzotriazol carbonato, propionaldeído PEG, mPEG butiraldeído, mPEG2 butiraldeído ramificado, mPEG acetil, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG maleimida “sem ligante”, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioéster, mPEG ortopiridil dissulfeto, Fmoc- PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, vinilssulfona PEG-NHS, acrilato PEG- NHS, fluoresceína PEG-NHS, e biotina PEG-NHS (ver, por exemplo, Monfardini et al.(1995) Bioconjugate Chem. 6:62-69; Veronese et al. (1997) J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207; U.S. 5.672.662; U.S. 5.932.462; U.S. 6.495.659; U.S. 6.737.505; U.S. 4.002.531; U.S. 4.179.337; U.S.
5.122.614; U.S. 5.324.844; U.S. 5.446.090; U.S. 5.612.460; U.S. 5.643.575; U.S. 5.766.581; U.S. 5.795.569; U.S.
5.808.096; U.S. 5.900.461; U.S. 5.919.455; U.S. 5.985.263; U.S. 5.990.237; U.S. 6.113.906; U.S. 6.214.966; U.S.
6.258.351; U.S. 6.340.742; U.S. 6.413.507; U.S. 6.420.339; U.S. 6.437.025; U.S. 6.448.369; U.S. 6.461.802; U.S.
6.828.401; U.S. 6.858.736; U.S. 2001/0021763; U.S.
2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; WO 05/00360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 00/02017; WO 02/49673; WO 94/28024; e WO 01/87925).
[00369] Em um exemplo, o polietileno glicol tem um peso molecular que varia de cerca de 3 kDa (4,982x10-24 kg) a cerca de 50 kDa (8,303x10-23 kg) e tipicamente de cerca de 5 kDa (8,303x10-24 kg) a cerca de 30 kDa (4,982x10-23 kg). A ligação covalente do PEG ao fármaco (conhecida como “PEGuilação”) pode ser realizada por técnicas conhecidas de síntese química. Por exemplo, a PEGuilação de proteína pode ser realizada reagindo o PEG ativado por NHS com a proteína sob condições de reação adequadas.
[00370] Embora inúmeras reações tenham sido descritas para PEGuilação, as que são geralmente aplicáveis conferem direcionalidade, usam condições de reação moderadas e não necessitam de processamento extensivo a jusante para remover catalisadores ou biprodutos tóxicos. Por exemplo, o monometoxi PEG (mPEG) tem apenas um hidroxil terminal reativo e, portanto, seu uso limita parte da heterogeneidade da mistura de produtos de PEG-proteína resultante. A ativação do grupo hidroxila no final do polímero oposto ao grupo metoxi terminal é geralmente necessária para realizar uma PEGuilação de proteína eficiente, com o objetivo de tornar o PEG derivado mais suscetível ao ataque nucleofílico. O nucleófilo atacante é usualmente o grupo épsilon-amino de um resíduo lisil, mas outras aminas também podem reagir (por exemplo, a alfa-amina N-terminal ou as aminas do anel da histidina) se as condições locais forem favoráveis. Uma ligação mais direcionada é possível em proteínas contendo uma única lisina ou cisteína. O último resíduo pode ser direcionado por PEG-maleimida para modificação específica de tiol. Alternativamente, a hidrazida de PEG pode ser reagida com uma enzima degradadora de hialuronano oxidada por periodato e reduzida na presença de NaCNBH3. Mais especificamente, os açúcares CMP PEGuilados podem reagir com uma enzima degradadora de hialuronano na presença de glicosil-transferases apropriadas. Uma técnica é a técnica de “PEGuilação”, em que várias moléculas poliméricas são acopladas ao polipeptídeo em questão. Ao usar esta técnica, o sistema imunológico tem dificuldades em reconhecer os epítopos na superfície do polipeptídeo responsáveis pela formação de anticorpos, reduzindo assim a resposta imune. Para polipeptídeos introduzidos diretamente no sistema circulatório do corpo humano para fornecer um efeito fisiológico específico (isto é, produtos farmacêuticos), a resposta imune potencial típica é uma resposta de IgG e/ou IgM, enquanto polipeptídeos que são inalados pelo sistema respiratório (isto é, polipeptídeo industrial) potencialmente pode causar uma resposta IgE (isto é, resposta alérgica). Uma das teorias que explicam a resposta imune reduzida é que a(s) molécula(s) polimérica(s) protegem o(s) epítopo(s) na superfície do polipeptídeo responsável pela resposta imune que leva à formação do anticorpo. Outra teoria ou pelo menos um fator parcial é que, quanto mais pesado o conjugado, mais resposta imunológica reduzida é obtida.
[00371] Tipicamente, para produzir o polipeptídeo MTSP-
1 modificado PEGuilado provido na presente invenção, as porções de PEG são conjugadas, por meio de ligação covalente, aos polipeptídeos. As técnicas para PEGuilação incluem, mas não estão limitadas a, ligantes especializados e químicas de acoplamento (ver, por exemplo, Harris (2002) Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 459-476), ligação de várias porções de PEG a um único sítio de conjugação (tal como via uso de PEGs ramificados; ver, por exemplo, Veronese et al. (2002) Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 177-180), PEGuilação específica do local e/ou mono-PEGuilação (ver, por exemplo, Chapman et al. (1999) Nature Biotech. 17:780-783), e PEGuilação enzimática direcionada ao sítio (ver, por exemplo, Sato (2002), Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504). Os métodos e as técnicas descritos na técnica podem produzir proteínas tendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais de 10 PEG ou derivados de PEG ligados a uma molécula de proteína única (ver, por exemplo, Publicação da Patente U.S. Nº 2006/0104968). b. Proteínas de Fusão
[00372] Preparação de fusões de proteínas terapêuticas para outras porções, tal como PEGuilação, conjugação com albumina, porções direcionadas, tais como anticorpos e fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, imunoglobulinas, fusões fc, fusão com albumina (HSA), proteínas de fusão XTEN, modificação dos padrões de glicosilação são conhecidos (ver Strohl (2015) BioDrugs 29:215-239 para uma revisão de uma variedade de proteínas de fusão para melhorar as propriedades farmacocinéticas das proteínas terapêuticas). Qualquer uma dessas modalidades conhecidas para melhorar as propriedades farmacológicas da terapia pode ser aplicada aos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção.
[00373] Proteínas de fusão contendo um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção e um ou mais outros polipeptídeo(s) também é(são) provido(s). São providas composições farmacêuticas contendo essas proteínas de fusão formuladas para administração por uma via adequada. As proteínas de fusão são formadas ligando em qualquer ordem o polipeptídeo MTSP-1 modificado e outro polipeptídeo, tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo, fator de crescimento, receptor, ligando e outro agente para finalidades de facilitar a purificação de uma protease, alterando as propriedades farmacodinâmicas de um polipeptídeo MTSP-1 direcionando o polipeptídeo MTSP-1 modificado para um(a) célula ou tecido alvo e/ou aumentando a expressão ou secreção de um polipeptídeo MTSP-1 modificado. Dentro de uma proteína de fusão do polipeptídeo MTSP-1 modificada, o polipeptídeo MTSP-1 modificado pode corresponder a toda ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo de um polipeptídeo MTSP-1. Em algumas modalidades, o polipeptídeo MTSP-1 ou sua porção cataliticamente ativa é um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção. As proteínas de fusão providas na presente invenção retêm substancialmente toda a sua especificidade e/ou seletividade para a proteína C3 do complemento. Geralmente, os polipeptídeos de fusão MTSP-1 retêm pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de especificidade do substrato e/ou seletividade em comparação com um poleipeptídeo MTSP-1 sem fusão, incluindo especificidade do substrato de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 sem fusão.
[00374] A ligação de um polipeptídeo MTSP-1 modificado e outro polipeptídeo pode ser efetuada direta ou indiretamente através de um ligante. Em um exemplo, a ligação pode ser por ligação química, tal como por meio de agentes heterobifuncionais ou ligações tiol ou outras dessas ligações. A fusão de um polipeptídeo MTSP-1 com outro polipeptídeo pode ser no terminal N ou C do polipeptídeo MTSP-1. Exemplos não limitativos de polipeptídeos que podem ser usados em proteínas de fusão com um polipeptídeo MTSP-1 modificado provido na presente invenção incluem, por exemplo, um polipeptídeo GST (glutationa S-transferase), domínio Fc da imunoglobulina G, ou uma sequência sinal heteróloga. As proteínas de fusão podem conter componentes adicionais, tais como proteína de ligação maltose de E. coli (MBP) que auxiliam na absorção da proteína pelas células (ver Publicação de Patente Internacional N° WO 01/32711).
[00375] Uma proteína de fusão de polipeptídeo MTSP-1 pode ser produzida por técnicas recombinantes padrão. Por exemplo, os fragmentos de DNA que codificam as diferentes sequências de polipeptídeos podem ser ligados juntos em quadro, de acordo com técnicas convencionais, por exemplo, empregando terminais com extremidade cega ou extremidade coesiva para ligação, digestão com enzimas de restrição para prover terminais apropriados, preenchimento de extremidades coesivas como apropriado, tratamento com fosfatase alcalina para evitar junções indesejáveis e ligação enzimática. Em uma outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais, incluindo sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de genes pode ser realizada usando iniciadores de âncora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem ser subsequentemente anelados e amplificados novamente para gerar uma sequência de genes quiméricos (ver, por exemplo, Ausubel et al. (eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Filhos, 1992). Além disso, estão disponíveis comercialmente muitos vetores de expressão que já codificam uma porção de fusão (por exemplo, um polipeptídeo GST). Um ácido nucleico que codifica MTSP-1 pode ser clonado em um vetor de expressão de modo que a porção de fusão esteja ligada no quadro ao polipeptídeo MTSP-1.
[00376] As proteínas de fusão Fc, fusão com albumina sérica humana, fusão com peptídeo carboxi-terminal são modificações conhecidas para melhorar a farmacocinética de peptídeos ou fármacos biológicos. Entre estes está a conjugação com monometoxi polietilenoglicol (PEG) de cadeia linear ou ramificada, resultando em aumentos na massa molecular e no raio hidrodinâmico, e uma diminuição na taxa de filtração glomerular pelo rim.
[00377] Outra abordagem para melhorar os parâmetros farmacocinéticos inclui a modificação dos padrões de glicosilação, resultando em depuração reduzida e extensão da meia-vida.
7. Moléculas de Ácido Nucleico
[00378] As moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos MTSP-1 são providas na presente invenção. As moléculas de ácido nucleico incluem variantes alélicas ou variantes de splicing de qualquer polipeptídeo MTSP-1 codificado, ou porção cataliticamente ativa do mesmo. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico providas na presente invenção têm pelo menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ou 99% de identidade de sequência ou hibridizam sob condições de meio ou alta estringência ao longo de pelo menos 70% do comprimento completo de qualquer polipeptídeo MTSP-1 codificado por ácido nucleico ou porção cataliticamente ativa do mesmo. Em outra modalidade, uma molécula de ácido nucleico pode incluir aquelas com sequências de códons degeneradas de qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 ou porções cataliticamente ativas dos mesmos, tais como as providas na presente invenção. Moléculas de ácido nucleico de exemplo, codificando proteases de andaime ou modificadas, ou porções cataliticamente ativas das mesmas, têm uma sequência de nucleotídeos, como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 60-98.
[00379] Também são providas moléculas de ácido nucleico, ou proteínas de fusão que contêm uma porção cataliticamente ativa de uma molécula de ácido nucleico, ligada operacionalmente a um promotor, tal como um promotor induzível para expressão em células de mamíferos. Tais promotores incluem, mas não estão limitados a, promotores CMV e SV40; promotores de adenovírus, tal como o promotor do gene E2, que responde à oncoproteína E7 do HPV; um promotor de PV, tal como o promotor PBV p89, que responde à proteína PV E2; e outros promotores que são ativados pelo HIV ou PV ou oncogenes.
[00380] Uma protease MTSP-1 provida na presente invenção, também pode ser dispensada às células em vetores de transferência de genes. Os vetores de transferência também podem codificar outros agentes terapêuticos adicionais para o tratamento da doença ou do distúrbio, tal como artrite reumatoide ou doença cardiovascular ou DMRI ou DGF, para os quais a protease é administrada. Os vetores de transferência que codificam uma protease podem ser usados sistemicamente, administrando o ácido nucleico a um indivíduo. Por exemplo, o vetor de transferência pode ser um vetor viral, tal como um vetor de adenovírus. Os vetores que codificam uma protease também podem ser incorporados nas células tronco e essas células tronco são administradas a um indivíduo, tal como por meio do transplante ou enxerto das células tronco nos sítios para terapia. Por exemplo, as células tronco mesenquimais (CTMs) podem ser manipuladas para expressar uma protease e essas CTMs enxertadas em um sítio de transplante para terapia. G. COMPOSIÇÕES, FORMULAÇÕES E DOSAGENS
[00381] As composições farmacêuticas contendo polipeptídeos MTSP-1 modificados, proteínas de fusão MTSP-1 modificadas ou moléculas de ácido nucleico codificadoras, podem ser formuladas de qualquer maneira convencional, misturando uma quantidade selecionada do polipeptídeo com um ou mais carreadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. A seleção do carreador ou excipiente está dentro da habilidade da profissão administradora e pode depender de vários parâmetros. Estes incluem, por exemplo, o modo de administração (isto é, sistêmico, oral, nasal, pulmonar, local, tópico ou qualquer outro modo) e o distúrbio tratado. As composições farmacêuticas providas na presente invenção podem ser formuladas para administração de dose única (direta) ou para diluição ou outra modificação. As concentrações dos compostos nas formulações são eficazes para a dispensação de uma quantidade, após administração,
que é eficaz para o tratamento pretendido. Tipicamente, as composições são formuladas para administração de dosagem única. Para formular uma composição, a fração em peso de um composto ou uma mistura é dissolvida, em suspensão, dispersada ou misturada de outro modo em um veículo selecionado a uma concentração eficaz, de modo que a condição tratada seja aliviada ou melhorada. Os carreadores ou veículos farmacêuticos adequados para administração dos compostos providos na presente invenção incluem quaisquer carreadores conhecidos pelos técnicos no assunto como adequados para o modo particular de administração.
1. Administração de Polipeptídeos MTSP-1 Modificados
[00382] Os polipeptídeos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos. Os polipeptídeos podem ser direcionados para dispensação, tal como por conjugação com um agente de direcionamento, tal como um anticorpo. As suspensões lipossomais, incluindo lipossomas direcionados a tecidos, também podem ser adequados como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, as formulações de lipossomas podem ser preparadas como descrito na Patente U.S. N° 4.522.811. A dispensação lipossômica também pode incluir formulações de liberação lenta, incluindo matrizes farmacêuticas, tais como géis de colágeno e lipossomas modificados com fibronectina (ver, por exemplo, Weiner et al. (1985) J Pharm Sci. 74(9): 922-5).
[00383] O composto ativo é incluído no carreador farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no indivíduo tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando os compostos em sistemas conhecidos in vitro e in vivo, tais como os ensaios providos na presente invenção.
[00384] Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção (isto é, compostos ativos) podem ser administrados in vitro, ex vivo ou in vivo entrando em contato com uma mistura, tal como um fluido corporal, tal como o vítreo, ou outra amostra de tecido, com um polipeptídeo MTSP-1 provido na presente invenção, incluindo qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Por exemplo, ao administrar um composto ex vivo, uma amostra de fluido corporal ou tecido de um indivíduo pode ser contatada com os polipeptídeos MTSP-1 que são revestidos em um tubo ou filtro, tal como, por exemplo, um filtro verdadeiro ou em uma máquina de redirecionamento. Ao administrar in vivo, os compostos ativos podem ser administrados por qualquer via apropriada, por exemplo, por via oral, nasal, pulmonar, parenteral, intravenosa, intradérmica, intravítrea, periocular, subcutânea ou tópica, na forma líquida, semilíquida ou sólida e são formulados de uma maneira adequada para cada via de administração. A determinação da dosagem está dentro da habilidade do médico, e pode ser uma função do distúrbio específico, da via de administração e do indivíduo. Dosagens de exemplo serão dosadas em 0,1-1 mg.
[00385] O polipeptídeo MTSP-1 modificado e os sais e solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração por inalação (através da boca ou do nariz), administração oral, transdérmica, pulmonar, parenteral ou retal. Para administração por inalação, o polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser dispensado na forma de uma apresentação em spray de aerossol a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador com o uso de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada provendo uma válvula para prover uma quantidade medida. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador, podem ser formulados contendo uma mistura em pó de um composto terapêutico e uma base de pó adequada, tal como lactose ou amido.
[00386] Para administração pulmonar aos pulmões, o polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser dispensado na forma de uma apresentação em spray aerossol a partir de um nebulizador, turbonebulizador, ou um inalador oral de dose controlada por microprocessador, com o uso de um propulsor adequado. Geralmente, o tamanho de partícula do aerossol é pequeno, tal como na faixa de 0,5 a 5 mícrons. No caso de uma composição farmacêutica formulada para administração pulmonar, os tensoativos detergentes não são tipicamente usados. A dispensação de fármacos pulmonares é um método não invasivo promissor de administração sistêmica. Os pulmões representam uma via atraente para a dispensação de fármacos, principalmente devido à alta área superficial para absorção, epitélio alveolar fino, vascularização extensa, falta de metabolismo hepático de primeira passagem e atividade metabólica relativamente baixa.
[00387] Para administração oral, as composições farmacêuticas podem assumir a forma de, por exemplo, comprimidos, pílulas, suspensões líquidas ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como, agentes de ligação (por exemplo, amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica. As preparações líquidas para administração oral podem assumir a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou podem ser apresentadas como um produto seco para constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As preparações também podem conter sais tampão, flavorizantes, colorantes e adoçantes, como apropriado.
[00388] As preparações para administração oral podem ser formuladas para liberação controlada do composto ativo. Para administração bucal, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de maneira convencional.
[00389] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de ação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos terapêuticos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.
[00390] O polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser formulado para administração parentérica por injeção (por exemplo, por injeção em bolus ou infusão contínua). As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem unitária (por exemplo, em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas) com um conservante adicionado. As composições podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma liofilizada em pó para constituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril sem pirogênio, antes do uso.
[00391] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser formulados para dispensação ocular ou oftálmica. A dispensação ocular de fármacos inclui, por exemplo, tópica, oral ou sistêmica e/ou injetada. Por exemplo, um polipeptídeo(s) MTSP-1 modificado(s) ou composição farmacêutica contendo um polipeptídeo(s) MTSP-1 modificado(s) pode ser administrado(a) topicamente, tal como na forma de colírio. Em outro exemplo, um polipeptídeo(s) MTSP-1 modificado(s) ou uma composição farmacêutica contendo um polipeptídeo MTSP-1 modificado pode(m) ser administrado(a)(s) por administração periocular e/ou intravítrea, tal como, por exemplo, por injeção(ões) periocular(es) ou intravítrea(s).
[00392] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados ou composição farmacêutica contendo polipeptídeos MTSP-1 modificados ou ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser formulados para administração sistêmica para tratamento de DGF. Em outro exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados ou a composição farmacêutica contendo polipeptídeos MTSP-1 modificados ou ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos MTSP-1 modificados são diretamente infundidos ou injetados no rim ou nos tecidos ou órgãos adjacentes ou ao redor do rim transplantado. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados ou a composição farmacêutica contendo polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser administrados antes do tempo do transplante de aloenxerto ou no momento do transplante com a administração continuando de maneira crônica, e/ou podem ser administrados durante um episódio de rejeição caso em que um episódio ocorra.
[00393] As composições farmacêuticas podem ser formuladas para aplicação local ou tópica, tal como para aplicação tópica na pele (transdérmica) e membranas mucosas, tal como no olho, na forma de géis, cremes e loções e para aplicação no olho ou para aplicação intracisternal ou intraespinal. Tais soluções, particularmente aquelas destinadas ao uso oftálmico, podem ser formuladas como soluções isotônicas de 0,01% a 10% e pH cerca de 5-7 com sais apropriados. Os compostos podem ser formulados como aerossóis para aplicação tópica, tal como por inalação (ver, por exemplo, Patentes U.S. Nºs 4.044.126, 4.414.209 e
4.364.923, que descrevem aerossóis para dispensação de um esteroide útil no tratamento de doenças inflamatórias, particularmente asma).
[00394] A concentração do composto ativo na composição do fármaco depende das taxas de absorção, inativação e excreção do composto ativo, o esquema de dosagem e a quantidade administrada, bem como outros fatores conhecidos dos técnicos no assunto. Como descrito mais adiante na presente invenção, as dosagens podem ser determinadas empiricamente usando comparações de propriedades e atividades (por exemplo, clivagem de uma ou mais proteína(s) do complemento) do polipeptídeo MTSP-1 modificado em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 tipo não modificado e/ou selvagem e/ou de referência.
[00395] As composições, se desejado, podem ser apresentadas em uma embalagem, em um kit ou dispositivo dispensador, que pode conter uma ou mais das formas de dosagem unitárias contendo o ingrediente ativo. Em alguns exemplos, a composição pode ser revestida em um dispositivo, tal como, por exemplo, em um tubo ou filtro, por exemplo, em uma máquina de redirecionamento. A embalagem, por exemplo, contém papel de metal ou plástico, tal como uma embalagem de bolhas. A embalagem ou o dispositivo dispensador pode ser acompanhada(o) de instruções para administração. As composições que contêm os agentes ativos podem ser acondicionadas como artigos de fabricação contendo material de acondicionamento, um agente provido na presente invenção, e um rotulador que indica o distúrbio para o qual o agente é provido.
[00396] Também são providas composições contendo moléculas de ácido nucleico, incluindo vetores de expressão, que codificam os polipeptídeos MTSP-1. Em algumas modalidades, as composições de moléculas de ácido nucleico que codificam os polipeptídeos MTSP-1 e os vetores de expressão que os codificam são adequados para terapia gênica. Em vez de dispensar a proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo, tal como sistemicamente ou por outra via, ou ex vivo, tal como por remoção de células, incluindo linfócitos, introdução do núcleo nos mesmos, e reintrodução no hospedeiro ou em um receptor compatível.
2. Administração de Ácidos Nucleicos que Codificam Polipeptídeos MTSP-1 Modificados (Terapia Gênica)
[00397] Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser dispensados às células e aos tecidos por expressão de moléculas de ácido nucleico. Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser administrados como moléculas de ácido nucleico que codificam polipeptídeos MTSP-1, incluindo técnicas ex vivo e expressão direta in vivo. Os ácidos nucleicos podem ser dispensados às células e aos tecidos por qualquer método conhecido pelos técnicos no assunto. O ácido nucleico isolado pode ser incorporado em vetores para posterior manipulação. Exemplos de ácidos nucleicos são aqueles que codificam ou que hibridizam sob estringência média a alta com um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo MTSP-1, ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo tendo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOS: 21-59. Moléculas de ácido nucleico de exemplo, que codificam polipeptídeos MTSP-1 modificados, ou porções cataliticamente ativas dos mesmos, têm uma sequência de nucleotídeos como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NOS: 60-98.
[00398] Os métodos para administrar polipeptídeos MTSP- 1 por expressão de moléculas de ácido nucleico codificadoras incluem a administração de vetores recombinantes. O vetor pode ser projetado para permanecer epissomal, tal como por inclusão de uma origem de replicação ou pode ser projetado para integrar-se a um cromossomo na célula. Os polipeptídeos MTSP-1 também podem ser usados na terapia de expressão gênica ex vivo usando vetores. Os vetores de terapia gênica adequados e os métodos de dispensação são conhecidos dos técnicos no assunto. Por exemplo, as células podem ser manipuladas para expressar um polipeptídeo MTSP-1 modificado, tal como integrando o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo MTSP-1 em uma localização genômica, ligado operacionalmente a sequências reguladoras ou de modo que seja colocado operacionalmente ligado a sequências reguladoras em uma localização genômica. Essas células podem então ser administradas local ou sistemicamente a um indivíduo, tal como um paciente que precisa de tratamento. Exemplos de vetores para terapia gênica in vivo e ex vivo incluem vetores virais e vetores não virais, tais como, por exemplo, lipossomos ou cromossomos artificiais.
[00399] Os vetores virais, incluindo, por exemplo, adenovírus, vírus do herpes, vírus adenoassociados (AAV),
retrovírus, tais como lentivírus, EBV, SV40, vetores de citomegalovírus, vetores de vírus vaccinia e outros projetados para terapia gênica podem ser empregados.
Os vetores podem ser aqueles que permanecem epissomais ou aqueles que podem se integrar aos cromossomos do indivíduo tratado.
Um polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser expressado por um vírus, que é administrado a um indivíduo em necessidade de tratamento.
Os vetores de vírus adequados para terapia gênica incluem adenovírus, vírus adenoassociados, retrovírus, lentivírus e outros mencionados acima.
Por exemplo, a tecnologia de expressão de adenovírus é bem conhecida na técnica e os métodos de produção e administração de adenovírus também são bem conhecidos.
Os sorotipos de adenovírus estão disponíveis, por exemplo, na American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). O adenovírus pode ser usado ex vivo, por exemplo, as células são isoladas de um paciente em necessidade de tratamento, e transduzidas com um vetor de adenovírus que expressa o polipeptídeo MTSP-1 modificado.
Após um período de cultura adequado, as células transduzidas são administradas a um indivíduo, local e/ou sistemicamente.
Alternativamente, as partículas de adenovírus que expressam o polipeptídeo MTSP- 1 são isoladas e formuladas em um carreador farmaceuticamente aceitável para a dispensação de uma quantidade terapeuticamente eficaz para prevenir, tratar ou melhorar uma doença ou condição de um indivíduo.
Em uma modalidade, a doença a ser tratada é causada pela ativação do complemento.
Tipicamente, as partículas de adenovírus são dispensadas a uma dose que varia de 1 partícula a 1014 partículas por quilograma de peso do indivíduo, geralmente entre 106 ou 108 partículas a 1012 partículas por quilograma de peso do indivíduo.
[00400] As moléculas de ácido nucleico podem ser introduzidas em cromossomos artificiais e outros vetores não virais. Cromossomos artificiais, tal como ACES (ver, Lindenbaum et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(21):e172) podem ser modificados para codificar e expressar o polipeptídeo MTSP-1. Resumidamente, os cromossomos artificiais de mamíferos (MACs) provêm um meio para introduzir grandes cargas de informações genéticas na célula em um formato não integrador e replicador autônomo. Único entre as MACs, o Sistema de Expressão Artificial de Cromossomos (ACES) com base em DNA satélite de mamíferos pode ser reproduzível reproduzido de novo em linhas celulares de diferentes espécies e facilmente purificado a partir dos cromossomos das células hospedeiras. O ACES de mamífero purificado pode então ser reintroduzido em uma variedade de linhas de células receptoras, onde foram mantidos de maneira estável por longos períodos na ausência de pressão seletiva usando um Sistema de ACE. Usando esta abordagem, foi atingida uma carga específica de um ou dois alvos de gene nas células CHO e LMTK(-).
[00401] Outro método para introduzir ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos MTSP-1 modificados é uma técnica de troca de genes em duas etapas na levedura, começando com um genoma completo de adenovírus (Ad2; Ketner et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 91: 6186-6190) clonado em um cromossomo artificial de levedura (YAC) e um plasmídeo contendo sequências de adenovírus para se direcionar uma região específica no clone de YAC, um cassete de expressão para o gene de interesse e um marcador selecionável positivo e negativo. Os YACs são de particular interesse porque permitem a incorporação de genes maiores. Esta abordagem pode ser usada para a construção de vetores com base em adenovírus contendo ácidos nucleicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos para transferência de genes para células de mamíferos ou animais inteiros.
[00402] Os ácidos nucleicos podem ser encapsulados em um veículo, tal como um lipossomo, ou introduzidos em células, tal como uma célula bacteriana, particularmente uma bactéria atenuada ou introduzidos em um vetor viral. Por exemplo, quando lipossomos são empregados, proteínas que se ligam a uma proteína da membrana da superfície celular associada à endocitose podem ser usadas para direcionar e/ou facilitar a captação, por exemplo, proteínas da capsídeo ou fragmentos das mesmas trópica(o)s para um tipo de célula específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização na ciclização, e proteínas que são direcionadas para a localização intracelular e intensificam a meia-vida intracelular.
[00403] Em algumas modalidades, é desejável prover uma fonte de ácido nucleico com um agente que tenha como células alvo, tal como um anticorpo específico para uma proteína da membrana da superfície celular ou uma célula alvo, ou um ligando para um receptor em uma célula alvo. Os polinucleotídeos e vetores de expressão providos na presente invenção podem ser preparados por qualquer método adequado. São adicionalmente providos vetores de ácido nucleico contendo moléculas de ácido nucleico como descrito acima.
São ainda providos vetores de ácido nucleico contendo moléculas de ácido nucleico como descrito acima e células contendo esses vetores.
[00404] Para métodos ex vivo e in vivo, moléculas de ácido nucleico que codificam o polipeptídeo MTSP-1 são introduzidas em células que são de um doador adequado ou do indivíduo a ser tratado. As células nas quais um ácido nucleico pode ser introduzido para finalidades de terapia incluem, por exemplo, qualquer tipo de célula disponível desejado adequado para a doença ou condição a ser tratada, incluindo, mas não limitado a, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sanguíneas, tais como, linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células tronco ou progenitoras, incluindo células tronco hematopoiéticas ou progenitoras, por exemplo, tais como, células tronco obtidas da medula óssea, sangue do cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal e outras fontes dos mesmos.
[00405] Para tratamento ex vivo, as células de um doador compatível com o indivíduo a ser tratado ou as células de um indivíduo a ser tratado são removidas, o ácido nucleico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao indivíduo. O tratamento inclui a administração direta, tal como, por exemplo, encapsulada dentro de membranas porosas, que são implantadas no paciente (ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4.892.538 e
5.283.187). Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomas e lipídios catiônicos (por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol), métodos de eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano e de precipitação com fosfato de cálcio. Os métodos de dispensação de DNA podem ser usados para expressar polipeptídeos MTSP-1 in vivo. Tais métodos incluem a dispensação lipossômica de ácidos nucleicos e a dispensação de DNA nu, incluindo a dispensação local e sistêmica, tal como o uso de eletroporação, ultrassom e dispensação de fosfato de cálcio. Outras técnicas incluem microinjeção, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomo, transferência de genes mediada por microcélulas e fusão de esferoplastos.
[00406] A expressão in vivo de um polipeptídeo MTSP-1 pode ser ligada à expressão de moléculas adicionais. Por exemplo, a expressão de um polipeptídeo MTSP-1 pode ser ligada à expressão de um produto citotóxico, tal como em um vírus manipulado ou expressado em um vírus citotóxico. Tais vírus podem ser direcionados para um tipo de célula específico que é alvo de um efeito terapêutico. O polipeptídeo MTSP-1 expressado pode ser usado para intensificar a citotoxicidade do vírus.
[00407] A expressão in vivo de um polipeptídeo MTSP-1 pode incluir a ligação operacional de uma molécula de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo MTSP-1 a sequências reguladoras específicas, tal como um promotor específico de célula ou específico de tecido. Os polipeptídeos MTSP-1 também podem ser expressados a partir de vetores que infectam e/ou se replicam especificamente nos tipos de células e/ou tecidos alvo. Os promotores induzíveis podem ser usados para regular seletivamente a expressão do polipeptídeo MTSP-1.
[00408] Moléculas de ácido nucleico, como ácidos nucleicos nus ou em vetores, cromossomos artificiais, lipossomos e outros veículos podem ser administrados ao indivíduo, por administração sistêmica, por vias de administração tópica, local e outras vias de administração. Quando a administração sistêmica e in vivo, a molécula de ácido nucleico ou veículo que contém a molécula de ácido nucleico pode ser direcionada para uma célula.
[00409] A administração também pode ser direta, tal como a administração de um vetor ou células que tipicamente têm como um(a) célula ou tecido alvo. Por exemplo, as células tumorais e a proliferação podem ser células alvo para expressão in vivo de polipeptídeos MTSP-1. As células usadas para expressão in vivo de um polipeptídeo MTSP-1 também incluem células autólogas ao paciente. Tais células podem ser removidas de um paciente, ácidos nucleicos para expressão de um polipeptídeo MTSP-1 introduzidas, e depois administradas a um paciente, tal como por injeção ou enxerto. H. USOS TERAPÊUTICOS E MÉTODOS DE TRATAMENTO
[00410] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção direcionados para a proteína C3 do complemento e permitem a modulação de doenças e distúrbios mediada(o)s por complemento. As proteases terapêuticas, tais como os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção, têm muitas vantagens potenciais sobre as abordagens terapêuticas tradicionais. A principal delas é a capacidade de inativar alvos de doenças de maneira catalítica (isto é, uma estequiometria para muitos). Assim, as proteases podem manter uma regulação eficaz em concentrações significativamente abaixo da concentração alvo. As vantagens diferenciadoras adicionais incluem (1) inativação irreversível; (2) baixa dose; (3) diminuição da frequência de dosagem; (4) tamanho molecular pequeno; (5) a capacidade de se direcionar a modificações pós-traducionais; (6) a capacidade de neutralizar altas concentrações alvo; e (7) a capacidade de se direcionar em direção contrária ao sítio ativo. Como terapêutica, uma protease ainda deve exibir as seguintes características: (1) acesso ao alvo molecular (extracelular) e (2) possui especificidade suficientemente estringente para um alvo crítico para um estado de doença. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser usados no tratamento de doenças e distúrbios mediada(o)s por complemento.
[00411] O técnico no assunto entende o papel do sistema do complemento nos processos de doenças e está ciente de uma variedade de tais doenças. É provida uma breve discussão de doenças de exemplo e o papel da proteína C3 do complemento em sua etiologia e patologia. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados e moléculas de ácido nucleico providos na presente invenção podem ser usados para o tratamento de qualquer condição para a qual a ativação da via do complemento esteja implicada, particularmente condições inflamatórias, incluindo condições inflamatórias agudas, tais como, choque séptico e condições inflamatórias crônicas, tal como Artrite Reumatoide (AR). As condições agudas e inflamatórias podem manifestar-se como uma doença mediada por imunidade, tal como, por exemplo, doença autoimune ou lesão tecidual causada por inflamação mediada por complexo imune. Uma condição inflamatória mediada por complemento também pode se manifestar como uma doença neurodegenerativa ou cardiovascular que tem componentes inflamatórios. Esta seção provê usos de exemplo e métodos de administração para polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Estas terapias descritas são exemplificativas e não se limitam às aplicações dos polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de tratamento de condições fisiológicas e médicas descritos e listados abaixo. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de tratamento da degeneração macular relacionada à idade (DMRI), atrofia geográfica (GA), hemoglobinúria paroxística noturna (PNH), função tardia de enxerto renal (DGF), sepse, artrite reumatoide (AR), glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), lupus eritematoso, esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, síndrome do desconforto respiratório, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), falência de múltiplos órgãos, Doença de Alzheimer (DA), lesões de isquemia- reperfusão causadas por eventos ou tratamentos como infarto do miocárdio (IM), acidente vascular cerebral, circulação extracorpórea (CEC) ou ponte aorto-coronária, angioplastia ou hemodiálise, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), fibrose pulmonar idiopática (FPI) e/ou síndrome de Guillain Barre.
[00412] O tratamento de doenças e condições com polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção pode ser efetuado por qualquer via de administração adequada, usando formulações adequadas como descritas na presente invenção, incluindo, mas não se limitando a, injeção subcutânea, administração oral, intravítrea, periocular e transdérmica. Se necessário, uma dosagem e uma duração e protocolo de tratamento específicos podem ser determinados empiricamente ou extrapolados. Por exemplo, doses exemplares de polipeptídeos MTSP-1 tipo selvagem ou de referência podem ser usadas como ponto de partida para determinar dosagens apropriadas. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados que têm mais especificidade e/ou seletividade em comparação com um polipeptídeo MTSP-1 tipo selvagem ou de referência podem ser eficazes em quantidades e/ou frequências reduzidas de dosagem. Os níveis de dosagem podem ser determinados com base em vários fatores, tais como, peso corporal do indivíduo, saúde geral, idade, atividade do composto específico empregado, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e gravidade e curso da doença, e disposição do paciente para a doença e julgamento do médico responsável pelo tratamento. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais carreadores para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração.
[00413] Após a melhora da condição do paciente, uma dose de manutenção de um composto ou de composições pode ser administrada, se necessário; e a dosagem, a forma de dosagem, ou a frequência de administração, ou uma combinação das mesmas, pode ser modificada. Em alguns casos, um indivíduo pode exigir tratamento intermitente a longo prazo, após qualquer recorrência dos sintomas da doença.
1. Doença Mediada por Ativação do Complemento
[00414] A cascata do complemento é uma faca de dois gumes, causando proteção contra invasão bacteriana e viral, promovendo fagocitose e inflamação. Por outro lado, mesmo quando o complemento está funcionando normalmente, pode contribuir para o desenvolvimento da doença, promovendo inflamação local e danos aos tecidos. Assim, os efeitos patológicos são mediados pelos mesmos mediadores responsáveis pelos papéis protetores do complemento. Por exemplo, o peptídeo anafilático e quimiotático C5a conduz a inflamação ao recrutar e ativar neutrófilos, C3a pode causar ativação patológica de outros fagócitos e o complexo de ataque à membrana pode matar ou lesionar células. Em um exemplo, tal como em muitas doenças autoimunes, o complemento produz danos nos tecidos porque é ativado sob circunstâncias inadequadas, tal como por anticorpo para os tecidos hospedeiros. Em outras situações, o complemento pode ser ativado normalmente, tal como por septicemia, mas ainda contribui para a progressão da doença, tal como na síndrome do desconforto respiratório. Patologicamente, o complemento pode causar danos substanciais aos vasos sanguíneos (vasculite), membrana basal dos rins e células endoteliais e epiteliais anexadas (nefrite), junta sinovial (artrite), e eritrócitos (hemólise) se não for adequadamente controlado.
[00415] O complemento tem um papel na imunopatogênese de uma série de distúrbios, incluindo doenças autoimunes, tal como artrite reumatoide (ver, por exemplo, Wang et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 92:8955-8959; Moxley et al. (1987) Arthritis & Rheumatism 30:1097-1104), lupus eritematoso (Wang et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:8563-8568; e Buyon et al. (1992) Arthritis Rheum. 35:1028-1037) e glomerulonefrite aguda (Couser et al. (1995) J Am Soc Nephrol. 5:1888-1894). Outras patologias que envolvem a ativação do sistema do complemento incluem sepse (ver, por exemplo, Stove et al. (1996) Clin Diag Lab Immunol 3:175- 183; Hack et al. (1989) Am. J. Med. 86:20-26), síndrome do desconforto respiratório (ver, por exemplo, Zilow et al. (1990) Clin. Exp. Immunol. 79:151-157; and Stevens et al. (1986) J. Clin. Invest. 77:1812-1816), falência de múltiplos órgãos (ver, por exemplo, Hecke et al. (1997) Shock 7:74; e Heideman et al. (1984) J. Trauma 24:1038-1043), lesão de isquemia-reperfusão, tal como ocorre em doenças cardiovasculares, tal como acidente vascular cerebral ou infarto do miocárdio (Austen WG et al. (2003) Int J Immunopathol Pharm 16(1):1-8), degeneração macular relacionada à idade (Bradley et al. (2011) Eye 25: 683-693; Gemenetzi et al. (2016) Eye 30: 1-14) e função tardia de enxerto renal (Danobeitia et al. (2013) [abstract]. Am J Transplant. 13 (suppl 5); Yu et al. (2016) Am J Transplant 16(9):2589-2597; Castallano et al. (2010) Am J Pathol 176(4):1648-1659). Alguns exemplos de doenças mediadas por complemento são descritos abaixo. a. Artrite Reumatoide
[00416] A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica. É uma doença autoimune na qual o sistema imunológico ataca componentes normais do tecido como se estivessem invadindo patógenos. A inflamação associada à artrite reumatoide ataca principalmente os revestimentos internos das juntas. As membranas que revestem internamente os vasos sanguíneos, o coração e os pulmões também podem ficar inflamadas. A AR é caracterizada por células B ativadas e células plasmáticas que estão presentes na junta sinovial inflamada, e em folículos linfóides da doença apresentados e centros germinais. Isso resulta em altos níveis de produção local de imunoglobulina e na deposição de complexos imunes, que podem incluir fatores reumatoides IgG e IgM, na junta sinovial e em associação com cartilagem articular, que pode servir como iniciadores da cascata do complemento. Níveis elevados de componentes do complemento, tais como C3a, C5a e C5b-9, foram encontrados nas juntas reumatoides inflamadas. Esses componentes do complemento podem exacerbar a inflamação associada à AR, induzindo uma variedade de atividades pró-inflamatórias, tais como por exemplo, alterações na permeabilidade vascular, quimiotaxia de leucócitos, e ativação e lise de vários tipos de células. b. Sepse
[00417] A sepse é uma doença causada por uma infecção grave, tal como uma infecção bacteriana, levando a uma resposta inflamatória sistêmica. O componente da parede celular bacteriana, lipopolissacarídeo, é frequentemente associado à sepse, embora outras infecções bacterianas, virais e fúngicas possam estimular os sintomas sépticos. O choque séptico geralmente resulta se o sistema imunológico natural do corpo não puder se defender de um microrganismo invasor, de modo que, por exemplo, as consequências pró- inflamatórias da resposta imune sejam prejudiciais aos tecidos hospedeiros. Os estágios iniciais da sepse são caracterizados pela ativação excessiva do complemento, resultando no aumento da produção de anafilatoxinas do complemento, tais como C3a, C4a e C5a, que atuam para aumentar a permeabilidade vascular, estimular a produção de superóxido a partir de neutrófilos e estimular a liberação de histamina. As ações do C5a podem contribuir para uma resposta imune produtiva a uma infecção bacteriana, mas se não for regulamentada, o C5a também pode ser severamente prejudicial. Em um modelo de inflamação induzido por E. coli, o bloqueio de C5a melhorou o resultado de animais sépticos, limitando a ativação de neutrófilos mediada por C5a que pode levar a lesão tecidual mediada por neutrófilos.
[00418] O comprometimento contínuo da resposta imune inata a uma infecção bacteriana geralmente leva a sepse crônica ou choque séptico, que pode ser fatal. No estágio tardio da sepse, é a atividade “adormecida” dos neutrófilos, em oposição à hiperatividade que ocorre nas fases iniciais, que contribui para a continuação da doença. No estágio final, as principais funções dos neutrófilos, incluindo quimiotaxia, atividade de explosão respiratória, e capacidade de matar bactérias são reduzidas. O complemento, e em particular o C5a, também desempenha um papel nas fases posteriores da sepse. A produção excessiva de C5a durante a sepse está associada à “inativação” de neutrófilos no sangue, um processo que foi associado à regulação negativa induzida por C5a de seu próprio receptor, C5aR, em neutrófilos (Guo et al. (2003) FASEB J 13:1889). Os níveis reduzidos de C5aR nos neutrófilos correlacionam-se com uma capacidade diminuída de neutrófilos no sangue de se ligar a C5a, respostas quimiotáticas prejudicadas, perda de produção de superóxido, e atividade bactericida prejudicada. Os níveis de C5aR, no entanto, podem começar a “se recuperar” em estágios posteriores da sepse e se correlacionar com casos de resultado benéfico da doença.
c. Esclerose múltipla
[00419] A esclerose múltipla (EM) e seu modelo animal, a encefalomielite alérgica experimental (EAE), são doenças inflamatórias desmielinizantes do sistema nervoso central (SNC). Na EM, a inflamação do tecido nervoso causa a perda de mielina, um material adiposo que atua como uma espécie de isolamento protetor das fibras nervosas do cérebro e da medula espinhal. Essa desmielinização deixa várias áreas do tecido cicatricial (esclerose) ao longo da cobertura das células nervosas, o que interrompe a capacidade dos nervos de conduzir impulsos elétricos de e para o cérebro, produzindo os vários sintomas da EM. A EM é mediada por linfócitos ativados, macrófagos/microglia e pelo sistema do complemento. A ativação do complemento pode contribuir para a patogênese dessas doenças através de seu duplo papel: a capacidade do complexo terminal ativado C5b-9 de promover desmielinização e a capacidade do C5b-9 sublítico de proteger os oligodendrócitos (OLG) da apoptose. d. Doença de Alzheimer
[00420] A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por emaranhados (filamentos helicoidais pareados anormalmente da proteína tau, que normalmente se liga a microtúbulos) e placas (depósitos extracelulares compostos principalmente de proteína beta-amilóide) no cérebro. Embora a causa exata da DA não seja totalmente clara, a neuroinflamação crônica nas regiões afetadas do cérebro com DA indica que mediadores pró-inflamatórios podem desempenhar um papel. Os emaranhados e placas dentro de um cérebro com DA são depositados com fragmentos de complemento ativados, tais como, por exemplo, C4d e C3d. Da mesma forma, neurites distróficas no cérebro com DA podem ser imunocoradas para MAC, indicando ataque autocatalítico dessas neurites e perda concomitante por neurites em DA. A ativação do complemento na DA ocorre por um mecanismo independente de anticorpos induzido pela proteína beta-amilóide agregada. Além disso, a cascata do complemento pode ser ativada pelas pentraxinas, proteína C reativa (PCR) e amilóide P (AP), que são todas reguladas positivamente na DA (McGeer et al., (2002) Trends Mol Med 8:519). A ativação do complemento na DA, marcada por aumentos nos mediadores do complemento, não é adequadamente controlada por uma regulação positiva compensatória das proteínas reguladoras do complemento, tal como, por exemplo, CD59. Assim, as consequências pró-inflamatórias da ativação do complemento exacerbam a progressão da DA e provavelmente contribuem para a destruição de neurites. e. Lesão de Isquemia-Reperfusão
[00421] A lesão de isquemia-reperfusão é a lesão sofrida após um evento isquêmico e subsequente restauração do fluxo sanguíneo e resulta da resposta inflamatória a um insulto hipóxico. O dano por isquemia-reperfusão pode ser agudo como durante procedimentos de cirurgia cardíaca, tal como, por exemplo, após cirurgia cardíaca aberta ou angioplastia, ou crônico como com insuficiência cardíaca congestiva ou doença cardiovascular oclusiva. Exemplos de lesões que podem causar lesão de isquemia-reperfusão incluem infarto do miocárdio (IM) e acidente vascular cerebral. O início de uma resposta inflamatória é provavelmente causado pelo aumento dos níveis de oxigênio nos tecidos que ocorrem com reperfusão e pelo acúmulo concomitante de metabólitos que podem gerar radicais livres de oxigênio que são imunoestimuladores. A lesão de isquemia-reperfusão está associada a uma variedade de eventos, incluindo gravidade do infarto do miocárdio, eventos isquêmicos cerebrais, isquemia intestinal e muitos aspectos da cirurgia vascular, cirurgia cardíaca, trauma e transplante. A lesão é manifestada por eventos inflamatórios do sistema imunológico inato, particularmente a ativação do sistema do complemento, em resposta ao tecido recém alterado como não próprio. Como tal, a lesão de isquemia-reperfusão é caracterizada por edema tecidual causado pelo aumento da permeabilidade vascular, e um infiltrado celular inflamatório agudo causado pelo influxo de leucócitos polimorfonucleares.
[00422] A ativação do sistema do complemento desempenha um papel nos eventos inflamatórios da lesão de isquemia- reperfusão. A lesão de isquemia resulta em alterações da membrana celular, afetando lipídios, carboidratos ou proteínas da superfície externa, de modo que esses epítopos expostos sejam alterados e possam atuar como neo-antígenos (auto-antígenos modificados). A IgM circulante reconhece e liga os neo-antígenos para formar complexos imunes na superfície celular lesada. Os complexos de antígeno- anticorpo formados são ativadores clássicos da via clássica do complemento, embora todas as vias estejam provavelmente envolvidas de alguma forma nos efeitos exacerbadores da lesão. O envolvimento da via clássica de complemento à lesão de isquemia-reperfusão é evidenciado por camundongos geneticamente deficientes em C3 ou C4 que exibem proteção igual à lesão local em membro posterior e modelo animal de lesão (Austen et al. (2003) Int J Immunopath Pharm 16:1). Por outro lado, em um modelo de rim de lesão por isquemia,
os camundongos com deficiência de C3, C5 e C6 foram protegidos, enquanto os camundongos com deficiência de C4 não, indicando a importância da via alternativa do complemento (Guo et al. (2005) Ann Rev Immunol 23:821). Mediadores induzidos após a ativação do complemento iniciam uma resposta inflamatória direcionada à membrana celular no sítio da lesão local.
[00423] Um mecanismo efetor principal do complemento na lesão de isquemia-reperfusão é o influxo e a ativação de neutrófilos no tecido inflamado por componentes do complemento, tal como, por exemplo, C5a. A ativação de neutrófilos resulta no aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e na liberação de enzimas lisossômicas em órgãos lesados locais, o que acaba resultando em apoptose, necrose e perda ou função de órgãos. A geração do MAC terminal, C5b-9, também contribui para a lesão tecidual local na lesão de isquemia-reperfusão. f. Distúrbios Oculares
[00424] No olho normal, o sistema do complemento é ativado continuamente em níveis baixos; as proteínas reguladoras do complemento intraocular solúvel e ligadas à membrana regulam firmemente essa ativação espontânea do complemento. A ativação de baixo nível do complemento protege contra patógenos sem causar danos aos tecidos próprios e à perda de visão. O sistema do complemento e as proteínas reguladoras do complemento controlam a inflamação intraocular na uveíte autoimune e desempenham um papel importante no desenvolvimento da inflamação da córnea, degeneração macular relacionada à idade e retinopatia diabética. O sistema do complemento desempenha um papel importante na patogênese da retinopatia diabética (ver, por exemplo, Ghosh et al. (2015) Endocr Rev 36:272–288), bem como na neuropatia diabética e na doença cardiovascular diabética. A ativação espontânea do complemento pode causar danos ao tecido da córnea após a infecção. A inibição do complemento é um alvo terapêutico relevante no tratamento de várias doenças oculares (ver, por exemplo, Purushottam et al. (2007) Mol Immunol. 44:3901–3908). Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI)
[00425] A degeneração macular relacionada à idade é um termo clínico que descreve uma variedade de doenças que são caracterizadas pela perda progressiva da visão central. A DMRI é a principal causa de perda de visão em indivíduos idosos em muitos países industrializados (Jager et al. (2008) N Engl J Med 358:2606-2617). A perda de visão ocorre devido à degeneração progressiva da mácula, a região na parte posterior do olho, que compreende uma alta densidade de fotorreceptores de cone, que é especializada em visão central de alta acuidade.
[00426] A DMRI pode se manifestar como DMRI de forma seca (não neovascular) e/ou DMRI de forma úmida. A DMRI de forma seca é a forma mais comum (85-90% dos casos) e mais branda da DMRI, e é caracterizada por lesões pequenas, redondas e branco-amarelas (drusas) na e sob a mácula. A DMRI de forma seca avançada, ou atrofia geográfica, leva ao afinamento da retina devido à perda de fotorreceptores PRE, deterioração da mácula e eventual cegueira. Embora mais rara, a perda de visão associada à DMRI de forma úmida é geralmente mais dramática do que na DMRI de forma seca. A DMRI de forma úmida inclui a formação de vasos sanguíneos patogênicos,
denominada neovascularização de coroide (CNV), na qual vasos sanguíneos anormais se desenvolvem sob a camada de epitélio pigmentar da retina (RPE). A invasão da retina pela CNV da coroide subjacente através de fraturas na membrana de Bruch, a matriz extracelular entre a coroide e o epitélio pigmentar da retina (RPE), ou a sua ruptura pode causar perda de visão na DMRI (por exemplo, devido a hemorragia sub-retiniana e/ou cicatrização).
[00427] As marcas clínicas iniciais da DMRI incluem o espessamento da membrana de Bruch e o aparecimento de drusa (Gass, J. D. (1972) Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 70: 409-36), que são depósitos lipoproteináceos extracelulares constituídos por proteínas agregadas, tais como, albumina, apolipoproteína E (APOE), componentes da via do complemento (por exemplo, fator H do complemento (CFH), C1q, C3, C5, C5b, C6, C7, C8, C9 e vitronectina (Hageman et al., (2001) Prog. Retin. Eye. Res. 29:95-112; Hageman et al. (2005) Proc. Nat. Acad. Sci. 102:7227-7232; Mullins et al. (2000) FASEB J 14:835-846; Anderson et al., (2010) Pro. Retin. Eye Res. 29:95-112), imunoglobulinas e/ou amilóide-β (Crabb et al. (2002) Proc Natl Acad Sci 99:14682-14687; Johnson et al. (2002) 99:11830-11835) e lipídios e componentes celulares que são localizados entre o RPE e a membrana de Bruch. A inflamação da DMRI é mediada pela desregulação da via alternativa do complemento. Os componentes do complemento C3 e C5 são os principais constituintes de drusa em pacientes com DMRI (Mullins et al., (2000) FASEB J 14, 835-46; Johnson et al., (2000) Exp Eye Res 70, 441-9; Anderson et al., (2002) Am J Ophthalmol 134, 411-31; e Leitner et al., (2001) Exp Eye Res 73, 887-96). É hipotetizado que a biogênese de drusa envolva processos inflamatórios crônicos que podem desencadear a ativação e formação de MAC, que podem lisar células RPE ou perturbar a homeostase fisiológica em células RPE, levando à inflamação característica da DMRI (Johnson et al. (2001) Exp Eye Res 73, 887-896). As proteínas do complemento (por exemplo, C3d) também foram detectadas no sangue em pacientes com DMRI (Scholl et al., (2008) PLoS One 3: e2593), indicando que a inflamação induzida por DMRI pode ser sistêmica. Existem evidências genéticas de um papel no complemento na patogênese da DMRI de forma seca (Klein et al. (2005) Science 308(5720):385-389; Yates et al., (2007) NEJM 357:553-561) e compstatina (e derivados da compstatina APL-1 e APL-2) e POT-4 (Potentia Pharmaceuticals), pequenos inibidores de peptídeos de C3, podem retardar a progressão da atrofia geográfica (Ricklin et al. (2008) Adv. Exp. Med. Biol. 632: 273-292) na DMRI, indicando que C3 (isto é, inibição de C3) é um alvo viável para o tratamento da DMRI. Resultados clínicos recentes validaram essas conclusões e verificações. C3 é um alvo clínico viável para distúrbios e condições mediado(a)s por complemento ou para aqueles em que o complemento desempenha um papel. g. Transplante de Órgãos e Função Tardia do Enxerto (DGF)
[00428] O complemento desempenha um papel na patogênese da lesão de isquemia-reperfusão. O mecanismo da lesão de reperfusão renal depende da geração de C5a e C5b-9, ambas com toxicidade direta nos túbulos renais, contribuindo para necrose tubular aguda e apoptose, levando a insuficiência renal aguda pós-isquêmica e fibrose tecidual. Por sua vez, a geração desses componentes da via terminal depende da síntese intrarrenal de C3 e da disponibilidade de outros componentes do complemento essenciais para a ativação do complemento. O nível de expressão de C3 no órgão doador é fortemente dependente do tempo isquêmico frio (Elham et al. (2010) Curr Opin Organ Transplant. 15:486–491).
[00429] A rejeição no transplante de órgãos sólidos é influenciada pela resposta inflamatória inicial e subsequente resposta aloimune adaptativa, ambas afetadas por vários componentes do complemento. As proteínas do complemento desempenham um papel significativo nos danos aos órgãos após o transplante no processo de reperfusão de isquemia e na modulação da ativação da resposta imune adaptativa. A inibição do complemento ou a modulação da função das moléculas de proteínas do complemento pode reduzir os danos aos órgãos de transplante e aumentar a vida útil dos órgãos (ver, por exemplo, Elham et al. (2010) Curr Opin Organ Transplant. 15:486–491). O direcionamento dos componentes do complemento para a intervenção terapêutica pode reduzir os danos nos órgãos no momento da recuperação, transferência e após o transplante. Exemplo de tais órgãos é o rim. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser administrados para mitigar e/ou tratar danos nos órgãos após o transplante.
[00430] A função tardia do enxerto (DGF), tal como a função tardia do rim, fígado, pulmão e/ou coração, é uma condição que ocorre em um subconjunto de pacientes transplantados nos quais o órgão transplantado não funciona normalmente imediatamente após o transplante. Outros possíveis transplantes incluem, mas não estão limitados a, tecido vascular, olho, córnea, cristalino, pele, medula óssea, músculo, tecido conjuntivo, tecido gastrointestinal,
tecido nervoso, osso, células tronco, ilhotas, cartilagem, hepatócitos e células hematopoiéticas. A DGF renal é caracterizada por necrose aguda do aloenxerto renal e foi clinicamente definida pela necessidade de diálise logo após o transplante. A lesão renal aguda durante o processo de transplante frequentemente se manifesta como DGF. A patologia subjacente à DGF é complexa, com contribuições de fatores derivados de doadores, tais como idade e duração da isquemia, e fatores de receptores, tais como lesão por reperfusão, respostas imunológicas e tratamento com medicamentos imunossupressores.
[00431] Os componentes da cascata do complemento e a ativação do complemento desempenham um papel crítico como mediadores da rejeição a transplantes e de lesão de isquemia- reperfusão, levando a DGF. Estudos em animais estabeleceram um papel fundamental para o complemento na lesão de reperfusão isquêmica. Por exemplo, o Eculizumab, um anticorpo monoclonal humanizado direcionado contra C5, bloqueia a ativação do complemento e demonstrou impedir a função tardia do enxerto em um subconjunto de pacientes de transplante renais de alto risco (ver, por exemplo, resumo (brief) do Horizon Scanning Research and Intelligence Centre, setembro de 2016; Johnson et al. (2015) Curr Opin Organ Transplant 20(6):643-651; Yu et al. (2016) Am J Transplant 16(9):2589-2597). A deposição granular de C4d foi associada à DGF em receptores de aloenxerto renal humano (Kikić et al. (2014) Transpl Int 27(3):312-321). O aumento da produção de C3 está associado à rejeição do transplante de rim (Pratt et al. (2002) Nat Med 8(6):582-587; Damman et al. (2011) Nephrol Dial Transplant 26(7):2345-2354).
Portanto, os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção, podem ser usados como um agente terapêutico para prevenir ou melhorar ou eliminar a rejeição de transplante e DGF.
2. Usos terapêuticos a. Doenças Inflamatórias Imunomediadas
[00432] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos na presente invenção podem ser utilizados para tratar doenças inflamatórias. As doenças inflamatórias que podem ser tratadas com proteases incluem doenças inflamatórias agudas e crônicas. As doenças inflamatórias de exemplo incluem doenças do sistema nervoso central (SNC), doenças autoimunes, condições de hiper-resposta das vias aéreas, tais como na asma, na artrite reumatoide, na doença inflamatória intestinal e na lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI).
[00433] A encefalomielite autoimune experimental (EAE) pode servir como modelo para esclerose múltipla (EM) (Piddlesden et al. (1994) J Immunol 152:5477). A EAE pode ser induzida em várias espécies geneticamente suscetíveis por imunização com mielina e componentes de mielina, tais como, proteína básica de mielina, proteína proteolipídica e glicoproteína de oligodendrócitos de mielina (MOG). Por exemplo, a EAE induzida por MOG recapitula recursos essenciais da EM humana, incluindo o curso da doença clínica crônica, recorrente, a tríade pato-histológica de inflamação, gliose reativa e a formação de grandes placas desmielinizadas confluentes. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser avaliados em modelos animais de EAE. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados são administrados, tal como por injeção intraperitoneal diária, e o curso e a progressão dos sintomas são monitorados em comparação com os animais de controle. Os níveis de componentes inflamatórios do complemento que podem exacerbar a doença também podem ser medidos analisando a atividade do complemento no soro em um ensaio hemolítico e analisando a deposição de componentes do complemento, tais como, por exemplo C1, C3 e C9.
[00434] A ativação do complemento modula a inflamação em doenças como a artrite reumatoide (AR) (Wang et al., (1995) PNAS 92:8955). Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser usados para tratar a AR. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP- 1 podem ser injetados local ou sistemicamente. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser dosados diariamente ou semanalmente. Os polipeptídeos MTSP-1 PEGuilados podem ser usados para reduzir a imunogenicidade. Em um exemplo, a artrite induzida por colágeno tipo II (CIA) pode ser induzida em camundongos como um modelo de doença articular inflamatória autoimune que é histologicamente semelhante a AR caracterizada por inflamação da junta sinovial, formação de pano (pannus) e erosão da cartilagem e do osso. Para induzir a CIA, o colágeno bovino tipo II (B- CII) na presença de adjuvante completo de Freund pode ser injetado por via intradérmica na base da cauda. Após 21 dias, os camundongos podem ser imunizados novamente usando o protocolo idêntico. Para examinar os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1, 3 semanas após o desafio inicial com B- CII, um polipeptídeo MTSP-1 ou controle pode ser administrado por via intraperitoneal duas vezes por semana, durante 3 semanas. Os camundongos podem ser sacrificados 7 semanas após a imunização inicial para análise histológica. Para avaliar o efeito terapêutico de um polipeptídeo MTSP-1 na doença estabelecida, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser administrado diariamente por um total de 10 dias após o início da artrite clínica em um ou mais membros. O grau de inchaço nas articulações afetadas inicialmente pode ser monitorado medindo a espessura da pata usando pinças. Em ambos os modelos, o soro pode ser retirado de camundongos para ensaios hemolíticos e medição de marcadores de complemento de ativação, tais como, por exemplo, C5a e C5b-
9. Em outro exemplo, modelos de primatas estão disponíveis para tratamentos de AR. A resposta das articulações sensíveis e inchadas pode ser monitorada em indivíduos tratados com polipeptídeos MTSP-1 e controles para avaliar o tratamento com polipeptídeo MTSP-1.
[00435] O polipeptídeo MTSP-1 modificado pode ser usado para tratar lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI). A lesão mediada por CI é causada por uma resposta inflamatória local contra a deposição de CI em um tecido. A resposta inflamatória resultante é caracterizada por edema, neutrofilia, hemorragia e, finalmente, necrose tecidual. A lesão tecidual mediada por IC pode ser estudada em uma reação in vivo de Arthus (RPA). Resumidamente, na reação RPA, um excesso de anticorpo (tal como, por exemplo, albumina IgG de coelho anti-ovo de galinha) é injetado na pele de animais, tais como, por exemplo ratos ou porquinhos-da-índia, que foram previamente infundidos intravenosamente com os correspondentes antígenos (isto é, albumina de ovo de galinha) (Szalai et al., (2000) J Immunol 164:463). Imediatamente antes do início de uma reação RPA, um polipeptídeo MTSP-1 ou um controle em bolus pode ser administrado ao mesmo tempo que o antígeno correspondente por uma injeção intravenosa na veia femoral direita. Alternativamente, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser administrado durante a hora inicial da reação RPA, começando imediatamente após a injeção do antígeno e imediatamente antes da injeção dérmica do anticorpo. Os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1 na geração de lesão tecidual mediada por CI dependente do complemento podem ser avaliados em vários momentos após o início da RPA, coletando sangue para determinar a atividade hemolítica sérica e colhendo a área infectada da pele para quantificação do tamanho da lesão.
[00436] Os polipeptídeos terapêuticos de MTSP-1, como os descritos na presente invenção, podem ser usados para tratar sepse e sepse grave que podem resultar em choque letal. Um modelo de choque letal mediado por complemento pode ser usado para testar os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1 como um agente terapêutico. Em um exemplo, os ratos podem ser iniciados com uma quantidade traço de lipopolissacarídeo (LPS), seguido pela administração de um anticorpo monoclonal contra um inibidor de membrana do complemento (anti-Crry) (Mizuno et al., (2002) Int Arch Allergy Immunol 127:55-62). Um polipeptídeo MTSP-1 ou controle pode ser administrado a qualquer momento durante o curso do início do choque letal, tal como antes da iniciação do LPS, após a iniciação do LPS ou após a administração anti-Crry e o resgate de ratos do choque letal pode ser avaliado. b. Doença Neurodegenerativa
[00437] A ativação do complemento exacerba a progressão da doença de Alzheimer (DA) e contribui para a perda de neurites no cérebro com DA. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos na presente invenção podem ser usados para tratar a DA. Modelos de camundongos que simulam algumas das características neuropatológicas e comportamentais da DA podem ser usados para avaliar os efeitos terapêuticos dos polipeptídeos MTSP-1. Exemplos de modelos de camundongos transgênicos incluem a introdução da proteína precursora de amilóide humana (APP) ou da proteína presenilina 1 (PS1) com mutações produtoras de doenças em camundongos sob o controle de um promotor agressivo. Esses camundongos desenvolvem características da DA, incluindo aumentos nas placas beta- amiloides e nas neurites distróficas. Camundongos transgênicos duplos para proteínas mutantes de APP e PS1 desenvolvem maior número de placas beta-amilóides fibrilares e mostram glia ativada e fatores de complemento associados à placa. Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser administrados, tal como por injeção diária intraperitoneal ou intravenosa, e o curso e a progressão dos sintomas são monitorados em comparação aos animais de controle. c. Doença cardiovascular
[00438] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser usados para tratar doenças cardiovasculares. Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser usados no tratamento de doenças cardiovasculares, incluindo lesão de isquemia-reperfusão resultante de acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio, circulação extracorpórea, ponte aorto-coronária, angioplastia ou hemodiálise. Os polipeptídeos MTSP-1 também podem ser usados no tratamento da resposta inflamatória associada à circulação extracorpórea que pode contribuir para lesão tecidual. Geralmente, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser administrado antes, concomitantemente ou após um tratamento ou evento que induz uma lesão de isquemia-reperfusão mediada por complemento. Em um exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser administrado a um indivíduo antes do tratamento de um indivíduo por um evento indutor de lesão isquêmica mediado por complemento, tal como, por exemplo, ponte aorto- coronária de angioplastia.
[00439] Os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1 no tratamento da lesão de isquemia-reperfusão podem ser avaliados em modelos animais da lesão. Em um desses modelos, a isquemia miocárdica é induzida em coelhos que realizaram uma incisão feita em seu pericárdio anterior, colocando uma sutura de seda 3-0 em torno da artéria coronária descendente anterior esquerda (DAE) a 5-8 mm de sua origem e apertando a ligadura de modo que o vaso fique completamente ocluído (Buerke et al., (2001) J Immunol 167:5375). Um polipeptídeo MTSP-1, tal como, por exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 modificado, ou um veículo de controle, tal como, solução salina, pode ser administrado por via intravenosa em doses crescentes como um bolus 55 minutos após a oclusão coronária (isto é, 5 minutos antes da reperfusão). Cinco minutos depois (isto é, após um total de 60 minutos de isquemia), a ligadura de DAE pode ser desatada e o miocárdio isquêmico pode ser reperfundido por 3 horas. No final do período de reperfusão, a ligadura ao redor da DAE é apertada. Os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1 na lesão de isquemia podem ser analisados avaliando os efeitos na necrose miocárdica, níveis de creatina quinase no plasma e marcadores de ativação de neutrófilos, tais como, por exemplo, atividade de mieloperoxidase e liberação de radicais superóxidos.
[00440] Em outro modelo de lesão miocárdica mediada por complemento, mantida após a perfusão de corações de camundongos isolados com tampão Krebs-Henseleit contendo 6% de plasma humano, o tratamento com polipeptídeos MTSP-1 modificados pode ser usado para limitar o dano tecidual ao coração. Nesse exemplo, o tampão usado para perfundir os corações pode ser suplementado com doses variáveis de polipeptídeos MTSP-1 modificados. Os corações perfundidos podem ser analisados quanto à deposição de C3 e C5b-9 humano, pressão de perfusão da artéria coronária, pressão diastólica final e frequência cardíaca.
[00441] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção podem ser usados como terapia antes da ou após a circulação extracorpórea (CEC) ou a ponte aorto- coronária para inibir a resposta imune inflamatória que geralmente segue a ponte e que pode contribuir para lesão tecidual. Uma recirculação in vitro de sangue total em um circuito de ponte extracorpóreo pode ser usado para estimular mudanças plaquetárias e leucocitárias e complementar a ativação induzida por CEC (Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564). Nesse modelo, a adição de um polipeptídeo MTSP-1 ou tampão de controle, em doses variadas, pode ser adicionada a um pacote de transferência que já contém sangue de um doador saudável e heparina suína, imediatamente antes da adição de sangue ao circuito extracorpóreo. As amostras de sangue podem ser coletadas 5, 15, 30, 45, 60, 75 e 90 minutos após a recirculação e analisadas para estudos de complemento, como por exemplo, ensaios hemolíticos e/ou ensaios de ativação do complemento para medir C5a, C3a e/ou sC5b-9. Uma amostra de pré-tratamento do sangue coletado antes de sua adição ao circuito extracorpóreo pode ser usada como controle. A citometria de fluxo de amostras de sangue pode ser realizada para determinar os níveis de moléculas de adesão em populações de leucócitos circulantes (isto é, neutrófilos) no sangue, tal como, por exemplo, os níveis de CD11b e P-selectina. d. Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI)
[00442] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos na presente invenção podem ser usados para tratar a Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI). Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI) que pode ser tratada com proteases incluem DMRI de forma úmida, DMRI de forma seca e atrofia geográfica. Estão disponíveis vários modelos animais de DMRI que simulam muitas das características do distúrbio humano (Pennesi et al. (2012) Mol. Aspects Med. 33(4):487-509). Foi demonstrado que mutações nos genes da via do complemento aumentam ou diminuem a suscetibilidade à DMRI (Edwards et al. (2005) Science 308(5720):421-424; Hageman et al. (2005) Proc. Nat. Acad. Sci 102(20):7227-7232; Klein et al. (2005) Science 308(5720):385-389). Por exemplo, no fator de complemento H (CFH), que normalmente interage com C3b, o polimorfismo de nucleotídeo único Y402H impediu a ligação de C3b ao fator B, levando à inibição da formação de C3. O Y402H está associado a um risco aumentado de DMRI em pessoas e a mutação foi previamente identificada em 43-59% dos pacientes com DMRI (Haines et al. (2005) Science 308(5720):419-421; Thakkinstian et al. (2006) Hum. Mol. Genet. 15(18):2784- 2790; Zareparsi et al. (2005) Am. J. Hum. Genet. 77(1):149- 153).
[00443] Camundongos geneticamente modificados que não têm a capacidade de produzir CFH desenvolvem características da DMRI, incluindo anormalidades retinianas, diminuição da acuidade visual e deposição do complemento (Coffey et al. (2007) Proc. Nat. Acad. Sci. 104:16651-16656). Mutações nas proteínas do complemento Fator B (Montes et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. 106(11):4366-4371), C2 (Gold et al. (2006) Nat. Genet. 38(4):458-462), e C3 (Maller et al. (2007) Nat. Genet. 39(10):1200-1201; Yates et al. (2007) New Engl. J. Med. 357(6):553-561) estão associadas ao aumento ou diminuição do risco de desenvolver DMRI com base no impacto na expressão e/ou atividade das várias proteínas do complemento (Reynolds et al. (2009) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 50(12):5818–5827).
[00444] As proteases MTSP-1 modificadas, tais como, as proteases MTSP-1 modificadas providas na presente invenção, em que uma atividade, tal como especificidade ou seletividade do substrato, da protease MTSP-1 para clivar a proteína C3 do complemento é alterada pode ser usada como terapia. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são administrados, por exemplo, por injeção intravítrea mensal ou bimensal, e o curso e a progressão dos sintomas são monitorados em comparação com animais ou indivíduos de controle. Os níveis de componentes do complemento que podem exacerbar a doença também podem ser medidos analisando a atividade do complemento no soro em um ensaio hemolítico e analisando a deposição de componentes do complemento, tal como, por exemplo, C1, C3 e C9.
[00445] A ativação do complemento desempenha um papel no progresso da doença na Degeneração Macular Relacionada à Idade (DMRI) (ver, por exemplo, Bradley et al., (2011) Eye
25:683-693; Gemenetzi et al. (2016) Eye 30:1-14). Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser usados para tratar a DMRI. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 ou uma composição farmacêutica contendo polipeptídeos MTSP-1, tais como os polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos na presente invenção, podem ser injetados por via intravítrea ou periocular. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser dosados diariamente ou semanalmente ou com menos frequência, tal como, por exemplo, mensalmente ou com menos frequência, tal como bimensalmente. Para a DMRI, os polipeptídeos MTSP- 1 modificados que são “modificados” por mais tempo no olho (por exemplo, proteínas de fusão, PEGuilação, etc.) podem ser usados em doses mensais. Além disso, dependendo da modificação específica, também são contempladas a dosagem bimensal e trimestral (a cada 3 meses). Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser modificados, tal como por PEGuilação, para reduzir a potencial imunogenicidade e/ou aumentar a meia-vida no soro. Para DMRI, os polipeptídeos MTSP-1 modificados que não são adicionalmente modificados por um período prolongado no olho (por exemplo, proteínas de fusão, proteínas PEGuiladas) são contemplados administração mensal ou bimensal. Se modificado, tal como por PEGuilação, a dosagem pode ser efetuada a cada 3 meses ou mais. e. Transplante de Órgão Função tardia do enxerto
[00446] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos na presente invenção podem ser usados para tratar a Função Tardia do Enxerto (DGF), incluindo DGF, tal como, por exemplo, DGF como resultado de Lesão de isquemia-reperfusão em receptores de transplante de rim. Os polipeptídeos MTSP-
1 também podem ser usados no tratamento da resposta inflamatória associada ao transplante de órgãos que podem contribuir para lesão tecidual. Geralmente, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser administrado antes, concomitantemente ou após um tratamento ou evento que induz uma lesão de isquemia- reperfusão mediada por complemento. Em um exemplo, um polipeptídeo MTSP-1 pode ser administrado a um indivíduo antes do tratamento de um indivíduo por um evento indutor de lesão isquêmica mediado por complemento, tal como, por exemplo, transplante de rim ou aloenxerto renal.
[00447] Os efeitos de um polipeptídeo MTSP-1 no tratamento da função tardia do enxerto, por exemplo, função tardia do enxerto como resultado de lesão de isquemia- reperfusão, podem ser avaliados em modelos animais da lesão, que simulam características exibidas em aloenxertos ou transplantes de rim humano.
[00448] A presença de biomarcadores precoces de disfunção precoce do enxerto levando à DGF, incluindo biomarcadores para lesão celular epitelial tubular, pode indicar a necessidade de terapia. Biomarcadores de DGF (isto é, creatina sérica) foram identificados (Malyszko et al. (2015) Nature Scientific Reports 5:11684; Wanga et al. (2015) PLoS One 10(9):e0136276). A detecção precoce de biomarcadores para DGF e intervenção terapêutica, tal como, por exemplo, tratamento terapêutico com um polipeptídeo MTSP-1 modificado, pode melhorar os resultados clínicos.
[00449] A ativação do complemento modula o progresso da doença em distúrbios, tal como atraso na função do enxerto após o transplante de órgãos, por exemplo, transplante de rim (Yu et al. (2016) Am J of Transplantation 16(9):2589-
2597). Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser usados para tratar DGF. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 podem ser administrados para dispensação sistêmica ou podem ser injetados diretamente no enxerto ou nos tecidos circundantes. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser administrados antes, durante ou após o transplante. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser dosados diariamente ou semanalmente ou com menos frequência, tal como, por exemplo, mensalmente ou com menos frequência, tal como bimensalmente. Em alguns casos, é administrada uma dose sistêmica única do polipeptídeo MTSP-1 modificado. Múltiplas infusões do polipeptídeo MTSP-1 modificado durante várias horas também são consideradas. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser dispensados cronicamente, se necessário, por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados, tais como os polipeptídeos MTSP-1 modificados descritos na presente invenção, podem ser dispensados diariamente ou em outro cronograma para manter uma quantidade eficaz no receptor de aloenxerto. Os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser usados para prolongar a sobrevivência do aloenxerto em um receptor, em particular, a sobrevivência crônica do aloenxerto. Os polipeptídeos MTSP-1 PEGuilados podem ser usados para reduzir a imunogenicidade.
3. Terapias combinadas
[00450] Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção podem ser usados em combinação com outros fármacos e agentes terapêuticos existentes para tratar doenças e condições. Tais tratamentos podem ser realizados em conjunto com outros fármacos anti-inflamatórios e/ou agentes terapêuticos. Exemplos de fármacos e agentes anti-
inflamatórios úteis para terapias combinadas incluem fármacos anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), incluindo salicilatos, tais como, aspirina, AINEs tradicionais, tais como, ibuprofeno, naproxeno, cetroprofeno, nabumetona, piroxicam, diclofenaco ou indometacina e inibidores seletivos de Cox-2, tal como celecoxibe (vendido sob a marca comercial Celebrex®) ou Rotecoxin (vendido sob a marca comercial Vioxx®). Outros compostos úteis em terapias combinadas incluem antimetabólitos, tais como metotrexato e leflunomida, corticosteróides ou outros esteróides, tal como cortisona, dexametasona ou prednisona, analgésicos tal como acetaminofeno, aminossalicilatos tais como mesalamina e agentes citotóxicos tal como azatioprina (vendida sob a marca comercial Imuran®), ciclofosfamida (vendida sob a marca comercial Cytoxan®) e ciclosporina A.
Agentes adicionais que podem ser usados em terapias combinadas incluem modificadores de resposta biológica.
Os modificadores da resposta biológica podem incluir inibidores de citocinas pró-inflamatórios, incluindo inibidores do TNF-alfa, tais como, etanercept (vendido sob a marca comercial Enbrel®), infliximab (vendido sob a marca comercial Remicade®) ou adalimumad (vendido sob a marca comercial Humira®) e inibidores da IL-1, tal como o anakinra (vendido sob a marca comercial Kineret®). Os modificadores da resposta biológica também podem incluir citocinas anti-inflamatórias, tal como IL-10, agentes direcionadores de células B, tais como anticorpos anti-CD20 (vendidos com a marca comercial Rituximab®), compostos direcionados a antígenos T, bloqueadores de moléculas de adesão, antagonistas de receptores de quimiocinas, inibidores de quinase, tais como, inibidores da proteína quinase ativada por mitogênio (MAP) quinase c-Jun N-terminal (JNK) ou fator nuclear (NF)κB, e ligandos do receptor-gama ativado por proliferador de peroxissomo (PPAR-γ). Agentes adicionais que podem ser usados em terapias combinadas incluem imunossupressores. Os imunossupressores podem incluir tacrolimus ou FK-506; ácido micofenólico; inibidores de calcineurina (CNIs); CsA; sirolimus ou outros agentes conhecidos por suprimir o sistema imunológico.
[00451] Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção também podem ser usados em combinação com agentes administrados para tratar doenças cardiovasculares e/ou administrados durante procedimentos para tratar doenças cardiovasculares, tais como, por exemplo, aqueles descritos na presente invenção que contribuem para condições inflamatórias associadas a lesão de isquemia-reperfusão mediada por complemento. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP- 1 providos podem ser administrados em combinação com anticoagulantes. Exemplos de anticoagulantes exemplares incluem, mas não estão limitados a, heparina, varfarina, acenocumarol, fenindiona, EDTA, citrato, oxalato e inibidores diretos de trombina, tais como, argatrobana, lepirudina, bivalirudina e ximelagatrana.
[00452] Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção também podem ser usados em combinação com agentes que são administrados para tratar DGF. Os polipeptídeos MTSP- 1 providos na presente invenção podem, por exemplo, ser administrados em combinação com um agente imunossupressor. Essa combinação é útil para prolongar a sobrevivência do aloenxerto em um receptor, em particular, a sobrevivência crônica do aloenxerto. Em modalidades preferidas, a combinação é formulada e preparada de modo a ser adequada para administração crônica ao receptor do aloenxerto, por exemplo, são empregadas formulações estáveis. Em certas modalidades, a combinação é formulada e preparada de modo que seja adequada para administração simultânea dos polipeptídeos MTSP-1 modificados e do fármaco imunossupressor ao receptor do aloenxerto. Em certas modalidades, a combinação é formulada e preparada de modo que seja adequada para administração sequencial (em qualquer ordem) dos polipeptídeos MTSP-1 modificados e do fármaco imunossupressor ao receptor do aloenxerto.
[00453] Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção também podem ser usados em combinação com agentes que são administrados para tratar a degeneração macular. Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem ser administrados com qualquer um ou mais de ranibizumabe (vendido sob o nome comercial Lucentis™); bevacizumab (vendido sob o nome comercial Avastin™); pegaptanib sódico (vendido sob o nome comercial Macugen™); aflibercept (vendido sob o nome comercial Eylea™); e verteporfina (vendida sob o nome comercial Visudyne™). Os polipeptídeos MTSP-1 providos na presente invenção também podem ser usados em combinação com um telescópio implantável, tratamento a laser ou fotocoagulação a laser, cirurgia e/ou terapia de fotodinâmica, isoladamente ou em combinação com a verteporfina terapêutica, para tratar a degeneração macular.
[00454] Agentes adicionais, tais como, outros inibidores do complemento, podem ser usados como fármacos anti-
inflamatórios em terapia combinada com polipeptídeos MTSP-1 modificados, como descrito na presente invenção. Exemplos de outros inibidores do complemento incluem fator de veneno de cobra (FVC), moléculas polianiônicas, tais como, heparina, sulfato de dextrano, sulfato de polivinila, polilisina ou suramina, moléculas naturais, tais como, K-76COOH, ácido rosmarínico ou extrato da erva medicinal chinesa Ephedra, moléculas sintéticas, tais como, mesilato de afamastat (FUT- 175), um inibidor sintético de C1s (C1s-INH-248) ou um inibidor contra C1s e fD (BCX-1470), inibidores de peptídeos, tais como, compstatina, inibidores de anticorpos de complemento, tais como anticorpos anti-C5 (N19-8), anti-C5 (h5G1.1) humanizados, anti-C6 ou anti-C8, e formas solúveis de reguladores de complemento de membrana, tais como, CR1 solúvel (sCR1), DAF solúvel (sDAF), MCP solúvel (sMCF) ou CD59 solúvel (sCD59) (Morgan et al., (2003) Mol Immunol. 40:159).
[00455] As composições farmacêuticas, contendo polipeptídeos MTSP-1 descritos na presente invenção, podem ser usadas para tratar qualquer de uma ou mais doenças ou condições inflamatórias mediadas por ativação do complemento. Também são providas combinações de polipeptídeos MTSP-1 e outro tratamento ou composto para tratamento de uma doença ou condição inflamatória. Os polipeptídeos MTSP-1 e o agente anti-inflamatório podem ser acondicionados como composições separadas para administração em conjunto ou sequencialmente ou intermitentemente. Alternativamente, eles podem ser providos como uma composição única para administração ou como duas composições para administração como uma composição única. As combinações podem ser acondicionadas como kits, opcionalmente com reagentes adicionais, instruções de uso, frascos e outros recipientes, seringas e outros itens para uso dos polipeptídeos MTSP-1 modificados. I. EXEMPLOS
[00456] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para finalidades ilustrativas e não pretendem limitar o escopo da invenção. Exemplo 1 Clonagem e Expressão de Polipeptídeos MTSP-1 Modificados e Triagem para Polipeptídeos MTSP-1 Modificados que Clivam C3 em um Sítio Alvo A. Clonagem e Mutagênese de MTSP-1
[00457] Foi preparado um ácido nucleico que codifica os aminoácidos 615-855 com a troca de C122S do polipeptídeo MTSP-1 humano apresentado na SEQ ID NO: 1. A construção incluiu a pró-região, a sequência de ativação e o domínio da protease, e continha os resíduos 598 ao terminal C da sequência publicada por Takeuchi et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 96:11054 e SEQ ID NO: 1 (isto é, correspondendo aos resíduos 598 a 855 da sequência de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 1).
[00458] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados foram gerados pela mutagênese direcionada pelo sítio Quikchange (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante com oligonucleotídeos projetados especificamente que serviram como iniciadores para incorporar mutações projetadas no DNA recém-sintetizado. Resumidamente, foi estabelecida uma reação de amostra de PCR contendo o MTSP-1 tipo selvagem como molde e iniciadores oligonucleotídicos projetados para conter a(s) mutação(ões) desejada(s). Após a PCR, cada produto da reação foi digerido com DpnI para remover as fitas de DNA parentais Dam metiladas. O DNA foi então transformado em células Blue Supercompetent XL-1 de E. coli (Stratagene) e plaqueadas em ágar seletivo contendo 50 µg/ml de carbenicilina. O DNA do plasmídeo foi isolado a partir de clones selecionados, e sequenciado para verificar a incorporação de mutação(ões) na(s) localização(ões) desejado(s) no gene de MTSP-1 e a ausência de quaisquer mutações adicionais indesejadas. B. Preparação de Polipeptídeos MTSP-1
1. Transformação
[00459] O domínio da protease dos polipeptídeos MTSP-1 tipo selvagem e modificado (ambos contendo a troca de C122S), como detalhado na Seção A, acima, foi clonado no vetor de expressão pQE-80 (Qiagen) e as construções resultantes transformadas em células BL21 Gold (DE3) de E. coli (Agilent Technologies, número de catálogo: 230132). Aproximadamente 50 µL de células BL21 Gold quimicamente competentes (DE3) foram transformadas com o DNA de plasmídeo apropriado (tipicamente aproximadamente 5 ng de DNA de plasmídeo purificado ou 5-10 µL de uma mistura reacional de ligação). As células e o DNA foram incubados em gelo por 30 minutos, submetidos a choque térmico a 42°C por 45 segundos, e depois incubados em gelo por 2 minutos. Foram adicionados 450 µL de Caldo Terrific em temperatura ambiente (meio TB) (VWR International, número de catálogo: 100219-866), e as células foram cultivadas no meio TB por 1 hora com agitação a 240 rpm a 37°C. 20 µL de solução contendo as células transformadas foram espalhados em um meio YT 2x + 100 µg/mL de placa de carbenicilina da Teknova (número de catálogo: Y4420) e incubados durante a noite a 37°C. Colônias isoladas foram então selecionadas e usadas para preparações de plasmídeos. Os plasmídeos resultantes foram submetidos a sequenciação de DNA para confirmar a presença da sequência de codificação para o polipeptídeo MTSP-1 desejado.
2. Expressão de Polipeptídeos MTSP-1
[00460] Foram adicionados 500 µL de uma cultura de células durante a noite que foram transformadas com um plasmídeo de expressão pQE-80 contendo a sequência de codificação para o polipeptídeo MTSP-1 desejado a 100 mL de Caldo Terrific/Carbenicilina100 contendo 2,1 mL da Solução 1, 5,4 mL da Solução 2 e 107 µl da solução 3 do Sistema Autoindução 1 Overnight ExpressTM em um balão Erlenmeyer de 500 mL. O balão foi colocado em um Agitador Infors Multitron ajustado a 210 rpm. A cultura foi cultivada (com agitação) durante a noite a 37°C. Na manhã seguinte, 20 µl de isopropil βD-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) 1M foram adicionados à cultura para induzir a expressão do polipeptídeo MTSP-1, e a cultura foi cultivada a 37°C com agitação por mais 2 horas. Essa “cultura induzida” foi coletada em uma garrafa de centrífuga cônica de 250 mL e centrifugada a 3600 rpm por 10 min a 4°C em uma centrífuga Allegra™ 6R com um rotor GH-
3.8/GH-3.8A. O sedimento celular resultante foi armazenado a -20°C ou posteriormente processado imediatamente como descrito abaixo.
3. Isolamento de Corpos de Inclusão de Polipeptídeo MTSP- 1
[00461] O sedimento de células bacterianas da cultura de 100 mL foi recolocado em suspensão em 60 ml de reagente de extração BugBuster® (Merck Millipore, NC9591474) contendo 60 µL de rLysozyme™ (Sigma, número de catálogo: L6876) por agitação em vórtice seguido de agitação a 240 rpm por 1 hora a 37°C para facilitar a lise das bactérias. Após a lise bacteriana, o material insolúvel foi sedimentado por centrifugação a 3.600 rpm por 10 minutos a 4°C, e o sobrenadante foi decantado. O sedimento resultante foi recolocado em suspensão por homogeneização em 100 mL de Tris 50 mM pH 8,0 usando um homogeneizador Power Gen 500 (Fisher Scientific, 14-261-04P) com uma sonda geradora de 20 x 195 mm usando pulsos de 5 segundos repetidos 2 x até o sedimento foi bem dispersado. O material recolocado em suspensão foi centrifugado a 3.600 rpm por 10 minutos a 4°C, o sobrenadante decantado, e o sedimento foi deixado secar ao ar por 10 a 15 minutos. O sedimento de corpos de inclusão (IB) foi pesado e armazenado a -20°C até o uso.
4. Ressuspensão e Desdobramento de Corpos de Inclusão Contendo Polipeptídeos MTSP-1
[00462] Os polipeptídeos insolúveis de MTSP-1 foram isolados de corpos de inclusão e desnaturados na presença de agente redutor. 4-5 gramas do grânulo de IB foram recolocados em suspensão em 25 mL de Tris 50 mM, pH 8,0 por homogeneização para formar a solução de IB. Foram adicionados 75 mL de tampão de desdobramento (GuHCl 6M, Tris 50 mM, pH 8,0 (Teknova, número de catálogo: G0380)) à solução de IB. A solução de IB resultante foi agitada a 240 rpm a 37°C por pelo menos 1 hora, ou até os corpos de inclusão estarem completamente dissolvidos.
5. Redobramento de Polipeptídeos MTSP-1
[00463] Cinco ml da solução de polipeptídeo MTSP desnaturada e recolocada em suspensão descrita acima foram gotejados lentamente em ≥100 ml de tampão de redobramento (arginina 1,5 M, Tris 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM) a uma diluição de 1:20 ou maior (ou aproximadamente ≤100 µg de proteína/ml de tampão de redobramento), com agitação. A solução de proteína no Tampão de Redobramento foi incubada em um agitador a 150 rpm por 24 horas em temperatura ambiente para permitir que ocorra o dobramento.
[00464] A solução de proteína resultante foi transferida para um tubo de diálise de celulose regenerada Spectra/Por® de 12.000 a 14.000 Dalton (MWCO) de ponto de corte de peso molecular (VWR) e dialisada em 180 L de Tris 25 mM, pH 8,0 por pelo menos 4 horas. No dia seguinte, as amostras foram transferidas para um novo tanque de 180 L de Tris 25 mM, pH 8,0 e deixadas dialisar durante a noite. No dia seguinte, as amostras foram transferidas para um terceiro tanque de 180 L de Tris 25 mM, pH 8,0 e dialisadas por pelo menos 18 horas. As amostras foram dialisadas pelo menos durante a noite e por até vários dias. As amostras dialisadas por um dia foram incubadas em temperatura ambiente e as amostras dialisadas por mais de um dia foram incubadas a 4°C. A razão entre o volume total do tampão de diálise e o volume total da amostra foi de pelo menos 100. Após a diálise, as amostras de protease foram removidas do tubo de diálise e filtradas usando um balão de 500 mL, 0,22 µm (Millipore), e a condutividade da solução foi medida. A condutividade da solução foi ajustada para impedir a ligação não específica à coluna de Benzamidina durante a etapa de ativação descrita abaixo. A concentração de NaCl foi ajustada para aproximadamente NaCl 0,5 M (por exemplo, 390 mL de NaCl 5 M foram adicionados a 3,9 L de proteína dialisada). A condutividade da solução deve ser de aproximadamente 1,3 ms (/cm).
6. Ativação de Polipeptídeos MTSP-1
[00465] Após filtração da solução contendo o polipeptídeo MTSP-1 redobrado, a concentração de NaCl foi ajustada para aproximadamente 0,5 M por adição de NaCl 5M. Vinte mL de sedimentos de agarose de tripsina imobilizadas foram acondicionados em uma coluna descartável Econo-Pak (Bio-Rad; número de catálogo 7321010) e a coluna foi equilibrada com 200 mL (isto é, 10 volumes de coluna) de solução de cromatografia tampão A (Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 0,5M). A solução de polipeptídeo MTSP-1 redobrada (ver acima) foi carregada na coluna, e o lançamento de fluxo contendo o polipeptídeo MTSP-1 ativado foi coletado. O fluxo através das frações que continham proteína foi combinado e dialisado durante a noite em tampão Tris 25 mM (pH = 8,0) e o tampão foi trocado duas vezes em 150 litros. A condutividade da solução de polipeptídeo MTSP-1 resultante ativada foi confirmada como sendo menor que 2 ms/cm ou ajustada adequadamente com Tris 25 mM, pH = 8,0.
7. Purificação de polipeptídeos MTSP-1
[00466] Os polipeptídeos MTSP-1 podem ser e foram purificados de acordo com as seguintes etapas:
1. Medir a condutividade da amostra ativada usando um medidor de condutividade SevenEasy. Se a medição for <3 ms/cm, prosseguir para a etapa 2 abaixo. Se a medição for >3 ms/cm, diluir a amostra com Solução de Cromatografia Tampão A (Tris 25 mM pH 8,0, NaCl 0,5 M) até a condutividade alcançar <3 ms/cm.
2. Usar um AKTAPURIFIER, carregar a amostra em uma coluna de troca catiônica HiTrap Q HP de 5 mL pré-equilibrada com 5 volumes de coluna (CV) da solução de cromatografia tampão A a uma vazão de 8 mL/min.
3. Lavar a coluna com 5 volumes da coluna de solução de cromatografia tampão A.
4. Eluir com 15 volumes de coluna com gradiente de NaCl de 0-50% usando soluções de cromatografia Tampão A/Tampão B a 5 mL/min. Coletar frações de 2 ml.
5. A coluna é lavada com 3 CV de Solução de Cromatografia Tampão B e depois reequilibrada com 5 CV de Solução de Cromatografia Tampão A antes do carregamento da próxima amostra.
6. MTSP-1 ativo é localizado por ensaio de atividade, onde 5 µl de fração são misturados com 50 µl de Tampão de Ensaio contendo 200 µM de um substrato de fluorescência extinto apropriado (adicionar substrato QHAR QF).
7. Ler a atividade em um leitor de placas Molecular Devices M5 a 30°C. Definir Excitação em 490 nm e Emissão em 520 nm.
8. Concentrar as quatro frações mais ativas usando um Filtro Centrífugo Amicon Ultra 10K de 15 mL.
9. Medir a concentração de A280 usando o Espectrofotômetro Nanodrop. Continuar concentrando até alcançar uma concentração final aproximada de 200 µM.
10. Para avaliar a qualidade do produto purificado, carregar 2 µg/faixa de amostra no Tampão De Amostra 2X contendo o Agente Redutor de Amostra 2X NuPAGE em um gel Bis-Tris NuPAGE Novex a 4-12%. Execute o gel em Tampão Contínuo MES 1X a 200V por 30 min. Visualizar o gel corando com Azul de Coomassie seguido de descoloração.
11. Congelar instantaneamente a amostra em nitrogênio líquido e armazenar a -80°C.
8. Remoção de Endotoxina de Polipeptídeos MTSP-1 Purificados para Uso em Modelos in vivo
[00467] A remoção da endotoxina de alto peso molecular foi obtida passando a amostra através de uma membrana de 15 ml da Unidade de Filtro Centrífuga Amicon Ultra-15 100K (Fisher Scientific). A amostra foi filtrada girando a 4000 RPM por 20 minutos. Se a amostra não tivesse passado pelo filtro após 20 minutos, a etapa de centrifugação foi repetida. Em seguida, a amostra foi transferida para um tubo de Falcon limpo. Para garantir a remoção completa da endotoxina de pequeno peso molecular, a amostra foi passada sobre uma coluna por gravidade S limpa Cellufine ET de 2 ml (Fisher Scientific). Pelo menos 24 horas antes da adição da amostra, a coluna S limpa Cellufine ET de 2 ml foi preparada. Adicionaram-se 4 mL de pasta fluida S limpa Cellufine ET e 10 mL de solução de etanol a 20% sem Endo (Fisher Scientific) à coluna de cromatografia por gravidade Econo-Pac. A solução de EtOH a 20% foi passada através da coluna, seguida por 25 mL de EtOH a 80%, NaOH 0,2N. O fundo da coluna por gravidade foi tampado e a coluna foi enchida com EtOH a 80%, NaOH 0,2 N, coberta e incubada em temperatura ambiente por pelo menos 16 horas. Após pelo menos 16 horas, o EtOH a 80% e NaOH 0,2 N foi deixado passar através da coluna. A coluna foi rinsada com 25 mL de água sem endotoxina e a água foi deixada passar através da coluna. Em seguida, a coluna foi equilibrada com
2 x 20 mL de solução salina tamponada com fosfato sem endo estéril (PBS). A amostra foi então adicionada à coluna e a amostra eluída foi coletada. A coluna foi lavada com 10 mL de PBS sem endo para garantir que a amostra passasse completamente pela coluna.
[00468] A concentração de proteína, A280, foi medida usando um espectrofotômetro NanoDrop® (NanoDrop) e o uso de um coeficiente teórico de extinção de 2,012mg/A280. Se necessário, a proteína ativa foi concentrada usando membrana de 15 ml da Amicon Ultra-15 10K Unidade de Filtro Centrífuga (Fischer Scientific) até aproximadamente 2,5 mg/ml em solução salina tamponada com citrato (citrato de sódio 20 mM, pH 5,0, NaCl 50 mM). Para avaliar a qualidade do produto purificado, 2 µg de amostra em tampão de amostra NuPAGE LDS 1x (Invitrogen, Corp.) contendo agente redutor de amostra NuPAGE 2x (Invitrogen) foi carregado em 12 poços com NuPAGE Novex a 4-12% Gel Bis-Tris a 4-12% (Invitrogen), e executar tampão Contínuo SDS NuPAGE MES 1X (Invitrogen) a 200 V por 30 minutos. A célula foi corada com Azul de Coomassie seguido de descoloração para visualizar as bandas de proteínas. A proteína foi congelada instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenada a -80°C. C. Seleção e Identificação de Polipeptídeos MTSP-1 Modificados que Clivam C3 para Inativá-lo
[00469] Os polipeptídeos MTSP-1 modificados foram identificados triando uma biblioteca de polipeptídeos MTSP- 1 modificados contra uma serpina ATIII modificada, como descrito em detalhes na Patente U.S. N° 8.211.428 (ver também a Publicação U.S. Nº US-2014-0242062-A1, agora Patente U.S. Nº 9.795.655). Uma serpina inibitória, ou fragmento da mesma,
capaz de formar um intermediário enzima acila covalente entre a serpina e a protease é usada para triagem. Geralmente, a serpina que é usada é aquela que tem como alvo e regula a protease tipo selvagem in vivo. Qualquer serpina, no entanto, que reaja e iniba irreversivelmente a protease alvo, pode ser usada como uma “isca” para esses experimentos de seleção.
[00470] No ensaio, uma serpina modificada por troca de seu enovelamento de sítio reativo (RSL) para incluir uma sequência alvo (isto é, o sítio alvo em C3 para clivagem em C3 inativo) captura proteases modificadas que clivam o sítio alvo para formar complexos estáveis. A protease modificada capturada é então isolada/identificada. Para os polipeptídeos MTSP-1, a serpina “isca” foi ATIII que foi modificada trocando os resíduos indicados abaixo por QHARASHLG (resíduos 737-745 de C3, SEQ ID NO: 9), que é o sítio direcionado para inativação de C3 humano.
[00471] ATIII “isca” (SEQ ID NO: 692) com a sequência inserida QHARASHLG correspondente ao sítio alvo de C3 (resíduos 737-745 da SEQ ID NO: 9): 10 20 30 40 50 60
HGSPVDICTA KPRDIPMNPM CIYRSPEKKA TEDEGSEQKI PEATNRRVWE LSKANSRFAT 70 80 90 100 110 120
TFYQHLADSK NDNDNIFLSP LSISTAFAMT KLGACNDTLQ QLMEVFKFDT ISEKTSDQIH 130 140 150 160 170 180
FFFAKLNCRL YRKANKSSKL VSANRLFGDK SLTFNETYQD ISELVYGAKL QPLDFKENAE 190 200 210 220 230 240
QSRAAINKWV SNKTEGRITD VIPSEAINEL TVLVLVNTIY FKGLWKSKFS PENTRKELFY 250 260 270 280 290 300
KADGESCSAS MMYQEGKFRY RRVAEGTQVL ELPFKGDDIT MVLILPKPEK SLAKVEKELT 310 320 330 340 350 360
PEVLQEWLDE LEEMMLVVHM PRFRIEDGFS LKEQLQDMGL VDLFSPEKSK LPGIVAEGRD 370 380 390 400 410 420
DLYVSDAFHK AFLEVNEEGS EAAASTAVVQ HARASHLGRV TFKANRPFLV FIREVPLNTI 430 440
[00472] As mutações no ATIII com referência à posição na SEQ ID NO: 692 são resumidas como a seguir:
RCL QHARASHLG 390 398 Terminal C GGGSDYKDDDDK 433 444 Mutação I390Q 390 390 Mutação A391H 391 391 Mutação G392A 392 392 Mutação S394A 394 394 Mutação L395S 395 395 Mutação N396H 396 396 Mutação P397L 397 397 Mutação N398G 398 398 Etiqueta Flag DYKDDDDK 437 444
[00473] Para realizar a seleção de variantes de protease que são capturadas pela isca ATIII modificada por QHAR-ASHLG, uma biblioteca de variantes de MTSP foi exibida na superfície do bacteriófago M13, fundida ao terminal C da proteína P3 do revestimento do fago. Várias bibliotecas de MTSP foram projetadas substituindo os códons naturais por códons NNK nas posições em MTSP consideradas importantes para o reconhecimento e a clivagem de substratos com base em modelagem molecular ou eram posições de “segunda esfera” que contactam resíduos mutados previamente selecionados e que provaram ser vantajosos. Essas posições correspondiam aos sítios do lado primário ou não primário no MTSP, incluindo as posições 40, 41, 60b, 60g, 96-99 (mais inserções de 1 e 2 aminoácidos na região 96-99), 151, 175, 192, 217 e 224. Para garantir uma representação suficiente para cada variante na biblioteca de fagos, o tamanho de cada biblioteca construída (medida por CFUs geradas pelo DNA transformado da biblioteca) foi significativamente maior que a diversidade calculada para todas as bibliotecas que continham 5 ou 6 posições aleatórias e comparáveis com a diversidade calculada para bibliotecas que continham 7 posições aleatórias. Após a construção das bibliotecas de fagos de MTSP, 96 colônias de cada biblioteca foram sequenciadas para confirmar a frequência e a distribuição das mutações e para avaliar a qualidade geral da biblioteca. Bibliotecas de alta qualidade (isto é, aquelas contendo a frequência esperada de mutações, sem contaminação, etc.) foram então submetidas a seleção por incubação com as múltiplas concentrações da serpina isca biotinilada por vários períodos de tempo. O complexo de fago de MTSP biotinilado foi capturado em placas revestidas com avidina, lavado com cloridrato de guanidina 6M para remover complexos de protease-serpina não covalente de alta afinidade e depois eluído com DTT. Em algumas ocasiões, foi realizada uma contra-seleção, usando alfa 2- macroglobulina ou serpinas de ocorrência natural, tal como ATIII. Frequentemente, a seleção e a contra-seleção foram realizadas simultaneamente incubando a biblioteca com ambas as serpinas alvo e serpina(s) de contra-seleção na mesma reação. Tipicamente, a(s) serpina(s) de contra-seleção estariam presentes no excesso molar sobre as serpinas de seleção. Foram realizadas várias rodadas de seleção, depois as colônias individualmente crescidas foram triadas por ensaio enzimático quanto ao desempenho contra um peptídeo correspondente ao substrato alvo. As colônias que produzem variantes com alta atividade para a clivagem da sequência alvo foram ainda caracterizadas por sequenciação de DNA do seu DNA de fagomídeo para identificar a identidade das mutações na sequência de codificação de MTSP-1. D. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados
[00474] A Tabela 14 abaixo apresenta modificações e as sequências de domínios de protease de exemplo de polipeptídeos MTSP-1 modificados que foram gerados e selecionados para inativar C3, com as mutações indicadas usando numeração em relação ao polipeptídeo MTSP-1 maduro apresentado na SEQ ID NO: 1 (numeração madura de MTSP-1) e também numeração de quimotripsina (modificações adicionais são apresentadas na Tabela 15). Enquanto os domínios de protease de referência têm SEQ ID NOs., entende-se que as mutações podem ser incluídas em polipeptídeos MTSP-1 modificados maduros, porções cataliticamente ativas dos mesmos que contêm as modificações referidas e formas ativas e formas de duas cadeias ativadas.
[00475] A troca de C122S, ou outra troca conservada para S, é incluída para eliminar a dimerização da protease e reduzir o potencial para formação de ligações dissulfeto “inadequadas” durante o processo de dobramento; embora vantajoso, é uma mutação opcional. Tabela 14. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ ID NO.* I640R/F706T/InsE/T707G/F708G/ I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99 C731S/G759N/Q783L/Q802E L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 21 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C1 /G759N/Q783L/Q802D 22S/G151N/Q175L/Q192D 22 Q637H/I640A/D661T/F664K/Y666W Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C1 /G759N/Q783L/Q802D 22S/G151N/Q175L/Q192D 23 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706D/InsV/T707P/F708L/C731S W/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802E 22S/G151H/Q175L/Q192E 24 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706D/InsV/T707P/F708L/C731S W/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 25 Q637H/I640A/D661T/F664K/Y666W Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 26 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706D/InsV/T707P/F708L/C731S W/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C1 27
Tabela 14. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ ID NO.* /G759N/Q783L/Q802D 22S/G151N/Q175L/Q192D Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /F706T/InsE/T707G/F708L/C731S W/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 28 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666G Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /D705I/F706Y/InsN/T707G/F708L W/D96I/F97Y/ins97aN/T98G/F9 /C731S/G759N/Q783L/Q802D 9L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 29 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706D/InsA/T707P/F708L W/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F9 /C731S/G759H/Q783L/Q802D 9L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 30 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /D705P/F706W/InsN/T707G/F708L W/D96P/F97W/ins97aN/T98G/F9 /C731S/G759N/Q783L/Q802E 9L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 31 Q637H/I640A/D661V/F664R/Y666W Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60g /D705I/F706N/T707G/F708L/C731 W/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S S/G759N/Q783L/Q802D /G151N/Q175L/Q192D 32 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705Y/F706E/InsV/T707G/F708L W/D96Y/F97E/ins97aV/T98G/F9 /C731S/G759H/Q783L/Q802D 9L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 33 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705L/F706D/InsG/T707G/F708L W/D96L/F97D/ins97aG/T98N/F9 /C731S/G759H/Q783L/Q802E 9L/C122S/G151H/Q175L/Q192E 34 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F9 35 /C731S/G759H/Q783L/Q802D 9L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705V/F706G/InsV/T707P/F708L W/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F9 /C731S/G759H/Q783L/Q802D 9L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 36 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706D/InsA/T707P/F708L W/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F9 /C731S/G759N/Q783L/Q802D 9L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 37 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S W/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 38 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/InsV/T707P/F708L/C731S W/D96K/ins97aV/T98P/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 39 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F9 /C731S/G759H/Q783L 9L/C122S/G151H/Q175L 40 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192 I640E/F708L/C731S/G759N/Q802T 41
T I640D/C731S/G759N/Q802T I41D/C122S/G151N/Q192T 42 I41S/F99L/C122S/G151N/Q192 I640S/F708L/C731S/G759N/Q802V 43
V I41E/F99L/C122S/G151N/Q192 I640E/F708L/C731S/G759N/Q802T 44
T I640D/Y658F/D705E/F708L/C731S I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/ 45 /G759N/Q802T G151N/Q192T
Tabela 14. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ ID NO.* I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192 I640D/Y658F/C731S/G759N/Q802T 46
T I640S/D661T/F664S/Y666W/D705K I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96 /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 47 Q637H/D661T/F664S/Y666W/D705K Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96 /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 48 Q637H/I640S/F664S/Y666W/D705K Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 /G759H/Q783L/Q802D 2S/G151H/Q175L/Q192D 49 Q637H/I640S/D661T/Y666W/D705K Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 /G759H/Q783L/Q802D 2S/G151H/Q175L/Q192D 50 Q637H/I640S/D661T/F664S/D705K Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K /F706G/InsV/T707P/F708L/C731S /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 /G759H/Q783L/Q802D 2S/G151H/Q175L/Q192D 51 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/T707P/F708L/C731 W/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S S/G759H/Q783L/Q802D /G151H/Q175L/Q192D 52 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/F708L/C731S W/D96K/F97G/ins97aV/F99L/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 53 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/C731S W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/C1 /G759H/Q783L/Q802D 22S/G151H/Q175L/Q192D 54 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F9 /C731S/Q783L/Q802D 9L/C122S/Q175L/Q192D 55 Q637H/I640S/D661T/F664S/Y666W Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60g /D705K/F706G/InsV/T707P/F708L W/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F9 /C731S/G759H/Q802D 9L/C122S/G151H/Q192D 56 Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a 57 T707P/F708L/C731S/Q802D V/T98P/F99L/C122S/Q192D I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 58 F708L/C731S/Q783L/Q802D P/F99L/C122S/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ V/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q19 T707P/F708L/C731S/Q783L/Q802D 2D 59 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/Q802D P/F99L/C122S/Q192D 63 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ V/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q19 T707P/F708L/C731S/Q783L/Q802D 2D 64 Q637H/I640S/D661Y/D705K/F706G Q38H/I41S/D60bY/D96K/F97G/ /InsV/T707P/F708L/C731S/Q802D ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q19 /D828V 2D/D217V 65 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/Q802D P/F99L/C122S/Q192G/D217V 66
Tabela 14. Polipeptídeos MTSP-1 Modificados Numeração de MTSP-1 maduro Numeração de Quimotripsina SEQ ID NO.* I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97 Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ aV/T98P/F99L/C122S/Q192D/D2 T707P/F708L/C731S/Q783L/Q802D 17V 67 Q637H/I640S/D661Y/D705K/F706G I41S/D96M/F97G/ins97aV/T98 /InsV/T707P/F708L/C731S/Q802D P/F99L/C122S/Q192G/D217V /D828V 68 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/Q802D/D828V P/F99L/C122S/Q192V/D217I 69 I640S/D661T/D705K/F706G/InsV/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 T707P/F708L/C731S/Q802D/D828V P/F99L/C122S/Q192H 70 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q802G/D828V P/F99L/C122S/Q192N/D217V 71 I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 F708L/C731S/ Q802V/D828I 92D 72 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97a I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ V/T98P/F99L/C122S/Q192G/D21 F708L/C731S/ Q802H 7V 73 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 F708L/C731S/ Q802N/D828V P/F99L/C122S/Q175L/Q192V 74 I640S/D661Y/ I41S/P49S/D96K/F97G/ins97a D705K/F706G/InsV/T707P/F708L/ V/T98P/F99L/C122S/Q192G/D21 C731S/ Q783L/ Q802D 7V 75 Q637H/I640S/D705K/F706G/InsV/ I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98 T707P/F708L/C731S/ Q802G/ P/F99L/C122S/Q175L/Q192N/I2 D828V 17V 76 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41T/F97W/F99L/C122S/G151N F708L/C731S/ Q783L/ Q802V /Q175M/Q192G/D217L 77 I640S/P648S/D705K/F706G/InsV/ I41G/F97L/F99L/C122S/Q175A T707P/F708L/C731S/ Q783L/ /Q192T/D217V Q802G/ D828V 78 I640S/D705K/F706G/InsV/T707P/ I41G/F97V/F99L/C122S/G151Q F708L/C731S/ Q783L/ Q802V/ /Q175M/Q192A/D217L D828V 79 I640T/F706W/F708L/ I41G/F97I/F99L/C122S/G151L C731S/G759N/Q783M/ Q802G/ /Q175M/Q192S/D217V D828L 80 I640G/F706L/F708L/ I41G/F97S/F99L/C122S/G151N C731S/Q783A/ Q802T/ D828V /Q175L/Q192G/D217I 81 * SEQ ID do domínio da protease que contém as trocas Exemplo 2 Clivagem in vitro da proteína C3 do complemento
[00476] A atividade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados foi determinada por clivagem da proteína do complemento do substrato, C3 humano, medindo a quantidade de C3 humano intacta remanescente após incubação com várias concentrações da protease por 1 hora a 37°C. Neste ensaio, o sinal é gerado na presença de C3 humano intacta e é perdido à medida que o C3 é clivado.
[00477] C3 humano purificado a plasma de 2 µM (hC3; Complement Technologies; Tyler, TX) foi incubada com os polipeptídeos MTSP-1 modificados (0 - 250 nM) por 1 hora a 37°C em tampão contendo Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM e Tween-20 a 0,01%. A atividade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados foi extinta pela adição de EGR-CMK (Haematologic Technologies, EGRCK-01) a uma concentração final de 10 µM e a mistura de polipeptídeo MTSP-1 modificado/hC3 foi deixada repousar por 30 minutos em temperatura ambiente.
[00478] Os níveis residuais de C3 humano não digerida foram quantificados usando uma Tela de Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificada (AlphaScreen®; Perkin Elmer). As grânulos aceitadores revestidos por IgG de camundongo α a 100 µg/mL (Perkin Elmer #6760606) foram incubadas com mAb α-hC3a de camundongo 5 nM (Abcam #ab11872- 50) em Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, Tween-20 a 0,01% e BSA a 0,2% para formar a mistura da grânulos aceitadores. A mistura de grânulos aceitadores foi protegida da luz e colocada em um agitador rotativo por 30-60 minutos. As misturas reacionais do polipeptídeo MTSP-1 modificado/hC3 (preparadas acima) foram diluídas 1600 vezes em Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, Tween-20 a 0,01%, BSA a 0,2% e alíquotas de 4 µL foram colocadas em poços duplicados de um Optiplate de 384 poços (Perkin Elmer #6007299). 8 µL de uma mistura de grânulos aceitadores/mAb α-hC3 foram incubados com 8 µl de pAb α-hC3 de cabra biotinilada 25 nM (preparado usando o kit EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina da Thermo Scientific #21327 da versão não biotinilada da Complement Technologies #A213). A placa foi então protegida da luz e incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. Após esta incubação, 4 µL de grânulos doadores revestidos com estreptavidina a 100 µg/mL (Perkin Elmer #6760606) foram adicionados a cada poço e incubados por 60 minutos, protegidos da luz. O sinal de AlfaScreen (Excitação = 680 nm, Emissão = 570 nm) foi então medido usando um leitor de placas Multilabel Envision 2104 (Perkin Elmer). Esse sinal (correspondente à concentração de hC3 restante ([hC3])) foi plotado em função da concentração de polipeptídeo MTSP-1 modificado ([Alterase]) e os dados foram ajustados à equação de quatro parâmetros abaixo para determinar a concentração do polipeptídeo MTSP-1 modificado (a concentração de ‘alterase’) necessária para clivar 50% do hC3 disponível (EC50), a inclinação de Hill (Hill), bem como os sinais máximo (Max) e mínimo (Min) no ensaio. − ℎ 3 = + 1+
[00479] A clivagem de hC3 por polipeptídeos MTSP-1 modificados com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 35 foi medida independentemente um total de 46 vezes, usando 9 lotes diferentes da protease. O polipeptídeo MTSP-1 modificado com a sequência apresentada na proteína C3 do complemento clivada SEQ ID NO: 35 com uma EC50 menor do que o polipeptídeo MTSP- 1 de referência apresentado na SEQ ID NO: 4, que possui uma EC50 = 13,9 nM (n = 235; DP = 4,1). O valor médio de EC50 para o polipeptídeo MTSP-1 modificado com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 35 foi determinado como sendo 6,9 nM (n = 46,
SD = 2,6). As reações de clivagem de C3 foram realizadas 1- 12 vezes para todos os outros polipeptídeos MTSP-1 modificados listados na Tabela 15.
[00480] A Tabela 15 apresenta modificações de exemplo, e a EC50 para polipeptídeos, como apresentada na Listagem de Sequências, que contém essas modificações. Entende-se que a listagem de sequências apresenta o domínio da protease, mas que essas mesmas mutações podem ser incluídas no MTSP-1 modificado de tamanho completo, e várias formas do mesmo, e formas cataliticamente ativas do mesmo. Como apresentado, todos incluem a troca da cisteína livre C122S; a troca reduz a agregação e pode ser opcional. Tabela 15. Clivagem hC3 com Polipeptídeos MTSP-1 Modificados SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 4 C122S 13,9 23 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 14,4 24 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E 6,68 32 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151N/Q175L/Q192D 2,87 35 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/F97G/T98P /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 6,86 36 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 2,85 37 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 5,92 38 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 169 39 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 12 40 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P /F99L/C122S/G151H/Q175L 1,45 42 I41D/C122S/G151N/Q192T 85,2 43 I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V 34,4 44 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T 124 45 I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 54,9 46 I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T 56,7
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L 47 /C122S/G151H/Q175L/Q192D 17,1 Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L 48 /C122S/G151H/Q175L/Q192D 215 Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ 49 C122S/G151H/Q175L/Q192D 13,1 Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ 50 C122S/G151H/Q175L/Q192D 8,64 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ 51 C122S/G151H/Q175L/Q192D 22,2 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C1 52 22S/G151H/Q175L/Q192D 7,88 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/F99L 53 /C122S/G151H/Q175L/Q192D 9,83 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P 54 /C122S/G151H/Q175L/Q192D 18,3 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P 55 /F99L/C122S/Q175L/Q192D 5,25 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P 56 /F99L/C122S/G151H/Q192D 19,9 57 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D 108 58 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D 68,6 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/ 59 Q192D 22 77 I41T/F97W/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217L 12,1 78 I41G/F97L/F99L/C122S/Q175A/Q192T/D217V 7,75 79 I41G/F97V/F99L/C122S/G151Q/Q175M/Q192A/D217L 9,74 80 I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V 2,84 81 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G/D217I 6,84 154 F97E/F99L/C122S/D217I/K224N 6,33 155 C122S/G193A 44,7 156 C122S/G193E 119 157 D96_F97delinsWYY/T98P/F99L/C122S 22,6 158 F97D/F99L/C122S/Q192G 78,1 159 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G 35,4 160 C122S/G151N/G193A 85,7 161 H40R/I41H/C122S/G151N 59,6 162 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N 110 163 H40R/I41H/F97E/C122S 51,7 164 F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 259 165 H40R/I41H/Y60gL/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/D217I/ K224S 7,41 166 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151D/Q192G 1530 167 H40R/I41H/F97D/F99L/Q192G 24,1 168 H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175A/Q192H/ D217I/K224R 19,8
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 169 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217M/K224R 38 170 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217R/K224A 25,9 171 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G/D217K/K224A 14,1 172 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217V/K224Y 2,76 173 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175K/Q192G/D217I/K224H 19,4 174 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217S 24,4 175 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217W/ K224R 9,92 176 H40R/I41H/Y60gN/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175K/Q192S/ D217S/K224L 187 177 H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/ K224L 3,72 178 H40K/I41L/Y60gF/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175R 237 179 H40R/I41H/Y60gL/F97D/F99L/C122S/G151N 54,9 180 H40K/I41M/Y60gG/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192R/ D217V/K224S 509 181 H40K/I41M/Y60gF/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 589 182 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N/Q175M/Q192A/D217S/K224R 470 183 H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/ K224R 7,94 184 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151D/Q175M/Q192G/D217V 70,8 185 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192A/D217N/ K224R 563 186 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A/D217N/ K224R 540 187 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192D/D217N/ K224R 9,74 188 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A/D217N/ K224R 1290 189 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192D/D217N/K224R 9990 190 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/D217N/K224R 103 191 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192D/D217N/K224R 9,64 192 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192A/D217N/ K224R 1230 193 H40K/I41M/F97D/F99L/C122S/Q175M/D217N/K224R 144 194 H40R/I41H/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 5860 195 H40R/I41H/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 46 196 H40R/I41H/F97E/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 82,4 197 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192H 179 198 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/L153R 59,9 199 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N/L153R/V202M 103 200 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192H/P232S 262 201 H40R/I41H/F97D/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 39,7 202 H40R/I41H/F97D/C122S/G151N/L153R 126 203 H40K/I41M/F99L/C122S/T150A/G151R/Q192G 110
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 204 H40R/I41H/F97D/C122S/G133D/G151N 60,4 205 I41R/F99L/C122S/Q192G 53,8 206 H40R/I41H/F99L/C122S/G151K/Q192G 1520 207 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151E/Q175L/ Q192E 126 208 K86R/K110R/C122S/K134R/K157R/K224R/K239R 17,3 209 H40R/I41H/K86R/F97D/K110R/C122S/K134R/G151N/K157R/ K224R/K239R 304 210 K86R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/K110R/C122S/K134R/K157 R/Q175L/Q192E/K224R/K239R 253 211 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217H/K224S 45,2 212 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217I/K224S 19,3 213 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G/D217K/K224A 23,4 214 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217E/K224R 31,2 215 H40R/I41H/F97D/C122S/Q175R/Q192G/D217I/K224Q 93,1 216 H40P/I41R/F99L/C122S/Q192G 62,4 217 H40P/I41R/F99L/C122S/G151K/Q192G 96,1 218 H40R/I41H/F99L/C122S/G151E/Q192G 829 219 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175L/ Q192E 163 220 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175T/ Q192E 743 221 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175T/ Q192D 1620 222 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151E/Q175T/ Q192D 1770 223 H40P/I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 442 224 H40P/I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175L /Q192E 212 225 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/ Q192E 311 226 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/ Q192D 622 227 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175T/ Q192E 1410 228 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175T/ Q192D 9990 229 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 523 230 H40P/I41R/F99L/C122S/G151E/Q192G 153 231 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151E/Q175T/ Q192E 363 232 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175S/ Q192E 267 233 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175I/ Q192E 1030 234 H40R/I41H/Y60gF/F97D/F99L/C122S/Q175K/Q192G/D217R/ K224Q 93,4
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 235 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G/D217Q/K224R 14,9 236 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192N/D217L/K224R 346 237 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/G151N/Q192H/D217K/K224A 137 238 ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G 53,5 239 F97N/ins97aT/T98Y/F99N/C122S 184 240 F97M/ins97aD/T98D/F99L/C122S/Q192T 151 241 ins97aV/F97Q/T98P/F99L/C122S/Q175F/Q192D 248 242 ins97aD/F97T/T98S/F99L/C122S/Q192E/D217Y/K224R 5000 243 ins97aN/F97H/T98D/F99L/C122S/Q192E/D217Q/K224S 2750 244 F97Q/ins97aT/T98M/C122S/Q192E/D217R/K224L 2450 245 ins97aD/F97Q/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E/D217F/ K224S 5560 246 ins97aD/F97G/T98N/F99L/C122S/Q192E/D217Y/K224R 9870 247 ins97aE/F97Y/T98S/F99L/C122S/Q192T/D217Q/K224R 249 248 ins97aG/F97N/T98D/F99L/C122S/Q192E/D217H/K224A 2790 249 ins97aA/F97G/T98N/F99L/C122S/Q175M/Q192T/K224A 200 250 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175S/ Q192D 2080 251 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175I/ Q192D 8370 252 I41R/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175I/ Q192E 2070 253 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151D/Q175I/ Q192D 1750 254 S90T/D96A/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 280 255 Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 341 256 ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E/Q209L 383 257 Y59F/D96V/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 293 258 D96V/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 258 259 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151S/Q175L/ Q192E 274 260 E24K/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/A152S/Q175L/ Q192D 291 261 ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/L153Q/Q175L/Q192D 332 262 ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/I136M/L155M/N170D/ Q175L/Q192E 429 263 I41R/ins97aE/F97T/T98G/F99L/A112V/C122S/Q175L/ Q192E 288 264 Y59F/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 289 265 Y59F/G60dS/R84H/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L /Q192E/V212I 102 266 Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/L153Q/Q175L/ Q192E 237 267 I41R/Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192D 288 268 I41R/Y59F/G60dS/R84H/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/ Q175L/Q192E/V212I 143
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 269 I41R/Y59F/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/L153Q/Q175L /Q192E 253 270 I41R/F97W/F99L/C122S/G151N/Q192G 97,3 271 F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q192G 87 272 I41D/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192E 157 273 I41D/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/ Q192E 148 274 Q38E/H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q192G 30,9 275 H40R/I41H/F97D/F99L/Q175R/Q192G/D217E/K224R 21,9 276 I41R/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q192G 232 277 ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192E 158 278 I41R/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/ Q192E 187 279 Q38E/H40R/I41H/D60bE/F97D/F99L/C122S/Q192G 28,1 280 Q38E/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q192G 39,5 281 Q38E/H40R/I41H/D60bK/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 15,3 282 Q38E/H40R/I41H/D60bN/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/ Q192G 9,42 283 Q38R/I41S/D60bH/F60eV/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 35,2 284 Q38G/H40R/I41H/D60bK/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 20,6 285 I41D/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/ Q192E/Q209L 103 286 Q38G/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 0,867 287 Q38R/I41S/D60bH/F60eV/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192E 22,5 288 H40R/I41H/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175R/Q192G /D217E/K224R 65,8 289 Q38H/I41S/D60bA/F60eV/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192T 7,46 290 Q38E/I41S/D60bH/F60eI/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192V 10,4 291 Q38R/I41S/D60bH/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 27,3 292 Q38E/I41S/D60bV/F60eK/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192I 20,4 293 Q38R/I41E/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192T 63,3 294 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192D 2,37 295 Q38H/I41A/D60bA/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 12 296 F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 194 297 ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 38,5 298 Q38G/H40R/I41H/D60bN/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/ Q192G 11,9 299 Q38G/H40R/I41H/D60bK/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/ Q192G 21,3
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 300 Q38E/H40R/I41H/D60bK/F60eT/F97D/F99L/C122S/Q175L/ Q192G 16,6 301 Q38H/I41S/D60bA/F60eV/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192T 14,2 302 Q38E/I41S/D60bH/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192V 11,5 303 Q38R/I41S/D60bH/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192E 32,9 304 Q38E/I41S/D60bV/F60eK/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192I 19,1 305 Q38R/I41E/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L /Q192T 105 306 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 7,74 307 Q38H/I41A/D60bA/F60eR/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192E 14,2 308 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192E 29,8 309 Q38H/I41S/D60bV/F60eQ/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192I 5,95 310 Q38H/I41A/D60bV/F60eI/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 7,64 311 Q38H/I41A/D60bV/F60eT/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192E 1,39 312 Q38H/I41A/F60eA/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 5,93 313 Q38H/I41A/D60bE/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192D 5,38 314 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192D 3,82 315 Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192D 2,28 316 Q38H/I41S/D60bS/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192E 8,35 317 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D 45,4 318 Q38R/I41T/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L /Q192G 30,6 319 Q38S/I41S/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N /Q175L/Q192S 6,26 320 Q38H/I41T/D60bV/F60eQ/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192G 4,93 321 Q38G/H40R/I41H/D60bH/F60eK/F97T/ins97aE/T98G/F99L/ C122S/Q175L/V183A/Q192G 27,7 322 Q38H/I41A/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 3,9 323 Q38L/I41T/D60bR/F60eL/Y60gM/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192G 23,7 324 Q38F/I41S/D60bF/F60eR/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192V 1,96
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 325 Q38V/I41S/D60bT/F60eT/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175H/Q192S 18,5 326 Q38W/I41A/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151T/Q175S /Q192D 68 327 Q38T/I41S/D60bV/F60eR/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175R/Q192V 15,7 328 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175A/Q192D 67,8 329 Q38H/I41S/D60bT/F60eT/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192V 5,08 330 Q38Y/I41A/D60bL/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175M/Q192A 1,53 331 Q38L/I41T/D60bA/F60eL/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175M/Q192T 20,2 332 Q38R/I41S/D60bY/F60eD/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175M/Q192A 3,22 333 Q38W/I41S/D60bG/F60eI/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175A/Q192D 43,1 334 Q38T/I41S/D60bG/F60eM/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175S/Q192S 28,8 335 I41T/D60bW/F60eH/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192G 3,1 336 Q38D/I41S/D60bT/F60eR/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151K/Q175S/Q192V 48,1 337 Q38H/I41S/D60bF/F60eV/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192A 1,57 338 Q38L/I41A/D60bH/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151Q/Q175A/Q192G 5,73 339 Q38H/I41A/D60bE/F60eH/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 8,28 340 Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 2,91 341 Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 12,1 342 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 12,6 343 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175A/Q192D 22,6 344 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /G151N/Q175L/Q192D 6,06 345 Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 6,95 346 D60bY/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192G 4,1 347 I41T/D60bY/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/ Q192G 3,88 348 Q38E/I41S/D60bT/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192V 32,7 349 Q38H/I41A/D60bK/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192D 22,3
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 350 Q38H/I41S/D60bA/F60eV/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E/Q209L 16,9 351 Q38H/I41A/D60bT/F60eR/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192V 6,54 352 Q38K/I41S/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192V 43 353 Q38F/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192E 1,25 354 Q38H/I41A/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192A 3,09 355 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192A 2,71 356 Q38H/I41A/D60bV/F60eA/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192V 1,57 357 Q38E/I41V/D60bF/F60eK/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192G 14,2 358 Q38H/H40P/I41A/F60eQ/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/ C122S/Q175L/Q192D 5,04 359 Q38R/I41V/D60bV/F60eV/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192G 18,3 360 Q38L/H40P/I41T/D60bV/F60eH/Y60gL/ins97aE/F97T/T98G /F99L/C122S/Q175L/Q192A 6,47 361 Q38H/I41A/D60bV/F60eH/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192D 5,31 362 Q38H/I41S/D60bA/F60eV/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192V 10,9 363 Q38R/I41T/D60bH/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L /Q192G 26,2 364 Q38H/I41S/D60bT/F60eR/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 15,4 365 Q38K/I41T/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175L/Q192A 37,8 366 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192E 14,6 367 Q38L/I41T/D60bV/F60eH/Y60gL/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192S 13,1 368 ins97aA/F97G/T98L/C122S/Q175M/Q192A/D217I/K224R 0,866 369 Q38H/I41A/D60bY/F60eT/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S /Q175L/Q192D 4,77 370 ins97aY/F97H/F99L/C122S/Q175M/Q192A/D217V 5,72 371 ins97aL/F97Q/T98G/F99L/C122S/Q175M/Q192S/D217I 6,67 372 ins97aY/F97G/T98V/C122S/Q175M/Q192S/D217V 2,42 373 Q38Y/I41S/D60bR/F60eE/Y60gF/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/Q175L/Q192V 25 374 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192V 20,2 375 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192V 7,43 376 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175A/Q192D 22,5
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 377 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192E 6,78 378 Q38H/I41A/D60bE/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 13,8 379 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 10,6 380 Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 6,42 381 Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 22,9 382 Q38H/I41S/L52M/D60bG/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117K/ C122S/I136L/Q192G/D217A 22 383 Q38E/I41A/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G /Q209L/D217H 10,2 384 I41S/D60bT/F93L/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G /D217H 27,7 385 I41T/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G/ D217I 4,52 386 Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117L/C122S /I136T/Q192G/D217I 2,43 387 Q38R/I41T/D60bT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V /Q192G/D217N/L233Q 39,8 388 Q38H/I41A/D60bW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136M /Q192G/D217N 3,06 389 Q38H/I41S/P49Q/D60bS/F93L/ins97aV/F97D/T98P/F99L/ C122S/Q192G/D217Q 48,3 390 Q38H/I41S/D60bT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V /Q192G/D217S 22,2 391 Q38H/I41S/D60bS/F93L/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/ C122S/I136F/Q192G/D217V 9,56 392 Q38H/I41T/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136F /L153P/Q192G/D217Y 25,5 393 Q38H/I41S/D60bT/F93L/ins97aV/F97D/T98P/F99L/S115N/ C122S/Q192V/F208L/D217Q 45,8 394 Q38K/I41T/D60bY/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136T /Q192G/F208V/D217R 19,5 395 Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V /Q192G/D217V 7,05 396 Q38H/I41S/D60bG/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117T/C122S /N164D/Q192G/D217E 10,3 397 Q38K/I41S/D60bV/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117T/C122S /Q145E/Q175L/Q192G 11,8 398 Q38H/I41S/D60bT/F60eT/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192V 5,52 399 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D 15,4 400 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D 5,93 401 Q38H/I41S/L52M/D60bH/D96V/ins97aV/F97D/T98P/F99L/ 16,9
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) C122S/T150A/Q192G/Q209L/D217T 402 I41S/D60bS/D96V/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/Q192G /F208L/D217N 52,4 403 Q38H/I41S/D60bT/S90T/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/ S127N/I136F/Q192G/D217Q 21,2 404 Q38H/I41S/D60bT/F93S/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/ I136L/Q192G/D217A 37 405 I41S/D60bH/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136V/ Q192G/D217N 20,6 406 L33M/Q38H/I41A/D60bA/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/ Q192G/D217N 50 407 Q38H/I41S/D60bY/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/L106M/ C122S/I136M/Q192G/Q209L/D217T 1,97 408 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 2,23 409 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aA/F97D/T98P /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 7,09 410 Q38H/I41T/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 9,75 411 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96Y/ins97aI/F97E/T98N /F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192V 4,36 412 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96S/ins97aR/F97A/T98S /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192T 2,07 413 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 1,51 414 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/ Q175L/Q192D 5,53 415 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/ins97aV/F97E/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 4,62 416 Q38H/I41S/D60bA/Y60gG/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /H143T/G151N/Q175L/Q192A 4,22 417 Q38H/I41S/D60bT/F60eH/Y60gF/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/H143R/G151N/Q175L/Q192S 21 418 Q38H/I41S/D60bS/F60eQ/Y60gF/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/H143R/G151N/Q175L/Q192T 12,9 419 Q38H/I41S/D60bF/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /H143Q/G151N/Q175L/Q192G 3,07 420 Q38H/I41S/D60bF/F60eQ/Y60gF/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/H143A/G151N/Q175L/Q192A 4,58 421 Q38H/I41S/D60bT/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /H143Q/G151Q/Q175L/Q192G 6,69 422 Q38H/I41S/D60bQ/F60eQ/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S /H143Q/G151Q/Q175L/Q192G 8,5 423 Q38H/I41S/D60bS/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /H143A/G151N/Q175L/Q192G 26,3 424 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96Q/F97E/ins97aD/T98S /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192R 4,6 425 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98S /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192A 1,17
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 426 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/ins97aG/F97D/T98N /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E 1,59 427 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/F97G/T98P /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 6,86 428 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 1,57 429 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192D 2,52 430 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151N/ Q175L/Q192D 4,9 431 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/ins97aV/F97E/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 4,13 432 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E 1,11 433 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 2,54 434 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 1,83 435 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/ Q175L/Q192D 3,72 436 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151N/Q175L/Q192D 3,04 437 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151N/ Q175L/Q192D 7,04 438 I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192E 6,33 439 Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192E 66,7 440 Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192E 3,83 441 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192E 3,19 442 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/T98P/F99L/C122S/ G151H/Q175L/Q192E 25,7 443 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192E 7,82 444 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/ C122S/G151H/Q175L/Q192E 11,5 445 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/Q175L/Q192E 4,86 446 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q192E 11,9 447 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L 1,31 448 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E 4,07 449 Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192E 10,4 450 Q38H/I41S/D60bT/F60eG/Y60gW/D96V/F97N/T98G/F99L/ 4,47
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) C122S/G151N/Q175L/Q192D 451 Q38K/I41G/F60eG/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51N/Q175L/Q192D 62,7 452 Q38Y/I41E/D60bS/F60eV/Y60gF/D96W/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151N/Q175L/Q192D 227 453 Q38H/I41S/D60bT/F60eG/D96Y/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51N/Q175L/Q192D 9,56 454 Q38V/I41G/F60eG/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51N/Q175L/Q192D 27,4 455 Q38Y/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/D96V/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151H/Q175L/Q192D 5,06 456 Q38H/I41S/D60bT/F60eG/D96P/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51Q/Q175L/Q192D 34,2 457 Q38K/I41G/D60bT/F60eG/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151N/Q175L/Q192D 27,4 458 Q38K/I41G/D60bT/F60eG/Y60gW/D96L/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151N/Q175L/Q192D 12,5 459 Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/D96P/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151N/Q175L/Q192D 45,9 460 Q38E/I41S/D60bW/F60eG/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51N/Q175L/Q192D 22,3 461 Q38M/I41S/F60eH/Y60gW/D96Y/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51N/Q175L/Q192D 21,6 462 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98G /F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192R 13,1 463 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97E/ins97aT/T98G /F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192G 16,9 464 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97E/ins97aS/T98G /F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192G 21,3 465 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96W/F97D/ins97aD/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 5,28 466 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aE/T98G /F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192R 7,16 467 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96W/F97D/ins97aT/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 4,9 468 Q38H/I41S/D60bT/F60eK/Y60gF/D96M/F97N/T98G/F99L/C1 22S/G151N/Q175L/Q192D 20,6 469 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97S/ins97aH/T98G /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 3,14 470 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aN/T98G /F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192G 3,76 471 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97S/ins97aD/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 5,17 472 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aD/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 3,13 473 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97N/ins97aE/T98S /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 4,53 474 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97R/ins97aD/T98G /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 5,71
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 475 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L /C122S/H143R/G151N/Q175L/Q192V 24,5 476 Q38Y/I41S/D60bV/F60eR/Y60gF/D96M/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151N/Q175L/Q192D 5,25 477 Q38E/I41S/D60bV/F60eK/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151N/Q175L/Q192D 19,1 478 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151N/Q175L/Q192D 5,12 479 Q38H/I41S/F60eT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 35,7 480 Q38H/I41S/D60bT/F60eK/D96V/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 13,3 481 I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 9,47 482 Q38Y/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 47,7 483 Q38Y/I41S/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 10,4 484 Q38Y/I41S/D60bT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G1 51N/Q175L/Q192D 3,08 485 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 16,4 486 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/F97N/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 15,9 487 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/T98G/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 3,27 488 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/F99L/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 10,8 489 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/C122S/ G151N/Q175L/Q192D 33,6 490 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151N/Q192D 56,7 491 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/ C122S/G151N/Q175L 1,08 492 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/ C122S/Q175L/Q192D 3,75 493 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P /F99L/M117K/C122S/G151H/Q175L/Q192D 4,75 494 L36Q/Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV /T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 5,49 495 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P /F99L/C122S/T150S/G151H/Q175L/Q192D/Q209L 2,88 496 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aA/T98P /F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 1,43 497 I41G/F97A/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192G/D217L 47,8 498 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 84,4 499 I41R/F97A/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192G/D217Q 401 500 I41S/F97E/F99L/C122S/G151N/Q175G/Q192R/D217A 74,3
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 501 I41G/F97S/F99L/C122S/G151T/Q175R/Q192A/D217Y 52,8 502 I41G/F97L/F99L/C122S/G151N/Q175A/Q192V/D217R 34 503 I41G/F97T/F99M/C122S/G151D/Q175T/Q192T/D217V 45,6 504 I41G/F97L/F99L/C122S/G151T/Q175M/Q192D/D217M 36,8 505 F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 524 506 I41G/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 108 507 I41G/F97S/C122S/G151N/Q175I/Q192T/D217T 860 508 I41G/F97S/F99L/C122S/Q175I/Q192T/D217T 155 509 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217T 105 510 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/D217T 107 511 I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T 97,7 512 F97R/ins97aT/T98V/C122S/Q175M/Q192T/D217S 42,2 513 F97V/ins97aH/T98R/F99L/C122S/Q175R/Q192G/D217S 905 514 F97Q/F99L/C122S/Q175N/Q192V/D217G 3670 515 F97L/ins97aM/T98N/F99L/C122S/Q175T/Q192T/D217S 256 516 F97S/ins97aN/T98G/F99M/C122S/Q175T/Q192T/D217S 2400 517 I41T/F97H/F99L/C122S/G151N/Q175H/Q192V/D217L 131 518 I41R/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175T/Q192T/D217I 159 519 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217H 49,4 520 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V/D217L 88 521 I41E/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175G/Q192T/D217V 13 522 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T/D217A 70,9 523 I41E/F97A/F99M/C122S/G151N/Q175R/Q192S/D217E 485 524 I41G/F99L/C122S/Q175I/Q192T/D217T 81,8 525 I41G/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217T 44,7 526 I41G/F99L/C122S/G151N/Q175I/Q192T 51,6 527 F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217H 91,6 528 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217H 27,1 529 I41E/F97V/F99L/C122S/Q175L/Q192S/D217H 44,3 530 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q192S/D217H 42,2 531 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/D217H 16,5 532 I41E/F97V/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S 51,2 533 F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V/D217L 137 534 I41D/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V/D217L 31,6 535 I41D/F97R/F99L/C122S/Q175R/Q192V/D217L 50,6 536 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q192V/D217L 42,3 537 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/D217L 19,4 538 I41D/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175R/Q192V 79,4 539 I41E/F97R/F99L/C122S/G151Q/Q175G/Q192T 41,1 540 I41D/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T/D217A 30,5 541 I41D/F97T/F99L/C122S/Q175S/Q192T/D217A 52,1 542 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217A 70,4
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 543 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/D217A 25,5 544 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T 56,7 545 F97T/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T/D217A 172 546 I41S/F97Q/F99L/C122S/Q175W/Q192V/D217R 50,6 547 I41G/F97L/F99L/C122S/G151N/Q192V/D217L 112 548 I41G/F97A/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192S 73,1 549 I41G/F97V/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217V 30,5 550 I41D/F97R/F99L/C122S/Q175L/Q192T/D217I 5,72 551 I41E/F97S/F99L/C122S/Q175L/Q192V/D217A 89,9 552 F97L/F99L/C122S/Q175K/Q192V/D217M 463 553 F97E/F99L/C122S/G151A/Q192V 1040 554 F97E/F99L/C122S/Q175H/Q192V/D217P 7770 555 F97R/ins97aI/T98P/C122S/Q175M/Q192V/D217I 23,6 556 I41D/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217A 45,1 557 I41D/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192T 28,6 558 I41D/F97T/F99L/C122S/G151N/Q192T 84,3 559 I41D/F99L/C122S/G151N/Q192T 47 560 I41D/F99L/C122S/Q175S/Q192T 27,4 561 I41D/F99L/C122S/Q192T 59,4 562 Q38R/I41G/Y60gG/F99M/C122S/G151N/Q192R 147 563 Q38K/I41G/Y60gG/F99L/C122S/G151N/Q192H 17,9 564 Q38L/I41R/Y60gF/F99L/C122S/G151N/Q192A 151 565 Q38K/I41D/Y60gG/F99L/C122S/G151N 52,7 566 Q38R/I41R/Y60gF/F99L/C122S/G151N/Q192G 197 567 Q38S/I41S/Y60gW/F99L/C122S/G151D/Q192T 15 568 Q38K/I41G/Y60gW/F99L/C122S/G151N/Q192A 9,96 569 Q38H/I41S/Y60gW/C122S/G151H/Q192A 8,96 570 Q38K/I41S/Y60gW/F99L/C122S/G151N/Q192G 35,1 571 Q38F/I41S/Y60gA/C122S/G151N/Q192R 33,1 572 Q38R/I41S/Y60gW/F99L/C122S/G151N/Q192E 116 573 Q38K/I41R/Y60gG/F99L/C122S/G151N/Q192G 335 574 Q38R/I41R/F99L/C122S/G151N/Q192G 248 575 Q38R/I41R/Y60gL/F99L/C122S/G151N/Q192G 388 576 I41E/C122S/G151N/Q175L/Q192A 45 577 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192G 62 578 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A 28,5 579 I41S/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192V 20,9 580 I41G/F99L/C122S/G151N/Q192A 61 581 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175G/Q192R 95,3 582 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192H 102 583 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175E/Q192R 297 584 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192V 156
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 585 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192S 112 586 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175P/Q192V 35,8 587 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175G/Q192T 30,2 588 I41S/C122S/G151N/Q175R/Q192R 134 589 I41S/F99M/C122S/G151N/Q175P/Q192S 139 590 I41S/C122S/G151N/Q175D/Q192R 96,8 591 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192T 155 592 I41G/F99L/C122S/G151N/Q175R/Q192A 74,5 593 F99L/C122S/G151N/Q192T 225 594 I41D/F99L/C122S/G151N 16,9 595 I41S/F99L/C122S/Q175P/Q192V 64,3 596 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175P 13,9 597 I41E/F99L/C122S/Q175G/Q192T 33,9 598 I41E/F99L/C122S/G151N/Q175G 20 599 I41D/Y59F/F99L/C122S/G151N/Q192T/V213A 414 600 I41D/G43A/F99L/C122S/G151N/Q192T/P232S/K239R 37,6 601 I41D/G43A/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 45 602 I41D/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 51,5 603 I41D/D96E/C122S/G151N/Q192T 78,8 604 I41D/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217E 27,6 605 I41D/F99L/M117T/C122S/G151N/Q192T/A204D/D217E 25,3 606 I41D/F99L/C122S/G151N/Q192T/D217E 22 607 I41D/F99L/C122S/I136M/G151N/Q192T/D217L/K224R 32,2 608 I41D/F60eI/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 47,9 609 I41D/C122S/G151N/Q192T/D217E 34,2 610 D96E/C122S/G151N/Q192T 298 611 Y59F/C122S/G151N/Q192T 288 612 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/F99L/C122S/ G151H/Q175L/Q192D 7,34 613 I41S/ins97aV/C122S/Q192D 336 614 I41S/F97L/F99L/C122S/Q192S 19,1 615 I41T/F97R/ins97aV/T98L/C122S/Q192S 13,2 616 I41S/F97V/T98N/F99L/C122S/Q192S 29,4 617 I41S/F97G/ins97aA/T98L/C122S/Q192A 6,75 618 I41S/F97D/F99L/C122S/Q192V 31 619 I41E/F97L/F99L/C122S/Q192A 47,4 620 I41S/F97A/ins97aV/T98L/C122S/Q192A 5,3 621 I41S/F97del/T98S/F99L/C122S/Q192S 23,2 622 I41A/Y60gW/D96F/F97G/F99M/C122S/Q175W/Q192A 4,06 623 I41G/Y60gW/F99L/C122S/Q175R/Q192S 6,95 624 I41A/Y60gW/ins97aE/F99L/C122S/Q175M/Q192T 8,9 625 I41T/ins97aA/F99Y/C122S/Q175L/Q192A 28
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 626 I41A/ins97aY/F99L/C122S/Q175R/Q192H 14,8 627 I41S/ins97aT/F99L/C122S/Q175R/Q192H 27,5 628 I41S/Y60gW/ins97aN/F99L/C122S/Q175R/Q192T 12 629 Q38H/I41S/D96S/ins97aK/C122S/G151N/Q192A 16,7 630 Q38H/I41A/D96A/ins97aA/C122S/G151D/Q192T 9,25 631 Q38H/I41S/D96Q/ins97aT/C122S/G151N/Q192A 17,9 632 Q38H/I41T/D96M/ins97aA/C122S/G151D 10,8 633 Q38Y/I41A/D96I/ins97aQ/C122S 4,26 634 Q38H/I41S/D96K/ins97aT/C122S/G151K/Q192A 19,2 635 Q38W/I41S/D96R/ins97aA/C122S/G151N/Q192A 9,5 636 Q38H/I41A/D96R/ins97aQ/C122S 7,6 637 Q38F/I41V/D96Q/ins97aT/C122S/G151D 9,89 638 L33M/Q38F/I41S/D96A/ins97aW/C122S/G151N/Q192S 10,6 639 Q38H/I41S/D96V/ins97aA/C122S/G151N/Q192A 16 640 Q38H/I41T/D96K/ins97aL/C122S/G151N/Q192A 44,7 641 Q38H/I41S/D96Q/ins97aA/C122S/Q192T 10,2 642 Q38W/I41V/D96R/ins97aA/C122S/G151N 4,49 643 Q38Y/I41T/D96M/ins97aS/C122S/G151N 12,5 644 Q38H/I41S/D96K/ins97aS/C122S/G151P/Q192S 25,6 645 Q38H/I41S/D96G/ins97aG/C122S/G151N/Q192A 34,6 646 Q38H/I41S/D96K/ins97aD/C122S/G151N/Q192S 26,8 647 I41S/D96E/ins97aG/C122S/G151Q/Q192A 44,4 648 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/G187D/Q192V/D217V 8,35 649 A35V/I41S/Y59F/C122S/Q192D/D217V 39,8 650 I41S/F93L/ins97aV/C122S/Q192V/D217V 9,82 651 I41S/S90P/ins97aV/C122S/Y146E/Q192N/D217V 6,47 652 I41S/S90T/ins97aV/C122S/Q192N/D217V 13,4 653 I41S/S90T/ins97aV/C122S/Q192V/D217V 10,5 654 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Q192G 25,6 655 I41S/Y59F/F97S/ins97aV/S116Y/C122S/Q192G/D217V 8,22 656 I41S/ins97aV/C122S/Q192G/Q209L 33,4 657 Q38H/I41S/ins97aV/A112V/C122S/Q192A/Q209L 10,9 658 I41S/ins97aV/C122S/Q192V/D217V 11 659 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Q192A 16,6 660 I41A/F97G/ins97aM/T98L/C122S 40,1 661 I41G/F97E/F99L/C122S/Q192A 30,1 662 I41S/F97V/ins97aV/T98P/C122S 30,9 663 I41S/T98S/F99L/C122S/Q192A 17,4 664 I41S/F97Q/F99L/C122S/Q192S 53,5 665 I41G/F97L/F99L/C122S/Q192S 41,4 666 I41S/F97G/ins97aA/T98P/C122S/Q192A 57,2 667 I41A/F97G/ins97aV/T98E/C122S 18,1
SEQ Numeração de Quimotripsina ID MODIFICAÇÕES EC50 NO.* (nM) 668 I41A/F97S/ins97aA/C122S 19,8 669 I41A/F97W/T98S/F99L/C122S/Q192A 27 670 I41L/N95D/D96T/F97W/F99L/C122S/Q192A 62,6 671 I41T/Y60gL/N95D/D96F/F97S/F99L/C122S/Q175S/Q192A 247 672 I41A/Y60gW/N95D/D96F/F97G/F99L/C122S/Q175H/Q192A 17,5 673 I41A/Y60gW/F99L/C122S/Q175T/Q192A 17,6 674 Q38M/I41T/D96M/ins97aH/C122S/G151E 19,1 675 Q38H/I41T/D96R/ins97aG/C122S/G151S 54,1 676 I41S/D60bY/ins97aV/T98N/C122S/Q192H 8,1 677 I41S/Y59F/D60bY/ins97aV/C122S/Q192G 5,24 678 I41S/D60bY/ins97aV/A112V/C122S/Q192G/Q209L 4,76 679 A35T/I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Y146F/V183A/Q192G/ R235H 18,4 680 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175H/Q192D 195 681 I41S/ins97aV/C122S/N164D/Q192G/R235H 46,4 682 I41S/Y59F/ins97aV/C122S/Q192G/N223D 34,1 683 I41S/ins97aV/C122S/N164D/Q192G/R235L 49,7 684 I41S/Y59F/F97Y/ins97aV/C122S/Q192G 29,1 685 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192V 32,3 686 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217V 3,19 687 I41S/F97L/F99L/C122S/G151N/Q192G/D217V 11,9 688 I41S/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192A/D217L 11,2 689 I41G/F97R/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192S/D217V 4,18 690 I41T/F97L/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192S/D217W 24,2 691 I41D/F97T/F99M/C122S/Q192V/D217M 63,8 * SEQ ID do domínio da protease contendo as trocas; entende-se que essas trocas podem ser incluídas no MTSP-1 de comprimento completo e em outras variantes, incluindo fragmentos cataliticamente ativos do mesmo.
[00481] Entre esses de interesse estão aqueles com uma EC50 para clivagem de hC3 menor que 10, tal como, mas não limitados a, por exemplo: EC50 Sequência de mutação SEQ ID (nM) NO. 0,866 ins97aA/F97G/T98L/C122S/Q175M/Q192A/D217I/K224R 368 0,867 Q38G/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G 286 1,08 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ 491 G151N/Q175L
EC50 Sequência de mutação SEQ ID (nM) NO. 1,11 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/ 432 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E 1,17 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98S/ 425 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192A 1,25 Q38F/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/ 353 C122S/Q175L/Q192E 1,31 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/ 447 C122S/G151H/Q175L 1,39 Q38H/I41A/D60bV/F60eT/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/ 311 C122S/Q175L/Q192E 1,43 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aA/T98P/ 496 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 1,45 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/ 40 F99L/C122S/G151H/Q175L 1,51 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/ 413 F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E 1,53 Q38Y/I41A/D60bL/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/ 330 G151N/Q175M/Q192A 1,57 Q38H/I41S/D60bF/F60eV/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/ 337 G151N/Q175L/Q192A 1,57 Q38H/I41A/D60bV/F60eA/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/ 356 C122S/Q175L/Q192V 1,57 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/ 428 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 1,59 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/ins97aG/F97D/T98N/ 426 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E 1,83 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/ 434 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 1,96 Q38F/I41S/D60bF/F60eR/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/ 324 C122S/G151N/Q175L/Q192V 1,97 Q38H/I41S/D60bY/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/L106M/ 407 C122S/I136M/Q192G/Q209L/D217T 2,07 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96S/ins97aR/F97A/T98S/ 412 F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192T 2,23 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/ 408 F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 2,28 Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/ 315 C122S/Q175L/Q192D 2,37 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/ 294 C122S/Q175L/Q192D 2,42 ins97aY/F97G/T98V/C122S/Q175M/Q192S/D217V 372 2,43 Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117L/C122S/ 386 I136T/Q192G/D217I 2,52 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/ 429 G151H/Q175L/Q192D 2,54 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/ 433 F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 2,71 Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/ 355 C122S/Q175L/Q192A
EC50 Sequência de mutação SEQ ID (nM) NO. 2,76 H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217V/K224Y 172 2,84 I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V 80 2,85 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P/ 36 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 2,87 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/ 32 G151N/Q175L/Q192D 2,88 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/ 495 F99L/C122S/T150S/G151H/Q175L/Q192D/Q209L 2,91 Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/ 340 C122S/G151N/Q175L/Q192D 3,04 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/ 436 G151N/Q175L/Q192D 3,06 Q38H/I41A/D60bW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136M/ 388 Q192G/D217N 3,07 Q38H/I41S/D60bF/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/ 419 H143Q/G151N/Q175L/Q192G 3,08 Q38Y/I41S/D60bT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/ 484 Q175L/Q192D 3,09 Q38H/I41A/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/ 354 Q175L/Q192A 3,1 I41T/D60bW/F60eH/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/ 335 Q175L/Q192G 3,13 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aD/T98G/ 472 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 3,14 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97S/ins97aH/T98G/ 469 F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G 3,19 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/T98P/F99L/C122S/ 441 G151H/Q175L/Q192E 3,19 I41S/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217V 686 3,22 Q38R/I41S/D60bY/F60eD/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/ 332 G151N/Q175M/Q192A 3,27 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/T98G/F99L/C122S/G151N 487 /Q175L/Q192D 3,72 H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/ 177 K224L 3,72 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/ 435 Q175L/Q192D 3,75 Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/ 492 Q175L/Q192D 3,76 Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aN/T98G/ 470 F99M/C122S/G151N/Q175L/Q192G 4,53 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97N/ins97aE/T98S/ 473 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 5,92 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/ 37 F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D 6,86 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/F97G/T98P/ 35 F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D
Exemplo 3
Confirmação de clivagem no sítio Q H A R ↓ A S H L em C3
[00482] Dois métodos analíticos independentes foram usados para caracterizar o(s) sítio(s) de clivagem de C3 pela variante do domínio da protease MTSP-1 que contém as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/ T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D: (a) análise direta de produtos de clivagem por MALDI-MS com identificação de peptídeos liberados na faixa de 1-40 kDa (1,661x10-24- 6,642x10-23 kg) e (b) MS intercambiado com LC de uma digestão proteolítica rotulada com análise de sequência de peptídeos de produto que contêm um terminal neo-N. Esses experimentos foram realizados como a seguir: (a) C3 (1 mg/ml em tampão PBS) foi incubado com variante de u-PA protease nas razões de enzima para substrato de 1:50 durante um total de uma hora. As amostras (50 µl) foram removidas dessas reações aos 0, 5, 10, 20, 40 e 60 minutos, e a reação de clivagem foi encerrada em cada amostra por adição de 1 µl de TFA a 1% e congelamento instantâneo em gelo seco. As amostras foram então reduzidas com TCEP 25 mM (1 hora a 37°C), e depois dessalinizadas por extração em fase sólida C18 (Agilent Omix). Os produtos de clivagem resultantes foram analisados diretamente por MALDI-MS (ABI 4700). Em cada momento após 0 minutos, um fragmento de PM 8289 ± 1 Da (1,376x10-23 ± 1,661x10-27 kg) foi observado, indicando clivagem na arginina no sítio QHAR|ASHG em C3. Não foram observados sítios de clivagem de C3 adicionais nessas reações. (b) A mistura variante C3/protease (10 µL) foi desnaturada em guanidina 6M, depois as cadeias laterais de cisteína foram reduzidas (TCEP 30 mM) e alquiladas (iodoacetamida). O grupo ε-amino das cadeias laterais da lisina foi bloqueado pelo tratamento com O-metilisoureia (3 µL de OMU, 8 µl de NaOH 1M, 15 min a 65°C; extinguir com 2 µl de TFA-água 1:1, seguido de limpeza com SPE) e, em seguida, os terminais amino do peptídeo foram rotulados com SulfoNHS-SS-biotina (HEPES 50 mM, reagente de biotina 250 uM, 30 min em temperatura ambiente). Após digestão proteolítica com tripsina ou Glu-C, os peptídeos rotulados com biotina foram capturados por sedimentos de avidina. A clivagem do rotulador de biotina foi alcançada com redução (TCEP), resultando em uma fração peptídica neo-N-terminal com um rotulador de N-tioacila. Esta fração peptídica foi analisada por MS intercambiável com LC (Thermo LTQ-XL); o principal componente relacionado a C3 identificado foi o peptídeo (N-tioacil)-ASHGLAR, indicando clivagem no sítio QHAR|ASHG em C3. Q H A R ↓ A S H L 737-744 P4 P3 P1 ↓ P1’ P4’. Exemplo 4 Análise Farmacodinâmica Ex Vivo (PD) de Variantes de MTSP-1 no Plasma de Macacos Cynomolgus
[00483] A clivagem de C3 no plasma de macaco cynomolgus tratado com EDTA anti-coagulado pelo tipo selvagem e polipeptídeos MTSP-1 modificados foi medida como descrito abaixo. Um ELISA de C3 foi usado para medir a dose efetiva (ED50) dos polipeptídeos MTSP-1 tipo selvagem e modificados, necessários para clivar 50% do C3 no plasma anti-coagulado “teste”. As reações de clivagem continham 80% de plasma e cada protease foi ensaiada em 9 concentrações diferentes, além de um controle de zero protease. A concentração mais alta de MTSP-1 tipo selvagem usada nesta reação foi de 6 µM e as oito concentrações seguintes foram preparadas por diluições sequenciais por um fator de 1,5. A concentração mais alta usada para proteínas variantes de MTSP-1 foi de 150 nM e, como a proteína tipo selvagem, as oito concentrações seguintes foram preparadas por diluições sequenciais por um fator de 1,5. Após a adição da protease de teste, a reação foi incubada por 10 minutos a 37°C. A reação foi rapidamente extinta por adição do inibidor de protease 10 µM EGR-CMK (Glu-Gly-Arg-clorometil cetona) e as amostras extintas foram colocadas em temperatura ambiente por 30 minutos antes de realizar o ELISA de C3. As reações de clivagem foram diluídas 1:2700 em BSA-PBST e o C3 não clivado foi “capturado” com anti-huC3 de cabra (A213 CompTech) (adsorvido em uma placa de microtitulação) e “detectado” por 0,5 µg/ml de MAB anti-huC3a (Abcam ab11872) em BSA-PBST a 1%. O ELISA foi então “desenvolvido” usando o conjugado de HRP de cabra anti-camundongo e o Kit de Detecção de Western Blotting WesternBright Sirius seguindo as instruções do fabricante. Tabela 16. Clivagem hC3 com polipeptídeos MTSP-1 modificados em plasma de macaco Cynomolgus ED50 80% de plasma
SEQ ID Numeração de Quimotripsina de cynomolgus NO.* (nM) Domínio de protease MTSP-1 tipo selvagem 4 2800 com C122S I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q 21 2200 175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/ 22 101 T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/ 23 195 T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/ 24 76
Tabela 16. Clivagem hC3 com polipeptídeos MTSP-1 modificados em plasma de macaco Cynomolgus ED50 80% de plasma
SEQ ID Numeração de Quimotripsina de cynomolgus NO.* (nM) T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/ 25 152 T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/ 26 136 T98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/ 27 118 T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/ 28 133 T98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97Y/ins 29 37 97aN/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins 30 85 97aA/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/F97W/ins 31 73 97aN/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98 32 58 G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97E/ins 33 133 97aV/T98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/F97D/ins 34 70 97aG/T98N/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins 35 92 97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins 36 103 97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins 37 37 97aA/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D * SEQ ID do domínio da protease que contém as trocas Exemplo 5 Estabilidade ex vivo de Polipeptídeos MTSP-1 Modificados no Humor Vítreo de Macacos Cynomolgus
[00484] A estabilidade ex vivo dos polipeptídeos MTSP-1 modificados foi avaliada no humor vítreo de macaco cynomolgus adquirido ou no controle negativo de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Os polipeptídeos MTSP-1 modificados que exibem estabilidade no humor vítreo podem ser usados para o tratamento de DMRI.
[00485] O humor vítreo de Cynomolgus a 80% (obtido da
BioChemed; Catálog. Nos BC7615-V1, BC60815-V1, BC33115-V6) em tampão contendo Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM e Tween- 20 ou PBS de controle a 0,01% foi incubado com polipeptídeos MTSP-1 modificados a uma concentração final de 0,1 µM. A mistura foi incubada a 37°C por 7 dias. A atividade residual da protease foi ensaiada com substrato fluorogênico 100 µM AGR-ACC (7-amino-4-carbamoilmetil-cumarina) em Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, Tween-20 a 0,01% e os resultados foram avaliados no comprimento de onda de excitação = 380 nm e comprimento de onda de emissão = 460 nm. Os resultados mostram que os polipeptídeos MTSP-1 modificados com as sequências apresentadas na SEQ ID NOS: 35, 38-40 e 47-56 exibem atividade residual comparável (isto é, estabilidade) após incubação no plasma de cynomolgus e PBS. Os resultados estão apresentados na Tabela 17 abaixo. Tabela 17: Estabilidade de polipeptídeos de MTSP-1 em humor vítreo Atividade (%) no Dia 7
SEQ Numeração de Quimotripsina ID vítreo PBS NO.* Domínio de protease MTSP-1 tipo 4 59 63 selvagem com C122S Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q1 35 92 94 92D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/ins97 38 73 91 aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97 39 77 85 aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ 40 18 23 ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97 47 86 87 aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97 48 76 78 aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97a 49 87 81 V/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/ins97a 50 85 91 V/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D
Tabela 17: Estabilidade de polipeptídeos de MTSP-1 em humor vítreo Atividade (%) no Dia 7
SEQ Numeração de Quimotripsina ID vítreo PBS NO.* Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/ins97a 51 85 93 V/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ 52 19 34 T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ 53 66 82 ins97aV/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ 54 94 98 ins97aV/T98P/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ 55 74 87 ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ 56 90 94 ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q192D * SEQ ID de um domínio da protease contendo as trocas
[00486] A estabilidade ex vivo dos polipeptídeos MTSP-1 modificados no humor vítreo de macaco Cynomolgus adquirido após 7 e 28 dias foi avaliada como acima. Os resultados mostram que os polipeptídeos MTSP-1 modificados providos na presente invenção são relativamente estáveis por pelo menos 7 dias no humor vítreo. Os resultados estão apresentados na Tabela 18 abaixo. Tabela 18 Atividade (%) a 37°C Numeração de Quimotripsina SEQ ID NO.* Dia 7 Dia 28 Domínio de protease MTSP-1 tipo selvagem com C122S 4 67 47 Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins 97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D 35 91 68 I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T 41 100 91 I41D/C122S/G151N/Q192T 42 71 35 I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V 43 79 ND I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T 44 91 90 I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T 45 85 ND I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T 46 88 86 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/Q192D 57 95 80 I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q1 75L/Q192D 58 96 75 Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/Q175L/Q192D 59 92 63 * SEQ ID do domínio da protease que contém as trocas Exemplo 6
Atividade Farmacodinâmica Ex Vivo no Plasma Humano
[00487] Diluições em série de polipeptídeos MTSP-1 modificados (ou tampão) foram adicionadas ao plasma humano (que contém ~ 8 μM de C3 endógena) para criar misturas reacionais que continham 6000, 4000, 2667, 1778, 1185, 790, 527, 351, 234 ou 0 nM de concentrações de cada polipeptídeo variante e plasma humano a 80%. Misturas reacionais semelhantes foram preparadas para MTSP tipo selvagem com o MTSP tipo selvagem presente em concentrações de 150, 100, 67, 44, 30, 20, 13, 9, 6 ou 0 nM. Estas misturas reacionais foram incubadas por 1 hora a 37°C e extintas com 10 µM de EGR-CMK. Cada mistura reacional foi diluída 1:15.625 em tampão PBST contendo 1% de BSA e a concentração residual de C3 não clivada na mistura foi “detectada” usando mAb anti- huC3a (Abcam ab11872) e o sinal do ensaio foi “desenvolvido” usando o conjugado de HRP HRP–anti-camundongo de cabra (JIR 115-035-003) e o kit de detecção Western Blotting WesternBright Sirius. Estes dados foram usados para calcular a concentração de cada polipeptídeo MTSP necessário para clivar 50% da C3 presente no plasma durante a incubação de 1 hora (isto é, a ED50).
[00488] Os resultados são mostrados na Tabela 19 abaixo, que apresenta a ED50 (nM) da hemólise no plasma humano a 80% pelo domínio da protease MTSP-1 de referência compreendendo o domínio da protease MTSP-1 WT com a troca de C122S, e os polipeptídeos MTSP-1 modificados. Como mostrado na Tabela 19, a ED50 para o polipeptídeo MTSP-1 de referência no plasma humano a 80% é de 3500 nM, enquanto os exemplos de polipeptídeos MTSP-1 têm maior capacidade de clivar o complemento como indicado por uma ED50 menor (por exemplo,
entre 24 nM e 835 nM). Por exemplo, o polipeptídeo MTSP-1 modificado com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 35, que contém as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192D, foi aproximadamente 140 vezes mais potente do que o domínio da protease MTSP-1 de referência com a troca de C122S. Tabela 19 ED50 80% de plasma
SEQ ID Numeração de Quimotripsina humano NO.* (60 min, nM) Domínio de protease MTSP-1 tipo selvagem com 4 3500 C122S I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175 21 835 L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98 22 52 G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98 23 65 G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98 24 50 P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98 25 50 P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98 26 38 G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98 27 41 P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98 28 32 G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97Y/ins97a 29 27 N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97a 30 34 A/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/F97W/ins97a 31 47 N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F 32 24 99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97E/ins97a 33 38 V/T98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/F97D/ins97a 34 39 G/T98N/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97a 35 25 V/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97a 36 27 V/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D
Tabela 19 ED50 80% de plasma
SEQ ID Numeração de Quimotripsina humano NO.* (60 min, nM) Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97a 37 44 A/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D * SEQ ID do domínio da protease que contém as trocas Exemplo 7 Clivagem do Receptor 2 Ativado por Proteinase (PAR-2) A. Atividade de Mutantes em um Ensaio Baseado em Célula do Receptor 2 Ativado por Proteinase
[00489] O tipo selvagem MTSP-1 é um ativador eficiente do receptor PAR-2, acoplado à proteína G, expressado em células endoteliais vasculares e em uma variedade de células epiteliais que são envolvidas em doenças inflamatórias, tais como artrite, inflamação pulmonar (asma), doença inflamatória intestinal, sepse e distúrbios da dor. A atividade reduzida de PAR-2 por um polipeptídeo MTSP-1 variante anti-C3, portanto, aumenta a seletividade de C3 para essa protease manipulada. Consequentemente, os polipeptídeos MTSP-1 modificados foram testados quanto à sua atividade (isto é, capacidade de ativação) no receptor 2 ativado por proteinase (PAR-2) em um ensaio baseado em células (Millipore). A ED50 (nM) da clivagem de PAR-2 pelas proteases foi medida plotando a fração de clivagem vs. concentração de protease em um ajuste de curva logística de 4 parâmetros (SoftMax Pro software, Molecular Devices, CA). Uma versão cataliticamente inativa de MTSP-1 foi provida como um controle negativo. A atividade de PAR-2 diminuída neste ensaio (isto é, uma ED50 mais alta para a clivagem de PAR-2 versus MTSP-1 tipo selvagem) para um polipeptídeo MTSP-
1 variante indica que a proteína variante exibe especificidade mais restrita do que MTSP-1 tipo selvagem. O aumento da especificidade versus PAR-2 indica que a variante também pode exibir uma clivagem inespecífica reduzida de outras proteínas em comparação com o MTSP-1 tipo selvagem. Os resultados destes ensaios (ver Tabela 20 abaixo) demonstram que os polipeptídeos exibem atividade de PAR-2 significativamente reduzida em comparação com MTSP-1 tipo selvagem.
[00490] Outro ensaio usado para simular a ativação proteolítica de PAR-2 in vivo mede a atividade de polipeptídeos MTSP-1 variantes em um substrato peptídico de fluorescência extinto contendo a sequência peptídica SKGR↓SL, a sequência P4 - P2’(Ser 33 a Leu 38) do sítio de clivagem de ativação no PAR-2. A clivagem do sítio R↓S neste substrato peptídico produz um sinal de fluorescência permitindo a medição da taxa de reação com um leitor de placas de fluorescência. A atividade reduzida em relação ao substrato peptídico SKGR/SL em comparação com a do MTSP-1 tipo selvagem indica que o polipeptídeo MTSP-1 variante possui especificidade do substrato intensificada.
[00491] Resultados de exemplo são mostrados na Tabela 20, abaixo. Todos os polipeptídeos MTSP-1 modificados testados exibiram ED50 pelo menos 30 vezes maior e kcat/Km menor em comparação com o domínio da protease MTSP-1 tipo selvagem com a troca de C122S apresentada na SEQ ID NO: 4. Os dados indicam que os polipeptídeos MTSP-1 modificados selecionados para clivagem de C3 têm atividade significativamente reduzida para um substrato nativo.
Tabela 20. Numeração de Quimotripsina SEQ SKGR/SL Ensaio ID kcat/Km com NO.* (M-1s-1) base em Célula PAR-2 ED50 (nM) Domínio de protease MTSP-1 tipo selvagem com 4 200000 1,4 C122S I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q1 21 <100 2600 75L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T 22 925 690 98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T 23 245 1900 98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T 24 959 1800 98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T 25 1730 640 98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T 26 742 560 98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T 27 1730 n.d. 98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T 28 1360 430 98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97Y/ins9 29 2320 450 7aN/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins9 30 4030 420 7aA/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/F97W/ins9 31 1620 n.d. 7aN/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G 32 3560 150 /F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97E/ins9 33 865 n.d. 7aV/T98G/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/F97D/ins9 34 1300 n.d. 7aG/T98N/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192E Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins9 35 6210 n.d. 7aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins9 36 4990 n.d. 7aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins9 37 2060 n.d. 7aA/T98P/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D * SEQ ID do domínio da protease que contém as trocas Exemplo 8 Atividade Farmacocinética e Farmacodinâmica no Humor Vítreo de Macacos Cynomolgus in vivo
[00492] A atividade farmacodinâmica in vivo no humor vítreo (modelo de macaco cynomolgus) do polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35, que é o domínio da protease que contém as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192D, foi avaliada. A capacidade de clivar e inativar C3 no humor vítreo é indicativa de um candidato ao tratamento da DMRI.
[00493] Doze macacos cynomolgus não modificados foram designados para um único grupo de tratamento. Os animais do estudo receberam por via intravítrea uma dose única de 125 µg de polipeptídeo MTSP-1 modificado em um olho. O domínio da protease isolado cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 35, que tem um peso molecular de aproximadamente 25 kDa (4,151x10-23 kg), foi administrado. O olho direito recebeu o artigo de teste e o olho esquerdo foi injetado com controle do veículo. Quatro animais foram sacrificados em cada um dos seguintes momentos: 24 horas após a dose, dia 2 e dia 6. Foram coletadas amostras de humor vítreo dos olhos direito e esquerdo e analisadas quanto à estabilidade do polipeptídeo MTSP-1 modificado e nível de C3 após tratamento com polipeptídeo MTSP-1 modificado ou veículo de controle; as concentrações de C3 e polipeptídeo MTSP-1 modificado foram determinadas por ELISA como detalhado acima.
[00494] A concentração do polipeptídeo MTSP-1 modificado presente nas amostras de humor vítreo obtidas 24 horas após a dose e no dia 2, dia 6, dia 7 e dia 28 foi medida por ELISA. A atividade proteolítica dos polipeptídeos MTSP-1 (e outras serina proteases) nas amostras vítreas foi extinta pela adição de EGR-CMK (Haematologic Technologies, EGRCK-01) a uma concentração final de 10 µM, e a mistura foi deixada repousar por 30 minutos em temperatura ambiente antes de realizar o ELISA.
[00495] A meia-vida do polipeptídeo MTSP-1 modificado da SEQ ID NO: 35 foi determinada em aproximadamente 1,7 dias, o que corresponde a aproximadamente 5 dias em um sistema humano (Deng et al. (2011) MAbs 3(1): 61-66). Recuperação in vivo (isto é, o nível de pico do polipeptídeo MSTP-1 modificado detectado dividido pela dose do polipeptídeo MTSP-1 modificado) do polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35 foi calculada por ELISA a partir do observado nível máximo do polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35. O valor teórico previsto para recuperação 100% in vivo foi de 2,5 µM. A recuperação medida in vivo do domínio da protease MTSP-1 (SEQ ID NO: 35) contendo as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192D foi calculada como sendo aproximadamente 59% do valor previsto ou aproximadamente 1,5 µM. Houve uma variação substancial entre dois experimentos separados (medida 1 = 100% e medida 2 = 18% de recuperação), indicando injeções intravítreas ruins ou manipulação, armazenamento ou diluição inadequada da amostra e, portanto, dispensação local incompleta de protease anti-C3 ativa no vítreo, no segundo experimento.
[00496] Os níveis de C3 no humor vítreo foram medidos por ELISA. Os níveis de C3 no olho de controle negativo injetado com veículo variaram entre 0,4 nM - 50 nM (2 amostras dos olhos injetados com veículo diferiram significativamente das outras 10, provavelmente devido à contaminação do sangue durante a colheita do vítreo com uma agulha). O nível de referência de C3 antes da administração de MSTP-1 era de aproximadamente 2,2 nM. C3 era indetectável no olho tratado com variante 1, 2, 6 e 7 dias após a injeção única do polipeptídeo MTSP anti-C3. 28 dias após a injeção única, a concentração de C3 foi de aproximadamente 1,4 nM no olho tratado com o polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35, que é aproximadamente 64% do nível de referência antes do tratamento.
[00497] Os resultados mostram que o polipeptídeo MTSP-1 modificado elimina cataliticamente C3. Sua meia-vida foi de 1,7 dias, avaliada por ELISA e ensaios enzimáticos, e suprime o complemento vitreal por pelo menos ou mais de 7 dias. Doses de até 1 mg/olho foram bem toleradas. A modelagem PK/PD indica uma supressão de C3 por 3 meses ou mais em humanos. Exemplo 9 Mutações de Exemplo em Posições no MTSP-1
[00498] Posições de exemplo e mutações de polipeptídeos MTSP-1, incluindo os domínios precursor e de protease de comprimento completo, e porções cataliticamente ativas dos mesmos, são apresentados na Tabela 21 abaixo. Tabela 21. Mutações de exemplo em posições em MTSP-1 Numeração de Numeração WT SEQ ID Mutações Conservadores Quimotripsina Madura NO. 35 de para Mutações exemplo 38 637 Q H H N, Q 41 640 I S S, R, A, T, K, Q E, D 59 658 Y F M, L, Y 60b 661 D T T, V S, I, L 60e 664 F S S, R, K T, Q, E 60g 666 Y W W Y 96 705 D K K, V, Y, R, Q, E, W, F L, I, P 97 706 F G G, T, D, P, S, Q, H, F E, N, Y,
W Ins97a V V, E, A, I, L, S, P,
Tabela 21. Mutações de exemplo em posições em MTSP-1 Numeração de Numeração WT SEQ ID Mutações Conservadores Quimotripsina Madura NO. 35 de para Mutações exemplo G, N Q, H, D 98 707 T P P, G, N Q, H 99 708 F L L I,V 151 759 G H H, N Q 175 783 Q L L I, V 192 802 Q D D, E Q
[00499] As trocas estão em qualquer forma de MTSP-1, incluindo o domínio da protease (SEQ ID NO: 2 ou 4) e o comprimento completo (SEQ ID NO: 1 ou 3). As trocas podem ser combinadas, incluindo as exemplificadas na presente invenção, incluindo até 15-18 ou mais trocas. Exemplo 10 Estudos de Segurança, Tolerabilidade e Toxicidade in vivo (Macaco Cynomolgus) de Variantes de MTSP-1 Após Injeção Intravítrea
[00500] A segurança e tolerabilidade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados após injeção intravítrea foram avaliadas in vivo em macacos cynomolgus. Três macacos cynomolgus não modificados foram designados para cada um dos três grupos de tratamento. Os animais do estudo foram administrados intravitrealmente 12,5 µg, 37,5 µg ou 125 µg por olho, de cada polipeptídeo MTSP-1 modificado. O olho direito recebeu o polipeptídeo de teste e o olho esquerdo foi injetado com controle do veículo. Os animais foram observados clinicamente (isto é, consumo de alimentos) e foram realizados exames oftalmológicos. O exame oftalmológico incluiu biomicroscopia com lâmpada de fenda e observações oftalmoscópicas indiretas, seguidas de fotografia colorida do fundo ou tomografia de coerência óptica (OCT) antes da dosagem (T = 0) e nos dias 2, 8 e 15 após a administração.
Todas as observações continuaram por até 4 semanas ou até a resolução.
[00501] O nível de efeito adverso não observado (NOAEL) foi avaliado para todos os animais. O NOAEL para animais administrados com um polipeptídeo MTSP-1 modificado com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 42 foi de ≥37,5 µg (equivalente a ≥125 µg/olho no homem). Não foram observados efeitos adversos nos animais aos quais foi administrado um polipeptídeo MTSP-1 modificado com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 35; portanto, o NOAEL para animais aos quais foi administrado um polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35 foi ≥125 µg (equivalente a ≥375 µg/olho no homem). Exemplo 11 Atividade Farmacodinâmica, Segurança/Toxicidade e Índice Terapêutico Após Injeção Intravenosa de Polipeptídeos MTSP- 1
[00502] O NOAEL após injeção intravenosa foi avaliado em um modelo de macaco cynomolgus. A dose não tóxica mais alta para macacos cynomolgus que foram administrados com um polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35 foi ≥4 mg/kg. A ED50 para inativação de C3 circulante também foi medido. A atividade de C3 (isto é, ED50 para inativação de C3) para animais administrados um polipeptídeo MTSP-1 modificado apresentado na SEQ ID NO: 35 foi de 0,07 mg/kg, o que foi significativamente menor que o do MTSP-1 WT. O “índice terapêutico” (T.I.) de um polipeptídeo variante MTSP-1 anti-C3 foi definido como a razão entre o NOAEL e o ED50 para a inativação de C3 in vivo. Os resultados estão apresentados na Tabela 22, abaixo:
Tabela 22. ED50 de Bolus SEQ ID destruí- NOAEL Numeração de Quimotripsina único NO. ção de C3 (mg/kg) T.I. (mg/kg) Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T /ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q 22 0,2 ≥0 NA 175L/Q192D Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T /ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q 23 0,2 ≥4 ~20 175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D /ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q 24 0,1 ≥2 ~20 175L/Q192E Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I /F97Y/ins97aN/T98G/F99L/C122S/G1 29 0,06 ≥1 ~17 51N/Q175L/Q192D Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K /F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 35 0,07 ≥4 >57 51H/Q175L/Q192D Exemplo 12 Demonstração de que os polipeptídeos MTSP-1 modificados clivam C3 e inibem a ativação do complemento A. Demonstração do efeito inibitório do complemento de uma protease anti-C3 (Sequência ID NO: 35) no plasma humano
1. Inibição in vitro da ativação do complemento no plasma humano pelo polipeptídeo variante MTSP-1 da Sequência ID NO: 35
[00503] Foram realizados estudos para avaliar a atividade anti-complemento do polipeptídeo MTSP-1 modificado para clivar C3 no plasma humano. O artigo de teste nesses experimentos, exemplificativo dos polipeptídeos modificados descritos neste pedido, foi o polipeptídeo MTSP-1 modificado da SEQ ID NO: 35, que é o domínio da protease que contém as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192D. O artigo de teste (referido como artigo de teste #1, abaixo), e os controles experimentais foram expostos ao sistema de teste, plasma citrado reunido.
[00504] A extensão da inibição do complemento foi avaliada medindo a inibição do ensaio hemolítico da via clássica padrão (CH50). O plasma citrado de teste foi exposto ao artigo de teste antes da análise do complemento. A extensão da inibição do complemento é a diminuição da lise hemolítica nos testes da função CH50 e C3 em comparação com a observada no plasma citratado de controle (isto é, não tratado). O teste da função C3 permite a análise da inibição específica do componente C3 da cascata do complemento.
2. Sistemas de Teste
[00505] O teste foi realizado apenas com plasma citratado reunido humano (NHS, conjuntos de 3-5 indivíduos normais).
3. Via de Administração
[00506] O artigo de teste foi adicionado ao sistema de teste na razão de uma parte para nove partes (1:9, V:V). Essa razão mantém a concentração apropriada do sistema de teste, de modo que haja concentração suficiente das proteínas de controle do complemento. O teste foi realizado misturando 450 µL do sistema de teste com 50 µL do artigo de teste preparado em um tubo de tampa de encaixe de 1,5 mL de microcentrífuga de polipropileno. A mistura foi preparada em gelo e depois agitada no vórtice para misturar. Depois de preparadas todas as misturas experimentais (controles positivos e negativos e múltiplas concentrações do artigo de teste), elas foram transferidas para um banho de água a 37°C ± 1°C e incubadas por 1 hora ± 10 minutos. Após a incubação das misturas, se necessário, as partículas foram removidas por centrifugação e todas as amostras foram aliquotadas em gelo e imediatamente congeladas a -70°C ou abaixo.
4. Descrições dos Artigos de Teste Artigo de Teste Armazenamento Concentração Outras Considerações Artigo de ≤ -65°C 4 mg/mL - 100 µL são providos Teste #1 151,6 µM - Tampão é PBS
5. Artigos de controle Outras Controle Positivo Armazena- Concentra- Considera- #2 Fonte mento ção ções HAGG (Ativador da Exsera -70°C 10 mg/mL Nenhuma Via Clássica)* l Biolabs * HAGG globulina gama ativada por calor Controle Outras Negativo #1 Fonte Armazenamento Concentração Considerações Solução Exsera 4°C 0,9% de Nenhuma Salina Biolabs Solução Salina (154 mmol de NaCl)
6. Preparação do Artigo de Controle e de Teste
[00507] Foram usadas cinco concentrações do artigo de teste com o nível mais alto a 2000 nM. Níveis mais baixos foram gerados com uma diluição em série de cinco vezes. Tabela de diluição: Quantidade Concentração Concentração Carga para Quantidade Volume no teste 10x adicionar Quanta de Solução Total (nM) (µM) (µL) Carga Salina (µL) 2000 20 30 151,6 200 230 400 4 40 20 160 200 80 0,8 40 4 160 200 16 0,16 40 0,8 160 200 3,2 0,032 40 0,16 160 200 Todas as diluições a serem feitas com solução salina, salvo indicação em contrário
7. Projeto e Dados Experimentais
[00508] O teste incluiu cinco concentrações do artigo de teste. Concentração Artigo de Rótulo do Final Teste ou Tubo (nM a menos que Controle indicado)
1-A 2000 1-B 400 Artigo de 1-C 80 Teste #1 1-D 16 1-E 3,2 Solução Salina 11-S NA Carga Líquida 12-N NA (sem aditivo) Zimosan 13-Z 1 mg/mL HAGG 14-H 1 mg/mL
8. Resultados Artigo de Rótu- Concentração Dados % de Teste ou lo do Final U/mL Inibição Controle Tubo (nM a menos que indicado) Artigo de 1-A 2000 5,56 92% Test #1 1-B 400 10,84 84% 1-C 80 41,45 40% 1-D 16 68,97 1% 1-E 3,2 72,98 -5% Solução S NA 69,32 Salina HAGG H 1 mg/mL 8,16
[00509] Esses dados demonstram que uma efetividade do polipeptídeo MTSP-1 anti-C3 (Sequência ID NO: 35) inibe a atividade do complemento no plasma humano, com 40% de inibição observada na “dose” da variante de MTSP-1 anti-C3 80 nM (sequência ID NO : 35) e inibição quase completa (isto é, 94%) observada na dose mais alta do polipeptídeo MTSP-1 usado nos estudos. B. Demonstração de que a clivagem no sítio QHAR/ASHL inativa C3 humano
[00510] Para confirmar que a inibição do complemento pelo Artigo de Teste 1 (polipeptídeo MTSP-1 da Sequência ID NO: 35) demonstrado acima é mediada pela clivagem de C3 no local QHAR/ASHL, o experimento descrito abaixo foi realizado.
1. Sumário do Projeto Experimental
[00511] O ensaio da função do complemento foi realizado com soro deficiente em C3 (adquirido da Complement Technologies; catálogo N° A314). C3 (também comprado da Complement Technologies; catálogo N° A113) foi adicionado de volta ao soro com e sem pré-incubação com uma composição contendo o artigo de teste #1 (o polipeptídeo MTPS-1 modificado de SEQ ID NO: 35). O grau em que a pré-incubação com o Artigo de teste #1 inibe a função do complemento reflete o nível de inibição de C3.
2. Descrição do Reagente C3 Purificado
[00512] A concentração normal de C3 no soro humano é de ~1 mg/mL. A concentração do C3 da Complement Technologies é de 1,1 mg/ml. O C3 foi adicionado ao soro esgotado de C3 a uma diluição de 1/50.
3. Descrição do Artigo de Teste Artigo de Armaze- Teste namento Concentração Outras Considerações Artigo de ≤-65°C 4 mg/mL - 100 µL são providos Teste #1 151,6 µM - Tampão é PBS
4. Controles Controle Positivo #2 Fonte Concentração HAGG (Ativador da Via Exsera 10 mg/mL Clássica)* Biolabs * HAGG - Globulina gama ativada por calor Controle Negativo #1 Fonte Concentração Solução Salina Exsera Biolabs 0.9% de Solução Salina (154 mmol de NaCl)
5. Preparação de Artigo de Controle e de Teste Tabela de diluição: Quantidade Concentração Concentração Carga para Quantidade Volume no teste 10x adicionar Quanta de Solução Total (nM) (µM) (µL) Carga Salina (µL) NT 20 30 151,6 200 230 200 2 20 20 180 200 40 0,4 40 2 160 200 8 0,08 40 0,4 160 200
Todas as diluições são feitas com solução salina, salvo indicação em contrário.
6. Projeto Experimental: Condições de Teste 1 e 2 Condição de teste 1:
[00513] Os componentes (Tubo 1 e Tubo 2) foram incubados separadamente por 2 horas a 37°C (± 2°C). O tubo 1 continha 100 µL de C3 e o tubo 2 continha 25 µl do artigo de teste (TA, polipeptídeo MTSP-1 ou solução salina). As amostras foram congeladas a -80°C ou menos até o teste em C3H50 com soro esgotado. Cada tubo foi incubado a 37°C por 2 horas. 90 µL de C3 do tubo 1 foram combinados com 10 µl (TA, polipeptídeo ou solução salina) do tubo 2, depois misturados e congelados imediatamente a 80°C; nenhuma clivagem prévia de C3 pelo TA antes da adição a C3H50 na diluição de 1/50. Condição de teste 2:
[00514] Os componentes foram misturados no tubo 3 (90 µL de C3 e 10 μl de TA, vórtice leve) e incubados por 2 horas (pré-clivagem de C3 no sítio QHAR (resíduos 737-740 da SEQ ID NO: 9) a 37°C (±2°C)), congelados imediatamente e adicionados a C3H50 a 1/50. Concentração Artigo Final na de Rótu- C3 Condição de Teste Condições Resultado lo do Purificada Teste ou de Teste Esperado Tubo (S/N) (nM a menos Contro- que le indicado) Solução Condição Salina S N de Teste NA Zero C3H50 apenas #1 Condição Solução Cheio de SC Y de Teste NA Salina C3H50 #2 Artigo 1-A Y 200 Cheio de Condição de 1-B Y 40 C3H50 ou de Teste Teste ligeiramente 1-C Y #1 8 #1 inibido Artigo 2-A Y Condição 200 Pouco C3H50
Concentração Artigo Final na de Rótu- C3 Condição de Teste Condições Resultado lo do Purificada Teste ou de Teste Esperado Tubo (S/N) (nM a menos Contro- que le indicado) de 2-B Y de Teste 40 inverso à Teste #2 concentração 2-C Y 8 #1 de TA Condição Carga N N de Teste NA Líquida #1 Condição Zimosan Z N de Teste 1 mg/mL #1 Condição HAGG H N de Teste 1 mg/mL #1
7. Leitura da Ativação ou Inibição do Complemento
[00515] Função hemolítica C3H50 modificada. C3H50 é uma medida da atividade funcional, mas com ênfase específica em C3, pois requer que a C3 seja adicionada exogenamente. O soro foi deficiente em C3. As condições experimentais preparadas (condições 1 e 2) são adicionadas ao soro deficiente a uma diluição de 1/50 para o teste. A incubação em teste com as hemácias foi realizada a 22°C por 45 minutos.
8. Resultados
[00516] Os resultados mostram que a inibição da ativação do complemento, como avaliada pela atividade hemolítica, é mediada pela clivagem de C3. Concentra- C3 ção Final Artigo de Rótulo Purifi- Condições de na Atividade controle e do cada Teste* Condição Hemolíti- de Teste Tubo (S/N) de Teste ca (U/mL) (nM) Solução Condição de Salina S N NA 82,43 Teste #1 apenas Solução Condição de SC Y NA 375,81 Salina Teste #2
1-A Y 200 437,77 Artigo de Condição de 1-B Y 40 594,13 Teste #1 Teste #1 1-C Y 8 470,03 2-A Y 200 73,67 Artigo de Condição de Teste #1 2-B Y Teste #2 40 97,89 2-C Y 8 295,35 *Condição de teste #1: Incubar os componentes separadamente por 2 horas a 37°C (± 2°C). Em seguida, congelar a -80°C ou menos até testar em C3H50 (atividade hemolítica C3) com soro esgotado (isto é, sem pré-clivagem de C3 no soro). *Condição de teste #2: Misturar os componentes por agitação em vórtice leve e incubar por 2 horas a 37°C (± 2°C) (isto é, pré-clivagem do soro C3 pelo polipeptídeo MTSP-1 (Sequência ID NO: 35)).
[00517] Estes dados demonstram que a pré-incubação de C3 com o MTSP-1 variante da Sequência ID NO: 35 (que cliva C3 no sítio QHAR/ASHL) inibem substancialmente a ativação do complemento no soro humano. Uma pré-incubação de 1 hora de soro humano com a variante de MTSP-1 reduz a atividade hemolítica do soro em aproximadamente 80%. Exemplo 13 Mutagênese Específica De Sítio de uma Variante de MTSP- 1 de Exemplo para Estabelecer Relações Estrutura-Atividade para Mutações Individuais em MTSP-1
[00518] Para avaliar o efeito de cada substituição, inserção ou eliminação, a mutagênese específica do sítio foi usada para criar 14 variantes da variante de MTSP-1 que contém as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/ C122S/G151H/Q175L/Q192D (variante de partida). Cada uma das 14 variantes continha uma única mutação (em comparação com a variante de partida) na qual cada resíduo mutado único na variante inicial (exceto C122S) foi “revertido” (um em cada variante) para o aminoácido correspondente presente no MTSP- 1 tipo selvagem. Essas variantes são mostradas na Tabela 23 abaixo com referência ao domínio da protease MTSP-1 WT apresentado na SEQ ID NO: 4. As células sombreadas indicam que os polipeptídeos MTSP-1 modificados estão mutados nesse resíduo quando em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 de referência apresentado na SEQ ID NO: 4. As células não sombreadas indicam que os polipeptídeos MTSP-1 modificados contêm o mesmo aminoácido que o polipeptídeo MTSP-1 de referência apresentado na SEQ ID NO: 4.
[00519] A atividade anti-C3 de cada variante selecionada foi avaliada medindo a ED50 para a clivagem de C3, como descrito acima, e a estabilidade de cada variante foi avaliada medindo a atividade enzimática residual, usando o substrato fluorogênico AGR-ACC, após incubação por 7 dias em tampão [Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)] ou humor vítreo de macaco cynomolgus a 80%, como mostrado abaixo. Esses dados demonstram que aproximadamente 50% dos polipeptídeos “variantes de partida” exibem maior atividade contra C3 no humor vítreo do que o domínio de protease MTSP- 1 tipo selvagem de referência, cuja sequência é apresentada na SEQ ID NO: 4. Adicionalmente, 12/14 dos polipeptídeos MTSP-1 modificados são mais estáveis no humor vítreo em comparação com o domínio da protease tipo selvagem de referência da SEQ ID NO: 4, com alguns mostrando mais estabilidade do que outros. Os candidatos terapêuticos para indicações oculares, tal como DMRI, incluindo os da tabela abaixo, são variantes que exibem alta atividade de clivagem de C3 e alta estabilidade no humor vítreo.
[00520] A atividade de C3 (isto é, ED50) dos polipeptídeos MTSP-1 modificados foi medida in vitro como descrito acima. A estabilidade dos polipeptídeos MTSP-1 após incubação por 7 dias, no humor vítreo do macaco cynomolgus ou na solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi medida com um ensaio de atividade usando o substrato fluorogênico AGR-ACC. Tabela 23. Estabilidade de Polipeptídeo Mutação por Numeração de Quimotripsina MTSP-1 (% de Atividade) no Dia 7 Cliva- Ins97a D60b F60e Y60g G151 Q175 Q192 SEQ ID gem hC3 Q38 I41 D96 F97 T98 F99 Vítreo PBS NO: (ED50, nM) 5 Q I D F Y D F T F G Q Q 13,6 59 63 35 H S T S W K G V P L H L D 4,6 92 94 47 Q S T S W K G V P L H L D 17 86 87 48 H I T S W K G V P L H L D 205 76 78 49 H S D S W K G V P L H L D 13 87 81 50 H S T F W K G V P L H L D 8,7 85 91 51 H S T S Y K G V P L H L D 22 85 93 38 H S T S W D G V P L H L D 11,9 73 91 39 H S T S W K F V P L H L D 20 77 85 52 H S T S W K G P L H L D 7,9 19 34 53 H S T S W K G V T L H L D 9,9 66 82 54 H S T S W K G V P F H L D 18 94 98 55 H S T S W K G V P L G L D 5,3 74 87 56 H S T S W K G V P L H Q D 20 90 94 40 H S T S W K G V P L H L Q 1,6 18 23
[00521] Os dados nos exemplos e acima indicam que os polipeptídeos MTSP-1 modificados clivam C3 humano eficientemente e mantêm 59-94% dessa atividade após incubação por 7 dias com humor vítreo.
[00522] Por exemplo, os polipeptídeos MTSP-1 modificados clivam C3 humano entre os resíduos 740 e 741 (SEQ ID NO: 9) para assim inativar C3: Resíduo n° Q H A R ↓ A S H L 737-744 P4 P3 P1 ↓ P1’ P4’.
[00523] Consequências funcionais dos polipeptídeos MTSP- 1 modificados, tal como os polipeptídeos MTSP-1 modificados que contêm as mutações: Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, onde C122S é incluído para reduzir a agregação (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 35, que apresenta um domínio da protease de um polipeptídeo MTSP-1 modificado que contém essas mutações) são os seguintes: Q38H - Essa mutação aumenta a atividade de C3 em aproximadamente 3,7 vezes. I41S - Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 44,6 vezes. D60bT- Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 2,8 vezes. F60eS - Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 1,9 vezes. Y60gW - Essa mutação aumenta a especificidade do substrato da enzima e aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 4,8 vezes. D96K - Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 2,6 vezes. F97G - Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 4,3 vezes e aumenta a especificidade do substrato. Inserto 97aV: Esta mutação aumenta a especificidade do substrato polipeptídico MTSP-1 modificado, aumenta a estabilidade dos polipeptídeos MTSP-1 modificados após 1 semana de incubação a 37°C em cerca de 4,8 vezes, e aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 1,7 vezes. T98P: Essa mutação aumenta a estabilidade da enzima após 1 semana de incubação a 37 ºC em 1,4 vezes e aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 2,2 vezes. F99L: Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 3,9 vezes. G151H: Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 1,2 vezes. Q175L: Essa mutação aumenta a atividade anti-C3 em aproximadamente 4,3 vezes. Q192D: Esta mutação aumenta a estabilidade no humor vítreo após 1 semana de incubação a 37°C em 5,1 vezes.
[00524] Entre os polipeptídeos, aqueles que contêm as mutações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D e I41D/C122S/G151N/Q192T são para uso para tratar DGF e/ou DMRI.
[00525] Todos os resíduos nos polipeptídeos MTSP-1 são referenciados por numeração de quimotripsina. Os polipeptídeos MTSP-1 não modificados incluem os de SEQ ID
NOs: 1-4, MTSP-1 de comprimento completo WT, domínio da protease MTSP-1 WT, MTSP-1 WT maduro, MTSP-1 de comprimento completo WT com C122S, domínio de protease MTSP-1 com C122S, MTSP-1 maduro com C122S, respectivamente, onde a numeração é pela numeração de quimotripsina. Todos os polipeptídeos MTSP-1 modificados podem incluir a troca de C122S no lugar do C122C. * * *
[00526] Uma vez que as modificações serão evidentes para os habilitados nesta técnica, pretende-se que esta invenção seja limitada apenas pelo escopo das reivindicações anexas.
Claims (151)
1. Polipeptídeo de serina protease 1 tipo membrana modificado (MTSP-1), caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais modificação(ões) de aminoácidos selecionadas de I41S, Q38H, D60bT, F60eS ou R, Y60gW, ins97aV, D96K, F97G, G151H ou N, e Q192T, em que o polipeptídeo MTSP-1 modificado tem atividade/especificidade aumentada para a proteína C3 do complemento em comparação com a forma ativa não modificada do polipeptídeo MTSP-1, em que: as modificações de aminoácidos são selecionadas de trocas, inserções e/ou eliminações no polipeptídeo MTSP-1 não modificado; o polipeptídeo MTSP-1 modificado cliva um sítio alvo na proteína C3 do complemento humana que inativa C3; o polipeptídeo MTSP-1 modificado cliva a proteína C3 do complemento para assim inibir ou reduzir a ativação do complemento em comparação com uma forma ativa do polipeptídeo MTSP-1 não modificado que não contém a(s) modificação(ões) de aminoácidos; os resíduos são numerados pela numeração de quimotripsina; os resíduos correspondentes são determinados pelo alinhamento e pela numeração de quimotripsina; e o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4, ou um fragmento ou uma forma cataliticamente ativo(a) do mesmo que inclui a(s) modificação(ões) de aminoácidos.
2. Polipeptídeo de serina protease 1 tipo membrana modificado (MTSP-1), caracterizado pelo fato de que compreende modificações de aminoácidos que aumentam a atividade/especificidade para a clivagem da proteína C3 do complemento humana em comparação com a forma ativa não modificada do polipeptídeo MTSP-1, em que: a clivagem de C3 está entre os resíduos 740 e 741 da SEQ ID NO: 9, em que a clivagem ocorre em Q H A R ↓ A S H L, resíduos 737-744 da SEQ ID NO: 9, com uma EC50 de 10 nM ou menor in vitro; o polipeptídeo MTSP-1 modificado cliva a proteína do complemento C3 para assim inibir ou reduzir a ativação do complemento em comparação com uma forma ativa do polipeptídeo MTSP-1 não modificado que não contém a(s) modificação(ões) de aminoácidos; o MTSP-1 modificado contém pelo menos 4 ou pelo menos 5 ou pelo menos 6 ou pelo menos 7 modificações de aminoácidos; as modificações de aminoácidos são selecionadas de trocas, inserções e/ou eliminações no polipeptídeo MTSP-1 não modificado; o MTSP-1 modificado compreende uma troca selecionada de um ou mais de I41S, Q38H, D60bT, F60eS ou R, Y60gW, ins97aV, D96K, F97G, G151H ou N, e Q192T; e o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende a sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4, ou um fragmento ou uma forma cataliticamente ativo(a) do mesmo que inclui a(s) modificação(ões) de aminoácidos.
3. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o MTSP- 1 modificado compreende I41S, Q38H, D60bT, F60eS ou R, Y60gW,
ins97aV, D96K, F97G, G151H, e Q192T.
4. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende as trocas I41S e Q38H.
5. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o sítio alvo compreende os resíduos 737-744 da proteína C3 do complemento.
6. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a clivagem está entre os resíduos 740 e 741 da SEQ ID NO: 9, em que a clivagem ocorre em Q H A R ↓ A S H L.
7. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que: a porção correspondente ao domínio de protease do polipeptídeo MTSP-1 tem atividade aumentada para a clivagem de C3 que é pelo menos 1 vez maior ou mais que 1 vez maior que a atividade do polipeptídeo MTSP-1 da SEQ ID NO: 4; e a sequência de aminoácidos do domínio de protease do polipeptídeo MTSP-1 ao qual a porção corresponde é apresentada na SEQ ID NO: 2.
8. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a atividade é avaliada in vitro por inibição ou inativação mediada por proteólise da proteína C3 do complemento ou ensaiando a atividade do complemento no soro em um ensaio hemolítico ou determinando a razão da ED50 do domínio de protease do polipeptídeo MTSP-1 modificado em comparação com o domínio de protease do polipeptídeo MTSP-1 não modificado da SEQ ID NO: 4.
9. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que tem atividade aumentada para a clivagem de C3 que é pelo menos 1,2 vezes ou pelo menos 1,5 vezes maior que a atividade do polipeptídeo MTSP-1 não modificado da SEQ ID NO: 4.
10. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que tem atividade aumentada para a clivagem de C3 que é pelo menos 3 vezes ou pelo menos 4 vezes maior que a atividade do polipeptídeo MTSP-1 não modificado da SEQ ID NO: 4.
11. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado consiste na sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4.
12. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado consiste na sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 4.
13. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado tem pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com os polipeptídeos conforme definidos em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4.
14. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado tem 1 ou até 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 trocas, inserções ou eliminações de aminoácidos, em comparação com o polipeptídeo MTSP-1 não modificado de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-6 ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo.
15. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a I41S.
16. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a Q38H.
17. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a D60bT.
18. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a F60eS.
19. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a Y60gW.
20. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a ins97aV.
21. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a D96K.
22. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a F97G.
23. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a G151H.
24. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a G151N.
25. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a Q192T.
26. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a Q192D.
27. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a Q192E.
28. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 e 19 a 27, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação correspondente a F60eR.
29. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação correspondente a Y59F.
30. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação correspondente a F99L.
31. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação correspondente a T98P.
32. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação correspondente a Q175L.
33. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação em uma posição correspondente a D217.
34. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação correspondente a D217V, I, L, W ou M.
35. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e 16 a 34, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma modificação correspondente a I41D, E, T, G ou R.
36. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende modificações correspondentes a I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T; I41D/C122S/G151N/Q192T;
I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V; ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T ou as mesmas modificações, exceto em que C122S é C122C.
37. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende modificações correspondentes a: I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E, ou I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192D.
38. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende modificações correspondentes a: I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T.
39. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende modificações correspondentes a qualquer um de: I41R/F97T/Ins97aE/T98G/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122
S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97Y/ins97aN/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/F97W/ins97aN/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97E/ins97aV/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/F97D/ins97aG/T98N/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L, ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/C122S/G151N/Q192T, ou I41S/F99L/C122S/G151N/Q192V, ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/Y59F/D96E/F99L/C122S/G151N/Q192T, ou I41D/Y59F/C122S/G151N/Q192T, ou
I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S /G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G 151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/F99L/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/C122 S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q192D, ou Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D, ou Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , ou Q38H/I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D /D217V, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V, ou I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192D/D217 V, ou
I41S/D96M/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192V/D217I, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192H, ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192N/D217V, ou I41S/D60bY/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192 D, ou Q38H/I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V , ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192V, ou I41S/P49S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q192G/D217V , ou I41S/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192N/I217 V, ou I41T/F97W/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217L, ou I41G/F97L/F99L/C122S/Q175A/Q192T/D217V, ou I41G/F97V/F99L/C122S/G151Q/Q175M/Q192A/D217L, ou I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V, ou I41G/F97S/F99L/C122S/G151N/Q175L/Q192G/D217I, ou I41T/F97L/F99L/C122S/G151N/Q175S/Q192S/D217W, ou I41D/F97T/F99M/C122S/Q192V/D217M, ou as mesmas modificações, exceto C122S não é modificado e é C122C.
40. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende modificações selecionadas das combinações que incluem uma ou mais das modificações Q38H, I41S, D60bT, F60eS, Y60gW, D96K, F97G, Ins97aV e G151H como a seguir: G151H, Ins97aV, Ins97aV/G151H, F97G, F97G/G151H, F97G/Ins97aV, F97G/Ins97aV/G151H, D96K, D96K/G151H, D96K/Ins97aV, D96K/Ins97aV/G151H, D96K/F97G,
D96K/F97G/G151H, D96K/F97G/Ins97aV, D96K/F97G/Ins97aV/G151H, Y60gW, Y60gW/G151H, Y60gW/Ins97aV, Y60gW/Ins97aV/G151H, Y60gW/F97G, Y60gW/F97G/G151H, Y60gW/F97G/Ins97aV, Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, Y60gW/D96K, Y60gW/D96K/G151H, Y60gW/D96K/Ins97aV, Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, Y60gW/D96K/F97G, Y60gW/D96K/F97G/G151H, Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS, F60eS/G151H, F60eS/Ins97aV, F60eS/Ins97aV/G151H, F60eS/F97G, F60eS/F97G/G151H, F60eS/F97G/Ins97aV, F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS/D96K, F60eS/D96K/G151H, F60eS/D96K/Ins97aV, F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, F60eS/D96K/F97G, F60eS/D96K/F97G/G151H, F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW, F60eS/Y60gW/G151H, F60eS/Y60gW/Ins97aV, F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW/F97G, F60eS/Y60gW/F97G/G151H, F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW/D96K, F60eS/Y60gW/D96K/G151H, F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, F60eS/Y60gW/D96K/F97G, F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT, D60bT/G151H, D60bT/Ins97aV, D60bT/Ins97aV/G151H, D60bT/F97G, D60bT/F97G/G151H, D60bT/F97G/Ins97aV, D60bT/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/D96K, D60bT/D96K/G151H, D60bT/D96K/Ins97aV, D60bT/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/D96K/F97G, D60bT/D96K/F97G/G151H, D60bT/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW, D60bT/Y60gW/G151H, D60bT/Y60gW/Ins97aV, D60bT/Y60gW/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW/F97G,
D60bT/Y60gW/F97G/G151H, D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV, D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW/D96K, D60bT/Y60gW/D96K/G151H, D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV, D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/Y60gW/D96K/F97G, D60bT/Y60gW/D96K/F97G/G151H, D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS, D60bT/F60eS/G151H, D60bT/F60eS/Ins97aV, D60bT/F60eS/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/F97G, D60bT/F60eS/F97G/G151H, D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/D96K, D60bT/F60eS/D96K/G151H, D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV, D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/D96K/F97G, D60bT/F60eS/D96K/F97G/G151H, D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW, D60bT/F60eS/Y60gW/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S, I41S/G151H, I41S/Ins97aV, I41S/Ins97aV/G151H, I41S/F97G, I41S/F97G/G151H, I41S/F97G/Ins97aV, I41S/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/D96K, I41S/D96K/G151H, I41S/D96K/Ins97aV, I41S/D96K/Ins97aV/G151H, I41S/D96K/F97G,
I41S/D96K/F97G/G151H, I41S/D96K/F97G/Ins97aV, I41S/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/Y60gW, I41S/Y60gW/G151H, I41S/Y60gW/Ins97aV, I41S/Y60gW/Ins97aV/G151H, I41S/Y60gW/F97G, I41S/Y60gW/F97G/G151H, I41S/Y60gW/F97G/Ins97aV, I41S/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/Y60gW/D96K, I41S/Y60gW/D96K/G151H, I41S/Y60gW/D96K/Ins97aV, I41S/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, I41S/Y60gW/D96K/F97G, I41S/Y60gW/D96K/F97G/G151H, I41S/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, I41S/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS, I41S/F60eS/G151H, I41S/F60eS/Ins97aV, I41S/F60eS/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/F97G, I41S/F60eS/F97G/G151H, I41S/F60eS/F97G/Ins97aV, I41S/F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/D96K, I41S/F60eS/D96K/G151H, I41S/F60eS/D96K/Ins97aV, I41S/F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/D96K/F97G, I41S/F60eS/D96K/F97G/G151H, I41S/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, I41S/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/Y60gW, I41S/F60eS/Y60gW/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/Ins97aV, I41S/F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/F97G, I41S/F60eS/Y60gW/F97G/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, I41S/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/D96K, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, I41S/D60bT, I41S/D60bT/G151H, I41S/D60bT/Ins97aV, I41S/D60bT/Ins97aV/G151H, I41S/D60bT/F97G,
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Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G,
Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/G151H, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/G151H, e as mesmas modificações, exceto C122S, não é modificado e é C122C.
41. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende modificações selecionadas das combinações que incluem T98P/F99LQ175L/Q192D, opcionalmente C122S e um ou mais selecionados de: Q38H, I41S, D60bT, F60eS, Y60gW, D96K, F97G, Ins97aV e G151H como a seguir: T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D,
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, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q19 2D, Q38H/I41S/D60bT/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q
192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q 192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192
D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q1 92D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D , Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q17 5L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175L/Q19 2D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q 192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151H/Q 175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175
L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 51H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/Q175L/Q192 D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/T98P/F99L/C122S/G151H/Q175 L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/Q1 75L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/Ins97aV/T98P/F99L/C122S/G1 51H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/Q175L /Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/T98P/F99L/C122S/G151H /Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/Ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/G151H/Q175L/Q192D, e as mesmas modificações, exceto C122S, não é modificado e é C122C.
42. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que compreende modificações selecionadas das combinações de modificações de MTSP-1 nas quais o domínio de protease cliva C3 humano in vitro com uma EC50 menor que 10 nM: ins97aA/F97G/T98L/C122S/Q175M/Q192A/D217I/K224R, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G
151N/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, Q38G/H40R/I41H/D60bN/F97D/F99L/C122S/Q175L/Q192G, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97D/ins97aE/T98S/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192A, Q38F/I41A/D60bT/F60eG/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192E, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122 S/G151H/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eT/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192E, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192E, Q38Y/I41A/D60bL/F60eQ/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151 N/Q175M/Q192A, Q38H/I41S/D60bF/F60eV/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151 N/Q175L/Q192A, Q38H/I41A/D60bV/F60eA/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192V, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D,
Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96L/ins97aG/F97D/T98N/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192E, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38F/I41S/D60bF/F60eR/Y60gF/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192V, Q38H/I41S/D60bY/D96Y/ins97aV/F97D/T98P/F99L/L106M/C122S /I136M/Q192G/Q209L/D217T, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96S/ins97aR/F97A/T98S/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192T, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/ins97aN/F97Y/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bT/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192D, ins97aY/F97G/T98V/C122S/Q175M/Q192S/D217V, Q38H/I41S/D60bS/ins97aV/F97D/T98P/F99L/M117L/C122S/I136 T/Q192G/D217I, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96P/ins97aN/F97W/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bT/F60eK/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/Q175L/Q192A, H40R/I41H/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217V/K224Y, I41G/F97I/F99L/C122S/G151L/Q175M/Q192S/D217V, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96V/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G
151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/T150S/G151H/Q175L/Q192D/Q209L, Q38H/I41A/D60bV/F60eI/Y60gW/F97T/ins97aE/T98G/F99L/C122 S/G151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96I/F97N/T98G/F99L/C122S/G 151N/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bW/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/I136M/Q192 G/D217N, Q38H/I41S/D60bF/F60eT/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/H143 Q/G151N/Q175L/Q192G, Q38Y/I41S/D60bT/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/G151N/Q 175L/Q192D, Q38H/I41A/F60eH/Y60gW/ins97aE/F97T/T98G/F99L/C122S/Q175 L/Q192A, I41T/D60bW/F60eH/F97D/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G151N/Q17 5L/Q192G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aD/T98G/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97S/ins97aH/T98G/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/ins97aV/T98P/F99L/C122S/G15 1H/Q175L/Q192E, I41S/F99L/C122S/G151N/Q175M/Q192G/D217V, Q38R/I41S/D60bY/F60eD/ins97aV/F97D/T98P/F99L/C122S/G151 N/Q175M/Q192A, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/T98G/F99L/C122S/G151N/ Q175L/Q192D, H40R/I41H/Y60gH/F97D/F99L/C122S/Q175M/Q192G/D217I/K224L ,
Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/F97D/F99L/C122S/G151H/Q175L /Q192D, Q38Y/I41S/D60bT/F60eR/Y60gW/D96M/F97N/T98G/F99L/C122S/Q 175L/Q192D, Q38H/I41A/D60bV/F60eR/Y60gW/D96F/F97Y/ins97aN/T98G/F99M /C122S/G151N/Q175L/Q192G, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96Y/F97N/ins97aE/T98S/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97D/ins97aA/T98P/F99L /C122S/G151N/Q175L/Q192D, e as mesmas modificações, exceto C122S, não é modificado e é C122C.
43. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que compreende modificações correspondentes a: Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/G15 1H/Q175L/Q192D, em que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende o domínio de protease da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
44. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 42, caracterizado pelo fato de que compreende modificações correspondentes a I41D/C122S/G151N/Q192T ou I41D /G151N/Q192T ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T ou I41E/F99L/G151N/Q192T, em que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende o domínio de protease da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
45. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 44, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6, 8, 21-59 e 63-81.
46. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 35.
47. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado consiste na sequência de resíduos de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2 ou 4 (domínio de protease).
48. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado consiste na sequência de resíduos de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 2 ou 4.
49. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado consiste na sequência de resíduos de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 2 ou 4.
50. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que cliva nos resíduos QHARASHL (resíduos 737-744) de C3 humano (SEQ ID NO: 9).
51. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que P1-P1’ é RA.
52. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 51, caracterizado pelo fato de que é modificado por um polímero para aumentar a meia-vida no soro e/ou reduzir a imunogenicidade ou ambas.
53. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que é PEGuilado.
54. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo MTSP-1 modificado ou uma porção cataliticamente ativa de um polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, que é fundido a um polipeptídeo não protease MTSP-1 ou uma porção do mesmo.
55. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo não protease é um domínio de multimerização ou um domínio de transdução de proteína (PTD).
56. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo não protease é um domínio de multimerização que é um domínio Fc.
57. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de resíduos de aminoácidos que codificam o polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56.
58. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 57.
59. Vetor, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que é um vetor procariótico.
60. Vetor, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que é um vetor eucariótico.
61. Vetor, de acordo com a reivindicação 58,
caracterizado pelo fato de que é um vetor viral.
62. Vetor, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que é um vetor de levedura.
63. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58, 60 e 61, caracterizado pelo fato de que é um vetor do vírus do herpes simplex ou um vetor do vírus vaccinia ou um vetor adenoviral ou um vetor retroviral ou um vetor de inseto.
64. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, caracterizado pelo fato de que é um vetor de expressão.
65. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 64, caracterizado pelo fato de que é um vetor de terapia genética.
66. Uso da molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 57, ou do vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 58 a 65, caracterizado pelo fato de ser para terapia genética para o tratamento de uma doença ou condição mediada por ou que envolva a ativação do complemento, em que a inibição da ativação do complemento afeta o tratamento ou a melhora da doença ou condição.
67. Método de tratamento de uma doença ou condição mediada por ou envolvendo a ativação do complemento, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um indivíduo o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 58 a 65, ou administrar a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 57, para tratar a doença ou condição.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento é selecionada(o) de doenças e condições inflamatórias, sepse, artrite reumatoide (AR), uma doença ou um distúrbio oftalmológica(o) ou ocular, uma doença cardiovascular, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP) , esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA), rejeição de órgãos transplantados, e lesão de isquemia- reperfusão.
69. Método, de acordo com a reivindicação 67 ou 68, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma doença ocular ou oftálmica ou é rejeição ou inflamação devido a um órgão transplantado.
70. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma retinopatia diabética ou uma degeneração macular.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma degeneração macular.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular é degeneração macular relacionada à idade (DMRI).
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 69, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é função tardia do enxerto renal (FTER).
74. Uso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento é selecionada(o) de sepse, artrite reumatoide (AR), uma doença ocular, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), esclerose múltipla (EM),
miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA) e lesão de isquemia- reperfusão.
75. Uso, de acordo com a reivindicação 66 ou 74, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma doença oftálmica ou ocular ou é rejeição ou inflamação devido a um órgão transplantado.
76. Uso, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma retinopatia diabética ou uma degeneração macular.
77. Uso, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma degeneração macular.
78. Uso, de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular é degeneração macular relacionada à idade (DMRI).
79. Uso, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é função tardia do enxerto renal (FTER).
80. Célula isolada ou cultura de células, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 57, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 58 a 65.
81. Célula não humana, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 57, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 58 a 65.
82. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, conforme definida na reivindicação 57, ou o vetor, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 58 a 65, em que a célula isolada não é um zigoto humano.
83. Método para inibir a ativação do complemento, caracterizado pelo fato de que compreende contactar um polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou uma proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56, com proteína C3 do complemento, em que a proteína C3 do complemento é clivada de modo que a ativação do complemento seja reduzida ou inibida.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o contato do polipeptídeo MTSP-1 modificado com a proteína C3 do complemento é efetuado in vitro.
85. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o contato do polipeptídeo MTSP-1 modificado com a proteína C3 do complemento é efetuado in vivo.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 85, caracterizado pelo fato de que a inibição da ativação do complemento leva a uma redução dos sintomas inflamatórios associados a uma doença ou um distúrbio mediada(o) por complemento selecionada(o) de um distúrbio inflamatório, um distúrbio neurodegenerativo e um distúrbio cardiovascular.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento é selecionada(o) de sepse, artrite reumatoide (AR), distúrbios oculares,
glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA) e lesão de isquemia-reperfusão.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que a lesão de isquemia-reperfusão é causada por um evento ou tratamento selecionado dentre infarto do miocárdio (IM), acidente vascular cerebral, angioplastia, ponte aorto-coronária, circulação extracorpórea (CEC), e hemodiálise.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 83 a 88, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento resulta do tratamento de um indivíduo.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o polipeptídeo MTSP-1 modificado é realizado antes do tratamento de um indivíduo que resultou na doença ou no distúrbio mediada(o) por complemento.
91. Método de tratamento de uma doença ou condição mediada por ou envolvendo a ativação do complemento, caracterizado pelo fato de que compreende a administração de um polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56, em que a inibição da ativação do complemento afeta o tratamento ou a melhora da doença ou condição.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento é selecionada(o) de sepse, artrite reumatoide (AR), uma doença ocular, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA) e lesão de isquemia- reperfusão.
93. Método, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma doença ocular ou é rejeição ou inflamação devido a um órgão transplantado.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma retinopatia diabética ou uma degeneração macular.
95. Método, de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma degeneração macular.
96. Método, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular é degeneração macular relacionada à idade (DMRI).
97. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é função tardia do enxerto renal (FTER).
98. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 97, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado ou a proteína de fusão ou a molécula codificadora de ácido nucleico ou o vetor é administrado(a) por via intravenosa.
99. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 97, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado ou a proteína de fusão ou a molécula codificadora de ácido nucleico ou o vetor é administrado(a) por via subcutânea.
100. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 97, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado ou a proteína de fusão ou a molécula codificadora de ácido nucleico ou o vetor é administrado(a) ao olho.
101. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 100, caracterizado pelo fato de que a administração no olho é realizada por injeção intravítrea.
102. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado é ligado a um domínio de transdução para facilitar a transdução no humor vítreo.
103. Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 102, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado é PEGuilado.
104. Combinação, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) um polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou uma proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56; e (b) um segundo agente ou agentes para o tratamento de uma doença ou um distúrbio mediada(o) por complemento.
105. Combinação, de acordo com a reivindicação 104, caracterizada pelo fato de que o segundo agente ou agentes é um agente(s) anti-inflamatório(s) ou anticoagulante(s).
106. Combinação, de acordo com a reivindicação 105,
caracterizada pelo fato de que o segundo agente é um agente(s) anti-inflamatório(s) selecionado de qualquer um ou mais de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (AINE), antimetabólito, corticosteróide, analgésico, agente citotóxico, inibidor de citocina pró-inflamatória, citocinas anti-inflamatórias, agentes direcionadores de células B, compostos direcionados a antígenos T, bloqueadores de moléculas de adesão, antagonistas de receptores de quimiocinas, inibidores de quinase, ligantes de PPAR-γ (gama), inibidores do complemento, heparina, varfarina, acenocoumarol, fenindiona, EDTA, citrato, oxalato, argatrobana, lepirudina, bivalirudina e ximelagatrana.
107. Método, uso ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 106, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a modificação I41D ou I41S.
108. Método, uso ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 107, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a modificação I41S.
109. Método, uso ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 108, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D, ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /G151H/Q175L/Q192D.
110. Método, uso ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 107, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as modificações: I41D/C122S/G151N/Q192T ou I41D/G151N/Q192T.
111. Método, uso ou combinação de qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 110, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 não modificado compreende a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados na SEQ ID NO: 4.
112. Polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 54 a 56, ou método, uso ou combinação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 66 a 79 e 83 a 110, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 e 42.
113. Método de tratamento de FTER, caracterizado pelo fato de que compreende a administração intravenosa do polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56.
114. Método, de acordo com a reivindicação 113, caracterizado pelo fato de que uma dose única é de 0,1 a 1 mg.
115. Método, de acordo com a reivindicação 113 ou 114, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 e 42.
116. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 115, caracterizado pelo fato de que o tratamento é repetido várias vezes.
117. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 116, caracterizado pelo fato de que o tratamento é repetido a cada 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente.
118. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12 2S/G151H/Q175L/Q192D.
119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 113 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende o domínio de protease apresentado na SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 42 ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo.
120. Método para tratamento de um distúrbio oftálmico ou distúrbio ocular, caracterizado pelo fato de que compreende a administração do polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, no olho.
121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é degeneração macular ou retinopatia diabética.
122. Método, de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é DMRI.
123. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que uma dosagem única é de 0,1 a 1 mg.
124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 a 123, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende a sequência de resíduos de aminoácidos apresentados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35 e 42.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 a 124, caracterizado pelo fato de que o tratamento é repetido várias vezes.
126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 a 125, caracterizado pelo fato de que o tratamento é repetido a cada 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, semanalmente, quinzenalmente ou mensalmente.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 120 a 126, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /G151H/Q175L/Q192D.
128. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as trocas I41D/C122S/G151N/Q192T ou I41D/G151N/Q192T.
129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 111 a 117, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende o domínio de protease apresentado na SEQ ID NO: 35 ou uma porção cataliticamente ativa do mesmo.
130. Uso de um polipeptídeo MTSP-1 modificado, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de DMRI ou FTER, em que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as trocas Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L/C12
2S/G151H/Q175L/Q192D ou Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /G151H/Q175L/Q192D ou I41D/C122S/G151N/Q192T ou I41D/G151N/Q192T.
131. Uso do polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou da proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizado pelo fato de ser para inibir a ativação do complemento.
132. Uso, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que: o polipeptídeo MTSP-1 modificado é contactado com a proteína C3 do complemento, pelo qual a proteína C3 do complemento é clivada de modo que a ativação do complemento seja reduzida ou inibida; e o contato do polipeptídeo MTSP-1 modificado com a proteína C3 do complemento é efetuado in vitro ou em um animal não humano.
133. Uso, de acordo com a reivindicação 131, caracterizado pelo fato de que o contato do polipeptídeo MTSP-1 modificado com a proteína C3 do complemento é efetuado in vivo.
134. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131 a 133, caracterizado pelo fato de que a inibição da ativação do complemento leva a uma redução dos sintomas inflamatórios associados a uma doença ou um distúrbio mediada(o) por complemento selecionada(o) dentre um distúrbio inflamatório, um distúrbio neurodegenerativo e um distúrbio cardiovascular.
135. Uso, de acordo com a reivindicação 134,
caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento é selecionada(o) dentre sepse, artrite reumatoide (AR), distúrbios oculares, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA) e lesão de isquemia-reperfusão.
136. Uso, de acordo com a reivindicação 135, caracterizado pelo fato de que a lesão de isquemia-reperfusão é causada por um evento ou tratamento selecionado dentre infarto do miocárdio (IM), acidente vascular cerebral, angioplastia, ponte aorto-coronária, circulação extracorpórea (CEC), e hemodiálise.
137. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131 a 136, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento resulta do tratamento de um indivíduo.
138. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131 a 137, caracterizado pelo fato de que o tratamento com o polipeptídeo MTSP-1 modificado é efetuado antes do tratamento de um indivíduo.
139. Uso do polipeptídeo MTSP-1 modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou da proteína de fusão, de acordo com a qualquer uma das reivindicações 54 a 56, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento de uma doença ou condição mediada por ou que envolva a ativação do complemento, em que a inibição da ativação do complemento afeta o tratamento ou a melhora da doença ou condição.
140. Uso, de acordo com a reivindicação 139,
caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio mediada(o) por complemento é selecionada(o) dentre sepse, artrite reumatoide (AR), uma doença ocular, glomerulonefrite membranoproliferativa (GNMP), esclerose múltipla (EM), miastenia grave (MG), asma, doença inflamatória intestinal, lesão tecidual inflamatória aguda mediada por complexo imune (CI), doença de Alzheimer (DA) e lesão de isquemia- reperfusão.
141. Uso, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma doença ocular ou é rejeição ou inflamação devido a um órgão transplantado.
142. Uso, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma retinopatia diabética ou uma degeneração macular.
143. Uso, de acordo com a reivindicação 142, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é uma degeneração macular.
144. Uso, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que a degeneração macular é degeneração macular relacionada à idade (DMRI).
145. Uso, de acordo com a reivindicação 141, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é função tardia do enxerto renal (FTER).
146. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 131 a 145, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D ou I41E/F99L/C122S/G151N/Q192T.
147. Uso, de acordo com a reivindicação 145,
caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as modificações Q38H/I41S/D60bT/F60eS/Y60gW/D96K/F97G/ins97aV/T98P/F99L /C122S/G151H/Q175L/Q192D.
148. Uso, de acordo com a reivindicação 145, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo MTSP-1 modificado compreende as modificações I41D/C122S/G151N/Q192T.
149. Método para preparar um polipeptídeo MTSP-1 modificado, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir um ácido nucleico ou vetor que codifica o polipeptídeo MTSP-1 modificado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 53, ou a proteína de fusão, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 54 a 56, em uma célula; cultivar a célula sob condições, em que o polipeptídeo é expressado; e opcionalmente, isolar o polipeptídeo expressado.
150. Método, de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula eucariótica.
151. Método, de acordo com a reivindicação 150, caracterizado pelo fato de que a célula é uma célula de mamífero ou uma célula de levedura.
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