BR112019023118A2

BR112019023118A2 - proteínas de ligação ao antígeno anti-jagged1

Info

Publication number: BR112019023118A2
Application number: BR112019023118-8A
Authority: BR
Inventors: Brian D. Bennett; Chadwick T. King; Jonathan Phillips
Original assignee: Amgen Inc.
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2018-05-30
Publication date: 2020-10-20
Also published as: US11028180B2; SG11201909529XA; US20210340270A1; US20190023802A1; JP7222614B2; EA201992348A1; CA3059975A1; ZA201906821B; CR20190513A; CO2019012204A2; US11897963B2; PE20200487A1; CN110621695A; US11897965B2; AU2018275231A1; TW201908339A; PH12019502449A1; CN110621695B; JOP20190259A1; MA48777A

Abstract

São proporcionados métodos de tratamento de condições relacionadas com doença pulmonar usando uma proteína de ligação ao antígeno específica para o polipeptídeo Jagged1.

Description

PROTEÍNAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO ANTI-JAGGED1

ÁREA DA INVENÇÃO

[0001] A presente divulgação se relaciona com o tratamento ou melhoria de doença pulmonar usando uma proteína de ligação ao antígeno específica para Jagged1.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A via de sinalização Notch regula uma rede diversa de funções de células (Kopan et al., Cell 137, 216-233 (2009)). Quatro receptores Notch foram identificados em mamíferos, i.e., Notch 1-4, que partilham elementos estruturais básicas que incluem um domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio intracelular. Similarmente, os ligantes canônicos de Notch partilham certas similaridades estruturais mas um número de ligantes não canônicos de Notch foi também identificado (Kopan et al., Cell 137, 216-233 (2009)). Os cinco ligantes canônicos em mamíferos são Delta-tipo 1, Delta-tipo 3, Delta-tipo 4, Jaggedl e Jagged2. A ligação de um ligante Notch ao domínio extracelular de um receptor Notch desencadeia uma cascata de sinalização que começa com clivagem proteolítica no local S2 extracelular por uma alfa secretase da família ADAM (uma desintegrina e metaloprotease). A clivagem em S2 é seguida por clivagem proteolítica por uma gama secretase no local S3 intracelular, o que resulta na liberação do domínio intracelular e eventos a jusante que ativam em última instância fatores de transcrição dependente de Notch tais como Hesl e Hey.

[0003] A expressão e sinalização aberrantes de Notch têm sido implicadas em um número de doenças, incluindo câncer (Koch et al., Cell. Mol. Life Sci. 64, 2746-2762 (2007)). É claro que continua a existir uma necessidade de agentes que tenham atributos clínicos que são ótimos para desenvolvimento como agentes terapêuticos. A invenção descrita aqui atende a esta necessidade e proporciona outros benefícios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0004] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a um método de tratamento de um sujeito com uma condição relacionada com doença pulmonar, compreendendo o método administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente a uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de um Jagged1. Em certas modalidades, o sujeito é humano. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é administrada intravenosamente, por nebulização ou por injeção subcutânea.

[0005] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente a uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de um Jagged1.

[0006] Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de anticorpo. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um fragmento Fab, um fragmento Fab' ou um fragmento F(ab')2. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo humano. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é do tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é acoplada a um grupo de marcação.

[0007] Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento. Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, em que a CDRL1 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, e 130; a CDRL2 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, e 131; a CDRL3 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, e 132; a CDRH1 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, e 262; a CDRH2 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 137, 143, 149, 155, 161, 167, 173, 179, 185, 191, 197, 203, 209, 215, 221, 227, 233, 239, 245, 251, 257, e 263; e a CDRH3 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, e 264.

[0008] Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, em que cada CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente, compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, e SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, e SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, e SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, e SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, e SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, e SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, e SEQ ID NO: 174; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, e SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, e SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, e SEQ ID NO: 192; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, e SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, e SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, e SEQ ID NO: 210; SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, e SEQ ID NO: 216; SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, e SEQ ID NO: 222; SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, e SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 100,

SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, e SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, e SEQ ID NO: 240; SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, e SEQ ID NO: 246; SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, e SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, e SEQ ID NO: 258; e SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, e SEQ ID NO: 264.

[0009] Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento, e em que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, e 351 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 268, 272, 276, 280, 284, 288, 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, e 352.

[0010] Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento, e em que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma combinação de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 267 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 268; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 271 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo

SEQ ID NO: 272; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 275 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 276; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 279 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 280; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 283 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 284; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 287 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 288; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 291 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 292; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 295 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 296; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 299 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 300; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 303 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 304; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 307 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 308; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 311 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 312; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 315 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 316; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 319 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 320; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 323 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:

324; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 327 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 328; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 331 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 332; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 335 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 336; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 339 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 340; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 343 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 344; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 347 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 348; e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 351 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO:

352.

[0011] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a uma molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma sequência de controle.

[0012] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a um vetor compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[0013] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a uma célula hospedeira compreendendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

[0014] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a um anticorpo ou seu fragmento produzido por uma célula hospedeira da presente invenção.

[0015] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a um método de produção de um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção, compreendendo o passo de preparação do anticorpo ou seu fragmento a partir de uma célula hospedeira que secreta o anticorpo.

[0016] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0017] Em um aspecto, a presente invenção está dirigida a uma proteína de ligação ao antígeno que compete pela ligação a Jagged1 humano com um anticorpo ou seu fragmento de acordo com a presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] FIGS. 1A-1F. As FIGS. 1A até 1D mostram coloração ácido periódico-Schiff/azul alciano de culturas de ALI não estimuladas não tratadas ou tratadas com IgG1 (10 ug/mL) ou 15D11.1 anti-Jag-1 (10 ug/mL ou 1 ug/mL). As FIGS. 1E até 1F mostram quantificação do número de células caliciformes e percentagem de conteúdo de mucina dos diferentes grupos de tratamento. Menos células caliciformes estão presentes na condição sem estimulação da linha de base e o tratamento anti-Jag-1 (10 ug/mL) reduziu o número de células caliciformes abaixo da linha de base.

[0019] FIGS. 2A-2G. As FIGS. 2A até 2E mostram coloração ácido periódico-Schiff/azul alciano de culturas de ALI não estimuladas ou estimuladas com IL-13 não tratadas ou tratadas com IgG1 (10 ug/mL) ou 15D11.1 anti-Jag-1 (10 ug/mL ou 1 ug/mL). FIGS. 2F e 2G - quantificação do número de células caliciformes e percentagem de conteúdo de mucina dos diferentes grupos de tratamento. Células caliciformes abundantes estão presentes na condição de estimulação com IL-13 e o tratamento anti-Jag-1 (10 ug/mL ou 1 ug/mL) reduziu significativamente o número de células caliciformes e percentagem de conteúdo de mucina.

[0020] FIGS. 3A-3D. As FIGS. 3A até 3D mostra resultados de qPCR para os marcadores de células caliciformes MUC5AC; MUC5B e FOXA3 de culturas de broncoesferas em 3D não estimuladas ou estimuladas com IL-13, não tratadas ou tratadas com IgG1 (10 ug/mL) ou anti-Jag-1 (10 ug/mL ou 1 ug/mL). IL-13 induziu a diferenciação de células caliciformes e o tratamento anti-Jag-1 (10 ug/mL e 1 ug/mL), mas não o tratamento com IgG1 (10 ug/mL), bloqueou a diferenciação de células caliciformes.

[0021] FIGS. 4A-4G. A FIG. 4A mostra um sumário esquemático do desenho do estudo de desafio de OVA, as FIG. 4B até 4E mostram Coloração Ácido Periódico-Schiff das vias aéreas de camundongos de controle, tratados com anti-Jag-1 (15D11.1) ou anti-TSLP, as FIGS 4F e 4G quantificação de células caliciformes e percentagem de conteúdo de mucina no epitélio das vias áreas dos diferentes grupos de tratamento. As vias áreas tratadas com controle e tratadas com anti-TSLP exibem células caliciformes abundantes e o grupo tratado com anti-Jag-1 mostra números reduzidos de células caliciformes e percentagem de conteúdo de mucina.

[0022] FIGS. 5A-5C. A FIG. 5A mostra mudanças de peso corporal para todos os grupos. Os camundongos sensibilizados sem e com OVA são exibidos separadamente nos gráficos na FIG. 5B e FIG. 5C.

[0023] A FIG. 6 mostra Avaliação da afinidade de ligação de mAb anti-hJagged1 15D11.1 a hJagged1

[0024] As FIGS. 7A-7C mostram Afinidade nas células por medição em equilíbrio usando KinExA.

[0025] As FIGS. 8A-8B mostram resultados de ensaios ELISA de reatividade cruzada entre espécies e seletividade de 15D11.1 contra membros da família de ligantes Notch

[0026] A FIG. 9 mostra Ligação de 15D11.1 a células 293T transfectadas com Jagged-1 humano.

[0027] A FIG. 10 mostra Reatividade cruzada entre espécies de 15D11.1 com células 293T transfectadas com Jagged-1 murino.

[0028] A FIG. 11 mostra Ligação de 15D11.1 a células 293T transfectadas com Jagged-1 de rato.

[0029] A FIG. 12 mostra Titulação de dose de mAb anti- Jagged-1 15D11.1 em ensaio de cocultura de ativação de Notch2 humano induzida por Jagged-1 humano

[0030] A FIG. 13 mostra Reatividade cruzada entre espécies de 15D11.1 contra Jagged-1 de camundongo.

[0031] As FIGS. 14A-14L mostra Titulação de dose de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 em culturas de broncoesferas não estimuladas.

[0032] As FIGS. 15A-15L mostra Titulação de dose de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 em culturas de broncoesferas estimuladas com IL-13 (1 ng/mL)

[0033] As FIGS. 16A-16B mostram que a Dosagem profilática de anticorpo para Jag1 inibe a expressão do gene da via de sinalização Notch Nrarp e do gene marcador de células caliciformes Muc5ac no modelo de metaplasia de células caliciformes de camundongo induzido por administração intratraqueal de IL-13.

[0034] As FIGS. 17A-17C mostram que a Dosagem profilática de anticorpo para Jag1 dirige um fenótipo de células epiteliais das vias aéreas ciliadas e inibe a metaplasia de células caliciformes no modelo de asma induzido por ovalbumina.

[0035] As FIGS. 18A-18D mostra que a Dosagem terapêutica de Ab neutralizante de Jag1 no modelo de asma induzido por ovalbumina inibe a expressão de genes de células secretoras.

[0036] As FIGS. 19A-19B mostram que o tratamento com anticorpo por Jag1 reduz a obstrução de muco das vias aéreas no modelo de camundongo transgênico b-ENaC de doença pulmonar muco-obstrutiva.

[0037] As FIGS. 20A-20F mostram que a Dosagem de anticorpo para Jag1 reduziu o conteúdo de mucina no epitélio respiratório de macacos.

[0038] As FIGS. 21A-21B mostram a Farmacocinética do anticorpo 15D11.1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0039] Os métodos de polipeptídeos e ácidos nucleicos recombinantes usados aqui, incluindo nos Exemplos, são geralmente aqueles apresentados em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) ou Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., Green Publishers Inc. and Wiley and Sons 1994), ambos os quais são incorporados aqui por referência para qualquer propósito.

[0040] Os cabeçalhos de seção usados aqui são somente para propósitos organizacionais e não são para serem interpretados como limitando o assunto descrito.

[0041] A não ser que de outro modo definido aqui, todos os termos técnicos e científicos usados em conexão com o presente pedido deverão ter os significados que são comumente entendidos pelos peritos na técnica. Adicionalmente, a não ser que de outro modo requerido pelo contexto, os termos singulares deverão incluir pluralidades e os termos plurais deverão incluir o singular.

[0042] Geralmente, as nomenclaturas usadas em conexão com, e técnicas de, cultura de células e de tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e química de proteínas e ácidos nucleicos e hibridação descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos e técnicas do presente pedido são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica e como descritos em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo a não ser que de outro modo indicado. Ver, p.ex., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), que são incorporados aqui por referência. As reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, como comumente alcançado na técnica ou como descrito aqui.

A terminologia usada em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formulação e distribuição farmacêuticas e tratamento de pacientes.

[0043] Deve ser entendido que esta invenção não está limitada à metodologia, protocolos e reagentes particulares, etc., descritos aqui pois tais podem variar. A terminologia usada aqui é para o propósito somente de descrever modalidades particulares e não se destina a limitar o escopo do divulgado, que é definido meramente pelas reivindicações.

[0044] Sem ser nos exemplos de operação, ou onde de outro modo indicado, todos os números expressando quantidades de ingredientes ou condições de reação usados aqui devem ser entendidos como modificados em todos os casos pelo termo “cerca de”. O termo “cerca de” quando usado em conexão com percentagens pode significar ±1%.

[0045] Seguindo a convenção, como usados aqui, “um” e “uma” significam “um(a) ou mais” a não ser que especificamente indicado de outro modo.

[0046] Como usados aqui, os termos “aminoácido” e “resíduo” são permutáveis e, quando usados no contexto de um peptídeo ou polipeptídeo, se referem a aminoácidos ocorrendo naturalmente e sintéticos, bem como análogos de aminoácidos, miméticos de aminoácidos e aminoácidos não ocorrendo naturalmente que são quimicamente similares aos aminoácidos ocorrendo naturalmente.

[0047] Um “aminoácido ocorrendo naturalmente” é um aminoácido que é codificado pelo código genético, bem como aqueles aminoácidos que são codificados pelo código genético que são modificados após síntese, p.ex., hidroxiprolina, γ- carboxiglutamato e O-fosfosserina. Um “análogo de aminoácido” é um composto que tem a mesma estrutura química básica que um aminoácido ocorrendo naturalmente, i.e., um carbono α que está ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, p.ex., homosserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Tais análogos podem ter grupos R modificados (p.ex., norleucina) ou esqueletos de peptídeos modificados, mas reterão a mesma estrutura química básica que um aminoácido ocorrendo naturalmente.

[0048] Um “mimético de aminoácido” é um composto químico que tem uma estrutura que é diferente da estrutura química geral de um aminoácido, mas que funciona de uma maneira similar a um aminoácido ocorrendo naturalmente. Exemplos incluem um derivado de metacriloíla ou acriloíla de uma amida, β-, γ-, δ-aminoácidos (tais como ácido piperidina-4- carboxílico) e similares.

[0049] Um “aminoácido não ocorrendo naturalmente” é um composto que tem a mesma estrutura química básica que um aminoácido ocorrendo naturalmente, mas não é incorporado em uma cadeia de polipeptídeo em crescimento pelo complexo de tradução. “Aminoácido não ocorrendo naturalmente” inclui também, mas não está limitado a, aminoácidos que ocorrem por modificação (p.ex., modificações pós-translacionais) de um aminoácido naturalmente codificado (incluindo os, mas não se limitando aos, 20 aminoácidos comuns) mas não são eles próprios naturalmente incorporados em uma cadeia de polipeptídeo em crescimento pelo complexo de tradução.

Uma lista não limitante de exemplos de aminoácidos não ocorrendo naturalmente que podem ser inseridos em uma sequência de polipeptídeos ou substituídos por um resíduo de tipo selvagem em sequência de polipeptídeos inclui β-aminoácidos, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos e aminoácidos com cadeias laterais derivatizadas.

Exemplos incluem (na forma L ou D; abreviado como entre parênteses): citrulina (Cit), homocitrulina (hCit), Nα-metilcitrulina (NMeCit), Nα-metil- homocitrulina (Nα-MeHoCit), ornitina (Orn), Nα-metilornitina (Nα-MeOrn ou NMeOrn), sarcosina (Sar), homolisina (hLys ou hK), homoarginina (hArg ou hR), homoglutamina (hQ), Nα- metilarginina (NMeR), Nα-metil-leucina (Nα-MeL ou NMeL), N- metil-homolisina (NMeHoK), Nα-metilglutamina (NMeQ), norleucina (Nle), norvalina (Nva), 1,2,3,4-tetra- hidroisoquinolina (Tic), Ácido octa-hidroindol-2- carboxílico (Oic), 3-(1-naftil)alanina (1-Nal), 3-(2- naftil)alanina (2-Nal), 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (IgI), para-iodofenilalanina (pI- Phe), para-aminofenilalanina (4AmP ou 4-Amino-Phe), 4- guanidino fenilalanina (Guf), glicililina (abreviada “K(Nε- glicil)” ou “K(glicil)” ou “K(gly)”), nitrofenilalanina (nitrophe), aminofenilalanina (aminophe ou Amino-Phe), benzilfenilalanina (benzilphe), ácido γ-carboxiglutâmico (γ- carboxiglu), hidroxiprolina (hidroxipro), p-carboxil- fenilalanina (Cpa), ácido α-aminoadípico (Aad), Nα-metil valina (NMeVal), N-α-metil leucina (NMeLeu), Nα- metilnorleucina (NMeNle), ciclopentilglicina (Cpg), ciclo- hexilglicina (Chg), acetilarginina (acetilarg), ácido α,β-

diaminopropionoico (Dpr), ácido α,γ-diaminobutírico (Dab), ácido diaminoprutiônico (Dap), ciclo-hexilalanina (Cha), 4- metil-fenilalanina (MePhe), β,β-difenil-alanina (BiPhA), ácido aminobutírico (Abu), 4-fenil-fenilalanina (ou bifenilalanina; 4Bip), ácido α-amino-isobutírico (Aib), beta-alanina, ácido beta-aminopropiônico, ácido piperidínico, ácido aminocaprioico, ácido amino-heptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N- etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp), γ- carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetil-lisina, ε-N-acetil- lisina, O-fosfosserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5-hidroxilisina, ω-metilarginina, Ácido 4-Amino-O-Ftálico (4APA) e outros aminoácidos similares e formas derivatizadas de qualquer um daqueles especificamente listados.

[0050] O termo “molécula de ácido nucleico isolada” se refere a um polímero de fita simples ou dupla de bases de desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos lidas da extremidade 5´ para a extremidade 3´ (p.ex., uma sequência de ácido nucleico de Jagged1 proporcionada aqui), ou um seu análogo, que foi separado de pelo menos cerca de 50 por cento de polipeptídeos, peptídeos, lipídeos, carboidratos, polinucleotídeos ou outros materiais com os quais o ácido nucleico é naturalmente encontrado quando ácido nucleico total é isolado a partir das células de origem. Preferencialmente, uma molécula de ácido nucleico isolada está substancialmente isenta de quaisquer outras moléculas de ácido nucleico contaminantes ou outras moléculas que são encontradas no ambiente natural do ácido nucleico que interfeririam com seu uso na produção de polipeptídeos ou seu uso terapêutico, de diagnóstico, profilático ou de investigação.

[0051] O termo “polipeptídeo isolado” se refere a um polipeptídeo (p.ex., uma sequência de polipeptídeo Jagged1 proporcionada aqui ou uma proteína de ligação ao antígeno da presente invenção) que foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de polipeptídeos, peptídeos, lipídeos, carboidratos, polinucleotídeos ou outros materiais com os quais o polipeptídeo é naturalmente encontrado quando isolado a partir de uma célula de origem. Preferencialmente, o polipeptídeo isolado está substancialmente isento de quaisquer outros polipeptídeos contaminantes ou outros contaminantes que são encontrados no seu ambiente natural o que interferiria com seu uso terapêutico, de diagnóstico, profilático ou de investigação.

[0052] O termo “codificando” se refere a uma sequência de polinucleotídeos codificando um ou mais aminoácidos. O termo não requer um códon de iniciação ou terminação.

[0053] Os termos “idêntico” ou percentagem de “identidade”, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos, se referem a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas. “Percentagem de identidade” significa a percentagem de resíduos idênticos entre os aminoácidos ou nucleotídeos nas moléculas comparadas e é calculada com base no tamanho da mais pequena das moléculas sendo comparadas. Para estes cálculos, as lacunas em alinhamentos (se algumas) podem ser atendidas por um modelo matemático ou programa de computador particular

(i.e., um “algoritmo”). Métodos que podem ser usados para calcular a identidade dos ácidos nucleicos ou polipeptídeos alinhados incluem aqueles descritos em Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.), (1988) New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; e Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48: 1073.

[0054] No cálculo da percentagem de identidade, as sequências sendo comparadas são alinhadas de um modo que resulte na maior correspondência entre as sequências. O programa de computador usado para determinar a percentagem de identidade é o pacote de programas GCG, que inclui GAP (Devereux et al., (1984), Nucl. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). O algoritmo de computador GAP é usado para alinhar os dois polipeptídeos ou polinucleotídeos para os quais a percentagem de identidade de sequências é para ser determinada. As sequências são alinhadas para correspondência ótima dos seus respectivos aminoácidos ou nucleotídeos (o “intervalo correspondido”, como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de lacunas (que é calculada como 3x a diagonal média, em que a “diagonal média” é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a “diagonal” é a pontuação ou número atribuído a cada correspondência de aminoácidos perfeita pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de lacunas (que é usualmente 1/10 vezes a penalidade de abertura de lacunas), bem como uma matriz de comparação tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas em conjunção com o algoritmo. Em certas modalidades, uma matriz de comparação padrão (ver, Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também usada pelo algoritmo.

[0055] Parâmetros recomendados para determinar a percentagem de identidade para polipeptídeos ou sequências de nucleotídeos usando o programa GAP são as seguintes:

[0056] Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453;

[0057] Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra;

[0058] Penalidade de Lacunas: 12 (mas sem penalidade para lacunas finais)

[0059] Penalidade de Comprimento de Lacunas: 4

[0060] Limiar de Similaridade: 0

[0061] Certos esquemas de alinhamento para alinhar duas sequências de aminoácidos podem resultar na correspondência de somente uma curta região das duas sequências, e esta pequena região alinhada pode ter identidade de sequências muito elevada mesmo não existindo relação significativa entre as duas sequências de comprimento total. Conformemente, o método de alinhamento selecionado (p.ex., o programa GAP) pode ser ajustado se assim desejado para resultar em um alinhamento que abranja pelo menos 50 aminoácidos contíguos do polipeptídeo alvo.

[0062] Os termos “polipeptídeo Jagged1” e “proteína Jagged1” são usados indistintamente e significam um polipeptídeo de tipo selvagem ocorrendo naturalmente expresso em um mamífero, tal como um humano ou um camundongo, e inclui alelos ocorrendo naturalmente (p.ex., formas alélicas ocorrendo naturalmente da proteína Jagged1 humana). Para propósitos desta divulgação, o termo “polipeptídeo Jagged1” pode ser usado indistintamente para se referir a qualquer polipeptídeo Jagged1 de comprimento total, p.ex., SEQ ID NO: 353, que consiste em 1218 resíduos de aminoácidos e que é codificada pela sequência de nucleotídeos SEQ ID NO:

354.

[0063] O termo “polipeptídeo Jagged1” engloba também um polipeptídeo Jagged1 no qual uma sequência de polipeptídeo Jagged1 ocorrendo naturalmente (p.ex., SEQ ID NO: 353) foi modificada. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, uma ou mais substituições de aminoácidos, incluindo substituições por aminoácidos não ocorrendo naturalmente, análogos de aminoácidos não ocorrendo naturalmente e miméticos de aminoácidos.

[0064] Em várias modalidades, um polipeptídeo Jagged1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 85 por cento idêntica a um polipeptídeo Jagged1 ocorrendo naturalmente (p.ex., SEQ ID NO: 353). Em outras modalidades, um polipeptídeo Jagged1 compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos cerca de 90 por cento ou cerca de 95, 96, 97, 98 ou 99 por cento idêntica a uma sequência de aminoácidos de polipeptídeo Jagged1 ocorrendo naturalmente (p.ex., SEQ ID NO: 353). Tais polipeptídeos Jagged1 possuem preferencialmente, mas não necessariamente, pelo menos uma atividade de um polipeptídeo Jagged1 de tipo selvagem, tal como a capacidade de se ligar a um receptor Notch. A presente invenção engloba também moléculas de ácido nucleico codificando tais sequências de polipeptídeo Jagged1.

[0065] O termo “ensaio de atividade de Jagged1” (também referido como “ensaio funcional de Jagged1”) significa um ensaio que pode ser usado para medir a atividade de Jagged1 ou um receptor Jagged1 (i.e., Notch 1-4) em um cenário celular.

[0066] O termo “ensaio de ligação a Jagged1” significa um ensaio que pode ser usado para medir a ligação de Jagged1 a Notch1-4. Em uma modalidade, o “ensaio de ligação a Jagged1” pode ser um ensaio usando FMAT ou FACS que mede a ligação de Jagged1 marcado com fluorescência a células expressando Notch 1-4 e a atividade da proteína de ligação a Jagged1/Notch 1-4 pode ser medida para deslocar a ligação de Jagged1 marcado com fluorescência para células expressando Notch 1-4. Em outra modalidade, o “ensaio de ligação a Jagged1” pode ser um ensaio que mede a ligação de Jagged1 radioativamente marcado a células expressando Notch 1-4 e a atividade da proteína de ligação a Jagged1/Notch 1-4 pode ser medida para deslocar a ligação de Jagged1 radioativamente marcado para células expressando Notch 1-4 (Biochimica et Biophysica Acta (2001) 1547:143-155).

[0067] Uma “proteína de ligação ao antígeno” como usada aqui significa qualquer proteína que se liga especificamente a um antígeno alvo especificado, tal como um polipeptídeo

Jagged1 (p.ex., um polipeptídeo Jagged1 humano tal como proporcionado em SEQ ID NO: 353). O termo engloba anticorpos intactos que compreendem pelo menos duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total, bem como seus derivados, variantes, fragmentos e mutações. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab´, F(ab´)2 e Fv. Uma proteína de ligação ao antígeno inclui também anticorpos de domínio tais como nanocorpos e scFv como descritos adicionalmente em baixo.

[0068] Em geral, uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 é para se “ligar especificamente” ao seu antígeno alvo Jagged1 quando a proteína de ligação ao antígeno exibe essencialmente ligação de fundo a moléculas diferentes de Jagged1. Uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente a Jagged1 pode, no entanto, reagir de modo cruzado com polipeptídeos Jagged1 de espécies diferentes. Tipicamente, uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 se liga especificamente a Jagged1 humano quando a constante de dissociação (KD) é ≤ 10-7 M como medida através de uma técnica de ressonância de plasma de superfície (p.ex., BIACore, GE- Healthcare Uppsala, Suécia) ou Ensaio de Exclusão Cinética (KinExA, Sapidyne, Boise, Idaho). Uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 se liga especificamente a Jagged1 humano com “elevada afinidade” quando a KD é ≤ 5x 10-9 M, e com “afinidade muito elevada” quando a KD é ≤ 5x 10-10 M, como medida usando métodos descritos.

[0069] “Região de ligação ao antígeno” significa uma proteína, ou uma porção de uma proteína, que se liga especificamente a um antígeno especificado. Por exemplo, aquela porção de uma proteína de ligação ao antígeno que contém os resíduos de aminoácidos que interagem com um antígeno e conferem à proteína de ligação ao antígeno a sua especificidade e afinidade pelo antígeno é referida como “região de ligação ao antígeno”. Uma região de ligação ao antígeno inclui tipicamente uma ou mais “regiões de ligação complementares” (“CDR”) de uma imunoglobulina, imunoglobulina de cadeia única ou anticorpo camelídeo. Certas regiões de ligação ao antígeno incluem também uma ou mais regiões de arcabouço. Uma “CDR” é uma sequência de aminoácidos que contribui para a especificidade e afinidade de ligação ao antígeno. As regiões “de arcabouço” podem auxiliar na manutenção da conformação apropriada das CDR para promover a ligação entre a região de ligação ao antígeno e um antígeno.

[0070] Uma “proteína recombinante”, incluindo uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 recombinante, é uma proteína produzida usando técnicas recombinantes, i.e., através da expressão de um ácido nucleico recombinante como descrito aqui. Métodos e técnicas para a produção de proteínas recombinantes são bem conhecidos na técnica.

[0071] O termo “anticorpo” se refere a uma imunoglobulina intacta de qualquer isotipo, ou um seu fragmento que pode competir com o anticorpo intacto quanto à ligação específica ao antígeno alvo, e inclui, por exemplo, anticorpos quiméricos, humanizados, totalmente humanos e biespecíficos. Um “anticorpo” como tal é uma espécie de uma proteína de ligação ao antígeno. Um anticorpo intacto compreenderá geralmente pelo menos duas cadeias pesadas de comprimento total e duas cadeias leves de comprimento total. Os anticorpos podem ser derivados meramente a partir de uma única fonte ou podem ser “quiméricos”, isto é, diferentes porções do anticorpo podem ser derivadas de dois anticorpos diferentes como descrito adicionalmente em baixo. As proteínas de ligação ao antígeno, anticorpos ou fragmentos de ligação podem ser produzidas em hibridomas, por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzimática ou química de anticorpos intactos.

[0072] O termo “cadeia leve” como usado no que diz respeito a um anticorpo ou seus fragmentos inclui uma cadeia leve de comprimento total e seus fragmentos tendo sequência de região variável suficiente para conferir especificidade de ligação. Uma cadeia leve de comprimento total inclui um domínio de região variável, VL, e um domínio de região constante, CL. O domínio da região variável da cadeia leve está no terminal amino do polipeptídeo. As cadeias leves incluem cadeias kappa e cadeias lambda.

[0073] O termo “cadeia pesada” como usado no que diz respeito a um anticorpo ou seus fragmentos inclui uma cadeia pesada de comprimento total e seus fragmentos tendo sequência de região variável suficiente para conferir especificidade de ligação. Uma cadeia pesada de comprimento total inclui um domínio de região variável, VH, e três domínios de região constante, CH1, CH2 e CH3. O domínio VH está no terminal amino do polipeptídeo e os domínios CH estão no terminal carboxila, com o CH3 estando mais próximo do terminal carboxila do polipeptídeo. As cadeias pesadas podem ser de qualquer isotipo, incluindo IgG (incluindo os subtipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), IgA (incluindo os subtipos IgA1 e IgA2), IgM e IgE.

[0074] O termo “fragmento imunologicamente funcional” (ou simplesmente “fragmento”) de um anticorpo ou cadeia de imunoglobulina (cadeia pesada ou leve), como usado aqui, é uma proteína de ligação ao antígeno compreendendo uma porção (independentemente de como essa porção é obtida ou sintetizada) de um anticorpo que não tem pelo menos alguns dos aminoácidos presentes em uma cadeia de comprimento total mas que é capaz de se ligar especificamente a um antígeno. Tais fragmentos são biologicamente ativos na medida em que se ligam especificamente ao antígeno alvo e podem competir com outras proteínas de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos intactos, pela ligação específica a um dado epítopo.

[0075] Estes fragmentos biologicamente ativos podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante ou podem ser produzidos por clivagem enzimática ou química das proteínas de ligação ao antígeno, incluindo anticorpos intactos. Os fragmentos de imunoglobulina imunologicamente funcionais incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2.

[0076] Em outra modalidade, Fvs, anticorpos de domínio e scFvs podem ser derivados de um anticorpo da presente invenção.

[0077] É contemplado adicionalmente que uma porção funcional das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas aqui, por exemplo, uma ou mais CDR, poderia ser covalentemente ligada a uma segunda proteína ou a uma molécula pequena para criar um agente terapêutico dirigido a um alvo particular no organismo, possuindo propriedades terapêuticas bifuncionais ou tendo uma meia-vida no soro prolongada.

[0078] Um “fragmento Fab” é compreendido por uma cadeia leve e as regiões CH1 e variáveis de uma cadeia pesada. A cadeia pesada de uma molécula Fab não pode formar uma ligação de dissulfeto com outra molécula de cadeia pesada.

[0079] Uma região “Fc” contém dois fragmentos de cadeia pesada compreendendo os domínios CH2 e CH3 de um anticorpo. Os dois fragmentos de cadeia pesada são mantidos unidos por duas ou mais ligações de dissulfeto e por interações hidrofóbicas dos domínios CH3.

[0080] Um “fragmento Fab´” contém uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém o domínio VH e o domínio CH1 e também a região entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeias possa ser formada entre as duas cadeias pesadas dos dois fragmentos Fab´ para formar uma molécula F(ab´)2.

[0081] Um “fragmento F(ab´)2” contém duas cadeias leves e duas cadeias pesadas contendo uma porção da região constante entre os domínios CH1 e CH2, tal que uma ligação de dissulfeto intercadeias seja formada entre as duas cadeias pesadas. Um fragmento F(ab´)2 é assim composto por dois fragmentos Fab´ que são mantidos unidos por uma ligação de dissulfeto entre as duas cadeias pesadas.

[0082] A “região Fv” compreende as regiões variáveis de ambas as cadeias pesada e leve, mas não tem as regiões constantes.

[0083] “Anticorpos de cadeia única” ou “scFvs” são moléculas Fv nas quais as regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram conectadas por um ligante flexível para formar uma única cadeia de polipeptídeo, que forma uma região de ligação ao antígeno. Os scFvs são discutidos em detalhe no Pedido de Patente Internacional No. de Publicação WO 88/01649 e Patentes dos Estados Unidos Nos. 4,946,778 e No. 5,260,203, as divulgações dos quais são incorporadas por referência.

[0084] Um “anticorpo de domínio” ou “imunoglobulina de cadeia única” é um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional contendo somente a região variável de uma cadeia pesada ou a região variável de uma cadeia leve. Exemplos de anticorpos de domínio incluem Nanobodies®. Em alguns casos, duas ou mais regiões VH estão covalentemente unidas com um ligante de peptídeo para criar um anticorpo de domínio bivalente. As duas regiões VH de um anticorpo de domínio bivalente podem visar o mesmo antígeno ou antígenos diferentes.

[0085] Uma “proteína de ligação ao antígeno bivalente” ou “anticorpo bivalente” compreende dois locais de ligação ao antígeno. Em alguns casos, as duas regiões de ligação têm as mesmas especificidades de antígeno. As proteínas de ligação ao antígeno bivalentes e os anticorpos bivalentes podem ser biespecíficos, ver, infra.

[0086] Uma “proteína de ligação ao antígeno multiespecífica” ou “anticorpo multiespecífico” é um que visa mais do que um antígeno ou epítopo.

[0087] Uma proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno “biespecífico”, “duplamente específico” ou “bifuncional” é uma proteína ou anticorpo, respectivamente, de ligação ao antígeno híbrido tendo dois locais de ligação ao antígeno diferentes. As proteínas e anticorpos de ligação ao antígeno biespecíficos são uma espécie de proteína de ligação ao antígeno multiespecífica ou anticorpo multiespecífico e podem ser produzidos por uma variedade de métodos incluindo, mas não se limitando a, fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab´. Ver, p.ex., Songsivilai e Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553. Os dois locais de ligação de uma proteína ou anticorpo de ligação ao antígeno biespecíficos se ligarão a dois epítopos diferentes, que podem residir no mesmo alvo de proteína ou em alvos de proteína diferentes.

[0088] O termo “competir” quando usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (p.ex., anticorpos) significa que a competição entre proteínas de ligação ao antígeno é determinada por um ensaio no qual a proteína de ligação ao antígeno (p.ex., anticorpo ou seu fragmento imunologicamente funcional) sob teste evita ou inibe a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência a um antígeno comum (p.ex., Jagged1 ou um seu fragmento). Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva podem ser usados, por exemplo: radioimunoensaio (RIA) direto ou indireto em fase sólida, imunoensaio enzimático (EIA) direto ou indireto em fase sólida, ensaio de competição em sanduíche (ver, p.ex., Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (ver, p.ex., Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619), ensaio marcado direto em fase sólida, ensaio em sanduíche marcado direto em fase sólida (ver, p.ex., Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcador direto em fase sólida usando marcador I-125 (ver, p.ex., Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15); EIA de biotina-avidina direto em fase sólida (ver, p.ex., Cheung, et al., 1990, Virology 176: 546-552); e RIA marcado direto (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82). Tipicamente, um tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células apresentado qualquer um destes, uma proteína de ligação ao antígeno de teste não marcada e uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada. A inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou células na presença da proteína de ligação ao antígeno de teste. Usualmente, a proteína de ligação ao antígeno de teste está presente em excesso. Detalhes adicionais dizendo respeito a métodos para determinação da ligação competitiva são proporcionados nos exemplos aqui. Geralmente, quando uma proteína de ligação ao antígeno competidora está presente em excesso, ela inibirá a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência a um antígeno comum em pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75%. Em alguns casos, a ligação é inibida em pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, ou 97% ou mais.

[0089] O termo “antígeno” se refere a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada por um agente de ligação seletivo, tal como uma proteína de ligação ao antígeno (incluindo, p.ex., um anticorpo) e, adicionalmente, capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de se ligarem a esse antígeno. Um antígeno pode possuir um ou mais epítopos que são capazes de interagir com diferentes proteínas de ligação ao antígeno, p.ex., anticorpos.

[0090] O termo “epítopo” é a porção de uma molécula que é ligada por uma proteína de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo). O termo inclui qualquer determinante capaz de se ligar especificamente a uma proteína de ligação ao antígeno, tal como um anticorpo.

Um epítopo pode ser contíguo ou não contíguo (descontínuo) (p.ex., em um polipeptídeo, resíduos de aminoácidos que não são contíguos um ao outro na sequência de polipeptídeo mas que dentro do contexto da molécula estão ligados pela proteína de ligação ao antígeno). Um epítopo conformacional é um epítopo que existe dentro da conformação de uma proteína ativa mas não está presente em uma proteína desnaturada.

Em certas modalidades, os epítopos podem ser miméticos na medida em que compreendem uma estrutura tridimensional que é similar a um epítopo usado para gerar a proteína de ligação ao antígeno, todavia não compreendem nenhum ou compreendem somente alguns dos resíduos de aminoácidos encontrados em esse epítopo usado para gerar a proteína de ligação ao antígeno.

O mais frequentemente, os epítopos residem em proteínas mas, em alguns casos, podem residir em outros tipos de moléculas, tais como ácidos nucleicos.

Os determinantes de epítopos podem incluir agrupamentos superficiais quimicamente ativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou sulfonila, e podem ter três características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas.

Geralmente, as proteínas de ligação ao antígeno específicas para um antígeno alvo particular reconhecerão preferencialmente um epítopo no antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas.

[0091] Como usado aqui, “substancialmente puro” significa que a espécie de molécula descrita é a espécie predominante presente, isto é, em uma base molar, ela é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na mesma mistura. Em certas modalidades, uma molécula substancialmente pura é uma composição em que a espécie em questão compreende pelo menos 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em outras modalidades, a espécie em questão é purificada até à homogeneidade essencial em que as espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais e, assim, a composição consiste em uma única espécie macromolecular detectável.

[0092] O termo “tratamento” se refere a quaisquer indícios de sucesso no tratamento ou melhoria de uma lesão, patologia ou condição, incluindo qualquer parâmetro objetivo ou subjetivo tal como redução, remissão, diminuição de sintomas ou tornando a lesão, patologia ou condição mais tolerável para o paciente; desaceleração na taxa de degeneração ou declínio; tornar o ponto final de degeneração menos debilitante; melhoria do bem-estar físico ou mental do paciente. O tratamento ou melhoria dos sintomas pode ser baseado em parâmetros objetivos ou subjetivos; incluindo os resultados de um exame físico, exames neuropsiquiátricos e/ou de uma avaliação psiquiátrica.

[0093] Uma “quantidade efetiva” é geralmente uma quantidade suficiente para reduzir a gravidade e/ou a frequência dos sintomas, eliminar os sintomas e/ou causa subjacente, evitar a ocorrência de sintomas e/ou sua causa subjacente e/ou melhorar ou remediar os danos que resultam do ou estão associados ao estado da doença (p.ex., doença pulmonar). Em algumas modalidades, a quantidade eficaz é uma quantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidade profilaticamente eficaz. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade suficiente para remediar um estado de doença ou sintomas, particularmente um estado ou sintomas associados ao estado de doença ou, de outro modo, evitar, impedir, retardar ou reverter a progressão do estado de doença ou qualquer outro sintoma indesejável associado à doença de qualquer forma. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” é uma quantidade de uma composição farmacêutica que, quando administrada a um sujeito, terá o efeito profilático pretendido, p.ex., evitando ou retardando o aparecimento (ou recorrência) do estado de doença ou reduzindo a probabilidade do aparecimento (ou recorrência) do estado de doença ou sintomas associados. O efeito profilático ou terapêutico total não ocorre necessariamente por administração de uma dose e pode ocorrer somente após administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações.

[0094] Os termos “dose terapeuticamente eficaz” e “quantidade terapeuticamente eficaz”, como usados aqui, significam uma quantidade de uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 que provoca uma resposta biológica ou medicinal em um sistema de tecidos, animal ou humano procurada por um investigador, médico ou outro clínico, que inclui alívio ou melhoria dos sintomas da doença ou disfunção sendo tratada, i.e., uma quantidade de uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 que suporta um nível observável de uma ou mais respostas biológicas ou medicinais desejadas, por exemplo, por exemplo níveis reduzidos de mucina armazenada e/ou número reduzido de células caliciformes por volume de epitélio.

[0095] O termo “polinucleotídeo” ou “ácido nucleico” inclui polímeros de nucleotídeos tanto de fita simples quanto de fita dupla. Os nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. As modificações incluem modificações de bases tais como derivados de bromouridina e inosina, modificações de ribose, tais como 2´,3´-didesoxirribose, e modificações de ligações internucleotídeos, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoamidato.

[0096] O termo “oligonucleotídeo” significa um polinucleotídeo compreendendo 200 ou menos nucleotídeos. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos têm 10 a 60 bases em comprimento. Em outras modalidades, os oligonucleotídeos têm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 a 40 nucleotídeos em comprimento. Os oligonucleotídeos podem ter fita simples ou fita dupla, p.ex., para uso na construção de um gene mutante. Os oligonucleotídeos podem ser oligonucleotídeos senso ou antissenso. Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador, incluindo um radiomarcador, um marcador fluorescente, um hapteno ou um marcador antigênico, para ensaios de detecção. Os oligonucleotídeos podem ser usados, por exemplo, como iniciadores de PCR, iniciadores de clonagem ou sondas de hibridação.

[0097] Uma “molécula de ácido nucleico isolada” significa um DNA ou RNA de origem genômica, mRNA, cDNA ou sintética ou alguma sua combinação que não está associada a todo o ou uma porção de um polinucleotídeo no qual o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza ou está ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza. Para propósitos desta divulgação deve ser entendido que “uma molécula de ácido nucleico compreendendo” uma sequência de nucleotídeos particular não engloba cromossomos intactos. As moléculas de ácido nucleico isoladas “compreendendo” sequências de ácido nucleico especificadas podem incluir, adicionalmente às sequências especificadas, sequências codificantes para até dez ou mesmo até vinte outras proteínas ou suas porções ou podem incluir sequências reguladoras operacionalmente ligadas que controlam a expressão da região codificante das sequências de ácido nucleico recitadas e/ou podem incluir sequências de vetor.

[0098] A não ser que especificado de outro modo, a extremidade esquerda de qualquer sequência de polinucleotídeo de fita simples discutida aqui é a extremidade 5´; a direção à esquerda de sequências de polinucleotídeo de fita dupla é referida como a direção 5´. A direção de adição 5´ para 3´ de transcritos de RNA nascentes é referida como a direção de transcrição; as regiões de sequência na fita de DNA tendo a mesma sequência que o transcrito de RNA que são 5´ em relação à extremidade 5´ do transcrito de RNA são referidas como “sequências a montante”; as regiões de sequência na fita de DNA tendo a mesma sequência que o transcrito de RNA que são 3´ em relação à extremidade 3´ do transcrito de RNA são referidas como “sequências a jusante”.

[0099] O termo “sequência de controle” se refere a uma sequência de polinucleotídeo que pode afetar a expressão e processamento das sequências codificantes às quais está ligada. A natureza de tais sequências de controle pode depender do organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, as sequências de controle para procariotas podem incluir um promotor, um local de ligação ribossomal e uma sequência de terminação da transcrição. Por exemplo, as sequências de controle para eucariotas podem incluir promotores compreendendo um ou uma pluralidade de locais de reconhecimento para fatores de transcrição, sequências intensificadoras da transcrição e sequências de terminação da transcrição. As “sequências de controle” podem incluir sequências líderes e/ou sequências de parceiros de fusão.

[0100] O termo “vetor” significa qualquer molécula ou entidade (p.ex., ácido nucleico, plasmídeo, bacteriófago ou vírus) usada para transferir informação codificante de proteína para uma célula hospedeira.

[0101] O termo “vetor de expressão” ou “construto de expressão” se refere a um vetor que é adequado para transformação de uma célula hospedeira e contém sequências de ácido nucleico que dirigem e/ou controlam (em conjunção com a célula hospedeira) a expressão de uma ou mais regiões codificantes heterólogas operacionalmente ligadas às mesmas. Um construto de expressão pode incluir, mas não está limitado a, sequências que afetam ou controlam a transcrição,

tradução, e, se íntrons estiverem presentes, afetam o splicing de RNA de uma região codificante operacionalmente ligada ao mesmo.

[0102] Como usado aqui, “operacionalmente ligado” significa que os componentes aos quais o termo é aplicado estão em uma relação que lhes permite levar a cabo suas funções inerentes sob condições adequadas. Por exemplo, uma sequência de controle em um vetor que está “operacionalmente ligada” a uma sequência codificante de proteína está ligada à mesma tal que a expressão da sequência codificante de proteína seja alcançada sob condições compatíveis com a atividade transcricional das sequências de controle.

[0103] O termo “célula hospedeira” significa uma célula que tenha sido transformada com uma sequência de ácido nucleico e deste modo expressa um gene de interesse. O termo inclui a descendência da célula genitora, quer ou não a descendência seja idêntica em morfologia ou na composição genética à célula genitora original, desde que o gene de interesse esteja presente.

[0104] Os termos “polipeptídeo” ou “proteína” são usados indistintamente aqui para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam também a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo ou mimético de um aminoácido ocorrendo naturalmente correspondente, bem como a polímeros de aminoácidos ocorrendo naturalmente. Os termos podem também englobar polímeros de aminoácidos que tenham sido modificados, p.ex., pela adição de resíduos de carboidrato para formar glicoproteínas, ou fosforilados. Os polipeptídeos e proteínas podem ser produzidos por uma célula ocorrendo naturalmente e não recombinante; ou são produzidos por uma célula geneticamente modificada ou recombinante e compreendem moléculas tendo a sequência de aminoácidos da proteína nativa ou moléculas tendo deleções, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da sequência nativa. Os termos “polipeptídeo” e “proteína” englobam especificamente proteínas de ligação ao antígeno Jagged1, anticorpos ou sequências que têm deleções de, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácidos de uma proteína de ligação ao antígeno. O termo “fragmento de polipeptídeo” se refere a um polipeptídeo que tem uma deleção no terminal amino, uma deleção no terminal carbóxi e/ou uma deleção interna em comparação com a proteína de comprimento total. Tais fragmentos podem também conter aminoácidos modificados em comparação com a proteína de comprimento total. Em certas modalidades, os fragmentos têm cerca de cinco a 500 aminoácidos de comprimento. Por exemplo, os fragmentos podem ter pelo menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ou 450 aminoácidos de comprimento. Fragmentos de polipeptídeos úteis incluem fragmentos imunologicamente funcionais de anticorpos, incluindo domínios de ligação.

[0105] O termo “proteína isolada” significa que uma proteína em questão (1) está isenta de pelo menos algumas outras proteínas com as quais seria normalmente encontrada, (2) está essencialmente isenta de outras proteínas da mesma fonte, p.ex., da mesma espécie, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos cerca de 50 por cento de polinucleotídeos, lipídeos, carboidratos ou outros materiais com os quais está associada na natureza, (5) está operacionalmente associada (por interação covalente ou não covalente) a um polipeptídeo com o qual não está associada na natureza ou (6) não ocorre na natureza. Tipicamente, uma “proteína isolada” constitui pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25% ou pelo menos cerca de 50% de uma dada amostra. DNA genômico, cDNA, mRNA ou outro RNA, de origem sintética, ou qualquer sua combinação podem codificar uma tal proteína isolada. Preferencialmente, a proteína isolada está substancialmente isenta de proteínas ou polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados no seu ambiente natural que interfeririam com seu uso terapêutico, de diagnóstico, profilático, de investigação ou outro.

[0106] Uma “variante” de um polipeptídeo (p.ex., uma proteína de ligação tal como um anticorpo) compreende uma sequência de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos na, deletados da e/ou substituídos na sequência de aminoácidos em relação a outra sequência de polipeptídeo. As variantes incluem proteínas de fusão.

[0107] Um “derivado” de um polipeptídeo é um polipeptídeo (p.ex., uma proteína de ligação ao antígeno tal como um anticorpo) que foi quimicamente modificado de alguma maneira distinta das variantes de inserção, deleção ou substituição, p.ex., através de conjugação a outra fração química.

[0108] O termo “ocorrendo naturalmente”, como usado ao longo do relatório descritivo em conexão com materiais biológicos tais como polipeptídeos, ácidos nucleicos, células hospedeiras e similares, se refere a materiais que são encontrados na natureza.

[0109] Um “sujeito” ou “paciente” como usados aqui podem ser qualquer mamífero. Em uma modalidade típica, o sujeito ou paciente é um humano.

[0110] Como divulgado aqui, um polipeptídeo Jagged1 descrito pela presente divulgação pode ser manipulado e/ou produzido usando metodologia de biologia molecular padrão. Em vários exemplos, uma sequência de ácido nucleico codificando um Jagged1, que pode compreender toda a ou uma porção de SEQ ID NO: 353, pode ser isolada e/ou amplificada a partir de DNA genômico ou cDNA usando iniciadores de oligonucleotídeo apropriados. Os iniciadores podem ser desenhados com base nas sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos proporcionadas aqui de acordo com técnicas de amplificação por (RT)-PCR padrão. O ácido nucleico de Jagged1 amplificado pode ser depois clonado em um vetor adequado e caracterizado por análise da sequência de DNA.

[0111] Os oligonucleotídeos para uso como sondas no isolamento ou amplificação de todas as ou uma porção das sequências de Jagged1 proporcionadas aqui podem ser desenhados e gerados usando técnicas sintéticas padrão, p.ex., dispositivo de síntese de DNA automatizado, ou podem ser isolados a partir de uma sequência mais longa de DNA.

[0112] A sequência de 1218 aminoácidos de Jagged1 humano é:

MRSPRTRGRS GRPLSLLLAL LCALRAKVCG ASGQFELEIL SMQNVNGELQ NGNCCGGARN PGDRKCTRDE CDTYFKVCLK EYQSRVTAGG PCSFGSGSTP VIGGNTFNLK ASRGNDRNRI VLPFSFAWPR SYTLLVEAWD SSNDTVQPDS IIEKASHSGM INPSRQWQTL KQNTGVAHFE YQIRVTCDDY YYGFGCNKFC RPRDDFFGHY ACDQNGNKTC MEGWMGRECN RAICRQGCSP KHGSCKLPGD CRCQYGWQGL YCDKCIPHPG CVHGICNEPW QCLCETNWGG QLCDKDLNYC GTHQPCLNGG TCSNTGPDKY QCSCPEGYSG PNCEIAEHAC LSDPCHNRGS CKETSLGFEC ECSPGWTGPT CSTNIDDCSP NNCSHGGTCQ DLVNGFKCVC PPQWTGKTCQ LDANECEAKP CVNAKSCKNL IASYYCDCLP GWMGQNCDIN INDCLGQCQN DASCRDLVNG YRCICPPGYA GDHCERDIDE CASNPCLDGG HCQNEINRFQ CLCPTGFSGN LCQLDIDYCE PNPCQNGAQC YNRASDYFCK CPEDYEGKNC SHLKDHCRTT PCEVIDSCTV AMASNDTPEG VRYISSNVCG PHGKCKSQSG GKFTCDCNKG FTGTYCHENI NDCESNPCRN GGTCIDGVNS YKCICSDGWE GAYCETNIND CSQNPCHNGG TCRDLVNDFY CDCKNGWKGK TCHSRDSQCD EATCNNGGTC YDEGDAFKCM CPGGWEGTTC NIARNSSCLP NPCHNGGTCV VNGESFTCVC KEGWEGPICA QNTNDCSPHP CYNSGTCVDG DNWYRCECAP GFAGPDCRIN INECQSSPCA FGATCVDEIN GYRCVCPPGH SGAKCQEVSG RPCITMGSVI PDGAKWDDDC NTCQCLNGRI ACSKVWCGPR PCLLHKGHSE CPSGQSCIPI LDDQCFVHPC TGVGECRSSS LQPVKTKCTS DSYYQDNCAN ITFTFNKEMM SPGLTTEHIC SELRNLNILK NVSAEYSIYI ACEPSPSANN EIHVAISAED IRDDGNPIKE ITDKIIDLVS KRDGNSSLIA AVAEVRVQRR PLKNRTDFLV PLLSSVLTVA WICCLVTAFY WCLRKRRKPG SHTHSASEDN TTNNVREQLN QIKNPIEKHG ANTVPIKDYE NKNSKMSKIR THNSEVEEDD MDKHQQKARF AKQPAYTLVD REEKPPNGTP TKHPNWTNKQ

DNRDLESAQS LNRMEYIV (SEQ ID NO: 353) e é codificada pela sequência de DNA: atgcgttccccacggacgcgcggccggtccgggcgccccctaagcctcctgctcgccct gctctgtgccctgcgagccaaggtgtgtggggcctcgggtcagttcgagttggagatcc tgtccatgcagaacgtgaacggggagctgcagaacgggaactgctgcggcggcgcccgg aacccgggagaccgcaagtgcacccgcgacgagtgtgacacatacttcaaagtgtgcct caaggagtatcagtcccgcgtcacggccggggggccctgcagcttcggctcagggtcca cgcctgtcatcgggggcaacaccttcaacctcaaggccagccgcggcaacgaccgcaac cgcatcgtgctgcctttcagtttcgcctggccgaggtcctatacgttgcttgtggaggc gtgggattccagtaatgacaccgttcaacctgacagtattattgaaaaggcttctcact cgggcatgatcaaccccagccggcagtggcagacgctgaagcagaacacgggcgttgcc cactttgagtatcagatccgcgtgacctgtgatgactactactatggctttggctgcaa taagttctgccgccccagagatgacttctttggacactatgcctgtgaccagaatggca acaaaacttgcatggaaggctggatgggccgcgaatgtaacagagctatttgccgacaa ggctgcagtcctaagcatgggtcttgcaaactcccaggtgactgcaggtgccagtacgg ctggcaaggcctgtactgtgataagtgcatcccacacccgggatgcgtccacggcatct gtaatgagccctggcagtgcctctgtgagaccaactggggcggccagctctgtgacaaa gatctcaattactgtgggactcatcagccgtgtctcaacgggggaacttgtagcaacac aggccctgacaaatatcagtgttcctgccctgaggggtattcaggacccaactgtgaaa ttgctgagcacgcctgcctctctgatccctgtcacaacagaggcagctgtaaggagacc tccctgggctttgagtgtgagtgttccccaggctggaccggccccacatgctctacaaa cattgatgactgttctcctaataactgttcccacgggggcacctgccaggacctggtta acggatttaagtgtgtgtgccccccacagtggactgggaaaacgtgccagttagatgca aatgaatgtgaggccaaaccttgtgtaaacgccaaatcctgtaagaatctcattgccag ctactactgcgactgtcttcccggctggatgggtcagaattgtgacataaatattaatg actgccttggccagtgtcagaatgacgcctcctgtcgggatttggttaatggttatcgc tgtatctgtccacctggctatgcaggcgatcactgtgagagagacatcgatgaatgtgc cagcaacccctgtttggatgggggtcactgtcagaatgaaatcaacagattccagtgtc tgtgtcccactggtttctctggaaacctctgtcagctggacatcgattattgtgagcct aatccctgccagaacggtgcccagtgctacaaccgtgccagtgactatttctgcaagtg ccccgaggactatgagggcaagaactgctcacacctgaaagaccactgccgcacgaccc cctgtgaagtgattgacagctgcacagtggccatggcttccaacgacacacctgaaggg gtgcggtatatttcctccaacgtctgtggtcctcacgggaagtgcaagagtcagtcggg aggcaaattcacctgtgactgtaacaaaggcttcacgggaacatactgccatgaaaata ttaatgactgtgagagcaacccttgtagaaacggtggcacttgcatcgatggtgtcaac tcctacaagtgcatctgtagtgacggctgggagggggcctactgtgaaaccaatattaa tgactgcagccagaacccctgccacaatgggggcacgtgtcgcgacctggtcaatgact tctactgtgactgtaaaaatgggtggaaaggaaagacctgccactcacgtgacagtcag tgtgatgaggccacgtgcaacaacggtggcacctgctatgatgagggggatgcttttaa gtgcatgtgtcctggcggctgggaaggaacaacctgtaacatagcccgaaacagtagct gcctgcccaacccctgccataatgggggcacatgtgtggtcaacggcgagtcctttacg tgcgtctgcaaggaaggctgggaggggcccatctgtgctcagaataccaatgactgcag ccctcatccctgttacaacagcggcacctgtgtggatggagacaactggtaccggtgcg aatgtgccccgggttttgctgggcccgactgcagaataaacatcaatgaatgccagtct tcaccttgtgcctttggagcgacctgtgtggatgagatcaatggctaccggtgtgtctg ccctccagggcacagtggtgccaagtgccaggaagtttcagggagaccttgcatcacca tggggagtgtgataccagatggggccaaatgggatgatgactgtaatacctgccagtgc ctgaatggacggatcgcctgctcaaaggtctggtgtggccctcgaccttgcctgctcca caaagggcacagcgagtgccccagcgggcagagctgcatccccatcctggacgaccagt gcttcgtccacccctgcactggtgtgggcgagtgtcggtcttccagtctccagccggtg aagacaaagtgcacctctgactcctattaccaggataactgtgcgaacatcacatttac ctttaacaaggagatgatgtcaccaggtcttactacggagcacatttgcagtgaattga ggaatttgaatattttgaagaatgtttccgctgaatattcaatctacatcgcttgcgag ccttccccttcagcgaacaatgaaatacatgtggccatttctgctgaagatatacggga tgatgggaacccgatcaaggaaatcactgacaaaataattgatcttgttagtaaacgtg atggaaacagctcgctgattgctgccgttgcagaagtaagagttcagaggcggcctctg aagaacagaacagatttccttgttcccttgctgagctctgtcttaactgtggcttggat ctgttgcttggtgacggccttctactggtgcctgcggaagcggcggaagccgggcagcc acacacactcagcctctgaggacaacaccaccaacaacgtgcgggagcagctgaaccag atcaaaaaccccattgagaaacatggggccaacacggtccccatcaaggattacgagaa caagaactccaaaatgtctaaaataaggacacacaattctgaagtagaagaggacgaca tggacaaacaccagcagaaagcccggtttgccaagcagccggcgtatacgctggtagac agagaagagaagccccccaacggcacgccgacaaaacacccaaactggacaaacaaaca ggacaacagagacttggaaagtgcccagagcttaaaccgaatggagtacatcgtatag (SEQ ID NO: 354).

[0113] Como afirmado aqui, o termo “polipeptídeo Jagged1” engloba sequências de polipeptídeo Jagged1 ocorrendo naturalmente, p.ex., sequência de aminoácidos humana SEQ ID NO: 353. O termo “polipeptídeo Jagged1”, no entanto, engloba também polipeptídeos compreendendo uma sequência de aminoácidos que difere da sequência de aminoácidos de uma sequência de polipeptídeo Jagged1 ocorrendo naturalmente, por um ou mais aminoácidos, tal que a sequência seja pelo menos 85% idêntica a SEQ ID NO: 353. Os polipeptídeos Jagged1 podem ser gerados por introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos, quer conservativas ou não conservativas e usando aminoácidos ocorrendo naturalmente ou não ocorrendo naturalmente, em posições particulares do polipeptídeo Jagged1.

[0114] Uma “substituição de aminoácidos conservativa” pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo (i.e., um resíduo encontrado em uma dada posição da sequência de polipeptídeo Jagged1 de tipo selvagem) por um resíduo não nativo (i.e., um resíduo que não é encontrado em uma dada posição da sequência de polipeptídeo Jagged1 de tipo selvagem) tal que exista pouco ou nenhum efeito na polaridade ou carga do resíduo de aminoácido em essa posição. As substituições de aminoácidos conservativas englobam também resíduos de aminoácidos não ocorrendo naturalmente que são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeos em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de frações de aminoácidos.

[0115] Os resíduos ocorrendo naturalmente podem ser divididos em classes com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: Asn, Gln, His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0116] Grupos adicionais de aminoácidos podem ser também formulados usando os princípios descritos em, p.ex., Creighton (1984) PROTEINS: STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES (2ª Ed. 1993), W.H. Freeman and Company. Em alguns casos pode ser útil caracterizar adicionalmente as substituições com base em duas ou mais de tais características (p.ex., a substituição por um resíduo “polar pequeno”, tal como um resíduo de Thr, pode representar uma substituição altamente conservativa em um contexto apropriado).

[0117] As substituições conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por outro membro da mesma classe. As substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma destas classes por um membro de outra classe.

[0118] Os resíduos de aminoácidos sintéticos, raros ou modificados tendo propriedades físico-químicas similares àquelas de um agrupamento acima descrito podem ser usados como um substituto “conservativo” para um resíduo de aminoácido particular em uma sequência. Por exemplo, um resíduo de D-Arg pode servir como um substituto para um resíduo de L-Arg típico. Pode ser também o caso que uma substituição particular possa ser descrita em termos de duas ou mais das classes acima descritas (p.ex., uma substituição por um resíduo pequeno e hidrofóbico significa substituição de um aminoácido por um resíduo(s) que é(são) encontrado(s) em ambas as classes acima descritas ou outros resíduos sintéticos, raros ou modificados que são conhecidos na técnica como tendo propriedades físico-químicas similares a tais resíduos cumprindo ambas as definições).

[0119] Sequências de ácido nucleico codificando um polipeptídeo Jagged1 proporcionado aqui, incluindo aquelas degeneradas em relação a SEQ ID NO: 354 e aquelas codificando variantes de polipeptídeo de SEQ ID NO: 353, formam outros aspectos da presente divulgação.

[0120] De modo a expressar as sequências de ácido nucleico de Jagged1 proporcionadas aqui, a sequência codificante apropriada, p.ex., SEQ ID NO: 354, pode ser clonada em um vetor adequado e, após introdução em um hospedeiro adequado, a sequência pode ser expressa para produzir o polipeptídeo codificando de acordo com técnicas de clonagem e expressão padrão, que são conhecidas na técnica (p.ex., como descrito em Sambrook, J., Fritsh, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989). A invenção se relaciona também com tais vetores compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção.

[0121] Um “vetor” se refere a um veículo de administração que (a) promove a expressão de uma sequência de ácido nucleico codificando polipeptídeo; (b) promove a produção do polipeptídeo a partir daí; (c) promove a transfecção/transformação de células alvo com elas; (d) promove a replicação da sequência de ácido nucleico; (e) promove a estabilidade do ácido nucleico; (f) promove a detecção do ácido nucleico e/ou células transformadas/transfectadas; e/ou (g) confere de outro modo função biológica e/ou físico-química vantajosa ao ácido nucleico codificando polipeptídeo. Um vetor pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácido nucleico cromossômico, não cromossômico e sintético (uma sequência de ácido nucleico compreendendo um conjunto adequado de elementos de controle da expressão). Exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fagos, baculovírus, plasmídeos de leveduras, vetores derivados de combinações de plasmídeos e DNA de fago e vetores de ácido nucleico (RNA ou DNA) viral.

[0122] Um vetor de expressão recombinante pode ser desenhado para expressão de uma proteína Jagged1 em células procarióticas (p.ex., E. coli) ou eucarióticas (p.ex., células de inseto, usando vetores de expressão de baculovírus, células de levedura ou células de mamífero). Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula hospedeira não humana, de mamífero. Células hospedeiras representativas incluem aqueles hospedeiros tipicamente usados para clonagem e expressão, incluindo estirpes de Escherichia coli TOP10F’, TOP10, DH10B, DH5a, HB101, W3110, BL21 (DE3) e BL21 (DE3) pLysS, BLUESCRIPT (Stratagene), linhas de células de mamíferos CHO, vetores CHO-K1, HEK293, 293-EBNA pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989); vetores pET (Novagen, Madison Wis.). Alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode ser transcrito e traduzido in vitro, por exemplo usando sequências reguladoras do promotor T7 e T7 polimerase e um sistema de tradução in vitro. Preferencialmente, o vetor contém um promotor a montante do local de clonagem contendo a sequência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo. Exemplos de promotores, que podem ser ligados e desligados, incluem o promotor lac, o promotor T7, o promotor trc, o promotor tac e o promotor trp.

[0123] Assim são proporcionados aqui vetores compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando Jagged1 que facilita a expressão de Jagged1 recombinante. Em várias modalidades, os vetores compreendem uma sequência de nucleotídeos operacionalmente ligada que regula a expressão de Jagged1. Um vetor pode compreender ou estar associado a qualquer promotor, intensificador e outros elementos facilitadores da expressão adequados. Exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão fortes (p.ex., um promotor/intensificador de IE de CMV humano, um promotor de RSV, promotor de SV40, promotor de SL3-3, promotor de MMTV ou promotor de LTR de HIV, promotor de EF1alfa, promotor de CAG), sequências de terminação de poli(A) efetivas, uma origem de replicação para o produto de plasmídeo em E. coli, um gene de resistência a antibióticos tal como um marcador selecionável e/ou um local de clonagem conveniente (p.ex., um poliligante). Os vetores podem também compreender um promotor indutível em oposição a um promotor constitutivo tal como IE de CMV. Em um aspecto é proporcionado um ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando um polipeptídeo Jagged1 que está operacionalmente ligada a um promotor específico do tecido que promove a expressão da sequência em um tecido metabolicamente relevante, tal como tecido de fígado ou pancreático.

[0124] Em outro aspecto da presente divulgação são proporcionadas células hospedeiras compreendendo os ácidos nucleicos e vetores de Jagged1 divulgados aqui. Em várias modalidades, o vetor ou ácido nucleico é integrado no genoma da célula hospedeira, que em outras modalidades o vetor ou ácido nucleico é extracromossômico.

[0125] Células recombinantes, tais como células de levedura, bacterianas (p.ex., E. coli) e de mamífero (p.ex., células imortalizadas de mamíferos) compreendendo um tal ácido nucleico, vetor ou combinações de qualquer una destas ou ambas são proporcionadas. Em várias modalidades são proporcionadas células compreendendo um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagemídeo ou elemento de expressão linear, que compreende uma sequência codificando a expressão de um polipeptídeo Jagged1.

[0126] Um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo Jagged1 proporcionado aqui pode ser introduzido em uma célula hospedeira por transformação ou por transfecção. Métodos de transformação de uma célula com um vetor de expressão são bem conhecidos.

[0127] Um ácido nucleico codificando Jagged1 pode ser posicionado em e/ou administrado a uma célula hospedeira ou animal hospedeiro através de um vetor viral. Qualquer vetor viral adequado pode ser usado em esta capacidade. Um vetor viral pode compreender qualquer número de polinucleotídeos virais, sozinhos ou em combinação com uma ou mais proteínas virais, que facilitam a administração, replicação e/ou expressão do ácido nucleico da invenção em uma célula hospedeira desejada. O vetor viral pode ser um polinucleotídeo compreendendo a totalidade ou parte de um genoma viral, um conjugado proteína viral/ácido nucleico, uma partícula tipo vírus (VLP) ou uma partícula de vírus intacta compreendendo ácidos nucleicos virais e um ácido nucleico codificando um polipeptídeo Jagged1. Um vetor viral de partícula viral pode compreender uma partícula viral de tipo selvagem ou uma partícula viral modificada. O vetor viral pode ser um vetor que requer a presença de outro vetor ou vírus de tipo selvagem para replicação e/ou expressão (p.ex., um vetor viral pode ser um vírus dependente de auxiliar), tal como um amplicon de vetor adenoviral. Tipicamente, tais vetores virais consistem em uma partícula viral de tipo selvagem ou uma partícula viral modificada no seu conteúdo de proteínas e/ou ácidos nucleicos para aumentar a capacidade de transgene ou auxiliar na transfecção e/ou expressão do ácido nucleico (exemplos de tais vetores incluem amplicons do vírus do herpes/AAV). Tipicamente, um vetor viral é similar e/ou derivado de um vírus que infecta normalmente humanos. Partículas de vetor viral adequadas a este respeito incluem, por exemplo, partículas de vetor adenoviral (incluindo qualquer vírus de ou derivado de um vírus dos Adenoviridae), partículas de vetor viral adenoassociado (partículas de vetor AAV) ou outros parvovírus e partículas de vetor parvoviral, partículas de vetor papilomaviral, vetores flavivirais, vetores alfavirais, vetores virais do herpes, vetores de poxvírus, vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais.

[0128] Um polipeptídeo Jagged1 expresso como descrito aqui pode ser isolado usando métodos de purificação de proteína padrão. Um polipeptídeo Jagged1 pode ser isolado a partir de uma célula na qual é naturalmente expresso ou pode ser isolado a partir de uma célula que foi manipulada para expressar Jagged1, por exemplo uma célula que não expressa naturalmente Jagged1.

[0129] Métodos de purificação de proteínas que podem ser empregues para isolar um polipeptídeo Jagged1, bem como materiais e reagentes associados, são conhecidos na técnica.

Métodos de purificação adicionais que podem ser úteis para isolamento de um polipeptídeo Jagged1 podem ser encontrados em referências tais como Bootcov MR, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11514-9, Fairlie WD, 2000, Gene 254: 67-76.

[0130] Proteínas de ligação ao antígeno antagonistas que se ligam a Jagged1, incluindo Jagged1 humano (hJagged1), são proporcionadas aqui. Em uma modalidade, o Jagged1 humano tem a sequência tal como apresentada em SEQ ID NO: 353.

[0131] As proteínas de ligação ao antígeno proporcionadas são polipeptídeos nos quais uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDR), como descritas aqui, estão embebidas e/ou unidas. Em algumas proteínas de ligação ao antígeno, as CDR estão embebidas em uma região de “arcabouço”, que orienta a(s) CDR(s) tal que as propriedades de ligação ao antígeno apropriadas da(s) CDR(s) sejam alcançadas. Certas proteínas de ligação ao antígeno descritas aqui são anticorpos ou são derivadas de anticorpos. Em outras proteínas de ligação ao antígeno, as sequências de CDR estão embebidas em um tipo diferente de molde de proteína. As várias estruturas são adicionalmente descritas em baixo.

[0132] As proteínas de ligação ao antígeno que são divulgadas aqui têm uma variedade de utilidades. As proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, são úteis em ensaios de ligação específica, purificação por afinidade de Jagged1 e em ensaios de rastreamento para identificar outros antagonistas da atividade de Jagged1. Outros usos para as proteínas de ligação ao antígeno incluem, por exemplo, diagnóstico de doenças ou condições associadas a Jagged1 e ensaios de rastreamento para determinar a presença ou ausência de Jagged1. Dado que as proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas são antagonistas, as proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 têm valor em métodos terapêuticos nos quais são úteis para tratar doença pulmonar, reduzir os níveis de mucina e reduzir os níveis de células caliciformes. Conformemente, em um aspecto, a presente invenção está dirigida a um método inibindo a diferenciação de células secretoras em um sujeito, compreendendo o método administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente a uma proteína tendo a sequência de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO: 353. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno compreende as CDRS e/ou o VH e VL divulgados no presente pedido.

[0133] Uma variedade de agentes de ligação seletivos úteis para modulação da atividade de Jagged1 é proporcionada. Estes agentes incluem, por exemplo, proteínas de ligação ao antígeno que contêm um domínio de ligação ao antígeno (p.ex., scFvs, anticorpos de domínio e polipeptídeos com uma região de ligação ao antígeno) e se ligam especificamente a um polipeptídeo Jagged1, em particular Jagged1 humano.

[0134] Em geral, as proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas compreendem tipicamente uma ou mais CDR como descritas aqui (p.ex., 1, 2, 3, 4, 5 ou 6). Em alguns casos, a proteína de ligação ao antígeno compreende (a) uma estrutura de polipeptídeo e (b) uma ou mais CDR que estão inseridas na e/ou unidas à estrutura de polipeptídeo. A estrutura de polipeptídeo pode tomar uma variedade de formas diferentes. Por exemplo pode ser, ou compreender, o arcabouço de um anticorpo ocorrendo naturalmente, ou seu fragmento ou variante, ou pode ter natureza completamente sintética. Exemplos de várias estruturas de polipeptídeo são adicionalmente descritas em baixo.

[0135] Em certas modalidades, a estrutura de polipeptídeo das proteínas de ligação ao antígeno é um anticorpo ou é derivada de um anticorpo. Conformemente, exemplos de certas proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas incluem, mas não estão limitados a, anticorpos monoclonais, anticorpos biespecíficos, minicorpos, anticorpos de domínio tais como Nanobodies®, anticorpos sintéticos (por vezes referidos aqui como “miméticos de anticorpos”), anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, anticorpos humanos, fusões de anticorpos, e porções ou fragmentos de cada um, respectivamente. Em alguns casos, a proteína de ligação ao antígeno é um fragmento imunológico de um anticorpo completo (p.ex., um Fab, um Fab´, um F(ab´)2). Em outros casos, a proteína de ligação ao antígeno é um scFv que usa CDR de um anticorpo da presente invenção.

[0136] Em uma modalidade, uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 tem uma ou mais das seguintes atividades: (a) se liga a Jagged1 humano tal que a KD seja ≤ 200 nM, seja ≤ 150 nM, seja ≤ 100 nM, seja ≤ 50 nM, seja ≤ 10 nM, seja ≤ 5 nM, seja ≤ 2 nM ou seja ≤ 1 nM, p.ex., como medido através de uma técnica de ressonância de plasma de superfície ou ensaio de exclusão cinética. (b) tem uma meia-vida no soro humano de pelo menos 3 dias;

[0137] Algumas proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas têm uma taxa de associação (ka) para Jagged1 de pelo menos 104/ M x segundos, pelo menos 105/M x segundos ou pelo menos 106/M x segundos como medida, por exemplo, como descrito em baixo. Certas proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas têm uma taxa de dissociação ou taxa de exclusão lenta. Algumas proteínas de ligação ao antígeno, por exemplo, têm uma kd (taxa de dissociação) de 1 x 10-2 s- 1 ou 1 x 10-3 s-1 ou 1 x 10-4 s-1 ou 1 x 10-5 s-1. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno tem uma KD (afinidade de ligação em equilíbrio) de menos do que 25 pM, 50 pM, 100 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM ou 50 nM.

[0138] Dependendo do ensaio, a ligação de uma proteína de ligação ao antígeno ao seu alvo pode ser também medida como uma EC50 (a concentração de proteína de ligação ao antígeno que dá uma resposta semimáxima quando ligada ao alvo). Uma EC50 para uma proteína de ligação ao antígeno anti-Jagged1 da presente invenção pode ser determinada por incubação de diferentes concentrações de proteína de ligação ao antígeno com células expressando Jagged1. As proteínas de ligação ao antígeno anti-Jagged1 da presente invenção podem ter EC50s menores que 200 nM, 150nM, 125 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM ou 30 nM.

[0139] Uma IC50 (a concentração inibidora semimáxima: uma medida da eficácia de uma proteína de ligação ao antígeno na inibição de uma função biológica ou bioquímica específica) pode ser também usada para medir a atividade de proteína de ligação ao antígeno anti-Jagged1. Uma IC50 pode ser medida usando um ensaio funcional. Por exemplo, o ligante Jagged1 ligado a células ou solúvel pode ser usado para ativar um receptor Notch expresso por uma célula em que a ativação da via do receptor Notch pode ser medida usando um gene repórter, tal como luciferase. Em uma modalidade, o receptor

Notch expresso pela célula repórter é Notch 2. As proteínas de ligação ao antígeno anti-Jagged1 da presente invenção podem ter IC50s menores que 200 nM, 150nM, 125 nM, 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM ou 2 nM.

[0140] Em outro aspecto é proporcionada uma proteína de ligação ao antígeno tendo uma meia-vida de pelo menos um dia in vitro ou in vivo (p.ex., quando administrada a um sujeito humano). Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno tem uma meia-vida de pelo menos três dias. Em várias outras modalidades, a proteína de ligação ao antígeno tem uma meia- vida de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 ou 60 dias ou mais. Em outra modalidade, a proteína de ligação ao antígeno é derivatizada ou modificada tal que tenha uma meia- vida mais longa em comparação com o anticorpo não derivado ou não modificado. Em outra modalidade, a proteína de ligação ao antígeno contém mutações pontuais para aumentar a meia- vida no soro. Detalhes adicionais dizendo respeito a tais formas mutantes e derivadas são proporcionados em baixo.

[0141] Algumas das proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas têm a estrutura tipicamente associada a anticorpos ocorrendo naturalmente. As unidades estruturais destes anticorpos compreendem tipicamente um ou mais tetrâmeros, cada um composto por dois casais idênticos de cadeias de polipeptídeo, embora algumas espécies de mamíferos produzam também anticorpos tendo somente uma cadeia pesada única. Em um anticorpo típico, cada par ou casal inclui uma cadeia “leve” de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 25 kDa) e uma cadeia “pesada” de comprimento total (em certas modalidades, cerca de 50-70 kDa). Cada cadeia de imunoglobulina individual é composta por vários “domínios de imunoglobulina”, cada um consistindo em aproximadamente 90 a 110 aminoácidos e expressando um padrão de dobragem característico.

Estes domínios são as unidades básicas das quais os polipeptídeos de anticorpos são compostos.

A porção amino-terminal de cada cadeia inclui tipicamente um domínio variável que é responsável pelo reconhecimento do antígeno.

A porção carbóxi-terminal é mais conservada evolutivamente do que a outra extremidade da cadeia e é referida como a “região constante” ou “região C”. As cadeias leves humanas são geralmente classificadas como cadeias leves kappa e lambda, e cada uma destas contém um domínio variável e um domínio constante.

As cadeias pesadas são classificadas como cadeias mu, delta, gama, alfa ou épsilon e estas definem o isotipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente.

A IgG tem vários subtipos, incluindo, mas não se limitando a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Os subtipos de IgM incluem IgM, e IgM2. Os subtipos de IgA incluem IgA1 e IgA2. Em humanos, os isotipos IgA e IgD contêm quatro cadeias pesadas e quatro cadeias leves; os isotipos IgG e IgE contêm duas cadeias pesadas e duas cadeias leves; e o isotipo IgM contém cinco cadeias pesadas e cinco cadeias leves.

A região C da cadeia pesada compreende tipicamente um ou mais domínios que podem ser responsáveis pela função efetora.

O número de domínios da região constante da cadeia pesada dependerá do isotipo.

As cadeias pesadas de IgG, por exemplo, contêm cada uma três domínios da região C conhecidos como CH1, CH2 e CH3. Os anticorpos que são proporcionados podem ter qualquer um destes isotipos e subtipos.

Em certas modalidades, o anticorpo para Jagged1 é do subtipo IgG1, IgG2, ou IgG4. Os termos “anticorpo para Jagged1” e “anticorpo anti-Jagged1” são usados indistintamente ao longo deste pedido e figuras. Ambos os termos se referem a um anticorpo que se liga a Jagged1.

[0142] Nas cadeias leves e pesadas de comprimento total, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região “J” de cerca de doze ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada incluindo também uma região “D” de cerca de dez aminoácidos mais. Ver, p.ex., Fundamental Immunology, 2ª ed., Cap. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press (deste modo incorporado por referência na sua totalidade para todos os propósitos). As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam tipicamente o local de ligação ao antígeno.

[0143] Para os anticorpos proporcionados aqui, as regiões variáveis das cadeias de imunoglobulina exibem geralmente a mesma estrutura global, compreendendo regiões de arcabouço (FR) relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, mais frequentemente chamadas “regiões determinantes da complementaridade” ou CDR. As CDR das duas cadeias de cada par cadeia pesada/cadeia leve mencionadas acima estão tipicamente alinhadas pelas regiões de arcabouço para formar uma estrutura que se liga especificamente a um epítopo específico em Jagged1. De N-terminal para C- terminal, as regiões variáveis de cadeia leve e pesada ocorrendo naturalmente se conformam ambas tipicamente com a seguinte ordem destes elementos: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Um sistema de numeração foi concebido para atribuição de números a aminoácidos que ocupam posições em cada um destes domínios. Este sistema de numeração é definido em Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 e 1991, NIH, Bethesda, Md.) ou Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883.

[0144] A informação da sequência para anticorpos específicos preparados e identificados como descrito nos Exemplos em baixo está resumida na TABELA 1. Assim, em uma modalidade, uma proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo com sequências de CDR, domínio variável e cadeia leve e pesada como especificadas em uma das linhas da TABELA

1.

[0145] Foram atribuídas SEQ ID NOs a sequências de cadeia leve variável, cadeia pesada variável, cadeia leve, cadeia pesada, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3 dos anticorpos e seus fragmentos da presente invenção e estas são mostradas na TABELA 1. Foram também atribuídas SEQ ID NOs a polinucleotídeos codificando as sequências de cadeia leve variável, cadeia pesada variável, cadeia leve, cadeia pesada, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3 dos anticorpos e seus fragmentos da presente invenção e estas são mostradas na TABELA 2. As proteínas de ligação ao antígeno da presente invenção podem ser identificadas por SEQ ID NO, mas também por nome de construto (p.ex., 15D11.1) ou número identificador (p.ex., iPS:480499).

[0146] As várias regiões variáveis da cadeia leve e cadeia pesada proporcionadas aqui são ilustradas na TABELA 3. Cada uma destas regiões variáveis pode ser anexada a uma região constante de cadeia pesada ou leve para formar uma cadeia pesada e leve de anticorpo completa, respectivamente. Além disso, cada uma das sequências de cadeia pesada e leve assim geradas pode ser combinada para formar uma estrutura de anticorpo completa.

Tabela 1. SEQ ID NOs. de Aminoácidos # de Ref Anticorpo VL VH CDRL1 CDRL2 CDRL3 CDRH1 CDRH2 CDRH3 iPS:480496 17B3,1 267 268 4 5 6 136 137 138 iPS:480499 15D11,1 271 272 10 11 12 142 143 144 iPS:480522 4F5,1 275 276 16 17 18 148 149 150 iPS:481499 1A12,1 279 280 22 23 24 154 155 156 iPS:480526 6B1,1 283 284 28 29 30 160 161 162 iPS:480529 1G9,1 287 288 34 35 36 166 167 168 iPS:480533 6E12,1 291 292 40 41 42 172 173 174 iPS:480548 9G5,1 295 296 46 47 48 178 179 180 iPS:480551 5A12,1 299 300 52 53 54 184 185 186 iPS:480555 6B11,1 303 304 58 59 60 190 191 192 iPS:480558 8C8,1 307 308 64 65 66 196 197 198 iPS:480561 8G12,1 311 312 70 71 72 202 203 204 iPS:480572 9D3,1_LC1 315 316 76 77 78 208 209 210 iPS:480573 9D3,1_LC2 319 320 82 83 84 214 215 216 iPS:481500 6C9,1 323 324 88 89 90 220 221 222 iPS:481501 4E2,1 327 328 94 95 96 226 227 228 iPS:481983 3D5,1 331 332 100 101 102 232 233 234 iPS:481984 5D11,1 335 336 106 107 108 238 239 240 iPS:481989 1H1,1 339 340 112 113 114 244 245 246 iPS:480570 9E8,1 343 344 118 119 120 250 251 252 iPS:480538 2B6,1 347 348 124 125 126 256 257 258 iPS:480569 1D2,1 351 352 130 131 132 262 263 264

Tabela 2. SEQ ID NOs. de Ácidos Nucleicos # de Ref Anticorp VL VH CDRL CDRL CDRL CDRH CDRH CDRH o 1 2 3 1 2 3 iPS:48049 26 26 1 2 3 133 134 135 17B3,1 6 5 6 iPS:48049 26 27 7 8 9 139 140 141 15D11,1 9 9 0 iPS:48052 27 27 13 14 15 145 146 147 4F5,1 2 3 4 iPS:48149 27 27 19 20 21 151 152 153 1A12,1 9 7 8 iPS:48052 28 28 25 26 27 157 158 159 6B1,1 6 1 2 iPS:48052 28 28 31 32 33 163 164 165 1G9,1 9 5 6 iPS:48053 28 29 37 38 39 169 170 171 6E12,1 3 9 0 iPS:48054 29 29 43 44 45 175 176 177 9G5,1 8 3 4 iPS:48055 29 29 49 50 51 181 182 183 5A12,1 1 7 8 iPS:48055 30 30 55 56 57 187 188 189 6B11,1 5 1 2 iPS:48055 30 30 61 62 63 193 194 195 8C8,1 8 5 6 iPS:48056 30 31 67 68 69 199 200 201 8G12,1 1 9 0 iPS:48057 9D3,1_LC 31 31 73 74 75 205 206 207 2 1 3 4 iPS:48057 9D3,1_LC 31 31 79 80 81 211 212 213 3 2 7 8 iPS:48150 32 32 85 86 87 217 218 219 6C9,1 0 1 2 iPS:48150 32 32 91 92 93 223 224 225 4E2,1 1 5 6 iPS:48198 32 33 97 98 99 229 230 231 3D5,1 3 9 0 iPS:48198 33 33 103 104 105 235 236 237 5D11,1 4 3 4 iPS:48198 33 33 109 110 111 241 242 243 1H1,1 9 7 8 iPS:48057 34 34 115 116 117 247 248 249 9E8,1 0 1 2 iPS:48053 34 34 121 122 123 253 254 255 2B6,1 8 5 6 iPS:48056 34 35 127 128 129 259 260 261 1D2,1 9 9 0

Tabela 3. Regiões Leves Variáveis e Pesadas Variáveis Exemplificativos: Sequências de Ácidos Nucleicos (“NA”) e Aminoácidos (“AA”)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG ATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GAGACAGAGTCACCATCACTTGT GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA CGGGCGAGTCAGGGTATTAGCGA GCGTCTGGATTCACCTTCAGTAG CTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGA TTATGGCATGCACTGGGTCCGCC AACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTC AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG CTGATCTTTGCTGCATCCAGTTT TGGGTGGCAGTTATATGGTATGA GCAAAGTGGGGTCCCATCCAGGT TGGAAGTAATGAATACTATGCAG NA TCAGCGGCAGTGAATCTGGGACA ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC

GATTTCACTCTCACCATCAGCAG ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA iPS:480496

CCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAA CACGCTGTATCTGCAAATGAACA 17B3,1

CTTACTATTGTCAACAGGCTAAC GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT AGTTTCCCGATCACCTTCGGCCA GTGTATTACTGTGCGAGACATGA AGGGACACGACTGGAGATTCAA CCACAGTCACTACGGTTTTGACT ACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC

ACCGTATCCTCA (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 2)

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RASQGISDWLAWYQQKPGKAPKL ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE LIFAASSLQSGVPSRFSGSESGT WVAVIWYDGSNEYYADSVKGRFT AA DFTLTISSLQPEDFATYYCQQAN ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA SFPITFGQGTRLEIQ VYYCARHDHSHYGFDYWGQGTLV

TVSS (SEQ ID NO: 3) (SEQ ID NO: 4)

CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG CTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGAC TCCTGTGCTGGTGAAACCCACAG AGTCGATCACCATCTCCTGCACT AGACCCTCACGCTGACCTGCACC GGAACCAGCAGTGCCGTTGGTGG GTCTCTGGGTTCTCACTCAGCAA TCATAACTTTGTCTCCTGGTACC TGCTGAAATGGGTGTGAGCTGGA AACAGTACCCAGGCAAAGCCCCC TCCGTCAGCCCCCAGGGAAGGCC AAACTCATGATTTATGAGGTCAG CTGGAGTGGCTTGCACACCTTTT TAATCGGCCCTCAGGGGTTTCTA TTCGAATGACGAAAAATCCTACA NA CTCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCT GCACATCTCTGAAGAGCAGGCTC

GGCAACACGGCCTCCCTGACCAT ACCATCTCCAAGGACACCTCCAA iPS:480499

CTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACG AAGCCAGGTGGTCCTTACCATGA 15D11,1

AGGCTGATTATTACTGCAGCTCT CCGACCTGGACCCTGTGGACACA TATACAAGCAGCAGCACTTGGGT GCCACCTATTACTGTGCACGGTC GTTCGGCGGAGGGACCAGGCTGA GTTTAACTGGAACTACGACTTTG CCGTCCTA ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6)

QSALTQPASVSGSPGQSITISCT QVTLKESGPVLVKPTETLTLTCT GTSSAVGGHNFVSWYQQYPGKAP VSGFSLSNAEMGVSWIRQPPGKA KLMIYEVSNRPSGVSTRFSGSKS LEWLAHLFSNDEKSYSTSLKSRL AA GNTASLTISGLQAEDEADYYCSS TISKDTSKSQVVLTMTDLDPVDT YTSSSTWVFGGGTRLTVL ATYYCARSFNWNYDFDYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 7) (SEQ ID NO: 8)

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCC CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGG iPS:480522

AGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG 4F5,1

GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT NA AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG CAACTTAGCCTGGTACCAGCAGA TGGTAGTTACTACTGGGGCTGGA AAGCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC TCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGG CTCATCGATGGTGCATCCACCAG CTGGAGTGGATTGGGAGTATCTA GGCCACTGGCATAACAGCCAGGT TTATGGTGGGAACACCTACTACA TCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTC GAGTTCACTCTCACCATCAGCAG ACCATATCCATAGACACGTCCAA CCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA TTTATTACTGTCAGCAGTATAAT GCTCTGTGACCGCCGCAGACACG AACTGGCCTACTTTCGGCCCTGG GCTGTGTATTACTGTGCGGGAGA GACCAAAGTGGATATCAAA ACTGCGGAGGGCTTTTGATATCT GGGGCCAAGGGACAATGGTCACC

GTCTCTTCA (SEQ ID NO: 9) (SEQ ID NO: 10)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCT RASQSVRSNLAWYQQKAGQAPRL VSGGSISSGSYYWGWIRQPPGKG LIDGASTRATGITARFSGSGSGT LEWIGSIYYGGNTYYNPSLKSRV AA EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYN TISIDTSKNQFSLKLSSVTAADT NWPTFGPGTKVDIK AVYYCAGELRRAFDIWGQGTMVT

VSS (SEQ ID NO: 11) (SEQ ID NO: 12)

AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG CTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGA GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA AGACGGTAACCATCTCCTGCACC GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA

CGCAGCAGTGACAGCATTGCCAG GCGTCTGGATTCACCTTCAGTTA iPS:481499

CAACTATGTGCAGTGGTACCAGC CTATGGCATGCACTGGGTCCGCC 1A12,1

AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACC AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG NA ACTGTGATCTTTGAGGATAACCA TGGGTGGCAGTTATATGGTATGA AAGACCCTCTGGGGTCCCTGATC TGGAAGTAATAAATACTATGCAG GGTTCTCTGGCTCCATCGACAGC ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC TCCTCCAACTCTGCCTCCCTCAC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA CATCTCTGGACTGAAGCCTGAGG CACGCTGTATCTGCAAATGAACA ACGAGGCTGACTACTACTGTCAG GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT TCTTATGATAGCAGCAATCATGT GTGTATTACTGTGCGAGAGATCA GGTATTCGGCGGAGGGACCAAGC TGACTACGGTGTCCTGTACTACT TGACCGTCCTA TTGACTACTGGGGCCAGGGAACC

CTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 13) (SEQ ID NO: 14)

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RSSDSIASNYVQWYQQRPGSSPT ASGFTFSYYGMHWVRQAPGKGLE TVIFEDNQRPSGVPDRFSGSIDS WVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFT AA SSNSASLTISGLKPEDEADYYCQ ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA SYDSSNHVVFGGGTKLTVL VYYCARDHDYGVLYYFDYWGQGT

LVTVSS (SEQ ID NO: 15) (SEQ ID NO: 16)

TCCTTTGAACTGACACAGCCACC CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG CTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGAC TCCTACGCTGGTGAAACCCACAC AGACGGCCAGGATCACCTGCTCT AGACCCTCACGCTGACCTGCACC GGAGATGCATTGCCAAAGCAATA TTCTCTGGGTTCTCACTCAGCAC TGCTTATTGGTACCGGCAGAAGC TAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGA CAGGCCAGGCCCCTGTACTGGTA TCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCC

ATATATAAAGACAGTGAGAGGCC CTGGAGTGGCTTGCACTCATTTA iPS:480526

CTCAGGGATCCATGAGCGATTCT TTGGAATGATGATAAGCGCTACA 6B1,1

NA CTGGCTCCACCTCAGGGACAACA GCCCATCTCTGAAGAGCAGGCTC GTCACGTTGACCATCAGTGGAGT ACCATCACCAAGGACACCTCCAA CCAGGCAGAAGACGAGGCTGACT AAACCAGGTGGTCCTTACAATGA ATTACTGTCAATCAACAGACAGA CCAACATGGACCCTGTGGACACA AGAGGTACTGTGTTCGGCGGAGG GCCACATATTACTGTGCACACAG GACCAAGTTGACCGTCCTA ACATGGCTACGATAGGATGCGTG ATGCTTTTGATATCTGGGGCCAA GGGACAATGGTCACCGTCTCTTC A

(SEQ ID NO: 17) (SEQ ID NO: 18)

SFELTQPPSVSVSPGQTARITCS QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCT GDALPKQYAYWYRQKPGQAPVLV FSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKA IYKDSERPSGIHERFSGSTSGTT LEWLALIYWNDDKRYSPSLKSRL AA VTLTISGVQAEDEADYYCQSTDR TITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDT RGTVFGGGTKLTVL ATYYCAHRHGYDRMRDAFDIWGQ

GTMVTVSS (SEQ ID NO: 19) (SEQ ID NO: 20)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC CAGGTGCAGTTGGTGCAGTCTGG AGACACCCTGTCTTTGTCTCCAG GGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGG GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC CCTCAGTGAAGGTTTCCTGCAAG AGGGCCAGTCAGATTTTTAGCAG GCATCTGGATACACCTTCACCAG CAGTTACTTAGCCTGGTACCAGC CTACTTTATACACTGGGTGCGAC AGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGG AGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAG CTCCTCATCTCTGGTGCATCCAG TGGATGGGAATAATCAACCCTAG CAGGGCCACTGGCATCCCAGACA TGGTGGTAGCACAAGCTACGCAC GGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGG AGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACC

NA iPS:480529

TCAGACTTCACTCTCACCATCAG ATGACCAGGGACACGTCCACGAG 1G9,1

CAGACTGGAGCCTGAGGATTTTG TACAGTCTACATGGAGCTTAGCA CAGTGTATTACTGTCAGCAGTAT GCCTGAGATCTGAGGACACGGCC GGTAGCTCATGCAGTTTTGGCCA GTGTATTACTGTGCGAGAGATCA GGGGACCAAGCTGGAGATCAAA GGAGGGAGCAGTGGCTGGTACAG ACTACTACTTCTACGGTATGGAC GTCTGGGGCCAAGGGACCACGGT

CACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 21) (SEQ ID NO: 22)

EIVLTQSPDTLSLSPGERATLSC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK RASQIFSSSYLAWYQQKPGQAPR ASGYTFTSYFIHWVRQAPGQGLE AA LLISGASSRATGIPDRFSGSGSG WMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVT MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA SDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQY VYYCARDQEGAVAGTDYYFYGMD

GSSCSFGQGTKLEIK VWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 23) (SEQ ID NO: 24)

GATATTGTGATGACTCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG ACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG TAGTCATGGATACAGCTATTTGA CTATGGCATGCACTGGGTCCGCC ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG CAGTCTCCACAGCTCCTGATCCA TGGGTGGCAGTTATATCATATGA TTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG TGGAAATAATAAATACTATGCAG NA GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGC ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC

AGTGGATCAGGCACAGAATTTAC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAC iPS:480533

ACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGG CACGCTGTATCTGCAAATGAACA 6E12,1

CTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC GCCTGAGACCTGAGGACACGGCT TGCATGCAAGTTCTGCTAACTCC GTGTTTTACTGTGCGAGAGATGC GATCACCCTCGGCCAAGGGACAC CAGTGGGAGCTCCCTCTACCTTG GACTGGAGATTAAA ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 25) (SEQ ID NO: 26)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RSSQSLLHSHGYSYLNWYLQKPG ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE QSPQLLIHLGSNRASGVPDRFSG WVAVISYDGNNKYYADSVKGRFT AA SGSGTEFTLRISRVEAEDVGVYY ISRDNSKTTLYLQMNSLRPEDTA CMQVLLTPITLGQGTRLEIK VFYCARDASGSSLYLDYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 27) (SEQ ID NO: 28)

GATATTGTGATGACTCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG ACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAA TAGTCATGGATACAACTATTTGA CTATGGCATGCACTGGGTCCGCC ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG CAGTCTCCACACCTCCTGATCTA TGGGTGGCAGTTATATCATATGA TTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG TGGAAGTAAAAAATACTATGCAG NA GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGC ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC

AGTGGATCAGGCACAGAATTTAC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA iPS:480548

ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGG CACGCTGTATCTGCAAATGAACA 9G5,1

CTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC GCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT TGCATGCAAGTTCTACAAACTCC GTGTATTACTGTGCGAGAGATGC GATCACCCTCGGCCAAGGGACAC CAGTGGGAGCTCCCTCTACTCTG GACTGGAGATTAAA ACTACTGGGGCCAGGGAATCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 30)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RSSQSLLHSHGYNYLNWYLQKPG ASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLE QSPHLLIYLGSNRASGVPDRFSG WVAVISYDGSKKYYADSVKGRFT AA SGSGTEFTLKISRVEAEDVGVYY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA CMQVLQTPITLGQGTRLEIK VYYCARDASGSSLYSDYWGQGIL

VTVSS (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32)

GATATTGTGATGACTCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG iPS:480551

ACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA 5A12,1

GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA NA AGGTCTAGTCAGGGCCTCCTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG TAGTCATGGATACCACTATTTGA CTATGGCATGCACTGGGTCCGCC ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG CAGTCTCCACAGCTCCTGATCTA TGGGTGACAGTTATATCAAAAGA TTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG TGGAAGTTATAAATACTATGCGG GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGC ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC AGTGGATCAGGCACAGAATTTAC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA ACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGG CACGCTGTATCTGCAAATGAACA CTGAGGATGTTGGGGTTTATTAC GCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT TGCATGCAAGTTCTACAAACTCC GTGTATTACTGTGCGAGGGATGC GATCACCCTCGGCCAAGGGACAC CAGTGGGAGCTCCCTCTACTTAG GACTGGAGATTAAA ACTACTGGGGCCAGGGTACCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RSSQGLLHSHGYHYLNWYLQKPG ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE QSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSG WVTVISKDGSYKYYADSVKGRFT AA SGSGTEFTLKISRVEAEDVGVYY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA CMQVLQTPITLGQGTRLEIK VYYCARDASGSSLYLDYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 35) (SEQ ID NO: 36)

CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG CTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGC GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA AGAGGGTCACCATCTCTTGTTCT GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA

GGAAGCAGCTCCAACATCGGAAG GCGTCTGGATTCACCTTCAGTAG iPS:480555

AAATACTGTAAACTGGTACCAGC CTATGGCATGCACTGGGTCCGCC 6B11,1

AGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAA AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG NA CTCCTCATCTATAGTAATAATCA TGGGTGGCAGTTATATGGTATGA GCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACC TGGAAGTAATAAATACCATGCAG GATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGC ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC ACCTCAGTCTCCCTGGCCATCAG ATCTCCAGAGACAATTCCAAGGA TGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGG CACGCTGTATCTGCAAATGAACA CTGATTATTACTGTGCAGCATGG GCCTGAGAGCCGAGGACACGGCT GATGACAGCCTGAATGGTGTGGT GTGTATTACTGTGCGGGGGACTT ATTCGGCGGAGGGACCAAGTTGA TGCTTACTTCTACTACGGTATGG CCGTCCTA ACGTCTGGGGCCAAGGGACCACG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 38)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCS QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA GSSSNIGRNTVNWYQQLPGTAPK ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE LLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSG WVAVIWYDGSNKYHADSVKGRFT AA TSVSLAISGLQSEDEADYYCAAW ISRDNSKDTLYLQMNSLRAEDTA DDSLNGVVFGGGTKLTVL VYYCAGDFAYFYYGMDVWGQGTT

VTVSS (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 40)

TCCTATGAGCTGACCCAGCCACC CAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG CTCGGTGTCAGTGTCCCCAGGAC TCCTACGCTGGTGAAACCCACAC AGACGGCCAGGATCACCTGCTCT AGACCCTCACGCTGACCTGCACC GGAGATGCTTTGCCAAGGCAATA TTCTCTGGGTTCTCACTCAGCAC TACTTATTGGTACCAGCAGAAAC TAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGA CAGGCCAGGCCCCTGTTCTGGTG TCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCC

ATATTTAAAGACACTGCGAGGCC CTGGAGTGGCTTGCACTCATTTA iPS:480558

CTCAGGGATCCCTGAGCGATTCT TTGGAATGATGATAAGCGCTACA 8C8,1

NA CTGGCTCCAGCTCAGGGACAACA GCCCATCTCTGAAGAGCAGGCTC GTCACGTTGACCATCAGTGGAGT ACCATCACCAAGGACACCTCCAA CCAGGCAGAAGACGAGGCTGACT AAACCAGGTGGTCCTTACAATGA ATTACTGTCAATCAACAGACAGA CCAACATGGACCCTGTGGACACA AGTGGTACTGTGTTCGGCGGAGG GCCACATATTACTGTGCACACAG GACCAAGCTGACCGTCCTA ACATGGCTACGATAGGATGCGTG ATGCTTTTGATATCTGGGGCCAA GGGACAATGGTCACCGTCTCTTC A

(SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42)

SYELTQPPSVSVSPGQTARITCS QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCT GDALPRQYTYWYQQKPGQAPVLV FSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKA IFKDTARPSGIPERFSGSSSGTT LEWLALIYWNDDKRYSPSLKSRL AA VTLTISGVQAEDEADYYCQSTDR TITKDTSKNQVVLTMTNMDPVDT SGTVFGGGTKLTVL ATYYCAHRHGYDRMRDAFDIWGQ

GTMVTVSS (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 44)

GAAATTGTGATGACCCAGACTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG ATTCTCTCTGTCCGTCACCCCTG CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCC GACAGCCGGCCTCCATCTCCTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT AAGTCTAGTCAGAGCCTCCTGCA GTCTCTGGTGGCTCCATCAACAG TAGTAGTGGAAAGACCTATTTGT TGGTGGTTACTACTGGAGCTGGA ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGC TCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGC CAGCCTCCACAGCTCCTGATCTA CTGGAGTGGATTGGGTACATCTC TGAAGTTTCCAACCGGTTCTCTG TTACAGTGGGAGCACCTACTACA

NA GAGTGCCAGATAGGTTCAGTGGC ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTT iPS:480561

AGCGGGTCAGGGACAGATTTCAC ACCATATCAGTAGACACGTCTAA 8G12,1

ACTGAAAATCAGCCGGGTGGAGG GAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGA CTGAGGATGTTGGGGTTTATTTC GCTCTGTGACTGCCGCGGACACG TGCATGCAAAGTATACAGCTTCC GCCGTGTATTACTGTGCGAGAGA GTGGACGTTCGGCCAAGGGACCA GAGCCCTACGGTGACTACGGCTT AGGTGGAAATCAAA TTGATATCTGGGGCCAAGGGACA

AAGGTCACCGTCTCTTCA (SEQ ID NO: 45) (SEQ ID NO: 46)

EIVMTQTPFSLSVTPGQPASISC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT KSSQSLLHSSGKTYLYWYLQKPG VSGGSINSGGYYWSWIRQHPGKG AA QPPQLLIYEVSNRFSGVPDRFSG LEWIGYISYSGSTYYNPSLKSRV SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYF TISVDTSKNQFSLRLSSVTAADT CMQSIQLPWTFGQGTKVEIK AVYYCARESPTVTTAFDIWGQGT

KVTVSS (SEQ ID NO: 47) (SEQ ID NO: 48)

GACATCCAGTTGACCCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG ATCCTCCCTGTGTGCATCTGTAG CCCAGGACTGGTGAAGCCCTCAC GAGACAGAGTCACCATCACTTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT CGGGTGAGTCAGGACATTAACAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG TTATTTAAATTGGTGTCGGCAGA TGGTGGTTACGACTGGAGCTGGA AACCAGGGAAAGTTCCTCAGTTC TCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGC CTGATCTATAGTGCATCCAATTT CTGGAGTGGATTGGGAACATTTA GCAATCTGGAGTCCCATCTCGGT TTACAGTGGGAGGACCTACTACA TCAGTGGCAGTGGATCTGGGACA ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAATT NA GATTTCACTCTCACTTTCAGCGG ACCATATCAGTAGACACGTCTAA

CCTGCAGACTGAATATGTTGCAC GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA iPS:480572 9D3,1_LC1

GTTATTACGGTCAACGGACTTAC GGTCTGTGACTGCCGCGGACACG AATGCCCTTCCGACGTTCGGCCT GCCGTGTATTACTGTGCGAGAGA AGGGACCAGGGCGGAAATCAAA TCGCCCTTATGGAGGTAATTCCG GCTACTACTACGGTATGGACGTC TGGGGCCAAGGGACCACGGTCAC

CGTCTCCCCA (SEQ ID NO: 49) (SEQ ID NO: 50)

DIQLTQSPSSLCASVGDRVTITC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT RVSQDINSYLNWCRQKPGKVPQF VSGGSISSGGYDWSWIRQHPGKG LIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGT LEWIGNIYYSGRTYYNPSLKSRI AA DFTLTFSGLQTEYVARYYGQRTY TISVDTSKNQFSLKLRSVTAADT NALPTFGLGTRAEIK AVYYCARDRPYGGNSGYYYGMDV

WGQGTTVTVSP (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52)

GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG AGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAG CCCAGGACTGGTGAAGCCCTCAC GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT AGGGCCAGTCAGACTATTAGCAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG CAGCTACTTAGCCTGGTACCAGC TGGTGGTTACGACTGGAGCTGGA AGAGACCTGGCCAGGCTCCCAGG TCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGC CTCCTTATGTATGGTGCATCCAA CTGGAGTGGATTGGGAACATTTA CAGGGTCATTGGCATCCCAGTCA TTACAGTGGGAGGACCTACTACA GGTTCAGTGGCGGTGGGTGTGGG ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAATT NA ACAGACTTCACTTTCACCATCAG ACCATATCAGTAGACACGTCTAA

CAGACTGGATCCTGAAGATTTTG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA iPS:480573 9D3,1_LC2

CAGTGTATTACTGTCAGCAGTAT GGTCTGTGACTGCCGCGGACACG GGTAACTCACCCATGTGCAGTTT GCCGTGTATTACTGTGCGAGAGA TGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGA TCGCCCTTATGGAGGTAATTCCG TCAAA GCTACTACTACGGTATGGACGTC TGGGGCCAAGGGACCACGGTCAC

CGTCTCCCCA (SEQ ID NO: 53) (SEQ ID NO: 54)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT RASQTISSSYLAWYQQRPGQAPR VSGGSISSGGYDWSWIRQHPGKG LLMYGASNRVIGIPVRFSGGGCG LEWIGNIYYSGRTYYNPSLKSRI AA TDFTFTISRLDPEDFAVYYCQQY TISVDTSKNQFSLKLRSVTAADT GNSPMCSFGQGTKVEIK AVYYCARDRPYGGNSGYYYGMDV

WGQGTTVTVSP (SEQ ID NO: 55) (SEQ ID NO: 56)

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCC CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGG iPS:481500

AGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG 6C9,1

NA GGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG CAACTTAGCCTGGTACCAGCAGA TAGTAGTTACTATTGGGGCTGGA AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC TCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGG CTCATCGATGGTGCATCCACCAG CTGGAGTGGATTGGGAGTATCTA GGCCACTGGCATCACAGCCAGGT TTATGGTGGGAACACCTACTACA TCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTC GAGTTCACTCTCACCATCAGCAG ACCATATCCGTAGACACGTCCAA CCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA TTTATTACTGTCAGCAGTATAAT GCTCTGTGACCGCCGCAGACACG AACTGGCCTACTTTCGGCCCTGG GCTGTGTATTACTGTGCGGGAGA GACCAAAGTGGATATCAAA ACTGCGGAGGGCTTTTGATATCT GGGGCCAAGGGACAATGGTCACC

GTCTCTTCA (SEQ ID NO: 57) (SEQ ID NO: 58)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCT RASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRL VSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKG LIDGASTRATGITARFSGSGSGT LEWIGSIYYGGNTYYNPSLKSRV AA EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYN TISVDTSKNQFSLKLSSVTAADT NWPTFGPGTKVDIK AVYYCAGELRRAFDIWGQGTMVT

VSS (SEQ ID NO: 59) (SEQ ID NO: 60)

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCC CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGG AGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG GGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT

AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGGAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG iPS:481501

CAACTTAGCCTGGTACCAGCAGA TGGTAGTTACTACTGGGGCTGGA 4E2,1

NA AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC TCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGG CTCATCGATGGTGCATCCACCAG CTGGAGTGGATTGGGAGTATCTA GGCCACTGGCATCACAGCCAGGT TTATGGTGGGAACACCTACTACA TCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTC GAGTTCACTCTCACCATCAGCAG ACCATATCCGTAGACACGTCCAA CCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA TTTATTACTGTCAGCAGTATAAT GCTCTGTGACCGCCGCAGACACG AATTGGCCTACTTTCGGCCCTGG GCTGTGTATTACTGTGCGGGAGA GACCAAAGTGGATATCAAA ACTGCGGAGGGCTTTTGATATCT GGGGCCAAGGGACAATGGTCACC

GTCTCTTCA (SEQ ID NO: 61) (SEQ ID NO: 62)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSC QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCT RASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRL VSGGSISSGSYYWGWIRQPPGKG LIDGASTRATGITARFSGSGSGT LEWIGSIYYGGNTYYNPSLKSRV AA EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYN TISVDTSKNQFSLKLSSVTAADT NWPTFGPGTKVDIK AVYYCAGELRRAFDIWGQGTMVT

VSS (SEQ ID NO: 63) (SEQ ID NO: 64)

GACATCCAGATGACCCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG GTCCTCCCTGTGTGCATCTGTAG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GAGACAGAGTCACCATCTCTTGC GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA CGGGCAAGTCAGGACATTAGAAA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG TGATTTAGGCTGGTATCAGCAGA CTTTGGCATGCACTGGGTCCGCC AACCAGGGAAAGCCCCTAAGCGC AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG

CTGATTTATGTTGCATCCAGTTT TGGGTGGCAATTTTATCATTTGA iPS:481983

GCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGT TGGAAATAATAAATACTATGCAG 3D5,1

NA TCAGCGGCAGTGGATTTGGGACA ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC GAATTCACTCTCACAATCAGCAG ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA CCTGCAGCGTGAAGATTTTGCAA CACGGTGTATCTGCAAATGAACA CTTATTACTGTCTACAGCATAAT GCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT ATTTACCCGTGCAGTTTTGGCCA GTGTATTACTGTGCGAGAGAGGG GGGGACCAAGCTGGAGATCAAA GGGGTATAACTGGAACTACGACT TTGACTACTGGGGCCAGGGAACC

CTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 65) (SEQ ID NO: 66)

DIQMTQSPSSLCASVGDRVTISC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RASQDIRNDLGWYQQKPGKAPKR ASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLE LIYVASSLQSGVPSRFSGSGFGT WVAILSFDGNNKYYADSVKGRFT AA EFTLTISSLQREDFATYYCLQHN ISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTA IYPCSFGQGTKLEIK VYYCAREGGYNWNYDFDYWGQGT

LVTVSS (SEQ ID NO: 67) (SEQ ID NO: 68)

TCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC CAGGTGCAACTGCAGGAGTCGGG TGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGAC CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGG AGACAGTCAGGATCACATGTCAA AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT GGAGACAGCCTCAGAACCTATTA GTCTCTGGTGGCTCCGTCAGCAG TGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGC TGGTGGTGACTACTGGAGCTGGA CAGGACAGGCCCCTGTACTTGTC TCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGA ATCTATGGTAAAAACATCCGGCC CTGGAGTGGATTGGTTATATCTA CTCAGGGATCCCAGACCGATTCT TTACACTGGGAGCACCAACTACA NA CTGCCTCCAGGTCAGGAAATACA ACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTC

GCTGCCTTGACCATCACTGGGGC ACCATATCAGTAGACACGTTCAA iPS:481984

TCAGGCGGAAGATGAGGCTGACT GCACCAGTTCTCCGTGAATCTGA 5D11,1

ATTACTGTAACTCCCGGGACAGC CCTCTGTGACCGCTGCGGACACG AGTGGTGACCATGTGATATTCGG GCCGTGTATTATTGTGCGAGATC CGGAGGGACCAAGGTGACCGTCC GGGTGTAGCAATGGCTCGCTTTG TA ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 69) (SEQ ID NO: 70)

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQ QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCT GDSLRTYYASWYQQKPGQAPVLV VSGGSVSSGGDYWSWIRQPPGKG IYGKNIRPSGIPDRFSASRSGNT LEWIGYIYYTGSTNYNPSLKSRV AA AALTITGAQAEDEADYYCNSRDS TISVDTFKHQFSVNLTSVTAADT SGDHVIFGGGTKVTVL AVYYCARSGVAMARFDYWGQGTL VTVSS

(SEQ ID NO: 71) (SEQ ID NO: 72)

AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG CTCTGTGTCGGAGTCTCCGGGGA CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCAC AGACGGTAACCATCTCCTGCACC AGACCCTGTCCCTCATCTGCACT CGCAGCAGTGGCAGCATTGTCAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG CAACTATGTGCAGTGGTACCAAC TGGTGGCTACCACTGGAGCTGGA AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACC TCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGC ATTGTGATCTATGAGGATAATCA CTGGAGTGGATTGGGTACATCTA AAGACCCTCTGGGGTCCCTGATC TTACAGTGGGAGCACCTACTACA NA GGTTCTCTGGCTCCATCGACAGC ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTT

TCCTCGAACTCTGCCTCCCTCAC ACCATATCAGTAGACACGTCTAA iPS:481989

CATCTCTGGACTGAAGACTGAGG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA 1H1,1

ACGAGGCTGACTACTATTGTCAG GCTCTGTGACTGCCGCGGACACG TCTTATGATAGCAGCAATCAGGT GCCGTATATTACTGTGCGAGAGA GTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGA GACTACGGTGGTAAAGGGGTACT CCGTCCTA TCGATCTCTGGGGCCGTGGCACC

CTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 73) (SEQ ID NO: 74)

NFMLTQPHSVSESPGKTVTISCT QVQLQESGPGLVKPSQTLSLICT RSSGSIVSNYVQWYQQRPGSSPT VSGGSISSGGYHWSWIRQHPGKG IVIYEDNQRPSGVPDRFSGSIDS LEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRV AA SSNSASLTISGLKTEDEADYYCQ TISVDTSKNQFSLKLSSVTAADT SYDSSNQVFGGGTKLTVL AVYYCARETTVVKGYFDLWGRGT

LVTVSS (SEQ ID NO: 75) (SEQ ID NO: 76)

CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG iPS:480570

CTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGC GGGAGGCTTGGTAAAGCCTGGGG 9E8,1

NA AGAGGGTCACCATCTCTTGTTCT GGTCCCTTAGACTCTCCTGTGCA GGAAGCAGCTCCAACATCGGAAG GCCTCTGGATTCACTTTCAGTTA TAATTATGTATTCTGGTACCAGC CGCCTGGATGGGCTGGGTCCGCC AGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAA AGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAG CTCCTCATCTTTAGGAATAATCA TGGATTGGCCGTATTAAAAGCAA GCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACC AACTGATGGTGGGACAACAGACT GATTCTTTGGCTCCAAGTCTGGC ACGCTGCACCCGTGAAAGGCAGA ACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAG TTCACCATCTCAAGAGATGATTC TGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGG AAAAAACACGCTGTATCTGCAAA CTGATTATTACTGTGCAGCATGG TGAACAGCCTGAAAACCGAGGAC GATGACAGCCTGAGTGGTTGGGT ACAGCCGTGTATTACTGTACCAC GTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGA AGATGGGGCACTGGCCCCCCACG CCGTCCTA GCTACTGGGGCCAGGGAACCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 77) (SEQ ID NO: 78)

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCS EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA GSSSNIGSNYVFWYQQLPGTAPK ASGFTFSYAWMGWVRQAPGKGLE LLIFRNNQRPSGVPDRFFGSKSG WIGRIKSKTDGGTTDYAAPVKGR AA TSASLAISGLRSEDEADYYCAAW FTISRDDSKNTLYLQMNSLKTED DDSLSGWVFGGGTKLTVL TAVYYCTTDGALAPHGYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 79) (SEQ ID NO: 80)

GAAATAGTGATGACGCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG AGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAG CCCAGGACTGGTGAAGCCTTCAC GGGATAGAGCCACCCTCTCCTGC AGACCCTGTCCCTCACCTGCACT

AGGGCCAGTCAGAGTGTTAGAAG GTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAG iPS:480538

CAACTTAGCCTGGTACCAGCAGA TGGTGGTTACTTCTGGAGCTGGA 2B6,1

NA AACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTC TCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGC CTCATCTATGGTGCATCCACCAG CTGGAGTGGATTGGGTACATCTA GGCCACTGGTATCCCAGCCAGGT TTACAGTGGGAGCACCTACTACA TCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACA ACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTT GAGTTCACTCTCACCATCAGCAG ACCATATCAGTAGACACGTCTAA CCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAG GAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGA TTTATTACTGTCAGCAATACACT GCTCTGTGACTGCCGCGGACACG GACTGGCCCACTTTCGGCGGAGG GCCGTGTATTACTGTGCGAGATG GACCAAGGTGGAGATCAAA GGGAGCAGCAGCCGGCTTTGACT ATTGGGGCCAGGGAACCCTGGTC

ACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 81) (SEQ ID NO: 82)

EIVMTQSPATLSVSPGDRATLSC QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT RASQSVRSNLAWYQQKPGQAPRL VSGGSISSGGYFWSWIRQHPGKG LIYGASTRATGIPARFSGSGSGT LEWIGYIYYSGSTYYNPSLKSRV AA EFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYT TISVDTSKNQFSLKLSSVTAADT DWPTFGGGTKVEIK AVYYCARWGAAAGFDYWGQGTLV

TVSS (SEQ ID NO: 83) (SEQ ID NO: 84)

GATATTGTGATGACTCAGTCTCC CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG ACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTG GGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGA GAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGC GGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA AGGTCTAGTCAGAGCCTCCTACA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAG TAGTCATGGATACAGCTATTTGA CTATGGCATGCACTGGGTCCGCC ATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGG AGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAG

CAGTCTCCACAGCTCCTGATCCA TGGGTGGCAGTTATATCATATGA iPS:480569

TTTGGGTTCTAATCGGGCCTCCG TGGAAATAATAAATACTATGCAG 1D2,1

NA GGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGC ACTCCGTGAAGGGCCGATTCACC AGTGGATCAGGCACAGAATTTAC ATCTCCAGAGACAATTCCAAGAA ACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGG CACGCTGTATCTGCAAATGAACA CTGAGGATGTTGGGGTTTATTAT GCCTGAGAGCTGAGGACACGGCT TGCATGCAAGTTCTGCTAACTCC GTGTATTACTGTGCGAGAGATGC GATCACCCTCGGCCAAGGGACAC CAGTGGGAGCTCCCTCTACCTTG GACTGGAGATTAAA ACTACTGGGGCCAGGGAACCCTG

GTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO: 85) (SEQ ID NO: 86)

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCA RSSQSLLHSHGYSYLNWYLQKPG ASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE QSPQLLIHLGSNRASGVPDRFSG WVAVISYDGNNKYYADSVKGRFT AA SGSGTEFTLRISRVEAEDVGVYY ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA CMQVLLTPITLGQGTRLEIK VYYCARDASGSSLYLDYWGQGTL

VTVSS (SEQ ID NO: 87) (SEQ ID NO: 88) Tabela 4. Sequências Exemplificativas de Ácidos Nucleicos (“NA”) e Aminoácidos (“AA”) de CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3 Tabela 4A. Sequências Exemplificativas de Ácidos Nucleicos (“NA”) e Aminoácidos (“AA”) de CDRL1, CDRL2 e CDRL3 # de antico Tipo CDRL1 CDRL2 CDRL3 Ref rpo

CGGGCGAGTCAGG GCTGCATCCAGTT CAACAGGCTAACA GTATTAGCGACTG TGCAAAGT GTTTCCCGATCAC

NA GTTAGCC C (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 17B3,1 89) 90) 91) iPS:480496

RASQGISDWLA AASSLQS QQANSFPIT AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 92) 93) 94)

ACTGGAACCAGCA GAGGTCAGTAATC AGCTCTTATACAA

GTGCCGTTGGTGG GGCCCTCA GCAGCAGCACTTG 15D11, TCATAACTTTGTC GGTG iPS:480499

NA 1 TCC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 95) 96) 97)

TGTSSAVGGHNFV EVSNRPS SSYTSSSTWV S

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 98) 99) 100)

AGGGCCAGTCAGA GGTGCATCCACCA CAGCAGTATAATA GTGTTAGGAGCAA GGGCCACT ACTGGCCTACT

NA CTTAGCC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 4F5,1 101) 102) 103) iPS:480522

RASQSVRSNLA GASTRAT QQYNNWPT AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 104) 105) 106)

ACCCGCAGCAGTG GAGGATAACCAAA CAGTCTTATGATA ACAGCATTGCCAG GACCCTCT GCAGCAATCATGT

NA CAACTATGTGCAG GGTA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1A12,1 107) 108) 109) iPS:481499

TRSSDSIASNYVQ EDNQRPS QSYDSSNHVV AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 110) 111) 112)

TCTGGAGATGCAT AAAGACAGTGAGA CAATCAACAGACA TGCCAAAGCAATA GGCCCTCA GAAGAGGTACTGT

NA TGCTTAT G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 6B1,1 113) 114) 115) iPS:480526

SGDALPKQYAY KDSERPS QSTDRRGTV AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 116) 117) 118)

AGGGCCAGTCAGA GGTGCATCCAGCA CAGCAGTATGGTA TTTTTAGCAGCAG GGGCCACT GCTCATGCAGT

NA TTACTTAGCC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1G9,1 119) 120) 121) iPS:480529

RASQIFSSSYLA GASSRAT QQYGSSCS AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 122) 123) 124)

AGGTCTAGTCAGA TTGGGTTCTAATC ATGCAAGTTCTGC GCCTCCTACATAG GGGCCTCC TAACTCCGATCAC TCATGGATACAGC C NA

TATTTGAAT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 6E12,1 125) 126) 127)

RSSQSLLHSHGYS LGSNRAS MQVLLTPIT iPS:480533

YLN

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 128) 129) 130)

AGGTCTAGTCAGA TTGGGTTCTAATC ATGCAAGTTCTAC GCCTCCTGCATAG GGGCCTCC AAACTCCGATCAC TCATGGATACAAC C NA

TATTTGAAT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 9G5,1 131) 132) 133)

RSSQSLLHSHGYN LGSNRAS MQVLQTPIT iPS:480548

YLN

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 134) 135) 136)

AGGTCTAGTCAGG TTGGGTTCTAATC ATGCAAGTTCTAC GCCTCCTGCATAG GGGCCTCC AAACTCCGATCAC TCATGGATACCAC C NA

TATTTGAAT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 5A12,1 137) 138) 139)

RSSQGLLHSHGYH LGSNRAS MQVLQTPIT iPS:480551

YLN

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 140) 141) 142)

TCTGGAAGCAGCT AGTAATAATCAGC GCAGCATGGGATG CCAACATCGGAAG GGCCCTCA ACAGCCTGAATGG

NA AAATACTGTAAAC TGTGGTA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 6B11,1 143) 144) 145) iPS:480555

SGSSSNIGRNTVN SNNQRPS AAWDDSLNGVV AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 146) 147) 148)

TCTGGAGATGCTT AAAGACACTGCGA CAATCAACAGACA TGCCAAGGCAATA GGCCCTCA GAAGTGGTACTGT

NA TACTTAT G (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 8C8,1 149) 150) 151) iPS:4805 iPS:480558

SGDALPRQYTY KDTARPS QSTDRSGTV AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 152) 153) 154)

AAGTCTAGTCAGA GAAGTTTCCAACC ATGCAAAGTATAC 8G12,1 NA GCCTCCTGCATAG GGTTCTCT AGCTTCCGTGGAC

G TAGTGGAAAGACC

TATTTGTAT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 155) 156) 157)

KSSQSLLHSSGKT EVSNRFS MQSIQLPWT YLY

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 158) 159) 160)

CGGGTGAGTCAGG AGTGCATCCAATT CAACGGACTTACA ACATTAACAGTTA TGCAATCT ATGCCCTTCCGAC

NA TTTAAAT G 9D3,1_ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: LC1 161) 162) 163) iPS:480572

RVSQDINSYLN SASNLQS QRTYNALPT AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 164) 165) 166)

AGGGCCAGTCAGA GGTGCATCCAACA CAGCAGTATGGTA CTATTAGCAGCAG GGGTCATT ACTCACCCATGTG

NA CTACTTAGCC CAGT 9D3,1_ (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: LC2 167) 168) 169) iPS:480573

RASQTISSSYLA GASNRVI QQYGNSPMCS AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 170) 171) 172)

AGGGCCAGTCAGA GGTGCATCCACCA CAGCAGTATAATA

GTGTTAGGAGCAA GGGCCACT ACTGGCCTACT iPS:481500 6C9,1 NA CTTAGCC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 173) 174) 175)

RASQSVRSNLA GASTRAT QQYNNWPT AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 176) 177) 178)

AGGGCCAGTCAGA GGTGCATCCACCA CAGCAGTATAATA GTGTTAGGAGCAA GGGCCACT ATTGGCCTACT

NA CTTAGCC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 4E2,1 179) 180) 181) iPS:481501

RASQSVRSNLA GASTRAT QQYNNWPT AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 182) 183) 184)

CGGGCAAGTCAGG GTTGCATCCAGTT CTACAGCATAATA ACATTAGAAATGA TGCAAAGT TTTACCCGTGCAG

NA TTTAGGC T (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 3D5,1 185) 186) 187) iPS:481983

RASQDIRNDLG VASSLQS LQHNIYPCS AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 188) 189) 190)

CAAGGAGACAGC GGTAAAAACATC AACTCCCGGGAC CTCAGAACCTAT CGGCCCTCA AGCAGTGGTGAC

NA TATGCAAGC CATGTGATA 5D11, (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1 191) 192) 193) iPS:481984

QGDSLRTYYAS GKNIRPS NSRDSSGDHVI AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 194) 195) 196)

ACCCGCAGCAGT GAGGATAATCAA CAGTCTTATGAT GGCAGCATTGTC AGACCCTCT AGCAGCAATCAG AGCAACTATGTG GTG NA

CAG (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1H1,1 197) 198) 199)

TRSSGSIVSNYV EDNQRPS QSYDSSNQV iPS:481989

Q

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 200) 201) 202)

TCTGGAAGCAGC AGGAATAATCAG GCAGCATGGGAT TCCAACATCGGA CGGCCCTCA GACAGCCTGAGT AGTAATTATGTA GGTTGGGTG NA

TTC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 9E8,1 203) 204) 205)

SGSSSNIGSNYV RNNQRPS AAWDDSLSGWV iPS:480570

F

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 206) 207) 208)

AGGGCCAGTCAG GGTGCATCCACC CAGCAATACACT AGTGTTAGAAGC AGGGCCACT GACTGGCCCACT

NA AACTTAGCC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2B6,1 209) 210) 211) iPS:480538

RASQSVRSNLA GASTRAT QQYTDWPT AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 212) 213) 214)

AGGTCTAGTCAG TTGGGTTCTAAT ATGCAAGTTCTG AGCCTCCTACAT CGGGCCTCC CTAACTCCGATC AGTCATGGATAC ACC NA

AGCTATTTGAAT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 1D2,1 215) 216) 217)

RSSQSLLHSHGY LGSNRAS MQVLLTPIT iPS:480569

SYLN

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 218) 219) 220) Tabela 4B. Sequências Exemplificativas de Nucleotídeos e Aminoácidos de CDRH1, CDRH2 e CDRH3 # de antico Tipo CDRH1 CDRH2 CDRH3 Ref rpo

AGTTATGGCATGCA GTTATATGGTATGA CATGACCACA C TGGAAGTAATGAAT GTCACTACGG ACTATGCAGACTCC TTTTGACTAC NA

GTGAAGGGC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 17B3,1 221) 222) 223)

SYGMH VIWYDGSNEYYADS HDHSHYGFDY iPS:480496

VKG

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 224) 225) 226)

AATGCTGAAATGGG CACCTTTTTTCGAA TCGTTTAACT iPS:480499 15D11, TGTGAGC TGACGAAAAATCCT GGAACTACGA

NA 1 ACAGCACATCTCTG CTTTGACTAC

AAGAGC

(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 227) 228) 229)

NAEMGVS HLFSNDEKSYSTSL SFNWNYDFDY KS

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 230) 231) 232)

AGTGGTAGTTACTA AGTATCTATTATGG GAACTGCGGA CTGGGGC TGGGAACACCTACT GGGCTTTTGA ACAACCCGTCCCTC TATC NA

AAGAGT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 4F5,1 233) 234) 235)

SGSYYWG SIYYGGNTYYNPSL ELRRAFDI iPS:480522

KS

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 236) 237) 238)

TACTATGGCATGC GTTATATGGTATG GATCATGAC AC ATGGAAGTAATAA TACGGTGTC ATACTATGCAGAC CTGTACTAC NA

TCCGTGAAGGGC TTTGACTAC 1A12, (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 1 239) 240) NO: 241)

YYGMH VIWYDGSNKYYAD DHDYGVLYY iPS:4805 iPS:481499

SVKG FDY

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 242) 243) NO: 244)

ACTAGTGGAGTGG CTCATTTATTGGA AGACATGGC 6B1,1 NA GTGTGGGC ATGATGATAAGCG TACGATAGG

ATGCGTGAT CTACAGCCCATCT GCTTTTGAT

CTGAAGAGC ATC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 245) 246) NO: 247)

TSGVGVG LIYWNDDKRYSPS RHGYDRMRD LKS AFDI

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 248) 249) NO: 250)

AGCTACTTTATAC ATAATCAACCCTA GATCAGGAG AC GTGGTGGTAGCAC GGAGCAGTG AAGCTACGCACAG GCTGGTACA AAGTTCCAGGGC GACTACTAC NA TTCTACGGT

ATGGACGTC 1G9,1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 251) 252) NO: 253)

SYFIH IINPSGGSTSYAQ DQEGAVAGT iPS:480529

KFQG DYYFYGMDV

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 254) 255) NO: 256)

AGCTATGGCATGC GTTATATCATATG GATGCCAGT AC ATGGAAATAATAA GGGAGCTCC ATACTATGCAGAC CTCTACCTT

NA 6E12, TCCGTGAAGGGC GACTAC 1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID iPS:480533 257) 258) NO: 259)

SYGMH VISYDGNNKYYAD DASGSSLYL AA SVKG DY

(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 260) 261) NO: 262)

AACTATGGCATGC GTTATATCATATG GATGCCAGT AC ATGGAAGTAAAAA GGGAGCTCC ATACTATGCAGAC CTCTACTCT NA

TCCGTGAAGGGC GACTAC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 9G5,1 263) 264) NO: 265)

NYGMH VISYDGSKKYYAD DASGSSLYS iPS:480548

SVKG DY

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 266) 267) NO: 268)

AGCTATGGCATGC GTTATATCAAAAG GATGCCAGT AC ATGGAAGTTATAA GGGAGCTCC ATACTATGCGGAC CTCTACTTA NA

TCCGTGAAGGGC GACTAC 5A12, (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 1 269) 270) NO: 271)

SYGMH VISKDGSYKYYAD DASGSSLYL iPS:480551

SVKG DY

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 272) 273) NO: 274)

AGCTATGGCATGC GTTATATGGTATG GACTTTGCT

AC ATGGAAGTAATAA TACTTCTAC 6B11, ATACCATGCAGAC TACGGTATG iPS:480555

NA 1 TCCGTGAAGGGC GACGTC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 275) 276) NO: 277)

SYGMH VIWYDGSNKYHAD DFAYFYYGM SVKG DV

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 278) 279) NO: 280)

ACTAGTGGAGTGG CTCATTTATTGGA AGACATGGC GTGTGGGC ATGATGATAAGCG TACGATAGG CTACAGCCCATCT ATGCGTGAT NA CTGAAGAGC GCTTTTGAT

ATC 8C8,1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 281) 282) NO: 283)

TSGVGVG LIYWNDDKRYSPS RHGYDRMRD iPS:480558

LKS AFDI

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 284) 285) NO: 286)

AGTGGTGGTTACT TACATCTCTTACA GAGAGCCCT ACTGGAGC GTGGGAGCACCTA ACGGTGACT CTACAACCCGTCC ACGGCTTTT NA

CTCAAGAGT GATATC 8G12, (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 1 287) 288) NO: 289)

SGGYYWS YISYSGSTYYNPS ESPTVTTAF iPS:480561

LKS DI

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 290) 291) NO: 292)

AGTGGTGGTTACG AACATTTATTACA GATCGCCCT iPS:480572 9D3,1 ACTGGAGC GTGGGAGGACCTA TATGGAGGT

NA _LC1 CTACAACCCGTCC AATTCCGGC

CTCAAGAGT TACTACTAC GGTATGGAC

GTC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 293) 294) NO: 295)

SGGYDWS NIYYSGRTYYNPS DRPYGGNSG LKS YYYGMDV

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 296) 297) NO: 298)

AGTGGTGGTTACG AACATTTATTACA GATCGCCCT ACTGGAGC GTGGGAGGACCTA TATGGAGGT CTACAACCCGTCC AATTCCGGC CTCAAGAGT TACTACTAC NA

GGTATGGAC 9D3,1 GTC _LC2 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 299) 300) NO: 301)

SGGYDWS NIYYSGRTYYNPS DRPYGGNSG iPS:480573

LKS YYYGMDV

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 302) 303) NO: 304)

AGTAGTAGTTACT AGTATCTATTATG GAACTGCGG ATTGGGGC GTGGGAACACCTA AGGGCTTTT CTACAACCCGTCC GATATC NA

CTCAAGAGT 6C9,1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID iPS:481500 305) 306) NO: 307)

SSSYYWG SIYYGGNTYYNPS ELRRAFDI AA LKS

(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 308) 309) NO: 310)

AGTGGTAGTTACT AGTATCTATTATG GAACTGCGG ACTGGGGC GTGGGAACACCTA AGGGCTTTT CTACAACCCGTCC GATATC NA

CTCAAGAGT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 4E2,1 311) 312) NO: 313)

SGSYYWG SIYYGGNTYYNPS ELRRAFDI iPS:481501

LKS

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 314) 315) NO: 316)

AGCTTTGGCATGCA ATTTTATCATTTG GAGGGGGGGT C ATGGAAATAATAA ATAACTGGAA ATACTATGCAGAC CTACGACTTT NA

TCCGTGAAGGGC GACTAC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 3D5,1 317) 318) NO: 319)

SFGMH ILSFDGNNKYYAD EGGYNWNYDF iPS:481983

SVKG DY

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 320) 321) NO: 322)

AGTGGTGGTGACTA TATATCTATTACA TCGGGTGTAG

CTGGAGC CTGGGAGCACCAA CAATGGCTCG 5D11, CTACAACCCCTCC CTTTGACTAC iPS:481984

NA 1 CTCAAGAGT (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 323) 324) NO: 325)

SGGDYWS YIYYTGSTNYNPS SGVAMARFDY LKS

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 326) 327) NO: 328)

AGTGGTGGCTACCA TACATCTATTACA GAGACTACGG CTGGAGC GTGGGAGCACCTA TGGTAAAGGG CTACAACCCGTCC GTACTTCGAT NA

CTCAAGAGT CTC (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 1H1,1 329) 330) NO: 331)

SGGYHWS YIYYSGSTYYNPS ETTVVKGYFD iPS:481989

LKS L

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 332) 333) NO: 334)

TACGCCTGGATGGG CGTATTAAAAGCA GATGGGGCAC C AAACTGATGGTGG TGGCCCCCCA GACAACAGACTAC CGGCTAC NA GCTGCACCCGTGA

AAGGC 9E8,1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID 335) 336) NO: 337)

YAWMG RIKSKTDGGTTD DGALAPHGY iPS:480570

YAAPVKG

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 338) 339) 340)

AGTGGTGGTTAC TACATCTATTAC TGGGGAGCAGCA iPS:480538

TTCTGGAGC AGTGGGAGCACC GCCGGCTTTGAC 2B6,1 NA

TACTACAACCCG TAT TCCCTCAAGAGT

(SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 341) 342) 343)

SGGYFWS YIYYSGSTYYNP WGAAAGFDY SLKS

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 344) 345) 346)

AGCTATGGCATG GTTATATCATAT GATGCCAGTGGG CAC GATGGAAATAAT AGCTCCCTCTAC AAATACTATGCA CTTGACTAC NA GACTCCGTGAAG

GGC 1D2,1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 347) 348) 349)

SYGMH VISYDGNNKYYA DASGSSLYLDY iPS:480569

DSVKG

AA (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 350) 351) 352)

[0147] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, e 351. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 268, 272, 276, 280, 284, 288, 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, e 352. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 267, 271, 275, 279, 283,

287, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, e 351 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 268, 272, 276, 280, 284, 288, 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, e 352. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma combinação de região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 267 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 268; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 271 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 272; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 275 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 276; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 279 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 280; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 283 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 284; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 287 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 288; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 291 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 292; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 295 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 296; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 299 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 300; uma região variável de cadeia leve compreendendo

SEQ ID NO: 303 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 304; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 307 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 308; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 311 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 312; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 315 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 316; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 319 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 320; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 323 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 324; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 327 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 328; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 331 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 332; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 335 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 336; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 339 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 340; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 343 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 344; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 347 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 348; e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 351 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 352.

[0148] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, e 349.. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 266, 270, 274, 278, 282, 286, 290, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, e 350. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 265, 269, 273, 277, 281, 285, 289, 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, e 349 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 266, 270, 274, 278, 282, 286, 290, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, e 350. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma combinação de região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 265 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 266; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 269 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 270; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 273 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 274; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 277 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 278; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 281 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 282; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 285 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 286; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 289 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 290; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 293 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 294; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 297 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 298; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 301 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 302; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 305 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 306; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 309 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 310; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 313 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 314; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 317 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 318; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 321 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 322; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 325 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 326; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 329 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 330; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 333 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 334; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 337 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 338; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 341 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 342; uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 345 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 346; e uma região variável de cadeia leve codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 349 e uma região variável de cadeia pesada codificada por uma sequência de polinucleotídeo compreendendo SEQ ID NO: 350.

[0149] Algumas proteínas de ligação ao antígeno compreendem um domínio leve variável e um domínio pesado variável como listado em uma das linhas para um dos anticorpos listados na TABELA 3. Em alguns casos, a proteína de ligação ao antígeno compreende dois domínios leves variáveis idênticos e dois domínios pesados variáveis idênticos de um dos anticorpos listados na TABELA 3. Algumas proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas compreendem um domínio leve variável e um domínio pesado variável como listados em uma das linhas de um dos anticorpos listados na TABELA 3, exceto que um dos ou ambos os domínios diferem da sequência especificada na tabela em somente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos, em que cada tal diferença de sequência é independentemente uma deleção, inserção ou substituição de aminoácido único, com as deleções, inserções e/ou substituições resultando em não mais do que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 mudanças de aminoácidos em relação às sequências de domínio variável especificadas na TABELA 3. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno compreende uma sequência de região variável da Tabela 3, mas com a metionina N-terminal deletada. Outras proteínas de ligação ao antígeno compreendem também um domínio leve variável e um domínio pesado variável como listados em uma das linhas para um dos anticorpos listados na TABELA 3, exceto que um dos ou ambos os domínios diferem da sequência especificada na tabela na medida em que o domínio variável de cadeia pesada e/ou domínio variável de cadeia leve compreendem uma ou consistem em uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com as sequências de aminoácidos das sequências de domínio variável de cadeia pesada ou domínio variável de cadeia leve como especificado na TABELA 3.

[0150] Em outro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno consiste apenas em um domínio variável leve ou domínio variável pesado de um anticorpo listado na TABELA 3. Ainda em outro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno compreende dois ou mais dos mesmos domínios variáveis pesados ou dois ou mais dos mesmos domínios variáveis leves daqueles listados na TABELA 3. Tais anticorpos de domínio podem ser fundidos em conjunto ou unidos através de um ligante como descrito em maior detalhe em baixo. Os anticorpos do domínio podem ser também fundidos ou ligados a uma ou mais moléculas para prolongar a meia-vida (p.ex., PEG ou albumina).

[0151] Outras proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas são variantes de anticorpos formadas por combinação das cadeias pesadas e leves mostradas na TABELA 3 e compreendem cadeias leves e/ou pesadas que têm cada uma pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com as sequências de aminoácidos destas cadeias. Em alguns casos, tais anticorpos incluem pelo menos uma cadeia pesada e uma cadeia leve, ao passo que em outros casos as formas variantes contêm duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas.

[0152] As várias combinações de regiões variáveis de cadeia pesada podem ser combinadas com qualquer uma das várias combinações de regiões variáveis de cadeia leve.

[0153] Em uma modalidade adicional, a proteína de ligação ao antígeno isolada proporcionada aqui é um anticorpo humano compreendendo uma sequência como apresentada na TABELA 3 e é do tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

[0154] As proteínas de ligação ao antígeno divulgadas aqui são polipeptídeos nos quais uma ou mais CDR são enxertadas, inseridas e/ou unidas. Uma proteína de ligação ao antígeno pode ter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDR. Uma proteína de ligação ao antígeno pode ter assim, por exemplo, uma CDR1 de cadeia pesada (“CDRH1”) e/ou uma CDR2 de cadeia pesada (“CDRH2”) e/ou uma CDR3 de cadeia pesada (“CDRH3”) e/ou uma

CDR1 de cadeia leve (“CDRL1”) e/ou uma CDR2 de cadeia leve (“CDRL2”) e/ou uma CDR3 de cadeia leve (“CDRL3”). Algumas proteínas de ligação ao antígeno incluem tanto uma CDRH3 como uma CDRL3. CDR de cadeias leves e pesadas específicas estão identificadas nas TABELAS 4A e 4B, respectivamente.

[0155] As regiões determinantes da complementaridade (CDR) e regiões de arcabouço (FR) de um dado anticorpo podem ser identificadas usando o sistema descrito por Kabat et al. em Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, Publicação NIH no. 91-3242, 1991. Certos anticorpos que são divulgados aqui compreendem uma ou mais sequências de aminoácidos que são idênticas ou têm identidade de sequências substancial com as sequências de aminoácidos de uma ou mais das CDR apresentadas nas TABELAS 4A e 4B. Estas CDR usam o sistema descrito por Kabat et al. como notado acima.

[0156] A estrutura e propriedades de CDR dentro de um anticorpo ocorrendo naturalmente foram descritas, supra. Resumidamente, em anticorpo tradicional, as CDR estão embebidas dentro de um arcabouço na região variável de cadeia leve e pesada onde constituem as regiões responsáveis pela ligação e reconhecimento do antígeno. Uma região variável compreende pelo menos três CDR de cadeia pesada ou leve, ver, supra (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD; ver também Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-883), dentro de uma região de arcabouço (designadas regiões de arcabouço 1-4, FR1, FR2, FR3 e FR4, por Kabat et al., 1991, supra; ver também Chothia e Lesk, 1987, supra). As CDR proporcionadas aqui, no entanto, podem não só ser usadas para definir o domínio de ligação ao antígeno de uma estrutura de anticorpo de tradicional, mas podem estar embebidas em uma variedade de outras estruturas de polipeptídeo, como descrito aqui.

[0157] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL1 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, e 130. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL2 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, e 131. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL3 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, e 132. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRH1 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, e 262. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRH2 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 137, 143, 149, 155, 161, 167, 173, 179, 185, 191, 197, 203, 209, 215, 221, 227, 233, 239, 245, 251, 257, e 263. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRH3 compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, e 264. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, em que cada CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente, compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, e SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, e SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, e SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, e SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, e SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, e SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, e SEQ ID NO: 174; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, e SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, e SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, e SEQ ID NO: 192; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, e SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, e SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, e SEQ ID NO: 210; SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, e SEQ ID NO: 216; SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO:

89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, e SEQ ID NO: 222; SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, e SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, e SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, e SEQ ID NO: 240; SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, e SEQ ID NO: 246; SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, e SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, e SEQ ID NO: 258; e SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, e SEQ ID NO: 264.

[0158] Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3 codificada por um nucleotídeo. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL1 codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43, 49, 55, 61, 67, 73, 79, 85, 91, 97, 103, 109, 115, 121, e 127. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL2 codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44, 50, 56, 62, 68, 74, 80, 86, 92, 98, 104, 110, 116, 122, e 128. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL3 codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45, 51, 57, 63, 69, 75, 81, 87, 93, 99, 105, 111, 117, 123, e 129. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRH1 codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 133, 139, 145, 151, 157, 163, 169, 175, 181, 187, 193, 199, 205, 211, 217, 223, 229, 235, 241, 247, 253, e 259. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRH2 codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 134, 140, 146, 152, 158, 164, 170, 176, 182, 188, 194, 200, 206, 212, 218, 224, 230, 236, 242, 248, 254, e 260. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRH3 codificada por uma sequência de polinucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 135, 141, 147, 153, 159, 165, 171, 177, 183, 189, 195, 201, 207, 213, 219, 225, 231, 237, 243, 249, 255, e

261. Em uma modalidade, o anticorpo ou seu fragmento compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, em que cada CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente, é codificada por uma sequência compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 134, e SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 140, e SEQ ID NO: 141; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 146, e SEQ ID NO: 147; SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 152, e SEQ ID NO: 153; SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 158, e SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 164, e SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 170, e SEQ ID NO: 171; SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID

NO: 175, SEQ ID NO: 176, e SEQ ID NO: 177; SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 182, e SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 188, e SEQ ID NO: 189; SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, e SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 200, e SEQ ID NO: 201; SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 206, e SEQ ID NO: 207; SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 211, SEQ ID NO: 212, e SEQ ID NO: 213; SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 217, SEQ ID NO: 218, e SEQ ID NO: 219; SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 223, SEQ ID NO: 224, e SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 229, SEQ ID NO: 230, e SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 235, SEQ ID NO: 236, e SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 241, SEQ ID NO: 242, e SEQ ID NO: 243; SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 247, SEQ ID NO: 248, e SEQ ID NO: 249; SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 253, SEQ ID NO: 254, e SEQ ID NO: 255; e SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 259, SEQ ID NO: 260, e SEQ ID NO: 261.

[0159] Em outro aspecto, uma proteína de ligação ao antígeno inclui 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 formas variantes das CDR listadas nas TABELAS 4A e 4B, tendo cada CDR pelo menos 80%, 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com uma sequência de CDR listada nas TABELAS 4A e 4B. Algumas proteínas de ligação ao antígeno incluem 1, 2,

3, 4, 5 ou 6 das CDR listadas nas TABELAS 4A e 4B, cada uma ou coletivamente diferindo por não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos das CDR listadas em esta tabela.

[0160] Em várias outras modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é derivada de tais anticorpos. Por exemplo, em um aspecto, a proteína de ligação ao antígeno compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 das CDR listadas em uma das linhas para qualquer anticorpo particular listado nas TABELAS 4A e 4B. Em um outro aspecto, uma proteína de ligação ao antígeno inclui 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 formas variantes das CDR listadas nas TABELAS 4A e 4B, tendo cada CDR pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequências com uma sequência de CDR listada nas TABELAS 4A e 4B. Algumas proteínas de ligação ao antígeno incluem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 das CDR listadas nas TABELAS 4A e 4B, cada uma ou coletivamente diferindo por não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos das CDR listadas em estas tabelas. Em outro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno compreende todas as 6 das CDRS listadas em uma linha das TABELAS 4A e 4B e o número total de alterações de aminoácidos nas CDR coletivamente é não mais do que 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos.

[0161] Ainda em outro aspecto, as proteínas de ligação ao antígeno contendo as CDR e/ou domínios variáveis listados nas TABELAS 3, 4A e 4B são um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo multiespecífico ou um fragmento de anticorpo dos anteriores. Em outra modalidade, o fragmento de anticorpo das proteínas de ligação ao antígeno isoladas proporcionadas aqui é um fragmento Fab, um fragmento Fab´, um fragmento F(ab´)2, um fragmento Fv, um diacorpo ou um scFv com base em um anticorpo com as sequências como listadas nas TABELAS 3, 4A e 4B.

[0162] Ainda em outro aspecto, a proteína de ligação ao antígeno isolada proporcionada nas TABELAS 3, 4A e 4B pode ser acoplada a um grupo de marcação e pode competir quanto à ligação a Jagged1 com uma proteína de ligação ao antígeno de uma das proteínas de ligação ao antígeno isoladas proporcionadas aqui.

[0163] Em outra modalidade são proporcionadas proteínas de ligação ao antígeno que competem com um dos anticorpos ou fragmentos funcionais exemplificados descritos acima para ligação específica a um Jagged1 humano (p.ex., SEQ ID NO: 353). Tais proteínas de ligação ao antígeno podem se ligar ao mesmo epítopo que uma das proteínas de ligação ao antígeno descritas aqui ou a um epítopo de sobreposição. É esperado que as proteínas e fragmentos de ligação ao antígeno que competem com as proteínas de ligação ao antígeno exemplificadas mostrem propriedades funcionais similares. As proteínas e fragmentos de ligação ao antígeno exemplificados incluem aqueles descritos acima, incluindo aqueles com domínios de região variável e CDR incluídos nas TABELAS 3, 4A e 4B. Assim, como um exemplo específico, as proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas incluem aquelas que competem com um anticorpo tendo: todas as 6 CDR listadas para qualquer anticorpo listado nas TABELAS 4A e 4B; ou um VH e um VL listados para qualquer anticorpo listado na TABELA 3.

[0164] As proteínas de ligação ao antígeno que são proporcionadas incluem anticorpos monoclonais que se ligam a Jagged1. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos usando qualquer técnica conhecida na técnica, p.ex., por imortalização de células de baço coletadas do animal transgênico após completação do programa de imunização. As células do baço podem ser imortalizadas usando qualquer técnica conhecida na técnica, p.ex., por sua fusão com células de mieloma para produzir hibridomas. As células de mieloma para uso em procedimentos de fusão produtores de hibridoma não são preferencialmente produtoras de anticorpos, têm elevada eficiência de fusão e deficiências em enzimas que as tornam incapazes de crescer em certos meios seletivos que suportam o crescimento somente das células fundidas desejadas (hibridomas). Exemplos de linhas de células adequadas para uso em fusões de camundongo incluem Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 e S194/5XXO Bul; exemplos de linhas de células usadas em fusões de rato incluem R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e 4B210. Outras linhas de células úteis para fusões de células são U-266, GM1500- GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6.

[0165] Em alguns casos, uma linha de células de hibridoma é produzida por imunização de um animal (p.ex., um animal transgênico tendo sequências de imunoglobulina humana) com um imunogênio de Jagged1; coleta de células de baço a partir do animal imunizado; fusão das células de baço coletadas a uma linha de células de mieloma, gerando deste modo células de hibridoma; estabelecimento de linhas de células de hibridoma a partir das células de hibridoma e identificação de uma linha de células de hibridoma que produz um anticorpo que se liga a um polipeptídeo Jagged1. Tais linhas de células de hibridoma e anticorpos monoclonais anti-Jagged1 produzidos por eles são aspectos do presente pedido.

[0166] Os anticorpos monoclonais secretados por uma linha de células de hibridoma podem ser purificados usando qualquer técnica conhecida na técnica. Os hibridomas ou mAbs podem ser adicionalmente rastreados para identificar mAbs com propriedades particulares, tais como a capacidade de aumentar a atividade de Jagged1.

[0167] Anticorpos quiméricos e humanizados baseados nas sequências anteriores são também proporcionados. Os anticorpos monoclonais para uso como agentes terapêuticos podem ser modificados de vários modos antes do uso. Um exemplo é um anticorpo quimérico, que é um anticorpo composto por segmentos de proteína de diferentes anticorpos que são covalentemente unidos para produzir cadeias leves ou pesadas de imunoglobulina funcionais ou suas porções imunologicamente funcionais. Geralmente, uma porção da cadeia pesada e/ou cadeia leve é idêntica ou homóloga a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo. Para métodos se relacionando com anticorpos quiméricos ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 4,816,567; e Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855, que são deste modo incorporados por referência. A enxertia de CDR é descrita, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos No.

6,180,370, No. 5,693,762, No. 5,693,761, No. 5,585,089 e No. 5,530,101.

[0168] Geralmente, o objetivo de produzir um anticorpo quimérico é criar uma quimera na qual o número de aminoácidos da espécie de paciente pretendida é maximizado. Um exemplo é o anticorpo “enxertado com CDR”, no qual o anticorpo compreende uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDR) de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o restante da(s) cadeia(s) de anticorpo é idêntico ou homólogo a uma sequência correspondente em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo. Para uso em humanos, a região variável ou CDR selecionadas de um anticorpo de roedor são frequentemente enxertadas em um anticorpo humano, substituindo as regiões variáveis naturais ou CDR do anticorpo humano ocorrendo naturalmente.

[0169] Um tipo útil de anticorpo quimérico é um anticorpo “humanizado”. Geralmente, um anticorpo humanizado é produzido a partir de um anticorpo monoclonal criado inicialmente em um animal não humano. Certos resíduos de aminoácidos em este anticorpo monoclonal, tipicamente de porções de reconhecimento de não antígeno do anticorpo, são modificados para serem homólogos a resíduos correspondentes em um anticorpo humano de isotipo correspondente. A humanização pode ser realizada, por exemplo, usando vários métodos por substituição de pelo menos uma porção de uma região variável de roedor pelas regiões correspondentes de um anticorpo humano (ver, p.ex., Patentes dos Estados Unidos No. 5,585,089 e No. 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature

321: 522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332: 323-27; Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536).

[0170] Em um aspecto, as CDR das regiões variáveis de cadeia leve e pesada dos anticorpos proporcionados aqui são enxertadas em regiões de arcabouço (FR) de anticorpos da mesma espécie filogenética ou de espécie filogenética diferente. Por exemplo, as CDR das regiões variáveis de cadeia pesada e leve VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12 e/ou VL1 e VL2 podem ser enxertadas em FR humanas de consenso. Para criar FR humanas de consenso, FR de várias sequências de aminoácidos de cadeia pesada ou cadeia leve humana podem ser alinhadas para identificar uma sequência de aminoácidos de consenso. Em outras modalidades, as FR de uma cadeia pesada ou cadeia leve divulgadas aqui são substituídas pelas FR de uma cadeia pesada ou cadeia leve diferente. Em um aspecto, os aminoácidos raros nas FR das cadeias pesadas e leves dos anticorpos para Jagged1 não estão substituídos, enquanto o resto dos aminoácidos de FR está substituído. Um “aminoácido raro” é um aminoácido específico que está em uma posição na qual este aminoácido particular não é usualmente encontrado em um FR. Alternativamente, as regiões variáveis enxertadas da uma cadeia pesada ou leve podem ser usadas com uma região constante que é diferente da região constante dessa cadeia pesada ou leve particular como divulgado aqui. Em outras modalidades, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeia única.

[0171] Em certas modalidades, regiões constantes de espécies diferentes da humana podem ser usadas em conjunto com a(s) região(ões) variável(eis) humana(s) para produzir anticorpos híbridos.

[0172] Anticorpos para Jagged1 totalmente humanos são também proporcionados. Estão disponíveis métodos para produção de anticorpos totalmente humanos específicos para um dado antígeno sem expor seres humanos ao antígeno (“anticorpos totalmente humanos”). Um meio específico proporcionado para implementação da produção de anticorpos totalmente humanos é a “humanização” do sistema imunitário humoral do camundongo. A introdução de loci de imunoglobulina (Ig) humana em camundongos nos quais os genes de Ig endógenos foram inativados é um meio de produção de anticorpos monoclonais (mAbs) totalmente humanos no camundongo, um animal que pode ser imunizado com qualquer antígeno desejável. O uso de anticorpos totalmente humanos pode minimizar as respostas imunológicas e alérgicas que podem por vezes ser causadas por administração de mAbs de camundongo ou derivados de camundongo a humanos como agentes terapêuticos.

[0173] Os anticorpos totalmente humanos podem ser produzidos por imunização de animais transgênicos (usualmente camundongos) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Os antígenos para este propósito têm tipicamente seis ou mais aminoácidos contíguos e, opcionalmente, estão conjugados com um transportador, tal como um hapteno. Ver, p.ex., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362: 255-258; e Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7: 33. Em um exemplo de um tal método, os animais transgênicos são produzidos por incapacitação dos loci de imunoglobulina endógena do camundongo codificando as cadeias de imunoglobulina pesadas e leves do camundongo e inserção no genoma do camundongo de grandes fragmentos de loci contendo DNA de genoma humano que codificam proteínas de cadeia pesada e leve humanas. Os animais parcialmente modificados, que têm menos do que o complemento total de loci de imunoglobulina humana, são depois cruzados para obter um animal tendo todas as modificações do sistema imunitário desejadas. Quando lhes é administrado um imunogênio, estes animais transgênicos produzem anticorpos que são imunoespecíficos para o imunogênio mas têm sequências de aminoácidos humanas em vez de murinas, incluindo as regiões variáveis. Para detalhes adicionais de tais métodos ver, por exemplo, WO96/33735 e WO94/02602. Métodos adicionais relacionados com camundongos transgênicos para produção de anticorpos humanos são descritos nas Patentes dos Estados Unidos No. 5,545,807; No. 6,713,610; No. 6,673,986; No. 6,162,963; No. 5,545,807; No. 6,300,129; No. 6,255,458; No. 5,877,397; No. 5,874,299 e No. 5,545,806; nas publicações PCT WO91/10741, WO90/04036 e em EP 546073B1 e EP 546073A1.

[0174] Os camundongos transgênicos descritos acima, referidos aqui como camundongos "HuMab", contêm um minilócus do gene da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada ([mu] e [gama]) e leve [kappa] humanas não rearranjadas, em conjunto com mutações visadas que inativam os loci das cadeias [mu] e [kappa] endógenas (Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859). Conformemente, os camundongos exibem expressão reduzida de IgM ou [kappa] de camundongo e em resposta à imunização, e os transgenes das cadeias pesada e leve humanas introduzidos sofrem troca de classes e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais humanos IgG [kappa] de elevada afinidade (Lonberg et al., supra.; Lonberg e Huszar, 1995, Intern.

Rev.

Immunol. 13: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann.

N.Y Acad.

Sci. 764: 536-546). A preparação de camundongo HuMab é descrita em detalhe em Taylor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J.

Immunol. 152: 2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp.

Pharmacology 113: 49-101; Taylor et al., 1994, International Immunology 6: 579-591; Lonberg e Huszar, 1995, Intern.

Rev.

Immunol. 13: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann.

N.Y Acad.

Sci. 764: 536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851; as referências anteriores são deste modo incorporadas por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

Ver, adicionalmente, Patentes dos Estados Unidos No. 5,545,806; No. 5,569,825; No. 5,625,126; No. 5,633,425; No. 5,789,650; No. 5,877,397; No. 5,661,016; No. 5,814,318; No. 5,874,299; e No. 5,770,429; bem como Patentes dos Estados Unidos No. 5,545,807; Publicações Internacionais Nos.

WO 93/1227; WO 92/22646; e WO 92/03918, as divulgações de todas as quais são deste modo incorporadas por referência na sua totalidade para todos os propósitos.

Tecnologias utilizadas para produção de anticorpos humanos em estes camundongos transgênicos são também divulgadas em WO 98/24893 e Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156, que são deste modo incorporados por referência.

Por exemplo, as estirpes de camundongos transgênicos HCo7 e HCo12 podem ser usadas para gerar anticorpos monoclonais humanos contra Jagged1. Detalhes adicionais dizendo respeito à produção de anticorpos humanos usando camundongos transgênicos são proporcionados em baixo.

[0175] Usando tecnologia de hibridoma, mAbs humanos específicos do antígeno com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados a partir dos camundongos transgênicos tais como aqueles descritos acima. Tais anticorpos podem ser clonados e expressos usando um vetor e célula hospedeira adequados, ou os anticorpos podem ser coletados a partir de células de hibridoma cultivadas.

[0176] Os anticorpos totalmente humanos podem ser também derivados a partir de bibliotecas de exibição em fagos (como divulgado em Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; e Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581). As técnicas de exibição em fagos mimetizam a seleção imunitária através da exibição de repertórios de anticorpos na superfície de bacteriófago filamentoso, e subsequente seleção de fagos pela sua ligação a um antígeno de escolha. Uma tal técnica é descrita na Publicação PCT No. WO 99/10494 (deste modo incorporada por referência).

[0177] A proteína de ligação a Jagged1 pode ser também uma variante, mimético, derivado ou oligômero com base na estrutura de proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 tendo as CDR, regiões variáveis e/ou cadeias de comprimento total como descrito acima.

[0178] Em uma modalidade, por exemplo, uma proteína de ligação ao antígeno é uma forma variante das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas acima. Por exemplo, algumas das proteínas de ligação ao antígeno têm uma ou mais substituições de aminoácidos conservativas em uma ou mais das cadeias leves ou pesadas, regiões variáveis ou CDR.

[0179] Os aminoácidos ocorrendo naturalmente podem ser divididos em classes com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: 1) hidrofóbicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; 2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; 3) ácidos: Asp, Glu; 4) básicos: His, Lys, Arg; 5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: Gly, Pro; e 6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

[0180] As substituições de aminoácidos conservativas podem envolver troca de um membro de uma destas classes por outro membro da mesma classe. As substituições de aminoácidos conservativas podem englobar resíduos de aminoácidos não ocorrendo naturalmente, que são tipicamente incorporados por síntese química de peptídeos em vez de por síntese em sistemas biológicos. Estes incluem peptidomiméticos e outras formas revertidas ou invertidas de frações de aminoácidos.

[0181] As substituições não conservativas podem envolver a troca de um membro de uma das classes acima por um membro de outra classe. Tais resíduos substituídos podem ser introduzidos em regiões do anticorpo que são homólogas com anticorpos humanos ou nas regiões não homólogas da molécula.

[0182] Ao se fazerem tais mudanças, de acordo com certas modalidades, o índice hidropático dos aminoácidos pode ser considerado. O perfil hidropático de uma proteína é calculado por atribuição a cada aminoácido de um valor numérico

(“índice de hidropatia”) e depois cálculo repetitivo da média destes valores ao longo da cadeia de peptídeo. A cada aminoácido foi atribuído um índice hidropático com base nas suas características de hidrofobicidade e carga. Eles são: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (- 3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

[0183] A importância do perfil hidropático na conferição de função biológica interativa a uma proteína é entendida na técnica (ver, p.ex., Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-131). É conhecido que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos tendo um índice ou pontuação hidropática similar e ainda reter uma atividade biológica similar. Ao se fazerem mudanças com base no índice hidropático, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ± 2 está incluída. Em alguns aspectos, aqueles que estão dentro de ± 1 estão incluídos e, em outros aspectos, aqueles dentro de ± 0,5 estão incluídos.

[0184] É também entendido na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode ser feita eficazmente com base na hidrofilicidade, particularmente onde a proteína ou peptídeo biologicamente funcional deste modo criado se destina para uso em modalidades imunológicas, como no presente caso. Em certas modalidades, a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, como governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona com a sua imunogenicidade e ligação ao antígeno ou imunogenicidade, isto é, com uma propriedade biológica da proteína.

[0185] Os seguintes valores de hidrofilicidade foram atribuídos a estes resíduos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) e triptofano (-3,4). Ao se fazerem mudanças com base em valores de hidrofilicidade similares, em certas modalidades, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ± 2 está incluída, em outras modalidades, aqueles que estão dentro de ± 1 estão incluídos e, em ainda outras modalidades, aqueles dentro de ± 0,5 estão incluídos. Em alguns casos se podem também identificar epítopos a partir de sequências primárias de aminoácidos com base na hidrofilicidade. Estas regiões são também referidas como “regiões de núcleo epitópico”.

[0186] Substituições de aminoácidos conservativas exemplificativas são apresentadas na Tabela 5. Tabela 5: Substituições de Aminoácidos Conservativas Resíduo Original Substituições Exemplificativas Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His

Resíduo Original Substituições Exemplificativas Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Pro His Asn, Gln Ile Leu, Val Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe Met, Leu, Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe Val Ile, Leu

[0187] Um especialista perito será capaz de determinar variantes adequadas de polipeptídeos como apresentado aqui usando técnicas bem conhecidas. Um perito na técnica pode identificar áreas adequadas da molécula que possam ser mudadas sem destruir a atividade visando a regiões que não se acredita serem importantes para a atividade. O especialista perito será também capaz de identificar resíduos e porções das moléculas que são conservados entre polipeptídeos similares. Em outras modalidades, mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem estar sujeitas a substituições de aminoácidos conservativas sem destruir a atividade biológica ou sem afetar adversamente a estrutura de polipeptídeo.

[0188] Adicionalmente, um perito na técnica pode rever estudos de estrutura-função identificando resíduos em polipeptídeos similares que são importantes para a atividade ou estrutura. Em vista de uma tal comparação se pode prever a importância de resíduos de aminoácidos em uma proteína que correspondem a resíduos de aminoácidos importantes para a atividade ou estrutura em proteínas similares. Um perito na técnica pode optar por substituições de aminoácidos quimicamente semelhantes para tais resíduos de aminoácidos previstos importantes.

[0189] Um perito na técnica pode também analisar a estrutura tridimensional e a sequência de aminoácidos em relação a essa estrutura em polipeptídeos similares. Em vista de tal informação, um perito na técnica pode prever o alinhamento de resíduos de aminoácidos de um anticorpo no que diz respeito à sua estrutura tridimensional. Um perito na técnica pode escolher não fazer mudanças radicais aos resíduos de aminoácidos previstos como estando na superfície da proteína, uma vez que tais resíduos podem estar envolvidos em interações importantes com outras moléculas. Além disso, um perto na técnica pode gerar variantes de teste contendo uma única substituição de aminoácido em cada resíduo de aminoácido desejado. Estas variantes podem ser depois rastreadas usando ensaios quanto à atividade de Jagged1,

proporcionando assim informação dizendo respeito a que aminoácidos podem ser mudados e quais não podem ser mudados. Por outras palavras, com base em informação reunida a partir de tais experiências de rotina, um perito na técnica pode facilmente determinar as posições de aminoácidos onde substituições adicionais devem ser evitadas sozinhas ou em combinação com outras mutações.

[0190] Um número de publicações científicas tem sido devotado à previsão da estrutura secundária. Ver, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7: 422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13: 222-245; Chou et al., 1974, Biochemistry 113: 211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 47: 45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47: 251-276; e Chou et al., 1979, Biophys. J. 26: 367-384. Além disso estão correntemente disponíveis programas de computador para auxiliar na previsão da estrutura secundária. Um método de previsão da estrutura secundária é baseado na modelação de homologia. Por exemplo, dois polipeptídeos ou proteínas que têm uma identidade de sequências de mais do que 30% ou similaridade maior do que 40% podem ter topologias estruturais similares. O crescimento recente da base de dados estruturais de proteínas (PDB) tem proporcionado previsibilidade intensificada da estrutura secundária, incluindo o número potencial de dobragens dentro da estrutura de um polipeptídeo ou proteína. Ver, Holm et al., 1999, Nucl. Acid. Res. 27: 244-247. Foi sugerido (Brenner et al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7: 369-376) que existe um número limitado de dobragens em um dado polipeptídeo ou proteína e que, logo que um número crítico de estruturas tenha sido resolvido, a previsão estrutural se tornará dramaticamente mais precisa.

[0191] Métodos adicionais de previsão de estrutura secundária incluem “rosqueamento” (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7: 377-387; Sippl et al., 1996, Structure 4: 15-19), “análise do perfil” (Bowie et al., 1991, Science 253: 164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183: 146- 159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84: 4355- 4358) e “linhagem evolutiva” (Ver, Holm, 1999, supra; e Brenner, 1997, supra).

[0192] Em algumas modalidades são feitas substituições de aminoácidos que: (1) reduzem a suscetibilidade à proteólise, (2) reduzem a suscetibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formação de complexos de proteínas, (4) alteram as afinidades de ligação ao antígeno ou ligante e/ou (4) conferem ou modificam outras propriedades físico- químicas ou funcionais em tais polipeptídeos. Por exemplo, substituições de aminoácidos únicas ou múltiplas (em certas modalidades, substituições de aminoácidos conservativas) podem ser feitas na sequência ocorrendo naturalmente. As substituições podem ser feitas naquela porção do anticorpo que reside fora do(s) domínio(s) formando(s) contatos intermoleculares. Em tais modalidades podem ser usadas substituições de aminoácidos conservativas que não mudam substancialmente as características estruturais da sequência genitora (p.ex., um ou mais aminoácidos de substituição que não perturbam a estrutura secundária que caracteriza a proteína de ligação ao antígeno genitora ou nativa). Exemplos de estruturas secundárias e terciárias de polipeptídeos reconhecidas na técnica são descritos em Proteins,

Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman and Company; Introduction to Protein Structure (Branden and Tooze, eds.), 1991, New York: Garland Publishing; and Thornton et al., 1991, Nature 354: 105, que são cada um incorporados aqui por referência.

[0193] Variantes de anticorpos preferenciais adicionais incluem variantes de cisteína em que um ou mais resíduos de cisteína na sequência de aminoácidos genitora ou nativa são deletados de ou substituídos por outro aminoácido (p.ex., serina). As variantes de cisteína são úteis, inter alia, quando os anticorpos têm de ser redobrados em uma conformação biologicamente ativa. As variantes de cisteína podem ter menos resíduos de cisteína do que o anticorpo nativo e, tipicamente, têm um número par para minimizar as interações resultando de cisteínas desemparelhadas.

[0194] As cadeias pesadas e leves, domínios de regiões variáveis e CDR que são divulgados podem ser usados para preparar polipeptídeos que contêm uma região de ligação ao antígeno que pode se ligar especificamente a Jagged1. Por exemplo, uma ou mais das CDR podem ser incorporadas em uma molécula (p.ex., um polipeptídeo) covalentemente ou não covalentemente para fazer uma imunoadesão. Uma imunoadesão pode incorporar a(s) CDR(s) como parte de uma cadeia de polipeptídeo maior, pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) a outra cadeia de polipeptídeo ou pode incorporar a(s) CDR(s) não covalentemente. A(s) CDR(s) permite(m) que a imunoadesão se ligue especificamente a um antígeno de interesse particular (p.ex., um polipeptídeo Jagged1 ou seu epítopo).

[0195] Miméticos (p.ex., “miméticos de peptídeos” ou “peptidomiméticos”) com base nos domínios de região variável e CDR que são descritos aqui são também proporcionados.

Estes análogos podem ser peptídeos, não peptídeos ou combinações de regiões de peptídeo e não peptídeo.

Fauchere, 1986, Adv.

Drug Res. 15: 29; Veber e Freidinger, 1985, TINS p. 392; e Evans et al., 1987, J.

Med.

Chem. 30: 1229, que são incorporados aqui por referência para qualquer propósito.

Miméticos de peptídeo que são estruturalmente similares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produzir um efeito terapêutico ou profilático similar.

Tais compostos são frequentemente desenvolvidos com o auxílio de modelação molecular computadorizada.

Geralmente, os peptidomiméticos são proteínas que são estruturalmente similares a um anticorpo exibindo uma atividade biológica desejada, tal como aqui a capacidade de se ligar especificamente a Jagged1, mas têm uma ou mais ligações de peptídeo opcionalmente substituídas por uma ligação selecionada de: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2- e -CH2SO-, por métodos bem conhecidos na técnica.

A substituição sistemática de um ou mais aminoácidos de uma sequência de consenso por um D- aminoácido do mesmo tipo (p.ex., D-lisina no lugar de L- lisina) pode ser usada em certas modalidades para gerar proteínas mais estáveis.

Adicionalmente, peptídeos restritos compreendendo uma sequência de consenso ou uma variação de sequência de consenso substancialmente idêntica podem ser gerados por métodos conhecidos na técnica (Rizo e Gierasch, 1992, Ann.

Rev.

Biochem. 61: 387), incorporados aqui por referência); por exemplo, por adição de resíduos de cisteína internos capazes de formar pontes de dissulfeto intramoleculares que ciclizam o peptídeo.

[0196] Derivados das proteínas de ligação ao antígeno que são descritas aqui são também proporcionados.

As proteínas de ligação ao antígeno derivatizadas podem compreender qualquer molécula ou substância que confere uma propriedade desejada ao anticorpo ou fragmento, tal como meia-vida aumentada em um uso particular.

A proteína de ligação ao antígeno derivatizada pode compreender, por exemplo, uma fração detectável (ou marcação) (p.ex., uma molécula radioativa, colorimétrica, antigênica ou enzimática, uma esférula detectável (tal como uma esférula magnética ou eletrodensa (p.ex., esférula (de ouro)) ou uma molécula que se liga a outra molécula (p.ex., biotina ou estreptavidina)), um grupo terapêutico ou de diagnóstico (p.ex., um marcador radioativo, citotóxico ou fração farmaceuticamente ativa) ou uma molécula que aumenta a adequabilidade da proteína de ligação ao antígeno para um uso particular (p.ex., administração a um sujeito, tal como um sujeito humano ou outros usos in vivo ou in vitro). Exemplos de moléculas que podem ser usadas para derivatizar uma proteína de ligação ao antígeno incluem albumina (p.ex., albumina de soro humano) e polietilenoglicol (PEG). Derivados ligados à albumina e PEGuilados de proteínas de ligação ao antígeno podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas na técnica.

Certas proteínas de ligação ao antígeno incluem um polipeptídeo de cadeia única peguilado como descrito aqui.

Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno é conjugada ou de outra forma ligada à transtirretina (TTR) ou uma variante de TTR.

A TTR ou variante de TTR pode ser quimicamente modificada com, por exemplo, um químico selecionado do grupo consistindo em dextrana, poli(pirrolidona de n-vinila),

polietilenoglicóis, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados e álcoois de polivinila.

[0197] Outros derivados incluem conjugados covalentes ou agregantes de proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 com outras proteínas ou polipeptídeos, tal como por expressão de proteínas de fusão recombinantes compreendendo polipeptídeos heterólogos fundidos ao terminal N ou terminal C de uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1. Por exemplo, o peptídeo conjugado pode ser um polipeptídeo de sinal heterólogo (ou líder), p.ex., o líder fator alfa de levedura, ou um peptídeo tal como um marcador de epítopo. As proteínas de fusão contendo proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 podem compreender peptídeos adicionados para facilitar a purificação ou a identificação da proteína de ligação ao antígeno Jagged1 (p.ex., poli-His). Uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 pode ser também ligada ao peptídeo FLAG como descrito em Hopp et al., 1988, Bio/Technology 6: 1204; e Patente dos Estados Unidos No. 5,011,912. O peptídeo FLAG é altamente antigênico e proporciona um epítopo reversivelmente ligado por um anticorpo monoclonal (mAb) específico, permitindo ensaio rápido e purificação fácil de proteína recombinante expressa. Reagentes úteis para preparação de proteínas de fusão nas quais o peptídeo FLAG está fundido a um dado polipeptídeo estão comercialmente disponíveis (Sigma, St. Louis, MO).

[0198] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno compreende um ou mais marcadores. O termo “grupo de marcação” ou “marcador” significa qualquer marcador detectável. Exemplos de grupos de marcação adequados incluem os, mas não estão limitados aos, seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (p.ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p.ex., FITC, rodamina, fósforos de lantanídeo), grupos enzimáticos (p.ex., peroxidase de rábano-silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos biotinila ou epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fechos de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, marcadores de epítopo). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação ao antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados como se ajustarem.

[0199] O termo “grupo efetor” significa qualquer grupo acoplado a uma proteína de ligação ao antígeno que atua como um agente citotóxico. Exemplos de grupos efetores adequados são radioisótopos ou radionuclídeos (p.ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I). Outros grupos adequados incluem toxinas, grupos terapêuticos ou grupos quimioterapêuticos. Exemplos de grupos adequados incluem calicheamicina, auristatinas, geldanamicina e maitansina. Em algumas modalidades, o grupo efetor é acoplado à proteína de ligação ao antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial.

[0200] Em geral, os marcadores estão em uma variedade de classes, dependendo do ensaio no qual são para ser detectados: a) marcadores isotópicos, que podem ser isótopos radioativos ou pesados; b) marcadores magnéticos (p.ex.,

partículas magnéticas); c) frações ativas em redox; d) corantes ópticos; grupos enzimáticos (p.ex., peroxidase de rábano-silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina); e) grupos biotinilados; e f) epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fechos de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação a metais, marcadores de epítopo, etc.). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação ao antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcação de proteínas são conhecidos na técnica.

[0201] Marcadores específicos incluem corantes ópticos, incluindo, mas não se limitando a, cromóforos, fósforos e fluoróforos, com os últimos sendo específicos em muitos casos. Os fluoróforos podem ser flúoros de “molécula pequena” ou flúoros proteináceos.

[0202] Por “marcador fluorescente” se entende qualquer molécula que possa ser detectada através das suas propriedades fluorescentes inerentes. Marcadores fluorescentes adequados incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarinas, pireno, verde Malacite, estilbena, amarelo Lucifer, AzulJ Cascade, vermelho Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, vermelho LC 640, Cy 5, Cy 5.5, vermelho LC 705, verde Oregon, os corantes Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascade,

Amarelo Cascade e R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamina e vermelho do Texas (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Corantes ópticos adequados, incluindo fluoróforos, são descritos em Molecular Probes Handbook por Richard P. Haugland, deste modo expressamente incorporado por referência.

[0203] Marcadores fluorescentes proteináceos adequados incluem também, mas não estão limitados a, proteína fluorescente verde, incluindo uma espécie de Renilla, Ptilosarcus ou Aequorea de GFP (Chalfie et al., 1994, Science 263: 802-805), EGFP (Clontech Labs, Inc., Número de Acesso do Genbank U55762), proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc., Quebec, Canadá; Stauber, 1998, Biotechniques 24: 462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6: 178-182), proteína fluorescente amarela intensificada (EYFP, Clontech Labs, Inc.), luciferase (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150: 5408-5417), β-galactosidase (Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2603-2607) e Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, Patentes dos Estados Unidos No. 5292658, No. 5418155, No. 5683888, No. 5741668, No. 5777079, No. 5804387, No. 5874304, No. 5876995, No. 5925558).

[0204] Ácidos nucleicos que codificam as proteínas de ligação ao antígeno descritas aqui, ou suas porções, são também proporcionados, incluindo ácidos nucleicos codificando uma das ou ambas as cadeias de um anticorpo, ou um seu fragmento, derivado, muteína ou variante, polinucleotídeos codificando regiões variáveis de cadeia pesada ou somente CDR, polinucleotídeos suficientes para uso como sondas de hibridação, iniciadores de PCR ou iniciadores de sequenciação para identificação, análise, mutação ou amplificação de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo, ácidos nucleicos antissenso para inibição da expressão de um polinucleotídeo e sequências complementares dos anteriores. Os ácidos nucleicos podem ter qualquer comprimento. Podem ter, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000, 1,500, 3,000, 5,000 ou mais nucleotídeos em comprimento e/ou podem compreender uma ou mais sequências adicionais, por exemplo, sequências reguladoras e/ou ser parte de um ácido nucleico maior, por exemplo, um vetor. Os ácidos nucleicos podem ter fita simples ou fita dupla e podem compreender nucleotídeos de RNA e/ou DNA e suas variantes artificiais (p.ex., ácidos nucleicos de peptídeo). Qualquer região variável proporcionada aqui pode ser anexada a estas regiões constantes para formar sequências de cadeia pesada e leve completas. No entanto deve ser entendido que estas sequências de região constante são proporcionadas somente como exemplos específicos. Em algumas modalidades, as sequências de região variável são unidas a outras sequências de região constante que são conhecidas na técnica.

[0205] Os ácidos nucleicos codificando certas proteínas de ligação ao antígeno, ou suas porções (p.ex., anticorpo de comprimento total, cadeia pesada ou leve, domínio variável ou CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 ou CDRL3) podem ser isolados a partir de células B de camundongos que foram imunizados com Jagged1 ou um seu fragmento imunogênico. O ácido nucleico pode ser isolado por procedimentos convencionais tais como reação em cadeia da polimerase (PCR). A exibição em fagos é outro exemplo de uma técnica conhecida por meio da qual derivados de anticorpos e outras proteínas de ligação ao antígeno podem ser preparados. Em uma abordagem, os polipeptídeos que são componentes de uma proteína de ligação ao antígeno de interesse são expressos em qualquer sistema de expressão recombinante adequado e é permitido que os polipeptídeos expressos se montem para formar proteínas de ligação ao antígeno.

[0206] Um aspecto proporciona adicionalmente ácidos nucleicos que hibridam com outros ácidos nucleicos sob condições de hibridação particulares. Métodos para hibridação de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Como definido aqui, uma condição de hibridação moderadamente estringente usa uma solução de pré-lavagem contendo 5x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), SDS a 0,5%, EDTA a 1,0 mM (pH 8,0), tampão de hibridação de cerca de 50% de formamida, 6x SSC e uma temperatura de hibridação de 55 °C (ou outras soluções de hibridação similares, tais como uma contendo cerca de 50% de formamida, com uma temperatura de hibridação de 42 °C) e condições de lavagem de 60 °C, em 0,5x SSC, SDS a 0,1%. Uma condição de hibridação estringente hibrida em 6x SSC a 45 °C, seguido por uma ou mais lavagens em 0,1x SSC, SDS a 0,2% a 68 °C. Além disso, um perito na técnica pode manipular as condições de hibridação e/ou lavagem para aumentar ou diminuir a estringência de hibridação tal que os ácidos nucleicos compreendendo sequências de nucleotídeos que são pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%

idênticas entre si permaneçam tipicamente hibridadas entre si.

[0207] Os parâmetros básicos afetando a escolha de condições de hibridação e orientação para criar condições adequadas são apresentados por, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., supra; e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., seções 2.10 e 6.3-6.4) e podem ser prontamente determinados por aqueles peritos na técnica com base, p.ex., no comprimento e/ou composição de bases do ácido nucleico.

[0208] Podem ser introduzidas mudanças por mutação em um ácido nucleico, levando deste modo a mudanças na sequência de aminoácidos de um polipeptídeo (p.ex., um anticorpo ou derivado de anticorpo) que ele codifica. As mutações podem ser introduzidas usando qualquer técnica conhecida na técnica. Em uma modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos particulares são mudados usando, por exemplo, um protocolo de mutagênese sítio-dirigida. Em outra modalidade, um ou mais resíduos aleatoriamente selecionados são mudados usando, por exemplo, um protocolo de mutagênese aleatória. Independentemente de como seja preparado, um polipeptídeo mutante pode ser expresso e rastreado quanto a uma propriedade desejada.

[0209] As mutações podem ser introduzidas em um ácido nucleico sem alterar significativamente a atividade biológica de um polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo se podem fazer substituições de nucleotídeos levando a substituições de aminoácidos em resíduos de amino ácidos não essenciais. Alternativamente, uma ou mais mutações podem ser introduzidas em um ácido nucleico que mudam seletivamente a atividade biológica de um polipeptídeo que ele codifica. Por exemplo, a mutação pode mudar quantitativamente ou qualitativamente a atividade biológica. Exemplos de mudanças quantitativas incluem aumento, redução ou eliminação da atividade. Exemplos de mudanças qualitativas incluem alteração da especificidade pelo antígeno de um anticorpo. Em uma modalidade, um ácido nucleico codificando qualquer proteína de ligação ao antígeno descrita aqui pode ser mutado para alterar a sequência de aminoácidos usando técnicas de biologia molecular que são bem estabelecidas na técnica.

[0210] Outro aspecto proporciona moléculas de ácido nucleico que são adequadas para uso como iniciadores ou sondas de hibridação para a detecção de sequências de ácidos nucleicos. Uma molécula de ácido nucleico pode compreender somente uma porção de uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo de comprimento total, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como uma sonda ou iniciador ou um fragmento codificando uma porção ativa de um polipeptídeo.

[0211] Sondas baseadas na sequência de um ácido nucleico podem ser usadas para detectar o ácido nucleico ou ácidos nucleicos similares, por exemplo, transcritos codificando um polipeptídeo. A sonda pode compreender um grupo de marcação, p.ex., um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um cofator de enzima. Tais sondas podem ser usadas para identificar uma célula que expressa o polipeptídeo.

[0212] Outro aspecto proporciona vetores compreendendo um ácido nucleico codificando um polipeptídeo ou uma sua porção

(p.ex., um fragmento contendo uma ou mais CDR ou um ou mais domínios de região variável). Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmídeos, vetores virais, vetores de mamíferos não epissômicos e vetores de expressão, por exemplo, vetores de expressão recombinantes.

Os vetores de expressão recombinantes podem compreender um ácido nucleico em uma forma adequada para expressão do ácido nucleico em uma célula hospedeira.

Os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais sequências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para a expressão, que estão ligadas operacionalmente à sequência de ácido nucleico a ser expressa.

As sequências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeos em muitos tipos de células hospedeiras (p.ex., intensificador gene precoce de SV40, promotor de vórus de sarcoma de Rous, promotor de citomegalovírus), aquelas que dirigem a expressão da sequência de nucleotídeos somente em certas células hospedeiras (p.ex., sequências reguladoras específicas de tecidos, ver, Voss et al., 1986, Trends Biochem.

Sci. 11: 287, Maniatis et al., 1987, Science 236: 1237, incorporados por referência aqui nas suas totalidades) e aquelas que dirigem a expressão indutível de uma sequência de nucleotídeos em resposta a tratamento ou condição particular (p.ex., o promotor de metalotionina em células de mamífero e o promotor responsivo a tet e/ou responsivo a estreptomicina em sistemas tanto procarióticos como eucarióticos (ver, id.)). Será apreciado por aqueles peritos na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Os vetores de expressão podem ser introduzidos em células hospedeiras para deste modo produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados por ácidos nucleicos com descrito aqui.

[0213] Outro aspecto proporciona células hospedeiras nas quais foi um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Uma célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica (p.ex., E. coli) ou célula eucariótica (por exemplo, células de levedura, inseto ou mamífero (p.ex., células CHO)). O DNA de vetor pode ser introduzido em células procarióticas ou eucarióticas através de técnicas de transfecção ou transformação convencionais. Para transfecção estável de células de mamíferos é conhecido que, dependendo do vetor de expressão e técnica de transfecção usados, somente uma pequena fração das células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. De modo a identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (p.ex., para resistência a antibióticos) é geralmente introduzido nas células hospedeiras em conjunto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis preferenciais incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, tais como G418, higromicina e metotrexato. As células estavelmente transfectadas com o ácido nucleico podem ser identificadas por seleção de fármacos (p.ex., as células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrem), entre outros métodos.

[0214] Sistemas e construtos de expressão na forma de plasmídeos, vetores de expressão, cassetes de transcrição ou expressão que compreendem pelo menos um polinucleotídeo como descrito acima são também proporcionados aqui, bem células hospedeiras compreendendo tais como sistemas ou construtos de expressão.

[0215] As proteínas de ligação ao antígeno proporcionadas aqui podem ser preparadas por qualquer uma de um número de técnicas convencionais. Por exemplo, as proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 podem ser produzidas por sistemas de expressão recombinantes, usando qualquer técnica conhecida na técnica. Ver, p.ex., Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Kennet et al. (eds.) Plenum Press, New York (1980); e Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).

[0216] As proteínas de ligação ao antígeno podem ser expressas em linhas de células de hibridoma (p.ex., em particular, os anticorpos podem ser expressos em hibridomas) ou em linhas de células sem ser hibridomas. Podem ser usados construtos de expressão codificando os anticorpos para transformar uma célula hospedeira de mamífero, de inseto ou microbiana. A transformação pode ser realizada usando qualquer método conhecido para introdução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, empacotamento do polinucleotídeo em um vírus ou bacteriófago e transdução de uma célula hospedeira com o construto por procedimentos de transfecção conhecidos na técnica, como exemplificado pelas Patentes dos Estados Unidos No. 4,399,216; No. 4,912,040; No. 4,740,461; No. 4,959,455. O procedimento de transformação ótimo usado dependerá de que tipo de célula hospedeira está sendo transformada. Métodos para introdução de polinucleotídeos heterólogos em células de mamíferos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, transfecção mediada por dextrana, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplastos, eletroporação, encapsulamento do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomos, mistura de ácidos nucleicos com lipídeos positivamente carregados e microinjeção direta de DNA em núcleos.

[0217] Os construtos de expressão recombinantes compreendem tipicamente uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma ou mais das seguintes: uma ou mais CDR proporcionadas aqui; uma região constante de cadeia leve; uma região variável de cadeia leve; uma região constante de cadeia pesada (p.ex., CH1, CH2 e/ou CH3); e/ou outra porção de molde de uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1. Estas sequências de ácido nucleico são inseridas em um vetor de expressão apropriado usando técnicas de ligação padrão. Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada ou leve está anexada ao terminal C da região variável de cadeia pesada ou leve específica anti-Jagged1 e está ligada em um vetor de expressão. O vetor é tipicamente selecionado para ser funcional na célula hospedeira empregue particular (i.e., o vetor é compatível com a maquinaria da célula hospedeira, permitindo que a amplificação e/ou expressão do gene possam ocorrer). Em algumas modalidades são usados vetores que empregam ensaios de complementação proteína-fragmento usando repórteres de proteínas, tais como di-hidrofolato redutase (ver, por exemplo, Pat. dos E.U.A. No. 6,270,964, que é deste modo incorporada por referência). Vetores de expressão adequados podem ser adquiridos, por exemplo, a partir da Invitrogen Life Technologies ou BD Biosciences (anteriormente “Clontech”). Outros vetores úteis para clonagem e expressão dos anticorpos e fragmentos incluem aqueles descritos em Bianchi e McGrew, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84: 439-44, que é deste modo incorporado por referência. Vetores de expressão adequados adicionais são discutidos, por exemplo, em Methods Enzymol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.

[0218] Tipicamente, os vetores de expressão usados em qualquer uma das células hospedeiras conterão sequências para manutenção de plasmídeos e para clonagem e expressão de sequências de nucleotídeos exógenas. Tais sequências, coletivamente referidas como “sequências flanqueantes” em certas modalidades incluirão tipicamente uma ou mais das seguintes sequências de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais sequências intensificadoras, uma origem de replicação, uma sequência de terminação transcricional, uma sequência de íntron completa contendo um local de splice dador e aceitador, uma sequência codificando uma sequência líder para secreção de polipeptídeos, um local de ligação ao ribossomo, uma sequência de poliadenilação, uma região poliligante para inserir o ácido nucleico codificando o polipeptídeo a ser expresso e um elemento marcador selecionável. Cada uma destas sequências é discutida em baixo.

[0219] Opcionalmente, o vetor pode conter uma sequência codificante de “marcador”, i.e., uma molécula de oligonucleotídeo localizada na extremidade 5´ ou 3´ da sequência codificante de proteína de ligação ao antígeno Jagged1; a sequência de oligonucleotídeo codifica poli-His

(tal como hexa-His) ou outro “marcador” tal como FLAG®, HA (vírus da gripe hemaglutinina) ou myc, para o qual existem anticorpos comercialmente disponíveis. Este marcador é tipicamente fundido ao polipeptídeo após expressão do polipeptídeo e pode servir como um meio para a purificação ou detecção por afinidade da proteína de ligação ao antígeno Jagged1 a partir da célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser alcançada, por exemplo, por cromatografia em coluna usando anticorpos contra o marcador como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, o marcador pode ser subsequentemente removido da proteína de ligação ao antígeno Jagged1 purificada por vários meios tais como uso de certas peptidases para clivagem.

[0220] As sequências flanqueantes podem ser homólogas (i.e., da mesma espécie e/ou estirpe que a célula hospedeira), heterólogas (i.e., de uma espécie sem ser a espécie ou estirpe da célula hospedeira), híbridas (i.e., uma combinação de sequências flanqueantes de mais do que uma fonte), sintéticas ou naturais. Como tal, a fonte de uma sequência flanqueante pode ser qualquer organismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ou invertebrado ou qualquer planta, contanto que a sequência flanqueante seja funcional na, e possa ser ativada pela, maquinaria da célula hospedeira.

[0221] Sequências flanqueantes úteis nos vetores podem ser obtidas por qualquer um de vários métodos bem conhecidos na técnica. Tipicamente, as sequências flanqueantes úteis aqui terão sido previamente identificadas por mapeamento e/ou por digestão com endonucleases de restrição e podem assim ser isoladas a partir da fonte de tecidos apropriada usando as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a sequência de nucleotídeos de comprimento total de uma sequência flanqueante pode ser conhecida. Aqui, a sequência flanqueante pode ser sintetizada usando os métodos descritos aqui para síntese ou clonagem de ácidos nucleicos.

[0222] Se toda a ou somente uma porção da sequência flanqueante for conhecida, ela pode ser obtida usando reação em cadeia da polimerase (PCR) e/ou por rastreamento de uma biblioteca genômica com uma sonda adequada tal como um oligonucleotídeo e/ou fragmento de sequência flanqueante da mesma ou outra espécie. Onde a sequência flanqueante não for conhecida, um fragmento de DNA contendo uma sequência flanqueante pode ser isolado a partir de um pedaço maior de DNA que pode conter, por exemplo, uma sequência codificante ou mesmo outro gene ou genes. O isolamento pode ser alcançado por digestão por endonucleases de restrição para produzir o fragmento de DNA apropriado seguido por isolamento usando purificação em gel de agarose, cromatografia em coluna Qiagen® (Chatsworth, CA) ou outros métodos conhecidos pelo especialista perito. A seleção de enzimas adequadas para alcançar este propósito será prontamente aparente a um perito na técnica.

[0223] Uma origem de replicação é tipicamente uma parte desses vetores de expressão procarióticos adquiridos comercialmente e dos auxiliares de origem na amplificação do vetor em uma célula hospedeira. Se o vetor de escolha não contém uma origem de local de replicação, um pode ser quimicamente sintetizado com base em uma sequência conhecida e ligado no vetor. Por exemplo, a origem de replicação do plasmídeo pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias gram-negativas, e várias origens virais (p.ex., SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (VSV) ou vírus do papiloma tais como HPV ou BPV) são úteis para clonagem de vetores em células de mamífero. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (por exemplo, a origem de SV40 é frequentemente usada somente porque também contém o promotor precoce do vírus).

[0224] Uma sequência de terminação da transcrição está tipicamente localizada 3´ em relação à extremidade de uma região codificante de polipeptídeo e serve para terminar a transcrição. Usualmente, uma sequência de terminação da transcrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C seguido por uma sequência de poli-T. Embora a sequência seja facilmente clonada a partir de uma biblioteca ou mesmo adquirida comercialmente como parte de um vetor, ela pode ser também prontamente sintetizada usando métodos para síntese de ácidos nucleicos tais como aquelas descritos aqui.

[0225] Um gene marcador selecionável codifica uma proteína necessária para a sobrevivência e crescimento de uma célula hospedeira cultivada em um meio de cultura seletivo. Genes marcadores de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, p.ex., ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeiras procarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos ou definidos. Marcadores selecionáveis específicos são o gene de resistência à canamicina, o gene de resistência à ampicilina e o gene de resistência à tetraciclina. Vantajosamente, um gene de resistência à neomicina pode ser também usado para seleção em células hospedeiras tanto procarióticas como eucarióticas.

[0226] Outros genes selecionáveis podem ser usados para amplificar o gene que será expresso. A amplificação é o processo em que os genes que são requeridos para produção de uma proteína crítica para crescimento ou sobrevivência das células são reiterados em tandem dentro dos cromossomos de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos de marcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos incluem os genes da di-hidrofolato redutase (DHFR) e timidina cinase sem promotor. Transformantes de células de mamíferos são colocados sob pressão de seleção em que somente os transformantes são singularmente adaptados para sobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão de seleção é imposta por cultura das células transformadas sob condições nas quais a concentração do agente de seleção no meio é sucessivamente aumentada, levando deste modo à amplificação tanto do gene selecionável quanto do DNA que codifica outro gene, tal como uma proteína de ligação a anticorpo que se liga ao polipeptídeo Jagged1. Como resultado, quantidades aumentadas de um polipeptídeo tal como uma proteína de ligação ao antígeno são sintetizadas a partir do DNA amplificado.

[0227] Um local de ligação ao ribossomo é usualmente necessário para iniciação da tradução do mRNA e é caracterizado por uma sequência de Shine-Dalgarno (procariotas) ou uma sequência de Kozak (eucariotas). O elemento está tipicamente localizado 3´ em relação ao promotor e 5´ em relação à sequência codificante do polipeptídeo a ser expresso.

[0228] Em alguns casos, tais como onde a glicosilação é desejada em um sistema de expressão de células hospedeiras eucarióticas, se pode manipular as várias pré ou pró- sequências para melhorar a glicosilação ou o rendimento. Por exemplo se pode alterar o local de clivagem da peptidase de um peptídeo de sinal particular ou adicionar pró-sequências, o que pode também afetar a glicosilação. O produto de proteína final pode ter, na posição -1 (em relação ao primeiro aminoácido da proteína madura), um ou mais aminoácidos adicionais incidentes na expressão, que podem não ter sido totalmente removidos. Por exemplo, o produto de proteína final pode ter um ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no local de clivagem da peptidase, anexados à extremidade do terminal amino. Alternativamente, o uso de alguns locais de clivagem de enzimas pode resultar em uma forma ligeiramente truncada do polipeptídeo desejado, se a enzima cortar em tal área dentro do polipeptídeo maduro.

[0229] A expressão e clonagem conterão normalmente um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e operacionalmente ligado à molécula codificando a proteína de ligação ao antígeno Jagged1. Os promotores são sequências não transcritas localizadas a montante (i.e., 5') em relação ao códon de iniciação de um gene estrutural (geralmente dentro de cerca de 100 a 1000 pb) que controlam a transcrição do gene estrutural. Os promotores são convencionalmente agrupados em uma de duas classes: promotores indutíveis e promotores constitutivos. Os promotores indutíveis iniciam níveis aumentados de transcrição a partir do DNA sob seu controle em resposta a alguma mudança nas condições de cultura, tal como a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura. Os promotores constitutivos, por outro lado, transcrevem uniformemente genes ao qual estão operacionalmente ligados, isto é, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão do gene. Um grande número de promotores, reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais, é bem conhecido. Um promotor adequado está operacionalmente ligado ao DNA codificando cadeia pesada ou cadeia leve compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 por remoção do promotor a partir do DNA fonte por digestão por enzimas de restrição e inserção da sequência promotora desejada no vetor.

[0230] Promotores adequados para uso com hospedeiros de levedura são bem conhecidos na técnica. Intensificadores de levedura são vantajosamente usados com promotores de levedura. Promotores adequados para uso em células hospedeiras de mamíferos são bem conhecidos e incluem aqueles, mas não estão limitados àqueles, obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus do polioma, vírus da varíola aviária, adenovírus (tais como Adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores de mamíferos adequados incluem promotores de mamíferos heterólogos, por exemplo, promotores de choque térmico e promotor de actina.

[0231] Uma sequência intensificadora pode ser inserida no vetor para aumentar a transcrição do DNA codificando cadeia leve ou cadeia pesada compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 por eucariotas superiores. Os intensificadores são elementos de atuação cis do DNA, usualmente com cerca de 10-300 pb em comprimento, que atuam no promotor para aumentar a transcrição.

Os intensificadores são relativamente independentes da orientação e posição, tendo sido encontrados em posições tanto 5´ quanto 3´ em relação à unidade de transcrição.

Várias sequências intensificadoras disponíveis a partir de genes de mamíferos são conhecidas (p.ex., globina, elastase, albumina, alfa- feto-proteína e insulina). Tipicamente, no entanto, é usado um intensificador de um vírus.

O intensificador de SV40, o intensificador do promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma e intensificadores de adenovírus conhecidos na técnica são elementos intensificadores exemplificativos para a ativação de promotores eucarióticos.

Enquanto um intensificador pode estar posicionado no vetor 5´ ou 3´ em relação a uma sequência codificante, ele está tipicamente localizado em um local 5´ em relação ao promotor.

Uma sequência codificando uma sequência de sinal nativa ou heteróloga apropriada (sequência líder ou peptídeo de sinal) pode ser incorporada em um vetor de expressão para promover a secreção extracelular do anticorpo.

A escolha do peptídeo de sinal ou líder depende do tipo de células hospedeiras nas quais o anticorpo é para ser produzido, e uma sequência de sinal heteróloga pode substituir a sequência de sinal nativa.

Exemplos de peptídeos de sinal que são funcionais em células hospedeiras de mamífero incluem os seguintes: a sequência de sinal para a interleucina-7 (IL-7) descrita na Patente dos EUA No. 4,965,195; a sequência de sinal para o receptor de interleucina-2 descrita em Cosman et al.,1984, Nature 312: 768; o peptídeo de sinal do receptor de interleucina-4 descrito na Patente EP No. 0367 566; peptídeo de sinal do receptor da interleucina-1 de tipo I descrito na Patente dos E.U.A. No. 4,968,607; peptídeo de sinal do receptor da interleucina-1 de tipo II descrito na Patente EP No. 0 460

846.

[0232] Em uma modalidade, a sequência líder compreende SEQ ID NO: 355 (MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RC) que é codificada por SEQ ID NO: 356 (atggacatga gagtgcctgc acagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gagaggcgcc agatgc). Em outra modalidade, a sequência líder compreende SEQ ID NO: 357 (MAWALLLLTL LTQGTGSWA) que é codificada por SEQ ID NO: 358 (atggcctggg ctctgctgct cctcaccctc ctcactcagg gcacagggtc ctgggcc).

[0233] Os vetores de expressão da invenção que são proporcionados podem ser construídos a partir de um vetor de partida tal como um vetor comercialmente disponível. Tais vetores podem conter ou não todas as sequências flanqueantes desejadas. Onde uma ou mais das sequências flanqueantes descritas aqui já não estiverem presentes no vetor, elas poderão ser individualmente obtidas e ligadas no vetor. Os métodos usados para obtenção de cada uma das sequências flanqueantes são bem conhecidos de um perito na técnica.

[0234] Após o vetor ter sido construído e uma molécula de ácido nucleico codificando uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou uma cadeia leve e uma cadeia pesada compreendendo uma sequência de ligação ao antígeno Jagged1 ter sido inserida no local apropriado do vetor, o vetor completo pode ser inserido em uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão do polipeptídeo. A transformação de um vetor de expressão para uma proteína de ligação ao antígeno em uma célula hospedeira selecionada pode ser alcançada por métodos bem conhecidos incluindo transfecção, infecção, coprecipitação com fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecção mediada por DEAE- dextrana ou outras técnicas conhecidas. O método selecionado será em parte uma função do tipo de célula hospedeira a ser usada. Estes métodos e outros métodos adequados são bem conhecidos do especialista perito e são apresentados, por exemplo, em Sambrook et al., 2001, supra.

[0235] Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições apropriadas, sintetiza uma proteína de ligação ao antígeno que pode ser subsequentemente coletada a partir do meio de cultura (se a célula hospedeira a secretar no meio) ou diretamente a partir da célula hospedeira produzindo a mesma (se ela não for secretada). A seleção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores, tais como níveis de expressão desejados, modificações de polipeptídeo que são desejáveis ou necessárias para a atividade (tais como glicosilação ou fosforilação) e facilidade de dobragem em uma molécula biologicamente ativa.

[0236] Linhas de células de mamíferos disponíveis como hospedeiros para expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, linhas de células imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo mas não se limitando a células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim de hamster bebê (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p.ex., Hep G2) e um número de outras linhas de células. Em certas modalidades, as linhas de células podem ser selecionadas através da determinação de que linhas de células têm níveis de expressão elevados e produzem constitutivamente proteínas de ligação ao antígeno com propriedades de ligação a Jagged1. Em outra modalidade, uma linha de células da linhagem de células B que não produz o seu próprio anticorpo mas tem uma capacidade de produzir e secretar um anticorpo heterólogo pode ser selecionada.

[0237] Em uma modalidade, a presente invenção está dirigida a uma proteína de ligação ao antígeno produzida por uma célula expressando um ou mais dos polinucleotídeos identificados nas Tabelas 2, 3 e 4.

[0238] Em um aspecto, uma proteína de ligação a Jagged1 é administrada para tratamento crônico. Em outro aspecto, as proteínas de ligação são administradas para terapia aguda.

[0239] Composições farmacêuticas que compreendem uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 são também proporcionadas e podem ser utilizadas em qualquer um dos métodos preventivos e terapêuticos divulgados aqui. Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma ou uma pluralidade das proteínas de ligação ao antígeno e um diluente, transportador, solubilizante, emulsificante, conservante e/ou adjuvante farmaceuticamente aceitável é também proporcionada. Materiais de formulação aceitáveis não são tóxicos para os receptores às dosagens e concentrações empregues.

[0240] Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Em tais modalidades, materiais de formulação adequados incluem, mas não estão limitados a, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina); antibióticos; antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio); tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentes de volume (tais como manitol ou glicina); agentes quelantes (tais como ácido etilenodiaminatetra-acético (EDTA)); agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil- beta-ciclodextrina); enchimentos; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidratos (tais como glucose, manose ou dextrina); proteínas (tais como albumina, gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, aromatizantes e diluentes; emulsificantes; polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona); polipeptídeos de baixo peso molecular; contraíons formadores de sais (tais como sódio); conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, álcool de fenetila, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (tais como glicerina, propilenoglicol ou polietilenoglicol); álcoois de açúcares (tais como manitol ou sorbitol); agentes de suspensão; tensoativos ou agentes molhantes (tais como pluronics, PEG, ésteres de sorbitana, polissorbatos tais como polissorbato 20, polissorbato, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes intensificadores da estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol); agentes intensificadores da tonicidade (tais como haletos de metais alcalinos, preferencialmente cloreto de sódio ou de potássio, manitol,

sorbitol); veículos de administração; diluentes; excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos. REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18ª Edição (A.R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company proporciona detalhes adicionais e opções para agentes adequados que podem ser incorporados nas composições farmacêuticas.

[0241] Em certas modalidades, a composição farmacêutica ótima será determinada por um perito na técnica dependendo, por exemplo, da via de administração prevista, formato de administração e dosagem desejada. Ver, por exemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra. Em certas modalidades, tais composições podem influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de eliminação in vitro das proteínas de ligação ao antígeno divulgadas. Em certas modalidades, o veículo ou transportador primário em uma composição farmacêutica pode ter natureza aquosa ou não aquosa. Por exemplo, um veículo ou transportador adequado pode ser água para injeção ou solução salina fisiológica. Em certas modalidades, as composições de proteína de ligação ao antígeno Jagged1 podem ser preparadas para armazenamento por mistura da composição selecionada tendo o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Adicionalmente, em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno Jagged1 pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes apropriados tais como sacarose.

[0242] As composições farmacêuticas podem ser selecionadas para distribuição parenteral. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou para administração através do trato digestivo, tal como oralmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro da perícia na técnica.

[0243] Os componentes da formulação estão presentes preferencialmente em concentrações que são aceitáveis para o local de administração. Em certas modalidades são usados tampões para manter a composição a pH fisiológico ou em a pH ligeiramente mais baixo, tipicamente dentro de uma gama de pH de cerca de 5 a cerca de 8.

[0244] Quando é contemplada administração parenteral, as composições terapêuticas podem ser proporcionadas na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, isenta de pirogênios compreendendo a proteína de ligação ao antígeno Jagged1 humana desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril na qual a proteína de ligação ao antígeno Jagged1 é formulada como uma solução isotônica, estéril, apropriadamente preservada. Em certas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como microesferas injetáveis, partículas bioerodíveis, compostos poliméricos (tais como ácido polilático ou ácido poliglicólico), esférulas ou lipossomos, que pode proporcionar liberação controlada ou sustentada do produto que pode ser administrado através de injeção de deposição. Em certas modalidades, pode ser também usado ácido hialurônico, tendo o efeito de promoção de duração sustentada na circulação. Em certas modalidades, dispositivos de administração de fármacos implantáveis podem ser usados para introduzir a proteína de ligação ao antígeno desejada.

[0245] Certas composições farmacêuticas são formuladas para inalação. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 são formuladas como um pó inalável, seco. Em modalidades específicas, as soluções de inalação de proteína de ligação ao antígeno Jagged1 podem ser também formuladas com um propulsor para administração por aerossol. Em certas modalidades, as soluções podem ser nebulizadas. Métodos de administração e formulação pulmonar são portanto adicionalmente descritos no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US94/001875, que é incorporado por referência e descreve a administração pulmonar de proteínas quimicamente modificadas. Algumas formulações podem ser administradas oralmente. As proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 que são administradas deste modo podem ser formuladas com ou sem transportadores habitualmente usados na composição de formas de dosagem sólidas tais como comprimidos e cápsulas. Em certas modalidades, uma cápsula pode ser desenhada para liberar a porção ativa da formulação no ponto no trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade for maximizada e a degradação pré-sistêmica for minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da proteína de ligação ao antígeno Jagged1. Diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes podem ser também empregues.

[0246] Algumas composições farmacêuticas compreendem uma quantidade eficaz de uma ou uma pluralidade de proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 em uma mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Por dissolução dos comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes aglutinantes, tais como amido, gelatina ou acácia; ou agentes lubrificantes tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.

[0247] Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes àqueles peritos na técnica, incluindo formulações envolvendo proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 em formulações de administração sustentada ou controlada. Técnicas para formulação de uma variedade de outros meios de administração sustentada ou prolongada, tais como transportadores de lipossomos, micropartículas bioerodíveis ou esférulas porosas e injeções de depósito, são também conhecidas daqueles peritos na técnica. Ver, por exemplo, o Pedido de Patente Internacional No. PCT/US93/00829, que é incorporado por referência e descreve a liberação controlada de micropartículas poliméricas porosas para administração de composições farmacêuticas. As preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, p.ex., filmes, ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactídeos (como divulgado na Patente dos E.U.A. No. 3,773,919 e Pedido de Patente Europeia No. de Publicação EP 058481, cada um dos quais é incorporado por referência), copolímeros de ácido L-

glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2: 547-556), poli (2-hidróxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), acetato de vinila de etileno (Langer et al., 1981, supra) ou ácido poli-D(-)-3- hidroxibutírico (Pedido de Patente Europeia No. de Publicação EP 133,988). As composições de liberação sustentada podem também incluir lipossomos que podem ser preparados por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Ver, p.ex., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82: 3688-3692; Pedidos de Patente Europeia Nos. de Publicação EP 036,676; EP 088,046 e EP 143,949, incorporados por referência.

[0248] As composições farmacêuticas usadas para administração in vivo são tipicamente proporcionadas como preparações estéreis. A esterilização pode ser alcançada por filtração através de membranas de filtração estéril. Quando a composição é liofilizada, a esterilização usando este método pode ser conduzida antes de ou após liofilização e reconstituição. As composições para administração parenteral podem ser armazenadas em forma liofilizada ou em uma solução. As composições parenterais são geralmente colocadas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.

[0249] Em certas formulações, uma proteína de ligação ao antígeno tem uma concentração de pelo menos 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL ou 150 mg/mL. Em uma modalidade, uma composição farmacêutica compreende a proteína de ligação ao antígeno, um tampão e polissorbato. Em outras modalidades, a composição farmacêutica compreende uma proteína de ligação ao antígeno, um tampão, sacarose e polissorbato. Um exemplo de uma composição farmacêutica é uma contendo 50-100 mg/mL de proteína de ligação ao antígeno, acetato de sódio a 5-20 mM, sacarose a 5-10% p/v e polissorbato a 0,002-0,008% p/v. Certas composições, por exemplo, contêm 65-75 mg/mL de uma proteína de ligação ao antígeno em tampão de acetato de sódio a 9-11 mM, sacarose a 8-10% p/v e polissorbato a 0,005-0,006% p/v. O pH de certas tais formulações está na gama de 4,5-6. Outras formulações têm um pH de 5,0-5,5 (p.ex., pH de 5,0, 5,2 ou 5,4).

[0250] Logo que a composição farmacêutica tenha sido formulada pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão, gel, emulsão, sólido, cristal ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (p.ex., liofilizada) que é reconstituída antes da administração. Estojos para produção de uma unidade de administração de dose única são também proporcionados. Certos estojos contêm um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Em certas modalidades são proporcionados estojos contendo seringas com câmara única e múltiplas pré-cheias (p.ex., seringas de líquidos e liosseringas). A quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica contendo proteína de ligação ao antígeno Jagged1 a ser empregue dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Um perito na técnica apreciará que os níveis de dosagem apropriados para o tratamento variarão dependendo, em parte, da molécula administrada, da indicação para a qual a proteína de ligação ao antígeno Jagged1 está sendo usada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou condição (idade e saúde geral) do paciente. Em certas modalidades, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ótimo.

[0251] A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação ao antígeno Jagged1 particular na formulação usada. Tipicamente, um médico administra a composição até ser alcançada uma dosagem que alcance o efeito desejado. A composição pode portanto ser administrada como uma dose única ou como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo ou como uma infusão contínua através de um dispositivo de implantação ou cateter. Dosagens apropriadas podem ser averiguadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados. Em certas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno podem ser administradas a pacientes ao longo de um período de tempo prolongado. Em certas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno é doseada a cada duas semanas, a cada mês, a cada dois meses, a cada três meses, a cada quatro meses, a cada cinco meses ou a cada seis meses.

[0252] A via de administração da composição farmacêutica está de acordo com métodos conhecidos, p.ex., oralmente, através de injeção por vias intravenosa, intraperitonial, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada ou por dispositivos de implantação. Em certas modalidades, as composições podem ser administradas por injeção de bólus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implantação.

[0253] A composição pode ser também administrada localmente através de implantação de uma membrana, esponja ou outro material apropriado sobre o qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em certas modalidades, onde é usado um dispositivo de implantação, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a administração da molécula desejada pode ser através de difusão, bólus de liberação programada ou administração contínua.

[0254] Pode ser também desejável usar composições farmacêuticas de proteína de ligação ao antígeno Jagged1 de acordo com o divulgado ex vivo. Em tais casos, células, tecidos ou órgãos que tenham sido removidos do paciente são expostos às composições farmacêuticas de proteína de ligação ao antígeno Jagged1 após o que as células, tecidos e/ou órgãos são subsequentemente implantados de volta no paciente.

[0255] Um médico será capaz de selecionar uma indicação de tratamento e níveis de lipídeos apropriados, dependendo do perfil individual de um paciente particular. Um padrão bem aceite para orientar o tratamento da hiperlipidemia é o Third Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of the High Blood Cholesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Relatório Final, National Institutes of Health, Publicação NIH No. 02-5215 (2002), a publicação impressa do qual é deste modo incorporada por referência na sua totalidade.

[0256] A eficácia de uma dose particular pode ser avaliada por referência a biomarcadores ou melhoria em certos parâmetros fisiológicos. Exemplos de biomarcadores adequados incluem a razão entre colesterol livre e lipídeo membranar, colesterol livre e proteína membranar, fosfatidilcolina e esfingomielina ou níveis de HDL-C.

[0257] São também proporcionadas aqui composições compreendendo uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 e um ou mais agentes terapêuticos adicionais, bem como métodos nos quais tais agentes são administrados simultaneamente ou sequencialmente com uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 para uso nos métodos preventivos e terapêuticos divulgados aqui. O um ou mais agentes adicionais podem ser coformulados com uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1 ou podem ser coadministrados com uma proteína de ligação ao antígeno Jagged1. Em geral, os métodos, composições e compostos terapêuticos podem ser também empregues em combinação com outros terapêuticos no tratamento de vários estados de doença, com os agentes adicionais sendo administrados simultaneamente.

[0258] As proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 que são proporcionadas aqui são úteis para detecção de Jagged1 em amostras biológicas. Por exemplo, as proteínas de ligação ao antígeno Jagged1 podem ser usadas em ensaios de diagnóstico, p.ex., ensaios de ligação para detectar e/ou quantificar Jagged1 expresso no soro.

[0259] As proteínas de ligação ao antígeno do descrito podem ser usadas para propósitos de diagnóstico para detectar, diagnosticar ou monitorizar doenças e/ou condições associadas a Jagged1. As proteínas de ligação ao antígeno divulgadas proporcionam um meio para a detecção da presença de Jagged1 em uma amostra usando métodos imuno-histológicos clássicos conhecidos dos peritos na técnica (p.ex., Tijssen, 1993, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Vol 15 (Eds R.H. Burdon and P.H. van Knippenberg, Elsevier, Amsterdam); Zola, 1987, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.); Jalkanen et al., 1985, J. Cell. Biol. 101: 976-985; Jalkanen et al., 1987, J. Cell Biol. 105: 3087-3096). A detecção de Jagged1 pode ser realizada in vivo ou in vitro.

[0260] As aplicações de diagnóstico proporcionadas aqui incluem uso das proteínas de ligação ao antígeno para detectar a expressão de Jagged1. Exemplos de métodos úteis na detecção da presença de Jagged1 incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA).

[0261] Para aplicações de diagnóstico, a proteína de ligação ao antígeno será tipicamente marcada com um grupo marcador detectável. Grupos de marcação adequados incluem os, mas não estão limitados aos, seguintes: radioisótopos ou radionuclídeos (p.ex., 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), grupos fluorescentes (p.ex., FITC, rodamina, fósforos de lantanídeo), grupos enzimáticos (p.ex., peroxidase de rábano-silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, grupos biotinila ou epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (p.ex., sequências de pares de fechos de leucina, locais de ligação para anticorpos secundários,

domínios de ligação a metais, marcadores de epítopo). Em algumas modalidades, o grupo de marcação é acoplado à proteína de ligação ao antígeno através de braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento estérico potencial. Vários métodos para marcação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados.

[0262] Em algumas modalidades, a proteína de ligação ao antígeno Jagged1 é isolada e medida usando técnicas conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 e suplementos periódicos); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunology New York: John Wiley & Sons.

[0263] Outro aspecto do divulgado proporciona a detecção da presença de uma molécula de teste que compete pela ligação a Jagged1 com as proteínas de ligação ao antígeno proporcionadas. Um exemplo de um tal ensaio envolveria detecção da quantidade de proteína de ligação ao antígeno livre em uma solução contendo uma quantidade de Jagged1 na presença ou na ausência da molécula de teste. Um aumento na quantidade de proteína de ligação ao antígeno livre (i.e., a proteína de ligação ao antígeno não ligada a Jagged1) indicaria que a molécula de teste é capaz de competir quanto à ligação a Jagged1 com a proteína de ligação ao antígeno. Em uma modalidade, a proteína de ligação ao antígeno é marcada com um grupo de marcação. Alternativamente, a molécula de teste é marcada e a quantidade de molécula de teste livre é monitorizada na presença e ausência de uma proteína de ligação ao antígeno.

[0264] As proteínas de ligação a Jagged1 podem ser usadas para tratar, diagnosticar ou melhorar uma condição associada à doença pulmonar.

Em várias modalidades, a doença pulmonar pode ser câncer do pulmão, uma infecção do trato respiratório ou pulmonar, uma doença do interstício, uma disfunção da troca gasosa ou circulação sanguínea, uma doença das vias aéreas ou uma disfunção da pleura.

Como usado aqui, um “câncer do pulmão” se refere a um tumor pulmonar primário (por exemplo, carcinoma broncogênico ou carcinoide brônquico) ou uma metástase de um tumor primário de outro órgão ou tecido (por exemplo, mama, cólon, próstata, rim, tireoide, estômago, colo do útero, reto, testículo, osso ou melanoma). Como usado aqui, “infecção do trato respiratório ou pulmonar” se refere a qualquer infecção bacteriana, viral, fúngica ou parasita de qualquer parte do sistema respiratório.

Como usada aqui, uma “doença do interstício” inclui qualquer disfunção do interstício incluindo fibrose (por exemplo, fibrose pulmonar intersticial, pneumonia intersticial, doença pulmonar intersticial, granulomatose celular de Langerhans, sarcoidose ou hemossiderose pulmonar idiopática). Como usada aqui, uma “disfunção da troca gasosa ou circulação sanguínea” se refere a qualquer anormalidade afetando a distribuição e/ou troca de gases para o/do sangue e pulmões (por exemplo, edema pulmonar, embolismo pulmonar, insuficiência respiratória (p.ex., devido a músculos fracos), síndrome do desconforto respiratório agudo ou hipertensão pulmonar). Como usada aqui, uma “doença das vias aéreas” inclui qualquer disfunção dos padrões respiratórios regulares, incluindo disfunções de etiologias genéticas e ambientais (por exemplo, asma, bronquite crônica,

bronquiolite, fibrose cística, bronquiectasia, enfisema, doença pulmonar obstrutiva crônica, panbronquiolite difusa ou linfangiomionatose). Como usada aqui, uma “disfunção da pleura” inclui, por exemplo, efusão pleural (p.ex., hemotórax (sangue no espaço pleural) ou enfisema (pus no espaço pleural), pneumotórax (ar, p.ex., traumático, espontâneo ou tensão), pleurisia ou fibrose pleural ou calcificação.

[0265] Na aplicação, uma condição associada à doença pulmonar pode ser tratada por administração de uma dose terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação a Jagged1 a um paciente com sua necessidade. A administração pode ser realizada como descrito aqui, tal como por injeção IV, injeção intraperitoneal (IP), injeção subcutânea, injeção intramuscular, nebulização ou oralmente na forma de um comprimido ou formação de líquido. Em algumas situações, uma dose terapeuticamente eficaz ou preferencial de uma proteína de ligação a Jagged1 pode ser determinada por um clínico. Uma dose terapeuticamente eficaz da proteína de ligação a Jagged1 dependerá, inter alia, do programa de administração, da dose unitária de agente administrado, se a proteína de ligação a Jagged1 é administrada em combinação com outros agentes terapêuticos, o estado imunitário e a saúde do receptor. O termo “dose terapeuticamente eficaz”, como usado aqui, significa uma quantidade de proteína de ligação a Jagged1 que provoca uma resposta biológica ou medicinal em um sistema de tecidos, animal ou humano sendo procurado por um investigador, médico ou outro clínico, que inclui alívio ou melhoria dos sintomas da doença ou disfunção sendo tratada.

[0266] É notado que uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de ligação a Jagged1 pode ser coadministrada com outro composto. A identidade e propriedades do composto coadministrado com a proteína de ligação a Jagged1 dependerão da natureza da condição a ser tratada ou melhorada.

[0267] São também proporcionados estojos para praticar os métodos divulgados. Tais estojos podem compreender uma composição farmacêutica tal como aquelas descritas aqui, incluindo ácidos nucleicos codificando os peptídeos ou proteínas proporcionados aqui, vetores e células compreendendo tais ácidos nucleicos e composições farmacêuticas compreendendo tais compostos contendo ácidos nucleicos, que podem ser proporcionados em um recipiente estéril. Opcionalmente, instruções sobre como empregar a composição farmacêutica proporcionada no tratamento de uma disfunção metabólica podem ser também incluídas ou ser tornadas disponíveis a um paciente ou um prestador de serviços médicos.

[0268] Em um aspecto, um estojo compreende (a) uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação a Jagged1; e (b) um ou mais recipientes para a composição farmacêutica. Um tal estojo pode também compreender instruções para o seu uso; as instruções podem ser adaptadas à disfunção metabólica precisa sendo tratada. As instruções podem descrever o uso e a natureza dos materiais proporcionados no estojo.

[0269] As instruções podem ser impressas em um substrato, tal como papel ou plástico, etc., e podem estar presentes nos estojos como um folheto informativo, na etiqueta do recipiente do estojo ou seus componentes (p.ex., associadas ao empacotamento), etc. Em outras modalidades, as instruções estão presentes como um ficheiro de dados de armazenamento eletrônico presente em um meio de armazenamento legível por computador adequado, p.ex., CD-ROM, disquete, etc. Ainda em outras modalidades, as instruções reais não estão presentes no estojo, mas são proporcionados meios para obter as instruções a partir de uma fonte remota, tal como através da Internet. Um exemplo desta modalidade é um estojo que inclui um endereço web onde as instruções podem ser vistas e/ou a partir do qual as instruções podem ser baixadas.

[0270] Frequentemente será desejável que alguns dos ou todos os componentes de um estojo sejam empacotados em empacotamento adequado para manter a esterilidade. Os componentes de um estojo podem ser empacotados em um elemento de contenção do estojo para fazer uma unidade facilmente manipulada, única, onde o elemento de contenção do estojo, p.ex., caixa ou estrutura análoga, pode ou não ser um recipiente hermético, p.ex., para preservar adicionalmente a esterilidade de alguns dos ou todos os componentes do estojo. Exemplos Exemplo 1: Imunização

[0271] Anticorpos totalmente humanos para Jagged-1 foram gerados usando tecnologia XenoMouse, camundongos transgênicos manipulados para expressar repertórios diversos de anticorpos IgGΚ e IgGλ totalmente humanos do isotipo correspondente (Mendez, M. J., Green, L. L., Corvalan, J. R., Jia, X. C., Maynard-Currie, C. E., Yang, X. D., Gallo, M. L., Louie, D. M., Lee, D. V., Erickson, K. L., Luna, J.,

Roy, C. M., Abderrahim, H., Kirschenbaum, F., Noguchi, M., Smith, D. H., Fukushima, A., Hales, J. F., Klapholz, S., Finer, M. H., Davis, C. G., Zsebo, K. M. e Jakobovits, A. (1997) Nature genetics 15, 146-156; Kellermann, S. A. e Green, L. L. (2002) Current opinion in biotechnology 13, 593-597). As estirpes XMG2-KL e XMG4-KL de camundongos foram imunizadas com duas formas de imunogênio Jagged-1; transfectantes de 293T expressando Jagged-1 humano de comprimento total e transfectantes de CHO expressando Jagged-1 humano de comprimento total. Os imunogênios celulares foram doseados a 4,0 x 106 células transfectadas com Jagged-1/camundongo e os reforços subsequentes foram de 2,0 x 106 células transfectadas com Jagged-1/camundongo. Os locais de injeção usados foram combinações de base-da-cauda subcutânea e intraperitoneal. O adjuvante usado foi Alum (E.M. Sergent Pulp and Chemical Co., Clifton, NJ, cat. # 1452-250) que foi preparado de acordo com as instruções do fabricante e misturado com solução de antígeno. Os camundongos foram imunizados ao longo de um período de 8 semanas a 12 semanas.

[0272] Os soros foram coletados aproximadamente às 5 semanas após a primeira injeção e títulos específicos foram determinados por coloração FACs de receptor BCMA transientemente expresso em células CHO-S. As respostas imunitárias específicas alcançadas usando os grupos de imunogênios de células CHO foram determinadas como sendo superiores. Dois grupos de animais imunes foram identificados e usados para duas campanhas de rastreamento; o primeiro grupo de animais incluindo 5 XMG2-KL e 3 XMG2-KLs imunizados com células CHO transientemente expressando

Jagged-1 foi agrupado e avançado para a geração de anticorpos. O segundo grupo foi 7 animais XMG4-KL imunizados com células CHO transientemente expressando Jagged-1 foi agrupado e avançado para a geração de anticorpos. Exemplo 2: Preparação de Anticorpos Monoclonais

[0273] Linfonodos drenantes e baços foram coletados a partir de animais imunes e agrupados para cada coorte. Os linfócitos e esplenócitos foram dissociados a partir de tecido em meio RPMI adequado (Invitrogen, Carlsbad, CA) para liberar as células dos tecidos e suspensos em RPMI. As células B foram selecionadas e ou expandidas usando um método adequado e fundidas com parceiro de fusão adequado, por exemplo, células P3X63Ag8.653 de mieloma não secretor (American Type Culture Collection CRL 1580; Kearney et al., J. Immunol. 123, 1979, 1548-1550).

[0274] As células B são misturadas com células parceiras de fusão a uma razão de 1:4. A mistura de células foi suavemente peletizada por centrifugação a 400 x g durante 4 minutos, o sobrenadante decantado e a mistura de células suavemente misturada por uso de uma pipeta de 1 mL. A fusão foi induzida com PEG/DMSO (polietilenoglicol/sulfóxido de dimetila; obtido a partir da Sigma-Aldrich, St. Louis MO; 1 mL por 10 milhões de linfócitos). PEG/DMSO foi lentamente adicionado com agitação suave ao longo de um minuto, seguido por um minuto de mistura. IDMEM (DMEM sem glutamina; 2 mL por 10 milhões de células B) foi depois adicionado ao longo de 2 minutos com agitação suave, seguido por IDMEM adicional (8 mL por 10 milhões de células B) que foi adicionado ao longo de 3 minutos.

[0275] As células fundidas foram suavemente peletizadas (400 x g 5 6 minutos) e ressuspensas em 20 mL de Meio de seleção (por exemplo, DMEM contendo Azasserina e Hipoxantina [HA] e outros materiais suplementares como necessário) por 20 milhões de células B. As células foram incubadas durante 20-30 minutos a 37 °C e depois ressuspensas em 200 mL de Meio de seleção por 20 milhões de células B e cultivadas durante três a quatro dias em frascos T175 antes do plaqueamento de 96 poços.

[0276] As células foram distribuídas em placas de 96 poços usando técnicas padrão para maximizar a clonalidade das colônias resultantes. Após vários dias de cultura, os sobrenadantes de hibridoma foram coletados e sujeitos a ensaios de rastreamento como detalhado nos exemplos em baixo, incluindo confirmação da ligação ao receptor Jagged-1 humano, identificação de anticorpos bloqueantes de ligante Notch por um ensaio de competição de ligação ao ligante e avaliação de reatividade cruzada com outros receptores relacionados com o receptor Jagged-1 (por exemplo, receptores Jagged-2 humanos e DLL-4 humanos). As linhas de hibridoma que foram identificadas como tendo as propriedades de ligação de interesse foram depois adicionalmente selecionadas com rastreamentos funcionais e sujeitas a técnicas de clonagem e subclonagem padrão. As linhas clonais foram expandidas in vitro e os anticorpos humanos secretados obtidos para análise e sequenciamento de genes de V foi realizada. Exemplo 3: Seleção de anticorpos de ligação específicos de receptor Jagged-1 por FMAT

[0277] Após 14 dias de cultura, os sobrenadantes de hibridoma foram rastreados quanto a anticorpos monoclonais específicos de Jagged-1 humano por Tecnologia de Ensaio de Microvolume Fluorométrico (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os sobrenadantes foram rastreados contra células 293T transientemente transfectadas com Jagged-1 humano e contrarrastreados contra células 293T transientemente transfectadas com o mesmo plasmídeo de expressão que não continha o gene Jagged-1.

[0278] Resumidamente, as células em meio Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram inoculadas em placas FMAT de 384 poços em um volume de 50 µL/poço a uma densidade de aproximadamente 4.000 células/poço para os transfectantes estáveis e a uma densidade de aproximadamente 16.000 células/poço para as células genitoras, e as células foram incubadas durante a noite a 37 ºC. Depois, 10 µL/poço de sobrenadante foram adicionados e as placas foram incubadas durante aproximadamente uma hora a 4 ºC, após o que 10 µL/poço de anticorpo secundário anti-IgG-Cy5 humana (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) foram adicionados a uma concentração de 2,8 µg/mL (concentração final de 400 ng/mL). As placas foram depois incubadas durante uma hora a 4 ºC, e a fluorescência foi lida usando um leitor de placas FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0279] Após duas campanhas de rastreamento, um painel de 495 (335 campanha #1, 160 campanha #2) linhas de hibridoma de ligação anti-Jagged-1 foram identificadas e avançadas para ensaios de caracterização adicional. Exemplo 4: Identificação de anticorpos bloqueantes por ensaio de competição de ligação de ligante por FMAT

[0280] Foi desenvolvido um método de competição de ligação ao ligante para identificar anticorpos (nos sobrenadantes de hibridoma) que se ligam ao receptor Jagged- 1 e bloqueiam a ligação ao ligante Notch-3. Resumidamente, as células em meio Freestyle (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram inoculadas em placas FMAT de 384 poços em um volume de 50 µL/poço a uma densidade de aproximadamente 3.000 células/poço para os transfectantes estáveis e a uma densidade de aproximadamente 15.000 células/poço para as células genitoras e centrifugadas com pulsos. Depois, 20 µL/poço de sobrenadante foram adicionados e as placas foram incubadas durante aproximadamente uma hora a 4 ºC, após o que 10 µL/poço de Notch-3/ALEXA647 humano (concentração final de 600 ng/mL). As placas foram depois incubadas durante três horas a 4 ºC, e a fluorescência foi lida usando um leitor de placas FMAT (Applied Biosystems, Foster City, CA).

[0281] As experiências incluíram sobrenadantes de hibridoma de controle negativo. O sinal médio observado em estas experiências de controle negativo foi adotado como o sinal máximo possível para o ensaio. Os sobrenadantes experimentais foram comparados com este sinal máximo e uma percentagem de inibição foi calculada para cada poço (% de Inibição = (1- (FL1 do sobrenadante de hibridoma anti- BCMA/Sinal Máximo de FL1))).

[0282] Para a campanha de rastreamento #1, duas réplicas do ensaio foram completadas e resultaram em 49 anticorpos de interesse com base em uma atividade de mais do que 60% de inibição em pelo menos uma das duas réplicas. Estes 49 sobrenadantes de hibridoma mais 10 sobrenadantes não bloqueantes foram avançados para teste adicional. Para a campanha de rastreamento #2, duas réplicas do ensaio resultaram em 4 sobrenadantes de hibridoma identificados com mais do que 60% de inibição, estes foram avançados para caracterização adicional. Exemplo 5: Identificação de anticorpos bloqueantes por ensaio de competição de ligação de ligante por FACs

[0283] Foi desenvolvido um método de competição de ligação ao ligante para identificar anticorpos (nos sobrenadantes de hibridoma) que se ligam ao receptor Jagged- 1 e bloqueiam a ligação de três ligantes; Notch-3, Notch 2 e Notch-1. Ensaios FACs foram realizados por incubação de 20 uL de sobrenadantes de hibridoma com 50.000 células transientemente expressando a 4 ºC durante uma hora seguidos por duas lavagens com PBS/BSA. As células foram depois tratadas com ligante Notch-3 marcado com fluorócromo a 5 ug/mL (#1559-NT, RnD Systems) a 4 ºC seguidas por duas lavagens. As células foram suspensas em 1 mL de PBS/BSA e a ligação de anticorpo foi analisada usando um instrumento FACSCalibur™. Ensaios similares foram realizados usando Notch-2 (#3735-NT, RnD Systems) e Notch-1 (#3647-TK, RnD Systems).

[0284] As experiências incluíram sobrenadantes de hibridoma de controle negativo. O sinal médio observado em estas experiências de controle negativo foi adotado como o sinal máximo possível para o ensaio. Os sobrenadantes experimentais foram comparados com este sinal máximo e uma percentagem de inibição foi calculada para cada poço (% de Inibição = (1- (FL1 do sobrenadante de hibridoma anti- BCMA/Sinal Máximo de FL1))).

Exemplo 6: Caracterização de Ligação Adicional por Citometria de Fluxo (FACs)

[0285] Ensaios de ligação FACS foram realizados para avaliar a ligação dos anticorpos específicos de receptor anti-Jagged-1 ao ortólogo de Jagged-1 murino bem como receptores relacionados Jagged-2 humano e DLL-4 Humano. Ensaios FACs foram realizados por incubação de sobrenadantes de hibridoma com 50.000 células a 4 ºC durante uma hora seguidos por duas lavagens com PBS/BSA. As células foram depois tratadas com anticorpos secundários marcados com fluorócromo a 4 ºC seguidas por duas lavagens. As células foram suspensas em 1 mL de PBS/BSA e a ligação de anticorpo foi analisada usando um instrumento FACSCalibur™. Exemplo 7: Identificação de antagonistas da função por bioensaio celular:

[0286] Células epiteliais brônquicas humanas normais e meios de cultura foram adquiridos a partir da Lonza. Culturas de interface ar líquido usando células de passagem 2 foram realizadas conforme instruções do fabricante usando o protocolo B-ALI da Lonza. Três semanas pós-transporte aéreo, as culturas foram tratadas com ou sem IL-13 (20 ng/mL) em combinação com; IgG1 (10 ug/mL); anti-Jag-1 (15D11.1) (10 ug/mL ou 1 ug/mL) durante 7 dias (adicionado basolateralmente ao meio). O meio fresco (com ou sem tratamento) foi mudado a cada dois dias. Aos 7 dias, as culturas foram fixas em PFA a 4% durante 48 hrs @ TA e depois transferidas para EtOH a 70% e armazenadas a 4 °C até processadas para coloração PAS/AB. Ver FIG. 1 e FIG. 2. Exemplo 8: Métodos de coloração PAS/AB e método de quantificação:

Coloração Ácido Periódico-Schiff/Azul Alciano em Culturas de Interface Ar Líquido:

[0287] Culturas de células epiteliais brônquicas da Interface Ar Líquido (ALI) derivadas de dadores NHBE foram fixas em paraformaldeído a 4% durante 48 horas à temperatura ambiente (TA) e embebidas em parafina. Secções com quatro mícrons de espessura foram coradas quanto a mucina/células caliciformes com coloração especial Ácido Periódico- Schiff/Azul Alciano (AB/PAS).

[0288] Resumidamente, após desparafinização, as seções foram tratadas com solução de ácido acético durante 3 minutos à TA seguida por coloração Azul Alciano (pH 2,5, Abcam, Cambridge MA; Cat # ab150662) durante 30 minutos à TA. Após enxaguamento em água da torneira durante 2 minutos seguido por enxaguamento em 2 mudanças de água destilada, as seções foram tratadas com solução de ácido periódico a 1% (Sigma, St Louis, MO; Cat # 3951) durante 10 minutos à TA. As seções foram enxaguadas uma vez mais em 2 mudanças de água destilada e subsequentemente coradas com Solução de Schiff (American Master Tech, Lodi, Ca; Cat # STSSCHLT) durante 10 minutos à TA. As seções foram depois enxaguadas em água da torneira quente seguida por água destilada e depois contracoradas em Hematoxilina de Mayer Modificada (American Master Tech, Lodi CA; Cat # HSMMHLT) durante 15 segundos. As seções foram subsequentemente azuladas com tampão TBS, enxaguadas em água destilada, desidratadas em álcoois, apuradas em Xilenos e depois montadas com uma lamínula usando meio de montagem Tissue-Tek® GlasTM (Sakura, Torrance, CA; Cat # 6419). Coloração Ácido Periódico-Schiff em pulmões murinos:

[0289] Os pulmões murinos foram fixos em Formalina Tamponada Neutra a 10% durante 24 horas à temperatura ambiente (TA) e embebidas em parafina. Seções com cinco mícrons de espessura foram coradas quanto a mucina/células caliciformes com coloração especial Ácido Periódico-Schiff PAS).xE5El-Zimaity, H.M., Ota, H., Scott, S., Killen, D.E. e Graham, D.Y.

[0290] Resumidamente, após desparafinização, as seções foram tratadas com Ácido Periódico a 0,5% recém-preparada durante 7 minutos à TA. Após enxaguamento em água destilada, as seções foram imersas em Solução de Schiff (American Master Tech, Lodi, Ca; Cat # STSSCHLT) durante 15 minutos à TA. As seções foram depois enxaguadas em água da torneira quente durante 5 minutos e subsequentemente contracoradas com Hematoxilina SelecTech 560 (Leica Biosystems; Buffalo Grove, IL; Cat # 3801575) durante 3 minutos à TA. As seções foram depois tratadas com SelecTech Define (Leica Biosystems, Cat # 3803590) e azuladas com Tampão Azul (Lieca Biosystems, Cat # 3802915). As seções foram depois enxaguadas em água destilada, desidratadas em álcoois, apuradas em Xilenos e depois montadas com uma lamínula usando meio de montagem Tissue-Tek® GlasTM (Sakura, Torrance, CA; Cat # 6419). Quantificação de volumes de mucina e números de células caliciformes em Culturas ALI

[0291] Seções de parafina com quatro mícrons de espessura de culturas de células epiteliais brônquicas da Interface Ar Líquido (ALI) que foram coradas quanto a mucina/células caliciformes usando coloração especial Azul Alciano/Ácido Periódico-Schiff foram quantificadas quanto à percentagem de mucina presente bem como número de células caliciformes presentes no epitélio. Utilizando o pacote de Software Visiopharm Integrative (Hørsholm, Dinamarca), a seção inteira da cultura ALI foi delineada e aleatoriamente amostrada quanto ao conteúdo de mucina e números de células caliciformes no epitélio por colocação de uma grelha de pontos sobre cada área de vista à ampliação de 100X e contagem do número de pontos que aterram no epitélio total versus o número de pontos que aterram na mucina corada pela coloração especial AB/PAS (Ver figura em baixo).

[0292] Aproximadamente 75% da área total da seção foi uniformemente aleatoriamente amostrada desta maneira, com o marcador A indicando todos os pontos que atingem o epitélio, B todos os pontos que atingem a mucina/células caliciformes e C que indica uma contagem de pontos para cada célula caliciforme (nem todas as contagens possíveis mostradas). Após todas as contagens serem tabuladas e somadas, os seguintes dois cálculos são realizados usando a ferramenta de calculadora no software: Volume de mucina/volume de epi (percentagem de armazenamentos de mucina presentes no epitélio): Vv = Psub/Pref

[0293] Onde: Psub = o número total de contagens de mucina Pref = o número total de contagens de epitélio total

[0294] O volume de mucina total é expresso como uma percentagem de mucina presente no epitélio total. Número de células caliciformes/volume de epitélio: Ncélulas caliciformes/Vepi = ∑Q- /BA x (a/p) x ∑P

[0295] Onde: ∑Q- = o número de células caliciformes contadas BA = espessura de seção a/p = área por ponto ∑P = número de pontos de área contados

[0296] O número de células caliciformes no epitélio é expresso como o número de células caliciformes por volume de epitélio em mm3 ou Ncélulas caliciformes/mm3 de epi Quantificação de volumes de mucina e números de células caliciformes nas vias aéreas murinas

[0297] Seções de parafina com cinco mícrons de espessura de pulmões murinos que foram coradas quanto a mucina/células caliciformes usando coloração especial Ácido Periódico- Schiff foram quantificadas quanto à percentagem de mucina presente bem como número de células caliciformes presentes no epitélio. Utilizando o pacote de Software Visiopharm

Integrative (Hørsholm, Dinamarca), as vias aéreas murinas de interesse foram delineadas e aleatoriamente amostradas quanto ao conteúdo de mucina e números de células caliciformes no epitélio por colocação de uma grelha de pontos sobre cada área de vista à ampliação de 100X e contagem do número de pontos que aterram no epitélio total versus o número de pontos que aterram na mucina corada pela coloração especial AB/PAS (Ver figura em baixo).

[0298] Aproximadamente 75% da área total da região de interesse, i.e., o epitélio murino, foi uniformemente aleatoriamente amostrada desta maneira, com o marcador A indicando todos os pontos que atingem o epitélio, B todos os pontos que atingem a mucina/células caliciformes e C que indica uma contagem de pontos para cada célula caliciforme (nem todas as contagens possíveis mostradas). Após todas as contagens serem tabuladas e somadas, os seguintes dois cálculos são realizados usando a ferramenta de calculadora no software: Percentagem de mucina/área de epi (percentagem de armazenamentos de mucina presentes no epitélio): Vv = Psub/Pref

[0299] Onde: Psub = o número total de contagens de mucina Pref = o número total de contagens de epitélio total

[0300] O volume de mucina total é expresso como uma percentagem de mucina presente no epitélio total das vias aéreas murinas. Número de células caliciformes/área de epitélio: Ncélulas caliciformes/Áreaepi = ∑Q- /(a/p) x ∑P

[0301] Onde: ∑Q- = o número de células caliciformes contadas a/p = área por ponto ∑P = número de pontos de área contados

[0302] O número de células caliciformes no epitélio é expresso como o número de células caliciformes por área de epitélio em mm2 ou Ncélulas caliciformes/mm2 de epi

[0303] Células epiteliais brônquicas humanas normais e meios de cultura foram adquiridos a partir da Lonza. Culturas de broncoesferas em 3D usando células de passagem 2 foram realizadas como descrito previamente (ref Danahay et al.). Uma semana pós-plaqueamento, as culturas foram tratadas com ou sem IL-13 (1 ng/mL ou 3,3 ng/mL) em combinação com; IgG1 (10 ug/mL); anti-Jag-1 (15D11.1) (10 ug/mL ou 1 ug/mL) durante 7 dias adicionais. Meio fresco (com ou sem tratamento) foi mudado a cada dois dias e suplementado com citocina fresca e tratamento. Aos 7 dias, as broncoesferas foram coletadas a partir da matrigel usando o Estojo Cultrex 3D Culture Cell Harvesting da Trevigen (Cat# 3448-020-K) com um protocolo do fabricante ligeiramente modificado. O RNA foi usado usando o Estojo RNAeasy da Qiagen (cat# 74181) conforme o protocolo do fabricante e qPCR foi realizada para MUC5AC (*ver em baixo); MUC5B (*ver em baixo) e FOXA3 (Hs00270130-m1). Ver FIG. 3. HPRT (*ver em baixo) foi usando como o gene de manutenção e a expressão do gene é expressa em relação a HPR. Inibição profilática de metaplasia de células caliciformes por Ab neutralizante de Jag1 no modelo de asma induzido pela ovalbumina e avaliação da toxicologia de tecidos

[0304] A inflamação pulmonar induzida por alérgeno e remodelação das vias aéreas (metaplasia de células caliciformes) de camundongo foram medidas no modelo de camundongo induzido pela ovalbumina de asma. Sete grupos de oito camundongos (56 camundongos totais) foram usados em este estudo. Camundongos Balb/c fêmeas adultos (mais do que 8 semanas de idade) foram sensibilizados e reforçados por injeção intraperitoneal (i.p.) de 0,2 mL de gel de hidróxido de alumínio a 2% (ALUM) gel (Serva Electrophoretics, 12261, Heidelberg, Alemanha) com ou sem 10 µg de antígeno ovalbumina (OVA) (Worthington Biochemical Corporation, LS003054, Lakewood, NJ) nos dias 0 e 14. Os grupos A, B e C foram sensibilizados e reforçados com 0,2 mL de injeções i.p. de uma solução de um mL de solução salina a 0,9% em 50 mL de gel ALUM. Os grupos D, E, F e G foram sensibilizados e reforçados com 0,2 mL de injeções i.p. de uma solução de 2,55 mg de OVA dissolvida em um mL de solução salina a 0,9%

em 50 mL de gel ALUM.

Os grupos D, E, F e G inalaram OVA nebulizada para evocar inflamação pulmonar induzida por antígeno e metaplasia de células caliciformes nos pulmões.

Para desafio de OVA nebulizada, os camundongos foram colocados em uma caixa de plexiglass e OVA aerossolizada foi nebulizada na caixa por um nebulizante (Equipamento Respiratório PARI, nebulizante LC STAR e compressor Proneb Ultra II, Midlothian, VA) cheio com ovalbumina a 1% em solução salina (0,01 g/mL) durante 20 minutos nos dias 21, 22 e 23. No dia 26, um desafio de OVA nebulizada de 20 minutos com ovalbumina a 5% em solução salina foi conduzido.

Os grupos A, B e C inalaram solução salina nebulizada sem OVA.

Os grupos A e D foram doseados com veículo (A52SuT: Acetato de Sódio a 20 mM, Sacarose a 5%, Tween 20 a 0,04%, ajustado até pH 5,2 com ácido acético), os grupos B e E foram doseados com Mab 15D11.1 anti-<hu Jag-1> hu (80 mg/kg), o grupo G foi doseado com IgG2a anti-<muTSLP> de rato (mTSLP- M702, 20 mg/kg) e os grupos C e F foram doseados com anticorpo de controle IgG1 humana 655-341-G1 (80 mg/kg). Todos os grupos foram doseados i.v. pela veia da cauda com um volume de 10 mL/kg nos dias 0, 7, 14 e 20. Ver FIG. 4. No dia 27, os camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram inflados com formalina tamponada neutra a 10% através de uma cânula traqueal.

Os pulmões inflados foram imersos em formalina durante pelo menos 24 h- Após terem sido processados em blocos de parafina, os pulmões foram secionados (5 µm) e flutuaram para lâminas de vidro.

As seções pulmonares foram coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para avaliação de infiltração de células inflamatórias ou ácido periódico– schiff (PAS) para avaliação do conteúdo de mucina.

Fatias coradas com H&E dos grupos A, B e C do rim, baço, timo, fígado, coração, ovário, pâncreas, cólon, duodeno, estômago, íleo, jejuno e fêmur foram também preparadas para avaliação por um toxicologista. Quatro semanas de bloqueio de Jag1 com Mab 15D11.1 não causaram perda de peso corporal. Os camundongos foram sensibilizados e reforçados por injeção intraperitoneal (i.p.) de 0,2 mL de hidróxido de alumínio a 2% sem ou com 10 µg de antígeno ovalbumina (OVA) nos dias 0 e 14 e, depois, desafiados com OVA inalado (IH) para induzir inflamação & metaplasia de células caliciformes. Veículo, anticorpo Mab anti-Jag1 15D11.1 (80 mg/kg de), anticorpo de controle de isotipo 655-341-G1 IgG1 humana (80 mg/kg) ou IgG2a anti- <muTSLP> de rato (20 mg/kg) foram doseados uma vez por semana nos dias 0, 7, 14 & 20. As mudanças de peso corporal médias (eixo dos y) a partir da linha de base são representadas graficamente ao longo do tempo (eixo dos x). Os dados são representados como média ± desvios padrão (n = 7-8). Não foi observada perda de peso em camundongos tratados com anticorpo anti-Jag1 em comparação com camundongos tratados com veículo ou anticorpo de controle de isotipo. No entanto, a sensibilização i.p. & OVA IH causa perda de peso transiente em todos os grupos. FIG. 5A: Mudanças de peso corporal para todos os grupos. Os camundongos sensibilizados sem & com OVA são exibidos separadamente nos gráficos FIG. 5B & FIG. 5C. Exemplo 9: Avaliação da afinidade de ligação de mAb anti- hJagged1 15D11.1 a hJagged1

[0305] O mAb anti-hJagged1 15D11.1 (PL-50432) foi avaliado quanto à sua afinidade pelo domínio extracelular de Jagged1 humano recombinante (Met 1 – Ser 1046), fundido com um marcador de poli-histidina no terminal C, e produzido em célula humana e obtido a partir da Creative Biomart (Cat # JAG1-3226H). A cinética de ligação e ajuste para uma concentração de antígeno de 50, 15,3, 5,1, 1,7 e 0,56 nM são mostrados na Figura 6.

[0306] A afinidade do hJagged1 recombinante solúvel foi determinada em plataforma Octet (Octet Red96) sob os cenários de medição cinética recomendados pelo fabricante. Resumidamente, hJagged1 foi diluído 1 a 3 de 150 nM a 0,5 nM em tampão Octet (base de Tris a 10 mM, NaCl a 150 mM, CaCl2 a 1 mM, BSA a 0,1 mg/mL, Triton X100 a 0,1%) e 60 uL destas amostras diluídas em série foram tomadas em microplaca de polipropileno preta de fundo inclinado de 384 poços (TW384) (Forte Bio, Cat #18-0019) (placa de amostras). 3 ug/mL de mAb anti-hJagged1 15D11.1 presentes em 60 uL na placa de amostras foram usados e capturados em biossensores AHC - anti-HuFc (Kinetic) (cat #18-5060). Uma amostra só com tampão é usada como um controle.

[0307] O anticorpo foi capturado durante 300 seg, a associação e dissociação foram medidas durante 300 e 1.200 seg, respectivamente. Software ForteBio Data Analysis versão

9.0.0.12 foi usado para interrogar a associação (300 seg) e dissociação (900 seg) e medir a cinética. Exemplo 10: Afinidade em células por medição em equilíbrio usando KinExA

[0308] O mAb anti-hJagged1 15D11.1 (PL-50432) foi avaliado quanto à sua afinidade pelo Jagged1 humano nativo expresso em uma linha de células 293 estável.

[0309] As células no meio foram diluídas em série e incubadas com concentração de anticorpo no local de ligação ativa de 30 pM ou 1 nM no meio na presença de NaN3 a 0,05% e foi permitido que equilibrassem. O mAb livre deixado no sobrenadante foi medido como explicado no texto. (FIG. 7A) A % de mAb livre (curva vermelha para 30 pM e curva azul para 1 nM) é representada graficamente contra a concentração de células. A análise de curva N usando o método de células inteiras, em equilíbrio foi realizado para determinar valores ótimos para Kd e o nível de expressão de antígeno. (FIGS. 7B e 7C) Os intervalos de confiança de 95% foram determinados por mudança iterativa do valor otimizado para Kd ou nível de expressão de antígeno enquanto se mantêm outros parâmetros nos seus valores ótimos.

[0310] A afinidade de mAb 15D11.1 foi determinada por medição da constante de dissociação em equilíbrio (Kd). Foi usado Ensaio de Exclusão Cinética (KinExA) no qual a Kd foi determinada a partir da concentração de anticorpo livre que permanece em solução após o equilíbrio ter sido estabelecido entre o anticorpo e o antígeno expresso à superfície das células. O ensaio KinExA mais intensivos em termos de recurso proporciona uma determinação mais sensível de afinidade de ligação pela forma nativa de Jagged1 do que o sistema de ensaio Octet à base de Jagged1. Foi seguido o método de Ensaio de Exclusão Cinética de Rathanaswami et al. (2008). (Rathanaswami et al., High affinity binding measurements of antibodies to cell-surface-expressed antigens, Analytical Biochemistry 373: 52-60 (2008)). Brevemente foram definidos dois conjuntos de equilíbrio diferentes usando células expressando Jagged1 induzidas por doxiciclina. As células foram dissociadas em células com solução de dissolução de células, lavadas duas vezes com 1X PBS gelada e contadas usando um Hemocitômetro. As células foram tituladas e incubadas com duas concentrações de anticorpo constantes diferentes, uma a 30 pM e a outra a 1 nM. As titulações de células e soluções de anticorpo foram definidas em meio com Azida de Sódio a 0,05%. As células foram tituladas a partir de 8,33 milhões por mililitro de concentração, 1 a 3, para 10 pontos em tubos Falcon de 50 mL. Para o cenário de equilíbrio a [Ab] baixa, 4,5 mL de Ab a 60 pM foram misturados com 4,5 mL de cada solução de titulação de células diluindo a concentração de células e Ab final em metade. Para o cenário de equilíbrio a [Ab] elevada, 200 µL de Ab a 1 nM foram misturados com 200 µL de cada solução de titulação de células diluindo a concentração de células e Ab final em metade. Para cada cenário de equilíbrio, uma amostra somente com meio de células em branco e amostra sem células adicionadas seriam incluídas para pontos de referência. Os cenários de equilíbrio foram incubados durante 44 horas à TA, com agitação.

[0311] Após 44 horas de incubação, os sobrenadantes foram separados dos péletes de células através de centrifugação a 500 x g durante 5 minutos. Os sobrenadantes de cenários de equilíbrio a [Ab] elevada e [Ab] baixa foram depois operados através de uma máquina KinExA 3200.

[0312] Cada cenário de amostras de equilíbrio foi lido em duplicado na máquina KinExA. Para amostras de equilíbrio a [Ab] baixa, 4,1 mL foram operados de cada amostra em duplicado. Para amostras de equilíbrio a [Ab] elevada, 100 uL foram operados de cada amostra em duplicado. Esférulas de PMMA (Partículas de Metacrilato de Polimetila) foram revestidas com Ab Fc anti-Fc humano de Cabra e subsequentemente bloqueadas com uma solução bloqueante (1X PBS pH 7,4 + BSA a 10 mg/mL + Azida de Sódio a 0,05%). Para cada amostra de equilíbrio, a [Ab] livre seria detectada por operação das amostras de equilíbrio através das esférulas revestidas por uma rápida lavagem com o tampão de operação (1X PBS pH 7,4 + BSA a 1% + Azida de Sódio a 0,05%). Depois, o Ab de detecção secundária, anti-huIgG (H+L) de Cabra Dylight 649, foi operado através da célula de fluxo a 680 ng/mL e 500 µL por operação. O sinal de saída de voltagem KinExA foi depois usado em software KinExA para calcular a Kd. A partir das representações gráficas em duas concentrações [Ab] totais iniciais diferentes, a Kd foi obtida a partir de ajuste de curva usando análise de curva n no software KinExA Pro (Sapidyne Instruments Inc., Boise ID). O intervalo de confiança de 95% é dado como Kd baixa e Kd elevada. Tabela 6. Sumário de Afinidades de Ligação a 15D11.1

[0313] *Sumário de Octet é a média de 3 experiências Exemplo 11: Resultados de ensaios ELISA de reatividade cruzada entre espécies e seletividade de 15D11.1 contra membros da família de ligantes Notch.

[0314] 15D11.1 se liga a Jagged-1 humano recombinante e Jagged-1 de rato mas não se liga a Jagged-2, Dll1 ou Dll4. Em baixo está o resumo das IC50s. Tabela 7.

[0315] 15D11.1 foi testado quanto à ligação a ligantes Notch purificados recombinantes usando um formato de ensaio ELISA padrão. 15D11.1 se ligou a Jagged-1 humano e de rato (com IC50s variando de 0,3 nM-0,9 nM) mas não se ligou a Jagged-2, Dll1 ou Dll4.

[0316] 15D11.1 foi testado quanto à ligação a ligantes Notch purificados recombinantes; Fc Jagged1 humano (quimera Fc Jagged 1 Humano Recombinante - R&D Systems Cat #: 1277- JG-050), Jagged1 humano His (JAG1/Jagged1 Humano Marcador His Sino Biological Cat #: 11648-H08H), Fc Jagged1 humano (quimera Fc Jagged 1 de Rato Recombinante - R&D Systems - Cat #: 599-JG-050), Jagged2 humano (quimera Fc Jagged2 Humano Recombinante - R&D Systems Cat #:1726-JG-050), Jagged2 murino (quimera Fc Jagged 2 de Camundongo Recombinante - R&D Systems Cat #: 4748-JG-050), Delta-tipo 1 murino (DLL1 de Camundongo Recombinante marcador His – Sino Biological Cat #: 50522-M08H-50), Delta-tipo 4 humano (DLL4 Humano Recombinante marcador His - R&D Systems - Cat #: 1506-D4- 050) e Delta-tipo 4 murino (DLL4 de Camundongo Recombinante marcador His - R&D Systems - Cat #: 1389-D4-050) usando um ensaio imunossorvente ligado a enzimas (ELISA) padrão. 1 ug/mL de proteína de ligante Notch (como indicado) em PBS, ρΗ 7,4, foi revestido em placas ELISA (Nunc Maxisorp) a 4 °C durante a noite. As placas foram bloqueadas com bloqueante de Caseína em PBS (Pierce) durante uma hora à temperatura ambiente. Diluições de 2 vezes em série de 15D11.1

[0317] em tampão PBST (tampão ΡΒΤ (PBS + Tween 20 a 0,05% (ν/ν)) com BSA a 0,5% (p/v)) foram adicionadas às placas e incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas com PBST e os anticorpos ligados foram detectados com IgG específica anti-Fab humano de cabra conjugada com peroxidase (Sigma). Substrato de ΤΜΒ (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina) foi usado e a absorvância a 450 nm foi lida usando um leitor de placas de ELISA padrão. A absorvância foi representada graficamente contra concentrações de 15D11.1 nas FIGS. 8A e 8B. Exemplo 12: Ligação de 15D11.1 a células 293T transfectadas com Jagged-1 humano.

[0318] 15D11.1 se ligou a células 293T estavelmente transfectadas com Jagged-1 humano com uma EC50 de 0,29 nM. A ligação de 15D11.1 a células genitoras 293T foi usada como um controle negativo.

[0319] A ligação de 15D11.1 a Jagged-1 humano foi avaliada por citometria de fluxo usando células 293T manipuladas para expressar estavelmente Jagged-1 humano de uma maneira indutível por Tet. 15D11.1 se ligou a células 293T transfectadas com Jagged-1 humano com uma EC50 de 0,29 nM. Ver FIG. 9.

[0320] Brevemente, células 293T @ ~60% de confluência foram cultivadas @ 37 °C/CO2 a 5% na presença de Doxiciclina a 1 ug/mL para induzir expressão de Jagged-1 humano. Na manhã seguinte, as células foram removidas com solução de dissociação de células não enzimática (Gibco), lavadas em PBS (Gibco) suplementado com FBS a 2% (Hyclone), diluídas com 1 x 10e5 células/100 uL em PBS/FBS a 2% e aliquotadas até placas de poços profundos de 96 poços de 1,5 mL (Nunc) para imunocoloração. Diluições em série 1:2 de 15D11.1 foram feitas variando de 13,2 nM a 0,026 nM em concentração. 100 uL de diluição de anticorpo foram adicionados a 1 x 10e5 células e incubados em gelo durante 1 hr. As células foram lavadas 2X c/ PBS/FBS a 2% e incubadas com anti-Fc humano de camundongo (clone 1.35.1) conjugado a dylight 649 a uma conc de (0,1 ug/mL) durante 1 hr adicional para detecção de 15D11.1. Após 2 lavagens adicionais, as células foram operadas em um citômetro de fluxo BD LSRII usando o canal APC. Exemplo 13: Reatividade cruzada entre espécies de 15D11.1 com células 293T transfectadas com Jagged-1 murino.

[0321] 15D11.1 se ligou a células 293T estavelmente transfectadas com Jagged-1 murino com uma EC50 de 0,36 nM.

[0322] A reatividade cruzada entre espécies de 15D11.1 a Jagged-1 murino foi avaliada por citometria de fluxo usando células 293T manipuladas para expressar estavelmente Jagged- 1 murino. 15D11.1 se ligou a células 293T transfectadas com Jagged-1 murino com uma EC50 de 0,36 nM. Ver FIG. 10.

[0323] Resumidamente, células 293T estavelmente expressando Jagged-1 murino foram removidas com solução de dissociação de células não enzimática (Gibco), lavadas em PBS (Gibco) suplementado com FBS a 2% (Hyclone), diluídas com 1 x 10e5 células/100 uL em PBS/FBS a 2% e aliquotadas até placas de poços profundos de 96 poços de 1,5 mL (Nunc) para imunocoloração. Diluições em série 1:2 de 15D11.1 foram feitas variando de 13,2 nM a 0,026 nM em concentração. 100 uL de diluição de anticorpo foram adicionados a 1 x 10e5 células e incubados em gelo durante 1 hr. As células foram lavadas 2X c/ PBS/FBS a 2% e incubadas com anti-Fc humano de camundongo (clone 1.35.1) conjugado a dylight 649 a uma conc de (0,1 ug/mL) durante 1 hr adicional para detecção de 15D11.1. Após 2 lavagens adicionais, as células foram operadas em um citômetro de fluxo BD LSRII usando o canal APC. Exemplo 14: Ligação de 15D11.1 a células 293T transfectadas com Jagged-1 de rato.

[0324] Células 293T foram transientemente transfectadas com Jagged-1 de rato e a ligação de 15D11.1 foi avaliada por citometria de fluxo. 15D11.1 se ligou a células transfectadas com Jagged-1 de rato com uma EC50 de 0,25 nM. A ligação de 15D11.1 a células genitoras 293T foi usada como um controle negativo.

[0325] A reatividade cruzada entre espécies de 15D11.1 com Jagged-1 de rato foi avaliada por citometria de fluxo usando células 293T transientemente transfectadas com Jagged-1 de rato. 15D11.1 se ligou a células 293T transfectadas com Jagged-1 de rato com uma EC50 de 0,25 nM. Ver FIG. 11.

[0326] Resumidamente, células 293T @ ~60% de confluência foram transientemente transduzidas com BacMam/Jagged1 de rato a 8% (V/V) durante a noite @ 37 °C/CO2 a 5%. Na manhã seguinte, as células foram removidas com solução de dissociação de células não enzimática (Gibco), lavadas em PBS (Gibco) suplementado com FBS a 2% (Hyclone), diluídas com 1 x 10e5 células/100 uL em PBS/FBS a 2% e aliquotadas até placas de poços profundos de 96 poços de 1,5 mL (Nunc) para imunocoloração. Diluições em série 1:2 de 15D11.1 foram feitas variando de 13,2 nM a 0,026 nM em concentração. 100 uL de diluição de anticorpo foram adicionados a 1 x 10e5 células e incubados em gelo durante 1 hr. As células foram lavadas 2X c/ PBS/FBS a 2% e incubadas com anti-Fc humano de camundongo (clone 1.35.1) conjugado a dylight 649 a uma conc de (0,1 ug/mL) durante 1 hr adicional para detecção de 15D11.1. Após 2 lavagens adicionais, as células foram operadas em um citômetro de fluxo BD LSRII usando o canal APC. Exemplo 15: Titulação de dose de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 em ensaio de cocultura de ativação de Notch2 humano induzida por Jagged-1 humano

[0327] O mAb anti Jagged-1 15D11.1 antagoniza a ativação de Notch induzida por Jagged-1 humano em experiências de cocultura de uma maneira dependente da dose com uma IC50 de 1,69 nM (IC50 média de 2,31 nM +/- 0,56 Desvio Padrão, de n = 4 experiências). Ver FIG. 12.

[0328] Células 293T manipuladas para expressarem estavelmente Jagged-1 humano de uma maneira induzida por doxiciclina foram cocultivadas com células SK-MEL-28 estavelmente transfectadas com um repórter de luciferase de vaga-lume responsivo a Notch (12xCSL) (pGL4, Promega) com quantidades crescentes de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 (66,7 nM-0,131 nM). As células SK-MEL-28 foram caracterizadas por Citometria de fluxo e qPCR e foi demonstrado que expressavam elevados níveis de receptor Notch 2 endogenamente (dados não mostrados). A expressão endógena de outros membros da família Notch não foi detectada (Notch 1 & Notch 3). 15D11.1 foi capaz de inibir a sinalização Notch induzida por Jagged-1 de uma maneira dependente da dose com uma IC50 média de 2,31 nM (+/- 0,56 Desvios Padrão) de n = 4 experiências.

[0329] Resumidamente, células indutíveis por Tet 293T/Jagged-1 humano foram incubadas com doxiciclina (1 ug/mL) durante a noite a 37 °C/CO2 a 5% para induzir a expressão de Jagged-1 humano. No dia seguinte, as células 293T/Jagged-1 humano induzidas por doxiciclina (2 x 10e4) foram cocultivadas com células SK-MEL-28 (2 x 10e4) estavelmente expressando o repórter de luciferase de vaga- lume 12xCSL (pGL4, Promega), na presença de quantidades crescentes de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 (1:2 diluições variando de 66,7 nM-0,131 nM) em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. As células foram cocultivadas durante a noite durante ~18 hrs a 37 °C/CO2 a 5%. No dia seguinte, um volume igual de One-Glo (Promega) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas @ TA durante 10 min com agitação suave e lidas em um luminímetro. Exemplo 16: Titulação de dose de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 em ensaio de cocultura de ativação de Notch1 murino induzida por Jagged-1 murino

[0330] O mAb anti Jagged-1 15D11.1 antagoniza a ativação de Notch 1 murino induzida por Jagged-1 murino em experiências de cocultura de uma maneira dependente da dose com uma IC50 de 7,72 nM (IC50 média de 9,0 nM +/- 1,47 Desvio Padrão, de n = 3 experiências).

[0331] Células 293T manipuladas para expressarem estavelmente Jagged-1 murino foram cocultivadas com células 293T estavelmente transfectadas com Notch1 murino e um repórter de luciferase de vaga-lume responsivo a Notch (7xCSL) com quantidades crescentes de mAb anti-Jagged-1

15D11.1 (667 nM-1,3 nM). 15D11.1 foi capaz de inibir a sinalização Notch1 murino induzida por Jagged-1 murino de uma maneira dependente da dose com uma IC50 média de 7,72 nM (+/- 1,47 Desvios Padrão) de n = 3 experiências. Ver FIG.

13.

[0332] Resumidamente, células 293T/Jagged-1 murino (2 x 10e4) foram cocultivadas com células 293T/Notch1 murino (2 x 10e4) estavelmente expressando um repórter de luciferase de vaga-lume 7xCSL responsivo a Notch, na presença de quantidades crescentes de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 (1:2 diluições variando de 667 nM-1,3 nM) em uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. As células foram cocultivadas durante a noite durante ~18 hrs a 37 °C/CO2 a 5%. No dia seguinte, um volume igual de One-Glo (Promega) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas @ TA durante 10 min com agitação suave e lidas em um luminímetro. Exemplo 17: Titulação de dose de mAb anti-Jagged-1 15D11.1 em culturas de broncoesferas não estimuladas e estimuladas

[0333] O impacto do tratamento com mAb anti-Jagged-1 (15D11.1) na diferenciação de células epiteliais das vias aéreas foi avaliado usando culturas de broncoesferas em 3D derivadas de células epiteliais brônquicas saudáveis normais ou doentes (CF & COPD) não estimuladas ou estimuladas com IL-13 (1 ng/mL) durante 7 dias na presença de concentrações crescentes de 15D11.1 (66,7 nM-0,131 nM). 15D11.1 reduziu a expressão de marcadores de células secretoras (SCGB1A1), células caliciformes (MUC5AC) e ativação de Notch (NRARP) de uma maneira dependente da dose após tratamento de 7 dias em culturas estimuladas com IL-13 (1 ng/mL) e não estimuladas e aumentou a expressão de marcador de células ciliadas

(DNAI2) em culturas não estimuladas. Os resultados foram similares em células dadores saudáveis normais e células dadoras doentes (CF e COPD). Os níveis de expressão são expressos em relação ao gene de manutenção HPRT1.

[0334] Células epiteliais brônquicas humanas normais e células epiteliais brônquicas com Doença Pulmonar Obstrutivo Crônica (COPD) foram adquiridas a partir da Lonza. Células epiteliais brônquicas com Fibrose Cística (CF) e meios de diferenciação (meios UNC ALI) foram obtidos a partir da University of North Carolina Chapel Hill (UNC). Culturas de broncoesferas em 3D usando células de passagem 2 foram realizadas como descrito previamente (ref Danahay et al.). Resumidamente, células epiteliais brônquicas humanas P1 foram expandidas em meio BEGM (Lonza) em um frasco de cultura de tecidos T75. Após confluência, as células foram tripsonizadas, ressuspensas em meio de diferenciação UNC + matrigel a 3% (Corning) e plaqueadas a uma densidade de 6.000 células/poço em 60 uL de meio UNC ALI solidificado contendo matrigel a 25%, em placas de fundo redondo de 96 poços. As broncoesferas foram cultivadas 7 dias com realimentação três vezes por semana. No dia 7, as culturas foram estimuladas +/- IL-13 (@ 1 ng/mL) + 15D11.1 durante 7 dias adicionais. Meio fresco (com ou sem tratamento) foi mudado a cada dois dias e suplementado com citocina fresca e tratamento. No dia 14, os organoides foram lisados e processados seguindo as especificações do fabricante da plataforma Affymetrix QuantiGene para examinar marcadores para células secretoras (SGB1A1; FIGS. 14A, 14E, 14I, 15A, 15E e 15I), células caliciformes (MUC5AC; FIGS. 14B, 14F, 14J, 15B, 15F e 15J), células ciliadas (DNAI2 (FIGS. 14C, 14G, 14K, 15C, 15G, e

15K) e FOXJ1) e marcador da ativação de Notch (NRARP; FIGS. 14D, 14H, 14L, 15D, 15H e 15L).

[0335] O mAb anti-Jag1 15D11.1 reduziu a expressão de marcadores de células secretoras (SCGB1A1; FIGS. 14A, E e I), células caliciformes (MUC5AC; FIGS. 14B, F e J) e ativação de Notch (NRARP; FIGS. 14D, H e L) enquanto demonstra expressão aumentada de marcador de células ciliadas (DNAI2; FIGS. 14C, G e K) de uma maneira dependente da dose após tratamento de 7 dias de culturas de broncoesferas não estimuladas derivadas de células epiteliais brônquicas normais (FIGS. 14A-D) ou doentes (CF (FIGS. 14E-H) e COPD (FIGS. 14I-L)). Os níveis de expressão são expressos em relação ao gene de manutenção HPRT1.

[0336] O mAb anti-Jag1 15D11.1 reduziu a expressão de marcadores de células secretoras (SCGB1A1; FIGS. 15A, E e I), células caliciformes (MUC5AC; FIGS. 15B, F e J) e ativação de Notch (NRARP; FIGS. 14D, H e L) de uma maneira dependente da dose após tratamento de 7 dias em culturas de broncoesferas estimuladas com IL-13 (1 ng/mL) derivadas de células epiteliais brônquicas normais ou doentes (CF e COPD). Os níveis de expressão são expressos em relação ao gene de manutenção HPRT1.

[0337] A expressão de genes de culturas de broncoesferas em 3D foi quantificada usando o Ensaio QuantiGene Multiplex (Affymetrix). 30 uL de solução de lise Affymetrix com Proteinase K foram adicionados a cada 60 uL de broncoesferas à razão 2:1 e incubados a 55 °C durante 30 min conforme Danahay et al., 2015. Uma amostra de 80 uL dos lisados foi transferida para placa de 96 poços proporcionada pela Affymetrix contendo 20 uL de uma solução de hibridação com mistura de lise, proteinase K, reagente bloqueante e conjunto de sondas e conjunto de esférulas específicos O/N a 55 °C. Os conjuntos de sondas continham os genes alvo: DNAI2(NM_023036); FOXA3(NM_0044971); FOXJ1(NM_001454); HPRT1(NM_000194); MUC5AC(NM_017511); MUC5B(NM_002458); NOTCH3(NM_000435); NRARP(NM_001004354); SCGB1A1(NM_003357) do Painel da Affymetrix M17012501 ou DNAI2(NM_023036); FOXJ1(NM_001454); HPRT1(NM_000194); MUC5AC(NM_017511); MUC5B(NM_002458); NRARP(NM_001004354); SCGB1A1(NM_003357); ANO1(NM_018043); SLC26A4(NM_000441) do Painel da Affymetrix M18013101. No dia seguinte, solução de lavagem, solução pré- amplificadora, solução amplificadora e solução de estreptavidina-ficoeritrina (SAPE) da sonda de marcação foram preparadas usando as especificações do fabricante. As placas foram lavadas em um lavador de placas magnéticas três vezes entre cada passo. Cada poço foi lido em instrumento FlexMap 3D (Luminex). Para assegurar que os níveis eram similares ao longo dos poços, os dados foram normalizados contra o gene de manutenção interna HRPRT1. Exemplo 18: A dosagem profilática de anticorpo para Jag1 inibe a expressão do gene da via de sinalização Notch NRARP e do gene marcador de células caliciformes Muc5ac no modelo de metaplasia de células caliciformes de camundongo induzido por administração intratraqueal de IL-13.

[0338] Para administração intratraqueal (IT) de IL-13, camundongos C57Bl/6 foram anestesiados com isoflurano a 3- 5% até ao efeito e doseados usando uma ponta de pipeta de carga de gele cega cuidadosamente inserida na traqueia através da boca. Os camundongos foram suspensos em um quadro usando fio de sutura em torno do incisor como necessário para visualizar a traqueia. 10 microgramas de IL-13 de camundongo foram administrados em 50 microlitros de solução salina diariamente, durante três dias. No dia 4, os pulmões foram coletados para RNA. Cinco grupos de camundongos foram usados. A três grupos foi administrada intratraquealmente solução salina e foram pré-tratados uma vez no dia 1 com nada (Sem tratamento), 100 mg/kg de anticorpo de controle de isotipo (Iso) ou 100 mg/kg de 15D11.1. A dois grupos foi administrada intratraquealmente IL-13 e foram pré-tratados uma vez no dia 1 com 100 mg/kg de anticorpo de controle de isotipo (Iso) ou 100 mg/kg de 15D11.1.

[0339] A) O gene da via de sinalização Notch Nrarp é subregulado nos pulmões de camundongos intratraquealmente desafiados com solução salina ou IL-13 quando tratados por 15D11.1 B) O gene marcador de células caliciformes Muc5ac é sobrerregulado nos pulmões de camundongos intratraquealmente desafiados com IL-13 e subregulado quando tratados por 15D11.1. Ver FIGS. 16A e B. Exemplo 19: A dosagem profilática de anticorpo para Jag1 dirige um fenótipo de células epiteliais das vias aéreas ciliadas e inibe a metaplasia de células caliciformes no modelo de asma induzido por ovalbumina

[0340] A remodelação das vias aéreas pulmonares induzida por alérgeno (metaplasia de células caliciformes) de camundongo foi medida no modelo de camundongo induzido pela ovalbumina de asma. Cinco grupos de oito camundongos (40 camundongos totais) foram usados em este estudo. Camundongos Balb/c fêmeas adultos (mais do que 8 semanas de idade) foram sensibilizados e reforçados por injeção intraperitoneal

(i.p.) de 0,2 mL de gel de hidróxido de alumínio a 2% (ALUM) gel (Serva Electrophoretics, 12261, Heidelberg, Alemanha) com ou sem 10 µg de antígeno ovalbumina (OVA) (Worthington Biochemical Corporation, LS003054, Lakewood, NJ) nos dias 0 e 14. O grupo A foi sensibilizado e reforçado com 0,2 mL de injeções i.p. de uma solução de um mL de solução salina a 0,9% em 50 mL de gel ALUM.

Os grupos B, C, D e E foram sensibilizados e reforçados com 0,2 mL de injeções i.p. de uma solução de 2,55 mg de OVA dissolvida em um mL de solução salina a 0,9% em 50 mL de gel ALUM.

Os grupos B, C, D e E inalaram OVA nebulizada para evocar inflamação pulmonar induzida por antígeno e metaplasia de células caliciformes nos pulmões.

O grupo A inalou solução salina nebulizada sem OVA.

Os grupos A e B foram doseados com Anticorpo de controle de isotipo (100 mg/kg, PL-35304) e os grupos C (1 mg/kg), D (10 mg/kg) e E (100 mg/kg) foram doseados com Mab 15D11.1 anti-<hu Jag-1> hu (PL- 42541).mg/kg). Todos os grupos foram doseados i.v. pela veia da cauda com um volume de 5 mL/kg nos dias 0, 7, 14 e 20. No dia 27, os camundongos foram eutanasiados e os pulmões foram inflados com formalina tamponada neutra a 10% através de uma cânula traqueal.

Os pulmões inflados foram imersos em formalina durante pelo menos 24 h. Após terem sido processados em blocos de parafina, os pulmões foram secionados (5 µm) e flutuaram para lâminas de vidro. As seções pulmonares foram coradas com ácido periódico–schiff (PAS) para avaliação do conteúdo de mucina.

[0341] FIG. 17A) Foi usada coloração imunofluorescente dual para visualizar conteúdo de células secretoras e ciliadas do epitélio das vias aéreas. As vias aéreas não sensibilizadas e sensibilizadas/desafiadas com OVA têm um fenótipo de células predominantemente secretoras onde um fenótipo de células mais ciliadas é observado nos camundongos sensibilizados/desafiados com OVA tratados com 15D11.1. FIG. 17B) Imagens representativas de epitélio das vias aéreas com mucina corada por PAS. FIG. 17C) O conteúdo de mucina, medido por técnica estereológica, no epitélio das vias aéreas diminui de uma maneira dependente da dose com tratamento com 15D11.1. Exemplo 20: A dosagem terapêutica de Ab neutralizante de Jag1 no modelo de asma induzido por ovalbumina inibe a expressão de genes de células secretoras

[0342] No modelo de OVA de camundongo da asma, cinco grupos de camundongos foram doseados no dia 22 (dosagem terapêutica). Um grupo não foi sensibilizado a OVA e foi doseado com anticorpo de controle de isotipo a 100 mg/kg (Solução Salina-Iso). Um grupo foi sensibilizado/desafiado com OVA e doseado com anticorpo de controle de isotipo a 100 mg/kg (Iso). Três grupos de camundongos foram sensibilizados/desafiados com OVA e doseados com 10, 30 ou 100 mg/kg de 15D11.1

[0343] FIG. 18A) 15D11.1 inibiu a expressão do gene marcador de células secretoras Scgb1a1 em tecido pulmonar de camundongo de uma maneira dependente da dose com uma ED50 entre as doses de 10 e 30 mg/kg. 15D11.1 também inibiu significativamente os genes marcadores de células caliciformes FIG. 18B) Muc5ac, FIG. 18C) Muc5b e FIG. 18D) o gene da via de ativação de Notch Nrarp. Exemplo 21: O tratamento com anticorpo por Jag1 reduz a obstrução de muco das vias aéreas no modelo de camundongo transgênico b-ENaC de doença pulmonar muco-obstrutiva

[0344] Os camundongos transgênicos (Tg) em b-ENaC desenvolvem obstrução do muco das vias aéreas (Livraghi- Butrico, A., et al., 2012, Genetically determined heterogeneity of lung disease in a mouse model of airway mucus obstruction. Physiol Genomics, 44: 470-484). 100 mg/kg de 15D11.1 ou 100 mg/kg de anticorpo de controle de isotipo foram administrados uma vez por semana durante três semanas a camundongos transgênicos (Tg) em b-ENaC e controles de companheiros de ninhada de tipo selvagem. Os pulmões foram coletados quatro semanas após a primeira dose de anticorpo e embebidos em parafina, secionados e corados com PAS quanto ao muco. A gravidade da patologia pulmonar foi classificada semiquantitativamente em uma escala variando de 0 a 3 quanto à pontuação de tampão de muco das vias aéreas: 0 pulmão normal, 1 epitélio revestindo material positivo quanto a PAS escasso nas vias aéreas médias/grandes, 2 quantidade ligeira de material positivo quanto a PAS e não mais do que 1 via aérea de tamanho médio obstruída, 3 quantidade moderada de material positivo quanto a PAS e mais do que 1 via aérea de tamanho médio obstruída.

[0345] FIG. 19A) Imagens representativas de epitélio das vias aéreas com mucina corada por PAS. FIG. 19B) A pontuação de tampão de muco foi diminuída nos pulmões por tratamento com 15D11.1. Exemplo 22: A dosagem de anticorpo para Jag1 reduziu o conteúdo de mucina no epitélio respiratório de macacos

[0346] 4 doses semanais de 15D11.1 50 mg/kg SC dadas a macacos-cinomólgos. No dia 28 após a primeira dose, os macacos foram eutanasiados e os pulmões processados e corados com PAS para avaliação do conteúdo de mucina.

[0347] Imagens representativas de epitélio das vias aéreas de macacos-cinomólgos com mucina corada por PAS. 15D11.1 reduziu o conteúdo de mucina (i.e., número de células caliciformes) no epitélio respiratório (FIGS. 20D-F) em comparação com macacos doseados somente com veículo (FIGS. 20A-C). Exemplo 23: Farmacocinética de anticorpo 15D11.1

[0348] O perfil farmacocinético de diferentes níveis de dose do anticorpo 15D11.1 após uma única injeção intravenosa (IV) ou subcutânea (SC) foi avaliado em camundongos BALB/c e macacos-cinomólgos. Amostras de soro foram coletadas e as concentrações de anticorpos foram analisadas por um ensaio imunossorvente ligado a enzimas.

[0349] Eliminação do anticorpo 15D11.1 após uma única administração intravenosa ou subcutânea de diferentes doses do anticorpo a FIG. 21A) camundongos e FIG. 21B) macacos- cinomólgos. Os perfis de eliminação em macacos-cinomólgos exibiram disposição mediada pelo alvo a doses menores do que 10 mg/kg.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratamento de um sujeito com uma condição relacionada com doença pulmonar, o método caracterizado pelo fato de que compreende administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação ao antígeno que se liga especificamente a uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos com pelo menos 90% de identidade de sequências de aminoácidos com uma sequência de aminoácidos de um Jagged1.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sujeito é um mamífero.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que o sujeito é humano.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado pelo fato de que a administração é por nebulização.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 e 4, caracterizado pelo fato de que a administração é por injeção subcutânea.

6. Proteína de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que se liga especificamente a um polipeptídeo Jagged1.

7. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o Jagged1 humano tem uma sequência compreendendo SEQ ID NO:

353.

8. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 e 7, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo recombinante, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, um anticorpo multiespecífico ou um seu fragmento de anticorpo.

9. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento Fab, um fragmento Fab' ou um fragmento F(ab')2.

10. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo humano.

11. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo monoclonal.

12. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é do tipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

13. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é do tipo IgG1 ou IgG2.

14. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é acoplada a um grupo de marcação.

15. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento, e em que o anticorpo compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, em que a CDRL1 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46, 52, 58, 64, 70, 76, 82, 88, 94, 100, 106, 112, 118, 124, e 130; a CDRL2 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47, 53, 59, 65, 71, 77, 83, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 125, e 131; a CDRL3 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, 96, 102, 108, 114, 120, 126, e 132; a CDRH1 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 136, 142, 148, 154, 160, 166, 172, 178, 184, 190, 196, 202, 208, 214, 220, 226, 232, 238, 244, 250, 256, e 262; a CDRH2 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 137, 143, 149, 155, 161, 167, 173, 179, 185, 191, 197, 203, 209, 215, 221, 227, 233, 239, 245, 251, 257, e 263; e a CDRH3 compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 138, 144, 150, 156, 162, 168, 174, 180, 186, 192, 198, 204, 210, 216, 222, 228, 234, 240, 246, 252, 258, e 264.

16. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento, e em que o anticorpo compreende uma CDRL1, uma CDRL2, uma CDRL3, uma CDRH1, uma CDRH2 e uma CDRH3, em que cada CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2 e CDRH3, respectivamente, compreende uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 137, e SEQ ID NO: 138; SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 143, e SEQ ID NO: 144; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ

ID NO: 18, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 149, e SEQ ID NO: 150; SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 155, e SEQ ID NO: 156; SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 161, e SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 167, e SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 173, e SEQ ID NO: 174; SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 179, e SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 185, e SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 191, e SEQ ID NO: 192; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 197, e SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 202, SEQ ID NO: 203, e SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 209, e SEQ ID NO: 210; SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 214, SEQ ID NO: 215, e SEQ ID NO: 216; SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 220, SEQ ID NO: 221, e SEQ ID NO: 222; SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 226, SEQ ID NO: 227, e SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 232, SEQ ID NO: 233, e SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 238, SEQ ID NO: 239, e SEQ ID NO: 240; SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 244, SEQ ID NO: 245, e SEQ ID NO: 246; SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 250, SEQ ID NO: 251, e SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 256, SEQ ID NO: 257, e SEQ ID NO:

258; e SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 262, SEQ ID NO: 263, e SEQ ID NO: 264.

17. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento, e em que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 267, 271, 275, 279, 283, 287, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, e 351 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 268, 272, 276, 280, 284, 288, 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, e 352.

18. Proteína de ligação ao antígeno isolada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um seu fragmento, e em que o anticorpo ou seu fragmento compreende uma combinação de uma região variável de cadeia leve e uma região variável de cadeia pesada selecionadas do grupo consistindo em uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 267 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 268; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 271 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 272; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 275 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 276; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 279 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 280; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 283 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 284; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 287 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 288; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 291 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 292; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 295 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 296; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 299 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 300; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 303 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 304; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 307 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 308; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 311 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 312; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 315 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 316; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 319 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 320; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 323 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 324; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 327 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 328; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 331 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 332; uma região variável de cadeia leve compreendendo

SEQ ID NO: 335 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 336; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 339 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 340; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 343 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 344; uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 347 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 348; e uma região variável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 351 e uma região variável de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 352.

19. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou seu fragmento, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17 e 18.

20. Molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico está operacionalmente ligada a uma sequência de controle.

21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 20.

22. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 21.

23. Anticorpo ou seu fragmento, caracterizado pelo fato de que é produzido pela célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 22.

24. Método de produção do anticorpo ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15,

16, 17 e 18, caracterizado pelo fato de que compreende o passo de preparação do anticorpo ou seu fragmento a partir de uma célula hospedeira que secreta o anticorpo.

25. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um anticorpo ou seu fragmento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17 ou 18, e excipiente farmaceuticamente aceitável.

26. Proteína de ligação ao antígeno isolada, caracterizada pelo fato de que compete pela ligação a Jagged1 humano com um anticorpo ou seu fragmento, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 15, 16, 17 e 18.