BR112019020413A2

BR112019020413A2 - composições e métodos para detectar câncer de próstata

Info

Publication number: BR112019020413A2
Application number: BR112019020413A
Authority: BR
Inventors: Prieur Alexandre
Original assignee: Ecs Progastrin Sa
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2020-06-09
Also published as: CN110945025B; KR20190133219A; CA3058263A1; EA201992318A1; BR112019020414A2; US20210087265A1; CN110662769A; US11614448B2; JP7071994B2; EP3601343A1; JP7156622B2; AU2018242152B2; CN110662769B; SG11201908997UA; US20200200751A1; CN110945025A; EA201992316A1; AU2018242152A1; KR102317805B1; EP3601347A1

Abstract

a presente invenção é relacionada a composições e métodos para o diagnóstico in vitro de câncer de próstata, em que a referida composição compreende um anticorpo se ligando a progastrina e os referidos métodos compreendem o uso de um anticorpo se ligando a progastrina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA DETECTAR CÂNCER DE PRÓSTATA

INTRODUÇÃO

[001] A presente invenção se refere ao diagnóstico ín vítro de câncer, mais particularmente a métodos para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata. As composições de acordo com a invenção compreendem uma molécula de ligação à progastrina, particularmente um anticorpo anti-hPG, enquanto os métodos de acordo com a invenção compreendem o uso de uma molécula de ligação à progastrina e particularmente a um anticorpo anti-hPG.

[002] De acordo com a Agência Internacional para Pesquisa do Câncer, o câncer de próstata (PC) é o segundo câncer mais comum em homens e a quinta principal causa de morte por câncer em homens. Em 2012, ocorreu em 1,1 milhão de homens e causou 307.000 mortes. Nos Estados Unidos, é o câncer não cutâneo mais comum em homens nos Estados Unidos. Estima-se que um em cada seis homens brancos e um em cada cinco homens afro-americanos serão diagnosticados com câncer de próstata durante a vida, com a probabilidade aumentando com a idade.

[003] A maioria dos cânceres de próstata (95%) é adenocarcinoma, ou câncer glandular, que começa quando as células normais da próstata secretora de sêmen se transformam em células cancerígenas. Aproximadamente 4% dos casos de

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2/83 câncer de próstata têm morfologia celular de transição e acredita-se que surjam do revestimento urotelial da uretra prostática. Acredita-se que os poucos casos com morfologia neuroendócrina surjam a partir de células-tronco neuroendócrinas normalmente presentes na próstata ou de programas de diferenciação aberrantes durante a transformação celular. Os carcinomas de células escamosas constituem menos de 1% de todos os carcinomas da próstata. 0 câncer de próstata geralmente causa metástase para os ossos, linfonodos e pode invadir o reto, a bexiga e os ureteres inferiores após a progressão local.

[004] Os tratamentos geralmente incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e terapia direcionada, isoladamente ou em combinação. No entanto, os resultados geralmente são ruins, com uma taxa de sobrevida em menos de 10% em 5 anos globalmente. Isso ocorre principalmente porque a maioria das pessoas é detectada apenas com doenças avançadas, o que tem uma consequência direta na taxa de sobrevivência. Em alguns países asiáticos, os esforços de triagem mostraram estar associados a uma maior taxa de sobrevivência.

[005] A taxa de sobrevivência de cinco anos da população geral de câncer de próstata é muito alta (cerca de 99%) . No entanto, essa taxa cai consideravelmente quando o câncer é metastizado (cerca de 28,5%). Felizmente, cerca de

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80% dos pacientes são diagnosticados com doença localizada (Vigilância E; Programa de Resultados Finais (SEER). Programa de Vigilância, Epidemiologia e Resultados Finais. Estatísticas Rápidas; 2016 [citado em 12 de setembro de 2016]. Disponível em: http://seer.cancer.gov/faststats/selections.php). Isso se deve em grande parte às melhorias nos métodos de triagem. No entanto, o antígeno específico da próstata (PSA) do biomarcador mais utilizado tem se mostrado controverso como teste de diagnóstico devido a suas limitações.

[006] Portanto, ainda são necessários métodos que permitam um diagnóstico rápido, confiável e econômico do câncer de próstata.

[007] Este é o objetivo da presente invenção.

DESCRIÇÃO

[008] A presente invenção fornece agora métodos para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata, em que o referido método compreende a detecção de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo. Preferencialmente, a quantidade de progastrina na referida amostra é determinada, permitindo assim a quantificação da progastrina.

[009] A pré-progastrina humana, um peptideo de 101 aminoácidos (referência da sequência de aminoácidos: MB19304.1), é o principal produto de tradução do gene da gastrina. A progastrina é formada pela divagem dos primeiros

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4/83 aminoácidos (o peptídeo sinal) da pré-progastrina. A cadeia de 80 aminoácidos da progastrina é processada ainda mais por divagem e modificação de enzimas em várias formas de hormônios da gastrina biologicamente ativos: gastrina 34 (G34) e gastrina 34 (G34-Gly) com glicina estendida, compreendendo os aminoácidos 38-71 da progastrina, gastrina 17 (G17) e gastrina 17 prolongada com glicina (G17-Gly), compreendendo os aminoácidos 55 a 71 da progastrina.

[0010] Os anticorpos monoclonais anti-progastrina humana (anti-hPG) e seu uso para terapia foram descritos nos seguintes documentos: WO 2011/083 088 para câncer colorretal, WO 2011/083 090 para câncer de mama, WO 2011/083 091 para câncer de pâncreas, WO 2011/116 954 para câncer colorretal e gastrointestinal, e WO 2012/013 609 e WO 2011/083089 para patologias hepáticas.

[0011] A presente invenção será mais completamente compreendida a partir da descrição detalhada dada aqui e dos desenhos anexos, que são dados apenas como ilustração e não limitam o escopo pretendido da invenção.

[0012] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para avaliação ín vítro de um risco da presença de câncer de próstata, em que o referido método compreende uma etapa de detecção de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo. A presença de progastrina

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5/83 na amostra indica que há um risco da presença de câncer de próstata.

[0013] Assim, em uma primeira modalidade, a invenção se refere a um método ín vitro para avaliar o risco da presença de câncer de próstata em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de:

a) contatar uma amostra biológica do referido indivíduo com pelo menos uma molécula de ligação à progastrina, e

b) detectar a ligação à progastrina da referida molécula de ligação à progastrina na referida amostra, em que a referida ligação indica um risco da presença de câncer de próstata.

[0014] A ligação da molécula de ligação à progastrina pode ser detectada por vários ensaios disponíveis para o especialista na técnica. Embora qualquer meio adequado para realizar os ensaios esteja incluído na invenção, pode ser mencionado em particular FACS, ELISA, RIA, western-blot e IHC.

[0015] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a invenção para a avaliação ín vitro de um risco da presença de câncer de próstata em um indivíduo, compreende as etapas de:

a) contatar a referida amostra biológica do referido indivíduo com pelo menos uma molécula de ligação à progastrina,

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b) determinar a concentração de progastrina na referida amostra biológica, em que uma concentração de progastrina de pelo menos 10 pM na referida amostra biológica é indicativa de um risco da presença de câncer de próstata.

[0016] Uma vez determinada a concentração de progastrina presente na amostra, o resultado pode ser comparado com o da (s) amostra (s) de controle, que é (são) obtidas de maneira semelhante às amostras de teste, mas de indivíduos conhecidos que não são sofrem de um câncer de próstata. Se a concentração de progastrina for significativamente mais elevada na amostra de teste, podese concluir que há uma probabilidade aumentada de que o indivíduo de quem foi derivado tenha um câncer de próstata.

[0017] Assim, em uma modalidade mais preferida, o método da invenção compreende as etapas adicionais de:

c) determinar uma concentração de referência de progastrina em uma amostra de referência,

d) comparar a concentração de progastrina na referida amostra biológica com areferida concentração de referência de progastrina,

e) avaliar, a partir da comparação da etapa d), o risco da presença de câncer de próstata.

[0018] De acordo com outro aspecto, a invenção se refere a um método ín vítro para diagnosticar câncer de

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7/83 próstata em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de:

b) detectar a ligação à progastrina da referida molécula de ligação à progastrina na referida amostra, em que a referida ligação indicou a presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

[0019] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método para a diagnóstico ín vítro de câncer de próstata em um indivíduo, compreendendo as etapas de:

b) determinar a concentração de progastrina na referida amostra biológica, em que uma concentração de progastrina de pelo menos 10 pM na referida amostra biológica é indicativa da presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

[0020] Em uma modalidade mais particular de um método de acordo com a invenção, uma concentração de progastrina de pelo menos 10 pM, pelo menos 20 pM, pelo menos 30 pM, na referida amostra biológica é indicativa da presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

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[0021] Em uma modalidade mais preferida, o método da invenção compreende as etapas adicionais de:

a) determinar uma concentração de referência de progastrina em uma amostra de referência,

b) comparar a concentração de progastrina na referida amostra biológica com o referido nível de referência ou concentração de progastrina,

c) diagnosticar, a partir da comparação da etapa d), a presença de câncer de próstata.

[0022] De acordo com outro aspecto, a invenção se refere a um método ín vítro para diagnosticar câncer de próstata metastizado em um indivíduo, o referido método compreendendo as etapas de:

a) contatar a amostra biológica do referido indivíduo com pelo menos uma molécula de ligação à progastrina, e

b) detectar a ligação à progastrina da referida molécula de ligação à progastrina na referida amostra, em que a referida ligação indica a presença de câncer de próstata metastizado no referido indivíduo.

[0023] Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere a um método para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata metastizado em um indivíduo, a partir de uma amostra biológica do referido indivíduo, compreendendo as etapas de:

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a) contatar a referida amostra biológica com pelo menos uma molécula de ligação à progastrina,

b) determinar por um ensaio bioquímico o nível ou concentração de progastrina na referida amostra biológica, em que uma concentração de progastrina de pelo menos 10 pM maior na referida amostra biológica é indicativa da presença de câncer de próstata metastizado no referido indivíduo.

[0024] Em uma modalidade mais particular de um método de acordo com a invenção, uma concentração de progastrina de pelo menos 10 pM, pelo menos 20 pM, pelo menos 30 pM, pelo menos 40 pM ou pelo menos 50 pM na referida amostra biológica é indicativa da presença de câncer de próstata metastizado no referido indivíduo.

[0025] Em uma modalidade mais preferida, o método da invenção compreende as etapas adicionais de:

b) comparar a concentração de progastrina na referida amostra biológica com a referida concentração de referência de progastrina,

c) diagnosticar, a partir da comparação da etapa d), a presença de câncer de próstata metastizado.

[0026] Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um método para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata em um indivíduo, compreendendo a

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10/83 determinação da concentração de progastrina em uma amostra biológica e comparando o referido valor obtido com a concentração de progastrina em uma amostra de referência.

[0027] Em uma modalidade mais particular, em um método para o diagnóstico de câncer de próstata de acordo com a presente invenção, a amostra biológica do referido indivíduo é contatada com pelo menos uma molécula de ligação à progastrina, em que a referida molécula de ligação à progastrina é um anticorpo ou um antígeno seu fragmento de ligação.

[0028] A expressão avaliação de um risco da presença de câncer de próstata em um indivíduo designa a determinação de uma probabilidade relativa de um determinado indivíduo sofrer de câncer de próstata, quando comparado a um indivíduo ou valor de referência. Um método de acordo com a invenção representa uma ferramenta na avaliação do referido risco, em combinação com outros métodos ou indicadores, tal como exame clínico, biópsia e determinação do nível de um biomarcador conhecido de câncer de próstata, tal como, por exemplo, antígeno específico da próstata (PSA).

[0029] A expressão diagnóstico ín vítro significa determinar se um indivíduo está sofrendo de uma determinada afecção. Sabe-se que o diagnóstico de câncer de próstata envolve pelo menos uma observação clínica dos sintomas desse indivíduo e da detecção de PSA. Atualmente, o teste de PSA

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11/83 é usado como um biomarcador. No entanto, o PSA não representa um biomarcador ideal, principalmente por causa da incerteza geral em relação ao seu significado, o que levou a ForçaTarefa de Serviços Preventivos dos EUA a recomendar contra o uso dos níveis de PDA para triagem em 2012 (Gaudreau et al, Bíomark Câncer. 2016, 8 (Supl 2) : 15-33) . Embora alguns biomarcadores tenham sido identificados na fase de descoberta, ainda é um grande desafio transferi-los para a clínica, principalmente devido à falta de um processo de avaliação sistemática (McGrath et al., Prostate Int. 2016, 4 (4) : 130-135; Gaudreau et al, Bíomark Câncer. 2016, 8 (Suppl 2): 15-33; Saini, Cell Oncol (Dordr). 2016, 39 (2): 97-106).

[0030] Portanto, um método para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata, de acordo com a presente invenção, pode ser considerado como uma ferramenta dentro de um processo de diagnóstico.

[0031] Em uma modalidade mais particular, a presente invenção se refere a um método para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata em um indivíduo, compreende a determinação da concentração de progastrina na referida amostra biológica e a determinação de um biomarcador conhecido de câncer de próstata, preferencialmente PSA.

[0032] A expressão câncer de próstata se refere a qualquer tipo de câncer originário da próstata. O câncer de

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12/83 próstata inclui, em particular, adenocarcinoma da próstata, mas também sarcomas, carcinomas de células pequenas, tumores neuroendócrinos, carcinomas de células de transição que também podem se desenvolver dentro da próstata. A expressão câncer de próstata também envolve câncer de próstata associado à metástase, em particular metástase para ossos, linfonodos, mas também para o reto, bexiga e ureteres inferiores.

[0033] O termo progastrina designa o peptídeo de progastrina de mamífero, e particularmente a progastrina humana. Para evitar dúvidas, sem qualquer especificação, a expressão progastrina humana se refere ao PG humano da sequência SEQ I1D No. 1. A progastrina humana compreende notavelmente um domínio N-terminal e C-terminal que não estão presentes nas formas do hormônio gastrina biologicamente ativo mencionadas acima. De preferência, a sequência do referido domínio N-terminal é representada pela SEQ ID NO. 2. Em outra modalidade preferida, a sequência do referido domínio C-terminal é representada pela SEQ ID NO. 3)

[0034] A determinação da concentração de progastrina, em um método de acordo com a invenção, é realizada por qualquer método conhecido por um especialista na técnica de bioquímica.

[0035] De preferência, a determinação dos níveis de progastrina em uma amostra inclui o contato da referida

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13/83 amostra com uma molécula de ligação à progastrina e a medição da ligação à progastrina da referida molécula de ligação à progastrina.

[0036] Quando os níveis de expressão são medidos no nível da proteína, pode ser notavelmente realizada usando moléculas de ligação à progastrina específicas, tais como por exemplo, anticorpos, em particular usando tecnologias bem conhecidas, tais como coloração da membrana celular usando biotinilação ou outras técnicas equivalentes, seguidas de imunoprecipitação com anticorpos específicos, western blot, ELISA ou ELISPOT, ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA), radioimunoensaios (RIA), imunohistoquímica (IHC), imunofluorescência (IF), microarranjos de anticorpos ou microarranjos de tecidos acoplados à imunohistoquímica. Outras técnicas adequadas incluem FRET ou BRET, métodos microscópicos ou histoquímicos de célula única usando comprimento de onda de excitação única ou múltipla e aplicação de qualquer um dos métodos óticos adaptados, tais como métodos eletroquímicos (técnicas de voltametria e amperometria), microscopia de força atômica e métodos de radiofrequência, por exemplo espectroscopia de ressonância multipolar, confocal e não confocal, detecção de fluorescência, luminescência, quimioluminescência, absorbância, refletância, transmitância e birrefringência ou índice de refração (por exemplo, ressonância plasmônica de

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14/83 superfície, elipsometria, um método de ressonância no espelho, método de guia de onda do acoplador de grade ou interferometria), ELISA celular, citometria de fluxo, radioisotopia, ressonância magnética, análise por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS PAGE); Espectroscopia de massa por HPLC; Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa/Espectrometria de Massa (LCMS/MS)). Todas estas técnicas são bem conhecidas na arte e não precisam ser mais detalhadas aqui. Essas diferentes técnicas podem ser usadas para medir os níveis de progastrina.

[0037] O referido método pode, em particular, ser escolhido entre: um método baseado em detecção imunológica, um método baseado em western blot, um método baseado em espectrometria de massa, um método baseado em cromatografia e um método baseado em citometria de fluxo. Embora quaisquer meios adequados para a realização dos ensaios estejam incluídos na invenção, métodos como FACS, ELISA, RIA, western-blot e IHC são particularmente úteis para a realização do método da invenção.

[0038] Em uma modalidade mais particular, um método para o diagnóstico ín vitro de câncer de próstata de acordo com a invenção compreende o contato de uma amostra biológica de um indivíduo com uma molécula de ligação à progastrina

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15/83 usando um ensaio imunoenzimático, preferencialmente com base nas técnicas escolhidas entre RIA e ELISA.

[0039] Uma amostra biológica como aqui utilizada é uma amostra de tecido ou fluido biológico que contém ácidos nucleicos ou polipeptídeos, por exemplo, de uma proteína, polinucleotídeo ou transcrito de câncer de próstata. Essa amostra deve permitir a determinação dos níveis de expressão de progastrina. Sabe-se que a progastrina é uma proteína secretada. As amostras biológicas preferidas para a determinação do nível da proteína progastrina incluem assim fluidos biológicos. Um fluido biológico como aqui utilizado significa qualquer fluido que inclui material de origem biológica. Fluidos biológicos preferidos para uso na presente invenção incluem fluidos corporais de um animal, por exemplo um mamífero, de preferência um indivíduo humano. O fluido corporal pode ser qualquer fluido corporal, incluindo, sem limitação, sangue, plasma, soro, linfa, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva, suor e urina. De preferência, as referidas amostras biológicas líquidas preferidas incluem amostras tais como uma amostra de sangue, uma amostra de plasma ou uma amostra de soro. Mais preferencialmente, a amostra biológica é uma amostra de sangue. De fato, essa amostra de sangue pode ser obtida por uma coleta de sangue completamente inofensiva do paciente e,

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16/83 portanto, permite uma avaliação não invasiva dos riscos de o indivíduo desenvolver um tumor.

[0040] Uma amostra biológica, como aqui utilizada, também inclui uma amostra de câncer sólido do paciente a ser testado, quando o câncer é um câncer sólido. Essa amostra de câncer sólido permite que o especialista realize qualquer tipo de medição do nível do biomarcador da invenção. Em alquns casos, os métodos de acordo com a invenção podem compreender ainda uma etapa preliminar de coleta de uma amostra de câncer sólido do paciente. Por uma amostra de câncer sólido, é referida uma amostra de tecido tumoral. Mesmo em um paciente com câncer, o tecido que é o local do tumor ainda compreende tecido saudável não tumoral. A amostra de câncer deve, portanto, ser limitada ao tecido tumoral retirado do paciente. A referida amostra de câncer pode ser uma amostra de biópsia ou uma amostra retirada de uma terapia de ressecção cirúrqica.

[0041] Uma amostra biolóqica é tipicamente obtida a partir de um orqanismo eucariótico, mais preferencialmente um mamífero, ou um pássaro, réptil ou peixe. De fato, um indivíduo que pode ser submetido ao método aqui descrito pode ser qualquer um de animais mamíferos, incluindo humanos, cães, qatos, qado, cabras, porcos, suínos, ovelhas e macacos; ou um pássaro; réptil; ou peixe. De preferência, um indivíduo

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17/83 é um ser humano; um indivíduo humano pode ser conhecido como paciente .

[0042] Por obtenção de uma amostra biológica, pretende- se aqui obter uma amostra biológica para uso nos métodos descritos nesta invenção. Na maioria das vezes, isso é feito com a remoção de uma amostra de células de um animal, mas também pode ser realizado com o uso de células previamente isoladas (por exemplo, isoladas por outra pessoa, em outro momento e/ou com outro objetivo) ou executando os métodos da invenção in vivo. Os tecidos de arquivo, com tratamento ou histórico de resultados, serão particularmente úteis.

[0043] Esta amostra pode ser obtida e, se necessário, preparada de acordo com métodos conhecidos de um especialista na técnica. Em particular, é bem conhecido na técnica que a amostra deve ser retirada de um indivíduo em jejum.

[0044] A determinação da concentração de progastrina se refere à determinação da quantidade de progastrina em um volume conhecido de uma amostra. A concentração de progastrina pode ser expressa relativamente a uma amostra de referência, por exemplo, como uma razão ou uma porcentagem. A concentração também pode ser expressa como a intensidade ou localização de um sinal, dependendo do método utilizado para a determinação da referida concentração. Preferencialmente, a concentração de um composto em uma

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18/83 amostra é expressa após a normalização da concentração total de compostos relacionados na referida amostra, por exemplo, o nivel ou a concentração de uma proteína é expressa após a normalização da concentração total de proteínas na amostra.

[0045] De preferência, o risco de o referido indivíduo sofrer de câncer de próstata é determinado pela comparação do nível de progastrina medido na referida amostra biológica com um nível de referência.

[0046] O termo nível de referência, como aqui utilizado, se refere ao nível de expressão do marcador de câncer de próstata em consideração, isto é, progastrina, em uma amostra de referência. Uma amostra de referência, como aqui utilizada, significa uma amostra obtida de indivíduos, preferencialmente dois ou mais indivíduos, conhecidos por estarem livres da doença ou, alternativamente, da população em geral. Os níveis de expressão de referência adequados de progastrina podem ser determinados medindo os níveis de expressão do referido marcador em vários indivíduos adequados, e esses níveis de referência podem ser ajustados para populações de indivíduos específicos. O valor de referência ou o nível de referência pode ser um valor absoluto; um valor relativo; um valor que tenha um limite superior ou inferior; uma faixa de valores; um valor médio; um valor mediano, um valor médio ou um valor em comparação com um determinado controle ou valor de linha de base. Um

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19/83 valor de referência pode ser baseado em um valor de amostra individual, tal como, por exemplo, um valor obtido a partir de uma amostra do indivíduo que está sendo testado, mas em um momento anterior. 0 valor de referência pode basear-se em um grande número de amostras, como na população de indivíduos do grupo correspondente à idade cronológica, ou com base em um conjunto de amostras que inclui ou exclui a amostra a ser testada.

[0047] Vantajosamente, um nível de referência é um nível predeterminado de progastrina, obtido a partir de uma amostra biológica de um indivíduo com um status particular conhecido em relação ao câncer. Em modalidades particulares, o nível de referência usado para comparação com a amostra de teste na etapa (b) pode ter sido obtido a partir de uma amostra biológica de um indivíduo saudável ou de uma amostra biológica de um indivíduo que sofre de câncer; entende-se que o perfil de expressão de referência também pode ser obtido a partir de um conjunto de amostras biológicas de indivíduos saudáveis ou de um conjunto de amostras de indivíduos com câncer.

[0048] Em uma modalidade particular do método da invenção, a amostra de referência é coletada de indivíduos isentos de qualquer câncer e, de preferência, de qualquer patologia. Deve ser entendido que, de acordo com a natureza da amostra biológica coletada de um paciente, a amostra de

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20/83 referência será uma amostra biológica da mesma natureza da referida amostra biológica.

[0049] O nível de progastrina é determinado no presente método, determinando a quantidade de progastrina que está ligada por uma molécula de ligação à progastrina, preferencialmente por um anticorpo que reconhece a progastrina.

[0050] Por molécula de ligação à progastrina, é aqui referida qualquer molécula que se liga à progastrina, mas não se liga à gastrina-17 (G17), gastrina-34 (G34), gastrina- 17 estendida com glicina (G17-Gly) ou gastrina-34 estendida com glicina (G34-Gly). A molécula de ligação à progastrina da presente invenção pode ser qualquer molécula de ligação à progastrina, tal como, por exemplo, uma molécula de anticorpo ou uma molécula receptora. De preferência, a molécula de ligação à progastrina é um anticorpo antiprogastrina ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0051] De acordo com uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um método de diagnóstico ín vítro de um câncer de próstata compreendendo a determinação da concentração de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo, em que o referido indivíduo exibe pelo menos uma sintoma clínico de câncer de próstata.

[0052] De acordo com outra modalidade particular, a presente invenção se refere a um método de diagnóstico ín

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21/83 vitro de um câncer de próstata compreendendo a determinação da concentração de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo, em que o referido indivíduo exibe pelo menos um sintoma clínico de câncer e/ou de metástase.

[0053] Por ligação, se liga ou semelhante, pretende- se que o anticorpo, ou seu fragmento de ligação ao antígeno, forme um complexo com um antígeno que, sob condições fisiológicas, seja relativamente estável. Os métodos para determinar se duas moléculas se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície e similares. Em uma modalidade particular, o referido anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga à progastrina com uma afinidade que é pelo menos duas vezes maior que a sua afinidade para a ligação a uma molécula não específica, tal como BSA ou caseína. Em uma modalidade mais particular, o referido anticorpo, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, se liga apenas à progastrina.

[0054] Em uma modalidade particular, em um método para o diagnóstico de câncer de próstata de acordo com a invenção, uma amostra biológica do indivíduo é contatada com pelo menos uma molécula de ligação à progastrina, em que a afinidade da referida molécula pela progastrina é de pelo menos 100 nM , pelo menos 90 nM, pelo menos 80 nM, pelo menos 70 nM, pelo menos 60 nM, pelo menos 50 nM, pelo menos 40 nM,

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22/83 pelo menos 30 nM, pelo menos 20 nM, pelo menos 10 nM, pelo menos 5 nM, pelo menos 1 nM, pelo menos 100 pM, pelo menos 10 pM ou pelo menos 1 pM, conforme determinado por um método tal como o descrito acima.

[0055] Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a um método para o diagnóstico de câncer de próstata, compreendendo a detecção da concentração de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo, em que a referida amostra biológica é contatada com um anticorpo anti-hPG, ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0056] O termo anticorpo, tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos policlonais e monoclonais. Um anticorpo (ou imunoglobulina) consiste em uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região variável (ou domínio) da cadeia pesada (aqui abreviada como HCVR ou VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada compreende três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como LCVR ou VL) e uma região constante da cadeia leve. A região constante da cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ainda ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDR) ou

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23/83 regiões hipervariáveis, responsáveis principalmente pela ligação de um epítopo de um antígeno e intercaladas com regiões mais regiões de estrutura conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). 0 método para identificar as CDRs dentro de cadeias leves e pesadas de um anticorpo e determinar sua sequência são bem conhecidos do especialista. Para evitar dúvidas, na ausência de qualquer indicação no texto, a expressão CDRs significa as regiões hipervariáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo, conforme definido pelo IMGT, em que a numeração exclusiva do IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões estruturais e das regiões determinantes de complementaridade, CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2.

[0057] A numeração exclusiva do IMGT foi definida para comparar os domínios variáveis, independentemente do receptor de antígeno, do tipo de cadeia ou da espécie [Lefranc Μ. - P., Immunology Today 18, 509 (1997)/Lefranc M.-P., The Immunologist 7, 132-136 (1999)/Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. e Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003) ] . Na numeração exclusiva do IMGT, os aminoácidos conservados sempre têm a mesma posição, por exemplo, cisteína 23 (1-CYS), triptofano 41 (CONSERVED-TRP), amínoâcido hidrofóbico 89, cisteína 104 (2-CYS), fenilalanina ou triptofano 118 (J-PHE ou J-TRP). A numeração exclusiva do

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IMGT fornece uma delimitação padronizada das regiões da estrutura (FR1-IMGT: posições 1 a 26, FR2-IMGT: 39 a 55, FR3-IMGT: 66 a 104 e FR4-IMGT: 118 a 128) e das regiões determinantes de complementaridade: CDR1-IMGT: 27 a 38, CDR2-IMGT: 56 a 65 e CDR3-IMGT: 105 a 117. Como as lacunas representam posições desocupadas, os comprimentos de CDRIMGT (mostrados entre colchetes e separados por pontos, por exemplo, [8.8.13]) tornam-se informações cruciais. A numeração exclusiva do IMGT é usada em representações gráficas 2D, designadas como IMGT Colliers de Feries [Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002)/Kaas, Q. e Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], e em estruturas 3D em IMGT/3Dstructure-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. e Lefranc, M.-P., receptor de células T e dados estruturais do MHC. Nucl. Acids. Res. 32, D208-D210 (2004)].

[0058] Cada VH e VL é composto por três CDRs e quatro FRs, dispostos do terminal amino ao terminal carboxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antigeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de

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25/83 complemento clássico. Os anticorpos podem ser de diferentes isotipos (nomeadamente IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM) .

[0059] Em uma modalidade particular, o referido anticorpo de ligação à progastrina ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é selecionado do grupo que consiste em: anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, anticorpos camelizados, anticorpos IgAl, anticorpos IgA2, anticorpos IgD, anticorpos IgE, anticorpos IgGl, anticorpos IgG2, anticorpos IgG3, anticorpos IgG4 e anticorpos IgM.

[0060] Um anticorpo policlonal é um anticorpo que foi produzido entre ou na presença de um ou mais outros anticorpos não idênticos. Em geral, os anticorpos policlonais são produzidos a partir de um linfócito B na presença de vários outros linfócitos B que produzem anticorpos não idênticos. Geralmente, os anticorpos policlonais são obtidos diretamente de um animal imunizado.

[0061] O termo anticorpo monoclonal designa um anticorpo que surge de uma população de anticorpos quase homogênea, em que a população compreende anticorpos idênticos, exceto por algumas possíveis mutações de ocorrência natural que podem ser encontradas em proporções mínimas. Um anticorpo monoclonal surge do crescimento de um clone de célula única, tal como um hibridoma, e é

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26/83 caracterizado por cadeias pesadas de uma classe e subclasse e cadeias leves de um tipo.

[0062] Pela expressão fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo, pretende-se indicar qualquer peptídeo, polipeptídeo ou proteína que retenha a capacidade de se ligar ao alvo (também geralmente referido como antígeno) do referido anticorpo, geralmente o mesmo epítopo e compreendendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos 5 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 10 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 15 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 25 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 40 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 50 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 60 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 70 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 80 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 90 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 100 aminoácidos resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 125 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 150 resíduos de aminoácidos contíguos, pelo menos 175 resíduos de aminoácidos contíguos, ou pelo menos 200 resíduos de aminoácidos contíguos, da sequência de aminoácidos do anticorpo.

[0063] uma modalidade particular, o referido fragmento de ligação ao antígeno compreende pelo menos uma

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CDR do anticorpo do qual é derivado. Ainda em uma modalidade preferida, o referido fragmento de ligação ao antígeno compreende 2, 3, 4 ou 5 CDRs, mais preferencialmente as 6 CDRs do anticorpo do qual é derivado.

[0064] Os fragmentos de ligação ao antígeno podem ser selecionados, sem limitação, no grupo constituído por Fv, scFv (se para cadeia única), Fab, F(ab')2, Fab' , fragmentos ou diacorpos scFv-Fc ou proteínas de fusão com peptídeos desordenados, tais como motivos XTEN (polipeptídeo recombinante estendido) ou PAS, ou qualquer fragmento cujo tempo de meia-vida seria aumentado por modificação química, tal como a adição de poli (alquileno) glicol, como poli (etileno) glicol (PEGuilação) (fragmentos peguilados chamados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F (ab')2-PEG ou Fab'PEG) (PEG para Poli (Etileno) Glicol) ou por incorporação em um lipossomo, os referidos fragmentos possuindo pelo menos uma das CDRs características do anticorpo de acordo com a invenção. De preferência, os referidos fragmentos de ligação ao antígeno serão constituídos ou compreenderão uma sequência parcial da cadeia variável pesada ou leve do anticorpo a partir do qual são derivadas, sendo a referida sequência parcial suficiente para reter a mesma especificidade de ligação que o anticorpo do qual é descendente e uma afinidade suficiente, preferencialmente pelo menos igual a 1/100, de uma maneira mais preferida a

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28/83 pelo menos 1/10, da afinidade do anticorpo do qual é descendente, com respeito para o alvo.

[0065] Em outra modalidade particular, em um método para o diagnóstico de câncer de próstata de acordo com a invenção, uma amostra biológica de um indivíduo é contatada com um anticorpo que se liga à progastrina, em que o referido anticorpo foi obtido por um método de imunização conhecido por um especialista na técnica, em que a utilização como um imunógeno de um peptídeo cuja sequência de aminoácidos compreende a totalidade ou uma parte da sequência de aminoácidos da progastrina. Mais particularmente, o referido imunógeno compreende um peptídeo escolhido entre:

• um peptídeo cuja sequência de aminoácidos compreende ou consiste na sequência de aminoácidos de progastrina de comprimento total e, em particular, de progastrina humana de comprimento total da SEQ ID N° 1, • um peptídeo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte da sequência de aminoácidos da progastrina, e particularmente à progastrina humana de comprimento total da SEQ ID N° 1, • um peptídeo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte ou a toda a sequência de aminoácidos da parte Nterminal da progastrina e, em particular, peptídeos que compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: SWKPRSQQPDAPLG (SEQ ID N° 2) e

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29/83 • um peptídeo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte ou a toda a sequência de aminoácidos da parte Cterminal da progastrina e, em particular, peptídeos que compreendem ou consistem na sequência de aminoácidos: QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN (SEQ ID N° 3), • um peptídeo cuja sequência de aminoácidos corresponde a uma parte da sequência de aminoácidos da parte C-terminal da progastrina e, em particular, peptídeos que compreendem a sequência de aminoácidos FGRRSAEDEN (SEQ ID N° 40) correspondente aos aminoácidos 71-80 de progastrina.

[0066] O especialista na matéria perceberá que essa imunização pode ser usada para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais, conforme desejado. Os métodos para obter cada um desses tipos de anticorpos são bem conhecidos na técnica. O perito na técnica irá assim selecionar e implementar facilmente um método para gerar anticorpos policlonais e/ou monoclonais contra qualquer antígeno.

[0067] Exemplos de anticorpos monoclonais que foram gerados usando um imunógeno compreendendo a sequência de aminoácidos SWKPRSQQPDAPLG, correspondente à sequência de aminoácidos 1-14 da progastrina humana (extremidade Nterminal) incluem, mas não estão restritos a, anticorpos monoclonais designados como: mAb3, mAb4, mAbl6, e mAbl9 e mAb20, conforme descrito na Tabela 1 a Tabela 4. A seguir foram descritos outros anticorpos monoclonais, embora não

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30/83 esteja claro se esses anticorpos realmente se ligam à progastrina (WO 2006/032980) . Resultados experimentais do mapeamento de epítopos mostram que mAb3, mAb4, mAbl6 e mAbl9 e mAb20 se ligam especificamente a um epítopo dentro da referida sequência de aminoácidos N-terminal de hPG. Anticorpos policlonais que reconhecem especificamente um epítopo no N-terminal da progastrina representado pela SEQ ID NO. 2, foram descritos na técnica (ver, por exemplo, WO 2011/083088).

Depósito de Hibridoma	mAb	Sequências de Aminoácido		SEQ ID N°
6B5B11C10	mAb3	VH CDR 1	GYIFTSYW	SEQ ID N°4
VH CDR 2	FYPGNSDS	SEQ ID N°5
VH CDR 3	TRRDSPQY	SEQ ID N°6
VL CDR 1	QSIVHSNGNTY	SEQ ID N°7
VL CDR 2	KVS	SEQ ID N°8
VL CDR 3	FQGSHVPFT	SEQ ID N°9

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31/83

mVH 3	EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCK ASGYIFTSYWVHWVKQRPGQGLE WIGGFYPGNSDSRYNQKFKGKAT LTAVT SAS TAYMD LSSLTNED S AV YFCTRRDSPQYWGQGTTLTVSS	SEQ ID N° 41
mVL3	DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCR SSQSIVHSNG NTYLEWYLQKPGQS PKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRLEAEDLGVYYCFQG SHVP FT FGGGTKLEIK	SEQ ID N° 42
huVH 3	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK AS GYIFT S YWVHWVRQAP GQRLE WMGGFYPG NSDSRYSQKFQG RV TITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAV YYCTRRDSPQYWGQGTLVTVSS	SEQ ID N° 53
huVL 3	DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSIVHSNG NTYLEWFQQRPGQ SPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQG SHVP FT FGGGTKVEIK	SEQ ID N° 54

[0068]

Tabela 1

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32/83

Depósito de Hibridoma	mAb	Sequências de Aminoácido		SEQ ID N°
20D2C3G2	mAb4	VH CDR 1	GYTFSSW	SEQ ID N°10
VH CDR 2	FLPGSGST	SEQ ID N°ll
VH CDR 3	ATDGNYDWFAY	SEQ ID N°12
VL CDR 1	QSLVHSSGVTY	SEQ ID N°13
VL CDR 2	KVS	SEQ ID N°14
VL CDR 3	SQSTHVPPT	SEQ ID N°15
mVH 4	QVQLQQSGAELMKPGASVKISCK ATGYTFSSSWI EWLKQRPG HGLE WIGEFLPGSGSTDYNEKFKGKATF TADT S S DTAYMLL S S LT S ED SAVY YCATDG NYDWFAYWGQGTLVTV SA	SEQ ID N° 43
mVL4	DLVMTQTPLSLPVSLGDQASISCR	SEQ ID N° 44

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33/83

			SSQSLVHSSGVTYLHWYLQKPGQ SPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQS THVPPTFGSGTKLEIK
huVH 4	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK AS GYT FS S SWMHWVRQAPGQGL EWMGIFLPGSGSTDY AQKFQG RV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCATDG NYDWFAYWGQGTLV TVSS	SEQ ID N° 55
huVL 4	DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKS SQSLVHSSGVTYL YWYLQKPGQS PQLLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQS THVPPTFGQGTKLEIK	SEQ ID N° 56

[0069] Tabela 2

Depósito de Hibridoma	mAb	Sequências de Aminoácido		SEQ ID N°
1E9D9B6	mAbl 6	VH CDR 1	GYTFTSYY	SEQ ID

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34/83

		N°16
VH	CDR	2	INPSNGGT	SEQ ID N°17
VH	CDR	3	TRGGYYPFDY	SEQ ID N°18
VL	CDR	1	QSLLDSDGKTY	SEQ ID N°19
VL	CDR	2	LVS	SEQ ID N°20
VL	CDR	3	WQGTHSPYT	SEQ ID N°21
mVH16	QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCK ASGYTFTSYYM YWVKQRPGQG LE WIGEINPSNGGTNFNEKFKSKATL TVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVY YCTRGGYYPFDYWGQGTTLTVSS	SEQ ID N° 45
mVL16	DWMTQTPLTLSVTIGRPASISCKS	SEQ ID N° 46

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35/83

	SQSLLDSDGKTYL YWLLQRPGQS PKRLIYLVSELDSGVPDRITGSGSG TDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQG THSPYTFGGGTKLEIK
huVH	16a	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK AS GYT FT S YYMYWVRQAP GQ GL E WMG11NPSNGGTSYAQKFQG RVT MTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAV YYCTRGGYYPFDYWGQGTTVTV ss
huVH	16b	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK AS GYT FT S YYMHWVRQAP GQ GL EWMGIINPSNGGTSYAQKFQGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA VYYCTRGGYYPFDYWGQGTTVT vss
huVH	16c	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCK AS GYT FT S YYMYWVRQAP GQ GL E WMGEINPSNGGTNYAQKFQGRV TMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTA

SEQ

ID N°

SEQ

ID N°

SEQ

ID N°

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36/83

			VYYCTRGGYYPFDYWGQGTTVT vss
huVL 16a	DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSLLDSDGKTYLYWFQQRPGQ SPRRLIYLVSNRDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQ GTHSPYTFGQGTKLEIK	SEQ ID N° 60
huVL 16b	DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSLLDSDG KTYLNWFQQRPGQ SPRRLIYLVSNRDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQ GTHSPYTFGQGTKLEIK	SEQ ID N° 61
huVL 16c	DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCR SSQSLLDSDGKTYLYWFQQRPGQ SPRRLIYLVSERDSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCWQ GTHSPYTFGQGTKLEIK	SEQ ID N° 62

[0070] Tabela 3

Depósito de Hibridoma	mAb	Sequências de Aminoácido		SEQ ID N°
1B3B4F11	mAbl 9	VH CDR 1	GYSITSDYA	SEQ ID N°22
VH CDR 2	ISFSGYT	SEQ ID N°23
VH CDR 3	AREVNYG DSYHFDY	SEQ ID N°24

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37/83

		VL CDR 1	SQHRTYT	SEQ ID N°25
VL CDR 2	VKKDGSH	SEQ ID N°26
VL CDR 3	GVGDAIKGQSVFV	SEQ ID N°27
mVH19	DVQLQESG PGLVKPSQSLSLTCTV TGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLE WMGYISFSGYTSYNPSLKSRISVTR DTSRNQFFLQLTSVTTEDTATYYC AREVNYG DSYHFDYWGQGTIVTV ss	SEQ ID N° 47
mVL19	QLALTQSSSASFSLGASAKLTCTLS SQHRTYTI EWYQQQSLKPPKYVM EVKKDGSHSTG HGIPDRFSGSSSG ADRYLSISNIQPEDEAIYICGVGDAI KGQSVFVFGGGTKVTVL	SEQ ID N° 48
huVH 19a	QVQLQESG PG LVKPSQTLSLTCT VSGYSITSDY AWNWI RQHPGKGL EWIGYISFSGYTYYN PSLKSRVTI S VDTSKNQFSLKLSSVTMDTAVYY CAREVNYG DSYH FDYWGQGTLV TVSS	SEQ ID N° 63
huVH 19b	QVQLQESG PG LVKPSQTLSLTCT VSGYSITSDY AWSWI RQHPGKGLE WIGYISFSGYTYYN PSLKSRVTI SV DTSKNQFSLKLSSVTMDTAVYYC	SEQ ID N° 64

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38/83

AREVNYG DSYHFDYWGQGTLVT vss

huVH 19c	QVQLQESG PG LVKPSQTLSLTCT VSGYSITSDY AWNWI RQHPGKGL EWIGYISFSGYTSYN PSLKSRVTI S VDTSKNQFSLKLSSVTMDTAVYY CAREVNYG DSYHFDYWGQGTLV TVSS	SEQ ID N° 65
huVL 19a	QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTL SSQHRTYTI EWHQQQPEKG PRYL MKVKKDGSHSKG DGIPDRFSGSSS GAERYLTISSLQSEDEADYYCGVG DAIKGQSVFVFGGGTKVEIK	SEQ ID N° 66
huVL 19b	QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTL SSQHRTYTIAWHQQQPEKGPRYL MKVKKDGSHSKG DGIPDRFSGSSS GAERYLTISSLQSEDEADYYCGVG DAIKGQSVFVFGGGTKVEIK	SEQ ID N° 67
huVL 19c	QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTL SSQHRTYTI EWHQQQPEKG PRYL MEVKKDGSHSKG DGIPDRFSGSSS GAERYLTISSLQSEDEADYYCGVG DAIKGQSVFVFGGGTKVEIK	SEQ ID N° 68

[0071] Tabela 4

[0072] Exemplos de anticorpos monoclonais que podem ser gerados pelo uso de um imunógeno que compreende a sequência de aminoácidos QGPWLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN, (parte C- terminal da progastrina) correspondente à

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39/83 sequência de aminoácidos 55-80 da progastrina humana incluem, mas não estão restritos a anticorpos designados como: mAb8 e mAbl3 nas seguintes Tabelas 5 e 6. Resultados experimentais do mapeamento de epítopos mostram que o mAbl3 se liga especificamente a um epítopo dentro da referida sequência de aminoácidos de C-terminal de hPG. Outro exemplo de um anticorpo monoclonal que pode ser gerado por é o anticorpo Mabl4, produzido pelo hibridoma 2H9F4B7, descrito no documento WO 2011/083088. O hibridoma 2H9F4B7 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no CNCM, Institut Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, França, em 27 de dezembro de 2016, sob a referência 1-5158 (ver WO 2017/114973).

Depósito de Hibridoma	mAb	Sequências de Aminoácido		SEQ ID N°
1C10D3B9	mAb8	VH CDR 1	GFTFTTYA	SEQ ID N°28
VH CDR 2	ISSGGTYT	SEQ ID N°29
VH CDR 3	ATQGNYSLDF	SEQ ID N°30
VL CDR 1	KSLRHTKGITF	SEQ IDN° 31
VL CDR 2	QMS	SEQ ID

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40/83

			N°32
VL CDR 3	AQNLELPLT	SEQ ID N°33
mVH 8	EVQLVESGGG LVKPGGSLRLSC MSG FTFTTYAMSWVRQAPG K GLEWVATISSGGTYTYY ADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCATQG NYSLDFWGQ GTTVTVSS	SEQ ID N° 49
mVL8	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR SSKSLRHTKG ITFLYWYLQKPGQ SPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSS GSGTDFTLKIS RVEAE DVGVYYC AQNLELPLTFGGGTKVEIK	SEQ ID N° 50
VH HZ8CV1	EVQLVESGGG LVKPGGSLRLSC MSGFTFTTYAMSWVRQAPG K GLEWVSSI SSGGTYTYY ADSVKG RFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCATQG NYSLDFWGQG TTVTVSS	SEQ ID N° 69
VL hZ8CVl	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR SSKSLRHTKG ITFLYWYLQKPGQ SPQLLIYQMSNRASGVPDRFSGS GSGTDFTLKIS RVEAE DVGVYYC AQNLELPLTFGGGTKVEIK	SEQ ID N° 70

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VH	HZ8CV2	EVQLVESGGG LVKPGGSLRLSC MSGFTFTTYAMSWVRQAPG K GLEWVATISSGGTYTYY ADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCATQG NYSLDFWGQ GTTVTVSS	SEQ 71	ID	N°
VL	HZ8CV2	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR SSKSLRHTKG ITFLYWYLQKPGQ SPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSS GSGTDFTLKIS RVEAE DVGVYYC AQNLELPLTFGGGTKVEIK	SEQ 72	ID	N°
CH	HZ8CV2	EVQLVESGGG LVKPGGSLRLSC MSGFTFTTYAMSWVRQAPG K GLEWVATISSGGTYTYY ADSVK GRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRA EDTAVYYCATQG NYSLDFWGQ GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSS KSTSGGTMLGCLVKDYFPEPV TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYIC NVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPP KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQ DWLNG KEYKC KVSNKALPAPI	SEQ 73	ID	N°

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42/83

			EK TISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG K
CL HZ8CV2	DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCR SSKSLRHTKG ITFLYWYLQKPGQ SPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSS GSGTDFTLKIS RVEAE DVGVYYC A.QNLELPLTFGGGTKVEI KRTVA A.PSVFI FPPSDEQLKSGTASWCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSG NSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC	SEQ ID N° 74

[0073] Tabela 5

Depósito de Hibridoma	mAb	Sequências de Amínoâcido		SEQ ID N°
2C6C3C7	mAb!3	VH CDR 1	GFIFSSYG	SEQ ID N°34
VH CDR 2	INTFGDRT	SEQ ID N°35
VH CDR 3	ARGTGTY	SEQ ID N°36

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VL CDR 1	QSLLDSDGKTY	SEQ ID N°37
VL CDR 2	LVS	SEQ ID N°38
VL CDR 3	WQGTHFPQT	SEQ ID N°39
mVH13	EVQLVESGGG LVQPGGSLKLSC MSGFIFSSYGMSWVRQSPDRRL ELVASI NTFGDRTYYPDSVKG RF TISRDNAKNTLYLQMTSLKSEDT A.IYYCARGTGTYWGQGTTLTVS s	SEQ ID N° 51
mVL 13	DWLTQTPLTLSVTIGQPASISCK SSQSLLDSDG KTYLNWLLQRPG QSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTG SGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYY CWQGTH FPQTFGGGTKLEI K	SEQ ID N° 52
huVH 13a	EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSC MSGFIFSSYGMSWVRQAPG KG LEWVANINTFGDRTYYVDSVKG RFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARGTGTYWGQGTLV TVSS	SEQ ID N° 75
huVH 13b	EVQLVESGGG LVQPGGSLRLSC MSGFIFSSYGMSWVRQAPG KG	SEQ ID N° 76

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			LEWVASINTFGDRTYYVDSVKG RFTISRDNAKNSL YLQMNSLRAE DTAVYYCARGTGTYWGQGTLV TVSS
huVL 13a	DWMTQSPLSLPVTLGQPASISC RSSQSLLDSDG KTYLNWFQQRP GQSPRRLIYLVSN RDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCWQGTH FPQTFGGGTKVEI K	SEQ ID N° 77
huVL 13b	DWMTQSPLSLPVTLGQPASISC RSSQSLLDSDG KTYLNWFQQRP GQSPRRLIYLVSKRDSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY YCWQGTH FPQTFGGGTKVEI K	SEQ ID N° 78

[0074] Tabela 6

[0075] Outros exemplos incluem anticorpos monoclonais e/ou policlonais anti-hPG gerados usando um imunógeno compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 40.

[0076] Em uma modalidade mais particular, em um método de acordo com a invenção, a referida amostra biológica é contatada com um anticorpo anti-hPG ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, em que o referido anticorpo anti-hPG

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45/83 é escolhido entre os anticorpos anti-hPG N-terminais e anticorpos anti-hPG C-terminais.

[0077] Os termos anticorpos anti-hPG N-terminal e (anticorpos anti-hPG C-terminal designam anticorpos que se ligam a um epítopo compreendendo aminoácidos localizados na parte N-terminal do hPG ou a um epítopo compreendendo aminoácidos localizados na parte C-terminal do hPG, respectivamente. Preferencialmente, o termo anticorpos anti-hPG N-terminais se refere a anticorpos que se ligam a um epítopo localizado em um domínio de progastrina cuja sequência é representada pela SEQ ID NO. 2. Em outra modalidade preferida, o termo (anticorpos anti-hPG Cterminais se refere a anticorpos que se ligam a um epítopo localizado em um domínio de progastrina cuja sequência é representada pela SEQ ID NO. 3.

[0078] O termo epítopo se refere a uma região de um antígeno que está ligado por um anticorpo. Epítopos podem ser definidos como estruturais ou funcionais. Os epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e possuem os aminoácidos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Os epítopos também podem ser conformacionais. Em certas modalidades, os epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou

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46/83 grupos sulfonil e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características específicas de carga. A determinação do epítopo ligado por um anticorpo pode ser realizada por qualquer técnica de mapeamento de epítopos, conhecida por um especialista na técnica. Um epítopo pode compreender diferentes aminoácidos que se localizam sequencialmente dentro da sequência de aminoácidos de uma proteína. Um epítopo também pode compreender aminoácidos que não estão localizados sequencialmente dentro da sequência de aminoácidos de uma proteína.

[0079] Em uma modalidade particular, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado do grupo que consiste em:

• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectívamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectívamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectívamente, ou

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47/83 sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências SEQ ID N° 16, 17 e 18,

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48/83 respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98 % de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente, • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente pelo menos três, de CDR-H1,

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CDR H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, e • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98 % de identidade após o

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50/83 alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente.

[0080] No sentido da presente invenção, a identidade percentual ou % de identidade entre duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos significa a porcentagem de nucleotídeos idênticos ou resíduos de aminoácidos entre as duas sequências a serem comparadas, obtidas após o alinhamento ideal, essa porcentagem é puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências são distribuídas aleatoriamente ao longo de seu comprimento. A comparação de duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos é tradicionalmente realizada comparando-se as sequências após alinhadas de maneira ideal, sendo a referida comparação capaz de ser conduzida por segmento ou usando uma janela de alinhamento. O alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser realizado, além da comparação manual, por meio de métodos conhecidos por um especialista na técnica.

[0081] Para a sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade com uma sequência de aminoácidos de referência, exemplos preferidos incluem aqueles que contêm a sequência de referência, certas modificações, principalmente uma deleção, adição ou substituição de pelo menos um aminoácido, truncamento ou extensão. No caso de substituição de um ou

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51/83 mais aminoácidos consecutivos ou não consecutivos, são preferidas substituições nas quais os aminoácidos substituídos são substituídos por aminoácidos equivalentes. Aqui, a expressão aminoácidos equivalentes pretende indicar quaisquer aminoácidos que possam ser substituídos por um dos aminoácidos estruturais sem, no entanto, modificar as atividades biológicas dos anticorpos correspondentes e dos exemplos específicos definidos abaixo.

[0082] Os aminoácidos equivalentes podem ser determinados em sua homologia estrutural com os aminoácidos pelos quais são substituídos ou nos resultados de testes comparativos de atividade biológica entre os vários anticorpos que provavelmente serão gerados.

[0083] Em uma modalidade mais particular, o referido anticorpo é um anticorpo monoclonal selecionado no grupo que consiste em:

• Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 41 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 42;

• Um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 43 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 44;

• Um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 45 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 46;

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52/83 • Um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 47 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 48;

• Um anticorpo monoclonal que compreende uma cadeia pesada de sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 49 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 50; e • Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 51 e uma cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 52.

[0084] Em outra modalidade particular, o anticorpo utilizado no método da invenção é um anticorpo humanizado.

[0085] Como aqui utilizada, a expressão anticorpo humanizado significa um anticorpo que contém regiões CDR derivadas de um anticorpo de origem não humana, sendo as outras partes da molécula de anticorpo derivadas de um ou vários anticorpos humanos. Além disso, alguns dos resíduos do segmento esquelético (chamados FR para estrutura) podem ser modificados para preservar a afinidade de ligação, de acordo com técnicas conhecidas por um especialista na técnica (Jones et al. , Nature, 321: 522-525, 1986) . O objetivo da humanização é uma redução na imunogenicidade de um anticorpo xenogênico, como um anticorpo murino, para introdução em humanos, mantendo a afinidade e a especificidade completas de ligação ao antígeno.

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[0086] Os anticorpos humanizados da invenção ou fragmentos do mesmo podem ser preparados por técnicas conhecidas por um especialista na técnica (tais como, por exemplo, as descritas nos documentos Singer et al., J. Immun., 150: 2844-2857 1992). Tais anticorpos humanizados são preferidos para uso em métodos que envolvem diagnóstico ín vítro ou tratamento preventivo e/ou terapêutico in vivo. Outras técnicas de humanização também são conhecidas do especialista na técnica. Na verdade, os anticorpos podem ser humanizados usando uma variedade de técnicas, incluindo enxerto de CDR (EP 0 451 261; EP 0 682 040; EP 0 939 127; EP 0 566 647; US 5.530.101; US 6.180.370; US 5.585.089; US 5.693.761; US 5.639.641 ; US 6.054.297; US 5.886.152; e US 5.877.293), revestimento ou recapeamento (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E. A., 1991, Molecular Immunology 28 (4/5): 489-498; Studnicka G. M. et al., 1994, Protein Engineering 7 (6): 805-814; Roguska Μ. A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Scl USA, 91: 969-973) e embaralhamento de cadeias (Patente US No. 5.565.332). Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de fagos. Ver também Pat. U.S. No. 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 e 5.814.318; e números de publicação de pedidos de patentes internacionais WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741.

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[0087] Em uma modalidade mais particular, o referido anticorpo é um anticorpo humanizado selecionado no grupo que consiste em:

• Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 7, 8 e 9 , respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente, • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo

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55/83 menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente, • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 19, 20 e 21, respectivamente, • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDR

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Η3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente, • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, de preferência 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98% de identidade após o

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57/83 alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectívamente, e • Um anticorpo humanizado compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos um, preferencialmente pelo menos dois, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectívamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente identidade de 85%, 90%, 95% e 98% após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectívamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectívamente, ou sequências com pelo menos 80%, preferencialmente 85%, 90%, 95% e 98 % de identidade após o alinhamento ideal com as sequências das SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectívamente,

[0088] em que o referido anticorpo também compreende regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano.

[0089] Em outra modalidade mais particular, o referido anticorpo é um anticorpo humanizado selecionado no grupo que consiste em:

• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ

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ID N° 53, e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 54;

• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 55 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos da SEQ ID N° 56;

• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 57, 58 e 59 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 60, 61 e 62;

• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 63, 64 e 65 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 66, 67 e 68;

• Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 69 e 71 e uma região variável da cadeia leve da sequência de aminoácidos selecionada entre as SEQ ID N° 70 e 72; e • Um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada da sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID N° 75 e 76 e uma cadeia leve região

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59/83 variável da sequência de aminoácidos selecionada entre SEQ ID N° 77 e 78;

[0090] em que o referido anticorpo também compreende regiões constantes da cadeia leve e da cadeia pesada derivadas de um anticorpo humano.

[0091] Em uma primeira modalidade, um método de acordo com a invenção compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo anti-hPG que se liga a um epitopo de hPG, em que o referido epitopo está localizado dentro da parte C- terminal do hPG ou a um epitopo localizado dentro da parte N-terminal do hPG.

[0092] Em uma modalidade mais especifica, um método de acordo com a invenção compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo anti-hPG que se liga a um epitopo de hPG, em que o referido epitopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte N-terminal de progastrina escolhida entre uma sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 10 a 14 de hPG, aminoácidos 9 a 14 de hPG, aminoácidos 4 a 10 de hPG, aminoácidos 2 a 10 de hPG e aminoácidos 2 a 14 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.

[0093] Em uma modalidade mais especifica, um método de acordo com a invenção compreende o contato de uma amostra biológica com um anticorpo anti-hPG que se liga a um epitopo

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60/83 de hPG, em que o referido epítopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte C-terminal de progastrina, escolhida entre uma sequência de aminoácidos correspondente aos aminoácidos 71 a 74 de hPG, aminoácidos 69 a 73 de hPG, aminoácidos 71 a 80 de hPG (SEQ ID N° 40), aminoácidos 76 a 80 de hPG, e aminoácidos 67 a 74 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.

[0094] Em uma primeira modalidade, uma composição de acordo com a invenção compreende um anticorpo que reconhece um epítopo incluindo uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da progastrina.

[0095] Em uma modalidade mais específica, uma composição de acordo com a invenção compreende um anticorpo que reconhece um epítopo de progastrina em que o referido epítopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte N-terminal da progastrina, em que a referida sequência de aminoácidos pode incluir os resíduos 10 a 14 de hPG, resíduos 9 a 14 de hPG, resíduos 4 a 10 de hPG, resíduos 2 a 10 de hPG ou resíduos 2 a 14 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.

[0096] Em uma modalidade mais específica, uma composição de acordo com a invenção compreende um anticorpo

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61/83 que reconhece um epitopo de progastrina, em que o referido epitopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte C-terminal da progastrina, em que a referida sequência de aminoácidos pode incluir os resíduos 71 a 74 de hPG, resíduos 69 a 73 de hPG, resíduos 71 a 80 de hPG (SEQ ID N° 40), resíduos 76 a 80 de hPG ou resíduos 67 a 74 de hPG, em que a sequência de aminoácidos de hPG é a SEQ ID N° 1.

[0097] Em uma modalidade particular de um método para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata de acordo com a invenção, o referido método compreende uma etapa de contato com uma amostra biológica de um indivíduo com uma primeira molécula que se liga a uma primeira parte da progastrina e com uma segunda molécula que se liga a uma segunda parte da progastrina. Em uma modalidade mais particular, em que a referida molécula de ligação à progastrina é um anticorpo, uma amostra biológica de um indivíduo é contatada com um anticorpo que se liga a um primeiro epitopo da progastrina e com um segundo anticorpo que se liga a um segundo epitopo da progastrina.

[0098] Em uma modalidade particular do método da invenção, o referido método compreende uma etapa de contato com uma amostra biológica de um indivíduo com um primeiro agente que se liga a uma primeira parte da progastrina e com um segundo agente que se liga a uma segunda parte da

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62/83 progastrina. Em uma modalidade mais particular, em que a referida molécula de ligação à progastrina é um anticorpo, uma amostra biológica de um indivíduo é contatada com um anticorpo que se liga a um primeiro epítopo da progastrina e com um segundo anticorpo que se liga a um segundo epítopo da progastrina.

[0099] De acordo com uma modalidade preferida, o referido primeiro anticorpo está ligado a um carreador insolúvel ou parcialmente solúvel. A ligação da progastrina pelo referido primeiro anticorpo resulta na captura da progastrina da referida amostra biológica. De preferência, o referido primeiro anticorpo é um anticorpo que se liga a um epítopo de hPG, em que o referido epítopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte C-terminal da progastrina, como descrito acima. Mais preferencialmente, o referido primeiro anticorpo é o anticorpo monoclonal Mabl4, produzido pelo hibridoma 2H9F4B7, descrito em WO 2011/083088. O hibridoma 2H9F4B7 foi depositado sob o Tratado de Budapeste no CNCM, Instituto Pasteur, 25-28 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, França, em 27 de dezembro de 2016, sob a referência 1-5158 (ver WO 2017/114973) .

[00100] De acordo com outra modalidade preferida, o referido segundo anticorpo é marcado com uma fração detectável, como descrito abaixo. A ligação da progastrina

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63/83 pelo segundo anticorpo permite a detecção das moléculas de progastrina que estavam presentes na amostra biológica. Além disso, a ligação da progastrina pelo segundo anticorpo permite a quantificação das moléculas de progastrina que estavam presentes na amostra biológica. De preferência, o referido segundo anticorpo é um anticorpo que se liga a um epítopo de hPG, em que o referido epítopo inclui uma sequência de aminoácidos correspondente a uma sequência de aminoácidos da parte N-terminal da progastrina, como descrito acima. Mais preferencialmente, o referido anticorpo N-terminal é um anticorpo policlonal, como descrito acima. Alternativamente, também é possível usar um anticorpo monoclonal que liga um epítopo dentro do N-terminal da progastrina, tal como por exemplo os anticorpos monoclonais do N-terminal descritos acima, notavelmente um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo CDR-H1, CDR-H2 e CDR-H3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo CDR-L1, CDR-L2 e CDR-L3 das sequências de aminoácidos das SEQ ID N° 19, 20 e 21.

[00101] Em uma modalidade particularmente preferida, o primeiro anticorpo está ligado a um carreador insolúvel ou parcialmente solúvel e o segundo anticorpo é marcado com uma fração detectável.

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[00102] Em uma modalidade preferida, o método da presente invenção para o diagnóstico de câncer de próstata compreende a detecção de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo humano.

[00103] Em uma modalidade mais preferida, o método da presente invenção para o diagnóstico de câncer de próstata compreende a determinação da concentração de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo humano.

[00104] Em outra modalidade particular, o método da presente invenção para o diagnóstico de câncer de próstata compreende a detecção da concentração de progastrina em uma amostra biológica de um indivíduo humano, em que a referida amostra biológica é selecionada a partir de sangue, soro e plasma.

[00105] Em uma outra modalidade preferida, o método da presente invenção compreende o contato de uma amostra do referido indivíduo com um anticorpo anti-hPG como descrito acima, em que a ligação do referido anticorpo anti-hPG na amostra indica a presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

[00106] Em uma modalidade mais particular, o método da presente invenção compreende o contato de uma amostra do referido indivíduo com um anticorpo anti-hPG como descrito acima, em que uma concentração de progastrina superior a 10

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65/83 pM no referido plasma é indicativa da presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

[00107] Mais preferencialmente, o método da presente invenção compreende o contato de uma amostra do referido indivíduo com um anticorpo anti-hPG como descrito acima, em que uma concentração de progastrina superior a 10 pM, 20 pM, 30 pM ou 40 pM na referida amostra é indicativa da presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

[00108] Ainda mais preferencialmente, o método da presente invenção compreende o contato de uma amostra do referido indivíduo com um anticorpo anti-hPG, como descrito acima, em que uma concentração de progastrina superior a 10 pM, preferencialmente 20 pM, mais preferencialmente 30 pM, ainda mais preferencialmente a 40 pM, ainda mais preferencialmente a 50 pM na referida amostra é indicativo da presença de câncer de próstata metastizado no referido indivíduo.

[00109] A presente invenção também se refere a métodos para monitorar a eficácia de um tratamento para câncer de próstata em um paciente, tal como quimioterapia, terapia biológica, imunoterapia ou terapia com anticorpos, determinando a concentração de progastrina em uma primeira amostra, como um fluido corporal ou biópsia do câncer de próstata, obtida de um paciente antes do tratamento para câncer de próstata e, em seguida, comparando a concentração

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66/83 de progastrina na primeira amostra com a de uma segunda amostra obtida do mesmo paciente após o tratamento, em que uma redução na concentração de progastrina na referida segunda amostra comparada à referida primeira amostra indica que o tratamento foi eficaz.

[00110] Em uma modalidade particular, um método de acordo com a invenção compreende comparar a concentração de progastrina em uma amostra biológica obtida de um paciente com um valor predeterminado de concentração de progastrina na amostra, em uma modalidade mais particular, o referido valor predeterminado é escolhido entre: uma mediana, ou média, dos valores da amostra com base na determinação mediana, ou média, do valor em uma população livre de câncer de próstata, um valor de concentração de progastrina obtido quando se sabia que o paciente estava livre de câncer de próstata.

[00111] Em uma modalidade particular, um método de acordo com a invenção para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata compreende a determinação da concentração de progastrina em uma amostra do referido paciente e um segundo teste de diagnóstico de câncer de próstata. Em uma modalidade mais particular, um método de acordo com a invenção para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata compreende a determinação da concentração de progastrina em uma amostra do referido paciente e um segundo teste de diagnóstico de

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67/83 câncer de próstata, em que o referido segundo teste de diagnóstico compreende a detecção de um biomarcador especifico, tal como, por exemplo, PSA, calicreína, antígeno PCa 3 (PCa3), TMPRSS2-ERG, SChLAPl, três genes de exossomos (ERG, PCA3, SPDEF), uma combinação urinária de dois genes (HOXC6 e DLX1), bem como qualquer outro biomarcador de câncer de próstata conhecido pelo especialista (ver, por exemplo, McGrath et al., Prostate Int. 2016, 4 (4) : 130-135) .

[00112] Em uma modalidade particular da invenção, um método de acordo com a presente invenção compreende a determinação do nível de progastrina ao longo do tempo em amostras de um paciente que foi ou está sendo tratado para câncer de próstata.

[00113] As características das modalidades da invenção se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada a seguir dos exemplos abaixo.

LEGENDAS DE FIGURAS

Figura 1

[00114] A concentração de progastrina foi medida em 40 amostras de plasma de pacientes com câncer de pulmão e 119 amostras de plasma de doadores saudáveis usando o Kit ELISA DECODE Lab (anticorpo de captura: Mabl4, anticorpo de detecção: policlonal anti-hPG).

EXEMPLOS

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Exemplo 1: Detecção da concentração plasmática de progastrina usando anticorpos policlonais

[00115] Os níveis plasmáticos de progastrina foram quantificados por ELISA através do uso de dois anticorpos anti-progastrina específicos: os anticorpos de captura são revestidos nas cavidades da placa, enquanto os anticorpos de revelação são usados para detectar progastrina e mediar a revelação do sinal.

[00116] No presente exemplo, a quantificação é baseada no método ELISA que permite, através do uso de um substrato cuja reação emite luz, atribuir um valor proporcional à quantidade de luminescência de anticorpos ligados ao antígeno retido pelos anticorpos de captura.

Material

Reagentes e aparelhos estão listados na Tabela 7:

Descrição	Fornecedor	Referência
Placas MaxiSORP branco Nunc, 96 cavidades	Dutscher	# 055221
Carbonato/ bicarbonato de sódio	Sigma	# 21851
DPBS IX	Lonza	# P04-36500
Tween-20	Biosolve	# 20452335
BSA	Euromedex	# 04-100-81 o-c
Estreptavidina-HRP	Pierce	# 21130

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	(Thermo)
Substrato de Sensibilidade Máxima SuperSignal ELISA Femto	Pierce (Thermo)	# 37074
Anticorpo Policlonal Anti- ProGastrina	Eurogentec	/

[00117] Tabela 7

[00118] Os anticorpos policlonais foram obtidos imunizando um coelho com progastrina N-terminal (SEQ ID N° 2) ou com progastrina C-terminal correspondendo aos aminoácidos 71 a 80 de hPG e possuindo a sequência FGRRSAEDEN (SEQ ID N° 40), de acordo com protocolos padrão.

[00119] As características de ligação dos anticorpos policlonais contra a progastrina utilizados neste ensaio são as seguintes: ausência de ligação a G34-Gly, G34, G17-Gly, G17, ligação à progastrina de comprimento total.

[00120] As placas de 96 cavidades são revestidas, preparando uma solução de carbonato - bicarbonato de sódio, 50 mM, pH 9,6, dissolvendo o conteúdo de uma cápsula em 100 ml de água MilliQ. Uma solução de anticorpo de captura (3 pg/ml), correspondente a anticorpos policlonais obtidos usando o C-terminal da progastrina FGRRSAEDEN (SEQ ID N° 40) é preparada em tampão de carbonato. 100 microlitros de solução de anticorpos são adicionados a cada cavidade e incubados a 4 °C e por 16 horas (1 noite) . As placas são

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70/83 então bloqueadas eliminando a solução de anticorpos e lavadas 3 vezes com 300 μΐ de PBS lX/Tween-20 a 0,1% e adicionando 200 μΐ de tampão de bloqueio (IX PBS/Tween-20 a 0,1%/BSA a 0,1%) por cavidade e incubadas 2 horas a 22 °C. O tampão de bloqueio é então eliminado, as cavidades são lavadas 3 vezes com 300 μΐ de PBS lX/Tween-20 a 0,1%.

[00121] A diluição do plasma é realizada da seguinte maneira: O plasma é usado puro, diluído em 1/2, 1/5 e 1/10. As diluições são preparadas a partir do plasma puro em IX PBS/0,1% Tween 20/0,1% BSA.

[00122] Para o teste de controle, o ELISA na presença de uma concentração conhecida de progastrina, a diluição da progastrina é preparada da seguinte forma: PG recombinante de estoque (progastrina humana de comprimento total produzida em E. coli e afinidade purificada com agarose de glutationa/remoção de marcação (Tev)/ contra- purificação IMAC /diálise, do Instituto Pasteur, Paris, França) é preparada em uma concentração de 0,45 mg/ml (45 microM), em triplicado. As faixas das concentrações de progastrina foram preparadas da seguinte forma:

- Solução A: Pré-diluição de 1/10, 2 μΐ de estoque + 18 μΐ de tampão

- Solução B: Pré-diluição 1/100, 10 μΐ de A + 90 μΐ do tampão

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- Solução C: Pré-diluição 1/1000, 10 μΐ de B + 90 μΐ do tampão

- Solução D: 500 pM, 5,55 μΐ de C + 494,5 μΐ do diluente

- Solução E: 250 pM, 250 μΐ de D + 250 μΐ do diluente

- Solução F: 100 pM, 200 pL de E + 300 μΐ do diluente

- Solução G: 50 pM, 250 μΐ de F + 250 μΐ do diluente

- Solução H: 25 pM, 200 μΐ de G + 200 μΐ do diluente

- Solução I: 10 pM, 100 μΐ de H + 150 μΐ do diluente

[00123] O intervalo de PG recombinante é linear e, portanto, pode ser mais ou menos extenso de acordo com o anticorpo utilizado.

[00124] Para a preparação das amostras de teste, aproximadamente 500 μΐ de cada amostra são retirados e armazenados até a análise (e confirmação, se necessário) dos resultados. 100 μΐ de cada ponto da faixa e/ou plasmas são analisados puros, diluídos para 1/2, 1/5 e 1/10 e incubados por 2 horas a 22 °C nas placas.

[00125] Para a revelação do teste, as placas são lavadas 3 vezes com 300 μΐ de IX PBS/0,1% de Tween-20. Uma solução do anticorpo policlonal de coelho anti-progastrina, em que os referidos anticorpos foram obtidos usando a parte N- terminal da progastrina como um imunógeno, acoplado à biotina a 0,5 pg/ml, é preparado por diluição em IX PBS/0,1% Tween -20/BSA a 0,1%. 100 μΐ desta solução são adicionados a cada cavidade. A incubação ocorre por 1 hora a 22 °C. A

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72/83 revelação com estreptavidina-HRP é realizada removendo o anticorpo de detecção e lavando 3 vezes com 300 μΐ de PBS 1X/O,1% de Tween-20 e, em seguida, preparando uma solução de estreptavidina-HRP a 20 ng/ml diluída em IX PBS/0,1% Tween20/0,1% BSA, em que 100 Adicione 100 μΐ desta solução a cada cavidade, antes da incubação por 1 hora a 22 °C.

[00126] A detecção consiste em eliminar a estreptavidina- HRP e lavar 3 vezes com 300 μΐ de PBS 1X/O,1% de Tween-20 e, em seguida, adicionar 100 μΐ de solução de substrato quimioluminescente por cavidade. A solução de substrato é preparada misturando volumes iguais do kit SuperSignal ELISA Femto de duas soluções, 20 ml + 20 ml, 30 minutos antes do uso e armazenado à temperatura ambiente no escuro. A luminescência é lida após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente no escuro.

[00127] Para cada condição, o teste é realizado em triplicado e os resultados das faixas serão apresentados como um gráfico mostrando a alteração na luminescência, dependendo da concentração de progastrina. Para cada diluição plasmática, a concentração de progastrina é determinada usando a equação da linha de regressão linear da faixa correspondente (intervalo de 1/10 para uma amostra diluída a 1/10).

Métodos e resultados

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[00128] A concentração plasmática mediana de progastrina é 0 pM em pacientes de controle, enquanto uma concentração plasmática significativa de progastrina pode ser detectada em pacientes com câncer de próstata (n = 103). Assim, pacientes com câncer de próstata têm níveis mais altos de progastrina no plasma em comparação com indivíduos saudáveis.

Exemplo 2: Detecção da concentração de progastrina usando anticorpos monoclonais anti progastrina

[00129] As cavidades das placas de 96 cavidades Nunc MaxiSORP são revestidas com um primeiro anticorpo específico para progastrina, como se segue. Anticorpos monoclonais anti-progastrina específicos para a região carboxi-terminal da progastrina são diluídos para uma concentração de 3 pg/ml em uma solução de 50 mM, pH 9, 6 de tampão carbonato /bicarbonato de sódio de em água MilliQ.

[00130] Um total de 100 μΐ da solução de anticorpo é então adicionado a cada cavidade das placas de 96 cavidades e incubado durante a noite a 4^o C. Após a ligação, a solução de anticorpo é removida das cavidades, que são lavadas três vezes com 100 μΐ de tampão de lavagem (IX PBS/0,1% Tween20) . Um total de 100 μΐ de tampão de bloqueio (IX PBS/0,1% de Tween-20/0,1% de BSA) é então adicionado a cada cavidade e incubado por 2 horas a 22° C. O tampão de bloqueio é então removido e as cavidades são lavadas três vezes com tampão de

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74/83 lavagem. As amostras de plasma ou soro isoladas dos pacientes são então adicionadas àss cavidades em um volume de 100 μΐ em uma série de diluições, tipicamente diluições de 1: 1, 1: 2, 1: 5 e 1: 10, e são incubadas por 2 horas a 22°C. As amostras de plasma ou soro são analisadas em duplicado.

[00131] Os ensaios também incluem duas curvas padrão. A primeira curva padrão é preparada usando diluições de progastrina recombinante para uma quantidade final de 1 ng, 0,5 ng, 0,25 ng, 0,1 ng, 0,05 ng, 0,01 ng e 0 ng por cavidade. A segunda curva padrão, que serve como controle negativo, é preparada a partir de soro humano negativo para progastrina diluída em tampão de bloqueio nas mesmas diluições como nas amostras de teste, ou seja, 1: 1, 1: 2, 1: 5 e 1:10. Alternativamente, quando as amostras de plasma estão sendo analisadas, a segunda curva padrão, que serve como controle negativo, é preparada a partir de plasma humano negativo com progastrina diluído em tampão de bloqueio nas mesmas diluições, como nas amostras de teste, ou seja, 1: 1, 1: 2, 1: 5 e 1:10.

[00132] Após a conclusão da incubação com as amostras de plasma ou soro, o conteúdo da cavidade é removido e as cavidades são lavadas três vezes com tampão de lavagem, 100 μΐ/cavidade, após o qual a progastrina ligada ao primeiro anticorpo é detectada usando um segundo anticorpo específico para progastrina, do seguinte modo.

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[00133] Os anticorpos monoclonais anti-progastrina acoplados à biotina, específicos para a região amino terminal da progastrina, são diluídos em tampão de bloqueio até uma concentração de 0,1 a 10 μΐ g/ml, dependendo do anticorpo. Um total de 100 μΐ da solução de anticorpo é então adicionado a cada cavidade e incubado por 1 hora a 22°C.

[00134] Após a conclusão da ligação secundária ao anticorpo, as placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem, 100 μΐ/cavidade, após o que 100 μΐ de uma solução de estreptavidina-HRP (25 ng/ml em tampão de bloqueio) são adicionados a cada cavidade e incubados por 1 hora a 22°C. Após a incubação com a solução de estreptavidina-HRP, as placas são lavadas três vezes com tampão de lavagem, 100 μΐ/cavidade. Depois disso, 100 μΐ de substrato quimioluminescente preparado usando um kit de substrato quimioluminescente de sensibilidade máxima Pierce SuperSignal ELISA Femto, é adicionado por cavidade, incubado por 5 min à temperatura ambiente no escuro e depois lido em um luminômetro.

[00135] Com base nas leituras do luminômetro, a análise de regressão linear é usada para derivar a equação das linhas correspondentes aos dados da curva padrão. Usando esta equação, a concentração de progastrina nas várias amostras de pacientes é então calculada.

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[00136] A concentração plasmática mediana de progastrina é calculada em pacientes com câncer de próstata e comparada com a concentração plasmática mediana de progastrina no plasma de pacientes controle. Esses dados demonstram que pacientes com câncer de próstata apresentam níveis elevados de progastrina no plasma em comparação com indivíduos saudáveis.

Exemplo 3: Detecção da concentração plasmática de progastrina utilizando uma combinação de anticorpos policlonais e anticorpos monoclonais.

[00137] No presente exemplo, os níveis plasmáticos de progastrina são quantificados por ELISA através do uso de anticorpo específico para progastrina humana (hPG) prérevestido em uma placa de 96 cavidades. Padrões e amostras são adicionados às cavidades, e qualquer hPG presente se liga ao anticorpo de captura imobilizado. As cavidades são lavadas e um conjugado anticorpo anti-hPG de detecção de peroxidase de rábano (HRP) é adicionado, produzindo um sanduíche anticorpo-antígeno-anticorpo. Após uma segunda lavagem, é adicionada a solução de substrato TMB, que produz uma cor azul em proporção direta à quantidade de hPG presente na amostra inicial. A solução Stop muda de cor de azul para amarelo e as cavidades são lidas a 450 nm com um leitor de microplacas.

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[00138] Os anticorpos policlonais são obtidos pela imunização de um coelho com progastrina N-terminal (SEQ ID N° 2) ou com progastrina C-terminal correspondente aos aminoácidos 71 a 80 de hPG e possuindo a sequência FGRRSAEDEN (SEQ ID N° 40), de acordo com protocolos padrão.

[00139] Os anticorpos monoclonais são obtidos pelo uso de hibridomas que produzem anticorpos contra a progastrina N- terminal (SEQ ID N° 2) ou contra a progastrina C-terminal correspondente aos aminoácidos 71 a 80 de hPG e possuindo a sequência FGRRSAEDEN (SEQ ID N° 40), de acordo com protocolos padrão.

[00140] As características de ligação dos anticorpos policlonais e monoclonais contra a progastrina utilizados neste ensaio são as seguintes: ausência de ligação a G34Gly, G34, G17-Gly, G17, ligação à progastrina de comprimento total.

[00141] Para o teste de controle, o ELISA na presença de uma concentração conhecida de progastrina, a diluição da progastrina é preparada da seguinte forma: PG recombinante de estoque (progastrina humana de comprimento total produzida em E. coli e afinidade purificada com agarose de glutationa/remoção de marcação (Tev)/ Contra- purificação IMAC /diálise, do Instituto Pasteur, Paris, França) é preparada em uma concentração de 0,45 mg/ml (45 microM), em

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78/83 triplicado. As faixas das concentrações de progastrina são preparadas da seguinte forma:

• Solução A: Pré-diluição de 1/10, 2 μΐ de estoque + 18 μΐ de tampão • Solução B: Pré-diluição 1/100, 10 μΐ de A + 90 μΐ do tampão • Solução C: Pré-diluição 1/1000, 10 μΐ de B + 90 μΐ do tampão • Solução D: 500 pM, 5,55 μΐ de C + 494,5 μΐ do diluente • Solução E: 250 pM, 250 μΐ de D + 250 μΐ do diluente • Solução F: 100 pM, 200 μΐ de E + 300 μΐ do diluente • Solução G: 50 pM, 250 μΐ de F + 250 μΐ do diluente • Solução H: 25 pM, 200 μΐ de G + 200 μΐ do diluente • Solução I: 10 pM, 100 μΐ de H + 150 μΐ do diluente

[00142] O intervalo de PG recombinante é linear e, portanto, pode ser mais ou menos extenso de acordo com o anticorpo utilizado.

Métodos e resultados

[00143] Os níveis de progastrina são determinados em amostras de plasma de indivíduos que sabidamente desenvolveram câncer de próstata posteriormente. A progastrina é capturada com o anticorpo monoclonal Cterminal mAb 14 produzido pelo hibridoma 2H9F4B7 descrito no documento WO 2011/083088 (o hibridoma 2H9F4B7 é depositado sob o Tratado de Budapeste no CNCM, institut Pasteur, 25-28

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79/83 rue du Docteur Roux, 75724 Paris CEDEX 15, França, em 27 de dezembro de 2016, com a referência 1-5158.) A detecção é realizada com anticorpos policlonais marcados específicos para o N- terminal.

[00144] O controle é constituído por amostras de plasma da população em geral.

[00145] Os dados demonstram que pacientes com câncer de próstata têm níveis detectáveis de progastrina no plasma, enquanto indivíduos saudáveis não têm nenhum.

Exemplo 4: Detecção da concentração plasmática de progastrina usando o Kit DECODE Lab

[00146] O teste permite uma medição de hPG no EDTA plasmático por ELISA.

[00147] O kit utiliza um anticorpo de captura específico para hPG pré-revestido em uma placa de 96 cavidades. O hPG presente nos padrões e nas amostras adicionadas às cavidades foi ligado pelo anticorpo de captura imobilizado. As cavidades foram lavadas e um conjugado anticorpo anti-hPG de detecção de peroxidase de rábano (HRP) foi adicionado, resultando em um complexo anticorpoantígeno-anticorpo. Após uma segunda lavagem, uma solução de substrato de 3,3',5,5'- Tetrametilbenzidina (TMB) foi adicionada à cavidade, produzindo uma cor azul em proporção direta à quantidade de hPG presente na amostra inicial. A

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80/83 cor da Solução Stop mudou de azul para amarelo e as cavidades foram lidas a 450 nm com um leitor de microplacas.

Métodos e resultados

[00148] Foram utilizadas 40 amostras de plasma de pacientes com câncer de pulmão e 119 amostras de plasma de doadores saudáveis para medir a concentração de progastrina usando o Kit ELISA DECODE Lab (anticorpo de captura: Mabl4, anticorpo de detecção: anti-hPG policlonal) seguindo a recomendação do fabricante.

Resumidamente:

[00149] 1. Prepare todos os reagentes, controles e amostras, conforme indicado na seção anterior, exceto o Ix Conj ugado.

[00150] 2. Remova o excesso de tira da estrutura da placa de microtitulação, devolva-a ao pacote da placa e armazene a 2-8°C.

[00151] 3. As amostras e os controles devem ser testados em duplicado. Prepare o pré-carregamento dos controles e amostras adicionando 65 μΐ/replicado nas cavidades das microplacas de polipropileno DeepWell de 96 cavidades.

[00152] 4. Adicione 50 μΐ de tampão de diluição da amostra a todas as cavidades que serão usadas nas tiras de placas de 96 cavidades pré-revestidas incluídas no kit.

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[00153] 5. Transfira 50 μΐ dos controles e amostras com uma pipeta multicanal (8 canais) das microplacas de polipropileno DeepWell de 96 cavidades pré-carregadas para as tiras de placas de 96 cavidades pré-revestidas incluídas no kit. Um exemplo do layout dos controles é dado abaixo. O tempo de carregamento não deve exceder 10 minutos.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	NC	NC
B	PCI	PCI
C	PC2	PC2
D
E
F
G

[00154] 6. Cubra a placa com parafina plástica e incube por 3h ± 5 min a 37 °C (± 2 °C) .

[00155] 7. Prepare o conjugado Ix conforme descrito na seção 10.2

[00156] 8. No final da etapa de incubação, descarte todo o líquido das cavidades invertendo a placa. Prossiga com uma etapa de lavagem completa adicionando 300 μΐ por cavidade de solução de lavagem IX. Descarte a solução de lavagem Ix invertendo a placa e seque bem a estrutura da placa de microtitulação de cabeça para baixo em papel absorvente. Repita a etapa de lavagem 6 vezes. No final das

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82/83 etapas de lavagem, garanta a remoção completa do liquido das cavidades: todo o liquido foi removido com sucesso quando nenhum sinal de liquido permanecer na toalha de papel. 0 procedimento de lavagem é critico. Uma lavagem insuficiente pode resultar em baixa precisão e leituras de absorbância falsamente elevadas.

[00157] 9. Adicione 100 μΐ do conjugado IX a cada cavidade.

[00158] 10. Cubra a placa com parafina plástica e incube 30 min ± 3 min a 21 °C (± 5 °C).

[00159] 11. No final da etapa de incubação, descarte todo o líquido das cavidades invertendo a placa. Prossiga com uma etapa de lavagem completa adicionando 300 μΐ por cavidade de solução de lavagem IX. Descarte a solução de lavagem Ix invertendo a placa e seque bem a estrutura da placa de microtitulação de cabeça para baixo em papel absorvente. Repita a etapa de lavagem 6 vezes. No final das etapas de lavagem, garanta a remoção completa do líquido das cavidades: todo o líquido foi removido com sucesso quando nenhum sinal de líquido permanecer na toalha de papel. O procedimento de lavagem é crítico. Uma lavagem insuficiente resultará em baixa precisão e leituras de absorbância falsamente elevadas.

[00160] 12. Adicione 100 μΐ da solução de substrato a cada cavidade. Após a adição da solução Substrato, o conteúdo

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83/83 das cavidades de Controle Positivo 1 e Controle Positivo 2 deve ficar azul.

[00161] 13. Incube por 15 minutos ± 2 minutos a 21 °C (± 5 °C) no escuro.

[00162] 14. Sem remover o conteúdo, das cavidades, adicione 100 μΐ da solução Stop a cada cavidade, a fim de interromper a reação. Após a adição da solução Stop, o conteúdo das cavidades de Controle Positivo 1 e Controle Positivo 2 deve ficar amarelo.

[00163] 15. Leia e registre o O.D. a 450 nm.

[00164] Como mostrado na Fig. 1, a concentração plasmática mediana de progastrina medida em pacientes controle (n = 119) foi 0 pM, enquanto uma concentração plasmática significativa de progastrina foi detectada em pacientes com câncer de próstata (n = 40). Assim, pacientes com câncer de próstata têm níveis mais altos de progastrina no plasma do que indivíduos saudáveis.

Claims

1. Método para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata em um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

b) detectar a ligação da referida molécula de ligação à progastrina a progastrina na referida amostra, em que a referida ligação indica a presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa b) compreende adicionalmente determinar a concentração de progastrina e em que uma concentração de progastrina de pelo menos lOpM na referida amostra biológica é indicativo de câncer de próstata no referido indivíduo.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas adicionais de:

c) determinar a concentração de referência de progastrina em uma amostra de referência,

d) comparar a concentração de progastrina na referida amostra biológica com a referida concentração de referência de progastrina,

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e) determinar, a partir da comparação da etapa d) , a presença de câncer de próstata.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de ligação à progastrina é um anticorpo, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, é selecionado entre os anticorpos monoclonais antiprogastrina N-terminais e os anticorpos monoclonais antiprogastrina C-terminais.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo que se liga à progastrina é um anticorpo monoclonal escolhido em um grupo consistindo de:

Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácido SEQ ID N° 4, 5 e 6, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 7, 8 e 9, respectivamente,

Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia

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3/5 pesada compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácido SEQ ID N° 10, 11 e 12, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 13, 14 e 15, respectivamente,

Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácido SEQ ID N° 16, 17 e 18, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 19, 20, e 21, respectivamente,

Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácido SEQ ID N° 22, 23 e 24, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 25, 26 e 27, respectivamente,

Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo

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4/5 menos duas, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácido SEQ ID N° 28, 29 e 30, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 31, 32 e 33, respectivamente, e

Um anticorpo monoclonal compreendendo uma cadeia pesada compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-H1, CDR-H2 e CDRH3 das sequências de aminoácido SEQ ID N° 34, 35 e 36, respectivamente, e uma cadeia leve compreendendo pelo menos uma, preferencialmente pelo menos duas, preferencialmente três, de CDR-L1, CDR-L2, e CDR-L3 das sequências de aminoácidos SEQ ID N° 37, 38 e 39, respectivamente.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida amostra biológica é contatada com uma primeira molécula, que se liga a uma primeira parte da progastrina, e com uma segunda molécula, que se liga a uma segunda parte da progastrina.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é escolhida entre: sangue, sérum e plasma.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a

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5/5 referida amostra biológica é plasma, e em que a concentração de progastrina de pelo menos lOpM é indicativa da presença de câncer de próstata no referido indivíduo.

10. Uso do anticorpo de ligação à progastrina, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, como descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é para o diagnóstico ín vítro de câncer de próstata.