BR112019019109A2 - mitorriboscinas: terapêuticos baseados em mitocôndria direcionados para células cancerosas, bactérias e levedura patogênica - Google Patents

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Abstract

a presente descrição se refere a inibidores da função mitocondrial. são descritos métodos de rastreamento de compostos para inibição mitocondrial. também são descritos métodos de uso de inibidores mitocondriais chamados de mitorriboscinas ? compostos terapêuticos baseados em mitocôndria que possuem atividade anticâncer e propriedades antibióticas ? para prevenir ou tratar o câncer, infecções bacterianas e por levedura patogênica assim como métodos de uso dos inibidores mitocondriais para fornecer benefícios antienvelhecimento. também são descritos compostos de mitorriboscina e grupos de mitorriboscina específicos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de invenção para ’’MITORRIBOSCINAS: TERAPÊUTICOS BASEADOS EM MITOCÔNDRIA DIRECIONADOS PARA CÉLULAS CANCEROSAS, BACTÉRIAS E LEVEDURA PATOGÊNICA.
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS [001] Esse pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. No. 62/471.688, depositado em 15 de março de 2017, cuja totalidade está incorporada aqui por referência.
CAMPO [002] A presente invenção refere-se a inibidores da função mitocondrial que visam o ribossoma mitocondrial, aqui referido como rnitorriboscinas, métodos para a identificação de mitorriboscinas, métodos de utilização dos inibidores para atingir células-tronco cancerosas, para atingir bactérias e leveduras patológicas e para fornecer benefícios antienvelhecimento e composições farmacêuticas para o tratamento de câncer, infecções bacterianas, infecções por levedura e envelhecimento, contendo uma ou mais mitorriboscinas como ingrediente ativo.
ANTECEDENTES [003] Pesquisadores têm lutado para desenvolver novos tratamentos anticâncer. Terapias para o câncer convencionais (por exemplo, irradiação, agentes alquilantes como ciclofosfamida e antimetabolitos tal como 5~Fluorouracil) têm tentado detectar seletivamente e erradicar células cancerígenas de crescimento rápido pela interferência com os mecanismos celulares envolvidos no crescimento celular e na replicação do DNA. Outras terapias para o câncer têm usado imunoterapias que ligam seletivamente antígenos tumorais mutantes em células cancerosas de crescimento rápido (por exemplo, anticorpos monoclonais). Infelizmente, os tumores frequentemente recidivam depois dessas terapias nos mesmos ou em locais diferentes, indicando que
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2/32 nem todas as células cancerosas foram erradicadas. A recidiva pode ser devida a dosagem quimioterapêutica insuficiente e/ou emergência de clones de câncer resistentes a terapia. Por isso, novas estratégias de tratamento do câncer sâo necessárias. Da mesma forma, os pesquisadores têm lutado para desenvolver novos tratamentos com antibióticos. A resistência aos antibióticos se desenvolveu devido ao acúmulo gradual de mutações aleatórias nos micróbios e ao uso indevido de antibióticos. O fraco investimento financeiro na pesquisa e desenvolvimento de antibióticos agravou a situação. Por Isso, novas estratégias de tratamento com antibióticos sâo necessárias.
[004] Avanços na análise mutacional têm permitido um estudo aprofundado das mutações genéticas que ocorrem durante o desenvolvimento do câncer. Apesar de ter conhecimento do cenário genômico, a oncologia moderna tem tido dificuldade na identificação das mutações primárias condutoras através dos subtipos de câncer. A dura realidade parece ser que o tumor de cada paciente é único e um único tumor pode conter múltiplos clones celulares divergentes. O que é necessário, então, é uma nova abordagem que enfatize semelhanças entre diferentes tipos de câncer. Direcionar as diferenças metabólicas entre as células tumorais e células normais é promissor como uma nova estratégia de tratamento do câncer. Uma análise dos dados de perfil de transcrição de amostras de câncer de mama humano revelou mais do que 95 transcritos elevadas de mRNA associados com a biogênese mitocondrial e/ou tradução mitocondrial. Sotgia et al., Ce// Cycle, 11 (23): 4390-4401 (2012). Adicionalmente, mais do que 35 dos 95 mRNAs regulados positivamente codificam as proteínas rlbossomais mitocondriais (MRPs). A análise proteômica de células-tronco de câncer de mama humano também revelou a superexpressão significativa de várias proteínas mltorribossômicas, assim como outras proteínas associadas à biogênese mitocondrial. Lamb et al., Oncotarget, 5
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3/32 (22): 11029-11037 (2014). A inibição funcional da biogênese mitocondrial que usa os efeitos fora do alvo de certos antibióticos bacteriostáticos ou inibidores de OXPHOS fornece evidência adicional de que as mitocôndrias funcionais são necessárias para a propagação de células-tronco cancerosas.
[005] Existe uma necessidade na técnica de novas estratégias anticâncer, novos compostos com atividade antibiótica de amplo espectro e compostos para reduzir os efeitos do envelhecimento. A teoria endosimbiótica da evolução mitocondrial pode ser usada como base para o desenvolvimento de terapias para tratar a resistência ao fármaco, que é característica tanto da recidiva do tumor quanto da doença infecciosa, e tais terapias podem ter o benefício adicional de retardar o processo de envelhecimento.
SUMÁRIO [006] Levando em consideração os antecedentes é, portanto, um objetivo desta descrição demonstrar que a biogênese mitocondrial desempenha um papel crítico na propagação e manutenção de muitos cânceres. É também um objetivo desta descrição apresentar métodos para identificar inibidores mitocondriais que se ligam ao ribossoma mitocondrial (subunidade grande ou subunidade pequena) e têm propriedades anticancerígenas e antibióticas. É também um objetivo desta descrição identificar inibidores mitocondriais e seus grupos e que tenham propriedades anticancerígenas e antibióticas. É também um objetivo desta descrição identificar classes de inibidores mitocondriais com propriedades antienvelhecimento. É também um objeto desta descrição identificar classes de inibidores mitocondriais que funcionem como rádios-sensibilizadores e foto-sensibilizadores.
[007] A presente descrição se refere a compostos inibidores mitocondriais que possuem atividade antimicrobiana e anticâncer, efeitos de radiossensibilização e fotossensibilização, assim como efeitos anti
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4/32 envelhecimento. A expressão mitorriboscinas” se refere amplamente a terapêuticas direcionadas a mitorribossomos que possuem propriedades anticâncer e antibióticas. Estes compostos se ligam à subunidade grande ou à subunidade pequena do mitorribossomo (ou, em alguns casos, a ambas) e inibem a bíogênese mitocondrial. A presente descrição se refere ainda a métodos de identificação de mitorriboscinas, métodos de produção de tais mitorriboscinas e métodos de utilização de mitorriboscinas para fins terapêuticos.
[008] Os inventores analisaram as propriedades fenotípicas das células-tronco cancerosas (CSCs) que poderíam ser alvo de uma ampla gama de tipos de câncer, e identificaram uma dependência estrita de CSCs na biogênese mitocondrial para a expansão clonal e sobrevivência de uma CSC. Trabalhos anteriores dos inventores demonstraram que diferentes classes de antibióticos aprovados pela FDA e, em particular, as tetraciclinas tais como doxiciclina e eritromicina, têm um efeito fora do alvo ao inibir a biogênese mitocondrial. Como resultado, tais compostos poderíam ter eficácia para erradicar as CSCs. No entanto, esses antibióticos comuns não foram projetados para atingir o mitorribossomo e, portanto, têm propriedades limitadas anticâncer. Sob a presente abordagem, os inventores identificaram compostos que visam o ribossoma mitocondrial ou mitorribossomo e inibem a biogênese mitocondrial. Esses compostos que atingem o mitorribossomo - mitorriboscinas - têm, portanto, propriedades anticâncer altamente potentes, entre outras propriedades vantajosas.
[009] Dado o papel da biogênese mitocondrial na propagação celular, os inibidores mitocondriais, conforme identificados na presente abordagem, fornecem uma classe inteiramente nova de terapia contra o câncer. Além de seu uso potencial como terapias contra o câncer, as mitorriboscinas servem como antibióticos de amplo espectro úteis. A teoria endo-simbiótica da evolução mitocondrial teoriza que organelas
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5/32 mitocondriais evoluíram a partir de bactérias aeróbias englobadas após milhões de anos de simbiose e adaptação. A história evolutiva das organelas mitocondriais sugere que os compostos que visam a tradução da proteína mitocondrial nas células cancerosas também possuem atividade antimicrobiana. De fato, como discutido abaixo, as mitorriboscinas demonstraram propriedades antibióticas.
[0010] Além disso, estudos sobre a inibição genética da tradução de proteínas mitocondriais mostraram efeitos colaterais benéficos, tais como o retardo do processo de envelhecimento e o aumento da expectativa de vida em organismos modelo. Esses resultados sugerem que os inibidores mitocondriais também podem ser úteis para terapias antienvelhecimento, o que é assunto em questão de estudos em andamento.
[0011] Novos inibidores mitocondriais podem ser identificados por meio de uma abordagem convergente de rastreamento de alto rendimento virtual in vitro seguida pela validação in vitro para a inibição mitocondrial. Novos inibidores mitocondriais podem ser rapidamente desenvolvidos combinando o design de fármacos in silico com o rastreamento fenotípico do fármaco.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0012] FIG. 1 ilustra a teoria endo-simbiótica da evolução mitocondrial.
[0013] FIG. 2 mostra um diagrama esquemático delineando uma estratégia de descoberta de fármaco de acordo com as modalidades da presente abordagem atual.
[0014] FIG. 3 mostra os efeitos de dez compostos candidatos de mitorriboscina sobre a depleção de ATP em células MCF7.
[0015] FIGs. 4A-4D ilustra as estruturas químicas de dez compostos de mitorriboscina identificados após o rastreamento fenotípico de fármaco. Estas estruturas são agrupadas em quatro grupos - mitoribo
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6/32 ciclinas (compostos a-c na FIG. 4A), mitoribomicinas (compostos d-g na FIG. 4B), mitoribosporinas (composto h e i na FIG. 4C), e mitoribofloxinas (composto j na FIG. 4D).
[0016] FIG. 5 mostra os efeitos de sete compostos de mitorriboscina sobre a formação de mamosfera em células MCF7.
[0017] FIG. 6A mostra os efeitos de três compostos de mitorriboscina sobre a viabilidade celular de células MCF7. FIG. 6B mostra os efeitos de três compostos de mitorriboscina sobre a viabilidade celular de células hTERT-BJ1.
[0018] FIG. 7A mostra os efeitos do composto 23/G4 sobre a taxa de consumo de oxigênio (OCR) ao longo do tempo em MCF7 células. A FIG. 7B mostra os efeitos do composto 23/G4 na taxa de acidificação extracelular (ECAR) ao longo do tempo em células MCF7. A FIG. 7C mostra os efeitos do composto 23/G4 no OCR para respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP, respiração maxima e capacidade respiratória disponível. A FIG. 7D mostra os efeitos do composto 23/G4 sobre ECAR para a glicólise, a reserva glicolitica e a capacidade de reserva glicolitica.
[0019] FIG. 8A a mostra os efeitos do composto 24/D4 na taxa de consumo de oxigênio (OCR) ao longo do tempo em células MCF7. FIG. 8B mostra os efeitos do composto 24/D4 na taxa de acidificação extracelular (ECAR) ao longo do tempo em células MCF7. A FIG. 8C mostra os efeitos do composto 24/D4 sobre OCR para a respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória disponível. FIG. 8D mostra os efeitos do composto 24/D4 no ECAR sobre a glicólise, reserva glicolitica e capacidade de reserva glicolitica.
[0020] FIG. 9A mostra os efeitos do composto 24/F9 na taxa de consumo de oxigênio (OCR) ao longo do tempo em MCF7 células. FIG. 9B mostra os efeitos do composto 24/F9 na taxa de acidificação
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7/32 extracelular (ECAR) ao longo do tempo em células MCF7. A FIG. 9C mostra os efeitos do composto 24/F9 sobre OCR na respiração basal, vazamento de prótons, respiração ligada ao ATP, respiração máxima e capacidade respiratória disponível. A FIG. 9D mostra os efeitos do composto 24/F9 no ECAR para a glicólise, reserva glicolítica e capacidade de reserva glicolítica.
[0021] FIG. 10A mostra os efeitos de dez compostos de mitorriboscina sobre respiração máxima em células MCF7. A FIG. 10B mostra os efeitos de dez compostos de mitorriboscina na produção de ATP em células MCF7.
[0022] FIG. 11 mostra os efeitos de três compostos de mitorriboscina em duas concentrações diferentes sobre a migração celular em células MDA-MB-231.
[0023] FIG. 12 ilustra as quatro novas classes de inibidores mitocondrial- mitoribociclinas, mitoribomicinas, mitoribosporinas e mitoribofloxinas.
DESCRIÇÃO [0024] A descrição a seguir ilustra modalidades da presente abordagem com detalhes suficientes para permitir a prática da presente abordagem. Embora a presente abordagem seja descrita com referência a estas modalidades específicas, deve ser apreciado que a presente abordagem pode ser realizada em diferentes formas e esta descrição não deve ser interpretada como limitando quaisquer reivindicações em anexo às modalidades específicas aqui apresentadas. Pelo contrário, estas modalidades são fornecidas de modo que esta descrição seja minuciosa e completa e transmita completamente o escopo da presente abordagem àqueles versados na técnica.
[0025] O ribossomo mitocondrial é um portal inexplorado para o tratamento de uma série de males, variando de câncer e infecções bacterianas e fúngicas até o envelhecimento. As mitocôndrias funcio
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8/32 nais são necessárias para a propagação de células-tronco do câncer. A inibição da biogênese mitocondrial nas células cancerosas impede a propagação dessas células. Os inibidores mitocondriais representam, portanto, uma nova classe de terapias anticâncer. Estes compostos podem também inibir a tradução da proteína mitocondrial e, portanto, possuem atividade antimicrobiana. Como resultado, os inibidores mitocondriais podem funcionar como antibióticos de amplo espectro que têm como alvo bactérias e leveduras patogênicas. A pesquisa também mostrou que os inibidores mitocondriais têm propriedades antienvelhecimento. Esta divulgação utiliza a expressão mitorriboscinas para descrever amplamente estes compostos terapêuticos baseados em mitocôndrias tendo propriedades anticâncer e antibióticas. Mitorriboscinas em doses mais baixas podem ser usadas para atingir terapeuticamente o processo de envelhecimento e prolongar a vida útil.
[0026] Novos inibidores mitocondriais que atingem o mitorribossomo - mitorriboscinas - podem ser identificados por meio de uma abordagem convergente de rastreamento virtual de alto rendimento seguida de validação in vivo quanto a inibição mitocondrial. FIG. 2 é uma visão geral dos métodos para a identificação de inibidores mitocondriais pelo uso do rastreamento de fármacos in silico e rastreamento fenotípico de fármaco aqui descritos. Toda ou uma parte da estrutura tridimensional do ribossoma mitocondrial de mamífero (mitorribossomo) pode ser usada na etapa S101 para identificar novos compostos que se ligam ao mitorribossomo através do rastreamento virtual de alto rendimento (vHTS) (isto é, rastreamento de fármaco in silico ). O rastreamento pode ser realizado através de uma biblioteca de moléculas. Por exemplo, durante as investigações iniciais, os inventores examinaram uma coleção de 45.000 compostos de molécula pequena para compostos que se espera que se liguem a qualquer subunidade grande conhecida do grande mitorribossomo (39S), que é um comple
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9/32 xo de múltiplas subunidades com mais do que 50 subunidades. O vHTS inicial pode usar vários programas de rastreamento, como o programa de rastreamento eHiTS, para identificar um subconjunto de compostos com uma forte afinidade de ligação à subunidade grande ou pequena do mitorribossomo de mamífero. Por exemplo, os inventores usaram o eHiTS para identificar os 5.000 principais compostos classificados de uma biblioteca inicial, com base na afinidade de ligação prevista para a subunidade grande (39S) do mitorribossomo de mamífero. O eHiTS é um método de rastreamento que cobre sistematicamente a parte do espaço de busca conformacional e posicionai que evita graves choques esféricos, produzindo posições de ancoragem altamente precisas em uma velocidade que é adequada para o rastreamento virtual de alto rendimento [0027] Deve ser entendido que aqueles versados na técnica podem selecionar ou desenvolver métodos para identificar um subconjunto de compostos que possuem uma afinidade de ligação desejada. Para executar eficientemente a ancoragem, uma série de arquivos de clipe pode ser preparada correspondendo à estrutura inteira da proteína e cada composto ancorado sequencialmente em cada um dos arquivos de clipe. A pontuação de consenso dos principais compostos pode ser realizada utilizando AutoDock 4.2, com base no mesmo sítio de ligação geral para cada composto previsto a partir do rastreamento eHiTS. Uma análise adicional da afinidade de ligação prevista e da inspeção visual pode ser realizada utilizando vários métodos, incluindo, por exemplo, um programa de concepção de novo, tal como SPROUT. Veja Law et al., JMol Struct. 666: 651-657 (2003), que está incorporado por referência na sua totalidade, para obter informações sobre o SPROUT. Dependendo do tamanho inicial da biblioteca e dos resultados, vários compostos podem ser selecionados para o rastreamento fenotípico de fármaco. Por exemplo, os inventores selecionaram
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880 compostos que tiveram um bom desempenho nestas etapas de análise para o rastreamento fenotípico de fármaco na etapa S103.
[0028] O rastreamento fenotípico de fármaco S103 pode ser realizado testando a inibição mitocondrial de compostos selecionados em uma linhagem celular selecionada. Por exemplo, os ensaios de depleção de ATP podem ser usados. Os inventores testaram os 880 compostos selecionados quanto a sua capacidade de induzir funcionalmente a depleção de ATP em células MCF7 de câncer da mama humano. Aproximadamente 85% do ATP celular é normalmente gerado pelo OXPHOS nas mitocôndrias, portanto, a depleção de ATP é um marcador substituto da inibição mitocondrial. Deve ser apreciado que aqueles versados na técnica podem empregar outros substitutos para a inibição mitocondrial. Entretanto, para o ensaio de depleção de ATP empregado pelos inventores, as células MCF7 (6000 células / poço) foram plaqueadas em placas pretas de 96 poços de fundo transparente e incubadas durante a noite antes do tratamento. Os 880 compostos identificados por vHTS foram aplicados às células MCF7 plaqueadas em uma concentração de 50 μΜ e foram rastreados quanto à depleção de ATP. Compostos que mostram os efeitos da depleção de ATP foram subsequentemente rastreados novamente em concentrações mais baixas (25 μΜ e 10 μΜ) para identificar os 10 principais compostos que mais potentemente Induzem a depleção de ATP. Os compostos foram testados após 72 horas de incubação e as experiências foram realizadas em duplicata. Após o tratamento, o meio foi aspirado dos poços e as placas foram lavadas com solução salina aquecida tamponada com fosfato (PBS), suplementada com Ca2+ e Mg2+. Em seguida, as células foram incubadas com uma solução de coloração Hoechst 33342 (Sigma) (10 pg/mL) durante 30 min e lavadas com PBS para avaliar a viabilidade celular. A fluorescência foi lida com um leitor de placas utilizando comprimentos de onda de excitação/emissão a
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355/460 nm. Em seguida, o ensaio luminescente CelITiter-GIo (Promega) foi realizado para medir a atividade metabólica (conteúdo de ATP) nos mesmos poços que foram tratados com um dado composto. Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante. A intensidade de fluorescência (coloração de Hoechst) e intensidade de iuminescência (conteúdo de ATP) foram normalizados para controles tratados apenas com veículo e foram exibidos como controle percentual para comparação. Os resultados deste estudo de depleção de ATP são mostrados na FIG. 3. A FIG. 3 mostra que todos os dez compostos de teste esgotaram significativamente os níveis de ATP em células viáveis. Deve ser apreciado que os especialistas na técnica podem optar por empregar ensaios de depleção de ATP iguais ou semelhantes, modificar tais ensaios, ou podem substituir o ensaio de depleção de ATP por outra metodologia para o rastreamento de compostos selecionados para inibição mitocondrial (por exemplo, ensaios de consumo de oxigênio).
[0029] A presente abordagem inclui métodos de confirmação da viabilidade celular. As pessoas versadas na técnica podem selecionar um ou mais métodos para confirmar a viabilidade celular adequada para a modalidade particular. Os inventores utilizaram inicialmente o ensaio da Sulforodamina (SRB), que é baseado na medida do conteúdo de proteína celular. Após tratamento durante 72 horas em placas de 96 poços, as células foram fixadas com ácido tricloroacético 10% (TCA) durante 1 hora na câmara fria e foram secas durante a noite em temperatura ambiente. Em seguida, as células foram incubadas com SRB durante 15 min, lavadas duas vezes com ácido acético 1% e secas ao ar durante pelo menos 1 hora. Finalmente, o corante ligado a proteína foi dissolvido em uma solução de Tris 10 mM, pH 8,8 e lido utilizando o leitor de placa a 540 nm. Utilizando o ensaio SRB, os inventores selecionaram apenas os compostos que depletam os níveis
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12/32 de ATP sem citotoxicidade proeminente para análise posterior. Citotoxicidade proeminente foi definida como menos do que 30% das células ainda na placa. Naturalmente, as modalidades que empregam outra metodologia de confirmação de viabilidade celular podem selecionar compostos para análise adicional com base em outras considerações, como pode ser conhecido na técnica.
[0030] A presente abordagem envolve ainda métodos de validação funcional na etapa S105, durante a qual a função de um composto como um inibidor mitocondrial pode ser confirmada. Podem ser utilizados vários métodos para validação funcional, incluindo, por exemplo, análise de fluxo metabólico, ensaios de mamosfera, ensaios de viabilidade e atividade antibiótica (antibacteriana e/ou antifúngica). Por exemplo, os inventores determinaram taxas de acidificação extracelular (ECAR) e taxas de consumo de oxigênio em tempo real (OCR) para células MCF7 usando o analisador Seahorse Extracelular Flux (XF96) (Seahorse Bioscience, MA, EUA). As células MCF7 foram mantidas em DMEM suplementado com FBS 10% (soro fetal de bovino), GlutaMAX 2 mM e Pen-Strep 1%. Foram semeadas 5.000 células por poço em placas de cultura celular XF de 96 poços e incubadas durante a noite a 37°C em uma atmosfera umidificada com 5% de CO2. Após 24 horas, as células foram tratadas com compostos selecionados que mostram depleção de ATP sem citotoxicidade proeminente em várias concentrações (ou apenas veículo). Após 72 horas de tratamento, as células foram lavadas em meio de ensaio XF pré-aquecido (para medição de OCR, o meio de ensaio XF foi suplementado com glicose 10 mM, piruvato 1 mM, L-glutamina 2mM e ajustado em pH 7,4). As células foram mantidas em 175 pL/poço de meio de ensaio XF a 37°C em uma incubadora sem CO2 durante 1 hora. Durante a incubação, 25 pL de glicose 80mM, oligomicina 9 μΜ, 2-desoxiglicose 1M (para medição de ECAR) e 25 pL de oligomicinalOpM, FCCP 9pM, rotenona 10pM,
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13/32 antimicina A 10μΜ (para medição de OCR) em meio de ensaio XF foram carregados nas portas de injeção do cartucho do sensor XFe-96. Durante o experimento, o instrumento injetou esses inibidores nos poços em um determinado ponto de tempo, enquanto ECAR/OCR eram medidos continuamente. As medições de ECAR e OCR foram normalizadas pelo conteúdo de proteína (usando o ensaio de Sulforodamina B). Os conjuntos de dados foram analisados pelo software XFe-96, usando os cálculos de ANOVA unidirecional e teste t de Student. Todas as experiências foram realizadas em triplicata e os resultados validaram os efeitos de inibição mitocondrial dos compostos de mitorriboscina aqui descritos. Deve ser apreciado que são conhecidos numerosos métodos para validação funcional e que aqueles versados na técnica podem selecionar um ou mais dependendo das necessidades de validação (por exemplo, outros ensaios que medem ou aproximam a função mitocondrial).
[0031] Em resumo, a presente abordagem fornece métodos de identificação de potenciais inibidores mitocondriais e mitorriboscinas, utilizando o rastreamento in silico de fármaco e rastreamento fenotípico de fármaco. Os novos compostos identificados utilizando esta metodologia podem ser testados quanto a atividade anticâncer (por exemplo, a capacidade de inibir a formação de mamosfera e a migração celular) e podem ser ainda testados em cepas bacterianas e/ou de levedura distintas para investigar a atividade antimicrobiana. A Fig. 2 resume os métodos gerais de acordo com modalidades da presente abordagem, mas deve ser apreciado que aqueles versados na técnica podem se desviar dos exemplos específicos aqui descritos sem se afastar da presente abordagem.
[0032] A presente abordagem levou à identificação de categorias de compostos inibidores mitocondriais - e, em particular, de mitorriboscinas - que possuem propriedades anticâncer, antimicrobianas e anti
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14/32 envelhecimento. Com base no rastreamento e validação inicial dos inventores, os compostos identificados na FIG. 4 possuem propriedades anticâncer, antimicrobianas e antienvelhecimento. Estas mitorriboscinas únicas são, portanto, candidatas a ensaios clínicos. Deve ser apreciado que as mitorriboscinas identificadas na FIG. 4 não são exaustivas, mas são meramente aquelas que foram identificadas até agora usando a nova metodologia aqui apresentada.
[0033] Quatro grupos de mitorriboscinas foram identificados, como mostrado nas FIGs. 4A-4D e 12. Os grupos de mitorriboscina mostrados na FIG. 12, mitoribiciclinas, mitoribomicinas, mitoribosporinas e mitorribofloxinas, podem ser selecionados para uso como terapêuticos anticâncer, antibiótico e/ou antienvelhecimento. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que a quantidade terapeuticamente eficaz de cada composto, para uma terapia particular, depende de uma multiplicidade de fatores. Em algumas modalidades, combinações de compostos de um ou mais grupos de mitorriboscina podem ser utilizadas como agentes terapêuticos anticâncer, antibiótico e/ou antienvelhecimento.
[0034] Em algumas modalidades, o composto de mitorriboscina compreende a fórmula geral ou seus sais:
Figure BR112019019109A2_D0001
em que cada R pode ser igual ou diferente e é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio, flúor, cloro, bromo, iodo, carboxila, alcanos, alcanos cíclicos, derivados baseados em alcanos, alcenos, aicenos cíclicos, derivados baseados
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15/32 em alceno, alcinos, derivados baseados em alcinos, cetonas, derivados baseados em cetona, aldeídos, derivados baseados em aideidos, ácidos carboxílicos, derivados baseados em ácidos carboxílicos, éteres, derivados baseados em éter, ésteres e derivados à base de ésteres, aminas, derivados à base de amina, amidas, derivados à base de amida, areno monocíclico ou policíclico, heteroarenos, derivados à base de areno, derivados à base de heteroareno, fenóis, derivados baseados em fenol, ácido benzoico, derivados baseados em ácido benzoico e um ou mais sinais de direcionamento mitocondrial. Para esclarecimento, os sinais de direcionamento mitocondrial sâo definidos como qualquer entidade química ou peptídica que aumente a eficiência do direcionamento da molécula acoplada à mltocôndria. Tal modificação será esperada aumente a potência e efetividade de uma mitorriboscina. Assim, R pode ser qualquer sinal de direcionamento mitocondrial (peptídeo ou químico), incluindo compostos catiônicos, tais como tri-fenilfosfônio (TPP), uma porção à base de guanidina e/ou ésteres de colina, entre outros [0035] Em algumas modalidades, o composto de mitorriboscina compreende a fórmula geral ou seus sais:
R
Figure BR112019019109A2_D0002
em que cada R pode ser Igual ou diferente e é selecionado do grupo constituído por hidrogênio, carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio, flúor, cloro, bromo, iodo, carboxila, alcanos, alcanos cíclicos, derivados baseados em alcano, alcenos, alcenos cíclicos , derivados baseados em alceno, alcinos, derivados baseados em alcino, cetonas, derivados baseados em cetona, aldeídos, derivados baseados em aldeídos, ácidos
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16/32 carboxílicos, derivados baseados em ácido carboxílico, éteres, derivados à base de éteres, ésteres e derivados à base de ésteres, aminas, derivados à base de amina, amidas, derivados à base de amida, areno monocídico ou policíclico, heteroarenos, derivados à base de areno, derivados à base de heteroareno, fenóis, derivados à base de fenol, ácido benzoico, derivados à base de ácido benzoico e um ou mais sinais de direcionamento mitocondrial.
[0036] Em algumas modalidades, o composto de mitorriboscina compreende a fórmula geral ou seus sais:
em que R é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio, flúor, cloro, bromo, iodo, carboxila, alcanos, alcanos cíclicos, derivados baseados em alcanos, alcenos, alcenos cíclicos, derivados baseados em alceno, alcinos derivado à base de alcino, cetonas, derivados à base de cetona, aldeídos, derivados à base de aldeído, ácidos carboxílicos, derivados à base de ácido carboxílico, éteres, derivados à base de ésteres, ésteres e derivados à base de ésteres, aminas, derivados à base de amino amidas, derivados baseados em amida, areno monocídico ou policíclico, heteroarenos, derivados baseados em areno, derivados baseados em heteroareno, fenóis, derivados baseados em fenol, ácido benzoico, derivados baseados em ácido benzoico e um ou mais sinais de direcionamento mitocondrial.
[0037] Em algumas modalidades, o composto de mitorriboscina compreende a fórmula geral ou seus sais:
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F
Figure BR112019019109A2_D0003
Figure BR112019019109A2_D0004
[0038] As mitorriboscinas específicas das fórmulas mostradas na FIG. 4 são mostrados como exemplos específicos dos grupos de mitorriboscinas identificadas na FIG. 12. Deve ser apreciado que as ml· torriboscinas podem ser selecionadas para uso terapêutico individualmente, ou em combinação com mais do que uma mitorriboscina específica, e/ou com outras substâncias para aumentar a eficácia de outros terapêuticos. A terapêutica pode ser usada na forma de composições farmacêuticas usuais que podem ser preparadas utilizando um ou mais métodos conhecidos. Por exemplo, uma composição farmacêutica pode ser preparada usando diluentes ou excipíentes tais como, por exemplo, uma ou mais cargas, agentes de volume, aglutinantes, agentes umectantes, agentes de desintegração, agentes tensoativos, lubrificantes e semelhantes, como são conhecidos na técnica. Podem ser selecionadas vários tipos de formas unitárias de administração, dependendo dos objetivos terapêuticos. Exemplos de formas para composições farmacêuticas incluem, mas não se limitam a comprimidos, pílulas, pós, líquidos, suspensões, emulsões, grânulos, cápsulas, supositórios, preparações para injeção (soluções e suspensões), cremes tópicos e outras formas que possam ser conhecidas na técnica. Para o propósito de moldar uma composição farmacêutica na forma de comprimidos, podem ser utilizados quaisquer excipientes conhecidos, por exemplo, veículos tais como lactose, açúcar branco, cloreto de sódio,
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18/32 glucose, ureia, amido, carbonato de cálcio, caulim, ciclodextrinas, celulose cristalina, ácido silícico e semelhantes; aglutinantes como água, etanol, propanol, xarope simples, soluções de glicose, soluções de amido, soluções de gelatina, carboximetilcelulose, goma-laca, metilcelulose, fosfato de potássio, polivinilpirrolidona, etc. Adicionalmente, agentes de desintegração tais como amido seco, alginato de sódio, agar em pó, laminaria em pó, hidrogenocarbonato de sódio, carbonato de cálcio, ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitana, laurilsulfato de sódio, monoglicerídeo de ácido esteárico, amido, lactose, etc. Inibidores de desintegração tais como açúcar branco, estearina, manteiga de coco, óleos hidrogenados; aceleradores de absorção tais como base de amônia quaternária, laurilsulfato de sódio, etc podem ser usados. Podem ser utilizados agentes umectantes tais como glicerina, amido e outros conhecidos na técnica. Agentes de absorção tais como, por exemplo, amido, lactose, caulim, bentonita, ácido silícico coloidal, etc., podem ser utilizados. Podem ser utilizados lubrificantes tais como talco purificado, estearatos, pó de ácido bórico, polietilenoglicol, etc. Se os comprimidos forem desejados, eles podem ser ainda revestidos com os materiais de revestimento usuais para fazer os comprimidos como comprimidos revestidos de açúcar, comprimidos revestidos com filme de gelatina, comprimidos revestidos com revestimentos entéricos, comprimidos revestidos com filmes, comprimidos de dupla camada e comprimidos de múltiplas camadas. As composições farmacêuticas adaptadas para administração tópica podem ser formuladas como unguentos, cremes, suspensões, loções, pós, soluções, pastas, géis, espumas, sprays, aerossóis ou óleos. Tais composições farmacêuticas podem incluir aditivos convencionais que incluem, mas não se limitam a conservantes, solventes para auxiliar a penetração do fármaco, co-solventes, emolientes, propelentes, agentes modiflcadores da viscosidade (agentes gelificantes), tensoativos e veículos.
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19/32 [0039] A presente abordagem envolve métodos para testar compostos e, em particular, mitorriboscinas, quanto às propriedades anticâncer. Como discutido acima, vHTS e a química computacional podem ser usados para identificar candidatos a inibidores mitocondriais. Esses candidatos podem ser testados quanto as propriedades específicas contra o câncer. Por exemplo, os inventores compararam sete compostos candidatos em paralelo quanto a sua capacidade de inibir a formação de mamosfera em células MCF7. FIG. 5 ilustra como cinco dos sete compostos testados inibiram significativamente a formação de mamosfera em uma concentração de 5 μΜ. Por exemplo, 23/G4 (Grupo 1) reduziu a formação de mamosfera em 50% nesta concentração. Da mesma forma, 24/F9 (Grupo 2) e 24/D4 (Grupo 3), ambos reduziram a formação de mamosfera em ~ 90%.
[0040] Com base nesta análise, os inventores avaliaram os efeitos funcionais dos três candidatos sobre a viabilidade global em monocamadas de células MCF7 e fibroblastos humanos normais (células hTERT-BJ1) (FIG. 6). 23/G4 (Grupo 1) reduziu a viabilidade de células MCF7 em 70% em uma concentração de 5 μΜ. Entretanto, 23/G4 não teve efeito sobre a viabilidade das células hTERT-BJ1, quando testado na mesma concentração. Assim, é possível identificar compostos, tais como 23/G4, que preferencialmente atingem CSCs e células de câncer em massa, mas não fibroblastos normais. Aqueles versados na técnica podem determinar o direcionamento preferencial de mitorriboscinas candidatas empregando o mesmo método ou outros métodos conhecidos na técnica.
[0041] A presente abordagem envolve métodos de validação de função de compostos de mitorriboscina. Por exemplo, os inventores avaliaram a validação funcional de três candidatos usando o Seahorse Analyzer, que mede quantitativamente a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR). OCR é um mar
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20/32 cador substituto para OXPHOS e ECAR é um marcador substituto para a produção de glicólise e L-lactato.
[0042] Os resultados dos inventores demonstraram que 23/G4 (Grupo 1), 24/F9 (Grupo 2) e 24/D4 (Grupo 3) inibiram de forma dependente da dose o consumo de oxigênio mitocondrial nas células MCF7, sendo o 23/G4 o mais potente (Figuras 7, 8 e 9). 23/G4 reduziu os níveis de ATP em mais do que 50% em uma concentração de apenas 500 nM. Além disso, 23/G4 reduziu os níveis de ATP em -75% a 2,5 μΜ (Fig. 7). Notavelmente, o tratamento com 23/G4, nas mesmas concentrações, teve pouco ou nenhum efeito na viabilidade celular global das monocamadas de MCF7 (FIG. 6). Portanto, 23/G4 reduziu muito eficazmente os níveis de ATP, sem mostrar citotoxicidade significativa.
[0043] Os dados demonstraram que 23/G4 induziu um aumento nas taxas de glicólise em mais de 1,5 vezes, enquanto que 24/F9 e 24/D4 suprimiram a glicólise. Isso podería explicar por que 24/F9 e 24/D4 foram mais potentes do que 23/G4 no ensaio de mamosfera, onde 24/F9 e 24/D4 reduziram a formação de mamosfera em - 90% em uma concentração de 5 μΜ (FIG. 5). A potência de ordem de classificação dos 10 maiores acertos pela sua capacidade de reduzir i) a respiração máxima e ii) a produção de ATP é mostrada na FIG. 10. Note que os 6 principais compostos a este respeito foram 23/G4, 25/B3, 24/H9, 24/F9, 23/E9 e 24/H6, sendo 23/G4 o mais potente, resultando em uma redução superior a 75% nos níveis de ATP com 5 μΜ.
[0044] Como EMT e a invasão celular são características fenotípicas associadas à estaminalidade e metástases à distância, os efeitos desses compostos sobre a capacidade de outra linhagem de células de câncer de mama mais agressiva, MDA-MB-231, para se submeterem à migração celular foram avaliados. FIG. 11 mostra que 23/G4, 24/D4 e 24/F9 inibiram a migração celular em mais de 70%, na conPetição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 90/110
21/32 centração de 2,5 μΜ.
[0045] A presente abordagem permite testar compostos quanto as propriedades anticâncer, considerando os efeitos dos compostos sobre a formação da mamosfera e migração celular. Utilizando os métodos aqui descritos, 23/G4 (Grupo 1) parece ser um novo composto promissor, uma vez que é mais seletivo em atingir CSCs e células cancerosas, poupando simultaneamente as células normais (FIG 6). 23/G4 é o composto mais eficaz que reduz efetivamente os níveis de ATP mitocondrial e induz a glicólise. Deve ser entendido que aqueles versados na técnica podem utilizar outros métodos conhecidos na técnica para avaliar os efeitos de um candidato a inibidor mitocondrial em uma linhagem celular particular sem se afastarem da presente abordagem. Também deve ser entendido que aqueles versados na técnica podem avaliar os efeitos de um candidato a inibidor mitocondrial em outros tipos de câncer, uma vez que os inibidores atingem as célulastronco cancerígenas (CSCs). As CSCs mostram características conservadas na maioria dos tipos de câncer. Antibióticos como doxiciclina e eritromicina, que se ligam aos ribossomos mitocondriais como um efeito fora do alvo, mostram eficácia em doze linhagens celulares diferentes, representando oito tipos diferentes de câncer. Estes incluem: carcinoma ductal in situ (CDIS), mama, ovário, pâncreas, carcinoma de pulmão, assim como melanoma e glioblastoma.
[0046] A FIG. 1 ilustra a evolução de bactérias aeróbicas em organelas mitocondriais ao longo de milhões de anos de simbiose e adaptação. Em vista dessa história evolutiva, os compostos que atingem a tradução de proteínas mitocondriais em células cancerosas também podem possuir atividade antimicrobiana. A presente abordagem fornece métodos para testar compostos quanto à atividade antimicrobiana, assim como novos compostos com atividade antimicrobiana. Para demonstrar que os inibidores mitocondriais funcionam como antibióticos
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22/32 de amplo espectro, os inventores testaram a atividade antimicrobiana dos três principais compostos (24/F9, 24/D4 e 23/G4) contra duas cepas bacterianas gram-positivas (Staph, aureus e Strep, pyogenes), três cepas bacterianas gram-negativas (E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae) e a cepa de levedura patogênica C. albicans.
[0047] Os efeitos antimicrobianos de um candidato a inibidor de mitocôndria podem ser avaliados usando o método de difusão de disco Kirby-Bauer, realizado de acordo com as diretrizes do Clinical and Laboratory Standards institute (CLSI) e os resultados são interpretados usando os pontos de corte de CLSI. Discos com antibióticos contra bactérias gram (+ve) e gram (-ve) (da Oxoid ™) podem ser usados como controles positivos. Os inventores avaliaram os efeitos antibióticos de certas mitorriboscinas aqui descritas com base na seguinte metodologia. Os compostos 24/D4, 24/F9 e 23/G4 aqui identificados foram preparados pela dissolução em dimetilsulfóxido (DMSO, da Sigma/Aldrich Company; St. Louis, MO, EUA) e foram utilizados para impregnar os Blamk Antimicrobial Susceptibility Disks (Oxoid ™). As culturas de bactérias testadas durante a noite foram ajustadas turbidez de padrões de 0,5 McFarland (106 CFU/mL) antes da inoculação em placas de ágar com swabs de algodão estéreis. Um cotonete embebido na cultura celular foi espalhado sobre uma superfície de placa de ágar de modo a obter uma camada uniforme de bactérias em toda a superfície. Após 10-15 minutos, os discos de antibióticos ou novos discos de compostos foram colocados na superfície inoculada das placas de ágar; depois, todas as placas de ágar foram incubadas a 37°C durante a noite. Os diâmetros de inibição foram medidos e a suscetibilidade foi expressa em termos de resistência (R), suscetibilidade moderada (I) e suscetibilidade (S). Placas de ágar inoculadas com bactérias testadas com discos impregnados com DMSO foram utilizadas como controles. O resultado obtido em uma única cepa bacteriana foi confirmado pelos
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23/32 kits de teste Sens! para gram-positives e de teste Sensi para gramnegativos (Liofilchem S.R.L.). Os testes de susceptibilidade de difusão do disco foram realizados em triplicate e repetidos três vezes de forma independente.
[0048] A concentração inibitória mínima (MIC) dos compostos antibacterianos pode ser determinada usando o método de diluição em caldo, de acordo com as diretrizes de CLSI. As soluções do composto de teste (ou soluções antibióticas utilizadas como controles positivos) foram diluídas, em série, com meio de MHB. Em seguida, as suspensões dos microrganismos, preparadas a partir de culturas de bactérias por uma noite no meio MHB, em uma concentração de 106 CFU/mL, foram adicionadas em cada diluição em uma proporção de 1:1. Os padrões de McFarland foram usados como referência para ajustar a turbidez das suspensões de microrganismos. O crescimento (ou falta dele) dos microrganismos foi determinado após incubação durante 24 horas a 37°C por turbidimetria (comprimento de onda de 600 nm). MIC 50 e MIC 99 são definidas como a concentração inibitória mínima do composto necessária para 50% e 99% de inibição do crescimento bacteriano. Os tubos de controle negativo não continham inóculo bacteriano e os tubos de controle positivo continham apenas DMSO. O teste de suscetibilidade por medição da MIC foi realizado em triplicate e repetido três vezes de forma independente. A significância estatística foi determinada pelo teste t de Student e valores menores que 0,05 foram considerados significativos.
Teste de Suscetibilidade Gram-positivo Staph, aureus (ATCC 25923) Strept. pyogenes (ATCC 19615)
ANTIBIÓTICO/INIBIDOR CONTEÚDO yg AVALIAÇÃO
S 1 R S 1 R
Ciprofloxacina 4 X X
Rifampicina 4 X X
23/G4 S X X
Gentamicina 8 X X
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24/32
Tobramicma 8 X X
Levofloxacma 8 X X
Pefloxadna 8 X X
Azitromicma 8 X X
Claritromicma 8 X X
Eritromicina 8 X X
Miocamicma 8 X X
Roxltromlcina 8 X X
Co-tnmoxazol 8 X X
Amoxacilina/Ác. Clavulânico 8/4 X X
Píperacilina 16 X X
24/D4 32 X X
Netilmicina 32 X X
Cefaclor 32 X X
Ceflxima 32 X X
Cefomcid 32 X X
Ceftadizlme 32 X X
Cefuroxima 32 X X
Ampicilina / Sulbactam 32/16 X X
24/F9 64 X X
Ceftriaxona 64 X X
Fosfomlcina 200 X X
Tabela 1. Sensibilidade ao Antibiótico de Bactérias Gram-positivas [0049] A Tabela 1 resume a atividade antibacteriana gram-positiva dos compostos de mitorriboscinas 24/F9, 24/D4 e 23/G4 em comparação com antibióticos conhecidos e através de duas cepas bacterianas gram-positivas (Staph, aureus e Strep, pyogenes). O título da coluna S identifica sensibilidade, I identifica intermediário e R identifica resistente. As tabelas 1 e 2 ilustram como todas as cinco cepas bacterianas testadas são sensíveis aos compostos de mitorriboscina (24/F9, 24/D4 e 23/G4). Nenhuma inibição de crescimento foi observada no controle (DIVISO).
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Teste de Suscetibilidade Gram-positivo E. co//ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 K. pneumoniae ATCC 13883
ANTIBIÒTICO/INIBIDOR CONTEÚDO pg AVALIAÇÃO ί
S I R S I R S I R |
Ciprofloxacina 4 X X X
Rifampicina 4 X X X
Gentamicina 8 X X X
Tobramicina 8 X X X
Lomefloxacina 8 X X X
Levofloxacina 8 X X X
Pefloxacina 8 X X X
Co-trimoxazol 8 X X X ί ro ______________I CA
23/D4 32 X X X ω ______________ί ΓΌ
23/G4 32 X X X
Amicacina 32 X X X
Ceftadizime 32 X X X
Cefuroxima 32 X X X
Ácido nalidixic© 32 X X X
Teicoplanin 32 X X X
Aztreonam 32 X X X
Amoxacilina / Ác. clavulânico 32/18 X X X
Ampicilina / Sulbactam 32/16 X X X
Cefotaxima 64 X X X
24/F9 64 X X X
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Teste de Suscetibilidade Gram-positivo E. co//ATCC 25922 P. aeruginosa ATCC 27853 K. pneumoniae ATCC 13883
ANTIBIÒTICO/INIBIDOR CONTEÚDO pg AVALIAÇÃO
S I R S I R S I R
Cefoperazona 64 X X X
Cefotaxima 64 X X X
Ceftriaxone 64 X X X
Nitrofurantoina 128 X X X
Piperacilina/Tazobactam 128/4 X X X
Ticareilma/Ácido clavulâníco 128/4 X X X
Fosfomicina 200 X X X
Tabela 2. Sensibilidade ao Antibiótico de Bactérias Gram-negativas [0050] A Tabela 2 resume a atividade antibacteriana dos compostos de mitorriboscinas 24/F9, 24/D4 e 23/G4 em comparação com antibióticos conhecidos e através de três cepas bacterianas gram-negativas diferentes (E coii, P. aeruginosa, K. pneumoniae). O título da coluna S identifica sensibilidade, I identifica intermediário e R identifica resistente.
[0051] A fim de determinar a concentração inibitória mínima (MIC) para 24/F9, 24/D4 e 23/G4, o método de diluição em caldo foi realizado. Usando esse método, os resultados da determinação de MIC demonstraram concordância com o teste de suscetibilidade de difusão em disco.
26/32
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Concentração Imbitória mínima (comparar com antibióticos comuns) MIC pg/ml
ANTIBIÓTICO/INIBIDOR E. coli ATCC25922 P. aeruginosa ATCC27853 K. pneumoniae ATCC13883 Staph, aureus ATCC25923 Strept. pyogenes ATCC19615 C. albicans ATCC13883
50% 99% 50% 99% 50% 99% 50% 99% 50% 99% 50% 99%
24/D4 16 32 16 32 16 32 16 32 16 32 - >64
23/G4 >16 >32 16 32 16 32 4 8 4 8 8 16
24/F9 32 64 >32 >64 32 64 32 64 32 64 - >64
DOXICiCUNA 0,5 2 1 2 2 4 0,5 1 0,5 1 - >64
LINEZOLID 128 >128 64 256 128 256 1 2 1 2 -
AMOXICIUNA 16 >32 128 256 32 >64 4 8 4 8
MÍCONAZOL - - - - - - 0,5 1
Tabela 3. Concentrações Inibitórlas Mínimas (MIC): Cepas Bacterianas e Levedura Patogênica
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28/32 [0052] A Tabela 3 mostra os resultados da determinação da CIM obtidos em comparação com antibióticos conhecidos, contra as cepas bacterianas testadas e C. albicans. O composto 23/G4 apresenta a maior atividade e potência de amplo espectro, quando comparado com os compostos 24/F9 e 24/D4.
Concentração Inibitória mínima (comparar com antibióticos comuns) MIC pg/ml
ANTIBIÓTICO/INIBIDOR MRSA ATCC 43300 MSSA ATCC 25923
50% 99% 50% 99%
24/D4 16 >32 16 32
23/G4 16 >32 4 8
24/F9 64 >64 32 64
AMOXICILINA >64 >64 4 8
Tabela 4. Concentrações Inibitórias Mínimas (MIC): MRSA v. MSSA [0053] A Tabela 4 mostra que o Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) também é sensível a 23/G4 e 24/D4. Foi confirmado que esta cepa de MRSA era realmente resistente à amoxicilina, como previsto. Esse resultado mostra que pode ser possível usar essa nova estratégia de descoberta de fármacos que emprega células de câncer humano para isolar novos antibióticos que podem atacar bactérias resistentes a fármaco, tal como MRSA.
[0054] Os dados demonstram que as mitorriboscinas identificadas pela presente abordagem têm propriedades anticâncer, antibacterianas, e são adequadas para composições farmacêuticas.
[0055] Os inventores mostraram que compostos que induzem depleção aguda de ATP em células de câncer podem sensibilizar essas células para radiação, luz ultravioleta, agentes quimioterapêuticos, substâncias naturais e/ou restrição calórica. Mitorriboscinas, como discutido aqui, demonstraram efeitos de depleção de ATP. Com base
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29/32 nesses resultados preliminares, as mitorriboscinas também podem ser usadas como radio-sensibilizadores e/ou foto-sensibilizadores. O uso como radio-sensibilizadores e/ou foto-sensibilizadores pode ser em combinação com outros vetores de tratamento, incluindo mas não limitados a outros métodos de tratamento de câncer, como podem ser conhecidos na técnica, e tratamento de câncer através da inibição da biogênese mitocondrial como aqui descrito. Do mesmo modo, as mitorriboscinas podem ser utilizadas para sensibilizar funcionalmente massas de células cancerosas e as células-tronco cancerosas aos agentes quimioterapêuticos, produtos farmacêuticos e/ou outras substâncias naturais, tais como suplementos dietéticos e restrição calórica.
[0056] Além do comportamento anticâncer e antibiótico, os inibidores mitocondriais que podem ser identificados pela presente abordagem têm o potencial de retardar o processo de envelhecimento dos mamíferos. Foi demonstrado que a inibição genética da tradução da proteína mitocondrial tem efeitos colaterais benéficos e, em particular, o efeito colateral da desaceleração do processo de envelhecimento e o aumento da expectativa de vida em organismos modelo. Os níveis mais baixos de estado estacionário de Mrps5 (uma proteína mitorribossômica) estão fortemente correlacionados funcionalmente com uma maior longevidade em murinos, resultando em um aumento significativo de -250 dias. Além disso, o knockdown seletivo de Mrps5 em C. eiegans aumenta dramaticamente o tempo de vida. Vermes knockdown para Mrps5 mostram reduções significativas na respiração mitocondrial e produção de ATP. Similarmente, o knockdown dos homólogos de vermes do complexo mitocondrial I, III, IV e V, assim como várias enzimas do ciclo de TCA, todas prolongando a vida robustamente, implicando ainda mais na redução da atividade de OXPHOS e níveis mais baixos de ATP como mecanismo. Finalmente, a inibição farmacológica da biogênese mitocondrial (usando os efeitos fora do alvo da
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30/32 doxiciclina) também aumenta significativamente a longevidade em C. elegans. Assim, doses menores das mitorriboscinas podem ser usadas para direcionar terapeuticamente o processo de envelhecimento e prolongar a vida útil.
[0057] Mitorriboscinas também podem ser usadas para reverter a resistência a fármacos em células de câncer. Acredita-se que a resistência ao fármaco seja baseada, pelo menos em parte, no aumento da função mitocondrial nas células de câncer. Em particular, é esperado que as células de câncer que demonstram resistência às terapias endócrinas, tal como o tamoxifeno, tenham uma função mitocondrial aumentada. As mitorriboscinas inibem a função mitocondrial e, portanto, podem ser úteis na redução e, em alguns casos, na reversão da resistência ao fármaco em células de câncer.
[0058] As mitorriboscinas podem também ser usadas como contraceptives masculinos e/ou como agentes espermistáticos ou imobilizadores de espermatozóides. A célula espermática humana consiste em uma cabeça e um flagelo. O flagelo inclui um pescoço, uma parte intermediária e uma cauda. A parte intermediária tem tipicamente ΙΟΙ 4 espirais de mitocôndrias em torno do filamento axial no citoplasma. Estas mitocôndrias fornecem motilidade para o esperma e, portanto, são muitas vezes referidas como a força motriz do espermatozóide. Mitorriboscinas inibem a função mitocondrial e, portanto, podem ser úteis na imobilização de espermatozóides para prevenir a concepção.
[0059] A terminologia utilizada na descrição da invenção tem o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não pretende ser limitante da invenção. Tal como utilizado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas no singular um/uma e o/a destinam-se a incluir também as formas do plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. A invenção inclui numerosas alternativas, modificações e equivalentes, como se tornarão evidentes
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31/32 a partir da consideração da seguinte descrição detalhada.
[0060] Será entendido que, embora as expressões primeiro, segundo, terceiro, a), b), e c), etc. possam ser aqui utilizadas para descrever vários elementos da invenção não devem ser limitadas por estas expressões. Estas expressões são usadas apenas para distinguir um elemento da invenção do outro. Assim, um primeiro elemento discutido abaixo podería ser denominado um aspecto de elemento, e similarmente, um terceiro sem se afastar dos ensinamentos da presente invenção. Assim, as expressões primeiro, segundo”, terceiro, a), b), e c)'!, etc. não pretendem necessariamente transmitir uma sequência ou outra hierarquia aos elementos associados, mas são utilizadas apenas para fins de identificação. A sequência de operações (ou etapas) não está limitada à ordem apresentada nas reivindicações. [0061] A menos que definidas de outra maneira, todas as expressões (incluindo expressões técnicas e científicas) aqui utilizadas possuem o mesmo significado como normalmente compreendidas por pela pessoa versada na técnica a qual esta invenção pertence, será compreendido ainda que expressões, tais como aquelas definidas em dicionários comumente usados, devem ser interpretadas como tendo um significado que seja consistente com o seu significado no contexto do presente pedido e da técnica relevante e não devem ser interpretadas em um sentido idealizado ou excessivamente formal, a menos que expressamente definido aqui. A terminologia utilizada na descrição da invenção tem o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não pretende ser limitante da invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas estão incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito na terminologia, a presente especificação está controlando.
[0062] Também como usado aqui, e/ou se refere e engloba qualquer e todas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listaPetição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 101/110
32/32 dos associados, bem como a falta de combinações quando interpretadas na alternativa (ou).
[0063] A menos que o contexto indique o contrário, é pretendido especificamente que as várias características da invenção aqui descritas possam ser usadas em qualquer combinação. Além disso, a presente invenção também contempla que, em algumas modalidades da invenção, qualquer característica ou combinação de características aqui estabelecidas pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se a especificação declara que um complexo compreende os componentes A, B e C, é pretendido especificamente que qualquer um de A, B ou C, ou uma sua combinação, possa ser omitido e renunciado.
[0064] Como aqui utilizado, a frase transicional que consiste essencialmente em (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como abrangendo os materiais ou etapas citadas e aqueles que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada. Assim, a expressão que consiste essencialmente em como aqui utilizada não deve ser interpretado como equivalente a que compreende.
[0065] A expressão cerca de, como aqui utilizada quando se refere a um valor mensurável, tal como, por exemplo, uma quantidade ou concentração e semelhantes, pretende abranger variações de ± 20%, ± 10%, ± 5 %, ± 1%, ± 0,5% ou mesmo ± 0,1% da quantidade especificada. Um Intervalo fornecido aqui para um valor mensurável pode incluir qualquer outro intervalo e/ou valor individual.
[0066] Tendo assim descrito certas modalidades da presente invenção, deve ser entendido que a Invenção definida pelas reivindicações anexas não deve ser limitada por detalhes particulares estabelecidos na descrição acima, já que muitas variações aparentes da mesma são possíveis sem se afastar do seu espírito ou escopo, tal como reivindicado.

Claims (42)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Uma mitorriboscina.
  2. 2. Mitorriboscina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina compreende a fórmula geral:
    AA r A ......ri
    R ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  3. 3. Mitorriboscina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina compreende a fórmula geral:
    R
    R A A · <:
    ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  4. 4. Mitorriboscina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina compreende a fórmula geral:
    AAV'-'R ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  5. 5. Mitorriboscina de acordo com a reivindicação 1, caracte
    Petição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 7/110
    2/6 rizada peto fato de que a mitorriboscina compreende a fórmula geral:
    F J // /
    Ϊ s ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
  6. 6. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada peto fato de que R é selecionado do grupo que consiste em hidrogênio, carbono, nitrogênio, enxofre, oxigênio, flúor, cloro, bromo, iodo, carboxila, alcanos, alcanos cíclicos, derivados baseados em alcanos, alcenos, alcenos cíclicos, derivados baseados em alceno, alcinos, derivados baseados em alcinos, cetonas, derivados baseados em cetona, aldeídos, derivados baseados em aldeídos, ácidos carboxílicos, derivados baseados em ácidos carboxílicos, éteres, derivados baseados em éter, ésteres e derivados à base de ésteres, aminas, derivados à base de amina, amidas, derivados à base de amida, areno monocíclico ou policíclico, heteroarenos, derivados à base de areno, derivados à base de heteroareno, fenóis, derivados baseados em fenol, ácido benzoico, derivados baseados em ácido benzoico e um ou mais sinais de direcionamento mitocondrial.
  7. 7. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina possui atividade antienvelhecimento.
  8. 8. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina possui atividade de radiossensibilização.
    Petição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 8/110
    3/6
  9. 9. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina possui atividade de fotossensibilização.
  10. 10. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina sensibiliza as células de câncer aos agentes quimioterapêuticos.
  11. 11. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina sensibiliza as células de câncer às substâncias naturais.
  12. 12. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina sensibiliza as células de câncer à restrição calórica.
  13. 13. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina se liga à subunidade grande do ribossoma mitocondrial.
  14. 14. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina se liga à subunidade pequena do ribossoma mitocondrial.
  15. 15. Mitorriboscina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a mitorriboscina se liga à pelo menos uma das subunidades grandes do ribossoma mitocondrial ou subunidades pequenas do ribossoma mitocondrial.
  16. 16. Método de tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente eficaz da mitorriboscina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  17. 17. Método de tratamento de uma infecção bacteriana, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapeuticamente efi
    Petição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 9/110
    4/6 caz da mitorriboscina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  18. 18. Método de tratamento de uma condição relacionada à idade, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo, de uma quantidade terapêuticamente eficaz da mitorriboscina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
  19. 19. Composição farmacêutica para o tratamento de câncer, caracterizada pelo fato de que contém como ingrediente ativo pelo menos uma mitorriboscina.
  20. 20. Composição farmacêutica para o tratamento de uma infecção bacteriana, caracterizada pelo fato de que contém como ingrediente ativo pelo menos uma mitorriboscina.
  21. 21. Composição farmacêutica para o tratamento de uma infecção por levedura patogênica, caracterizada pelo fato de que contém como ingrediente ativo pelo menos uma mitorriboscina.
  22. 22. Composição farmacêutica para o tratamento do envelhecimento, caracterizada pelo fato de que contém como ingrediente ativo pelo menos uma mitorriboscina.
  23. 23. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma mitorriboscina compreende pelo menos uma mitoribociclina.
  24. 24. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma mitorriboscina compreende pelo menos uma mitoribomicina.
  25. 25. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma mitorriboscina compreende pelo menos uma mitoribosporina.
  26. 26. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que a pelo me
    Petição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 10/110
    5/6 nos uma mitorriboscina compreende peto menos uma mitoribofloxina.
  27. 27. Método de identificação de uma mitorriboscina usando o rastreamento virtual de alto rendimento e o rastreamento fenotipico de fármaco, caracterizado peto fato de que compreende:
    identificar a mitorriboscina que atinge o ribossoma mitocondrial usando o rastreamento virtual de alto rendimento;
    sintetizar a mitorriboscina; e testar a mitorriboscina quanto a atividade de inibição mitocondrial.
  28. 28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado peto fato de que a mitorriboscina se liga à subunidade grande do ribossoma mitocondrial.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a mitorriboscina se liga à subunidade pequena do ribossoma mitocondrial.
  30. 30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o rastreamento fenotipico de fármaco é um rastreamento de fármaco in vitro.
  31. 31. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o rastreamento fenotipico de fármaco compreende um ensaio de depleção de ATP.
  32. 32. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o rastreamento fenotipico de fármaco compreende um ensaio de taxa de acidificação extracelular.
  33. 33. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado peto fato de que o rastreamento fenotipico de fármaco compreende um ensaio de taxa de consumo de oxigênio.
  34. 34. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizado peto fato de que compreende ainda testar a mitorriboscina quanto a atividade anticâncer.
    Petição 870190091687, de 13/09/2019, pág. 11/110
    6/6
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a atividade anticâncer testada é a formação de mamosfera.
  36. 36. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a atividade anticâncer testada é a migração celular.
  37. 37. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende ainda testar a mitorriboscina quanto a atividade antimicrobiana.
  38. 38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a atividade antimicrobiana é testada usando o método de difusão em disco de Kirby-Bauer.
  39. 39. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que a atividade antimicrobiana é testada usando o ensaio de concentração inibitória mínima.
  40. 40. Composição farmacêutica para pelo menos um de contraceptive masculino, um agente espermistático e um agente imobilizador de espermatozóide, caracterizada pelo fato de que contém como ingrediente ativo pelo menos uma mitorriboscina.
  41. 41. Uso de pelo menos uma mitorriboscina e/ou mitoribofloxina, caracterizado por ser para preparar uma composição ou medicamento para o tratamento de câncer, de uma infecção bacteriana, de uma condição relacionada à idade, de uma infecção por levedura patogênica, para o tratamento do envelhecimento.
  42. 42. Invenção, em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso, englobadas pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.
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