KR102623283B1 - 미토리보신: 암 세포, 박테리아, 및 병원성 효모를 표적으로 하는 미토콘드리아 기반의 치료제 - Google Patents

미토리보신: 암 세포, 박테리아, 및 병원성 효모를 표적으로 하는 미토콘드리아 기반의 치료제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미토콘드리아 기능의 억제에 관한 것이다. 미토콘드리아 억제르 ㄹ위한 화합물의 스크리닝 방법이 개시된다. 또한, 미토리보신(항암 및 항생제 특성을 갖는 미토콘드리아 기반의 치료제 화합물)이라 불리는 미토콘드리아 억제제를 암, 박테리아 감염, 및 병원성 효모를 예방 또는 치료하기 위해 사용하는 방법뿐만 아니라, 항-노화의 유익을 제공하기 위해 미토콘드리아 억제제를 사용하는 방법이 개시된다. 구체적인 미토리보신 화합물 및 미토리보신의 군이 또한 개시된다.

Description

미토리보신: 암 세포, 박테리아, 및 병원성 효모를 표적으로 하는 미토콘드리아 기반의 치료제
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 인용에 의해 그 전체 내용이 본 명세서에 포함되는 2017년 3월 15일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/471,688호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 본 명세서에서 "미토리보신(mitoriboscin)"으로 나타낸 미토콘드리아 리보솜을 표적으로 하는 미토콘드리아 기능의 신규한 억제제, 미토리보신의 확인 방법, 암 줄기 세포를 표적으로 하고, 박테리아 및 병원성 효모를 표적으로 하며, 항노화의 유익을 제공하기 위한 상기 억제제의 이용 방법, 및 활성 성분으로서 하나 이상의 미토리보신을 함유하는 암, 박테리아 감염, 효모 감염, 및 노화의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
연구자들은 새로운 항암 치료법을 개발하기 위해 노력해 왔다. 종래의 암 치료법(예컨대, 방사선, 시클로포스파미드와 같은 알킬화제, 및 5-플루오로우라실과 같은 항-대사물질)은 세포 성장과 DNA 복제에 관여되는 세포 메커니즘을 간섭함으로써 빠르게 성장하는 암 세포를 선택적으로 검출 및 근절하기 위해 애써 왔다. 다른 암 치료법은 빠르게 성장하는 암 세포 상의 돌연변이체 종양 항원에 선택적으로 결합하는 면역치료법을 이용하였다(예컨대, 단일클론 항체). 불행하게도, 이러한 치료법 후에 종종 동일하거나 상이한 위치(들)에서 종양이 재발하며, 이는 모든 암 세포가 근절된 것은 아님을 나타낸다. 재발은 불충분한 화학치료제 복용량 및/또는 치료법에 저항성인 암 클론의 출현으로 인한 것일 수 있다. 따라서, 신규한 암 치료 전략이 필요하다. 유사하게, 연구자들은 새로운 항생제 치료법을 개발하기 위해 노력해 왔다. 항생제 저항성은 미생물 내에서의 무작위 돌연변이의 점진적인 축적과 항생제의 오용으로 인해 발생하였다. 항생제 연구 및 개발에서의 빈약한 재정적 투자는 이러한 상황을 악화시켰다. 따라서, 신규한 항생제 치료 전략이 필요하다.
돌연변이 분석에서의 진보는 암의 발생 동안에 일어나는 유전적 돌연변이의 심층 연구를 허용하였다. 게놈 경관(genomic landscape)의 지식을 갖고 있음에도 불구하고, 현대의 종양학은 암 서브타입에 걸쳐서 1차적인 동인(driver) 돌연변이를 확인하는데 어려움을 갖고 있다. 이러한 냉혹한 현실은 각각의 환자의 종양이 독특하고, 단일 종양이 다수의 분기성(divergent) 클론 세포를 함유할 수 있기 때문인 것으로 보인다. 따라서, 상이한 암 타입 사이의 공통성을 강조하는 새로운 접근법이 필요하다. 종양 및 정상 세포 사이의 대사적 차이점을 표적으로 하는 것은 신규한 암 치료 전략으로서 가능성을 유지한다. 인간 유방암 샘플 유래의 전사 프로파일링 데이터의 분석은 미토콘드리아 생물발생(biogenesis) 및/또는 미토콘드리아 번역과 연관된 95개 이상의 상승된 mRNA 전사체를 밝혔다[Sotgia et al., Cell Cycle, 11(23):4390-4401 (2012)]. 부가적으로, 95개의 상향조절된 mRNA 중 35개 이상이 미토콘드리아 리보솜 단백질(MRP)을 암호화한다. 마찬가지로 인간 유방암 줄기 세포의 프로테옴 분석은 몇 가지 미토리보솜 단백질뿐만 아니라 미토콘드리아 생물발생과 연관된 다른 단백질의 현저한 과발현을 밝혔다[Lamb et al., Oncotarget, 5(22):11029-11037 (2014)]. 어떤 정균적 항생제 또는 OXPHOS 억제제의 표적-외(off-target) 효과를 이용한 미토콘드리아 생물발생의 기능적 억제는 기능적인 미토콘드리아가 암 줄기 세포의 전파에 필요하다는 부가적인 증거를 제공한다.
본 기술분야에는 신규한 항암 전략, 넓은 스펙트럼의 항생제 활성을 갖는 새로운 화합물, 및 노화의 효과를 감소시키기 위한 화합물에 대한 필요성이 존재한다. "미토콘드리아 진화의 내-공생 이론"이 암의 재발 및 감염성 질환 모두에 특징적인 약물-저항성을 치료하기 위한 전략의 개발을 위한 기초로 사용될 수 있고, 이러한 치료법은 노화 공정을 늦추는 부가적인 유익을 가질 수 있다.
따라서, 전술한 배경을 고려하여, 본 발명의 목적은 미토콘드리아 생물발생이 많은 암의 전파 및 유지에 있어서 핵심적인 역할을 수행함을 보이는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 미토콘드리아 리보솜(큰 서브-유닛 또는 작은 서브-유닛)에 결합하고 항암 및 항생제 특성을 갖는 미토콘드리아 억제제를 확인하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 항암 및 항생제 특성을 갖는 미토콘드리아 억제제 및 그의 그룹을 확인하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 항-노화 특성을 갖는 미토콘드리아 억제제의 클래스를 확인하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 방사선증감제 및 광증감제로서 기능하는 미토콘드리아 억제제의 클래스를 확인하는 것이다.
본 발명은 항암 및 항미생물 활성, 방사선증감 및 광증감 효과뿐만 아니라 항-노화 효과를 갖는 미토콘드리아 억제제 화합물에 관한 것이다. "미토리보신"이란 용어는 대략적으로 항암 및 항생제 특성을 갖는 미토리보솜-표적화 치료제를 나타낸다. 상기 화합물은 상기 미토리보솜의 큰 서브-유닛 또는 작은 서브-유닛(또는 어떤 경우에는 양쪽 모두)에 결합하며, 미토콘드리아 생물발생을 억제한다. 본 발명은 또한 미토리보신의 확인 방법, 이러한 미토리보신의 제조 방법, 및 치료적 목적을 위한 미토리보신의 사용 방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 다양한 범위의 암 타입에 걸쳐서 표적이 될 수 있는 암 줄기 세포(CSC)의 표현형적 특성을 분석하였고, CSC의 클론 확장과 생존을 위하여 미토콘드리아 생물발생에 대한 CSC의 엄격한 의존성을 확인하였다. 본 발명자들에 의한 이전의 연구는 상이한 클래스의 FDA-승인된 항생제, 특히 독시사이클린 및 에리트로마이신과 같은 테트라사이클린은 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 표적-외 효과를 갖고 있음을 보여주었다. 그 결과, 이러한 화합물은 CSC를 근절하는 효과를 가질 수 있었다. 그러나, 상기 보통의 항생제는 미토리보솜을 표적으로 하도록 디자인되지 않았으며, 따라서 제한된 항암 특성을 갖는다. 본 발명의 접근법 하에, 본 발명자들은 미토콘드리아 리보솜, 또는 미토리보솜을 표적으로 하고 미토콘드리아 생물발생을 억제하는 화합물을 확인하였다. 따라서, 상기 미토리보솜-표적화 화합물인 미토리보신은 다른 유리한 특성들 중에서도 매우 강력한 항암 특성을 갖는다.
세포 전파에 있어서 미토콘드리아 생물발생의 역할을 고려할 때, 본 발명의 접근법 하에 확인된 것과 같은 미토콘드리아 억제제는 완전히 새로운 클래스의 암 치료법을 제공한다. 암 치료법으로서의 그 잠재적인 용도에 더하여, 미토리보신은 유용한 넓은-스펙트럼의 항생제로서 작용한다. 상기 미토콘드리아 진화의 내-공생 이론은 미토콘드리아 세포소기관(organelle)이 인걸프된(engulfed) 호기성 박테리아로부터 진화하였고, 이후 수 백만 년 동안 공생 및 적응되었음을 이론화한다. 미토콘드리아 세포소기관의 진화적 역사는 암 세포에서 미토콘드리아 단백질 번역을 표적화하는 화합물이 또한 항-미생물 활성을 갖고 있음을 제시한다. 실제로, 하기 논의한 것과 같이, 미토리보신은 항생제 특성을 나타내었다.
부가적으로, 미토콘드리아 단백질 번역의 유전적 억제에 관한 연구는 모델 유기체에서 노화 공정의 지연 및 증가된 수명과 같은 유익한 "부작용"을 보여주었다. 상기 결과는 미토콘드리아 억제제가 또한 항-노화 치료법용으로 유용할 수 있음을 제시하며, 이는 후속 연구의 주제이다.
신규한 미토콘드리아 억제제는 가상의 고속대량(high-throughput) 인 실리코(in silico) 스크리닝의 수렴성 접근법과, 이후의 미토콘드리아 억제에 대한 시험관내 검증을 통해 확인될 수 있다. 새로운 미토콘드리아 억제제는 인 실리코 약물 디자인과 표현형적 약물 스크리닝을 조합함으로써 신속하게 개발될 수 있다.
도 1은 미토콘드리아 진화의 내-공생 이론을 도시한다.
도 2는 본 발명의 접근법의 구현예에 따른 약물 발견 전략을 개략적으로 나타낸 계통도를 보여준다.
도 3은 MCF7 세포에서 ATP-결핍에 대한 10종의 후보 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다.
도 4a 내지 도 4d는 표현형적 약물 스크리닝 후에 확인된 10종의 미토리보신 화합물의 화학적 구조를 도시한다. 상기 구조는 다음의 4가지 그룹으로 분류된다 - 미토리보사이클린(도 4a 상의 화합물 a-c), 미토리보마이신(도 4b 상의 화합물 d-g), 미토리보스포린(도 4c 상의 화합물 h 및 i), 및 미토리보플록신(도 4d 상의 화합물 j).
도 5는 MCF7 세포에서 맘모스피어(mammosphere) 형성에 대한 7 종의 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다.
도 6a는 MCF7 세포의 세포 생존능에 대한 3 종의 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다. 도 6b는 hTERT-BJ1 세포의 세포 생존능에 대한 3 종의 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다.
도 7a는 MCF7 세포에서 시간에 따른 산소 소비 속도(OCR)에 대한 화합물 23/G4의 효과를 보여준다. 도 7b는 MCF7 세포에서 시간에 따른 세포외 산성화 속도(ECAR)에 대한 화합물 23/G4의 효과를 보여준다. 도 7c는 기저 호흡, 양성자 누출, ATP-연계 호흡, 최대 호흡, 및 예비 호흡 용량에 대하여 OCR에 대한 화합물 23/G4의 효과를 보여준다. 도 7d는 해당작용, 해당작용 비축물, 및 해당작용 비축물 용량에 대하여 ECAR에 대한 화합물 23/G4의 효과를 보여준다.
도 8a는 MCF7 세포에서 시간에 따른 산소 소비 속도(OCR)에 대한 화합물 24/D4의 효과를 보여준다. 도 8b는 MCF7 세포에서 시간에 따른 세포외 산성화 속도(ECAR)에 대한 영향을 보여준다. 도 8c는 기저 호흡, 양성자 누출, ATP-연계 호흡, 최대 호흡, 및 예비 호흡 용량에 대하여 OCR에 대한 화합물 24/D4의 효과를 보여준다. 도 8d는 해당작용, 해당작용 비축물, 및 해당작용 비축물 용량에 대하여 ECAR에 대한 화합물 24/D4의 효과를 보여준다.
도 9a는 MCF7 세포에서 시간에 따른 산소 소비 속도(OCR)에 대한 화합물 24/F9의 효과를 보여준다. 도 9b는 MCF7 세포에서 시간에 따른 세포외 산성화 속도(ECAR)에 대한 화합물 24/F9의 효과를 보여준다. 도 9c는 기저 호흡, 양성자 누출, ATP-연계 호흡, 최대 호흡, 및 예비 호흡 용량에 대하여 OCR 에 대한 화합물 24/F9의 효과를 보여준다. 도 9d는 해당작용, 해당작용 비축물, 및 해당작용 비축물 용량에 대하여 ECAR에 대한 화합물 24/F9의 효과를 보여준다.
도 10a는 MCF7 세포에서 최대 호흡에 대한 10 종의 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다. 도 10b는 MCF7 세포에서 ATP 생산에 대한 10 종의 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다.
도 11은 MDA-MB-231 세포에서 세포 이동에 대하여 2가지 상이한 농도에서 3 종의 미토리보신 화합물의 효과를 보여준다.
도 12는 다음의 4가지 새로운 클래스의 미토콘드리아 억제제인 미토리보사이클린, 미토리보마이신, 미토리보스포린, 및 미토리보플록신을 도시한다.
다음의 기재는 본 발명의 접근법의 구현예를 본 발명의 접근법을 실행할 수 있도록 충분히 상세하게 설명한다. 본 발명의 접근법이 상기 구체적인 구현예를 참조하여 개시되지만, 본 발명의 접근법은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 이러한 개시가 임의의 첨부된 청구항을 본 명세서에 개시된 특정 구현예로 제한하는 것을 의도하는 것은 아님이 인식되어야 한다. 오히려, 상기 구현예는 이러한 개시가 철저하고 완전하며, 본 기술분야의 기술자에게 본 발명의 접근법의 범위를 충분히 전달하기 위하여 제공된다.
미토콘드리아 리보솜은 암으로부터 박테리아 및 진균의 감염 및 노화에 이르는 범위의 다수의 고통을 치료하기 위한 미지의 관문이다. 기능적 미토콘드리아는 암 줄기 세포의 전파를 위해 필요하다. 암 세포에서 미토콘드리아 생물발생을 억제하면 상기 세포의 전파가 지연된다. 따라서, 미토콘드리아 억제제는 새로운 클래스의 항암 치료법을 나타낸다. 상기 화합물은 또한 미토콘드리아 단백질 번역을 억제할 수 있고, 따라서 항-미생물 활성을 갖는다. 그 결과, 미토콘드리아 억제제는 박테리아 및 병원성 효모 모두를 표적으로 하는 넓은 스펙트럼의 항생제로 기능할 수 있다. 연구는 또한 미토콘드리아 억제제가 항-노화 특성을 갖고 있음을 보여주었다. 본 명세서에서는 "미토리보신"이란 용어를 항암 및 항생제 특성을 갖는 미토콘드리아 기반의 치료제 화합물을 대략적으로 개시하기 위해 사용한다. 낮은 용량에서 미토리보신은 노화 공정을 치료적으로 표적화하고 수명을 연장하기 위해 사용될 수 있다.
미토리보솜을 표적으로 하는 신규한 미토콘드리아 억제제인 미토리보신은 가상의 고속대량 스크리닝의 수렴성 접근법과, 이후의 미토콘드리아 억제에 대한 생체내 검증을 통해 확인될 수 있다. 도 2는 본 명세서에 개시된 인 실리코 약물 스크리닝과 표현형적 약물 스크리닝을 이용함으로써 미토콘드리아 억제제를 확인하기 위한 방법의 개요이다. 포유동물 미토콘드리아 리보솜(미토리보솜)의 3차원 구조의 전부 또는 일부가 가상의 고속대량 스크리닝(vHTS)을 통해 미토리보솜에 결합하는 신규한 화합물을 확인하기 위해 단계 S101에서 사용될 수 있다(즉, 인 실리코 약물 스크리닝). 상기 스크리닝은 분자의 라이브러리에 대해 수행될 수 있다. 예를 들면, 초기 연구 동안에 본 발명자들은 50개 이상의 서브유닛을 갖는 다수-서브유닛 콤플렉스인 큰 미토리보솜(39S)의 공지된 큰 서브유닛의 어딘가에 결합할 것으로 기대되는 화합물을 위하여 45,000개 소분자 화합물의 컬랙션을 스크리닝하였다. 초기 vHTS는 포유동물 미토리보솜의 큰 또는 작은 서브유닛에 강한 결합 친화도를 갖는 화합물의 서브세트를 확인하기 위하여 eHiTS 스크리닝 프로그램과 같은 다양한 스크리닝 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 eHiTS를 사용하여 포유동물 미토리보솜의 큰 서브유닛(39S)에 대한 예측되는 결합 친화도에 기반하여 초기 라이브러리로부터 상위 5,000개 순위의 화합물을 확인하였다. eHiTS는 심각한 입체적 충돌을 피하는 입체형태 및 위치 검색 공간 부분을 시스템적으로 커버하는 스크리닝 방법으로서, 가상의 고속대량 스크리닝용으로 매우 적합한 속도에서 매우 정확한 도킹 포즈를 생성한다.
본 기술분야의 통상의 기술자는 원하는 결합 친화도를 갖는 화합물의 서브세트를 확인하기 위한 방법을 선택 및 개발할 수 있음이 인식되어야 한다. 상기 도킹을 효율적으로 수행하기 위하여, 일련의 클립 파일이 전체 단백질 구조에 대응하여 준비되고, 각각의 화합물이 순차적으로 각각의 상기 클립 파일에 도킹될 수 있다. 상위 화합물의 콘센서스 점수화는 eHiTS 스크리닝으로부터 예측되는 각각의 화합물에 대한 동일한 일반적 결합 부위에 기반하여 AutoDock 4.2를 이용해 수행될 수 있다. 예측된 결합 친화도 및 시각적 검사에 대한 추가적인 분석이, 예를 들면, SPROUT와 같은 데 노보(de novo) 디자인 프로그램을 포함하는 다수의 방법을 이용해 수행될 수 있다. SPROUT에 대한 정보를 위해서는 인용에 의해 그 전체 내용이 포함되는 [Law et al., J Mol Struct . 666: 651-657 (2003)] 참조. 초기 라이브러리 크기 및 결과에 따라, 표현형적 약물 스크리닝을 위한 다수의 화합물이 선택될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 단계 S103에서 표현형적 약물 스크리닝을 위하여 상기 분석 단계에서 잘 수행하는 880개 화합물을 선택하였다.
표현형적 약물 스크리닝(S103)은 선택된 세포주에서 선택된 화합물의 미토콘드리아 억제를 테스트함으로써 달성될 수 있다. 예를 들면, ATP 고갈 분석법이 사용될 수 있다. 본 발명자들은 MCF7 인간 유방암 세포에서 ATP-고갈을 기능적으로 유도하는 능력에 대해 상기 선택된 880개 화합물을 테스트하였다. 대략 85%의 세포 ATP는 보통 미토콘드리아에서 OXPHOS에 의해 생성되며, 따라서 ATP 고갈은 미토콘드리아 억제에 대한 대체 마커이다. 본 기술분야의 기술자는 미토콘드리아 억제를 위한 다른 대체법을 도입할 수 있음이 인식되어야 한다. 그러나, 본 발명자들이 도입한 상기 ATP 고갈 분석법의 경우, MCF7 세포(6,000 세포/웰)를 검은 투명 바닥 96-웰 플레이트에 플레이팅하였고, 처리 전에 밤새 인큐베이션하였다. vHTS에 의해 확인된 상기 880개 화합물을 상기 플레이팅된 MCF7 세포에 50 μM의 농도로 적용하였고, ATP 고갈을 위해 스크리닝하였다. 이어서, ATP 고갈 효과를 보이는 화합물을 더 낮은 농도(25 μM 및 10 μM)에서 다시 스크리닝하여 가장 강력하게 ATP 고갈을 유도하는 상위 10개 화합물을 확인하였다. 72시간의 인큐베이션 후에 화합물을 테스트하였고, 실험을 중복해 수행하였다. 처리 후, 배지를 상기 웰로부터 흡인하였고, 플레이트를 Ca2 + 및 Mg2 +로 보충된 따뜻한 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 세척하였다. 이후, 세포를 Hoechst 33342(Sigma) 염색 용액(10 ㎍/㎖)으로 30분 동안 배양하였고, PBS로 세척하여 세포 생존능을 추정하였다. 355/460-㎚에서 여기/방출 파장을 이용해 플레이트 판독기로 형광을 판독하였다. 이후, CellTiter-Glo 발광 분석법(Promega)을 수행하여 해당 화합물로 처리된 바로 그 동일한 웰에서의 대사 활성(ATP 함량)을 측정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 분석법을 수행하였다. 형광 강도(Hoechst 염색) 및 발광 강도(ATP 함량)를 비히클(vehicle)-단독 처리된 대조군에 대해 표준화하였고, 비교를 위해 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 상기 ATP 고갈 연구의 결과는 도 3에 나타나 있다. 도 3은 10개의 모든 테스트 화합물이 살아있는 세포에서 ATP 레벨을 현저하게 고갈시켰음을 보여준다. 본 기술분야의 기술자는 동일하거나 유사한 ATP 고갈 분석법을 도입하도록 선택하고, 이러한 분석법을 변형하고, 또는 상기 ATP 고갈 분석법을 미토콘드리아 억제를 위해 선택된 화합물을 스크리닝하기 위한 다른 방법론(예컨대, 산소 소비 분석법)으로 교체할 수 있음이 인식되어야 한다.
본 발명의 접근법은 세포 생존능을 확인하는 방법을 포함한다. 본 기술분야의 기술자는 특정 구현예에 적합한 세포 생존능을 확인하기 위한 하나 이상의 방법을 선택할 수 있다. 본 발명자들은 처음에는 세포 단백질 함량의 측정에 기반하는 설포로다민(SRB) 분석법을 사용하였다. 96-웰 플레이트에서 72시간 동안 처리한 후, 세포를 10% 트리클로로아세트산(TCA)으로 저온실에서 1시간 동안 고정하였고, 실온에서 밤새 건조시켰다. 이후, 세포를 SRB로 15분 동안 인큐베이션하였고, 1% 아세트산으로 2회 세척하였으며, 적어도 1시간 동안 공기 건조시켰다. 마지막으로, 단백질-결합된 염료를 10 mM Tris, pH 8.8 용액에 용해시켰고, 540-㎚에서 플레이트 판독기를 이용해 판독하였다. 상기 SRB 분석법을 이용하여, 본 발명자들은 현저한 세포독성 없이 ATP 레벨을 고갈시키는 화합물만을 추가적인 분석을 위해 선별하였다. 현저한 세포독성은 30% 이하의 세포가 플레이트 상에 여전히 있는 것으로 정의하였다. 물론, 다른 세포 생존능 확인 방법론을 도입하는 구현예는 본 기술분야에 알려져 있을 수 있는 다른 고려사항에 기반하여 추가적인 분석을 위해 화합물을 선별할 수 있다.
본 발명의 접근법은 단계 S105에서 기능적 검증 방법을 추가로 수반하며, 그 동안 미토콘드리아 억제제로서의 화합물의 기능이 확인될 수 있다. 예를 들면, 대사성 플럭스 분석, 맘모스피어 분석법, 생존능 분석법, 및 항생제(항-박테리아 및/또는 항-진균) 활성을 포함하는 다수의 방법이 기능적 검증을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 시호스 세포외 플럭스(Seahorse Extracellular Flux)(XF96) 분석기(Seahorse Bioscience, MA, USA)를 이용하여 MCF7 세포에 대해 세포외 산성화 속도(ECAR) 및 실시간 산소 소비 속도(OCR)를 결정하였다. MCF7 세포는 10% FBS(우 태아 혈청), 2 mM GlutaMAX, 및 1% Pen-Strep으로 보충된 DMEM에서 유지되었다. 웰 당 5,000개 세포를 XF96-웰 세포 배양 플레이트에 분주하였고, 5% CO2 가습 대기에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포를 다양한 농도(또는 비히클 단독)에서 현저한 세포독성 없이 ATP-고갈을 보여주는 선택된 화합물로 처리하였다. 처리 72시간 후, 세포를 미리 데운 XF 분석 배지(OCR 측정의 경우, XF 분석 배지는 10 mM 글루코오스, 1 mM 피루베이트, 2 mM L-글루타민으로 보충되었고, pH 7.4로 조정되었음)에서 세척하였다. 세포를 비-CO2 인큐베이터에서 37℃에서 1시간 동안 175 ㎕/웰의 XF 분석 배지에서 유지하였다. 인큐베이션 동안에, XF 분석 배지 내에 25 ㎕의 80 mM 글루코오스, 9 μM 올리고마이신, 1 M 2-데옥시글루코오스(ECAR 측정의 경우) 및 25 ㎕의 10 μM 올리고마이신, 9 μM FCCP, 10 μM 로테논, 10 μM 안티마이신 A(OCR 측정의 경우)를 XFe-96 센서 카트리지의 주입 포트 내에 로딩하였다. 실험 동안에, 상기 기기는 해당 시점에서 웰 내로 상기 억제제들을 주입하면서, ECAR/OCR을 연속해서 측정하였다. ECAR 및 OCR 측정을 (상기 설포로다민 B 분석법을 이용하여) 단백질 함량에 의해 표준화하였다. 일원(one-way) ANOVA 및 스튜던트 t-테스트 계산을 이용하여 XFe-96 소프트웨어에 의해 데이터 세트를 분석하였다. 모든 실험은 3중으로 수행하였고, 본 명세서에 개시된 미토리보신 화합물의 미토콘드리아 억제 효과에 대한 결과를 검증하였다. 기능적 검증을 위한 다수의 방법이 알려져 있고, 본 기술분야의 기술자는 검증 필요성에 따라 하나 이상(예컨대, 미토콘드리아 기능을 측정하거나 근사하는 다른 분석법)을 선택할 수 있음이 인식되어야 한다.
요약하면, 본 발명의 접근법은 인 실리코 약물 스크리닝 및 표현형적 약물 스크리닝을 이용하여 잠재적인 미토콘드리아 억제제 및 미토리보신을 확인하는 방법을 제공한다. 상기 방법론을 이용하여 확인된 신규한 화합물은 항암 활성(예컨대, 맘모스피어 형성 및 세포 이동을 억제하는 능력)에 대해 테스트될 수 있고, 항-미생물 활성을 조사하기 위하여 별개의 박테리아 및/또는 효모 균주에 대해 추가로 테스트될 수 있다. 도 2는 본 발명의 접근법의 구현예에 따른 일반적인 방법을 요약하지만, 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 접근법을 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 구체적인 실시예로부터 변동될 수 있음이 인식되어야 한다.
본 발명의 접근법은 항암, 항-미생물, 및 항-노화 특성을 갖는 미토콘드리아-억제 화합물, 특히 미토리보신의 카테고리를 확인할 수 있게 한다. 본 발명자들의 초기 스크리닝 및 검증에 기반하여, 도 4에서 확인된 화합물은 항암, 항-미생물, 및 항-노화 특성을 갖는다. 따라서, 상기 특유의 미토리보신은 임상 시험의 후보물질이다. 도 4에서 확인된 미토리보신은 제한적인 것이 아니며, 단지 본 명세서에 개시된 신규한 방법론을 이용하여 지금까지 확인된 화합물일 뿐임이 인식되어야 한다.
도 4a 내지 도 4d 및 도 12에 나타낸 것과 같은 4가지 그룹의 미토리보신이 확인되었다. 도 12에 나타낸 미토리보신 그룹인 미토리보사이클린, 미토리보마이신, 미토리보스포린, 및 미토리보플록신은 항암제, 항생제, 및/또는 항-노화 치료제로 사용하기 위해 선택될 수 있다. 특정 치료법을 위한 각각의 화합물의 치료적 유효량은 다수의 인자들에 의존할 것임이 본 기술분야의 기술자에 의해 인식되어야 한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 미토리보신 그룹 유래의 화합물의 조합이 항암제, 항생제, 및/또는 항-노화 치료제로 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 미토리보신 화합물은 하기 일반식 또는 그의 염을 포함한다:
상기에서, 각각의 R은 동일하거나 상이할 수 있으며, 수소, 탄소, 질소, 황, 산소, 불소, 염소, 브롬, 요오드, 카르복실, 알칸, 시클릭 알칸, 알칸계 유도체, 알켄, 시클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알킨, 알킨계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데히드, 알데히드계 유도체, 카르복시산, 카르복시산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아미노계 유도체, 아미드, 아미드계 유도체, 단환식(monocyclic) 또는 다환식(polycyclic) 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 벤조산계 유도체, 및 하나 이상의 미토콘드리아 표적화 신호물질로 이루어진 군으로부터 선택된다. 명확하게 하기 위하여, 미토콘드리아 표적화 신호물질은 부착된 분자를 미토콘드리아로 표적화하는 효율을 증가시키는 임의의 화학물질 또는 펩티드 개체(entity)로 정의된다. 이러한 변형은 미토리보신의 효능 및 효과를 증가시킬 것으로 기대될 것이다. 따라서, R은 다른 것들 중에서도 트리-페닐-포스포늄(TPP)과 같은 양이온성 화합물, 구아니디늄계 모이어티(moiety) 및/또는 콜린 에스테르를 포함하는 임의의 미토콘드리아 표적화 신호물질(펩티드 또는 화학물질)일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 미토리보신 화합물은 하기 일반식 또는 그의 염을 포함한다:
상기에서, 각각의 R은 동일하거나 상이할 수 있으며, 수소, 탄소, 질소, 황, 산소, 불소, 염소, 브롬, 요오드, 카르복실, 알칸, 시클릭 알칸, 알칸계 유도체, 알켄, 시클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알킨, 알킨계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데히드, 알데히드계 유도체, 카르복시산, 카르복시산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아미노계 유도체, 아미드, 아미드계 유도체, 단환식 또는 다환식 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 벤조산계 유도체, 및 하나 이상의 미토콘드리아 표적화 신호물질로 이루어진 군으로부터 선택된다
일부 구현예에서, 상기 미토리보신 화합물은 하기 일반식 또는 그의 염을 포함한다:
상기에서, R은 수소, 탄소, 질소, 황, 산소, 불소, 염소, 브롬, 요오드, 카르복실, 알칸, 시클릭 알칸, 알칸계 유도체, 알켄, 시클릭 알켄, 알켄계 유도체, 알킨, 알킨계 유도체, 케톤, 케톤계 유도체, 알데히드, 알데히드계 유도체, 카르복시산, 카르복시산계 유도체, 에테르, 에테르계 유도체, 에스테르 및 에스테르계 유도체, 아민, 아미노계 유도체, 아미드, 아미드계 유도체, 단환식 또는 다환식 아렌, 헤테로아렌, 아렌계 유도체, 헤테로아렌계 유도체, 페놀, 페놀계 유도체, 벤조산, 벤조산계 유도체, 및 하나 이상의 미토콘드리아 표적화 신호물질로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 상기 미토리보신 화합물은 하기 일반식 또는 그의 염을 포함한다:
도 4에 나타낸 식의 구체적인 미토리보신은 도 12에서 확인된 미토리보신 그룹의 구체적인 예를 보여준다. 상기 미토리보신은 개별적으로, 또는 하나 이상의 구체적인 미토리보신, 및/또는 다른 치료제의 효능을 향상시키기 위한 다른 물질들과 조합하여 치료적 용도로 선택될 수 있음이 인식되어야 한다. 상기 치료제는 하나 이상의 공지된 방법을 이용하여 제조될 수 있는 보통의 약학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들면, 약학적 조성물은, 예를 들면, 본 기술분야에 알려진 것과 같은 하나 이상의 충진제, 팽화제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 표면활성제, 윤활제 등과 같은 희석제 또는 부형제를 이용해 제조될 수 있다. 다양한 타입의 투여 단위 형태는 치료 목적(들)에 따라 선택될 수 있다. 약학적 조성물의 형태의 예는 정제, 알약, 분말, 액체, 현탁액, 유탁액, 과립, 캡슐, 좌약, 주사용 제제(용액 및 현탁액), 국소 크림, 및 본 기술분야에 공지된 것과 같은 다른 형태를 비제한적으로 포함한다. 정제의 형태로 약학적 조성물을 형태화하기 위한 목적으로, 공지된 임의의 부형제, 예를 들면, 락토오스, 백설탕, 염화나트륨, 글루코오스, 요소, 전분, 탄산칼슘, 카올린, 시클로덱스트린, 결정성 셀룰로오스, 규산 등과 같은 담체; 물, 에탄올, 프로판올, 단일 시럽, 글루코오스 용액, 전분 용액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸 셀룰로오스, 쉘락, 메틸 셀룰로오스, 인산칼륨, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 결합제;가 사용될 수 있다. 부가적으로, 건조 전분, 알긴산나트륨, 아가 분말, 라미날리아 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르, 나트륨 라우릴설페이트, 스테아르산의 모노글리세라이드, 전분, 락토오스 등과 같은 붕해제가 사용될 수 있다. 백설탕, 스테아린, 코코넛 버터, 수소화 오일과 같은 붕해 억제제; 4차 암모늄 염기, 나트륨 라우릴설페이트 등과 같은 흡수 가속화제;가 사용될 수 있다. 글리세린, 전분, 및 본 기술분야에 공지된 다른 것들과 같은 습윤제가 사용될 수 있다. 예를 들면, 전분, 락토오스, 카올린, 벤토나이트, 콜로이드성 규산 등과 같은 흡착제가 사용될 수 있다. 정제된 탈크, 스테아레이트, 붕산 분말, 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 윤활제가 사용될 수 있다. 만일 정제를 원한다면, 정제는 보통의 코팅 물질로 추가로 코팅되어서, 상기 정제를 당의정, 젤라틴 필름 코팅 정제, 장용 코팅물로 코팅된 정제, 필름으로 코팅된 정제, 이중층 정제 및 다중층 정제로 제조할 수 있다. 국소 투여용으로 도입된 약학적 조성물은 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 포말, 스프레이, 에어로졸, 또는 오일로 제형화될 수 있다. 이러한 약학적 조성물은 보존제, 약물 침투를 도와주는 용매, 공용매, 연화제, 추진제, 점도 변형제(겔화제), 계면활성제 및 담체를 비제한적으로 포함하는 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 접근법은 항암 특성을 위하여 화합물, 특히 미토리보신의 테스트 방법을 수반한다. 상기 논의한 것과 같이, vHTS 및 컴퓨터 화학이 미토콘드리아 억제제 후보물질을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 상기 후보물질은 특정 항암 특성을 위해 테스트될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은 MCF7 세포에서 맘모스피어 형성을 억제하는 능력에 대하여 7 종의 후보 화합물을 병행해 비교하였다. 도 5는 테스트된 7 종의 화합물 중 5 종이 5 μM의 농도에서 맘모스피어 형성을 얼마나 현저하게 억제하는지를 도시한다. 예를 들면, 23/G4(그룹 1)은 상기 농도에서 맘모스피어 형성을 50%까지 감소시켰다. 유사하게, 24/F9(그룹 2) 및 24/D4(그룹 3)은 모두 맘모스피어 형성을 ∼90%까지 감소시켰다.
상기 분석에 기반하여, 본 발명자들은 MCF7 세포 단일층 및 정상 인간 섬유아세포(hTERT-BJ1 세포)에서 전체 생존능에 대한 상기 3종의 후보물질의 기능적 효과를 평가하였다(도 6). 23/G4(그룹 1)는 5 μM의 농도에서 MCF7 세포의 생존능을 70%까지 감소시켰다. 그러나, 23/G4는 동일한 농도에서 테스트되었을 때 hTERT-BJ1 세포의 생존능에 영향을 미치지 않았다. 따라서, CSC 및 "벌크" 암 세포를 우세하게 표적화하지만 정상 섬유아세포는 표적화하지 않는 23/G4과 같은 화합물을 확인하는 것이 가능하다. 본 기술분야의 기술자는 상기와 동일한 방법 또는 본 기술분야에 공지된 다른 방법을 도입하여 후보 미토리보신의 우세한 표적화를 결정할 수 있다.
본 발명의 접근법은 미토리보신 화합물의 기능 검증 방법을 수반한다. 예를 들면, 본 발명자들은 산소 소비 속도(OCR) 및 세포외 산성화 속도(ECAR)를 정량적으로 측정하는 시호스 분석기를 이용하여 3 종의 후보물질의 기능 검증을 평가하였다. OCR은 OXPHOS에 대한 대체 마커이고, ECAR은 해당작용 및 L-락테이트 생산에 대한 대체 마커이다.
본 발명자들의 결과는 23/G4(그룹 1), 24/F9(그룹 2) 및 24/D4(그룹 3) 모두 MCF7 세포에서 미토콘드리아 산소 소비를 용량-의존적으로 억제하고, 23/G4이 가장 강력하였음을 나타내었다(도 7, 8 및 9). 23/G4는 단지 500 nM의 농도에서 ATP 레벨을 >50%까지 감소시켰다. 또한, 23/G4는 2.5 μM에서 ATP 레벨을 ∼75%까지 감소시켰다(도 7). 주목할 것은, 23/G4을 이용한 처리는 동일한 농도에서 MCF7 단일층의 전체 세포 생존능에 대한 영향이 없거나 거의 없었다(도 6). 따라서, 23/G4는 현저한 세포독성을 보이지 않고 ATP 레벨을 매우 효과적으로 고갈시켰다.
상기 데이터는 23/G4는 해당작용 속도에 있어서 1.5배 이상의 증가를 유도하였지만, 24/F9 및 24/D4는 모두 해당작용을 저해하였음을 보여주었다. 이것은 24/F9 및 24/D4가 상기 맘모스피어 분석법에서 23/G4보다 강력한지에 대한 이유를 설명할 수 있으며, 여기서 24/F9 및 24/D4는 모두 5 μM의 농도에서 맘모스피어 형성을 ∼90%까지 감소시켰다(도 5). ⅰ) 최대 호흡 및 ⅱ) ATP 생산을 감소시키는 능력에 대한 상위 10개 히트(hit)의 효능 순위는 도 10에 나타나 있다. 이와 관련하여, 상위 6개 화합물은 23/G4, 25/B3, 24/H9, 24/F9, 23/E9 및 24/H6였고, 이들 중 23/G4가 가장 강력하였으며, 5 μM에서 ATP 레벨을 75% 이상 감소시켰음을 주목해야 한다.
EMT 및 세포 침입은 "줄기세포능(stemness)" 및 원거리 전이와 연관된 표현형적 특징이므로, 보다 공격적인 다른 유방암 세포주인 MDA-MB-231이 세포 이동을 하는 능력에 대한 상기 화합물의 효과를 평가하였다. 도 11은 23/G4, 24/D4 및 24/F9가 모두 2.5 μM의 농도에서 70% 이상 세포 이동을 억제하였음을 보여준다.
본 발명의 접근법은 맘모스피어 형성 및 세포 이동에 대한 화합물의 효과를 고려함으로써 항암 특성에 대해 화합물을 테스트하게 한다. 본 명세서에 개시된 방법을 이용함으로써, 23/G4(그룹 1)는 전망있는 새로운 선도 화합물인 것으로 보이는데, 왜냐하면 CSC 및 암 세포의 표적화에 보다 선택적이면서 정상 세포에는 영향을 미치지 않기 때문이다(도 6). 23/G4는 미토콘드리아 ATP 레벨을 효과적으로 감소시키고 해당작용을 유도하는 가장 강력한 히트 화합물이다. 본 기술분야의 기술자는 본 발명의 접근법으로부터 벗어나지 않으면서 특정 세포주에 대한 후보 미토콘드리아 억제제의 효과를 평가하기 위하여 본 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용할 수 있음이 인식되어야 한다. 상기 억제제는 암 줄기 세포(CSC)를 표적으로 하기 때문에, 본 기술분야의 기술자는 또한 다른 타입의 암에 대한 후보 미토콘드리아 억제제의 효과를 평가할 수 있음이 인식되어야 한다. CSC는 대부분의 암 타입에 걸쳐서 보존된 특징을 보인다. 표적-외 효과로서 미토콘드리아 리보솜에 결합하는 독시사이클린 및 에리트로마이신과 같은 항생제는 8가지 상이한 암 타입을 나타내는 12가지 상이한 세포주에서 효능을 보인다. 이들은 다음을 포함한다: 관상피내암(DCIS), 유방, 췌장, 폐 암종뿐만 아니라 흑색종 및 교모세포종.
도 1은 수 백만 년에 걸친 공생 및 적응으로 호기성 박테리아가 미토콘드리아 세포소기관으로 진화하는 것을 묘사한다. 상기 진화 이론의 측면에서, 암 세포에서 미토콘드리아 단백질 번역을 표적으로 하는 화합물은 또한 항-미생물 활성을 가질 수 있다. 본 발명의 접근법은 항-미생물 활성에 대한 화합물의 테스트 방법뿐만 아니라, 항-미생물 활성을 갖는 신규한 화합물을 제공한다. 미토콘드리아 억제제가 넓은 스펙트럼의 항생제로서 기능하는 것을 입증하기 위하여, 본 발명자들은 2가지 그람-양성 박테리아 균주(Staph. aureus 및 Strep. pyogenes) 및 3가지 그람-음성 박테리아 균주(E. coli , P. aeruginosa , K. pneumoniae), 및 병원성 효모 균주(C. albicans)에 대하여 상기 상위 3종의 화합물의 항-미생물 활성을 테스트하였다.
후보 미토콘드리아 억제제의 항-미생물 효과는 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute) 지침에 따라 수행되는 커비-바우어(Kirby-Bauer) 디스크-확산 방법을 이용해 평가될 수 있으며, 그 결과는 CLSI 중단점(breakpoint)을 이용해 해석된다. 그람 (+ve) 및 그람 (-ve) 박테리아(Oxoid™ 제품)에 대한 항생제 디스크가 양성 대조군으로 사용될 수 있다. 본 발명자들은 다음의 방법론에 기반하여 본 명세서에 개시된 소정의 미토리보신의 항생제 효과를 평가하였다. 본 명세서에서 확인된 화합물 24/D4, 24/F9, 및 23/G4는 이들을 디메틸 설폭사이드(DMSO, Sigma/Aldrich Company; St. Louis, MO, USA)에 용해시켜 준비하였고, 이를 블랭크 항-미생물 민감성 디스크(Oxoid™)에 스며들게 하였다. 테스트된 박테리아를 밤새 배양한 후, 멸균 면봉으로 아가 플레이트 상에 접종하기 전에 0.5 McFarland 표준물(106 CFU/㎖)의 탁도로 조정하였다. 상기 세포 배양물에 침지시킨 면봉을 아가 플레이트 표면에 스트리킹하여 전체 표면에 걸쳐서 박테리아의 균일한 층을 수득하였다. 10-15분 후, 상기 항생제 디스크 또는 신규한 화합물 디스크를 상기 아가 플레이트의 접종된 표면에 두었다; 그 후, 모든 아가 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 억제 직경을 측정하였고, 저항성(R), 보통의 민감성(I) 및 민감성(S)의 측면에서 민감성을 표현하였다. DMSO가 스며든 디스크로 테스트된 박테리아로 접종된 아가 플레이트를 대조군으로 사용하였다. 단일 박테리아 균주에 대해 수득된 결과를 센시(Sensi) 테스트 그람-양성 및 센시 테스트 그람-음성 키트(Liofilchem S.R.L.)에 의해 확인하였다. 상기 디스크 확산 민감성 테스트는 3중으로 수행하였고, 독립적으로 3회 반복하였다.
상기 항균 화합물의 최소 억제 농도(MIC)는 CLSI 지침에 따라 브로스(broth) 희석 방법을 이용해 결정될 수 있다. 테스트 화합물 용액(또는 양성 대조군으로 사용된 항생제 용액)을 MHB 배지로 연속 희석하였다. 이후, 상기 MHB 배지에서의 박테리아의 밤샘 배양물로부터 제조된 106 CFU/㎖ 농도의 미생물 현탁액을 각각의 희석액에 1:1의 비로 첨가하였다. McFarland 표준물을 참조물로 사용하여 미생물 현탁액의 탁도를 조정하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후 탁도법(600 ㎚의 파장)에 의해 상기 미생물의 성장(또는 이의 부재)을 결정하였다. MIC 50 및 MIC 99는 박테리아 성장을 50% 및 99% 억제하기 위해 필요한 화합물의 최소 억제 농도로 정의되었다. 음성 대조군 튜브는 박테리아 접종물을 함유하지 않았으며, 양성 대조군 튜브는 DMSO만을 함유하였다. 상기 MIC 측정에 의한 민감성 테스트는 3중으로 수행하였고, 독립적으로 3회 반복하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-테스트를 이용해 결정하였고, 0.05 이하의 값을 유의미한 것으로 간주하였다.
[표 1] 그람-양성 박테리아 항생제 민감성
Figure 112019102519989-pct00005
표 1은 공지된 항생제와 비교하여 2종의 그람-양성 박테리아 균주(Staph. aureus 및 Strep. pyogenes)에 대한 미토리보신 화합물 24/F9, 24D4, 및 23/G4의 그람-양성 항-박테리아 활성을 요약한다. S로 표시된 컬럼은 민감성을 나타내고, I는 중간을 나타내며, R은 저항성을 나타낸다. 표 1 및 표 2는 테스트된 5종의 모든 박테리아 균주가 미토리보신 화합물 (24/F9, 24/D4 및 23/G4)에 대해 얼마나 민감한지를 나타낸다. 대조군(DMSO)에서는 성장 억제가 보이지 않았다.
[표 2] 그람-음성 박테리아 항생제 민감성
Figure 112019102519989-pct00006
표 2는 공지된 항생제와 비교하여 3종의 상이한 그람-음성 박테리아 균주(E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae)에 대한 미토리보신 화합물 24/F9, 24D4, 및 23/G4의 항-박테리아 활성을 요약한다. S로 표시된 컬럼은 민감성을 나타내고, I는 중간을 나타내며, R은 저항성을 나타낸다.
24/F9, 24/D4 및 23/G4에 대한 최소 억제 농도(MIC)를 결정하기 위하여, 브로쓰 희석 방법을 수행할 수 있다. 상기 방법을 이용하여, 상기 MIC 결정 결과는 디스크-확산 민감성 테스트와 일치됨을 보여주었다.
[표 3] 최소 억제 농도(MIC): 박테리아 균주 및 병원성 효모
Figure 112019102519989-pct00007
표 3은 공지된 항생제와 비교하여 테스트된 박테리아 균주 및 C. albicans와 비교할 때 수득된 MIC 결정 결과를 보여준다. 화합물 23/G4는 화합물 24/F9 및 24/D4와 비교하여 가장 넓은 스펙트럼의 활성 및 효능을 보여준다.
[표 4] 최소 억제 농도(MIC): MRSA v. MSSA
Figure 112019102519989-pct00008
표 4는 메티실린-저항성 스타필로코커스 아우레우스(MRSA)가 또한 23/G4 및 24/D4에 민감성임을 보여준다. 예상한 것과 같이, 상기 MRSA 균주는 실제로 아목시실린에 대해 저항성이었음을 확인하였다. 상기 결과는 MRSA와 같은 약물-저항성 박테리아를 표적할 수 있는 새로운 항생제를 단리하기 위하여 인간 암 세포를 도입하는 상기 새로운 약물 발견 전략을 사용하는 것이 가능할 수 있음을 보여준다.
상기 결과는 본 발명의 접근법에 의해 확인된 미토리보신이 항암, 항균 특성을 갖고, 약학적 조성물용으로 적합함을 나타낸다.
본 발명자들은 암 세포에서 급성 ATP 고갈을 유도하는 화합물이 방사선, 자외선, 화학치료제, 천연 물질 및/또는 칼로리 제한에 대해 상기 세포를 민감하게 할 수 있음을 보여주었다. 본 명세서에서 논의한 것과 같이, 미토리보신은 ATP-고갈 효과를 나타내었다. 상기 예비 결과에 기초하여, 미토리보신은 또한 방사선증감제 및/또는 광증감제로 사용될 수 있다. 방사선증감제 및 광증감제로서의 사용은 본 기술분야에 공지될 수 있는 다른 암 치료 방법 및 본 명세서에 개시된 것과 같은 미토콘드리아 생물발생의 억제를 통한 암 치료를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 치료 벡터와 조합될 수 있다. 유사하게, 미토리보신은 벌크 암 세포 및 암 줄기 세포를 화학치료제, 약제, 및/또는 식이 보충제와 같은 다른 천연 물질 및 칼로리 제한에 기능적으로 민감하게 하기 위해 사용될 수 있다.
항암 및 항생 거동에 더하여, 본 발명의 접근법에 의해 확인될 수 있는 미토콘드리아 억제제는 포유동물 노화 공정을 늦출 잠재력을 갖는다. 미토콘드리아 단백질 번역의 유전적 억제는 모델 유기체에서 유익한 부작용, 특히 노화 공정을 늦추고 수명을 증가시키는 부작용을 갖는 것으로 나타났다. 낮은 정상-상태(steady-state) 레벨의 Mrps5(미토리보솜 단백질)는 더 긴 뮤린(murine) 수명과 강하게 기능적으로 연관되어서, ∼250일의 현저한 증가되는 결과를 갖는다. 또한, C. elegans에서 Mrps5의 선택적 녹-다운은 수명을 극적으로 증가시킨다. Mrps5 녹-다운 벌레는 미토콘드리아 호흡 및 ATP 생산에서 현저한 감소를 보인다. 유사하게, 미토콘드리아 복합체 Ⅰ, Ⅲ, Ⅳ 및 Ⅴ 뿐만 아니라 몇 가지 TCA 사이클 효소의 벌레 동족체의 녹-다운은 모두 수명을 강력하게 연장하였는데, 이는 상기 메커니즘으로서 감소된 OXPHOS 활성 및 낮은 ATP 레벨을 추가로 보여주는 것이다. 마지막으로, (독시사이클린의 표적-외 효과를 이용한) 미토콘드리아 생물발생의 약리학적 억제는 또한 C. elegans에서의 수명을 현저하게 증가시킨다. 따라서, 낮은 용량의 미토리보신이 노화 공정을 치료적으로 표적화하고 수명을 연장시키기 위해 사용될 수 있다.
미토리보신은 또한 암 세포에서 약물 저항성을 되돌리기 위해 사용될 수 있다. 약물 저항성은 적어도 부분적으로는 암 세포에서의 증가된 미토콘드리아 기능에 기초하는 것으로 생각된다. 특히, 타목시펜과 같은 내분비 치료법에 저항성을 보이는 암 세포는 증가된 미토콘드리아 기능을 갖는 것으로 예상된다. 미토리보신은 미토콘드리아 기능을 억제하고, 따라서 암 세포에서의 약물 저항성을 감소시키고, 일부 경우에는 되돌리는데 유용할 수 있다.
미토리보신은 또한 남성의 피임약 및/또는 정자정지제(spermistatic agent) 또는 정자-고정제(sperm-immobilizing agent)로서 사용될 수 있다. 인간 정자 세포는 헤드 및 편모로 이루어져 있다. 상기 편모는 목, 중간 부위, 및 꼬리를 포함한다. 상기 중간 부위는 전형적으로 세포질 내에 축 필라멘트를 둘러싸는 10-14개 나선의 미토콘드리아를 갖는다. 상기 미토콘드리아는 정자에 이동성을 제공하고, 따라서 종종 "정자의 동력실"로 불린다. 미토리보신은 미토콘드리아 기능을 억제하고, 따라서 수정을 방지하기 위해 정자 세포를 고정하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 상세한 설명에서 개시된 용어는 특정 구현예를 개시하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명을 제한하기 위한 의도는 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 첨부된 청구항에서 사용된 것과 같이, 단수 형태인 "한", "하나", 및 "상기"는, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 복수 형태도 역시 포함하기 위한 의도이다. 본 발명의 상세한 설명의 고려로부터 명확하게 되는 것과 같이, 본 발명은 무수한 대안, 변형, 및 등가물을 포함한다.
"제1", "제2", "제3", "a)," "b)," 및 "c)" 등의 용어가 본 발명의 다양한 구현예를 개시하기 위해 본 명세서에서 사용될 수 있지만, 이들 용어에 의해 제한되어서는 안됨이 이해될 것이다. 상기 용어들은 본 발명의 한 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용된 것이다. 따라서, 하기 논의된 제1 요소는 요소 측면에서의 용어일 수 있고, 유사하게 본 발명의 사상을 벗어나지 않으면서 제3 요소가 될 수 있다. 따라서, "제1", "제2", "제3", "a)," "b)," 및 "c)" 등의 용어는 관련 요소들에게 순서 또는 다른 체계를 필수적으로 전달하기 위한 의도는 아니며, 확인을 위한 목적으로만 사용된다. 작동(또는 단계)의 순서는 청구항에서 제공된 순서에 한정되는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 용어(기술적 및 과학적 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보통 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 보통 사용되는 사전에서 정의된 것과 같은 용어는 본 출원 및 관련 기술의 문맥에서의 의미와 일치되는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하고, 본 명세서에서 명시적으로 나타내지 않는 한 이상적이거나 매우 공식적인 의미로 해석되어서는 안됨이 추가로 이해될 것이다. 본 발명의 명세서에서 사용된 용어는 특정 구현예를 개시하기 위한 목적일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 의도는 아니다. 본 명세서에 인용된 모든 공개문헌, 특허 출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전체가 인용에 의해 포함된다. 명칭에 있어서 상충되는 경우, 본 발명의 명세서가 조정한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "및/또는"은 하나 이상의 연관된 목록의 아이템의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라, 대안적인 ("또는")으로 해석될 때는 조합의 부재를 나타내고 포괄한다.
문맥이 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서에 개시된 본 발명의 다양한 특징들은 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 구체적으로 의도한다. 아울러, 본 발명은 또한 본 발명의 일부 구현예에서 본 명세서에 개시된 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제 또는 생략될 수 있음을 고려한다. 설명을 위하여, 본 명세서가 화합물 A, B 및 C를 포함하는 복합체를 개시한다면, 이는 임의의 A, B 또는 C, 또는 그의 조합이 생략 및 배제될 수 있음을 구체적으로 의도하는 것이다.
본 명세서에 나타낸 것과 같이, 과도기적 구인 "필수적으로 이루어지는"(및 문법적 변이체)은 언급된 물질 또는 단계와, 본 발명에서 청구된 "기본적이고 신규한 특징(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 것들"을 포괄하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "필수적으로 이루어지는"이란 용어는 "포함하는"과 등가인 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "약"이란 용어는, 예를 들면, 양 또는 농도 등과 같은 측정가능한 수치를 나타낼 때, 특정된 양의 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 또는 심지어 ±0.1%의 변동을 포괄하는 것을 의미한다. 측정가능한 수치에 대해 본 명세서에서 제공되는 범위는 그 안의 임의의 다른 범위 및/또는 개별 수치를 포함할 수 있다.
본 발명의 소정 구현예가 상기에 개시되었지만, 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명은 상기 개시된 특정한 설명에 의해 제한되어서는 안되는데, 그 이유는 그의 많은 명백한 변동들이 청구항에서 개시된 사상 또는 범위를 벗어나지 않고서도 가능하기 때문임이 이해되어야 한다.

Claims (40)

  1. 미토리보신으로서,
    상기 미토리보신은 하기 일반식의 화합물 중 적어도 하나, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 미토리보마이신이거나;
    , , 및
    상기 미토리보신은 하기 일반식의 화합물 중 적어도 하나, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 미토리보스포린이거나; 또는
    , 및
    상기 미토리보신은 하기 일반식의 화합물, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 미토리보플록신이거나; 또는

    상기 미토리보신은 하기 화합물 중 적어도 하나, 또는 약학적으로 허용가능한 그의 염을 포함하는 미토리보사이클린인 미토리보신:
    , , 및 .
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 항-노화 활성을 갖는 미토리보신.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 방사선증감 활성을 갖는 미토리보신.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 광증감 활성을 갖는 미토리보신.
  10. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 암 세포를 화학치료제에 민감하게 하는 미토리보신.
  11. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 암 세포를 천연 물질에 민감하게 하는 미토리보신.
  12. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 암 세포를 칼로리 제한에 민감하게 하는 미토리보신.
  13. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 미토콘드리아 리보솜의 큰 서브-유닛에 결합하는 미토리보신.
  14. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 미토콘드리아 리보솜의 작은 서브-유닛에 결합하는 미토리보신.
  15. 청구항 1에 있어서,
    상기 미토리보신은 양이온성 화합물, 트리-페닐-포스포늄, 구아니디늄, 콜린 에스테르, 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 표적화 신호를 포함하는 미토리보신.
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 청구항 1 및 청구항 7 내지 청구항 15 중 어느 한 항의 적어도 하나의 미토리보신을 활성 성분으로 함유하는 암의 치료용 약학적 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 청구항 1 및 청구항 7 내지 청구항 15 중 어느 한 항의 적어도 하나의 미토리보신을 활성 성분으로 함유하는 박테리아 감염의 치료, 병원성 효모 감염의 치료, 노화의 치료, 남성 피임약, 정자정지제, 및 정자-고정제 중 적어도 하나를 위한 약학적 조성물.
  26. 삭제
  27. 가상의 고속대량 스크리닝을 이용하여 미토콘드리아 리보솜을 표적으로 하는 화합물을 확인하는 단계;
    상기 확인된 화합물을 합성하는 단계;
    미토콘드리아 억제 활성에 대해 상기 합성된 화합물을 테스트하는 단계; 및
    상기 합성된 화합물이 미토리보신임을 확인하는 단계;를 포함하는 가상의 고속대량 스크리닝 및 표현형적 약물 스크리닝을 이용한 미토리보신의 확인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서,
    상기 미토리보신은 상기 미토콘드리아 리보솜의 큰 서브-유닛에 결합하는 방법.
  29. 청구항 27에 있어서,
    상기 미토리보신은 미토콘드리아 리보솜의 작은 서브-유닛에 결합하는 방법.
  30. 청구항 27에 있어서,
    상기 표현형적 약물 스크리닝은 시험관내 약물 스크리닝인 방법.
  31. 청구항 27에 있어서,
    상기 표현형적 약물 스크리닝은 ATP-고갈 분석법을 포함하는 방법.
  32. 청구항 27에 있어서,
    상기 표현형적 약물 스크리닝은 세포외 산성화 속도 분석법을 포함하는 방법.
  33. 청구항 27에 있어서,
    상기 표현형적 약물 스크리닝은 산소 소비 속도 분석법을 포함하는 방법.
  34. 청구항 27에 있어서,
    항암 활성에 대해 상기 미토리보신을 테스트하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 테스트된 항암 활성은 맘모스피어 형성인 방법.
  36. 청구항 34에 있어서,
    상기 테스트된 항암 활성은 세포의 이동인 방법.
  37. 청구항 34에 있어서,
    항-미생물 활성에 대해 상기 미토리보신을 테스트하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 청구항 37에 있어서,
    상기 항 미생물 활성은 커비-바우어 디스크 확산 방법을 이용해 테스트되는 방법.
  39. 청구항 37에 있어서,
    상기 항-미생물 활성은 최소 억제 농도 분석법을 이용해 테스트되는 방법.
  40. 청구항 22에 있어서,
    상기 미토리보신은 미토리보사이클린, 미토리보마이신, 미토리보스포린, 및 미토리보플록신 중 적어도 하나를 포함하는 약학적 조성물.
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