BR112019014843A2

BR112019014843A2 - peptídeos terapêuticos e neuroprotetores

Info

Publication number: BR112019014843A2
Application number: BR112019014843A
Authority: BR
Inventors: L Karageozian Hampar; Y Park John; H Karageozian Vicken
Original assignee: Allegro Pharmaceuticals Llc
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2020-04-14
Also published as: ZA201905372B; EP3570867A4; RU2019126014A; AU2018210241A1; IL268169A; EP3570867A2; JP7330510B2; RU2019126014A3; WO2018136669A3; US20210085749A1; WO2018136669A2; CN110678193A; KR20190120197A; US20180207227A1; WO2018136669A8; CA3050904A1; JP2020505365A; MX2019008621A

Abstract

peptídeos não naturais e seus métodos de uso em sujeito animal humano ou não humano para causar um efeito tal como: neuroproteção, proteção contra ou diminuição de incapacidade ou dano do nervo, tratamento de glaucoma, tratamento de degeneração macular relativa a idade ou outras degenerações retinianas herdadas ou adquiridas, intensificação de reparo de tecido retiniano, intensificação de terapia regenerativa retiniana através de ativação de células imunes inatas ou tra-tamento de degeneração retiniana herdada ou adquirida.

Description

“PEPTÍDEOS TERAPÊUTICOS E NEUROPROTETORES”

Pedidos Relacionados [001]Este pedido reivindica prioridade dos Pedidos de Patentes Provisionais dos Estados Unidos 62/448.300, intitulado Neuroprotective Peptides, depositado em 19 de janeiro de 2017, e 62/500.998, intitulado Therapeutic Peptides and their Mechanisms of Action, depositado em 3 de maio de 2017, a totalidade das divulgações de ambos os pedidos sendo expressamente incorporada neste documento por referência.

Campo da Invenção [002]A presente invenção se refere geralmente aos campos de biologia e medicina e, mais particularmente, a peptídeos neuroprotetores usáveis para tratar dano de nervo que resulta de doenças neurodegenerativas ou neuropáticas (por exemplo, glaucoma, retinite pigmentosa, degenerações da retina herdadas ou adquiridas, neuropatia periférica, distúrbios do sistema nervoso central (CNS) ou periférico neurodegenerativos), insultos hipóxicos (por exemplo, parada cardíaca ou acidente vascular cerebral) ou lesões mecânicas (por exemplo, trauma, lesões da coluna espinhal), bem como úteis para intensificar reparo do tecido retiniano ou neurológico e terapia regenerativa neurológica através da melhoria da função moduladora imune.

Fundamentos [003]De acordo com 37 CFR 1.71(e), este documento de patente contém material que está sujeito a proteção por direitos autorais e o proprietário deste documento de patente se reserva o direito de todos os direitos autorais sejam quais forem.

[004] Além de lesões de nervo traumáticas e insultos hipóxicos, várias doenças são conhecidas por causarem efeitos neurodegenerativos ou neuropáticos. Por exemplo, glaucoma é uma neuropatia óptica que provoca escavação ou “cupping” do disco óptico, degeneração de células do gânglio retiniano e perda do campo visual

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2/19 resultante. Como pressão intraocular elevada (IOP) é um grande fator de risco para progressão de glaucoma, muitas estratégias de tratamento foram dirigidas para abaixar a pressão intraocular.

[005]Pesquisa recente sugere que a degeneração do nervo que ocorre em glaucoma pode resultar de um processo que é similar àquele que ocorre em seguida a lesão traumática a neurônios do sistema nervoso central (CNS). Por exemplo, em seguida a lesão do CNS níveis de certas substâncias neurotóxicas são vistos aumentarem no fluido extracelular. Acredita-se que as substâncias tóxicas, então, causam lesão neuronal secundária além de lesão mecânica que ocorreu como resultado do trauma primário. Drogas capazes de evitar ou diminuir os efeitos destas substâncias neurotóxicas podem ser candidatas para o desenvolvimento, não apenas de agentes neuroprotetores, mas também de agentes neuroprotetores úteis na redução de morte neuronal ou incapacidade em seguida a insulto ou trauma a outros tecidos neuronais, incluindo o cérebro e a coluna espinhal. Ver, Yoles, E., et al.; a2Adrenoreceptor Agonists Are Neuroprotective in a Flat Model of Optic Nerve Degeneration; Investigative Ophthalmology & Visual Science, Vol. 40, No. 1, pp. 65-73 (January 1999) e Neufeld, A.H., et al.; Inhibition of Nitric-Oxide Synthase 2 by Aminoguanidine Provides Neuroprotection of Retinal Ganglion Cells in a Rat Model of Chronic Glaucoma; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999).

[006]O Requerente está atualmente desenvolvendo um oligopeptídeo sintético (Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC) que inibe uma série de integrinas e, quando administrado ao olho, pode causar vitreólise, descolamento vítreo-retiniano posterior (PVD) e é utilizável para tratamento de distúrbios do olho, tal como degeneração macular úmida (WMD), retinopatia diabética (PDR), edema macular diabético (DME) e tração vitreomacular (VMT). Como aqui descrito, o Requerente descobriu que este oligopeptídeo sintético também demonstra efeitos neuroprotetores em um modelo de rato de degeneração do nervo óptico e, como afirmado acima, tam

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3/19 bém pode ser eficaz para prevenir ou restaurar outros tipos de dano ou degeneração de nervo, tal como dano neuronal secundário associado a lesões traumáticas.

Sumário [007]De acordo com a presente invenção, é fornecido um método para induzir, em um sujeito animal humano ou não humano, um efeito selecionado de: neuroproteção, proteção contra ou diminuição de incapacidade ou dano do nervo, tratamento de glaucoma, tratamento de degeneração macular relativa a idade ou outras degenerações retinianas herdadas ou adquiridas, intensificação de reparo de tecido retiniano, intensificação de terapia regenerativa retiniana através de ativação de células imunes inatas ou tratamento de degeneração retiniana herdada ou adquirida. Esse método compreende administrar ao sujeito um peptídeo não natural o qual causa esse efeito em uma quantidade que é eficaz para causar esse efeito.

[008]De acordo com a invenção, o peptídeo pode compreender GlicinilArginil-Glicinil-Cisteico-Treonil-Prolina incluindo qualquer fragmento, congênero, derivado, sal, hidrato, isômero, multímero, forma cíclica, forma linear, conjugado, derivado ou outra forma modificada farmaceuticamente aceitável do mesmo que causa o referido efeito. Outros peptídeos não naturais os quais são usáveis em métodos da presente invenção podem incluir alguns dos compostos descritos no Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos copendente 62/521.984, depositado em 19 de junho de 2017, cuja totalidade da divulgação é expressamente incorporada aqui por referência.

[009] Ainda de acordo com a invenção, o método pode ser realizado para proteger contra dano ao, diminuir dano ao ou restaurar a função após dano ao nervo óptico e/ou a retina em um sujeito que sofre de glaucoma, degeneração macular relativa a idade, degeneração macular seca ou outras degenerações retinianas herdadas ou adquiridas como retinite pigmentosa.

[010]Ainda de acordo com a invenção, o método pode ser realizado para tra

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4/19 tar um sujeito que sofreu trauma, lesão ou insulto mecânico (por exemplo, insulto hipóxico ou isquêmico) no cérebro, na coluna espinhal, no CNS ou no sistema nervoso periférico.

[011]Ainda de acordo com a invenção, o método pode ser realizado para tratar ou restaurar função diminuída do cérebro ou de outra porção do sistema nervoso de um sujeito em seguida a um evento de dano ao nervo ou cérebro, tal como doença, lesão ou insulto incluindo, mas não se limitando a, parada cardíaca, acidente vascular cerebral, insulto hipóxico ou isquêmico, doença, distúrbio ou trauma.

[012]Ainda de acordo com a invenção, o método pode ser realizado para proteger contra ou diminuir dano ao nervo devido a uma doença ou um distúrbio neuropático ou neurodegenerativo, seja ocular ou sistêmico.

[013]Ainda aspectos e detalhes adicionais da presente invenção serão entendido mediante leitura da descrição detalhada e dos exemplos estabelecidos aqui abaixo.

Breve Descrição dos Desenhos [014]A descrição detalhada e os exemplos a seguir são fornecidos para a finalidade de descrever não exaustivamente alguns, mas não necessariamente todos, exemplos ou modalidades da invenção e não limitarão o escopo da invenção de maneira nenhuma.

[015]Figura 1 é um gráfico de barras comparando número de células ganglionais em cada campo em comparação com o número de campos examinados como descrito no Exemplo 1 abaixo descreve Tratamento Luminate comparado com controle [016]Figura 2 é um gráfico de barras comparando Número Total de Células em todos os campos em comparação com o número de células totais no tratamento Luminate e no controle como descrito no Exemplo 1 abaixo tratamento Luminate e controle

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5/19 [017] Figura 3 é um gráfico de barras comparando contagens de células de epitélio de pigmento retiniano (RPE) em placas de controle e tratadas como descrito no Exemplo 2 abaixo (Legenda: Cont = Tratamento de Controle (BSS); Lu = Tratamento Luminate (Somente); H2O2 100μΜ = Tratamento de Peróxido (Somente); Lu H2O2 100μΜ =.Luminate Seguido por Tratamento de Peróxido).

[018]Figura 4 é um gráfico de barras comparando contagens de células Muller retinianas em placas de controle e tratadas como descrito no Exemplo 3 abaixo (Legenda: Cont = Tratamento de Controle (BSS); Lu = Tratamento Luminate (Somente); KA = Tratamento de Ácido Ciânico (Somente) e KA-Lu 500μΜ =. Luminate Seguido por Tratamento de Ácido Ciânico).

[019]Figura 5 , mostra fotomicrografias histológicas de tecido retiniano tiradas de ratos tratados com doses de controle ou crescentes de agente neurotóxico ácido Caínico como descrito no Exemplo 4 abaixo.

[020]Figura 6 é um gráfico de barras comparando contagens de células neuronais retinianas em placas de controle e tratadas como descrito no Exemplo 5 abaixo (Legenda: Cont = Tratamento de Controle (BSS); Lu = Tratamento Luminate (Somente); KA 100μΜ = Tratamento de Ácido Ciânico (Somente) e Lu-KA 100μΜ =. Luminate Seguido por Tratamento de Ácido Ciânico).

Descrição Detalhada [021 ]A descrição detalhada a seguir e os desenhos anexos aos quais ela se refere se destinam a descrever alguns, mas não necessariamente todos, exemplos ou modalidades da invenção. As modalidades descritas serão consideradas em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não restritivas. O conteúdo desta descrição detalhada e dos desenhos anexos não limitam o escopo da invenção de nenhuma maneira.

[022]O Requerente estudou a segurança e os efeitos neuroprotetores de um composto compreendendo o peptídeo não natural Glicinil-Arginil-Glicinil-CisteicoPetição 870190068181, de 18/07/2019, pág. 15/50

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Treonil-Prolina tendo a fórmula estrutural do Composto 1 abaixo (também referido como ALG-1001 ou Luminate®, Allegro Ophthalmics, LLC):

[023]Uma forma cíclica do peptídeo não natural Glicinil-Arginil-GlicinilCisteico-Treonil-Prolina é mostrada abaixo como Composto 2:

Cysteicacid Ácido Cisteico

Compound 2 Composto2 [024]Os Compostos 1 e 2, assim como outros compostos relacionados, são descritos nos Pedidos de Patente dos Estados Unidos N^Q de Série 13/467.995 e

14/696.250, a totalidade da divulgação de cada tal pedido sendo expressamente incorporada aqui por referência.

Exemplo 1

Modelo de Rato de Elevada Pressão Intraocular

In Vivo de Neuroprotecão Ocular [025]Ratos Wister saudáveis (n =8) de dez (10) semanas de idade foram mantidos em um viveiro mantido a uma temperatura constante de 26°C e um ciclo claro-escuro constante (14 horas e 10 horas respectivamente) com comida disponível ad libitum. Os ratos foram aleatoriamente divididos em um grupo de tratamento com Luminate de cinco (5) animais (Grupo A) e um grupo de tratamento de Solução de Sal Básico (BSS-controle) de três (3) animais (Grupo B).

[026]Os animais do Grupo A receberam cada um uma injeção intravítrea

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7/19 simples de 1,28mg/20pL de Luminate no olho direito. Os animais do Grupo B receberam cada um uma injeção intravítrea simples de 20μΙ_ de solução de sal equilibrada (BSS). Os olhos esquerdos de todos os animais nos Grupos A e B não foram injetados e foram usados como controles não tratados. As injeções intravítreas foram administradas 2mm posterior ao limbo no quadrante supranasal usando uma agulha de calibre 30 fixada a uma seringa de 1,0 cm³. Foi tomado cuidado para evitar dano à lente ou retina.

[027]Vinte e quatro (24) horas após administração das injeções, os ratos foram anestesiados por injeção intraperitoneal de 3,0mL/kg de uma mistura de cloridrato de cetamina (2,5mg/mL), diazepam (2,0mg/L) e atropina (0,1mg/mL). Os olhos foram, então, submetidos a descolamento conjuntival peritoneal do músculo reto lateral para expor o nervo óptico. O nervo óptico foi, então, ligado com sutura de seda por um período de 60 minutos durante o qual a ausência de fluxo de sangue na retina de cada olho ligado foi verificada por inspeção usando uma lente de contato Plana. As ligaduras foram removidas após 60 minutos e a restauração de fluxo de sangue para a retina foi verificada em cada olho anteriormente ligado usando a lente de contato Plana.

[028]Em seguida à remoção das ligaduras e à verificação de que o fluxo de sangue da retina foi restaurado, os ratos foram alojados vivos por 48 horas e, então, sacrificados por canalização da aorta abdominal e da veia cava inferior e perfusão com 200 mL de formaldeído a 10%.

[029]Os olhos foram, então, enucleados e fixados para análise histopatológica. Amostras da retina e do nervo óptico de cada olho foram desidratadas e embebidas em parafina. Seções horizontais de 4 microns de espessura foram cortadas e coradas com hematoxilina e eosina. Sob microscopia de luz, as contagens de células ganglionares foram contadas em seções axiais da retina de cada olho da ora serrata através do nervo óptico. Além disso, em cada seção, o número de células gan

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8/19 glionares por milímetro através do comprimento total da retina foi calculado digitalmente usando uma lâmina de medição calibrada para este propósito.

[030]A medição da camada plexiforme interna foi realizada observando as lâminas a uma ampliação de 40x não mais de 1 mm do nervo óptico.

[031 ]Os resultados foram submetidos a análise estatística. Os resultados para cada grupo foram expressos como média ± desvio padrão e a significância estatística entre os resultados dos grupos foi avaliada por ANOVA de 2 vias, assim como o teste U Mann-Whitney. Probabilidades de < 0,05 foram consideradas ser significativas.

[032]A Tabela 1 abaixo mostra o número de células ganglionares por campo para cinco (5) olhos tratados com LUMINATE® e três olhos tratados com BSS (controle):

TABELA 1

	CASO 1	CASO 2	CASO 3	CASO 4	CASO 5
Campo 1	20	5	8	16	14
Campo 2	17	14	10	16	24
Campo 3	19	25	21	13	20
Campo 4	19	16	9	28	16
Campo 5	16	5	23	24	12
Campo 6	21	25	29	16	15
Campo 7	22	37	29	15	16
Campo 8	19	15	31	25	10
Campo 9	40	16	41	33	12
Campo 10	28	7	29	8	19
Campo 11	13		29	24	17
SOMA	234	165	259	218	175
SD	7,268	10,157	10,596	7,454	4,036

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	Controle 1	Controle 2	Controle 3
Campo 1	3	5	4
Campo 2	6	14	2
Campo 3	3	25	11
Campo 4	13	16	15
Campo 5	3	5	10
Campo 6	0	25	14
Campo 7	0	37	15
Campo 8	1	15	8
Campo 9	3	16	10
Campo 10	0	7	19
Campo 11	2		16
SOMA	34	165	124
SD	3,754	10,157	5,198

[033]A Tabela 2, abaixo, exibe uma análise ANOVA de duas vias dos dados estabelecidos na Tabela 1. O Grupo A consiste em olhos relativos a ALG1001 e o Grupo B consiste em olhos tratados com BSS (controle).

TABELA 2

Formato de Tabela Agrupado	Grupo A	Grupo B
CASOS	CONTROLES
	A:Y1	A:Y2	A:Y3	A:Y4	A:Y5	B:Y1	B:Y2	B:Y3	B:Y4	B:Y5
Campo 1	20	5	8	16	14	3	5	4
Campo 2	17	14	10	16	24	6	14	2

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Campo 3	19	25	21	13	20	3	25	11
Campo 4	19	16	9	28	16	13	16	15
Campo 5	16	5	23	24	12	3	5	10
Campo 6	21	25	29	16	15	0	25	14
Campo 7	22	37	29	15	16	0	37	15
Campo 8	19	15	31	25	10	1	15	8
Campo 9	40	16	41	33	12	3	16	10
Campo 10	28	7	29	8	19	0	7	19
Campo 11	13		29	24	17	2		16

[034]A Tabela 3 mostra resultados tabulares da análise ANOVA exibida na tabela 2, indicando uma diferença estatisticamente significante (p<0,0001) entre os olhos tratados com Luminate (Grupo A) e os olhos tratados com BSS (controle) (Grupo B).

Tabela 3

Resultados Tabulares ANOVA duas vias

Tabela Analisada	ANOVA duas vias, não RM

ANOVA duas vias	Comum
Alfa	0,05

Fonte de Variação	% de variação total	Valor de p	Sumário de valor de p	Significante?

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Interação	3,810	0,9385	ns	Não
Fator de fila	12,37	0,2386	ns	Não
Fator de co- luna	22,62	<0,0001	★ ★★★	Sim

Tabela ANOVA	SS	DF	MS	F (DFn,DFd)	Valor de P
Interação	297,7	10	29,77	F(10,64)=0,4070	P=0,9385
Fator de fila	966,7	10	96,67	F(10,64)=1,321	P=02386
Fator de co- luna	1.767	1	1.767	F(10,64)=24,16	P<0,0001
Residual	4.682	64	73,16

[035]A Figura 1 é um gráfico de barras de número de células ganglionais em cada campo vs. o número de campos examinados para o tratamento de Luminate e controle ilustrando as diferenças entre a média [036]A Tabela 4 mostra resultados tabulares do Teste U de Mann-Whitney o qual também indica uma diferença estatisticamente significante (p<0,0001) entre os olhos tratados com Luminate (Grupo A) e os olhos tratados com BSS (controle) (Grupo B).

Tabela 4

Resultados Tabulares Mann-Whitney

Tabela Analisada	Dados 1

Coluna B	CONTROLES
vs.	vs.
Coluna A	CASOS

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Teste Mann Whitney
Valor de p	<0,0001
Valor exato ou aproximado?	Exato
Sumário de valor de p	★ ★★★
Significativamente diferente: (P<0,05)	Sim
Valor de uma ou duas caudas?	Duas caudas
Soma de classificações na coluna A,B	2.871,870,5
Mann-Whitney U	342,5

Diferença entre medianas
Mediana da coluna A	18,00, n=54
Mediana da coluna B	9,000, n=32
Diferença: Real	-9,000
Diferença: Hodges-Lehmann	-10,00
95,05% Cl de diferença	-13,00 a-6,000
Cl exato ou aproximado?	Exato

[037]A Figura 2 é um gráfico de barras comparando a contagem de células ganglionais média por campo entre os olhos tratados com Luminate (Grupo A) e os olhos tratados com BSS (controle) (Grupo B) usando uma teste de Mann-Whitney U.

[038]Conclui-se destes dados do Exemplo 1 que a administração intravítrea de uma preparação compreendendo uma quantidade eficaz do peptídeo GlicinilArginil-Glicinil-Cisteico-Treonil-Prolina (Luminate) teve efeitos neuroprotetores significantes neste modelo de rato de elevada IOP. Como observado acima, resultados positivos neste modelo de animal de dano neuronal induzido por glaucoma no olho

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13/19 não são apenas indicativos de utilidade como um agente neuroprotetor ocular, mas também como um agente neuroprotetor útil na redução de morte neuronal ou incapacidade em seguida a insulto ou trauma a outros tecidos neuronais, incluindo o cérebro e a coluna espinhal.

Exemplo 2

Efeitos de Luminate Neuroorotetores InVitro em Epitélio de Pigmento Retiniano (RPE) [039] Peróxido de hidrogênio (H2O2), um mediador fisiológico de tensão oxidativa, é conhecido por induzir apoptose em células epiteliais de pigmento retiniano (RPE).

[040]Células ARPE-19 foram incubadas em meio de DMEM/F12 suplementado com soro bovino fetal (FBS) a 10% e 50pg/ml de estreptomicina e 50pg/ml de penicilina a 37°C em uma atmosfera de 5% de CO2. Para induzir diferenciação, células ARP-19 foram cultivadas em transpoços revestidos com Laminin por 2 semanas no mesmo meio suplementado com FBS 1% e antibióticos. As células RPE foram, então, isoladas e alíquotas de cerca de 150μΙ - 200μΙ de suspensão de células foram dispensadas para os pratos petri contendo meio de controle. As células foram, então, incubadas a 37 graus C por 24 horas antes do uso.

[041]Após isso, os seguintes quatro (4) pratos de células neuronais separados foram preparados como mostrado abaixo:

A) Células RPE Retinianas de Controle;

B) Células RPE retinianas incubadas com 1,0mg/ml ALG-1001 (Luminate);

C) Células RPE retinianas incubadas com 100μΜ de Peróxido de Hidrogênio; e

D) Células RPE retinianas incubadas com 1,0mg/ml ALG-1001 (Luminate) por 24 horas antes da exposição a 100μΜ de Peróxido de Hidrogênio.

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14/19 [042]Oito (8) horas pós-exposição, os números de células foram medidos usando ensaio de exclusão de azul de Tripan em uma Câmara Neubar. A Figura 3 é um gráfico de barras comparando as contagens de células RPE em Placas A, B, C e

D. Estes dados do Exemplo 2 mostram que peróxido de hidrogênio foi tóxico para as células RPE, como evidenciado pelo fato de que a contagem de células RPE na placa tratada com Peróxido de Hidrogênio sozinho (Placa C) foi de apenas 78% da contagem de células de controle (Placa A). No entanto, a contagem de células RPE na placa pré-tratada com ALG-1001 (Luminate) antes da exposição a peróxido de hidrogênio (Placa D) foi de 90% da contagem de células de controle (Placa A), desse modo indicando que o pré-tratamento com ALG-1001 (Luminate) teve um efeito neuroprotetor neste modelo in vitro.

Exemplo 3

Efeitos de Luminate Neuroprotetores InVitro em Células Muller Retinianas [043]Camundongos CD1 foram eutanizados por decapitação, os olhos foram rapidamente enucleados para complemento de DMEM com solução antibiótica e armazenados durante a noite à temperatura ambiente. Subsequentemente os globos intactos foram incubados em DMEM contendo tripsina a 0,1% e 70U/ml de colagenase a 37^QC por 60 minutos.

[044]Os materiais incubados foram colocados em um prato petri contendo DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10% e as retinas foram removidas sem as células RPE para pequenos agregados e semeadas em pratos de cultura de 35 mm. O meio não foi trocado por 6 dias e, então, reabastecido a cada 3 - 4 dias. As culturas foram mantidas a 37^QC em um 55% de CO2/95% de O2 em um incubador umidificado.

[045]Quando 0 crescimento para fora da célula atingiu semiconfluência, agregados retinianos (80%) foram removidos pipetando 0 meio para 0 prato. Esta

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15/19 operação foi repetida três (3) vezes até uma população de células planas purificadas ser obtida. Após 24 horas, as células foram expostas à condições experimentais.

[046]Quatro (4) pratos de células Muller separadas foram preparados como a seguir: A) Células Muller de controle; B) células Muller incubadas com ALG-1001 (Luminate) 1,0mg/ml; C) células Muller incubadas com 500μΜ de ácido Caínico e D) células Muller incubadas com Luminate 1,0mg/ml por 24 horas antes da exposição a 500μΜ de ácido Caínico. Quarenta e oito (48) horas pós-exposição, os números de células foram medidos usando ensaio de exclusão de azul de Tripan em uma Câmara Neubar.

[047]A Figura 4 é um gráfico de barras comparando as contagens de células Muller nas Placas A, B, C e D. Estes dados indicam que a placa incubada com 1,0mg/l de Luminate por 24 horas antes da exposição a 500μΜ de ácido Caínico (Placa D) tinha uma contagem de células Muller mais alta que qualquer das outras placas (A, B ou C) e substancialmente mais células Muller que a placa (Placa C) que recebeu o desafio de ácido Caínico sem pré-tratamento de Luminate.

[048]Quarenta e oito (48) horas pós-exposição, os números de células foram medidos usando ensaio de exclusão de azul de Tripan em uma Câmara Neubar. A Figura 4 é um gráfico de barras comparando as contagens de células Muller nas Placas A, B, C e D. Estes dados indicam que a placa incubada com 1,0mg/l de Luminate por 24 horas antes da exposição a 500μΜ de ácido Caínico (Placa D) tinha uma contagem de células Muller mais alta que qualquer das outras placas (A, B ou

C) e substancialmente mais células Muller que a placa (Placa C) que recebeu o desafio de ácido Caínico sem pré-tratamento de Luminate.

Exemplo 4

Efeitos Neurotóxicos Relativos a Dose In Vivo de Ácido Caínico [049]Os olhos direitos de 4 ratos Wister foram injetados intravitreamente com 20μΙ das quatro soluções diferentes como a seguir: A) Solução BSS como controle,

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B) 0,5mM de ácido Caínico, C) 5,0mM de ácido Caínico e D) 50,0mM de ácido Cainico.

[050]0s ratos foram sacrificados 24 horas pós-tratamento e os olhos foram preparados para exame de Histopatologia. A Figura 5 mostra seções histológicas representativas para cada um dos quatro (4) olhos tratados.

[051 ]Os resultados demonstram claramente a degeneração da retina do rato Wister quando a concentração de ácido Caínico é aumentada de 0,5mM para 5,0mM a 50,0mM. Isto confirma que ácido Caínico não causa neurotoxicidade retiniana relativa a dose in vitro e confirma a relevância de estudos usando células retinianas tratadas com ácido Caínico in vitro, tal como Exemplos 2, 3 e 5 deste pedido de patente.

Exemplo 5

Efeitos de Luminate Neuroprotetores InVitro em Células Neuronais Retinianas [052]Camundongos CD1 foram eutanizados por decapitação, os olhos foram rapidamente enucleados para complemento de DMEM com solução antibiótica e a retina foi isolada do epitélio de pigmento.

[053]A retina isolada foi incubada em meio de Hank contendo 2,5mg/ml de papaína e 0,1mg/ml de cisteína por 15 minutos a 30°C. Após enxaguar o meio de Hank, suplementado com 1,9mM de CaCE, 0,6mM de MgCE e 0,1mg/ml de albumina de soro bovino.

[054]A retina foi mecanicamente dissociada, cerca de 150μΙ - 200μΙ de suspensão de células foram dispensadas para os pratos petri contendo meio de controle. Células bipolares foram identificadas em um microscópio pela morfologia das células. As células foram incubadas por 6 horas antes do uso.

[055]Quatro (4) pratos de células Neuronais separadas foram preparados como a seguir: A) Células Neuronais Retinianas de controle; B) células Neuronais

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Retinianas incubadas com ALG-1OO1 (Luminate) 1,0mg/ml; C) células Neuronais Retinianas incubadas com 100μΜ de ácido Caínico e D) células Neuronais Retinianas incubadas com Luminate 1,0mg/ml por 24 horas antes da exposição a 500μΜ de ácido Caínico.

[056]Oito (8) horas pós-exposição, os números de células foram medidos usando ensaio de exclusão de azul de Tripan em uma Câmara Neubar.

[057]A Figura 6 é um gráfico de barras comparando as contagens de células neuronais retinianas em Placas A, B, C e D. Estes dados indicam que ácido Caínico foi tóxico para as células neuronais retinianas e o pré-tratamento de Luminate diminuiu substancialmente essa toxicidade. Especificamente, a contagem de células neuronais na placa tratada apenas com 100μΜ de ácido Caínico (Placa C) foi de 58% em comparação com o Controle, enquanto a contagem de células neuronais na placa incubada com 1,0mg/ml de Luminate por 24 horas antes da exposição a 500μΜ de ácido Caínico (Placa D) foi de 80% do Controle. Estes resultados são particularmente notáveis dado que a Placa D recebeu cinco (5) vezes mais ácido Caínico que a Placa C.

Exemplo 6

Estudo de Marcação Humano, Prospective), Aberto para Luminate no Tratamento de AMD Seca [058]Para determinar se uma única injeção intravítrea de Luminate de 1,0mg/50pL tem alguma efeito na melhoria da Acuidade Visual Mais Bem Corrigida (BCVA) de sujeitos de AMD Seca com AMD Seca moderada a moderadamente severa.

[059]Este é um estudo de prova de conceito clínico humano aprovado por IRB prospective intervencional, de etiqueta aberta conduzido em 7 sujeitos humanos com AMD Seca moderada a moderadamente severa.

[060]Gs critérios de inclusão principais envolviam pacientes com olhos de

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Degeneração Macular Seca com fotorreceptor relativamente intacto e camadas de RPE no 1mm central da mácula por OCT.

[061 ]A BCVA de linha de base dos sujeitos estava entre 20/30 e 20/400 sem evidência de fluido subretiniano ou CNV e nenhum histórico de tratamento AntiVEGF.

[062]Todos os pacientes recrutados sofreram uma única injeção intravítrea de linha de base de 1,0mg/50pL de Luminate e foram monitorados mensalmente, além disso espessura macular central, OCT, fotografias coloridas digitais e BCVA pré e pós-tratamento foram obtidas.

[063]Os resultados deste estudo de prova de conceito de etiqueta aberta para Luminate no tratamento de AMD Seca em pacientes humanos são resumidos na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5

Paciente	BCVA de Linha de Base	BCVA 3 Meses Pós-Tratamento
1	0,5 log Mar (20/63)	0,3 log Mar (20/40) Ganharam 10 letras
2	1,0 log Mar (20/200)	0,6 log Mar (20/80) Ganharam 20 letras
3	1,3 log Mar (20/400)	1,0 log Mar (20/200) Ganharam 15 letras
4	0,2 log Mar (20/32)	1,0 log Mar (20/200) Ganharam 15 letras
5	1,3 log Mar (20/400)	1,3 log Mar (20/400) Não Ganharam letras
6	0,40 log Mar (20/50)	0,20 log Mar (20/32) Ganharam 10 letras

*Paciente 5 foi observado ter as piores características anatômicas foveais de

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[064]Estes resultados indicam que neste estudo, a BCVA de sujeitos tratados com Luminate melhoraram até 20 letras.

[065]Também será apreciado que, embora a invenção tenha sido descrita aqui acima com referência a certos exemplos ou modalidades da invenção, várias adições, deleções, alterações e modificações podem ser feitas nesses exemplos e nessas modalidades descritas sem afastamento do espírito e do escopo pretendidos da invenção. Por exemplo, quaisquer elementos, etapas, membros, componentes, composições, reagentes, partes ou porções de uma modalidade ou um exemplo podem ser incorporados ou usados com outra modalidade ou outro exemplo, a menos que de outro modo especificado ou a menos que fazendo isso tornaria essa modalidade ou esse exemplo inadequados para seu uso pretendido. Além disso, quando as etapas de um método ou processo tiverem sido descritas ou listadas em uma ordem particular, a ordem dessas etapas pode ser mudada, a menos que de outro modo especificado ou a menos que fazendo isso tornaria o método ou processo inadequado para sua finalidade pretendida. Adicionalmente, os elementos, as etapas, os membros, os componentes, as composições, os reagentes, as partes ou porções de qualquer invenção ou exemplo descrito aqui podem opcionalmente existir ou ser utilizados na ausência ou substancial ausência de qualquer outro elemento, etapa, membro, componente, composição, reagente, parte ou porção, a menos que de outro modo observado. Todas as adições, deleções, modificações e alterações razoáveis serão consideradas equivalentes dos exemplos e das modalidades descritas e serão incluídas dentro do escopo das seguintes reivindicações.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para induzir, em um sujeito animal humano ou não humano, um efeito selecionado de: neuroproteção, proteção contra ou diminuição de incapacidade ou dano do nervo, tratamento de glaucoma, tratamento de degeneração macular relativa a idade ou outras degenerações retinianas herdadas ou adquiridas, intensificação de reparo de tecido retiniano, intensificação de terapia regenerativa retiniana através de ativação de células imunes inatas ou tratamento de degeneração retiniana herdada ou adquirida, o referido método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa de:

administrar ao sujeito um peptídeo não natural o qual causa o referido efeito em uma quantidade que é eficaz para causar o referido efeito.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende Glicinil-Arginil-Glicinil-Cisteico-Treonil-Prolina ou um fragmento, congênero, derivado, sal, hidrato, isômero, multímero, forma cíclica, forma linear, conjugado, derivado ou outra forma modificada farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende uma quantidade eficaz do Composto 1.
4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a composição compreende uma quantidade eficaz do Composto 2.
5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para proteger contra ou diminuir dano ao nervo óptico e/ou a retina devido a pressão intraocular acima do normal.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para proteger contra dano ao, diminuir dano ao ou restaurar a função após dano ao nervo óptico e/ou a retina em um sujeito que sofre de glaucoma, degeneração macular relativa a idade ou outras degenerações retinianas

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2/2 herdadas ou adquiridas como retinite pigmentosa.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para tratar um sujeito que sofreu uma lesão traumática ou mecânica em um nervo.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para tratar um sujeito que sofreu uma lesão traumática ou mecânica no cérebro, coluna espinhal ou sistema nervoso periférico.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado em um sujeito que sofreu trauma ou insulto hipóxico no cérebro.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado em um sujeito que sofreu trauma ou insulto hipóxico na coluna espinhal.
11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para proteger contra ou diminuir dano ao nervo devido a uma doença ou um distúrbio neuropático ou neurodegenerativo, seja ocular ou sistêmico.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para proteger contra ou diminuir dano ao cérebro ou outro sistema nervoso em seguida a parada cardíaca, acidente vascular cerebral ou insulto hipóxico.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o método é realizado para restaurar função após dano ao cérebro ou outro sistema nervoso diminuído em seguida a parada cardíaca, acidente vascular cerebral, insulto hipóxico ou trauma.