BR112019013008A2 - espécie de metschnikowia isolada, método para produzir xilitol, xilitol bioderivado, composição, método para produzir um composto bioderivado, composto bioderivado, polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado, vetor e célula hospedeira - Google Patents

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Abstract

a cepa de metschnikowia designada com número de acesso 081116-01 pela autoridade depositária internacional do canadá (idac) para utilização de xilose na produção de xilitol e outros compostos e composição e método a partir dela.

Description

ESPÉCIE DE METSCHNIKOWIA ISOLADA, MÉTODO PARA PRODUZIR XILITOL, XILITOL BIODERIVADO, COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM COMPOSTO BIODERIVADO, COMPOSTO BIODERIVADO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR E CÉLULA HOSPEDEIRA
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO DE PATENTE CORRELATO [0001] Este pedido de patente reivindica o beneficio de prioridade deste ao Pedido de Patente dos Estados Unidos Provisório N° 62/437610, depositado em 21 de dezembro de 2016, cujo conteúdo é aqui incorporado, em sua totalidade, por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO [0002] A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular e da microbiologia. São providas no presente espécies de Metschnikowia que produzem compostos úteis a partir de xilose quando cultivadas, bem como métodos para produzir e usar essas espécies de Metschnikowia.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [0003] O presente pedido de patente contém uma Listagem de Sequências que foi submetida em formato ASCII via EFS-Web e que é aqui incorporada, em sua totalidade, por referência. A referida cópia em ASCII, criada em 19 de dezembro de 2017, é denominada 14305-008-228_Sequence_Listing.txt e tem 188.107 bytes de tamanho.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [0004] Xilose é um açúcar de presença abundante na biomassa lignocelulósica, uma matéria-prima renovável para produção de substâncias químicas bioderivadas. No entanto, o uso de biomassa lignocelulósica e a produção de substâncias químicas bioderivadas são limitados pela absorção naturalmente baixa
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2/227 por organismos microbianos. Portanto, um organismo microbiano que seja capaz de usar xilose para produzir compostos bioderivados, como xilitol, representa uma necessidade não atendida.
[0005] O xilitol é um álcool de açúcar de cinco carbonos usado amplamente como uma alternativa de carboidrato baixo e teor calórico baixo ao açúcar (Drucker et al., Arch of Oral Biol. 24:965-970 (1979)). 0 xilitol é quase tão doce como a sacarose, porém com 33% menos calorias. Foi relatado que os niveis de insulina de pessoas com diabetes e de indivíduos com hiperglicemia não são afetados pelo xilitol. O consumo de xilitol é também supostamente benéfico para a saúde dos dentes, reduzindo a incidência de cáries. Por exemplo, há relatos de que o xilitol na goma de mascar inibe o crescimento de Streptoccocus mutans (Haresaku et al., Caries Res. 41:198203 (2007)), e de que reduz a incidência de infecção aguda do ouvido médio (Azarpazhooh et al., Cochrane Database of Systematic Reviews ll:CD007095 (2011)). Além disso, foi relatado que o xilitol inibe a desmineralização do esmalte de dentes sadios e que remineraliza o esmalte de dentes danificados (Steinberg et al., Clinical Preventive Dentistry 14:31-34 (1992); Maguire et al., British Dental J. 194:429-436 (2003); Grillaud et al., Arch of Pediatrics and Adolescent Medicine 12:1180-1186 (2005)).
[0006] Comercialmente, o xilitol pode ser produzido por redução quimica da xilose, embora esse processo possa apresentar dificuldades associadas com a separação e purificação de xilose ou xilitol de hidrolisados. Foram descritos sistemas microbianos para a produção de xilitol
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3/227 (Sirisansaneeyakul et al., J. Ferment. Bioeng. 80:565-570 (1995); Onishi et al., Agric. Biol. Chem. 30:1139-1144 (1966); Barbosa et al., J. Ind. Microbiol. 3:241-251 (1988); Gong et al., Biotechnol. Lett. 3:125-130 (1981); Vandeska et al.,
World J. Microbiol. Biotechnol. 11:213-218 (1995); Dahiya et al., Cabdirect.org 292-303 (1990); Gong et al., Biotechnol.
Bioeng. 25:85-102 (1983)). Por exemplo, a levedura do gênero Candida foi descrita como útil para a produção de xilitol. No entanto, Candida spp. Podem ser patógenos oportunistas, de modo que utilizar desses organismos em processos relacionados a produtos alimentares não é desejável.
[0007] A espécie Metschnikowia, métodos e composições aqui fornecidos atendem a essas necessidades e proporcionam outras vantagens relacionadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0008] É aqui provida uma nova espécie de Metschnikowia isolada. Essa espécie de Metschnikowia produz xilitol com taxas e eficiências especificadas que se distinguem de outras espécies de Metschnikowia. Por exemplo, em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia que produz pelo menos 0,1 g/L/h de xilitol a partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30°C por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose. Em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que produz pelo menos 1 g/L de xilitol a partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30°C por três dias em meio liquido Yeast Nitrogen Base (YNB) contendo 4% de xilose. Em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que produz pelo menos 1 g/L de xilitol a
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4/227 partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30°C por dois dias em meio liquido Yeast Nitrogen Base (YNB) contendo 2% de xilose e 2% de glicose.
[0009] É também aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que produz uma combinação distinta de compostos. Por exemplo, em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que produz aproximadamente 0,11 g/L/h de xilitol, aproximadamente 6,8E-05 g/L/h de n-butanol, aproximadamente 2,5E-04 g/L/h de isobutanol, aproximadamente 2,4E-04 g/L/h de isopropanol, aproximadamente 2,64E-04 g/L/h de etanol e aproximadamente 3,73E-06 g/L/h de álcool 2fenetilico quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose. Em outro aspecto, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que produz os compostos: xilitol, nbutanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-fenetilico a uma concentração de aproximadamente 8.000 mg/L de xilitol, aproximadamente 4,85 mg/L de n-butanol, aproximadamente 18,06 mg/L de isobutanol, aproximadamente 17,5 mg/L de isopropanol, aproximadamente 19,7 mg/L de etanol e aproximadamente 0,269 mg/L de álcool 2-fenetilico quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose. Em ainda outro aspecto, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que produz os compostos: xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-fenetilico numa razão relativa de 99,26% de xilitol, 0,061% de n-butanol, 0,223% de isobutanol, 0,217% de isopropanol, 0,236% de etanol e 0,003% de álcool 2-fenetilico
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5/227 quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose.
[0010] É ainda mesmo provida no presente documento uma espécie de Metschnikowia isolada que possui características genéticas distintas. Por exemplo, em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada com uma sequência do dominio D1/D2 que inclui: (1) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de ácido nucleico dentro da sequência consenso de SEQ ID NO: 2; ou (3) uma sequência de ácido nucleico incluindo os resíduos 1-153, 178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 4 substituições nucleotidica e, pelo menos, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56. Em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada com uma sequência do dominio D1/D2 que inclui: (1) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; ou (2) uma sequência de ácido nucleico dentro da sequência consenso de SEQ ID NO: 2; ou (3) uma sequência de ácido nucleico incluindo os resíduos 1-153, 178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 4 substituições nucleotidicas e, pelo menos, uma sequência codificante de ácido nucleico que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 57-78. Em um aspecto especial, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada com: (1) uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97,1% idêntica à sequência consenso do dominio D1/D2 de SEQ ID NO: 2; e (2) uma sequência codificante de ácido nucleico de SEQ ID NO: 70.
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6/227 [0011] Além disso, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que possui características genéticas e características fisiológicas distintas. Por exemplo, em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada com: (1) uma sequência do dominio D1/D2 que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (2) uma sequência codificante de ácido nucleico de SEQ ID NO: 68, e em que a referida espécie de Metschnikowia isolada cresce até atingir ODsoo de aproximadamente 25 no periodo de 41 horas de cultura em meio Yeast Extract Peptone (YEP) incluindo 2% de xilose como a única fonte de carbono.
[0012] Em um aspecto adicional, a espécie de Metschnikowia isolada aqui provida possui uma sequência especifica do dominio D1/D2. Por exemplo, em alguns aspectos, a sequência do dominio D1/D2 inclui uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 1 e 3-25. Adicionalmente, em alguns aspectos, a sequência do dominio D1/D2 da espécie de Metschnikowia isolada aqui provida não inclui a sequência do dominio D1/D2 de uma espécie de Metschnikowia selecionada a partir de Metschnikowia andauensis, Metschnikowia chrysoperlae, Metschnikowia fructicola, Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia shanxiensis, Metschnikowia sinensis e Metschnikowia zizyphicola.
[0013] Em um aspecto, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada designada com Número de Acesso 08111601, depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá, uma Autoridade Depositária Internacional, em 08 de novembro de 2016, segundo os termos do Tratado de Budapeste.
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7/227 [0014] Além disso, é aqui provida uma versão recombinante da espécie de Metschnikowia depositada. Assim, em alguns aspectos, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada designada com Número de Acesso 081116-01, depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá, uma Autoridade Depositária Internacional, em 08 de novembro de 2016, segundo os termos do Tratado de Budapeste, em que a espécie de Metschnikowia inclui ainda uma via metabólica capaz de produzir um composto bioderivado a partir de xilose ou uma modificação genética, ou ambos. A via metabólica da espécie de Metschnikowia, em algumas modalidades, inclui pelo menos uma sequência exógena de ácido nucleico que codifica pelo menos uma enzima da via metabólica. O composto bioderivado pode ser selecionado a partir de qualquer um dos compostos bioderivados aqui descritos, incluindo, entre outros, álcool fenetilico, 2metil-butanol ou 3-metil-butanol.
[0015] São também providos no presente métodos para produzir um composto bioderivado (p. ex., xilitol, arabitol, etanol, nbutanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol) utilizando a espécie de Metschnikowia isolada ora provida. Assim, em alguns aspectos, é provido neste documento um método para produzir xilitol incluindo cultivar a espécie de Metschnikowia isolada ora provida em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir xilitol a partir de xilose. Tal espécie de Metschnikowia pode produzir pelo menos 0,1 g/L/h, pelo menos 0,2 g/L/h, pelo menos 0,3 g/L/h, pelo menos 0,4 g/L/h, pelo menos 0,50 g/L/h, pelo menos 0,60 g/L/h, pelo menos 0,70 g/L/h, pelo menos 0,80 g/L/h, pelo menos 0,80 g/L/h, pelo
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menos 1,00 g/L/h, pelo menos 1,50 g/L/h, pelo menos 2,00
g/L/h, pelo menos 2,50 g/L/h, pelo menos 3, 00 g/L/h, pelo
menos 3,50 g/L/h, pelo menos 4,00 g/L/h, pelo menos 5, 00
g/L/h, pelo menos 6, 00 g/L/h, pelo menos 7,00 g/L/h, pelo
menos 8,00 g/L/h, pelo menos 9, 00 g/L/h ou pelo menos 10,00
g/L/h de xilitol a partir de xilose.
[0016] Os métodos aqui providos podem incluir cultivar a
espéci e de Metschnikowia aqui provi da com xilose comc ) uma
fonte de carbono em combinação com outros co-substratos. Assim, em alguns aspectos, as condições incluem cultivar a espécie de Metschnikowia isolada em meio incluindo xilose e uma fonte de carbono C3, uma fonte de carbono C4, uma fonte de carbono C5, uma fonte de carbono C6 ou uma combinação das mesmas. As condições podem também incluir cultivar a espécie de Metschnikowia isolada em meio incluindo xilose e um cosubstrato selecionado a partir de celobiose, galactose, glicose, etanol, acetato, arabinose, arabitol, sorbitol e glicerol ou uma combinação dos mesmos. As condições de cultura podem incluir condições aeróbicas de cultura, cultivo descontínuo, cultivo descontínuo alimentado ou cultivo continuo. Os métodos podem também incluir separar o xilitol de outros componentes na cultura.
[0017] Em alguns aspectos, é provido neste documento um composto bioderivado (p. ex., xilitol, arabitol, etanol, nbutanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol) produzido por um método aqui descrito.
[0018] Em alguns aspectos, é aqui provida uma composição contendo a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita.
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Além disso, ou alternativamente, é também provida neste documento uma composição contendo o composto bioderivado (p. ex., xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetílico, 2-metilbutanol ou 3-metil-butanol) aqui descrito. Em algumas modalidades, a composição é meio de cultura incluindo xilose, e, em algumas modalidades, a composição é meio de cultura da qual foi removida a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita. Em algumas modalidades, a composição inclui impurezas provenientes do método utilizado para produzir a composição, as quais podem incluir glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o álcool de açúcar C7 é volemitol ou um isômero do mesmo. A composição pode também incluir uma quantidade específica das impurezas, como quando a quantidade de glicerol ou arabitol, ou dos dois, é pelo menos 10%, 20%, 30% ou 40% maior do que a quantidade do respectivo glicerol ou arabitol, ou ambos, produzidos por um organismo microbiano diferente da espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita.
[0019] Em outro aspecto, são aqui providos polipeptídeos isolados e ácidos nucleicos isolados, os quais correspondem às proteínas e aos ácidos nucleicos, ora identificados, da nova espécie de Metschnikowia aqui descrita. Assim, em alguns aspectos, é provido neste documento um polipeptídeo isolado com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56. Em alguns aspectos, é provido neste documento um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir de SEQ ID NOS: 57-78. Adicionalmente, é também provido um
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10/227 vetor com as sequências de ácidos nucleicos isolados aqui descritos, bem como uma célula hospedeira contendo tal vetor.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A Figura 1 mostra um alinhamento de sequências entre todas as sequências de D1/D2 identificadas de clones HO individuais de Metschnikowia sp. Estão representadas as SEQ ID NOS: 2 e 3-25.
[0021] A Figura 2 mostra uma árvore do vizinho mais próximo (neighbor-j oining tree) de todas as sequências de RPB2 para os H0 Metschnikowia sp., membros do ciado de Metschnikowia pulcherrima e da espécie fora do grupo, Metschnikowia kunwiensis, a qual mostra as distâncias entre as diferentes espécies.
[0022] A Figura 3 mostra curvas de crescimento exemplares para o H0 Metschnikowia sp. Em comparação a membros do ciado Metschnikowia pulcherrima.
[0023] A Figura 4 mostra a produção de xilitol a partir de xilose para H0 Metschnikowia sp. e a cepa M2 de Saccharomyces. cerevisiae. YP+4% de xilose indica meio Yeast Extract Peptone com 4% de xilose. YP+10% de xilose indica meio Yeast Extract Peptone com 10% de xilose.
[0024] As Figuras 5A-5D mostram curvas de crescimento celular para H0 Metschnikowia sp. e para cepa Metschnikowia pulcherrima flavia (FL) cultivada em meios diferentes. A Figura 5A é meio YNB com 4% de glicose (YNBG) . A Figura 5B é meio YNB com 4% de xilose (YNBX) . A Figura 5C é meio YNB com 2% de glicose e 2% de xilose (YNBGX) . A Figura 5D é meio YPD com 4% de xilose (YPDX).
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11/227 [0025] As Figuras 6A e 6B mostram glicerol e etanol produzidos por HO Metschnikowia sp. e a cepa FL nos meios YNBG, YNBGX e YPDX.
[0026] As Figuras 7A-7D mostram os niveis de arabitol produzidos durante o crescimento de HO Metschnikowia sp. e a cepa FL nos meios YNBG (Figura 7A) , YNBX (Figura 7B) , YNBGX (Figura 7C) e YPDX (Figura 7D).
[0027] As Figuras 8A-8C mostram os niveis de xilitol produzidos durante o crescimento de HO Metschnikowia sp. e da cepa FL nos meios YNBX (Figura 8A) , YNBGX (Figura 8B) e YPDX (Figura 8C).
[0028] As Figuras 9A-9D mostram as razões de pico da produção de vários compostos voláteis produzidos por H0 Metschnikowia sp. e a cepa FL nos meios YNBG (Figura 9A) , YNBX (Figura 9B) , YNBGX (Figura 9C) e YPDX (Figura 9D).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0029] As composições e os métodos aqui providos baseiam-se, em parte, na descoberta, isolamento e caracterização de uma nova espécie de levedura dentro do gênero Metschnikowia. O isolamento e a caracterização dessa nova espécie de Metschnikowia, denominada no presente HO ou a H0 Metschnikowia sp., revelaram inúmeras propriedades vantajosas, novos genes e proteínas e utilizações de valiosas para a H0 Metschnikowia sp. e uma H0 recombinante de Metschnikowia sp. do mesmo. Por exemplo, algumas das propriedades vantajosas da H0 Metschnikowia sp. inclui a sua capacidade para utilizar glicose, xilose e celobiose como fonte de carbono para produzir um composto bioderivado, como xilitol, arabitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol
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12/227 ou álcool fenetílico. Novos genes exemplares da HO Metschnikowia sp. incluem ACT1, ARO8, AROIO, GPD1, GXF1, GXF2, GXS1, HGT19, HXT2.6, HXT5, PGK1, QUP2, RPB1, RPB2 , TEF1, TP11, XKS1, XYL1, XYL2, XYT1, TALI e TKL1, bem como novas proteínas para ArolO, Gxf2, Hgtl9, Hxt5, Tefl, Xksl, Xyll, Tall e Tkll. Assim, a HO Metschnikowia sp. pode ser utilizada em um método para produzir um composto bioderivado, tais como xilitol, arabitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol ou álcool fenetílico, pela cultura da HO Metschnikowia sp. em meio contendo xilose como a fonte de carbono para produção do composto bioderivado. Além disso, são providas no presente composições incluindo um composto bioderivado produzido pelos métodos que utilizam a HO Metschnikowia sp. ou HO recombinante de Metschnikowia sp. para produzir o composto bioderivado. São ainda providos no presente polipeptídeos isolados direcionados às novas proteínas da HO Metschnikowia sp. e ácidos nucleicos isolados direcionados aos novos genes da HO Metschnikowia sp., além de células hospedeiras que incluem esses ácidos nucleicos.
[0030] Neste relatório descritivo, o termo aeróbico quando usado em referência a uma condição de cultura ou crescimento pretende significar que há oxigênio livre (O2) disponível para a condição de cultura ou crescimento. Isso inclui quando o oxigênio dissolvido no meio líquido é acima de 50% de saturação.
[0031] Neste relatório descritivo, o termo anaeróbico quando usado em referência a uma condição de cultura ou crescimento pretende significar que a condição de cultura ou crescimento é desprovida de oxigênio livre (O2) .
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13/227 [0032] Neste relatório descritivo, o termo atenuar, ou equivalentes gramaticais do mesmo, pretende significar enfraquecer, reduzir ou diminuir a atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína. A atenuação da atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína pode simular a interrupção completa se a atenuação fizer com que a atividade ou quantidade fique abaixo de um nivel critico necessário para o funcionamento de uma dada via. No entanto, a atenuação da atividade ou quantidade de uma enzima ou proteína que simule a interrupção completa de uma via pode ainda ser suficiente para que uma via separada continue a funcionar. Por exemplo, a atenuação de uma enzima ou proteína endógena pode ser suficiente para simular a interrupção completa da mesma enzima ou proteína para produção de um determinado composto (p. ex., xilitol), mas a atividade ou quantidade restante de enzima ou proteína pode ser suficiente para manter outras vias ou reações, como uma via que é critica para que a espécie de Metschnikowia hospedeira sobreviva, reproduza ou cresça. A atenuação de uma enzima ou proteína pode também ser enfraquecer, reduzir ou diminuir a atividade ou quantidade da enzima ou proteína em uma quantidade que seja suficiente para aumentar o rendimento de xilitol, mas não necessariamente simular a interrupção completa da enzima ou proteína.
[0033] Neste relatório descritivo, o termo de base biológica significa um produto que é formado, no todo ou em parte, por um composto bioderivado. Um produto de base biológica ou bioderivado contrasta com um produto derivado de petróleo, em que tal produto é derivado de ou foi sintetizado a partir de petróleo ou de uma matéria-prima petroquímica.
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14/227 [0034] Neste relatório descritivo, o termo bioderivado significa derivado de ou sintetizado por um organismo biológico e pode ser considerado um recurso renovável, pois pode ser gerado por um organismo biológico. Tal organismo biológico, especificamente a espécie de Metschnikowia aqui revelada, pode utilizar matéria-prima ou biomassa, como, açúcares (p. ex., xilose, celobiose, glicose, frutose, galactose (p. ex., galactose proveniente da biomassa de plantas marinhas) e sacarose), carboidratos, obtidos de fonte agrícola, vegetal, bacteriana ou animal, e glicerol (p. ex., glicerol bruto, subproduto da fabricação de biodiesel).
[0035] Neste relatório descritivo, o termo fonte de carbono refere-se a qualquer molécula contendo carbono, utilizada por um organismo para a sintese de suas moléculas orgânicas, incluindo, entre outros, os compostos bioderivados aqui descritos. Isso inclui moléculas com quantidades diferentes de átomos de carbono. Os exemplos específicos incluem uma fonte de carbono C3, uma fonte de carbono C4, uma fonte de carbono C5 e uma fonte de carbono C6. Uma fonte de carbono C3 refere-se a uma fonte de carbono contendo três átomos de carbono, como glicerol. Uma fonte de carbono C4 refere-se a uma fonte de carbono contendo quatro átomos de carbono, como eritrose ou treose. Uma fonte de carbono C5 refere-se a uma fonte de carbono contendo cinco átomos de carbono, como xilose, arabinose, arabitol, ribose ou lixose. Uma fonte de carbono C6 refere-se a uma fonte de carbono contendo seis átomos de carbono, como glicose, galactose, manose, alose, altrose, gulose ou idose.
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15/227 [0036] Neste relatório descritivo, o termo dominio D1/D2 é um dominio com 450-600 nucleotídeos na extremidade 5' de uma subunidade grande do rDNA (26S) encontrado na maior parte das leveduras. A maioria das espécies de leveduras pode ser identificada pela divergência na sequência do dominio D1/D2. Cepas coespecificas de leveduras em geral possuem menos de 1% de divergência na sequência nucleotidica para o dominio D1/D2, enquanto que espécies biológicas são separadas por uma divergência acima de 1% para esse dominio. No entanto, em casos raros, como para a espécie Clavispora lusitaniae (Lachance et al., FEMS Yeast Res. 2003; 4:253-8),
Metschnikowia andauensis e Metschnikowia fructicola (Sipiczki et al., PLoS One. 2013; 8:e67384) e a espécie única de
Metschnikowia aqui descrita, uma diferença maior de 1% para o dominio D1/D2 pode ser encontrada dentro da mesma espécie. Por exemplo, a espécie única de Metschnikowia aqui descrita tem uma divergência de até 3,8% no dominio D1/D2. Métodos para analisar a sequência nucleotidica do dominio D1/D2 são bem conhecidos na técnica. Um método exemplar para análise do dominio D1/D2 de uma espécie de Metschnikowia, como descrito mais detalhadamente adiante, inclui amplificar uma sequência de 499 nucleotídeos por PCR utilizando o par de primers (iniciadores) NL1 (5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'; SEQ ID NO: 26) e NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'; SEQ ID NO: 27).
[0037] O termo codifica ou um equivalente gramatical do mesmo quando se aplica a uma sequência de ácido nucleico refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica aminoácidos de um peptídeo, polipeptídeo ou proteína quando da tradução, se os ácidos nucleicos são RNA, ou transcrição e
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16/227 tradução se os ácidos nucleicos são DNA. Assim, o termo sequência codificante de ácido nucleico, refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica aminoácidos quando da transcrição e/ou tradução. Tal sequência incluiría, por exemplo, uma sequência de DNA genômico que corresponde a um éxon de um gene eucariótico ou ao cDNA de um gene eucariótico. Tais sequências contrastam com as do reforçador, promotores e introns do mesmo gene, as quais, em condições normais, não codificam quaisquer aminoácidos.
[0038] O termo exógeno, conforme usado neste documento, pretende significar que a molécula mencionada ou a atividade citada é introduzida na espécie de Metschnikowia aqui descrita. A molécula pode ser introduzida, por exemplo, pela introdução de um ácido nucleico codificante no material genético da espécie de Metschnikowia hospedeira, como por integração em um cromossomo hospedeiro ou como material genético não cromossômico como um plasmideo. Alternativa ou adicionalmente, a molécula introduzida pode ser ou incluir, por exemplo, um ácido nucleico não codificante que modula (p. ex., aumenta, diminui ou torna constitutiva) a expressão de um ácido nucleico codificante, como um promotor ou reforçador. Portanto, o termo, quando usado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante, refere-se à introdução do ácido nucleico codificante em uma forma que possa ser expressa na espécie de Metschnikowia hospedeira e/ou introdução de um ácido nucleico que aumenta a expressão (p. ex., superexpressa) de um ácido nucleico codificante da espécie de Metschnikowia hospedeira. Quando usado em referência a uma atividade biossintética, o termo refere-se a uma atividade que é
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17/227 introduzida na espécie de Metschnikowia hospedeira. A fonte pode ser, por exemplo, um ácido nucleico codificante homólogo ou heterólogo que expresse a atividade mencionada após a introdução na espécie de Metschnikowia. Portanto, o termo endógeno refere-se a uma molécula ou atividade mencionada que está presente na espécie de Metschnikowia hospedeira. Do mesmo modo, o termo, quando usado em referência à expressão de um ácido nucleico codificante, refere-se à expressão de um ácido nucleico codificante contido no organismo microbiano. 0 termo heterólogo refere-se a uma molécula ou atividade derivada de uma fonte diferente da espécie de Metschnikowia mencionada, enquanto que homólogo refere-se a uma molécula ou atividade derivada da espécie de Metschnikowia hospedeira. Assim, a expressão exógena de um ácido nucleico codificante aqui revelado pode utilizar um ácido nucleico codificante heterólogo ou homólogo ou os dois.
[0039] Entende-se que, quando mais de um ácido nucleico exógeno está incluído em uma espécie de Metschnikowia, aquele mais de um ácido nucleico exógeno refere-se ao ácido nucleico codificante mencionado ou à atividade biossintética mencionada, como discutido acima. Entende-se também que, um organismo microbiano pode ter uma ou múltiplas cópias do mesmo ácido nucleico exógeno. Entende-se ainda, conforme revelado no presente, que tal mais de um ácido nucleico exógeno pode ser incluído na espécie de Metschnikowia hospedeira em moléculas separadas de ácido nucleico, em moléculas policistrônicas de ácido nucleico ou uma combinação das mesmas e ser ainda considerado como mais de um ácido nucleico exógeno. Por exemplo, como aqui revelado, um organismo microbiano pode ser
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18/227 criado para que expresse dois ou mais ácidos nucleicos exógenos codificantes de uma enzima ou proteína de uma via desejada. No caso em que dois ácidos nucleicos exógenos codificantes de uma atividade desejada são introduzidos em uma espécie de Metschnikowia hospedeira, entende-se que os dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos como um ácido nucleico único, por exemplo, em um plasmideo único, em plasmídeos separados, pode ser integrados no cromossomo do hospedeiro em um único sítio ou múltiplos sítios e serem ainda considerados dois ácidos nucleicos exógenos. Do mesmo modo, entende-se que mais de dois ácidos nucleicos exógenos podem ser introduzidos em um organismo hospedeiro em qualquer combinação desejada, por exemplo, em um único plasmideo, em plasmídeos separados, ser integrados no cromossomo do hospedeiro em um único sítio ou em múltiplos sítios e serem ainda considerados dois ou mais ácidos nucleicos exógenos, por exemplo, três ácidos nucleicos exógenos. Assim, o número de ácidos nucleicos exógenos mencionados ou de atividades biossintéticas mencionadas refere-se ao número de ácidos nucleicos codificantes ou o número de atividades biossintéticas, não o número de ácidos nucleicos separados introduzidos no organismo hospedeiro.
[0040] Neste relatório descritivo, o termo modificação genética, interrupção gênica (gene disruption), ou equivalentes gramaticais do mesmo, pretende significar uma alteração genética que torna o produto gênico codificado funcionalmente inativo, ou ativo, mas atenuado. A alteração genética pode ser, por exemplo, deleção de todo o gene, deleção de uma sequência regulador necessária para transcrição
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19/227 ou tradução, deleção de uma parte do gene que resulta em um produto gênico truncado ou por qualquer uma das várias estratégias de mutação bem conhecidas na técnica que inativa ou atenua o produto gênico codificado. Um método especialmente útil de interrupção gênica é a deleção completa do gene, pois este reduz ou elimina a ocorrência de reversões genéticas na espécie de Metschnikowia aqui provida. Uma interrupção gênica também inclui uma mutação nula, a qual se refere a uma mutação dentro de um gene ou em uma região contendo um gene que resulta no gene não sendo transcrito em RNA e/ou traduzido em um produto gênico funcional. Tal mutação nula pode surgir de muitos tipos de mutações incluindo, por exemplo, mutações pontuais inativadoras, deleção de uma parte de um gene, deleções de genes inteiros ou deleção de segmentos cromossômicos.
[0041] Neste relatório descritivo, o termo inativar, ou equivalentes gramaticais do mesmo, pretende significar parar a atividade da enzima ou proteína. Tal inativação pode ser conseguida por delação de toda a sequência de ácido nucleico codificante da enzima ou proteína. A inativação pode também ser realizada por deleção de uma parte da sequência de ácido nucleico codificante da enzima ou proteína tal que a enzima ou proteína resultante codificada pela sequência de ácido nucleico não tem a atividade da enzima ou proteína completa. Adicionalmente, a inativação de uma enzima ou proteína pode ser conseguida por substituições ou inserções, incluindo em combinação com deleções, na sequência de ácido nucleico codificante da enzima ou proteína. As inserções podem incluir ácidos nucleicos heterólogos, como aqueles aqui descritos.
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20/227 [0042] Neste relatório descritivo, o termo isolado, quando usado em referência a uma espécie de Metschnikowia aqui descrita, pretende significar um organismo substancialmente livre de pelo menos um componente como o organismo microbiano mencionado é encontrado na natureza. O termo inclui uma espécie de Metschnikowia da qual são removidos alguns ou todos os componentes com os quais é encontrada em seu ambiente natural. O termo também inclui um organismo microbiano do qual são removidos alguns ou todos os componentes com os quais o organismo microbiano é encontrado em ambientes não naturais. Portanto, uma espécie de Metschnikowia isolada está parcial ou completamente separada de outras substâncias com as quais é encontrada na natureza ou com as quais é cultivada, armazenada ou subsiste em ambientes não naturais. Os exemplos específicos de espécie de Metschnikowia isolada incluem um organismo microbiano parcialmente puro, um organismo microbiano substancialmente puro e um organismo microbiano cultivado em um meio que não é natural.
[0043] Neste relatório descritivo, o termo meio, meio de cultura, meio de crescimento, ou equivalentes gramaticais do mesmo, refere-se a uma substância líquida ou sólida (p. ex., gelatinosa) contendo nutrientes que sustenta o crescimento de uma célula, incluindo qualquer organismo microbiano como a espécie de Metschnikowia aqui descrita. Os nutrientes que sustentam o crescimento incluem: um substrato que fornece carbono, como, entre outros, xilose, celobiose, galactose, glicose, etanol, acetato, arabitol, sorbitol e glicerol; sais que fornecem elementos essenciais incluindo magnésio, nitrogênio, fósforo e enxofre; uma fonte de
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21/227 aminoácidos, como peptona ou triptona; e uma fonte para conteúdo vitaminico, como extrato de levedura. Exemplos específicos do meio útil nos métodos e para caracterizar a espécie de Metschnikowia aqui descrita incluem meio Yeast Extract Peptone (YEP) e meio Yeast Nitrogen Base (YNB) com uma fonte de carbono como, entre outras, xilose, glicose, celobiose, galactose ou glicerol ou uma combinação das mesmas. As formulações dos meios YEP e YNB são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, o meio YEP com 4% de xilose inclui, entre outros, 1,0 g de extrato de levedura, 2,0 g de peptona, 4,0 g de xilose e 100 mL de água. Como outro exemplo, o meio YNB com 2% de glicose e 2% de xilose inclui, entre outros, 2 pg de biotina, 400 pg de pantotenato de cálcio, 2 pg de ácido fólico, 2000 pg de inositol, 400 pg de niacina, 200 pg de ácido p-aminobenzoico, 400 pg de cloridrato de piridoxina, 200 pg de riboflavina, 400 pg de cloridrato de tiamina, 500 pg de ácido bórico, 40 pg de sulfato de cobre, 100 pg de iodeto de potássio, 200 pg de cloreto férrico, 400 pg de sulfato de manganês, 200 pg de molibdato de sódio, 400 pg de sulfato de zinco, 1 g de fosfato de potássio monobásico, 500 mg de sulfato de magnésio, 100 mg de cloreto de sódio, 100 mg de cloreto de cálcio, 20 g de glicose, 20 g de xilose e 1 litro de água. A quantidade da fonte de carbono no meio pode ser facilmente determinada por um técnico no assunto. Quando mais de um substrato que fornece carbono está presente no meio, estes são denominados co-substratos. O meio pode também incluir outras substâncias além de nutrientes necessários para o crescimento, como uma substância que somente permite a seleção de células para crescerem (p. ex., antibiótico ou
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22/227 antifúngico), as quais são em geral encontradas em meio seletivo, ou uma substância que permite a diferenciação de um organismo microbiano sobre outro quando cultivados no mesmo meio, as quais são em geral encontradas em meio diferencial ou indicador. Tais substâncias são bem conhecidas por um técnico no assunto.
[0044] Neste relatório descritivo, o termo espécie de Metschnikowia refere-se a qualquer espécie de levedura que se inclua no gênero Metschnikowia. Espécies exemplares de Metschnikowia incluem, entre outras, Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia fructicola, Metschnikowia chrysoperlae, Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia andauensis, Metschnikowia shanxiensis, Metschnikowia sinensis, Metschnikowia zizyphicola, Metschnikowia bicuspidata, Metschnikowia lunata, Metschnikowia zobellii, Metschnikowia australis, Metschnikowia agaveae, Metschnikowia gruessii, Metschnikowia hawaiiensis, Metschnikowia krissii, cepa NS-O-85 de Metschnikowia sp., cepa NS-O-89 de Metschnikowia sp. e a espécie única de Metschnikowia aqui descrita, Metschnikowia sp. HO, alternativamente conhecida como HO Metschnikowia sp. A espécie de Metschnikowia aqui descrita, ou seja, a HO Metschnikowia sp., é uma espécie recém-descoberta, designada com o Número de Acesso 081116-01, e que foi depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá (IDAC) , uma Autoridade Depositária Internacional, cujo endereço situa-se em 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá R3E 3R2, em 08 de novembro de 2016, segundo os termos do Tratado de Budapeste. O nome cientifico proposto para a H0 Metschnikowia sp. é Metschnikowia vinificola (vinifi: de vinifera (espécie
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23/227 de uva de vinho); cola: da palavra latina incola que significa habitante). Assim, o nome da espécie de vinificola (habitante de uvas viniferas) refere-se ao isolamento da cepa do tipo de uvas de vinho.
[0045] Adicionalmente, uma espécie de Metschnikowia citada no presente pode incluir uma espécie de Metschnikowia não natural ou recombinante. A intenção é que tal organismo signifique uma espécie de Metschnikowia com pelo menos uma alteração genética não encontrada normalmente nas espécies naturais de Metschnikowia, incluindo cepas do tipo selvagem da espécie mencionada. As alterações genéticas incluem, por exemplo, modificações introduzindo ácidos nucleicos codificantes que podem expressar polipeptideos metabólicos, outras adições de ácidos nucleicos, deleções de ácidos nucleicos e/ou outra interrupção gênica do material genético do organismo microbiano. Tais modificações incluem, por exemplo, regiões de codificação, e fragmentos funcionais das mesmas, para polipeptideos heterólogos, homólogos ou ambos, heterólogos e homólogos, da espécie mencionada. Modificações adicionais incluem, por exemplo, regiões reguladoras não codificadoras nas quais as modificações alteram a expressão de um gene ou operon. Polipeptideos metabólicos exemplares incluem enzimas ou proteínas em uma via metabólica ora descrita.
[0046] Uma modificação metabólica refere-se a uma reação bioquímica que é alterada de seu estado natural. Portanto, a espécie de Metschnikowia aqui descrita pode ter modificações genéticas em uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam polipeptideos metabólicos, ou fragmentos funcionais
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24/227 dos mesmos, as quais alteram a reação bioquímica catalisada pelo polipeptídeo metabólico, incluindo reações catabólicas ou anabólicas e metabolismo basal. Modificações metabólicas exemplares são reveladas no presente.
[0047] Neste relatório descritivo, o termo via metabólica refere-se a um ou mais polipeptídeos metabólicos (p. ex., proteínas ou enzimas) que catalisam a conversão de um composto substrato em um composto produto e/ou produzem um co-substrato para a conversão de um composto substrato em um composto produto. Tal composto produto pode ser um dos compostos bioderivados aqui descritos, ou um composto intermediário que pode levar ao composto bioderivado quando da conversão posterior por outras proteínas ou enzimas da via metabólica. Assim, uma via metabólica pode ser composta por uma série de polipeptídeos metabólicos (p. ex., dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais) que atuam sobre um composto substrato para convertê-lo em um dado composto produto através de uma série de compostos intermediários. Os polipeptídeos metabólicos de uma via metabólica podem ser codificados por um ácido nucleico exógeno como aqui descrito ou produzidos naturalmente pela espécie de Metschnikowia.
[0048] Neste relatório descritivo, o termo superexpressão, ou equivalentes gramaticais do mesmo, pretende significar a expressão de um produto gênico (p. ex., ácidos ribonucleicos (RNA) , proteina ou enzima) em uma quantidade que é maior do que é normal para uma espécie hospedeira de Metschnikowia, ou em um momento ou local na espécie hospedeira de Metschnikowia que é diferente daquele da expressão do tipo selvagem.
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25/227 [0049] Neste relatório descritivo, os termos identidade de sequência ou homologia de sequência, quando usado em referência a uma sequência de ácido nucleico ou uma sequência de aminoácidos, referem-se à similaridade entre duas ou mais moléculas de ácidos nucleicos ou entre dois ou mais polipeptídeos. A identidade pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência, a qual pode ser comparada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então, as moléculas são idênticas naquela posição. Um grau de identidade entre sequências é em função do número de acertos ou de posições homólogas, compartilhados pelas sequências. O alinhamento de duas sequências para determinar o seu percentual de identidade de sequência pode ser efetuado utilizando programas de software conhecidos na técnica, como, por exemplo, aqueles descritos em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Uohn Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999). De preferência, parâmetros padrão são utilizados para o alinhamento. Um programa de alinhamento bem conhecido na técnica que pode ser utilizado é o BLAST configurado para parâmetros padrão. Especificamente, os programas são BLASTN e BLASTP, utilizando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; ordenadas por = HIGH SCORE (escore alto); Banco de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBU + PDB + GenBank CDS translations + SwissProtein + SPupdate + PIR. Detalhes desses programas podem ser encontrados no National Center for Biotechnology Information.
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26/227 [0050] Neste relatório descritivo, o termo substancialmente anaeróbico quando usado em referência a uma cultura ou condição de crescimento pretende significar que a quantidade de oxigênio dissolvido em um meio liquido é menor do que aproximadamente 10% de saturação. O termo também pretende incluir câmaras lacradas mantidas com uma atmosfera com menos de aproximadamente 1% de oxigênio, incluindo meio liquido ou sólido.
[0051] Neste relatório descritivo, o termo álcool de açúcar refere-se a um álcool produzido pela redução de um aldeido ou cetona de um açúcar. Assim, um álcool de açúcar C7 refere-se a um álcool produzido pela redução de um aldeido ou cetona de um açúcar com sete átomos de carbono, como volemitol ou um isômero do mesmo.
[0052] Neste relatório descritivo, o termo xilitol refere-se a um álcool de açúcar pentose com a fórmula quimica C5H12O5, massa molar de 152,15 g/mol e nome IUPAC de (2R, 3r,4S)pentano-1,2,3,4,5-pentol [ (2S, 4R)-pentano-1,2,3,4,5-pentol] . Xilitol é usado comumente como uma alternativa de carboidrato baixo e teor calórico baixo ao açúcar, que não afeta os niveis de insulina de pessoas com diabetes e de indivíduos com hiperglicemia.
[0053] Neste relatório descritivo, o termo xilose refere-se a um monossacarideo de cinco carbonos com grupo formila funcional tendo a fórmula C5H10O5, massa molar de 150,13 g/mol e nome IUPAC de (3R,4S,5R)-oxano-2,3,4,5-tetrol. Xilose é também conhecida na técnica como D-xilose, D-xilopiranose, xilosideo, d-(+)-xilose, xilopiranose, açúcar da madeira, xylomed e Dxilopentose.
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27/227 [0054] A presente invenção provê novas espécies de Metschnikowia isoladas que produzem xilitol, e outros compostos bioderivados, a partir de xilose quando cultivadas em meio contendo xilose. Assim, em algumas modalidades, é provida no presente uma espécie de Metschnikowia isolada que produz pelo menos 0,1 g/L/h de xilitol a partir de xilose quando cultivada. É também provida neste documento uma espécie de Metschnikowia isolada que produz pelo menos 1 g/L de xilose a xilitol quando cultivada.
[0055] Conforme pode ser entendido por um técnico no assunto, a quantidade de xilitol a partir de xilose produzida pela espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode variar dependendo das condições de cultura e/ou das modificações metabólicas feitas à espécie de Metschnikowia conforme aqui descrito. Assim, em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,2 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,3 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,4 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,50 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,60 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,70 g/L/h de xilitol a
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28/227 partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,80 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 0,80 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 1,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 1,50 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 2,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 2,50 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 3,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 3,50 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 4,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 5,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 6,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de
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Metschnikowia isolada é pelo menos 7,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 8,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 9,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, a quantidade de xilitol produzida pela espécie de Metschnikowia isolada é ou é pelo menos 10,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose.
[0056] Em algumas modalidades, a eficiência de conversão da espécie de Metschnikowia isolada aqui provida para converter xilose em xilitol é pelo menos 0,01 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,02 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,03 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,04 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,05 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,06 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,07 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,08 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,09 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,1 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,15 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,2 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,25 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,3 g
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30/227 xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,35 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,4 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,45 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,5 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,55 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,6 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,65 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,7 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,75 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,8 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,85 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,8 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 0,85 g xilitol por 1 g de xilose. A eficiência de conversão pode ser pelo menos 1 g xilitol por 1 g de xilose.
[0057] Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 1 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 2 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 3 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 4 g/L. Em algumas modalidades, a
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31/227 concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 5 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 10 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 20 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 30 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 40 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 50 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 60 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 70 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 80 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 90 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 100 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 150 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de
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32/227 xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 200 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 250 g/L. Em algumas modalidades, a concentração de xilitol produzido no meio de cultura pela espécie de Metschnikowia isolada é pelo menos 300 g/L.
[0058] Além disso, é provida também neste documento uma espécie de Metschnikowia isolada que produz uma combinação de compostos bioderivados aqui descritos, cada um em uma taxa especifica. Por exemplo, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 0,11 g/L/h de xilitol e um ou mais dos seguintes compostos: aproximadamente 6,8E-05 g/L/h de n-butanol, aproximadamente 2,5E-04 g/L/h de isobutanol, aproximadamente 2,4E-04 g/L/h de isopropanol, aproximadamente 2,64E-04 g/L/h de etanol ou aproximadamente 3,73E-06 g/L/h de álcool 2-fenetilico. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 6,8E-05 g/L/h de n-butanol. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 2,5E-04 g/L/h de isobutanol. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 2,4E-04 g/L/h de isopropanol. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 2,64E-04 g/L/h de etanol. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 3,73E-06 g/L/h de álcool
2-fenetilico. Quando uma espécie de Metschnikowia isolada aqui
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33/227 descrita produz uma combinação de compostos bioderivados em taxas especificas, então, a razão entre esses compostos pode ser determinada. Assim, em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita produz os compostos xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-fenetilico a uma concentração de aproximadamente 8.000 mg/L de xilitol, aproximadamente 4,85 mg/L de n-butanol, aproximadamente 18,06 mg/L de isobutanol, aproximadamente 17,5 mg/L de isopropanol, aproximadamente 19,7 mg/L de etanol e aproximadamente 0,269 mg/L de álcool 2-fenetilico.
[0059] As condições de cultura que pode produzir a taxa de xilitol a partir de xilose aqui descrita incluem condições que variam a quantidade de aeração do meio, a temperatura do meio, a quantidade de tempo durante o qual a cultura é cultivada e a composição do meio. Em algumas modalidades, o cultivo da espécie de Metschnikowia isolada ocorre em condições aeróbicas. Em algumas modalidades, o cultivo da espécie de Metschnikowia isolada ocorre em condições substancialmente anaeróbicas. Em algumas modalidades, a temperatura do meio varia de 20 °C a 35 °C ou, alternativamente, 26 °C a 35°C ou, alternativamente, 28 °C a 32 °C ou, alternativamente, a cerca de 30 °C. Em algumas modalidades, a cultura é cultivada por 1 dia. Em alguma modalidade, a cultura é cultivada por 2 dias.
Em algumas modalidades, a cultura é cultivada por 3 dias. Em
algumas modalidades, a cultura é cultivada por 4 dias. Em
algumas modalidades, a cultura é cultivada por 5 dias. Em
algumas modalidades, a cultura é cultivada por 6 dias. Em
algumas modalidades, a < cultura é cultivada por 7 or i mais di as .
A composição do meio pode ser qualquer meio bem conhecido na
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34/227 técnica para cultivar leveduras, especialmente espécies no gênero de Metschnikowia. Os meios exemplares incluem, entre outros, o meio Yeast Extract Peptone (YEP) ou o meio Yeast Nitrogen Base (YNB). Adicionalmente, a fonte de carbono no meio, utilizada pela espécie de Metschnikowia isolada, pode incluir xilose como a única fonte de carbono, bem como xilose em combinação com outras fontes de carbono aqui descritas. A
quantidade da fonte de carbono no meio pode variar de 1 % a 20%
(p. ex. , 1 % a 20% de xilose) ou, alternativamente, 2% a 14%
(p. ex. , 2 % a 14% de xilose) ou, alternativamente, 4% a 10%
(p. ex. , 4a a 10 % de xilose) . Em algumas modalidades , a
quantidade a fonte de carbono é 4% (p. ex., 4% de xilose).
[0060] Em algumas modalidades, xilose não é a única fonte de carbono. Por exemplo, em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C3, uma fonte de carbono C4, uma fonte de carbono C5, uma fonte de carbono C6 ou uma combinação das mesmas. Assim, em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C3 (p. ex., glicerol) . Em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C4 (p. ex., eritrose ou treose) . Em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C5 (p. ex., arabitol, ribose ou lixose) . Em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C6 (p. ex., glicose, galactose, manose, alose, altrose, gulose e idose) . Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, o meio inclui xilose e celobiose, galactose, glicose, arabitol, sorbitol e glicerol ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade especifica, o meio inclui xilose e glicose. A quantidade das duas ou mais fontes de carbono no meio pode
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35/227 variar independentemente de 1% a 20% (p. ex., 1% a 20% de xilose e 1% a 20% de glicose) ou, alternativamente, 2% ato 14% (p. ex., 2% a 14% de xilose e 2% a 14% de glicose) ou, alternativamente, 4% a 10% (p. ex., 4% a 10% de xilose e 4% a
10%) . Em uma modalidade : especifica, a quantidade de cada uma
das fontes de carbono é 2 % (p. ex., 2% de xilose e 2% de
glicose) .
[0061] Tendo por base as condições aqui descritas, em uma
modalidade especifica, é aqui provida uma espécie de
Metschnikowia isolada que produz pelo menos 0,1 g/L/h de
xilitol a partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30 °C por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 4% de xilose. Em outra modalidade especifica, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que converte pelo menos 0,1% (m/v) de xilose em xilitol quando cultivada em condições aeróbicas e a 30 °C por três dias em meio liquido Yeast Nitrogen Base (YNB) compreendendo 4% de xilose. Em ainda outra modalidade especifica, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada que converte pelo menos 0,1% (m/v) de xilose em xilitol quando cultivada em condições aeróbicas e a 30 °C por dois dias em meio liquido Yeast Nitrogen Base (YNB) compreendendo 2% de xilose e 2% de glicose. Em mais outra modalidade especifica, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir aproximadamente 0,11 g/L/h de xilitol, aproximadamente 6,8E-05 g/L/h de n-butanol, aproximadamente 2,5E-04 g/L/h de isobutanol, aproximadamente 2,4E-04 g/L/h de isopropanol, aproximadamente 2,64E-04 g/L/h de etanol e aproximadamente 3,73E-06 g/L/h de álcool 2
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36/227 fenetilico quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 4% de xilose. Em ainda outra modalidade especifica, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir os compostos xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-fenetilico a uma concentração de aproximadamente 8.000 mg/L de xilitol, aproximadamente 4,85 mg/L de n-butanol, aproximadamente 18,06 mg/L de isobutanol, aproximadamente 17,5 mg/L de isopropanol, aproximadamente 19,7 mg/L de etanol e aproximadamente 0,269 mg/L de álcool 2-fenetilico quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 4% de xilose. Em ainda outra modalidade especifica, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode produzir os compostos xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-fenetilico numa razão relativa de 99,26% de xilitol, 0,061% de n-butanol, 0,223% de isobutanol, 0,217% de isopropanol, 0,236% de etanol e 0,003% de álcool 2-fenetilico quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 4% de xilose.
[0062] Ensaios adequados de purificação e/ou para testar a produção de um composto bioderivado produzido por uma espécie de Metschnikowia aqui descrita, incluindo ensaios para testar a produção de xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol ou álcool 2-fenetilico, podem ser realizados utilizando métodos bem conhecidos (vide também Exemplos). Réplicas adequadas, como culturas em triplicata, podem ser cultivadas para cada espécie de Metschnikowia a ser testada. A formação de compostos e subprodutos na espécie de Metschnikowia pode
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37/227 ser monitorada. 0 produto final, intermediários e outros compostos podem ser analisados por métodos como HPLC (Cromatografia liquida de alta eficiência), GC-MS (Cromatografia gasosa-Espectroscopia de massas) e LC-MS (Cromatografia líquida-Espectroscopia de massas) ou outros métodos analíticos adequados utilizando procedimentos rotineiros bem conhecidos na técnica. A liberação do composto no caldo de fermentação pode também ser testada com o sobrenadante da cultura. Subprodutos e resíduos de fontes de carbono podem ser quantificados por HPLC utilizando, por exemplo, uma coluna de troca catiônica, um detector de índice de refração e um detector de UV (Lin et al., Biotechnol. Bioeng. 90:775-779 (2005)), ou outros métodos adequados de ensaios e detecção bem conhecidos na técnica. A atividade individual de enzimas ou proteínas de uma via metabólica pode também ser analisada utilizando métodos bem conhecidos na técnica.
[0063] Uma espécie de Metschnikowia isolada aqui provida, além de ou como alternativa à característica de produção acima, pode ser identificada pela característica genética. Por exemplo, em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita possui uma sequência do domínio D1/D2 que inclui SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita possui uma sequência do domínio D1/D2 com uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 96,8%, pelo menos 96,9%, pelo menos 97%, pelo menos
97,1%, pelo menos 97,2%, pelo menos 97,3%, pelo menos 97,4%, pelo menos 97,5%, pelo menos 97,5%, pelo menos 97,6%, pelo menos 97,7%, pelo menos 97,8%, pelo menos 97,9%, pelo menos
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98%, pelo menos 98,1%, pelo menos 98,2%, pelo menos 98,3%, pelo menos 98,4%, pelo menos 98,5%, pelo menos 98,6%, pelo menos 98,7%, pelo menos 98,8%, pelo menos 98,9%, pelo menos 99%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% idêntica à SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, uma espécie de
Metschnikowia isolada aqui descrita possui uma sequência do domínio D1/D2 que inclui uma sequência de ácido nucleico dentro da sequência consenso de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita possui uma sequência do domínio D1/D2 que é pelo menos 97,1%, pelo menos 97,2%, pelo menos 97,3%, pelo menos
97,4%, pelo menos 97,5%, pelo menos 97,6%, pelo menos 97,7%, pelo menos 97,8%, pelo menos 97,9%, pelo menos 98,0%, pelo menos 98,1%, pelo menos 98,2%, pelo menos 98,3%, pelo menos
98,4%, pelo menos 98,5%, pelo menos 98,6%, pelo menos 98,7%, pelo menos 98,8%, pelo menos 98,9%, pelo menos 99,0%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos
99,4%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, pelo menos 99,9% idêntica à sequência consenso do domínio D1/D2 de SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita possui uma sequência do domínio D1/D2 que inclui uma sequência de ácido nucleico compreendendo os resíduos 1-153, 178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 1, 2, 3 ou 4 substituições nucleotídicas.
[0064] Além de ou alternativamente à sequência do domínio D1/D2, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita pode
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39/227 ser identificada pela presença de uma sequência de ácido nucleico que é única da HO Metschnikowia sp. Assim, em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita possui pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de ArolO (SEQ ID NO: 37), Gxf2 (SEQ ID NO: 40), Hgtl9 (SEQ ID NO: 42), Hxt5 (SEQ ID NO: 44), Tefl (SEQ ID NO: 46), Xksl (SEQ ID NO: 51), Xyll (SEQ ID NO: 52), Tall (SEQ ID NO: 55) e Tkll (SEQ ID NO: 56). Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína ArolO (SEQ ID NO: 37) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Gxf2 (SEQ ID NO: 40). Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Hgtl9 (SEQ ID NO: 42). Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Hxt5 (SEQ ID NO: 44) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Tefl (SEQ ID NO: 49) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Xksl (SEQ ID NO: 51) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a
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40/227 sequência de aminoácidos da proteína Xyll (SEQ ID NO: 52) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Tall (SEQ ID NO: 55) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácidos da proteína Tkll (SEQ ID NO: 56).
[0065] Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita possui pelo menos uma sequência codificante de ácido nucleico selecionado a partir de ACT1 (SEQ ID NO: 57), ARO8 (SEQ ID NO: 58), AROIO (SEQ ID NO: 59), GPD1 (SEQ ID NO: 60), GXF1 (SEQ ID NO: 61), GXF2 (SEQ ID NO: 62), GXS1 (SEQ ID NO: 63), HXT19 (SEQ ID NO: 64), HXT2.6 (SEQ ID NO: 65), HXT5 (SEQ ID NO: 66), PGK1 (SEQ ID NO: 67), QUP2 (SEQ ID NO: 68), RPB1 (SEQ ID NO: 69), RPB2 (SEQ ID NO: 70), TEF1 (SEQ ID NO: 71), TPI1 (SEQ ID NO: 72), XKS1 (SEQ ID NO: 73), XYL1 (SEQ ID NO: 74), XYL2 (SEQ ID NO: 75), XYT1 (SEQ ID NO: 76), TALI (SEQ ID NO: 77) e TKL1 (SEQ ID NO: 78). Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de ACT1 (SEQ ID NO: 57) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de ARO8 (SEQ ID NO: 58) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de AROIO (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de GPD1 (SEQ ID NO: 60) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui
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41/227 descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de GXF1 (SEQ ID NO: 61) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de GXF2 (SEQ ID NO: 62) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de GXS1 (SEQ ID NO: 63) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de HXT19 (SEQ ID NO: 64) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de HXT2. 6 (SEQ ID NO: 65). Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de HXT5 (SEQ ID NO: 66) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de PGK1 (SEQ ID NO: 67) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de QUP2 (SEQ ID NO: 68) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de RPB1 (SEQ ID NO: 69) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de RPB2 (SEQ ID NO: 70) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de TEF1 (SEQ ID NO: 71) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de TPI1 (SEQ ID NO: 72) . Em
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42/227 algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de XKS1 (SEQ ID NO: 73) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de XYL1 (SEQ ID NO: 74) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de XYL2 (SEQ ID NO: 75) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de XYT1 (SEQ ID NO: 76) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de TALI (SEQ ID NO: 77) . Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência codificante de ácido nucleico de TKL1 (SEQ ID NO: 78).
[0066] Além de ou alternativamente à sequência do domínio D1/D2 e da proteína única e de ácidos nudeicos codificantes de HO Metschnikowia sp., uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita pode ser identificada por certas características fisiológicas. Por exemplo, em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita cresce até atingir ODsoo de aproximadamente 25 dentro de 41 horas de cultura em meio Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 2% de xilose como a única fonte de carbono. Outras características identificadoras incluem: células com formato de globoso a oval; o brotamento multilateral; células de pulcherrima esféricas abundantes semelhantes a clamidósporos quando cultivadas em caldo por 7 dias a 30 °C; crescimento lento a 4 °C, crescimento normal entre 20 °C e 33 °C e/ou nenhum crescimento a 37 °C em ágar
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YPD; secreção de pigmento rosa para o meio; e a assimilação de D-glicose, D-galactose, D-xilose, sacarose, glicerol, etanol, succinato e celobiose.
[0067] Em certas modalidades especificas, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56.
[0068] Em certas modalidades especificas, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico dentro da sequência consenso de SEQ ID NO: 2 e pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56.
[0069] Em certas modalidades especificas, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico compreendendo os resíduos 1-153, 178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 4 substituições nucleotidicas, e pelo menos uma sequência de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56.
[0070] Em certas modalidades especificas, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência do dominio D1/D2 que inclui uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1 e pelo menos uma sequência codificante de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NOS: 57-78 .
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[0071] Em certas modalidades especificas, uma espécie de
Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência do
dominio D1/D2 que inclui uma sequência de ácido nucleico
dentro da sequência consenso de SEQ ID NO: 2 e pelo menos uma
sequência codificante de ácido nucleico selecionada a partir
de SEQ ID NOS: 57-78.
[0072] Em certas modalidades especificas, uma espécie de
Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência do dominio D1/D2 que inclui uma sequência de ácido nucleico compreendendo os resíduos 1-153, 178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 4 substituições nucleotidicas, e pelo menos uma sequência codificante de ácido nucleico selecionada a partir de SEQ ID NOS: 57-78.
[0073] Em certas modalidades especificas, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui: uma sequência do dominio D1/D2 que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; e uma sequência codificante de ácido nucleico de SEQ ID NO: 70, e em que a espécie de Metschnikowia isolada cresce até atingir ODsoo de aproximadamente 25 dentro de 41 horas de cultura em meio Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 2% de xilose como a única fonte de carbono.
[0074] Em certas modalidades especificas, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 97,1% idêntica à sequência consenso do dominio D1/D2 de SEQ ID NO: 2; e uma sequência codificante de ácido nucleico de SEQ ID NO: 70.
[0075] Além disso, é também provida neste documento uma espécie de Metschnikowia isolada tendo uma das sequências especificas do dominio D1/D2 aqui descrita. Por exemplo, em
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45/227 algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita inclui uma sequência de ácido nucleico que é selecionada a partir de uma dentre SEQ ID NOS: 1 e 3-25. Assim, em algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia
ID NO: 3. Em isolada inclui uma sequencra de ácido nucleico de SEQ ID NO:
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 5.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 6.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 7.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 8.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 9.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 10.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 11.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 12.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 13.
Em algumas modalidades a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma sequência de ácido nucleico de SEQ ID
NO: 14.
Em algumas
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modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 15. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 16. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 18. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 19. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 20. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 21. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 22. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 23. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 24. Em algumas
modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada inclui uma
sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 25.
[0076] Em certas modalidades especificas, uma espécie de
Metschnikowia isolada aqui descrita inclui um dominio D1/D2
que não compreende o dominio D1/D2 de uma espécie conhecida de Metschnikowia. Por exemplo, tais domínios que não estão
incluídos são os domínios D1/D2 de, entre outras, as espécies
dentro do ciado de Metschnikowia pulcherrima, como
Metschnikowia andauensis, Metschnikowia chrysoperlae,
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Metschnikowia fructicola, Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia shanxiensis, Metschnikowia sinensis e Metschnikowia zizyphicola.
[0077] Em algumas modalidades, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada designada com o Número de Acesso 08111601, depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá, uma Autoridade Depositária Internacional, em 08 de novembro de 2016, segundo os termos do Tratado de Budapeste. A espécie de Metschnikowia isolada designada com o Número de Acesso 081116-01 é mencionada no presente como HO ou a H0 Metschnikowia sp. A Autoridade Depositária Internacional do Canadá está localizada em 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, Canadá R3E 3R2.
[0078] Além disso, é também provida neste documento uma espécie recombinante de Metschnikowia. Assim, em algumas modalidades, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia isolada designada com o Número de Acesso 081116-01, depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá, uma Autoridade Depositária Internacional, em 08 de novembro de 2016, segundo os termos do Tratado de Budapeste, em que a espécie de Metschnikowia inclui ainda uma via metabólica capaz de produzir um composto bioderivado a partir de xilose ou uma modificação genética, ou ambos. Em uma modalidade especifica, a via metabólica compreende pelo menos uma sequência exógena de ácido nucleico codificante de pelo menos uma enzima da via metabólica.
[0079] Como aqui descrita, a espécie recombinante de Metschnikowia provida pode ser modificada para incluir uma via metabólica capaz de produzir um composto bioderivado a partir
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48/227 de xilose. Quando essa modificação inclui a introdução de uma sequência exógena heteróloga de ácido nucleico codificante de pelo menos uma enzima da via metabólica, a sequência de codificação da enzima pode ser modificada de acordo com a utilização de códons do hospedeiro. 0 código genético padrão é bem conhecido na técnica, conforme revisado em, por exemplo, Osawa et al., Microbiol Rev. 56(1) :229-64 (1992) . Espécies de leveduras, incluindo, entre outras, Saccharomyces cerevisiae, Candida azyma, Candida diversa, Candida magnoliae, Candida rugopelliculosa, Yarrowia lipolytica e Zygoascus hellenicus, utilizam o código padrão. Certas espécies de leveduras utilizam códigos alternativos. Por exemplo, CUG, códon padrão para Leu, codifica Ser em espécies do ciado CUG como Candida albicans, Candida cylindracea, Candida melibiosica, Candida parapsilosis, Candida rugose, Pichia stipitis e espécies de Metschnikowia. A tabela de códons de DNA para a HO Metschnikowia sp. é fornecida abaixo. 0 códon CTG do DNA em um gene exógeno de uma espécie não do ciado CUG precisa ser trocado para TTG, CTT, CTC, TTA ou CTA para expressão funcional de uma proteína na espécie de Metschnikowia. Outra otimização de códons pode resultar em aumento da expressão proteica de um gene exógeno na espécie de Metschnikowia. Métodos de otimização de códons são bem conhecidos na técnica (p. ex. , Chung et al., BMC Syst Biol. 6:134 (2012); Chin et al., Bioinformatics 30(15):2210-12 (2014)), e existem várias ferramentas disponíveis (p. ex., DNA2.0 em https://www.dna20.com/services/genegps; e OPTIMIZER em http://genomes.urv.es/OPTIMIZER).
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Códons para HO Metschnikowia sp.
Aminoácido SLC Códons de DNA
Isoleucina I ATT ATC ATA
Leucina L CTT CTC CTA TTA TTG
Valina V GTT GTC GTA GTG
Fenilalanina F TTT TTC
Metionina M ATG
Cisteína C TGT TGC
Alanina A GCT GCC GCA GCG
Glicina G GGT GGC GGA GGG
Prolina P CCT CCC CCA CCG
Treonina T ACT ACC ACA ACG
Serina S TCT TCC TCA TCG AGT AGC CTG
Tirosina Y TAT TAC
Triptofano W TGG
Glutamina 0 CAA CAG
Asparagina N AAT AAC
Histidina H CAT CAC
Ácido E GAA GAG
glutâmico
Ácido D GAT GAC
aspártico
Lisina K AAA AAG
Arginina R CGT CGC CGA CGG AGA AGG
Códons de Stop TAA TAG TGA
parada
[0080] Em algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia isolada aqui provida pode ter uma ou mais vias biossintéticas para produzir compostos como xilitol, arabitol, etanol, n
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50/227 butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetílico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol a partir de xilose. A via biossintética pode ser uma via endógena ou uma via exógena. A espécie de Metschnikowia aqui provida pode ter ainda ácidos nucleicos que podem expressar que codificam uma ou mais das enzimas ou proteínas participantes em uma ou mais vias biossintéticas de produtos como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetílico, 2-metil-butanol, e 3-metil-butanol. Os ácidos nucleicos para alguma parte ou toda uma via biossintética em particular podem ser expressos, dependendo de quais enzimas ou proteínas são endógenas para espécie de Metschnikowia. Em algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia pode ter expressão endógena de todas as enzimas de uma via biossintética para produzir um composto a partir de xilose e produzir naturalmente o composto, o que pode ser melhorado modificando mais ou aumentando a expressão de uma enzima ou proteína da via biossintética (p. ex., um transportador de xilose). Em algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia pode ser deficiente em uma ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética desejada, então, ácidos nucleicos que podem expressar a(s) enzima(s) ou proteína(s) deficiente(s) são introduzidos na espécie de Metschnikowia para expressão exógena subsequente. Alternativamente, se a espécie de Metschnikowia exibir expressão endógena de alguns genes da via, mas é deficiente em outros, então é preciso um ácido nucleico codificante da(s) enzima(s) ou proteína (s) deficiente(s) para conseguir a biossíntese do composto desejado. Assim, uma espécie recombinante de Metschnikowia
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51/227 pode incluir ainda mais as atividades de enzimas ou proteínas exógenas para obter uma via biossintética desejada ou uma via biossintética desejada pode ser obtida introduzindo uma ou mais atividades de enzimas ou proteínas exógenas que, junto com uma ou mais enzimas ou proteínas endógenas, para produzir um composto desejado como xilitol, arabitol, etanol, nbutanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol a partir de xilose.
[0081] A espécie de Metschnikowia aqui provida pode conter alterações genéticas estáveis, que se refere a microrganismos que podem ser cultivados por mais de cinco gerações sem perda da alteração. Em geral, as alterações genéticas estáveis incluem modificações que persistem por mais de 10 gerações, sendo que modificações especialmente estáveis persistirão por mais de aproximadamente 25 gerações e, mais especialmente, modificações genéticas estáveis persistirão por mais de 50 gerações, incluindo indefinidamente.
[0082] No caso de interrupções gênicas, uma alteração genética estável especialmente útil é deleção do gene. O uso de uma deleção gênica para introduzir uma alteração genética estável é especialmente útil para reduzir a probabilidade de reversão para um fenótipo anterior à alteração genética. Por exemplo, a produção estável de uma substância bioquímica, acoplada ao crescimento, pode ser conseguida, por exemplo, pela deleção de um gene codificante de uma enzima que catalisa uma ou mais reações dentro de um grupo de modificações metabólicas. A estabilidade da produção de uma substância bioquímica acoplada ao crescimento pode ser reforçada mais através de deleções
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52/227 múltiplas, reduzindo significativamente a probabilidade de que ocorram múltiplas reversões compensadoras para cada atividade interrompida.
[0083] Os técnicos no assunto entenderão que as alterações genéticas, incluindo as modificações metabólicas aqui exemplificadas, são descritas com referência a um organismo hospedeiro adequado como uma espécie de Metschnikowia aqui provida e as suas reações metabólicas correspondentes ou um organismo adequado como fonte do material genético adequado tal como genes para uma via metabólica desejada. No entanto, dado o sequenciamento completo do genoma de uma ampla variedade de organismos e o elevado nivel de capacidade na área da genômica, os técnicos no assunto serão rapidamente capazes de aplicar os ensinamentos e orientação ora fornecidos para essencialmente todos os outros organismos. Por exemplo, as alterações metabólicas aqui exemplificadas podem ser facilmente aplicadas a outras espécies pela incorporação do mesmo ácido nucleico codificante ou análogo de outras espécies além daquelas citadas. Tais alterações genéticas incluem, por exemplo, alterações genéticas de homólogos da espécie, em geral e, em particular, deslocamentos de genes ortólogos, parálogos ou não ortólogos.
[0084] Um ortólogo é um gene ou genes relacionados por descendência vertical e que são responsáveis por funções substancialmente iguais ou idênticas em organismos diferentes. Por exemplo, a epóxido hidrolase de camundongo e a epóxido hidrolase humana podem ser consideradas ortólogas para a função biológica de hidrólise de epóxidos. Os genes são relacionados por descendência vertical quando, por exemplo,
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53/227 eles compartilham similaridade de sequência em quantidade suficiente para indicar que são homólogos, ou são relacionados por evolução a partir de um ancestral comum. Os genes podem também ser considerados ortólogos se compartilharem a estrutura tridimensional, mas não necessariamente similaridade de sequência, em quantidade suficiente para indicar que evoluiram a partir de um ancestral comum na medida em que a similaridade de sequência primária não possa ser identificada. Genes ortólogos podem codificar proteínas com similaridade de sequência entre aproximadamente 25% e 100% de identidade da sequência de aminoácidos. Além disso, pode também ser considerado que genes codificantes de proteínas que compartilham similaridade dos aminoácidos inferior a 25% tenham surgido por descendência vertical caso as suas estruturas tridimensionais mostrem também similaridades. Considera-se que membros da familia de enzimas serina protease, incluindo o ativador plasminogênio tecidual e a elastase, tenham surgido por descendência vertical a partir de um ancestral comum.
[0085] Ortólogos incluem genes ou seus produtos gênicos codificados que, através, por exemplo, de evolução, divergiram em estrutura ou atividade global. Por exemplo, quando uma espécie codifica um produto gênico exibindo duas funções e quando tais funções foram separadas em genes distintos em uma segunda espécie, os três genes e os seus produtos correspondentes são considerados ortólogos. Para a produção de um composto bioquímico, os técnicos no assunto entenderão que deve ser escolhido um gene ortólogo abrigando a atividade metabólica a ser introduzida ou interrompida no
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54/227 desenvolvimento de uma espécie de Metschnikowia aqui provida. Um exemplo de ortólogo exibindo atividades separáveis é quando atividades distintas foram separadas em produtos gênicos distintos entre duas ou mais espécies ou dentro de uma única espécie. Um exemplo especifico é a separação de proteólise da elastase e proteólise do plasminogênio, dois tipos de atividade serina protease, em moléculas distintas como ativador de plasminogênio e elastase. Um segundo exemplo é a separação da atividade 5'-3' exonuclease de micoplasma e DNA polimerase III de Drosophila. A DNA polimerase da primeira espécie pode ser considerada um ortólogo de qualquer uma ou de ambas as exonucleases ou a polimerase da segunda espécie e vice-versa.
[0086] Em contraste, parálogos são homólogos relacionados, por exemplo, por duplicação seguida por divergência evolucionária e têm funções semelhantes ou comuns, mas não idênticas. Parálogos podem originar-se ou serem derivados de, por exemplo, a mesma espécie ou de uma espécie diferente. Por exemplo, epóxido hidrolase microssomal (epóxido hidrolase I) e epóxido hidrolase solúvel (epóxido hidrolase II) podem ser consideradas parálogas porque representam duas enzimas distintas, que evoluiram simultaneamente a partir de um ancestral comum, que catalisam reações distintas e têm funções distintas na mesma espécie. Parálogos são proteínas da mesma espécie com similaridade de sequência significativa entre si, sugerindo que são homólogas ou relacionadas por evolução simultânea a partir de um ancestral comum. Grupos de famílias de proteínas parálogas incluem homólogos de HipA, genes de luciferase, peptidases e outros.
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55/227 [0087] Um deslocamento de gene não ortólogo é um gene não ortólogo de uma espécie que pode substituir a função de um gene de referência em uma espécie diferente. A substituição inclui, por exemplo, ser capaz de executar substancialmente a mesma ou uma função semelhante na espécie de origem em comparação à função de referência na espécie diferente. Embora em geral, um deslocamento de gene não ortólogo possa vir a ser identificado como estruturalmente relacionado a um gene conhecido que codifica a função de referência, genes menos estruturalmente relacionados, mas funcionalmente semelhantes e os seus produtos gênicos correspondentes, não obstante, ainda se enquadrarão no significado do termo como usado neste relatório descritivo. A similaridade funcional requer, por exemplo, pelo menos alguma similaridade estrutural no sitio ativo ou na região de ligação de um produto gênico não ortólogo em comparação a um gene que codifica a função a ser substituída. Portanto, um gene não ortólogo inclui, por exemplo, um parálogo ou um gene não relacionado.
[0088] Portanto, ao identificarem e desenvolverem uma espécie de Metschnikowia aqui provida tendo capacidade biossintética, os técnicos no assunto entenderão que, aplicando os ensinamentos e a orientação aqui fornecidos em relação a uma determinada espécie, a identificação de modificações metabólicas pode incluir identificação e inclusão ou inativação de ortólogos. Na medida em que parálogos e/ou deslocamentos de genes não ortólogos estejam presentes no microrganismo de referência que codificam uma enzima catalisadora de uma reação metabólica semelhante ou substancialmente semelhante, os técnicos no assunto também
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56/227 podem utilizar esses genes relacionados evolutivamente. Do mesmo modo, para uma interrupção gênica, genes relacionados evolutivamente podem também ser interrompidos ou excluídos em um organismo microbiano hospedeiro para reduzir ou eliminar a redundância funcional de atividades enzimáticas tendo como alvo a interrupção.
[0089] Ortólogos, parálogos e deslocamentos de genes não ortólogos podem ser determinados por métodos bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Por exemplo, a inspeção das sequências de ácidos nucleicos ou de aminoácidos de dois polipeptideos revelará a identidade de sequência e similaridades entre as sequências comparadas. Com base em tais similaridades, o técnico no assunto pode determinar se a similaridade é suficientemente alta para indicar que as proteínas estão relacionadas através de evolução a partir de um ancestral comum. Algoritmos bem conhecidos pelos técnicos no assunto, como Align, BLAST, Clustal W e outros comparam e determinam uma similaridade ou identidade de sequência bruta, e também determinam a presença ou significância de lacunas (gaps) na sequência, à qual pode ser atribuído um peso ou escore. Tais algoritmos são também conhecidos na técnica e podem ser igualmente aplicados para determinar a similaridade ou identidade de sequência de nucleotídeos. São computados parâmetros de similaridade suficiente para determinar a relação com base em métodos bem conhecidos para o cálculo da similaridade estatística, ou a possibilidade de encontrar um pareamento semelhante em um polipeptídeo aleatório, e a significância do pareamento determinada. Uma comparação por computador de duas ou mais sequências pode, se desejado, ser
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57/227 também aperfeiçoada visualmente pelos técnicos no assunto. Podem ser esperados produtos gênicos relacionados ou proteínas com alta similaridade, por exemplo, 25% a 100% de identidade de sequência. Proteínas que não são relacionadas podem ter uma identidade essencialmente igual àquela que se esperaria se ocorrida naturalmente, caso um banco de dados de tamanho suficiente fosse analisado (aproximadamente 5%) . Sequências entre 5% e 24% podem ou não representar homologia suficiente para concluir que as sequências comparadas estão relacionadas. Pode-se realizar análise estatística adicional para determinar a significância de tais pareamentos dado o tamanho do conjunto de dados para determinar a relevância dessas sequências.
[0090] Parâmetros exemplares para determinar a relação de duas ou mais sequências utilizando o algoritmo BLAST, por exemplo, pode ser definidos como abaixo. Resumidamente, os alinhamentos de sequências de aminoácidos podem ser realizados com BLASTP versão 2.0,8 (05-Jan-1999) e os seguintes parâmetros: Matriz: 0 BLOSUM62; abertura de lacuna: 11; extensão de lacuna: 1; x_dropoff: 50; esperado: 10,0; tamanho de palavra: 3; filtro: ligado. Os alinhamentos de sequências de ácidos nucleicos podem ser realizados com BLASTN versão 2.0,6 (16-Set-l998) e os seguintes parâmetros: Pareamento: 1; erro no pareamento: 2; abertura de lacuna: 5; extensão de lacuna: 2; x_dropoff: 50; esperado: 10,0; tamanho de palavra: 11; filtro: desligado. Os técnicos no assunto saberão quais modificações podem ser feitas aos parâmetros acima para aumentar ou diminuir o rigor da comparação, por exemplo, e determinar a relação de duas ou mais sequências.
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58/227 [0091] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produção de xilitol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, é provida a espécie de Metschnikowia dispondo de uma via de biossintese para produção de xilitol a partir de xilose. São também providos métodos para produção de xilitol bioderivado, nos quais é realizada a cultura da espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de xilitol em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir xilitol.
[0092] Foram identificadas muitas espécies de leveduras (Candida spp., Debaryomyces hansenii, Pichia anômala, Kluyveromvces spp, Pachysolen tannophilus, Saccharomyces spp. e Schizosaccharomyces pombe) com a capacidade para converter xilose em xilitol (Sirisansaneeyakul et al., J. Ferment. Bioeng. 80:565-570 (1995); Onishi et al., Agric. Biol. Chem. 30:1139-1144 (1966); Barbosa et al., J. Ind. Microbiol. 3:241251 (1988); Gong et al., Biotechnol. Lett. 3:125-130 (1981); Vandeska et al., World J. Microbiol. Biotechnol. 11:213-218 (1995); Dahiya et al. , Cabdirect.org. 292-303 (1990); Gong et al., Biotechnol. Bioeng. 25:85-102 (1983)). A capacidade para produzir xilitol a partir de xilulose também foi descoberta em várias leveduras (Saccharomyces spp., D. hansenii, Pichia farinose, Hansenula spp., Endomycopsis chodatii, Candida spp. e Cryptococcus neoformans) (Onishi et al., Appl. Microbiol. 18:1031-1035 (1969)). A maior parte da pesquisa sobre a produção biológica de xilitol é com leveduras, e novas espécies de leveduras capazes de converter xilose em xilitol continuam a serem descobertas (Kamat et al., J. App.
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Microbiol. 115: 1357-1367 (2013); Bura et al., J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 39:1003-1011 (2012); Junyapate et al., Antonie Van Leeuwenhoek 105:471-480 (2014); Guaman-Burneo et al., Antonie Van Leeuwenhoek 108: 919-931 (2015); Cadete et al., Int. J. Syst. Evolv. Microbiol. 65:2968-2974 (2015)).
[0093] Saccharomyces cerevisiae é um organismo do tipo levedura que é utilizado em muitos processos alimentares, mas que não utiliza naturalmente xilose com eficiência. Para que produzisse xilitol a partir de xilose, foi criada, neste organismo, a expressão de xilose redutases de outras espécies de leveduras como Scheffersomyces stipitis (Pichia stipitis) e Candida shehatae (Hallborn et al. , Bio/Technology 9:1090-1095; Hallborn et al., Appl. Microbiol. Biotechol. 42:326-333 (1994); Lee et al., Process Biochem. 35:1199-1203 (2000);
Giovinden et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 55:76-80 (2001); Chung et al., Enzyme Microb. Technol. 30:809-816 (2002)).
[0094] Vias alternativas para produção de xilitol em S. cerevisiae foram exploradas. A expressão de xilitol desidrogenase de Scheffersomyces stipitis e a deleção do gene xiluloquinase em uma cepa deficiente em transcetolase de S. cerevisiae permitiu a conversão de glicose em xilitol através de uma via com múltiplas etapas (Toivari et al., Appl. Enviorn. Microbiol. 73:5471-5476 (2007)).
[0095] A expressão do transportador de celodextrina e da βglicosidase intracelular de Neurospora crassa permitiu-lhe utilizar simultaneamente celobiose e xilose durante a produção de xilitol (Oh et al., Metab. Eng. 15:226-234 (2013); Zha et al. , PLoS One 8:e68317 (2013)). Além disso, a superexpressão
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60/227 de ALD5, IDP2 de S. cerevisae ou de ZWF1 de S. stipitis levou a níveis aumentados de NADPH, resultando em produtividade mais alta de xilitol (Oh et al., Metab. Eng. 15:226-234 (2013)).
[0096] A produção de xilitol pode ser melhorada pelo uso de xilose redutases com preferência por NADPH e com preferência por NADH para diminuir a limitação de cofatores de NAD(P)H. Essa estratégia foi utilizada em S. cerevisiae com a expressão de xilose redutase de S. stipitis do tipo selvagem com preferência por NADPHH e do mutante com preferência por NADH e de ZWF1 e ACS1 de S. cerevisiae (Jo et al., Biotechnol. J. 10:1935-1943 (2015)) .
[0097] Visando diminuir os custos de processamento da produção de xilitol, xilose redutase de S. stipitis, β-glicosidase de Aspergillus aculeatus, β-xilosidase de Apsergillus oryzae e endoxilanase de Trichoderma reesei foram expressas em S. cerevisiae (Guirimand et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 100:3477-3487 (2016)). A expressão dessas enzimas de fungos permitiu a degradação direta de hemicelulose sem a adição de enzimas exógenas.
[0098] Candida tropicalis é patogênica, mas é também um dos produtores naturais de xilitol. Diversas patentes e literatura descreveram a aplicação de leveduras do gênero Candida como a cepa hospedeira para produção de produção de xilitol a partir de xilose; ou seja, C. tropicalis ATCC 13803 (PCT/IN2009/000027 e KR100259470) , C. tropicalis ATCC 9968 (PCT/FI1990/000015) , C. tropicalis KFCC 10960 (KR100199819),
C. tropicalis (NRRL 12968) (PCT/IN2013/000523), C.tropicalis
ATCC 750 (West et al., World J. Mircrobiol. Biotechnol. 25:913-916 (2009)) e C. tropicalis ATCC 7349 (SAROTE et al.,
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J. Ferment. e Bioeng. 80:565-570 (1995)). Uma estratégia utilizada para melhorar a produção de xilitol em C. tropicalis constituiu a expressão de uma xilose redutase com preferência por NADH de C. parapsilosis, o que permitiu a redução de xilose com NADPH e com NADH (Lee et al., Appl. Enviorn. Microbiol. 69:6179-6188 (2003)). A deleção de xilitol desidrogenase aumenta a produção de xilitol pelo bloqueio do catabolismo de xilitol, mas é preciso um co-substrato como glicose ou glicerol que regenere NADPH para atividade da xilose redutase (Ko et al., Appl. Environ. Microbiol. 72:42074213 (2006); Ko et al., Biotechnol. Lett. 28:1159-1162 (2006)). Melhorias adicionais para produção de xilitol foram efetuadas combinando a deleção do gene de xilitol desidrogenase com a expressão da xilose redutase de Neurospora crassa (Jeon et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 35:191-198 (2012)) . A absorção de xilose e a produtividade de xilitol dessa cepa foi novamente melhorada ainda mais pela expressão de um transportador de xilose de Arabidopsis thaliana (Jeon et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 36:809-817 (2013)).
[0099] Se glicerol for fornecido como co-substrato, a regeneração de NADPH por de reforçada pela expressão de glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase em C. tropicalis (Ahmad et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 35:199-204 (2012)). A produção de xilitol pode também ser reforçada pela deleção de glicerol quinase e expressão de três glicerol desidrogenases regeneradoras de NADP de Scheffersomyces stipitis (Ahmad et al., Bioprocess Biosyst. Eng. 36:1279-1284 (2013)). Um dos problemas com a produção de xilitol a partir de substratos mistos de açúcares
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62/227 é que a xilose redutase de C. tropicalis pode converter arabinose em arabitol, um contaminante na produção de xilitol. Para impedir isso, a xilose redutase endógena foi deletada e uma xilose redutase mutante específica para xilose de Neurospora crassa foi expressa junto com enzimas bacterianas de assimilação de arabinose (Yoon et al. , Biotechnol. Lett. 33:747-753 (2011); Nair et al., ChemBloChem 9:1213-1215 (2008)) . Isso minimizou a formação de arabitol enquanto permitiu a assimilação de arabinose para o crescimento celular.
[00100] Kluyveromyces marxianus é uma levedura termotolerante encontrada frequentemente em laticínios. Pode ser utilizada para a produção de xilitol devido a sua elevada taxa de crescimento, tolerância a temperaturas até 52 °C e capacidade para utilizar vários açúcares. A expressão da xilose redutase de Neurospora crassa isoladamente ou em conjunto com a deleção do gene de xilitol desidrogenase em K. marxianus levou à produção ótima de xilitol a 42 °C (Zhang et al. , Bioresour. Technol. 152:192-201 (2014)). Melhorias adicionais à produção de xilitol foram feitas testando a expressão de vários transportadores de xilose: aquagliceroporina de K. marxianus, facilitador de glicose/xilose de Candida intermedia ou simporte de glicose/xilose de C. intermedia (Zhang et al. , Bioresour. Technol. 175:642-645 (2015)). A expressão do facilitador de glicose/xilose de C. intermedia demostrou ser eficaz para aumentar o rendimento e produtividade de xilitol e, notavelmente, produziu a concentração final mais alta relatada de xilitol. K. marxianus foi também utilizada em um experimento de adaptação evolutiva que resultou em uma cepa
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63/227 com capacidades melhoradas de utilização de xilose e produção de xilitol (Sharma et al. , Bioprocess Biosyst. Eng. 39:835-843 (2016) ) .
[00101] Duas outras espécies de leveduras foram também criadas por engenharia genética para explorar a produção de xilitol. Debaryomyces hansenii é outro produtor natural de xilitol que é osmotolerante não patogênico. A produção de xilitol foi aumentada nessa espécie pela deleção do gene de xilitol desidrogenase (Pai et al. , Bioresour. Technol. 147:449-455 (2013)). Pichia pastoris é uma levedura comumente utilizada para expressão proteica. Foi criada para produzir xilitol diretamente a partir de glicose através da via glicosearabitol-xilulose-xilitol (Cheng et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 98:3539-3552 (2014)). Isso foi conseguido expressando xilitol desidrogenase de Gluconobacter oxydans e a arabitol desidrogenase formadora de xilulose de Klebsiella pneumoniae.
[00102] Além de fungos filamentosos e leveduras, foi observado um número limitado de espécies bacterianas (Corynebacterium sp. e Enterobacter liquefaciens) que produzem xilitol a partir de xilose (Yoshitake et al. , Agric. Biol. Chem. 35:905-911 (1971); Yoshitake et al., Agric. Biol. Chem. 37:2261-2267 (1973); Yoshitake et al., Agric. Biol. Chem. 40:1493-1503 (1976); Rangaswamy et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:8893 (2002)) . Há também relatos de que Mycobacterium smegmatis é capaz de produzir xilitol a partir de xilulose (Izumori et al. , J. Ferment. Technol. 66:33-36 (1988)). Um rastreamento posterior de bactérias constatou que Gluconobacter spp. e Acetobacter xylinum são capazes de converter arabitol em
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64/227 xilitol através da conversão sequenciada de arabitol em xilulose e xilulose em xilitol (Suzuki et al., Biosci. Blotechnol. Biochem. 66:2614-2620 (2002)).
[00103] Microalgas constituem uma plataforma atraente para a produção de recursos renováveis. A produção de xilitol em microalgas foi relatada uma vez, em que a expressão da xilose redutase de Neurospora crassa em Chlamydomonas reinhardtii permitiu-lhe converter uma quantidade pequena de xilose em xilitol (Pourmir et al., J. Blotechnol. 165:178-183 (2013)).
[00104] Foi observado que os extratos de vários fungos filamentosos (Penicillium spp., Aspergillus spp., Rhizopus nigricans, Gliocladium roseum, Byssochlamys fulva, Myrothecium verrucaria, Neurospora crassa, Rhodotorula glutinis e Torulopsis utilis) continham uma enzima capaz de converter xilose em xilitol (Chiang et al., Nature 188:79-81 (1960); Chiang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 3:554-559 (1960); Chiang et al., Biochem. Biophys. Acta. 29:664-5 (1958)). Estudos subsequentes identificaram fungos filamentosos adicionais (Petromyces albertensis, Penicillium spp. e Aspergillus niger) capazes de converter xilose em xilitol com graus variáveis de eficiência (Dahiya et al., Can. J. Microbiol. 37:14-18 (1991); Sampaio et al., Brazilian J.
Microbiol. 34:325-328 (2003)).
[00105] Trichoderma reesei, um fungo filamentoso que secreta enzima celuloliticas, produziu mais xilitol quando os genes para xilitol desidrogenase e L-arabinitol-4-desidrogenase foram deletados visando bloquear o metabolismo de xilitol (Dashtban et al. , Appl. Biochem. Biotecnol. 169:554569(2013)). A produção de xilitol também aumentou em T. reesei
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65/227 quando xilose redutase foi superexpressa e xiluloquinase foi inibida (Hong et al., Blomed Res. Int. 2014:169705 (2014)). Phanerochaete sórdida, um fungo de podridão branca com atividade ligninolitica, produziu mais xilitol quando expressou o gene xilose redutase de Phanerochaete chrysosporium (Hirabayashi et al., J. Biosci. Bioeng. 120:6-8 (2015)).
[00106] As bactérias metabolizam xilose com xilose isomerases em vez de com a via xilose redutase-xilitol desidrogenase. Portanto, o uso de hospedeiros bacterianos para a produção de xilitol tipicamente envolve a expressão recombinante de xilose redutases. A xilose redutase de Candida tropicalis foi expressa em Escherichia coli e demonstrou ser funcional para produção de xilitol a partir de xilose (Suzuki et al., J. Biosci. Bioeng. 87:280-284 (1999)). Um estudo subsequente expressou xilose redutases de Candida boidinii, Candida tenuis e Scheffersomyces stipitis em conjunto com deleção do gene endógeno de xiluloquinase (Cirino et al. , Biotechnol. Bioeng. 95:1167-1176 (2006)). A fim de melhorar a produção de xilitol a partir de misturas de glicose e xilose, a proteína receptora de AMP ciclico foi substituída por uma mutante que contorna a repressão pela glicose do metabolismo de xilose. A expressão dos transportadores de xilose, XylE ou XylFGH tem efeitos semelhantes à substituição da proteína receptora de AMP ciclico por uma forma mutante (Khankal et al. , J. Biotehnol. 134:246-252 (2008)) .
[00107] A regeneração de cofatores é também importante para melhorar a produção de xilitol em bactérias, o que foi explorado em E. coli através de um grande número de deleções
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66/227 de genes e a expressão de vias regeneradoras de cofatores (Chin et al., Blotechnol. Bioeng. 102:209-220 (2009); Chin et al., Blotechnol. Prog. 27:333-341 (2011); Iverson et al.,
World J. Microbiol. Blotechnol. 29:1225-1232 (2013); Iverson et al., BMC Syst. Biol. 10:31 (2016)). Outro estudo que teve como objetivo melhorar a produção de xilitol a partir de misturas de glicose e xilose interrompeu o sistema de glicose fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato para eliminar a repressão por catabólitos (Su et al., Metab. Eng. 31:112-122 (2015)). O metabolismo endógeno de xilose foi bloqueado nessa cepa pela interrupção de xilose isomerase, xilulose quinase e do sistema de frutose fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato, e a xilose redutase de Neurospora crassa foi expressa para aperfeiçoar a produção de xilitol.
[00108] Lactococcus lactis é uma bactéria bem caracterizada comumente utilizada para processos de laticínios, como a produção de queijos, e pôde ser adotada para outros processos relacionados a alimentos. L. lactis foi capaz de produzir xilitol a partir de xilose quando expressou a xilose redutase de S. stipitis e o transportador de xilose de Lactobacillus brevis (Nyyossola et al., J. Blotechnol. 118:55-56 (2005)).
[00109] Corynebacterium glutamicum é uma bactéria como muitos usos industriais como a produção de MSG. Foi criada para utilizar simultaneamente xilose e glicose, o que é um traço importante para produtividade de xilitol (Sasaki et al., Appl. Microbiol. Blotechnol. 85:105-115 (2009)). Para aperfeiçoar a produção de xilitol em C. glutamicum, esta foi criada para expressar um transportador de pentose e uma xilose redutase mutante de Candida tenuis em conjunto com interrupções de seus
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67/227 genes lactato desidrogenase, xiluloquinase e frutose fosfotransferase dependente de fosfoenolpiruvato (Sasaki et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 86:1057-1066 (2010)). A produção de xilitol em C. glutamicum foi alcançada também expressando xilose redutase de Scheffersomyces stipitis (Kim et al., Enzyme Microb. Technol. 46:366-371 (2010)). A expressão de xilose redutase Rhodotorula mucilaginosa, 1arabinose isomerase de E. coll, d-psicose 3 epimerase de Agrobacterium tumefaciens, 1-xilulose redutase de Mycobacterium smegmatis e um transportador de pentose de fusão permitiram a produção de xilitol a partir de misturas de xilose e arabinose sem a formação de arabitol (Dhar et al., J. Biotechnol. 230:63-71 (2016)).
[00110] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para a produção de xilitol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar mais a produção de xilitol nessas espécies de Metschnikowia.
[00111] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir arabitol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, é provida uma espécie de Metschnikowia dispondo de uma via de biossintese para produzir arabitol a partir de xilose. São também providos métodos para produção de arabitol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de arabitol em condições e por um período de tempo suficiente para produzir arabitol.
[00112] Foram identificadas algumas espécies de leveduras que podem produzir arabitol a partir de xilose. Por exemplo, a
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68/227 cepa NRRL 27,624 de Zygocaccharomyces rouxxii recentemente identificada demonstrou produzir D-arabitol como o principal produto metabólico a partir de glicose (Saha et al., 2007, J. Ind. Microbial. Biotechnol., 34:519-523). No entanto, foi também identificada como produtora de D-arabitol e xilitol a partir de xilose e a partir de uma mistura de xilose e xilulose (Saha et al., 2007) . Com base nesses resultados, a via para produção de D-arabitol a partir de xilose incluiu uma enzima xilose redutase, xilitol desidrogenase e arabitol desidrogenase (Saha et al., 2007). Adicionalmente, Candida maltosa demonstrou produzir D-arabitol a partir de D-xilulose por uma xilulose redutase (Cheng et al., 2011, Microbial. Cell Factories, 10:5) . Foi também constatado que a produção de arabitol também melhorava pela adição de xilose com glicerol nas espécies de leveduras dentro do gênero de Debaryomyces, Geotrichum e Metschnikowia (Publicação do Pedido de Patente Internacional WO 2012/011962, publicado em 26 de janeiro de 2012) .
[00113] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de arabitol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar mais a produção de arabitol nessas espécies de Metschnikowia.
[00114] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir etanol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de etanol a partir de xilose. Com absorção reforçada
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69/227 de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de etanol a partir de xilose. São também providos métodos para produção de etanol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de etanol em condições e por um período de tempo suficiente para produzir etanol.
[00115] O etanol tem uma série de usos e é mais comumente utilizado como aditivo de combustível. Como aditivo de combustível, o etanol é um produto de baixo valor, sendo que muito do custo de sua produção é atribuído ao custo das matérias-primas. Seria desejável, portanto, desenvolver etanologênicos e processos de fermentação para a produção de etanol a partir de materiais de partida facilmente disponíveis, pouco dispendiosos, como lignocelulose. A fermentação de glicose e xilose é considerada atualmente de alta prioridade para conversão econômica de biomassa em etanol. A maioria dos microrganismos é capaz de fermentar glicose, mas poucos, segundo relatos, utilizam xilose com eficiência e um número ainda menor fermenta essa pentose a etanol.
[00116] Um número relativamente pequeno de microrganismos do tipo selvagem consegue fermentar D-xilose. Esses microrganismos não são em geral adequados para fermentação em grande escala. Essa característica desfavorável pode surgir, por exemplo, como resultado da falta de familiaridade com os microrganismos, a dificuldade em obter os microrganismos, a baixa produtividade e/ou crescimento em lignocelulósicos previamente tratados ou o rendimento insatisfatório quando cultivados em açúcares mistos derivados de biomassa (C. Abbas,
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Lignocellulosics to ethanol: meeting ethanol demand in the future, The Alcohol Textbook, 4a Edição (K. A. Jacques, T. P. Lyons e D. R. Kelsall, eds) . Nottingham University Press, Nottingham, UK, 2003, pp. 41-57.; C. Abbas, Emerging biorefineries and biotechnological applications of nonconventional yeast: now and in the future, The Alcohol Textbook, 4a Edição (K. A. Uacques, T. P. Lyons e D. R. Kelsall, eds). Nottingham University Press, Nottingham, United Kingdom, 2003, pp. 171-191).
[00117] Leveduras são consideradas microrganismos promissores para fermentação alcoólica de xilose (vide Ryabova, supra). Suas células são maiores do que as de bactérias; as leveduras são resistentes à infecção viral e tendem a ser mais resistentes ao feedback negativo do etanol. Além do mais, o crescimento e o metabolismo das leveduras têm sido extensivamente estudados para algumas espécies.
[00118] Uma série de leveduras é conhecida por fermentar naturalmente D-xilose. Essas incluem, por exemplo, Pichia stipitis, Candida shehatae e Pachysolen tannophilus (vide Ryabova, supra; Citação 2, C. Abbas 2003) . A levedura de cerveja comum Saccharomyces cerevisiae não é conhecida por fermentar D-xilose naturalmente, porém, segundo relatos, várias cepas de S. cerevisiae fermentam D-xilose.
[00119] Inúmeros estudos descreveram o metabolismo de D-xilose por S. cerevisiae recombinante (vide, p. ex., Matsushika et al., Applied Microbiology and Biotechnology 84, no. 1 (2009) : 37-53); Publicação de Patente U.S. N° 2005/0153411A1 (14 de julho de 2005); Publicação de Patente U.S. N° 2004/0231661A1 (25 de novembro de 2004); Patente U.S. N° 4 368 268 (11 de
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71/227 janeiro de 1983); Patente U.S. N° 6 582 944 (24 de junho de
2003) ; Patente U.S. N° 7 226 735 (05 de junho de 2007);
Publicação de Patente U.S. N° 2004/0142456A1 (22 de julho de
2004) ; Jeffries, T. W. & Jin, Y-S., Appl. Microbiol.
Biotechnol. 63: 495-509 (2004); Jin, Y-S., Met. Eng. 6: 229238 (2004); Pitkanen, J-Y., Universidade de Tecnologia de
Helsinque, Departamento de Tecnologia Química, Relatório de Bioquímica Técnica (Janeiro de 2005); Porro, D. et al., App. & Env. Microbiol. 65(9): 4211-4215 (1999); Jin, Y-S., et al.,
App. & Env. Microbiol. 70(11): 6816-6825 (2004); Sybirna, K, et al., Curr. Genetics 47(3): 172-181 (2005); Toivari, Μ. H., et al., Metabolic Eng. 3:236-249 (2001).
[00120] O metabolismo de D-xilose prossegue ao longo de uma via semelhante àquela da glicose através da via pentose fosfato. O carbono de D-xilose é processado a etanol via o ciclo glicolítico ou via CO2 do ciclo respiratório de TCA. A fermentação a etanol depende, em parte, no metabolismo de piruvato, o qual é um metabólito que pode ser utilizado em respiração ou fermentação (vide van Hoek, P., et al., Appl. & Enviro. Microbiol. 64(6); 2133-2140 (1998)). O piruvato entra na fermentação após a descarboxilação do piruvato a acetaldeído pela enzima piruvato descarboxilase (E.C. 4.1.1.1). Piruvato descarboxilase é membro da família de carboxilases dependentes de biotina. Ela catalisa a descarboxilação do piruvato para formar oxaloacetato com divagem de ATP. O oxaloacetato pode ser utilizado para síntese de gordura, glicose e alguns aminoácidos ou outros derivados. A enzima é altamente conservada e encontrada em uma variedade de procariotos e eucariotos.
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72/227 [00121] Outros organismos microbianos capazes de produzir etanol a partir de xilose são também conhecidos na técnica. Foi relatado que a levedura metilotrófica termotolerante Hansenula polymorpha (também conhecida como Pichia angusta) exibe as temperaturas de crescimento ótimo e máximo de 37° C e 48° C, respectivamente, e que pode fermentar naturalmente Dxilose em certas condições. (US 8071298; Voronovsky et al., FEMS Yeast Res. 5(11): 1055-62 (2005)). Adicionalmente, segundo relatos, três cepas de Pichia stipitis e três de Candida shehatae fermentam xilose quando submetidas a condições aeróbicas e microaerofilicas. Das cepas consideradas, P. stipitis NRRL Y-7124 foi capaz de utilizar todo, exceto 7 g/L de 150 g/L de xilose suprida aerobicamente para produzir 52 g/L etanol com rendimento de 0,39 g por grama de xilose (7 6% de rendimento teórico) e a uma taxa comparável
à taxa mais rápida mostrada por C. shehatae NRRL Y-12878. Para
todas as cepas testadas, os resultados de fermentação de
culturas aeróbicas foram mais favoráveis do que aqueles de
culturas microaerofilicas. Slininger, P.J. et al., Biotechnol
Lett (1985) 7: 431.
[00122] Por exemplo, Zymomonas mobilis, uma bactéria etanologênica que cresce em glicose, frutose e em sacarose, metaboliza esses açúcares a CO2 e etanol através da via Entner-Douderoff. Embora cepas do tipo selvagem não consigam usar xilose como fonte de carbono, criaram-se cepas recombinantes de Z. mobilis que são capazes de crescer nesse açúcar (Publicação de Patente U.S. N° 20080187973, Patente U.S. N° 5 514 583, Patente U.S. N° 5 712 133, WO 95/28476, Feldmann
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73/227 et al. (1992) Appl Microbiol Biotechnol 38: 354-361, Zhang et al. (1995) Science 267:240-243).
[00123] A conversão de xilose a etanol por Escherichia coli recombinante foi relatada. A adição de quantidades pequenas de ions cálcio, magnésio e ferroso estimulou a fermentação. Beall et al., Biotechnology and Bioengineering 38, no. 3 (1991) : 296-303.
[00124] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de etanol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar ainda mais a produção de etanol nessas espécies de Metschnikowia.
[00125] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossíntese para produzir n-butanol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossíntese para produção de n-butanol a partir de xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de n-butanol a partir de xilose. São também providos métodos para produção um n-butanol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossíntese de n-butanol em condições e por um período de tempo suficiente para produzir n-butanol.
[00126] Butanol oferece uma série de vantagens como combustível. Butanol é um álcool com quatro carbonos, um líquido neutro transparente miscível na maioria dos solventes (álcoois, éter, aldeídos, cetonas e hidrocarbonetos) e é
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74/227 fracamente solúvel em água (solubilidade em água 6,3% em comparação ao etanol que é totalmente miscivel) . Possui uma classificação por octanagem comparável à gasolina, tornando-o um combustível de valor para qualquer motor de combustão interna feita para queimar gasolina. Os testes de combustível também comprovou que o butanol não se separa em fases na presença de água e não tem impacto negativo sobre a expansão de elastômeros. Butanol não só tem um teor energético elevado que é mais próximo àquele da gasolina do que o etanol, de modo que compromete menos a economia de combustível, mas também pode ser facilmente adicionado à gasolina convencional devido a sua baixa pressão de vapor.
[00127] A biossíntese de butanol pode ser realizada através da via de fermentação de acetona, butanol e etanol (a via ABE). Os produtos dessa via de produção fermentative do butanol, utilizando uma espécie produtora de solvente da bactéria Clostridium acetobutylicum, são seis partes de butanol, três partes de acetona e uma parte de etanol. A vida de produção de butanol foi introduzida em vários organismos hospedeiros. Por exemplo, a via foi expressa em Escherichia coli (Atsumi et al., Nature 451:86-89 (2008)) e Saccharomyces cerevisiae (Steen et al., Microb. Cell Fact 7:36 (2008)) por suas altas taxas de crescimento e a eficiência de ferramentas genéticas. Pseudomonas putida, Lactobacillus brevis e Bacillus subtilis foram utilizados pela sua tolerância potencialmente elevada a solventes (Nielsen et al., Metab. Eng. 11:262-273 (2009);
Berezina et al., Appl. Microbiol. Biot. 87:635-646 (2010)).
[00128] Uma alternativa ao uso de culturas alimentares como material de partida para produção de butanol é biomassa,
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75/227 especificamente biomassa lignocelulósica. Criaram-se cepas de Clostridium spp. para produção de butanol para xilose, como C. saccharoperbutylacetonicum (p. ex., cepa ATCC 27021 de C. saccharoperbutylacetonicum ou cepa ATCC 27022 de C. saccharoperbutylacetonicum) . Vide, p. ex., a Patente U.S. N° 8900841. Clostridium cellulolyticum foi criado para desviar-se de sua via nativa de biossíntese de valina para produção de isobutanol a partir de celulose cristalina (Higashide et al., Appl. Environ. Microb. 77:2727-2733 (2011)). Clostridium cellulovorans, o qual produz quando nativo ácido butirico como o principal produto metabólico, foi introduzido com uma enzima aldeido/álcool desidrogenase (AdhE2) para converter o precursor butiril-CoA em 1-butanol a partir de celulose (Yang et al., Metab. Eng. 32:39-48 (2015)). A produção de 1-butanol a partir de xilose foi também demonstrada utilizando Thermoanaerobacterium saccharolyticum (Bhandiwad et al., Metab. Eng. 21:17-25 (2014)).
[00129] Para aumentar a decomposição de celulose e reduzir a possibilidade de contaminação, foram utilizados organismos termofilicos. O primeiro exemplo da produção de isobutanol em termófilos foi demonstrada em Geobacillus thermoglucosidasius utilizando celobiose como substrato (Lin et al., Metab. Eng. 24:1-8 (2014)). Nesse trabalho, foram investigadas as estabilidades térmicas de enzimas envolvidas na sintese de isobutanol. O resultado desse estudo foi aplicado à conversão direta de celulose em isobutanol em Clostridium thermocellum expressando e aperfeiçoando a via de biossíntese de isobutanol (Lin et al., Metab. Eng. 31:44-52 (2015)).
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76/227 [00130] Uma das leveduras produtoras de etanol mais eficazes, S. cerevisiae, possui diversas vantagens como alta produção de etanol a partir de hexoses e alta tolerância ao etanol e outros compostos inibidores nos hidrolisados ácidos de biomassa de lignocelulose. Embora cepas padrão dessa levedura não consigam utilizar pentoses, como xilose, pode-se prover uma cepa recombinante da levedura que consiga fermentar xilose e celo-oligossacarideos, integrando genes para a expressão intercelular de vias de assimilação de xilose, como xilose redutase e xilitol desidrogenase de Pichia stipitis e um gene para expressar β-glicosidase de A. acleatus. Vide, p. ex., a Publicação de Patente U.S. N° 20100129885; a Publicação de Patente U.S. N° 20100261241;
[00131] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de nbutanol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar mais a produção de n-butanol nessas espécies de Metschnikowia.
[00132] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir isobutanol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de isobutanol a partir de xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de isobutanol a partir de xilose. São também providos métodos para produção um isobutanol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de isobutanol
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77/227 em condições e por urn periodo de tempo suficiente para produzir isobutanol.
[00133] Isobutanol, também um candidato a biocombustivel, foi produzido em microrganismos recombinantes expressando uma via metabólica heteróloga de cinco etapas (vide, p. ex., WO/2007/050671, WO/2008/098227 e WO/2009/103533). O microrganismo recombinante incluindo uma via para a produção de isobutanol a partir de açúcares com cinco carbonos (pentose), incluindo xilose, é também conhecido na técnica (vide p. ex., WO 2012173659; WO 2011153144). O microrganismo recombinante pode ser criado para expressar uma xilose isomerase exógena funcional. Xilose isomerases exógenas funcionais em leveduras são conhecidas na técnica. Vide, p. ex., US2006/0234364. O gene da xilose isomerase exógena pode ser ligado operativamente a sequências promotoras e terminadoras que são funcionais na célula de levedura.
[00134] Por exemplo, conhecia-se Saccharomyces cerevisiae recombinante para produzir isobutanol a partir de xilose. Vide, p. ex., US20130035515, Brat et al., FEMS yeast research 13,2 (2013) : 241-244; Lee, Won-Heong et al. Bioprocess and biosystems engineering 35,9 (2012): 1467-1475; A superexpressão simultânea de uma via de biossintese aperfeiçoada de valina, localizada no citosol, junto com a superexpressão de xilose isomerase XylA de Clostridium phytofermentans, transaldolase Tall e xiluloquinase Xksl permitiu que células recombinantes de Saccharomyces cerevisiae complementassem a auxotrofia para valina de mutantes com tripla deleção ilv2,3,5 para crescimento em D-xilose como a única fonte de carbono. Além disso, após superexpressão
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78/227 adicional de cetoácido descarboxilase ArolO e álcool desidrogenase Adh2, as células foram capazes de fermentar Dxilose diretamente a isobutanol.
[00135] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de isobutanol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar mais a produção de isobutanol nessas espécies de Metschnikowia.
[00136] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir isopropanol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de isopropanol a partir de xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de isopropanol a partir de xilose. São também providos métodos para produção um isopropanol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de isopropanol em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir isopropanol.
[00137] A polimerização de etileno fornece polietileno, um tipo de plástico com uma ampla gama de aplicações úteis. Etileno é produzido tradicionalmente para combustíveis fósseis refinados não renováveis, mas a desidratação do etanol derivado biologicamente a etileno oferece uma rota alternativa ao etileno proveniente de fontes renováveis de carbono, ou seja, etanol proveniente da fermentação de açúcares fermentáveis. Do
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79/227 mesmo modo, isopropanol e n-propanol podem ser desidratados a propileno, o qual, por sua vez, pode ser polimerizado a polipropileno. Tal qual como com polietileno, o uso de propanol derivado biologicamente como material de partida (ou seja, isopropanol ou n-propanol) resultaria em Polipropileno Verde. Vide, p. ex., WO 2009/049274, WO 2009/103026, WO 2009/131286, WO 2010/071697, WO 2011/031897, WO 2011/029166, WO 2011/022651 e WO 2012/058603.
[00138] Foi observada a produção de isopropanol em células hospedeiras recombinantes de Lactobacillus (p. ex., Lactobacillus reuteri), criadas para conterem uma via de isopropanol, e produzem quantidades aumentadas de isopropanol. Vide, p. ex., WO2013178699 Al. A produção direta de isopropanol a partir de celobiose por Escherichia coli criada, utilizando uma via sintética, foi também observada. Vide, p. ex., Soma et al., Journal of bioscience and bioengineering 114.1 (2012) : 80-85.
[00139] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de isopropanol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar mais a produção de isopropanol nessas espécies de Metschnikowia.
[00140] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir acetato de etila a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de acetato de etila a partir de
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80/227 xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de acetato de etila a partir de xilose. São também providos métodos para produção de acetato de etila bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de acetato de etila em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir acetato de etila.
[00141] Acetato de etila é um solvente amigável para o meioambiente com muitas aplicações industriais. A sintese microbiana de acetato de etila é desejável. A capacidade de leveduras produzirem quantidades maiores desse éster é conhecida há muito tempo e pode ser aplicada na produção do éster em grande escala a partir de matérias-primas renováveis. Pichia anômala, Candida utilis e Kluyveromyces marxianus são leveduras que convertem açúcar em acetato de etila com alto rendimento. Lõser et al., Appl Microbiol Biotechnol (2014) 98:5397-5415.
[00142] A sintese de muito acetato de etila requer oxigênio que é normalmente suprido por aeração. Acetato de etila é altamente volátil de modo que a aeração resulta em sua transferência de fases e stripping (regeneração). Esse processo de stripping não pode ser evitado, mas requer o manuseio adequado durante a experimentação e oferece uma oportunidade para recuperação integrada ao processo economicamente rentável do éster sintetizado.
[00143] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de acetato de etila. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar
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81/227 mais a produção de acetato de etila nessas espécies de Metschnikowia.
[00144] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir álcool fenetilico a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de álcool fenetilico a partir de xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de álcool fenetilico a partir de xilose. São também providos métodos para produção de álcool fenetilico bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de álcool fenetilico em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir álcool fenetilico.
[00145] Álcool fenetilico é um liquido incolor, transparente, ligeiramente viscoso que pode ser produzido por organismos microbianos. Álcool fenetilico foi encontrado em uma série de óleos essenciais naturais, em alimentos, temperos e tabaco e em bebidas alcoólicas não destiladas, cervejas e vinhos. Ele evita ou retarda o crescimento bacteriano e, assim, protege produtos cosméticos e de cuidados pessoais de deterioração. Álcool fenetilico também transmite uma fragrância a um produto.
[00146] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de álcool fenetilico. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar
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82/227 mais a produção de álcool fenetilico nessas espécies de Metschnikowia.
[00147] Organismos microbianos dispondo de uma via de biossintese para produzir 2-metil-butanol a partir de xilose são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de 2-metil-butanol a partir de xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano pode também apresentar produção melhorada de 2metil-butanol a partir de xilose. São também providos métodos para produção 2-metil-butanol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de 2-metil-butanol em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir 2-metil-butanol.
[00148] 2-metil-butanol pode ser utilizado como solvente e intermediário na produção de outras substâncias químicas. 2metil-butanol também tem aplicações em aditivos de combustível e de óleo lubrificante, auxiliares de flotação, produção de inibidores de corrosão, produtos farmacêuticos, solvente de tintas e agente de extração.
[00149] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida
pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de 3-
metil butanol. A engenharia metabólica adicional pode ser
utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar
mais a produção de 2-metil butanol nessas espécies de
Metschnikowia.
[00150] Organismos microbianos dispondo de uma via de
biossintese para produzir 3-metil-butanol a partir de xilose
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83/227 são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, são providas espécies de Metschnikowia com pelo menos um ácido nucleico exógeno que codifica uma enzima de uma via de biossintese para produção de 3-metil-butanol a partir de xilose. Com absorção reforçada de xilose, o organismo microbiano também possui produção melhorada de 3-metil-butanol a partir de xilose. São também providos métodos para produção
3-metil-butanol bioderivado, cultivando a espécie de Metschnikowia aqui provida dispondo de uma via de biossintese de 3-metil-butanol em condições e por um período de tempo suficiente para produzir 3-metil-butanol.
[00151] 3-metil-butanol (também conhecido como álcool isoamílico ou álcool isopentílico) é um álcool claro, incolor. 3-metil-butanol é um ingrediente principal na produção de óleo de banana, um éster encontrado na natureza e também produzido como aromatizante na indústria. É também o principal ingrediente do reagente de Kovac, utilizado para o teste diagnóstico bacteriano de indóis. 3-metil-butanol é usado também como agente antiespumante no reagente Clorofórmio:Álcool Isoamílico.
[00152] Entende-se que a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser utilizada como a cepa hospedeira para produção de 3metil-butanol. A engenharia metabólica adicional pode ser utilizada na adoção da espécie de Metschnikowia para aumentar mais a produção de 3-metil-butanol nessas espécies de Metschnikowia.
[00153] Dependendo dos constituintes da via biossintética de uma espécie de Metschnikowia de um composto em particular, a espécie de Metschnikowia aqui provida pode incluir pelo menos
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84/227 uma via biossintética-ácido nucleico codificante de expressão exógena e até todos os ácidos nucleicos codificantes para uma ou mais vias biossintéticas do composto. 0 composto pode ser, por exemplo, xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetílico, 2-metilbutanol ou 3-metil-butanol. Por exemplo, a biossíntese de etanol pode ser estabelecida em uma espécie de Metschnikowia com deficiência em uma enzima ou proteína da via que seja necessária para produzir etanol a partir de xilose através da expressão exógena do ácido nucleico codificante correspondente. Em outras palavras em uma espécie de Metschnikowia deficiente em todas as enzimas ou proteínas de uma via do etanol, a expressão exógena de todas as enzimas ou proteínas na via pode ser incluída, embora se entenda que todas as enzimas ou proteínas de uma via podem ser expressas mesmo se a espécie de Metschnikowia contiver pelo menos uma das enzimas ou proteínas da via. Por exemplo, a expressão exógena de todas as enzimas ou proteínas em uma via para produção de etanol pode ser incluída na HO Metschnikowia sp. aqui provida para aumentar a produção de etanol a partir de xilose, embora a HO Metschnikowia sp. tenha expressão endógena de todas as enzimas da via de biossíntese de etanol a partir de xilose.
[00154] Dados os ensinamentos e a orientação aqui fornecidos, os técnicos no assunto entenderão que o número de ácidos nucleicos codificantes a introduzir em uma forma que pode ser expressa será, pelo menos, paralelo às deficiências da via da espécie de Metschnikowia. Portanto, uma espécie de Metschnikowia aqui provida pode ter um, dois, três, quatro,
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85/227 cinco, seis, sete ou oito até todos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou proteínas constituintes da via biossintética. Em algumas modalidades, a espécie de Metschnikowia também pode incluir outras modificações genéticas que facilitam ou aperfeiçoam a biossintese de um determinado composto ou que conferem outras funções úteis ao organismo microbiano hospedeiro. Uma de tais outras funcionalidades pode incluir, por exemplo, aumento da sintese de um ou mais dos precursores da via para um determinado composto.
[00155] Em algumas modalidades, uma espécie de Metschnikowia aqui provida dispõe a capacidade enzimática para sintetizar compostos como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila ou álcool fenetilico a partir de xilose. Nessa modalidade especifica, pode ser útil aumentar a sintese ou o acúmulo de um composto para, por exemplo, direcionar as reações da via de biossintese em direção à produção do composto desejado. A sintese ou o acúmulo aumentado pode ser conseguido, por exemplo, pela superexpressão de ácidos nucleicos que codificam uma ou mais as enzimas ou proteínas da via de biossintese para produção de compostos como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila ou álcool fenetilico a partir de xilose. A superexpressão da enzima ou enzimas e/ou da proteína ou proteínas das vias de biossintese da via
desej ada pode ocorrer, por exemplo, através da expressão
exógena do gene ou genes endógenos, ou através da expressão
exógena do gene ou genes heterólogos. Portanto, a espécie de
Metschnikowia conforme aqui provida pode ser prontamente
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86/227 modificada para produção de um composto desejado, por exemplo, através da superexpressão de um, dois, três, quatro, cinco e de até todos os ácidos nucleicos que codificam as enzimas ou proteínas da via biossintética para o produto desejado. Além disso, uma espécie de Metschnikowia pode ser gerada por mutagênese de um gene endógeno que resulta em aumento na atividade de uma enzima da via biossintética.
[00156] Em modalidades especialmente úteis, a expressão exógena dos ácidos nucleicos codificantes é empregada. A expressão exógena confere a capacidade para personalizar a expressão e/ou os elementos reguladores ao hospedeiro e à aplicação para alcançar um nível desejado de expressão que seja controlado pelo usuário. No entanto, a expressão endógena também pode ser utilizada em outras modalidades como, p. ex., removendo um efetor regulador negativo ou pela indução do promotor do gene quando ligado a um promotor induzível ou outro elemento regulador. Assim, um gene endógeno com um promotor induzível natural pode ser regulado positivamente pelo agente indutor adequado fornecido, ou a região reguladora de um gene endógeno pode ser criada e incorporar um elemento regulador induzível, pelo qual, permitindo a regulação da expressão aumentada de um gene endógeno em um momento desejado. Do mesmo modo, um promotor induzível pode ser incluído como um elemento regulador de um gene exógeno introduzido em uma espécie de Metschnikowia.
[00157] Entende-se que qualquer um ou mais dos ácidos nucleicos exógenos aqui descritos podem ser introduzidos em uma espécie de Metschnikowia para produzir uma espécie de Metschnikowia com produção aumentada de um composto desejado, como xilitol,
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87/227 arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metilbutanol. Os ácidos nucleicos podem ser introduzidos de modo a conferir, por exemplo, uma via biossintética para produzir etanol a partir de xilose no organismo microbiano. Alternativamente, ácidos nucleicos codificantes podem ser introduzidos para produzir uma espécie intermediária de Metschnikowia com a capacidade biossintética para catalisar algumas das reações requeridas para conferir capacidade biossintética. Por exemplo, uma espécie de Metschnikowia dispondo de uma via biossintética pode compreender pelo menos dois ácidos nucleicos exógenos que codificam enzimas ou proteínas desejadas. Assim, entende-se que qualquer combinação de duas ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética podem ser incluídas em uma espécie de Metschnikowia aqui provida. Do mesmo modo, entende-se que qualquer combinação de três ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética podem ser incluídas em uma espécie de Metschnikowia aqui provida desde que a combinação de enzimas e/ou proteínas da via biossintética desejada resulte na produção do composto desejado correspondente. Do mesmo modo, qualquer combinação de quatro ou mais enzimas ou proteínas de uma via biossintética conforme aqui reveladas podem ser incluídas em uma espécie de Metschnikowia aqui provida, se desejado, desde que a combinação de enzimas e/ou proteínas da via biossintética desejada resulte na produção do composto desejado correspondente.
[00158] Além da biossintese de um composto desejado como aqui descrito, a espécie de Metschnikowia e os métodos aqui
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88/227 providos também podem ser utilizados em várias combinações entre si e/ou com outros organismos microbianos e métodos bem conhecidos na técnica para realizar a biossintese do composto por outras rotas. Por exemplo, uma alternativa para produzir etanol além do uso dos produtores de etanol é através da adição de uma espécie de Metschnikowia capaz de converter um intermediário de etanol na via em etanol. Um de tais procedimentos inclui, por exemplo, a fermentação por uma espécie de Metschnikowia que produza um intermediário na via do etanol. 0 intermediário na via do etanol pode então ser usado como substrato para um segundo organismo microbiano que converte o intermediário na via do etanol em etanol. 0 intermediário na via do etanol pode ser adicionado diretamente à outra cultura do segundo organismo ou esgotar-se a cultura original dos produtores intermediários na via do etanol dessas espécies de Metschnikowia, por exemplo, separação celular e, então, a adição subsequente do segundo organismo ao caldo de fermentação pode ser utilizada para produzir o composto final sem etapas de purificação de intermediários. Embora etanol seja utilizado como exemplo aqui, a mesma abordagem pode ser empregada para produção de outros compostos desejados como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3metil-butanol.
[00159] Em outras modalidades, a espécie de Metschnikowia e os métodos aqui providos podem ser montados em uma grande variedade de vias secundárias para realizar a biossintese de um composto desejado. Nessas modalidades, as vias biossintéticas para um composto desejado aqui descrito podem
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89/227 ser divididas em espécies diferentes de Metschnikowia e, as diferentes espécies de Metschnikowia podem ser cultivadas simultaneamente para produzir o composto final. Em tal esquema biossintético, o composto de um organismo microbiano é o substrato para um segundo organismo microbiano até que o composto final seja sintetizado. Por exemplo, a biossintese de um composto desejado pode ser realizada criando um organismo microbiano que contenha as vias biossintéticas para conversão de um intermediário da via em outro intermediário ou o composto da via. Alternativamente, um composto desejado também pode ser produzido por via biossintética na espécie de Metschnikowia através da cultura simultânea ou fermentação simultânea utilizando dois organismos no mesmo vaso, onde o primeiro organismo microbiano produz um intermediário para o composto desejado e o segundo organismo microbiano converte o intermediário no composto desejado. 0 composto desejado pode ser xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metilbutanol ou 3-metil-butanol.
[00160] Dados os ensinamentos e a orientação aqui fornecidos, os técnicos no assunto entenderão que existe uma grande variedade de combinações e permutações para as espécies de Metschnikowia e os métodos aqui providos, junto com outra espécie de Metschnikowia, com a cultura simultânea de outras espécies de Metschnikowia dispondo de vias secundárias e com combinações de outros procedimentos químicos e/ou bioquímicos bem conhecidos na técnica para produzir um composto desejado.
[00161] São providos métodos para produção de um composto bioderivado como aqui descrito. Tais métodos podem incluir
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90/227 cultivar uma espécie de Metschnikowia isolada dispondo de uma via metabólica para produção do composto bioderivado em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir o composto bioderivado a partir de xilose. Assim, em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir xilitol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir xilitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir arabitol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir arabitol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir etanol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir etanol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir n-butanol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir n-butanol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir isobutanol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir isobutanol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir isopropanol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir isopropanol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um
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91/227 método para produzir acetato de etila, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir acetato de etila a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir álcool fenetilico, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir álcool fenetilico a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir 2-metilbutanol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir 2-metil-butanol a partir de xilose. Em algumas modalidades, é aqui provido um método para produzir 3-metil-butanol, o qual compreende cultivar a espécie de Metschnikowia isolada aqui descrita em condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir 3-metil-butanol a partir de xilose.
[00162] Os métodos aqui providos incluem a produção do composto bioderivado em uma taxa, eficiência de conversão e/ou concentração especificadas. Assim, em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,1 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,2 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,3 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a
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92/227 uma taxa de pelo menos 0,4 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex. , xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,50 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,60 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,70 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,80 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 0,80 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 1,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 1,50 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 2,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 2,50 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 3,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 3,50 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o
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93/227 composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilosea uma taxa de pelo menos 4,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 5,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produzo composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilosea uma taxa de pelo menos 6,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 7,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 8,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de pelo menos 9,00 g/L/h. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma taxa de ou pelo menos 10,00 g/L/h.
[00163] Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,01 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,02 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,03 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex.,
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94/227 xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,04 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,05 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,06 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,07 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,08 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,09 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,1 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,15 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de
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95/227 pelo menos 0,2 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,25 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,3 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,35 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,4 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,45 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,5 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,55 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,6 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em
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96/227 algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,65 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,7 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,75 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,8 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,85 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,8 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 0,85 g de composto bioderivado por 1 g de xilose. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose com eficiência de conversão de pelo menos 1 g de composto bioderivado por 1 g de xilose.
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97/227 [00164] Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 1 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 2 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 3 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 4 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 5 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 10 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 20 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 30 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 40 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 50 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 60 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex.,
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98/227 xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 70 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 80 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 90 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 100 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 150 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 200 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 250 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 300 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 350 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 400 g/L. Em algumas modalidades, o método aqui provido produz o composto bioderivado (p. ex., xilitol) a partir de xilose a uma concentração de pelo menos 500 g/L.
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99/227 [00165] Qualquer uma das espécies de Metschnikowia aqui descritas pode ser cultivada para produzir e/ou secretar o composto desejado bioderivado, incluindo xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetílico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol. Por exemplo, a espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser cultivada para a produção biossintética de um composto desejado. Assim, em algumas modalidades, são providos meios de cultura que contêm um composto desejado bioderivado conforme aqui descrito ou um intermediário do mesmo. Em alguns aspectos, o meio de cultura pode também ser separado da espécie de Metschnikowia que produziu o composto desejado bioderivado ou o intermediário do mesmo. Métodos para separar um organismo microbiano do meio de cultura são bem conhecidos na técnica. Métodos exemplares incluem filtração, floculação, precipitação, centrifugação, sedimentação e métodos semelhantes.
[00166] Para a produção do composto desejado bioderivado, incluindo xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetílico, 2-metilbutanol ou 3-metil-butanol, as espécies de Metschnikowia aqui providas são cultivadas em um meio com uma fonte de carbono e outros nutrientes essenciais. Em algumas modalidades, as espécies de Metschnikowia aqui providas são cultivadas em um meio de cultura aeróbica. O cultivo aeróbico pode ser descontínuo, descontínuo alimentado ou contínuo, em que o oxigênio dissolvido no meio está acima de 50% de saturação. Em algumas modalidades, as espécies de Metschnikowia aqui providas são cultivadas em um meio de cultura substancialmente
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100/227 anaeróbica. Como aqui descrito, uma condição de crescimento exemplar para realizar a biossintese de um composto desejado como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metilbutanol ou 3-metil-butanol inclui condições anaeróbicas de cultura ou fermentação. Em certas modalidades, as espécies de Metschnikowia aqui providas podem ser sustentadas, cultivadas ou fermentadas em condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas. Resumidamente, uma condição anaeróbica refere-se a um ambiente desprovido de oxigênio. As condições substancialmente anaeróbicas incluem, por exemplo, uma fermentação descontínua ou fermentação continua, tal que a concentração do oxigênio dissolvido no meio permaneça entre 0 e 10% de saturação. As condições substancialmente anaeróbicas também incluem células em crescimento ou repouso em meio liquido ou sobre ágar sólido dentro de uma câmara lacrada mantida com uma atmosfera de menos de 1% de oxigênio. O percentual de oxigênio pode ser mantido, por exemplo, por aspersão da cultura com uma mistura de N2/CO2 ou outro gás ou gases adequados diferentes de oxigênio.
[00167] É, às vezes, desejável manter as condições anaeróbicas no fermentador para reduzir o custo do processo global. Tais condições podem ser obtidas, por exemplo, aspergindo inicialmente o meio com nitrogênio e depois vedando os frascos com uma tampa tipo crimp com septo. Para cepas nas quais o crescimento não é observado em meio anaeróbico, condições microaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas podem ser aplicadas perfurando o septo com um pequeno orifício para limitar a aeração. Condições anaeróbicas exemplares foram
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101/227 descritas anteriormente e são bem conhecidas na técnica. Condições aeróbicas e anaeróbicas exemplares são descritas, por exemplo, na publicação dos Estados Unidos 2009/0047719, depositada em 10 de agosto de 2007. Fermentações podem ser realizadas de maneira descontínua, descontínua alimentada ou continua conforme aqui reveladas. As fermentações podem também ser conduzidas em duas fases, se desejado. A primeira fase pode ser aeróbica para permitir alto crescimento e, portanto, alta produtividade, seguida por uma fase anaeróbica de rendimentos elevados.
[00168] Se desejado, o pH do meio pode ser mantido em um valor desejado, como pH por volta de 5,5-6,5 pela adição de uma base, como NaOH ou outras bases, ou ácido, conforme necessário para manter o meio de cultura em um pH desejável. A taxa de crescimento pode ser determinada medindo a densidade óptica com um espetrofotômetro (600 nm) , e a taxa de absorção de xilose, monitorando a depleção da fonte de carbono ao longo do tempo.
[00169] O meio de cultura para a espécie de Metschnikowia aqui provida pode incluir xilose, seja como a única fonte de carbono ou em combinação com uma ou mais co-substratos aqui descritos ou conhecidos na técnica. O meio de cultura pode incluir ainda mais outros suplementos, como extrato de levedura e/ou peptona. O meio de cultura pode incluir ainda, por exemplo, qualquer outra fonte de carboidratos que possa suprir uma fonte de carbono à espécie de Metschnikowia. Tais fontes incluem, por exemplo: outros açúcares como celobiose, galactose, glicose, etanol, acetato, arabitol, sorbitol e glicerol. Assim, o meio de cultura pode incluir xilose e o co
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102/227 substrato glicose. O meio de cultura pode incluir xilose e o co-substrato celobiose. O meio de cultura pode incluir xilose e o co-substrato galactose. O meio de cultura pode incluir xilose e o co-substrato glicerol. O meio de cultura pode incluir uma combinação de glicose, xilose e celobiose. O meio de cultura pode incluir uma combinação de glicose, xilose e galactose. O meio de cultura pode incluir uma combinação de
glicose, xilose, e glicerol. 0 meio de cultura pode incluir
uma combinação de xilose, celobiose, galactose e glicerol.
[00170] O meio de cultura pode ter 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%,
8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% , 16%, 17%, 18%, 19%, 20%
ou uma quantidade maior de uma fonte de carbono (m/v) . Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ter 2% da fonte de carbono. Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ter 4% da fonte de carbono. Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ter 10% da fonte de carbono. Em algumas modalidades, o
meio de cultura pode ter 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%,
10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% ou uma
quantidade maior de xilose (m/v). 0 meio de cultura pode ter
1% de xilose. 0 meio de cultura pode ter 2% de xilose. 0 meio
de cultura pode ter 3% de xilose. 0 meio de cultura pode ter
4% de xilose. 0 meio de cultura pode ter 5% de xilose. 0 meio
de cultura pode ter 6% de xilose. 0 meio de cultura pode ter
7% de xilose. 0 meio de cultura pode ter 8% de xilose. 0 meio
de cultura pode ter 9% de xilose. 0 meio de cultura pode ter
10% de xilose. O meio de cultura pode ter 11% de xilose. O meio de cultura pode ter 12% de xilose. O meio de cultura pode ter 13% de xilose. O meio de cultura pode ter 14% de xilose. O meio de cultura pode ter 15% de xilose. O meio de cultura pode
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103/227 ter 16% de xilose. O meio de cultura pode ter 17% de xilose. 0 meio de cultura pode ter 18% de xilose. O meio de cultura pode ter 19% de xilose. O meio de cultura pode ter 20% de xilose.
[00171] Em algumas modalidades, xilose não é a única fonte de carbono. Por exemplo, em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C3, uma fonte de carbono C4, uma fonte de carbono C5, uma fonte de carbono C6 ou uma combinação das mesmas. Assim, em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C3 (p. ex., glicerol) . Em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C4 (p. ex., eritrose ou treose) . Em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C5 (p. ex., arabitol, ribose ou lixose). Em algumas modalidades, o meio inclui xilose e uma fonte de carbono C6 (p. ex., glicose, galactose, manose, alose, altrose, gulose e idose) . Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, o meio inclui xilose e celobiose, galactose, glicose, arabitol, sorbitol e glicerol ou uma combinação das mesmas. Em uma modalidade especifica, o meio inclui xilose e glicose. A quantidade das duas ou mais fontes de carbono no meio pode variar independentemente de 1% a 20% (p. ex., 1% a 20% de xilose e 1% a 20% de glicose) ou, alternativamente, de 2% a 14% (p. ex., 2% a 14% de xilose e 2% a 14% de glicose) ou, alternativamente, 4% a 10% (p. ex., 4% a 10% de xilose e 4% a 10%) . Em uma modalidade especifica, a quantidade de cada uma das fontes de carbono é 2% (p. ex., 2% de xilose e 2% de glicose) .
[00172] O meio de cultura pode ser um meio rico em C5, como um açúcar de cinco carbonos (como xilose) como a fonte primária
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104/227 de carbono. O meio de cultura pode ter também um açúcar C6 (açúcar de seis carbonos) . Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ter um açúcar C6 como a fonte primária de carbono. Em algumas modalidades, o açúcar C6 é glicose. A cultura pode ter um açúcar C6 e um açúcar C5 como a fonte de carbono, e pode ter o açúcar C6 e o açúcar C5 presentes em razões diferentes. Em alguma modalidade, a razão entre a quantidade de açúcar C6 e aquela do açúcar C5 (a razão C6:C5) no meio de cultura é entre cerca de 10:1 e 1:20. Por exemplo, a razão C6:C5 no meio de cultura pode ser cerca de 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:11, 1:12, 1:13, 1:14, 1:15, 1:16, 1:17, 1:18, 1:19 ou 1:20. Em algumas modalidades, a razão C6:C5 no meio de cultura é aproximadamente 3:1. Em algumas modalidades,
a razão C6:C5 no meio de cultura é aproximadamente 1:1. Em
algumas modalidades, a razão C6:C5 no meio de cultura é
aproximadamente 1:5. Em algumas modalidades, a razão C6:C5 no
meio de cultura é aproximadamente 1:10. O açúcar C5 pode ser xilose, e o açúcar C6 pode ser glicose. Em algumas modalidades, a razão entre a quantidade de glucose e aquela de xilose (a razão glicose: xilose) no meio de cultura é entre cerca de 20:1 e 1:10. Por exemplo, a razão glicose: xilose no meio de cultura pode ser cerca de 20:1, 19:1, 18:1, 17:1, 16:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 ou 1:10. Em algumas modalidades, a razão glicose:xilose no meio de cultura é aproximadamente 3:1. Em algumas modalidades, a razão glicose:xilose no meio de cultura é aproximadamente 1:1. Em algumas modalidades, a razão glicose:xilose no meio de
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105/227 cultura é aproximadamente 1:5. Em algumas modalidades, a razão glicose:xilose no meio de cultura é aproximadamente 1:10.
[00173] Outras fontes de carboidratos incluem, por exemplo, matérias-primas renováveis e biomassa. Tipos exemplares de biomassas que podem ser utilizados como matérias-primas nos métodos aqui providos incluem matérias-primas de biomassa celulósica e biomassa hemicelulósica ou porções de matériasprimas. Tais matérias-primas de biomassa contêm, por exemplo, substratos de carboidratos úteis como fontes de carbono como xilose, glicose, arabinose, galactose, manose, frutose e amido. Dados os ensinamentos e a orientação aqui fornecidos, os técnicos no assunto entenderão que outras matérias-primas renováveis e biomassas além daquelas exemplificadas acima também podem ser usadas para cultivar a espécie de Metschnikowia aqui provida para a produção do composto desejado bioderivado incluindo, p. ex., xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol.
[00174] Assim, dados os ensinamentos e a orientação aqui fornecidos, os técnicos no assunto entenderão que é possível produzir uma espécie de Metschnikowia que secrete os compostos biossintetizados aqui descritos quando cultivada em xilose como fonte de carbono. Tais compostos incluem, por exemplo, xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3metil-butanol e qualquer um dos metabolites intermediários dos mesmos. É apenas necessário criar atividades em uma ou mais das enzimas ou proteínas requeridas para realizar a biossintese do composto desejado ou intermediário incluindo,
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106/227 por exemplo, a inclusão de algumas ou de todas as vias biossintéticas para produção do composto desejado. Assim, é aqui provida uma espécie de Metschnikowia que produz e/ou secreta um composto desejado como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol quando cultivada em uma fonte de carboidratos ou outra de carbono, e que produz e/ou secreta um metabólito intermediário mostrado na via de biossintese do composto desejado quando cultivada em xilose e opcionalmente outras fontes de carboidratos ou de carbono.
[00175] A espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser criada utilizando métodos bem conhecidos na técnica, exemplificados no presente, para expressão exógena de pelo menos um ácido nucleico que codifica uma enzima ou proteína de uma via metabólica em quantidades suficientes para produzir um composto desejado a partir de xilose. Entende-se que as espécies de Metschnikowia aqui providas são cultivadas em condições suficientes para produzir um composto desejado como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3metil-butanol. Seguindo os ensinamentos e a orientação aqui fornecidos, a espécie de Metschnikowia aqui provida pode realizar a biossintese do composto desejado resultando em concentrações intracelulares entre aproximadamente 0,1-200 mM ou mais. Em geral, a concentração intracelular do composto desejado é entre aproximadamente 3-150 mM, particularmente, entre aproximadamente 5-125 mM e mais particularmente entre aproximadamente 8-100 mM, incluindo cerca de 10 mM, 20 mM, 50
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107/227 mM, 80 mM ou mais. Concentrações intracelulares entre e acima de cada uma dessas faixas exemplares também podem ser conseguidas pela espécie de Metschnikowia aqui provida.
[00176] Em algumas modalidades, as condições da cultura incluem condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas de crescimento ou manutenção. Condições anaeróbicas exemplares foram descritas anteriormente e são bem conhecidas na técnica. Condições anaeróbicas exemplares para processos de fermentação são descritas no presente e descritas, por exemplo, na Publicação U.S. 2009/0047719. Qualquer uma dessas condições pode ser empregada com a espécie de Metschnikowia bem como outras condições anaeróbicas bem conhecidas na técnica. Sob tais condições anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas, as cepas produtoras conseguem sintetizar o composto desejado em concentrações intracelulares de 5-10 mM ou mais, bem como todas as outras concentrações exemplificadas no presente. Entende-se que, ainda que a descrição acima se refira a concentrações intracelulares, a espécie produtora de Metschnikowia consegue produzir o composto desejado no meio intracelular e/ou secretar o composto no meio de cultura.
[00177] Os métodos aqui providos pode incluir qualquer processo de cultivo bem conhecido na técnica, como cultivo descontínuo, cultivo descontínuo alimentado ou cultivo continuo. Tal processo pode incluir fermentação. Processos exemplares de fermentação incluem, entre outros, fermentação descontínua alimentada e separação descontínua; fermentação descontínua alimentada e separação continua; e fermentação continua e separação continua. Em um protocolo exemplar de fermentação descontínua, o organismo produtor é cultivado em um biorreator
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108/227 adequadamente dimensionado purgado com um gás apropriado. Em condições anaeróbicas, a cultura é purgada com um gás inerte ou combinação de gases, por exemplo, nitrogênio, mistura de N2/CO2, argônio, hélio e gases semelhantes. À medida que as células crescem e utilizam a fonte de carbono, fonte(s) adicional(is) de carbono e/ou outros nutrientes são alimentados ao biorreator em uma taxa que equilibre aproximadamente o consumo da fonte de carbono e/ou dos nutrientes. A temperatura do biorreator é mantida em uma temperatura desejada, em geral, na faixa de 22-37 graus C, mas a temperatura pode ser mantida em mais alta ou mais baixa dependendo das características de crescimento do organismo produtor e/ou das condições desejadas para o processo de fermentação. O crescimento continua por um periodo de tempo desejado até serem alcançadas as características desejadas da cultura no fermentador, por exemplo, densidade celular, concentração do composto e características semelhantes. Em um processo de fermentação descontínua, o periodo de tempo para a fermentação situa-se em geral na faixa entre diversas horas e diversos dias, por exemplo, 8 a 24 horas, ou 1, 2, 3, 4 ou 5 dias ou até uma semana, dependendo das condições desejadas para a cultura. O pH pode ser controlado ou não, se desejado, e, nesse caso, uma cultura na qual o pH não é controlado terá o pH diminuído para 3-6 pelo final do ciclo. Quando completado o periodo de cultivo, o conteúdo do fermentador pode ser passado através de uma unidade de separação celular, por exemplo, uma centrifuga, uma unidade de filtração e unidades semelhantes para remover células e resíduos celulares. Quando o composto desejado é expresso no meio intracelular, as
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109/227 células podem ser Usadas ou rompidas enzimática ou quimicamente antes ou depois da separação de células do caldo de fermentação, se desejado, a fim de liberar composto adicional. O caldo de fermentação pode ser transferido para uma unidade de separação de compostos. O isolamento do composto ocorre por procedimentos padrão de separação, empregados na técnica para separar um composto desejado de soluções aquosas diluídas. Tais métodos incluem, entre outros, extração líquido-líquido utilizando um solvente orgânico imiscível em água (p. ex., tolueno ou outros solventes adequados, incluindo entre outros, éter dietílico, acetato de etila, tetrahidrofurano (THF), cloreto de metileno, clorofórmio, benzeno, pentano, hexano, heptano, éter de petróleo, éter metil terciário butílico (MTBE), dioxano, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) e semelhantes) para fornecer uma solução orgânica do composto, se apropriado, métodos padrão de destilação e métodos semelhantes, dependendo das características químicas do composto do processo de fermentação.
[00178] Em um protocolo exemplar de fermentação totalmente contínua, o organismo produtor é em geral cultivado inicialmente em modo descontínuo a fim de se alcançar uma densidade celular desejada. Quando a fonte de carbono e/ou outros nutrientes esgotam, o meio de alimentação com a mesma composição é suprido continuamente a uma taxa desejada, e o líquido de fermentação é retirado na mesma taxa. Sob tais condições, a concentração do composto no biorreator geralmente permanece constante, bem como a densidade celular. A temperatura do fermentador é mantida em uma temperatura
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110/227 desejada, conforme discutido acima. Durante a fase de fermentação continua, é em geral desejável manter uma faixa adequada de pH para otimizar a produção. O pH pode ser monitorado e mantido utilizando métodos rotineiros, incluindo a adição de ácidos ou bases adequadas para manter uma faixa desejada de pH. O biorreator é operado continuamente por períodos prolongados de tempo, em geral pelo menos uma semana a diversas semanas e até um mês, ou por mais tempo, conforme adequado e desejado. O líquido de fermentação e/ou a cultura são monitorados periodicamente, incluindo amostragem até diariamente, se desejado, para assegurar a consistência da concentração do composto e/ou densidade celular. No modo contínuo, o conteúdo do fermentador é removido constantemente enquanto novo meio de alimentação é suprido. A corrente de saída, contendo células, meio e produto, é geralmente submetida a um procedimento de separação contínua do composto, com ou sem remoção de células e resíduos celulares, se desejado. Os métodos de separação contínua empregados na técnica podem ser usados para separar o composto de soluções aquosas diluídas, incluindo entre outros, extração contínua líquido-líquido utilizando um solvente orgânico imiscível em água (p. ex., tolueno ou outros solventes adequados, incluindo entre outros, éter dietílico, acetato de etila, tetrahidrofurano (THF), cloreto de metileno, clorofórmio, benzeno, pentano, hexano, heptano, éter de petróleo, éter metil terciário butílico (MTBE), dioxano, dimetilformamida (DMF), dimetilsulfóxido (DMSO) e semelhantes), métodos padrão de destilação contínua e métodos semelhantes, ou outros métodos bem conhecidos na técnica.
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111/227 [00179] Além das condições de cultivo e fermentação aqui reveladas as condições de crescimento para realizar biossíntese do composto desejado podem incluir a adição de um osmoprotetor às condições de cultura. Em certas modalidades espécie de Metschnikowia aqui provida pode ser sustentada cultivada ou fermentada como aqui descrito na presença de um osmoprotetor.
Resumidamente osmoprotetor refere-se a um composto que atua como osmólito e ajuda um organrsmo microbiano como aqui descrito a sobreviver estresses osmóticos.
Os osmoprotetores incluem entre outros betaínas aminoácidos e o açúcar trealose. Exemplos não limitantes destes incluem glicina betaína pralina betaína dimetiltetina, dimetilslfoniopropionato, 3-dimetilsulfonio-2metilpropionato ácido pipecólico dimetilsulfonioacetato colina, L-carnitina e ectoína. Em um aspecto, o osmoprotetor é glicina betaína. Qualquer técnico no assunto entende que a quantidade e o tipo de osmoprotetor adequados para proteger um organrsmo microbiano aqui descrito de estresse osmótico dependerão do organismo microbiano usado.
A quantidade de osmoprotetor nas condições de cultura pode ser, por exemplo não mais de aproximadamente
0,1 mM não mais de aproximadamente
0,5 mM, não mais de aproximadamente 1,0 mM não mais de aproximadamente não mais de aproximadamente
2,0 mM, não mais de aproximadamente 2,5 mM não mais de aproximadamente
3,0 mM não mais de aproximadamente
5, 0 mM, não mais de aproximadamente 7.0 mM não mais de aproximadamente 10 mM não mais de aproximadamente mM, não mais de aproximadamente 100 mM ou não mais de aproximadamente 500 mM.
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112/227 [00180] As condições de cultura podem incluir, por exemplo, procedimentos para cultura líquida bem como procedimentos de fermentação ou outros para cultura em grande escala. Como aqui descrito, é possível obter rendimentos especialmente úteis dos produtos biossintéticos em condições aeróbicas, anaeróbicas ou substancialmente anaeróbicas de cultura.
[00181] As condições de cultura aqui descritas podem ser escalonadas e cultivadas continuamente para produção de um composto desejado. Procedimentos exemplares de crescimento incluem, por exemplo, fermentação descontínua alimentada e separação descontínua; fermentação descontínua alimentada e separação contínua ou fermentação contínua e separação contínua. Todos esses processos são bem conhecidos na técnica. Procedimentos de fermentação são especialmente úteis para a produção biossintética de quantidades comerciais de um produto desejado. Em geral, e tal qual com procedimentos de cultura não contínua, a produção contínua e/ou quase contínua inclui cultivar a espécie de Metschnikowia aqui provida em nutrientes e meio suficientes para sustentar e/ou quase sustentar o crescimento em fase exponencial. A cultura contínua sob tais condições podem incluir, por exemplo, crescimento ou cultivo por 1 dia, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou mais. Adicionalmente, a cultura contínua pode incluir períodos mais longos de tempo de 1 semana, 2, 3, 4 ou 5 ou mais semanas e até diversos meses. Alternativamente, os organismos aqui providos podem ser cultivados por horas, se adequado para uma aplicação em particular. Deve-se entender que as condições de cultura contínua e/ou quase contínua também podem incluir todos os intervalos de tempo intermediários entre esses períodos
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113/227 exemplares. Entende-se ainda que o tempo de cultura do organismo microbiano é por um período de tempo suficiente para produzir uma quantidade suficiente de composto para uma finalidade desejada.
[00182] Além dos procedimentos de fermentação acima utilizando a espécie de Metschnikowia aqui provida com produção contínua de quantidades substanciais de um composto desejado, o composto bioderivado também pode ser, por exemplo, submetido simultaneamente à síntese química e/ou procedimentos enzimáticos para converter o composto em outros compostos, ou o composto bioderivado pode ser separado da cultura de fermentação e submetido sequencialmente à conversão química e/ou enzimática para converter o composto em outros compostos, se desejado.
[00183] A fim de gerar produtores melhores, pode-se utilizar o modelamento metabólico para aperfeiçoar as condições de crescimento. O modelamento metabólico também pode ser utilizado para criar knockouts (silenciamento) de genes que aperfeiçoam adicionalmente a utilização da via (vide, por exemplo, as Publicações de Patentes U.S. 2002/0012939, US 2003/0224363, US 2004/0029149, US 2004/0072723, US 2003/0059792, US 2002/0168654 e US 2004/0009466, e A Patente U.S. No 7,127,379). A análise com modelamento permite predizer com confiança os efeitos sobre o crescimento celular de se deslocar o metabolismo para produção mais eficiente produção de um produto desejado.
[00184] Em algumas modalidades, os métodos aqui providos para produzir um composto bioderivado incluem ainda separar o composto bioderivado de outros componentes na cultura
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114/227 utilizando vários métodos bem conhecidos na técnica. 0 composto bioderivado pode ser xilitol, arabitol, etanol, nbutanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol. Tais métodos de separação incluem, por exemplo, procedimentos de extração, bem como métodos que incluem a extração continua liquidoliquido, pervaporação, filtração por membrana, separação por membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão por tamanho, cromatografia de adsorção, ultrafiltração, adsorção em carvão ativado, ajuste do pH e precipitação ou uma combinação de um ou mais métodos enumerados acima. Todos os métodos acima são bem conhecidos na técnica.
[00185] Além disso, é também provido neste documento um composto bioderivado como aqui descrito. Em algumas modalidades, o composto bioderivado, incluindo xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metilbutanol, é produzido pelos métodos aqui providos.
[00186] A presente invenção também provê composições com um composto bioderivado produzido pelas espécies de Metschnikowia aqui descritas e um componente adicional. O componente diferente do composto bioderivado pode ser uma parte celular, por exemplo, uma quantidade traço de uma parte celular do meio de cultura, ou pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura ou uma fração purificada ou parcialmente purificada dos mesmos, produzida na presença de, uma espécie de Metschnikowia aqui provida. Assim, em alguma modalidade, a
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115/227 composição é o meio de cultura. Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser o meio de cultura do qual foi removida a espécie de Metschnikowia isolada aqui provida. A composição pode ter, por exemplo, um nivel reduzido de um subproduto quando produzido pela espécie de Metschnikowia aqui provida. A composição pode ter, por exemplo, um ou mais compostos bioderivados, como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol, e um lisado celular ou sobrenadante da cultura de uma espécie de Metschnikowia aqui provida. 0 componente adicional pode ser um subproduto ou uma impureza, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos. 0 subproduto pode ser glicerol. 0 subproduto pode ser arabitol. 0 subproduto pode ser um álcool de açúcar C7 (p. ex., volemitol ou um isômero do mesmo) . Em algumas modalidades, a quantidade do subproduto ou da impureza (p. ex., glicerol ou arabitol ou ambos) é pelo menos 10%, 20%, 30% ou 40% maior do que aquela do respectivo subproduto ou impureza produzido por um organismo microbiano diferente da espécie de Metschnikowia isolada aqui provida.
[00187] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter xilitol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita utilizada para produzir o
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116/227 xilitol bioderivado. 0 componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. 0 componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00188] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter arabitol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o etanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00189] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter etanol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o etanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente
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117/227 adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00190] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter n-butanol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o nbutanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00191] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter isobutanol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o isobutanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
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118/227 [00192] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter isopropanol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o isopropanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00193] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter acetato de etila bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o acetato de etila bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00194] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter álcool fenetilico bioderivado e um componente
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119/227 adicional. 0 componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. 0 componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. 0 componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. 0 componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o álcool fenetilico bioderivado. 0 componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. 0 componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00195] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter 2-metil-butanol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser a espécie de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o 2-metil-butanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00196] Em algumas modalidades, as composições aqui providas podem ter 3-metil-butanol bioderivado e um componente adicional. O componente adicional pode ser o caldo de
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120/227 fermentação ou o meio de cultura. O componente adicional pode ser o sobrenadante do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser uma parte celular do caldo de fermentação ou do meio de cultura. O componente adicional pode ser os organismos microbianos com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita usada para produzir o 3-metil-butanol bioderivado. O componente adicional pode ser o lisado celular do organismo microbiano aqui provido. O componente adicional pode ser um subproduto, como glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos.
[00197] Em algumas modalidades, a matéria-prima de carbono e outras fontes para absorção celular como fosfato, amônia, sulfato, cloreto e outros halogênios podem ser escolhidos para alterar a distribuição isotópica dos átomos presentes no composto bioderivado produzido por espécies de Metschnikowia aqui providas. As várias matérias-primas de carbono e outras fontes para absorção enumeradas acima serão denominadas no presente, coletivamente, como fontes para absorção. As fontes para absorção podem proporcionar enriquecimento isotópico para qualquer átomo presente no composto bioderivado produzido por espécies de Metschnikowia aqui providas, ou nos subprodutos ou impurezas. O enriquecimento isotópico pode ser pode ser conseguido para qualquer átomo alvo incluindo, por exemplo, carbono, hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, enxofre, fósforo, cloreto ou outros halogênios.
[00198] Em algumas modalidades, as fontes para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de carbono-12, carbono-13 e carbono-14. Em algumas modalidades, as fontes
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121/227 para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de oxigênio-16, oxigênio-17 e oxigênio-18. Em algumas modalidades, as fontes para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de hidrogênio, deutério e tritio. Em algumas modalidades, as fontes para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de nitrogênio-14 e nitrogênio-15. Em algumas modalidades, as fontes para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de enxofre-32, enxofre-33, enxofre-34 e enxofre-35. Em algumas modalidades, as fontes para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de fósforo-31, fósforo-32 e fósforo-33. Em algumas modalidades, as fontes para absorção podem ser selecionadas para alterar as razões de cloro-35, cloro-36 e cloro-37.
[00199] Em algumas modalidades, a razão isotópica de um átomo alvo pode ser pode ser variada para uma razão desejada selecionando uma ou mais fontes para absorção. Uma fonte para absorção pode ser derivada de uma fonte natural, como encontrada na natureza, ou de uma fonte feita pelo homem, e o técnico no assunto é capaz de selecionar uma fonte natural, uma fonte feita pelo homem, ou uma combinação das mesmas, para conseguir uma razão isotópica desejada de um átomo alvo. Um exemplo de uma fonte feita pelo homem para absorção inclui, por exemplo, uma fonte para absorção que é pelo menos parcialmente derivada em uma reação sintética quimica. Tais fontes isotopicamente enriquecidas para absorção podem ser adquiridas comercialmente ou preparadas no laboratório e/ou opcionalmente misturadas com uma fonte natural da fonte de absorção para conseguir uma razão isotópica desejada. Em algumas modalidades, uma razão isotópica de um átomo alvo de
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122/227 uma fonte para absorção pode ser conseguida selecionando uma origem desejada da fonte para absorção como encontrada na natureza. Por exemplo, como discutido acima, uma fonte natural pode ser de base biológica derivada de ou sintetizada por um organismo biológico ou uma fonte como produtos à base de petróleo ou a atmosfera. Em algumas de tais modalidades, uma fonte de carbono, por exemplo, pode ser selecionada a partir de uma fonte de carbono derivada de combustível fóssil, a qual pode ser relativamente esgotada de carbono-14, ou fonte de carbono ambiental ou atmosférica, como CO2, a qual pode possuir uma quantidade maior de carbono-14 do que sua correspondente derivada de petróleo.
[00200] O isótopo instável de carbono, carbono-14 ou radiocarbono constitui aproximadamente 1 em 1012 átomos de carbono na atmosfera da terra e sua meia-vida é cerca de 5700 anos. O estoque de carbono é reabastecido na camada superior da atmosfera por uma reação nuclear envolvendo raios cósmicos e nitrogênio comum (14N). Os combustíveis fósseis não contêm carbono-14, por terem decaído há muito tempo. A queima de combustíveis fósseis diminui a fração de carbono-14 da atmosfera, o conhecido efeito Suess.
[00201] Métodos para determinar as razões isotópicas de átomos em um composto são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. O enriquecimento isotópico é facilmente avaliado por espectrometria de massas, utilizando técnicas conhecidas na área como espectrometria de massa acelerada (AMS), Espectrometria de massa de razão isotópica estável (SIRMS) e Fracionamento isotópico natural de posição específica por ressonância magnética nuclear (SNIF-NMR). Tais técnicas de
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123/227 espectro de massas podem ser integradas a técnicas de separação como cromatografia liquida (LC), cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e/ou cromatografia gasosa e técnicas semelhantes.
[00202] No caso do carbono, a norma ASTM D6866 foi desenvolvida nos Estados Unidos para determinar o conteúdo de base biológica de amostras sólidas, líquidas e gasosas, utilizando datação por radiocarbono, pela American Society for Testing and Materials (ASTM) International. A norma baseia-se no uso de datação por radiocarbono para a determinação do conteúdo de base biológica de um produto. ASTM D6866 foi publicada pela primeira vez em 2004, e a versão atual em atividade da norma é ASTM D6866-11 (válida em Io de abril de 2011) . As técnicas de datação por radiocarbono são bem conhecidas pelos entendidos no assunto, incluindo aquelas aqui descritas.
[00203] O conteúdo de base biológica de um composto é estimado pela razão entre carbono-14 (14C) e carbono-12 (12C) . Especificamente, a Fração Moderna (Fm) é computada a partir da expressão: Fm = (S-B) / (M-B) , onde B, S e M representam as razões 14C/12C do branco, da amostra e da referência moderna, respectivamente. Fração Moderna é o desvio da razão 14C/12C de uma amostra, medido em relação à Moderna. Moderna é definida como 95% da concentração de radiocarbono (em 1950 d.C.) no Ácido Oxálico I do National Bureau of Standards (NBS) (ou seja, materiais de referência de padrões (SRM) 4990b) normalizada para õ13Cvpdb=-19 por mil (Olsson, The use of Oxalic Acid as a Standard em Radiocarbon Varitions and Absolute Chronology, Nobel Symposium, 12th Proc., John Wiley & Sons, New York (1970)) . Os resultados da espectrometria de massa,
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124/227 por exemplo, medidos por ASM, são calculados utilizando a definição acordada internacionalmente de 0,85 vezes a atividade especifica de NBS Ácido oxálico I (SRM 4990b) normalizada para õ13Cvpdb=-19 por mil. Isso é equivalente a uma razão absoluta 14C/12C (1950 d.C.) de 1,176 ± 0,010 x 10“12 (Karlen et al., Arklv Geofysik, 4:465-471 (1968)). Os cálculos da norma levam em conta a absorção diferencial de um isótopo em relação a outros, por exemplo, a absorção preferencial em sistemas biológicos de 12C sobre 13C sobre 14C, e essas correções são refletidas como Fm corrigida para õ13.
[00204] Um padrão de ácido oxálico (SRM 4990b ou HOx 1) foi obtido a partir de uma cultura de beterraba de 1955. Embora tivessem sido obtidas 1000 libras, esse padrão de ácido oxálico não está mais disponível comercialmente. O padrão Ácido Oxálico II (HOx 2; designação N.I.S.T SRM 4990 C) foi obtido a partir do melaço de beterraba francesa de 1977 de 1977. No inicio da década de oitenta, um grupo de 12 laboratórios mediu as razões dos dois padrões. A razão da atividade entre Ácido oxálico II e 1 é 1,293310,001 (a média ponderada). A razão isotópica de HOx II é -17,8 por mil. ASTM D6866-11 sugere o uso do padrão disponível Ácido oxálico II, SRM 4990 C (Hox2) para o padrão de moderna (vide discussão sobre padrão original versus correntemente disponível de ácido oxálico em Mann, Radiocarbon, 25(2):519-527 (1983)). Fm = 0% representa a ausência completa de átomos de carbono-14 em um material, indicando, assim, uma fonte de carbono fóssil (por exemplo, à base de petróleo) . Fm = 100%, após correção para o carbono-14 injetado na atmosfera após 1950 pelos testes com bombas nucleares, indica uma fonte de carbono inteiramente
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125/227 moderna. Como descrito acima, tal fonte moderna inclui fontes de base biológica.
[00205] Conforme descrito em ASTM D6866, o percentual de carbono moderno (pMC) pode ser pode ser maior do que 100% por causa dos efeitos continuados, mas decrescentes dos programas de testes nucleares da década de cinquenta, que resultaram em um enriquecimento considerável de carbono-14 na atmosfera conforme descrito em ASTM D6866-11. Pelo fato de todas as atividades do carbono-14 de amostras terem como referência um padrão pré-bomba e porque quase todos os novos produtos de base biológica são produzidos em um ambiente pós-bomba, todos os valores de pMC (após correção para fração isotópica) devem ser multiplicados por 0,85 (até 2010) para refletir melhor o verdadeiro conteúdo de base biológica da amostra. A conteúdo de base biológica superior a 103% sugere que ou ocorreu um erro biológico ou que a fonte de carbono de base biológica tem mais do que diversos anos de idade.
[00206] ASTM D6866 quantifica o conteúdo de base biológica em relação ao conteúdo orgânico total do material e não considera as substâncias presentes contendo carbono inorgânico ou outras sem carbono. Por exemplo, um produto formado 50% por material à base de amido e 50% por água terra um conteúdo de base biológica = 100% (50% de conteúdo orgânico que é 100% de base biológica) com base em ASTM D6866. Em outro exemplo, um produto formado 50% por material à base de amido, 25% à base de petróleo e 25% por água terra um conteúdo de base biológica = 66,7% (75% de conteúdo orgânico, mas somente 50% do produto é de base biológica) . Em outro exemplo, um produto formado 50% por carbono orgânico e é um produto à base de petróleo terra
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126/227 um conteúdo de base biológica = 0% (50% de carbono orgânico, mas provenientes de fontes fósseis) . Assim, tendo por base os métodos bem conhecidos e padrões conhecidos para determinar o conteúdo de base biológica de um composto ou material, o técnico no assunto pode determinar prontamente o conteúdo de base biológica e/ou produtos preparados downstream (a jusante) que utilizam com um conteúdo desejado de base biológica.
[00207] Aplicações de técnicas de datação por carbono-14 para quantificar o conteúdo de base biológica de materiais são conhecidas no assunto (Currie et al., Nuclear Instruments and Methods In Physics Research B, 172:281-287 (2000)). Por exemplo, a datação por carbono-14 foi utilizada para quantificar o conteúdo de base biológica em materiais contendo tereftalato (Colonna et al., Green Chemistry, 13:2543-2548 (2011)). Notavelmente, polímeros de tereftalato de polipropileno (PPT), derivados de 1,3-propanodiol renovável e ácido tereftálico derivado de petróleo, resultaram em valores de Fm próximos a 30% (ou seja, como 3/11 do carbono polimérico deriva de 1,3-propanodiol renovável e 8/11 do ácido tereftálico do elemento final fóssil) (Currie et al., supra, 2000). Em contraste, polímero de tereftalato de polibutileno, derivado de 1,4-butanodiol renovável e ácido tereftálico renovável, resultou em conteúdo de base biológica acima de 90% (Colonna et al., supra, 2011).
[00208] Assim, em algumas modalidades, são aqui providos compostos bioderivados com uma relação entre carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte para absorção de carbono atmosférico, também referido como carbono ambiental. Os compostos bioderivados incluem, p. ex., xilitol, arabitol,
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127/227 etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol. Por exemplo, em alguns aspectos, o composto bioderivado pode ter um valor Fm de pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%,
pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos
40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo
menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%,
pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos
95%, pelo menos 98% ou de até 100% Em algumas de tais
modalidades , a fonte para absorção é CO2. Em algumas
modalidades, são aqui providos compostos bioderivados com uma relação entre carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que reflete uma fonte para absorção de carbono à base de petróleo. Nesse aspectos, os compostos bioderivados aqui providos podem ter um valor Fm inferior a 95%, inferior a 90%, inferior a 85%, inferior a 80%, inferior a 75%, inferior a 70%, inferior a 65%, inferior a 60%, inferior a 55%, inferior a 50%, inferior a 45%, inferior a 40%, inferior a 35%, inferior a 30%, inferior a 25%, inferior a 20%, inferior a 15%, inferior a 10%, inferior a 5%, inferior a 2% ou inferior a 1%. Em algumas modalidades, os compostos bioderivados aqui providos podem ter uma relação entre carbono-12, carbono-13 e carbono-14 que é obtida por uma combinação de uma fonte para absorção de carbono atmosférico com uma fonte para absorção à base de petróleo. O uso de tal combinação de fontes para absorção é uma maneira pela qual a relação entre carbono-12, carbono-13 e carbono-14 pode ser variada, e as respectivas razões refletiram as proporções das fontes para absorção.
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128/227 [00209] Além disso, a presente invenção também provê os produtos derivados dos compostos bioderivados incluindo, p. ex., xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metilbutanol ou 3-metil-butanol, em que os compostos bioderivados têm uma relação entre os isótopos carbono-12, carbono-13 e carbono-14 aproximadamente do mesmo valor que o CO2 que ocorre no meio ambiente. Por exemplo, em alguns aspectos, são aqui providos compostos bioderivados com uma razão isotópica de carbono-12 versus carbono-13 versus carbono-14 aproximadamente do mesmo valor do CO2 que ocorre no meio ambiente, ou uma das outras razões aqui reveladas. Entende-se, conforme aqui revelado, que um produto pode ter uma razão isotópica de carbono-12 versus carbono-13 versus carbono-14 aproximadamente do mesmo valor que o CO2 que ocorre no meio ambiente, ou uma das razões aqui reveladas, em que o produto é gerado a partir de compostos bioderivados conforme aqui revelados, em que o composto bioderivado é modificado quimicamente para gerar um produto final. Métodos para modificar quimicamente um composto bioderivado e gerar um produto desejado são bem conhecidos pelos técnicos no assunto, como aqui descrito.
[00210] A presente invenção também provê produtos de base biológica contendo um ou mais composto bioderivado, produzido por uma espécie de Metschnikowia aqui descrita ou produzido por um método aqui descrito. Em algumas modalidades, são providos produtos de base biológica, produzidos com um composto bioderivado aqui descrito, como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol. Tal
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129/227 produção pode incluir reagir quimicamente o composto bioderivado (p. ex., conversão química, funcionalização quimica, acoplamento quimico, oxidação, redução, polimerização, copolimerização e os semelhantes) e obter o produto final. Em algumas modalidades, são providos produtos de base biológica contendo um composto bioderivado aqui descrito, como xilitol, arabitol, etanol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, acetato de etila, álcool fenetilico, 2-metil-butanol ou 3-metil-butanol. Em algumas modalidades,
são providos produtos de base biológica contendo pelo menos
2%, pelo menos 3 %, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos
15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo
meno s 35%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%,
pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos
95%, pelo menos 98% ou 10 0% do composto bioderivado aqui
revelado.
[00211] A presente invenção provê polipeptideos isolados direcionados para as proteínas da HO Metschnikowia sp. e ácidos nucleicos isolados direcionados para os genes da HO Metschnikowia sp., bem como células hospedeiras compreendendo tais ácidos nucleicos. A presença desses ácidos nucleicos em uma espécie de Metschnikowia pode identificar a espécie de Metschnikowia como a HO Metschnikowia sp. ou uma variante da mesma. Assim, é provido um polipeptideo isolado que possui a sequência de aminoácidos das proteínas ArolO, Gxf2, Hgtl9, Hxt5, Tefl, Xksl, Xyll, Tall ou Tkll ou uma variante das mesmas; um ácido nucleico isolado que possui uma sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas ArolO, Gxf2, Hgtl9, Hxt5, Tefl, Xksl, Xyll, Tall ou Tkll ou uma variante das
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130/227 mesmas; um ácido nucleico isolado que possui a sequência de ácido nucleico do gene para ACT1, ARO8, AROIO, GPD1, GXF1, GXF2 , GXS1, HGT19, HXT2.6, HXT5, PGK1, QUP2, RPB1, RPB2 , TEF1, TP11, XKS1, XYL1, XYL2, XYT1, TALI ou TKL1; bem como uma célula hospedeira contendo tais sequências de ácido nucleico e/ou expressando tais proteínas.
[00212] Polipeptideos exemplares da HO Metschnikowia sp. incluem ArolO (SEQ ID NO: 37), Gxf2 (SEQ ID NO: 40), Hgtl9 (SEQ ID NO: 42), Hxt5 (SEQ ID NO: 44), Tefl (SEQ ID NO: 46), Xksl (SEQ ID NO: 51), Xyll (SEQ ID NO: 52), Tall (SEQ ID NO: 55) e Tkll (SEQ ID NO: 56) . Assim, em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55. Em algumas modalidades, é provido um polipeptideo isolado com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56.
[00213] Além disso, a presente invenção provê polipeptideos isolados com uma sequência de aminoácidos que é uma variante
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para uma proteína da HO Metschnikowia sp. aqui descrita, mas
que ainda retém a atividade funcional do polipeptídeo. Por exemplo, em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado possui uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOS:
37, 40, 42, 44, 46, 51, 52, 55 e 56, em que a sequência de
aminoácidos inclui 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25
substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. As variantes de uma proteína aqui provida também incluem, por exemplo, deleções, fusões ou truncamentos quando comparadas à sequência do polipeptídeo de referência. Assim, em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado aqui provido possui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95,0%, pelo menos
95,1%, pelo menos 95,2%, pelo menos 95,3%, pelo menos 95,4%,
pelo menos 95,5%, pelo menos 95,6%, pelo menos 95,7%, pelo
menos 95,8%, pelo menos 95,9%, pelo menos 96,0%, pelo menos
96,1%, pelo menos 96,2%, pelo menos 96,3%, pelo menos 96,4%,
pelo menos 96,5%, pelo menos 96,6%, pelo menos 96,7%, pelo
menos 96,8%, pelo menos 96,9%, pelo menos 97,0%, pelo menos
97,1%, pelo menos 97,2%, pelo menos 97,3%, pelo menos 97,4%,
pelo menos 97,5%, pelo menos 97,6%, pelo menos 97,7%, pelo
menos 97,8%, pelo menos 97,9%, pelo menos 98,0%, pelo menos
98,1%, pelo menos 98,2%, pelo menos 98,3%, pelo menos 98,4%,
pelo menos 98,5%, pelo menos 98,6%, pelo menos 98,7%, pelo
menos 98,8%, pelo menos 98,9%, pelo menos 99,0%, pelo menos
99,1%, pelo menos 99,2%, pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%,
pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7% ou pelo
menos 99,8% idêntica a qualquer uma das SEQ ID NOS: 37, 40,
42, 44, 46, 51, 52, , 55 e 56.
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132/227 [00214] As variantes das proteinas aqui descritas podem também conter substituições conservadoras de aminoácidos, significando que um ou mais aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido que não altera a estrutura secundária e/ou terciária da proteína. Tais substituições podem incluir a substituição de um aminoácido por um residue com propriedades fisico-quimicas semelhantes, como a substituição de um residue alifático (lie, Vai, Leu ou Ala) por outro, ou substituições entre resíduos básicos Lys e Arg, residues ácidos Glu e Asp, residues com amida Gin e Asn, residues com hidroxila Ser e Tyr ou residues aromáticos Phe e Tyr. Trocas de aminoácidos fenotipicamente silenciosas são descritas mais detalhadamente em Bowie et al., Science 247:1306-10 (1990) . Além disso, as variantes de uma proteína aqui descrita incluem aquelas com substituições, deleções ou adições de aminoácidos à sequência de aminoácidos fora de regiões funcionais da proteína, desde que a substituição, deleção ou adição não afete a função do polipeptídeo resultante. Técnicas para efetuar essas substituições e deleções são bem conhecidas no assunto e incluem, por exemplo, mutagênese sitio-dirigida.
[00215] Os polipeptideos isolados aqui providos também incluem fragmentos funcionais das proteinas aqui descritas, os quais retenham a sua função. Em algumas modalidades, é provido um polipeptídeo isolado que é um fragmento funcional de uma proteína aqui descrita. Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo que é um fragmento funcional de uma proteína aqui descrita. Em algumas modalidades, o polipeptídeo isolado pode ser fragmentos de uma proteína como ArolO (SEQ ID NO: 37), Gxf2 (SEQ ID NO: 40),
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Hgtl9 (SEQ ID NO: 42) , Hxt5 (SEQ ID NO: 44) , Tef 1 (SEQ ID NO:
46), Xksl ( SEQ ID NO: 51), Xyll ( SEQ ID NO: 52) , Tall (SEQ ID
NO: 55), e Tkll (SEQ ID NO: 56 ) , que retenha a função da
proteína .
[00216] Em algumas modalidades, as variantes das proteínas aqui descritas incluem modificação covalente ou conjugação com agregação de outras porções químicas, como grupos glicosila, grupos polietilenoglicol (PEG), lipídios fosfato, grupos acetila e os semelhantes. Em algumas modalidades, as variantes das proteínas aqui descritas incluem ainda, por exemplo, proteínas de fusão formadas com a proteína aqui descrita e outro polipeptídeo. Os polipeptídeos adicionados para criar a proteína de fusão incluem aqueles que facilitam a purificação ou oligomerização da proteína aqui descrita, ou aqueles que intensificam a estabilidade e/ou a função da proteína aqui descrita.
[00217] As proteínas aqui descritas podem ser fundidas a polipeptídeos heterólogos para facilitar a purificação. Muitos peptídeos heterólogos disponíveis (etiquetas peptídicas) permitem a ligação seletiva da proteína de fusão a um parceiro de ligação. Exemplos não limitantes de etiquetas peptídicas include 6-His, tiorredoxina, hemaglutinina, GST e a etiqueta de sequência sinal OmpA. Um parceiro de ligação que reconhece e se liga às etiquetas peptídicas heterólogas pode ser qualquer molécula ou composto, incluindo ions de metais (por exemplo, colunas de afinidade por metais), anticorpos, fragmentos de anticorpos ou qualquer proteína ou peptídeo que ligue seletiva ou especificamente o peptídeo heterólogo para permitir a purificação da proteína de fusão.
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134/227 [00218] As proteínas aqui descritas podem também ser modificadas para facilitar a formação de oligômeros. Por exemplo, a proteína aqui descrita pode ser fundida a porções de peptídeos que promovem a oligomerização, como zíperes de leucina e certos polipeptídeos de fragmentos de anticorpos, como polipeptídeos Fc. Técnicas para preparar essas proteínas de fusão são conhecidas, e são descritas, por exemplo, em WO 99/31241 e em Cosman et al., Immunity 14:123-133 (2001). A fusão a um polipeptideo Fc oferece a vantagem adicional de facilitar a purificação por cromatografia de afinidade em colunas de proteína A ou proteína G. A fusão a um zíper de leucina (LZ), por exemplo, uma repetição hepta repetitiva, frequentemente com quatro ou cinco resíduos de leucina intercalados com outros aminoácidos, é descrita em Landschulz et al., Science 240:1759-64 (1988).
[00219] A proteína aqui descrita pode estar em forma isolada ou em forma substancialmente purificada. Os polipeptídeos podem ser recuperados e purificados de culturas de células recombinantes por métodos conhecidos, incluindo, por exemplo, precipitação com sulfato de amônio ou etanol, cromatografia de troca aniônica ou catiônica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxiapatita e cromatografia com lectina. Em algumas modalidades, cromatografia de proteínas é empregada para purificação.
[00220] Em algumas modalidades, são providas espécies recombinantes de Metschnikowia com um ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita. Em algumas modalidades, a espécie recombinante de Metschnikowia possui um
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135/227 ácido nucleico exógeno que codifica uma proteína aqui descrita, em que a proteína contém 1 a 25, 1 a 20, 1 a 15, 1 a 10 ou 1 a 5 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Em algumas modalidades, a proteína é ArolO (SEQ ID NO: 37), Gxf2 (SEQ ID NO: 40), Hgtl9 (SEQ ID NO: 42), Hxt5 (SEQ ID NO: 44), Tefl (SEQ ID NO: 46), Xksl (SEQ ID NO: 51), e
Xyll (SEQ ID NO: 52) e retém a função da proteína. Em algumas modalidades, a proteína contém 1 a 10 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de ArolO (SEQ ID NO: 37), Gxf2 (SEQ ID NO: 40), Hgtl9 (SEQ ID NO: 42), Hxt5 (SEQ ID NO: 44), Tefl (SEQ ID NO: 46), Xksl (SEQ ID NO: 51), e Xyll (SEQ ID NO: 52) e retém a função da proteína. Em algumas modalidades, a proteína contém 1 a 5 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos de ArolO (SEQ ID NO: 37), Gxf2 (SEQ ID NO: 40), Hgtl9 (SEQ ID NO: 42), Hxt5 (SEQ ID NO: 44), Tefl (SEQ ID NO: 46), Xksl (SEQ ID NO: 51), e Xyll (SEQ ID NO: 52) e retém a função da proteína. O organismo microbiano não natural pode ser uma espécie de Metschnikowia, incluindo, entre outros, a H0 Metschnikowia sp. aqui descrita.
[00221] As proteínas aqui descritas podem ser expressas de modo recombinante por hospedeiros adequados. Quando se deseja a expressão heteróloga de uma proteína, as sequências de codificação de genes específicos podem ser modificadas de acordo com a utilização de códons do hospedeiro. O código genético padrão é bem conhecido na técnica, conforme revisado em, por exemplo, Osawa et al., Microbiol Rev. 56(1) :229-64 (1992). Espécies de leveduras, incluindo entre outras, Saccharonyces cerevisiae, Candida azyma, Candida diversa, Candida magnoliae, Candida rugopelliculosa, Yarrowia
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136/227 lipolytica e Zygoascus hellenicus, utilizam o código padrão. Certas espécies de leveduras utilizam códigos alternativos. Por exemplo, CUG, códon padrão para Leu, codifica Ser em espécies como Candida albicans, Candida cylindracea, Candida melibiosica, Candida parapsilosis, Candida rugose, Pichia stipitis e espécies de Metschnikowia. A tabela de codons para a HO Metschnikowia sp. é fornecida no presente.
[00222] Além do mais, os hospedeiros podem produzir simultaneamente outras formas da mesma categoria de proteínas, de modo que múltiplas formas do mesmo tipo de proteína são expressas na mesma célula. Por exemplo, os hospedeiros podem produzir simultaneamente diferentes transportadores, os quais podem formar oligômeros para transportar o mesmo açúcar. Alternativamente, os diferentes transportadores podem funcionar independentemente para transportar açúcares diferentes.
[00223] As variantes de proteínas aqui descritas podem ser geradas por métodos convencionais conhecidos na técnica, como introduzindo mutações em localizações especificas por mutagênese sitio-dirigida, direcionada por oligonucleotídeo. A mutagênese sitio-dirigida é considerada uma abordagem informativa para criar proteínas e podem depender de estruturas cristalográficas de alta resolução de proteínas alvo para trocas de aminoácidos específicos (Van Den Burg et al. , PNAS 95:2056-60 (1998)). Métodos computacionais para identificar trocas em posições especificas para vários objetivos na criação de proteínas são também conhecidos na técnica (Hellinga, Nature Structural Biology 5:525-27 (1998)).
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137/227 [00224] Outras técnicas conhecidas no assunto incluem, entre outros, técnicas de mutagênese não informativa (denominadas genericamente de evolução direcionada) . A evolução direcionada, em conjunto com rastreamento de alto rendimento, permite testar variações estatisticamente significativas na conformação de proteínas (Arnold, 1998) . A tecnologia da evolução direcionada pode incluir métodos de diversificação semelhantes àquele descrito por Cramer! et al., Nature 391:288-91 (1998), mutagênese por saturação de posições, processo de extensão promovida (staggered extension process, StEP) (Zhao et al., Nature Biotechnology 16:258-61 (1998)) e sintese/remontagem de DNA (Patente U.S. No 5,965,408).
[00225] Conforme aqui revelado, um ácido nucleico que codifica uma proteína aqui descrita pode ser introduzido em um organismo hospedeiro. Em alguns casos, pode-se desejar também modificar uma atividade da proteína para aumentar a produção de um produto desejado. Por exemplo, mutações conhecidas que aumentam a atividade de uma proteína podem ser introduzidas em uma molécula do ácido nucleico codificante. Adicionalmente, métodos de otimização podem ser aplicados para aumentar a atividade de uma proteína e/ou diminuir uma atividade inibidora, por exemplo, diminuir a atividade de um regulador negativo.
[00226] Um de tais métodos de otimização é evolução direcionada. A evolução direcionada é uma abordagem poderosa que envolve a introdução de mutações direcionadas a um gene específico a fim de melhorar a e/ou alterar as propriedades de uma enzima. Enzimas melhoradas e/ou alteradas podem ser identificadas através do desenvolvimento e implementação de
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138/227 ensaios sensíveis de rastreamento de alto rendimento que permitem o rastreamento automático de muitas variantes da enzima (por exemplo, >104) . Ciclos iterativos de mutagênese e rastreamento são realizados tipicamente para fornecer uma enzima com propriedades aperfeiçoadas. Algoritmos computacionais que podem ajudar a identificar áreas do gene para mutagênese também são desenvolvidos e podem reduzir significativamente o número de variantes da enzima que precisam ser geradas e rastreadas. Inúmeras tecnologias de evolução direcionada foram desenvolvidas (para revisões, vide Hibbert et al., Biomol. Eng 22:11-19 (2005); Huisman and Lalonde, em Biocatalysis in the pharmaceutical and biotechnology industries, pág. 717-742 (2007), Patel (ed.), CRC Press; Otten and Quax. Biomol. Eng 22:1-9 (2005); e Sen et al., Appl Biochem.Biotechnol 143:212-223 (2007)) para criar bibliotecas de variantes diversas com eficiência, e esses métodos foram aplicados com êxito para melhorar uma ampla gama de propriedades em muitas classes de enzimas. As características de enzimas que foram melhoradas e/ou alteradas por tecnologias de evolução direcionada incluem, por exemplo: seletividade/especificidade, para conversão de substratos não naturais; estabilidade térmica, para processamento robusto a alta temperatura; estabilidade do pH, para bioprocessamento em condições de pH mais baixo ou mais alto; tolerância do substrato ou produto, de modo que possam ser alcançados títulos elevados do produto; ligação (Km) , incluindo ampliar a ligação do substrato para incluir substratos não naturais; inibição (Κι), para remover a inibição por produtos, substratos ou intermediários fundamentais; atividade (kcat), para
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139/227 aumentar as taxas de reações enzimáticas e se alcançar o fluxo desejado; níveis de expressão, para aumentar rendimentos de proteinas e o fluxo global da via; estabilidade ao oxigênio, para operação de enzimas sensíveis ao ar em condições aeróbicas; e atividade anaeróbica, para operação de uma enzima aeróbica na ausência de oxigênio.
[00227] Uma série de métodos exemplares foi desenvolvida para a mutagênese e diversificação de genes direcionados a propriedades desejadas de enzimas especificas. Tais métodos são bem conhecidos pelos técnicos no assunto. Qualquer um destes pode ser usado para alterar e/ou aperfeiçoar a atividade de uma proteína aqui descrita. Tais métodos incluem, entre outros EpPCR, que introduz mutações pontuais aleatórias reduzindo a fidelidade da DNA polimerase em reações PCR (Pritchard et al., J Theor.Biol. 234:497-509 (2005)); amplificação por circulo rolante com tendência a erros (Errorprone Rolling Circle Amplification, epRCA), que é semelhante ao epPCR exceto que um plasmideo inteiramente circular é utilizado como o molde e 6-mers aleatórios com ligações tiofosfato resistentes à exonuclease nos dois últimos 2 nucleotídeos são utilizados para amplificar o plasmideo, seguido por transformação em células nas quais o plasmideo
volta a ficar circular em repetições tandem (Fuj ii et al. ,
Nucleic Acids Res. 32:el45 (2004); e Fuji! et al., Nat.
Protoc. 1:2493· -2497 (2006) ) ; embaralhamento do DNA ou de
Familia (DNA or Family shuffling), que envolve tipicamente a digestão de dois ou mais genes variantes com nucleases como Dnase I ou EndoV para gerar um pool de fragmentos aleatórios que voltam a ser montados por ciclos de anelamento ou extensão
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140/227 na presença de DNA polimerase, criando-se uma biblioteca de genes quiméricos (Stemmer, Proc Natl Acad Sei USA 91:1074710751 (1994); e Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)); extensão promovida (Staggered extension, StEP), que implica em usar primers (iniciadores) como molde, seguido por ciclos repetidos de PCR em duas etapas com desnaturação e duração muito curta de anelamento/extensão (de apenas 5 segundos) (Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16:258-261 (1998)); recombinação de primers randômicos (Random Priming Recombination, RPR), na qual sequências iniciadoras aleatórias são usadas para gerar fragmentos muito curtos de DNA complementares a segmentos diferentes do molde (Shao et al., Nucleic Acids Res 26:681-683 (1998)) .
[00228] Métodos adicionais incluem Recombinação heteroduplex, na qual DNA plasmidial linearizado é utilizado para formar heteroduplexos que são corrigidos por reparo de erro de pareamento (Volkov et al, Nucleic Acids Res. 27:el8 (1999); e Volkov et al., Methods Enzymol. 328:456-463 (2000)); quimeragênese randômica em moldes transitórios (Random Chimeragenesis on Transient Templates, RACHITT), que emprega fragmentação por DNAse I e fracionamento por tamanho de DNA fita simples (ssDNA) (Coco et al., Nat. Biotechnol. 19:354-359 (2001)); Extensão recombinada em moldes truncados (Recombined Extension on Truncated templates, RETT), que implica na troca de molde de fitas em crescimento unidirecional a partir dos primers na presença de fragmentos unidirecionais de ssDNA utilizados como urn pool de moldes (Lee et al., J. Molec. Catalysis 26:119-129 (2003)); embaralhamento gênico por oligonucleotídeos degenerados (Degenerate Oligonucleotide Gene
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Shuffling, DOGS), no qual primers degenerados são utilizados para controlar a recombinação entre moléculas; (Bergquist e Gibbs, Methods Mol. Biol 352:191-204 (2007); Bergquist et al., Biomol. Eng 22:63-72 (2005); Gibbs et al., Gene 271:13-20 (2001)); truncamento incremental para a criação de enzimas híbridas (Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes, ITCHY), que cria uma biblioteca combinatória com deleções de 1 par de bases de urn gene ou fragmento gênico de interesse (Ostermeier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:3562-3567 (1999); e Ostermeier et al., Nat. Biotechnol.
17:1205-1209 (1999)); truncamento tio-incremental para a criação de enzimas híbridas (Thio-Incremental Truncation for the Creation of Hybrid Enzymes, THIO-ITCHY), que é semelhante ap ITCHY exceto que fosfotioato dNTPs são utilizados para gerar os truncamentos (Lutz et al., Nucleic Acids Res 29:E16 (2001)); SCRATCHY, que combina dois métodos para recombinação de genes, ITCHY e embaralhamento do DNA (Lutz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:11248-11253 (2001)); mutagênese por deriva genética randômica (Random Drift Mutagenesis, RNDM), na qual mutações feitas via epPCR são seguidas por rastreamento/seleção daquelas que retêm atividade utilizável (Bergquist et al., Biomol. Eng. 22:63-72 (2005)); mutagênese por saturação de sequências (Sequence Saturation Mutagenesis, SeSaM) , um método de mutagênese aleatória que gera um pool de fragmentos de comprimento aleatório por incorporação aleatória de um nucleotídeo fosfotioato e divagem, o qual é utilizado como molde para extensão na presença de bases universais como inosina, e a replicação de um complemento contendo inosina fornece a incorporação aleatória de bases e,
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142/227 consequentemente, a mutagênese (Wong et al., Biotechnol. J. 3:74-82 (2008); Wong et al., Nucleic Acids Res. 32:e26 (2004); e Wong et al., Anal. Biochem. 341:187-189 (2005)); embaralhamento sintético (Synthetic Shuffling), que usa oligonucleotideos sobrepostos destinados a codificar toda a diversidade genética em alvos e permite diversidade muito elevada para a progênie embaralhada (Ness et al., Nat. Biotechnol. 20:1251-1255 (2002); Tecnologia da troca e excisão de nucleotídeos (Nucleotide Exchange and Excision Technology, NexT), que emprega uma combinação de incorporação de dUTP seguida por tratamento com uracil DNA glicosilase e, a seguir, piperidina para realizar a fragmentação final do DNA (Muller et al., Nucleic Acids Res. 33:ell7 (2005) .
[00229] Métodos adicionais incluem recombinação proteica independente da homologia de sequência (Sequence HomologyIndependent Protein Recombination, SHIPREC), na qual urn linker é utilizado para facilitar a fusão entre dois genes relacionados distantemente ou não relacionados, e uma gama de quimeras é gerada entre os dois genes, resultando em bibliotecas de híbridos de cruzamento simples (Sieber et al., Nat. Biotechnol. 19:456-460 (2001)); Gene Site Saturation Mutagenesis™ (GSSM™), na qual os materiais de partida incluem um plasmideo de DNA de dupla fita superenrolada (dsDNA) contendo uma inserção e dois primers que são gerados no sitio desejado de mutações (Kretz et al., Methods Enzymol. 388:3-11 (2004)); Mutagênese de cassete combinatório (Combinatorial Cassette Mutagenesis, CCM), que envolve o uso de cassetes de oligonucleotideos curtos para substituir regiões limitadas por um número grande se alterações na sequência de aminoácidos
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143/227 (Reidhaar-Olson et al. Methods Enzymol. 208:564-586 (1991); e Reidhaar-Olson et al. Science 241:53-57 (1988)); mutagênese de múltiplos cassete combinatórios (Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis, CMCM), que é essencialmente semelhante à CCM e uses epPCR com alta taxa de mutação para identificar pontos quentes e regiões quentes e, a seguir, a extensão por CMCM para cobrir uma região definida de espaço da sequência proteica (Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40:35893591 (2001)); a técnica Mutator Strains (Cepas Mutadoras), na qual plasmideos ts mutadores condicionais, utilizando o gene mutD5, que codifica uma subunidade mutante de DNA polimerase III, para permitir aumentos de 20 a 4000-X na frequência natural e aleatória de mutações durante a seleção e bloquear o acúmulo de mutações deletérias quando a seleção não é necessária (Selifonova et al., Appl. Environ. Microbiol. 67:3645-3649 (2001)); Low et al., J. Mol. Biol. 260:359-3680 (1996)).
[00230] Métodos exemplares adicionais incluem Mutagênese LookThrough (LTM), que é um método de mutagênese multidimensional que avalia e aperfeiçoa mutações combinatórias de aminoácidos selecionados (Rajpal et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:8466-8471 (2005)); Remontagem de genes (Gene Reassembly), que é um método de embaralhamento do DNA que pode ser aplicados a múltiplos genes de uma vez ou criar uma grande biblioteca de quimeras (mutações múltiplas) de um único gene (Tecnologia Tunable GeneReassembly™ (TGR™) fornecida pela Verenium Corporation) , criação de proteínas in silico (Protein Design Automation, PDA), que é um algoritmo de otimização que ancora o esqueleto (backbone) proteico estruturalmente
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144/227 definido com uma dobra em particular e que busca espaço na sequência para substituições de aminoácidos que podem estabilizar a dobra e a energética global da proteína, funcionando em geral com mais eficiência em proteinas com estruturas tridimensionais conhecidas (Hayes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99:15926-15931 (2002)); e Mutagênese iterativa por saturação (Iterative Saturation Mutagenesis, ISM), que envolve usar o conhecimento sobre a estrutura/função para escolher um sitio provável para melhoria da enzima, realizando mutagênese por saturação em um sitio escolhido por um método de mutagênese como Stratagene QuikChange (Stratagene; San Diego CA), rastreamento/seleção de propriedades desejadas e, utilizando clone(s) melhorado(s) , partindo em outro sitio e continuando a repetição até que uma atividade desejada seja alcançada (Reetz et al., Nat. Protoc. 2:891-903 (2007); e Reetz et al., Angew. Chem. Int. Ed Engl. 45:7745-7751 (2006)).
[00231] Qualquer um dos métodos mencionados acima para mutagênese pode ser pode ser utilizado isoladamente ou em qualquer combinação. Adicionalmente, qualquer método ou combinação dos métodos de evolução direcionada pode ser utilizado em conjunto com técnicas de evolução adaptativa, conforme aqui descrito ou do contrário conhecido na técnica.
[00232] A presente invenção provê ácidos nucleicos isolados com sequências de ácido nucleico que codificam as proteinas aqui descritas bem como as sequências de ácido nucleico codificante dos genes aqui descritos. Os ácidos nucleicos aqui providos incluem aqueles com a sequência de ácido nucleico fornecida na listagem de sequências; aqueles que hibridizam com as
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145/227 sequências de ácido nucleico fornecidas na listagem de sequências, em condições de hibridização de alto rigor (por exemplo, 42 °C, 2,5 horas, 6><SCC, SDS 0,1%); e aqueles com considerável identidade de sequência de ácido nucleico com a sequência de ácido nucleico fornecida na listagem de sequências. Os ácidos nucleicos aqui providos também abrangem substituições equivalentes de códons que podem ser traduzidos para produzir as mesmas sequências de aminoácidos. A presente invenção também provê vetores incluindo os ácidos nucleicos aqui descritos. O vetor pode ser um vetor de expressão adequado para expressão em um organismo microbiano hospedeiro. O vetor pode ser um vetor viral.
[00233] Os ácidos nucleicos aqui providos incluem aqueles que codificam proteínas com uma sequência de aminoácidos como aqui descrita, bem como as suas variantes que retenham a sua função. Os ácidos nucleicos aqui providos podem ser cDNA, DNA sintetizado quimicamente, DNA amplificado por PCR, RNA ou combinações dos mesmos. Devido à degeneração do código genético, duas sequências de DNA podem diferir e ainda assim codificar sequências idênticas de aminoácidos.
[00234] A presente invenção também provê fragmentos úteis de ácidos nucleicos que codificam as proteínas aqui descritas, incluem sondas e primers. É possível utilizar tais sondas e primers, por exemplo, em métodos de PCR para amplificar ou detectar a presença de ácidos nucleicos que codificam as proteínas aqui descritas in vitro, bem como em Southern e Northern blots para análise. Células que expressam as proteínas aqui descritas podem também ser identificadas pelo
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146/227 uso de tais sondas. Métodos para a produção e uso de tais primers e sondas são bem conhecidos.
[00235] A presente invenção também provê fragmentos de ácidos nucleicos que codificam as proteínas aqui descritas e que são oligonucleotídeos antisenso ou senso com um ácido nucleico fita simples capaz de se ligar a uma sequência do mRNA ou DNA alvo da proteína ou a sequência de ácido nucleico aqui descrita.
[00236] Um ácido nucleico codificante de uma proteína aqui descrita pode incluir ácidos nucleicos que hibridizam com um ácido nucleico aqui revelado pela SEQ ID NO ou uma molécula de ácido nucleico que hibridiza com molécula de ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos aqui revelada pela SEQ ID NO. As condições de hibridização podem condições de hibridização altamente rigorosas, moderadamente rigorosas ou de baixo rigor que são bem conhecidas por qualquer técnico no assunto como aquelas aqui descritas.
[00237] Hibridização rigorosa refere-se a condições sob as quais polinucleotídeos hibridizados permanecem estáveis. Conforme conhecido pelos técnicos no assunto, a estabilidade de polinucleotídeos hibridizados é refletida na temperatura de fusão (Tm) dos híbridos. Em geral, a estabilidade de polinucleotídeos hibridizados é em função da concentração de sal, por exemplo, a concentração de ions sódio e temperatura. Uma reação de hibridização pode ser realizada em condições de rigor menor, seguida por lavagens de rigor variável, porém maior. A referência ao rigor da hibridização está relacionada a tais condições de lavagem. A hibridização altamente rigorosa inclui condições que permitem a hibridização de somente
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147/227 aquelas sequências de ácido nucleico que formam polinucleotideos hibridizados estáveis em NaCl 0,018M a 65 °C, por exemplo, se não for estável em NaCl 0,018M a 65 °C, o híbrido não será estável em condições de alto rigor, como contempladas no presente. Condições de alto rigor podem ser fornecidas, por exemplo, pela hibridização em formamida 50%, 5X solução de Denhart, 5X SSPE, SDS 0,2% a 42 °C, seguida por lavagem em O,1X SSPE e SDS 0,1% a 65 °C. Outras condições de hibridização além de condições altamente rigorosas podem também ser utilizadas para descrever as sequências de ácido nucleico aqui revelado. Por exemplo, a expressão hibridização moderadamente rigorosa refere-se a condições equivalentes à hibridização em formamida 50%, 5X solução de Denhart, 5X SSPE, SDS 0,2% a 42°C, seguida por lavagem em 0,2X SSPE, SDS 0,2% a 42 °C. A expressão hibridização de baixo rigor refere-se a condições equivalentes à hibridização em formamida 10%, 5X solução de Denhart, 6X SSPE, SDS 0,2% a 22 °C, seguida por lavagem em IX SSPE, SDS 0,2% a 37 °C. A solução de Denhart contém Ficoll 1%, polivinilpirrolidona 1% e albumina sérica bovina 1% (BSA). 20X SSPE (cloreto de sódio, fosfato de sódio, ácido etilenodiaminatetracético (EDTA)) contém cloreto de sódio 3M, fosfato de sódio 0,2M e EDTA 0,025M. Outros tampões e condições adequadas de hibridização de baixo, moderado e alto rigor são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999).
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148/227 [00238] Os ácidos nucleicos que codificam uma proteína aqui provida incluem aqueles com certo percentual de identidade de sequência com uma sequência de ácido nucleico aqui revelado pela SEQ ID NO. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico
pode ter pelo menos 95,0%, pelo menos 95,1%, pelo menos 95,2%,
pelo menos 95,3%, pelo menos 95,4%, pelo menos 95,5% , pelo
menos 95, 6% , pelo menos 95,7%, pelo menos 95, 8% , pelo menos
95, 9% , pelo menos 96,0%, pelo menos 96,1%, pelo menos 96,2%,
pelo menos 96,3%, pelo menos 96,4%, pelo menos 96, 5% , pelo
menos 9 6,6% , pelo menos 96,7%, pelo menos 96, 8% , pelo menos
9 6,9% , pelo menos 97,0%, pelo menos 97,1%, pelo menos 97,2%,
pelo menos 97,3%, pelo menos 97,4%, pelo menos 97,5% , pelo
menos 97, 6% , pelo menos 97,7%, pelo menos 97,8% , pelo menos
97, 9% , pelo menos 98,0%, pelo menos 98,1%, pelo menos 98,2%,
pelo menos 98,3%, pelo menos 98,4%, pelo menos 98,5% , pelo
menos 98, 6% , pelo menos 98,7%, pelo menos 98,8% , pelo menos
98, 9% , pelo menos 99,0%, pelo menos 99,1%, pelo menos 99,2%,
pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, pelo menos 99, 5% , pelo
menos 99,6 O , pelo menos 99 , 7%, ou pelo menos 9 9,8% de
identidade de sequência, ou ser idêntica a uma sequência
selecionada a partir de SEQ ID NOS : 57-78 .
[00239] Assim, em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado aqui provido possui uma sequência de ácido nucleico dos genes da HO Metschnikowia sp. Aqui revelada, incluindo ACT1 (SEQ ID NO: 57), ARO8 (SEQ ID NO: 58), AROIO (SEQ ID NO: 59), GPD1 (SEQ ID NO: 60), GXF1 (SEQ ID NO: 61), GXF2 (SEQ ID NO: 62), GXS1 (SEQ ID NO: 63), HXT19 (SEQ ID NO: 64), HXT2.6 (SEQ ID NO: 65), HXT5 (SEQ ID NO: 66), PGK1 (SEQ ID NO: 67), QUP2 (SEQ ID NO: 68), RPB1 (SEQ ID NO: 69), RPB2 (SEQ ID NO: 70), TEF1
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149/227 (SEQ ID NO: 71), TPI1 (SEQ ID NO: 72), XKS1 (SEQ ID NO: 73), XYL1 (SEQ ID NO: 74), XYL2 (SEQ ID NO: 75), XYT1 (SEQ ID NO: 76), TALI (SEQ ID NO: 77) ou TKL1 (SEQ ID NO: 78). Assim, em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico de ACT1 (SEQ ID NO: 57) . Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico de ARO8 (SEQ ID NO: 58) . Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico de AROIO (SEQ ID NO: 59) . Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico de GPD1 (SEQ ID NO: 60) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de GXF1 (SEQ ID NO: 61) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de GXF2 (SEQ ID NO: 62) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de GXS1 (SEQ ID NO: 63) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de HXT19 (SEQ ID NO: 64) . Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de HXT2.6 (SEQ ID NO: 65) . Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de HXT5 (SEQ ID NO: 66) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de PGK1 (SEQ ID NO: 67) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de QUP2 (SEQ ID NO: 68) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de RPB1 (SEQ ID NO: 69) .Em
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150/227 algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de RPB2 (SEQ ID NO: 70) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de TEF1 (SEQ ID NO: 71) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de TPI1 (SEQ ID NO: 72) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de XKS1 (SEQ ID NO: 73) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de XYL1 (SEQ ID NO: 74) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de XYL2 (SEQ ID NO: 75) .Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isoladocom uma sequência de ácido nucleico de ou XYT1 (SEQ ID NO: 76) . Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico de ou TALI (SEQ ID NO: 77). Em algumas modalidades, é provido um ácido nucleico isolado com uma sequência de ácido nucleico de ou TKL1 (SEQ ID NO: 78).
[00240] Entende-se que modificações que não afetam substancialmente a atividade das várias modalidades desta invenção são abrangidas também pela definição da invenção aqui provida. Assim, os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar, mas não limitar a presente invenção. Por todo este pedido de patente várias publicações foram citadas. Os conteúdos dessas publicações, incluindo publicações do GenBank e de números GI, são aqui incorporados, em sua totalidade, por referência neste pedido de patente com objetivo de descrever mais detalhadamente o estado da técnica ao qual esta invenção pertence.
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Exemplo I
Identificação de HO Metschnikowia sp.
[00241] Esse exemplo demonstra que a HO Metschnikowia sp. pertence ao gênero de Metschnikowia e possui sequências D1/D2 e ITS que se relacionam mais proximamente ao clado de Metschnikowia pulcherrima, mas possui alta variabilidade dentro de sua região D1/D2 que o limiar em geral aplicável de 1% para identificação de espécies não pode ser utilizado. No entanto, a alta variabilidade limita-se principalmente a duas regiões em particular e uma região D1/D2 conservada foi identificada. A análise filogenética utilizando a sequência do gene RPB2 mostra que a HO Metschnikowia sp. é uma espécie nova que é reunida com Metschnikowia zizyphicola em um subgrupo, em comparação a outros membros do ciado Metschnikowia pulcherrima. As características morfológicas e fisiológicas, especialmente no perfil de crescimento de HO Metschnikowia sp. em meio contendo xilose, confirma que HO Metschnikowia sp. é uma espécie nova que está estreitamente relacionada à Metschnikowia zizyphicola.
Análise das sequências do dominio D1/D2 e ITS [00242] A análise da sequência dos domínios 1 e 2 (dominio D1/D2) da subunidade maior (LSU) do gene rRNA e do espaçador interno transcrito (ITS), que está localizado entre a subunidade menor (SSU) e LSU dos genes rRNA, é ferramenta em geral aceita para identificação de espécies de leveduras (Kurtzman and Robnett, 1998, Antonie Van Leeuwenkoek, 73:331371) . Estudos anteriores de leveduras dos ascomicetos demonstraram que cepas com mais de 1% de substituição no dominio D1/D2 normalmente representam espécies separadas
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152/227 (Kurtzman & Robnett, 1998). Foram encontradas exceções em Clavispora lusitaniae (Lachance et al., 2003, FEMS Yeast Res. 4:253-258), Metschnikowia andauensis e Metschnikowia fructicola (Sipiczki et al., 2013, PLoS One, 8:e67384), em que algumas cepas mostram mais de 1% de divergência ou heterogeneidade no domínio D1/D2.
[00243] O domínio D1/D2 da H0 Metschnikowia sp. foi amplificado a partir de seu DNA genômico utilizando os primers NL1 (5'GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG- 3'; SEQ ID NO: 26) e NL4 (5'GGTCCGTGTTTCAAGACGG -3'; SEQ ID NO: 27). A sequência exemplar com 499 bases do domínio D1/D2 (iniciando imediatamente depois do primer NL1 e terminando antes do primer NL4) foi identificada para H0 Metschnikowia sp. : AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCC CCCGGGAATTGTAATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAAGTCCACTGGAAAG TGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCCCGTGAACCCCTTCAACGCCTTCATCCCAGATCTCCAAG AGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACC GGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGA GTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACTTAACTGGGCCA GCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAATGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGG TCCTTATTTCCTCGCCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGCGTAATGGTTGCAAGT OGG (SEQ ID NO: 1) [00244] Essa sequência D1/D2 exemplar foi um pool de múltiplos tipos de domínios D1/D2 - um tipo de sequência consenso abrangendo todos os tipos em uma célula.
[00245] A sequência acima foi comparada contra o banco de dados NCBI Nucleotide collection (nr/nt) utilizando a ferramenta básica de busca de alinhamento local de nucleotídeos (Nucleotide Basic Local Alignment Search Tool, BLASTN). A
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153/227 partir da busca com BLASTN, gerou-se um relatório de taxonomia (Tabela 1) . 0 relatório de taxonomia mostrou que entre os 105 acertos totais, 104 hits são do gênero Metschnikowia com a maioria das espécies pertencendo ao ciado Metschnikowia pulcherrima, incluindo Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia fructicola, Metschnikowia andauensis, Metschnikowia chrysoperlae, Metschnikowia sinensis, Metschnikowia shanxiensis e Metschnikowia zizyphicola.
Tabela 1
Taxonomia Número de acertos Número de Organismos Descrição
Saccharomycetes 105 35
. Metschnikowia 104 34
.. Metschnikowia sp. 45 1 Metschnikowia sp. acertos
.. Metschnikowia sp. 4 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 4 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia sp. 3 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 3 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia sp. 1 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 1 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia sp. 9 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 9 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia sp. 2 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 2 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia pulcherrima 7 1 Metschnikowia pulcherrima acertos
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Taxonomia Número de acertos Número de Organismos Descrição
.. Metschnikowia sp. MS- 2013 6 1 Metschnikowia sp. MS- 2013 acertos
.. Metschnikowia sp. 6 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 6 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia sp. 11- 1090 5 1 Metschnikowia sp. 11- 1090 acertos
.. Metschnikowia sp. 11- 1088 9 1 Metschnikowia sp. 11- 1088 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1634 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1634 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1656 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1656 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1648 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1648 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1651 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1651 acertos
.. Metschnikowia andauensis 2 1 Metschnikowia andauensis acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola BBSl-19a 1 1 Metschnikowia aff. fructicola BBSl-19a acertos
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Taxonomia Número de acertos Número de Organismos Descrição
.. Metschnikowia aff. chrysoperlae NRRL Y-6259 2 1 Metschnikowia aff. chrysoperlae NRRL Y- 6259 acertos
.. Metschnikowia aff. chrysoperlae P34A005 1 1 Metschnikowia aff. chrysoperlae P34A005 acertos
.. Metschnikowia chrysoperlae 1 1 Metschnikowia chrysoperlae acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola KKS 1 1 Metschnikowia aff. fructicola KKS acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola D3896 1 1 Metschnikowia aff. fructicola D3896 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola D3895 1 1 Metschnikowia aff. fructicola D3895 acertos
.. Metschnikowia sp. YS W1 1 1 Metschnikowia sp. YS W1 acertos
.. Metschnikowia sp. 4,3,38 1 1 Metschnikowia sp. 4,3,38 acertos
.. Metschnikowia sp. NRRL Y-6148 1 1 Metschnikowia sp. NRRL Y-6148 acertos
.. Metschnikowia aff. chrysoperlae P34A004 1 1 Metschnikowia aff. chrysoperlae P34A004 acertos
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Taxonomia Número de acertos Número de Organismos Descrição
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1652 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1652 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1627 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1627 acertos
.. Metschnikowia aff. fructicola HA 1647 1 1 Metschnikowia aff. fructicola HA 1647 acertos
.. Metschnikowia sp. 11- 1089 2 1 Metschnikowia sp. 11- 1089 acertos
.. Metschnikowia sp. 5 MS-2013 1 1 Metschnikowia sp. 5 MS-2013 acertos
.. Metschnikowia aff. chrysoperlae HA 1623 1 1 Metschnikowia aff. chrysoperlae HA 1623 acertos
.. Metschnikowia aff. chrysoperlae P44A006 1 1 Metschnikowia aff. chrysoperlae P44A006 acertos
[00246] 0 dominio D1/D2 identificado acima da HO Metschnikowia sp. (SEQ ID NO: 1) foi comparado ainda ao dominio D1/D2 de espécies especificas dentro do ciado Metschnikowia pulcherrima (Tabela 2). Inúmeras diferenças foram identificadas. Por exemplo, o número de variações em nucleotídeos na sequência do dominio D1/D2 entre a HO Metschnikowia sp. e a espécie do ciado Metschnikowia pulcherrima de Metschnikowia pulcherrima,
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Metschnikowia fructicola, Metschnikowia andauensis,
Metschnikowia chrysoperlae, Metschnikowia sinensis,
Metschnikowia shanxiensis e Metschnikowia zizyphicola foram 11 (2,2%), 14 (2,8%), 11 (2,2%), 11 (2,2%), 11 (2,2%), 11 (2,2%) e 12 (2,4%), respectivamente.
Tabela 2
Táxon Designação da cepa Número de Acesso de 26s rDNA
M. andauensis CBS 10809 AU745110
M. chrysoperlae CBS 9803 AY452047
M. fructicola CBS 8853 AF360542
M. pulcherrima CBS 5833 U45736
M. shanxiensis CBS 10359 DQ367883
M. sinensis CBS 10357 DQ367881
M. zizyphicola CBS 10358 DQ367882
[00247] A análise da sequência do dominio D1/D2 e de ITS for também conduzida pelo CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. A HO Metschnikowia sp. foi cultivada no meio Malt Extact Agar (MEA, OXOID) . O DNA foi extraído depois de urn periodo de incubação de 3-4 dias no escuro a 25 °C utilizando o kit de isolamento de DNA MoBio - UltraClean Microbial DNA. Fragmentos contendo o dominio D1/D2 foram amplificados com os primers LROR (5'-ACCCGCTGAACTTAAGC-3' ; SEQ ID NO: 28) e LR5 (5' TCCTGAGGGAAACTTCG-3'; SEQ ID NO: 29) (Vilgalys and Hester, 1990, J. Bacteriol., 172(8):4238-4246). Fragmentos contendo o Espaçador Interno Transcrito 1 e 2 e o gene 5,8S (ITS) foram amplificados com os primers LS266 (5'-GCATTCCCAAACAACTCGACTC3'; SEQ ID NO: 30) e V9G (5' -TTACGTCCCTGCCCTTTGTA-3' ; SEQ ID
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NO: 31) (Gerrits van den Ende & de Hoog 1999)) . Os fragmentos de PCR foram sequenciados com o kit de sequenciamento ABI Prism Big DyeTM Terminator v. 3.0 Ready Reaction Cycle. Amostras foram analisadas em um analisador genético ABI PRISM 3700 e contigs foram montados utilizando as sequências forward e reverse com o programa SeqMan do pacote LaserGene. Foram identificadas as sequências de D1/D2 e ITS a seguir:
Sequência do domínio D1/D2:
GATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTG TAATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCGGGGGTTAAGTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAG AGGGTGACAGCCCCGTGAACCCCTTTAAAGCCTTCATCCCAGATCTCCAAGAGTCGAGTTGT TTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTA CGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACTTAACTGGGCCAGCATCGGGGCG GCGGGAAACAAAACCACCGGGGAATGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCTATTTCC ATGCTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGCGTAATGGTTGCAAGTCGCCCGTCTTG AAACACGGACCAAGGAGTCTAACAATCATGCAAGTGTTTGGGCCCAAAACCCATACGCGCAA TGAAAGTAACCGGAGCGAACCTTCTGGTGCAGCTCCAGCCACACCGAGACCCAAATCCCGGT GTGAGCAAGCATGGCTGTTGGGACCCGAAAGATGGTGAACTATACCTGGATAGGGTGAAGCC AGAGGAAACTCTGGTGGAGGCTCGTAGCGGTTCTGACGTGCAAATCGATCGTCGAATCTGGG TATAGGGGCGAAAGAC (SEQ ID NO: 32)
Sequência de ITS:
CTTAGTGAGGCCTCTGGATTGAATCTAGGGCCGGGGCGACCCGGCCGTGGGTTGAGAAACTG GTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCG GAAGGATCATTAAAAATATTATTACACACTTTTAGGAAAAACCTCTGAACCTTTTTTTTCAT ATACACTTTTAAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAG CGAATTGCGATACGTAATATGACTTGCAGACGTGAATCATTGAATCTTTGAACGCACATTGC GCCCCGGGGTATTCCCCAGGGCATGCGTGGGTGAGCGATATTTACTCTCAAACCTCCGGTTT GGTCCTGCTTCGGCCTAATATCAACGGCGCTAGAATAAGTTTTAGCCCCATTCTTTTTCCTC
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ACCCTCGTAAGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACA
GGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAAT
TGTAATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCGGGGGTTAAGTCCACTGGAAAGTGGCGCCAC
AGAGGGTGACAGCCCCGTGA (SEQ ID NO: 33) [00248] Essas sequências foram comparadas contra o banco de dados NCBI Nucleotide collection (nr/nt) utilizando a ferramenta básica de busca de alinhamento local de nucleotídeos (BLASTN) e em um grande banco de dados de fungos do CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre com sequências da maioria de cepas do tipo. Essa comparação mostrou que a HO Metschnikowia sp. é uma espécie nova dentro do gênero Metschnikowia. A espécie mais próxima conhecida dentro do gênero foi identificada como Metschnikowia andauensis, que mostrava 97% de identidade de sequência para a sequência D1/D2. Adicionalmente, Metschnikowia pulcherrima demonstrou ter 98% de identidade de sequência para a sequência D1/D2, mas somente 94% de identidade de sequência para sequência de ITS, e Metschnikowia shanxiensis mostrou ter apenas 96% de identidade de sequência para a sequência D1/D2 e 98% de identidade de sequência para um fragmento curto da sequência de ITS.
[00249] No entanto, como indicado acima, o dominio D1/D2 das cepas do tipo de Metschnikowia andauensis e Metschnikowia fructicola foram relatados como não homogêneos. Por exemplo, foi relatado que podem ser encontradas até 18 (3,6%) substituições dentro de clones de M. andauensis e até 25 (5%) substituições dentro de clones de M. fructicola (Sipiczki et al., 2013, PLoS One, 8:e67384). Assim, com o objetivo de investigar se o dominio D1/D2 da H0 Metschnikowia sp. é
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160/227 homogêneo, DNA foi extraído de 6 colônias retiradas do estoque permanente de HO Metschnikowia sp., amplificado por PCR com os primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ; SEQ ID NO: 34) e NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'; SEQ ID NO: 27), os quais são flanqueados por uma sequência com 20 nt idêntica ao plasmideo pUC19 para clonagem em conjunto. Os produtos da PCR foram purificados em gel e clonados nos sítios Saci e HindIII de pUC19. Os plasmídeos clonados foram sequenciados a partir de ambas as extremidades, e as sequências foram analisadas com Generous 7,1,9.
[00250] No total de 32 sequências clonadas e analisadas do domínio D1/D2, há 23 tipos (Tabela 3) com variações de até 23 bases (4,6%) ultrapassando a diferença entre H0 Metschnikowia sp. e as cepas do tipo do ciado M. pulcherrima.
Tabela 3
Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. EL-l
1 H01- 1, H02-2 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAGCCCCTCTAACGCCTCTACCCCAAATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA 3
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. ffl-7
TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTCACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 3)
2 H01- 2, H01- 3, H03-2 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAAAGCCTTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCTATTTC CATGTTGCCCCGAGGCCTGCATTCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 4) 20
3 H02-1 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAGCCCCTCTAAAGCCTCTACCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT 11
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-1
GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATACCCCTGGTCTCTATTTC CATGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 5)
4 H02-3 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAGCCCCTCTAACGCCTCTACCCCAAATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCTATTTC CATGTTGCCCCGAGGCCTGCATTCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 6) 11
5 H03-1 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAGCCCCTCTAACGCCTCTACCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC 12
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-7
GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCTATTTC CATGTTGCCCCGAGGCCTGCATTCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 7)
6 Hl-1, Hl-3 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTTAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTCTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTTGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 8) 13
7 Hl-2 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCCTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA 20
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164/227
Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-7
GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATACCCCTGGTCTCTATTTC CATGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 9)
8 Hl-4 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTAAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTTAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATCGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGGAGCAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGCCCTTACTCC CATACTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 10) 23
9 Hl-5, H2-5, H2-7 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA 18
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 168/248
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-1
GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTTAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGGAGCAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGCCCTTACTCC CACACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 11)
10 Hl-6 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTTAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTCTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTCACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 12) 9
11 Hl-7 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG 0
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. ffl-7
CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAGCCCCTCTAAAGCCTCTACCCCAAATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTCTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTCACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 13)
12 Hl-8 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTAAACCCCTTCAAAGCCTTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTACTCC CTCACCATCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC 15
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 170/248
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-l
GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 14)
13 H2-1 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAAAGCCTTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTACTCC CACACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 15) 14
14 H2-2 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTTCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAACGCCTTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA 14
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-l
TGTACCTCTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTTGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 16)
15 H2-3 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTACTCC CTCACCATCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 17) 16
16 H2-4 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTAAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTTAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT 20
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotídicas vs. HL-l
GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGGAGCAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGCCCTTACTCC CACAcCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 18)
17 H2-6, H3-7 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATT TGAAGAGATT TGGGTCCGGCCGGCGGGGGT TAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCCTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTCACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 19) 12
18 H2-8 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCCTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC 18
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-1
GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGGAGCAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTTTTTC CTTGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 20)
19 H3-1, H3-4, H3-6 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTTCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTTTTTC CTTGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 21) 20
20 H3-2 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAACGCCTTCATCCCAGATCTCCAA 8
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-l
GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTCTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTCACCACCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 22)
21 H3-3 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAAAGCCTTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACTGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTACTCC CTCACCATCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 23) 15
22 H3-5 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAA 12
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Tipo Clone Sequência N° de substituições nucleotidicas vs. HL-1
GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAAAGCTTTTACCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCTCAATTTC CTTGTTGCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 24)
23 H3-8 AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAG CGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCCCCCGGGAATTGT AATTTGAAGAGATTTGGGTTCGGCCGGCAGGGGTTAA GTCCACTGGAAAGTGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCC CGTGAACCCCTTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAA GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTG GTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACCGGCGAGAGACC GATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGC ACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTT GAAAGGGAAGGGCT TGCAAGCAGACACT TAACTGGGC CAGCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAA TGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGGTCCTTACTCC CTCACCATCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGC GTAATGGTTGCAAGTCGC (SEQ ID NO: 25) 17
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173/227 [00251] As variações nas regiões D1/D2 ficaram limitadas a duas áreas maiores que estão localizadas entre os nucleotídeos 154177 e 435-452 de SEQ ID NO: 1 (Figura 1) . Fora dessas duas regiões variáveis maiores, houve apenas 9 posições onde uma diferença de nucleotídeo foi observada em pelo menos dois clones. Em um único clone, o número de nucleotídeos variáveis fora das duas regiões altamente variáveis foi 0 (tipo 13, 15 e 22) ou 1 (tipo 1, 6, 11, 12, 17, 19, 20, 21 e 23) ou 2 (tipo 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 14 e 18) ou 3 (tipo 8) ou 4 (tipo 16).
[00252] Adicionalmente, foi identificada a sequência consenso seguinte do domínio D1/D2:
AAACCAACAGGGATTGCCTCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCC CCCGGGAATTGTAATTTGAAGAGATTTGGGTCCGGCCGGCAGGGGTTAAGTCCACTGGAAAG TGGCGCCACAGAGGGTGACAGCCCCGTGAACCCCTTCAACGCCCTCATCCCAGATCTCCAAG AGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATACC GGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGA GTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCTTGCAAGCAGACACTTAACTGGGCCA GCATCGGGGCGGCGGGAAACAAAACCACCGGGGAATGTACCTTTCGAGGATTATAACCCCGG TCTCTATTTCCTYACYRCCCCGAGGCCTGCAATCTAAGGATGCTGGCGTAATGGTTGCAAGT CGC (SEQ ID NO: 2) [00253] Todas as sequências identificadas do domínio D1/D2 para a H0 Metschnikowia sp. tinham pelo menos 97,1% de identidade de sequência com a sequência consenso de D1/D2.
[00254] Com base nesses resultados, ficou claro que a H0 Metschnikowia sp. é membro do gênero Metschnikowia e que está estreitamente relacionada ao ciado Metschnikowia pulcherrima, mas ficou evidente que era necessária caracterização adicional além da sequência do domínio D1/D2 para diferenciar a H0
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Metschnikowia sp. dos outros membros do ciado Metschnikowia pulcherrima.
Análise da sequência do gene de RNA polimerase II (RPB2) [00255] As sequências de ACT1, Ia e 2a posição de codons de EF2 e RPB2 foram utilizadas para análise filogenética de todas as espécies conhecidas na família Metschnikowiaceae (Guzmán et al., 2013, Mol. Phylogenet. Evol., 68(2):161-175). Assim, a sequência de RPB2 da HO Metschnikowia sp. foi analisada.
[00256] Sequências parciais do gene RPB2 foram extraídas do GeneBank para seis espécies do ciado Metschnikowia pulcherrima e para uma espécie fora do grupo, Metschnikowia kunwiensis, a qual é próxima, mas separada da Metschnikowia pulcherrima (Tabela 4).
Tabela 4
Táxon Designação da cepa Número de Acesso de RPB2
M. andauensis CBS 10809 KC859678
M. chrysoperlae CBS 9803 KG8 5 9 68 6
M. fructicola CBS 8853 KC859693
M. pulcherrima CBS 5833 KC859707
M. shanxiensis CBS 10359 KC859710
M. sinensis CBS 10357 KC859713
M. zizyphicola CBS 10358 KC859716
M. kunwiensis CBS 9067 KC859701
[00257] A sequência do gene RPB2 da H0 Metschnikowia sp. foi extraída de contigs do genoma inteiro de H0 Metschnikowia sp., utilizando a estratégia de Shotgun, e é representada por:
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ATGTCGCAGGAGCCGGTAGAAGACCCTTACGTCTACGACGAGGAGGACGCGCACAGCATCAC
GCCCGAGGACTGCTGGACGGTGATTCTGTCGTTTTTCCAGGAAAAAGGCCTTGTCTCACAGC
AGTTGGACTCGTTCGACGAGTTCATCGAGTCAAACATCCAGGAGTTGGTGTGGGAGGACTCG
CACTTGATTCTCGACCAGCCGGCGCAACATACTTCCGAGGACCAGTATGAAAATAAGCGGTT
TGAAATCACGTTTGGCAAGATCTATATTTCGAAGCCAACGCAGACCGAGGGCGACGGAACAA
CGCACCCGATGTTCCCACAGGAGGCACGCTTGCGTAACTTGACCTACAGCTCGCCGCTTTAC
GTGGACATGCTGAAAAAGAAGTTTCTTTCCGATGACAGAGTGAGAAAGGGTAACGAGCTAGA
ATGGGTGGAGGAGAAAGTCGATGGCGAGGAGGCCCAGCTGAAGGTGTTCTTGGGTAAGGTGC
CAATCATGCTAAGGTCGAAGTTTTGCATGTTGCGGGACTTGGGCGAGCACGAGTTCTACGAG
TTGAAAGAGTGCCCTTACGATATGGGTGGCTATTTCGTCATCAACGGTTCCGAAAAAGTCTT
GATCGCCCAGGAGCGCTCGGCGGCTAACATTGTCCAGGTGTTTAAGAAGGCAGCGCCCTCGC
CCATCTCGCACGTGGCGGAGATCCGTTCCGCGCTTGAAAAGGGTTCCCGTTTGATCTCCTCG
ATGCAGATCAAACTATATGGTCGTGACGACAAGGGCACCACTGGCAGAACAATCAAGGCCAC
ATTGCCCTACATCAAGGAAGACATCCCGATTGTGATTGTATTCAGAGCCCTCGGCGTGGTCC
CCGATGGAGACATTTTGGAACACATTTGTTACGATGCAAACGATTGGCAAATGTTAGAGATG
TTGAAGCCATGTGTGGAGGAAGGTTTCGTGATCCAGGAGCGCGAAGTCGCACTTGACTTTAT
CGGTAGAAGAGGTGTCTTGGGTATCAGAAGGGAAAAGCGTATCCAGTACGCAAAGGATATTT
TACAGAAAGAGTTGTTGCCTAACATCACACAGGAGGCCGGTTTCGAGTCAAGAAAGGCATTC
TTCTTGGGTTACATGGTCAACCGTTTGTTGTTATGTGCATTAGAAAGAAAGGAGCCTGACGA
CAGAGATCATTTTGGCAAGAAGAGATTGGATTTGGCCGGACCCTTGTTGGCATCCTTGTTCC
GTCTCTTATTCAAAAAGCTTACCAGGGATATCTATAACTACATGCAGCGGTGCGTGGAGAAT
GACAAGGAGTTTAATCTCACGTTGGCGGTCAAGTCACAGACCATCACTGATGGTTTGCGGTA
CTCGTTGGCCACAGGTAATTGGGGTGAACAAAGAAAGGCCATGAGTGCACGTGCCGGTGTGT
CGCAGGTGTTGAACAGATACACATACTCATCGACATTGTCGCATTTGAGAAGAACAAATACT
CCAATTGGCCGTGACGGTAAGATCGCCAAACCTAGACAGTTGCACAACACCCACTGGGGTCT
TGTATGTCCTGCAGAAACTCCTGAGGGTCAGGCGTGTGGTTTGGTGAAGAATTTGTCTTTGA
TGACGTGTATATCCGTTGGTACCTCTTCCGAGCCGATCTTGTATTTCTTGGAAGAGTGGGGT
ATGGAACCCTTGGAGGACTATGTTCCTTCGAACGCACCAGACTGCACAAGAGTCTTTGTCAA
CGGTGTATGGGTTGGCACACACAGAGAACCGGCACAGCTTGTCGATACCATGAGGAGGTTGA
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GAAGGAAGGGCGATATCTCTCCCGAGGTGTCGATCATCAGGGACATCAGAGAAATGGAGTTC AAGATCTTCACCGATGCAGGCCGTGTCTACCGTCCGTTGTTCATCGTGGACGACGACCCAGA GTCCGAAACCAAGGGTGAGTTGATGTTGCAAAAAGAGCACGTGCACAAGTTGTTGAACTCGG CCTACGATGAATATGACGAGGATGACTCCAATGCGTACACATGGTCGTCGTTGGTGAATGAT GGTGTGGTAGAGTACGTTGACGCCGAGGAGGAGGAGACAATCATGATCGCCATGACCCCAGA GGATTTGGAGGCTTCCAAGAGTGCGTTGTCGGAGACTCAGCAACAGGATCTTCAAATGGAGG AACAAGAGCTTGATCCTGCAAAGCGAATCAAACCAACTTATACCTCATCCACACACACCTTC ACGCATTGTGAGATTCATCCTTCGATGATTTTGGGTGTCGCCGCCTCTATCATTCCGTTCCC CGACCATAACCAGTCGCCGCGTAACACATACCAGTCTGCTATGGGTAAACAAGCCATGGGTG TATTTTTGACTAACTATGCCGTTAGAATGGACACAATGGCAAATATCTTATACTACCCACAG AAACCCTTGGCCACAACAAGAGCCATGGAGCACTTGAAGTTCCGTGAGTTGCCTGCTGGTCA GAATGCAGTGGTGGCCATTGCTTGTTACTCCGGCTACAACCAAGAAGATTCCATGATCATGA ACCAGTCGTCGATTGATAGAGGATTGTTCCGGTCTTTGTTTTTCAGATCTTACATGGATCTA GAGAAGAGACAAGGTATGAAAGCCTTGGAGACGTTTGAAAAGCCATCCAGATCTGACACCTT GAGATTGAAGCATGGAACCTACGAAAAGTTAGATGACGATGGTTTGATCGCGCCTGGTGTCA GGGTCAGTGGTGAGGATATCATCATCGGTAAAACCACACCTATTCCACCTGACACCGAGGAG TTGGGTCAGAGAACCCAGTATCATACCAAGAGAGATGCCTCGACGCCATTGAGAAGCACGGA GTCTGGTATTGTTGACCAGGTTCTTTTGACCACAAATGGTGACGGCGCCAAGTTCGTCAAGG T C AG AAT G AG AAC GAG G AAGG T T C C AC AAAT C GG T G AC AAG T T T GC C T C C AG AC AC GG AC AA AAGGGTACAATCGGTGTCACATATAGACACGAGGATATGCCTTTCAGTGCACAGGGTATTGT GCCTGACTTGATCATAAACCCGCATGCTATTCCATCTCGTATGACAGTCGCTCACTTGATCG AGTGTTTGTTGTCGAAAGTCTCTTCCTTGTCCGGATTGGAAGGTGACGCCTCGCCATTCACG GACGTCACAGCCGAGGCTGTTTCCAAATTGTTGAGAGAGCACGGATACCAATCTAGAGGTTT CGAGGTGATGTACAATGGTCACACCGGTAAGAAGATGATGGCGCAAGTGTTCTTTGGCCCAA CGTACTACCAGAGATTGAGGCATATGGTGGATGACAAGATCCACGCTAGAGCCAGAGGTCCA GTTCAAGTTTTGACCAGGCAGCCTGTGGAAGGTAGATCCAGGGATGGTGGATTACGTTTCGG AGAGATGGAGAGAGATTGTATGATTGCGCACGGAGCTGCTGGATTCTTAAAGGAAAGATTGA TGGAGGCTTCGGATGCTTTCAGAGTTCACGTTTGTGGAATCTGTGGTTTGATGTCGGTGATT GCAAACTTGAAGAAGAACCAGTTCGAGTGTCGGTCGTGCAAAAACAAGACCAACATTTACCA
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GATCCACATTCCATACGCAGCCAAATTGTTGTTCCAGGAGTTGATGGCCATGAACATTTCTC CTAGATTGTACACGGAGAGATCAGGAATCAGTGTGCGTGTCTGA (SEQ ID NO: 70) [00258] As sequências foram editadas no Genieous 7,1,9 e alinhadas utilizando ClustalW. A árvore do vizinho mais proximo foi construída com o construtor de árvores Genieous 7,1,9.
[00259] A distância filogenética entre membros do ciado Metschnikowia pulcherrima era menor do que a distância entre as espécies de Metschnikowia pulcherrima e a fora do grupo, Metschnikowia kunwiensis (Figura 2) . A H0 Metschnikowia sp. foi agrupada com Metschnikowia zizyphicola como um subgrupo (Figura 2) . Os outros subgrupos são: (a) Metschnikowia
pulcherrima e Metschnikowia fructicola; (b) M. andauensis, M.
sinensis e M. shaxiensis; e (c) M. chrysoperlae (Figura 2).
[00260] A análise filogenética acima mostra que a H0
Metschnikowia sp. é uma espécie nova que é reunida com
Metschnikowia zizyphicola em um subgrupo, em comparação a
outros membros do ciado Metschnikowia pulcherrima.
Características morfológicas e fisiológicas [00261] A H0 Metschnikowia sp. compartilha certas características morfológicas e fisiológicas com outras espécies de Metschnikowia, porém possui características distintas também. Por exemplo, como com outras espécies do ciado Metschnikowia pulcherrima, as células de H0 Metschnikowia sp. são globosas a ovais. O brotamento é multilateral, células de pulcherrima esféricas abundantes semelhantes a clamidósporos estão presentes quando células da levedura H0 Metschnikowia sp. são cultivadas em caldo YPD por 7 dias a 30 °C. A H0 Metschnikowia sp. pode crescer lentamente
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178/227 a 4 °C, cresce bem entre 20 °C e 33 °C e não cresce a 37 °C em ágar YPD. A HO Metschnikowia sp. secreta pigmento de cor rosa no meio. A HO Metschnikowia sp. consegue assimilar D-glicose, D-galactose, D-xilose, sacarose, glicerol, etanol, succinato e celobiose e fermenta fracamente a glicose.
[00262] A HO Metschnikowia sp. distingue-se de outras espécies do ciado Metschnikowia pulcherrima por seu crescimento em meio YP mais 2% de xilose por um período prolongado de tempo. Nos estágios tardios de crescimento aeróbico em meio YP mais 2% de xilose por 41 horas com ODsoo inicial em 0,03, a densidade óptica em ODsoo de culturas de H0 Metschnikowia sp. e de Metschnikowia zizyphicola foi próxima e muito maior do que aquela de outras cepas (Figura 3) . A relação estreita de H0 Metschnikowia sp. com Metschnikowia zizyphicola, revelada pelo perfil de crescimento em xilose, é compatível com o resultado para análises da sequência de RPB2 discutidas acima.
[00263] Com base em todos os experimentos acima, está claro que a H0 Metschnikowia sp. é uma nova espécie do ciado
Metschnikowia pulcherrima e que esta pode ser separada de
outros membros pela sequência de RPB2 e por seu perfil de
crescimento em xilose •
Exemplo II
Produção de Xilitol a partir de xilose de H0
Metschnikowia sp.
[00264] Esse exemplo demonstra que a H0 Metschnikowia sp. produz xilitol a partir de xilose quando cultivada em meio YEP contendo xilose.
[00265] A produção de xilitol a partir de xilose foi analisada para a H0 Metschnikowia sp. em meio Yeast Extract Peptone
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179/227 (YEP) suplementado com xilose 4% m/v ou 10% m/v. Como controle, a levedura M2 do vinho de S. cerevisiae foi analisada também.
[00266] Células de HO Metschnikowia sp. foram inoculadas em 50 mL de meio YEP + xilose 4% m/v ou 10% m/v em um frasco de 125 mL e cultivadas em uma incubadora a 30 °C com agitação a 120 rpm. Uma amostra de 1 mL foi retirada da cultura e as células foram removidas por centrifugação. O sobrenadante foi passado através de um filtro de seringa de nylon de 0,22 pm para um frasco de amostra para HPLC. O teor de xilitol no sobrenadante foi analisado por HPLC em uma coluna Rezex RPM-monossacarideo Pb+2 (Phenomenex) a 80 °C utilizando água como fase móvel a uma vazão de 0,6 mL/min. Os picos foram detectados com detector do indice de refração Agilent G1362A (Agilent).
[00267] A HO Metschnikowia sp. produziu xilitol por uma via dependente de xilose. Por exemplo, no meio com 4% de xilose, a HO Metschnikowia sp. produziu aproximadamente 13,8 g/L de xilitol a partir de 40 g/L de xilose em 5 dias, enquanto que em 10% de xilose, ela produziu aproximadamente 23 g/L de xilitol a partir de 100 g/L de xilose em 10 dias (Figura 4) . Quando a xilose esgotou, a HO Metschnikowia sp. começou a consumir o xilitol no meio (Figura 4). Nos dois meios, a espécie M2 de S. cerevisiae não produziu xilitol (Figura 4).
Exemplo III
Produção de vários compostos pela HO Metschnikowia sp.
[00268] Esse exemplo demonstra que a H0 Metschnikowia sp. produz diversos compostos diferentes, além de xilitol, quando cultivada em meio YEP contendo xilose.
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[00269] A HO Metschnikowia sp. for cultivada em meio YEP
contendo 4% de xilose a 30 °C. Amostras foram retiradas no 3° e
no 6° dia após a inoculação, e foram analisadas por
cromatografia gasosa espectrometria de massa (GCMS) para
compostos voláteis, bem como para xilitol.
[00270] Esse ensaio mostrou que xilitol, isopropanol, etanol, isobutanol, n-butanol e álcool 2-fenetilico foram produzidos pela HO Metschnikowia sp. A Tabela 5 apresenta a concentração média desses produtos, medida nos Dias 3 e 6. A taxa de produção, determinada para cada um desses compostos, foi aproximadamente 0,11 g/L/h de xilitol, aproximadamente 6,8E-05 g/L/h de n-butanol, aproximadamente 2,5E-04 g/L/h de isobutanol, aproximadamente 2,4E-04 g/L/h de isopropanol, aproximadamente 2,64E-04 g/L/h de etanol e aproximadamente 3,73E-06 g/L/h de álcool 2-fenetilico numa razão relativa de 99,26% de xilitol, 0,061% de n-butanol, 0,223% de isobutanol, 0,217% de isopropanol, 0,236% de etanol e 0,003% de álcool 2fenetilico, quando cultivada em condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) compreendendo 4% de xilose.
Tabela 5
Concentração Dia 3 [pg/ml] Desvio padrão Concentração Dia 6 [pg/ml] Desvio padrão
Xilitol 8000 0,01 NT NT
Isopropanol 17,58 1,32 19, 93 1, 94
Etanol 19, 74 0, 64 94,49 1,27
Isobutanol 18, 1 ο,ι 20,85 0,21
n-Butanol 4, 9 0,3 0,84 0,03
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Concentração Dia 3 [pg/ml] Desvio padrão Concentração Dia 6 [pg/ml] Desvio padrão
álcool 2fenetilico 0,27 0,26 4.11 0,55
NT = não testado.
Exemplo IV
Crescimento e produção de metabólitos específicos para a HO Metschnikowia sp.
[00271] Esse exemplo demonstra que a HO Metschnikowia sp. cresce de modo diferencial e que produz diferentes metabólitos quando comparada a uma espécie próxima relacionada (Metschnikowia pulcherrima flavia).
[00272] Três colônias únicas de HO Metschnikowia sp. e Metschnikowia pulcherrima flavia (FL) foram inoculadas em 5 mL do meio Yeast Extract Peptone dextrose (YEPD) , respectivamente, e cultivadas a 30 °C durante a noite. As culturas foram mudadas para 100 mL de YEPD e cultivadas a 30 °C por 4 horas. As células foram coletadas e inoculadas em 200 mL de meio em um frasco de 500 mL com OD6oo=l,0. Quatro tipos diferentes de meio foram utilizados: 1) YNBG: Yeast Nitrogen Base com 4% de glicose, 2) YNBX: Yeast Nitrogen Base com 4% de xilose, 3) YNBGX: Yeast Nitrogen Base com 2% de glicose e 2% de xilose e 4) YPDX: YEP com 2% dextrose e 2% de xilose. As culturas foram cultivadas a 30 °C com agitação a 180 rpm. Amostras foram retiradas diariamente para monitorar o crescimento, o qual foi medido por ODsoo, e o teor de metabólitos, que foi medido por cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC). Os compostos voláteis produzidos por H0 Metschnikowia sp. e FL foram medidos por GC-MS do headspace.
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Os dados de ODgoo e HPLC representam as médias de três réplicas biológicas. Os desvios padrão foram calculados também. Os dados de GC-MS foram comparados aproximadamente pela altura do pico.
[00273] Foram observadas diferenças na taxa de crescimento entre as cepas de HO Metschnikowia sp. e FL em todos os meios testados. Especificamente, HO cresce mais rápido do que FL (FIGS. 5A-5D) . Por exemplo, no Dia 3, a razão de ODsoo com HO Metschnikowia sp. versus FL foi 1,17 em YNBG (Figura 5A), 1,30 em YNBX (Figura 5B) , 1,2 6 em YNBGX (Figura 5C) e 1,19 em YPDX (Figura 5D).
[00274] Glicerol e etanol foram detectados no Dia 1 nos meios YNBG, YNBGX e YPDX. As concentrações foram semelhantes entre as duas cepas nos meios YNBG e YNBGX (Figuras 6A e 6B) . No entanto, no meio YPDX, H0 Metschnikowia sp. produziu 45% mais glicerol do que FL (905 mg/L versus 624 mg/L; Figura 6A).
[00275] H0 Metschnikowia sp. e FL produziram arabitol em todos os meios de crescimento (Figuras 7A-7D). Contudo, no meio YNBG, H0 Metschnikowia sp. produziu 60 mg/L mais arabitol do que FL no Dia 1 (Figura 7A). De forma ainda mais acentuada, no meio YNBGX, H0 Metschnikowia sp. produziu uma quantidade significativamente maior de arabitol no Dia 1, Dia 2 e Dia 3 com H0 Metschnikowia sp. produzindo cerca de 40 mg/L mais arabitol do que FL (Figura 7C) . Nos meios YNBX e YPDX, os níveis de arabitol foram semelhantes entre as duas espécies (Figura 7B e 7D).
[00276] A H0 Metschnikowia sp. produziu a quantidade máxima de xilitol no Dia 3 no meio YNBX (1,61 g/L), Dia 2 no YNBGX (1,43 g/L) e Dia 4 no YPDX (21,5 g/L), enquanto FL produziu uma
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183/227 quantidade máxima de xilitol no Dia 6 em YNBX (2,33 g/L) , Dia 2 em YNBGX (0,73 g/L) e Dia 4 em YPDX (21,9 g/L) (Figuras 8A8C) . A razão do teor de xilitol no Dia 3 entre HO Metschnikowia sp. e FL foi 4,39 em YNBX, 5,43 em YNBGX e 0,87 em YPDX.
[00277] Os compostos voláteis nos meios após o crescimento por 1 dia em YNBG e 3 dias em YNBX, YNBGX e YPDX, respectivamente, foram medidos por GC-MS do headspace. A razão da altura do pico foi calculada e comparada entre FL e a HO Metschnikowia sp. Essa análise mostrou que a cepa FL produziu mais compostos voláteis do que HO (Figuras 9A-9D). Especificamente, FL produziu mais acetaldeido, acetato de etila, acetal, 1-(1Etoxietoxi) pentano e álcool fenetilico em meio YNBG (Figura 9A) ; mais acetato de isoamila, 2-metil-l-butanol e 3-metil-lbutanol em meio YNBX (Figura 9B); mais acetato de etila, propanoato de etila, acetato de isoamila, 2-metil-l-butanol, 3-metil-l-butanol e álcool fenetilico em meio YNBGX (Figura 9C) e mais acetaldeido, isobutanol, acetato de isoamila, 3metil-l-butanol, nonanoato de etila e álcool fenetilico em meio YPDX (Figura 9D).
[00278] Com base nos resultados acima, o perfil de crescimento e dos metabólitos secretados entre as espécies H0 Metschnikowia sp. e FL mostram diferenças na taxa de crescimento e no teor, bem como na dinâmica de alguns metabólitos durante o crescimento em meio diferente.
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Exemplo V
Identificação de genes e proteínas específicas de HO Metschnikowia sp.
[00279] Esse exemplo demonstra que foram identificados inúmeros genes e proteínas são únicos à HO Metschnikowia sp.
[00280] As pesquisas de homologia foram conduzidas utilizando os seguintes parâmetros: Os genes ACT1, ARO8, AROIO, GPD1, PGK1, RPB1, RPB2, TEF1, TPI1 XKS1, TALI e TKL1 foram identificados por pesquisas de homologia utilizando sequências de proteínas correspondentes de Saccharomyces cerevisiae com o programa tblastn no Generous 7,1,9 no genoma inteiro de H0 Metschnikowia sp., constituído por contigs de Shotgun. Os genes XYL1, XYL2, HXT2.6, QUP2, GXF1 e GXF2 foram identificados por pesquisas de homologia das proteínas Xyll, Xyl2, Hxt2.6, Qup2 e Sutl de Pichia stiptis no genoma inteiro de H0 Metschnikowia sp., constituído por contigs de Shotgun. Os genes GXS1 e XYT1 foram identificados por pesquisas de homologia das proteínas Gxsl e Gxfl de Candida intermedia no genoma inteiro de H0 Metschnikowia sp., constituído por contigs de Shotgun. O gene HXT5 foi identificado por pesquisa de homologia da proteína Hxt5 de Candida albicans no genoma inteiro de H0 Metschnikowia sp., constituído por contigs de Shotgun. O gene HGT19 foi identificado pesquisando o transcriptoma de H0 Metschnikowia sp. para proteínas induzidas por xilose com a categoria do termo de ontologia genética de
facilitadores principais.
[00281] Tendo por base os experimentos acima, foram
identificadas diversas sequênci as únicas de aminoácidos,
correspondentes a proteínas Adicionalmente, foram
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185/227 identificadas diversas sequências únicas de ácidos nucleicos codificantes, correspondentes a genes conhecidos. A Tabela 6 fornece uma lista de proteínas exemplares e sequências de ácidos nucleicos codificantes da HO Metschnikowia sp., entre
as quais todas as sequências de ácidos nucleicos codificantes
são únicas e únicas. Tabela 6 diversas das proteínas correspondentes são
Descrição Sequência
Sequência de MCKAGFAGDDAPRAVFPSIVGRPRHQGIMVGMGQKDSYVGDEAQSK
aminoácidos da RGILTLRYPIEHGIVNNWDDMEKIWHHTFYNELRVAPEEHPVLLTE
proteína Actl APMNPKSNREKMTQIMFETFNVPAFYVSIQAVLSLYSSGRTTGIVL
de HO DSGDGVTHLVPIYAGFSMPHGILRLNLAGRDLTDYLMKILSERGYT
Metschnikowia FSTTAEREIVRDIKEKLCYVALDFEQEMQTSSQSSAIEKSYELPDG
sp. QVITIGNERFRAAEALFRPTDLGLEAVGIDQTTYNSIIKCDVDVRK ELYGNIVMSGGTTLFPGIAERMQKEITALAPSSMKVKIIAPPERKY SVWIGGSILASLSTFQQMWISKQEYDESGPTIVHHKCF (SEQ ID NO: 35)
Sequência de MTKPLAKDLQHHLSTEAKSRKGSALKGAFKYYNQPGMTFLGGGLPL
aminoácidos da SDYFPFDKITADVPSAPFPNGCGARVTESDKTVIEVHKRKQDNSDS
proteína Aro8 GYADVELARSLQYGYTEGHTELVQFLRDHTDTIHRVPYEDWDVITN
de HO VGNTQAWDAVLRTFTSRGDVILVEDHTFSSAMETAHAHGVTTYPVV
Metschnikowia MDTEGIVPSALEKLLDNWVGAKPRMLYTICTGQNPTGSCLSGERRR
sp. EVYSLAQKHDLIIIEDEPYYFLQMEPYTRDLALRSSKHVHGHEEFI KALVPSFISMDVDGRVLRLDSVSKTIAPGARLGWVVGQKRLLERFL RLHETSIQNASGFTQSLLNGLFQRWGQKGYLDWLIGIRAEYTHKRD VAIDALYKYFPQEVVTILPPVAGMFFVVNLDASKHPKFEELGSDPL AVENSLYEAGLAHGCLMIPGSWFKADGETTPPQAPVPVDESLKNSI FFRGTYAAVPLDELEVGLKKFGEAVKAEFGL (SEQ ID NO: 36)
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Descrição Sequência
Sequência de MAPIITRASSEETTPQITDDQIPLGEYLFLRICQANPKLRSVFGIP
aminoácidos da GDFSLALLEHLYTKSVAKKVEFVGFCNELNAAYAADGYAKHIDGLS
proteína ArolO VLLTTFGVGELSTLNAIAGAFTEYAPVLHIVGTTSTKQAEQSRAAG
de HO TRDVRNIHHLVQNKNPLCAPNHDVYKPMVESLSVCQESLDMNGDLN
Metschnikowia LEKIDNVLRMVTNERRPGYIFIPSDVSDIMVSAGRLNQPLTFSELT
sp. DESALKNMASRILAKLYNSKHPSVLGDALADRFGGQTALDNLVEKL PSNFVKLFSTLLARNIDETLPNYIGVYSGKLSSDKIVIDELERNTD FLLTLGHANNEINSGVYSTDFSAITEYVEVHPDYILIDGEYVLIKN AETGKRLFSIVDLLTKLVSDFDASKMIHNNHAVNNIRARRETKQFS SLDTVSPGVITQNKLVDFFNDYLRPNDILLCDTCSFLFGVFELKFP RGVKFIAQTLYE SIGYAL PAT FGAARAERDLGTNRRVVLIQGDGSA QMTIQEWSTYLRYDISSPEIFLLNNEGYTVERMIKGPTRSYNDIQD TWKWTEFFKIFGDEDCEKHEAEKVNTTNELEALTRRKTSEKIRLYE LKLSKLDIVDKFRILRE (SEQ ID NO: 37)
Sequência de MTATAPFKIE S PFRIAIIGSGNWGTAVAKLVAENTAEKPEIFQKQV
aminoácidos da NMWVFEEDINGRKLTEIINTDHENVKYMPEVKLPENLVANPDIEAT
proteína Gpdl VKDADLLIFNIPHQFLPRVCKQLVGKVSPTARAISCLKGLEVDASG
de HO CKLLSQSITDTLGIYCGVLSGANIANEVARGRWSETSIAYNRPTDF
Metschnikowia RGEGKDICEFVLKEAFHRRYFHVRVIKDVIGASIAGALKNVVAIAA
sp. GFVEGEGWGDNAKSAIMRIGLKETIHFASYWEKFGIQGLSAPEPTT FTEESAGVADLITTCSGGRNVKVARYMIEKNVDAWEAEKALLNGQS SQGIITAKEVHELLVNYKLQEEFPLFEATYAVIYENADVNTWPTIL AE (SEQ ID NO: 38)
Sequência de MSQDELHTKSGVETPINDSLLEEKHDVTPLAALPEKSFKDYISISI
aminoácidos da FCLFVAFGGFVFGFDTGTISGFVNMSDFKTRFGEMNAQGEYYLSNV
proteína Gxfl RTGLMVSIFNVGCAVGGIFLCKIADVYGRRIGLMFSMVVYVVGIII
de HO QIASTTKWYQYFIGRLIAGLAVGTVSVISPLFISEVAPKQLRGTLV
Metschnikowia CCFQLCITLGIFLGYCTTYGTKTYTDSRQWRIPLGICFAWALFLVA
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Descrição Sequência
sp . GMLNMPESPRYLVEKSRIDDARKSIARSNKVSEEDPAVYTEVQLIQ AGIDREALAGSATWMELVTGKPKIFRRVIMGVMLQSLQQLTGDNYF FYYGTTIFKAVGLQDSFQTSIILGIVNFASTFVGIYAIERMGRRLC LLTGSACMFVCFIIYSLIGTQHLYKNGFSNEPSNTYKPSGNAMIFI TCLYIFFFASTWAGGVYCIVSESYPLRIRSKAMSVATAANWMWGFL ISFFTPFITSAIHFYYGFVFTGCLAFSFFYVYFFVVETKGLSLEEV DILYASGTLPWKSSGWVPPTADEMAHNAFDNKPTDEQV (SEQ ID NO: 39)
Sequência de MSAEQEQQVSGTSATIDGSASLKQEKTAEEEDAFKPKPATAYFFIS
aminoácidos da FLCGLVAFGGYVFGFDTGTISGFVNMDDYLMRFGQQHADGTYYLSN
proteína Gxf2 VRTGLIVSIFNIGCAVGGLALSKVGDIWGRRIGIMVAMIIYMVGII
de HO IQIASQDKWYQYFIGRLITGLGVGTTSVLSPLFISESAPKHLRGTL
Metschnikowia VCCFQLMVTLGIFLGYCTTYGTKNYTDSRQWRIPLGLCFAWALLLI
sp. SGMVFMPESPRFLIERQRFDEAKASVAKSNQVSTEDPAVYTEVELI QAGIDREALAGSAGWKELITGKPKMLQRVILGMMLQSIQQLTGNNY FFYYGTTIFKAVGMSDSFQTSIVLGIVNFASTFVGIWAIERMGRRS CLLVGSACMSVCFLIYSILGSVNLYIDGYENTPSNTRKPTGNAMIF ITCLFIFFFASTWAGGVYSIVSETYPLRIRSKGMAVATAANWMWGF LISFFTPFITSAIHFYYGFVFTGCLIFSFFYVFFFVRETKGLSLEE VDELYATDLPPWKTAGWTPPSAEDMAHTTGFAEAAKPTNKHV (SEQ ID NO: 40)
Sequência de MGLESNKLIRKYINVGEKRAGSSGMGIFVGVFAALGGVLFGYDTGT
aminoácidos da ISGVMAMPWVKEHFPKDRVAFSASESSLIVSILSAGTFFGAILAPL
proteína Gxsl LTDTLGRRWCIIISSLVVFNLGAALQTAATDIPLLIVGRVIAGLGV
de HO GLISSTIPLYQSEALPKWIRGAVVSCYQWAITIGIFLAAVINQGTH
Metschnikowia KINSPASYRIPLGIQMAWGLILGVGMFFLPETPRFYISKGQNAKAA
sp. VSLARLRKLPQDHPELLEELEDIQAAYEFETVHGKSSWSQVFTNKN KQLKKLATGVCLQAFQQLTGVNFIFYFGTTFFNSVGLDGFTTSLAT
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Descrição Sequência
NIVNVGSTIPGILGVEIFGRRKVLLTGAAGMCLSQFIVAIVGVATD SKAANQVLIAFCCIFIAFFAATWGPTAWVVCGEIFPLRTRAKSIAM CAASNWLLNWAIAYATPYLVDSDKGNLGTNVFFIWGSCNFFCLVFA YFMIYETKGLSLEQVDELYEKVASARKSPGFVPSEHAFREHADVET AMPDNFNLKAEAISVEDASV (SEQ ID NO: 41)
Sequência de MSEKPVVSHSIDTTSSTSSKQVYDGNSLLKTSNERDGERGNILSQY
aminoácidos da TEEQAMQMGRNYALKHNLDATLFGKAAAVARNPYEFNSMSFLTEEE
proteína Hgtl9 KVALNTEQTKKWHIPRKLVEVIALGSMAAAVQGMDESVVNGATLFY
de HO PTAMGITDIKNADLIEGLINGAPYLCCAIMCWTSDYWNRKLGRKWT
Metschnikowia IFWTCAISAITCIWQGLVNLKWYHLFIARFCLGFGIGVKSATVPAY
sp. AAETTPAKIRGSLVMLWQFFTAVGIMLGYVASLAFYYIGDNGISGG LNWRLMLGSACLPAIVVLVQVPFVPESPRWLMGKERHAEAYDSLRQ LRFSEIEAARDCFYQYVLLKEEGSYGTQPFFSRIKEMFTVRRNRNG ALGAWIVMFMQQFCGINVIAYYSSSIFVESNLSEIKAMLASWGFGM INFLFAIPAFYTIDTFGRRNLLLTTFPLMAVFLLMAGFGFWIPFET NPHGRLAVITIGIYLFACVYSAGEGPVPFTYSAEAFPLYIRDLGMG FATATCWFFNFILAFSWPRMKNAFKPQGAFGWYAAWNIVGFFLVLW FLPETKGLTLEELDEVFDVPLRKHAHYRTKELVYNLRKYFLRQNPK PLPPLYAHQRMAVTNPEWLEKTEVTHEENI (SEQ ID NO: 42)
Sequência de MSSTTDTLEKRDTEPFTSDAPVTVHDYIAEERPWWKVPHLRVLTWS
aminoácidos da VFVITLTSTNNGYDGSMLNGLQSLDIWQEDLGHPAGQKLGALANGV
proteína LFGNLAAVPFASYFCDRFGRRPVICFGQILTIVGAVLQGLSNSYGF
Hxt2.6 de HO FLGSRIVLGFGAMIATIPSPTLISEIAYPTHRETSTFAYNVCWYLG
Metschnikowia AIIASWVTYGTRDLQSKACWSIPSYLQAALPFFQVCMIWFVPESPR
sp. FLVAKGKIDQARAVLSKYHTGDSTDPRDVALVDFELHEIESALEQE KLNTRSSYFDFFKKRNFRKRGFLCVMVGVAMQLSGNGLVSYYLSKV LDSIGITETKRQLEINGCLMIYNFVICVSLMSVCRMFKRRVLFLTC FSGMTVCYTIWTILSALNEQRHFEDKGLANGVLAMIFFYYFFYNVG
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Descrição Sequência
INGLPFLYITEILPYSHRAKGLNLFQFSQFLTQIYNGYVNPIAMDA ISWKYYIVYCCILFVELVIVFFTFPETSGYTLEEVAQVFGDEAPGL HNRQLDVAKESLEHVEHV (SEQ ID NO: 43)
Sequência de aminoácidos da proteína Hxt5 de HO Metschnikowia sp. MSIFEGKDGKGVSSTESLSNDVRYDNMEKVDQDVLRHNFNFDKEFE ELEIEAAQVNDKPSFVDRILSLEYKLHFENKNHMVWLLGAFAAAAG LLSGLDQS11SGASIGMNKALNLTEREASLVS SLMPLGAMAGSMIM T PLNEWFGRKS S L11S CIWYTIGSALCAGARDHHMMYAGRFILGVG VGIEGGCVGIYISESVPANVRGSIVSMYQFNIALGEVLGYAVAAIF YTVHGGWRFMVGSSLVFSTILFAGLFFLPESPRWLVHKGRNGMAYD VWKRLRDINDESAKLEFLEMRQAAYQERERRSQESLFSSWGELFTI ARNRRALTYSVIMITLGQLTGVNAVMYYMSTLMGAIGFNEKDSVFM S LVGGGS LLIGTIPAILWMDRFGRRVWGYNLVGFFVGLVLVGVGYR FNPVTQKAASEGVYLTGLIVYFLFFGSYSTLTWVIPSESFDLRTRS LGMTICSTFLYLWSFTVTYNFTKMSAAFTYTGLTLGFYGGIAFLGL IYQVCFMPETKDKTLEEIDDIFNRSAFSIARENISNLKKGIW (SEQ ID NO: 44)
Sequência de aminoácidos da proteína Pgkl de HO Metschnikowia sp. MSLSNKLSVKDLDLANKRVFIRVDFNVPLDGTTITNNQRIVAALPT IKYVLEQKPKAVILASHLGRPNGERVEKYSLAPVAKELQSLLSDQK VTFLNDSVGPEVEKAVNSASQGEVFLLENLRYHIEEEGSKKVDGNK VKASKEDVEKFRQGLTALADVYVNDAFGTAHRAHSSMVGLELPQKA AGFLMAKELEYFAKALENPTRPFLAILGGAKVSDKIQLIDNLLDKV DILIVGGGMAFTFKKVLDNMPIGTSLFDEAGSKNVENLIAKAKKNN VEIVLPVDFVTADDFNKDANTGVATQEEGIPDGWMGLDAGPKSREL FAEAVAKAKTIVWNGPPGVFEFEKFAQGTKSLLDAAVKSAEAGNTV IIGGGDTATVAKKFGVVEKLSHVSTGGGASLELLEGKELPGVVAIS DKQ (SEQ ID NO: 45)
Sequência de aminoácidos da MGFRNLKRRLSNVGDSMSVHSVKEEEDFSRVEIPDEIYNYKIVLVA LTAASAAIIIGYDAGFIGGTVSLTAFKSEFGLDKMSATAASAIEAN
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Descrição Sequência
proteína Qup2 VVSVFQAGAYFGCLFFYPIGEIWGRKIGLLLSGFLLTFGAAISLIS
de HO NSSRGLGAIYAGRVLTGLGIGGCSSLAPIYVSEIAPAAIRGKLVGC
Metschnikowia WEVSWQVGGIVGYWINYGVLQTLPIS SQQWIIPFAVQLIPSGLFWG
sp. LCLLIPESPRFLVSKGKIDKARKNLAYLRGLSEDHPYSVFELENIS KAIEENFEQTGRGFFDPLKALFFSKKMLYRLLLSTSMFMMQNGYGI NAVTYYSPTIFKSLGVQGSNAGLLSTGIFGLLKGAASVFWVFFLVD TFGRRFCLCYLSLPCSICMWYIGAYIKIANPSAKLAAGDTATTPAG TAAKAMLYIWTIFYGITWNGTTWVICAEIFPQSVRTAAQAVNAS SN WFWAFMIGHFTGQALENIGYGYYFLFAACSAIFPVVVWFVYPETKG VPLEAVEYLFEVRPWKAHSYALEKYQIEYNEGEFHQHKPEVLLQGS ENSDTSEKSLA (SEQ ID NO: 46)
Sequência de MDQTTKKPRDGGLNDPRLGSIDRNFKCQTCGEDMAECPGHFGHIEL
aminoácidos da AKPVFHIGFIAKIKKVCECVCMHCGKLLVDDANPLMAQAIRIRDPK
proteína Rpbl KRFNAVWNVSKTKMVCEADTINEEGQVTAGRGGCGHTQPTVRRDGL
de HO KLWGTWKQNKTYDENEQPERRLLSPSEILSVFRHISPEDCHKLGFN
Metschnikowia EDYARPEWMLITVLPVPPPPVRPSIAFNDTARGEDDLTFKLADILK
sp. ANINVQRLEIDGSPQHVISEFEALLQFHVATYMDNDIAGQPQALQK TGRPIKSIRARLKGKEGRLRGNLMGKRVDFSARTVISGDPNLDLDQ VGVPISIARTLTIPOVVTPYNIHKLTEYVRNGPNEHPGAKYVIRDT GDRIDLMYNKRAGDIALQYGWKVERHLMDDDPVLFNRQPSLHKMSM MAHRVKVMPYSTFRLNLSVTSPYNADFDGDEMNLHVPQSPETRAEM SQICAVPLQIVSPQSNKPVMGIVQDTLCGIRKMTLRDNFIEYEQVM NMLYWIPNWDGVIPPPAVLKPKPLWSGKQLLSMAIPKGIHLQRFDD GRDMLSPKDSGMLIVDGEIIFGVVDKKTVGATGGGLIHTVMREKGP YVCAQLFSSIQKVVNYWLLHNGFSIGIGDTIADKDTMRDVTTTIQE AKQKVQEIIIDAQQNKLE PE PGMTLRE S FEHNVSRILNQARDTAGR SAEMNLKDSNNVKQMVTSGSKGSFINISQMSACVGQQIVEGKRIPF GFGDRTLPHFTKDDYSPESKGFVENSYLRGLTPQEFFFHAMAGREG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 194/248
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Descrição Sequência
LIDTAVKTAETGYIQRRLVKALEDIMVHYDGTTRNSLGDIIQFVYG EDGIDATSVEKQSVDTIPGSDSSFEKRYRIDVLDPAKSIPESLLES GKQIKGDVAVQKVLDEEYDQLLKDRKFLREVVFPNGDYNWPLPVNL RRIIQNAQQIFHSGRQKASDLRLEEIVEGVQSLCTKLLVLRGKTEL IKEAQENATLLFQCLLRSRLAARRVIEEFKLNKVSFEWVCGEIESQ FQKSIVHPGEMVGVVAAQSIGEPATQMTLNTFHYAGVSSKNVTLGV PRLKEILNVAKNIKTPALTVYLEPEIAVDIEKAKVVQSAIEHTTLK NVTSSTEIYYDPDPRSTVIEEDYDTVEAYFAIPDEKVEETIDNQSP WLLRLELDRAKMLDKQLTMAQVAEKISQNFGEDLFVIWSDDTADKL IIRCRVIRDPKLEEEGEHEEDQILKRVEAHMLETISLRGIPGITRV FMMQHKMSTPDADGEFSQKQEWVLETDGVNLAEVITVPGVDASRTY SNNFIEILSVLGIEATRTALFKEILNVIAFDGSYVNYRHMALLVDV MTARGHLMAITRHGINRAETGALMRCSFEETVEILLDAGAAAELDD CRGISENVILGQMPPLGTGAFDVMVDEKMLQDASVSSDIGVAGQTD GGATPYRDYEMEDDKIQFEEGAGFSPIHTANVSDASGSLTSYGGQP SMVSPTSPFSFGATSPGYGGVTSPAYGATSPTYSPTSPTYSPTSPS YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPT SPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSY SPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSYSPTSPQYSPTSPSYSPTS PQYSPTSPSYSPTSPQYSPTSPSYSPTSPQYSPTSPQYSPGSPAYS PGSPSYSTEKKDEDKK (SEQ ID NO: 47)
Sequência de aminoácidos da proteína Rpb2 de HO Metschnikowia sp. MSQEPVEDPYVYDEEDAHSITPEDCWTVISSFFQEKGLVSQQLDSF DEFIESNIQELVWEDSHLILDQPAQHTSEDQYENKRFEITFGKIYI SKPTQTEGDGTTHPMFPQEARLRNLTYSSPLYVDMSKKKFLSDDRV RKGNELEWVEEKVDGEEAQSKVFLGKVPIMLRSKFCMLRDLGEHEF YELKECPYDMGGYFVINGSEKVLIAQERSAANIVQVFKKAAPSPIS HVAEIRSALEKGSRLISSMQIKLYGRDDKGTTGRTIKATLPYIKED IPIVIVFRALGVVPDGDILEHICYDANDWQMLEMLKPCVEEGFVIQ
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 195/248
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Descrição Sequência
EREVALDFIGRRGVLGIRREKRIQYAKDILQKELLPNITQEAGFES RKAFFLGYMVNRLLLCALERKEPDDRDHFGKKRLDLAGPLLASLFR LLFKKLTRDIYNYMQRCVENDKEFNLTLAVKSQTITDGLRYSLATG NWGEQRKAMSARAGVSQVLNRYTYSSTLSHLRRTNTPIGRDGKIAK PRQLHNTHWGLVCPAETPEGQACGLVKNLSLMTCISVGTSSEPILY FLEEWGMEPLEDYVPSNAPDCTRVFVNGVWVGTHREPAQLVDTMRR LRRKGDISPEVSIIRDIREMEFKIFTDAGRVYRPLFIVDDDPESET KGELMLQKEHVHKLLNSAYDEYDEDDSNAYTWSSLVNDGVVEYVDA EEEETIMIAMTPEDLEASKSALSETQQQDLQMEEQELDPAKRIKPT YTSSTHTFTHCEIHPSMILGVAASIIPFPDHNQSPRNTYQSAMGKQ AMGVFLTNYAVRMDTMANILYYPQKPLATTRAMEHLKFRELPAGQN AVVAIACYSGYNQEDSMIMNQSSIDRGLFRSLFFRSYMDLEKRQGM KALETFEKPSRSDTLRLKHGTYEKLDDDGLIAPGVRVSGEDIIIGK TTPIPPDTEELGQRTQYHTKRDASTPLRSTESGIVDQVLLTTNGDG AKFVKVRMRTTKVPQIGDKFASRHGQKGTIGVTYRHEDMPFSAQGI VPDLIINPHAIPSRMTVAHLIECLLSKVSSLSGLEGDASPFTDVTA EAVSKLLREHGYQSRGFEVMYNGHTGKKMMAQVFFGPTYYQRLRHM VDDKIHARARGPVQVLTRQPVEGRSRDGGLRFGEMERDCMIAHGAA GFLKERLMEASDAFRVHVCGICGLMSVIANLKKNQFECRSCKNKTN IYQIHIPYAAKLLFQELMAMNISPRLYTERSGISVRV (SEQ ID NO: 48)
Sequência de aminoácidos da proteína Tefl de HO Metschnikowia sp. MGKEKSHVNVVVIGHVDSGKSTTTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEA AELGKGS FKYAWVLDKLKAERERGITIDIALWKFET PKYHVTVIDA PGHRDFIKNMITGTSQADCAILIIAGGVGEFEAGISKDGQTREHAL LAYTLGVRQLIVAVNKMDSVKWDKNRFEEIIKETSNFVKKVGYNPK TVPFVPISGWNGDNMIEASTNCPWYKGWEKETKAGKSSGKTLLEAI DAIEPPTRPTDKALRLPLQDVYKIGGIGTVPVGRVETGVIKAGMVV TFAPAGVTTEVKSVEMHHEQLVEGLPGDNVGFNVKNVSVKEIRRGN
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 196/248
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Descrição Sequência
VCGDSKQDPPKAAASFTAQVIVLNHPGQISSGYSPVLDCHTAHIAC KFDTLLEKIDRRTGKSLESEPKFVKSGDAAIVKMVPTKPMCVEAFT DYPPLGRFAVRDMRQTVAVGVIKAVEKSDKAGKVTKAAQKAAKK (SEQ ID NO: 49)
Sequência de aminoácidos da proteína Tpil de HO Metschnikowia sp. MARQFFVGGNFKMNGTKESLTAIVDTLNKADLPENVEVVIAPPAPY LSLVVEANKQKTVEVAAQNVFSKASGAYTGEIAPQQLKDLGANWTL TGHSERRTIIKESDEFIAEKTKFALESGVSVILCIGETLEEKKAGI TLEVCARQLDAVSKIVSDWTNVVIAYEPVWAIGTGLAATAQDAQDI HKEIRAHLSKTIGAEQAEAVRILYGGSVNGKNAVDFKDKADVDGFL VGGASLKPEFIDIIKSRL (SEQ ID NO: 50)
Sequência de aminoácidos da proteína Xksl de HO Metschnikowia sp. MTYSSSSGLFLGFDLSTQQLKIIVTNENLKALGTYHVEFDAQFKEK YAIKKGVLSDEKTGEILSPVHMWLEAIDHVFGLMKKDNFPFGKVKG ISGSGMQHGSVFWSKSASSSLKNMAEYSSLTEALADAFACDTSPNW QDHSTGKEIKDFEKVVGGPDKLAEITGSRAHYRFTGLQIRKLAVRS ENDVYQKTDRISLVSSFVASVLLGRITTIEEADACGMNLYNVTESK LDEDLLAIAAGVHPKLDNKSKRETDEGVKELKRKIGEIKPVSYQTS GSIAPYFVEKYGFSPDSKIVSFTGDNLATIISLPLRKNDVLVSLGT STTVLLVTESYAPSSQYHLFKHPTIKNAYMGMICYSNGALARERVR DAINEKYGVAGDSWDKFNEILDRSGDFNNKLGVYFPIGEIVPNAPA QTKRMEMNSHEDVKEIEKWDLENDVTSIVESQTVSCRVRAGPMLSG SGDSNEGTPENENRKVKTLIDDLHSKFGEIYTDGKPQSYESLTSRP RNIYFVGGASRNKSIIHKMASIMGATEGNFQVEIPNACALGGAYKA SWSLECESRQKWVHFNDYLNEKYDFDDVDEFKVDDKWLNYIPAIGL LSKLESNLDQN (SEQ ID NO: 51)
Sequência de aminoácidos da proteína Xyll de HO MATIKLNSGYDMPQVGFGCWKVTNSTCADTIYNAIKVGYRLFDGAE DYGNEKEVGEGINRAIDEGLVARDELFVVSKLWNNFHHPDNVEKAL DKTLGDLNVEYLDLFLIHFPIAFKFVPFEEKYPPGFYCGEGDKFIY EDVPLLDTWRALEKFVKKGKIRSIGISNFSGALIQDLLRGAEIPPA
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 197/248
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Descrição Sequência
Metschnikowia sp. VLQIEHHPYLQQPRLIEYVQSKGIAITAYSSFGPQSFVELDHPKVK ECVTLFEHEDIVSIAKAHDKSAGQVLLRWATQRGLAVIPKSNKTER LLSNLNVNDFDLSEAELEQIAKLDVGLRFNNPWDWDKIPIFH (SEQ ID NO: 52)
Sequência de aminoácidos da proteína Xyl2 de HO Metschnikowia sp. MPANPSLVLNKVNDITFENYEVPLLTDPNDVLVQVKKTGICGSDIH YYTHGRIGDFVLTKPMVLGHESAGVVVEVGKGVTDLKVGDKVAIEP GVPSRTSDEYKSGHYNLCPHMCFAATPNSNPDEPNPPGTLCKYYKS PADFLVKLPEHVSLELGAMVEPLTVGVHASRLGRVTFGDHVVVFGA GPVGILAAAVARKFGAASVTIVDIFDSKLELAKSIGAATHTFNSMT EGVLSEALPAGVRPDVVLECTGAEICVQQGVLALKAGGRHVQVGNA GSYLKFPITEFVTKELTLFGSFRYGYNDYKTSVAILDENYKNGKEN ALVDFEALITHRFPFKNAIEAYDAVRAGDGAVKC11DGPE (SEQ ID NO: 53)
Sequência de aminoácidos da proteína Xytl de HO Metschnikowia sp. MGYEEKLVAPALKFKNFLDKTPNIHNVYVIAAISCTSGMMFGFDIS SMSVFVDQQPYLKMFDNPSSVIQGFITASMSLGSFFGSLTSTFISE PFGRRASLFICGILWVIGAAVQSSSQNRAQLICGRIIAGWGIGFGS SVAPVYGSEMAPRKIRGTIGGIFQFSVTVGIFIMFLIGYGCSFIQG KAS FRIPWGVQMVPGLILLIGLFFIPES PRWLAKQGYWE DAEIIVA NVQAKGNRNDANVQIEMSEIKDQLMLDEHLKEFTYADLFTKKYRQR TITAIFAQIWQQL T GMNVMMYYIVYIFQMAGY SGNTNLVPSLIQYI INMAVTVPALFCLDLLGRRTILLAGAAFMMAWQFGVAGILATYSEP AYISDTVRITIPDDHKSAAKGVIACCYLFVCSFAFSWGVGIWVYCS EVWGDSQSRQRGAALATSANWIFNFAIAMFTPSSFKNITWKTYIIY ATFCACMFIHVFFFFPETKGKRLEEIGQLWDEGVPAWRSAKWQPTV PLASDAELAHKMDVAHAEHADLLATHSPSSDEKTGTV (SEQ ID NO: 54)
Sequência de aminoácidos da MSNSLESLKATGTVIVTDTGEFDSIAKYTPQDATTNPSLILAASKK AEYAKVIDVAIKYAEDKGSNPKEKAAIALDRLLVEFGKEILSIVPG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 198/248
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Descrição Sequência
proteína Tall RVSTEVDARLSFDKDATVKKALEIIELYKSIGISKDRVLIKIASTW
de HO EGIQAAKELEAKHDIHCNLTLLFSFVQAVACAEAKVTLISPFVGRI
Metschnikowia LDWYKASTGKEYDAESDPGVVSVRQIYNYYKKYGYNTIVMGASFRN
sp. TGEIKALAGCDYLTVAPKLLEELMNSSEEVPKVLDAASASSASEEK VSYIDDESEFRFLLNEDAMATEKLAQGIRGFAKDAQTLLAELENRF K (SEQ ID NO: 55)
Sequência de MSDIDQLAISTIRLLAVDAVAKANSGHPGAPLGLAPAAHAVWKEMK
aminoácidos da FNPKNPDWVNRDRFVLSNGHACALLYAMLHLYGFDMSLDDLKQFRQ
proteína Tkll LNSKTPGHPEKFEIPGAEVTTGPLGQGISNAVGLAIAQKQFAATFN
de HO KDDFAISDSYTYAFLGDGCLMEGVASEASSLAGHLQLNNLIAFWDD
Metschnikowia NKISIDGSTEVAFTEDVLKRYEAYGWDTLTIEKGDTDLEGVAQAIK
sp. TAKASKKPTLIRLTTIIGYGSLQQGTHGVHGAPLKPDDIKQLKEKF GFDPTKSFVVPQEVYDYYGTLVKKNQELESEWNKTVESYIQKFPEE GAVLARRLKGELPEDWAKCLPTYTADDKPLATRKLSEMALIKILDV VPELIGGSADLTGSNLTRAPDMVDFQPPQTGLGNYAGRYIRYGVRE HGMGAIMNGIAGFGAGFRNYGGTFLNFVSYAAGAVRLSALSHLPVI WVATHDSIGLGEDGPTHQPIETLAHFRATPNISVWRPADGNEVSAA YKSAIESTSTPHILALTRQNLPQLAGSSVEKASTGGYTVYQTTDKP AVIIVASGSEVAISIDAAKKLEGEGIKANVVSLVDFHTFDKQPLDY RLSVLPDGVPIMSVEVMSSFGWSKYSHEQFGLNRFGASGKAEDLYK FFDFTPEGVADRAAKTVQFYKGKDLLSPLNRAF (SEQ ID NO: 56)
Sequência ATGTGCAAAGCCGGTTTTGCCGGTGACGACGCACCTCGTGCTGTGT
nucleotídica TCCCATCTATCGTGGGTAGACCAAGACACCAGGGTATCATGGTCGG
do gene ACT1 CATGGGTCAAAAGGACTCTTATGTTGGTGACGAGGCCCAGTCCAAG
de HO AGAGGTATTTTGACTTTGAGATACCCCATTGAGCATGGTATCGTGA
Metschnikowia ACAACTGGGACGACATGGAGAAGATCTGGCATCACACCTTCTACAA
sp. CGAGTTGAGAGTCGCCCCTGAGGAACACCCAGTCTTGTTGACCGAG GC T C C AAT G AAC C C T AAG T C C AAC AG AG AG AAG AT G AC T C AAAT CA
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 199/248
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Descrição Sequência
TGTTCGAGACTTTCAACGTTCCGGCTTTCTACGTTTCCATCCAGGC CGTCTTGTCCTTGTACTCCTCCGGTAGAACCACTGGTATTGTTTTA GATTCTGGTGACGGTGTTACTCACTTGGTTCCTATCTATGCTGGAT TCTCCATGCCTCACGGTATTTTGAGATTGAACTTGGCTGGTAGAGA CTTGACCGACTACTTGATGAAGATTTTGTCCGAGCGTGGTTACACT TTCTCCACCACTGCCGAGAGAGAAATTGTCCGTGACATCAAGGAGA AATTGTGCTACGTCGCCTTGGACTTTGAGCAGGAGATGCAAACGTC TTCTCAATCTTCCGCTATCGAGAAATCGTACGAGTTGCCAGATGGA CAAGTCATCACTATTGGTAACGAGAGATTTAGAGCTGCCGAGGCCT TGTTCCGTCCTACTGACTTGGGCTTGGAGGCTGTTGGTATCGACCA AAC C AC T T AC AAC TCTATCAT C AAG T G T G AC G T C G AC G T T AG AAAG GAGTTGTACGGTAACATTGTTATGTCCGGTGGTACTACTTTATTCC CAGGTATTGCTGAGCGTATGCAAAAGGAGATTACCGCGTTGGCTCC TTCCTCCATGAAGGTCAAGATTATTGCTCCACCTGAGAGAAAGTAC TCTGTATGGATTGGTGGCTCCATCTTGGCTTCCTTGTCCACTTTCC AACAGATGTGGATCTCGAAGCAAGAGTACGACGAGTCTGGACCAAC TATCGTTCACCACAAGTGTTTTTAA (SEQ ID NO: 57)
Sequência nucleotidica do gene AR08 de HO Metschnikowia sp. ATGACTAAACCACTTGCTAAGGATTTGCAGCACCACTTGAGCACGG AGGCCAAGTCACGCAAGGGCCTGGCGCTTAAGGGCGCATTCAAGTA CTACAACCAGCCCGGGATGACGTTTCTCGGCGGCGGATTGCCCCTT CTGGACTATTTCCCCTTTGATAAAATCACTGCGGACGTGCCGCTGG CGCCGTTCCCAAACGGATGTGGTGCGAGAGTCACCGAATCAGACAA AACCGTGATTGAGGTGCATAAGCGGAAACAAGACAACAGTGACAGC GGCTACGCGGACGTTGAGTTGGCGCGTAGTTTGCAGTACGGATACA CGGAGGGACACACTGAGCTTGTGCAGTTCTTACGTGACCACACCGA CACGATCCACCGCGTGCCATATGAAGATTGGGACGTGATCACCAAT GTGGGCAACACGCAAGCGTGGGACGCCGTGTTGCGGACGTTTACGC TGCGTGGTGACGTGATCTTGGTGGAAGACCACACCTTTTCGCTGGC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 200/248
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Descrição Sequência
CATGGAGACCGCGCACGCGCACGGCGTCACCACTTATCCCGTGGTG ATGGACACCGAGGGAATCGTGCCATCGGCGTTGGAGAAACTCTTGG ACAACTGGGTTGGCGCAAAGCCGCGCATGCTCTACACGATCTGCAC GGGACAGAACCCAACTGGATCGTGTCTCAGTGGGGAACGCCGCCGC GAGGTGTATCTGTTGGCACAGAAACATGATTTGATCATCATCGAGG ACGAGCCGTACTACTTCTTGCAGATGGAGCCATATACACGTGATTT GGCGCTTCGCCTGCTGAAGCACGTGCACGGCCATGAGGAGTTCATC AAGGCGCTTGTTCCCTCGTTCATCTCGATGGACGTGGACGGACGTG TGCTCCGACTCGACTCCGTGTCGAAGACGATCGCTCCAGGCGCCCG TTTGGGCTGGGTCGTGGGGCAGAAACGCCTCTTGGAGCGATTCTTG CGTTTGCACGAAACGTCGATCCAGAACGCTTCGGGTTTCACGCAGC TGCTCTTGAACGGCTTGTTTCAAAGATGGGGCCAGAAGGGATACTT GGACTGGTTGATTGGTATCCGTGCTGAGTACACTCACAAGAGGGAC GTGGCAATTGATGCTTTATACAAGTACTTCCCGCAAGAAGTAGTGA CGATTTTGCCGCCCGTGGCCGGTATGTTCTTTGTTGTCAACTTGGA CGCCAGCAAGCACCCGAAATTTGAGGAGTTGGGCAGCGACCCGTTG GCTGTCGAGAACAGCCTCTACGAGGCTGGCTTGGCGCACGGGTGCT TGATGATTCCTGGCTCGTGGTTCAAGGCTGACGGCGAGACCACCCC GCCACAAGCGCCTGTGCCTGTGGACGAGCTGTTGAAGAACAGCATT TTCTTTAGGGGTACTTACGCGGCAGTACCCTTGGACGAGTTGGAGG TTGGCTTGAAGAAGTTTGGCGAGGCTGTCAAGGCCGAGTTTGGTTT GTAA (SEQ ID NO: 58)
Sequência ATGGCACCAATCATCACCAGGGCTTCATCCGAAGAAACAACACCCC
nucleotidica AAATTACAGACGACCAGATCCCTTTGGGGGAGTACCTTTTCCTCAG
do gene AROIO AATCTGCCAGGCAAATCCAAAACTTCGCTCGGTGTTTGGCATTCCC
de HO GGAGACTTCAGTTTGGCGTTATTGGAGCATCTCTATACCAAGCTGG
Metschnikowia TGGCGAAAAAAGTTGAGTTTGTTGGTTTCTGTAACGAGCTCAATGC
sp. GGCATATGCAGCAGATGGATATGCAAAGCATATTGACGGCTTGAGT
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 201/248
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Descrição Sequência
GTCTTGCTTACGACTTTTGGGGTGGGAGAACTATCCACTTTGAACG CCATAGCCGGCGCATTCACAGAGTACGCTCCAGTATTGCATATTGT CGGCACCACATCTACGAAACAGGCGGAGCAGTCCAGGGCGGCAGGC ACGAGAGATGTAAGAAACATCCATCACTTGGTGCAGAACAAAAACC CGCTTTGTGCGCCCAATCACGATGTATATAAGCCCATGGTGGAAAG TTTATCTGTATGCCAGGAATCCTTGGACATGAATGGCGACTTGAAC T T GGAAAAGAT C GATAAC G T C T T GAGAAT GG T 0ACAAAT GAGAGGA GACCAGGGTACATTTTCATTCCGAGCGATGTTTCCGATATCATGGT TTCCGCAGGCAGGTTGAATCAGCCGTTGACCTTTAGTGAATTGACA GATGAGTCTGCGTTGAAAAACATGGCCCTGAGAATTTTGGCAAAAC TTTACAATTCAAAGCACCCTTCTGTACTTGGCGATGCATTAGCAGA CAGGTTTGGGGGGCAAACTGCTTTGGATAACCTTGTTGAAAAGTTA CCATCGAATTTCGTCAAGTTGTTTTCCACGCTTTTGGCCAGAAACA TCGACGAGACTTTACCGAACTATATCGGGGTCTACAGCGGCAAATT G T C C T C C GATAAGAT T G T CAT T GAC GAAT T GGAGAGAAACAC C GAC TTTTTGTTGACCCTCGGCCATGCTAACAATGAGATCAATTCCGGGG TATACTCAACTGACTTTTCTGCAATCACCGAGTATGTGGAGGTGCA TCCAGATTACATTCTCATTGATGGCGAGTACGTTCTCATCAAAAAC GGAGAAACCGGAAAGAGAT T GT T T T CAAT T GT T GAT TTGCTTACTA AGCTTGTCTCAGATTTCGATGCATCGAAGATGATTCACAACAATCA TGCTGTTAACAACATTAGAGCGAGGCGCGAAACCAAGCAGTTTTCG TCATTGGATACGGTTTCGCCTGGAGTGATCACGCAAAACAAGTTGG TTGATTTTTTCAATGACTACTTGCGGCCAAACGATATCTTGTTGTG CGATACATGCAGTTTTCTTTTTGGTGTGTTCGAGCTTAAGTTCCCG AGGGGCGTCAAGTTTATTGCACAAACCTTATACGAATCGATCGGGT ATGCACTTCCCGCGACTTTTGGCGCTGCAAGGGCCGAAAGGGATTT GGGCACGAACAGAAGAGTGGTGTTGATACAGGGAGATGGTTCTGCC CAAATGACAATCCAGGAATGGTCCACATATTTGAGATACGACATTC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 202/248
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Descrição Sequência
TGTCGCCAGAAATCTTTTTGCTCAACAACGAGGGCTACACGGTTGA AAGGATGATCAAAGGGCCCACTCGGTCCTATAACGATATTCAGGAC AC T T GGAAAT GGACGGAAT T T T T CAAGAT T T T CGGCGACGAAGAC T GCGAGAAGCATGAGGCTGAAAAAGTCAACACCACAAACGAATTGGA AGCTTTGACTAGGCGCAAAACAAGCGAGAAGATCCGCTTGTATGAA C T C AAGT T GAGC AAAT T AGAC AT T GT GGAC AAAT T T CGGAT C T T GC GTGAATAG (SEQ ID NO: 59)
Sequência nucleotídica do gene GPD1 de HO Metschnikowia sp. ATGACCGCTACTGCTCCTTTCAAGATCGAATCCCCCTTCAGAATTG CCATCATCGGCTCCGGTAACTGGGGTACCGCCGTGGCCAAGCTTGT GGCTGAGAACACCGCTGAGAAGCCGGAAATCTTCCAGAAACAGGTG AACATGTGGGTGTTTGAGGAGGACATCAACGGCCGCAAATTGACCG AGATCATCAACACTGACCATGAGAACGTCAAGTACATGCCAGAGGT GAAGTTGCCAGAAAACTTGGTTGCAAACCCAGACATTGAGGCCACC GTCAAGGATGCTGACCTCCTTATTTTCAACATCCCCCACCAGTTCT TGCCAAGAGTGTGCAAGCAATTGGTTGGCAAGGTTTCGCCTACCGC CAGAGCCATTTCCTGTCTTAAGGGCTTGGAGGTGGATGCCTCTGGC TGCAAATTGTTGTCGCAGTCCATCACCGACACCTTGGGCATCTACT GTGGTGTCTTGTCCGGTGCCAACATCGCCAACGAGGTGGCTAGAGG CCGCTGGTCCGAGACCTCCATCGCCTACAACAGACCCACCGACTTC CGTGGCGAGGGCAAGGATATCTGTGAGTTTGTGTTGAAGGAGGCCT TCCACAGAAGATACTTCCACGTGCGCGTGATCAAGGACGTTATTGG CGCCTCGATCGCCGGTGCGTTGAAGAACGTTGTGGCCATTGCCGCC GGCTTCGTCGAAGGTGAGGGCTGGGGTGACAATGCCAAGTCTGCCA TCATGAGAATCGGCCTCAAGGAGACCATTCACTTTGCCTCGTACTG GGAGAAGTTTGGCATCCAGGGTCTTTCTGCTCCTGAGCCTACCACC TTCACCGAGGAGTCTGCCGGTGTTGCCGACTTGATCACCACGTGTT CCGGTGGTAGAAACGTCAAGGTTGCCAGATACATGATTGAGAAGAA TGTCGACGCTTGGGAGGCTGAGAAGGCCTTGTTGAACGGCCAGTCC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 203/248
200/227
Descrição Sequência
TCGCAAGGTATCATCACCGCCAAGGAGGTGCACGAGTTGTTGGTGA ACTACAAGTTGCAAGAGGAGTTCCCATTGTTCGAGGCCACCTACGC TGTCATTTACGAGAACGCCGATGTCAACACCTGGCCTACGATTTTG GCCGAGTAA (SEQ ID NO: 60)
Sequência nucleotidica do gene GXF1 de HO Metschnikowia sp. ATGTCTCAAGACGAACTTCATACAAAGTCTGGTGTTGAAACACCAA TCAACGATTCGCTTCTCGAGGAGAAGCACGATGTCACCCCACTCGC GGCATTGCCCGAGAAGTCCTTCAAGGACTACATTTCCATTTCCATT TTCTGTTTGTTTGTGGCATTTGGTGGTTTTGTTTTCGGTTTCGACA CCGGTACGATTTCCGGTTTCGTCAACATGTCCGACTTCAAGACCAG ATTTGGTGAGATGAATGCCCAGGGCGAATACTACTTGTCCAATGTT AGAACTGGTTTGATGGTTTCTATTTTCAACGTCGGTTGCGCCGTTG GTGGTATCTTCCTTTGTAAGATTGCCGATGTTTATGGCAGAAGAAT TGGTCTTATGTTTTCCATGGTGGTTTATGTCGTTGGTATCATTATT CAGATTGCCTCCACCACCAAATGGTACCAATACTTCATTGGCCGTC TTATTGCTGGCTTGGCTGTGGGTACTGTTTCCGTCATCTCGCCACT TTTCATTTCCGAGGTTGCTCCTAAACAGCTCAGAGGTACGCTTGTG TGCTGCTTCCAGTTGTGTATCACCTTGGGTATCTTTTTGGGTTACT GCACGACCTACGGTACAAAGACTTACACTGACTCCAGACAGTGGAG AATCCCATTGGGTATCTGTTTCGCGTGGGCTTTGTTTTTGGTGGCC GGTATGTTGAACATGCCCGAGTCTCCTAGATACTTGGTTGAGAAAT CGAGAATCGACGATGCCAGAAAGTCCATTGCCAGATCCAACAAGGT TTCCGAGGAAGACCCCGCCGTGTACACCGAGGTGCAGCTTATCCAG GCTGGTATTGACAGAGAGGCCCTTGCCGGCAGCGCCACATGGATGG AGCTTGTGACTGGTAAGCCCAAAATCTTCAGAAGAGTCATCATGGG TGTCATGCTTCAGTCCTTGCAACAATTGACTGGTGACAACTACTTT TTCTACTACGGAACCACGATTTTCAAGGCTGTTGGCTTGCAGGACT CTTTCCAGACGTCGATTATCTTGGGTATTGTCAACTTTGCCTCGAC TTTTGTCGGTATTTACGCCATTGAGAGAATGGGCAGAAGATTGTGT
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 204/248
201/227
Descrição Sequência
TTGTTGACCGGATCTGCGTGCATGTTTGTGTGTTTCATCATCTACT CGCTCATTGGTACGCAGCACTTGTACAAGAACGGCTTCTCTAACGA ACCTTCCAACACATACAAGCCTTCCGGTAACGCCATGATCTTCATC ACGTGTCTTTACATTTTCTTCTTTGCCTCGACCTGGGCCGGTGGTG TTTACTGTATCGTGTCCGAGTCTTACCCATTGAGAATCAGATCCAA GGCCATGTCTGTCGCCACCGCCGCCAACTGGATGTGGGGTTTCTTG ATCTCGTTCTTCACGCCTTTCATCACCTCCGCCATCCACTTTTACT ACGGTTTTGTTTTCACTGGCTGCTTGGCGTTCTCCTTCTTCTACGT CTACTTCTTTGTCGTGGAGACCAAGGGTCTTTCCTTGGAGGAGGTT GACATTTTGTACGCTTCCGGTACGCTTCCATGGAAGTCCTCTGGCT GGGTGCCTCCTACCGCGGACGAAATGGCCCACAACGCCTTCGACAA CAAGCCAACTGACGAACAAGTCTAA (SEQ ID NO: 61)
Sequência nucleotidica do gene GXF2 de HO Metschnikowia sp. ATGAGTGCCGAACAGGAACAACAAGTATCGGGCACATCTGCCACGA TAGATGGGCTGGCGTCCTTGAAGCAAGAAAAAACCGCCGAGGAGGA AGACGCCTTCAAGCCTAAGCCCGCCACGGCGTACTTTTTCATTTCG TTCCTCTGTGGCTTGGTCGCCTTTGGCGGCTACGTTTTCGGTTTCG ATACCGGCACGATTTCCGGGTTTGTTAACATGGACGACTATTTGAT GAGATTCGGCCAGCAGCACGCTGATGGCACGTATTACCTTTCCAAC GTGAGAACCGGTTTGATCGTGTCGATCTTCAACATTGGCTGTGCCG TCGGTGGTCTTGCGCTTTCGAAAGTTGGTGACATCTGGGGCAGAAG AATTGGTATTATGGTTGCTATGATCATCTACATGGTGGGAATCATC ATCCAGATCGCTTCACAGGATAAATGGTACCAGTACTTCATTGGCC GTTTGATCACCGGGTTGGGTGTCGGCACCACGTCCGTGCTCAGTCC TCTTTTCATCTCCGAGTCGGCTCCGAAGCATTTGAGAGGCACCCTT GTGTGTTGTTTCCAGCTCATGGTCACCTTGGGTATCTTTTTGGGCT ACTGCACGACCTACGGTACCAAGAACTACACTGACTCGCGCCAGTG GCGGATTCCCTTGGGTCTTTGCTTTGCATGGGCGCTTTTGTTGATC TCGGGAATGGTTTTCATGCCCGAATCCCCACGTTTCTTGATTGAAC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 205/248
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Descrição Sequência
GCCAGAGATTCGACGAGGCGAAGGCCTCCGTGGCCAAATCGAACCA GGTCTCGACCGAGGACCCCGCCGTGTACACTGAAGTGGAGTTGATC CAGGCCGGTATTGACCGTGAGGCATTGGCCGGATCCGCTGGCTGGA AAGAGCTTATCACGGGCAAGCCCAAGATGTTGCAGCGTGTGATTTT GGGAATGATGCTCCAGTCGATCCAGCAGCTCACCGGTAACAACTAC TTTTTCTACTACGGTACCACGATCTTCAAGGCCGTGGGCATGTCGG ACTCGTTCCAGACCTCGATTGTTTTGGGTATTGTCAACTTCGCCTC CACTTTTGTCGGAATCTGGGCCATCGAGCGTATGGGCCGCAGATCT TGTTTGCTTGTTGGTTCCGCGTGCATGAGTGTGTGTTTCTTGATCT ACTCCATCTTGGGTTCCGTCAACCTTTACATCGACGGCTACGAGAA CACGCCTTCGAACACGCGTAAGCCTACCGGTAACGCCATGATCTTC ATCACGTGTTTGTTTATCTTCTTCTTCGCCTCCACCTGGGCCGGTG GTGTGTACAGTATTGTTTCTGAAACATACCCATTGAGAATCCGGTC TAAAGGTATGGCCGTGGCCACCGCTGCCAACTGGATGTGGGGTTTC TTGATTTCGTTCTTCACGCCTTTCATCACCTCGGCCATCCACTTCT ACTACGGGTTTGTGTTCACAGGGTGTCTTATTTTCTCCTTCTTCTA CGTGTTCTTCTTTGTTAGGGAAACCAAGGGTCTCTCGTTGGAAGAG GTGGATGAGTTATATGCCACTGACCTCCCACCATGGAAGACCGCGG GCTGGACGCCTCCTTCTGCTGAGGATATGGCCCACACCACCGGGTT TGCCGAGGCCGCAAAGCCTACGAACAAACACGTTTAA (SEQ ID NO: 62)
Sequência nucleotidica do gene GXS1 de HO Metschnikowia sp. ATGAGCATCTTTGAAGGCAAAGACGGGAAGGGGGTATCCTCCACCG AGTCGCTTTCCAATGACGTCAGATATGACAACATGGAGAAAGTTGA TCAGGATGTTCT TAGACACAAC T T CAAC T T T GACAAAGAAT T C GAG GAGCTCGAAATCGAGGCGGCGCAAGTCAACGACAAACCTTCTTTTG TCGACAGGATTTTATCCCTCGAATACAAGCTTCATTTCGAAAACAA GAACCACATGGTGTGGCTCTTGGGCGCTTTCGCAGCCGCCGCAGGC TTATTGTCTGGCTTGGATCAGTCCATTATTTCTGGTGCATCCATTG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 206/248
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Descrição Sequência
G AAT G AAC AAAGC AT T G AAC T T G AC T G AAC G T G AAGC C TCATTGGT GTCTTCGCTTATGCCTTTAGGCGCCATGGCAGGCTCCATGATTATG ACACCTCTTAATGAGTGGTTCGGAAGAAAATCATCGTTGATTATTT CTTGTATTTGGTATACCATCGGATCCGCTTTGTGCGCTGGCGCCAG AGATCACCACATGATGTACGCTGGCAGATTTATTCTTGGTGTCGGT GTGGGTATAGAAGGTGGGTGTGTGGGCATTTACATTTCCGAGTCTG TCCCAGCCAATGTGCGTGGTAGTATCGTGTCGATGTACCAGTTCAA TATTGCTTTGGGTGAAGTTCTAGGGTATGCTGTTGCTGCCATTTTC TACACTGTTCATGGTGGATGGAGGTTCATGGTGGGGTCTTCTTTAG TATTCTCTACTATATTGTTTGCCGGATTGTTTTTCTTGCCCGAGTC ACCTCGTTGGTTGGTGCACAAAGGCAGAAACGGAATGGCATACGAT GTGTGGAAGAGATTGAGAGACATAAACGATGAAAGCGCAAAGTTGG AAT T T T T GGAGAT GAGACAGGC T GC T TAT CAAGAGAGAGAAAGACG CTCGCAAGAGTCTTTGTTCTCCAGCTGGGGCGAATTATTCACCATC GC T AGAAAC AGAAGAGC AC T T AC T T AC T C T GT C AT AAT GAT C AC T T TGGGTCAATTGACTGGTGTCAATGCCGTCATGTACTACATGTCGAC TTTGATGGGTGCAATTGGTTTCAACGAGAAAGACTCTGTGTTCATG TCCCTTGTGGGAGGCGGTTCTTTGCTTATAGGTACCATTCCTGCCA TTTTGTGGATGGACCGTTTCGGCAGAAGAGTTTGGGGTTATAATCT TGTTGGTTTCTTCGTTGGTTTGGTGCTCGTTGGTGTTGGCTACCGT TTCAATCCCGTCACTCAAAAGGCGGCTTCAGAAGGTGTGTACTTGA CGGGTCTCATTGTCTATTTCTTGTTCTTTGGTTCCTACTCGACCTT AACTTGGGTCATTCCATCCGAGTCTTTTGATTTGAGAACAAGATCT TTGGGTATGACAATCTGTTCCACTTTCCTTTACTTGTGGTCTTTCA CCGTCACCTACAACTTCACCAAGATGTCCGCCGCCTTCACATACAC TGGGTTGACACTTGGTTTCTACGGTGGCATTGCGTTCCTTGGTTTG ATTTACCAGGTCTGCTTCATGCCCGAGACGAAGGACAAGACTTTGG AAGAAATTGACGATATCTTCAATCGTTCTGCGTTCTCTATCGCGCG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 207/248
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Descrição Sequência
CGAGAACATCTCCAACTTGAAGAAGGGTATTTGGTAA (SEQ ID NO: 63)
Sequência nucleotidica do gene HGT19 de HO Metschnikowia sp. ATGTCAGAAAAGCCTGTTGTGTCGCACAGCATCGACACGACGCTGT CTACGTCATCGAAACAAGTCTATGACGGTAACTCGCTTCTTAAGAC CCTGAATGAGCGCGATGGCGAACGCGGCAATATCTTGTCGCAGTAC ACTGAGGAACAGGCCATGCAAATGGGCCGCAACTATGCGTTGAAGC ACAATTTAGATGCGACACTCTTTGGAAAGGCGGCCGCGGTCGCAAG AAAC C CATAC GAG TTCAATTCGAT GAG T T T T T TGACCGAAGAGGAA AAAGTCGCGCTTAACACGGAGCAGACCAAGAAATGGCACATCCCAA GAAAGTTGGTGGAGGTGATTGCATTGGGGTCCATGGCCGCTGCGGT GCAGGGTATGGATGAGTCGGTGGTGAATGGTGCAACGCTTTTCTAC CCCACGGCAATGGGTATCACAGATATCAAGAATGCCGATTTGATTG AAGGTTTGATCAACGGTGCGCCCTATCTTTGCTGCGCCATCATGTG CTGGACATCTGATTACTGGAACAGGAAGTTGGGCCGTAAGTGGACC ATTTTCTGGACATGTGCCATTTCTGCAATCACATGTATCTGGCAAG GTCTCGTCAATTTGAAATGGTACCATTTGTTCATTGCGCGTTTCTG CTTGGGTTTCGGTATCGGTGTCAAGTCTGCCACCGTGCCTGCGTAT GCTGCCGAAACCACCCCGGCCAAAATCAGAGGCTCGTTGGTCATGC TTTGGCAGTTCTTCACCGCTGTCGGAATCATGCTTGGTTACGTGGC GTCTTTGGCATTCTATTACATTGGTGACAATGGCATTTCTGGCGGC TTGAACTGGAGATTGATGCTAGGATCTGCATGTCTTCCAGCTATCG TTGTGTTAGTCCAAGTTCCGTTTGTTCCAGAATCCCCTCGTTGGCT CATGGGTAAGGAAAGACACGCTGAAGCATATGATTCGCTCCGGCAA TTGCGGTTCAGTGAAATCGAGGCGGCCCGTGACTGTTTCTACCAGT ACGTGTTGTTGAAAGAGGAGGGCTCTTATGGAACGCAGCCATTCTT CAGGAGAAT CAAGGAGAT GTTCACCGT GAGAAGAAACAGAAAT GG T GCATTGGGCGCGTGGATCGTCATGTTCATGCAGCAGTTCTGTGGAA TCAACGTCATTGCTTACTACTCGTCGTCGATCTTCGTGGAGTCGAA
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 208/248
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Descrição Sequência
TCTTTCTGAGATCAAGGCCATGTTGGCGTCTTGGGGGTTCGGTATG ATCAATTTCTTGTTTGCAATTCCAGCGTTCTACACCATTGACACGT TTGGCCGACGCAACTTGTTGCTCACTACTTTCCCTCTTATGGCGGT ATTCTTACTCATGGCCGGATTCGGGTTCTGGATCCCGTTCGAGACA AACCCACACGGCCGTTTGGCGGTGATCACTATTGGTATCTATTTGT TTGCATGTGTCTACTCTGCGGGCGAGGGACCAGTTCCCTTCACATA CTCTGCCGAAGCATTCCCGTTGTATATCCGTGACTTGGGTATGGGC TTTGCCACGGCCACGTGTTGGTTCTTCAACTTCATTTTGGCATTTT CCTGGCCTAGAATGAAGAATGCATTCAAGCCTCAAGGTGCCTTTGG CTGGTATGCCGCCTGGAACATTGTTGGCTTCTTCTTAGTGTTATGG TTCTTGCCCGAGACAAAGGGCTTGACGTTGGAGGAATTGGACGAAG TGTTTGATGTGCCTTTGAGAAAACACGCGCACTACCGTACCAAAGA ATTAGTATACAACTTGCGCAAATACTTCTTGAGGCAGAACCCTAAG CCATTGCCGCCACTTTATGCACACCAAAGAATGGCTGTTACCAACC CAGAATGGTTGGAAAAGACCGAGGTCACGCACGAGGAGAATATCTA G (SEQ ID NO: 64)
Sequência nucleotidica do gene HXT2. 6 de HO Metschnikowia sp. ATGCTGAGCACTACCGATACCCTCGAAAAAAGGGACACCGAGCCTT TCACTTCAGATGCTCCTGTCACAGTCCATGACTATATCGCAGAGGA GCGTCCGTGGTGGAAAGTGCCGCATTTGCGTGTATTGACTTGGTCT GTTTTCGTGATCACCCTCACCTCCACCAACAACGGGTATGATGGCC TGATGTTGAATGGATTGCAATCCTTGGACATTTGGCAGGAGGATTT GGGTCACCCTGCGGGCCAGAAATTGGGTGCCTTGGCCAACGGTGTT TTGTTTGGTAACCTTGCTGCTGTGCCTTTTGCTTCGTATTTCTGCG ATCGTTTTGGTAGAAGGCCGGTCATTTGTTTCGGACAGATCTTGAC AATTGTTGGTGCTGTATTACAAGGTTTGTCCAACAGCTATGGATTT TTTTTGGGTTCGAGAATTGTGTTGGGTTTTGGTGCTATGATAGCCA CTATTCCGCTGCCAACATTGATTTCCGAAATCGCCTACCCTACGCA TAGAGAAACTTCCACTTTCGCCTACAACGTGTGCTGGTATTTGGGA
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 209/248
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Descrição Sequência
GCCATTATCGCCTCCTGGGTCACATACGGCACCAGAGATTTACAGA GCAAGGCTTGCTGGTCAATTCCTTCTTATCTCCAGGCCGCCTTACC TTTCTTTCAAGTGTGCATGATTTGGTTTGTGCCAGAGTCTCCCAGA TTCCTCGTTGCCAAGGGCAAGATCGACCAAGCAAGGGCTGTTTTGT CTAAATACCATACAGGAGACTCGACTGACCCCAGAGACGTTGCGTT GGT T GAG T T T GAGC T CGAT GAGAT T GAGAGT GCAT T GGAGCAGGAA AAAT T GAACAC TCGCTCGTCATACTTT GAC T T T T TCAAGAAGAGAA ACTTTAGAAAGAGAGGCTTCTTGTGTGTCATGGTCGGTGTTGCAAT GCAGCTTTCTGGAAACGGCTTAGTGTCCTATTACTTGTCGAAAGTG C TAG AC T C G AT T GG AAT C AC T G AAAC C AAG AG AC AGC T C GAGAT CA ATGGCTGCTTGATGATCTATAACTTTGTCATCTGCGTCTCGTTGAT GAGTGTTTGCCGTATGTTCAAAAGAAGAGTATTATTTCTCACGTGT TTCTCAGGAATGACGGTTTGCTACACGATATGGACGATTTTGTCAG CGCTTAATGAACAGAGACACTTTGAGGATAAAGGCTTGGCCAATGG CGTGTTGGCAATGATCTTCTTCTACTATTTTTTCTACAACGTTGGC ATCAATGGATTGCCATTCCTATACATCACCGAGATCTTGCCTTACT CACACAGAGCAAAAGGCTTGAATTTATTCCAATTCTCGCAATTTCT CACGCAAATCTACAATGGCTATGTGAACCCAATCGCCATGGACGCA ATCAGCTGGAAGTATTACATTGTGTACTGCTGTATTCTCTTCGTGG AGTTGGTGATTGTGTTTTTCACGTTCCCAGAAACTTCGGGATACAC TTTGGAGGAGGTCGCCCAGGTATTTGGTGATGAGGCTCCCGGGCTC CACAACAGACAAT T GGAT G T T GC GAAAGAAT CAC T C GAGCAT G T T G AGCATGTTTGA (SEQ ID NO: 65)
Sequência nucleotidica do gene HXT5 de HO Metschnikowia ATGAGCATCTTTGAAGGCAAAGACGGGAAGGGGGTATCCTCCACCG AGTCGCTTTCCAATGACGTCAGATATGACAACATGGAGAAAGTTGA TCAGGATGTTCT TAGACACAAC T T CAAC T T T GACAAAGAAT T C GAG GAGCTCGAAATCGAGGCGGCGCAAGTCAACGACAAACCTTCTTTTG TCGACAGGATTTTATCCCTCGAATACAAGCTTCATTTCGAAAACAA
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 210/248
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Descrição Sequência
sp. GAACCACATGGTGTGGCTCTTGGGCGCTTTCGCAGCCGCCGCAGGC TTATTGTCTGGCTTGGATCAGTCCATTATTTCTGGTGCATCCATTG G AAT G AAC AAAGC AT T G AAC T T G AC T G AAC G T G AAGC C TCATTGGT GTCTTCGCTTATGCCTTTAGGCGCCATGGCAGGCTCCATGATTATG ACACCTCTTAATGAGTGGTTCGGAAGAAAATCATCGTTGATTATTT CTTGTATTTGGTATACCATCGGATCCGCTTTGTGCGCTGGCGCCAG AGATCACCACATGATGTACGCTGGCAGATTTATTCTTGGTGTCGGT GTGGGTATAGAAGGTGGGTGTGTGGGCATTTACATTTCCGAGTCTG TCCCAGCCAATGTGCGTGGTAGTATCGTGTCGATGTACCAGTTCAA TATTGCTTTGGGTGAAGTTCTAGGGTATGCTGTTGCTGCCATTTTC TACACTGTTCATGGTGGATGGAGGTTCATGGTGGGGTCTTCTTTAG TATTCTCTACTATATTGTTTGCCGGATTGTTTTTCTTGCCCGAGTC ACCTCGTTGGTTGGTGCACAAAGGCAGAAACGGAATGGCATACGAT GTGTGGAAGAGATTGAGAGACATAAACGATGAAAGCGCAAAGTTGG AAT T T T T GGAGAT GAGACAGGC T GC T TAT CAAGAGAGAGAAAGACG CTCGCAAGAGTCTTTGTTCTCCAGCTGGGGCGAATTATTCACCATC GC T AGAAAC AGAAGAGC AC T T AC T T AC T C T GT C AT AAT GAT C AC T T TGGGTCAATTGACTGGTGTCAATGCCGTCATGTACTACATGTCGAC TTTGATGGGTGCAATTGGTTTCAACGAGAAAGACTCTGTGTTCATG TCCCTTGTGGGAGGCGGTTCTTTGCTTATAGGTACCATTCCTGCCA TTTTGTGGATGGACCGTTTCGGCAGAAGAGTTTGGGGTTATAATCT TGTTGGTTTCTTCGTTGGTTTGGTGCTCGTTGGTGTTGGCTACCGT TTCAATCCCGTCACTCAAAAGGCGGCTTCAGAAGGTGTGTACTTGA CGGGTCTCATTGTCTATTTCTTGTTCTTTGGTTCCTACTCGACCTT AACTTGGGTCATTCCATCCGAGTCTTTTGATTTGAGAACAAGATCT TTGGGTATGACAATCTGTTCCACTTTCCTTTACTTGTGGTCTTTCA CCGTCACCTACAACTTCACCAAGATGTCCGCCGCCTTCACATACAC TGGGTTGACACTTGGTTTCTACGGTGGCATTGCGTTCCTTGGTTTG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 211/248
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Descrição Sequência
ATTTACCAGGTCTGCTTCATGCCCGAGACGAAGGACAAGACTTTGG AAGAAATTGACGATATCTTCAATCGTTCTGCGTTCTCTATCGCGCG CGAGAACATCTCCAACTTGAAGAAGGGTATTTGGTAA (SEQ ID NO: 66)
Sequência nucleotidica do gene PGK1 de HO Metschnikowia sp. ATGTCTTTATCTAACAAATTGTCTGTGAAAGACTTGGACCTCGCTA ACAAGAGAGTCTTCATCAGAGTCGACTTCAACGTTCCTCTTGACGG AACCACCATCACCAACAACCAGAGAATTGTTGCTGCTTTGCCAACC ATCAAATACGTCTTGGAGCAGAAGCCAAAGGCCGTCATCTTGGCTT CCCACTTGGGCAGACCAAACGGTGAGAGAGTTGAGAAGTACTCGTT GGCTCCAGTTGCCAAGGAATTGCAGTCCTTGTTGTCTGACCAGAAG GTCACATTCTTGAACGACAGCGTTGGACCTGAGGTCGAGAAGGCTG TCAACAGCGCCTCTCAGGGCGAGGTGTTCTTGTTGGAGAACTTGCG TTACCACATCGAGGAGGAAGGCTCCAAGAAGGTCGACGGCAACAAG GTCAAGGCTTCCAAGGAGGATGTCGAGAAGTTCAGACAAGGATTGA CCGCCTTGGCCGACGTCTACGTCAACGACGCTTTCGGTACCGCCCA CAGAGCCCACTCTTCTATGGTTGGTCTTGAATTGCCTCAGAAGGCT GCCGGTTTCTTGATGGCCAAGGAGTTGGAGTACTTCGCCAAGGCCT TGGAGAACCCTACCAGACCATTCTTGGCCATCTTGGGTGGTGCCAA GGTCTCCGACAAGATCCAGTTGATCGACAACTTGTTGGACAAGGTC GACATCTTGATTGTTGGTGGTGGTATGGCTTTCACCTTCAAGAAGG TTTTGGACAACATGCCAATTGGTACTTCTCTTTTCGACGAGGCCGG CTCCAAGAACGTCGAGAACTTGATTGCCAAGGCTAAGAAGAACAAC GTCGAGATTGTCTTGCCCGTTGACTTTGTCACCGCTGACGACTTCA ACAAGGATGCCAACACTGGTGTTGCCACCCAAGAGGAGGGTATCCC AGACGGATGGATGGGTCTTGATGCCGGTCCAAAGTCCAGAGAACTC TTTGCTGAGGCTGTTGCTAAGGCCAAGACCATTGTCTGGAACGGCC CACCAGGTGTTTTCGAGTTTGAGAAATTCGCTCAGGGCACCAAGTC CTTGTTGGACGCTGCCGTCAAGTCCGCCGAGGCTGGCAACACCGTC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 212/248
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Descrição Sequência
ATCATTGGCGGTGGTGACACTGCCACTGTTGCCAAGAAGTTCGGTG TCGTTGAGAAGTTGTCTCACGTCTCCACTGGTGGTGGTGCCTCCTT GGAGTTGTTGGAGGGTAAGGAGTTGCCAGGTGTCGTTGCCATTTCT GACAAGCAGTAA (SEQ ID NO: 67)
Sequência nucleotidica do gene QUP2 de HO Metschnikowia sp. ATGGGCTTTCGCAACTTAAAGCGCAGGCTCTCAAATGTTGGCGACT CCATGTCAGTGCACTCTGTGAAAGAGGAGGAAGACTTCTCCCGCGT GGAAATCCCGGATGAAATCTACAACTATAAGATCGTCCTTGTGGCT TTAACAGCGGCGTCGGCTGCCATCATCATCGGCTACGATGCAGGCT TCATTGGTGGCACGGTTTCGTTGACGGCGTTCAAACTGGAATTTGG CTTGGACAAAATGTCTGCGACGGCGGCTTCTGCTATCGAAGCCAAC GTTGTTTCCGTGTTCCAGGCCGGCGCCTACTTTGGGTGTCTTTTCT TCTATCCGATTGGCGAGATTTGGGGCCGTAAAATCGGTCTTCTTCT TTCCGGCTTTCTTTTGACGTTTGGTGCTGCTATTTCTTTGATTTCG AACTCGTCTCGTGGCCTTGGTGCCATATATGCTGGAAGAGTACTAA CAGGTTTGGGGATTGGCGGATGTCTGAGTTTGGCCCCAATCTACGT TTCTGAAATCGCGCCTGCAGCAATCAGAGGCAAGCTTGTGGGCTGC TGGGAAGTGTCATGGCAGGTGGGCGGCATTGTTGGCTACTGGATCA ATTACGGAGTCTTGCAGACTCTTCCGATTAGCTCACAACAATGGAT CATCCCGTTTGCTGTACAATTGATCCCATCGGGGCTTTTCTGGGGC CTTTGTCTTTTGATTCCAGAGCTGCCACGTTTTCTTGTATCGAAGG GAAAGATCGATAAGGCGCGCAAAAACTTAGCGTACTTGCGTGGACT TAGCGAGGACCACCCCTATTCTGTTTTTGAGTTGGAGAACATTAGT AAGGCCAT T GAAGAGAAC T T CGAGCAAACAGGAAGGGGT T T T T T CG ACCCATTGAAAGCTTTGTTTTTCAGCAAAAAAATGCTTTACCGCCT TCTCTTGTCCACGTCAATGTTCATGATGCAGAATGGCTATGGAATC AATGCTGTGACATACTACTCGCCCACGATCTTCAAATCCTTAGGCG TTCAGGGCTCAAACGCCGGTTTGCTCTCAACAGGAATTTTCGGTCT TCTTAAAGGTGCCGCTTCGGTGTTCTGGGTCTTTTTCTTGGTTGAC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 213/248
210/227
Descrição Sequência
ACATTCGGCCGCCGGTTTTGTCTTTGCTACCTCTCTCTCCCCTGCT CGATCTGCATGTGGTATATTGGCGCATACATCAAGATTGCCAACCC TTCAGCGAAGCTTGCTGCAGGAGACACAGCCACCACCCCAGCAGGA ACTGCAGCGAAAGCGATGCTTTACATATGGACGATTTTCTACGGCA TTACGTGGAATGGTACGACCTGGGTGATCTGCGCGGAGATTTTCCC CCAGTCGGTGAGAACAGCCGCGCAGGCCGTCAACGCTTCTTCTAAT TGGTTCTGGGCTTTCATGATCGGCCACTTCACTGGCCAGGCGCTCG AGAATATTGGGTACGGATACTACTTCTTGTTTGCGGCGTGCTCTGC AATCTTCCCTGTGGTAGTCTGGTTTGTGTACCCCGAAACAAAGGGT GTGCCTTTGGAGGCCGTGGAGTATTTGTTCGAGGTGCGTCCTTGGA AAGCGCACTCATATGCTTTGGAGAAGTACCAGATTGAGTACAACGA GGGTGAATTCCACCAACATAAGCCCGAAGTACTCTTACAAGGGTCT GAAAACTCGGACACGAGCGAGAAAAGCCTCGCCTGA (SEQ ID NO: 68)
Sequência nucleotidica do gene RPB1 de HO Metschnikowia sp. ATGGACCAGACAACCAAGAAACCCAGAGATGGTGGCTTGAACGATC CACGTTTGGGCTCCATCGACCGTAACTTCAAGTGTCAAACCTGTGG CGAAGATATGGCTGAATGTCCGGGCCATTTTGGCCACATTGAGTTG GCCAAGCCCGTGTTTCACATCGGTTTTATTGCCAAGATCAAGAAAG TGTGCGAGTGTGTTTGTATGCACTGTGGAAAACTTCTTGTTGACGA TGCTAACCCCTTGATGGCTCAGGCCATTCGGATCAGGGATCCGAAG AAGCGCTTCAACGCCGTGTGGAACGTGTCCAAGACCAAGATGGTGT GTGAAGCAGACACTATCAATGAAGAAGGCCAGGTCACAGCCGGGAG AGGAGGATGTGGCCACACGCAGCCAACTGTGCGCAGAGACGGCTTG AAGTTGTGGGGTACTTGGAAACAGAACAAAACTTACGACGAGAACG AACAGCCAGAACGTCGTTTGTTAAGTCCATCAGAGATTTTGAGCGT TTTCAGACACATCAGCCCCGAGGACTGTCATAAGTTGGGCTTTAAC GAGGACTATGCCAGACCTGAGTGGATGTTGATCACGGTTTTGCCTG TCCCACCACCACCAGTGAGGCCTTCCATTGCCTTTAACGATACGGC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 214/248
211/227
Descrição Sequência
TAGAGGT GAGGAT GAT T T GACGT T CAAGT T GGC T GAGAT T C T CAAA GCAAATATCAACGTACAGCGTCTTGAAATCGACGGTTCGCCACAGC ACGTCATCAGTGAGTTCGAGGCTTTGTTACAGTTTCATGTGGCGAC TTACATGGATAATGATATCGCTGGCCAGCCTCAGGCGCTTCAAAAG ACCGGTCGTCCTATCAAATCGATCAGAGCCAGATTGAAGGGTAAAG AGGGGAGATTGAGAGGTAACTTGATGGGCAAACGTGTGGACTTTTC TGCGCGTACTGTTATTTCTGGTGACCCCAATCTCGACCTTGACCAG GTCGGTGTGCCTATATCCATTGCTAGGACTTTGACTTATCCTGAGG TTGTCACCCCATACAACATTCACAAATTGACCGAGTATGTTCGCAA TGGCCCTAATGAGCACCCTGGTGCGAAATATGTCATTCGTGACACC GGTGACCGTATTGATCTAATGTACAACAAAAGGGCGGGTGACATTG CCTTGCAGTATGGGTGGAAGGTTGAACGTCATTTGATGGACGACGA TCCAGTTTTGTTTAATCGTCAACCCTCCTTGCATAAGATGTCCATG ATGGCACATCGAGTCAAAGTCATGCCCTACTCCACATTCAGATTGA ATTTGTCCGTCACTTCTCCTTACAATGCTGATTTCGATGGTGATGA GATGAACTTACATGTTCCTCAGTCGCCTGAGACCAGAGCCGAGATG TCTCAAATTTGCGCGGTTCCGCTTCAAATCGTCTCTCCACAATCGA ACAAACCTGTGATGGGTATTGTGCAAGACACATTGTGTGGTATCCG TAAAATGACATTACGCGACAATTTCATTGAATATGAGCAAGTCATG AACATGTTGTACTGGATCCCTAACTGGGATGGTGTCATTCCTCCGC CGGCGGTACTCAAGCCCAAGCCATTGTGGTCGGGTAAACAGTTGTT GTCTATGGCCATTCCCAAGGGTATTCACTTGCAGAGGTTCGATGAC GGAAGGGACATGCTCAGTCCAAAAGATCTGGGGATGTTGATTGTTG ACGGTGAGATCATCTTTGGTGTTGTTGACAAAAAAACCGTCGGCGC CACTGGAGGCGGATTGATCCACACGGTCATGAGAGAGAAGGGTCCA TACGTCTGTGCGCAGCTTTTCAGCTCGATCCAGAAGGTTGTCAATT ATTGGCTTTTGCATAATGGTTTCTCTATCGGTATTGGTGACACAAT TGCCGACAAAGACACCATGCGTGATGTGACAACGACCATTCAAGAG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 215/248
212/227
Descrição Sequência
GCCAAACAGAAGGTCCAGGAAATCATCATTGACGCCCAGCAAAACA AGTTGGAGCCTGAACCCGGTATGACTCTCAGAGAATCGTTCGAGCA TAATGTTTCCCGTATTCTCAATCAAGCTCGTGATACTGCTGGCCGT T 0 0 GO T G AAAT G AAC T T G AAGG AT C T G AAC AAC G T G AAAC AG AT GG TCACATCCGGATCGAAAGGTTCTTTCATCAACATCTCTCAAATGTC TGCCTGTGTCGGTCAACAAATTGTTGAGGGTAAGCGTATTCCCTTC GGTTTTGGTGATCGTACGTTACCTCATTTTACCAAGGATGACTACT CGCCTGAATCGAAGGGTTTTGTTGAGAACTCGTACCTCAGAGGCTT GACTCCCCAGGAGTTTTTCTTTCACGCTATGGCAGGAAGAGAAGGT CTTATTGATACTGCCGTCAAGACTGCAGAAACAGGTTACATCCAGC GTCGTTTAGTCAAAGCTTTGGAAGATATTATGGTGCATTATGATGG CACAACCAGAAACTCTTTAGGCGACATCATCCAGTTTGTTTATGGT GAGGACGGAATTGATGCTACATCGGTTGAAAAGCAATCAGTTGATA CTATACCCGGTTCAGACTCCTCGTTTGAGAAGCGCTACAGAATTGA CGTTTTGGACCCAGCTAAATCCATTCCTGAGTCGTTGCTAGAGTCA GGCAAGCAAATCAAGGGAGATGTGGCAGTTCAGAAGGTGTTGGATG AAGAGTACGACCAATTGCTCAAGGATCGTAAGTTCTTGAGAGAGGT TGTTTTCCCCAATGGTGACTACAACTGGCCATTACCCGTTAATTTG CGTCGTATTATTCAAAATGCTCAGCAGATTTTCCACAGTGGCCGTC AAAAAGCTTCCGACTTAAGATTGGAAGAGATAGTCGAAGGCGTGCA GTCCCTTTGTACCAAGCTTCTTGTTCTCCGAGGAAAGACGGAGCTC ATCAAGGAGGCGCAGGAAAATGCGACTTTGCTTTTCCAGTGCTTGT TGAGATCTAGGTTGGCTGCTCGTCGTGTCATTGAGGAGTTCAAGCT CAATAAGGTCTCTTTTGAATGGGTATGTGGTGAAATCGAGTCCCAG TTTCAGAAGTCTATTGTACACCCAGGTGAGATGGTTGGTGTTGTCG CTGCGCAGTCTATCGGTGAGCCTGCGACGCAGATGACTTTAAACAC CTTCCATTACGCCGGTGTCTCTTCCAAAAACGTTACCCTTGGTGTC CCTCGTCTTAAGGAAATTTTGAATGTGGCGAAAAACATCAAAACGC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 216/248
213/227
Descrição Sequência
CGGCTCTTACCGTGTACTTGGAGCCCGAGATCGCTGTTGACATTGA AAAGGCCAAGGTTGTTCAATCGGCTATTGAACACACCACGTTGAAG AACGTGACCTCGTCCACAGAAATCTACTACGATCCTGATCCTAGAA GCACCGTGATTGAGGAAGATTATGATACTGTTGAAGCTTACTTTGC CATTCCCGACGAGAAGGTCGAGGAAACTATCGACAATCAGTCTCCA TGGTTGCTTCGTCTTGAATTGGACAGAGCCAAAATGTTGGATAAGC AACTTACGATGGCTCAAGTGGCCGAGAAGATTTCGCAGAACTTTGG AGAAGACTTGTTCGTTATTTGGTCTGATGACACTGCAGACAAGTTG ATCATCCGTTGTCGTGTTATCCGCGATCCAAAATTGGAAGAGGAAG GCGAGCACGAGGAGGACCAAATTTTGAAGAGAGTGGAGGCCCACAT GTTGGAGACAATCTCATTGCGTGGTATCCCTGGTATCACGAGAGTC TTTATGATGCAACATAAGATGAGCACGCCAGATGCGGATGGTGAAT TTCTGCAAAAGCAAGAATGGGTTTTGGAAACTGATGGTGTAAACTT GGCCGAGGTCATCACTGTTCCTGGCGTCGATGCATCCCGAACCTAT TCCAACAACTTCATCGAGATTCTTTCTGTGCTCGGTATTGAGGCGA CTCGTACTGCTTTGTTCAAGGAAATTCTCAATGTCATTGCATTTGA CGGTTCATACGTCAACTACCGTCATATGGCTTTGCTTGTGGACGTC ATGACTGCACGTGGTCATTTGATGGCTATCACCCGTCATGGTATTA ACAGAGCGGAAACTGGTGCTTTGATGCGTTGTTCTTTTGAAGAGAC GGTTGAGATCTTGTTGGATGCTGGTGCCGCTGCTGAACTAGATGAC TGCCGTGGTATCTCCGAGAATGTCATATTAGGACAAATGCCACCTT TGGGTACCGGTGCTTTTGATGTGATGGTCGACGAGAAGATGTTGCA GGACGCAAGTGTGAGTTCTGATATTGGTGTTGCTGGTCAGACTGAC GGAGGTGCGACGCCATATAGAGACTATGAGATGGAGGATGATAAGA TTCAATTTGAGGAAGGTGCGGGATTCTCGCCAATTCATACCGCAAA TGTATCTGATGCCTCTGGGTCTTTAACCTCGTACGGCGGGCAACCA TCCATGGTATCACCTACCTCGCCATTCTCGTTTGGCGCCACGTCTC CTGGGTATGGCGGTGTGACCTCGCCTGCGTACGGCGCAACTTCGCC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 217/248
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Descrição Sequência
AACGTACTCACCAACGTCACCAACATACTCGCCAACTTCGCCCAGT TACTCACCGACGTCACCAAGTTACTCACCGACGTCACCAAGTTACT CACCGACGTCACCAAGTTACTCACCGACGTCACCAAGTTACTCGCC AACATCGCCAAGTTATTCGCCAACTTCACCAAGTTATTCGCCAACT TCGCCAAGTTACTCGCCAACTTCGCCAAGTTATTCGCCTACTTCGC CAAGTTATTCGCCAACTTCGCCAAGTTACTCACCGACGTCACCAAG TTACTCACCGACGTCACCAAGTTACTCACCGACGTCACCAAGTTAC TCGCCTACTTCGCCAAGTTACTCGCCTACTTCGCCAAGTTACTCAC CTACTTCGCCAAGTTATTCGCCTACTTCGCCTAGTTACTCACCTAC TTCGCCGCAGTATTCGCCAACTTCGCCTAGTTACTCTCCGACGTCG CCGCAGTATTCGCCAACTTCGCCAAGCTACTCGCCTACGTCACCGC AATACCTGCCAACGTCGCCAAGTTACTCGCCCACTTCGCCTCAATA CTCTCCAACTTCGCCTCAATACTCGCCGGGCTCACCGGCATATTCA CCAGGC T CACCAC TGTACTCTACT GAGAAGAAGGACGAGGACAAGA AGTGA (SEQ ID NO: 69)
Sequência nucleotidica do gene RPB2 de HO Metschnikowia sp. ATGTCGCAGGAGCCGGTAGAAGACCCTTACGTCTACGACGAGGAGG ACGCGCACAGCATCACGCCCGAGGACTGCTGGACGGTGATTCTGTC GTTTTTCCAGGAAAAAGGCCTTGTCTCACAGCAGTTGGACTCGTTC GACGAGTTCATCGAGTCAAACATCCAGGAGTTGGTGTGGGAGGACT CGCACTTGATTCTCGACCAGCCGGCGCAACATACTTCCGAGGACCA GTATGAAAATAAGCGGTTTGAAATCACGTTTGGCAAGATCTATATT TCGAAGCCAACGCAGACCGAGGGCGACGGAACAACGCACCCGATGT TCCCACAGGAGGCACGCTTGCGTAACTTGACCTACAGCTCGCCGCT T TAC G T GGACAT GC T GAAAAAGAAG TTTCTTTCCGAT GACAGAG T G AGAAAGGGTAACGAGCTAGAATGGGTGGAGGAGAAAGTCGATGGCG AGGAGGCCCAGCTGAAGGTGTTCTTGGGTAAGGTGCCAATCATGCT AAGGTCGAAGTTTTGCATGTTGCGGGACTTGGGCGAGCACGAGTTC TACGAGTTGAAAGAGTGCCCTTACGATATGGGTGGCTATTTCGTCA
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 218/248
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Descrição Sequência
TCAACGGTTCCGAAAAAGTCTTGATCGCCCAGGAGCGCTCGGCGGC TAACATTGTCCAGGTGTTTAAGAAGGCAGCGCCCTCGCCCATCTCG CACGTGGCGGAGATCCGTTCCGCGCTTGAAAAGGGTTCCCGTTTGA TCTCCTCGATGCAGATCAAACTATATGGTCGTGACGACAAGGGCAC CACTGGCAGAACAATCAAGGCCACATTGCCCTACATCAAGGAAGAC ATCCCGATTGTGATTGTATTCAGAGCCCTCGGCGTGGTCCCCGATG GAGACAT T T T GGAACACAT T T GT TACGAT GGAAACGAT T GGCAAAT GTTAGAGATGTTGAAGCCATGTGTGGAGGAAGGTTTCGTGATCCAG GAGCGCGAAGTCGCACTTGACTTTATCGGTAGAAGAGGTGTCTTGG GTATCAGAAGGGAAAAGCGTATCCAGTACGCAAAGGATATTTTACA GAAAGAGTTGTTGCCTAACATCACACAGGAGGCCGGTTTCGAGTCA AGAAAGGCATTCTTCTTGGGTTACATGGTCAACCGTTTGTTGTTAT GT GGAT TAGAAAGAAAGGAGCC T GACGACAGAGAT CAT T T T GGCAA GAAGAGATTGGATTTGGCCGGACCCTTGTTGGCATCCTTGTTCCGT CTCTTATTCAAAAAGCTTACCAGGGATATCTATAACTACATGCAGC GGTGCGTGGAGAATGACAAGGAGTTTAATCTCACGTTGGCGGTCAA GTCACAGACCATCACTGATGGTTTGCGGTACTCGTTGGCCACAGGT AATTGGGGTGAACAAAGAAAGGCCATGAGTGCACGTGCCGGTGTGT CGCAGGTGTTGAACAGATACACATACTCATCGACATTGTCGCATTT GAGAAGAACAAATACTCCAATTGGCCGTGACGGTAAGATCGCCAAA CCTAGACAGTTGCACAACACCCACTGGGGTCTTGTATGTCCTGCAG AAACTCCTGAGGGTCAGGCGTGTGGTTTGGTGAAGAATTTGTCTTT GATGACGTGTATATCCGTTGGTACCTCTTCCGAGCCGATCTTGTAT TTCTTGGAAGAGTGGGGTATGGAACCCTTGGAGGACTATGTTCCTT CGAACGCACCAGACTGCACAAGAGTCTTTGTCAACGGTGTATGGGT TGGCACACACAGAGAACCGGCACAGCTTGTCGATACCATGAGGAGG TTGAGAAGGAAGGGCGATATCTCTCCCGAGGTGTCGATCATCAGGG ACATCAGAGAAATGGAGTTCAAGATCTTCACCGATGCAGGCCGTGT
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 219/248
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Descrição Sequência
CTACCGTCCGTTGTTCATCGTGGACGACGACCCAGAGTCCGAAACC AAGGGTGAGTTGATGTTGCAAAAAGAGCACGTGCACAAGTTGTTGA ACTCGGCCTACGATGAATATGACGAGGATGACTCCAATGCGTACAC ATGGTCGTCGTTGGTGAATGATGGTGTGGTAGAGTACGTTGACGCC GAGGAGGAGGAGACAATCATGATCGCCATGACCCCAGAGGATTTGG AGGCTTCCAAGAGTGCGTTGTCGGAGACTCAGCAACAGGATCTTCA AATGGAGGAACAAGAGCTTGATCCTGCAAAGCGAATCAAACCAACT TATACCTCATCCACACACACCTTCACGCATTGTGAGATTCATCCTT CGATGATTTTGGGTGTCGCCGCCTCTATCATTCCGTTCCCCGACCA TAACCAGTCGCCGCGTAACACATACCAGTCTGCTATGGGTAAACAA GCCATGGGTGTATTTTTGACTAACTATGCCGTTAGAATGGACACAA TGGCAAATATCTTATACTACCCACAGAAACCCTTGGCCACAACAAG AGCCATGGAGCACTTGAAGTTCCGTGAGTTGCCTGCTGGTCAGAAT GCAGTGGTGGCCATTGCTTGTTACTCCGGCTACAACCAAGAAGATT CCATGATCATGAACCAGTCGTCGATTGATAGAGGATTGTTCCGGTC TTTGTTTTT GAGAT 0 T TACAT GGAT C TAGAGAAGAGACAAGGTAT G AAAGC C T T GGAGAC G T T T GAAAAGC CAT C GAGAT C T GACAC C T T GA GATTGAAGCATGGAACCTACGAAAAGTTAGATGACGATGGTTTGAT CGCGCCTGGTGTCAGGGTCAGTGGTGAGGATATCATCATCGGTAAA ACCACACCTATTCCACCTGACACCGAGGAGTTGGGTCAGAGAACCC AGTATCATACCAAGAGAGATGCCTCGACGCCATTGAGAAGCACGGA GTCTGGTATTGTTGACCAGGTTCTTTTGACCACAAATGGTGACGGC GC CAAG T T C G T CAAGG T CAGAAT GAGAAC GAC GAAGG T T C CACAAA TCGGTGACAAGTTTGCCTCCAGACACGGACAAAAGGGTACAATCGG TGTCACATATAGACACGAGGATATGCCTTTCAGTGCACAGGGTATT GTGCCTGACTTGATCATAAACCCGCATGCTATTCCATCTCGTATGA CAGTCGCTCACTTGATCGAGTGTTTGTTGTCGAAAGTCTCTTCCTT GTCCGGATTGGAAGGTGACGCCTCGCCATTCACGGACGTCACAGCC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 220/248
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Descrição Sequência
GAGGCTGTTTCCAAATTGTTGAGAGAGCACGGATACCAATCTAGAG GTTTCGAGGTGATGTACAATGGTCACACCGGTAAGAAGATGATGGC GCAAGTGTTCTTTGGCCCAACGTACTACCAGAGATTGAGGCATATG GTGGATGACAAGATCCACGCTAGAGCCAGAGGTCCAGTTCAAGTTT TGACCAGGCAGCCTGTGGAAGGTAGATCCAGGGATGGTGGATTACG TTTCGGAGAGATGGAGAGAGATTGTATGATTGCGCACGGAGCTGCT GGATTCTTAAAGGAAAGATTGATGGAGGCTTCGGATGCTTTCAGAG TTCACGTTTGTGGAATCTGTGGTTTGATGTCGGTGATTGCAAACTT GAAGAAGAACCAGTTCGAGTGTCGGTCGT G CAAAAACAAGAC CAAC ATTTACCAGATCCACATTCCATACGCAGCCAAATTGTTGTTCCAGG AGTTGATGGCCATGAACATTTCTCCTAGATTGTACACGGAGAGATC AGGAATCAGTGTGCGTGTCTGA (SEQ ID NO: 70)
Sequência nucleotidica do gene TEF1 de HO Metschnikowia sp. ATGGGTAAAGAAAAGTCGCACGTCAACGTCGTTGTCATTGGACACG TCGATTCCGGTAAGTCTACTACCACCGGTCACTTGATCTACAAGTG TGGTGGTATTGACAAGAGAACTATCGAGAAGTTCGAGAAGGAGGCC GCCGAGTTGGGTAAGGGTTCTTTCAAGTACGCTTGGGTGTTGGACA AGT T GAAGGC T GAGAGAGAGAGAGGTAT CAC TAT CGACAT T GCC T T GTGGAAGTTCGAGACTCCTAAGTACCACGTCACCGTCATTGACGCC CCAGGTCACAGAGATTTCATCAAGAACATGATCACTGGTACTTCCC AGGCTGACTGTGCTATCTTGATCATCGCCGGTGGTGTTGGTGAGTT CGAGGCTGGTATCTCCAAGGATGGCCAGACCAGAGAGCACGCTTTG TTGGCTTACACCTTGGGTGTTAGACAATTGATTGTTGCCGTCAACA AGAT GGAC T C C G T CAAG T GGGACAAGAACAGAT T T GAGGAGAT CAT CAAGGAGACCTCTAACTTCGTCAAGAAGGTTGGTTACAACCCTAAG ACTGTGCCATTCGTGCCAATCTCTGGTTGGAACGGTGACAACATGA TTGAGGCTTCCACCAACTGCCCATGGTACAAGGGTTGGGAGAAGGA GACCAAGGCCGGTAAGTCTTCCGGTAAGACCTTGTTGGAGGCCATT GACGCCATTGAGCCACCAACCAGACCTACCGACAAGGCCTTGAGAT
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 221/248
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Descrição Sequência
TGCCTTTGCAGGATGTCTACAAGATCGGTGGTATCGGAACGGTGCC AGTCGGCCGTGTCGAGACCGGTGTCATCAAGGCCGGTATGGTCGTC ACCTTCGCCCCAGCTGGTGTCACCACTGAGGTCAAGTCCGTCGAGA TGCACCACGAGCAGTTGGTTGAGGGTCTTCCAGGTGACAACGTTGG TTTCAACGTCAAGAACGTCTCTGTTAAGGAGATCAGAAGAGGTAAC GTCTGTGGTGACTCCAAGCAGGACCCACCAAAGGCTGCCGCTTCTT TCACCGCTCAGGTTATTGTGTTGAACCACCCTGGTCAGATCTCCTC TGGTTACTCTCCAGTGTTGGACTGTCACACCGCCCACATTGCCTGT AAAT T C GACAC C T T G T T GGAGAAGAT T GACAGAAGAAC T GG TAAG T CCTTGGAGTCTGAGCCTAAGTTCGTCAAGTCTGGTGACGCCGCCAT TGTCAAGATGGTGCCAACCAAGCCAATGTGTGTTGAGGCTTTCACC GACTACCCACCTTTGGGTAGATTCGCCGTCAGAGACATGAGACAGA CTGTTGCTGTCGGTGTCATCAAGGCCGTCGAGAAGTCCGACAAGGC TGGTAAGGTCACCAAGGCTGCTCAGAAGGCTGCCAAGAAGTAA (SEQ ID NO: 71)
Sequência nucleotidica do gene TPI1 de HO Metschnikowia sp. ATGGCTCGTCAATTTTTCGTCGGAGGTAACTTCAAAATGAACGGCA CTAAGGAGTCGCTCACCGCCATTGTCGACACCTTGAACAAGGCCGA CTTGCCCGAGAACGTCGAGGTGGTGATTGCTCCCCCAGCCCCATAC CTTTCCCTCGTGGTCGAGGCCAACAAGCAGAAGACCGTGGAGGTCG CTGCTCAAAACGTGTTCAGCAAGGCCTCCGGTGCCTACACAGGTGA GATTGCTCCTCAGCAATTGAAGGACTTGGGCGCCAACTGGACCTTG ACCGGCCACTCTGAGAGAAGAACGATCATCAAGGAGTCCGACGAGT TCATCGCCGAGAAGACCAAGTTTGCTTTGGAGTCTGGTGTTAGCGT CATCTTGTGTATCGGTGAGACCTTGGAGGAGAAGAAGGCTGGCATC ACGCTTGAGGTGTGCGCCAGACAATTGGACGCTGTGTCCAAGATTG TTTCCGACTGGACCAACGTCGTCATTGCTTACGAGCCCGTCTGGGC TATTGGTACTGGCTTGGCCGCCACTGCCCAGGATGCTCAGGACATC CACAAGGAGATCAGAGCCCACTTGTCTAAGACCATTGGCGCTGAAC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 222/248
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Descrição Sequência
AAGCCGAGGCCGTCAGAATCTTGTACGGTGGTTCCGTCAACGGCAA AAACGCTGTTGACTTCAAGGACAAGGCTGATGTTGACGGATTCTTG GTTGGCGGTGCCTCCTTGAAGCCAGAGTTCATTGACATCATCAAGT CTAGATTGTAA (SEQ ID NO: 72)
Sequência nucleotidica do gene XKS1 de HO Metschnikowia sp. ATGACTTATAGTTCCAGCTCTGGCCTCTTTTTGGGCTTCGACTTGT CGACGCAGCAGCTTAAAATCATTGTGACAAACGAGAACTTGAAGGC GCTTGGTACCTACCATGTTGAGTTTGATGCTCAATTCAAAGAGAAA TACGCGATCAAAAAGGGTGTTTTGTCAGATGAAAAAACGGGCGAGA TTTTATCACCCGTGCACATGTGGCTAGAGGCAATTGACCATGTCTT TGGGTTGATGAAAAAAGACAATTTCCCCTTCGGAAAAGTGAAAGGC ATAAGCGGTTCAGGGATGCAGCACGGATCGGTCTTTTGGTCGAAGT CTGCTTCTTCATCCTTAAAGAATATGGCCGAATATTCCTCTTTAAC AGAAGCCTTGGCTGATGCCTTTGCGTGTGATACTTCTCCCAACTGG CAGGAC CAT T C GACAGGGAAAGAAAT CAAAGAC T T T GAGAAAG T C G TTGGAGGCCCGGACAAATTGGCGGAAATTACAGGCTCAAGAGCTCA CTACAGGTTCACTGGGTTGCAGATTCGGAAGTTGGCAGTGAGATCT GAGAAT GAC G T T TAC CAGAAAAC C GATAGAATAT CTTTGGTGTCGA GTTTTGTTGCGTCCGTTCTTTTGGGCAGGATCACCACAATTGAGGA GGCGGACGCTTGCGGAATGAATTTATACAATGTGACCGAGTCTAAG CTTGATGAAGATTTGTTAGCAATCGCTGCAGGGGTGCATCCAAAGC TCGATAACAAATCCAAAAGGGAAACAGACGAGGGTGTCAAAGAACT AAAGC GAAAGAT T GG T GAGAT CAAAC C C G T GAG T TAT CAGAC T T C G GGCTCAATCGCACCATATTTTGTCGAGAAATACGGCTTCTCTCCAG ATTCGAAGATTGTTTCGTTTACGGGTGATAATCTTGCGACCATCAT CTCTTTGCCTTTGAGAAAAAACGACGTCTTGGTGTCACTAGGCACA TCCACCACCGTACTTTTGGTGACCGAGAGCTACGCGCCTTCTTCGC AGTATCATCTTTTCAAGCATCCTACAATTAAGAATGCTTACATGGG AATGATTTGCTACAGTAATGGCGCGCTAGCAAGAGAAAGAGTTCGT
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 223/248
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Descrição Sequência
GACGCCATCAATGAGAAGTATGGTGTGGCAGGGGATTCTTGGGACA AGTTCAATGAGATCTTGGATCGCTCAGGCGACTTCAACAATAAGTT GGGTGTTTACTTTCCCATCGGTGAAATTGTGCCCAATGCTCCGGCC C AG AC AAAG AG AAT GG AAAT G AAC T C GC AT G AGG AT G T G AAAG AG A TCGAAAAGTGGGATTTGGAAAACGATGTCACTTCTATTGTTGAGTC ACAAACCGTTAGTTGCCGAGTGAGAGCGGGCCCAATGCTTTCTGGA TCGGGTGACTCGAATGAAGGAACGCCCGAAAATGAAAATAGGAAAG TCAAAACACTCATCGACGATTTACACTCTAAGTTCGGCGAAATTTA CACAGACGGGAAACCTCAGAGCTACGAGTCTTTGACTTCGAGGCCG CGGAACATCTACTTTGTCGGAGGGGCTTCAAGAAACAAGAGTATCA TACACAAGATGGCTTCGATCATGGGTGCTACCGAAGGAAACTTTCA GGTTGAGATTCCGAATGCGTGTGCTCTTGGCGGCGCCTACAAGGCA AGCTGGAGCCTTGAGTGTGAGAGCAGACAAAAGTGGGTGCACTTCA ATGATTACCTCAATGAGAAGTACGATTTCGATGATGTGGATGAGTT CAAAGTGGACGACAAATGGCTCAACTATATTCCGGCGATTGGCTTG TTGTCGAAATTGGAAAGCAACCTTGACCAGAACTAA (SEQ ID NO: 73)
Sequência nucleotidica do gene XYL1 de HO Metschnikowia sp. ATGGCTACTATCAAATTGAACTCTGGATACGACATGCCCCAAGTGG GTTTTGGGTGCTGGAAAGTAACTAACAGTACATGTGCTGATACGAT CTACAACGCGATCAAAGTTGGCTACAGATTATTTGATGGCGCTGAA GATTACGGGAACGAGAAAGAGGTGGGCGAAGGAATCAACAGGGCCA TTGACGAAGGCTTGGTGGCACGTGACGAGTTGTTCGTGGTGTCCAA GCTCTGGAACAACTTCCATCATCCAGACAACGTCGAGAAGGCGTTG GACAAGACTTTGGGCGACTTGAATGTCGAGTACTTGGACTTGTTCT TGATCCATTTCCCAATTGCGTTCAAATTCGTGCCCTTTGAGGAGAA ATACCCGCCCGGCTTCTACTGTGGAGAAGGCGATAAGTTTATCTAC GAGGATGTGCCTTTGCTTGACACGTGGCGGGCATTGGAGAAGTTTG TGAAGAAGGGTAAGATCAGATCCATCGGAATCTCGAACTTTTCCGG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 224/248
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Descrição Sequência
CGCGTTGATCCAGGACTTGCTCAGGGGCGCCGAGATCCCCCCTGCC GTGTTGCAGATTGAGCACCACCCATACTTGCAGCAGCCCAGATTGA TTGAGTATGTGCAGTCCAAGGGTATTGCCATCACAGCCTACTCCTC TTTTGGCCCACAGTCGTTTGTGGAGTTGGACCACCCCAAGGTCAAG GAGTGTGTCACGCTTTTCGAGCACGAAGACATTGTTTCCATCGCTA AAGCTCACGACAAGTCCGCGGGCCAGGTATTATTGAGGTGGGCCAC GCAAAGGGGTCTTGCCGTGATTCCAAAGTCAAACAAAACCGAGCGT TTGTTGCTGAATTTGAATGTGAACGATTTTGATCTCTCTGAAGCAG AATTGGAGCAAATCGCAAAGTTGGACGTGGGCTTGCGCTTCAACAA CCCTTGGGACTGGGACAAGATTCCAATCTTCCATTAA (SEQ ID NO: 74)
Sequência nucleotidica do gene XYL2 de HO Metschnikowia sp. ATGCCTGCTAACCCATCCTTGGTTTTGAACAAAGTGAACGACATCA CGTTCGAGAACTACGAGGTTCCGTTACTCACAGACCCCAACGATGT ATTGGTTCAGGT GAAAAAGAC T GGAAT CTGTGGATCT GACAT C CAC TACTACACCCACGGCAGAATTGGCGACTTCGTGTTGACAAAGCCAA TGGTTTTGGGCCACGAATCCGCCGGTGTGGTCGTGGAGGTCGGCAA AGGTGTCACTGACTTGAAGGTTGGTGATAAGGTTGCCATTGAGCCC GGAGTGCCTTCTCGCACCAGTGACGAGTACAAGAGTGGCCACTACA ACTTGTGCCCACACATGTGTTTTGCCGCCACGCCCAACTCTAACCC CGACGAGCCAAACCCGCCAGGGACTTTGTGCAAATATTACAAGTCC CCAGCGGACTTCTTGGTGAAATTGCCTGAGCACGTCTCCCTTGAGT TGGGCGCTATGGTCGAGCCTTTGACTGTCGGTGTGCACGCCTCGCG TTTGGGCCGTGTCACTTTTGGTGACCACGTTGTGGTTTTCGGTGCT GGCCCAGTCGGTATCCTTGCGGCTGCCGTGGCCAGAAAGTTTGGCG CTGCCAGCGTGACTATCGTCGACATCTTCGACAGCAAATTGGAATT GGCCAAGTCCATTGGCGCGGCCACTCACACATTCAACTCAATGACT GAGGGTGTTCTTTCGGAGGCTTTGCCCGCGGGCGTGAGACCTGACG TTGTATTGGAGTGCACTGGAGCAGAGATCTGTGTGCAGCAAGGTGT
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 225/248
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Descrição Sequência
ACTTGCGTTGAAGGCTGGTGGCCGCCACGTGCAAGTTGGAAATGCC GGCTCCTATCTCAAATTCCCCATCACCGAATTTGTTACCAAGGAGT TGACTCTCTTTGGATCCTTCCGTTACGGTTACAACGACTACAAGAC GTCGGTCGCCATCTTGGACGAGAATTACAAGAACGGGAAGGAGAAT GCGTTGGTGGACTTTGAAGCCTTGATTACTCACCGTTTCCCCTTCA AGAATGCCATTGAGGCTTACGACGCGGTGCGCGCTGGCGACGGAGC TGTCAAGTGTATCATTGACGGCCCAGAGTAA (SEQ ID NO: 75)
Sequência nucleotidica do gene XYT1 de HO Metschnikowia sp. ATGGGTTACGAGGAAAAGCTTGTAGCGCCCGCGTTGAAATTCAAAA ACTTTCTTGACAAAACCCCCAATATTCACAATGTCTATGTCATTGC CGCCATCTCCTGTACATCAGGTATGATGTTTGGATTTGATATCTCG TCGATGTCTGTCTTTGTCGACCAGCAGCCATACTTGAAGATGTTTG ACAACCCTAGTTCCGTGATTCAAGGTTTCATTACCGCGCTGATGAG TTTGGGCTCGTTTTTCGGCTCGCTCACATCCACGTTCATCTCTGAG CCTTTTGGTCGTCGTGCATCGTTGTTCATTTGTGGTATTCTTTGGG TAATTGGAGCAGCGGTTCAAAGTTCGTCGCAGAACAGGGCCCAATT GATTTGTGGGCGTATCATTGCAGGATGGGGCATTGGCTTTGGGTCA TCGGTGGCTCCTGTTTACGGGTCCGAGATGGCTCCGAGAAAGATCA GAGGCACGATTGGTGGAATCTTCCAGTTCTCCGTCACCGTGGGTAT CTTTATCATGTTCTTGATTGGGTACGGATGCTCTTTCATTCAAGGA AAGGCCTCTTTCCGGATCCCCTGGGGTGTGCAAATGGTTCCCGGCC TTATCCTCTTGATTGGACTTTTCTTTATTCCTGAATCTCCCCGTTG GTTGGCCAAACAGGGCTACTGGGAAGACGCCGAAATCATTGTGGCC AATGTGCAGGCCAAGGGTAACCGTAACGACGCCAACGTGCAGATTG AAAT GT CGGAGAT TAAGGAT CAAT T GAT GC T T GACGAGCAC T T GAA GGAGTTTACGTACGCTGACCTTTTCACGAAGAAGTACCGCCAGCGC ACGATCACGGCGATCTTTGCCCAGATCTGGCAACAGTTGACCGGTA TGAATGTGATGATGTACTACATTGTGTACATTTTCCAGATGGCAGG
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 226/248
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Descrição Sequência
CTACAGCGGCAACACGAACTTGGTGCCCAGTTTGATCCAGTACATC ATCAACATGGCGGTCACGGTGCCGGCGCTTTTCTGCTTGGATCTCT TGGGCCGTCGTACCATTTTGCTCGCGGGTGCCGCGTTCATGATGGC GTGGCAATTCGGCGTGGCGGGCATTTTGGCCACTTACTCAGAACCG GCATATATCTCTGACACTGTGCGTATCACGATCCCCGACGACCACA AGTCTGCTGCAAAAGGTGTGATTGCATGCTGCTATTTGTTTGTGTG CTCGTTTGCATTCTCGTGGGGTGTCGGTATTTGGGTGTACTGTTCC GAGGTTTGGGGTGACTCCCAGTCGAGACAAAGAGGCGCCGCTCTTG CGACGTCGGCCAACTGGATCTTCAACTTCGCCATTGCCATGTTCAC GCCGTCCTCATTCAAGAATATCACGTGGAAGACGTATATCATCTAC GCCACGTTCTGTGCGTGCATGTTCATACACGTGTTTTTCTTTTTCC CAGAAACAAAGGGCAAGCGT T T GGAGGAGATAGGCCAGC T T T GGGA CGAAGGAGTCCCAGCATGGAGGTCAGCCAAGTGGCAGCCAACAGTG CCGCTCGCGTCCGACGCAGAGCTTGCACACAAGATGGATGTTGCGC ACGCGGAGCACGCGGACTTATTGGCCACGCACTCGCCATCTTCAGA CGAGAAGACGGGCACGGTCTAA (SEQ ID NO:76)
Sequência nucleotidica do gene TALI de HO Metschnikowia sp. ATGTCTAACTCTTTGGAATCCTTGAAAGCTACCGGCACCGTGATCG TCACCGACACTGGTGAGTTCGACTCGATTGCCAAGTACACCCCACA AGATGCCACCACCAACCCTTCGTTGATTTTAGCCGCCTCGAAAAAG GCTGAGTACGCCAAGGTGATTGATGTTGCTATTAAATACGCCGAGG ACAAGGGCAGCAACCCTAAGGAGAAGGCCGCCATTGCCTTGGACAG ATTGTTGGTGGAGTTCGGTAAGGAAATCTTGCTGATTGTGCCTGGC AGAGTGTCTACCGAGGTTGACGCCAGATTGTCGTTTGACAAGGACG CCACCGTCAAGAAGGCGCTTGAGATCATCGAATTGTACAAGTCCAT TGGCATCTCGAAGGACAGAGTGTTGATCAAGATCGCTTCCACCTGG GAAGGTATCCAGGCCGCCAAGGAGTTGGAGGCCAAGCACGACATCC ACTGTAACTTGACGCTTTTGTTCAGTTTCGTGCAGGCGGTGGCGTG TGCCGAGGCCAAGGTCACTTTGATCTCGCCTTTCGTCGGCAGAATC
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 227/248
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Descrição Sequência
TTGGACTGGTACAAGGCCTCCACCGGCAAGGAGTACGATGCCGAGT CCGACCCTGGTGTTGTGTCTGTCAGACAGATCTACAACTACTACAA GAAGTACGGCTACAACACGATTGTCATGGGCGCGTCTTTCAGAAAC ACTGGCGAGATCAAGGCCTTGGCTGGCTGCGACTACTTGACTGTGG CCCCTAAGTTGTTGGAGGAGTTGATGAACTCTTCCGAGGAGGTGCC TAAGGTGTTGGACGCTGCCTCGGCCAGCTCCGCGTCTGAGGAGAAG GTTTCCTACATTGACGACGAGAGCGAGTTCAGATTCTTGTTGAACG AGGACGCCATGGCCACCGAGAAGTTGGCCCAGGGTATCAGAGGCTT TGCCAAGGACGCCCAGACCTTGTTGGCCGAGTTGGAGAACAGATTC AAGTAG (SEQ ID NO: 77)
Sequência nucleotidica do gene TKL1 de HO Metschnikowia sp. ATGTCCGACATCGATCAATTGGCTATTTCTACCATCCGTTTGTTGG CGGTCGACGCCGTGGCCAAGGCCAACTCTGGTCACCCCGGTGCCCC ATTGGGTCTCGCCCCTGCCGCCCACGCCGTTTGGAAGGAGATGAAA TTCAACCCAAAGAACCCCGACTGGGTCAACAGAGACCGTTTTGTGT TGTCGAACGGTCACGCTTGCGCTTTGTTATACGCCATGTTGCACCT TTACGGCTTCGACATGTCGCTTGACGACTTGAAGCAGTTCCGTCAG T T GAAC T C GAAAACAC C C GGACAT GGC GAGAAG T T T GAAAT C C CAG GTGCCGAGGTCACCACGGGCCCCTTGGGTCAGGGTATCTCCAACGC CGTGGGTTTGGCCATTGCACAGAAGCAATTCGCTGCCACGTTCAAC AAGGACGATTTCGCCATCTCTGACTCGTACACCTACGCCTTCTTGG GTGACGGATGTTTGATGGAGGGTGTCGCCTCGGAAGCATCTTCTTT GGCTGGCCACCTCCAATTGAACAACTTGATTGCGTTCTGGGACGAC AACAAGATCTCGATCGATGGATCCACTGAAGTGGCCTTCACCGAGG ACGTGTTGAAGCGTTACGAGGCTTACGGTTGGGACACGCTCACGAT TGAGAAGGGTGACACTGACTTGGAGGGCGTCGCTCAGGCGATCAAG ACTGCCAAGGCGCTGAAGAAGCCTACTTTGATCCGTTTGACCACCA TCATCGGCTACGGCTCGCTCCAGCAGGGTACCCACGGTGTTCACGG TGCTCCATT GAAGC CAGAT GACAT CAAGCAG T T GAAGGAGAAG T T T
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 228/248
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Descrição Sequência
GGCTTCGACCCAACCAAGTCGTTTGTCGTGCCTCAGGAAGTTTACG ACTACTACGGCACACTCGTAAAGAAGAACCAGGAGTTGGAGTCCGA GTGGAACAAGACCGTCGAGTCCTACATCCAGAAATTCCCAGAGGAG GGCGCTGTCTTGGCGCGCAGACTCAAGGGTGAGTTGCCTGAGGACT GGGCCAAGTGCTTGCCTACTTACACCGCTGATGACAAGCCGTTGGC CACGAGAAAGTTGTCTGAGATGGCTCTCATCAAGATCTTGGATGTC GTTCCAGAGCTTATTGGTGGCTCTGCCGACTTGACCGGCTCGAACT TGACCCGTGCCCCTGACATGGTTGACTTCCAGCCCCCTCAGACCGG CTTGGGTAACTACGCTGGTAGATACATCCGTTACGGTGTGCGTGAG CACGGTATGGGTGCCATCATGAACGGTATCGCCGGTTTTGGTGCTG GTTTCCGTAACTACGGCGGTACCTTCTTGAACTTCGTCTCGTACGC CGCCGGTGCTGTGCGTTTGTCGGCTCTTTCTCACTTGCCTGTGATC TGGGTTGCTACGCATGACTCGATTGGTTTGGGTGAGGACGGTCCTA CCCACCAGCCTATTGAGACCTTGGCCCACTTCAGAGCTACCCCTAA CATCTCTGTGTGGAGACCTGCTGACGGTAACGAGGTGTCAGCTGCT TACAAGTCTGCCATTGAGTCTACCTCTACCCCACACATCTTGGCCT TGACCAGACAGAACTTGCCTCAATTGGCTGGTTCTTCTGTGGAGAA GGCCTCTACCGGTGGTTACACCGTGTACCAGACCACTGACAAGCCT GCCGTCATCATCGTGGCTTCTGGTTCCGAGGTGGCCATCTCTATTG ACGCCGCCAAGAAGTTGGAGGGTGAGGGCATCAAGGCCAACGTTGT TTCCTTGGTTGACTTCCACACTTTCGACAAGCAGCCTTTGGACTAC CGTTTATCTGTTTTGCCAGATGGCGTGCCAATCATGTCCGTTGAGG TGATGTCCTCGTTCGGCTGGTCCAAGTATTCTCACGAGCAGTTCGG CTTGAACAGATTCGGTGCCTCCGGCAAGGCCGAAGACCTTTACAAG TTCTTCGACTTCACGCCAGAAGGCGTTGCTGACAGAGCCGCCAAGA CCGTGCAGTTCTACAAGGGCAAGGACCTCCTTTCGCCTTTGAACAG AGCCTTCTAA (SEQ ID NO: 78)
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 229/248
226/227 [00282] As sequências identificadas acima de aminoácidos e de ácidos nucleicos foram comparadas a seus homólogos correspondentes em Metschnikowia fructicola 277 (FR) e Metschnikowia pulcherrima flavia (FL) . A Tabela 7 mostra a porcentagem de bases de nucleotídeos e resíduos de aminoácidos que são idênticas aos genes e proteínas de HO Metschnikowia sp. quando comparadas às espécies FR e FL.
Tabela 7
Nome de ORF % identidade de bases de nucleotídeos % identidade de resíduos de aminoácidos
Homólogo de FR Homólogo FL de Homólogo de FR Homólogo de FL
HO ACT1 9 9,6 99, 7 100 100
HO ARO8 96, 2 96, 3 100 100
HO AROIO 97,4 97, 6 95, 6 96, 7
HO GPD1 98, 6 98,7 99, 8 100
HO GXF1 98,7 98,7 100 99, 8
HO GXF2 98,2 98,1 9 9,6 99, 5
HO GXS1 98,5 98,2 100 99, 8
HO HGT19 97, 1 97,8 98,7 99
HO HXT2.6 98,2 98,3 100 99, 2
HO HXT5 98,2 98,1 9 9,6 99, 8
HO PGK1 99, 3 99, 8 100 100
HO QUP2 98,3 98 100 99, 8
HO RPB1 97, 9 97, 6 100 99, 9
HO RPB2 98,2 98,5 100 100
HO TEF1 98,8 99, 2 99, 8 99, 8
HO TPI1 98, 9 99, 3 100 100
Petição 870190080752, de 20/08/2019, pág. 230/248
227/227
Nome de ORF % identidade de bases de nucleotídeos % identidade de residues de aminoácidos
Homólogo de FR Homólogo FL de Homólogo de FR Homólogo de FL
HO XKS1 97, 1 9 6,6 98,2 97
HO XYL1 97, 6 97,4 99, 7 99, 4
HO XYL2 98,3 98,3 99, 7 100
HO XYT1 97, 9 97, 6 100 97,6
HO TALI 98, 6 98,8 99, 7 99, 4
HO TKL1 99, 0 98,5 99, 9 99, 9
[00283] Assim, a HO Metschnikowia sp. possui sequências únicas de ácido nucleico para os genes seguintes: ACT1, ARO8, AROIO, GPD1, GXF1, GXF2 , GXS1, HXT19, HXT2.6, HXT5, PGK1, QUP2, RPB1, RPB2 , TEF1, TP11, XKS1, XYL1, XYL2, XYT1, TALI e TKL1, bem como sequências únicas de aminoácidos para as proteinas seguintes: ArolO, Gxf2, Hgtl9, Hxt5, Tefl, Xksl, Xyll, Tall e Tkll.

Claims (57)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de que produz pelo menos 0,1 g/L/h de xilitol a partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30°C por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose .
  2. 2. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de que produz pelo menos 1 g/L de xilitol a partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30°C durante três dias em meio liquido Yeast Nitrogen Base (YNB) contendo 4% de xilose.
  3. 3. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de que produz pelo menos 1 g/L de xilitol a partir de xilose quando cultivada em condições aeróbicas e a 30°C durante dois dias em meio liquido Yeast Nitrogen Base (YNB) contendo 2% de xilose e 2% de glicose.
  4. 4. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de que produz cerca de 0,11 g/L/h de xilitol, cerca de 6,8E-05 g/L/h de n-butanol, cerca de 2,5E-04 g/L/ h de isobutanol, cerca de 2,4E-04 g/L/h de isopropanol, cerca de 2,64E-04 g/ L/h de etanol e cerca de 3,73E-06 g/L/ h de álcool 2-feniletilico, quando cultivada em condições aeróbias durante três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose.
  5. 5. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de que produz os compostos xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-feniletilico a uma concentração de cerca de 8.000 mg/L de xilitol, cerca de 4,85 mg/L de nbutanol, cerca de 18,06 mg/L isobutanol, cerca de 17,5 mg/L de
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    2/11 isopropanol, cerca de 19,7 mg/L de etanol e cerca de 0,269 mg/L de álcool 2-feniletilico quando cultivada sob condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose.
  6. 6. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de que produz compostos xilitol, n-butanol, isobutanol, isopropanol, etanol e álcool 2-feniletilico numa razão relativa de 99,26% de xilitol, 0,061% de n-butanol, 0,223% de isobutanol, 0,217% de isopropanol, 0,236% de etanol e 0,003% de álcool 2feniletilico quando cultivada sob condições aeróbicas por três dias em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 4% de xilose.
  7. 7. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de compreender uma sequência do domínio D1/D2 que compreende: (1) uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; (2) uma sequência de ácidos nucleicos no interior da sequência consenso de SEQ ID NO: 2; ou (3) uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo os resíduos 1-153, 178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 4 substituições nucleotídicas e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de aminoácidos selecionada de o grupo consistindo de SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56.
  8. 8. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de compreender uma sequência do domínio D1/D2 que compreende: (1) uma sequência de ácidos nucleicos que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; ou (2) uma sequência de ácidos nucleicos no interior da sequência consenso de SEQ ID NO: 2; ou (3) uma sequência de ácidos nucleicos compreendendo os resíduos 1-153,
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    3/11
    178 a 434 e 453 a 499 de SEQ ID NO: 2 com não mais do que 4 substituições nucleotidicas e, pelo menos, uma sequência codificante de ácidos nudeicos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NOS: 57-78.
  9. 9. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de compreender: (1) uma sequência de domínio D1/D2 que é pelo menos 96,8% idêntica à SEQ ID NO: 1; e (2) uma sequência codificante de ácidos nudeicos de SEQ ID NO: 68, e em que a referida espécie de Metschnikowia isolada cresce até uma D.O.soonm de cerca de 25 no periodo de 41 horas de cultura em meio liquido Yeast Extract Peptone (YEP) contendo 2% xilose como a única fonte de carbono.
  10. 10. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de compreender: (1) uma sequência de ácidos nudeicos que é pelo menos 97,1% idêntica à sequência consenso do domínio D1/D2 de SEQ ID NO: 2; e (2) uma sequência codificante de ácidos nudeicos de SEQ ID NO: 70 .
  11. 11. Espécie de Metschnikowia isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que a sequência do domínio D1/D2 compreende uma sequência de ácidos nudeicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1 e 3-25.
  12. 12. Espécie de Metschnikowia isolada, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizada pelo fato de que a sequência do domínio D1/D2 não compreende a sequência do domínio D1/D2 de espécies de Metschnikowia selecionadas do grupo consistindo de Metschnikowia andauensis, Metschnikowia chrysoperlae, Metschnikowia fructicola, Metschnikowia
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    4/11 pulcherrima, Metschnikowia shanxiensis, Metschnikowia sinensis, and Metschnikowia zizyphicola.
  13. 13. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de ser designada por número de acesso 081116-01, depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá, uma Autoridade Depositária Internacional, em 8 de novembro de 2016, sob os termos do Tratado de Budapeste.
  14. 14. Método para produzir xilitol caracterizado pelo fato de compreender cultivar a espécie de Metschnikowia isolada, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, sob condições e por tempo suficiente para produzir xilitol a partir de xilose.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a espécie de Metschnikowia isolada produz pelo menos 0,1 g/L/h, pelo menos 0,2 g/L/h, pelo menos 0,3 g/L/h, pelo menos 0,4 g/L/h, pelo menos 0,50 g/L/h, pelo menos 0,60 g/L/h, pelo menos 0,70 g/L/h, pelo menos 0,80 g/L/h, pelo menos 0,90 g/L/h, pelo menos 1,00 g/L/h, pelo menos 1,50 g/L/h, pelo menos 2,00 g/l/h, pelo menos 2,50 g/L/h, pelo menos 3,00 g/L/h, pelo menos 3,50 g/L/h, pelo menos 4,00 g/L/h, pelo menos 5,00 g/L/h, pelo menos 6,00 g/L/h, pelo menos 7,00 g/L/h, pelo menos 8,00 g/L/h, pelo menos 9,00 g/L/h, ou pelo menos 10,00 g/L/h de xilitol a partir de xilose.
  16. 16. Método, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as condições compreendem cultivar a espécie de Metschnikowia isolada em meio compreendendo xilose e uma fonte de carbono C3, uma fonte de carbono C4, uma fonte de
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    5/11 carbono C5, uma fonte de carbono C6, ou uma combinação das mesmas.
  17. 17. Método, de acordo com as reivindicações 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que as condições compreendem cultivar a espécie de Metschnikowia isolada em meio compreendendo xilose e um co-substrato selecionado a partir de um grupo consistindo de celobiose, galactose, glicose, etanol, acetato, arabinose, arabitol, sorbitol e glicerol, ou uma combinação dos mesmos.
  18. 18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o co-substrato é glicose.
  19. 19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma combinação de glicose, xilose e celobiose.
  20. 20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma combinação de glicose, xilose e galactose.
  21. 21. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma combinação de glicose, xilose e glicerol.
  22. 22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a
    21, caracterizado pelo fato de que o cultivo compreende condições de cultivo aeróbico.
  23. 23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a
    22, caracterizado pelo fato de que o cultivo compreende cultivo descontínuo, cultivo descontínuo alimentado ou cultivo continuo.
    Petição 870190057688, de 21/06/2019, pág. 24/34
    6/11
  24. 24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a
    23, caracterizado pelo fato de que o método também compreende separar o xilitol de outros componentes na cultura.
  25. 25. Método, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a separação compreende extração, extração liquidoliquido continua, pervaporação, filtração por membrana, separação por membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia iônica, cromatografia de absorção, ou ultrafiltração.
  26. 26. Xilitol bioderivado caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 25.
  27. 27. Composição caracterizada pelo fato de compreender a espécie de Metschnikowia isolada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou o xilitol bioderivado conforme definido na reivindicação 26 ou ambos.
  28. 28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a composição é meio de cultura compreendendo xilose.
  29. 29. Composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a composição é meio de cultura do qual a espécie de Metschnikowia isolada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 foi removida.
  30. 30. Composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de compreender glicerol, arabitol, um álcool de açúcar
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    7/11
    C7 ou uma combinação dos mesmos, como impurezas do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 25.
  31. 31. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que o álcool de açúcar C7 é volemitol ou um isômero do mesmo.
  32. 32. Composição, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a quantidade de glicerol ou arabitol ou ambos é pelo menos 10%, 20%, 30% ou 30% maior do que a quantidade do respectivo glicerol ou arabitol ou ambos produzidos por um organismo microbiano diferente da espécie de Metschnikowia isolada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
  33. 33. Espécie de Metschnikowia isolada caracterizada pelo fato de ser designada por número de acesso 081116-01, depositada na Autoridade Depositária Internacional do Canadá, uma Autoridade Depositária Internacional, em 08 de novembro de 2016, sob os termos do Tratado de Budapeste, em que a espécie de Metschnikowia também compreende uma via metabólica capaz de produzir um composto bioderivado a partir de xilose ou uma modificação genética ou ambos.
  34. 34. Espécie de Metschnikowia isolada, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a via metabólica compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico exógeno que codifica pelo menos uma enzima da via metabólica.
  35. 35. Espécie de Metschnikowia isolada, de acordo com as reivindicações 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que o
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    8/11 composto bioderivado é selecionado do grupo que consiste em álcool fenetílico, 2-metil-butanol e 3-metil-butanol.
  36. 36. Método para produzir um composto bioderivado caracterizado pelo fato de compreender cultivar a espécie de Metschnikowia isolada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 33 a 35 sob condições e por um periodo de tempo suficiente para produzir o composto bioderivado.
  37. 37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que as condições compreendem cultivar a espécie de Metschnikowia isolada em meio compreendendo xilose e uma fonte de carbono C3, uma fonte de carbono C4, uma fonte de carbono C5, uma fonte de carbono C6 ou uma combinação dos mesmos.
  38. 38. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que as condições compreendem cultivar o organismo microbiano em meio compreendendo xilose e um co-substrato selecionado do grupo que consiste em celobiose, galactose, glicose, arabitol, sorbitol e glicerol ou uma combinação dos mesmos.
  39. 39. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o co-substrato é glicose.
  40. 40. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma combinação de glicose, xilose e celobiose.
  41. 41. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma combinação de glicose, xilose e galactose.
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    9/11
  42. 42. Método, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o meio compreende uma combinação de glicose, xilose e glicerol.
  43. 43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a
    42, caracterizado pelo fato de que o cultivo compreende condições de cultura aeróbica.
  44. 44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a
    43, caracterizado pelo fato de que o cultivo compreende cultivo descontínuo, cultivo descontínuo alimentado ou cultivo continuo.
  45. 45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36 a
    44, caracterizado pelo fato de que o método também compreende separar o composto bioderivado de outros componentes na cultura.
  46. 46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a separação compreende extração, extração liquidoliquido continua, pervaporação, filtração por membrana, separação por membrana, osmose reversa, eletrodiálise, destilação, cristalização, centrifugação, filtração extrativa, cromatografia iônica, cromatografia de absorção, ou ultrafiltração.
  47. 47. Composto bioderivado caracterizado pelo fato de que é produzido pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 36 a 46.
  48. 48. Composição caracterizada pelo fato de compreender a espécie de Metschnikowia conforme definida em qualquer uma das reivindicações 33 a 35 ou o composto bioderivado conforme definido na reivindicação 47.
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    10/11
  49. 49. Composição, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a composição é meio de cultura compreendendo xilose.
  50. 50. Composição, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que a composição é meio de cultura do qual a espécie de Metschnikowia conforme definida em qualquer uma das reivindicações 33 a 35 foi removida.
  51. 51. Composição, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pelo fato de que compreende glicerol, arabitol, um álcool de açúcar C7 ou uma combinação dos mesmos, como impurezas do método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 36 a 46.
  52. 52. Composição, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que o álcool de açúcar C7 é volemitol ou um isômero do mesmo.
  53. 53. Composição, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pelo fato de que a quantidade de glicerol ou arabitol ou ambos é pelo menos 10%, 20%, 30% ou 30% maior do que a quantidade do respectivo glicerol ou arabitol ou ambos produzidos por um organismo microbiano diferente da espécie de Metschnikowia isolada conforme definida em qualquer uma das reivindicações 33 a 35 .
  54. 54. Polipeptideo isolado caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 37, 40, 42, 44, 49, 51, 52, 55 e 56.
    Petição 870190057688, de 21/06/2019, pág. 29/34
    11/11
  55. 55. Ácido nucleico isolado caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de ácidos nucleicos selecionada do grupo que consiste em SED ID NOS: 57-78.
  56. 56. Vetor caracterizado pelo fato de compreender a sequência de ácido nucleico isolado conforme definida na reivindicação 55.
  57. 57. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de compreender o vetor conforme definido na reivindicação 56.
BR112019013008A 2016-12-21 2017-12-20 espécie de metschnikowia isolada, método para produzir xilitol, xilitol bioderivado, composição, método para produzir um composto bioderivado, composto bioderivado, polipeptídeo isolado, ácido nucleico isolado, vetor e célula hospedeira BR112019013008A2 (pt)

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