BR112019012705A2 - método para prover uma ou mais frações de um material de biomassa, fração de biomassa e ração alimentícia - Google Patents
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Abstract
a presente invenção se refere a um método para prover um produto de scp de um material de biomassa em que o dito produto de scp compreende uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos no material de biomassa, o método compreendendo as etapas de: (i) provisão do material de biomassa; (ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido; (iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos; (iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos; (v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo o produto de scp compreendendo uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção
MÉTODO PARA PROVER UMA OU MAIS FRAÇÕES DE UM MATERIAL DE BIOMASSA, FRAÇÃO DE BIOMASSA E RAÇÃO ALIMENTÍCIA
Campo da Invenção [0001] A presente invenção se refere a um método para prover um ou mais isolados de uma biomassa. Em particular, a presente invenção se refere a um método industrial para remover ácidos nucleicos de uma biomassa, por exemplo, para produzir proteína de célula única de bactérias metanotróficas cultivadas com um teor reduzido de ácido nucleico.
Antecedentes da invenção [0002] Um dos maiores desafios da humanidade é como podemos alimentar uma população global, que cresce rapidamente, com alimentos nutritivos e acessíveis. Espera-se que a população global ultrapasse 9 bilhões em 2050 e, de acordo com a Organização das Nações Unidas para Agricultura e Alimentação (FAO), consumirão duas vezes mais proteína animal em 2050 comparado aos dias de hoje. A atual pressão antropogênica sobre os recursos finitos da terra e a dinâmica concomitante da mudança climática geram sérias preocupações sobre a resiliência das cadeias de alimentos/rações agrícolas contemporâneas, forçando a busca por fontes alternativas de proteína que podem substituir as fontes de proteína animal convencionais. Com isso, o foco mudou para a exploração de micróbios como fontes de alimento para consumo e, em particular, produtos como SCP têm se mostrado bastante interessantes. O termo “proteína de célula única” (SCP) foi concebido em 1968 em uma reunião realizada no Massachusetts Institute of Technology (MIT) para substituir os termos menos estéticos “proteína microbiana” e “petroproteína”, que eram utilizados originalmente. Hoje em dia, SCP derivada de biomassa bacteriana é principalmente utilizada para ração animal e, em alguns casos, para consumo humano, e se espera que seja de maior importância no futuro.
[0003] O termo proteína de célula única (SCP) comumente se refere a um
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2/32 produto proteico isolado de micro-organismos unicelulares. O produto proteico pode ser na forma de uma biomassa ou um extrato de proteína e compreende materiais de parede celular de micro-organismos de unicelulares de culturas puras ou mistas de algas, leveduras, fungos ou bactérias. A proteína de célula única é tradicionalmente utilizada como um ingrediente ou um substituto para alimentos ricos em proteína, e é adequada para consumo humano ou como rações animais.
[0004] A utilização de micro-organismos para obter biomassa para uso em ração e alimento resulta em um produto que tem uma proporção maior de ácidos nucleicos do que os alimentos convencionais. Embora a quantidade de ácidos nucleicos presentes em SCP variem, dependendo do micro-organismo específico empregado, geralmente, cerca de 5 a cerca de 18% de ácidos nucleicos (peso seco) estão presentes na SCP.
[0005] RNA, DNA e o ácido nucléico propriamente ditos não são desejados no produto de proteína, tal como no produto de SCP, uma vez que estes compostos podem ter efeito direto ou indireto na saúde de um mamífero, como humanos ou animais, por exemplo, por causarem gota ou artrite gotosa ou pedras nos rins em mamíferos.
[0006] Convencionalmente, RNA e DNA alimentares são decompostos em fragmentos de ácido nucléico no lúmen intestinal, e decompostos adicionalmente em nucleotídeos e/ou nucleosídeos e bases livres de purina e pirimidina por nucleotídeo e/ou enzimas fosfatase de nucleosídeo na mucosa.
[0007] O metabolismo de bases purinas resulta em altos níveis de ácido úrico. Humanos não possuem a enzima uricase, que oxida ácido úrico em alantoína, um metabólito solúvel e excretável. O consumo de uma fonte de proteína, com teor alto de ácidos nucleicos, resulta em hiperuricemia que é definida pelo nível anormalmente alto de ácido úrico encontrado no sangue. Ácido úrico tem baixa solubilidade nos valores de pH fisiológico, formando, assim, cristais de ácido úrico que podem ser retidos nas articulações e rins, causando gota ou artrite gotosa e pedras nos rins.
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3/32 [0008] Com isso, ácidos nucleicos podem, em quantidades excessivas ou descontroladas, ser considerados substâncias biogênicas e são considerados um fator limitante no uso de SCP derivada de algas, leveduras, fungos e bactérias em produtos alimentícios para nutrição humana. A concentração normal de ácido úrico no plasma em homens é de 5,1 ±0,9 mg ml’1 e, em mulheres, é aproximadamente 1 mg ml·1 menor. A Dose Diária Recomendada para proteína é de 65 gramas ao dia para um adulto do sexo masculino que pesa 70 quilos e o Grupo de Aconselhamento Calórico de Proteína do Sistema das Nações Unidas recomenda que a quantidade de ácido nucleico ingerida ao dia, proveniente de proteína microbiana, deve ser menos que 2 gramas com o ácido nucleico total de todas as origens, não excedendo um total de 4 gramas ao dia.
[0009] Há uma variedade de métodos que foram relatados na literatura científica para a remoção ou redução do teor de ácido nucleico da SCP. Métodos, como tratamento enzimático, tratamento ácido, tratamento de base e choque de calor foram descritos. Estes métodos; entretanto, são muito ineficazes e não são capazes de remover a maioria dos ácidos nucleicos e nucleotídeo/nucleosídeos, purinas e pirimidinas são ainda deixadas no produto. Além disso, os métodos enzimáticos ou químicos também podem afetar de maneira negativa o teor de proteína do produto final, o que é altamente indesejável. Por fim, os métodos do estado da técnica são muito complexos, precisam de etapas de processamento adicionais, não são aplicáveis no cenário industrial, e/ou são muito caros para serem utilizados para produzir ração e alimento. Ademais, processos que foram utilizados no passado para a remoção de ácido nucleico, como tratamento enzimático, tratamento ácido, tratamento de base e choque de calor, afetam o produto de SCP em termos de sabor, odor e cor e, uma vez que o teor de ácido nucleico, seus fragmentos e nucleotídeos e/ou nucleosídeos é muito alto no produto de SCP tradicional, o produto de SCP se torna não atrativo para alimento, uma vez que precisa ter um sabor, odor e cor suaves, de modo a não influenciar a palatabilidade do
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4/32 alimento ou ração.
[0010] Portanto, há uma necessidade por um método aprimorado para prover isolados de biomassas, como produtos de SCP nos quais os ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e/ou RNA) são removidos sem afetar o sabor, odor e cor dos produtos de SCP ou o produto alimentício no qual os produtos de SCP podem ser utilizados. Além disso, há uma necessidade na indústria por um método que seja eficaz em prover diversos isolados de biomassa e em remover ácidos nucleicos, reduzindo ou sem afetar o teor de proteína da proteína SCP, que seja simples, reproduzível, rápido, possa manipular amplos volumes, industrialmente aplicável, barato e/ou precise de um mínimo de etapas de manipulação.
Sumário da invenção [0011] Assim, um objetivo da presente invenção se refere a um método simplificado para prover um ou mais isolados, em particular, um produto de SCP no qual os ácidos nucleicos (por exemplo, DNA e/ou RNA) são removidos sem afetar o produto de SCP.
[0012] É um objetivo da presente invenção prover um método que solucione os problemas mencionados acima do estado da técnica, que tem métodos que resultam em produtos de SCP nos quais o sabor, odor e cor são afetados, assim como métodos ineficazes e métodos que resultam na incapacidade de remover a maioria dos ácidos nucleicos, efeitos adversos no teor de proteína do produto final, métodos muito complexos, necessidades de etapas de processamento adicionais, não aplicabilidade em cenários industriais e/ou produtos de SCP muito caros para encontrar uso na produção de alimento e ração.
[0013] Assim, um aspecto da invenção se refere a um método para prover uma ou mais frações de um material de biomassa, o método compreende as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular,
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5/32 provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em uma primeira fração (primeiro retentado) compreendendo proteínas, e uma segunda fração (primeiro permeado) compreendendo ácidos nucleicos e vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(iv) sujeitar a segunda fração (primeiro permeado) a um segundo tratamento que resulta em uma terceira fração (segundo retentado) compreendendo ácido nucleico e uma quarta fração (segundo permeado) compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos.
[0014] Ainda, um aspecto da presente invenção se refere a um método para prover um produto de Proteína de célula única (produto de SCP) de um material de biomassa em que o dito produto de SCP compreende uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácido nucleico no material de biomassa, o método compreendendo as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos e vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo o produto de SCP compreendendo uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos.
[0015] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método para remover ácidos nucleicos de um material de biomassa, o método compreende
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6/32 as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos e vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo uma fração na qual os ácidos nucleicos foram removidos.
[0016] Ainda, outro aspecto da presente invenção se refere a uma fração de biomassa obtida por um método de acordo com a presente invenção.
[0017] Ainda, outro aspecto da presente invenção se refere a uma fração de biomassa compreendendo um material de biomassa e um teor reduzido de ácidos nucleicos, em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos no material de biomassa.
[0018] Ainda, um aspecto adicional da presente invenção se refere a uma alimentação compreendendo uma ou mais frações ou produto de SCP, de acordo com a presente invenção.
Breve Descrição das Figuras [0019] A Figura 1 apresenta uma realização da presente invenção para prover uma fração de biomassa ou um produto de SCP. O método descreve um material de biomassa provido (um material de biomassa com quebra celular), compreendendo resíduos celulares, proteínas, aminoácidos (AA), vitaminas, minerais, DNA e RNA, obtido após quebra celular. O material de biomassa quebrado é sujeito à separação consecutiva, primeiro, por microfiltração (MF), seguida por ultrafiltração (UF). O primeiro retentado obtido da microfiltração
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7/32 compreende os resíduos celulares e as proteínas, o primeiro permeado obtido da microfiltração compreende as vitaminas, minerais, aminoácidos (AA), DNA e RNA. O primeiro permeado é, então, adicionado ao segundo processo de separação, o processo de ultrafiltração. O segundo retentado obtido da ultrafiltração compreende o DNA e RNA, o segundo permeado obtido da ultrafiltração compreende as vitaminas, minerais e aminoácidos (AA). O primeiro retentado e o segundo permeado são, então, combinados provendo o produto de SCP, de acordo com a presente invenção.
[0020] A Figura 2 apresenta uma realização da presente invenção para prover diversas frações do processamento a jusante de proteína de célula única bacteriana fermentada, que resulta em frações compreendendo resíduos celulares, sólidos suspensos, gordura, proteínas e/ou peptídeos, vitaminas/minerais/aminoácidos e ácidos nucleicos. A proteína de célula única fermentada pode ser, preferencialmente, proteína de célula única bacteriana que, na figura 2, pode ser obtida da fermentação de bactérias metanotróficas em um reator (1), como um reator de tipo Loop em U (1). O reator de tipo Loop em U (1) pode, durante a fermentação, ser alimentado com metano (1), por exemplo, provido na forma de biogás, soluções minerais (3), e o oxigênio necessário (4). Durante o processo de fermentação, CO2 em excesso, produzido pelas bactérias metanotróficas, pode ser descarregado do reator (1) através da saída (5). A biomassa pode ser coletada e transferida ao homogenizador (6) que quebra as células liberando proteínas intracelulares e/ou peptídeos, minerais, sais, vitaminas etc. Do homogenizador (6), a biomassa quebrada é transferida a um decantador (7) onde a fração de resíduos celulares (8) pode ser retirada. A biomassa pode ser, subsequentemente, transferida a um clarificador (9) para remover sólidos suspensos (10), como resíduos celulares suspensos. A biomassa clarificada pode ser, subsequentemente, sujeita a um separador de gordura (11) que provê uma fração de gordura (12). A biomassa pode ser, então, sujeita ao primeiro processo de separação (13) compreendendo filtração em membrana,
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8/32 por exemplo, por microfiltração (13), ou separação cromatográfica, por exemplo, por cromatografia de afinidade (13), provendo uma fração de proteína e/ou peptídeo (14) - uma primeira fração. A biomassa - ou uma segunda fração - é, então, transferida a um segundo processo de separação (15), compreendendo uma filtração em membrana, como uma separação por ultrafiltração (15), resultando em uma fração (16) compreendendo as vitaminas, minerais e aminoácidos; e uma fração (17) compreendendo os ácidos nucleicos.
[0021] A presente invenção será, agora, descrita em mais detalhes a seguir. Descrição Detalhada da Invenção [0022] Assim, atualmente, há uma necessidade mundial por fontes alternativas de proteína para ração e alimento a humanos e animais; entretanto, essa necessidade aumentará drasticamente ao longo dos próximos anos, uma vez que a população continua a aumentar. Proteína de célula única (SCP), por exemplo, obtida de biomassa microbiana, é uma fonte altamente potente, uma vez que é barata e reproduzível.
[0023] Proteína microbiana, como proteína de célula única (SCP), requer o cultivo de micro-organismos em um tanque de fermentação. Muitas técnicas de fermentação diferentes foram descritas e, como um exemplo, o material de biomassa, de acordo com a presente invenção, pode ser provido pelo processo de fermentação descrito nos documentos WO 2010/069313; WO 2000/70014; ou US 2004/0241790, preferencialmente, o material de biomassa é provido pelo processo de fermentação conforme descrito no documento WO 2010/069313, em que estão todos incorporados por referência.
[0024] Assim, quando a fermentação, por exemplo, por um dos métodos de fermentação mencionados acima, for concluída e o material de biomassa for obtido do fermentador, o material de biomassa pode ser sujeito a processamento a jusante adicional.
[0025] Uma realização preferida da presente invenção se refere a um método para prover uma ou mais frações de um material de biomassa, o método
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9/32 compreende as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em uma primeira fração (primeiro retentado) compreendendo proteínas, e uma segunda fração (primeiro permeado) compreendendo ácidos nucleicos;
(iv) sujeitar a segunda fração (primeiro permeado) a um segundo tratamento que resulta em uma terceira fração (segundo retentado) compreendendo ácido nucleico e uma quarta fração (segundo permeado) compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos.
[0026] Durante o fracionamento de um material de biomassa, diversas frações valiosas, individualmente ou em diversas combinações, podem ser obtidas e utilizadas em diferentes aplicações.
[0027] Em uma realização da presente invenção, a primeira fração obtida na etapa (iii) pode ser combinada à quarta fração obtida na etapa (iv), provendo uma quinta fração. Nessa combinação de frações, um material de biomassa é provido de quantidade reduzida de ácido nucleico.
[0028] Durante o processamento do material de biomassa rompido provido na etapa (ii) a viscosidade do material de biomassa rompido pode ser muito alta, complicando o bombeamento e processamento do material de biomassa rompido, particularmente, no primeiro processo de separação e/ou no segundo processo de separação. Assim, em uma realização da presente invenção, a viscosidade do material de biomassa rompido pode ser reduzida.
[0029] Em uma realização da presente invenção, o material de biomassa rompido provido na etapa (ii) pode ser sujeito a pelo menos um processo de separação que remove sólidos suspensos do material de biomassa. Os sólidos suspensos podem compreender células e/ou resíduos celulares.
[0030] Preferencialmente, pelo menos um processo de separação que remove
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10/32 sólidos suspensos inclui um decantador, um clarificador ou uma combinação destes. Preferencialmente, pelo menos um processo de separação que remove sólidos suspensos envolve o tratamento consecutivo do material de biomassa de sujeitar o material de biomassa rompido à decantação e o sobrenadante do processo de decantação é subsequentemente sujeito à clarificação. O sobrenadante obtido do processo de clarificação pode ser subsequentemente sujeito ao primeiro processo de separação conforme descrito na etapa (iii) [0031] O processo de decantação e/ou o processo de clarificação pode remover, principalmente, células e resíduos celulares do material de biomassa, provendo um material de biomassa rompido com resíduos celulares reduzidos. O material de biomassa rompido obtido do processo de decantação (o sobrenadante obtido da decantação) pode constituir um material de biomassa rompido com teor reduzido de células e resíduos celulares.
[0032] No presente contexto, um material de biomassa rompido com teor reduzido de células e resíduos celulares compreende menos que 10% (p/p) de célula ou resíduos celulares, como abaixo de 8%, por exemplo, abaixo de 7%, como abaixo de 6%, por exemplo, abaixo de 5%, como abaixo de 4%, por exemplo, abaixo de 3%, como entre 1,5-10%, por exemplo, entre 2-9%, como entre 2,5-8%, por exemplo, entre 3-7%, como entre 3,5-6%, por exemplo, entre 4-5%.
[0033] O material de biomassa quebrado obtido da clarificação (o sobrenadante obtido da clarificação) pode constituir um material de biomassa rompido substancialmente sem resíduos celulares [0034] No presente contexto, um material de biomassa rompido com teor reduzido de células e resíduos celulares compreende menos que 1,5% (p/p) célula ou resíduos celulares, como abaixo de 1%, por exemplo, abaixo de 0,75%, como abaixo de 0,5%, por exemplo, abaixo de 0,25%, como abaixo de 0,1%, por exemplo, entre 0,1-1,5%, por exemplo, entre 0,25-1%, como entre 0,5-0,75%.
[0035] Os sólidos suspensos, como resíduos celulares, podem ser uma fonte
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11/32 abundante de fosfolipídios. Como as vitaminas, fosfolipídios são nutrientes essenciais. Estão dentre as substâncias mais importantes no organismo humano e animal, tendo uma função múltipla: como um substituto da gordura ou uma fonte de energia em produtos de ração e alimentícios; como agentes fisiológicos no metabolismo; e como emulsificantes para gorduras.
[0036] Em uma realização da presente invenção, o material de biomassa rompido provido na etapa (ii) pode ser sujeito a um processo de remoção de gordura, provendo uma fração de gordura. Preferencialmente, o processo de remoção de gordura inclui um separador de gordura. A remoção de gordura pode ser realizada antes ou depois do decantador e/ou clarificador. Ainda mais preferencialmente, o processo de remoção de gordura é realizado após o processo de clarificação.
[0037] A fração de gordura obtida do processo de remoção de gordura consiste principalmente em ácidos graxos que podem ser utilizados para a produção de sabões, cosméticos e agentes de liberação de molde industriais. A fração de gordura também pode encontrar uso em produtos alimentícios, pois não é cara e pode adicionar textura e “paladar a alimentos processados (alimentos preparados).
[0038] Em uma realização adicional da presente invenção, o primeiro processo de separação compreende uma primeira filtração em membrana ou um primeiro processo de separação cromatográfica.
[0039] O processo de separação cromatográfica pode incluir um processo de separação cromatográfica em coluna. Preferencialmente, o processo de separação cromatográfica em coluna inclui uma Cromatografia em Leito Fixo, absorção em tanque agitado, Cromatografia de Leito Fluidizado e/ou Cromatografia de Leito Expandido. Preferencialmente, o processo de separação cromatográfica em coluna pode ser a Cromatografia de Leito Expandido.
[0040] Além disso, o processo de separação cromatográfica pode incluir cromatografia por afinidade, cromatografia de troca de íon, cromatografia de
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12/32 fase reversa, cromatografia por interação hidrofóbica, ou uma mistura destas, como cromatografia de modo misto. Preferencialmente, o processo de separação cromatográfica pode ser cromatografia por afinidade ou cromatografia de modo misto.
[0041] Em uma realização da presente invenção, a uma ou mais frações pode ser um produto de Proteína de célula única (um produto de SCP), um produto de ácido nucleico, um produto de célula/resíduos celulares, um produto de aminoácidos. No contexto da presente invenção, os termos “produto de SCP”, “produto de ácido nucleico”, “produto de célula/resíduos celulares” e “produto de aminoácidos” se referem aos produtos ricos em SCP, ácido nucleico, resíduos celulares ou aminoácidos, respectivamente.
[0042] Os ácidos nucleicos isolados de acordo com a presente invenção podem ser utilizados, diretamente ou como processados adicional, de acordo com as regulamentações pendentes, como um ingrediente para alimento ou ração. Em particular, os ácidos nucleicos isolados, de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados como um ingrediente para fórmulas de alimentação para bebês ou recém-nascidos.
[0043] Outra realização preferida da presente invenção se refere a um método para prover um produto de SCP de um material de biomassa em que o dito produto de SCP compreende uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos no material de biomassa, o método compreendendo as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos;
(iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa
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13/32 os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo o produto de SCP compreendendo uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos.
[0044] O material de biomassa provido na etapa (i) pode ser provido de um tanque de fermentação, preferencialmente de um fermentador de tipo Loop em U (preferencialmente, conforme descrito no documento WO 2010/069313).
[0045] Conforme mencionado anteriormente, grandes quantidades de ácidos nucleicos são produzidas durante o cultivo de micro-organismos, e diante ao interesse de limitar ou evitar esses riscos de desvantagens de ter ácidos nucleicos presentes no produto de fermentação, os métodos, de acordo com a presente invenção, são apresentados por reduzirem o teor de ácidos nucleicos no produto de fermentação em pelo menos 10%, em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácido nucleico no material de biomassa; como pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 30%, como pelo menos 40%, por exemplo, pelo menos 50%, como pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, como pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 90%, como pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98%.
[0046] Uma realização preferida adicional da presente invenção se refere a um método para remover ácidos nucleicos de um material de biomassa, o método compreende as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos;
(iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa
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14/32 os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo um produto de SCP em que os ácidos nucleicos foram removidos.
[0047] No presente contexto, o termo “ácidos nucleicos” se refere à biopolímeros, ou grandes biomoléculas, essenciais para todas as formas de vida conhecidas. Ácidos nucleicos incluem DNA (ácido desoxirribonucleico) e RNA (ácido ribonucleico) ou fragmentos destes. Ácidos nucleicos são feitos de monômeros conhecidos como nucleotídeos. No presente contexto, os termos “nucleotídeo” e “nucleosídeo” podem ser utilizados de maneira substituível e a simples diferença é que nucleosídeos podem ser considerados nucleotídeos sem um grupo de fosfato.
[0048] No presente contexto, o termo “remoção de ácidos nucleicos” se refere à remoção de pelo menos 10% dos ácidos nucleicos naturalmente presentes no material de biomassa (resultante do produto de fermentação); como pelo menos 20%, por exemplo, pelo menos 30%, como pelo menos 40%, por exemplo, pelo menos 50%, como pelo menos 60%, por exemplo, pelo menos 70%, como pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 90%, como pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98%.
[0049] Biocatalisadores adequados utilizados no processo e no fermentador, de acordo com a invenção, podem ser preferencialmente, células vivas, por exemplo, micro-organismos de origem natural, ou seja, de tipos selvagem, especialmente tipos mutados selecionados ou tipos geneticamente modificados que podem ser utilizados para produzir proteína de célula única, proteína de célula única enriquecida, extratos de proteínas ou peptídeo, extratos celulares, ou preparações contendo substâncias benéficas particulares a serem utilizadas, por exemplo, para alimentos e ração, ou serem liberados a fim de melhorar ou otimizar a saúde, desempenho ou bem-estar de humanos ou animais, como, entre outros, animais biungulados (por exemplo, gado, cabras, ovelhas, porcos, etc.), aves domésticas (por exemplo, aves, galinhas, patos,
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15/32 gansos, peru etc.), peixe (por exemplo, salmão, alabote, truta, bacalhau, ou outras espécies criadas em cativeiro) ou mariscos (por exemplo, moluscos, como mexilhões, ostras, camarões, lagostins, lagostas, ou vieiras).
[0050] Os biocatalisadores são preferencialmente micro-organismos vivos. A fermentação dos micro-organismos pode ser realizada utilizando culturas puras ou utilizando combinações ou uma mistura de diferentes micro-organismos, por exemplo, para a produção de levedura para panificação, proteína de célula única (SCP). O processo de fermentação também pode resultar em biotransformações (ou seja, conversão microbiana de diferentes compostos químicos em outros compostos químicos úteis), ou produção de enzimas intracelulares ou extracelulares, proteínas ou hormônios para uso em diferentes indústrias ou em determinados produtos, (por exemplo, farmacêuticos, nutracêuticos ou compostos para uso como agentes de diagnóstico ou analíticos).
[0051] As bactérias preferidas para uso na invenção são aquelas capazes de produzir proteína de célula única, especialmente, uma cultura compreendendo bactérias metanotróficas.
[0052] Em uma realização da presente invenção, o material de biomassa pode ser um material de proteína de célula única. Preferencialmente, o material de proteína de célula única, e o material de biomassa, compreende uma bactéria metanotrófica.
[0053] Em uma realização da presente invenção, as bactérias metanotróficas podem ser opcionalmente combinadas a uma ou mais espécies de outras bactérias, por exemplo, bactérias heterotróficas.
[0054] Em outra realização da presente invenção, o fermentador pode ser utilizado para a fermentação de fungos ou leveduras metilotróficos, como Pichia stipitis ou Pichia pastoris. P. stipitis e P. pastoris são, ambas, capazes de metabolizar metanol e podem ser adequadas para possível produção de OGM.
[0055] As bactérias metanotróficas preferidas são espécies da família
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Methylococcaceae, especialmente Methylococcus capsulatus, que utilizam metano ou metanol como uma fonte de carbono e, por exemplo, amônia, nitrato, nitrogênio molecular como uma fonte de nitrogênio para a síntese de proteína.
[0056] Em uma realização da presente invenção, as bactérias metanotróficas podem ser selecionadas da família Methylococcaceae ou da família Methylocystaceae. Preferencialmente, o material de biomassa compreende uma cepa de Methylococcus. Ainda mais preferencialmente, a cepa de Methylococcus é Methylococcus capsulatus.
[0057] M. capsulatus metaboliza o metano, por exemplo, de gás natural, em biomassa e dióxido de carbono. M. capsulatus também é capaz de metabolizar metanol ao invés de metano. Gás natural frequentemente contém 5-10% de etano e carbonetos maiores, e M. capsulatus pode somente oxidar esses carbonetos em álcoois, aldeídos e ácidos carboxílicos correspondentes, mas não pode oxidar eles completamente em dióxido de carbono e água ou utilizálos para a produção de biomassa.
[0058] Altas concentrações acumuladas de ácidos carboxílicos podem inibir o crescimento de M. capsulatus. Portanto, pode ser útil cofermentar uma ou mais cepas de bactérias heterotróficas com as bactérias metanotróficas para digestão de carbonetos maiores (álcoois, ácidos carboxílicos etc.), por exemplo, etanol, acetato, citrato etc. ou produtos de degradação de biomassa morta ou decantada parcialmente digerida.
[0059] Assim, o caldo de fermentação pode, além de M. capsulatus, ser suplementado com uma ou mais bactérias heterotróficas ou leveduras (por exemplo, Saccharomyces e/ou Candida). A cofermentação é realizada preferencialmente utilizando três bactérias heterotróficas, que são selecionadas para prover um ecossistema de fermentação em que todos os nichos de produto são ocupados. Sua função principal é explorar ácido acético e outros ácidos carboxílicos e degradá-los em dióxido de carbono, se modo que seja evitado acúmulo de ácido carboxílico.
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17/32 [0060] As seguintes bactérias heterotróficas podem ser particularmente úteis para cofermentar com M. capsulatus; Ralstonia sp.; Bacillus brevis; BrevibacHIus agri; Alcaligenes acidovorans; AneurinibacHIus danicus e Bacillus firmus. Leveduras adequadas podem ser selecionadas dentre as espécies de Saccharomyces e/ou Candida.
[0061] Em uma realização da presente invenção, a combinação preferida de bactérias pode ser uma cofermentação de M. capsulatus com Alcaligenes acidovorans (NCIMB 13287), AneurinibacHIus danicus (NCIMB 13288) e Bacillus firmus (NCIMB 13289).
[0062] O caldo de fermentação no fermentador pode, preferencialmente, ser provido de maneira contínua das quantidades necessárias de água e sais de nutrientes, como amônio/amônia, magnésio, cálcio, potássio, ferro, cobre, zinco, manganês, níquel, cobalto e molibdênio na forma de sulfatos, cloretos ou nitratos, fosfatos e componentes de controle de pH, ou seja ácidos e/ou bases, conforme normalmente utilizados pelo técnico no assunto, por exemplo, ácido sulfúrico (H2SO4), ácido nítrico (HNO3), hidróxido de sódio (NaOH), nitrato de potássio (KNO3). O último também é uma fonte de nitrogênio adequada para M. capsulatus. Os detalhes específicos do processo de fermentação, e substratos etc. são descritos nos documentos WO 2000/70014 e WO 2010/069313, que são aqui incorporados por referência.
[0063] O material de biomassa produzido da fermentação de gás natural compreenderá de 60 a 80% em peso da proteína crua; de 5 a 20% em peso de gordura crua; de 3 a 12% em peso de resíduos; de 3 a 15% em peso de ácidos nucleicos (RNA e DNA).
[0064] Com isso, em uma realização da presente invenção, 0 material de biomassa provido na etapa (i) pode ser sujeito a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido.
[0065] No presente contexto, 0 termo “quebra celular” se refere a um método ou processo para liberação de moléculas biológicas de dentro de uma célula ou organismo.
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18/32 [0066] Em uma realização da presente invenção, o processo de quebra celular pode envolver uma quebra celular mecânica ou pressurizada.
[0067] Em uma realização adicional da presente invenção, o processo de quebra celular envolve a homogeneização do material de biomassa, sujeitar o material de biomassa a moagem com esfera ou forças de cisalhamento. Preferencialmente, a quebra celular envolve a homogeneização e a homogeneização pode ser uma homogeneização de alta pressão.
[0068] Em uma realização da presente invenção, o material de biomassa obtido do tanque de cultivo pode ser sujeito à centrifugação e/ou processo de filtração, por exemplo, uma ultrafiltração inicial, para remover parte da água presente no material de biomassa e para formar uma pasta aquosa ou pasta fluida antes da homogeneização. Durante essa centrifugação, o conteúdo de matéria seca do material de biomassa pode ser aumentado tipicamente de cerca de 2 a cerca de 15% em peso, por exemplo, a cerca de 12% em peso. A ultrafiltração inicial pode ser realizada em uma temperatura entre 40 e 50 °C, por exemplo, entre 42 e 46 °C, e ainda concentra o material de biomassa em um produto contendo de 10 a 30%, preferencialmente de 15 a 25%, por exemplo, de 18 a 22% em peso de material de proteína de célula única. A exclusão de tamanho utilizada durante a ultrafiltração será, geralmente, na variação de aproximadamente 100.000 Daltons.
[0069] Após a ultrafiltração inicial, o material de biomassa pode ser resfriado, preferencialmente, a uma temperatura de 4 a 30 °C, como de 10 a 20 °C, por exemplo, a aproximadamente 15 °C, por exemplo, ao passar a pasta fluida de proteína concentrada da unidade de ultrafiltração por um trocador de calor, após o que pode ser mantida em um tanque de tampão em temperatura constante, por exemplo, por um período de 1 a 24 horas, preferencialmente 3 a 15 horas, por exemplo, 5 a 12 horas, em uma temperatura de 10 a 20 °C, mais preferencialmente de 5 a 15 °C em um pH na variação de 5,5 a 6,5.
[0070] Homogeneização pode ser realizada em um homogenizador de alta pressão convencional no qual as células podem ser rompidas, primeiro, ao
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19/32 pressurizar e, então, despressurizar o interior do homogenizador.
[0071] Homogeneização pode ser preferencialmente, homogeneização de alta pressão, que envolve uma alteração na pressão do material de biomassa. Preferencialmente, a alteração na pressão do material de biomassa pode ser uma queda de pressão na variação de 200 a 2.500 bar, como na variação de 400 a 2.000 bar, por exemplo, na variação de 600 a 1.500 bar, como na variação de 1.000 a 1,300 bar, por exemplo, na variação de 1.200 a 1.250 bar, como na variação de 1.300 a 2.200 bar, por exemplo, na variação de 1400 a 2.000 bar, como acima de 1.200 bar, por exemplo, acima de 1.250 bar, como acima de 1.500 bar, por exemplo, cerca de 2.000 bar.
[0072] Em uma realização da presente invenção, o processo de quebra celular provido na etapa (ii) pode ser realizado sob condições de temperatura controlada, preferencialmente, em uma temperatura de menos que 50 °C, particularmente, preferencialmente de 25 a 50 °C, por exemplo, de 25 a 35 °C. [0073] Uma única etapa de queda de pressão interna pode ser preferida; entretanto, em uma realização da presente invenção, a queda de pressão interna pode ser graduada, como compreendendo duas ou mais etapas. Se duas ou mais etapas forem providas, a queda de pressão interna pode começar com a mais alta queda de pressão e seguida por uma redução em quedas sucessivas na pressão, de acordo com o número de etapas.
[0074] O processo de homogeneização descrito aqui resulta em um material de biomassa quebrado compreendendo células rompidas. As células rompidas podem estar presentes em uma quantidade de pelo menos 80% em peso (20% das células permanecem não rompidas), preferencialmente pelo menos 90% em peso, ainda mais preferencialmente pelo menos 95% em peso, ainda mais preferido pelo menos 98% em peso. Tipicamente, o material de biomassa rompido pode ser uma pasta fluida de proteína relativamente viscosa contando componentes celulares solúveis e particulados, como proteínas; resíduos celulares; RNA; DNA; vitaminas; minerais: e aminoácidos (como aminoácidos livres).
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20/32 [0075] Assim, em uma realização da presente invenção, o material de biomassa rompido pode ser ainda tratado pela aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos.
[0076] Em uma realização da presente invenção em que o primeiro processo de separação pode ser uma primeira filtração em membrana. Preferencialmente, a primeira filtração em membrana pode ser uma microfiltração.
[0077] No presente contexto, o termo “microfiltração” (comumente abreviado para MF) se refere a um tipo de processo de filtração física no qual um fluido contaminado é passado através de uma membrana com tamanho de poro especial para separar micro-organismos e partículas suspensas do líquido do processo.
[0078] Em uma realização da presente invenção, o primeiro processo de separação pode ter um valor limite de peso molecular (MWCO) maior que 1.000.000 Dalton, como maior que 1.200.000 Dalton, por exemplo, maior que 1.500.000 Dalton.
[0079] Em uma realização adicional da presente invenção, a primeira filtração em membrana pode ter um tamanho de poro na variação de 0,03-10 pm, como um tamanho de poro na variação de 0,05-5 pm, por exemplo, um tamanho de poro na variação de 0.1-2, como um tamanho de poro na variação de 0,15-1, por exemplo, um tamanho de poro na variação de 0,2-0,75, como um tamanho de poro na variação de 0,25-0,5.
[0080] A primeira filtração em membrana pode envolver uma membrana de polímero orgânico, como polissulfonas, poli(estirenos), PVDF (fluoreto de polivinilideno) e PAN (poliacrilonitrila) incluindo copolímeros contendo estireno, como acrilonitrila-estireno, butadieno-estireno e copolímeros de halogeneto de estireno-vinilbenzila, policarbonatos, polímero celulósicos, polipropileno, cloreto de polivinila, tereftalato de poli(etileno); ou uma membrana de polímero
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21/32 inorgânico, como um material de filtro de membrana de cerâmica. Preferencialmente, a primeira filtração em membrana pode envolver um material de filtro de membrana de cerâmica.
[0081] Em uma realização da presente invenção, a primeira filtração em membrana pode ser um filtro de disco dinâmico.
[0082] Em uma realização preferida da presente invenção, o material de biomassa rompido pode ser fornecido a um primeiro processo de separação que envolve um processo de microfiltração, preferencialmente, utilizando material de filtro de membrana de cerâmica. Do processo de microfiltração, pode ser provido um primeiro retentado, o dito primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares. Do processo de microfiltração, pode ser provido um primeiro permeado, o dito primeiro permeado compreendendo RNA, DNA, vitaminas, minerais e aminoácidos (aminoácidos livres).
[0083] O primeiro permeado obtido do primeiro processo de separação pode ser sujeito a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos das vitaminas, minerais, e dos aminoácidos (aminoácidos livres).
[0084] Em uma realização da presente invenção, o segundo tratamento envolve uma segunda filtração em membrana, a dita segunda filtração em membrana provê um segundo retentado compreendendo os ácidos nucleicos e um segundo permeado compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos; ou um tratamento de precipitação no qual o ácido nucleico é precipitado e uma fração líquida compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos (aminoácidos livres).
[0085] Em outra realização da presente invenção, a segunda filtração em membrana pode ser uma ultrafiltração provendo um segundo retentado compreendendo os ácidos nucleicos e um segundo permeado compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos (aminoácidos livres).
[0086] Preferencialmente, a segunda filtração em membrana pode ter um valor limite de peso molecular (MWCO) na variação de 10.000-100.000 Dalton, como
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22/32 na variação de 25.000-75.000 Dalton. Além disso, é preferido que a segunda filtração em membrana possa ter um tamanho de poro na variação de 0,0020,1 pm, como um tamanho de poro na variação de 0,005-0,05 pm, por exemplo, um tamanho de poro na variação de 0,0075-0,01.
[0087] A segunda filtração em membrana pode envolver uma membrana de polímero orgânica, como polissulfonas, poli(estirenos), PVDF (fluoreto de polivinilideno) e PAN (poliacrilonitrila) incluindo copolímeros contendo estireno, como acrilonitrila-estireno, butadieno-estireno e copolímeros de halogeneto de estireno-vinilbenzila, policarbonatos, polímero celulósicos, polipropileno, cloreto de polivinila, tereftalato de poli(etileno); ou uma membrana de polímero inorgânico, como um material de filtro de membrana de cerâmica. Preferencialmente, a segunda filtração em membrana pode envolver uma membrana de polímero orgânica.
[0088] Em uma realização da presente invenção, a membrana de cerâmica utilizada na primeira filtração em membrana (e/ou na segunda filtração em membrana) pode ser à base a alumínio, titânio, óxidos de zircônia, carboneto de silício ou alguns materiais vítreos.
[0089] Em uma realização adicional da presente invenção, a segunda filtração em membrana pode ser um filtro de disco dinâmico.
[0090] Em outra realização da presente invenção, o segundo tratamento pode envolver a precipitação dos ácidos nucleicos. Preferencialmente, os ácidos nucleicos podem ser precipitados das vitaminas, minerais, e aminoácidos pela adição de um álcool orgânico, preferencialmente, um álcool selecionado dentre etanol ou isopropanol.
[0091] Após a precipitação dos ácidos nucleicos, o álcool orgânico, como isopropanol ou etanol, pode ser removido do sobrenadante por evaporação ou destilação.
[0092] Em uma realização preferida da presente invenção, o primeiro permeado pode ser fornecido a um segundo processo de separação que envolve preferencialmente um processo de ultrafiltração, preferencialmente,
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23/32 utilizando material de filtro de membrana de cerâmica; ou um processo de precipitação no qual os ácidos nucleicos são precipitados utilizando etanol ou isopropanol. Do processo de ultrafiltração, um segundo retentado pode ser provido, o dito segundo retentado compreendendo ácidos nucleicos (RNA e DNA). Do processo de ultrafiltração, um segundo permeado pode ser provido, o dito segundo permeado compreendendo vitaminas, minerais e aminoácidos (aminoácidos livres).
[0093] Em uma realização da presente invenção, a membrana de cerâmica utilizada na primeira etapa de separação; na segunda etapa de separação ou em ambas as etapas de separação pode ser colocada sob pressão para melhorar a capacidade e/ou eficácia da membrana. Tipicamente, um fluxo turbulento pode ser transmitido ao material de biomassa em contato com a membrana e esse fluxo turbulento agita os líquidos adjacentes à membrana e permite um conteúdo maior de sólidos no retentado.
[0094] A pressão aplicada pode ser aplicada com uma bomba e/ou com um gás inerte sob pressão ao material de biomassa.
[0095] Geralmente, produtos destinados a entrar no mercado como produto alimentício ou ração ou como um ingrediente para consumo precisam ser tratados para matar micróbios (principalmente, bactérias) e eliminar patógenos. A pasteurização é um processo geralmente utilizando na indústria de alimentos, ração e bebidas para reduzir o número de patógenos viáveis, de modo que sejam improváveis de causarem doença.
[0096] Em uma realização da presente invenção, a uma ou mais frações ou o produto de SCP pode ser pasteurizado.
[0097] No caso de o teor de ácidos nucleicos em uma ou mais frações ou no produto de SCP precisar ser ainda mais reduzido, sequências adicionais de um ou de uma combinação dos processos de separação, por exemplo, as filtrações em membrana (microfiltração e ultrafiltração), conforme aqui descritas, podem ser executadas. Alternativamente, a remoção adicional de ácidos nucleicos da uma ou mais frações ou do produto de SCP pode envolver o tratamento
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24/32 enzimático da uma ou mais frações ou do produto de SCP.
[0098] Em uma realização da presente invenção, o método ainda compreende a etapa de:
(vi) sujeitar uma primeira fração ou o primeiro retentado obtido na etapa (iii); e/ou a quarta fração ou o segundo permeado compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv); e/ou a quinta fração ou o produto de SCP provido na etapa (v) a um tratamento enzimático que hidrolisa os ácidos nucleicos restantes ou fragmentos destes em nucleotídeos individuais.
[0099] As enzimas utilizadas para a hidrólise dos ácidos nucleicos restantes ou fragmentos destes em nucleotídeos individuais podem ser selecionadas dentre nuclease, nucleosidase ou a nucleotidase.
[0100] Quando as enzimas foram adicionadas para reduzir o teor de ácido nucleico, a atividade enzimática pode ser preferencialmente inativada. Com isso, o método pode ainda compreender a etapa de:
(vii) inativação da enzima adicionada na etapa (vi).
[0101] Em uma realização da presente invenção, o processo de quebra celular na etapa (ii); o primeiro processo de separação na etapa (iii); o segundo tratamento na etapa (iv); a preparação do produto de SCP na etapa (v); o tratamento com enzima na etapa (vi) e/ou a inativação de enzima na etapa (vii) é/são realizados sob condições de temperatura controlada, preferencialmente, em uma temperatura de menos que 50 °C, particularmente preferencialmente de 25 a 50 °C, por exemplo, de 25 a 35 °C.
[0102] O método, de acordo com a presente invenção, pode, além disso, compreender a etapa de adição de um ou mais ácidos graxos insaturados, como ARA, DHA e/ou EPA, a uma ou mais frações obtidas da presente invenção, como ao primeiro retentado obtido na etapa (iii), ao segundo permeado obtido na etapa (iv) e/ou ao produto de SCP obtido na etapa (v). Com isso, em uma realização da presente invenção, a uma ou mais frações, o primeiro retentado, o segundo permeado, e/ou o produto de SCP pode ser
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25/32 combinado a um ou mais ácidos graxos insaturados, como ARA, DHA e/ou EPA, preferencialmente, o produto de SCP pode ser combinado a DHA.
[0103] O método da presente invenção resulta em uma ou mais frações exclusivas, ou produto de SCP com diversas funcionalidades aprimoradas, desvantagens reduzidas e aplicações.
[0104] Uma realização preferida da presente invenção se refere a uma ou mais frações ou um produto de SCP compreendendo um material de biomassa e um teor reduzido de ácidos nucleicos, em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos no material de biomassa.
[0105] Pode ser preferido que a degradação enzimática dos ácidos nucleicos não seja utilizada em quantidades muito grandes de ácidos nucleicos, uma vez que o processo simplesmente resulta na degradação dos ácidos nucleicos em nucleotídeos e nucleosídeos, mas não remove os componentes e o desafio com articulações e rins, gota, artrite gotosa e pedras nos rins ainda podem ocorrer.
[0106] Em uma realização da presente invenção, a uma ou mais frações ou o produto de SCP pode compreender menos que 90 mg de ácidos nucleicos por grama de material de biomassa em uma base de matéria seca, como menos que 75 mg/g de material de biomassa, por exemplo, menos que 50 mg/g de material de biomassa, como menos que 25 mg/g de material de biomassa, por exemplo, menos que 1 mg/g de material de biomassa, como menos que 750 pg/g de material de biomassa, por exemplo, menos que 500 pg/g de material de biomassa, como menos que 100 pg/g de material de biomassa, por exemplo, menos que 10 pg/g de material de biomassa.
[0107] Pode ser preferido que a uma ou mais frações ou o produto de SCP pode compreender um teor de ácido nucleico de 0,01 a 4,5% em peso em uma base de matéria seca, como 0,1 a 4%, por exemplo, de 1 a 3,5%, como de 2 a 3%, por exemplo, cerca de 2,2% em peso em uma base de matéria seca.
[0108] Em uma realização adicional da presente invenção, a uma ou mais frações ou produto de SCP pode compreender um material de proteína de
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26/32 célula única. Além disso, preferencialmente, a uma ou mais frações ou o produto de SCP compreende uma bactéria metanotrófica.
[0109] Como os ácidos nucleicos foram removidos do produto de SCP, de acordo com a presente invenção, o teor de proteína do produto de SCP da presente invenção pode ser maior do que o dos produtos do estado da técnica, em que os ácidos nucleicos são simplesmente mantidos no produto de SCP ou em que somente a degradação enzimática dos ácidos nucleicos foi introduzida. [0110] A uma ou mais frações ou o produto de SCP, de acordo com a presente invenção, pode compreender pelo menos 50% de proteína em uma base de matéria seca, como pelo menos 60% de proteína em uma base de matéria seca, por exemplo, pelo menos 70% de proteína em uma base de matéria seca, como pelo menos 80% de proteína em uma base de matéria seca, por exemplo, pelo menos 90% de proteína em uma base de matéria seca, como pelo menos 95% de proteína em uma base de matéria seca, por exemplo, na variação de 50-95% de proteína em uma base de matéria seca, como na variação de 60-85% de proteína em uma base de matéria seca, por exemplo, na variação de 65-75% de proteína em uma base de matéria seca, como na variação de 68-83% de proteína em uma base de matéria seca.
[0111] E m uma realização da presente invenção, a uma ou mais frações ou produto de SCP pode ser suplementado com um ou mais ácidos graxos. Preferencialmente, a uma ou mais frações ou produto de SCP pode compreender um ou mais ácidos graxos insaturados, como ARA, DHA e/ou EPA, preferencialmente, a uma ou mais frações ou produto de SCP pode compreender DHA. O teor de ácidos graxos insaturados na uma ou mais frações ou produto de SCP pode ser dependente do uso pretendido do produto. Na realização da presente invenção, a uma ou mais frações ou produto de SCP compreende 0,5-15% (p/p) em uma base de matéria seca dos ácidos graxos insaturados.
[0112] Embora a uma ou mais frações ou produto de SCP, de acordo com a presente invenção, possa ser utilizado diretamente em ou como um ingrediente
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27/32 para produtos alimentícios ou ração, a uma ou mais frações ou produto de SCP pode comumente ser adicionalmente processado, por exemplo, para remover água em excesso do produto. Durante o processamento adicional, a uma ou mais frações ou produto de SCP também pode ser sujeito a uma etapa de secagem adicional para prover um produto seco compreendendo uma ou mais frações ou SCP. A uma ou mais frações ou produto de SCP seco pode ter um teor de umidade de 15% ou menos, como 10% ou menos, por exemplo, 8% ou menos, como 5% ou menos. A etapa de secagem adicional pode ser provida ao utilizar um secador de spray.
[0113] A uma ou mais frações ou produto de SCP, de acordo com a presente invenção, pode ser utilizado diretamente como um produto alimentício ou ração; ou pode ser utilizado como um ingrediente para um alimento ou um produto de ração. Em uma realização preferida da presente invenção, a ração pode ser uma ração para peixe ou ração para animal ou ração para humanos, preferencialmente, uma ração para peixe ou uma ração para animal.
[0114] Em uma realização da presente invenção, a uma ou mais frações ou o produto de SCP pode ser utilizado para alimento ou ração ou ser liberado a fim de melhorar ou otimizar a saúde, desempenho ou bem-estar de humanos ou animais, como, entre outros, animais biungulados (por exemplo, gado, cabras, ovelhas, porcos, etc.), aves domésticas (por exemplo, aves, galinhas, patos, gansos, peru etc.), peixe (por exemplo, salmão, alabote, truta, bacalhau, ou outras espécies criadas em cativeiro) ou mariscos (por exemplo, moluscos, como mexilhões, ostras, camarões, lagostins, lagostas, ou vieiras).
[0115] A Figura 1 ilustra uma realização da presente invenção na qual começamos com a provisão do material de biomassa, compreendendo aminoácidos; proteínas; resíduos celulares; vitaminas; minerais; RNA e DNA.
[0116] O material de biomassa pode ser preferencialmente derivado de um material de proteína de célula única, particularmente compreendendo bactérias metanotróficas. A cepa preferida de bactérias metanotróficas, sendo Methylococcus capsulatus (NCIMB 11132), é provida da NCIMB (National
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Collection of Industrial, Food e Marine Bacteria, Aberdeen, Scotland [Escócia]). Como M. capsulatus pode oxidar somente carbonetos em álcoois, aldeidos e ácidos carboxílicos correspondentes, mas não pode oxidar carbonetos maiores completamente em dióxido de carbono e água ou utilizá-los para a produção de biomassa, três outras cepas Alcaligenes acidovorans (NCIMB 13287), Bacillus firmus (NCIMB 13289) e Aneurínibacillus danicus (NCIMB 13288) também são providas e utilizadas junto a M. capsulatus. A fonte de carbono preferida pela presente invenção pode ser gás natural, biogás, singás, metano ou metanol. [0117] Após a fermentação final, preferencialmente, em uma cultura contínua, o material de biomassa é coletado, isso não é apresentado na Figura 1, mas o procedimento de cultivo do material de biomassa e colheita do material de biomassa é bem conhecido ao técnico no assunto. Após a colheita, parte da água é separada do material de biomassa utilizando um processo de ultrafiltração inicial, aumentando o teor de matéria seca de cerca de 2% para cerca de 15% (p/p). Essa ultrafiltração inicial tem uma exclusão por tamanho na variação de cerca de 100.000 Daltons, e o processo de ultrafiltração inicial é realizado em uma temperatura entre 40 e 50 °C.
[0118] O material de biomassa é, então, homogeneizado e esse processo envolve uma alteração na pressão provida como uma queda de pressão de 600-1500 bar, levando a um material de biomassa rompido. Esse processo de homogeneização não é ilustrado na Figura 1, mas é realizado após a colheita do material de biomassa e antes de aplicar o material de biomassa ao primeiro processo de separação, a filtração em membrana (MF).
[0119] O material de biomassa rompido provido é sujeito à MF utilizando um filtro de disco dinâmico semipermeável com um tamanho de poro de 0,5 pm com 3 membranas de cerâmicas discoides. Esse dispositivo inclui um sistema de retrolavagem que envia uma parte do permeado de volta à membrana a cada 20 segundos. Nesse sistema, os discos rotativos limitam o entupimento da membrana e a formação de camada de polarização. A MF é realizada em um período máximo de 24 horas, por exemplo, por um período menor que 24
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29/32 horas, por exemplo, por um período menor que 15 horas, por exemplo, por um período menor que 11 horas, por exemplo, por um período menor que 8 horas, por exemplo, por um período menor que 6 horas, por exemplo, por um período menor que 4 horas.
[0120] O primeiro retentado resultante, obtido do processo de MF compreende proteínas e resíduos celulares e o primeiro permeado compreende o DNA, RNA e vitaminas, minerais e aminoácidos.
[0121] O primeiro permeado é, então, aplicado a uma segunda filtração em membrana sendo uma ultrafiltração (UF). A membrana de UF é um filtro de disco dinâmico semipermeável com um tamanho de poro de MWCO de 20 nm ou 5000 Da. Esse dispositivo também inclui um sistema de retrolavagem que envia uma parte do permeado de volta à membrana a cada 20 segundos. Nesse sistema, os discos rotativos limitam o entupimento da membrana e a formação de uma camada de polarização. A UF é realizada em um período máximo de 24 horas, por exemplo, por um período menor que 24 horas, por exemplo, por um período menor que 15 horas, por exemplo, por um período menor que 11 horas, por exemplo, por um período menor que 8 horas, por exemplo, por um período menor que 6 horas, por exemplo, por um período menor que 4 horas.
[0122] O segundo retentado resultante obtido do processo de UF compreende DNA e RNA, enquanto o segundo permeado compreende as vitaminas, minerais e aminoácidos.
[0123] O componente líquido do material de biomassa passa através da membrana de MF de cerâmica semipermeável, doravante mencionado primeiro permeado. O componente que não passa através da membrana de MF de cerâmica semipermeável, doravante mencionado primeiro retentado, tem uma concentração maior de resíduos celulares e proteínas que o primeiro permeado. O primeiro retentado de MF é coletado, e o primeiro permeado continua para separação adicional ao contatar o primeiro permeado com a membrana de UF de cerâmica semipermeável sob as condições anteriores até
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30/32 a composição desejada do segundo retentado ser obtida. O segundo permeado é o líquido de filtração que passa através da membrana de UF de cerâmica semipermeável, doravante mencionado segundo permeado. O componente que não passa através da membrana de UF de cerâmica semipermeável, doravante mencionado segundo retentado, tem uma concentração maior de ácidos nucleicos que o segundo permeado, o primeiro permeado e o primeiro retentado.
[0124] A uma ou mais frações ou produto de SCP pode ser provido ao combinar o retentado da MF (o primeiro retentado) com o permeado da UF (o segundo permeado). Essa combinação resulta em um produto de fermentação tendo um teor reduzido de ácido nucleico em relação ao material de biomassa e aos produtos correspondentes descritos na técnica anterior.
[0125] Com isso, a fração de biomassa combinada ou produto de SCP, compreendendo o primeiro retentado e um segundo permeado de duas filtrações consecutivas provê uma fração de biomassa ou um produto de SCP enriquecido em resíduos de parede celular, proteínas, minerais, vitaminas e aminoácidos, obtidos do processamento da biomassa de fermentação, preferencialmente, compreendendo bactérias metanotróficas.
[0126] No presente contexto, os termos teor de “matéria seca” e “resíduo” foram determinados de acordo com o método A.O.A.C. (Padrão A.O.A.C. de referência, 1945).
[0127] A concentração de DNA e RNA total da uma ou mais frações que foram avaliadas por extrações de fenol-clorofórmio e medições de concentração de ácido nucleico, ao medir a absorbância em 260 nm. Uma extração de fenolclorofórmio é uma extração líquido-líquido. Uma extração líquido-líquido é um método que separa misturas de moléculas com base na solubilidade diferencial das moléculas individuais em dois líquidos imiscíveis diferentes. Extrações de líquido-líquido são amplamente utilizadas para isolar DNA e RNA total (Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Toxicological Profile for Chloroform. Atlanta, GA: U.S. Department of Health and Human Services,
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Public Health Service; 1997).
[0128] Como uma alternativa ao uso de membranas de cerâmica, o uso de membranas de polímero orgânico com as adaptações adequadas, no primeiro processo de separação e/ou no segundo processo de separação, pode ser utilizado também. Polímeros orgânicos preferidos podem ser polissulfonas, poli(estirenos), PVDF (fluoreto de polivinilideno) e PAN (poliacrilonitrila) incluindo copolímeros contendo estireno, como acrilonitrila-estireno, butadienoestireno e copolímeros de halogeneto de estireno-vinilbenzila, policarbonatos, polímeros celulósicos, polipropileno, cloreto de polivinila, tereftalato de poli(etileno).
[0129] Ainda, a sequência mencionada acima de etapas é preferida, as vitaminas, minerais e aminoácidos podem ser removidos do material de biomassa antes de o ácido nucleico ser removido das proteínas/peptídeos e/ou dos resíduos celulares. Neste caso, o método, de acordo com a presente invenção, para remover ácidos nucleicos de um material de biomassa compreende as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas, resíduos celulares e/ou ácido nucleico; e um primeiro permeado compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(iva) suspender o primeiro retentado em um líquido;
(ivb) sujeitar o primeiro permeado suspenso a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos de proteínas e/ou resíduos celulares;
(v) opcionalmente, combinação do primeiro permeado obtido na etapa (iii) com as proteínas e/ou resíduos celulares obtidos na etapa (iv), provendo uma fração na qual os ácidos nucleicos foram removidos.
[0130] Preferencialmente, o líquido é uma fase aquosa. A fase aquosa pode
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32/32 ser preferencialmente água.
[0131] Deve ser observado que as realizações e aspectos descritos no contexto de um dos aspectos da presente invenção também se aplicam a outros aspectos da invenção.
[0132] Todas as referências de patente e não patente mencionadas no presente pedido são aqui incorporadas por referência em sua integridade.
Referências [0133] WO 2010/069313;
[0134] WO 2000/70014;
[0135] US 2004/0241790.
Claims (15)
1. Método para prover uma ou mais frações de um material de biomassa, caracterizado pelo método compreender as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em uma primeira fração (primeiro retentado) compreendendo proteínas, e uma segunda fração (primeiro permeado) compreendendo ácidos nucleicos;
(iv) sujeitar a segunda fração (primeiro permeado) a um segundo tratamento que resulta em uma terceira fração (segundo retentado) compreendendo ácido nucleico e uma quarta fração (segundo permeado) compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela primeira fração obtida na etapa (iii) ser combinada à quarta fração obtida na etapa (iv), provendo uma quinta fração.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo primeiro processo de separação compreender uma primeira filtração em membrana ou um primeiro processo de separação cromatográfica.
4. Método para prover um produto de proteína de célula única (produto de SCP) de um material de biomassa, caracterizado pelo dito produto de SCP compreender uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos no material de biomassa, o método compreendendo as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
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2/4 (iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos;
(iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo o produto de SCP compreendendo uma quantidade reduzida de ácidos nucleicos em relação à quantidade que ocorre naturalmente de ácidos nucleicos.
5. Método para remover ácidos nucleicos de um material de biomassa, caracterizado pelo método compreender as etapas de:
(i) provisão do material de biomassa;
(ii) sujeitar o material de biomassa a um processo de quebra celular, provendo um material de biomassa rompido;
(iii) aplicação do material de biomassa rompido a um primeiro processo de separação que resulta em um primeiro retentado compreendendo proteínas e/ou resíduos celulares, e um primeiro permeado compreendendo ácidos nucleicos;
(iv) sujeitar o primeiro permeado a um segundo tratamento que separa os ácidos nucleicos de vitaminas, minerais e/ou aminoácidos;
(v) opcionalmente, combinar o primeiro retentado obtido na etapa (iii) com as vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv), provendo um produto de SCP em que os ácidos nucleicos foram removidos.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo primeiro processo de separação ser uma primeira filtração por membrana.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela primeira filtração por membrana ser uma microfiltração.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores,
Petição 870190056754, de 19/06/2019, pág. 39/50
3/4 caracterizado pelo segundo tratamento envolver uma segunda filtração em membrana ou um segundo processo de separação cromatográfica ou um tratamento de precipitação onde os ácidos nucleicos são precipitados e uma fração líquida compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos, em que a dita segunda filtração em membrana provê um segundo retentado compreendendo os ácidos nucleicos e um segundo permeado compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos, e em que a segunda filtração em membrana é uma ultrafiltração.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo material de biomassa ser um material de proteína de célula única.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo material de biomassa compreender uma bactéria metanotrófica.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo método ainda compreender a etapa de:
(vi) sujeitar uma primeira fração ou o primeiro retentado obtido na etapa (iii); e/ou a quarta fração ou o segundo permeado compreendendo vitaminas, minerais e/ou aminoácidos obtidos na etapa (iv); e/ou a quinta fração ou o produto de SCP provido na etapa (v), a um tratamento enzimático que hidrolisa os ácidos nucleicos restantes ou fragmentos destes em nucleotídeos individuais.
12. Fração de biomassa, caracterizada por ser obtida por um método, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Fração de biomassa, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela fração de biomassa compreender pelo menos 50% de proteína em uma base de matéria seca.
14. Ração, caracterizada por compreender a fração de biomassa, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 13.
15. Ração, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela
Petição 870190056754, de 19/06/2019, pág. 40/50
4/4 ração ser ração para peixe, ou ração para animal ou alimento para humano.
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