BR112018076261B1 - Método e sistema de mistura por gotejamento de bocal de reagente - Google Patents

Método e sistema de mistura por gotejamento de bocal de reagente Download PDF

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Bradley Kent Drews
Michael Dai Wang
Umberto Ulmanella
James Michael Osmus
Stephen Wayne Clark
Johanna Lynn Whitacre
Steven Scott Phelps
Michelle L. Alvarez
Michael Adalbert Niziolek
Debra Sue Bryan
Joshua Augustin Darland
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Abstract

Um instrumento de análise pode realizar operações analíticas em um analito que é combinado com múltiplos reagentes antes de ser introduzido para uma célula de fluxo. O instrumento pode incluir um bocal gotejador que aspira reagentes a partir de um recipiente, junto com um analito. Os reagentes podem ser direcionados para um volume e podem ser movidos repetidamente para dentro e para fora do volume através do ciclo de uma bomba. Os reagentes podem ser ejetados para um recipiente de destino com o bocal gotejador promovendo a formação de vórtice no recipiente para aprimorar a misturação. A aspiração e ejeção repetida através do bocal gotejador efetivamente mistura os reagentes e o modelo de um modo automatizado ou semi- automatizado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente dos No. US 15/841,098, depositado em 13 de dezembro de 2017, que reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente dos No. US 62/442,765, depositado em 5 de janeiro de 2017 e também reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente Britânico (GB) No. 1704760.6, depositado em 24 de março de 2017, que também reivindica o benefício de prioridade do Pedido de Patente dos No. US 62/442.765; todos estes pedidos anteriores são incorporados aqui por referência em suas totalidades.
FUNDAMENTOS
[002] Instrumentos foram desenvolvidos e continuam a evoluir para o sequenciamento de moléculas de interesse, particularmente DNA, RNA e outras amostras biológicas. Antes das operações de sequenciamento, amostras das moléculas de interesse são preparadas de maneira a formam uma biblioteca ou modelo que será misturado com reagentes e por último introduzido para uma célula de fluxo onde moléculas individuais vão anexar em sítios e serão amplificadas para aprimorar a capacidade de detecção. A operação de sequenciamento, então, inclui repetir um ciclo de etapas para ligar as moléculas nos sítios, marcar os componentes de ligação, formar imagem dos componentes nos sítios, e processar os dados de imagem resultantes.
[003] Em tais sistemas de sequenciamento, sistemas fluídicos (ou subsistemas) provêm o fluxo de substâncias (por exemplo, os reagentes) sob o controle de um sistema de controle, tal como um computador programado e interfaces apropriadas.
SUMÁRIO
[004] Detalhes de uma ou mais implementações do assunto descrito nesta especificação são definidos nos desenhos anexos e a descrição abaixo. Outras funcionalidades, aspectos, e vantagens serão aparentes a partir da descrição, os desenhos, e as reivindicações.
[005] Em algumas implementações, um sistema pode ser provido que inclui um caminho de escoamento a ser conectado de maneira fluida com uma célula de fluxo para suportar analitos de interesse em um sistema de análise; um sistema fluídico para aspirar reagentes a partir de recipientes de reagente, para misturar os reagentes, para ejetar os reagentes misturados para um recipiente de destino, e para distribuir os reagentes misturados a partir do recipiente de destino para o caminho de escoamento; e um bocal gotejador em comunicação fluida com o sistema fluídico, o bocal gotejador compreendendo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um inserto de bocal disposto em uma extremidade distal do lúmen central, em que o bocal gotejador serve tanto para aspirar os reagentes misturados a partir do recipiente quanto para ejetar reagentes misturados de volta para o recipiente de destino através do inserto de bocal.
[006] Em algumas implementações do sistema, o bocal e o lúmen podem ser dimensionados para promover a formação de vórtice de mistura no recipiente de destino quando os reagentes são expelidos a partir do bocal gotejador através do inserto de bocal e para o recipiente de destino.
[007] Em algumas implementações do sistema, o lúmen pode ter um diâmetro interno nominal de cerca de 0,5 mm e o inserto de bocal pode ser um inserto tubular que possui um diâmetro interno nominal de cerca de 0,25 mm.
[008] Em algumas implementações do sistema, a extremidade distal do bocal gotejador pode ter uma forma em cunha com facetas se encontrando em um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
[009] Em algumas implementações do sistema, o inserto de bocal pode ter uma extremidade distal que é compatível com o formato com a forma em cunha da extremidade distal do bocal gotejador.
[0010] Em algumas implementações do sistema, a forma em cunha pode incluir quatro facetas se encontrando em o ápice.
[0011] Em algumas implementações do sistema, o bocal gotejador pode se estender até uma distância nominal de 2 mm a partir de uma superfície de fundo do recipiente de destino.
[0012] Em algumas implementações do sistema, o sistema pode incluir uma pluralidade de outros gotejadores para aspirar respectivos reagentes; os outros gotejadores podem não ter insertos de bocal.
[0013] Em algumas implementações do sistema, o bocal gotejador pode ser para acelerar os recipientes misturados até uma velocidade de escoamento de pelo menos cerca de 1600 mm/s em uma taxa de fluxo de pelo menos cerca de 5.000 μL/min.
[0014] Em algumas implementações, um sistema pode ser provido que inclui uma célula de fluxo para suportar analitos de interesse em um sistema de análise; um sistema fluídico para aspirar reagentes, para misturar os reagentes, para ejetar os reagentes misturados para um recipiente de destino, e para distribuir os reagentes misturados a partir do recipiente de destino para a célula de fluxo; um bocal gotejador em comunicação fluida com o sistema fluídico, o bocal gotejador compreendendo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um bocal localizado em uma extremidade distal do corpo alongado, em que o bocal reduz um diâmetro interno nominal do lúmen central; e circuitos de controle acoplados de maneira operativa com o sistema fluídico, os circuitos de controle para controlar o sistema fluídico fazem com que o sistema fluídico: aspire um conjunto de reagentes um por um, ejete os reagentes no conjunto de reagentes para o recipiente de destino através do bocal, aspire o conjunto de reagentes a partir do recipiente de destino através do bocal para a mistura, e ejete o conjunto de reagentes misturados de volta para o recipiente de destino através do bocal.
[0015] Em algumas implementações do sistema, o bocal pode incluir um inserto inserido no lúmen central na extremidade distal do bocal gotejador.
[0016] Em algumas implementações do sistema, o recipiente de destino pode conter um analito a ser sequenciado.
[0017] Em algumas implementações do sistema, o lúmen central pode ter um diâmetro interno nominal de 0,5 mm e o bocal pode ter um diâmetro interno nominal de 0,25 mm.
[0018] Em algumas implementações do sistema, a extremidade distal do bocal gotejador pode ter uma forma em cunha com facetas se encontrando em um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
[0019] Em algumas tais implementações do sistema, o bocal pode ter uma extremidade distal que é compatível com o formato com a forma em cunha da extremidade distal do bocal gotejador.
[0020] Em algumas implementações, um método pode ser provido que inclui: a) atuar uma bomba para aspirar, um por um, uma pluralidade de reagentes a partir de uma correspondente pluralidade de recipientes de reagente; b) atuar a bomba para ejetar os reagentes para um recipiente de destino via um bocal gotejador em comunicação fluida com a bomba, o bocal gotejador compreendendo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um bocal localizado em uma extremidade distal do corpo alongado, em que o bocal reduz um diâmetro interno nominal do lúmen central; c) atuar a bomba para aspirar os reagentes a partir do recipiente de destino e através do bocal gotejador para misturar adicionalmente os reagentes; e d) atuar a bomba para ejetar os reagentes a partir do bocal gotejador e de volta para o recipiente de destino.
[0021] Em algumas implementações do método, o bocal e o lúmen podem ser dimensionados para promover a formação de vórtice de mistura no recipiente de destino quando os reagentes são expelidos a partir do bocal gotejador através do bocal e para o recipiente de destino.
[0022] Em algumas implementações do método, o lúmen central pode ter um diâmetro interno nominal de 0,5 mm e o bocal pode incluir um inserto que é inserido para o lúmen central e que possui um diâmetro interno nominal de 0,25 mm.
[0023] Em algumas implementações do método, a extremidade distal do bocal gotejador pode ter uma forma em cunha com facetas se encontrando em um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
[0024] Em algumas implementações do método, os reagentes podem incluir pelo menos três reagentes de diferentes gravidades específicas.
[0025] Em algumas implementações do método, o método pode incluir adicionalmente a realização de uma ou mais repetições de (b) e (c) antes de realizar (d).
[0026] Detalhes de uma ou mais implementações do assunto descrito nesta especificação são definidos nos desenhos anexos e a descrição abaixo. Outras funcionalidades, aspectos, e vantagens serão aparentes a partir da descrição, os desenhos, e as reivindicações. Note que as dimensões relativas das seguintes figuras podem não estar desenhadas em escala.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0027] Estas e outras funcionalidades, aspectos, e vantagens da presente descrição serão mais bem entendidas quando a seguinte descrição detalhada é lida com referência aos desenhos anexos em que caracteres semelhantes representam partes semelhantes através dos desenhos, em que:
[0028] A FIG. 1 é uma visão geral diagramática de um exemplo de sistema de sequenciamento em que as técnicas divulgadas podem ser empregadas.
[0029] A FIG. 2 é uma visão geral diagramática de um exemplo de sistema fluídico do sistema de sequenciamento da FIG. 1.
[0030] A FIG. 3 é uma visão geral diagramática de um exemplo de sistema de controle e processamento do sistema de sequenciamento da FIG. 1.
[0031] A FIG. 4 é uma vista de perspectiva de um exemplo de um coletor de reagente com válvulas seletoras.
[0032] A FIG. 5 é uma vista de topo do exemplo de arranjo de válvula e coletor da FIG. 4.
[0033] A FIG. 6A é uma vista diagramática de um exemplo de arranjo para aspirar e misturar reagentes e um modelo de amostra, enquanto a FIG. 6B mostra como reagentes e um modelo de amostra podem ser estriados antes da mistura.
[0034] A FIG. 7 é uma vista diagramática de um exemplo de como reagentes a ser misturados podem ser aspirados individualmente para um volume de mistura.
[0035] A FIG. 8 é uma seção diagramática de um exemplo de vaso de recipiente de destino para reagente misturado e um modelo de amostra mostrando um bocal gotejador que ejeta reagentes misturados para o recipiente.
[0036] As FIGS. 9A - 9D ilustram um exemplo de bocal gotejador que pode ser usado na mistura dos reagentes.
[0037] A FIG. 10 é uma representação gráfica de exemplo de ciclos de aspiração e mistura de reagentes e um modelo de amostra.
[0038] E a FIG. 11 é um fluxograma ilustrando exemplo de lógica para aspirar e misturar reagentes e um modelo de amostra.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0039] A FIG. 1 ilustra uma implementação de um sistema de sequenciamento 10 configurado para processar amostras moleculares que podem ser sequenciadas para determinar os seus componentes, a ordenação de componente, e em geral a estrutura da amostra. O sistema inclui um instrumento 12 que recebe e processa uma amostra biológica. Uma fonte de amostra 14 provê a amostra 16 que em muitos casos vai incluir uma amostra de tecido. A fonte de amostra pode incluir, por exemplo, um indivíduo ou sujeito, tal como um humano, animal, microrganismo, planta, ou outro doador (incluindo amostras ambientais), ou qualquer outro sujeito que inclui moléculas orgânicas de interesse, a sequência a qual deve ser determinada. O sistema pode ser usado com amostras diferentes do que aquelas a partir de organismos, incluindo moléculas sintetizadas. Em muitos casos, as moléculas vão incluir DNA, RNA, ou outras moléculas tendo pares de base a sequência da qual pode definir genes e variantes tendo particulares funções de interesse final.
[0040] A amostra 16 é introduzida para um sistema de preparo de amostra/biblioteca 18. Este sistema pode isolar, romper, e de outra forma preparar a amostra para a análise. A biblioteca resultante inclui as moléculas de interesse em comprimentos que facilitam a operação de sequenciamento. A biblioteca resultante então é provida para o instrumento 12 onde a operação de sequenciamento é realizada. Na prática, a biblioteca, que algumas vezes pode ser referida como um modelo, é combinada com reagentes em um processo automatizado ou semi-automatizado, e então introduzida para a célula de fluxo antes do sequenciamento.
[0041] Na implementação ilustrada na FIG. 1, o instrumento inclui uma célula de fluxo ou matriz 20 que recebe a biblioteca de amostra. A célula de fluxo inclui um ou mais canais fluídicos que permitem que a química de sequenciamento ocorra, incluindo a anexação das moléculas da biblioteca, e a amplificação em localizações ou sítios que podem ser detectados durante a operação de sequenciamento. Por exemplo, a célula de fluxo/matriz 20 pode incluir modelos de sequenciamento imobilizados em uma ou mais superfícies nas localizações ou sítios. A “célula de fluxo” pode incluir uma matriz padronizada, tal como uma micromatriz, uma nanomatriz, e assim por diante. Na prática, as localizações ou sítios pode ser disposto em um padrão regular, repetitivo, um padrão não repetitivo complexo, ou em um arranjo aleatório em uma ou mais superfícies de um suporte. Para permitir que a química de sequenciamento ocorra, a célula de fluxo também permite a introdução de substâncias, tal como incluindo vários reagentes, tampões, e outros meios de reação, que podem ser usados para reações, descarga, e assim por diante. As substâncias escoam através da célula de fluxo e podem contatar as moléculas de interesse nos sítios individuais.
[0042] No instrumento a célula de fluxo 20 é montada em um estágio móvel 22 que, nesta implementação, pode ser movido em uma ou mais direções como indicado pelo numeral de referência 24. A célula de fluxo 20, por exemplo, pode ser provida na forma de um cartucho removível e substituível que pode interfacear com portas no estágio móvel 22 ou outros componentes do sistema de maneira a permitir que reagentes e outros fluidos sejam distribuídos para ou a partir da célula de fluxo 20. O estágio está associado com um sistema de detecção óptica 26 que pode direcionar radiação ou luz 28 para a célula de fluxo durante o sequenciamento. O sistema de detecção óptica pode empregar vários métodos, tal como métodos de microscopia por fluorescência, para a detecção dos analitos dispostos nos sítios da célula de fluxo. Por meio de um exemplo não limitante, o sistema de detecção óptica 26 pode empregar varredura de linha confocal para produzir dados de imagem pixelizada progressiva que podem ser analisados para localizar sítios individuais na célula de fluxo e para determinar o tipo de nucleotídeo que foi mais recentemente anexado ou ligado com cada sítio. Outras técnicas de formação de imagem adequadas também podem ser empregadas, tais como técnicas em que um ou mais pontos de radiação são escaneados ao longo da amostra ou técnicas que empregam abordagens de formação de imagem “passo e disparo”. O sistema de detecção óptica 26 e o estágio 22 podem cooperar para manter o sistema de detecção e célula de fluxo em uma relação estática enquanto obtém uma imagem de área, ou, como notado, a célula de fluxo pode ser escaneada de qualquer modo adequado (por exemplo, varredura de ponto, varredura de linha, varredura de “passo e disparo”).
[0043] Enquanto muitas tecnologias diferentes podem ser usadas para a formação de imagem, ou mais em geral para a detecção das moléculas nos sítios, implementações contempladas na atualidade podem fazer o uso de formação de imagem óptica com foco em comprimentos de onda que podem causar a excitação de marcadores fluorescentes. Os marcadores, excitados em virtude do seu espectro de absorção, retornam sinais fluorescentes em virtude do seu espectro de emissão. O sistema de detecção óptica 26 está configurado para capturar tais sinais, para processar dados de imagem pixelizada em uma resolução que permite a análise dos sítios de emissão de sinal, e para processar e armazenar os dados de imagem resultantes (ou dados derivados a partir do mesmo).
[0044] Em uma operação de sequenciamento, operações cíclicas ou processos são implementados de um modo automatizado ou semi-automatizado em que reações são promovidas, tais como com nucleotídeos únicos ou com oligonucleotídeos, seguidos pela descarga, formação de imagem e desbloqueio no preparo para um ciclo subsequente. A biblioteca de amostra, preparada para o sequenciamento e imobilizada na célula de fluxo, pode passar por um número de tais ciclos antes de toda a informação útil ser extraída a partir da biblioteca. O sistema de detecção óptica pode gerar dados de imagem a partir de varreduras da célula de fluxo (e os seus sítios) durante cada ciclo da operação de sequenciamento pelo uso de circuitos de detecção eletrônica (por exemplo, câmeras ou circuitos eletrônicos de formação de imagem ou chips). Os dados de imagem resultantes então podem ser analisados para localizar sítios individuais nos dados de imagem, e para analisar e caracterizar as moléculas presentes nos sítios, tais como pela referência para uma cor específica ou comprimento de onda de luz (um espectro de emissão característico de um marcador fluorescente particular) que é detectado em uma localização específica, como indicado por um grupo ou agrupamento de pixels nos dados de imagem na localização. Em uma aplicação de sequenciamento de DNA ou RNA, por exemplo, os quatro nucleotídeos comuns podem ser representados por espectros de emissão de fluorescência distinguíveis (comprimentos de onda ou faixas de comprimento de onda de luz). Cada espectro de emissão, então, pode ser designado um valor correspondente para aquele nucleotídeo. Com base nesta análise, e rastreio dos valores cíclicos determinados para cada sítio, nucleotídeos individuais e as suas ordens podem ser determinados para cada sítio. Estas sequências então podem ser adicionalmente processadas para montar segmentos mais longos incluindo genes, cromossomas, e assim por diante. Como usado nesta descrição os termos “automatizado” e “semi-automatizado” querem dizer que as operações são realizadas pela programação de sistema ou configuração com pouca ou nenhuma interferência humana uma vez que as operações são iniciadas, ou uma vez que processos incluindo as operações são iniciados.
[0045] Na implementação ilustrada, reagentes 30 são desenhados ou aspirados para a célula de fluxo através de válvulas 32. As válvulas podem acessar os reagentes a partir de recipientes ou vasos em que eles estão armazenados, tal como através de pipetas ou gotejadores (não mostrado na FIG. 1). As válvulas 32 podem permitir a seleção dos reagentes com base em uma sequência prescrita de operações realizadas. As válvulas podem receber adicionalmente comandos para direcionar os reagentes através de caminhos de escoamento 34 para a célula de fluxo 20. Caminhos de escoamento de efluente ou saída 36 direcionam os reagentes usados a partir da célula de fluxo. Na implementação ilustrada, uma bomba 38 serve para mover os reagentes através do sistema. A bomba também pode servir outras funções úteis, tais como medir reagentes ou outros fluidos através do sistema, aspirar ar ou outros fluidos, e assim por diante. Válvulas adicionais 40 a jusante da bomba 38 permitem direcionar apropriadamente o reagente usado para vasos ou recipientes de descarte 42.
[0046] O instrumento inclui adicionalmente uma faixa de circuitos que auxiliam no comando da operação dos vários componentes de sistema, monitorando a sua operação pela resposta a partir de sensores, coletando dados de imagem, e pelo menos parcialmente processando os dados de imagem. Na implementação ilustrada na FIG. 1, um sistema de controle/supervisor 44 inclui um sistema de controle 46 e um sistema de análise e aquisição de dados 48. Ambos os sistemas vão incluir um ou mais processadores (por exemplo, circuitos de processamento digital, tais como microprocessadores, processadores de múltiplos núcleos, FPGA’s, ou quaisquer outros circuitos de processamento adequados) e circuitos de memória associados 50 (por exemplo, dispositivos de memória de estado sólido, dispositivos de memória dinâmicos, dispositivos de memória a bordo e/ou fora de bordo, e assim por diante) que podem armazenar instruções executáveis por máquina para controlar, por exemplo, um ou mais computadores, processadores, ou outros dispositivos lógicos similares para prover certa funcionalidade. Computadores de propósito geral ou específico da aplicação podem pelo menos parcialmente compor o sistema de controle e o sistema de análise e aquisição de dados. O sistema de controle pode incluir, por exemplo, circuitos configurados (por exemplo, programados) para processar comandos para controle fluídico, óptico, de estágio, e qualquer outra função útil do instrumento. O sistema de análise e aquisição de dados 48 interfaceia com o sistema de detecção óptica para comandar o movimento do sistema de detecção óptica ou o estágio, ou ambos, a emissão de luz para detecção cíclica, recebendo e processando sinais retornados, e assim por diante. O instrumento também pode incluir várias interfaces como indicado na referência 52, tal como uma interface de operador que permite o controle e o monitoramento do instrumento, transferência das amostras, lançamento de operações de sequenciamento automatizadas ou semi- automatizadas, geração de relatórios, e assim por diante. Finalmente, na implementação da FIG. 1, redes externas ou sistemas 54 podem ser acoplados com e cooperam com o instrumento, por exemplo, para a análise, controle, monitoramento, serviço, e outras operações.
[0047] Pode ser notado que enquanto uma única célula de fluxo e caminho fluídico, e um único sistema de detecção óptica são ilustrados na FIG. 1, em alguns instrumentos mais do que uma célula de fluxo e caminho fluídico podem ser acomodados. Por exemplo, em uma implementação contemplada atualmente, dois tais arranjos são providos para aprimorar o sequenciamento e o rendimento. Na prática, qualquer número de células de fluxo e caminhos podem ser providos. Estes podem fazer o uso dos mesmos ou de diferentes receptáculos de reagente, receptáculos de descarte, sistemas de controle, sistemas de análise de imagem, e assim por diante. Onde for provido, os múltiplos sistemas fluídicos podem ser individualmente controlados ou controlados de um modo coordenado. Deve ser entendido que a frase “conectado de maneira fluida” pode ser usado aqui para descrever conexões entre dois ou mais componentes que colocam tais componentes em comunicação fluida entre si, muito da mesma maneira que “conectado de maneira elétrica” pode ser usado para descrever uma conexão elétrica entre dois ou mais componentes. A frase “interposto de maneira fluídica” pode ser usada, por exemplo, para descrever uma ordenação particular de componentes. Por exemplo, se o componente B é interposto de maneira fluídica entre componentes A e C, então fluido escoando a partir do componente A para o componente C pode escoar através do componente B antes de alcançar o componente C.
[0048] A FIG. 2 ilustra um exemplo de sistema fluídico do sistema de sequenciamento da FIG. 1. Na implementação ilustrada, a célula de fluxo 20 inclui uma série de rotas ou pistas 56A e 56B que podem ser agrupados em pares para receber substâncias fluidas (por exemplo, reagentes, tampões, meios de reação) durante operações de sequenciamento. As pistas 56A são acopladas com uma linha comum 58 (uma primeira linha comum), enquanto as pistas 56B são acopladas com uma segunda linha comum 60. Uma linha de desvio 62 também é provida para permitir que os fluidos desviem da célula de fluxo sem entrar na mesma. Como notado acima, uma série de vasos ou recipientes 64 permite o armazenamento de reagentes e outros fluidos que podem ser usados durante a operação de sequenciamento. Uma válvula seletora de reagente 66 é mecanicamente acoplada com um motor ou atuador (não mostrado) para permitir a seleção de um ou mais dos reagentes a ser introduzidos para a célula de fluxo. Reagentes selecionados então são avançados para uma válvula seletora de linha comum 68 que similarmente inclui um motor (não mostrado). A válvula seletora de linha comum pode ser comandada para selecionar uma ou mais das linhas comuns 58 e 60, ou ambas as linhas comuns, para fazer com que os reagentes 64 escoam para as pistas 56A e/ou 56B de um modo controlado, ou a linha de desvio 62 para escoar um ou mais dos reagentes através da linha de desvio. Pode ser notado que outras operações úteis podem ser permitidas pela linha de desvio, tal como a capacidade de iniciar todos os reagentes (e líquidos) para a válvula seletora de reagente (e a válvula seletora de linha comum) sem retirar ar através da célula de fluxo, a capacidade de realizar lavagem (por exemplo, lavagem automatizada ou semi-automatizada) dos canais de reagente e gotejadores independentes da célula de fluxo, e a capacidade de realizar funções de diagnóstico (por exemplo, testes de distribuição de volume e pressão) no sistema.
[0049] Os reagentes usados saem da célula de fluxo através de linhas acopladas entre a célula de fluxo e a bomba 38. Na implementação ilustrada, a bomba inclui uma bomba de seringa tendo um par de seringas 7 0 que são controladas e movidas por um atuador 72 para aspirar os reagentes e outros fluidos e para ejetar os reagentes e fluidos durante diferentes operações de testes, ciclos de verificação e sequenciamento. O conjunto de bomba pode incluir várias outras partes e componentes, incluindo válvulas, instrumentação, atuadores, e assim por diante (não mostrado). Na implementação ilustrada, sensores de pressão 74A e 74B detectam a pressão nas linhas de entrada da bomba, enquanto um sensor de pressão 74C é provido para detectar pressões emitidas pela bomba de seringa.
[0050] Fluidos usados pelo sistema entram em uma válvula seletora de reagente usado 76 a partir da bomba. Esta válvula permite a seleção de um de múltiplos caminhos de escoamento para os reagentes usados e outros fluidos. Na implementação ilustrada, um primeiro caminho de escoamento leva a um primeiro receptáculo de reagente usado 78, enquanto um segundo caminho de escoamento leva através de um medidor de fluxo 80 um segundo receptáculo de reagente usado 82. Dependendo dos reagentes usados, pode ser vantajoso coletar os reagentes, ou certos dos reagentes em vasos separados para a disposição, e a válvula seletora de reagente usado 76 permite tal controle.
[0051] Também deve ser notado que as válvulas dentro do conjunto de bomba podem permitir que vários fluidos, incluindo reagentes, solventes, limpadores, ar, e assim por diante sejam aspirados pela bomba e injetados ou circulados através de uma ou mais das linhas comuns, a linha de desvio, e a célula de fluxo. Além disso, como notado acima, em uma implementação contemplada atualmente, duas implementações paralelas do sistema fluídico mostrado na FIG. 2 são providas sob controle comum. Cada um dos sistemas fluídicos pode ser parte de um único instrumento de sequenciamento, e pode realizar funções incluindo operações de sequenciamento em diferentes células de fluxo e bibliotecas de amostra em paralelo.
[0052] O sistema fluídico opera sob o comando do sistema de controle 46 que implementa protocolos prescritos para testes, verificação, sequenciamento, e assim por diante. Os protocolos prescritos serão estabelecidos de antemão e incluem uma série de eventos ou operações para atividades tais como aspiração de reagentes, aspiração de ar, aspiração de outros fluidos, ejeção de tais reagentes, ar e fluidos, e assim por diante. Os protocolos vão permitir a coordenação de tais operações fluídicas com outras operações do instrumento, tais como reações que ocorrem na célula de fluxo, formação de imagem da célula de fluxo e os seus sítios, e assim por diante. Na implementação ilustrada, o sistema de controle 46 emprega uma ou mais interfaces de válvula 84 que são configuradas para prover sinais de comando para as válvulas, bem como uma interface de bomba 86 configurada para comandar a operação do atuador da bomba. Vários circuitos de entrada/saída 88 também podem ser providos para receber resposta e processar tal resposta, tais como a partir de sensores de pressão 74A-C e medidor de fluxo 80.
[0053] A FIG. 3 ilustra certos componentes funcionais do sistema de controle/supervisor 44. Como ilustrado, os circuitos de memória 50 armazenam rotinas prescritas que são executados durante testes, comissionamento, solução de problemas, serviços, e operações de sequenciamento. Muitos tais protocolos e rotinas podem ser implementados e armazenados nos circuitos de memória, e estes podem ser atualizados ou alterados de tempo em tempo. Como ilustrado na FIG. 3, estes podem incluir um protocolo de controle fluídico 90 para controlar as várias válvulas, bombas, e quaisquer outros atuadores fluídicos, bem como para receber e processar resposta a partir de sensores fluídicos, tais como válvulas, e sensores de fluxo e sensores de pressão. Um protocolo de controle de estágio 92 permite mover a célula de fluxo como for desejado, tal como durante a formação de imagem. Um protocolo de controle de óptica 94 permite que os comandos sejam emitidos para os componentes de formação de imagem para iluminar porções da célula de fluxo e para receber os sinais retornados para o processamento. Um protocolo de processamento e aquisição de imagem 96 permite que os dados de imagem sejam pelo menos parcialmente processados para a extração de dados úteis para o sequenciamento. Outros protocolos e rotinas podem ser providos nos mesmos ou em diferentes circuitos de memória como indicado pela referência 98. Na prática, os circuitos de memória podem ser providos como um ou mais dispositivos de memória, tal como tanto memória volátil quanto não volátil. Esta memória pode estar dentro do instrumento, e parte pode estar fora de bordo.
[0054] Um ou mais processadores 100 acessam os protocolos armazenados e implementam os mesmos no instrumento. Como notado acima, os circuitos de processamento podem ser parte de computadores específicos de aplicativo, computadores de propósito geral, ou qualquer plataforma adequada de hardware, firmware e software. Os processadores e a operação do instrumento pode ser comandada por operadores humanos através de uma interface de operador 101. A interface de operador pode permitir testes, comissionamento, solução de problemas, e serviços, bem como reportar qualquer problema que possa surgir no instrumento. A interface de operador também pode permitir o lançamento e o monitoramento de operações de sequenciamento.
[0055] A FIG. 4 ilustra um conjunto de válvula que serve para retirar reagentes e outros fluidos a partir de recipientes e distribuir os mesmos para a célula de fluxo. O conjunto de válvula 102 inclui uma estrutura de coletor 104 em que canais estão formados para definir caminhos de escoamento para os reagentes e outros fluidos. Como pode ser observado na FIG. 4, as válvulas 66 e 68 são acionadas e controladas pelos motores 106 e 108. Uma ou mais interfaces de motor ou conexões 110 proveem energia e, onde for desejado, sinais para e a partir de motores. Como notado acima, os motores (e desta forma as válvulas) são controlados pelos circuitos de controle durante testes, comissionamento, e serviços, bem como durante a operação de sequenciamento.
[0056] As rotas fluidas e de reagente dentro do coletor são acopladas com os gotejadores 112 que, durante a operação, retiram reagentes e outros fluidos a partir de respectivos recipientes (não mostrado). Os caminhos de escoamento para os reagentes e fluidos, designados em geral pela referência 114 na FIG. 4, podem ser formados através de moldagem, gravação, ou qualquer outro processo adequado para permitir que os reagentes e fluidos se movam a partir de gotejadores para as quando a bomba discutida acima é comandada para aspirar os reagentes e fluidos. Pelo menos um dos gotejadores é configurado como um bocal gotejador 116 para auxiliar na mistura de reagentes durante a operação de sequenciamento (por exemplo, antes das reações e formação de imagem). Também ilustrado na FIG. 4 está um volume de mistura configurado como um canal 118 em que reagentes e fluidos podem ser retirados e movidos para a mistura. Em algumas implementações, o volume de mistura pode ser uma porção ou toda a linha de desvio 62. Por exemplo, reagentes podem ser aspirados para a linha de desvio 62 em uma sequência desejada mas tal que os reagentes não atravessam todo o comprimento da linha de desvio (o que pode fazer com que eles sejam roteados para o descarte). Uma vez que a linha de desvio (ou uma porção da mesma que serve como o volume de mistura) seja carregada com a sequência desejada de reagentes, o fim da linha de desvio através da qual os reagentes foram introduzidos pode ser comutado, usando uma válvula, de forma a conectar de maneira fluida com um caminho de escoamento que leva a, por exemplo, um recipiente de destino de forma que todo o conjunto de reagentes carregado para a linha de desvio então pode ser expelido de volta para a linha de desvio e para o recipiente de destino. Em outras implementações, o volume de mistura, por exemplo, pode ser um recipiente de destino, por exemplo, o recipiente de destino a partir do qual os fluidos pré-misturados são distribuídos, ou um recipiente de destino separado, por exemplo, um que está completamente vazio antes da distribuição dos reagentes selecionados.
[0057] A FIG. 5 é uma vista de topo do conjunto de válvula 102. Novamente aqui, as válvulas 66 e 68 são visíveis no coletor e acopladas para os caminhos de escoamento para os reagentes e fluidos. A válvula seletora de reagente 66 recebe os reagentes a partir de gotejadores, e direciona os fluidos aspirados para a válvula seletora de linha comum 68. O canal de mistura 118 é acoplado com a válvula seletora de linha comum para permitir a mistura de reagentes como descrita acima. Também mostrado na FIG. 5 estão as portas 120 providas no coletor para permitir o acoplamento do coletor com os gotejadores. Uma das portas 120 (indicada pela referência 122) será acoplada com o bocal gotejador para permitir a injeção de reagentes para um recipiente de destino, e para retirar os reagentes a partir do recipiente de destino para a mistura. O recipiente de destino, por exemplo, pode ser um recipiente, tubo, ou outro vaso projetado para conter os reagentes. O recipiente de destino, por exemplo, pode ser usado como um volume de trabalho temporário em que os reagentes e/ou outros materiais podem ser transferidos de maneira a preparar os mesmos para a distribuição, por exemplo, por mistura, para a célula de fluxo. Assim, reagentes e outros fluidos podem, uma vez preparados no recipiente de destino, ser transferidos a partir do recipiente de destino para a células de fluxo.
[0058] Uma implementação contemplada atualmente do canal de mistura 118 e caminhos de escoamento de reagente para a mistura é ilustrada na FIG. 6A. Como notado acima, o canal de mistura 118 é acoplado com a válvula seletora de linha comum 68, que por sua vez é acoplado com uma saída da válvula seletora de reagente 66. O canal de mistura 118 também é acoplado com a bomba 38 para permitir a aspiração e a ejeção de reagentes e fluidos como descrito abaixo. Na implementação ilustrada na FIG. 6A, vasos ou recipiente de reagente 124, 126, e 128 armazenam reagentes 130, 132, e 134, respectivamente. Um adicional ou recipiente de destino 136 armazena, neste exemplo, um modelo de amostra pré- preparado ou biblioteca 138. Para a operação de mistura os reagentes 130, 132 e 134 são pré-misturados e então combinados com o modelo 138. Para permitir tal pré-mistura, os reagentes são aspirados um por um para o canal de mistura 118 através de respectivos caminhos de escoamento indicados na FIG. 6A pela referência 140. Um caminho de escoamento adicional 142 permite que os reagentes sejam depositados no recipiente de destino 136 junto com o modelo. Na implementação ilustrada, o canal de mistura 118 forma um volume interno em serpentina tendo ciclos 144 que permitem que os volumes desejados de reagentes sejam aspirados e misturados em uma área relativamente compacta do coletor.
[0059] Em uma implementação contemplada atualmente, os reagentes 130, 132, e 134 possuem diferentes propriedades de fluido o que pode apresentar desafios para a mistura. Por exemplo, as densidades dos reagentes diferem, e diferenças substanciais podem existir entre as viscosidades e tensões interfaciais de óleo dos reagentes. Em uma implementação contemplada atualmente, por exemplo, as viscosidades variam entre aproximadamente 1,5 cP e 50 cP, por exemplo, 2,4 cP em 25 °C, enquanto tensões interfaciais de óleo variam entre cerca de 5,0 e cerca de 19,2 dinas/cm. O modelo, em comparação, pode ter uma densidade ainda diferente e uma menor viscosidade (por exemplo, na ordem de 1 cP em 25 °C) e uma diferente tensão interfacial de óleo (por exemplo, na ordem de cerca de 9,8 dinas/cm). A Figura 6B ilustra a estriação dos reagentes e modelo no recipiente de destino 136 quando não misturada. Na implementação ilustrada, o modelo compreende cerca de 30% do volume total, enquanto o reagente 130 compreende cerca de 22%, o reagente 132 compreende cerca de 42%, e o reagente 134 compreende cerca de 6%. No presente contexto, o termo “cerca de” está intencionado a significar que os valores indicados não são exatos e o valor real pode variar a partir daqueles indicados de uma maneira que não altera materialmente a referida operação.
[0060] Para permitir a mistura automatizada dos reagentes e modelo, o sistema fluídico e o seu controle permitem que os reagentes sejam aspirados seletivamente um por um para o canal de mistura, injetados para o recipiente de destino, e retirados de maneira cíclica e reinjetados para a mistura. A FIG. 7 ilustra uma técnica contemplada atualmente para a aspiração de reagente. Como mostrado, os reagentes 130, 132, e 134 são aspirados um por um pelo controle da válvula 66. Com a válvula seletora de linha comum direcionando os reagentes para o canal de mistura, vários conjuntos de volumes de cada reagente são aspirados como indicado pelo numeral de referências 146, 148, 150, 152, e 154. Para prover a redução de picos de pressão durante a mistura, a bomba também pode aspirar um volume de ar antes de aspirar os reagentes. O volume de ar provê um amortecedor que limita picos de pressão positiva e negativa durante a mistura. Na implementação ilustrada na FIG. 7, o ar aspirado pode ser localizado para a esquerda superior dos conjuntos de reagente. Além disso, um tampão líquido pode ser aspirado o que ajuda na preparação, lavagem, e empuxo os reagentes. Uma vez aspirado como ilustrado na FIG. 7, as válvulas então podem ser controladas para permitir que a bomba injete os reagentes para o modelo 138 que será pré-carregado para o recipiente de modelo 136 descrito acima.
[0061] Em outra técnica em que três ou mais reagentes podem ser selecionados para a mistura no recipiente de destino, pelo menos dois dos reagentes selecionados para a mistura podem ser introduzidos repetidamente um por um para o canal de mistura, com pelo menos um outro reagente selecionado para a mistura sendo mantida na reserva até os reagentes que são introduzidos repetidamente um por um para o canal de mistura terem sido completamente distribuídos para o canal de mistura. O reagente reservado então pode ser adicionado todo de uma vez para o canal de mistura. Por exemplo, se os reagentes A e B devem ser introduzidos repetidamente um por um para o canal de mistura, seguidos pelo reagente reservado C, então os reagentes no canal de mistura em geral podem ser depositados em camada como ABABABABABC, de maneira oposta a ABCABCABCABCABC (o que pode resultar, por exemplo, de uma técnica similar com aquela discutida com relação à Figura 7). Acredita-se que tal técnica seja vantajosa na prevenção ou redução da ocorrência de, para alguns reagentes, subprodutos de reação indesejados. Por exemplo, o reagente reservado pode reagir com um dos outros reagentes em isolamento de uma maneira particular, mas pode reagir com dois ou mais dos outros reagentes em combinação de outra maneira. A última pode ser a reação desejada que pode ocorrer uma vez que os reagentes foram completamente misturados, em que o anterior pode ocorrer durante a pré- mistura quando os reagentes ainda podem ser relativamente estratificados e podem misturar apenas com o reagente vizinho diretamente adjacente. Em outro exemplo, o reagente reservado pode reagir com o material que forma a estrutura do canal de mistura e produzir um subproduto indesejado. Já que a introdução repetida um a um de reagentes para o canal de mistura pode precisar de vários minutos, por exemplo, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, ou mais, dependendo do número e da quantidade de cada reagente desejado, a reserva da introdução de reagentes potencialmente problemáticos até após os outros reagentes terem sido distribuídos um por um para o canal de mistura pode reduzir significativamente a quantidade de tempo que o reagente reservado gasta em contato com os outros reagentes e com a estrutura do canal de mistura, reduzindo desta forma o potencial pode subprodutos de reação indesejáveis a ser gerados. É claro que, em tais implementações, o reagente reservado pode não se beneficiar da pré-mistura que os outros reagentes se beneficiam, mas o potencial reduzido para subprodutos de reação indesejáveis pode passar a perda de pré-mistura com relação ao reagente reservado. Em particular, se o reagente reservado é um líquido de viscosidade inferior, a perda da pré-mistura com relação ao agente reservado por último pode ter pouco impacto.
[0062] O uso de um volume de mistura semelhante a canal, por exemplo, um volume que é muito mais longo em comprimento do que a sua largura (por exemplo, pelo menos 10X, 100X, 150X a 170X, 160X, 200X, ou 500X mais longo do que sua largura) pode permitir que os reagentes distribuídos em série mantenham um arranjo relativamente estratificado um com relação ao outro dentro do canal reduzindo a área de interface de contato de superfície para superfície entre cada camada de reagentes (os reagentes são líquidos e assim provavelmente vão se difundir entre si através deste limite em algum grau com o tempo, assim as áreas de interface de contato/limite referenciadas aqui devem ser entendidas como sendo de natureza teórica; a redução destas áreas teóricas, no entanto, vai diminuir a taxa de difusão). Em adição, para reagentes que podem ser de alguma maneira imiscíveis entre si, um volume de mistura que é, por exemplo, de forma esférica ou que possui uma maior razão de largura para comprimento pode permitir que as várias doses de reagente que são distribuídas para o volume de mistura flutuem dentro do volume de mistura e potencialmente se recombinem com doses anteriores do mesmo reagente, perdendo desta forma a estratificação que pode ser alcançada em um volume semelhante a canal de mistura. Por exemplo, um canal de mistura que tem aproximadamente 2,25 mm de diâmetro ou largura por aproximadamente 360 mm do seu comprimento pode prover estratificação vantajosa nos reagentes distribuídos durante o processo de pré-mistura. Uma vez que o volume de mistura foi carregado com as quantidades desejadas de múltiplos conjuntos de reagentes, os conteúdos do volume de mistura podem ser distribuídos para o recipiente de destino (algumas porções dos fluidos no volume de mistura pode ser perdida para o volume morto do sistema fluídico; o volume total dos reagentes distribuído para o volume de mistura pode ser calibrado para levar em conta tal perda). Após a distribuição para o recipiente de destino, os reagentes pré-misturados distribuídos podem ser repetidamente aspirados a partir de e ejetados de volta para o recipiente de destino para promover a mistura adicional. Em algumas implementações, os reagentes pré-misturados (ou pós-pré-misturados) podem ser aspirados a partir do recipiente de destino e puxados de volta para o volume de mistura antes de ser ejetados de volta para o recipiente de destino. Assim, em tais implementações, os reagentes pré-misturados podem ser movidos para dentro e para fora do volume de mistura repetidamente durante a operação de mistura de aspiração/ejeção.
[0063] Foi descoberto que o uso do canal de mistura com um bocal gotejador que promove a formação de vórtice no recipiente de destino e provê excelente misturação dos reagentes e o modelo apesar de diferenças substanciais nas propriedades de fluido dos reagentes. Além disso, estas estruturas e técnicas permitem a misturação automática com pouca ou nenhuma interação humana. Um exemplo de bocal gotejador para o uso nestas técnicas é ilustrado nas FIGS. 8 e 9A-9C. Como mostrado na FIG. 8, o bocal gotejador possui um corpo alongado com um lúmen central (cavidade) se estendendo ao longo do seu comprimento e uma ponta 156 na sua extremidade distal. Um bocal é provido na ponta para reduzir o diâmetro interno do gotejador nesta localização para aumentar a velocidade de fluidos aspirados e ejetados através do gotejador. Na implementação ilustrada, o bocal é formado como um inserto 158 que está alojado na extremidade distal ou ponta do gotejador. Outras estruturas, tais como tampas, usinadas, formadas, regiões perturbadas, e assim por diante podem formar o bocal.
[0064] Na implementação ilustrada, o gotejador como um diâmetro externo nominal 160 de cerca de 0,125 polegadas (3,175 mm), e um diâmetro interno nominal 162 de 0,020 polegadas ±0,001 polegadas (0,508 mm). O bocal, por outro lado, como um diâmetro interno nominal 164 de 0,010 polegadas ±0,001 polegadas (0,254 mm, apesar de algumas implementações poderem apresentar um diâmetro interno de bocal que varia entre 0,20 e 0,28 mm). É claro que outros tamanhos e dimensões podem ser usados para prover a mistura desejada. Adicionalmente, na implementação ilustrada, o bocal gotejador 116 é posicionado em uma altura 166 acima do fundo do recipiente 138 de aproximadamente 2 mm. Já que os reagentes são injetados para o recipiente, então, como indicado pela referência 168, a formação de vórtice no recipiente é aprimorada em virtude da velocidade aumentada dos reagentes se movendo através do bocal, aprimorando desta forma a misturação no recipiente, como indicado pelas setas 170 na FIG. 8. Os reagentes misturados são deixados subir no recipiente como indicado pela referência 172.
[0065] A FIG. 9A ilustra a extremidade distal do bocal gotejador em uma maneira mais detalhada. Como pode ser observado na figura, o diâmetro interno nominal 162 do gotejador é reduzido pelo inserto de bocal 158, neste caso até aproximadamente metade do diâmetro interno do gotejador (o inserto de bocal, neste exemplo, é de forma tubular). Uma forma contemplada atualmente da extremidade distal é mais bem ilustrada nas FIGS. 9B, 9C e 9D. Como mostrado aqui, o bocal gotejador possui uma extremidade facetada inferior compreendendo quatro facetas 174, dando a aparência de uma forma em cunha para a ponta do bocal gotejador. O gotejador possui uma linha central 176, e as facetas se encontram em um ápice 178 que está deslocado ou excêntrico com relação à linha central 176. Esta geometria da extremidade distal reduz ou evita arrastar ou raspar o recipiente quando o gotejador é abaixado para o recipiente, ou quando o recipiente é elevado em torno do gotejador. Pode ser notado, no entanto, que na implementação ilustrada, o inserto possui um contorno inferior que corresponde com o contorno da ponta (por exemplo, uma ou mais das facetas anguladas). Colocando de outro modo, o inserto pode ser de forma compatível com o facetado ou a forma em cunha da extremidade distal do bocal gotejador. Além disso, pode ser notado que em uma implementação contemplada atualmente o gotejador e bocal são feitos de um plástico de engenharia, tal como poliéter éter cetona (PEEK). Tais materiais podem prover resistência química para os reagentes e quaisquer solventes usados no processo.
[0066] A FIG. 10 é uma representação gráfica de ciclos de exemplo na aspiração, misturação e ejeção de reagentes e um modelo de amostra, enquanto a FIG. 11 é um fluxograma ilustrando exemplo de lógica para aspirar e misturar reagentes e um modelo de amostra. Na FIG. 10, o ciclo de aspiração, mistura, e ejeção é designado pelo numeral de referência 180, com pressões aplicadas pela bomba indicada pelo eixo 182 e tempos do ciclo pelo eixo 184. Pressões negativas indicam a aspiração de um ou mais dos reagentes, enquanto pressões positivas indicam a ejeção. O processo pode ser considerado para incluir uma sequência de “transferência” 186, seguido por uma sequência de “mistura” 196, como discutido abaixo.
[0067] Seguindo o fluxograma da FIG. 11, a lógica de controle 204 pode começar com a aspiração de ar em 206 para remover líquido existente dos caminhos de escoamento através dos quais misturas anteriores de reagentes podem ter sido roteadas. Por exemplo, qualquer líquido de sobra que permanece no caminho de escoamento 142, que liga a válvula seletora de reagente 66 com o recipiente de destino 136, pode ser aspirado com ar (isto é, tal que o líquido é substituído com ar) de forma que qualquer nova mistura de reagentes que é subsequentemente distribuída para o recipiente de destino através do caminho de escoamento 142 não é vinda com o líquido que sobrou. A sequência de transferência então pode começar com uma sequência de iniciação como indicada pela referência 208 na FIG. 11. Esta sequência de iniciação é indicada pela série de eventos de pressão negativa ou aspiração coletivamente indicados pela referência 188 na FIG. 10. Em geral, estes eventos permitem a retirada de reagentes inicialmente para o sistema. Em algum maior detalhe, retornando à FIG. 11, um tampão pode ser aspirado como indicado em 210. Este tampão pode compreendem um líquido selecionado de forma a não ser reativo ou ser relativamente inerte com relação aos reagentes e pode ser usado como um fluido de trabalho incompressível que se estende, pelo menos em parte, entre a bomba e os reagentes para permitir uma medição mais precisa dos reagentes para o volume de mistura nas seguintes etapas, se for desejado. O primeiro reagente então p[ode ser aspirado em um evento de iniciação como indicado em 212 na FIG. 11, seguido pela aspiração de qualquer número de outros reagentes, através da aspiração do reagente final em 214. Em uma implementação contemplada atualmente, por exemplo, três tais reagentes são aspirados na sequência de iniciação.
[0068] Na lógica ilustrada na FIG. 11, os reagentes a ser misturados então são aspirados em uma sequência de transferência 218. A sequência de transferência continua com a aspiração do primeiro reagente como indicado em 220, seguido pela aspiração, um por um, de cada um dos reagentes adicionais até o reagente final ser aspirado como indicado em 222. Como anteriormente, em uma implementação contemplada atualmente três reagentes são aspirados nesta sequência. Como notado acima, em uma implementação contemplada atualmente um número de conjuntos dos reagentes são aspirados em quantidades relativamente pequenas para criar uma sequência dos reagentes, e desta forma para promover a pré-misturação. Assim, em 224 a lógica pode determinar se todos os conjuntos dos reagentes foram aspirados, e se não, retornar para 220 para continuar a aspiração de conjuntos adicionais. Também pode ser notado que na implementação atualmente contemplada todos os conjuntos contêm todos os reagentes selecionados para a mistura, apesar de este não precisar ser o caso. Além disso, diferentes volumes ou quantidades de reagentes podem ser aspirados nos vários conjuntos. Uma vez que todos os reagentes foram aspirados, controle pode avançar além da sequência de transferência. A sequência de transferência é ilustrada pelos eventos de pressão negativa indicados pelo numeral de referência 190 na FIG. 10.
[0069] Como mostrado na FIG. 11, e como será claro a partir dos eventos de pressão negativa separados (e positiva) da FIG. 10, cada sucessiva aspiração (ou ejeção) de reagentes ou reagentes pré-misturados envolve controlar uma ou mais das válvulas descritas acima, bem como a bomba. Ou seja, para aspirar os reagentes individuais, a válvula seletora de reagente será deslocada para direcionar pressão negativa para o gotejador para o correspondente recipiente do reagente selecionado. A bomba similarmente será comandada para retirar o reagente (ou ar ou tampão ou modelo), e para exprimir os fluidos aspirados de acordo com o protocolo prescrito. Este protocolo de mistura será predeterminado e armazenado nos circuitos de memória descritos acima e realizado de um modo automatizado ou semi-automatizado com base na operação de sequenciamento, também definido nos circuitos de memória. Estes protocolos são executados pelos circuitos de controle e processamento que, através de circuitos de interface apropriados comandam a operação das válvulas e da bomba.
[0070] Uma vez que todos os reagentes foram aspirados, os fluidos aspirados podem ser ejetados para o recipiente de destino como indicado em 226 na FIG. 11. Como notado acima, na implementação atualmente contemplada, isto é feito através do bocal gotejador onde a mistura começa em virtude da velocidade aumentada dos reagentes através do bocal e a resultante formação de vórtice no recipiente de destino. Esta ejeção para o recipiente de destino é indicada pelo evento de pressão positiva 192 na FIG. 10. Em certas implementações, a aspiração pode ser realizada adicionalmente como indicado na referência 228 na FIG. 11. A seguir, os reagentes aspirados podem ser ejetados para o recipiente de destino. Esta sequência pode ser seguida pela aspiração de ar como indicado pelo numeral de referência 230 na FIG. 11 e o evento de pressão negativa 194 na FIG. 10 (por exemplo, para remover tanto líquido quanto for possível da linha de desvio, canal de mistura, canal de modelo, e gotejador). Também pode ser notado que em algumas implementações, o bocal gotejador, ou o recipiente, ou ambos podem ser movidos um com relação ao outro (por exemplo, verticalmente) durante a aspiração e a ejeção para ajudar adicionalmente a misturar amostras estriadas e reagentes.
[0071] Seguindo a aspiração e pré-misturação parcial no volume de mistura ou canal pelas operações descritas acima, a mistura é realizada repetidamente movendo os reagentes no canal, e entre o canal e o recipiente de destino através do bocal gotejador. Para isto, uma série de ciclos de mistura é implementada em uma sequência de mistura 234. Nesta sequência, os reagentes e modelo combinados são aspirados em 236 e ejetados de volta para o recipiente de destino em 238. A lógica pode determinar repetidamente se todos estes ciclos de mistura desejados foram realizados em 240, e continuar até todos tais ciclos estarem completos. Na ilustração gráfica da FIG. 10, os ciclos são indicados coletivamente pela referência 198. Como pode ser observado, cada um envolve um evento de pressão negativa relativamente curto seguido por um evento de pressão positiva relativamente curto. Estes eventos efetivamente aspiram os reagentes e modelo combinados para o volume de mistura ou canal através do bocal gotejador, e retorna os reagentes progressivamente misturados e modelo para o recipiente de destino através do bocal. Enquanto qualquer volume desejado pode ser deslocado neste processo, em uma implementação contemplada atualmente, cerca de 2.000 μL são aspirados a partir do e ejetados para o recipiente de destino em cada ciclo de mistura, apesar de outras implementações poderem dispensar cerca de 500 μL ou 1500 μL, dependendo do tamanho das células de fluxo que são usadas. No fim do processo de mistura, os reagentes misturados e modelo podem ser retornados para o recipiente de destino para proceder com a operação de sequenciamento.
[0072] Pode ser notado que em uma implementação presente, o bocal gotejador efetivamente aumenta a velocidade dos reagentes (e reagentes misturados) já que eles são misturados durante a aspiração e a ejeção. Este aumento na velocidade aumenta a energia cinética para ajudar na misturação. Por exemplo, em uma implementação contemplada atualmente, o bocal acelera a mistura até pelo menos cerca de 1600 mm/s em uma taxa de fluxo de pelo menos cerca de 5.000 μL/min.
[0073] O uso, se houver, de indicadores ordinários, por exemplo, (a), (b), (c)... ou semelhantes, nesta descrição e nas reivindicações deve ser entendido como não cobrindo qualquer ordem ou sequência particular, exceto no grau em que tal ordem ou sequência está indicado de maneira explícita. Por exemplo, se existem três etapas marcadas (i), (ii), e (iii), deve ser entendido que estas etapas podem ser realizadas em qualquer ordem (ou até concorrentemente, se não for contraindicado de qualquer maneira) a menos que seja indicado de outra forma. Por exemplo, se a etapa (ii) envolve a manipulação de um elemento que é criado na etapa (i), então a etapa (ii) pode ser observada como acontecendo em algum ponto após a etapa (i). Similarmente, se a etapa (i) envolve a manipulação de um elemento que é criado na etapa (ii), o inverso deve ser entendido.
[0074] Também deve ser entendido que o uso de "para," por exemplo, "uma válvula para comutar entre dois caminhos de escoamento," pode ser substituível com linguagem tal como "configurado para," por exemplo, "uma válvula configurada para comutar entre dois caminhos de escoamento", ou semelhantes.
[0075] Termos tais como “cerca de,” “aproximadamente,” “substancialmente,” “nominal,” ou semelhantes, quando usados em referência às quantidades ou propriedades quantificáveis similares, devem ser entendidos como sendo inclusivos de valores dentro de ±10% dos valores especificados, a menos que seja indicado de outra forma.
[0076] Em adição às implementações listadas nesta descrição, as seguintes implementações adicionais devem ser entendidas como dentro do escopo desta descrição:
[0077] Implementação 1: Um sistema incluindo: uma célula de fluxo para suportar analitos de interesse em um sistema de análise; um sistema fluídico para aspirar reagentes, para misturar os reagentes, e para ejetar os reagentes misturados para um recipiente de destino; e um bocal gotejador em comunicação fluida com o sistema fluídico, o bocal gotejador incluindo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um inserto de bocal disposto em uma extremidade distal apesar de que o bocal gotejador aspira reagentes a partir do recipiente e ejeta reagentes misturados de volta para o recipiente de destino.
[0078] Implementação 2: O sistema da implementação 1, em que o bocal e o lúmen são dimensionados para promover a formação de vórtice de mistura no lúmen quando os reagentes são aspirados para o gotejador através do inserto de bocal.
[0079] Implementação 3: O sistema da implementação 1, em que o lúmen possui um diâmetro interno nominal de cerca de 0,5 mm e o inserto de bocal possui um diâmetro interno nominal de cerca de 0,25 mm.
[0080] Implementação 4: O sistema da implementação 1, em que a extremidade distal do bocal gotejador possui uma forma em cunha com um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
[0081] Implementação 5: O sistema da implementação 4, em que o inserto de bocal possui uma extremidade distal que é compatível com o formato com a forma em cunha da extremidade distal do bocal gotejador.
[0082] Implementação 6: O sistema da implementação 4, em que a forma em cunha inclui quatro facetas que se encontram no ápice.
[0083] Implementação 7: O sistema da implementação 1, em que bocal gotejador possui um comprimento para se estender até uma distância nominal 2 mm a partir de uma superfície de fundo do recipiente.
[0084] Implementação 8: O sistema da implementação 1, incluindo uma pluralidade de outros gotejadores para aspirar respectivos reagentes, em que os outros gotejadores não incluem insertos de bocal.
[0085] Implementação 9: O sistema da implementação 1, em que o bocal gotejador acelera os recipientes misturados até pelo menos cerca de 1600 mm/s em uma taxa de fluxo de pelo menos cerca de 5.000 μL/min.
[0086] Implementação 10: Um sistema incluindo: uma célula de fluxo para suportar analitos de interesse em um sistema de análise; uma pluralidade de reagentes disposto em respectivos recipientes; um sistema fluídico para aspirar reagentes, para misturar os reagentes, e para ejetar os reagentes misturados para um recipiente de destino; um bocal gotejador em comunicação fluida com o sistema fluídico, o bocal gotejador incluindo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um bocal em uma extremidade distal; e circuitos de controle acoplados de maneira operativa com o sistema fluídico para comandar o sistema fluídico para aspirar uma pluralidade de reagentes um por um, para ejetar a pluralidade de reagentes para o recipiente de destino através do bocal, para aspirar a pluralidade de reagentes a partir do recipiente de destino através do bocal para a mistura, e para ejetar os reagentes misturados de volta para o recipiente através do bocal.
[0087] Implementação 11: O sistema da implementação 10, em que o bocal inclui um inserto na extremidade distal do bocal gotejador.
[0088] Implementação 12: O sistema da implementação 10, em que o recipiente de destino inclui um analito a ser sequenciado.
[0089] Implementação 13: O sistema da implementação 10, em que o lúmen possui um diâmetro interno nominal de 0,5 mm e o bocal possui um diâmetro interno nominal de 0,25 mm.
[0090] Implementação 14: O sistema da implementação 10, em que a extremidade distal do bocal gotejador possui uma forma em cunha com um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
[0091] Implementação 15: O sistema da implementação 14, em que o bocal possui uma extremidade distal que é compatível com o formato com a forma em cunha da extremidade distal do bocal gotejador.
[0092] Implementação 16: Um método incluindo: atuar uma bomba para aspirar uma pluralidade de reagentes a partir de um recipiente de destino contendo um analito a ser analisado; aspirar a pluralidade de reagentes através de um bocal gotejador em comunicação fluida com a bomba para misturar a pluralidade de reagentes, o bocal gotejador incluindo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um bocal em uma extremidade distal; e atuar a bomba para ejetar os reagentes misturados para o recipiente de destino.
[0093] Implementação 17: O método da implementação 16, em que o bocal e o lúmen são dimensionados para promover a formação de vórtice de mistura no lúmen quando os reagentes são aspirados para o gotejador através do bocal.
[0094] Implementação 18: O método da implementação 16, em que o lúmen possui um diâmetro interno nominal de 0,5 mm e o bocal inclui um inserto que possui um diâmetro interno nominal de 0,25 mm.
[0095] Implementação 19: O método da implementação 16, em que a extremidade distal do bocal gotejador possui uma forma em cunha com um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
[0096] Implementação 20: O método da implementação 16, em que os reagentes incluem pelo menos três reagentes de diferentes gravidades específicas.
[0097] Deve ser percebido que todas as combinações dos conceitos anteriores (providos que tais conceitos não sejam mutuamente inconsistentes) são contempladas como sendo parte do assunto inventivo divulgado aqui. Em particular, todas as combinações do assunto reivindicado que aparecem no fim desta descrição são contempladas como sendo parte do assunto da invenção divulgado aqui. Também deve ser percebido que a terminologia empregada de maneira explícita aqui que também pode aparecer em qualquer descrição incorporada por referência deve ser concedida um significado ainda mais consistente com os conceitos particulares divulgados aqui.

Claims (14)

1. Sistema caracterizado pelo fato de que compreende: um caminho de escoamento (34) para fluxo de célula a ser conectado de maneira fluida com uma célula de fluxo (20) para suportar analitos de interesse em um sistema de análise; um sistema fluídico compreendendo uma pluralidade de caminhos de escoamento (140), um caminho de escoamento adicional (142), um canal de mistura (118) acoplado a uma bomba (38) e a uma válvula seletora de linha comum (68), que é acoplada a uma válvula seletora de reagente (66), cada um da pluralidade de caminhos de escoamento seletivamente em comunicação fluídica com um recipiente de reagente (64, 126, 126, 128) de uma pluralidade de recipientes de reagente em uma primeira extremidade e em comunicação fluídica com a válvula seletora (66) em uma segunda extremidade, o caminho de escoamento adicional (142) seletivamente em comunicação fluídica com um recipiente de destino (136) em uma primeira extremidade e em comunicação fluídica com a válvula seletora de reagente (66) em uma segunda extremidade, o sistema fluídico para aspirar reagentes a partir da pluralidade de recipientes de reagente (64, 124, 126, 128) para o canal de mistura (118) via a válvula seletora para ejetar os reagentes aspirados a partir da pluralidade de recipientes de reagente a partir do canal de mistura e para o recipiente de destino (136) via as válvulas seletoras, e para distribuir os reagentes misturados a partir do recipiente de destino (136) para o caminho de escoamento para célula de fluxo; e um bocal gotejador (116) em comunicação fluida com o sistema fluídico, o bocal gotejador compreendendo um corpo alongado tendo um lúmen central se estendendo entre extremidades dos mesmos e um inserto de bocal (158) disposto em uma extremidade distal do lúmen central, em que o bocal gotejador serve tanto para aspirar os reagentes misturados a partir do recipiente de destino (136) quanto para ejetar reagentes misturados de volta para o recipiente de destino através do inserto de bocal.
2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inserto de bocal (158) e o lúmen são dimensionados para promover a formação de vórtice de mistura no recipiente de destino (136) quando os reagentes são expelidos a partir do bocal gotejador (116) através do inserto de bocal (158) e para o recipiente de destino (136).
3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o lúmen possui um diâmetro interno nominal de 0,5 mm ±10% e o inserto de bocal é um inserto tubular que possui um diâmetro interno nominal de 0,25 mm ±10%.
4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma extremidade distal do bocal gotejador (116) possui uma forma em cunha com facetas se encontrando em um ápice que está deslocado com relação a um eixo central do bocal gotejador.
5. Sistema, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o inserto de bocal (158) possui uma extremidade distal que é compatível com o formato com a forma em cunha da extremidade distal do bocal gotejador (116).
6. Sistema, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a forma em cunha compreende quatro facetas se encontrando no ápice.
7. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que bocal gotejador (116) deve se estender até uma distância nominal de 2 mm a partir de uma superfície de fundo do recipiente de destino (136).
8. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de outros gotejadores para aspirar respectivos reagentes, em que os outros gotejadores não possuem insertos de bocal (158).
9. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o bocal gotejador (116) deve acelerar os recipientes misturados até uma velocidade de escoamento de pelo menos 1600 mm/s ±10% em uma taxa de fluxo de pelo menos 5.000 μL/min ±10%.
10. Sistema de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer uma das reivindicações 3 a 5, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: um circuito de controle acoplado de maneira operativa com o sistema fluídico, o circuito de controle para controlar o sistema fluídico para fazer com que o sistema fluídico: aspire um conjunto de reagentes (130, 132, 134) um por um para o canal de mistura (118), ejete os reagentes no conjunto de reagentes para o recipiente de destino (136) através do bocal, aspire o conjunto de reagentes a partir do recipiente de destino (136) através do bocal para a mistura, e ejete o conjunto de reagentes misturados de volta para o recipiente de destino (136) através do bocal.
11. Sistema, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o recipiente de destino contém um analito a ser sequenciado.
12. Método de operar um sistema como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende: a) atuar uma bomba (38) para aspirar, um por um, uma pluralidade de reagentes (130, 132, 134) a partir da correspondente pluralidade de recipientes de reagente (64, 124, 126, 128), para o canal de mistura (118) a partir da pluralidade de caminhos de escoamento (140) via a válvula seletora de reagente (66); b) atuar a bomba (38) para ejetar os reagentes a partir do canal de mistura (118) para o recipiente de destino (136) via um bocal gotejador (116) em comunicação fluídica com a bomba; c) atuar a bomba (38) para aspirar os reagentes a partir do recipiente de destino (136) e através do bocal gotejador (116) para misturar adicionalmente os reagentes; e d) atuar a bomba (38) para ejetar os reagentes a partir do bocal gotejador (116) e de volta para o recipiente de destino (136) .
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os reagentes compreendem pelo menos três reagentes de diferentes gravidades específicas.
14. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente realizar uma ou mais repetições de (b) e (c) antes de realizar (d).
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