BR112017023250B1 - Derivado, sistema de liberação de fármaco, kit, composição farmacêutica e uso do referido derivado - Google Patents

Abstract

derivado, sistema de liberação de fármaco, kit, composição farmacêutica e uso do referido derivado. classe de moléculas obtidas para a conjugação de espécie ou substrato a bortezomibe por ligações do tipo de diéster borônico estáveis em um ambiente neutro, capazes de ser degradadas em um ph levemente ácido (4,5 - 5,0) liberando o fármaco bortezomibe e também conjugadas na superfície de um micro- ou nanossitema (um tipo de substrato) para a liberação de fármacos tornando-se um constituinte das mesmas. elas representam uma classe de profármacos de bortezomibe com respeito à hidrólise do éster borônico. podem ser usadas no transporte e liberação de bortezomibe quando é necessário difundi-lo em ambientes de ph levemente ácido após passar através de ambientes de ph neutro em que o fármaco permanece estavelmente conjugado na forma de um éster borônico não biologicamente ativo. pode ser usada a liberação intracelular de bortezomibe, onde o último permitirá que o fármaco seja transportado biologicamente ativo através do fluxo sanguíneo, enquanto passando por degradação química induzida por ph, uma vez introduzido no ambiente intracelular, induzindo difusão da forma terapeuticamente eficaz de bortezomibe. na situação, este é usado como um constituinte de um sistema de liberação de fármaco, ancorado nele e fornecido como uma função de liberação, capaz de alcançar o ambiente intracelular em ph 4,5, onde a degradação do profármaco à qual a invenção se refere ocorrerá, pela difusão de bortezomibe.

Description

Campo Técnico da Invenção

[001] Esta invenção refere-se a um sistema de liberação com base em Bortezomibe na forma de micro ou nanopartículas (ou veículo) fornecido com sistemas de liberação de fármaco. O Bortezomibe no veículo pode ser em tal forma ou na forma de um derivado, como é explicado abaixo.

[002] Mais particularmente, a invenção refere-se a uma classe de derivados obtidos reagindo uma unidade molecular (ou ligante) com Bortezomibe através de uma ligação do tipo de diéster borônico.

[003] Estes derivados são estáveis em um ambiente neutro, porém são capazes de ser degradados em um ambiente levemente ácido (pH = 4,5 - 5,0) liberando o fármaco Bortezomibe, e eles podem também ser conjugados com o veículo através do ligante.

[004] Os derivados de acordo com a invenção representam uma classe de profármacos de Bortezomibe relativos à hidrólise do éster borônico e podem ser usados para o transporte de Bortezomibe e sua liberação em ambientes de pH levemente ácidos, tal como, o ambiente intracelular, após passar através de meio tendo um pH neutro (tal como, o fluxo sanguíneo) em que o fármaco permanece estavelmente conjugado na forma de um éster borônico não biologicamente ativo.

[005] Na prática, os derivados de acordo com a invenção podem ser usados para a liberação intracelular de Bortezomibe na medida em que eles permitem ao fármaco ser transportado através da corrente sanguínea, que é caracterizada por um pH que é aproximadamente neutro (7,4), em uma forma biologicamente inativa, enquanto que uma vez introduzido no ambiente intracelular, que é caracterizado por um pH de ácido (aproximadamente 4,5 - 5,0), eles sofrem degradação química induzida por pH, dando a origem à difusão da forma terapeuti- camente efetiva de Bortezomibe.

[006] No caso onde tais derivados são usados como os constituintes de um sistema de liberação de fármaco eles serão ancorados a ele por meio de uma unidade de ligante, e este (o sistema de liberação de fármaco), tendo uma função de liberação, será capaz de atingir o ambiente intracelular em um pH de 4,5 - 5,0, onde degradação do pro- fármaco ao qual a invenção refere-se ocorrerá, dando origem à difusão de Bortezomibe. Por exemplo, os derivados de acordo com a invenção podem ser usados para o propósito de ativar a liberação intracelular (em pH 4,5 - 5,0) de Bortezomibe seguindo administração endovenosa (em um ambiente de pH neutro).

[007] Os derivados de acordo com a invenção são usados na preparação de sistemas terapêuticos capazes de liberar Bortezomibe no ambiente intracelular.

Técnica anterior

[008] Bortezomibe [ácido 3-metil-1-(3-fenil-2-(pirazina-2- carboxiamido)-propanamido)butilborônico] é representado por fórmula (I), e tem em sua estrutura o grupo funcional de ácido borônico, e como tal tem similar reatividade aos ácidos borônicos

[009] Bortezomibe é um composto sintético pertencendo a uma classe de agentes antineoplásicos de nova geração que agem inibindo a atividade tipo quimiotripsina de proteassoma 26S e consequentemente degradando proteínas de célula [Adams J, Palombella VJ, Sau- sville EA, Johnson J, Destree A, Lazarus DD, Maas J, Pien CS, Pra- kash S, Elliott PJ. Cancer Res (1999), 59:2615-2622; Pickart CM, Eddins MJ. Biochim Biophys Acta. 2004 Nov 29;1695(l-3):55-72].

[0010] Isto é usado clinicamente para o tratamento de melanoma múltiplo (MM) primeiro diagnosticado ou refratário e outras formas de tumor, tal como, linfoma de células do manto [Jagannath S, Barlogie B, Berenson J, Siegel D, Irwin D, Richardson PG, et al. Brit J Haematol (2004) 127: 165-172; Orlowski RZ. Exp Rev Anticancer Ther (2004) 4:171-179]. Foi também testado para o tratamento de muitos tumores sólidos, tais como, tumores da próstata, mama, pulmões, rins e ovários [Cusack JC. Cancer Treat Rev (2003) 29: 21-31]. Bortezomibe inibe a série de reação de ubiquitina-proteassoma. Esta inibição dá origem a numerosos efeitos sobre células de tumor, incluindo mudanças em proliferação celular [King RW, Deshaies RJ, Peters JM, Kirschner MW. Science (1996) 274: 1652-1659], adesão celular [Read MA, Neish AS, Luscinskas FW, Palombella VJ, Maniatis T, Collins T. Immunity (1995) 2: 493-506] e angiogênese [Dulic V, Kaufmann WK, Wilson SJ, Tlsty TD, Lees E, Harper JW, et al. Cell (1994) 76:1013-1023] que provocam uma parede para o ciclo celular e apoptose. Estes efeitos aplicam-se principalmente às células de tumor, porém podem também afetar células normais [Adams J. Semin Oncol (2001), 28:613-619].

[0011] O principal efeito colateral causado por tratamento com Bortezomibe é uma neuropatia periférica que frequentemente representa o fator limitante de dose para seu uso clínico e podem também resultar em tratamento sendo descontinuado. Em particular, neuropatia periférica induzida por Bortezomibe toma a forma de parestesia distal e dor neuropática com uma distribuição de "luva e meia" [Cata JP, Weng HR, Burton AW, Villareal H, Giralt S, Dougherty PM. J Pain (2007) 8: 296-306; Cavaletti G, Pezzoni G, Pisano C, Oggioni N, Sala, F, Zoia C, Ferrarese C, Marmiroli P, Tredici G. Neurosci. Lett. (2002) 322:103-106; Richardson PG, Briemberg H, Jagannath S, Wen PY, Barlogie B, Berenson J, et al. J Clin Oncol (2006) 24: 3113-3120; Me- regalli C, Canta A, Carozzi VA, Chiorazzi A, Oggioni N, Gilardini A, Ce- resa C, Avezza F, Crippa L, Marmiroli P, Cavaletti G. Eur J Pain. (2010) 14:343-350]. Estes sintomas surgem durante tratamento com Bortezomibe, porém são frequentemente também prolongados após o tratamento ser interrompido, causando deficiências apreciáveis em pacientes com severas repercussões sobre sua qualidade de vida [Ja- gannath S, Barlogie B, Berenson J, Siegel D, Irwin D, Richardson PG, et al. Brit J Haematol (2004) 127: 165-172]. Até agora, entretanto, não ficou claro quais as mudanças morfológicas especificas nas fibras nervosas periféricas estão associadas com os vários componentes dolo-rosos de neuropatia induzida por Bortezomibe.

[0012] Os sistemas construídos usando partículas de sílica meso- porosa que são potencialmente úteis na liberação/distribuição de fár- macos ou genes são descritos nos documentos listados abaixo: WO2007108016, WO201209448, US20090311332.

[0013] Documento WO2007108016 descreve micro e nanosiste- mas de liberação de fármaco construídos usando partículas de sílica mesoporosa e caracterizados pela presença de um ligante específico de receptor sobre a superfície externa da partícula e um fármaco introduzido ou predominantemente ligado dentro dos poros. O ligante específico de receptor, os receptores dos quais são super-expressos em células de tumor, é reconhecido e internalizado pelas células de tumor e representa com ele todo o nanossistema que libera o fármaco no ambiente intracelular em resposta ao estímulo específico. O ligante específico de receptor e o fármaco podem ser de diferentes tipos. Os sistemas acima mencionados preparam possíveis tratamentos alvejados efetivos com baixas doses de fármaco e baixa toxicidade e efeitos colaterais.

[0014] Documento WO201209448 descreve estruturas de submí- cron com base em sílica porosa com superfícies revestidas com um polímero catiônico. Estas podem incluir um oligonucleotídeo e um agente terapêutico. O uso de Bortezomibe é citado entre os agentes terapêuticos reivindicados, além disso, os sistemas propostos não fornecem mecanismos para a liberação de fármacos sensíveis ao pH.

[0015] Documento US 200903110332 descreve um método para sintetizar nanopartículas de sílica mesoporosa e suas correspondentes aplicações. O método inclui separação das partículas sobre a base de seu tamanho.

[0016] Um material que deve ser liberado é introduzido nas partículas produzidas e liberação controlada é ativada reduzindo o pH na superfície da partícula de sílica mesoporosa. Bortezomibe ou profár- macos de Bortezomibe não são mencionados.

[0017] O objetivo desta invenção é desenvolver derivados de Bor- tezomibe que permitem liberação mais efetiva com uma redução em efeitos colaterais em comparação com Bortezomibe com tal quando é administrado de acordo com a técnica conhecida. Em particular, o objetivo da invenção é inibir as neuropatias periféricas que se originam como um efeito colateral adverso associado com a administração de Bortezomibe.

Sumário da Invenção

[0018] O objetivo da presente invenção reside, portanto, em um sistema de liberação compreendendo a associação de veícu- lo/ligante/Bortezomibe como será definido em breve.

[0019] Outro objetivo da invenção é uma classe de derivados de Bortezomibe capazes de liberar Bortezomibe como uma consequência de sua degradação que ocorre em um pH de 4,0 - 5,5, preferivelmente pH 4,5 - 5,0.

[0020] Estes derivados têm fórmula geral (II) que será brevemente descrita. Eles podem ser usados como tais para os mesmos usos te- rapêuticos como Bortezomibe e podem ser introduzidos em conhecidos sistemas de micro e nanopartícula (tal como, por exemplo, descrito no WO2007108016) incorporando um ligante para liberação dos fármacos.

[0021] Os derivados de acordo com a invenção tornam possível reduzir os efeitos colaterais normalmente associados com altas doses de fármacos antitumor que são necessários em tratamentos convencionais como um resultado de administração direta às células de tumor sozinhas diretamente em um ambiente intracelular.

[0022] Ainda outro objetivo da invenção é um conjugado compreendendo os derivados de Bortezomibe definidos acima com partículas micro- e nanoporosas. As partículas de submícron com base em sílica tendo uma morfologia fornecida com cavidades capazes de receber o agente terapêutico ou agentes ou o profármaco que deve ser liberado são preferidas. Particularmente preferidas são as micro- e nanopartí- culas descritas no WO2007/108016.

[0023] Ainda outro objetivo são composições farmacêuticas compreendendo o profármaco ou o sistema de liberação para o tratamento de formas de tumor em geral ou para aliviar os efeitos colaterais associados com a administração de Bortezomibe.

[0024] Outros objetivos da invenção ficarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada.

Breve Descrição das Figuras

[0025] Figura 1. Diagrama do conjugado compreendendo sílica mesoporosa acoplada com ácido fólico sobre a superfície externa e alojando o derivado de Bortezomibe (mostrado esquematizadamente como um oval) quimicamente ancorado nos pores.

[0026] Figura 2. Uma micrografia de uma sílica mesoporosa do tipo de MSU obtido usando um microscópio eletrônico de varredura.

[0027] Figura 3. Espectro de 13C-RMN do éster borônico.

[0028] Figura 4. Cromatograma de Bortezomibe em uma concentração de 70 ppm em fluido corporal simulado em um pH de 5.

[0029] Figura 5. Linha de calibração relativa ao segundo pico no cromatograma da solução em pH 5.

[0030] Figura 6. Linha de calibração relativa ao terceiro pico do cromatograma da solução em pH 5.

[0031] Figura 7. Cromatograma da amostra de SBA-BORT durante os testes de liberação em fluido corporal simulado em pH 5.

[0032] Figura 8. Cromatograma of Bortezomibe in uma concentração de 50 ppm in fluido corporal simulado em pH 7.

[0033] Figura 9. Linha de calibração relativa ao pico 1 do cromato- grama da solução em pH 7.

[0034] Figura 10. Cromatograma obtido da solução tamponada para pH 7 em que a amostra de conjugado de Sílica (SBA-15)/ ligante / Bortezomibe foi suspensa durante 0,5 hora.

[0035] Figura 11. Cromatograma obtido da solução tamponada para pH 7 em que a amostra de conjugado de Sílica (SBA-15)/ ligante /Bortezomibe foi suspensa durante 9,0 horas.

[0036] Figura 12. Liberação de Bortezomibe de fluidos corporais simulados em pH 5 e pH 7 como uma função de tempo.

[0037] Figura 13. Imagens de TEM ilustrando a captação de MSN- FOL por células HeLa expressando FR após incubação de 1 hora (veja a seção de materiais e métodos). Imagem (A) foi obtida em uma ampliação de x8000, enquanto a área ligada pelo quadrado foi adquirida em uma ampliação de x25000 (B).

[0038] Figura 14. O MSN-FOL/GPS-BTZ inibe desenvolvimento em células de tumor cervical uterino HeLa de FR positivo (Figura 14A), porém não em células de carcinoma mamário MCF-7 (Figura 14B) nem em células HEK293 normais (C), ambas das quais são FR negativo. As células foram tratadas com MSN-FOL/GPS-BTZ ou deixadas não tratadas (controle C). MSN-FOL e MSN-FOL/GPS foram usados como outros controles negativos (veja Materiais e Métodos). A vitalidade celular foi avaliada após 1, 2 ou 3 dias de tratamento. Os valores reportados representam a média ± desvio-padrão de quatro experimentos independentes realizados em triplicato para cada condição.

Descrição Detalhada da Invenção

[0039] As seguintes definições aplicam-se no contexto desta invenção:

[0040] • por sistema de liberação de fármaco entende-se o conju gado de veículo/Ligante/Bortezomibe;

[0041] • por profármaco de derivado de Bortezomibe entende-se o composto de fórmula geral (II) obtido por reação entre o ligante e Bor- tezomibe no grupo funcional de ácido borônico;

[0042] • por ligante ou unidade molecular ou ligante bidentado en tende-se a molécula de fórmula geral (III), uma extremidade da qual é capaz de reagir com o grupo funcional de ácido borônico de Borte- zomibe e a outra extremidade capaz de ligar-se ao veículo;

[0043] • por ligante ou agente tendo uma função de liberação en tende-se um composto responsável por liberação e reconhecimento de moléculas abundantemente expressas sobre a superfície de células de tumor, desse modo trazendo liberação seletiva para o tecido alvo;

[0044] • por veículo entende-se uma partícula, por exemplo, uma partícula de sílica porosa, tendo dimensões micro- a nanométricas que podem ligar-se com o derivado de boro de Bortezomibe (o pró-fármaco como definido acima) em sua superfície, por exemplo pode ser a partícula de sílica porosa ou uma matriz com base em óxidos inorgânicos tendo porosidade controlada, que são, por exemplo, obtidos por processos de "impressão molecular" ou por meio do uso de tensoativos. (Katz, A.; Davis, M. E. Molecular Imprinting of Bulk, Microporous sílica, Nature. 2000, 403, 286-289.);

[0045] • por micro ou nanossistema de liberação de fármaco en- tende-se um veículo como definido acima que carrega sobre sua superfície um composto designado para reconhecer moléculas abundantemente expressas sobre a superfície de células de tumor, desse modo trazendo liberação seletiva para o tecido alvo, selecionado, por exemplo, de: ácido fólico, biotina, peptídeos, anticorpos, glicosídeos, carboidratos ou proteínas, todos os compostos em si conhecidos.

[0046] Os derivados de Bortezomibe de acordo com a invenção são representados por fórmula geral (II) e podem ser obtidos pela reação química de Bortezomibe de fórmula geral (I) com um ligante biden- tado que pode ser representado por fórmula geral (III) que reage para formar um derivado de boro cíclico na extremidade do ligante transportando R4.

[0047] No composto de fórmula (II), Y e Z representam, independentemente um do outro, -NH, -O-, -S-, e A é o substituinte obtido após a reação entre o composto de fórmula (I) (Bortezomibe) e o composto de fórmula (III).

[0048] Em particular, A tem o seguinte significado

[0049] Os ligantes bidentados (ou ligantes) de acordo com a invenção são representados por fórmula geral (III):

[0050] em que:

[0051] R1, R2, R3, independentemente um do outro, são selecio nados de CH3, C2H5, OCH3, OC2H5, OC3H7, OC4H9, OC5H11;

[0052] X é uma ligação simples ou S, O, NH;

[0053] R4 é selecionado de NH2, SH, epóxido, halogênio, CN, tio- cianato, -CH=CH2;

[0054] n e m são números inteiros positivos, de tal modo que, n = 0-5 e m = 0-3 com n + m > 1

[0055] Os derivados de Bortezomibe o permitem ser liberado em um pH de 4,5 - 5,0 abrindo o anel de boro, enquanto a outra extremidade pode ser deixada livre ou mais vantajosamente ligada a um conhecido sistema de micro ou nanopartícula.

[0056] Os derivados de Bortezomibe de acordo com a invenção podem ser obtidos por um processo fornecendo os seguintes estágios básicos.

[0057] Os derivados de Bortezomibe de acordo com a invenção podem ser preparados reagindo-se primeiro Bortezomibe com o ligan- te de fórmula (III), desse modo obtendo o composto de fórmula (II), que é em seguida ligado ao veículo. Como uma alternativa, o ligante de fórmula (III) é reagido com o veículo através dos substituintes R1, R2 e R3, e o que é obtido é causado para reagir com Bortezomibe, obtendo o sistema de Veículo/Ligante/Bortezomibe de acordo com a invenção. Todas as reações são reações orgânicas que se incluem no escopo do conhecimento daqueles versados na técnica. Condições de reação típicas são, por exemplo, ilustradas na seção de exemplos.

[0058] Os derivados de Bortezomibe podem ser usados para a li- beração intracelular de Bortezomibe pelo fato de que eles permitem o fármaco a ser transportado em uma forma biologicamente inativa através do fluxo sanguíneo, porém visto que eles alcançam o ambiente intracelular, eles sofrem degradação química induzida pelas características do ambiente (pH), liberando Bortezomibe livre.

[0059] Quando o derivado é usado como um constituinte de um sistema de liberação de fármaco ele será ancorado a este, e como o sistema inteiro tem uma função de liberação ele será capaz de alcançar o ambiente intracelular em pH 4,5 - 5,0 onde a degradação do pró- fármaco ocorrerá com a liberação de Bortezomibe livre.

[0060] O derivado é degradado, liberando o Bortezomibe em um pH de 4,5 - 5,0 (o pH típico do ambiente intracelular). Para uma descrição geral dos micro- ou nanossistemas apresentados aqui, onde estes são usados para o transporte dos profármacos de Bortezomibe que são o objetivo da invenção, veja o documento WO2007108016.

[0061] O diagramo mostrado abaixo descreve o uso potencial da invenção descrita. Em particular, um uso potencial como um componente de um micro- ou nanossistema para a liberação intracelular de Bortezomibe é ilustrado. O sistema compreende uma matriz com base em óxidos inorgânicos com porosidade regular e controlada (no caso particular, uma partícula de sílica mesoporosa é ilustrada), caracterizado pelo fato de que uma substância responsável pela liberação e reconhecimento molecular (diagramaticamente ilustrada como um asterisco; por meio de exemplo, ácido fólico foi selecionado na Figura 1) é seletivamente acoplada, preferivelmente na superfície externa, e, preferencialmente nos poros, a molécula pertencendo à classe de moléculas que são o objeto da invenção (pró-fármaco de Bortezomibe, representado diagramaticamente como um oval), quimicamente ancorado ao sistema.

[0062] Em uma outra modalidade da invenção, a matriz inorgânica compreende, além de ou como substituição para as substâncias responsáveis pela liberação e reconhecimento molecular, outras moléculas tendo uma função marcadora, em particular marcadores fluorescentes. Estas moléculas podem ser combinadas na superfície externa da matriz inorgânica em combinação com as substâncias de liberação. Rodamina e fluoresceína são preferidas. Um método de preparação é descrito em Morelli, C. et al. L. PEG-templated mesoporous silica nanoparticles exclusively target cancer cells. Nanoscale. 3 de Agosto de 2011(8):3198-207, onde a preparação de sílicas mesoporosas se ligam à fluoresceína e ácido fólico é descrito.

[0063] Os derivados de Bortezomibe de acordo com a invenção representam uma classe de profármacos de Bortezomibe relacionando-se à hidrólise do éster de ácido borônico e podem também ser conjugados na superfície de um micro- ou nanossistema para a liberação de fármaco de tal modo a se tornar um constituinte do mesmo.

[0064] Estes são quimicamente estáveis em um pH neutro, enquanto eles se decompõem com a liberação de Bortezomibe em pH levemente acídico pH (4,5 - 5,0). Eles podem ser usados no transporte e liberação de Bortezomibe visto que é necessário para induzir sua difusão em ambientes tendo pH levemente ácido após terem passados através de meios tendo um pH neutro no qual os fármaco permanece estavelmente conjugado na forma de um derivado de boro biologicamente não ativo.

[0065] Estes derivados podem também ser ligados aos sistemas de micro e nanopartículas usados para um transporte de Bortezomibe visto que eles são necessários para induzir sua difusão em ambientes tendo um pH levemente ácido após ter passado através de meios tendo um pH neutro no qual o fármaco permanece estavelmente conjugado na forma de um éster borônico não biologicamente ativo, condições que ocorrem se os micro e nanossistemas acima mencionados para a liberação de fármaco forem usados para a injeção endovenosa.

[0066] O derivado de Bortezomibe de acordo com a invenção tem em sua estrutura o grupo funcional de éster borônico e como tal tem reatividade similar àquela de ésteres borônicos.

[0067] As moléculas (ligantes de bidentato) que foram feitos reagir com Bortezomibe para dar origem aos profármacos tendo as propriedades acima descritas são ilustradas pela fórmula geral (III).

[0068] Uma molécula particularmente preferida é 3-glicidoxipropil- trimetóxi-silano de fórmula 2.1:

[0069] Outras moléculas particularmente preferidas são:

Administração de Composições Framacêuticas

[0070] A presente invenção também inclui composições farmacêuticas compreendendo derivados de Bortezomibe de fórmula (II) e conjugado com base em Bortezomibe, juntamente com um veículo farma- ceuticamente aceitável.

[0071] De acordo com a presente invenção os derivados e conjugados de acordo com a invenção podem ser formulados para administração simples ou contemporânea, sequencial ou retardada com outros ingredientes ativos ou pró-fármacos tais como, por exemplo, fármacos antitumor, material genético, radionuclídeos ou marcadores fluorescentes e podem, portanto, ser inseridos em uma formulação simples ou em formulações separadas.

[0072] Para uso no campo terapêutico, as composições farmacêuticas são preparadas em formulações adequadas para um tipo de ad-ministração contemplado e os veículos para os indivíduos que requerem tratamento, como conhecido por aqueles versados na técnica.

[0073] A formulação pode, por exemplo, ser obtida através do uso de sais e substâncias de tamponamento ou outros excipientes que são conhecidos na técnica e são farmaceuticamente aceitáveis.

[0074] A administração dos derivados e conjugados de acordo com a invenção pode, por exemplo, ocorrer nasalmente, bucalmente, oralmente, intradermicamente, subcutaneamente, intramuscularmente, intraperitonealmente, endovenosamente, intratecalmente, intercranial- mente, parenteralmente ou intraperitonealmente.

[0075] As formas farmacêuticas que podem ser usadas para injetáveis podem, por exemplo, incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis, tais como também pós estéreis para uma preparação de dispersões extemporais e todos os excipientes, veículos e tampões conhecidos por aqueles versados na técnica para uso na preparação de injetáveis. Os pós estéreis são preferivelmente preparados através de técnicas de dissecação conhecidas por aqueles versados na técnica, por exemplo, através de dessecação sob vácuo e secagem por congelamento.

[0076] Doses terapeuticamente apropriadas serão estabelecidas por aqueles versados na técnica responsável para o tratamento, com base na gravidade das condições dos indivíduos que requerem tratamento e na rotina de administração selecionada.

[0077] Qualquer composição de acordo com a invenção pode ser incluída em um kit de administração. Por meio de exemplo não limitan- te, um kit de acordo com a invenção pode compreender o derivado de Bortezomibe ou o sistema de liberação de Veícu- lo/Ligante/Bortezomibe formulado de uma maneira apropriada para administração específica, juntamente com um veículo farmaceutica- mente aceitável, por exemplo, água para preparações injetáveis ou um veículo farmaceuticamente aceitável para administração oral, onde aplicáveis.

[0078] Os componentes do kit de acordo com a invenção podem ser em forma líquida ou forma liofilizada e são preferivelmente empacotados em recipientes estéreis adequados, tais como, por exemplo, garrafas, tubos de teste ou seringas, ou individualmente ou já misturados.

[0079] Os kits de acordo com a invenção podem também incluir ferramentas ou dispositivos para administração dos nanoveículos de acordo com a invenção por meio de várias rotinas de administração, por exemplo, administração parenteral, intramuscular ou endovenosa.

[0080] Os kits de acordo com a invenção também compreendem instruções para uso dos componentes e quaisquer outros reagentes não inclusos nos próprios kits.

[0081] Os sistemas de liberação e os profármacos com base em Bortezomibe de acordo com a invenção são vantajosamente usados no tratamento de tumores, em particular eles são úteis para aliviar os efeitos colaterais e melhorar as condições clínicas de indivíduos afetados por formas de tumores, em particular carcinomas, mieloma múltiplo, linfomas tais como linfoma de célula manto, tumores da próstata, mama, pulmões, rins e ovário, mais particularmente carcinomas dos ovários, rins, cérebro, pulmões e mama.

[0082] Os sistemas de liberação e os profármacos de acordo com a invenção podem vantajosamente ser usados para todas aquelas doenças para as quais Bortezomibe é usado, a fim de reduzir sua dose e aliviar os efeitos colaterais, tais como, por exemplo, as mudanças morfológicas em fibras de nervo periférico, neuropatias periféricas, pares- tesia distal e dor neuropática com uma distribuição de "luva e meia ".

[0083] Os seguintes exemplos, juntamente com as figuras, são fornecidos puramente por meio de ilustração da invenção e não devem ser considerados como limitante de seu escopo. Exemplos Ligação do ligante de fórmula (iii) ao nanoveículo e reação subsequente com Bortezomibe Síntese de sílica funcionalizada com 3-glicidoxipropil

Procedimento

[0084] A sílica secada (SBA-15 0,55 g) feita reagir em uma atmosfera de nitrogênio inerte com 3-glicidoxipropilsilano (0,74 ml) em tolue- no anidroso. A reação foi deixada continuar sob refluxo com agitação magnética durante oito horas. A sílica funcionalizada foi filtrada e lavada com tetra-hidrofurano em filtros de poliamida e sequencialmente secada. Deste modo, a sílica funcionalizada com o ligante de glicidoxi- propila (1,1 g) foi recuperada. [N-2(-aminoetil)-3-aminopropilsilano)] (AEAPS) (3-trimetoxisililpropil)dietilenotriamina

[0085] A sílica mesoporosa (SBA-15 ou outro tipo) foi pré-ativada em aproximadamente 120°C em uma estufa durante a no ite, e foi sub- sequentemente resfriada e tratada com aminossilano (AEAPS ou Si- DETA).

[0086] A mistura foi aquecida com refluxo com tolueno anidroso (30 ml/g de suporte) durante 24 horas em uma atmosfera de N2. A mis- tura reacional foi resfriada para temperatura ambiente, o tolueno e o excesso de diamina foram removidos por filtragem sob vácuo.

[0087] O produto recuperado foi lavado diversas vezes com diclo- rometano e secado sob vácuo a 40°C.

Alternativa A

[0088] Como uma alternativa, a reação de funcionalização com 3- glicidoxipropiltrimetoxissilano pode ser realizada em dioxano seco.

Reação de Enxerto em dioxano seco durante 18 horas em temperatura ambiente

[0089] O processo de síntese fornece para a suspensão de 400 mg de material mesoporoso* e a dissolução de 0,80 ml de 3- glicidoxipropiltrimetoxissilano em 12 ml de dioxano seco em temperatura ambiente. A mistura foi deixada com agitação magnética em temperatura ambiente durante 18 horas. A mistura foi subsequentemente filtrada e lavada em dioxano e THF seco e secada a 45°C.

Alternativa B

[0090] Como uma alternativa, este tipo de reação pode ser realizado em etanol em temperatura ambiente usando tempos de reação mais longos.

[0091] Em uma preparação típica, uma solução obtida dissolvendo 8,11 g de 3-aminopropiltrietoxissilano (APTES, C9H23NO3S1) em 17,13 ml de etanol foi introduzida em uma suspensão obtida suspendendo 4 g de sílica mesoporosa do tipo MSU*, adequadamente secados, em 14,3 ml de etanol. A suspensão obtida foi agitada em temperatura ambiente durante 18 horas, subsequentemente lavada, filtrada e secada.

[0092] 3,50 g de produto foram recuperados (deve-se ter em men te que o seguinte procedimento pode referir-se tanto a um material cuja porosidade foi impregnada pelo tensoativos de síntese quanto um material sem tensoativo. No caso acima, o material cuja porosidade foi impregnada com o tensoativos de síntese foi usado, e este se suspenso em etanol libara o tensoativos ou parte do mesmo, fazendo com que os dados relativos à quantidade de produto recuperada no término do cálculo de produção não seja muito significante).

[0093] *Qualquer procedimento de funcionalização é válido para todos os tipos de sílica mesoporosa, entretanto, as alternativas propostas (acima toda a alternativa A que usa dioxano, que é um solvente não prótico) são adequadas para a funcionalização de micro- ou na- nossistemas nos quais os ligantes específicos de receptor tais como ácido fólico ou outros foram anteriormente ligados, contanto que contanto que seja realizada em temperatura ambiente e sob condições de reatividade que conservam sua atividade biológica.

[0094] As reações de funcionalização acima podem ser usadas para todos os ligantes de fórmula geral (III), variando o tempo de reação com relação ao grau de funcionalização desejado. Síntese de Sílica funcionalizada com 3-propoxipropil- 1,2-diol Procedimento

[0095] A sílica funcionalizada com a glicidoxipropila foi feita reagir com uma solução a 0,001N de HCI. A reação foi deixada progredir com agitação magnética durante sete horas em temperatura ambiente.

[0096] Filtragem e lavagem com água destilada e acetona de grau analítico em filtros de poliamida foram realizadas. Sílica funcionalizada com o grupo funcional diol foi recuperada. Ancoragem de Bortezomibe à sílica funcionalizada

[0097] Em uma atmosfera de nitrogênio inerte, Bortezomibe foi feito reagir com sílica funcionalizada com o grupo funcional diol em diclo- rometano anidroso. A reação foi deixada progredir com agitação mag-nética durante noventa minutos.

[0098] Filtragem e diversas lavagens foram realizadas em filtros de poliamida usando diclorometano anidroso. A sílica com o Bortezomibe ligante como um éster borônico cíclico foi recuperada.

[0099] Como uma alternativa, a seguinte preparação:

[00100] Quantidades equimolares de Bortezomibe e grupo funcional na sílica mesoporosa (SBA-15 ou outro tipo) funcionalizada com ligan- tes de AEAPS e SiDETA foram aquecidas para 40°C em tolueno ani- droso na presença de peneiras moleculares durante 7 horas. O produto recuperado (diazaborolidina) foi lavado diversas vezes com dicloro- metano e secado sob vácuo.

[00101] Diazaborolidinas hidrolisam rapidamente em soluções ácidas diluídas, porém em soluções neutras, a hidrólise é muito lenta (J. Am. Chem. Soc, 1958, 80 (20), pp 5411-5413) Preparação do derivado de Bortezomibe de fórmula (II) e ligação sub-sequente com o nanoveículo

[00102] • O 3-glicidoxipropilsilano foi feito reagir com uma solução a 0,001N de HC1 em THF (tetra-hidrofurano).

[00103] • A mistura reacional foi deixada durante 3 horas com agi tação magnética.

[00104] • O produto impuro foi recuperado removendo o solvente sob condições de pressão reduzida e foi em seguida tratado com água e subsequentemente extraído com diclorometano. O 3- (sililpropóxi)propano-1,2-diol foi recuperado neste modo e em seguida feito reagir com Bortezomibe em diclorometano durante aproximadamente 2 horas. O éster borônico obtido foi tratado com sílica (SBA-15 ou outro tipo) em etanol durante 48 horas em temperatura ambiente.

[00105] • Ele foi filtrado e lavado diversas vezes em filtros de polia- mida usando etanol e diclorometano anidroso. Sílica com o Bortezomi- be ligado como um éster borônico cíclico foi recuperada.

[00106] Usando os ligantes de AEAPS e SiDETA, a ligação ao Bor- tezomibe pode ser feita usando as mesmas condições como são usadas para ligação de Bortezomibe à sílica funcionalizada com AEAPS e SiDETA. O derivado de fórmula (II) obtido pode em seguida ser ligado à sílica como o derivado de fórmula (II) obtido com o glicidóxi. 1-amino-3-(3-silil)propóxi)propan-2-ol

[00107] Amônia gasosa em temperatura ambiente foi feita borbulhar através de uma solução de 3-glicidoxipropilsilano em etanol durante 10 horas. O solvente foi removido sob condições de pressão reduzida e o 1-amino-3-[(3-silil)propóxi]-propan-2-ol (C) foi recuperado e em seguida subsequentemente tratado com Bortezomibe em quantidades equimolares em tolueno a 40°C na presença de peneiras moleculares.

[00108] A oxa-azaborolidina obtida foi tratada com sílica (SBA-15 ou outro tipo) em etanol durante 48 horas em temperatura ambiente.

[00109] Esta foi filtrada e lavada diversas vezes em filtros de polia- mida usando etanol e diclorometano anidroso. No produto recuperado, o Bortezomibe foi ligante à sílica por meio de uma estrutura de oxa- azaborolidina cíclica.

[00110] Com respeito aos ligantes de fórmula geral (III) em que R4 é uma ligação dupla (aliltrietoxisilano, aliltrimetoxissilano, etc.), a ligação dupla pode ser convertida em um epóxido através de uma reação de epoxidação com perácidos ou através da formação de halo-hidrina e substituição nucleofílica intramolecular subsequente. O epóxido obtido foi em seguida processado do mesmo modo como a glicidoxipropi- la.

[00111] No caso onde R4 é um halogênio ((3-cloro- propil)trimetoxissilano), o ligante pode ser convertido no alceno cor-respondente através de uma reação de desidro-halogenação (β- eliminação) e subsequentemente processado do mesmo modo como os derivados em que R4 é uma ligação dupla.

Síntese do éster borônico

[00112] Bortezomibe pode reagir com os dióis obtidos pela abertura do grupo epóxi apresentados na molécula, formando um éster borôni- co cíclico.

[00113] Experimentos preliminares foram realizados usando modelos de ácido borônico com uma visão de estudo e desenvolvimento das condições de reação ideal para a formação dos ésteres borônicos iniciando de 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano. Ácido 3-metilbutilborônico e ácido fenilborônico foram usados como substratos modelo para este propósito.

[00114] A presença de grupos trimetoxissilila torna possível ligar-se com a superfície da sílica mesoporosa. A ligação de éster formada pode ser hidrolisada em ambiente levemente ácido (pH 4,5 - 5,0) e permite que o fármaco seja liberado nos endossomas e, portanto, no sítio alvo limitando a liberação longe do ambiente celular.

Nanopartículas funcionalizadas com o derivado de boro no exemplo anterior Funcionalização

[00115] Profármacos de Bortezomibe podem ser usados como os constituintes de micro- ou nanossistemas para a liberação de fármaco.

[00116] O método experimental seguido forneceu a funcionalização das nanopartículas de sílica mesoporosa e conjugação subsequente com a funcionalidade introduzida pelo ácido borônico. O material me- soporoso foi funcionalizado usando 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano; o grupo funcional epóxido foi subsequentemente hidrolisado para permitir que o Bortezomibe fosse ancorado.

[00117] A molécula de 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano é capaz de ligar o Bortezomibe e ao mesmo tempo pode ser ancorada à superfície da sílica mesoporosa.

[00118] O material mesoporoso do tipo SBA-15 foi sintetizado por modificação de uma preparação reportada na literatura (Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng Aspects 229 (2003)1-8). As preparações usadas resultaram da graduação do procedimento original e modificação delas com respeito à relação molar EtOH/H2O. Preparação da amostra SBA 15: 4,2 g de Plurônico P-123 (Sigma Aldrich) e subsequentemente 0,7 g de CTAB (Alfa Aesar) foram dissolvidos em uma solução compreendendo 56,6 mL de H2O ultrapuro, 35 mL de 99+% EtOH (Sigma Aldrich) e 84 mL de HCl a 2M. Quando a dissolução foi concluída, 14 mL de TEOS (Sigma Aldrich) foram adicionados, a mistura obtida foi deixada agitar em temperatura ambiente durante 30 minutos e subsequentemente transferida para uma autoclave Teflon on- de ela foi deixada envelhecer durante 5 horas a 80°C e subsequente-mente em uma temperatura de 120°C durante 12 horas. O precipitado branco obtido foi recuperado por filtragem usando filtros de poliamida com uma porosidade de 0,2 pm.

[00119] Alternativamente, sílicas mesoporosas do tipo MSU obtidas pelo seguinte protocolo de síntese ou similar (derivando dos procedimentos reivindicados no WO2007108016) podem ser usadas: uma solução compreendendo 150 g de H2O destilado e 13,80 g de Triton X100 (Sigma-Aldrich) foi preparada em um béquer plástico de 500 ml. Visto que o tensoativos foi completamente dissolvido, uma solução compreendendo 10 g de n-decano (99+% C10H22, Carlo Erba) e 14,50 g de TEOS (Si(OC2H5)4, Sigma-Aldrich) foi preparada. A solução foi lentamente vertida ao longo das paredes do béquer em que o tensoa- tivo modelo foi dissolvido com agitação muito suave. A emulsão de duas fases obtida foi deixada envelhecer com agitação suave em temperatura ambiente durante 8 dias. Visto que a fase orgânica sobreja- cente foi removida, a emulsão foi filtrada usando filtros de poliamida tendo uma porosidade de 0,2 μm.

[00120] Outros tipos de sílica mesoporosa podem ser usados como uma alternativa.

[00121] O material mesoporoso SBA-15 foi tratado com 3- glicidoxipropiltrimetoxisilano (5) em tolueno anidroso sob refluxo durante 8 horas (Diagrama 1.1)i

[00122] Após filtragem e lavagem com tetra-hidrofurano, a sílica mesoporosa funcionalizada foi recuperada e caracterizada por espec- troscopia de infravermelho (IR), análises termogravimétricas (TGA) e calorimetria diferencial (DSC).

[00123] Uma forte redução na absorção em 3450 cm-1 associada com alongamento da ligação de O-H nos grupos silanol da sílica e a presença de faixas de alongamento de ligações de C-H em 2951 e 2853 cm-1 correspondentes à cadeia de átomos de carbono do grupo glicidoxipropila que estavam ausentes no espectro de IR do material não funcionalizado foram obtidos no espectro de IR.

[00124] Características do ligante orgânico são também as faixas a 910 e 816 cm-1 relacionando-se ao alongamento assimétrico do anel epóxi.

[00125] As análises de DSC e TGA foram realizadas no material mesoporoso SBA-15 após calcinação e no material (8) funcionalizado com 3-glicidoxipropila.

[00126] Diferença considerável foi constatada dos gráficos (não en-contradas) com relação às análises de DSC e TGA das duas amostras. No caso do material funcionalizado, a curva de TGA mostrou uma perda de peso de aproximadamente 11,3% (expressa em termos da relação de massa de massa orgânica/(SiO2+orgânica) de 0,113). Na curva DSC, o pico exotérmico em uma temperatura de 248°C foi a evidência da reação de combustão do grupo glicidoxipropila.

[00127] A fim de sintetizar os ésteres borônicos da sílica mesoporo- sa funcionalizada (8), o anel epóxi foi convertido no diol corresponden- te por hidrólise em um ambiente ácido.

[00128] A reação de hidrólise foi realizada por tratamento de sílica mesoporosa 8 com uma solução aquosa de ácido clorídrico a 0,00 1N durante 7 horas em temperatura ambiente (Diagrama 2.1).

[00129] O produto hidrolisado 9 recuperado por filtragem foi secado e caracterizado por espectroscopia e análises de DSC e TGA. Um aumento de intensidade na faixa com relação ao alongamento da ligação O-H em aproximadamente 3443 cm-1 atribuível à presença do grupo funcional diol e o desaparecimento da faixa em 910 cm-1 correspondendo ao alongamento assimétrico do anel epóxi foram observados no espectro de IR de produto 9.

[00130] Os experimentos foram realizados na formação de ésteres borônicos partindo de sílica mesoporosa funcionalizada 9 usando 3- ácido metilbutilborônico (6) como um substrato modelo. O composto 9 foi tratado com ácido borônico 6 (análogo de Bortezomibe. Moléculas similares de Bortezomibe foram usadas para ligar a reatividade da mo-lécula mais diretamente com a estrutura do grupo funcional no suporte do estudo para torná-la mais rigorosa, condições similares àquelas em que a reação de Bortezomibe ocorre) em tolueno anidroso sob refluxo durante 24 hours (Diagrama 3.1).

[00131] O produto (10) recuperado por filtragem da mistura reacio- nal foi lavada com THF, em que o solvente ácido 3-metilbutilborônico é solúvel, secado e caracterizado por espectroscopia de IR e análises de DSC e TGA.

Formação do Diéster borônico

[00132] O diéster borônico foi formado usando outro sistema modelo: ácido fenilborônico (um análogo de Bortezomibe). A reação de 9 com ácido fenilborônico foi realizada sob condições diferentes: a reação foi realizada em temperatura ambiente durante tempos mais curtos usando diclorometano como solvente. O material mesoporoso 9 foi tratado com ácido fenilborônico (11) em diclorometano anidroso em temperatura ambiente durante 90 minutos (Diagrama 4.1).

[00133] Caracterização de produto 12, recuperado após filtragem e lavagem com diclorometano, usando espectroscopia de IR e análises de DSC e TGA, confirmou a formação do boronato. O espectro de IR mostrado, como características da estrutura de 12, uma faixa corres-pondente ao alongamento de ligação de C-H aromático em 3015 cm-1 correspondendo ao fenil borato, uma faixa de absorção em 1368 cm-1 atibuída à vibração assimétrica da ligação de B-O do boronato e duas faixas em 804 e 707 cm-1 com relação à dobra perpendicular ao plano das ligações de Ar-H.

[00134] Bortezomibe foi em seguida ancorado à sílica mesoporosa SBA-15 usando condições similares àquelas nos experimentos com ácido fenil borônico (Diagrama 5.1).

[00135] A análise do produto recuperado (14) por espectroscopia de IR revelou a presença de uma faixa correspondendo ao alongamento da ligação de amida presente na molécula de Bortezomibe em 1680 cm-1 e uma faixa em 1533 cm-1 que seria atribuível à dobra do grupo NH. Também típicas da molécula de Bortezomibe são as faixas em 1446 cm-1 com relação ao alongamento da ligação de C-N e em 744 e 701 cm-1 correspondendo para dobrar fora do plano do anel aomático. Estas faixas no espectro de IR do diol de partida (9).

[00136] A ancoragem do Bortezomibe ao material mesoporoso fun- cionalizado 9 foi também confirmada por análise de RMN de composto 14 no estado sólido.

[00137] Todos os sinais atribuíveis tanto ao ligante orgânico quanto à molécula de Bortezomibe foram observados no espectro de 13C- RMN de 14 (Figura 3).

[00138] O sinal em 7,52 ppm foi devido ao carbônio do grupo meti- leno ligado à sílica (S1-CH2), enquanto os dois sinais em 21,49 e 23,50 correspondiam respectivamente às metilas na cadeia lateral do resíduo de aminoácido de leucina e o carbono de metileno central da cadeia propila ligada ao silício.

[00139] Sinais com relação aos átomos de carbono dos dois grupos CH2 ligados aos átomos de oxigênio de éter do ligante orgânico (CH2- O-CH2) estavam também presentes em 70.50 e 71.56 ppm. Dentro da faixa de 122,56-154,76 ppm, o espectro mostrou sinais com relação aos carbonos aromáticos da molécula de Bortezomibe, e sinais que podem ser atribuídos às amida carbonilas daquela molécula entre 162,76 e 171,45 ppm.

[00140] No espectro 29Si-RMN no estado sólido (não mostrado), dois picos muito fortes são observados em -110,6 e -105,5 ppm cor-respondendo às estruturas Q4[Si(OSi)4] e Q3[Si(OSi)3OH] respectiva-mente. Dois picos estavam também presentes em campos menores, - 66,2 e -56,1 ppm, que podem ser atribuídos ao silício das estruturas T3[RSi(OSi)3] e T2[RSi(OSi)2OH]. A presença da espécie T no espectro confirma que o ligante orgânico foi ligado à estrutura inorgânica da sílica. Análise de nB-RMN de 14 também mostra sinais que podem ser atribuídos ao boro tricoordinado e tetracoordinado.

Profármacos de Bortezomibe como constituintes de micro- ou nanos- sistemas de liberação: avaliação da estabilidade do pró-fármaco em pH diferente

[00141] O agente ligante para ancoragem do fármaco à matriz, co- mo mostrado acima, é 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano, que é capaz de reagir com grupo funcional ácido borônico e o material mesoporoso ao mesmo tempo.

[00142] De acordo com este método, o fármaco é covalentemente ligante na superfície da sílica de um material mesoporoso. A ligação é estável em pH neutro e torna-se lábil no pH levemente ácido (4,5 - 5,0) que são tipicamente encontrados na célula dentro dos endosso- mas e lisossomas.

[00143] Estas características (juntamente com a possibilidade de conjugação de um ligante específico de receptor com o sistema) torna-ram o sistema como um todo potencialmente capaz de difundir-se dentro do fluxo circulatório (sem perdas significantes de Bortezomibe), sendo reconhecido e internalizado pelas células de tumor que supe- rexpressa os receptores de ligante específicos de receptor, com liberação do fármaco após hidrólise de ácido da ligação covalente.

[00144] O comportamento do sistema anteriormente referido foi avaliado por HPLC (Cromatografia Líquida de Desempenho Elevado) em soluções de tampão em pH 5,0 e pH 7,0 que imita os ambientes intracelulares de fluxo sanguíneo, respectivamente.

Liberação de Bortezomibe pelo sistema de liberação de fármaco com-preendendo um pré-fármaco de Bortezomibe (conjugado de sílica (SBA-15)/ligante/Bortezomibe).

[00145] O perfil de liberação do fármaco do sistema total foi estudado reproduzindo os ambientes fisiológicos com os quais entraria em contato "in vitro". A liberação foi, portanto, estimulada em uma solução em pH neutro (SBF) a fim de estimular a rotina seguido pelo sistema de matriz-fármaco dentro do fluxo circulatório até sua entrada na célula alvo, e em uma solução de ácido em pH = 5, que imita o ambiente presente nos endossomas, vesículas intracelulares que se formam após o sistema de fármaco-matriz ter sido internalizado por por endocitose.

Preparação de c- SBF (Fluido Corporal Simulado)

[00146] O c-SBF são soluções tamponadas para diferentes valores de pH que imitam o ambiente de fluido corporal.

[00147] Em particular foram usados:

[00148] 1) uma suspensão de tampão em pH 7, formada em vez de por di-hidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) e hidróxido de sódio (NaOH) reproduzindo o ambiente neutro de plasma sanguíneo.

[00149] 2) uma suspensão de tampão de pH 4,4 com base em ace tato de sódio e ácido acético, que reproduz o ambiente ácido dos li- sossomas com o qual o fármaco entra em contato após endoctose.

Condições Analíticas para HPLC (Cromatografia Liquid de Desempenho Elevado).

[00150] O perfil de liberação do fármaco foi avaliado por HPLC usando acetonitrila/água (30/70 v/v) com 0,1% de ácido fórmico como a fase eluente e uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min. O detector de UV foi estabelecido a 270 nm.

[00151] Uma coluna Lichrosorb RP18 TEKNOKROMA 10 μm 25 x 0,46 foi usada.

[00152] O volume das soluções injetadas foi de 1 microlitro e amostras da solução sob condições fisiológicas foram obtidas em intervalos de 30 minutos durante 12 horas.

[00153] As linhas de calibração foram traçadas usando três soluções tampão tendo diferentes concentrações de Bortezomibe. O fár- maco mostrou três diferentes picos em pH 5 no cromatograma de HPLC.

[00154] Os segundo e terceiro picos foram considerados para os propósitos de avaliação da liberação de fármaco porque a área que estes subtendem é linearmente correlacionada com a concentração das soluções-padrão.

[00155] A presença de dois diferentes picos é devido à existência de duas formas de Bortezomibe no pH em questão que têm diferentes tempos de eluição como mostrado na Figura 4.

[00156] Os valores obtidos de análise das soluções de Bortezomibe em diferentes concentrações são mostrados nas Tabelas 1.1 e 2.1 para os picos identificados pelos números 2 e 3 respectivamente no cro- matograma obtido em pH 5, mostrado na Figura 4. As linhas de cali- bração obtidas de picos 2 e 3 são mostradas nas Figuras 5 e 6 respec-tivamente. Tabela 1.1 - Valores da área subtendida pelo segundo pico para a so-lução em pH 5 Tabela 2.1 - Valores da área subtendida pelo terceiro pico para a solu- ção em pH 5

Liberação de Bortezomibe em um ambiente ácido (tampão em pH = 5)

[00157] O profármaco ao qual a invenção refere-se ao conjugado de (Sílica (SBA-15)/ligante/Bortezomibe) como tal ou como um constituinte de um micro- ou nanossistema de liberação de fármaco (neste caso o veículo na Figura 1) é uma molécula capaz de liberar a forma ativa de Bortezomibe em pH ligeiramente ácido. O pH ligeiramente ácido é característico do ambiente intracelular, então o fármaco pode difundir-se dentro do ambiente celular se este for o primeiro compartimento de pH ligeiramente ácido que o profármaco ou o sistema do qual do qual é um constituinte que está em contato seguindo a interna- lização por endocitose após passar através do fluido sanguíneo em pH neutro. As endossomas (organelas intracelulares) são de fato caracte-rizadas por um pH ligeiramente ácido próximo ao valor de 5, então a liberação da amostra de conjugado de sílica (SBA- 15)/ligante/Bortezomibe foi avaliada em uma amostra reproduzindo o ambiente ácido de endossoma. Um tampão de ácido acético/acetato de sódio, preparado misturando 51 ml de uma solução aquosa de ácido acético a 0,2M obtido de 99% de ácido acético (Carlo Erba) e 49 ml de uma solução aquosa a 0,2M de acetato de sódio foi usado para este propósito. O último foi obtido adicionando 0,803 g de acetato de sódio [CH3COONa] (Sigma Aldrich) a 49 ml de H2O ultrapura.

[00158] A amostra injetada na coluna de cromatografia foi preparada dissolvendo 4 mg de material SBA-BORT em 15 ml de solução tampão em um pH próximo ao valor de 5 e agitada em uma temperatura de 37°C para fornecer a melhor reprodução das co ndições fisiológicas do ambiente intracelular.

[00159] A Tabela 3.1 mostra as concentrações de Bortezomibe en-contradas por HPLC na solução de tampão em pH 5, as áreas relativas dos picos considerados e as quantidades expressas em gramas em diferentes intervalos de tempo.

[00160] A Figura 7 mostra um cromatograma de HPLC durante os testes de liberação realizados em fluido corporal simulado em pH 5.

[00161] As concentrações do fármaco em diferentes intervalos de tempo foram obtidas dividindo o valor de cada área subtendida pelo correspondente pico pelo valor do gradiente (y) da linha de calibração.

[00162] Em particular as concentrações encontradas durante as primeiras 2,5 horas derivam-se exclusivamente das áreas subtendidas pelo segundo pico, por que o terceiro só foi detectável a partir da terceira hora em diante. Ambos os picos foram, entretanto, considerados em tempos subsequentes a fim de obter a quantidade final de fármaco a partir da soma das concentrações correspondentes a todas as áreas individuais.

[00163] Como pode ser observado a partir dos valores mostrados na Tabela 3.1, as concentrações do fármaco tendem a aumentar pro-gressivamente ao longo do tempo até aproximadamente a oitava hora, e então vir valores aproximadamente constantes.

Liberação de Bortezomibe em um ambiente neutro (tampão em pH = 7)

[00164] A fim de demonstrar a estabilidade do sistema dentro de um ambiente de pH neutro, tal como o fluxo sanguíneo, testes de liberação foram realizados na amostra de SBA-BORT em um meio tam- ponado em pH 7 em uma temperatura de 37°C simulando o fluxo sanguíneo.

[00165] Um tampão de KH2PO4 / NaOH (fosfato de di-hidrogênio de potássio / hidróxido de sódio) foi usado para este propósito, preparado dissolvendo 6,81 g de di-hidrogenofosfato de potássio em 291 ml de hidróxido de sódio a 0,10M. Tabela 3.1 - Dados relativos à liberação de SBA-BORT em pH = 5 como uma função de tempo.

[00166] Subsequentemente 4 mg de amostra de SBA-BORT foram dispersos em 15 ml da solução tampão. A mistura foi deixada em agi-tação por todo o período de duração dos testes de liberação em uma temperatura de 37°C.

[00167] As amostras acima mencionadas foram tiradas a cada 30 minutos para análise de HPLC. A Figura 8 mostra o cromatograma de Bortezomibe em uma concentração de 50 ppm em fluido corporal si-mulado em pH 7.

[00168] Os valores obtidos a partir da análise de soluções de Borte- zomibe em diferentes concentrações são mostrados na Tabela 4.1 com relação ao pico identificado pelo número 1. A linha de calibração obtida é mostrada na Figura 9. Tabela 4.1 - Valores da área subtendida pelo pico para a solução em pH 7

[00169] Será observado a partir dos dois cromatogramas mostrados na Figura 10 e Figura 11 que o pico identificado pelo número 1 na Figura 8 é quase ausente mesmo após 9 horas de suspensão no fluido em pH 7.

[00170] Em particular, nenhuma perda de fármaco a partir do sistema de conjugado de Sílica (SBA-15)/ligante/Bortezomibe que pôde ser detectada por HPLC foi observada durante aproximadamente as primeiras quatro horas.

[00171] A Tabela 5.1 mostra dados indicativos da liberação de Bor- tezomibe em pH 7 como uma função de tempo.

[00172] A quantidade de Bortezomibe liberada a partir do sistema de conjugado de Sílica (SBA-15)/ligante/Bortezomibe após ter permanecido na solução tamponada durante 9 horas foi aproximadamente 50 vezes menor do que aquela detectada na solução tamponada em pH 5 durante o mesmo período.

[00173] A Figura 12 mostra o progresso da liberação de Bortezomi- be em dois diferentes valores de pH: em tampão em pH 5 e pH 7 como uma função de tempo.

[00174] A partir dos dados de liberação, como demonstrado pela Figura 12.1, pode-se concluir que o sistema é extremamente estável dentro da solução que imita o ambiente do plasma sanguíneo. Enquanto o sistema SBA-BORT permaneceu em solução durante até três horas, a técnica usada não detectou qualquer presença do fármaco, após o que permaneceu amplamente ancorada à matriz de sílica me- soporosa.

[00175] A evidência experimental relativa à liberação de Bortezomi- be em um ambiente ácido mostra que concentrações significantes do fármaco estão presentes em solução mesmo após o sistema SBA- BORT ter estado em residência por curtos períodos, confirmando a labilidade da ligação do tipo de diéster borônico em pH ligeiramente ácido. Tabela 5.1 - Dados relativos à liberação de SBA-BORT em pH = 7 como uma função de tempo

Experimentos de vitalidade celular

[00176] Os experimentos sobre vitalidade celular foram, portanto, realizados em sistemas compreendendo uma matriz com base em óxidos inorgânicos tendo uma porosidade regular e controlada caracterizada pelo fato de que o ácido fólico foi seletivamente acoplado à matriz como a substância responsável para alvejamento e reconhecimento da molécula e um profármaco de Bortezomibe foi ancorado nos po- ros.

[00177] Para este propósito nanopartículas de sílica mesoporosa (MSNs, também referida como SBA acima) foram funcionalizadas com ácido fólico (desse modo produzindo partículas referidas como MSN- FOL) ou com ácido fólico e Bortezomibe (o último sendo referido como: MSN-FOL/GPS-BTZ) representando o mais "completo" produto de acordo com a invenção, isto é, o micro- ou nanossistema de liberação de fármaco. Neste caso particular, que foi aquele testado, o ligante foi o grupo funcional de glicidoxipropila (GPS).

[00178] Experimentos de atualização e vitalidade celular foram realizados. A toxicidade potencial das nanopartículas foi determinada pelos experimentos de vitalidade celular que mostraram que elas não são tóxicas até uma concentração de 3 μg/105 células (resultados não re-portados), e, portanto, continuamos com esta relação de MSNs/número de células em experimentos subsequentes.

[00179] Observações realizadas usando um microscópio eletrônico (TEM) revelaram que o MSN-FOL conseguiu penetrar as células HeLa expressando altos níveis de FR mesmo após incubação de 1 hora, sendo principalmente estando principalmente localizado em formações de endossoma dentro do citoplasma (Figura 13).

[00180] A fim de determinar se as nanopartículas podem constituir um instrumento confiável em terapia direcionada, o MSN-FOL foi conjugado com o Bortezomibe usando um sistema sensível ao pH (MSN- FOL/GPS-BTZ). Estas partículas foram então construídas em uma tentativa de obter um dispositivo antitumor que usaria o ácido fólico como um ligante específico do receptor exclusivamente para reconhecimento das células positivas de FR, e uma vez que a endocitose de receptor mediada pelos MSNs ocorreu em um sistema sensível ao pH capaz de liberar o fármaco apenas no ambiente ácido das cavidades endolisos- sômicas.

[00181] A toxicidade/eficácia de MSN-FOL/GPS-BTZ foi avaliada pelos experimentos de vitalidade celular usando o teste de exclusão de azul Tripano (veja Materiais e Métodos). Uma interrupção óbvia do crescimento foi observada após apenas 1 dia em células HeLa (FR- positivo) tratadas com MSN-FOL/GPS-BTZ, em comparação com o controle. O efeito citostático foi então transmutado em um efeito citotó- xico no segundo e acima de todo o terceiro dia de tratamento (Figura 14A). Na confirmação do fato de que a toxicidade foi exclusivamente devido à presença de BTZ, os intermediários de síntese MSN-FOL e MSN-FOL/GPS usados como um outro controle negativo não revelou nenhum efeito sobre a proliferação celular em qualquer dos tempos considerados (Figura 14A).

[00182] Ao contrário, células de carcinoma de mama MCF-7 e células renais embriônicas normais HEK293, ambas as cepas negativas de FR, não mostraram nenhuma inibição de crescimento seguindo o tratamento com MSN-FOL/GPS-BTZ em relação ao controle ou amostras tratadas com MSN-FOL e MSN-FOL/GPS (Figuras 14B e 14C) (Morelli C, Maris P, Sisci D, Perrotta E, Brunelli E, Perrotta I, Panno ML, Taga- relli A, Versace C, Casula MF, Testa F, Ando S, Nagy JB, Pasqua L. Nanopartículas de sílica mesoporosa padronizada por PEG exclusiva-mente células cancerígenas alvo. Nanoscale. Agosto de 2011; 3(8):3198-207).

[00183] Os dados obtidos mostram que nossas nanopartículas de sílica mesoporosa são um potencial veículo no campo para a liberação controlada de fármacos, por que elas podem ser seletivamente reco-nhecidas e internalizadas apenas por células de tumor expressando FR e não por células negativas de FR (por exemplo, a maioria das células normais). Isto permitirá o fármaco ser liberado dentro dos lisos- somas (pH 4 - 5) e agirá apenas dentro das células alvo, com uma redução dramática consequente nos efeitos colaterais, devido a sua dis- tribuição sistêmica não seletiva.

Materiais e Métodos Cepas celulares e condições de cultura

[00184] Células de adenocarcinoma cervical uterino humanas HeLa (American Type Culture Collection, ATCC, USA) e células renais em-briônicas normais HEK293 foram cultivadas em Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS); células de carcinoma de mama humana MCF-7 (Interlab Cell Line Collection, ICLC, Genoa, Itália) foram propagadas em DMEM:F12 contendo 5% de FBS.

[00185] 100 IU ml-1 de penicilina, 100 μg ml-1 de estreptomicina e 0,2 mM de L-glutamina foram adicionados a ambos os meios de cultura. Os meios e os reagentes foram adquiros de Gibco® (Thermo Fisher Scientific Inc.).

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM)

[00186] As células foram semeadas em placas de Petri de cultura celular de 60 mm de diâmetro e incubadas a 37°C com MSN-FOL. Após 1 hora de incubação as células foram lavadas e coletadas em Salina Tampão de Fosfato (PBS, Invitrogen, Itália) e centrifugadas a 14.000 rpm. O pélete resultante foi em seguida imediatamente fixado em PBS com 3% de glutaraldeído (pH 7,4) durante 2 horas, em seguida transferida para dentro de solução de tetróxido de ósmio a 3% durante mais 2 horas, desidratada em um gradiente de acetona e finalmente embutida em Araldite (Fluka, Buchs, Suíça). Seções de Ultrathin foram obtidas usando um microtomo, estratificadas em uma grade de cobre de mesh 300, contrastada com citrato de chumbo e acetato de uranila e em seguida observadas usando um microscópio eletrônico "Zeiss EM 900".

Experimentos de vitalidade celular

[00187] O efeito de MSNs conjugado com Bortezomibe (BTZ) sobre a proliferação celular foi avaliado usando o método de exclusão azul Tripano, um agente de manchamento capaz de penetrar através das membranas de células danificadas ou mortas (que são excluídas da contagem), porém que não atravessam a membrana de células intactas (que são em vez disso contadas). As células, em um estágio de crescimento exponencial, foram então inoculadas em meio de cultura em multicamadas de 12 cavidades, em uma quantidade de 105 célu- las/cavidade, e deixadas desenvolver durante a noite. No dia seguinte, as células foram sincronizadas em meio sem soro (SFM) a fim de obter uma população celular que estava no mesmo estágio no ciclo, desse modo evitando diferenças em crescimento entre as células. Após 24 horas, 3 μg / 105 células MSN-FOL, MSN-FOL/GPS e MSN- FOL/GPS-BTZ foram adicionados às células durante 1 hora; o meio foi então substituído por um meio frasco ao qual 5% de FBS foram adicionados e as células foram colhidas após 1, 2 ou 3 dias por tripsiniza- ção e incubadas em uma solução a 0,5% de azul Tripano em temperatura ambiente durante 10 minutos. A vitalidade celular foi determinada microscopicamente contando as células que não tomaram a mancha (células vitais) usando um citômetro sanguíneo (Burker, Brand, Alemanha).

Claims (18)

1. Derivado caracterizado pelo fato de que apresenta a fór-mula geral (II) em que: Y e Z representam, independentemente um do outro, -NH, - O-, -S- e A é com: R1, R2, R3, sendo selecionados independentemente um do outro de CH3, C2H5, OCH3, OC2H5, OC3H7, OC4H9, OC5H11; X é uma ligação simples ou S, O, NH; n e m são números inteiros positivos de modo que n = 0 - 5 e m = 0 - 3 com n + m > 1.

2. Derivado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtenível reagindo o Bortezomibe de fórmula geral (I): com um ligante bidentado de fórmula geral (III) em que: R1, R2, R3, X, n e m têm os significados indicados de acordo com a reivindicação 1, e R4 é selecionado de NH2, SH, epóxido, halogênio, CN, tio- cianato, -CH=CH2; que reage formando um derivado de boro cíclico na extre-midade do ligante transportando R4.

3. Derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o ligante de bidentato de fórmula (III) é selecionado de: 3-glicidoxipropil-trimetóxi-silano; 3- aminopropiltrietoxissilano; 3-aminopropiltrimetoxissilano; 4-aminobutil- dimetilmetoxissilano; 3-(2-aminoetilamino)propil-trimetoxissilano (N-[3- (trimetoxissilil)propil]etilenodiamina); 3-[2-(2-aminoetilamino)etilamino]-propiltrimetoxissilano; N1-(3-trimetoxissililpropil)dietilenotriamina; 3-(2-aminoetilamino)propil-metildimetoxissilano; 3-mercaptopropiltrimetoxissilano; 3-glicidoxipropildimetoximetilsilano; 3-glicidoxipropildimetiletoxissilano; 3-glicidoxipropiltrimetoxissilano; aliltrietoxissilano; aliltrimetoxissilano; 3-cianopropiltrietoxis- silano; clorometil(metil)dimetoxissilano; clorometiltrimetoxissilano; clo- rometiltrietoxissilano; (3-cloropropil)dimetoximetilsilano; (3-cloropropil)- trimetoxissilano; 3-tiocianatopropiltrietoxissilano; 3-tiocianatopropiltri- metoxissilano.

4. Derivado de acordo com qualquer uma da das reivindica-ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que ele é quimicamente estável em pH neutro, enquanto ele se decompõe com uma liberação de Bor- tezomibe em pH levemente ácido entre 4,0 e 5,5, preferivelmente 4,5 - 5,0.

5. Derivado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é para uso no campo farmacêutico como um fármaco antitumoral.

6. Sistema de liberação de fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende o derivado de fórmula (II) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ancorado a uma matriz inorgânica porosa de dimensões micro- ou nanométricas.

7. Sistema de acordo com a reivindicação anterior, caracte-rizado pelo fato de que a matriz inorgânica compreende óxidos inorgâ-nicos tal como sílica mesoporosa.

8. Sistema de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracte-rizado pelo fato de que os poros de dimensões nanométricas são poros tendo uma porosidade controlada obtida pelo método de impressão ou pelo uso de um tensoativo.

9. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que a matriz inorgânica compreende uma ou mais moléculas selecionadas de substâncias responsáveis pela liberação de reconhecimento molecular e moléculas agindo como marcadores.

10. Sistema de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a substância responsável por liberação de reconhe-cimento molecular é selecionada de ácido fólico, biotina, peptídeos, anticorpos, glicosídeos, carboidratos, proteínas.

11. Sistema de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o marcador é um marcador fluorescente, em particular fluoresceína e rodamina.

12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o derivado ou Sistema como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, juntamente com um veículo farmaceu- ticamente aceitável.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação anterior, caracterizada pelo fato de que o derivado ou sistema é formulado em combinação com outros ingredientes ativos ou profár- macos.

14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração por meio de via nasal, bucal, oral, intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperiotoneal, endovenosa, intratecal, intracraniano, parenteral ou intraperitoneal.

15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que é formulada como uma formulação injetável, por exemplo, solução ou dispersão aquosa estéril, como um pó estéril para a preparação de dispersões extemporâneas.

16. Kit, caracterizado pelo fato de compreender o derivado, sistema ou composição como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 15, preparado em doses predeterminadas para administração exclusiva ou simultânea, sequencial ou retardada de outros ingredientes ativos ou profármacos tais como, por exemplo, fármacos antitumor, material de gene, radionuclídeos, marcadores fluorescentes.

17. Uso do derivado, do sistema ou do kit de como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que na preparação de uma composição farmacêutica e/ou um medi-camento para tratamento, melhora da condição clínica e alívio dos efeitos colaterais em indivíduos que sofrem de formas de tumores, em particular carcinomas, mieloma múltiplo, linfomas tal como linfoma de célula manto, tumores da próstata, mama, pulmões, rins e ovário, mais particularmente carcinomas dos ovários, rins, cérebro, pulmões e mamas.

18. Uso de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que as condições clínicas e os efeitos colaterais são mudanças morfológicas em fibras nervosas periféricas, neuropatias periféricas, parestesia distal e dor neuropática tendo uma distribuição de "luva e meia".