CN111253578A - 叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物及其制备方法和用途 - Google Patents

叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物及其制备方法和用途 Download PDF

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CN111253578A CN202010093618.2A CN202010093618A CN111253578A CN 111253578 A CN111253578 A CN 111253578A CN 202010093618 A CN202010093618 A CN 202010093618A CN 111253578 A CN111253578 A CN 111253578A
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Abstract

本发明涉及一种叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇‑聚(ε‑己内酯)嵌段共聚物及其制备方法和用途。所述嵌段共聚物可作为纳米递送系统在体内水平输送小分子疏水化疗药物。所述桥联嵌段聚合物可主动靶向肿瘤组织，促进肿瘤细胞摄取；且在肿瘤细胞内谷胱甘肽刺激下发生特异性降解，从而改变纳米颗粒结构，提高胞内药物释放速度，增强肿瘤细胞杀伤功能。

Description

叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物 及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及纳米药物递送系统领域，特别涉及靶向桥联修饰的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物的药物递送系统领域。
背景技术
纳米药物递送系统具有独特的尺寸，可以提高药物的体内稳定性，避免药物在血液中被快速清除；此外，纳米药物递送系统可以借助肿瘤血管的增强通透性和滞留效应(Enhanced Permeability and Retention effect,EPR effect)改变药物的体内分布、被动地增强药物病灶富集、降低给药剂量和毒副作用。由于在肿瘤治疗中体现出的巨大潜力，纳米药物递送系统长期以来一直是研究领域的热点，尤其是以两亲性嵌段聚合物为基础的药物辅料及其制剂，部分已经被批准进入临床取得了巨大经济效益。这些两亲性嵌段聚合物往往拥有较好的生物可降解性和体内相容性，以聚乙二醇-聚乳酸、聚乙二醇-聚乙醇酸和聚乙二醇-聚己内酯为主。
随着基础领域的深入研究，纳米药物递送系统在静脉给药后的命运被逐渐揭示，在历经血液循环、肿瘤富集等环节后，肿瘤细胞摄取和细胞内药物释放是载体在体内完成的最后工作。只有将药物分子输送至肿瘤细胞后，再将其以原药形式释放到细胞核等作用区域，才能最终进行肿瘤细胞杀伤。然而，传统的纳米药物递送系统并未很好地解决这两个问题。在设计之初，传统纳米药物希望具有“血液隐匿性”和“血液稳定性”，降低血液中的清除和不必要的药物释放；但这样的设计使得其进入肿瘤组织后，同样不被肿瘤细胞摄取且难于在肿瘤细胞内释放药物。因此，药物释放瓶颈制约着纳米药物递送系统的性能，也限制了两亲性聚合物作为纳米药物递送系统的药物输送性能，制约其转化和应用。
靶向递送系统是近年来药物递送系统的研究热点。由于肿瘤细胞与正常组织细胞相比，其表面往往会高表达独特的受体蛋白，如叶酸受体、Her2受体等，设计针对受体蛋白靶向的递送系统，提高其识别肿瘤细胞的能力，有助于改善肿瘤细胞对递送系统的摄取行为。例如，叶酸可靶向肿瘤细胞表面的叶酸受体，以其为基础发展了一系列的纳米药物，可将不同结构的化疗药物进行靶向递送，提高胞内药物浓度。前列腺特异性膜抗原(PSMA)在大多数前列腺癌病灶中高表达，不仅可用于前列腺癌诊断，更可设计纳米药物递送系统，表面修饰PSMA适配体的纳米递送系统BIND-014，已进入临床实验。现有结果表明，BIND-014治疗未接受过化疗的转移性去势抵抗前列腺癌患者有效且耐受性良好。
由于肿瘤细胞代谢生长旺盛，细胞内存在明显而复杂的微环境，基于这些特殊的理化条件，研究人员设计了“桥联”的两亲性嵌段聚合物，这类高分子在亲水疏水组分之间设计了响应性化学键，典型的如二硫键、双硒键或腙键等。在肿瘤细胞内，响应性化学键会被特殊的微环境(如弱酸性环境、氧化还原条件)破坏降解，使亲疏水组分解离。随后，纳米递送系统的物理结构被改变，从而促进内核药物释放。例如，钟志远教授研究组利用高分子囊泡中的酸敏感缩醛键降解，使聚合物亲水性增强，导致囊泡解体迅速释放药物，提高了蛋白或小分子药物的给药效率。陈学思研究员课题组制备了聚乙二醇键合药胶束，桥联酰胺键可以在肿瘤细胞内酸性环境(pH～5.5)下降解并迅速释放阿霉素原药，对肝癌HepG2细胞的杀伤显著改善。这些研究证明，肿瘤细胞内存在的独特微环境，可调控基于“桥联”聚合物组装的纳米递送系统的性能，改善药物释放瓶颈。
实体瘤细胞内部存在氧化应激现象，为了保持氧化还原动态平衡，也会高表达还原型谷胱甘肽。研究结果显示，肿瘤细胞内的谷胱甘肽浓度约为10mM。然而，常见的氧化还原响应桥联化学键，如二硫键、二硒键，对这一浓度GSH的响应性不足，使得纳米递送系统的响应性不高。在元素周期表中，同主族元素的化学性质存在部分相似性，研究表明，二碲键的键能仅为149kJ/mol，远低于二硫键(240kJ/mol)和二硒键(192kJ/mol)，更易与谷胱甘肽发生反应。
发明内容
本发明的目的旨在提供一类同时具有叶酸修饰和二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物及其制备方法和用途。作为小分子化疗药物输送载体，该共聚物不仅能在肿瘤富集后特异性识别肿瘤细胞，改善药物分布；还可以在细胞内更易受氧化还原条件刺激，加速药物释放，进而最终提高药物治疗效果。
本发明的技术方案：
一种叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物，其结构如通式(I)如下：
Figure BDA0002384534730000031
其中，A1选自CgHh，g、h为整数，1≤g≤20，2≤h≤42；A2选自CiHj，i、j为整数，1≤i≤20，2≤j≤42；PEG表示聚乙二醇残基，x1为聚(ε-己内酯)的聚合度，为整数。
其中，优选A1为碳原子数2-12的亚烷基；
优选A2为碳原子数2-12的亚烷基。
优选17≤x1≤176；更优选43≤x1≤132。
其中所述聚乙二醇残基以如下通式表示：
Figure BDA0002384534730000032
其中，x2为整数，1≤x2≤500。
本发明提供的叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物的制备方法：
将端基含二碲键和叶酸基团的聚乙二醇衍生物与具有羧基端基的聚(ε-己内酯)在0-40℃下良溶剂中进行大分子偶联反应，所用催化剂体系为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，二者摩尔比例为1.0-5.0:1，催化剂与聚乙二醇衍生物摩尔比例为1.0-5.0:1，沉淀纯化后既得叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物；
其中优选在无水条件下进行高分子偶联反应；
优选在催化剂存在下进行反应；
优选催化剂是二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶；优选良溶剂是二氯甲烷；
优选反应在25℃下进行；
优选反应时间是24h；
优选所得粗产物经过纯化处理，例如沉淀处理。
本发明提供的叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物可以用于制备药物载体。以及使用该药物载体制备载药纳米颗粒。
其中优选所述药物载体的制备方法是将叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物在与水互溶的有机相中溶解，缓慢滴加至过量的水中，从而制备纳米颗粒；同时，如在有机相中加入疏水性药物，可以完成对药物的包载，得到载药纳米颗粒。
优选所述有机相为二甲基亚砜、四氢呋喃或乙腈；
优选所述疏水性药物为紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、全反式维甲酸或羟基喜树碱中的一种或多种。
本发明提供的药物载体以及载药纳米颗粒可以用于抗肿瘤治疗中。
本发明的优点及有益效果：
本发明选取的嵌段聚合物组分具有高度生物相容性，合成方法简便可控、产物纯化过程易操作、利于重复，具有较高可行性。在嵌段聚合物组装为纳米药物载体后，其同时具有肿瘤细胞靶向性和肿瘤细胞胞内谷胱甘肽响应性，可在系统给药过程中，主动识别肿瘤细胞，特异性地在肿瘤细胞内降解，加速释放药物，改善肿瘤治疗效果。
附图说明
图1.本发明的实施例1中，叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物的化学结构及合成路线。
图2.本发明的实施例1中，凝胶渗透色谱表征叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物。
图3.本发明的实施例1中，核磁共振氢谱对叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物(聚乙二醇分子量5000)进行表征，溶剂为氘代氯仿。
图4.本发明的实施例1中，核磁共振氢谱对不同分子量的叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物进行表征，溶剂为氘代氯仿。
图5.本发明的实施例3中，NPDOX(A)、F-NPDOX(B)和F-TeNPDOX(C)在不同条件下DOX的累计释放行为。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。
图6.本发明的实施例4中，流式细胞仪检测NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX在4T1细胞系(A)或NIH-3T3细胞系(B)的摄取行为。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。
图7.本发明的实施例4中，高效液相色谱定量分析不同条件下NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX在4T1细胞系(A)或NIH-3T3细胞系(B)的摄取行为。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。细胞内蛋白总量通过BCA法检测，药物摄取经蛋白总量归一化。
图8.本发明的实施例5中，激光共聚焦显微镜观察NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX在4T1细胞系的摄取及药物释放行为。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。
图9.本发明的实施例6中，MTT法检测检测NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX携载DOX对4T1细胞活力的影响。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。通过函数t-test计算显著性差异，*p<0.05。
图10.本发明的实施例7中，NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX在Blab/c小鼠体内的血液循环情况。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。
图11.本发明的实施例8中，流式细胞仪分析给药后GFP+4T1细胞对NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX的摄取行为。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。
图12.本发明的实施例9中，不同处理组对4T1原位肿瘤模型的抑制。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例2所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。通过函数t-test计算显著性差异，*p<0.05。
图13.本发明的实施例9中，不同处理组对4T1原位肿瘤模型治疗结束后，肿瘤组织的质量。NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX制备方法如实施例3所述，组分为mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50。
具体实施方式
实施例中的缩写含义如下：
(1)mPEG，聚乙二醇单甲醚
(2)PEG，聚乙二醇残基
(3)ε-CL，ε-己内酯
(4)PCL，聚(ε-己内酯)
(5)DOX，阿霉素
(6)4-二甲氨基吡啶，DMAP
(7)二环己基碳二亚胺，DCC
实施例中原料来源及处理方法：
(1)FA-PEG-COOH，分子量2000，5000，10000，20000，上海景宇生物技术有限公司，使用前经甲苯共沸蒸馏除水；
(2)FA-PEG-b-PCL，聚乙二醇分子量5000，聚(ε-己内酯)分子量5240，西安瑞禧生物科技有限公司；
(3)DOX，武汉大华伟业医药化工有限公司；
(4)ε-CL，日本大赛璐化学工业株式会社；
(5)异辛酸亚锡，国药集团化学试剂有限公司；
(6)4-二甲氨基吡啶，国药集团化学试剂有限公司；
(7)丁二酸酐，国药集团化学试剂有限公司；
(8)异丙醇铝，国药集团化学试剂有限公司；
(9)噻唑兰，Sigma-Aldrich公司；
(10)甲苯，液相色谱级，韩国森山公司，经威格公司溶剂纯化装置处理；
(11)4T1细胞，ATCC公司；
(12)NIH-3T3细胞，ATCC公司；
(13)Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)完全培养基，Invitrogen公司；
(14)Balb/c小鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司；
(15)Balb/c nude小鼠，北京华阜康生物科技股份有限公司；
(16)未经特别说明的其它试剂，均为可从常规化学试剂公司商购获得的分析纯级别的试剂，直接使用；
(17)聚乙二醇-聚ε-己内酯(mPEG-b-PCL)具体合成过程如下：
将聚乙二醇单甲醚(mPEG113，6.0g，1.2mmol)和ε-CL(7.8g，68.4mmol)在加入到干燥的圆底烧瓶中，转入手套箱(水含量小于0.1ppm)，130°将二者加热至搅拌熔融状态，滴加催化剂异辛酸亚锡(36.6mg，0.09mmol)，反应持续120min。体系温度降至25℃后，用无水二氯甲烷溶解粗产物，浓缩后，沉淀至冷的无水乙醚/甲醇(8/2，v/v)混合溶液中。减压抽滤，收集固体，真空干燥至恒重，即得到mPEG-b-PCL嵌段聚合物。
对该聚合物进行核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱分析，ε-己内酯聚合度为52，聚合物分子量分布为1.09，记为mPEG113-b-PCL52。
(18)聚ε-己内酯(PCL)，参考文献(Polymer,2009,50,5048-5054)合成和表征，具体过程如下：
称取ε-CL(2.24g，19.6mmol)，加入约30mL干燥甲苯，搅拌5min后，加入170μL含0.376mmol Al(OiPr)3的甲苯溶液，室温反应60min，加入340μL醋酸以终止反应。反应结束后，旋蒸浓缩体系，0℃用甲醇沉淀，减压抽滤，固体粉末真空干燥至恒重，即得到聚己内酯均聚物。
对该聚合物进行核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱分析，己内酯聚合度为50，分子量分布为1.06，记为PCL50。
(19)端基为羧基的聚ε-己内酯(PCL-COOH)，具体合成过程如下：
称取PCL50(1.37g，0.24mmol)，加入约15mL干燥二氯甲烷，搅拌5min后，加入4-二甲氨基吡啶(54.9mg，0.45mmol)和丁二酸酐(45mg，0.45mmol)，室温反应24h。反应结束后，旋蒸浓缩体系，0℃用甲醇沉淀，减压抽滤，固体粉末真空干燥至恒重，即得到PCL50-COOH。
对该聚合物进行核磁共振氢谱分析，丁二酸酐修饰效率高于96.4％。
(20)二(1-羟基伦癸基)二碲化物(DHDL)，具体合成过程如下：
将碲粉(1.25g，10.0mmol)溶解在溶有硼氢化钠(0.84g，10mmol)的四氢呋喃/水溶液中(20mL:0.2mL，v:v)，室温搅拌。约1h后，剧烈反应消退，再补充碲粉(1.25g，10.0mmol)一次。反应混合物在室温继续反应4h，在蒸汽浴中加热直至碲粉完全溶解，得到紫色Na2Te2溶液。将Na2Te2溶液转移至100mL圆底烧瓶，N2保护下加入溶解在20mL无水四氢呋喃中的11-溴环烷醇(5.02g，20mmol)。在50℃下继续反应12h后，二氯甲烷萃取，无水Na2SO4干燥有机相，乙酸乙酯重结晶得到砖红色粉末，产率45.7％。
(21)端基含二碲键和叶酸基团的聚乙二醇衍生物的合成
在25℃下，按表1的配比将FA-PEG-COOH在无水二氯甲烷中完全溶解。
将DHDL、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶在无水二氯甲烷中溶解，缓慢滴加至前述FA-PEG-COOH溶液中。反应24h后，过滤除去副产物，在冷的无水乙醚中沉淀三次，真空干燥固体至恒重，得到端基含二碲键和叶酸基团的聚乙二醇衍生物，命名为FA-PEG-TeTe-OH。
表1不同投料比(质量比)合成端基含二碲键和叶酸基团的聚乙二醇衍生物
Figure BDA0002384534730000081
实施例1：叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物的合成
叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物的化学结构及合成路线如附图1所示。
具有不同分子量的叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物是以端基含二碲键和叶酸基团的聚乙二醇衍生物与端基为羧基的聚(ε-己内酯)偶联而成。合成的具体实验步骤如下：
在25℃下，按表2的配比将FA-PEG-TeTe-OH、PCL-COOH、二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶在无水二氯甲烷中完全溶解，反应24h。反应结束后，过滤除去副产物，在冷的无水乙醚/甲醇混合溶剂(10/1,v/v)中沉淀三次，真空干燥固体至恒重，得到叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物，命名为FA-PEG-TeTe-PCL。
表2不同投料比(质量比)合成叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物(DCC与DMAP的摩尔比例为1:1)
Figure BDA0002384534730000082
用凝胶渗透色谱(GPC)法以聚苯乙烯为标准分析FA-PEG-TeTe-PCL的数均分子量和分子量分布宽度指数(PDI)，GPC谱见图5。
由图2可见，嵌段聚合物的GPC谱均为单峰，个别产物存在拖尾现象即含有未完全反应的均聚物，这与大分子偶联反应存在位阻效应和催化剂性能有关。
对上述叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚ε-己内酯嵌段聚合物进行1H NMR分析，1HNMR谱见图3。
图3中，FA-PEG-TeTe-PCL的1H NMR图谱字母a到f记了归属于两嵌段聚合物的质子氢。大分子的偶联反应效率通过1.58ppm的多重峰(归属于聚(ε-己内酯)的-CH2-)与3.66ppm的单峰(归属于聚乙二醇的-OCH2CH2-)的积分面积比计算得到，反应效率高于92％。
由图4可见不同分子量的FA-PEG-TeTe-OH与PCL-COOH键合后产物的1H NMR图谱，其各个质子信号峰均与图3相似，证明了该方法可以合成对不同分子量的叶酸修饰二碲键桥联聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物。
实施例2：纳米颗粒制备
两亲性聚乙二醇-聚(ε-己内酯)，基于水溶液中的疏水-疏水相互作用，可以在特定条件下通过优化制备手段在水中得到“核-壳”状胶束结构纳米颗粒。在其疏水内核中，可以对疏水性药物分子进行包载，得到纳米药物递送系统。本实施例采用纳米沉淀方法制备以下纳米颗粒。
1)制备空载的纳米颗粒，以FA-PEG113-TeTe-PCL50为例，具体方法为：将质量为10mg的FA-PEG113-TeTe-PCL50溶解在200μL的DMSO中，将上述油相缓慢滴加至5mL搅拌的超纯水中，滴加完成后继续搅拌30min，转移至截留分子量为3500的透析袋中，使用超纯水透析24h，3000rpm离心除去可能存在的沉淀物，得到空载纳米颗粒。
2)制备载药的纳米颗粒，以FA-PEG113-TeTe-PCL50为例，具体方法为：将质量为10mg的FA-PEG113-TeTe-PCL50以及1mg的阿霉素(DOX)溶解在200μL的DMSO中，将上述油相缓慢滴加至5mL搅拌的超纯水中，滴加完成后继续避光搅拌30min，转移至截留分子量为3500的透析袋中，使用超纯水透析24h，3000rpm离心除去未包裹的游离DOX。
实施例3：二碲键桥联靶向纳米递送系统在不同条件下的DOX释放测定
本实施例选取mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，分别命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。将纳米颗粒溶液分别用pH 7.40且含有谷胱甘肽的缓冲溶液稀释至2mL(10mg/mL)，转移至截留分子量3500的透析管中，浸入15mL缓冲溶液中，37℃、60rpm下摇床处理。在不同时间间隔，取100μL透析袋外缓冲溶液，高效液相色谱检测溶液中DOX含量，结果见图5。
由图5所示，对于不含二碲键的NPDOX、F-NPDOX而言，不论加入或不加入谷胱甘肽，其DOX释放行为基本一致，在72h后，药物累计释放量大约为20％。而对于二碲键桥联的F-TeNPDOX实验组，在加入谷胱甘肽后，药物释放速度明显提升，72h的药物累计释放量超过70％。这一结果表明，模拟肿瘤细胞内环境的谷胱甘肽会刺激二碲键降解，使纳米颗粒崩解，从而加速药物释放，有利于肿瘤细胞杀伤。
实施例4：二碲键桥联靶向纳米递送系统特异性增强叶酸高表达肿瘤细胞的细胞摄取
在本实施例中，分别通过流式细胞术和高效液相色谱(HPLC)检测细胞对于包载DOX的纳米递送细胞的摄取情况。本实施例以mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，制备方法如实施例2所述，颗粒命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。
采用流式细胞仪半定量检测细胞对纳米颗粒的摄取情况。使用24孔板，在细胞板中分别种入4T1细胞或NIH-3T3细胞，细胞密度为5×104/孔，转入CO2培养箱中过夜。弃去培养基，向各孔中分别加入含有NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX的新鲜培养基溶液，在37℃、5％CO2条件下培养4h。培养结束后，胰酶消化细胞并用PBS离心洗涤两遍，用流式细胞分析仪(Becton Dickinson)进行分析，结果如图6。如图6所示，对于NPDOX，由于没有靶向基团修饰，其在MDA-MB-231和NIH-3T3细胞中的摄取行为大致相仿，细胞内荧光强度接近；而对于F-NPDOX和F-TeNPDOX，其更倾向于被细胞表面高表达叶酸受体的4T1细胞摄取，在NIH-3T3细胞系中，二者的胞内荧光强度与NPDOX没有显著性差异，可以认为在纳米递送系统修饰叶酸靶向基团后，特异性地增强了叶酸高表达肿瘤细胞对于靶向纳米递送系统的摄取。
使用高效液相色谱定量分析细胞对靶向纳米递送系统的摄取情况。在6孔板中种入2×105个4T1细胞或NIH-3T3细胞，补充含有10％FBS的DMEM培养基，转入培养箱中过夜。弃去培养基，向各孔中分别加入含有NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX的新鲜培养基溶液，在37℃、5％CO2条件下培养4h。培养结束后，PBS洗涤细胞两遍后裂解细胞，使用HPLC定量分析细胞内的DOX含量，使用BCA法检测细胞内蛋白的总含量，将DOX含量与蛋白含量进行归一化处理，其结果如图7。由图7可见，对于NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX而言，其在4T1和NIH-3T3细胞的摄取行为，与流式细胞仪分析结果趋势十分接近，F-NPDOX和F-TeNPDOX会特异性增强叶酸受体高表达4T1细胞内DOX的含量，约为3.5μg/mg蛋白。值得注意的是，在培养基中加入游离叶酸，会使这种DOX含量增强减弱，DOX的摄取恢复到与非靶向NPDOX接近的水平，这一结果表明靶向纳米递送系统确实是通过叶酸受体介导的内吞作用增强4T1肿瘤细胞摄取。
实施例5：二碲键桥联靶向纳米递送系统在细胞内的药物释放
在本实施例中，使用激光共聚焦显微镜观察细胞对于包载DOX的纳米递送细胞的摄取情况。本实施例以mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，制备方法如实施例2所述，颗粒命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。
使用激光共聚焦显微镜观察纳米递送系统在细胞内的药物释放情况。使用24孔板，放入细胞爬片后种入4T1细胞，细胞密度为2×104/孔，转入CO2培养箱中过夜。弃去培养基，向各孔中分别加入含有NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX的新鲜培养基溶液，在37℃、5％CO2条件下培养4h。实验结束后，用4％多聚甲醛固定细胞，0.1％Triton X-100穿膜后加入AlexaFluor 488标记细胞骨架，DAPI染色细胞核，使用激光共聚焦显微镜(蔡司LSM 810)进行观察，其结果如图8。由图8可见，F-NPDOX和F-TeNPDOX组细胞内的红色DOX荧光信号明显强于NPDOX组，与实施例X结果吻合。此外，二碲键在细胞内的断裂会加速DOX释放，由于DOX的作用机制是与细胞核内的DNA大沟区结合，细胞内的游离DOX会迅速转移至细胞核，在F-TeNPDOX实验组，细胞核内出现大量红色荧光信号。
实施例6：二碲键桥联靶向纳米递送系统对乳腺癌细胞增殖的抑制
在本实施例中，使用MTT法检测检测纳米递送系统携载DOX与4T1细胞共培养后，细胞活力的变化，研究纳米递送系统对细胞增殖的影响。本实施例以mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，制备方法如实施例2所述，颗粒命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。
将4T1细胞接种于96孔板，每孔细胞密度为5×103/孔，加入100μL含有10％FBS的DMEM培养基后，转入细胞培养箱中过夜。弃去原有培养基，向细胞培养板各孔中分别加入含有NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX的新鲜培养基溶液，在37℃、5％CO2条件下培养12h，再弃去培养基，更换不含药物或纳米递送系统的新鲜培养基，继续培养60h。总计培养72h后，向各孔中加入浓度为5mg/mL的噻唑兰(25μL)，37℃处理2h；再加入100μL细胞裂解液，37℃处理4h，酶标仪检测570nm处各孔吸光度，分析结果见图9。由图9可见，当DOX浓度小于1μg/mL时，三组纳米递送系统均不存在细胞毒性；随着DOX的浓度逐渐增大，细胞毒性逐渐显现。由于细胞摄取量较大，可将更多DOX输送至肿瘤细胞，F-NPDOX的细胞杀伤能力强于NPDOX；由于二碲键的引入，输送至肿瘤细胞内的DOX可被快速释放用于细胞杀伤，F-TeNPDOX对MDA-MB-231细胞的生长抑制能力最强。
实施例7：纳米递送系统在体内的循环情况
在本实施例中，通过高效液相色谱(HPLC)检测纳米递送系统的血液循环和清除情况，研究二碲键桥联的靶向聚合物组装得到的递送系统与非二碲键桥联的靶向聚合物以及非二碲键桥联非靶向聚合物组装形成的递送系统的血液循环性能。由于DOX本身具有荧光性质，我们通过对血液中DOX进行定量分析来确定纳米递送系统在血液中的含量。本实施例以mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，制备方法如实施例2所述，颗粒命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。
本实施例在Balb/c小鼠体内进行，尾静脉单次注射DOX、NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX，DOX的给药剂量为10mg/kg。在注射后特定时间间隔摘除小鼠眼球以取血，采集的血液在加入抗凝剂后经10000rpm离心10min收集血浆。血浆中的DOX含量经过萃取和HPLC检测来分析，结果见图10。如图所示，F-NPDOX和F-TeNPDOX在血液中的清除情况大致相似，不存在显著性差异；而NPDOX的血液循环性能更好，说明在血液循环过程中，颗粒表面的聚乙二醇壳层能够保护纳米颗粒，赋予纳米颗粒“血液隐匿性”，延缓血液清除。同时，靶向叶酸基团的引入会对轻微影响颗粒循环性能，二碲键的引入不会加速颗粒在血液中的清除。
实施例8：二碲键桥联靶向纳米递送系统在活体肿瘤细胞内的富集情况
在本实施例中，通过流式细胞仪检测纳米递送系统在肿瘤细胞内的富集情况，研究二碲键桥联的靶向聚合物组装得到的递送系统与非二碲键桥联的靶向聚合物以及非二碲键桥联非靶向聚合物组装形成的递送系统的肿瘤细胞摄取性能。由于DOX本身具有荧光性质，我们通过对肿瘤细胞内的DOX含量进行半定量分析来确定纳米递送系统在肿瘤细胞中的含量。本实施例以mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，制备方法如实施例2所述，颗粒命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。
本实施例在荷瘤免疫缺陷裸鼠上进行，模型建立方法如下：使用还有10％FBS的DMEM培养基培养4T1/GFP细胞，在建模前6小时改用无血清培养基处理细胞。建模时，0.25％胰酶消化细胞1min，吹打收集细胞，经150g离心收集细胞，再用无血清培养基重悬细胞，调整密度至3×107cells/mL。将100μL细胞悬液注射在裸鼠右侧第二个乳腺中，在SPF级动物房中饲养裸鼠约1周，可见肿瘤形成。当肿瘤体积达到200mm3后开始实验，尾静脉单次注射DOX、NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX，DOX的给药剂量为10mg/kg。在注射后特定时间间隔处死小鼠，解剖肿瘤组织并用胶原酶I在37℃下分散，离心过滤得到细胞悬浮液。通过分选级流式分析GFP高表达的4T1细胞中的DOX含量，结果见图11。如图所示，与游离DOX相比，NPDOX在各个时间点都可以更好地富集于肿瘤细胞内，说明NPDOX可借助EPR效应被动富集于肿瘤，被肿瘤细胞摄取。尽管如实施例7所述，靶向基团的引入会使F-NPDOX和F-TeNPDOX的血液循环性能有一定下降，但叶酸基团可以增强纳米递送系统对肿瘤细胞的识别和摄取能力，最终提高纳米递送系统在肿瘤细胞中的含量，从而将更多的化疗药物输送至肿瘤细胞。
实施例9：二碲键桥联靶向纳米递送系统携载化疗药物对乳腺癌生长的抑制
在本实施例中，基于免疫缺陷裸鼠，建立4T1乳腺癌原位肿瘤模型，进行乳腺癌生长抑制试验。模型建立使用4T1细胞，方法如实施例8所述，肿瘤的体积计算公式为：V＝0.5*x*y*y，其中x是指肿瘤较长的直径，y是指肿瘤较短的直径。在肿瘤体积达到约50mm3时开始治疗，本实施例以mPEG113-b-PCL52、FA-PEG113-b-PCL46和FA-PEG113-TeTe-PCL50制备载药纳米颗粒，制备方法如实施例2所述，颗粒命名为NPDOX、F-NPDOX以及F-TeNPDOX。将荷瘤裸鼠随机分为5组，每组裸鼠数量为5只，每组分别注射PBS溶液、DOX、NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX，其中DOX、NPDOX、F-NPDOX和F-TeNPDOX均溶解于体积为200μL的PBS溶液中，DOX的给药剂量为5mg/kg。在第0、7、14和21天共进行四次静脉给药，在0、3、6、9、12、15、18、21、24和27天测量肿瘤的长短直径，计算肿瘤体积。图12为肿瘤体积在治疗周期内的变化情况，如图所示，DOX和NPDOX的治疗对肿瘤生长仅有部分抑制效果，相比于无法被动富集于肿瘤组织的NPDOX，F-NPDOX由于提高了肿瘤富集，改善了药物疗效；而二碲键的引入，使得DOX可在肿瘤细胞内快速释放，F-TeNPDOX对MDA-MB-231肿瘤抑制效果最强。图13为治疗结束后解剖得到的肿瘤组织重量，其结果趋势与图12类似，使用F-TeNPDOX治疗后，肿瘤的质量最小。
尽管出于说明和描述的目的在此给出本发明，但并非意在穷举或限制。许多修改和变化对本领域技术人员来说将是显而易见的。为了解释原则和实际应用而选择和描述所述技术方案，并且使本领域技术人员理解具有各种修改的本发明不同的实施方案适合于预期的具体用途。

Claims (6)

1.一种叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物，其结构如通式(I)所示：
Figure FDA0002384534720000011
其中，A1选自CgHh，g、h为整数，1≤g≤20，2≤h≤42；A2选自CiHj，i、j为整数，1≤i≤20，2≤j≤42；PEG表示聚乙二醇残基，x1为聚(ε-己内酯)的聚合度。
2.根据权利要求1中所述的叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物，其特征在于，所述聚乙二醇残基以如下通式表示：
Figure FDA0002384534720000012
其中，x2为整数，1≤x2≤500。
3.根据权利要求1所述的叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物，其特征在于，所述聚(ε-己内酯)的聚合度x1为整数，17≤x1≤176；更优选43≤x1≤132。
4.一种权利要求1-3中任意一项所述的叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物的制备方法，包括：
将端基含二碲键和叶酸基团的聚乙二醇衍生物与具有羧基端基的聚(ε-己内酯)在0-40℃下良溶剂中进行大分子偶联反应，所用催化剂体系为二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶，二者摩尔比例为1.0-5.0:1，催化剂与聚乙二醇衍生物摩尔比例为1.0-5.0:1，沉淀纯化后既得叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物。
5.一种由权利要求1-3任意一项所述叶酸修饰二碲键桥联的聚乙二醇-聚(ε-己内酯)嵌段共聚物制备的药物载体。
6.一种由权利要求5所述药物载体制备的载药纳米颗粒。
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