BR112017016638B1

BR112017016638B1 - Agente de ligação do gene de ativação de linfócitos-3, uso do mesmo e composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112017016638B1
Application number: BR112017016638-0A
Authority: BR
Inventors: Helen Toni Jun; Marilyn Kehry; Peter Bowers; David J. King
Original assignee: Anaptysbio, Inc
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2023-11-07
Also published as: IL253718B; US20180127496A1; EP3253798A2; HK1246814A1; HK1247618A1; MX2017009904A; EP4011914A1; MA41463A; EA201791742A1; SG11201706199RA; WO2016126858A3; CA2975753A1; WO2016126858A2; NZ734880A; SG10201907161YA; JP2018505674A; US20210095026A1; CN107428836A; ZA201705303B; IL253718A0

Abstract

anticorpos direcionados contra o gene de ativação de linfócitos 3 (lag-3). a invenção está relacionada a um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina e a um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que se ligam a uma proteína codificada pelo gene de ativação de linfócitos-3 (lag-3). a invenção fornece um agente de ligação de lag-3 que compreende o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina e o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina mencionados anteriormente. a invenção também fornece vetores relacionados, composições e métodos de utilização do agente de ligação de lag-3 para tratar um distúrbio ou doença que é responsiva à inibição de lag-3, por exemplo, câncer ou uma doença infecciosa.

Description

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL SUBMETIDO ELETRONICAMENTE

[001] É incorporada por referência em sua totalidade nesse relatório descritivo uma listagem de sequências de nucleotídeos/aminoácidos legível por computador submetida concomitantemente com esse pedido e identificada da seguinte forma: Um arquivo ASCII de 182.600 Byte (Texto) denominado “723163_ST25.TXT”, criado em 2 de fevereiro de 2016.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] O gene de ativação de linfócitos-3 (LAG-3), também conhecido como CD223, é um membro da família do supergene de imunoglobulina e está estruturalmente e geneticamente relacionado a CD4. LAG-3 é expresso em células T, células B, células natural killer (NK) e células dendríticas plasmacitóides (pDCs). Como CD4, foi demonstrado que LAG-3 interage com moléculas de MHC Classe II (Baixeras e cols., J. Exp. Med., 176: 327-337 (1992)), mas se liga em um sítio distinto (Huard e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94 (11): 5744-5749 (1997)). Em particular, por exemplo, uma proteína de fusão de imunoglobulina LAG-3 (sLAG-3Ig) que se liga diretamente e especificamente por meio de LAG-3 às MHC Classe II na superfície celular (Huard e cols., Eur. J. Immunol., 26: 1180-1186 (1996)).

[003] LAG-3 é supra-regulado após ativação de célula T, e modula a função de células T, bem como sua homeostasia (Sierro e cols., Expert Opin. Ther. Targets, 15 (1): 91-101 (2011)). A interação LAG-3/MHC Classe II pode participar da infra-regulação da estimulação antígeno-dependente de linfócitos T CD4+, como demonstrado em estudos in vitro de respostas de célula T antígeno-específicas nas quais a adição de anticorpos anti-LAG-3 levou à proliferação aumentada de células T, maior expressão de antígenos de ativação como, por exemplo, CD25, e concentrações maiores de citocinas como, por exemplo, interferon-gama e interleucina-4 (Huard e cols., Eur. J. Immunol., 24: 3216-3221 (1994)). Também foi demonstrado que células T reguladoras CD4+CD25+ (Treg) expressam LAG-3 mediante ativação, e anticorpos para LAG-3 inibem a supressão por células Treg induzidas, tanto in vitro quanto in vivo, sugerindo que LAG-3 contribui para a atividade supressora de células Treg (Huang e cols. Immunity, 21: 503-513 (2004)). Além disso, foi demonstrado que LAG-3 regula negativamente a homeostasia de célula T por células T reguladoras em mecanismos tanto célula T-dependentes quanto T-independentes (Workman, C.J. e Vignali, D.A., J. Immunol., 174: 688-695 (2005)).

[004] Subconjuntos de células T convencionais que são anérgicas ou exibem funções defeituosas expressam LAG-3, e células T LAG-3+ estão enriquecidas em locais tumorais e durante infecções virais crônicas. No entanto, embora tenha sido demonstrado que camundongos com knockout de LAG-3 montam respostas de célula T CD4+ e CD8+ vírus-específicas normais, sugerindo um papel não essencial para LAG-3, o bloqueio da via de PD-1/PD-L1, combinado com bloqueio de LAG-3 aumentou o controle viral, comparado com o bloqueio de PD-L1 isoladamente (Blackburn e cols., Nat. Immunol., 10: 29-37 (2009); e Richter e cols., Int. Immunol., 22: 13-2 (2010)).

[005] Em um modelo em camundongo de autotolerância a tumores no qual células T CD8+ transgênicas foram tornadas não responsivas/anérgicas in vivo, o bloqueio de LAG-3 ou a deficiência em células T CD8+ aumentou a proliferação de células T, o recrutamento e funções efetoras de células T no local tumoral (Grosso e cols., J. Clin. Invest., 117: 338392 (2007)).

[006] A inibição da atividade de LAG-3, por exemplo, por meio do uso de anticorpos monoclonais, está atualmente sob investigação como uma abordagem terapêutica para tratar infecções virais e melanoma com base em estudos pré-clínicos. Por exemplo, a adição de huLAG-3 solúvel fundida a uma região Fc aumentou a proliferação de células T antígeno-específicas para antígenos virais e tumorais, como por exemplo, proteína da matriz de influenza ou antígeno de melanoma reconhecido por células T (MART-1), em PBMCs de pacientes saudáveis ou com câncer (Casati e cols., J. Immunol., 180: 3782-3788 (2008)).

[007] Há uma necessidade por antagonistas de LAG-3 adicionais (por exemplo, um anticorpo) que se liga à LAG-3 com alta afinidade e eficazmente neutraliza a atividade de LAG-3. A invenção fornece esses agentes de ligação de LAG- 3.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Xaa1 Ile Xaa2 Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Xaa3 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa4 Gly Trp Ile Asp Xaa5 Xaa6 Asn Xaa7 Asp Ser Xaa8 Tyr Xaa9 Ser Lys Phe Xaa10 Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Xaa11 Thr Ala Tyr Met Xaa12 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser (ID. DE SEQ. N°: 181), em que (a) Xaal é asparagina (Asn) ou serina (Ser), (b) Xaa2 é lisina (Lys), tirosina (Tyr) ou asparagina (Asn), (c) Xaa3 é lisina (Lys) ou glutamina (Gln), (d) Xaa4 é isoleucina (Ile) ou metionina (Met), (e) Xaa5 é alanina (Ala) ou prolina (Pro), (f) Xaa6 é ácido glutâmico (Glu) ou metionina (Met), (g) Xaa6 é glicina (Gly), asparagina (Asn) ou ácido aspártico (Asp), (h) Xaa8 é ácido glutâmico (Glu) ou glutamina (Q), (i) Xaa9 é alanina (Ala) ou serina (Ser), (j) Xaa10 é glutamina (Gln) ou arginina (Arg), (k) Xaa11 é ácido aspártico (Asp) ou asparagina (Asn), e (l) Xaa12 é glutamina (Gln) ou lisina (Lys).

[009] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Xaa1 Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Xaa2 Cys Xaa3 Val Tyr Gly Gly Xaa4 Phe Xaa5 Gly Tyr Tyr Trp Xaa6 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Xaa7 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Xaa8 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa9 Ser Leu Lys Leu Xaa10 Xaa11 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa12 Arg Glu Gly Xaa13 Tyr Gly Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (ID. DE SEQ. N°: 35), em que (a) Xaa1 é arginina (Arg) ou glicina (Gly), (b) Xaa2 é treonina (Thr) ou isoleucina (Ile), (c) Xaa3 é treonina (Thr) ou alanina (Ala), (d) Xaa4 é serina (Ser) ou fenilalanina (Phe), (e) Xaa5 é serina (Ser) ou fenilalanina (Phe), (f) Xaa6 é serina (Ser) ou isoleucina (Ile), (g) Xaa7 é glicina (Gly) ou arginina (Arg), (h) Xaa8 é serina (Ser) ou asparagina (Asn), (i) Xaa9 é fenilalanina (Phe) ou leucina (Leu), (j) Xaa10 é asparagina (Asn) ou serina (Ser), (k) Xaa11 é serina (Ser) ou fenilalanina (Phe), (l) Xaa12 é alanina (Ala) ou valina (Val), e (m) Xaa13 é ácido aspártico (Asp) ou asparagina (Asn).

[0010] A invenção ainda fornece um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende o ID. DE SEQ. N°: 190 ou 191.

[0011] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos Asp Xaa1 Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Xaa2 Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Xaa3 Xaa4 Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Xaa Gln Ser Thr Xaa Val Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr (ID. DE SEQ. N°: 57), em que (a) Xaal é valina (Val) ou isoleucina (Ile), (b) Xaa2 é cisteína (Cys) ou serina (Ser), (c) Xaa3 é glicina (Gly) ou serina (Ser), (d) Xaa4 é asparagina (Asn) ou ácido aspártico (Asp), (e) Xaa5 é lisina (Lys), glicina (Gly), asparagina (Asn), serina (Ser) ou leucina (Leu), (f) Xaa6 é valina (Val) ou isoleucina (Ile), (g) Xaa7 é serina (Ser), alanina (Ala) ou glicina (Gly), e (h) Xaa8 é histidina (His) ou tirosina (Tyr).

[0012] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Xaa6 Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val (ID. DE SEQ. N°: 89), em que (a) a subsequência Xaal Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é deletada ou é Tyr-Asp-Ala-Ser-Asn, e (b) Xaa6 é treonina (Thr) ou isoleucina (Ile).

[0013] A invenção também fornece um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende o ID. DE SEQ. N°: 196 ou 197.

[0014] Além disso, a invenção fornece sequências de ácidos nucléicos isoladas ou purificadas que codificam os polipeptídeos de imunoglobulina citados anteriormente, vetores que compreendem essas sequências de ácidos nucléicos, agentes de ligação de LAG-3 que compreendem os polipeptídeos de imunoglobulina citados anteriormente, sequências de ácidos nucléicos que codificam esses agentes de ligação de LAG-3, vetores que compreendem essas sequências de ácidos nucléicos, células isoladas que compreendem esses vetores, composições que compreendem esses agentes de ligação de LAG-3 ou esses vetores com um carreador farmaceuticamente aceitável, e métodos de tratamento de câncer ou doenças infecciosas em mamíferos por administração de quantidades eficazes dessas composições a mamíferos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0015] A Figura 1A é um gráfico do volume tumoral médio ao longo do tempo em camundongos implantados com células de adenocarcinoma do cólon Colon26 e injetados com os anticorpos indicados. Cada traçado de dados na figura se refere ao grupo de tratamento indicado.

[0016] A Figura 1B é um gráfico do volume tumoral ao longo do tempo de animais individuais em três grupos de tratamento de camundongos implantados com células de adenocarcinoma do cólon Colon26 e injetados com os anticorpos indicados. Cada traçado de dados nos gráficos se refere a um animal individual no grupo de tratamento.

[0017] A Figura 2A retrata a secreção de IL-2 por células T CD4+ em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) em concentrações variáveis de anticorpos anti-PD-1 ou anti-LAG- 3.

[0018] A Figura 2B retrata a expressão de LAG-3 e de PD- 1 em células T CD4+ antes (naive) ou subsequente à exposição (24, 48 e 72 horas) às células dendríticas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0019] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina e/ou um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina, ou um fragmento (por exemplo, fragmento de ligação ao antígeno) deste. O termo “imunoglobulina” ou “anticorpo”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma proteína que é encontrada no sangue ou em outros fluidos corpóreos de vertebrados, que é usada pelo sistema imune para identificar e neutralizar objetos estranhos, como por exemplo, bactérias e vírus. O polipeptídeo é “isolado” na medida em que está removido de seu ambiente natural. Em uma modalidade preferida, uma imunoglobulina ou anticorpo é uma proteína que compreende pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR). As CDRs formam a “região hipervariável” de um anticorpo, que é responsável pela ligação ao antígeno (discutido com mais detalhe abaixo). Uma imunoglobulina inteira tipicamente consiste em quatro polipeptídeos: duas cópias idênticas de um polipeptídeo da cadeia pesada (H) e duas cópias idênticas de um polipeptídeo da cadeia leve (L). Cada uma das cadeias pesadas contém uma região variável (VH) do terminal N e três regiões constantes (CH1, CH2 e CH3) do terminal C, e cada cadeia leve contém uma região variável (VL) do terminal N e uma região constante (CL) do terminal C. As cadeias leves de anticorpos podem ser divididas em um de dois tipos distintos, kappa (K) ou lambda (À) , com base nas sequências de aminoácidos de seus domínios constantes. Em uma imunoglobulina típica, cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por ligações dissulfeto, e as duas cadeias pesadas estão ligadas entre elas por ligações dissulfeto. A região variável da cadeia leve está alinhada com a região variável da cadeia pesada, e a região constante da cadeia leve está alinhada com a primeira região constante da cadeia pesada. As regiões constantes das cadeias pesadas restantes estão alinhadas entre elas.

[0020] As regiões variáveis de cada par de cadeias leves e pesadas formam o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo. As regiões VH e VL possuem a mesma estrutura geral, com cada região compreendendo quatro regiões framework (FW ou FR). O termo “região framework”, como usado nesse relatório descritivo, se refere às sequências de aminoácidos relativamente conservadas dentro da região variável que estão localizadas entre as regiões hipervariáveis ou determinantes de complementaridade (CDRs). Há quatro regiões framework em cada domínio variável, que são designadas FR1, FR2, FR3 e FR4. As regiões framework formam as lâminas β que fornecem o arcabouço estrutural da região variável (veja, por exemplo, C.A. Janeway e cols. (eds.), Immunobiology, 5a Edição, Garland Publishing, Nova York, NY (2001)).

[0021] As regiões framework são conectadas por três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Como discutido acima, as três CDRs, conhecidas como CDR1, CDR2 e CDR3, formam a “região hipervariável” de um anticorpo, que é responsável pela ligação ao antígeno. As CDRs formam alças que conectam e, em alguns casos, que compreendem parte da estrutura de lâmina beta formada pelas regiões framework. Embora as regiões constantes das cadeias leves e pesadas não estejam envolvidas diretamente na ligação do anticorpo a um antígeno, as regiões constantes podem influenciar a orientação das regiões variáveis. As regiões constantes também exibem várias funções efetoras, como por exemplo, participação na lise anticorpo-dependente mediada por complemento ou toxicidade celular anticorpo-dependente por meio de interações com moléculas e células efetores.

[0022] O polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina e o polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina da invenção desejavelmente se ligam à proteína codificada pelo gene de ativação de linfócitos-3 (LAG-3) (também denominada nesse relatório descritivo como “proteína de LAG-3”). Como discutido acima, LAG-3 é uma proteína de 498 aminoácidos que regula negativamente a função e homeostasia de células T (Triebel e cols., J. Exp. Med., 171 (5): 1393-1405 (1990); e Triebel F., Trends Immunol., 24 (12): 619-22 (2003)). LAG-3 é um membro da família do supergene de imunoglobulina e está estruturalmente e geneticamente relacionada a CD4. Foi demonstrado que a região intracitoplasmática de LAG-3 interage com uma proteína denominada LAP, que supostamente é uma molécula de transdução de sinal envolvida na infra-regulação da via de ativação de CD3/TCR (Iouzalen e cols., Eur. J. Immunol., 31: 2885-2891 (2001)). Além disso, foi demonstrado que as células T reguladoras CD4+CD25+ (Treg) expressam LAG-3 mediante ativação, e anticorpos para LAG-3 inibem a supressão por células Treg induzidas, tanto in vitro quanto in vivo, sugerindo que LAG-3 contribui para a atividade supressora de células Treg (Huang e cols., Immunity, 21: 503-513 (2004)). No entanto, um estudo recente sugere que a expressão de LAG- 3 em células T CD4+ as torna mais suscetíveis à supressão por Tregs, ao invés de torná-las mais supressivas (veja Durham e cols., PLoS ONE, 9(11): e109080 (2014)). Em certas circunstâncias, também foi demonstrado que LAG-3 possui efeitos imunoestimuladores (veja, por exemplo, Prigent e cols., Eur. J. Immunol., 29: 3867-3876 (1999)); El Mir e Triebel, J. Immunol., 164: 5583-5589 (2000)); e Casati e cols., Cancer Res., 66: 4450-4460 (2006)). O polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção e o polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina da invenção podem formar um agente que se liga à LAG-3 e a outro antígeno, resultando em um agente de ligação “duplo-reativo” (por exemplo, um anticorpo duplo-reativo). Por exemplo, o agente pode se ligar à LAG-3 e a outro regulador negativo do sistema imune como, por exemplo, proteína de morte programada 1 (PD-1) e/ou proteína do domínio de imunoglobulina de célula T e do domínio de mucina 3 (TIM-3).

[0023] Anticorpos que se ligam à LAG-3, e componentes destes, são conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos 2010/0233183, 2011/0150892 e 2014/0093511). Anticorpos anti-LAG-3 também estão disponíveis comercialmente de fontes como, por exemplo, Abcam (Cambridge, MA) e R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN).

[0024] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Xaa1 Ile Xaa2 Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Xaa3 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa4 Gly Trp Ile Asp Xaa5 Xaa6 Asn Xaa7 Asp Ser Xaa8 Tyr Xaa9 Ser Lys Phe Xaa10 Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Xaa11 Thr Ala Tyr Met Xaa12 Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser (ID. DE SEQ. N°: 181), em que (a) Xaal é asparagina (Asn) ou serina (Ser), (b) Xaa2 é lisina (Lys), tirosina (Tyr) ou asparagina (Asn), (c) Xaa3 é lisina (Lys) ou glutamina (Gln), (d) Xaa4 é isoleucina (Ile) ou metionina (Met), (e) Xaa5 é alanina (Ala) ou prolina (Pro), (f) Xaa6 é ácido glutâmico (Glu) ou metionina (Met), (g) Xaa6 é glicina (Gly), asparagina (Asn) ou ácido aspártico (Asp), (h) Xaa8 é ácido glutâmico (Glu) ou glutamina (Q), (i) Xaa9 é alanina (Ala) ou serina (Ser), (j) Xaa10 é glutamina (Gln) ou arginina (Arg), (k) Xaa11 é ácido aspártico (Asp) ou asparagina (Asn), e (l) Xaa12 é glutamina (Gln) ou lisina (Lys).

[0025] Em outro aspecto, o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina compreende, consiste, ou consiste essencialmente, na sequência de aminoácidos Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Xaa1 Ile Xaa2 Asp Asp Tyr Ile His Trp Val Xaa3 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa4 Gly Trp Ile Asp Xaa5 Glu Asn Xaa6 Asp Ser Glu Tyr Xaa7 Ser Lys Phe Xaa8 Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Thr Xaa9 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Tyr Ala Phe Gly Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser (ID. DE SEQ. N°: 1), em que (a) Xaa1 é asparagina (Asn) ou serina (Ser), (b) Xaa2 é lisina (Lys), tirosina (Tyr) ou asparagina (Asn), (c) Xaa3 é lisina (Lys) ou glutamina (Gln), (d) Xaa4 é isoleucina (Ile) ou metionina (Met), (e) Xaa5 é alanina (Ala) ou prolina (Pro), (f) Xaa6 é glicina (Gly), asparagina (Asn) ou ácido aspártico (Asp), (g) Xaa7 é alanina (Ala) ou serina (Ser), (h) Xaa8 é glutamina (Gln) ou arginina (Arg), e (i) Xaa9 é ácido aspártico (Asp) ou asparagina (Asn).

[0026] Em uma modalidade, o polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina compreende, consiste, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 2, ID. DE SEQ. N°: 3, ID. DE SEQ. Nº: 4, ID. DE SEQ. Nº: 5, ID. DE SEQ. Nº: 6, ID. DE SEQ. Nº: 7, ID. DE SEQ. Nº: 8, ID. DE SEQ. Nº: 9, ID. DE SEQ. Nº: 10, ID. DE SEQ. Nº: 11, ID. DE SEQ. Nº: 12, ID. DE SEQ. Nº: 13, ID. DE SEQ. Nº: 14, ID. DE SEQ. Nº: 15, ID. DE SEQ. Nº: 16, ID. DE SEQ. Nº: 17, ID. DE SEQ. Nº: 18, ID. DE SEQ. Nº: 19, ID. DE SEQ. Nº: 20, ID. DE SEQ. Nº: 21, ID. DE SEQ. Nº: 22, ID. DE SEQ. Nº: 23, ID. DE SEQ. Nº: 24, ID. DE SEQ. Nº: 25, ID. DE SEQ. Nº: 26, ID. DE SEQ. Nº: 27, ID. DE SEQ. Nº: 28, ID. DE SEQ. Nº: 29, ID. DE SEQ. Nº: 30, ID. DE SEQ. Nº: 31, ID. DE SEQ. Nº: 32, ID. DE SEQ. Nº: 33, ID. DE SEQ. Nº: 34, ID. DE SEQ. Nº: 182, ID. DE SEQ. Nº: 183, ID. DE SEQ. Nº: 184, ID. DE SEQ. Nº: 185 ou ID. DE SEQ. Nº: 186.

[0027] A invenção também fornece um polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende, consiste, ou consiste essencialmente, na sequência de aminoácidos Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Xaa1 Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Xaa2 Cys Xaa3 Val Tyr Gly Gly Xaa4 Phe Xaa5 Gly Tyr Tyr Trp Xaa6 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Xaa7 Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Xaa8 Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Xaa9 Ser Leu Lys Leu Xaa10 Xaa11 Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa12 Arg Glu Gly Xaa13 Tyr Gly Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (ID. DE SEQ. N°: 35), em que (a) Xaa1 é arginina (Arg) ou glicina (Gly), (b) Xaa2 é treonina (Thr) ou isoleucina (Ile), (c) Xaa3 é treonina (Thr) ou alanina (Ala), (d) Xaa4 é serina (Ser) ou fenilalanina (Phe), (e) Xaa5 é serina (Ser) ou fenilalanina (Phe), (f) Xaa6 é serina (Ser) ou isoleucina (Ile), (g) Xaa7 é glicina (Gly) ou arginina (Arg), (h) Xaa8 é serina (Ser) ou asparagina (Asn), (i) Xaa9 é fenilalanina (Phe) ou leucina (Leu), (j) Xaa10 é asparagina (Asn) ou serina (Ser), (k) Xaa11 é serina (Ser) ou fenilalanina (Phe), (l) Xaa12 é alanina (Ala) ou valina (Val), e (m) Xaa13 é ácido aspártico (Asp) ou asparagina (Asn).

[0028] Em uma modalidade, o polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina compreende, consiste, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 36, ID. DE SEQ. N°: 37, ID. DE SEQ. Nº: 38, ID. DE SEQ. Nº: 39, ID. DE SEQ. Nº: 40, ID. DE SEQ. Nº: 41, ID. DE SEQ. Nº: 42, ID. DE SEQ. Nº: 43, ID. DE SEQ. Nº: 44, ID. DE SEQ. Nº: 45, ID. DE SEQ. Nº: 46, ID. DE SEQ. Nº: 47, ID. DE SEQ. Nº: 48, ID. DE SEQ. Nº: 49, ID. DE SEQ. Nº: 50, ID. DE SEQ. Nº: 51, ID. DE SEQ. Nº: 52, ID. DE SEQ. Nº: 53, ID. DE SEQ. Nº: 54, ID. DE SEQ. Nº: 55 ou ID. DE SEQ. Nº: 56.

[0029] Em outra modalidade, é fornecido um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende o ID. DE SEQ. N°: 190 ou 191. Exemplos de um polipeptídeo desse tipo incluem aqueles que compreendem qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 192-195.

[0030] Quando o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 1-ID. DE SEQ. N°: 56, IDS. DE SEQ. Nos: 182-186 ou IDS. DE SEQ. Nos: 190-195, componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetem materialmente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteína como, por exemplo, biotina, que facilitam a purificação ou o isolamento). Quando o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção consiste em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 1-ID. DE SEQ. N°: 56, o polipeptídeo não compreende nenhum componente adicional (ou seja, componentes que não são endógenos para o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção).

[0031] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% idêntica) a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 1-56. “Identidade” de sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos, como descrita nesse relatório descritivo, pode ser determinada por comparação de uma sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de interesse com uma sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos de referência. O percentual de identidade é o número de resíduos de nucleotídeos ou de aminoácidos que são iguais (ou seja, que são idênticos) entre a sequência de interesse e a sequência de referência dividido pelo comprimento da sequência mais longa (ou seja, o comprimento da sequência de interesse ou da sequência de referência, a que for mais longa). Diversos algoritmos matemáticos para a obtenção do alinhamento ótimo e cálculo da identidade entre duas ou mais sequências são conhecidos e incorporados em diversos programas de software disponíveis. Exemplos desses programas incluem CLUSTAL-W, T-Coffee e ALIGN (para o alinhamento de sequências de ácidos nucléicos e de aminoácidos), programas BLAST (por exemplo, BLAST 2.1, BL2SEQ, e suas últimas versões) e programas FASTA (por exemplo, FASTA3x, FASTM e SSEARCH) (para pesquisas de alinhamento de sequências e similaridade de sequências). Algoritmos de alinhamento de sequências também são revelados, por exemplo, em Altschul e cols., J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin e cols., eds., “Biological Sequence Analysis: Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids”, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul e cols., Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997), e Gusfield, “Algorithms on Strings, Trees and Sequences”, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997)).

[0032] Em outra modalidade, a invenção fornece um polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina que compreende, consiste, ou consiste esselcialmente em um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende a sequência de aminoácidos Asp Xaa1 Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Xaa2 Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Xaa3 Xaa4 Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Xaa Xaa Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Xaa Gln Ser Thr Xaa Val Pro Tyr Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr (ID. DE SEQ. N°: 57), em que (a) Xaal é valina (Val) ou isoleucina (Ile), (b) Xaa2 é cisteína (Cys) ou serina (Ser), (c) Xaa3 é glicina (Gly) ou serina (Ser), (d) Xaa4 é asparagina (Asn) ou ácido aspártico (Asp), (e)Xaa5 é lisina (Lys), glicina (Gly), asparagina (Asn), serina (Ser) ou leucina (Leu), (f) Xaa6 é valina (Val) ou isoleucina (Ile), (g) Xaa7 é serina (Ser), alanina (Ala) ou glicina (Gly), e (h) Xaa8 é histidina (His) ou tirosina (Tyr).

[0033] Em uma modalidade, o polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina compreende, consiste, ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 58, ID. DE SEQ. N°: 59, ID. DE SEQ. N°: 60, ID. DE SEQ. N°: 61, ID. DE SEQ. N°: 62, ID. DE SEQ. N°: 63, ID. DE SEQ. N°: 64, ID. DE SEQ. N°: 65, ID. DE SEQ. Nº: 66, ID. DE SEQ. Nº: 67, ID. DE SEQ. Nº: 68, ID. DE SEQ. Nº: 69, ID. DE SEQ. Nº: 70, ID. DE SEQ. Nº: 71, ID. DE SEQ. Nº: 72, ID. DE SEQ. Nº: 73, ID. DE SEQ. Nº: 74, ID. DE SEQ. Nº: 75, ID. DE SEQ. Nº: 76, ID. DE SEQ. Nº: 77, ID. DE SEQ. Nº: 78, ID. DE SEQ. Nº: 79, ID. DE SEQ. Nº: 80, ID. DE SEQ. Nº: 81, ID. DE SEQ. Nº: 82, ID. DE SEQ. Nº: 83, ID. DE SEQ. Nº: 84, ID. DE SEQ. Nº: 85, ID. DE SEQ. Nº: 86, ID. DE SEQ. Nº: 87, ID. DE SEQ. Nº: 88, ID. DE SEQ. Nº: 187, ID. DE SEQ. Nº: 188 ou ID. DE SEQ. Nº: 189.

[0034] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende, consiste essencialmente, ou consiste na sequência de aminoácidos Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Xaa6 Leu Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val (ID. DE SEQ. N°: 89), em que (a) a subsequência Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 é deletada ou é Tyr-Asp-Ala-Ser-Asn, e (b) Xaa6 é treonina (Thr) ou isoleucina (Ile).

[0035] O polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção pode incluir ou ser desprovido da subsequência Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 nas posições 49-53 do ID. DE SEQ. N°: 89 quando Xaa6 é treonina (Thr) ou isoleucina (Ile). Quando o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção compreende a subsequência Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5, cada um de Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4, e Xaa5 pode ser qualquer resíduo de aminoácido adequado. De preferência, Xaa1 é tirosina (Tyr), Xaa2 é ácido aspártico (Asp), Xaa3 é alanina (Ala), Xaa4 é serina (Ser) e Xaa5 é asparagina (Asn). Uma sequência de aminoácidos preferida de um polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina que inclui a subsequência Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 compreende o ID. DE SEQ. N°: 90. Quando o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina é desprovido da subsequência Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5, o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina preferivelmente compreende a sequência de aminoácidos do ID. DE SEQ. N°: 91 ou ID. DE SEQ. N°: 92.

[0036] Em outra modalidade, é fornecido um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende o ID. DE SEQ. N°: 196 ou 197. Exemplos de um polipeptídeo desse tipo incluem aqueles que compreendem qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 198-200.

[0037] Quando o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 57-ID. DE SEQ. N°: 92, IDS. DE SEQ. Nos: 187-189, ou IDS. DE SEQ. Nos: 196-200, componentes adicionais podem ser incluídos no polipeptídeo que não afetem materialmente o polipeptídeo (por exemplo, porções de proteína como, por exemplo, biotina, que facilitam a purificação ou o isolamento). Quando o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção consiste em uma sequência de aminoácidos de qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 57-ID. DE SEQ. N°: 92, o polipeptídeo não compreende nenhum componente adicional (ou seja, componentes que não são endógenos para o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção).

[0038] A invenção fornece um polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica (por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica) a qualquer um dos ID. DE SEQ. N°: 57-ID. DE SEQ. N°: 92. O termo “identidade” de sequência de ácidos nucléicos ou de aminoácidos pode ser determinada com o uso dos métodos descritos nesse relatório descritivo.

[0039] Um ou mais aminoácidos dos polipeptídeos da cadeia pesada e/ou dos polipeptídeos da cadeia leve de imunoglobulina mencionados anteriormente podem ser trocados ou substituídos com um aminoácido diferente. Uma “troca” ou “substituição” de aminoácido se refere à troca de um aminoácido em certa posição ou resíduo por outro aminoácido na mesma posição ou resíduo dentro de uma sequência de polipeptídeos.

[0040] Aminoácidos são amplamente agrupados como “aromático” ou “alifático”. Um aminoácido aromático inclui um anel aromático. Exemplos de aminoácidos “aromáticos” incluem histidina (H ou His), fenilalanina (F ou Phe), tirosina (Y ou Tyr) e triptofano (W ou Trp). Aminoácidos não aromáticos são amplamente agrupados como “alifáticos”. Exemplos de aminoácidos “alifáticos” incluem glicina (G ou Gly), alanina (A ou Ala), valina (V ou Val), leucina (L ou Leu), isoleucina (I ou Ile), metionina (M ou Met), serina (S ou Ser), treonina (T ou Thr), cisteína (C ou Cys), prolina (P ou Pro), ácido glutâmico (E ou Glu), ácido aspártico (A ou Asp), asparagina (N ou Asn), glutamina (Q ou Gln), lisina (K ou Lys) e arginina (R ou Arg).

[0041] Aminoácidos alifáticos podem ser subdivididos em quatro subgrupos. O “subgrupo alifático não polar grande” consiste em valina, leucina e isoleucina. O “subgrupo alifático ligeiramente polar” consiste em metionina, serina, treonina e cisteína. O “subgrupo alifático polar/carregado” consiste em ácido glutâmico, ácido aspártico, asparagina, glutamina, lisina e arginina. O “subgrupo de pequeno resíduo” consiste em glicina e alanina. O grupo de aminoácidos carregados/polares podem ser subdivididos em três subgrupos: o “subgrupo carregado positivamente”, que consiste em lisina e arginina, o “subgrupo carregado negativamente”, que consiste em ácido glutâmico e ácido aspártico, e o “subgrupo polar”, que consiste em asparagina e glutamina.

[0042] Aminoácidos aromáticos podem ser subdivididos em dois subgrupos: o “subgrupo de anel de nitrogênio”, que consiste em histidina e triptofano, e o “subgrupo de fenil”, que consiste em fenilalanina e tirosina.

[0043] A troca ou substituição de aminoácidos pode ser conservativa, semiconservativa ou não conservativa. A frase “substituição de aminoácido conservativa” ou “mutação conservativa” se refere à troca de um aminoácido por outro aminoácido com uma propriedade comum. Uma forma funcional de definir propriedades comuns entre aminoácidos individuais é analisar as freqüências normalizadas de alterações de aminoácidos entre proteínas correspondentes de organismos homólogos (Schulz e Schirmer, “Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, Nova York (1979)). De acordo com essas análises, grupos de aminoácidos podem ser definidos quando aminoácidos dentro de um grupo são trocados preferencialmente uns com os outros e, portanto, se parecem muito uns com os outros em relação aos seus impactos sobre a estrutura de proteína global (Schulz e Schirmer, supra).

[0044] Exemplos de substituições conservativas de aminoácidos incluem substituições de aminoácidos dentro dos subgrupos descritos acima, por exemplo, lisina para arginina e vice-versa, de modo que uma carga positiva possa ser mantida, ácido glutâmico para ácido aspártico e vice-versa, de modo que uma carga negativa possa ser mantida, serina para treonina, de modo que um -OH livre possa ser mantido, e glutamina para asparagina, de modo que um -NH2 livre possa ser mantido.

[0045] “Mutações semiconservativas” incluem substituições de aminoácidos de aminoácidos dentro dos mesmos grupos listados acima, mas não dentro do mesmo subgrupo. Por exemplo, a substituição de ácido aspártico para asparagina, ou asparagina para lisina, envolve aminoácidos dentro do mesmo grupo, mas subgrupos diferentes. “Mutações não conservativas” envolvem substituições de aminoácidos entre grupos diferentes, por exemplo, lisina para triptofano, ou fenilalanina para serina etc.

[0046] Além disso, um ou mais aminoácidos podem ser inseridos nos polipeptídeos da cadeia pesada e/ou nos polipeptídeos da cadeia leve de imunoglobulina mencionados anteriormente. Qualquer número de quaisquer aminoácidos adequados pode ser inserido na sequência de aminoácidos do polipeptídeo da cadeia pesada e/ou do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina. A esse respeito, pelo menos um aminoácido (por exemplo, 2 ou mais, 5 ou mais, ou 10 ou mais aminoácidos), mas não mais do que 20 aminoácidos (por exemplo, 18 ou menos, 15 ou menos, ou 12 ou menos aminoácidos), pode ser inserido na sequência de aminoácidos do polipeptídeo da cadeia pesada e/ou do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina. De preferência, 1-10 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos) são inseridos na sequência de aminoácidos do polipeptídeo da cadeia pesada e/ou do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina. A esse respeito, os aminoácidos podem ser inseridos em qualquer um dos polipeptídeos da cadeia pesada e/ou dos polipeptídeos da cadeia leve de imunoglobulina mencionados anteriormente em qualquer localização adequada. De preferência, os aminoácidos são inseridos em uma CDR (por exemplo, CDR1, CDR2 ou CDR3) do polipeptídeo da cadeia pesada e/ou do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina.

[0047] O polipeptídeo isolado da cadeia pesada e os polipeptídeos da cadeia leve de imunoglobulina da invenção não estão limitados aos polipeptídeos que compreendem as sequências de aminoácidos específicas descritas nesse relatório descritivo. Na verdade, o polipeptídeo da cadeia pesada ou o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina pode ser qualquer polipeptídeo da cadeia pesada ou polipeptídeo da cadeia leve que compete com o polipeptídeo da cadeia pesada ou o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção pela ligação à LAG-3. A esse respeito, por exemplo, o polipeptídeo da cadeia pesada ou o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina pode ser qualquer polipeptídeo da cadeia pesada ou polipeptídeo da cadeia leve que se liga ao mesmo epitopo de LAG-3 reconhecido pelos polipeptídeos da cadeia pesada e leve descritos nesse relatório descritivo. A competição de anticorpo pode ser testada com o uso de ensaios de competição de peptídeo de rotina que utilizam ELISA, Western blot ou métodos de imunoistoquímica (veja, por exemplo, as Patentes U.S. 4.828.981 e 8.568.992; e Braitbard e cols., Proteome Sci., 4: 12 (2006)).

[0048] A invenção fornece um agente de ligação de LAG-3 isolado que compreende, que consiste essencialmente, ou que consiste em uma ou mais das sequências de aminoácidos isoladas da invenção descritas nesse relatório descritivo. O termo “agente de ligação de LAG-3” significa uma molécula, preferivelmente uma molécula proteinácea, que se liga especificamente à proteína de LAG-3. De preferência, o agente de ligação de LAG-3 é um anticorpo ou um fragmento (por exemplo, fragmento imunogênico) deste. O agente de ligação de LAG-3 da invenção compreende, consiste essencialmente, ou consiste no polipeptídeo isolado da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção e/ou no polipeptídeo isolado da cadeia leve de imunoglobulina da invenção. Em uma modalidade, o agente de ligação de LAG-3 compreende, consiste essencialmente, ou consiste no polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção ou no polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção. Em outra modalidade, o agente de ligação de LAG-3 compreende, consiste essencialmente, ou consiste no polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção e no polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção.

[0049] Qualquer resíduo de aminoácido do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção e/ou do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção pode ser substituído, em qualquer combinação, com um resíduo de aminoácido diferente, ou pode ser deletado ou inserido, desde que a atividade biológica do agente de ligação de LAG- 3 seja aumentada ou aprimorada como resultado das trocas, inserções e/ou deleções de aminoácidos. A “atividade biológica” de um agente de ligação de LAG-3 se refere, por exemplo, à afinidade de ligação por um epitopo de LAG-3 particular, neutralização ou inibição da ligação de LAG-3 ao seu receptor (ou receptores), neutralização ou inibição da atividade de LAG-3 in vivo (por exemplo, IC50), farmacocinética e reatividade cruzada (por exemplo, com homólogos ou ortólogos não humanos da proteína de LAG-3, ou com outras proteínas ou tecidos). Outras propriedades biológicas ou características de um agente de ligação ao antígeno reconhecidas na técnica incluem, por exemplo, avidez, seletividade, solubilidade, enovelamento, imunotoxicidade, expressão e formulação. As propriedades ou características mencionadas anteriormente podem ser observadas, medidas e/ou avaliadas com o uso de técnicas padronizadas que incluem, sem limitação, ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plasmônio de superfície (BIACORE™), ou KINEXA™, ensaios de neutralização in vitro ou in vivo, ensaios de ligação de receptor-ligante, ensaios da produção e/ou secreção de citocina ou fator de crescimento e ensaios de transdução de sinal e imunoistoquímica.

[0050] Os termos “inibir” ou “neutralizar”, como usados nesse relatório descritivo com relação à atividade de um agente de ligação de LAG-3, se referem à habilidade para antagonizar, proibir, evitar, restringir, tornar mais lenta, romper, alterar, eliminar, interromper ou reverter substancialmente a progressão ou gravidade, por exemplo, da atividade biológica de LAG-3, ou de uma doença ou condição associada com LAG-3. O agente de ligação de LAG-3 isolado da invenção inibe ou neutraliza preferivelmente a atividade de LAG-3 por pelo menos cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 100%, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente.

[0051] O agente de ligação de LAG-3 isolado da invenção pode ser um anticorpo inteiro, como descrito nesse relatório descritivo, ou um fragmento de anticorpo. Os termos “fragmento de um anticorpo”, “fragmento de anticorpo” e “fragmento funcional de um anticorpo” são usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo para significar um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade para se ligar especificamente a um antígeno (veja, geralmente, Holliger e cols., Nat. Biotech., 23(9): 1126-1129 (2005)). O agente de ligação de LAG-3 isolado pode conter qualquer fragmento de anticorpo de ligação à LAG-3. O fragmento de anticorpo desejavelmente compreende, por exemplo, uma ou mais CDRs, a região variável (ou porções desta), a região constante (ou porções desta), ou combinações destas. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, sem limitação, (i) um fragmento Fab, que é um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1, (ii) um fragmento F(ab’)2, que é um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça, (iii) um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (iv) um fragmento Fab’, que resulta da quebra da ponte dissulfeto de um fragmento F(ab’)2 usando condições redutoras leves, (v) um fragmento Fv dissulfeto-estabilizado (dsFv), e (vi) um anticorpo de domínio (dAb), que é um polipeptídeo do domínio variável de região única de anticorpo (VH ou VL) que se liga especificamente ao antígeno.

[0052] Em modalidades nas quais o agente de ligação de LAG-3 isolado compreende um fragmento do polipeptídeo da cadeia pesada ou da cadeia leve de imunoglobulina, o fragmento pode ser de qualquer tamanho, desde que o fragmento se ligue e, preferivelmente, iniba, a atividade de LAG-3. A esse respeito, um fragmento do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina desejavelmente compreende entre cerca de 5 e 18 (por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente) aminoácidos. Similarmente, um fragmento do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina desejavelmente compreende entre cerca de 5 e 18 (por exemplo, cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente) aminoácidos.

[0053] Quando o agente de ligação de LAG-3 é um anticorpo ou fragmento de anticorpo, o anticorpo ou fragmento de anticorpo desejavelmente compreende uma região constante da cadeia pesada (Fc) de qualquer classe adequada. De preferência, o anticorpo ou fragmento de anticorpo compreende uma região constante da cadeia pesada que se baseia nos anticorpos IgG1, IgG2 ou IgG4 do tipo selvagem, ou variantes destes. Em algumas modalidades, o agente de ligação de LAG-3 compreende uma região Fc modificada geneticamente para reduzir ou eliminar funções efetoras do anticorpo. Regiões Fc modificadas geneticamente com função efetora reduzida ou anulada são conhecidas na técnica e disponíveis comercialmente, bem como o são técnicas para a modificação genética de regiões Fc para reduzir ou eliminar a função efetora, qualquer uma delas podendo ser usadas em conjunto com a invenção.

[0054] O agente de ligação de LAG-3 também pode ser um fragmento de anticorpo de cadeia única. Exemplos de fragmentos de anticorpo de cadeia única incluem, sem limitação, (i) um Fv de cadeia única (scFv), que é uma molécula monovalente que consiste nos dois domínios do fragmento Fv (ou seja, VL e VH) unidos por um vinculador sintético que permite que os dois domínios sejam sintetizados como uma única cadeia polipeptídica (veja, por exemplo, Bird e cols., Science, 242: 423-426 (1988); Huston e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); e Osbourn e cols., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)) e (ii) um diabody, que é um dímero de cadeias polipeptídicas, em que cada cadeia polipeptídica compreende uma VH conectada a uma VL por um peptídeo vinculador que é muito pequeno para permitir o pareamento entre a VH e a VL na mesma cadeia polipeptídica dirigindo, dessa forma, o pareamento entre os domínios complementares em diferentes cadeias polipeptídicas de VH-VL para gerar uma molécula dimérica que possui dois sítios de ligação ao antígeno funcionais. Fragmentos de anticorpo são conhecidos na técnica e são descritos em mais detalhes, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2009/0093024 A1.

[0055] O agente de ligação de LAG-3 isolado também pode ser um intrabody ou fragmento deste. Um intrabody é um anticorpo que é expresso e que funciona intracelularmente. Intrabodies tipicamente não possuem ligações dissulfeto e são capazes de modular a expressão ou atividade de genesalvo por meio de sua atividade de ligação específica. Intrabodies incluem fragmentos de domínio único como, por exemplo, domínios VH e VL isolados e scFvs. Um intrabody pode incluir sinais de tráfego subcelular anexados ao terminal N ou C do intrabody para permitir a expressão em concentrações elevadas nos compartimentos subcelulares onde uma proteína- alvo está localizada. Mediante interação com um gene-alvo, um intrabody modula a função da proteína-alvo e/ou obtém knockout fenotípico/funcional por mecanismos como, por exemplo, aceleração da degradação da proteína-alvo e sequestro da proteína-alvo em um compartimento subcelular não fisiológico. Outros mecanismos de inativação gênica mediada por intrabody podem depender do epitopo ao qual o intrabody é dirigido, por exemplo, ligação ao sítio catalítico em uma proteína-alvo ou aos epitopos que estão envolvidos em interações proteína-proteína, proteína-DNA ou proteína-RNA.

[0056] O agente de ligação de LAG-3 isolado também pode ser um conjugado de anticorpo. A esse respeito, o agente de ligação de LAG-3 isolado pode ser um conjugado de (1) um anticorpo, um arcabouço alternativo, ou fragmentos deste, e (2) uma proteína ou porção não protéica que compreende o agente de ligação de LAG-3. Por exemplo, o agente de ligação de LAG-3 pode ser todo ou parte de um anticorpo conjugado a um peptídeo, uma molécula fluorescente ou um agente quimioterápico.

[0057] O agente de ligação de LAG-3 isolado pode ser, ou pode ser obtido de, um anticorpo humano, um anticorpo não humano ou um anticorpo quimérico. O termo “quimérico” significa um anticorpo ou fragmento deste que compreende regiões tanto humanas quanto não humanas. De preferência, o agente de ligação de LAG-3 isolado é um anticorpo humanizado. Um anticorpo “humanizado” é um anticorpo monoclonal que compreende um arcabouço de anticorpo humano e pelo menos uma CDR obtida ou derivada de um anticorpo não humano. Anticorpos não humanos incluem anticorpos isolados de qualquer animal não humano como, por exemplo, um roedor (por exemplo, um camundongo ou rato). Um anticorpo humanizado pode compreender uma, duas ou três CDRs obtidas ou derivadas de um anticorpo não humano. Em uma modalidade da invenção, a CDRH3 do agente de ligação de LAG-3 da invenção é obtida ou derivada de um anticorpo monoclonal de camundongo, enquanto as regiões variáveis e região constante restantes do agente de ligação de LAG-3 da invenção são obtidas ou derivadas de um anticorpo monoclonal humano.

[0058] Um anticorpo humano, um anticorpo não humano, um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado pode ser obtido por qualquer meio, incluindo por meio de fontes in vitro (por exemplo, um hibridoma ou uma linhagem de célula que produz um anticorpo de forma recombinante) e fontes in vivo (por exemplo, roedores). Métodos para a geração de anticorpos são conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Kohler e Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow e Lane (eds.), “Antibodies: A Laboratory Manual”, CSH Press (1988); e Janeway e cols. (eds.), Immunobiology, 5a Edição, Garland Publishing, Nova York, NY (2001)). Em certas modalidades, um anticorpo humano ou um anticorpo quimérico pode ser gerado usando um animal transgênico (por exemplo, um camundongo), em que um ou mais genes de imunoglobulina endógenos são substituídos com um ou mais genes de imunoglobulina humana. Exemplos de camundongos transgênicos em que os genes de anticorpo endógenos são eficazmente substituídos com genes de anticorpo humano incluem, sem limitação, o Medarex HUMAB-MOUSE™, o Kirin TC MOUSE™ e o Kyowa Kirin KM-MOUSE™ (veja, por exemplo, Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005) e Lonberg, Handb. Exp. Pharmacol., 181: 69-97 (2008)). Um anticorpo humanizado pode ser gerado usando qualquer método adequado conhecido na técnica (veja, por exemplo, An, Z. (ed.), “Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic”, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, Nova Jersey (2009)) incluindo, por exemplo, enxertia de CDRs não humanas em um arcabouço de anticorpo humano (veja, por exemplo, Kashmiri e cols., Methods, 36(1): 25-34 (2005); e Hou e cols., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). Em uma modalidade, um anticorpo humanizado pode ser produzido com o uso dos métodos descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. 2011/0287485 A1.

[0059] Em uma modalidade, uma CDR (por exemplo, CDR1, CDR2 ou CDR3) ou uma região variável do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina e/ou do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina descritos nesse relatório descritivo pode ser transplantada (ou seja, enxertada) em outra molécula como, por exemplo, um anticorpo ou polipeptídeo não anticorpo, usando química de proteína ou tecnologia de DNA recombinante. A esse respeito, a invenção fornece um agente de ligação de LAG-3 isolado que compreende pelo menos uma CDR de um polipeptídeo da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de imunoglobulina como descrito nesse relatório descritivo. O agente de ligação de LAG-3 isolado pode compreender uma, duas ou três CDRs de uma região variável da cadeia pesada e/ou da cadeia leve de imunoglobulina, como descrito nesse relatório descritivo.

[0060] Em uma modalidade preferida, o agente de ligação de LAG-3 se liga a um epitopo de LAG-3 que bloqueia a ligação de LAG-3 às moléculas de MHC Classe II e inibe a sinalização mediada por LAG-3. Por exemplo, o agente de ligação de LAG- 3 pode se ligar a um ou mais dos quatro domínios extracelulares Ig-like (D1-D4) da proteína de LAG-3 (veja, por exemplo, Triebel e cols., J. Exp. Med., 171(5): 1393-1405 (1990); e Bruniquel e cols., Immunogenetics, 47: 96-98 (1997)). De preferência, o agente de ligação de LAG-3 se liga ao domínio 1 (D1) e/ou ao domínio (D2) da proteína de LAG-3. A invenção também fornece um epitopo de LAG-3 isolado ou purificado que bloqueia a ligação de LAG-3 às moléculas de MHC Classe II de uma forma indireta ou alostérica.

[0061] A invenção também fornece uma ou mais sequências de ácidos nucléicos isoladas ou purificadas que codificam o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção e o agente de ligação de LAG-3 da invenção.

[0062] O termo “sequência de ácidos nucléicos” visa englobar um polímero de DNA ou RNA, ou seja, um polinucleotídeo, que pode ser de fita simples ou de fita dupla e que pode conter nucleotídeos não naturais ou alterados. Os termos “ácido nucléico” e “polinucleotídeo”, como usados nesse relatório descritivo, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA). Esses termos se referem à estrutura primária da molécula e, dessa forma, incluem DNA de fita dupla e de fita simples e RNA de fita dupla e de fita simples. Os termos incluem, como equivalentes, análogos de RNA ou DNA feitos de análogos de nucleotídeos e polinucleotídeos modificados como, por exemplo, sem limitação, polinucleotídeos metilados e/ou cobertos. Ácidos nucléicos são tipicamente ligados por meio de ligações fosfato para formar sequências de ácidos nucléicos ou polinucleotídeos, embora muitas outras ligações sejam conhecidas na técnica (por exemplo, fosforotioatos, boranofosfatos e semelhantes).

[0063] A invenção ainda fornece um vetor que compreende uma ou mais sequências de ácidos nucléicos que codificam o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção e/ou o agente de ligação de LAG-3 da invenção. O vetor pode ser, por exemplo, um plasmídeo, epissomo, cosmídeo, vetor viral (por exemplo, retroviral ou adenoviral) ou fago. Vetores adequados e métodos de preparação do vetor são bem conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Sambrook e cols., “Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, 3a Edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), e Ausubel e cols., “Current Protocols in Molecular Biology”, Greene Publishing Associates e John Wiley & Sons, Nova York, N.Y. (1994)).

[0064] Além da sequência de ácidos nucléicos que codifica o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção e/ou o agente de ligação de LAG-3 da invenção, o vetor preferivelmente compreende sequências de controle da expressão como, por exemplo, promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores de transcrição, peptídeos sinalizadores (por exemplo, o peptídeo sinalizador de osteonectina), sítios de entrada de ribossomo internos (IRES) e semelhantes, que permitem a expressão da sequência codificadora em uma célula hospedeira. Sequências de controle da expressão exemplares são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, em Goeddel, “Gene Expression Technology: Methods in Enzymology”, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).

[0065] Um grande número de promotores, incluindo promotores constitutivos, indutíveis e repressíveis, de diversas fontes diferentes, é bem conhecido na técnica. Fontes representativas de promotores incluem, por exemplo, vírus, mamíferos, insetos, plantas, leveduras e bactérias, e promotores adequados dessas fontes são facilmente disponíveis, ou podem ser feitos sinteticamente, com base nas sequências disponíveis publicamente, por exemplo, de depósitos como, por exemplo, da ATCC, bem como de outras fontes comerciais ou individuais. Promotores podem ser unidirecionais (ou seja, iniciam a transcrição em uma direção) ou bidirecionais (ou seja, iniciam a transcrição na direção 3’ ou 5’). Exemplos não limitantes de promotores incluem, por exemplo, o sistema de expressão bacteriano T7, o sistema de expressão bacteriano pBAD (araA), o promotor de citomegalovírus (CMV), o promotor de SV40, o promotor de RSV. Promotores indutíveis incluem, por exemplo, o sistema Tet (Patentes U.S. 5.464.758 e 5.814.618), o sistema indutível de Ecdisona (No e cols., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3346-3351 (1996)), o sistema T-REX™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), o sistema LACSWITCH™ (Stratagene, San Diego, CA) e o sistema de recombinase indutível por tamoxifeno Cre- ERT (Indra e cols., Nuc. Acid. Res., 27: 4324-4327 (1999); Nuc. Acid. Res., 28: e99 (2000); Patente U.S. 7.112.715; e Kramer & Fussenegger, Methods Mol. Biol., 308: 123-144 (2005)).

[0066] O termo “intensificador”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma sequência de DNA que aumenta a transcrição, por exemplo, de uma sequência de ácidos nucléicos à qual está ligada operacionalmente. Intensificadores podem estar localizados muitas quilobases afastados da região codificadora da sequência de ácidos nucléicos e podem mediar a ligação de fatores reguladores, padrões de metilação de DNA ou alterações na estrutura do DNA. Um grande número de intensificadores de diversas fontes diferentes é bem conhecido na técnica e está disponível como ou dentro de polinucleotídeos clonados (por exemplo, de depósitos como, por exemplo, da ATCC, bem como de outras fontes comerciais ou individuais). Diversos polinucleotídeos que compreendem promotores (por exemplo, o promotor de CMV comumente usado) também compreendem sequências intensificadoras. Intensificadores podem estar localizados upstream, dentro ou downstream de sequências codificadoras.

[0067] O vetor também pode compreender um “gene de marcador selecionável”. O termo “gene de marcador selecionável”, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma sequência de ácidos nucléicos que permite que células que expressam a sequência de ácidos nucléicos sejam especificamente selecionadas para ou contra, na presença de um agente seletivo correspondente. Genes de marcador selecionável adequados são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas Publicações de Pedido de Patente Internacional WO 1992/008796 e WO 1994/028143; Wigler e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567-3570 (1980); O'Hare e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527-1531 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072-2076 (1981); Colberre-Garapin e cols., J. Mol. Biol., 150: 1-14 (1981); Santerre e cols., Gene, 30: 147-156 (1984); Kent e cols., Science, 237: 901-903 (1987); Wigler e cols., Cell, 11: 223-232 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026-2034 (1962); Lowy e cols., Cell, 22: 817-823 (1980); e Patentes U.S. 5.122.464 e 5.770.359.

[0068] Em algumas modalidades, o vetor é um “vetor epissômico de expressão” ou “epissomo”, que é capaz de replicar em uma célula hospedeira, e persiste como um segmento extracromossômico de DNA dentro da célula hospedeira na presença de pressão seletiva apropriada (veja, por exemplo, Conese e cols., Gene Therapy, 11: 1735-1742 (2004)). Vetores epissômicos de expressão representativos comercialmente disponíveis incluem, sem limitação, plasmídeos epissômicos que utilizam o Antígeno Nuclear de Epstein Barr 1 (EBNA1) e a origem de replicação do Vírus de Epstein Barr (EBV) (oriP). Os vetores pREP4, pCEP4, pREP7 e pcDNA3.1 de Invitrogen (Carlsbad, CA) e pBK-CMV de Stratagene (La Jolla, CA) representam exemplos não limitantes de um vetor epissômico que usa antígeno-T e a origem de replicação de SV40 no lugar de EBNA1 e oriP.

[0069] Outros vetores adequados incluem vetores de expressão de integração, que podem se integrar aleatoriamente no DNA da célula hospedeira, ou podem incluir um sítio de recombinação para permitir a recombinação específica entre o vetor de expressão e o cromossomo da célula hospedeira. Esses vetores de expressão de integração podem utilizar as sequências de controle da expressão endógenas dos cromossomos da célula hospedeira para efetuar a expressão da proteína desejada. Exemplos de vetores que se integram de forma sítio-específica incluem, por exemplo, componentes do sistema flp-in de Invitrogen (Carlsbad, CA) (por exemplo, pcDNA™ 5/FRT), ou o sistema cre-lox, como pode ser encontrado nos Vetores pExchange-6 Core de Stratagene (La Jolla, CA). Exemplos de vetores que se integram aleatoriamente em cromossomos da célula hospedeira incluem, por exemplo, pcDNA3.1 (quando introduzido na ausência de antígeno-T) de Life Technologies (Carlsbad, CA), UCOE de Millipore (Billerica, MA) e pCI ou pFN10A (ACT) FLEXI™ de Promega (Madison, WI).

[0070] Vetores virais também podem ser usados. Vetores virais de expressão disponíveis comercialmente representativos incluem, sem limitação, o sistema baseado em adenovírus Per.C6 disponível por Crucell, Inc. (Leiden, Holanda), o pLP1 de base lentiviral de Invitrogen (Carlsbad, CA), e os vetores retrovirais pFB-ERV mais pCFB-EGSH de Stratagene (La Jolla, CA).

[0071] Sequências de ácido nucléicos que codificam as sequências de aminoácidos da invenção podem ser fornecidas a uma célula no mesmo vetor (ou seja, em cis). Um promotor unidirecional pode ser usado para controlar a expressão de cada sequência de ácidos nucléicos. Em outra modalidade, uma combinação de promotores bidirecionais e unidirecionais pode ser usada para controlar a expressão de múltiplas sequências de ácidos nucléicos. Sequências de ácidos nucléicos que codificam as sequências de aminoácidos da invenção alternativamente podem ser fornecidas à população de células em vetores separados (ou seja, em trans). Cada uma das sequências de ácidos nucléicos em cada um dos vetores separados pode compreender as mesmas sequências de controle da expressão ou sequências de controle da expressão diferentes. Os vetores separados podem ser fornecidos às células simultaneamente ou sequencialmente.

[0072] O vetor (ou vetores) que compreende o ácido nucléico (ou ácidos nucléicos) que codifica as sequências de aminoácidos da invenção pode ser introduzido em uma célula hospedeira que é capaz de expressar os polipeptídeos codificados dessa forma, incluindo qualquer célula procariótica ou eucariótica adequada. Dessa forma, a invenção fornece uma célula isolada que compreende o vetor da invenção. Células hospedeiras preferidas são aquelas que podem se desenvolver facilmente e confiavelmente, possuem taxas de crescimento razoavelmente rápidas, possuem sistemas de expressão bem caracterizados, e podem ser transformadas ou transfectadas facilmente e eficientemente.

[0073] Exemplos de células procarióticas adequadas incluem, sem limitação, células dos gêneros Bacillus (por exemplo, Bacillus subtilis e Bacillus brevis), Escherichia (por exemplo, E. coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella e Erwinia. Células procarióticas particularmente úteis incluem as várias cepas de Escherichia coli (por exemplo, K12, HB101 (ATCC N° 33694), DH5α, DH10, MC1061 (ATCC N° 53338) e CC102).

[0074] De preferência, o vetor é introduzido em uma célula eucariótica. Células eucarióticas adequadas são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, células de levedura, células de inseto e células de mamíferos. Exemplos de células de levedura adequadas incluem aquelas dos gêneros Kluyveromyces, Pichia, Rhino-sporidium, Saccharomyces e Schizosaccharomyces. Células de levedura preferidas incluem, por exemplo, Saccharomyces cerivisae e Pichia pastoris.

[0075] Células de inseto adequadas são descritas, por exemplo, em Kitts e cols., Biotechniques, 14: 810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4: 564-572 (1993); e Lucklow e cols., J. Virol., 67: 4566-4579 (1993). Células de inseto preferidas incluem Sf-9 e HI5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

[0076] De preferência, são utilizadas na invenção células de mamíferos. Diversas células hospedeiras de mamíferos adequadas são conhecidas na técnica, e muitas estão disponíveis pela “American Type Culture Collection” (ATCC, Manassas, VA). Exemplos de células de mamíferos adequadas incluem, sem limitação, células de ovário de hamster chinês (CHO) (ATCC N° CCL61), células CHO DHFR (Urlaub e cols. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), células de rim embrionário humano (HEK) 293 ou 293T (ATCC N° CRL1573) e células 3T3 (ATCC N° CCL92). Outras linhagens de células de mamíferos adequadas são as linhagens de células de macaco COS-1 (ATCC N° CRL1650) e COS-7 (ATCC N° CRL1651), bem como a linhagem de célula CV-1 (ATCC N° CCL70). Células hospedeiras de mamíferos exemplares adicionais incluem linhagens de células de primatas e linhagens de células de roedores, incluindo linhagens de células transformadas. Células diplóides normais, cepas de células derivadas de cultura in vitro de tecido primário, bem como explantes primários, também são adequadas. Outras linhagens de células de mamíferos adequadas incluem, sem limitação, células de neuroblastoma de camundongo N2A, HeLa, células de camundongo L-929 e linhagens de células de hamster BHK ou HaK, todas disponíveis pela ATCC. Métodos para a seleção de células hospedeiras de mamíferos adequadas e métodos para a transformação, cultura, amplificação, triagem e purificação de células são conhecidos na técnica.

[0077] Em uma modalidade, a célula de mamífero é uma célula humana. Por exemplo, a célula de mamífero pode ser uma linhagem de célula linfóide humana ou derivada de célula linfóide humana, por exemplo, uma linhagem de célula de origem pré-linfócito B. Exemplos de linhagens de células linfóides humanas incluem, sem limitação, células RAMOS (CRL-1596), Daudi (CCL-213), EB-3 (CCL-85), DT40 (CRL-2111), 18-81 (Jack e cols., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 15811585 (1988)), Raji (CCL-86), PER.C6 (Crucell Holland B.V., Leiden, Holanda), e derivados destas.

[0078] Uma sequência de ácidos nucléicos que codifica a sequência de aminoácidos da invenção pode ser introduzida em uma célula por “transfecção”, “transformação” ou “transdução”. Os termos “transfecção”, “transformação” ou “transdução”, como usados nesse relatório descritivo, se referem à introdução de um ou mais polinucleotídeos exógenos em uma célula hospedeira por utilização de métodos físicos ou químicos. Muitas metodologias de transfecção são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, coprecipitação de DNA com fosfato de cálcio (veja, por exemplo, Murray E.J. (ed.), “Methods in Molecular Biology”, Vol. 7, “Gene Transfer and Expression Protocols”, Humana Press (1991)); DEAE- dextrana; eletroporação; transfecção mediada por lipossomo catiônico; bombardeamento de micropartículas facilitado por partícula de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e coprecipitação de DNA com fosfato de estrôncio (Brash e cols., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Vetores de fago ou virais podem ser introduzidos em células hospedeiras, após crescimento de partículas infecciosas em células de empacotamento adequadas, muitas das quais estão disponíveis comercialmente.

[0079] A invenção fornece uma composição que compreende uma quantidade eficaz do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção, do agente de ligação de LAG- 3 da invenção, da sequência de ácidos nucléicos da invenção que codifica qualquer um dos citados anteriormente, ou do vetor da invenção que compreende a sequência de ácidos nucléicos da invenção. De preferência, a composição é uma composição farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamente aceitável), que compreende um carreador, preferivelmente um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamente aceitável), e as sequências de aminoácidos da invenção, agente de ligação ao antígeno, ou vetor. Qualquer carreador adequado pode ser usado dentro do contexto da invenção, e esses carreadores são bem conhecidos na técnica. A escolha do carreador será determinada, em parte, pelo local particular no qual a composição pode ser administrada e pelo método particular usado para administrar a composição. A composição opcionalmente pode ser estéril. A composição pode ser congelada ou liofilizada para armazenamento e reconstituída em um carreador estéril adequado antes do uso. As composições podem ser geradas de acordo com técnicas convencionais descritas, por exemplo, em “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 21a Edição, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).

[0080] A invenção ainda fornece um método de tratamento de um distúrbio em um mamífero que é responsivo à inibição ou neutralização de LAG-3. O método compreende a administração da composição mencionada anteriormente a um mamífero que possui um distúrbio que é responsivo à inibição ou neutralização de LAG-3 e, em consequência, o distúrbio é tratado no mamífero. Um distúrbio que é “responsivo à inibição de LAG-3” ou “responsivo à neutralização de LAG-3” se refere a qualquer doença ou distúrbio no qual uma diminuição nos níveis ou atividade de LAG-3 possui um benefício terapêutico em mamíferos, preferivelmente humanos, ou no qual a expressão inadequada (por exemplo, superexpressão) ou atividade de LAG-3 aumentada causa ou contribui para os efeitos patológicos da doença ou distúrbio. Distúrbios que são responsivos à inibição de LAG-3 incluem, por exemplo, câncer e doenças infecciosas. O método da invenção pode ser usado para tratar qualquer tipo de câncer conhecido na técnica como, por exemplo, melanoma, carcinoma de célula renal, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer da vesícula biliar, câncer laríngeo, câncer hepático, câncer da tireóide, câncer do estômago, câncer da glândula salivar, câncer da próstata, câncer pancreático ou carcinoma da célula de Merkel (veja, por exemplo, Bhatia e cols., Curr. Oncol. Rep., 13(6): 488-497 (2011)). O método da invenção pode ser usado para tratar qualquer tipo de doença infecciosa (ou seja, uma doença ou distúrbio causado por uma bactéria, um vírus, um fungo ou um parasita). Exemplos de doenças infecciosas que podem ser tratadas pelo método da invenção incluem, sem limitação, doenças causadas por um vírus da imunodeficiência humana (HIV), um vírus sincicial respiratório (RSV), um vírus influenza, um vírus da dengue, um vírus da hepatite B (HBV, ou um vírus da hepatite C (HCV)). A administração de uma composição que compreende o polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, o polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção, o agente de ligação de LAG-3 da invenção, a sequência de ácidos nucléicos da invenção que codifica qualquer um dos citados anteriormente, ou o vetor da invenção que compreende a sequência de ácidos nucléicos da invenção induz uma resposta imune contra um câncer ou doença infecciosa em um mamífero. Uma “resposta imune” pode englobar, por exemplo, produção de anticorpos e/ou a ativação de células imunes efetoras (por exemplo, células T).

[0081] Como usados nesse relatório descritivo, os termos “tratamento”, “que trata” e semelhantes se referem à obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. De preferência, o efeito é terapêutico, ou seja, o efeito cura parcialmente ou completamente uma doença e/ou sintomas adversos atribuíveis à doença. Para essa finalidade, o método da invenção compreende a administração de uma “quantidade terapeuticamente eficaz” do agente de ligação de LAG-3. Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado terapêutico desejado. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores como, por exemplo, o estado de doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e da habilidade do agente de ligação de LAG-3 para despertar uma resposta desejada no indivíduo. Por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente de ligação de LAG-3 da invenção é uma quantidade que diminui a bioatividade de LAG-3 em um humano.

[0082] Alternativamente, o efeito farmacológico e/ou fisiológico pode ser profilático, ou seja, o efeito evita completa ou parcialmente uma doença ou sintoma desta. A esse respeito, o método da invenção compreende a administração da “quantidade profilaticamente eficaz” do agente de ligação de LAG-3. Uma “quantidade profilaticamente eficaz” se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para obter um resultado profilático desejado (por exemplo, prevenção do surgimento da doença).

[0083] Uma dose típica pode estar, por exemplo, na faixa de 1 pg/kg até 20 mg/kg de peso corporal animal ou humano; no entanto, doses abaixo ou acima dessa faixa exemplar estão dentro do escopo da invenção. A dose parenteral diária pode ser cerca de 0, 00001 μg/kg até cerca de 20 mg/kg de peso corporal total (por exemplo, cerca de 0,001 μg /kg, cerca de 0,1 μg /kg , cerca de 1 μg /kg, cerca de 5 μg /kg, cerca de 10 μg/kg, cerca de 100 μg /kg, cerca de 500 μg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente), preferivelmente de cerca de 0,1 μg/kg até cerca de 10 mg/kg de peso corporal total (por exemplo, cerca de 0,5 μg/kg, cerca de 1 μg/kg, cerca de 50 μg/kg, cerca de 150 μg/kg, cerca de 300 μg/kg, cerca de 750 μg/kg, cerca de 1,5 mg/kg, cerca de 5 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente), mais preferivelmente de cerca de 1 μg/kg até 5 mg/kg de peso corporal total (por exemplo, cerca de 3 μg/kg, cerca de 15 μg/kg, cerca de 75 μg/kg, cerca de 300 μg/kg, cerca de 900 μg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 4 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente) e, ainda mais preferivelmente, de cerca de 0,5 até 15 mg/kg de peso corporal por dia (por exemplo, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2,5 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 11 mg/kg, cerca de 13 mg/kg, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente). A eficácia terapêutica ou profilática pode ser monitorada por avaliação periódica de pacientes tratados. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento pode ser repetido até que ocorra uma supressão desejada de sintomas da doença. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis e estão dentro do escopo da invenção. A dosagem desejada pode ser liberada por administração de um bolo único da composição, por administrações de múltiplos bolos da composição, ou por administração por infusão contínua da composição.

[0084] A composição que compreende uma quantidade eficaz do polipeptídeo da cadeia pesada de imunoglobulina da invenção, do polipeptídeo da cadeia leve de imunoglobulina da invenção, do agente de ligação de LAG-3 da invenção, da sequência de ácidos nucléicos da invenção que codifica qualquer um dos citados anteriormente, ou do vetor da invenção que compreende a sequência de ácidos nucléicos da invenção pode ser administrada a um mamífero com o uso de técnicas de administração padronizadas, incluindo administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou por supositório. A composição preferivelmente é adequada para administração parenteral. O termo “parenteral”, como usado nesse relatório descritivo, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal e intraperitoneal. Mais preferivelmente, a composição é administrada a um mamífero com o uso de liberação sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea.

[0085] Após administrado a um mamífero (por exemplo, um humano que reage de forma cruzada), a atividade biológica do agente de ligação de LAG-3 da invenção pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, a atividade biológica pode ser avaliada por determinação da estabilidade de um agente de ligação de LAG-3 particular. Em uma modalidade da invenção, o agente de ligação de LAG-3 (por exemplo, um anticorpo) possui uma meia-vida in vivo entre cerca de 30 minutos e 45 dias (por exemplo, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 4 horas, cerca de 6 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, cerca de 1 dia, cerca de 5 dias, cerca de 10 dias, cerca de 15 dias, cerca de 25 dias, cerca de 35 dias, cerca de 40 dias, cerca de 45 dias, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente). Em outra modalidade, o agente de ligação de LAG-3 possui uma meia-vida in vivo entre cerca de 2 horas e 20 dias (por exemplo, cerca de 5 horas, cerca de 10 horas, cerca de 15 horas, cerca de 20 horas, cerca de 2 dias, cerca de 3 dias, cerca de 7 dias, cerca de 12 dias, cerca de 14 dias, cerca de 17 dias, cerca de 19 dias, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente). Em outra modalidade, o agente de ligação de LAG-3 possui uma meia-vida in vivo entre cerca de 10 dias e cerca de 40 dias (por exemplo, cerca de 10 dias, cerca de 13 dias, cerca de 16 dias, cerca de 18 dias, cerca de 20 dias, cerca de 23 dias, cerca de 26 dias, cerca de 29 dias, cerca de 30 dias, cerca de 33 dias, cerca de 37 dias, cerca de 38 dias, cerca de 39 dias, cerca de 40 dias, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente).

[0086] A atividade biológica de um agente de ligação de LAG-3 particular também pode ser avaliada por determinação de sua afinidade de ligação à LAG-3 ou a um epitopo desta. O termo “afinidade” se refere à constante de equilíbrio para a ligação reversível de dois agentes e é expressa como a constante de dissociação (KD). A afinidade de um agente de ligação a um ligante, por exemplo, a afinidade de um anticorpo por um epitopo, pode ser, por exemplo, de cerca de 1 picomolar (pM) até cerca de 100 micromolar (μM) (por exemplo, de cerca de 1 picomolar (pM) até cerca de 1 nanomolar (nM), de cerca de 1 nM até cerca de 1 micromolar (μM), ou de cerca de 1 μM até cerca de 100 μM). Em uma modalidade, o agente de ligação de LAG-3 pode se ligar a uma proteína de LAG-3 com uma KD menor ou igual a 1 nanomolar (por exemplo, 0,9 nM, 0,8 nM, 0,7 nM, 0,6 nM, 0,5 nM, 0,4 nM, 0,3 nM, 0,2 nM, 0,1 nM, 0,05 nM, 0,025 nM, 0,01 nM, 0,001 nM, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente). Em outra modalidade, o agente de ligação de LAG-3 pode se ligar à LAG-3 com uma KD menor ou igual a 200 pM (por exemplo, 190 pM, 175 pM, 150 pM, 125 pM, 110 pM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 75 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 25 pM, 20 pM, 15 pM, 10 pM, 5 pM, 1 pM, ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores citados anteriormente). A afinidade de imunoglobulina por um antígeno ou epitopo de interesse pode ser medida com o uso de qualquer ensaio reconhecido na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, separação de células ativadas por fluorescência (FACS), microesferas separáveis (por exemplo, microesferas magnéticas), ressonância de plasmônio de superfície (SPR), competição de fase em solução (KINEXA™), panning de antígenos e/ou ELISA (veja, por exemplo, Janeway e cols. (eds.), Immunobiology, 5a Edição, Garland Publishing, Nova York, NY, 2001).

[0087] O agente de ligação de LAG-3 da invenção pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outros fármacos (por exemplo, como um adjuvante). Por exemplo, o agente de ligação de LAG-3 pode ser administrado em combinação com outros agentes para o tratamento ou prevenção das doenças reveladas nesse relatório descritivo. A esse respeito, o agente de ligação de LAG-3 pode ser usado em combinação com pelo menos um outro agente anticâncer incluindo, por exemplo, qualquer agente quimioterápico conhecido na técnica, radiação ionizante, agentes anticâncer de pequena molécula, vacinas para câncer, terapias biológicas (por exemplo, outros anticorpos monoclonais, vírus que matam o câncer, terapia gênica e transferência adotiva de células T), e/ou cirurgia. Quando o método da invenção trata uma doença infecciosa, o agente de ligação de LAG-3 pode ser administrado em combinação com pelo menos um agente antibacteriano ou pelo menos um agente antiviral. A esse respeito, o agente antibacteriano pode ser qualquer antibiótico adequado conhecido na técnica. O agente antiviral pode ser qualquer vacina de qualquer tipo adequado que visa especificamente um vírus em particular (por exemplo, vacinas vivas atenuadas, vacinas de subunidade, vacinas de vetor recombinante, e terapias antivirais de pequena molécula (por exemplo, inibidores da replicação viral e análogos de nucleosídeos).

[0088] Em outra modalidade, o agente de ligação de LAG- 3 da invenção pode ser administrado em combinação com outros agentes que inibem vias de pontos de checagem imune. Por exemplo, o agente de ligação de LAG-3 da invenção pode ser administrado em combinação com agentes que inibem ou antagonizam as vias da proteína de morte programada 1 (PD- 1), da proteína do domínio de imunoglobulina de célula T e da proteína do domínio de mucina 3 (TIM-3), e da proteína associada ao linfócito T citotóxico 4 (CTLA-4). Tratamentos combinados que simultaneamente visam duas ou mais dessas vias de pontos de checagem imune demonstraram atividade antitumoral aumentada e potencialmente sinérgica (veja, por exemplo, Sakuishi e cols., J. Exp. Med., 207: 2187-2194 (2010); Ngiow e cols., Cancer Res., 71: 3540-3551 (2011); e Woo e cols., Cancer Res., 72: 917-927 (2012)). Em uma modalidade, o agente de ligação de LAG-3 da invenção é administrado em combinação com um anticorpo que se liga a TIM-3 e/ou um anticorpo que se liga a PD-1. A esse respeito, o método da invenção de tratamento de um câncer ou uma doença infecciosa em um mamífero pode ainda compreender a administração ao mamífero de uma composição que compreende (i) um anticorpo que se liga a uma proteína de TIM-3 e (ii) um carreador farmaceuticamente aceitável, ou de uma composição que compreende (i) um anticorpo que se liga a uma proteína de PD-1 e (ii) um carreador farmaceuticamente aceitável.

[0089] Além dos usos terapêuticos, o agente de ligação de LAG-3 descrito nesse relatório descritivo pode ser usado em aplicações diagnósticas ou de pesquisa. A esse respeito, o agente de ligação de LAG-3 pode ser usado em um método para diagnosticar um distúrbio ou doença na qual a expressão inadequada (por exemplo, superexpressão) ou atividade de LAG-3 aumentada causa ou contribui para os efeitos patológicos da doença ou distúrbio. De forma similar, o agente de ligação de LAG-3 pode ser usado em um ensaio para monitorar os níveis de proteína de LAG-3 em um indivíduo que está sendo testado para uma doença ou distúrbio que é responsivo à inibição de LAG-3. Aplicações de pesquisa incluem, por exemplo, métodos que utilizam o agente de ligação de LAG-3 e um marcador para detectar uma proteína de LAG-3 em uma amostra, por exemplo, em um fluido corporal humano ou em uma célula ou extrato de tecido. O agente de ligação de LAG-3 pode ser usado com ou sem modificação, por exemplo, marcação covalente ou não covalente com uma porção detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo (por exemplo, 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I), um composto fluorescente ou quimioluminescente (por exemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina), uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou peroxidase de raiz-forte) ou grupos prostéticos. Qualquer método conhecido na técnica para conjugar separadamente um agente de ligação ao antígeno (por exemplo, um anticorpo) a uma porção detectável pode ser empregado no contexto da invenção (veja, por exemplo, Hunter e cols., Nature, 194: 495-496 (1962); David e cols., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain e cols., J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982)).

[0090] Os níveis de proteína de LAG-3 podem ser medidos com o uso do agente de ligação de LAG-3 da invenção por qualquer método adequado conhecido na técnica. Esses métodos incluem, por exemplo, radioimunoensaio (RIA) e FACS. Valores de expressão normais ou padronizados de LAG-3 podem ser estabelecidos usando qualquer técnica adequada, por exemplo, por combinação de uma amostra que compreende, ou suspeita de compreender, LAG-3 com um anticorpo LAG-3-específico sob condições adequadas para formar um complexo antígeno- anticorpo. O anticorpo é marcado direta ou indiretamente com uma substância detectável para facilitar a detecção do anticorpo ligado ou não ligado. Substâncias detectáveis adequadas incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos (veja, por exemplo, Zola, “Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, CRC Press, Inc. (1987)). A quantidade de polipeptídeo de LAG-3 expressa em uma amostra é então comparada com um valor-padrão.

[0091] O agente de ligação de LAG-3 pode ser fornecido em um kit, ou seja, uma combinação embalada de reagentes em quantidades predeterminada com instruções para a realização de um ensaio diagnóstico. Se o agente de ligação de LAG-3 é marcado com uma enzima, o kit desejavelmente inclui substratos e cofatores necessários à enzima (por exemplo, um substrato precursor que fornece um cromóforo ou fluoróforo detectável). Além disso, outros aditivos podem ser incluídos no kit como, por exemplo, estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas para fornecer concentrações em solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser fornecidos como pós secos (tipicamente liofilizados), incluindo excipientes que, mediante dissolução, fornecerão uma solução de reagente que possui a concentração apropriada.

[0092] Os exemplos seguintes ilustram ainda mais a invenção, mas, evidentemente, não devem ser considerados de modo algum como limitantes de seu escopo.

EXEMPLO 1

[0093] Esse exemplo demonstra um método de geração de anticorpos monoclonais dirigidos contra LAG-3 humana.

[0094] O gene que codifica o domínio extracelular (ECD) de LAG-3 humana foi fundido à IgG2a de camundongo (Fc de mIgG2a de LAG-3 humana) ou a uma forma incapacitada de proteína fluorescente de Wasabi (dWFP LAG-3 humana) para produzir antígeno para uso em imunização de camundongo e avaliação de hibridoma. Especificamente, camundongos-fêmeas Swiss Webster (SWR) foram adquiridos de Harlan Laboratories, Inc. (Indianapolis, IN) e divididos em dois grupos. Após seis dias de aclimatação, um grupo de animais foi imunizado com quatro a seis doses de Fc de mIgG2a de LAG-3 humana purificada a 50 μg/camundongo em intervalos de três a quatro semanas usando adjuvante completo de Freund (CFA) ou adjuvante incompleto de Freund (IFA). O segundo grupo de animais foi injetado com quatro a seis doses em intervalos de três a quatro semanas alternando entre Fc de mIgG2a de LAG-3 humana ou ECD de dWFP LAG-3 humana. CFA ou IFA também foi usado como adjuvante no segundo grupo. Os animais foram sangrados para medição da titulação sérica para LAG-3 humana como avaliada por ligação à LAG-3 humana da superfície celular. Células CHO-S foram transfectadas com um domínio extracelular de LAG-3 humana de comprimento total fundido ao domínio transmembrana H-2Kk (células CHO-S huLAG-3 ECD). Os soros foram diluídos de 1:1.000 - 1:1.000.000 e incubados com as células CHO-S huLAG-3 ECD por 30 minutos a 4°C. As células foram centrifugadas, lavadas uma vez com PBS/BSA 1%, e incubadas com anti-IgG de camundongo de cabra (H+L) conjugado à PE (Southern Biotech, Birmingham, Alabama) ou marcado com ALEXAFLUOR™ 647 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) por 30 minutos a 4°C. As células foram lavadas duas vezes em PBS/BSA 1%, ressuspensas em PBS/BSA 1%, e analisadas em um Bioanalisador FACSARRAY™ de BD (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Com base nas leituras de titulação, um animal de cada grupo recebeu um reforço 3 dias antes da coleta do baço. Suspensões de célula única foram preparadas de tecido do baço e usadas para a geração de hibridomas por fusão de células com o uso de técnicas padronizadas. Duas linhagens de células de mieloma diferentes foram usadas para fusão, F0 (descrita em de St. Groth e Scheidegger, J. Immunol. Methods, 35: 1-21 (1980)) e P3X63Ag8.653 (descrita em Kearney e cols., J. Immunol., 123: 1548-1550 (1979)).

[0095] Os sobrenadantes de hibridoma foram avaliados quanto à ligação às células CHO-S huLAG-3 ECD e comparados com a ligação às células CHO-S não transfectadas como descrito acima. Com base na ligação às células CHO-S huLAG- 3 ECD, os hibridomas foram transferidos para placas de 48 poços e expandidos.

[0096] Os sobrenadantes foram então testados quanto à habilidade para bloquear a ligação de Fc de mIgG2a de LAG-3 humana marcada com DyL650 (Fc de mIgG2a de LAG-3 humana DyL650) às células Daudi, que é uma linhagem de célula B que expressa endogenamente níveis altos de MHCII (o receptor de LAG-3). Resumidamente, Fc de mIgG2a de LAG-3 humana DyL650 foi pré-incubada com IgG de controle ou candidatos a anticorpos monoclonais anti-LAG-3 humana antes da adição às células Daudi. O bloqueio foi medido por redução na fluorescência de células Daudi usando um Bioanalisador FACSARRAY™ de BD. Esses hibridomas foram então subclonados e expandidos na placa para a geração de sobrenadante exaurido. Os anticorpos foram subsequentemente purificados e testados novamente para confirmar tanto a ligação às células CHO-S huLAG-3 ECD quanto a habilidade de bloqueio no ensaio de Daudi.

[0097] Os resultados desse exemplo confirmam a produção de anticorpos monoclonais anti-LAG-3 usando tecnologia de célula de hibridoma.

EXEMPLO 2

[0098] Esse exemplo descreve o design e geração de anticorpos monoclonais anti-LAG-3 com CDR enxertada e quiméricos.

[0099] Anticorpos dos hibridomas descritos no Exemplo 1 foram isotipados, submetidos à RT-PCR para clonagem da região variável da cadeia pesada (VH) e da região variável da cadeia leve (VL) de anticorpo, e sequenciados. Especificamente, RNA foi isolado de péletes de células de clones de hibridoma (1x106 células/pélete) usando o kit RNEASY™ (Qiagen, Venlo, Holanda), e cDNA foi preparado usando o “SUPERSCRIPT™ III First-Strand Synthesis System” sensibilizado com óligo-dT (Life Technologies, Carlsbad, CA). A amplificação por PCR da VL utilizou um pool de iniciadores diretos degenerados de VL de camundongo (veja Kontermann e Dubel, eds., “Antibody Engineering”, Springer-Verlag, Berlin (2001)) e um iniciador reverso da região constante K de camundongo. A amplificação por PCR da VH utilizou um pool de iniciadores diretos degenerados de VH de camundongo (Kontermann e Dubel, supra) e um iniciador reverso da região constante Y1 ou Y2a de camundongo (com base na isotipagem de anticorpo purificado de cada clone) com o protocolo recomendado no “SUPERSCRIPT™ III First-Stand Synthesis System” (Life Technologies, Carlsbad, CA). Os produtos de PCR foram purificados e clonados em pcDNA3.3-TOPO (Life Technologies, Carlsbad, CA).

[00100] Colônias individuais de cada pélete de células foram selecionadas e sequenciadas usando metodologia padronizada de sequenciamento de Sanger (Genewiz, Inc., South Plainfield, NJ). As sequências da região variável foram examinadas e alinhadas com a sequência da linhagem germinativa da região-V da cadeia pesada ou cadeia leve humana mais próxima. Três anticorpos foram selecionados para enxerto de CDR, que foram designados (1) 5.B11, (2) 5.D7, e (3) 1.E10.

[00101] Sequências de anticorpo com CDR enxertada foram projetadas por clonagem de resíduos de CDR de cada um dos anticorpos de camundongo descritos acima no homólogo da linhagem germinativa humana mais próximo. As regiões variáveis de anticorpo com CDR enxertada foram sintetizadas e expressas com regiões constantes de IgG1/K humana para análise. Além disso, foram construídos anticorpos quiméricos de camundongo/humanos usando as regiões variáveis dos anticorpos de camundongo descritos acima ligadas às regiões constantes de IgG1/K humana. Anticorpos quiméricos e com CDR enxertada foram caracterizados quanto à ligação às células CHO-S huLAG-3 ECD e quanto à atividade no ensaio de bloqueio de LAG-3 humana ECD/Daudi como descrito acima.

[00102] A atividade antagonista funcional de anticorpos quiméricos e com CDR enxertada também foi testada em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) de célula T humana CD4+/célula dendrítica, no qual a ativação de células T CD4+ na presença de anticorpos anti-LAG-3 é avaliada por medição da secreção de IL-2. Na medida em que LAG-3 é um regulador negativo da função de célula T, esperava-se que o antagonismo de LAG-3 resultasse em ativação aumentada de célula T, como medida por produção de IL-2 aumentada. Os anticorpos 5.B11, 5.D7 e 1.E10 com CDR enxertada demonstraram atividade antagonística no ensaio de MLR, como medida por um aumento na atividade de IL-2.

[00103] Os resultados desse exemplo demonstram um método de geração de anticorpos monoclonais quiméricos e com CDR enxertada que se ligam especificamente e inibem LAG-3.

EXEMPLO 3

[00104] Esse exemplo demonstra a maturação de afinidade de anticorpos monoclonais humanizados dirigidos contra LAG- 3 humana.

[00105] Anticorpos com CDR enxertada derivados de dois dos anticorpos monoclonais murídeos originais descritos no Exemplo 2, 5.D7 e 1.E10, foram submetidos à maturação de afinidade por meio de hipermutação somática in silico (iSHM). Esse método incorpora mutações como previstas por análise computacional que compara in vivo sequências de anticorpo maturadas, como baixadas do NCBI, e as compara com sequências de IGHV, IGKV e IGLV da linhagem germinativa humana e suas formas alélicas (como descrito em Bowers e cols., J. Biol. Chem., 288(11): 7688-7696 (2013)). As propriedades de ligação de LAG-3 de anticorpos resultantes foram avaliadas com o uso de ressonância de plasmônio de superfície (SPR), bem como a habilidade para se ligar às células CHO-S huLAG- 3 ECD, como descrito previamente. Análises de afinidade baseada em solução também foram realizadas com o uso de um ensaio 3000 KINEXA™ (Sapidyne Instruments, Boise, Idaho), e os resultados foram analisados usando KINEXA™ Pro Software 3.2.6. Os parâmetros experimentais foram selecionados para alcançar um sinal máximo com anticorpo isoladamente entre 0,8 e 1,2 V, enquanto o sinal de ligação não específica limitante com tampão isoladamente para menos do que 10% do sinal máximo. Microesferas de azlactona (50 mg) foram revestidas com antígeno por diluição em uma solução de LAG- 3 humana ou cino-WFP-LAG-3 (50 μg/ml em 1 ml) em 50 mM de Na2CO3. A solução foi revolvida em temperatura ambiente por 2 horas, e as microesferas foram peletizadas em uma centrífuga e lavadas duas vezes com solução de bloqueio (10 mg/ml de BSA, 1 M de Tris-HCl, pH 8,0). As microesferas foram ressuspensas em solução de bloqueio (1 ml), revolvidas em temperatura ambiente por 1 hora e diluídas em 25 volumes de PBS/ NaN3 0,02%. Para medição da afinidade, o anticorpo secundário foi corante ALEXFLUOR™ 647-anti-IgG humana (500 ng/ml). As concentrações de anticorpo da amostra foram mantidas constantes (50 pM ou 75 pM), enquanto antígeno de WFP-LAG-3 humana ou de Cynomolgus foi titulado usando uma série de diluições de três vezes de 1 μM até 17 pM. Todas as amostras foram diluídas em PBS, NaN3 0,2%, 1 mg/ml de BSA e foi permitido que se equilibrassem em temperatura ambiente por 30 horas. Adicionalmente, amostras contendo apenas anticorpo e apenas tampão foram testadas a fim de determinar o sinal máximo e o sinal de ligação não específica, respectivamente.

[00106] A estabilidade térmica dos anticorpos selecionados foi avaliada usando um ensaio ThermoFluor® como descrito em McConnell e cols., Protein Eng. Des. Sel., 26: 151 (2013). Esse ensaio avalia a estabilidade por meio da habilidade de um corante fluorescente hidrofóbico para se ligar a pedaços hidrofóbicos na superfície de proteína que estão expostos como os desenovelamentos da proteína. A temperatura na qual 50% da proteína se desenovelam (Tm) é determinada para medir a estabilidade térmica. Esse ensaio demonstrou que as variantes do anticorpo monoclonal 5.D7 tinham temperaturas de fusão (Tms) aceitáveis (ou seja, acima de 70°C) que eram adequadas para o desenvolvimento de fármacos.

[00107] Para eliminar o risco potencial de questões relacionadas à farmacocinética in vivo dos anticorpos testados foi feita uma avaliação de ligação não específica às células negativas-alvo (veja, por exemplo, Hotzel e cols., mAbs, 4: 753-760 (2012)). Os anticorpos foram testados quanto à ligação às células HEK 293F usando um ensaio baseado em citometria de fluxo. Os resultados indicaram que a ligação não específica era baixa para 5.D7 e poderia ainda ser eliminada por meio de purificação em segunda etapa.

[00108] Os resultados desse exemplo confirmam um método de maturação da afinidade de anticorpos monoclonais humanizados dirigidos contra LAG-3.

EXEMPLO 4

[00109] Esse exemplo demonstra um método de identificação de anticorpos dirigidos contra LAG-3 humana de uma biblioteca evolutiva.

[00110] Uma biblioteca evolutiva de IgG, com base em segmentos do gene-V da sequência da linhagem germinativa unidos a regiões (D)J recombinadas derivadas de doador humano, foi construída como descrito em Bowers e cols. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108(51): 20455-20460 (2011). A cadeia pesada (HC) e a cadeia leve (LC) de IgG foram clonadas em vetores epissômicos separados (Horlick e cols., Gene, 243 (1-2): 187-194 (2000)), com cada vetor codificando um marcador selecionável de antibiótico distinto. O vetor da HC foi formatado de tal forma que o anticorpo tanto fosse apresentado na superfície celular quanto secretado no meio de cultura de tecido (Horlick e cols., J. Biol. Chem., 288 (27): 19861-19869 (2013)). Os diversos conjuntos de HCs e LCs foram cotransfectados em células HEK293 e expandidos até aproximadamente 109 células. A biblioteca de células foi então submetida a duas rodadas cada de seleção negativa contra microesferas magnéticas acopladas à estreptavidina (SA) isoladamente (N° de Catálogo 11047, Life Technologies, Carlsbad, CA) e antígeno biotinilado irrelevante revestido com microesferas magnéticas acopladas à SA. Uma rodada de seleção positiva foi então realizada usando microesferas magnéticas revestidas diretamente com Fc de mIgG2a de LAG-3 humana ou com microesferas magnéticas acopladas à SA revestidas com Fc de mIgG1 de ECD de LAG-3 biotinilada. As células selecionadas positivamente foram diluídas e plaqueadas em formato de 96 poços em uma densidade aproximada de 1-10 células/poço. As colônias resultantes foram expandidas em placas-filhas e uma porção de cada população foi testada quanto à ligação à Fc de mIgG1 de ECD de LAG-3 DyL650 por análise FACSARRAY™. Os anticorpos secretados no sobrenadante também foram testados por BIACORE™ quanto à habilidade para se ligar à Fc de mIgG1 de ECD de LAG-3.

[00111] As células que exibiram coloração específica à Fc de mIgG2a de LAG-3 humana DyL650 por análise FACSARRAY™ e/ou ligação por BIACORE™ foram expandidas para separação e submetidas a sequenciamento para recuperar as combinações HC/LC específicas capazes de ligação à LAG-3 humana. Os quadros de leitura aberta (ORFs) que codificam as HCs e LCs dos anticorpos encontrados nas populações de células foram resgatados por PCR. Geralmente, múltiplas sequências de HC/LC eram encontradas por sequenciamento. Em alguns casos, as combinações HC/LC desejadas foram identificadas por enriquecimento de células que expressam anticorpos monoclonais de interesse, primeiro por separação por FACS com Fc de mIgG2a de LAG-3 humana DyL650. As populações de células que exibem expressão de anticorpo elevada e positivas para ligação à Fc de mIgG2a de LAG-3 humana DyL650 foram isoladas e submetidas à análise de sequência subsequente. No geral, 12 pares de HC/LC diferentes foram identificados como hits potenciais de anticorpo anti-LAG-3 específico adequados para caracterização adicional. Essas estratégias foram rotuladas A1/A14, A2, A3/A17, A4/A19, A5/A16, A6, A8/A20, A9, A10/A15, A11, A12 e A13.

[00112] Os anticorpos também foram caracterizados quanto à sua habilidade para se ligar à proteína de LAG-3 de macaco Cynomolgus (cino-LAG-3). Na medida em que esses anticorpos de linhagem germinativa identificados pela biblioteca eram muito fracos para se ligar ao antígeno expresso na superfície celular, antígeno solúvel similar ao antígeno humano foi marcado com DyL650 (Fc de mIgG2a de cino-LAG-3 DyL650) e depois incubado com células HEK293 que exibem estratégias de anticorpo na superfície celular. Oito estratégias de anticorpo identificadas pela biblioteca evolutiva foram testadas e demonstraram uma habilidade para se ligar à Fc de mIgG1 de ECD de cino-LAG-3.

[00113] Os resultados desse exemplo confirmam que anticorpos monoclonais dirigidos contra LAG-3 humana e não humana podem ser identificados com o uso de uma biblioteca evolutiva.

EXEMPLO 5

[00114] Esse exemplo demonstra a maturação de afinidade de anticorpos dirigidos contra LAG-3 humana identificados usando uma biblioteca evolutiva.

[00115] Linhagens de células estáveis que coexpressam a HC e a LC de cada anticorpo identificado pela biblioteca evolutiva descrita no Exemplo 4 foram transfectadas com ativação induzida por citidina desaminase (AID) para iniciar SHM in vitro. AID também foi transfectada diretamente na população mista de células original expandida pela triagem da biblioteca. Em todos os casos, populações de células foram coradas tanto quanto à expressão de IgG quanto à ligação ao antígeno, coletadas por citometria de fluxo como uma população bruta, e depois expandidas para análise de sequência por sequenciamento da geração seguinte (NGS). Esse processo foi repetido várias vezes para acumular mutações derivadas por SHM nas regiões variáveis das cadeias pesadas e leves, e seus derivados, para cada estratégia. Os aumentos na afinidade foram monitorados por (1) SPR, (2) habilidade para se ligar às células CHO-S huLAG-3 ECD, e (3) atividade no ensaio de MLR. À medida que a afinidade de cada anticorpo aumentava, o rigor de seleção era aumentado até que os objetivos de afinidade fossem alcançados através da identificação e recombinação de novas mutações.

[00116] A estabilidade térmica dos anticorpos selecionados foi avaliada usando um ensaio ThermoFluor® como descrito acima. Esse ensaio demonstrou que a seleção de anticorpos monoclonais pela estratégia A17 tinha Tms aceitáveis que eram adequadas para o desenvolvimento de fármacos. Os anticorpos também foram testados quanto à ligação às células HEK 293F com o uso de um ensaio baseado em citometria de fluxo. Os resultados indicaram que a ligação não específica era baixa para candidatos selecionados por A17.

[00117] Os anticorpos selecionados foram testados quanto à habilidade para bloquear a ligação de Fc de mIgG2a de LAG- 3 humana marcada com DyL650 (Fc de mIgG2a de LAG-3 humana DyL650) às células Daudi, como descrito acima. Uma faixa de doses de anticorpos neutralizantes foi pré-incubada com a LAG-3 solúvel e analisada por citometria de fluxo. Alguns anticorpos anti-LAG-3 com afinidade maturada inibiram completamente a interação de LAG-3 solúvel com MHCII.

[00118] Os resultados desse exemplo confirmam um método de maturação da afinidade de anticorpos monoclonais dirigidos contra LAG-3 identificados com o uso de uma biblioteca evolutiva.

EXEMPLO 6

[00119] Esse exemplo demonstra que um anticorpo monoclonal anti-LAG-3 da invenção pode inibir a sinalização de LAG-3 e aumentar a ativação de célula T in vitro isoladamente e em combinação com um anticorpo anti-PD-1 ou um anticorpo anti-TIM-3.

[00120] Para estabelecer parâmetros para estudos de combinação de anti-LAG-3 e anti-PD-1, o anticorpo anti-PD-1 APE02058 foi titulado em uma curva de dose-resposta no ensaio de MLR de célula T humana CD4+ descrito acima. Com base nos resultados da titulação do anticorpo anti-PD-1 em vários ensaios de MLR, 133 pM (EC50 aproximada) e 13 pM (EC10 aproximada) foram selecionados para testagem em combinação para estudos de antagonismo com o anticorpo monoclonal antiLAG-3. Em combinação com 133 pM ou 13,3 pM de anti-PD-1, a EC50 do anticorpo monoclonal anti-LAG-3 diminuiu de 690 pM (anti-LAG-3 apenas) para 40 pM (+ 133 pM de anti-PD-1) ou 200 pM (+ 13,3 pM de anti-PD-1), o que era um aumento na potência de 17 vezes e 3 vezes, respectivamente.

[00121] Para estabelecer parâmetros para estudos de combinação de anti-LAG-3 e anti-TIM-3, o anticorpo anti-LAG- 3 APE05505 foi titulado em uma curva de dose-resposta no ensaio de MLR de célula T humana CD4+ descrito acima. Com base nos resultados da titulação do anticorpo anti-LAG-3 em vários ensaios de MLR, 2 nM (EC50 aproximada) e 0,2 nM (EC10 aproximada) foram selecionados para testagem em combinação para estudos de antagonismo com o anticorpo monoclonal anti- TIM-3. Em combinação com 2 nM ou 0,2 nM de anti LAG-3, a EC50 do mAb anti-LAG-3 diminuiu de 11 nM (anti-LAG-3 apenas) para 6 nM (+ 0,2 nM de anti-TIM-3) ou 3 nM (+ 2 nM anti-TIM- 3), o que era um aumento na potência de 1,8 vez e 3,6 vezes, respectivamente.

[00122] Os resultados desse exemplo demonstram que o agente de ligação de LAG-3 da invenção pode inibir a atividade biológica de LAG-3 isoladamente e em combinação com antagonistas de outros reguladores negativos do sistema imune.

EXEMPLO 7

[00123] Esse exemplo demonstra que um anticorpo monoclonal anti-LAG-3 da invenção pode inibir a sinalização de LAG-3 e aumentar a ativação de célula T in vivo em combinação com um anticorpo anti-PD-1.

[00124] A atividade de um anticorpo monoclonal substituto anti-LAG-3 de camundongo (mAb C9B7W, BioXcell, West Lebanon, New Hampshire) foi testada isoladamente ou em combinação com um anticorpo monoclonal substituto anti-PD-1 de camundongo (mAb RMP1-14, BioXcell, West Lebanon, New Hampshire) no modelo de tumor singênico MC38. Grupos de dez animais foram injetados por via subcutânea com 1x106 células MC38. Dez dias após a inoculação, os animais foram randomizados quanto ao tamanho do tumor. Os camundongos foram tratados com 5 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-PD-1 e/ou 10 mg/kg de anticorpo monoclonal anti-LAG-3 nos dias 1, 4, 8 e 11, totalizando quatro doses de cada anticorpo ou combinação de anticorpos. Os tumores foram medidos duas vezes por semana para avaliar a resposta ao tratamento. A combinação anti-PD-1 + anti-LAG- 3 foi mais eficaz na redução do crescimento tumoral do que cada agente único isoladamente. Resposta completa foi observada em todos os dez animais do grupo tratado com a combinação, quando comparados com sete animais no grupo de apenas anti-PD-1 e nenhum animal no grupo de apenas antiLAG-3. Nove animais que exibem uma resposta completa do grupo da combinação foram então atacados novamente por inoculação subcutânea com 4x106 células MC38. Nenhum dos animais no grupo de atacados novamente desenvolveu tumor mensurável, enquanto todos os camundongos virgens de tratamento de controle injetados com a mesma quantidade de células desenvolveram tumor palpável.

[00125] As atividades dos anticorpos monoclonais substitutos descritos acima também foram testadas isoladamente ou em combinação no modelo de tumor singênico Colon26. Grupos de 12 animais foram injetados por via subcutânea com 5x105 células Colon26. Os camundongos foram tratados com 10 mg/kg de anticorpo anti-PD-1 e/ou 10 mg/kg de anticorpo anti-LAG-3 nos dias 4, 7, 11 e 14, totalizando quatro doses de cada anticorpo ou combinação de anticorpos. Os tumores foram medidos duas vezes por semana para avaliar a resposta ao tratamento. A combinação anti-PD-1 + anti-LAG- 3 foi mais eficaz para o crescimento tumoral do que cada agente único isoladamente. Resposta completa foi observada em 10 dos 12 animais no grupo da combinação, quando comparados com três animais no grupo de apenas anti-PD-1 e um animal no grupo de apenas anti-LAG-3. Nove animais que exibem resposta completa do grupo da combinação foram então atacados novamente com 5x105 células Colon26. Nenhum dos animais no grupo de atacados novamente desenvolveu tumor mensurável, enquanto todos os camundongos virgens de tratamento de controle injetados com a mesma quantidade de células desenvolveram tumor palpável.

[00126] Os resultados desse exemplo demonstram que o agente de ligação de LAG-3 da invenção, em combinação com antagonistas de outros reguladores negativos do sistema imune, pode inibir a atividade biológica de LAG-3 in vivo.

EXEMPLO 8

[00127] Esse exemplo demonstra o efeito do isótipo do anticorpo sobre a atividade antitumoral de um anticorpo antiLAG-3 isoladamente ou em combinação com um anticorpo anti- PD-1 em um modelo de tumor singênico em camundongo.

[00128] Anticorpos substitutos que reconhecem LAG-3 de camundongo de isótipos IgG1 (D265A) e IgG2a foram criados após sequenciamento e clonagem das regiões variáveis de um anticorpo neutralizante anti-LAG-3 de camundongo (mAb C9B7W, BioXcell, West Lebanon, NH) de uma linhagem de célula de hibridoma de rato e clonagem em um vetor de expressão de IgG1 de camundongo ou de IgG2a de camundongo. Esses anticorpos foram então testados quanto à eficácia tanto isoladamente quanto em combinação com um anticorpo substituto IgG1 de camundongo (D265A) que reconhece PD-1 de camundongo, criado similarmente a partir de um anticorpo de rato adquirido de BioXcell (mAb RMP1-14, West Lebanon, NH). Especificamente, células de adenocarcinoma do cólon Colon26 (5x105 s.c.) foram implantadas em camundongos Balb/c e desenvolvidas por 3 dias. Os camundongos foram randomizados em sete grupos de 12 animais/grupo e dosados com cada anticorpo ou combinação de anticorpos nos dias 4, 7, 11 e 14, como descrito na Tabela 1. Os camundongos injetados com anticorpos com isótipo combinado serviram como um controle. Os volumes do tumor foram medidos duas vezes por semana até o final do estudo. Tabela 1

[00129] Os resultados para esse experimento são mostrados nas Figuras 1A e 1B, que mostram que um anticorpo anti-LAG- 3 de camundongo de agente único com função efetora mínima (ou seja, IgG1 (D265A)) possui eficácia antitumoral, quando comparado com um anticorpo anti-LAG-3 de camundongo com função efetora (ou seja, IgG2a), que não possui efeito aparente sobre o crescimento tumoral.

[00130] Além disso, a Figura 1A mostra que um anticorpo anti-LAG-3 de camundongo com função efetora mínima (ou seja, IgG1 (D265A)) em combinação com um regime de um anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A) exibiu atividade antitumoral aumentada, comparado com o anticorpo IgG1 anti- PD-1 de camundongo (D265A) isoladamente. No entanto, um anticorpo anti-LAG-3 de camundongo com função efetora intacta (IgG2a) em combinação com um anticorpo anti-PD-1 de camundongo foi menos eficaz do que um anticorpo IgG1 anti- PD-1 de camundongo (D265A) isoladamente, sugerindo que a função efetora do anticorpo possivelmente interferiu com a eficácia mediada por anti-PD-1 de camundongo.

[00131] A Figura 1B fornece gráficos de volume tumoral ao longo do tempo para animais individuais do grupo de tratamento 3 (animais tratados com anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A)), grupo 7 (combinação de anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A) com anticorpo IgG1 antiLAG-3 de camundongo (D265A)) e grupo 6 (combinação de anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A) com anticorpo IgG2 anti-LAG-3 de camundongo). No grupo 7 (anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A) com anticorpo IgG1 anti-LAG- 3 de camundongo (D265A)), 8/12 animais não tinham crescimento tumoral visível ao final do estudo. Em contraste, apenas 3/12 dos animais no grupo 6 (anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A) com anticorpo IgG2 anti-LAG-3 de camundongo) não tinham tumor visível ao final do estudo. No grupo 3 (anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A) isoladamente), 6/12 dos animais eram livres de tumor ao final do estudo, sugerindo possível interferência pela função efetora do anticorpo IgG2 anti-LAG-3 de camundongo quando dosado em combinação com o anticorpo IgG1 anti-PD-1 de camundongo (D265A).

[00132] Os resultados desse exemplo demonstram que anticorpos anti-LAG-3 de camundongo e anti-PD-1 de camundongo sem função efetora, isoladamente e em combinação, podem inibir o crescimento tumoral em um modelo em camundongo de tumor singênico. Não foi observada eficácia com o uso de um anticorpo anti-LAG-3 de camundongo com função efetora e, além disso, o uso pode interferir com a eficácia mediada por anti-PD-1.

EXEMPLO 9

[00133] Esse exemplo demonstra que a atividade inibidora de um anticorpo monoclonal anti-LAG-3 da invenção pode ser diferenciada daquela de um anticorpo monoclonal anti-PD-1 em uma reação mista de linfócitos com base no tempo de coleta e se correlaciona com expressão de PD-1 e de LAG-3.

[00134] Um anticorpo antagonista de LAG-3 funcional foi testado em um ensaio de reação mista de linfócitos (MLR) de célula T humana CD4+ no qual a ativação de células T CD4+ em presença de anticorpos anti-LAG-3 é avaliada por medição da secreção de IL-2. O anticorpo anti-LAG-3 foi testado lado- a-lado com um anticorpo antagonista anti-PD-1, em que os anticorpos foram adicionados e/ou coletados em pontos de tempo diferentes. Especificamente, monócitos isolados do sangue periférico de um doador humano foram diferenciados em células dendríticas (DCs) e depois misturados com células T CD4+ isoladas de um segundo doador. Os anticorpos inibidores foram adicionados no início da cocultura ou 24 horas após o início da cocultura. Os níveis de IL-2 foram medidos em 24 e 48 horas após a adição de anticorpo.

[00135] Esperava-se que o antagonismo de LAG-3 e PD-1 resultasse em ativação aumentada de célula T, como medida pela produção de IL-2 aumentada. Quando adicionado no início do ensaio, o anticorpo anti-PD-1 aumentou a secreção de IL- 2 tanto 24 quanto 48 horas após a adição de anticorpo, enquanto o anticorpo anti-LAG-3 aumentou a secreção de IL-2 quando medida em 48 horas no ensaio de MLR, mas não em 24 horas. Quando anticorpos inibidores anti-LAG-3 ou anti-PD-1 foram adicionados em 24 horas após o início da cocultura e coletados em 72 horas, ambos os anticorpos foram ativos e a EC50 pareceu ser equivalente (Figura 2A). Isso se correlaciona com a expressão, na medida em que expressão aumentada de PD-1 é observada em 24 - 72 horas, enquanto LAG-3 parece ser expressa mais tarde no ensaio em 48 e 72 horas (Figura 2B).

[00136] Os resultados desse exemplo demonstram que os efeitos da inibição de LAG-3 se correlacionam com expressão do alvo, e que a expressão de LAG-3 ocorre temporalmente mais tarde do que PD-1.

[00137] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, citadas nesse relatório descritivo são aqui incorporadas por referência no mesmo grau como se cada referência fosse individual e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fosse descrita em sua totalidade nesse relatório descritivo.

[00138] O uso dos termos “um” e “uma” e “o” e “pelo menos um” e referentes similares no contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações seguintes) deve ser considerado como englobando tanto o singular quanto o plural, a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo ou claramente contradito pelo contexto. O uso do termo “pelo menos um” seguido por uma lista de um ou mais itens (por exemplo, “pelo menos um de A e B”) deve ser considerado como significando um item selecionado dos itens listados (A ou B) ou qualquer combinação de dois ou mais dos itens listados (A e B), a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo ou claramente contradito pelo contexto. Os termos “que compreendem”, “que possuem”, “que incluem” e “que contêm” devem ser considerados como termos em aberto (ou seja, significando “que incluem, sem limitação”), a menos que observado de forma diferente. A citação de faixas de valores nesse relatório descritivo visa simplesmente servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que cai dentro da faixa, a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado individualmente nesse relatório descritivo. Todos os métodos descritos nesse relatório descritivo podem ser realizados em qualquer ordem, a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo ou de algum outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, “tais como”) fornecidos nesse relatório descritivo, visa simplesmente melhor iluminar a invenção e não impõe uma limitação sobre o escopo da invenção, a menos que reivindicado de forma diferente. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser considerada como indicando qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção.

[00139] Modalidades preferidas dessa invenção são descritas nesse relatório descritivo, incluindo o melhor modo conhecido para a realização da invenção. Variações dessas modalidades preferidas podem ficar evidentes para aqueles habilitados na técnica mediante leitura da descrição citada anteriormente. Os inventores esperam que aqueles habilitados na técnica empreguem essas variações de forma apropriada, e os inventores desejam que a invenção seja praticada de modo diferente do especificamente descrito nesse relatório descritivo. Consequentemente, essa invenção inclui todas as modificações e equivalentes do tema citado nas reivindicações a ela anexadas, como permitido pelas leis aplicáveis. Além disso, qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as suas variações possíveis é englobada pela invenção, a menos que indicado de forma diferente nesse relatório descritivo ou de algum outro modo claramente contradito pelo contexto.

Claims

1. Agente de ligação do gene de ativação de linfócitos- 3 (LAG-3) caracterizado por compreender: uma região variável da cadeia leve de imunoglobulina (VL) que compreende uma cadeia leve CDR1, uma cadeia leve CDR2 e uma cadeia leve CDR3 de SEQ ID NO: 88; e uma região variável da cadeia pesada de imunoglobulina (VH) que compreende uma cadeia pesada CDR1, uma cadeia pesada CDR2 e uma cadeia pesada CDR3 de SEQ ID NO: 182.

2. Agente de ligação do gene de ativação de linfócitos- 3 (LAG-3), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela região VH compreender SEQ ID NO: 182 e região VL compreender SEQ ID NO:88.

3. Agente de ligação do gene de ativação de linfócitos- 3 (LAG-3), de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser um anticorpo, um conjugado de anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste, opcionalmente um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fab’, um fragmento Fab, um fragmento Fv, um fragmento scFv, um fragmento dsFv, um fragmento dAb ou um polipeptídeo de ligação de cadeia única.

4. Agente de ligação do gene de ativação de linfócitos- 3 (LAG-3), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de LAG-3 compreende uma região Fc com função efetora reduzida ou anulada.

5. Composição farmacêutica caracterizada por compreender o agente de ligação de LAG-3, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um carreador farmaceuticamente aceitável.

6. Uso do agente de ligação do gene de ativação de linfócitos-3 (LAG-3), conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é câncer.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o câncer é melanoma, carcinoma de célula renal, câncer de pulmão, câncer de bexiga, câncer de mama, câncer cervical, câncer de cólon, câncer da vesícula biliar, câncer laríngeo, câncer hepático, câncer da tireóide, câncer do estômago, câncer da glândula salivar, câncer da próstata, câncer pancreático ou carcinoma da célula de Merkel.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o distúrbio é uma doença infecciosa.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a doença infecciosa é causada por um vírus ou uma bactéria, opcionalmente o vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus sincicial respiratório (RSV), vírus influenza, vírus da dengue ou vírus da hepatite B (HBV).

11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizado pelo de que o medicamento para o tratamento de câncer ou de uma doença infecciosa é para uso em combinação com um agente de ligação de PD-1, opcionalmente em que o agente de ligação de PD-1 é um anticorpo, um conjugado de anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno deste.