BR112017016497B1

BR112017016497B1 - Composições e métodos para metabolismo muscular melhorado

Info

Publication number: BR112017016497B1
Application number: BR112017016497-3A
Authority: BR
Inventors: Antoine Charles Bily; Marjolaine Meyer; Karl Chevalier; Lise Laurencon; Nicolas Feuillere; Marc Roller; Simona Birtic; Pascale Elizabeth Renée Fança-Berthon; Leila Denise Falcao
Original assignee: Naturex Sa
Priority date: 2015-02-03
Filing date: 2016-02-03
Publication date: 2021-03-30
Also published as: KR102520312B1; KR20180011755A; US20160220624A1; US10258658B2; CA2975497C; WO2016125025A1; CO2017007874A2; EP3253399A1; AU2016214079B2; AU2016214079A1; US20170296605A1; US9700589B2; RU2017127509A; MX2017009929A; CN107624069A; RU2017127509A3; RU2730853C2; JP6726196B2; EP3253399B1; JP2018505892A

Abstract

composições e métodos para metabolismo muscular melhorado. uma composição para melhorar metabolismo muscular num sujeito e métodos para fabricar e usar a mesma. modalidades incluem composições tendo um extrato de rhaponticum e um extrato de rhodiola. um extrato de rhaponticum pode incluir quantidades de ecdiesteronas incluindo 20-hidroxiecdisona. um extrato de rhodiola pode incluir salidrosidas e rosavinas, incluindo rosavina. dosagens de ingestão adequadas da composição podem ser operáveis para aumentar a síntese de proteína e reduzir proteólise de proteína num sujeito.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente US N.° de Série: 14/612.973, depositado em 3 de fevereiro de 2015, incorporado a seguir por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente divulgação fornece composições e métodos para aumentar síntese de proteína muscular, reduzir proteólise muscular, aumentar massa e/ou resistência muscular e melhorar desempenho esportivo aeróbico/anaeróbico. Composições úteis incluem, mas não se limitam a, extratos de Rhaponticum e Rhodiola e combinações dos mesmos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0003] Em um aspecto, a invenção inclui uma composição incluindo um extrato de Rhaponticum. Em algumas modalidades, o extrato de Rhaponticum compreende pelo menos 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de ecdiesteroides incluindo, por exemplo, cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteroides ou cerca de 0,4% a 5% de ecdiesteroides. Em algumas modalidades, a composição de extrato de Rhaponticum compreende pelo menos 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de 20-hidroxiecdisona incluindo, por exemplo, cerca de 0,1% a 5,0% de 20-hidroxiecdisona.

[0004] Em um aspecto, a invenção inclui uma composição incluindo um extrato de Rhodiola. Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende pelo menos 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de salidrosidas incluindo, por exemplo, cerca de 1% a 4% de. Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de rosavinas incluindo, por exemplo, cerca de 0,5% a 10% ou 3% a 6% de rosavinas. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de rosavina incluindo, por exemplo, cerca de 0,5% a 10% de rosavina ou 1% a 5% de rosavina. Em algumas modalidades, a composição de extrato de Rhodiola compreende pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de extrato de Rhodiola incluindo, por exemplo, cerca de 50% a 99%, 60% a 95%, 70% a 95% de extrato de Rhodiola.

[0005] Em um aspecto, a invenção inclui uma composição incluindo um extrato de Rhaponticum e um extrato de Rhodiola. Em algumas modalidades, o extrato de Rhaponticum compreende pelo menos 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de ecdiesteroides incluindo, por exemplo, cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteroides ou cerca de 0,4% a 5% de ecdiesteroides. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de 20-hidroxiecdisona incluindo, por exemplo, cerca de 0,1% a 5,0% de 20- hidroxiecdisona.

[0006] Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende pelo menos 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de salidrosidas incluindo, por exemplo, cerca de 1% a 4% de. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de rosavinas incluindo, por exemplo, cerca de 3% a 6% de rosavinas. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de rosavina incluindo, por exemplo, cerca de 2% a 5% de rosavina.

[0007] Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de extrato de Rhodiola incluindo, por exemplo, cerca de 50% a 99%, 60% a 95%, 70% a 95% de extrato de Rhodiola.

[0008] Em outro aspecto, a invenção inclui composições tendo (i) pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de ecdiesteroides incluindo, por exemplo, cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteroides ou cerca de 0,4% a 5% de ecdiesteroides e (ii) pelo menos 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de salidrosidas incluindo, por exemplo, cerca de 1% a 4%. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de 20-hidroxiecdisona incluindo, por exemplo, 0,1% a 5,0% de 20-hidroxiecdisona. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de rosavinas incluindo, por exemplo, cerca de 3% a 6% de rosavinas. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,75%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% de rosavina incluindo, por exemplo, cerca de 2% a 5% de rosavina.

[0009] Em outras modalidades, qualquer uma das composições anteriores pode ser incluída numa formulação farmacêutica. A composição pode ser formulada em qualquer formulação conveniente e apropriada, dependendo da rota de administração pretendida. As formulações adequadas para administração oral incluem, por exemplo, um comprimido, pílula, cápsula, pó, solução, suspensão, xarope ou elixir. Opcionalmente, a composição contém ainda um excipiente ou transportador farmaceuticamente aceitável ou outro ingrediente farmaceuticamente ativo ou não ativo.

[0010] Outros aspectos da invenção incluem métodos para aumentar a síntese de proteína, aumentar a resistência muscular e/ou reduzir a proteólise de proteína num sujeito administrando ao sujeito de qualquer uma das composições ou formulações farmacêuticas descritas acima. Outros aspectos incluem métodos para tratar condições associadas a ou caracterizadas por atrofia muscular num sujeito administrando ao sujeito de qualquer uma das composições ou formulações farmacêuticas descritas acima. A composição ou formulação pode ser administrada ao sujeito por qualquer rota de administração apropriada. Numa modalidade, a composição é administrada oralmente. Em algumas modalidades, ao sujeito é administrada uma dose diária de pelo menos 1 mg/kg/dia, 5 mg/kg/dia, 10 mg/kg/dia, 20 mg/kg/dia, 30 mg/kg/dia, 40 mg/kg/dia, 50 mg/kg/dia, 75 mg/kg/dia, 100 mg/kg/dia, 200 mg/kg/dia, 400 mg/kg/dia, 600 mg/kg/dia, 800 mg/kg/dia, 1.000 mg/kg/dia, 2.000 mg/kg/dia, 3.000 mg/kg/dia, 5.000 mg/kg/dia ou mais por dia. Numa modalidade, a formulação oral é de cerca de 30 a 1.000 mg/kg/dia. Em outra modalidade, a formulação oral é de cerca de 50 a 100 mg/kg/dia, cerca de cerca de 5 a 50 mg/kg/dia ou menor que 200 mg/kg/dia. Em modalidades adicionais, a formulação oral pode ser de cerca de 200 a 500 mg/dia, ou cerca de 50 a 2000 mg/dia. A dose diária total pode ser administrada como uma dosagem unitária ou dividida em múltiplas dosagens administradas em tempos diferentes (por exemplo, duas vezes, três vezes, quatro vezes ou mais por dia).

[0011] Em várias modalidades, a dosagem pode ser modificada com base no tipo de sujeito e/ou na massa do sujeito. Por exemplo, em algumas modalidades uma dosagem adequada para um sujeito humano pode ser de 50 a 2000 mg/dia, ou 200 a 500 mg/dia. Em algumas modalidades, uma dosagem desejável para um sujeito humano ou sujeito ruminante pode ser de 5 a 50 mg/kg/dia ou menor que 200 mg/kg/dia.

[0012] Em algumas modalidades, um sujeito pode ser tratado para condições incluindo sarcopenia, obesidade sarcopênica, um câncer, esclerose múltipla, distrofia muscular, uma fratura óssea requerendo imobilização (por exemplo, tala ou gesso), esclerose lateral amiotrófica (ALS), uma neuropatia periférica, acidente vascular cerebral ou caquexia. Os sujeitos podem ter ou ser diagnosticados como tendo uma tal condição e tal condição pode ser idiopática ou secundária a outra condição. Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero incluindo, por exemplo, um humano ou um animal (por exemplo, canino, felino, ovino, bovino, ruminante, etc.). Por conseguinte, em várias modalidades, as composições aqui descritas podem ser usadas em alimento, produtos alimentícios ou suplementos nutricionais para humanos ou animais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] A Fig. 1a é um gráfico de fenólicos totais identificados no extrato do Exemplo 11;

[0014] A Fig. 1b é um gráfico de ácidos orgânicos totais identificados no extrato do Exemplo 11;

[0015] A Fig. 2a é um gráfico de carboidratos livres totais identificados no extrato do Exemplo 11;

[0016] As Figs. 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6a, 6b, 7a e 7b são gráficos de barras representando a determinação de fosforilação S6K1 em treonina 389 em miotubos C2C12 após incubação com 5 diferentes preparações de extrato de Rhaponticum a três concentrações e com aminoácido baixo e alto;

[0017] As Figs. 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 10b, 11a, 11b, 12a e 12b são gráficos de barras representando a determinação de fosforilação Akt em treonina 308 em miotubos C2C12 após incubação com 5 diferentes preparações de extrato de Rhaponticum a três concentrações e com aminoácido baixo e alto;

[0018] As Figs. 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a e 17b são gráficos de barras representando a determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com 5 diferentes preparações de extrato de Rhaponticum a três concentrações e com aminoácido baixo e alto;

[0019] As Figs. 18a e 18b são gráficos de barras representando a determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a três concentrações;

[0020] As Figs. 19a, 19b, 20a, 20b e 21 são gráficos de barras representando a determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola sozinhos ou em combinação a duas concentrações;

[0021] As Figs. 22a e 22b são gráficos de barras que representam o efeito de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola em expressão de gene de miostatina e atrogina em miotubos C2C12;

[0022] As Figs. 23a, 23b, 24a e 24b são gráficos de barras que representam o efeito de coincubação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola em expressão de gene de miostatina em miotubos C2C12;

[0023] As Figs. 25a, 25b, 26a e 26b são gráficos de barras que representam o efeito de coincubação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola em expressão de gene de atrogina em miotubos C2C12;

[0024] As Figs. 27a, 27b e 28 são gráficos de barras que representam a determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com diferentes preparações de extratos de Rhaponticum a duas concentrações;

[0025] A Fig. 29a é um fluxograma representando um processo de extração para raiz de Rhaponticum; e

[0026] A Fig. 29b é um fluxograma representando frações obtidas com solventes diferentes.

[0027] A Fig. 30a é um gráfico de barras que representa o aumento na resistência pega (em kg de força) de ratos Wistar em um grupo de controle e num grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0028] A Fig. 30b é um gráfico de barras que representa o aumento na resistência pega (em kg de força / g de peso corporal) de ratos Wistar em um grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0029] A Fig. 31a é um gráfico de barras que representa o peso do Extensor Digitorum Longus (EDL) (em gramas) de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0030] A Fig. 31b é um gráfico de barras que representa o peso EDL (como percentual de peso corporal total) de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0031] A Fig. 32a é um gráfico de barras que representa o peso soleus (em gramas) de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0032] A Fig. 32b é um gráfico de barras que representa o peso soleus (como percentual de peso corporal total) de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0033] A Fig. 33a é um gráfico de barras que representa o teor de proteína no Extensor Digitorum Longus (EDL) de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0034] A Fig. 33b é um gráfico de barras que representa o teor de proteína no EDL de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0035] A Fig. 34a é um gráfico de barras que representa o teor de proteína no soleus de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0036] A Fig. 34b é um gráfico de barras que representa o teor de proteína no soleus de ratos Wistar no grupo de controle e no grupo experimental após 42 dias de tratamento com uma composição de Rhaponticum e Rhodiola.

[0037] A Fig. 35a é um western blot de proteína extraída de amostra de músculo FDP com antipuromicina.

[0038] A Figura 35b é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para controle negativo. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0039] A Figura 35c é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para proteínas de soro de leite. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0040] A Figura 35d é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para tratamento com Rhodiola rosea. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0041] A Figura 35e é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para tratamento com Rhaponticum carthamoides. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0042] A Fig. 36a é um western blot de proteína extraída de amostra de músculo deltoide com antipuromicina. p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0043] A Figura 36b é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para controle negativo. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0044] A Figura 36c é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para proteínas de soro de leite. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0045] A Figura 36d é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para tratamento com Rhodiola rosea. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0046] A Figura 36e é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para tratamento com Rhaponticum carthamoides. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0047] A Fig. 37a é um western blot de proteína extraída de amostra de músculo do bíceps com antipuromicina. B:

[0048] A Figura 37b é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para controle negativo. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0049] A Figura 37c é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para proteínas de soro de leite. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0050] A Figura 37d é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para tratamento com Rhodiola rosea. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0051] A Figura 37e é um gráfico mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e para tratamento com Rhaponticum carthamoides. * p<0,05 significativamente diferente. * * p<0,001 significativamente diferente.

[0052] A Figura 38 é um gráfico para níveis de síntese de proteína de todos os músculos de rato (FDP, deltoide e bíceps combinados) em seguida a exercício de resistência agudo no qual o gráfico mostra unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento quantitativo e de controle negativo. * p<0,001 significativamente diferente do controle negativo. Φ p<0,05 significativamente diferente de proteínas de soro de leite. ◊ p<0,05 significativamente diferente de tratamento com Rhodiola Rosea. ■: P<0,001 significativamente diferente de tratamento com Rhaponticum carthamoides.

[0053] Deve também ser notado que as figuras são apenas destinadas a facilitar a descrição das modalidades preferidas. As figuras não ilustram todos os aspectos das modalidades descritas e não limitam o escopo da presente divulgação.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0054] A presente divulgação proporciona modalidades de exemplo de novas composições para uso farmacêutico ou nutracêutico num mamífero, preferencialmente num humano, para aumentar a síntese de proteína, massa muscular e/ou a resistência muscular. Os exemplos de trabalho demonstram que a combinação de extratos de Rhodiola e Rhaponticum e composições sintéticas relacionadas pode aumentar a síntese de proteína, reduzir a proteólise (inibir a expressão de Atrogina-1 e miostatina), aumentar a massa muscular e a resistência muscular. Em várias modalidades, composições são fornecidas compreendendo um extrato de Rhodiola rosea e/ou um extrato de Rhaponticum carthamoides. Composições sintéticas (isto é, composições nas quais um ou mais ingredientes não são derivados de extratos de plantas) são também reveladas. EXTRATOS DE RHAPONTICUM

[0055] O extrato de Rhaponticum pode ser derivado de qualquer espécie Rhaponticum incluindo (mas não limitada a) Rhaponticum acaule (L.) DC., Rhaponticum aulieatense Iljin, Rhaponticum australe (Gaudich.), Rhaponticum berardioides (Batt.), Rhaponticum canariense DC., Rhaponticum carthamoides (Willd.), Rhaponticum coniferum (L.) Greuter, Rhaponticum cossonianum (Ball) Greuter, Rhaponticum cynaroides Less., Rhaponticum exaltatum (Willk.) Greuter, Rhaponticum fontqueri, Rhaponticoides hajastana (Tzvelev) M.V.Agab. & Greuter, Rhaponticum heleniifolium Godr. & Gren., Rhaponticoides iconiensis (Hub.-Mor.) M.V.Agab. & Greuter, Rhaponticum insigne (Boiss.) Wagenitz, Rhaponticum integrifolium C.Winkl., Rhapontikum karatavicum Iljin, Rhaponticum longifolium (Hoffmanns. & Link) Dittrich, Rhaponticum lyratum C.Winkl. ex Iljin, Rhaponticum namanganicum Iljin, Rhaponticum nanum Lipsky, Rhaponticum nitidum Fisch, Rhaponticum pulchrum Fisch. & C.A.Mey. Rhaponticum repens (L.) Hidalgo, Rhaponticum scariosum Lam., Rhaponticum serratuloides (Georgi) Bobrov, Rhaponticum uniflorum (L.) DC. Em algumas modalidades, o extrato herbal de Rhaponticum é feito de uma planta selecionada da família de Asteraceae, do gênero Rhaponticum e mais especificamente a espécie Rhaponticum Carthamoides.

[0056] Um extrato pode ser preparado de qualquer(quaisquer) parte(s) da planta Rhaponticum, no entanto, a raiz é particularmente útil. Raiz de Rhaponticum pode ser extraída com um solvente do grupo de etanol, metanol, água, etanol em água, acetato de etila, acetona, hexano ou qualquer outro solvente de extração convencional, de preferência etanol em água ou água, mais preferencialmente etanol em água 10 a 90% v/v e ainda mais preferencialmente etanol em água 30 a 70% (v/v). Numa modalidade, a extração consiste em misturar raiz de Rhaponticum moída com solvente numa razão solvente:planta entre 1:1 a 30:1 e a planta pode sofrer um processo de extração simples ou, alternativamente, duplo (ou mais extrações). A duração da extração é de preferência >1 h, mais preferencialmente 1,5 h. Numa modalidade preferida, raiz de Rhaponticum é misturada com etanol em água (50% v/v) a uma razão de 10:1 e sofre 3 extrações sucessivas. Após a extração, a mistura combinada pode ser filtrada e/ou centrifugada e o sobrenadante concentrado até 30 a 70% de DM, mais preferencialmente% 50% DM e, finalmente, seco até a forma sólida, com <10% de umidade, tal como na forma de um pó. Um perito na arte reconhecerá múltiplos processos de preparar extratos de plantas e que podem ser utilizados para a presente divulgação, em adição aos processos particulares aqui revelados.

[0057] Componentes de interesse em Rhaponticum são ecdiesteroides, em particular 20-hidroxiecdisona ((2β,3β,5β,22R)-2,3,14,20,22,25-Hexahidroxicolest-7-en-6- ona). Este composto pode ser usado como uma referência para determinação da qualidade das preparações, embora ele possa não ser o único composto trazendo efeitos e uma mistura de compostos é provável de tornar o extrato mais eficaz que 20HE sozinho (Timofee et al, Voldov et al).

[0058] Em algumas modalidades, o extrato de Rhaponticum compreende pelo menos 0,01% de ecdiesteroides totais, cerca de 0,05% a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de ecdiesteroides totais com base no peso total do extrato (p/p) mais preferivelmente pelo menos cerca de 0,1 a 10% de ecdiesteroides totais, mais preferivelmente 0,4% a 5% de ecdiesteroides totais com base no peso total do extrato (p/p).

[0059] Em algumas modalidades, o extrato de Rhaponticum compreende pelo menos 0,01% de 20-hidroxiecdisona (20HE) com base no peso total do extrato (p/p), cerca de 0,05% a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de 20 HE, mais preferivelmente pelo menos cerca de 0,1 a 5,0% de 20HE com base no peso total do extrato (p/p).

[0060] Além disso, o extrato de Rhaponticum também pode compreender ecdiesteroides que não ecdiesterona, tal como por meio de um exemplo não limitativo, os seguintes ecdiesteroides: polipodina B, Makisterone A, 2- Deoxiecdiesterona, Integristerone A, Integristerone B, Taxisterone, Ajugasterone C, α-ecdysone, Lesterone, Rapisterone D, Inokosterone, Rapisterone, 20- hidroxiecdisona 2,3;20,22-diacetonida, 20-hidroxiecdisona 2,3-monoacetonida; 20-hidroxiecdisona 20,22-monoacetonida; 22-oxo-20-hidroxiecdisona, 24(28)-de-hidromakisterone A; (24z)-29-hidroxi-24(28)-de-hidromakisterone C; cartamosterona; rubrosterona, di-hidrorubrosterona; posterona, isovitexirona, leuzeasterona, makisterone C, polipodina B 20,22-acetonida; rapisterona B, rapisterona C, rapisterona D 20-acetato, 24(24’)(z)-de-hidroamarasterone B, polipodina B-22-benzoato; cartamosterona A, cartamosterona B; Amarasterona A; cartamoleusterona; 24(28)-de-hidroamarasterone B, 22-deoxi-28- hidroximakisterone C; 3-epi-20-hidroxiecdisona; 24-epi- makisterone A, 14-epi-ponasterona A 22-glucosida; 5-α-20- hidroxiecdisona; 20-hidroxiecdisona 2-acetato, 20- hidroxiecdisona 3-acetato; 1β-hidroximakisterone C; 26- hidroximakisterone C; 15-hidroxiponasterone A; inokosterone 20,22-acetonida, turkestone.

[0061] O extrato de Rhaponticum também pode compreender os seguintes ecdiesteroides: abutasterone25-acetoxi-20- hidroxiecdisona 3-o-; beta;-d-glucopiranosida; acetilpinasterol; aquirantesterona; ajugacetalsterona a; ajugacetalsterona b; ajugalida e; ajugasterona b; ajugasterona b; ajugasterona c 3; 22-diacetonida; ajugasterona c 22-etilideno; acetal; ajugasterona c 22- monoacetonida; ajugasterona d; amarasterona a; amarasterona b; asteraster b; atrotosterona a; atrotosterona b; atrotosterona c; blechnosida a; blechnosida b; bombicosterol; bombicoster 3-fosfato; brahuisterona; calonisterona; calvaster a; calvaster b; canescensterona; capitasterona; carpesterol; castasterona; queilantona a; queilantona b; coronatasterona; cianosterona a; ciasterona; ciasterona 3-acetato; ciasterona 22-acetato; ciasterona 3- monoacetonida; ciatisterona; dacri-hainansterona; decumbesterona a; de-hidroajugalactona; de- hidroajugalactona; de-hidroamarasterona b; de- hidrociasterona 2-glucosida; 3-de-hidroecdisona; 2-de- hidro-3-epi-20-hidroxiecdisona; e/ou 22-de-hidro-12- hidroxiciasterona, de-hidro-20-hidroxiecdisona; 3-de-hidro- 20-hidroxiecdisona; de-hidro-242-hidroximakisterone c de- hidro-12-hidroxi-29-nor-ciasterona; de-hidro-12-hidroxi-29- nor-sengosterona; de-hidro-12-hidroxi-sengosterona; (28)- de-hidromakisterone a; 2-de-hidropoststerone; 24-de- hidropreciasterone; 2-deoxicastasterone; 22-deoxi-21-di- hidroxiecdisona; 22-deoxi-26-di-hidroxiecdisona; 2-deoxi- 26-di-hidroxiecdisona; 3-deoxi-1(alfa) 20-di- hidroxiecdisona; 2-deoxi-20-di-hidroxiecdisona 2-deoxi- polipodina b; 2-deoxiecdisona; deoxiecdisona; 2- deoxiecdisona 3-acetato; 2-deoxiecdisona 22-acetato; 2- deoxiecdisona 22-adenosina-monofosfato; 2-deoxiecdisona 22- benzoato; 2-deoxiecdisona 3-4-(1-(beta)-d-glucopiranosil)- ferulato; 2-deoxiecdisona 22-(beta)-d-glucosida; 25- deoxiecdisona 22-o-(beta)-d-glucopiranosida; 2- deoxiecdisona 22-fosfato; 2-deoxiecdisona 25-ramnosida; (5(alfa))-2-deoxi-21-hidroxiecdisona; 2-deoxi-20- hidroxiecdisona; 22-deoxi-26-hidroxiecdisona; 14-deoxi-20- hidroxiecdisona; 2-deoxi-21-hidroxiecdisona; 2-deoxi-20- hidroxiecdisona 25-acetato; 2-deoxi-20-hidroxiecdisona 22- acetato; (5(alfa))-2-deoxi-20-hidroxiecdisona 3-acetato; 2- deoxi-20-hidroxiecdisona 3-acetato; 2-deoxi-20- hidroxiecdisona 22-benzoato; e/ou 2-deoxi-20- hidroxiecdisona 3-crotonato.

[0062] O extrato de Rhaponticum pode compreender polifenóis (em particular, ácido gálico e polímero como procianidina B1).

[0063] O extrato de Rhaponticum pode compreender compostos fenólicos (em particular cinarina e ácido colorogênico).

[0064] O extrato de Rhaponticum pode compreender flavonóides, tal como patuletina, 6-hidroxicaempferol-7- glucosida, quercetagitrina, quercetina, quercetagetina, luteolina, caempferol, isorhamnetina, quercetina-3-metil éter, quercetina-5-o-β-D-galactosida, isorhamnetina 5-o-α- L-ramnosida, quercetagetina-7-o-β-glucopiranosida; apigenina, ariodictiol, eriodictiol-7-β-glucopiranosida, hesperina, crisantemina, Cianina.

[0065] O extrato de Rhaponticum pode compreender lignanas (cartamogenina, cartamosida, traqueelogenina, traquelosida).

[0066] O extrato de Rhaponticum pode compreender taninos (ácido elágico).

[0067] O extrato de Rhaponticum pode compreender serotonina fenilpropanoides.

[0068] O extrato de Rhaponticum pode compreender poliacetilenos.

[0069] O extrato de Rhaponticum pode compreender sesquiterpeno lactonas.

[0070] O extrato de Rhaponticum pode compreender triterpenoide glicosídeos (raponticosídeos A a H).

[0071] O extrato de Rhaponticum pode compreender triterpenoides (parkeol, parkeil acetato). EXTRATOS DE RHODIOLA

[0072] A presente divulgação também inclui um extrato de Rhodiola, uma planta que cresce em alta altitude tendo cerca de 200 espécies, incluindo R. rosea e R. crenulata (Kelly, Altern. Med. Rev. 6:293-302, (2001); Ming et al., Phytother. Res. 19:740-743, (2005)). Rhodiola rosea é um adaptógeno que ajuda o corpo a se adaptar e resistir a uma variedade de tensões físicas, químicas e ambientais.

[0073] O extrato de Rhodiola usado nas composições da presente divulgação pode ser feito de qualquer planta no grupo de Rhodiola rosea, Rhodiola crenulata, Rhodiola sachalinensis Rhodiola sacra, Rhodiola algida, Rhodiola dumulosa, Rhodiola kirilowii, Rhodiola henryi, Rhodiola yunannensis. Um extrato pode ser feito de qualquer porção da planta Rhodiola, no entanto, os extratos preparados da raiz e rizoma são particularmente úteis.

[0074] Espécies de Rhodiola podem conter fenilpropanoides, tal como rosavina ((2E)-3-fenilprop-2-en- 1-il 6-O-α-L-arabinopiranosil-α-D-glucopiranosida), rosina ((2R,3S,4S,5R,6R)-2-(hidroximetil)-6-[(E)-3-fenilprop-2- enoxi]oxano-3,4,5-triol) e rosarina ((2E)-3-fenil-2- propenil6-O-.alfa.-L-arabinofuranosil-(9CI);[(E)-3-Fenil-2- propenil]6-O-α-L-arabinofuranosil-β-D-glucopiranosida;[(E)- 3-Fenil-2-propenil]6-O-(α-L-arabinofuranosil)-β-D- glucopiranosida). Espécies Rhodiola podem também conter derivados de feniletanol, tal como salidrosida/rodiolosida (2-(4-hidroxifenil)etil β-D-glucopiranosida) e tirosol (4- (2-Hidroxietil)fenol). Espécies Rhodiola podem ainda conter flavonoides (por exemplo, rodiolina, rodionina, rodiosina, acetilrodalgina e tricina); monoterpernos (por exemplo, rosiridol e rosaridina); triterpenos (por exemplo, daucosterol e beta-sitosterol); ácidos fenólicos (por exemplo, ácidos clorogênico, hidroxicinâmicos e gálico); taninos, aminoácidos essenciais e minerais. Os ingredientes ativos como p-triosol, salidrosida, rosavina, piridrda, rodiosina e rodionina são encontrados na maioria das espécies Rhodiola, mas podem variar nas quantidades. Um ingrediente bioativo de interesse em Rhodiola rosea é salidrosida. Rosavinas (por exemplo, a soma de rosarina, rosina e rosavina) são outro constituinte bioativo identificado a partir da planta. Salidrosida e/ou rosavinas podem ser usadas como referências para determinação da qualidade das preparações.

[0075] Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende pelo menos cerca de 0,10% a 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de salidrosidas com base no peso seco total do extrato; mais preferivelmente pelo menos cerca de 1% a 4% de salidrosidas. Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende pelo menos cerca de 0,10% a cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de rosavina, mais preferivelmente pelo menos cerca de 2,0% a 5% de rosavina com base no peso total do extrato. Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende pelo menos cerca de 0,10% a cerca de 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% de rosavinas (por exemplo, a soma de rosarina, rosavina e rosina), mais preferivelmente pelo menos cerca de 3% a 6% ou 1 a 6% de rosavinas com base no peso total do extrato herbal. COMBINAÇÕES DE EXTRATO

[0076] Em algumas modalidades, o extrato de Rhodiola compreende cerca 1 a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% p/p (por exemplo, cerca de 1%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90% ou cerca de 99% p/p) com base no peso total da composição e o extrato de Rhaponticum compreende cerca de 99% a 1% p/p (por exemplo, cerca de 1%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% ou cerca de 99% p/p) com base no peso total da composição.

[0077] O extrato de Rhodiola pode compreender cerca de 50 a 99% p/p e o extrato de Rhaponticum compreende cerca de 1 a 50% p/p do peso total da composição. O extrato de Rhodiola pode compreender cerca de 1 a 50% p/p e o extrato de Rhaponticum compreende cerca de 50 a 99%) p/p do peso total da composição. Várias proporções de exemplo adequadas de Rhodiola e Rhaponticum são como se segue.

[0078] O extrato de Rhodiola pode ser de cerca de 90% p/p e o extrato de Rhaponticum é de cerca de 10% p/p do peso total da composição. O extrato de Rhodiola compreende cerca de 10% p/p e o extrato de Rhaponticum compreende cerca de 90% p/p do peso total da composição. O extrato de Rhodiola é de cerca de 60% p/p e o extrato de Rhaponticum é de cerca de 40% p/p do peso total da composição. O extrato de Rhodiola compreende cerca de 40% p/p e o extrato de Rhaponticum compreende cerca de 60% p/p do peso total da composição. O extrato de Rhodiola é de cerca de 50% p/p e o extrato de Rhaponticum é de cerca de 50% p/p do peso total da composição. Em algumas modalidades, a razão em massa de Rhaponticum e Rhodiola pode estar entre cerca de 60:40 e 80:20. Numa modalidade, a razão em massa de Rhaponticum e Rhodiola pode ser de cerca de 75:25.

[0079] Numa modalidade, são proporcionadas composições que compreendem um extrato de Rhodiola rosea (raiz) a cerca de 50% p/p e um extrato de Rhaponticum carthamoides (raiz) a cerca de 50% p/p com base no peso total dos componentes de extrato da composição. O extrato de Rhodiola contém 1 a 4% de salidrosidas, 2 a 5% de rosavina e 3 a 6% de rosavinas e o extrato de Rhaponticum contém 0,37% de 20HE e 0,78% de ecdiesteronas totais. Em algumas modalidades, a composição pode compreender cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteronas ou cerca de 0,5% a 3% de ecdiesteronas.

[0080] Qualquer combinação adequada das proporções dos extratos herbais de Rhodiola rosea e Rhaponticum carthamoides é contemplada como abrangida pelas composições aqui reveladas. As percentagens aqui fornecidas se referem à razão p/p do peso seco da porção de extrato sobre o peso total da composição. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[0081] Como aqui descrito, várias espécies de plantas, ervas ou porções das mesmas podem ser selecionadas como parte de composições e métodos para o tratamento de doença e promover o metabolismo muscular melhorado. Extratos dessas espécies podem ser preparados de várias formas adequadas. Numa modalidade, um extrato de plantas, ervas ou porções das mesmas, pode ser obtido via água e/ou álcool, ou ambos, e, então, secando até um pó fino. Em outra modalidade, a extração pode ser realizada via extração de CO2 supercrítica.

[0082] As composições da presente divulgação podem ser, por exemplo, na forma de formulações sólidas, líquidas ou em aerossol compreendendo pelo menos os dois extratos em quaisquer proporções (um ou mais dos extratos), como aqui divulgado. As composições da divulgação podem ainda compreender outros componentes, por exemplo, mas não se limitando a, vitaminas, produtos farmacêuticos ou excipientes adicionados a uma formulação numa quantidade de 0,1 a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% ou 10% p/p do produto final e as razões dos extratos podem, portanto, variar em conformidade. Tais composições podem ser fabricadas em várias formulações as quais são administradas a um mamífero para promover crescimento muscular e resistência muscular.

[0083] Numa modalidade, a composição inventiva está contida em cápsulas. As cápsulas adequadas para administração oral incluem cápsulas de encaixe feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas, moles feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes ativos em mistura com enchimento, tal como lactose, ligantes, tal como amidos, e/ou lubrificantes, tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes.

[0084] Os líquidos para administração podem ser soluções ou suspensões. Em um exemplo, a composição da invenção é fornecida como um pó seco. O sujeito dissolve ou suspende o pó numa bebida de escolha (por exemplo, água, refrigerante, suco de fruta, etc.) e, então, consome essa bebida. Alternativamente, as composições inventivas são fornecidas na forma líquida. No caso de comprimidos, substâncias moldadas ou as cápsulas, a forma de dosagem deve ser adaptável a dosagem desigual. Unidades tendo diferentes níveis de dose podem ser pré-embaladas, por exemplo, em embalagens de blister, e rotuladas para o tempo de ingestão. Os intervalos podem ser BID, TID, QID ou mais frequentes. No caso de cápsulas, um ou mais pellets de ação retardada podem ser incluídos com contas de longa ação. Sem dúvida, existem outras formas alternativas para formular. Como um exemplo, micropartículas de longa ação e quantidades adequadas de uma ou mais quantidades de partículas com micropartículas de ação mais retardada podem ser misturadas e encapsuladas. Substratos de matriz podem ser utilizados para formar 2, 3 ou 4 comprimidos de múltiplas camadas ou comprimidos revestidos prensados. Comprimidos revestidos prensados podem ter núcleos de ação retardada. Comprimidos de múltiplas camadas e revestidos prensados diferentemente formulados que podem incluir comprimidos revestidos e não revestidos embalados para especificar tempo de uso, podem ser utilizados. Micropartículas de longa ação e de ação retardada podem igualmente ser suspensas em fluidos parenterais para fornecer dosagem não uniforme.

[0085] Em algumas modalidades, um extrato, tal como secando e pulverizando uma dessas espécies selecionadas, pode ser preparado. De acordo com outras modalidades, um extrato pode ser concentrado antes de secar, o que pode ser desejável para reduzir o volume do extrato. Tais concentrações podem reduzir o volume do extrato, embora preservando o espectro completo de características e níveis de compostos marcadores da planta, erva nativa ou porção da mesma.

[0086] Em modalidades adicionais, uma técnica de processamento de água de baixa temperatura pode ser usada. Tal processo pode ser desejável porque ele pode capturar uma grande porção de constituintes de apoio como polissacarídeos, flavonoides, terpeno e voláteis valiosos, óleos e resinas (parte dos quais são tipicamente capturados apenas por álcool ou hexano, ambos os quais deixam traços indesejados). O material de planta extraído pode, então, ser concentrado e o líquido concentrado pode ser secado utilizando, por exemplo, um secador de pulverização de ultra-alta velocidade que produz um pó fino, ou semelhantes. Em algumas modalidades, a concentração do extrato herbal a ser seco até um pó pode reduzir o volume do pó herbal sem mudar substancialmente a composição de partes constituintes da planta. Tal método pode ser desejável para reduzir traços químicos indesejados que podem ser introduzidos no material herbal e um pó herbal mais puro, de amplo espectro pode, portanto, ser obtido. Por exemplo, as razões de concentrações de 10 para 1 a 20 para 1 podem ser obtidas, o que pode reduzir significativamente o volume do material e proporcionar dosagem conveniente em cápsulas.

[0087] “Transportador farmaceuticamente aceitável” é uma substância que pode ser adicionada aos ingredientes ativos para ajudar a formular ou estabilizar a preparação e não provoca efeitos toxicológicos adversos significativos no paciente. Exemplos de tais transportadores são bem conhecidos dos peritos na arte e incluem água, açúcares, tal como maltose ou sacarose, albumina, sais, tal como cloreto de sódio, etc. Outros transportadores são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences por E. W. Martin, aqui incorporado por referência. Essas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz de extratos de Rhodiola e Rhaponticum.

[0088] Transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na arte. A composição é preferencialmente formulada para ingestão oral. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração de droga. O transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes) e misturas adequadas dos mesmos. Em alguns casos, ele incluirá agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tal como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio, na composição.

[0089] Como aqui utilizado, “transportadores”, como aqui utilizado, incluem transportadores, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis que são não tóxicos para a célula ou o mamífero sendo exposto aos mesmos nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o transportador fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa. Exemplos de transportadores fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tal como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tal como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tal como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tal como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal, tal como sódio; e/ou surfactantes não iônicos, tal como TWEEN, polietileno glicol (PEG) e PLURONIC.

[0090] Transportadoras farmaceuticamente aceitáveis também incluem transportadores naturais e não naturais, tal como maltodextrina, goma arábica (E414), dióxido de silício (E551), dextrina de tapioca, dextrinas, goma acácia e semelhantes.

[0091] A invenção também inclui formulações sintéticas tendo os mesmos ingredientes ativos, nas mesmas proporções, conforme listado acima. Estes ingredientes podem ser purificados ou sintetizados e ser incluídos nas composições e formulações sem a inclusão de qualquer outro material de planta ocorrendo naturalmente que esteja normalmente presente num extrato.

MÉTODOS PARA USO

[0092] O extrato de Rhodiola pode ser usado para aumentar a síntese de proteína e diminuir expressão de gene de miostatina e/ou atrogina em células do músculo esquelético. O extrato de Rhaponticum pode ser usado para aumentar a síntese de proteína, aumentar a fosforilação de membros da via Akt, aumentar a fosforilação S6K1 e/ou reduzir a expressão de gente de miostatina e/ou atrogina em células do músculo esquelético.

[0093] Numa outra modalidade, a combinação de extratos de Rhodiola e Rhaponticum pode ser administrada em quantidades que intensificam suas funções em comparação com aquelas de cada um quando administrados sozinhos.

[0094] Em ainda outro aspecto, um método para melhorar a massa muscular e a resistência muscular num mamífero é fornecido, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição aqui descrita. O mamífero é preferencialmente um humano, mais preferivelmente um atleta. Em um aspecto adicional da divulgação, um método para promover desempenho esportivo/físico aeróbico e anaeróbico num mamífero é fornecido, compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição aqui divulgada. Em ainda outro aspecto, um método para tratar condições associadas com ou caracterizadas por atrofia muscular num mamífero é fornecido compreendendo administrar ao mamífero uma quantidade eficaz da composição aqui descrita.

[0095] Em algumas modalidades, a composição é administrada oralmente a um mamífero, preferivelmente um humano, numa dose diária de cerca de 1 a 5.000 mg/dia, preferencialmente a cerca de 30 a 1.000 mg/dia, mais preferencialmente cerca de 50 a 1.000 mg/dia e ainda mais preferivelmente cerca de 100 a 600 mg/dia ou 200 a 500 mg/dia. Doses mais baixas de cerca de 0,5 mg/dia ou uma dose mais alta que 5.000 mg/dia podem ser fornecidas. Em algumas modalidades, múltiplas doses diárias de 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou mais mg por dose são fornecidas.

[0096] Intervalos de dosagem são convencionalmente QD (uma vez ao dia), BID (duas vezes ao dia), TID (três vezes ao dia), QID (quatro vezes ao dia) ou mais frequentes, incluindo 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais doses ao dia. O tempo de administração pode ser com base na meia-vida, na formulação da forma de dosagem sendo utilizada, na reatividade sistêmica, na conveniência, se autoadministrada ou em regimes e se a substância é terapêutica, nutricional, esteroidal ou anti-infecciosa.

[0097] A menos que uma composição seja liberada por controle, ou tenha uma meia-vida longa permitindo administração QD, o intervalo de tempo entre a ingestão de doses pode ser irregular. Por exemplo, se uma substância é ingerida ao levantar e ao deitar, os intervalos são, provavelmente, de 16 e 8 horas. Se tomada ao levantar, ao meio-dia e ao deitar, os intervalos podem ser 5, 11 e 8 horas. Se tomada regularmente espaçada durante as horas acordado, os intervalos podem ser de 5,33, 5,33, 5,33 e 8 horas. Em tais casos, a dosagem racional deve ser uniforme para ser consistente com intervalos de tempo irregulares.

[0098] Nutracêuticos e certas drogas e esteroides, antibióticos e substâncias semelhantes podem mais bem tomados com o estômago cheio. Tais intervalos durante o dia podem ser irregulares e o tempo entre a última dose diária e a próxima dose matinal diferente.

[0099] Para a prevenção ou tratamento de doença ou promoção da função corporal melhorada, a dosagem apropriada de um agente ativo dependerá do tipo de doença a ser tratada ou da função de alvo, como definido acima, da gravidade e do curso da doença, se o agente é administrado para fins preventivos ou terapêuticos, da terapia anterior, do histórico clínico do sujeito e da resposta ao agente, e da discrição do médico assistente. O agente é adequadamente administrado ao sujeito de uma só vez ou durante uma série de tratamentos. Dosagens e concentração de droga desejada das composições podem variar dependendo da utilização particular vislumbrada. A determinação da dosagem ou rota de administração adequada está bem dentro da perícia de um versado na técnica. Experimentos em animais proporcionam orientação confiável para a determinação de doses eficazes para terapia humana. Consequentemente, uma “quantidade eficaz” de qualquer composição ou formulação particular, de acordo com esta divulgação, variará com base nas circunstâncias particulares e uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada em cada caso de aplicação por um versado na técnica utilizando apenas experimentação de rotina a fim de alcançar o efeito desejado.

[00100] Como aqui usados, os termos "tratar", "tratamento", "terapia" e semelhantes, como aqui utilizados, se referem a terapia curativa, terapia profilática e terapia preventiva, incluindo terapia de sujeitos saudáveis. Um exemplo de "terapia preventiva" é a prevenção ou diminuição de condição ou distúrbio patológico alvo. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com o distúrbio assim como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles em quem o distúrbio será prevenido. Administração “crônica" se refere a administração do(s) agente(s) num modo contínuo em oposição a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo prolongado. Administração "intermitente" é um tratamento que não é feito consecutivamente sem interrupção, mas, ao invés disso, é de natureza cíclica. Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui administração simultânea (concorrente) e consecutiva em qualquer ordem. Em algumas modalidades, as composições e os métodos aqui divulgados podem ser utilizados para tratar condições associadas com ou caracterizadas por atrofia muscular incluindo sarcopenia, obesidade sarcopênica, um câncer, esclerose múltipla, distrofia muscular, uma fratura óssea requerendo imobilização (por exemplo, tala ou gesso), esclerose lateral amiotrófica (ALS), uma neuropatia periférica, acidente vascular cerebral, caquexia ou similares. Tais condições podem ser idiopáticas, secundárias a uma condição diagnosticada, ou algo semelhante.

[00101] Conforme aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é a quantidade mínima de agente ativo (por exemplo, uma composição compreendendo extratos de Rhodiola e Rhaponticum) que é necessária para conferir o benefício terapêutico a um sujeito. Por exemplo, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" para um sujeito que sofre ou é propenso a sofrer, ou para evitar que ele sofra é uma quantidade tal que induz, melhora ou de outro modo causa uma melhoria dos sintomas patológicos, da progressão da doença, das condições fisiológicas associadas com ou resistência a sucumbir ao distúrbio acima descrito.

[00102] Os exemplos seguintes são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas divulgadas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas para funcionar bem e, assim, podem ser consideradas como constituindo modos preferidos para a sua prática. Os versados na técnica, no entanto, devem, à luz da divulgação, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas que são reveladas e ainda obter um resultado igual ou semelhante sem afastamento do espírito e do escopo das modalidades. PREPARAÇÃO DE EXTRATO

[00103] Os extratos podem ser preparados usando um processo de extração de solvente orgânico. Por exemplo, raízes de Rhaponticum carthamoides podem ser moídas (por exemplo, até um tamanho de malha 4 mm) e o material moído misturado com um solvente incluindo, mas não se limitando a, 100% de água, etanol 1% a 99% em água (v/v), metanol 1% a 99% em água (v/v), acetato de etila, acetona, hexano ou qualquer outro solvente orgânico convencionalmente utilizado para extração (por exemplo, EtOH 50%) num reator ou qualquer recipiente tendo uma função de extração. Uma razão adequada de solvente:planta está entre cerca de 1:1 a 30:1, mais preferivelmente entre 5:1 e 15:1 (por exemplo, 10: 1 (v/p)). A matéria-prima é extraída, por exemplo, sob refluxo com agitação, mas pode ser por meio de maceração, com ou sem refluxo, com ou sem agitação e com ou sem pressão aplicada. A temperatura de extração geralmente dependerá do solvente utilizado. O tempo de extração é, de preferência, de pelo menos 1h (por exemplo, 1h e 30 min.).

[00104] Após o tempo de extracção, a mistura pode ser filtrada ou centrifugada a fim de separar o líquido da fase sólida (torta). Na etapa de filtração, filtros de 25 mícrons podem ser usados.

[00105] A etapa de extração pode ser repetida mais vezes para conseguir mais de uma cobertura (por exemplo, repetida 2 vezes para atingir um total de 3 coberturas) e os filtrados combinados. A fase sólida é descartada.

[00106] Os filtrados combinados podem ser concentrados sob vácuo (por exemplo, 0,8 Pa) até entre 30% e 70% DM (de preferência 50% DM). Pode ser utilizado qualquer tipo de sistema de evaporação de solvente. O passado de extração resultante é chamado de "extrato nativo”.

[00107] O extrato nativo é, então, seco até um teor %DM de cerca de 90% a 99% (por exemplo, 97%), mas pode ser seco até uma %DM mais baixa. Esta etapa pode ser realizada por qualquer processo de secagem incluindo, mas não se limitando a, atomização, secagem a ar, secagem em forno, secagem ao sol, etc. com ou sem transportador. Exemplo 1: Extração de Rhaponticum com Etanol 50% (v/v) (F0).

[00108] Uma versão esquemática do seguinte processo de extração é mostrada na FIG. 29a. A erva em bruto Rhaponticum (raiz, 65 kg em base seca) foi pesada e moída em pó grosso. O pó foi colocado em uma câmara de extração/um reator e 700 L de etanol a 50% em água (v/v, 50% de álcool) foram adicionados à matéria-prima, o que é uma razão aproximada de 10:1 (v/p)). A mistura foi aquecida sob refluxo com agitação por 1,5 horas a uma temperatura de 80 a 90°C. Após 1,5 horas, o líquido foi filtrado e mantido de lado. O resíduo (fase sólida) foi recuperado e a etapa de extração foi repetida mais duas vezes (para alcançar um total de três coberturas).

[00109] Os filtrados foram combinados antes de serem concentrados sob vácuo (0,8 Pa) até 30 a 60% DM (por exemplo, 39% DM). Um total de 25 kg da pasta de concentração (denominado "extrato nativo F0") foi obtido e analisado quanto a ingredientes bioativos.

[00110] Neste processo, o etanol pode ser recoletado do filtrado e reusado na etapa de extração, assegurando que o solvente esteja sempre a 50% de álcool.

[00111] A pasta de extração concentrada foi, então, secada por atomização para produzir um pó seco (menos de 10% de umidade) (F0-EtOH 50% em pó seco). Uma amostra de pó seco foi obtida e usada para análise de ingrediente biaotivo, análise microbiana, análise de metais pesados, análise de pesticidas e análise nutricional. Exemplo 2: Etapas de centrifugação e filtração (F0 como representado na Fig. 29a)

[00112] 12 kg de extrato nativo de Rhaponticum (a 39% DM) preparado de acordo com o Exemplo 1 foram diluídos com água até 10% DM, então, centrifugados. O rendimento foi de 43 kg de extrato nativo diluído a aprox. 10% DM (F0-nativo diluído e centrifugado).

[00113] Em 42 kg deste extrato nativo diluído (a 10% DM) foi realizada ultrafiltração (UF) a 5 kDa, então, a 1 kDa para obter 3 frações: >5 kDa, 1 a 5 kDa e <1 kDa. As frações foram secas sob vácuo ou atomização (o rendimento foi 1,55 kg, 0,90 kg e 1,15 kg, respectivamente) (UF F0- nativo). A amostra foi enviada para análise bioativa. Exemplo 3: Etapas de purificação (F5’ como representado na Fig. 29a)

[00114] 1 kg de extrato nativo diluído de Rhaponticum (a aprox. 10% DM) preparado de acordo com o Exemplo 2 (F0- nativo diluído e centrifugado) foi purificado em uma coluna de resina adsorvente D-101 (volume de resina de 1 L). O eluato foi concentrado e seco para dar um pó fino ((14,5 g de pó de extrato purificado obtidos) (F5’-purificado EtOH 50% de extrato). Exemplo 4: Processo de extração de Rhaponticum com Etanol 70% (v/v) (F5 & F7).

[00115] Uma quantidade conhecida de raiz de Rhaponticum moída até pó grosso foi misturada com água a uma razão solvente:planta de 10:1 (v/p) e extraída sem refluxo a 80°C por 2 h. Uma única extração foi feita. A fase sólida foi descartada e a fase líquida é recuperada e filtrada até 25 μm.

[00116] Parte do filtrado foi concentrada usando um evaporador Rota para remover a maior parte do solvente e finalmente seca sob vácuo até <10% de umidade. O extrato era um pó (F7: EtOH 70% de extrato).

[00117] A outra parte do filtrado foi purificada em coluna de resina adsorvente como descrito no Exemplo 3, concentrada e seca sob vácuo até <10% de umidade. O extrato era um pó (extrato ETOH 70% purificado F5).

[00118] Exemplo 5: Processo de extração de Rhaponticum com água (F1 & F3)

[00119] O mesmo procedimento foi repetido como no Exemplo 4, exceto que água foi usada em vez de EtOH 70%.

[00120] Uma quantidade conhecida de raiz de Rhaponticum moída até pó grosso foi misturada com água a uma razão solvente:planta de 10:1 (v/p) e extraída sem refluxo a 80°C por 2 h. Uma única extração foi feita. A fase sólida foi descartada e a fase líquida foi recuperada e filtrada até 25 μm.

[00121] Parte do filtrado foi concentrada usando um evaporador Rota para remover a maior parte da água e finalmente seca sob vácuo até <10% de umidade. O extrato era um pó (F1: Extrato aquoso).

[00122] A outra parte do filtrado foi purificada em coluna de resina adsorvente como descrito no Exemplo 3, concentrada e seca sob vácuo até <10% de umidade. O extrato era um pó. (Extrato aquoso purificado F3). Exemplo 6: Processo de extração de Rhaponticum com acetona (F2 & F4)

[00123] O mesmo procedimento foi repetido como no Exemplo 4, exceto que acetona foi usada em vez de EtOH 70%:

[00124] Uma quantidade conhecida de raiz de Rhaponticum moída até pó grosso foi misturada com acetona a uma razão solvente:planta de 10:1 (v/p) e extraída sem refluxo a 80°C por 2 h. Uma única extração foi feita. A fase sólida foi descartada e a fase líquida foi recuperada e filtrada até 2 5 μm.

[00125] Parte do filtrado foi concentrada usando um evaporador Rota para remover a maior parte do solvente e finalmente seca sob vácuo até <10% de umidade. O extrato era um pó. (F2: Extrato de acetona).

[00126] A outra parte do filtrado foi purificada em coluna de resina adsorvente, concentrada e seca sob vácuo até <10% de umidade. O extrato era um pó. (Extrato de acetona purificado F4). Exemplo 7: Preparação de extrato herbal de Rhodiola rosea

[00127] Material de Rhodiola rosea seco foi extraído utilizando álcool aquoso. Por exemplo, em algumas preparações, foi preferido etanol aquoso a 50% ou etanol a 70%. O extrato obtido foi, então, filtrado e o sobrenadante foi concentrado. O extrato filtrado foi centrifugado e o sobrenadante límpido foi purificado por coluna. O etanol foi usado para eluir a coluna. A eluição de etanol obtida foi, então, concentrada. Algumas preparações incluíram uma etapa de secagem opcional. Exemplo 8 Dosagem de salidrosidas e rosavinas totais em extrato herbal de Rhodiola rosea

[00128] A quantidade de vários compostos, incluindo salidrosidas e rosavinas totais (rosarina, rosavina e rosina), foi determinada em extrato de raiz de Rhodiola rosea usando o método HPLC desenvolvido por: M. Ganzera et al., “Analysis of the marker compounds of Rhodiola rosea L. (Golden root) by reversed phase high performance liquid chromatography” Chem. Pharm. Bull. 49(4) 465 - 467 (2001). Resumidamente, a quantificação de compostos alvo foi realizada num sistema de HPLC HPLC Agilent 1100 equipado com um detector de UV. A separação dos compostos foi realizada em coluna de HPLC ACE C18 (250 x 4, 6 mm, 5 μm) ajustada em 45°C. A fase móvel consistiu em acetonitrila (eluente A) e tampão Fosfato pH 7 (eluente B). O gradiente foi como a seguir: 11% isocrático A (10 min), 11-30% A (20 min), 30-80% A (5 min), 80% isocrático A (10 min), 80-11% de A (5 min). O tempo de passagem total foi de 50 min. O volume de injeção foi de 5 μL e taxa de fluxo foi de 1 mL/min. Monitoramento de UV foi efetuado a 225 nm para detecção salidrosidas e 250 nm para detecção de rosavinas. A quantidade de compostos alvo foi quantificada comparando área de pico da amostra com área de pico do composto de referência de concentração conhecida. Tabela 1: Salidrosidas e rosavinas totais (rosarina, rosavina e rosina) em extrato de raiz de Rhodiola rosea.

Exemplo 9: Análise de 20HE nos diferentes extratos de raiz de Rhaponticum

[00129] A quantidade de beta-ecdisona (20HE) nos diferentes extratos de Rhaponticum preparados como nos Exemplos 1 a 6 foi determinada utilizando um sistema de HPLC Agilent 1100 equipado com um detector de UV-Vis. A separação do composto foi realizada numa coluna HPLC Zorbax Eclipse Plus C18 (2,1 x 50 mm-1,8 mícron) com temperatura de coluna ajustada a 35°C. A fase móvel consistia em metanol (eluente A) e 0,1% de ácido fórmico em água (eluente B). A taxa de fluxo foi de 0,4 mL/min. O gradiente foi linear com rampa de 10 a 100% A em 15 min. O volume de injeção foi de 2 μL. O monitoramento de UV foi efetuado a 250 nm, bw 8 nm. A quantidade de compostos alvo foi quantificada comparando área de pico da amostra com área de pico do composto de referência de concentração conhecida. Tabela 2: Concentração de 20-Hidroxiecdisona (20-HE) nas diferentes frações de Rhaponticum carthamoides extraídas com etanol (50%), etanol (70%), água ou acetona com ou sem purificação subsequente em coluna.

*valores são expressos na amostra como analisada e não em base seca Exemplo 10: Análise de ecdiesteroides de extrato de raiz de Rhaponticum etanólico

[00130] O extrato seco de raiz de Rhaponticum carthamoides (F0- EtOH 50% pó seco) foi obtido por extração com etanol 50% (v/v) em água como descrito no Exemplo 1. A identificação de ecdisteroides foi realizada utilizando um sistema de HPLC equipado com um Detector de Matriz de Fotodiodo. A separação foi realizada numa coluna HPLC C18 Atlantis (150 x 3 mm -3 μm) ajustada a 40°C. A fase móvel consistia em metanol com 0,1% de ácido acético (v/v, eluente A) e 0,1% (v/v) de ácido acético em água (eluente B). A taxa de fluxo foi de 0,6 mL/min. O programa de gradiente foi como se segue: 20% isocrático A (5 min), 2040% A (25 min), 40-70% A (15 min), 70-85% A (15 min). O tempo de passagem total é de 60 min. O monitoramento foi realizado a 242 nm. Tabela 3: Ecdiesteroides identificados em extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides etanólico (50% v/v) seco até a forma de pó (umidade <10%)

Nq: não quantificável Total de ecdiesteronas (como 20- Hidroxiecdisona)= 0,788%.

[00131] Um total de 19 ecdisteroides foi identificado no extrato de raiz de Rhaponticum. Alguns eram identificáveis apenas por suas estruturas químicas. Exemplo 11: Análise fitoquímica e fisicoquímica de extrato etanólico de extrato de raiz de Rhaponticum etanólico (excluindo ecdiesteroides)

[00132] O extrato seco de raiz de Rhaponticum carthamoides (F0- EtOH 50% pó seco) foi obtido por extração com etanol 50% (v/v) em água como descrito no Exemplo 1 e analisado quanto a fitocompostos que não ecdiesteroides e análise química. Gráficos de fenóis totais, ácidos orgânicos totais e total de carboidratos livres identificadas na composição estão representados nas Figs, 1a, 1b e 2. Tabela 4: Análise física (espectrofotometria e gravimetria) de extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides etanólico (50% v/v) seco até a forma de pó.

Total de Cinzas, Fibra, proteína, água e resultados de HPLC/GC dão 70,6% do extrato identificado, compostos tais como tiofenos de acetileno e esterol são encontrados em baixas quantidades (identificadas, mas não quantificadas). MÉTODOS DE USAR EXTRATOS DE RHAPONTICUM E RHODIOLA

[00133] Os exemplos seguintes avaliaram o efeito de extrato de Rhaponticum e do extrato de Rhodiola, sozinhos e em combinação, sobre a síntese de proteína e vias de sinalização metabólicas. EXEMPLO 12: Fosforilação de S6K1 em treonina 389 e de Akt em treonina 308 de diferentes preparações de extratos de Rhaponticum carthamoides (ETAPA 1 como representada na Fig. 29a)

[00134] Um estudo foi projetado para avaliar a capacidade do extrato de Rhaponticum estimular a síntese de proteína e vias metabólicas no nível de Akt. A serina/treonina cinase Akt (proteína cinase B) é ativada por uma variedade de estímulos através de fosforilação em Thr308 e Ser473. Uma vez que Akt fosforilada migra para o núcleo onde ela está envolvida numa variedade de processos celulares, tal como o transporte de glicose, a síntese de proteína ou de lipídeos e o armazenamento de triglicerídeos.

[00135] A capacidade do extrato de Rhaponticum estimular a síntese de proteína no nível de S6 cinase 1 também foi avaliada. A sp70 S6 cinase é uma proteína citoplasmática ubíqua que é ativada em resposta a citocinas. Ela se encontra a jusante da via mTOR/PI3K e é fosforilada em múltiplos resíduos, incluindo treonina 389. A fosforilação de Thr389, no entanto, mais estreitamente se correlaciona com a atividade de p70 cinase in vivo. Uma vez ativada, a p70 S6 cinase fosforila a proteína S6 na proteína ribossomal 40S (rpS6) que leva ao processo de síntese de proteína.

[00136] Células C2C12 foram originalmente obtidas por Yaffe e Saxel (1977) através de passagem em série seletiva de mioblastos cultivados do músculo da coxa de camundongos C3H 70 h após uma lesão por esmagamento (Yaffe D, 1977). Estas células mostraram ser capazes de diferenciação. Células C2C12 são um modelo útil para estudar a diferenciação de células miogênicas em células do músculo esqueletal (por exemplo, mecanismos de fosforilação da miosina) e expressar proteínas do músculo e o receptor de andrógeno.

[00137] Foram preparadas cinco preparações diferentes de extrato de Rhaponticum: extrato de etanol 50%, extrato de etanol 70%, extrato de água 100%, bem como extratos purificados em coluna (exceto para EtOH 50%), como descrito nos Exemplos 1 a 5 da presente divulgação. Tabela 5: Preparações de Rhaponticum

[00138] As concentrações testadas para cada preparação de extrato de Rhaponticum foram preparadas a fim de ter uma concentração final em hidroxi-ecdisona de 0,1 μM, 1 μM e 10μM. Com base na concentração de hidroxi-ecdisona medida em cada extrato, as concentrações utilizadas para cada preparação de Rhaponticum foram como se segue: Tabela 6:

[00139] No início do estudo, o valor da % de hidroxi- ecdisona por extrato F0 não foi determinada e a concentração final testada foi baseada na concentração de hidroxil-ecdisona no extrato F7. No entanto, a concentração desta ecdisona no F0 foi superestimada. Esta é a razão pela qual a concentração final de hidroxi-ecdisona testada para o extrato F0 era diferente das outras frações.

[00140] Células em crescimento foram colhidas e plaqueadas a uma densidade de 170.000 células por poço em uma placa de 6 poços. As células foram crescidas por 48 h em 5% de CO2 a 37°C. Após as células atingirem 80% de confluência, o meio foi substituído por meio de diferenciação (DMEM + 2% FBS). Após 5 dias, mioblastos foram fundidos em miotubos multinucleados. 1h antes de iniciar o experimento, as células foram incubadas em meio de Krebs para privar células de aminoácidos.

[00141] As células foram tratadas com cinco preparações de extrato de planta de Rhaponticum a 3 concentrações na presença de concentração normal (0,8 mM) ou baixa (0,08mM) de aminoácidos e com DMSO a 0,002% por 2 h.

[00142] No final do experimento, as células foram lisadas em tampão de lisado de célula (100μL por poço) e centrifugadas para isolar a proteína solúvel no sobrenadante. As proteínas deste ensaio celular foram quantificadas utilizando um ensaio colorimétrico derivado de método de LOWRY. Assim, 50μg de proteína total em 100μL de tampão de lise foram transferidos para tiras de micropoços revestidas com anticorpo pS6K1 ou pAkt e incubados 2 h a 37°C. Após várias lavagens, adicionou-se o anticorpo de detecção e incubou-se 1h a 37°C. Mais uma vez, várias lavagens foram processadas e foi adicionado anticorpo secundário ligado a HRP. No final da incubação de 30 min a 37°C, o substrato de TMB (3,3’,5,5’- Tetrametilbenzidina) foi adicionado e uma cor azul foi desenvolvida em poços positivos. Para evitar a saturação de sinal foi adicionada uma solução de parada que induz uma cor amarela. A intensidade da cor amarela foi legível num espectrofotômetro a 450 nm e diretamente proporcional à quantidade de pS6K1 ou Akt detectada.

[00143] Cada condição é testada em n=5 ou n=6. IGF1 100 ng/ml foi usado como um controle positivo.

[00144] Os resultados de Akt fosforilada são expressos em absorbância por μg de proteína (Abs/μg de proteína), após 2 h de incubação e em % de condição de controle não tratado (100%).

[00145] Os resultados de T389 S6 cinase 1 fosforilada são expressos em absorbância por μg de proteína (Abs/μg de proteína), após 2 h de incubação e em % de condição de controle não tratado (100%).

[00146] Todos os resultados expressos em % de controle não tratado. As diferenças entre valores obtidos foram avaliadas por ANOVA para medições repetidas seguida por um teste t de Dunnett, se ANOVA revelasse diferenças significativas por um teste de U-Mann-Whitney para comparar controles não tratados versus IGF1 ou extratos de plantas; * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 versus o controle não tratado.

[00147] Todos os resultados são dados como média ± SEM. Para todos os parâmetros avaliados análises estatísticas foram realizadas utilizando um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn (GraphPad PRISM®4). A comparação entre duas condições foi realizada utilizando um teste de Mann Whitney. Um valor de p de 0,05 foi considerado como significativo.

[00148] O fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1) é estabelecido como um fator anabólico que pode induzir o crescimento do músculo esquelético ativando a fosfoinositida 3-cinase (PI3K)/Akt/via do alvo mamífero da rapamicina (mTOR). A estimulação da fosforilação de ambos S6K1 e Akt já foi relatada por Miyazaki et al. (Miyazaki M, 2010). Portanto, o IGF-1, foi escolhido como um controle positivo do experimento. A fosforilação basal de S6K1 foi quatro vezes mais alta na presença de concentrações normais de aminoácidos do que na presença de baixa concentração de aminoácidos (0,8 mM vs 0,08mM).

[00149] Na presença de baixa concentração de aminoácidos todas as frações testadas, exceto F7, em todas as doses testadas aumentaram a fosforilação de S6K1 (Ver Figs 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6a, 6b, 7a e 7b). Os efeitos não foram dependentes da dose nas doses testadas.

[00150] Na presença de concentração normal de aminoácidos a dose mais baixa de cada fração, exceto F3, e a concentração intermediária de F0, F3 e F5 estimularam a fosforilação de S6K1 (Ver Figs 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6a, 6b, 7a e 7b). Os efeitos observados foram mais baixos do que aqueles observados com IGF-1 e foram significativos apenas para as frações F0, F1 e F3 (doses mais baixas ou intermediárias). Tem que ser observado que sob a condição de solubilidade parcial do extrato de F7 de concentrações intermediárias e altas testadas, uma queda na fosforilação de S6K1 foi relatada. Figs 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b, 6a, 6b, 7a e 7b: Determinação de fosforilação de S6K1 em treonina 389 em miotubos C2C12 após incubação com 5 diferentes preparações de extrato de Rhaponticum a três concentrações.

[00151] Cinco preparações diferentes de extrato de Rhaponticum a três concentrações foram incubadas por 2 h na presença de miotubos C2C12 diferenciados. No final da incubação as células foram lisadas, as proteínas solúveis totais foram quantificadas e o nível de fosforilação de S6K1 em resíduo treonina 389 foi medido e normalizado para a proteína beta-actina. Média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs valor de controle.

[00152] O IGF-1 foi previamente relatado estimular fosforilação de Akt e foi neste contexto escolhido como uma referência positiva no ensaio (Miyazaki M, 2010). Depois da incubação de IGF-1 (100ng/mL, 2h), fosforilação de Akt foi ativada por um fator de 1,6 para. Resultados semelhantes foram anteriormente publicados para fosforilação de Akt por Latres ou Miyazaki (Latres E, 2005) (Miyazaki M, 2010).

[00153] Na presença de concentração de aminoácido baixa ou normal, observou-se uma estimulação não significativa de fosforilação de Akt para todas as diferentes frações testadas na dose mais baixa, exceto para a fração F0 incubada com baixa concentração de aminoácido e F3 incubada com concentração de aminoácido normal, em que um aumento não significativo foi observado com a dose intermediária.

[00154] Foi notado que o nível basal de fosforilação de Akt foi duas vezes mais alto na presença de condição de aminoácido normal em comparação com a condição de aminoácido baixa. Por fim, sob condição de solubilidade parcial dos extratos F1 (concentração alta) ou F7 (concentrações intermediária e alta), uma queda na fosforilação de Akt foi documentada qualquer que seja a concentração de aminoácidos usada.

[00155] Figs 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 10b, 11a, 11b, 12a, 12b: Determinação de fosforilação de Akt em treonina 308 em miotubos C2C12 após incubação com 5 diferentes preparações de extrato de Rhaponticum a três concentrações.

[00156] Cinco preparações diferentes de extrato de Rhaponticum a três concentrações foram incubadas por 2 h na presença de miotubos C2C12 diferenciados. No final da incubação as células foram lisadas, as proteínas solúveis totais foram quantificadas e o nível de fosforilação de Akt em resíduo treonina 308 foi medido e normalizado para a proteína beta-actina. Média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs valor de controle. EXEMPLO 13: Efeito de 5 diferentes preparações de extratos de Rhaponticum carthamoides em síntese de Proteína (incorporação de leucina tritiada) em miotubos C2C12 (ETAPA 1 como representada na Fig. 29a)

[00157] Um estudo foi projetado para avaliar a capacidade do extrato de planta estimular a síntese de proteína medindo a incorporação da leucina tritiada. Células de C2C12 e as cinco preparações diferentes de extratos de Rhaponticum foram preparadas como no Exemplo 12.

[00158] Para o ensaio de síntese de proteína, células em crescimento foram colhidas e plaqueadas a uma densidade de 30.000 células por poço em uma placa de 24 poços. As células foram crescidas por 48 h em 5% de CO2 a 37°C. Após as células atingirem 80% de confluência, o meio foi substituído por meio de diferenciação (DMEM + 2% FBS). Após 5 dias, mioblastos foram fundidos em miotubos multinucleados. A síntese de proteínas foi determinada medindo a incorporação da leucina de aminoácido tritiada. Resumidamente, 1h antes do desafio de leucina as células foram incubadas em meio livre de aminoácido. Então, as células foram incubadas por 2h30 na presença de: leucina radiomarcada 5μCi/mL e IGF1 100ng/mL ou extrato de planta na presença de concentração normal (0,8 mM) ou baixa (0,08mM) de aminoácidos e com DMSO a 0,002%.

[00159] Todos os resultados expressos em % de controle não tratado. As diferenças entre valores obtidos são avaliadas por ANOVA para medições repetidas seguida por um teste t de Dunnett, se ANOVA revelar diferenças significativas por um teste de U-Mann-Whitney para comparar controles não tratados versus IGF1 ou extratos de plantas; * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001 versus o controle não tratado.

[00160] Todos os resultados são dados como média ± SEM. Para todos os parâmetros avaliados análises estatísticas foram realizadas utilizando um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn (GraphPad PRISM®4). A comparação entre duas condições foi realizada utilizando um teste de Mann Whitney. Um valor de p de 0,05 foi considerado como significativo.

[00161] IGF1 induziu a síntese de proteína na presença de concentração baixa (+45%, p<0,001) ou normal (+21%, p <0,001) de aminoácidos. O teste foi validado, uma vez que dados com IGF-1 sobre a síntese de proteína são semelhantes aos dados relatados na literatura que descrevem um aumento na síntese de proteína de 20 a 50% na presença de IGF1 com concentração baixa ou normal de aminoácidos (Kazi AA, 2010) (Broussard SR, 2004). Notou-se que a incorporação de radioatividade foi mais alta na presença de concentração de aminoácido baixa, indicando que a competição entre leucina radioativa e leucina fria foi mais fraca do que na presença de concentração normal de aminoácidos, como esperado.

[00162] Dentre as diferentes preparações de R. Carthamoides, frações F0 (EtOH50% nativo), F5 (extrato EtOh70% purificado) e F7 (extrato EtOH70%) foram capazes de estimular significativamente a síntese de proteína. Esta estimulação foi equivalente ou mais forte do que a referência do ensaio: IGF1 (IGF-1 100ng/mL +21% p<0,001 versus F0 10μg/mL +43% p<0,001 ou F5 300μg/mL +23% p<0,01 ou F7 10μg/mL +29% p<0,001). A fração F5 estimulou a síntese de proteína de uma forma dependente da dose e efeito significativo de 30μg/mL o que correspondeu a uma concentração de 20HE de 1μM. Adicionalmente, as frações F0 e F7 exibiram melhor efeito na dose mais baixa (respectivamente equivalente a 0,04μM e 0,1 μM de 20HE). A estimulação da síntese de proteína induzida por 10μg/mL de fração F0 foi significativamente mais alta que aquela observada com IGF-1.

[00163] As frações F1 (extrato aquoso) e F3 tiveram efeito muito ligeiro não significativo na presença de baixos aminoácidos e isto também foi verdadeiro para F3 na concentração mais alta de aminoácido.

[00164] Figs 13a, 13b, 14a, 14b, 15a, 15b, 16a, 16b, 17a, 17b: Determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com 5 diferentes preparações de extrato de Rhaponticum a três concentrações.

[00165] Cinco preparações diferentes de extrato de Rhaponticum a três concentrações foram incubadas por 2h30 na presença de miotubos C2C12 diferenciados e leucina tritiada (5μCi). No final da incubação as células foram lisadas, as proteínas solúveis totais foram quantificadas e o nível de leucina tritiada incorporada nas células foi contado. Média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs valor de controle.

[00166] Em resumo destes experimentos, na presença de concentração normal de aminoácidos, as frações F0, F5 e F7 estimularam significativamente a síntese de proteína. Esta estimulação foi semelhante ou mais forte do que a referência do ensaio, IGF-1 (IGF-1 100ng/mL, +20%, p<0,001 versus F0 10μg/mL, +43%, p<0,001 ou F5 300μg/mL, +23%, p<0,01 ou F7 10μg/mL, +29%, p<0,001). Estas frações também estimularam a via de sinalização (fosforilações de Akt e S6K1) nas doses baixas testadas. Foi notado que para F1 1.300μg/mL e F7 1.000μg/mL problemas de solubilidade em todos os ensaios.

[00167] Por outro lado, as frações F1 e F3 não estimularam a síntese de proteína. No entanto, alguma estimulação de fosforilações de Akt e S6K1 foi observada com estas frações.

[00168] Em conclusão, a fração F0 e em menor grau a fração F7, ambas nas concentrações mais baixas (equivalentes a 0,04-0,1μM de 20HE), aumentaram a fosforilação de Akt e S6K1, o que se correlacionou com um aumento significativo na síntese de proteína. EXEMPLO 14: Efeito de uma preparação selecionada de extrato de Rhaponticum carthamoides com Rhodiola em síntese de proteína (incorporação de leucina tritiada) em miotubos C2C12 (ETAPA 2a e b como representada na Fig. 29a).

[00169] De acordo com nossa condição experimental, os melhores resultados foram obtidos com doses mais baixas de fracção F0 na presença de concentração de aminoácido normal mostrando estimulação de síntese de proteína e ativação da sinalização (indução de fosforilações de S6K1 e akt) (ver Exemplo 13). Portanto, esta fração foi selecionada para ser testada no experimento de coincubação com outra preparação de extrato de planta derivada de espécie Rhodiola que contém salidrosida como componente ativo.

[00170] O extrato de Rhodiola utilizado continha: Tabela 7:

[00171] Numa primeira parte do estudo, o melhor efeito do extrato de planta de Rhaponticum foi documentado com a fração F0 na dose mais baixa, uma nova avaliação de respost a à dose a 0,1-1-10μg/mL foi realizada sobre a síntese de proteína em paralelo com uma análise de resposta à dose de extrato de Rhodiola. As concentrações de Rhodiola escolhidas foram: 10-104-417μg/mL correspondendo a concentrações de salidrosida finais de 1-10-40μM. Tabela 8:

Tabela 9:

[00172] Para este estudo, foram obtidas células C2C12 como descrito no EXEMPLO 12. O ensaio de síntese de proteína foi realizado como descrito no EXEMPLO 13, exceto que leucina radiomarcada 5μCi/mL e IGF1 100ng/mL, extrato F0 em 1,5 e 10μg/ml de extrato de Rhodiola em 10, 104 e 417μg/ml na presença de concentração normal (0,8 mM) de aminoácidos e com DMSO a 0,005% foram usados.

[00173] Figs. 18a e 18b: Determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a três concentrações.

[00174] Extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a três concentrações foram incubados por 2h30 na presença de miotubos C2C12 diferenciados e leucina tritiada (5μCi). No final da incubação as células foram lisadas, as proteínas solúveis totais foram quantificadas e o nível de leucina tritiada incorporada nas células foi contado. Média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs valor de controle.

[00175] Todos os resultados são dados como média ± SEM. Para todos os parâmetros avaliados análises estatísticas foram realizadas utilizando um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn (GraphPad PRISM®4). A comparação entre duas condições foi realizada utilizando um teste de Mann Whitney. Um valor de p de 0,05 foi considerado como significativo.

[00176] IGF1 induziu a síntese de proteína na presença de concentração normal de aminoácidos, como anteriormente relatado (Kazi AA, 2010) (Broussard SR, 2004). Este resultado confirmou nossos dados anteriores gerados na etapa 1 (IGF-1 etapa 1 +21%, p<0,001 vs IGF-1 etapa 2 +27%, p<0,01).

[00177] A fração F0 foi capaz de estimular significativamente a síntese de proteína em 1μg/mL (Ver Figs. 18a e 18b). Esta estimulação foi similar à referência do ensaio: IGF-1 (IGF-1 100ng/mL ou F0 1μg/mL +27% p<0,01). Uma estimulação da síntese de proteína foi observada com F0 10μg/mL, no entanto, ela não atingiu significância estatística e foi mais fraca do que na primeira etapa (+16% versus +43%). Esta diferença poderia ser devida à concentração mais alta de DMSO utilizada neste experimento, com base na solubilidade do extrato de Rhodiola e antecipação do próximo experimento de coincubação. Estes resultados indicaram que o(s) composto(s) ativo(s) no extrato F0 sobre a síntese de proteínas é(são) sensível(eis) à concentração de DMSO.

[00178] Extrato de Rhodiola induziu síntese de proteína na concentração mais baixa (+ 23%, p<0,01). Esta atividade foi similar àquela de IGF-1. Em contraste, a 417μg/mL, Rhodiola inibiu a síntese de proteína (Ver Figs. 18a e 18b). No entanto, esta dose elevada foi, provavelmente, devida ao limite de solubilidade do extrato e isso poderia levar a efeito deletério na síntese de proteína.

[00179] Portanto, para os próximos experimentos de coincubação, foi decidido testar extrato F0 de Rhaponticum e extrato de Rhodiola 1 e 10μg/mL, sozinhos e em combinação, em DMSO, a concentração final de 0,005%. Cada preparação foi sonicada para melhorar a solubilidade.

[00180] Numa segunda etapa, diferentes combinações de ambos os extratos de planta foram estudadas para determinar se o efeito de potenciação na síntese de proteína poderia ser documentado.

[00181] Para este estudo, foram obtidas células C2C12 como descrito no EXEMPLO 12. O ensaio de síntese de proteína foi realizado como descrito no EXEMPLO 13, exceto que leucina radiomarcada 5μCi/mL e IGF1 100ng/mL, extrato F0 a 1 e 10μg/ml, ou extrato de Rhodiola a 1 e 10μg/ml ou combinação de F0 com Rhodiola em diferentes concentrações na presença de concentração normal (0,8 mM) de aminoácidos e com DMSO a 0,005% foram usados. Tabela 10:

Tabela 11:

[00182] Figs 19a, 19b, 20a, 20b e 21: A determinação de síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola sozinhos ou em combinação a duas concentrações.

[00183] Duas concentrações de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola foram incubadas por 2h30 na presença de miotubos C2C12 diferenciados e leucina tritiada (5μCi). Adicionalmente, a combinação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a duas concentrações diferentes foram cada qual incubadas por 2h30 na presença de miotubos C2C12 diferenciados e leucina tritiada (5μCi). No final da incubação as células foram lisadas, as proteínas solúveis totais foram quantificadas e o nível de leucina tritiada incorporada nas células foi contado. Média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs valor de controle.

[00184] IGF1 induziu significativamente a síntese de proteína na presença de concentração normal de aminoácido, como anteriormente relatado (+22%, p<0,05 vs +27%, p<0,01 e +21%, p<0,001 em estudos anteriores).

[00185] Rhodiola induziu fortemente e significativamente a síntese de proteína a 10μg/ml, como previamente relatado (+30%, p <0,001 vs + 23%, p<0,01 na etapa anterior) (Ver Figs 19a, 19b, 20a, 20b e 21).

[00186] F0 induziu significativamente a síntese de proteína em 1 & 10μg/ml como relatado anteriormente. Semelhantemente à etapa 1 a indução da síntese de proteína por F0 (10μg/mL) foi significativa e mais forte do que o efeito de IGF-1. A diferença com o experimento da etapa 2a poderia ser devida à etapa de sonicação durante a solubilização do extrato. Efeitos de F0 e Rhodiola na síntese de proteína foram semelhantes quando doses equivalentes foram consideradas (Ver Figs 19a, 19b, 20a, 20b e 21).

[00187] Uma potenciação foi observada com baixas doses de ambos os extratos (F0 & Rhodiola 1:1 +19% p<0,05 vs F0 1μg/ml +14% NS e Rhodiola 1μg/ml +10% NS). O aumento na síntese de proteína com a combinação foi superior àquele do extrato de Rhaponticum ou Rhodiola sozinhos e, portanto, um efeito de potenciação foi observado.

[00188] F0 sozinho (10μg/ml), Rhodiola sozinho (10μg/ml) e a combinação dos mesmos aumentaram todos significativamente a síntese de proteína em comparação com o controle. Entretanto, nenhuma potenciação de síntese de proteína foi observada com a combinação de altas doses de Rhodiola e F0 em comparação com cada extrato sozinho (F0 & Rhodiola 10:10 +28% p<0,001 vs F0 10μg/ml +29% p<0,001 e Rhodiola 10μg/ml +30% p<0,001).

[00189] Um efeito mais baixo do que cada extrato sozinho a alta dose (10μg/ml), mas efeito mais forte que cada extrato sozinho a baixa dose (1μg/ml), foi observado com as combinações de alta dose de um extrato e baixa dose do outro (F0 & Rhodiola 1:10 +16% NS vs F0 1μg/ml +14% NS e Rhodiola 10μg/ml +30% p<0,001 ou F0 & Rhodiola 10:1 +19% p<0,05 vs F0 10μg/ml +29% p<0,001 e Rhodiola 1μg/ml +10% NS). Exemplo 15: Avaliação de duas concentrações de extrato de Rhaponticum F0 e duas concentrações de extrato de Rhodiola em expressões de genes de miostatina e atrogina E COMBINAÇÃO DOS MESMOS (Etapa 2c a representada na Fig. 29a)

[00190] Um estudo foi realizado para determinar se uma potenciação existe em outros processos fisiológicos e efeito de extratos sozinhos e em combinação sobre a proteólise muscular, medindo o efeito dos extratos e a combinação dos mesmos na expressão de gene de miostatina e atrogina 1. O extrato de Rhaponticum F0 e o extrato de Rhodiola foram usados como descrito no Exemplo 14.

[00191] Para o ensaio de expressão de gene, células em crescimento foram colhidas e plaqueadas a uma densidade de 30.000 células por poço em uma placa de 24 poços. As células foram crescidas por 48 h em 5% de CO2 a 37°C. Após as células atingirem 80% de confluência, o meio foi substituído por meio de diferenciação (DMEM + 2% FBS). Após 5 dias, mioblastos foram fundidos em miotubos multinucleados.

[00192] As células foram tratadas com extrato F0 a 1 e 10μg/ml, ou extrato de Rhodiola a 1 e 10μg/ml ou combinação de F0 com Rhodiola em diferentes concentrações por 6h. No final do experimento, as células C2C12 foram lisadas em solução de trizol e o RNA foi extraído e purificado utilizando o método de fenol/clorofórmio. A quantidade de RNA após extração foi quantificada por espectrofotômetro (260nm/280nm/320nm) e suspensa a uma concentração final de 1μg/μL. Subsequentemente, 1μg de RNA foi utilizado como modelo para a síntese da primeira fita de cDNA utilizando iniciadores oligo(dT) e o sistema de transcriptase reversa AMV, como descrito pelo fabricante (Applied Biosystems 4368814). qPCRs foram, então, realizadas utilizando um sistema de detecção de PCR em tempo real 7900HT Fast (Applied Biosystems) e um programa de qPCR padrão para (1 ciclo 95°C 15 min., 40 ciclos 95°C 15s e 60°C 1 min., uma curva de fusão 60 a 95°C para sondas sybergreen). Experimentos de termociclagem foram realizados em uma mistura mestre de PCR SYBR green (Applied Biosystems) para genes de beta actina, Miostatina e Atrogina contendo os 100ng de amostras de cDNA e um conjunto de iniciadores a uma concentração final de 200nM projetada em dois éxons diferentes.

[00193] Todos os resultados são dados como média ± SEM. Para todos os parâmetros avaliados análises estatísticas foram realizadas utilizando um teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn (GraphPad PRISM®4). A comparação entre duas condições foi realizada utilizando um teste de Mann Whitney. Um valor de p de 0,05 foi considerado como significativo. Tabela 12:

Tabela 13:

[00194] Na literatura, vários artigos relataram a inibição da expressão do gene de atrogina em torno de 40% após incubação de 24 h com IGF-1 em 10ng/mL (Latres E, 2005) (Stitt, TN, 2004). Não existem dados publicados sobre inibição da expressão do gene da miostatina por IGF-1, porque a maior parte dos estudos incidiu sobre o IGF-1 do efeito deletério de miostatina (Trendelenburg AU, 2009). No entanto, internamente, nós documentamos um efeito inibidor de 20-40% do IGF-1 na expressão do gene da miostatina. Com base na literatura e em dados internos IGF-1 foi selecionado como o nosso controle positivo neste ensaio. Neste experimento IGF1 inibiu significativamente expressões de genes de miostatina & atrogina (respectivamente, -25%, p<0,001 & -59%, p<0,001).

[00195] Figuras 23a, 23b, 24a e 24b: Efeito de coincubação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola em expressão de gene de miostatina em miotubos C2C12. A combinação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a duas concentrações diferentes cada foi incubada por 6h na presença de miotubos C2C12 diferenciados. No final da incubação as células foram lisadas e o RNA foi extraído, convertido em cDNA para realizar uma PCR quantitativa. Média ± SEM. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 vs valor de controle; ### p<0,001 vs valor de controle (teste de Mann- Whitney).

[00196] Rhodiola significativamente e de forma dependente da dose inibiu a expressão do gene da miostatina (-15% NS e -54% p<0,001 em dose baixa e alta, respectivamente), embora ela tivesse apenas um ligeiro efeito não significativo na expressão de gene de atrogina na dose mais alta (-13% NS) (Ver Figs. 22a e 22b).

[00197] F0 induziu uma ligeira redução, embora não significativa, na expressão do gene da miostatina (-10% NS e -21% NS na dose baixa e alta, respectivamente), mas não teve qualquer efeito na expressão do gene da atrogina (+12% NS e -4% NS em dose baixa e alta, respectivamente)

[00198] Figuras 22a e 22b: Efeito de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola em expressão de gene de miostatina e atrogina em miotubos C2C12.

[00199] Os extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a duas concentrações diferentes foram incubados por 6h na presença de miotubos C2C12 diferenciados. No final da incubação as células foram lisadas e o RNA foi extraído, convertido em cDNA para realizar uma PCR quantitativa. Média ± SEM. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 vs valor de controle; ### p<0,001 vs valor de controle (teste de Mann-Whitney).

[00200] Resultados da expressão do gene da miostatina são apresentados nas figuras 23a, 23b, 24a e 24b.

[00201] A combinação de F0 10μg/mLl & Rhodiola 1μg/mL induziu uma diminuição significativa na expressão do gene da miostatina (-23%, p<0,05 vs controle), enquanto F0 10μg/mL sozinho induziu apenas -21% (NS vs controle) e Rhodiola 1 μg/mL, apenas -15% (NS vs controle). Portanto, a diminuição com a combinação foi superior àquela de cada extrato sozinho e um efeito de potenciação foi observado.

[00202] F0 e Rhodiola 1μg/mL sozinhos ou em combinação induziram uma diminuição ligeira, mas não significativa na expressão do gene da miostatina. A magnitude do efeito foi mais forte com a combinação (-19% NS) em comparação com F0 sozinho (-10%) ou Rhodiola sozinha (-15% NS) (Ver figuras 23a, 23b, 24a e 24b).

[00203] Rhodiola 10μg/mL inibiu fortemente e significativamente a expressão do gene da miostatina; no entanto, na presença de F0 1μg/mL ou 10μg/mL, não se observou qualquer efeito potenciador, pois o efeito inibidor das combinações foi sistematicamente mais baixo que aquele de Rhodiola (10μg/mL) sozinho.

[00204] Figs. 25a, 25b, 26a e 26b: Efeito de coincubação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola em expressão de gene de atrogina em miotubos C2C12.

[00205] A combinação de extratos de Rhaponticum F0 e Rhodiola a duas concentrações diferentes cada foi incubada por 6h na presença de miotubos C2C12 diferenciados. No final da incubação as células foram lisadas e o RNA foi extraído, convertido em cDNA para realizar uma PCR quantitativa. Média ± SEM. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 vs valor de controle; ### p<0,001 vs valor de controle (teste de Mann-Whitney).

[00206] A combinação de F0 1μg/mL & Rhodiola 10μg/mL induziu uma diminuição forte e significativa na expressão do gene da atrogina (-31%, p<0,05 vs controle), ao passo que cada fração sozinha não o fez: F0 1ug/ml sozinho induziu um aumento de 21% (NS vs controle) e Rhodiola 10 ug/ml uma diminuição de -13% (NS vs controle). Portanto, a diminuição com a combinação foi superior àquela de cada extrato sozinho e um forte efeito de potenciação foi observado.

[00207] A combinação de F0 de 10μg/mL & Rhodiola 1μg/mL diminuiu a expressão do gene da atrogina de uma forma não significativa (-10%) NS) e esta diminuição foi superior àquela de F0 sozinho (-4% NS) ou Rhodiola sozinho (+25% NS).

[00208] F0 e Rhodiola 1μg/mL não tiveram efeito significativo na expressão do gene da atrogina sozinhos ou em combinação. Deve ser notado que a magnitude do efeito foi mais forte com a combinação (-3% NS) em comparação com F0 sozinho (+21%NS) boi Rhodiola sozinho (+25%NS), como representado nas Figs. 25a, 25b, 26a e 26b.

[00209] F0 e Rhodiola 10μg/mL tiveram efeito muito ligeiro, mas não significativo, na expressão do gene da atrogina sozinhos ou em combinação, e não se observou qualquer efeito de potenciação.

[00210] Em conclusão, a combinação F0 1μg/mL & Rhodiola 10μg/mL exibiu efeito de potenciação na inibição da expressão do gene da atrogina. A diminuição com a combinação foi superior àquela de cada extrato sozinho e um forte efeito de potenciação foi observado. EXEMPLO 16 Avaliação de 4 novas preparações de fração F0 de extrato de Rhaponticum a 2 concentrações (etapa 3 como representado na Fig. 29a)

[00211] Para melhorar os resultados obtidos na síntese de proteína e para aumentar a chance de ter um produto melhor e mais puro para testar em modelo de animal, a fração F0 foi processado de forma diferente e mais purificada para obter novas frações. F0 Ne-ETOH correspondendo a F0 inicial previamente testada nos EXEMPLOS 12, 13, 14 e 15. A fração F1 correspondeu à fração F1 dos EXEMPLOS 12 e 13. Depois da atomização da fração F0 foi gerada a fração F0 seca. Após diluição da fração F0 em solução aquosa e purificação em coluna foi gerada a fração F5’. Tabela 14:

[00212] As células do músculo esquelético C2C12 foram obtidas como no EXEMPLO 12. O ensaio de síntese de proteína foi realizado como nos EXEMPLOS 13 e 14, exceto que leucina radiomarcada 5μCi/mL e IGF1 100ng/mL, extrato F0 a 11,4 e 22.9μg/ml ou extrato seco de F0 a 6,5 e 13μg/ml ou extrato F1 a 13,4 e 26,7μg/ml ou extrato F5’ a 1 e 1,9μg/ml na presença de concentração normal (0,8 mM) de aminoácidos e com DMSO a 0,005%. No fim dos experimentos os sobrenadantes foram descartados e as células foram lisadas em hidróxido de sódio 0,1N por 30 min. A radioatividade associada à fração solúvel da célula foi, então, contada e a quantificação de proteína foi determinada usando o método de Lowry colórico.

[00213] Cada condição é testada em n=6. IGF1 100 ng/ml é usado como um controle positivo da estimulação e sinalização da síntese de proteína. Os resultados da síntese de proteína são expressos em cpm/μL/2,5 h em % de condição de controle não tratado (100%).

[00214] Os resultados são apresentados nas Figs. 27a, 27b e 28.

[00215] IGF1 induziu significativamente a síntese de proteína na presença de concentração normal de aminoácido (+25%, p<0,001) como anteriormente relatado nas etapas 1- 2a-2b (etapa 1 +21%, p<0,001; etapa 2a +27%, p<0,01; etapa 2b +21%, p<0,05 vs etapa 3 +25%, p<0,001). Resultados similares são relatados na literatura na presença de concentração normal de aminoácidos (Kazi AA, 2010) (Broussard SR, 2004).

[00216] Extrato de Rhaponticum F0 NE-EtOH 50% (extrato EtOH50% nativo) induziu significativamente a síntese de proteína a 20HE 0,05μM e 20HE 0,1μM (respectivamente +20%, p<0,01 e +18%, p<0,05). A estimulação da síntese de proteína pela fração F0 foi documentada anteriormente a 20HE 0,04μM (+29%, p<0,001 na etapa 2B). A 0,05μM e 0,1μM o efeito na síntese de proteína é significativo, mas mais fraco do que a 0,04μM.

[00217] Extrato de Rhaponticum F0 EtOH50% (forma de pó seco) induziu a síntese de proteína em ambas as concentração, mas a estimulação foi forte e significativa apenas na dose mais baixa (+33%, p<0,00 a em 6,5μg/mL, correspondendo a HE 0,05μM). Este efeito foi mais forte do que o efeito observado com a fração F0 NE-EtOH 50%.

[00218] Não se observou nenhum efeito da fração F5' (extrato EtOH50% purificado) na síntese de proteína em qualquer concentração final de 20HE testada.

[00219] A fração aquosa não purificada F1 exibiu atividade mais forte na síntese de proteína do que a preparação NE-EtOH 50% e suas frações derivadas. Na concentração final de 0,05μM de 20HE, fração F1 mostrou percentagem semelhante de estimulação de síntese de proteína à fração F0 seca (+30%, p<0,001 e +33%, respectivamente, p<0,001). Seja qual for a concentração final de 20HE, o efeito da fração F1 na síntese de proteína foi semelhante.

[00220] Dentre as diferentes frações de Rhaponticum testadas, as frações F1 (extrato aquoso), F0 NE-ETOH 50% (extrato EtOH50% nativo) e F0 seco (pó atomizado de F0 50%EtOH) exibiram efeito estimulador significativo na síntese de proteína. Para cada fração positiva foi observado melhor efeito na dose mais baixa de 20HE (0,05μM). O efeito mais forte na síntese de proteína foi obtido com o pó atomizado de F0 50%EtOH.

[00221] Por outro lado, a fração F5’ derivada de F0 NE- ETOH 50% e enriquecida em 20HE não estimulou a síntese de proteína. Todos estes resultados sugerem que o efeito na síntese de proteína de extratos de Rhaponticum não são unicamente dependentes da concentração de 20HE e que outro(s) componente(s) ativo(s) capaz(es) de promover a síntese de proteína está/estão presente(s) nos extratos ativos. Figs. 27a, 27b e 28: A determinação da síntese de proteína em miotubos C2C12 após incubação com diferentes preparações de extratos de Rhaponticum a duas concentrações.

[00222] Quatro preparações diferentes de extratos de Rhaponticum a duas concentrações foram incubadas na presença de miotubos C2C12 diferenciados e leucina tritiada 5μCi por 2h30min. No final da incubação as células foram lisadas, as proteínas solúveis totais foram quantificadas e o nível de leucina tritiada incorporada nas células foi contado. Média ± SEM. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 vs valor de controle.

[00223] Observou-se uma potenciação com a combinação de Rhodiola (1 μg/ml) e Rhaponticum (1 μg/ml) no ensaio da síntese de proteína.

[00224] A síntese de proteína pode ser estimulada via inibição de miostatina alvo. Welle et al. demonstrou em camundongos maduros que a miostatina exerce uma influência inibidora tônica na taxa de síntese de proteína miofibrilar, mesmo depois de os músculos estarem completamente desenvolvidos (Welle S, 2008). Bloqueio da miostatina ou sua ausência natural leva a um aumento significativo na massa muscular (Lee SJ, 2005). Em nosso experimento documentamos uma diminuição na expressão do gene da miostatina após tratamento de C2C12 com extrato de planta Rhodiola a 10μg/mL (equivalente a 10ppm) duas vezes melhor do que o IGF-1 de referência. De modo interessante, Zubeldia et al relataram que miotubos tratados por 6h com extrato de Ajuga turkestanica a 20 ppm (extrato de planta contendo ecdisona incluindo 20HE e turkesterone) inibiu significativamente a expressão do gene da miostatina e a inibição foi duas vezes mais forte do que a inibição induzida pela metandrostenolona esteroide anabólica (1μM) (Zubeldia JM, 2012).

[00225] A fração F0 de Rhaponticum não mostrou efeito significativo na expressão do gene da miostatina enquanto Rhodiola (10μg/mL) sozinho a reduziu significativamente. Para nosso conhecimento, nenhum efeito direto de Rhodiola na expressão do gene da miostatina foi relatado na literatura. Além disso, foi observada potencialização do efeito na inibição da expressão do gene da miostatina com a combinação de extratos de Rhodiola e Rhaponticum no nosso estudo. Como observado para a síntese de proteína nenhum efeito de potenciação de ambos os extratos (Rhaponticum e Rhodiola) foi documentado anteriormente.

[00226] Ganho de massa muscular é um equilíbrio entre síntese de proteína, proteólise e diferenciação de células satélites. Atrogina-1 ou F-box de atrofia muscular (MAFbx) é uma das principais ligases de ubiquitina E3 relacionada a atrofia altamente expressa no músculo esquelético durante estados de atrofia muscular e outras doenças, tal como sepse, caquexia de câncer e jejum (Cong H, 2011). Nós exploramos o sistema de proteassoma da ubiquitina. Nenhum dos extratos sozinho exibiu um efeito significativo na expressão do gene da atrogina. Em contraste, curiosamente, foi observado um efeito de potenciação da inibição da expressão do gene da atrogina (-31%, p<0,05) quando a fração F0 do extrato de Rhaponticum foi incubada na presença de extrato de Rhodiola na razão de 1:10. Cong et al. mostrou que a redução de atrogina utilizando adenovírus SiMAFbx leva a 55% de inibição da expressão do gene, 60% de inibição do nível de proteína e um aumento de 20% na massa muscular. Foi mostrado que a atrogina direcionou a degradação de MyoD na atrofia do músculo esquelético (Lagirand-Cantaloube J, 2009). RESULTADOS SOBRE BAIXO AMINOÁCIDO: Tabela 15:

[00227] Na presença de baixo aminoácido, nenhuma indução significativa de síntese de proteína foi relatada, exceto com fração F0 EtOH 50%; no entanto, a estimulação da síntese de proteína ou fosforilação pS6K1 foi duas vezes mais baixa que aquela induzida pelo IGF-1. Foi observado que em quase todas as condições a sinalização de pS6K1 foi ativada, mas provavelmente não atingiu o limiar necessário para induzir resposta fisiológica. Com efeito, em condição de baixo aminoácido o nível de pS6K1 foi mais baixo que aquele observado na condição de controle na presença de concentração de aminoácido normal (máximo de 1,2 para melhor fração versus 2,1 para o controle na presença da concentração de aminoácido normal). Portanto, é preferível usar extrato de planta na presença de concentração de aminoácido normal.

[00228] F3, F5 e F5' são frações purificadas de extratos aquosos (frações em azul) ou etanol (frações em laranja). Em todas estas frações purificadas, nenhuma atividade de estimulação na síntese de proteína ou a um nível mais baixo que aquele da solução mãe foi observada. Estes dados indicam que durante a etapa de purificação a(s) molécula(s) ativa(s) foi/foram perdida(s) durante o processo de purificação. Tabela 16:

[00229] Nenhuma correlação real foi encontrada entre a concentração de 20HE e a estimulação da síntese de proteína. No entanto, na fração não purificada na qual a estimulação mais forte da síntese de proteína foi relatada a melhor concentração de 20HE parecia estar entre 0,05 e 0,1μM. Estes resultados sugerem que 20HE não era a única molécula ativa envolvida na ativação da síntese de proteína. Portanto, seria de particular interesse obter informações sobre o perfil da molécula nas diferentes frações para determinar qual coquetel de moléculas contribui para a estimulação de síntese de proteína. Tabela 17:

[00230] A atividade máxima da planta Rhaponticum foi observada a uma concentração entre 10μg/mL e 100μg/mL. Quando a fração perdeu uma parte de sua atividade, devido à etapa de purificação, foi observado que o extrato tinha que ser testado em concentração mais forte para observar efeito semelhante na síntese de proteína. Em seguida, a melhor concentração para avaliação in vitro de extrato de planta Rhaponticum é de 10 a 100μg/mL. Tabela 18:

[00231] Extratos de Rhaponticum e Rhodiola foram ambos ativos na síntese de proteína; cada extrato sozinho aumentou a síntese de proteína em 20-30%, atingindo o nível superior que poderia ser obtido no ensaio. O efeito de potenciação na síntese de proteína deve ser mais bem apreciado no nível da sua via de sinalização uma vez que o limite máximo de estimulação está acima de 100% quando pAkt ou pS6K são medidas.

[00232] O extrato de Rhodiola induziu inibição da expressão do gene da miostatina, mas um efeito benéfico mais baixo foi observado quando Rhodiola e a fração F0 de Rhaponticum foram coincubados. Os resultados sugerem que a(s) molécula(s) dentro da fração F0 era/eram capazes de antagonizar o efeito benéfico do extrato de Rhodiola. Identificação e pré-purificação desta/destas substância(s) poderiam melhorar efeito de coincubação.

[00233] Nenhum dos extratos sozinho exibiu efeito na expressão do gene da atrogina, ao passo que sob certa condição de coincubação ((F0 1μg/mL & Rhodiola 10 μg/mL) um efeito de potenciação sobre a inibição da expressão do gene da atrogina foi observado. Foi observado um efeito sinérgico e benéfico de extratos de Rhodiola e Rhaponticum na proteólise.

[00234] Em conclusão, este estudo mostrou que extrato de EtOH 50% de Rhaponticum foi a fração mais potente entre todas as frações avaliadas na estimulação da síntese de proteína. Extrato de Rhodiola também aumentou fortemente a síntese de proteína. Quando coincubado com a fração F0 de Rhaponticum, um efeito mais alto poderia ser mostrado neste parâmetro em comparação com cada extrato sozinho (quando cada extrato foi misturado à concentração de 1 μg/ml).

[00235] Em paralelo, o extrato de Rhodiola diminuiu fortemente a expressão do gene da miostatina a 10 μg/ml, mas não se observou nenhum melhor efeito quando coincubado com a fração F0 de Rhaponticum. Deve ser notado que um efeito de potenciação foi observado na expressão do gene da miostatina ao combinar Rhodiola (1 μg/ml) e Rhaponticum (1 μg/ml), pelo que a expressão do gene da miostatina foi mais baixa (embora não de forma significativa) em comparação com cada um dos extratos sozinhos.

[00236] Um efeito inibidor sinérgico da mistura de extratos poderia ser observado na expressão do gene da atrogina sugerindo um impacto benéfico da mistura de extratos de Rhaponticum e Rhodiola na proteólise em adição de seu efeito na síntese de proteína. EXEMPLO 17: TESTE DO EFEITO DA COMBINAÇÃO DE EXTRATO DE RHODIOLA E EXTRATO DE RHAPONTICUM NA SÍNTESE DE PROTEÍNA DO MÚSCULO E VIA ASSOCIADA, MASSA MUSCULAR E RESISTÊNCIA MUSCULAR EM MODELO ANIMAL

[00237] A combinação de extratos e Rhodiola e Rhaponticum foi testada quanto ao seu efeito na resistência física, peso muscular, fosforilação de Akt muscular e teor de proteína, glicose no plasma e lactato.

[00238] O extrato seco de raiz de Rhaponticum carthamoides (F0- EtOH 50% pó seco) foi obtido por extração com etanol 50% (v/v) em água como descrito no Exemplo 1. O extrato pode preferencialmente conter aproximadamente (% p/p) 0,395% de 20HE, 0,79% de ecdisteriides totais e 13,4% de polifenol total (Folin ciocalteu) com base no peso seco total do extrato herbal.

[00239] O extrato etanólico de raiz de Rhodiola rosea pode ser obtido, que de preferência compreende aproximadamente (% p/p) 3,41% de salidrosidas, 3,12% de rosavina e 4,20% de rosavinas (como soma de rosarina, rosavina e rosina) com base no peso seco total do extrato herbal.

[00240] Ambos os extratos estavam numa forma de pó com <5% de umidade. Os extratos foram misturados numa razão de 50:50 (p/p) com base no peso total da composição. Nenhum transportador ou excipientes adicionais foram adicionados em alguns testes.

[00241] Esta combinação dos dois extratos de raiz de Rhodiola rosea e raiz de Rhaponticum carthamoides foi analisada quanto a compostos alvo:

[00242] Ratos machos Wister foram tratados com a combinação de extrato numa dose de 50 mg/kg bw (n=10) ou com veículo (n=10) por um período de 6 semanas. A combinação foi administrada por gavagem uma vez ao dia.

[00243] A força de preensão no membro anterior dos ratos Wistar foi avaliada antes (dia 0) e após 42 dias de tratamento (dia 43) e a evolução da força de preensão do dia 0 até o dia 43 foi calculada como o delta (força de preensão no d43 - força de preensão no d0). Como é bem conhecido na arte, este teste de força de preensão se destina a medir a força de preensão do membro anterior e posteriore tem sido utilizado por outros, por exemplo, para medir a força em seguida a administração de 20HE (Feldman- Gorelick et al, 2008, JAFC).

[00244] Conforme ilustrado na Fig. 30a, o aumento da força de preensão delta no grupo tratado com a mistura foi de 45% mais alto que o aumento observado no grupo de controle não tratado. Adicionalmente, como ilustrado na Fig. 30b, quando a força de preensão delta é alternativamente relatada com base no peso corporal (isto é, força em kg/g de peso corporal), o grupo tratado com a mistura era ainda 40% mais alto que o aumento observado no grupo de controle não tratado.

[00245] O peso do rato foi medido duas vezes por semana, cada semana do período de tratamento. A glicose no plasma e o lactato foram medidos antes do tratamento e depois de 6 semanas de tratamento (antes e depois do exercício).

[00246] Ao final dos 43 dias de tratamento (dia 44), após o teste de força de preensão e coleta de sangue, os animais foram sacrificados. Os músculos dos membros posteriores e anteriores dos ratos Wistar foram removidos (Extensor Digitorum Longus (EDL), Soleus, Quadriceps, Tibialis e Triceps) e pesados. Como ilustrado nas Figs. 31a e 31b, um aumento de 5% no peso EDL e na razão de peso EDL para peso corporal foi observado (p<0,05 Mann-Whitney para ambos). Adicionalmente, como ilustrado nas Figs. 32a e 32b, um aumento também foi encontrado no peso do músculo Soleus e na razão peso soleus para peso corporal. Nenhuma modificação substancial de peso muscular foi documentada em outros músculos.

[00247] O teor de proteína e a fosforilação de Akt foram medidos nos músculos amostrados. A combinação de Rhaponticum e Rhodiola administrada a 50 mg/kg por 6 semanas não mudou significativamente a quantidade de proteína dentro do músculo EDL (em μg de proteína por mg de tecido; Figura 33a) e a quantidade total de proteína do EDL (mg por músculo; Fig. 33b). No entanto, um aumento no teor de proteína (em μg de proteína por mg de tecido; +10%, p=0,08, Fig. 34a) e na quantidade total de proteína do EDL (mg por músculo; +14%, Fig. 34b) foi observado dentro do músculo soleus em ratos Wistar. EXEMPLO 18: TESTE DO EFEITO DE 8 SEMANAS DE SUPLEMENTAÇÃO COM COMBINAÇÃO DE EXTRATO DE RHODIOLA E EXTRATO DE RHAPONTICUM NA COMPOSIÇÃO CORPORAL, MASSA MUSCULAR, RESISTÊNCIA MUSCULAR E RESISTÊNCIA AO EXERCÍCIO EM HOMENS RECRETIVAMENTE ATIVOS DURANTE UM PROGRAMA DE TREINAMENTO DE RESISTÊNCIA

[00248] Dados os resultados de estudos in vitro e em animais, postula-se que a suplementação de homens recreativamente ativos com a mistura divulgada durante treinamento de resistência pode proporcionar benefícios adicionais em termos de aumentar a resistência e o tamanho do músculo. A finalidade deste estudo é determinar os efeitos da preparação divulgada suplementada para homens recreativamente ativos durante 8 semanas do treinamento de resistência externa constante dinâmica (DCER) na resistência e área da seção transversal do músculo da coxa.

[00249] O objetivo primário deste estudo é avaliar os efeitos de 8 semanas de suplementação com a combinação de extratos de Rhaponticuml/Rhodiola (ver exemplo 17 para descrição da mistura) na resistência muscular (leg press e supino 1-RM). O experimento pode avaliar a resistência muscular corporal superior e inferior usando 1RM e teste de exercício de supino e Leg press a 4 e 8 semanas.

[00250] Os objetivos secundários são avaliar os efeitos da suplementação de 8 semanas, com a combinação de extratos de RhaponticumlRhodiola na composição corporal e massa muscular (DXA), teor de proteína muscular, glicose no sangue e resistência/tempo até exaustão durante exercício de treinamento de resistência.

[00251] O estudo pode ser um estudo de grupo randomizado, duplo cego, controlado com placebo, paralelo. De acordo com a randomização, os participantes podem tomar dose baixa (100 mg) ou alta (400 mg) do suplemento ou um placebo diariamente durante 8 semanas. Mudanças na resistência muscular (resistência muscular corporal superior e inferior) pode ser avaliada na semana 0 (linha de base), semana 4 e semana 8 usando 1RM e supino e Leg press. Mudanças na composição corporal e na massa muscular podem ser avaliadas na semana 0 e na semana 8 utilizando DEXA. A biopsia e análise muscular podem ser realizadas na semana 0 e na semana 8. A resistência/tempo até exaustão podem ser medidos pelo aumento da repetição de 1-RM na semana 0 (pré- tratamento; linha de base) e na semana 8. A fadiga mental pode ser avaliada utilizando a Classificação do questionário de esforço percebido (RPE) na semana 0 (pré- tratamento; linha de base) e na semana 8.

[00252] A fim de verificar as respostas metabólicas agudas à ingestão do suplemento (no início e no final da fase de suplementação), uma ingestão aguda do suplemento pode ser realizada em seguida a uma randomizada, duplo cego, cruzada, controlada por placebo. Seguindo a ingestão aguda de dose baixa (200 mg) ou alta (400 mg) do suplemento ou do placebo, a resistência muscular (resistência muscular corporal superior e inferior) pode ser avaliada como descrito acima. Os parâmetros biológicos, tal como glicose no sangue e lactato no sangue podem ser medidos.

[00253] Para o estudo, homens em idade universitária saudáveis, recreativamente ativos (18 a 35 anos de idade, por exemplo) podem ser recrutados para participar deste estudo. Os participantes podem ser inscritos no estudo se eles preencherem todos os critérios de inclusão e não apresentarem nenhum dos critérios de exclusão (determinados pelos questionários). A aprovação ética pode ser adquirida da comissão de ética da universidade apropriada.

[00254] Os participantes podem ser incluídos no estudo se eles: - Forem não fumantes; - Tiverem de 18 a 35 anos de idade; - Tiverem um BMI de 19 a 29,9 kg/m2; - Forem estáveis no peso (isto é, não tiverem ganhado peso ou perdido mais de 3kg/m2 nos últimos 3 meses); - Forem recreativamente ativos, isto é, vão à academia aproximadamente duas vezes por semana, mas não seguem nenhum treinamento intensivo ou programa de competição (tipo de esporte que eles praticam recreativamente e a frequência/intensidade a serem determinados); - Estiveram em treinamento de peso pelo menos 2 vezes por semana pelos 3 meses anteriores ao início do estudo; - Não tomaram nenhuma medicação (definir uma duração limitada antes do início do estudo) e/ou não tomaram dentro do último mês quaisquer suplementos dietéticos considerados pelo investigador influenciar o metabolismo, peso corporal e/ou apetite; e - Não tomaram níveis ergogênicos de suplementos nutricionais que possam afetar a massa muscular (por exemplo, creatina, HMB etc.) e/ou suplementos que possam afetar os níveis de hormônios anabólicos/catabólicos (por exemplo, androstenodiona, DHEA, etc.) dentro de 1 mês (tbd) antes do início do estudo.

[00255] Os participantes serão excluídos se eles: - Forem fumantes; - Forem à academia mais de duas vezes por semana e/ou seguirem algum treinamento intensivo ou programa de competição (tipo indesejado de esporte e frequência/intensidade a serem determinados); - Tiverem um diagnóstico atual de uma condição médica significativa; - Tiverem um histórico ou sintomas de distúrbios metabólicos, endócrinos ou cardíacos; - Tomarem medicação ou suplementos e/ou tomaram dentro do último mês quaisquer suplementos dietéticos considerados pelo investigador influenciar o metabolismo, peso corporal e/ou apetite; ou - Tomaram níveis ergogênicos de suplementos nutricionais que possam afetar a massa muscular (por exemplo, creatina, HMB etc.) e/ou suplementos que possam afetar os níveis de hormônios anabólicos/catabólicos (por exemplo, androstenodiona, DHEA, etc.) dentro de 1 mês (tbd) antes do início do estudo.

[00256] Os participantes podem ser alocados em um de dois grupos independentes: tratamento ou placebo (20 participantes em cada grupo). Os grupos podem ser combinados tanto quanto possível com base nas características físicas.

[00257] O produto do estudo pode ser a combinação dos extratos de Rhodiola e Rhaonticum como descrito no EXEMPLO 17. Duas doses podem ser testadas no estudo: uma dose baixa (100 mg) e dose alta (400 mg) do produto de teste. Um placebo inerte de combinação pode ser utilizado e consiste em celulose.

[00258] Todos os participantes podem completar um teste à base de resistência antes da fase de suplementação (0 semana) e a 4 semanas e 8 semanas. Um máximo de repetição (1RM; o peso mais pesado que pode ser levantado em um exercício específico com forma correta) pode ser avaliado no corpo superior e inferior por exercícios de supino (utilizando a máquina de Smith) e leg press, respectivamente.

[00259] Antes e após a suplementação de 8 semanas, a altura e o peso do participante podem ser registradas, assim como os perímetros dos membros e a circunferência da cintura. A composição corporal e o peso muscular podem ser avaliados por DEXA na linha de base (0 semana) e depois de 8 semanas, o dia antes do exercício 1-RM.

[00260] As biópsias musculares pré e pós suplementação podem ser realizadas para medir a proteína fosforilada versus proteína total, análise de proteína, vias de Akt/pS6K1 e tamanho do diâmetro da fibra muscular. A glicose no sangue também pode ser medida.

[00261] Para resistência/tempo até exaustão estes parâmetros podem ser medidos pelo aumento da repetição de 1-RM. A fadiga mental pode ser avaliada utilizando a Classificação do questionário de esforço percebido (RPE).

[00262] Todos os participantes podem completar um programa de treinamento supervisionado de 8 semanas de duas sessões por semana para verificar a homogeneidade de exercício entre os participantes. A carga de treinamento pode ser um percentual ajustado de medições 1RM de linha de base e o programa de treinamento pode progredir em intensidade a cada 2 semanas. Os participantes podem treinar 2 a 3 vezes por semana sob a supervisão de um treinador de resistência e condicionamento qualificado. Todas as sessões de treinamento podem ocorrer de manhã e cada sessão pode durar aproximadamente 90 min. Cada sessão pode consistir num aquecimento padronizado, 4 x 6 repetições de cada exercício (com uma recuperação de 4 min entre conjuntos) e um resfriamento. Exercícios visando a musculatura do corpo superior (por exemplo, supino, shoulder press e exercícios tricep weighted) e inferior (por exemplo, leg press e leg extension, hamstring curls) podem ser realizados. A classificação de esforço percebido pode ser registrada em intervalos durante as sessões de treinamento. A todos os participantes podem ser ensinadas técnicas corretas para cada exercício antes de o estudo começar.

[00263] A fim de controlar a ingestão de proteína na dieta dos participantes, um nutricionista aconselhou dietas favorecendo a ingestão de proteína e registros dietéticos na forma de chamada dietética de 24h podem ser usados e analisados nas semanas 0, 4 e 8.

[00264] Os valores médios em 0, 4 e 8 semanas podem ser computados. A mudança da linha de base pode ser avaliada em cada ponto no tempo e dentro de cada grupo utilizando ANOVA de medida repetida (ou ANOVA de uma via se apenas dois pontos no tempo).

[00265] Além disso, a mudança da linha de base (Δ Tx-T0) pode ser calculada para cada variável e as mudanças médias podem ser comparadas entre grupos utilizando ANOVA de múltiplas vias.

[00266] Os resultados são esperados mostrar um aumento na massa muscular, na resistência muscular (1-RM), no tamanho da fibra muscular e no teor de proteína. A suplementação é esperada aumentar o tempo até a exaustão/resistência ao exercício e melhorar o limiar da fadiga mental. EXEMPLO 19: TESTE DO EFEITO DO EXTRATO DE RHODIOLA OU RHAPONTICUM OU DA COMBINAÇÃO DE AMBOS NA SÍNTESE DE PROTEÍNA DO MÚSCULO APÓS TREINAMENTO DE RESISTÊNCIA EM MODELO ANIMAL

[00267] O extrato de Rhodiola ou o extrato de Rhaponticum sozinhos ou a combinação de ambos os extratos foram testados quanto ao seu efeito na estimulação de síntese da proteína muscular após um exercício de treinamento de resistência agudo.

[00268] ratos Wistar de 11 semanas de idade foram adquiridos de Charles River (Charles River Laboratories, L'Arbresle, Rhône, França) e alojados a uma temperatura ambiente e umidade constantes e mantidos num ciclo de luz/escuro de 12/12h. Eles foram alimentados com 30 g/dia de dieta de baixa proteína especial para os ratos, empobrecida em proteína, antioxidantes e vitaminas (ver tabelas abaixo mostrando a lista de ingredientes e os valores nutricionais da dieta) para se aproximar de uma dieta humana não fortificada recreativamente ativoae obtida pela SAFE (Scientific Animal Food & Engineering, Augy, France) e água foi dada ad libitum. Os ratos tinham 12 semanas de idade no início do experimento e, então, considerados como totalmente adultos. Tabela 19: Lista de ingredientes da dieta de baixa proteína A04 especial da SAFE (Augy, França)

Tabela 20: Valores nutricionais da dieta de baixa proteína A04 especial da SAFE (Augy, França)

[00269] O experimento foi realizado em 8 grupos de 8 ratos, que receberam o tratamento correspondente como indicado abaixo:

[00270] Grupo 1 (grupo de controle): 0,5 % CMC (carboxi- metil celulose) como veículo e controle negativo.

[00271] Grupo 2: 0,21 mg/ml proteína de soro de leite Milical

[00272] Grupo 3: 10 mg/ml de extrato de raiz de Rhodiola rosea

[00273] Grupo 4: 10 mg/ml de extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides

[00274] Grupo 5: 20 mg/ml de Rhodiola / Rhaponthicum, razão 50:50 (p/p)

[00275] Grupo 6: 10 mg/ml de Rhodiola / Rhaponthicum, razão 50:50 (p/p)

[00276] Grupo 7: 5 mg/ml de Rhodiola / Rhaponthicum, razão 50:50 (p/p)

[00277] Grupo 8: 2 mg/ml de Rhodiola / Rhaponthicum, razão 50:50 (p/p)

[00278] As doses equivalentes humanas correspondentes (em mg/kg de peso corporal e em mg/dia), bem como a dosagem correspondente em mg/kg de peso corporal de ratos são relatadas na Tabela 21 abaixo. Tabela 21: Doses equivalentes humanas usadas para alimentar grupos diferentes de animais no estudo do Exemplo 19

* Fórmula da FDA, 2005; Dose equivalente humana HED (mg/kg) = dose de animal em mg/kg x (peso do animal em kg/peso humano em kg)0,33.

[00279] O extrato seco de raiz de Rhaponticum carthamoides (F0- EtOH 50% pó seco) foi obtido por extração com etanol 50% (v/v) em água como descrito no Exemplo 1. O extrato pode preferencialmente conter aproximadamente (% p/p) 0,395% de 20HE, 0,79% de ecdisteriides totais e 13,4% de polifenol total (Folin ciocalteu) com base no peso seco total do extrato herbal.

[00280] O extrato etanólico de raiz de Rhodiola rosea pode ser obtido, que de preferência compreende aproximadamente (% p/p) 2,45% de salidrosidas, 1,14% de rosavina e 2,43% de rosavinas (como soma de rosarina, rosavina e rosina) com base no peso seco total do extrato herbal.

[00281] Ambos os extratos estavam numa forma de pó com <5% de umidade. Os extratos foram misturados numa razão de 50:50 (p/p) com base no peso total da composição. Nenhum transportador ou excipientes adicionais foram adicionados em alguns testes.

[00282] Esta combinação dos dois extratos de raiz de Rhodiola rosea e raiz de Rhaponticum carthamoides foi analisada quanto a compostos alvo. Treinamento

[00283] Após uma semana de adaptação 16 ratos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de 8 ratos. 72 horas antes do treinamento, os ratos realizaram uma sessão de aprendizagem para se familiarizarem com a escada e foram mantidos em jejum de 24 horas antes do experimento.

[00284] No dia do experimento, 4 ratos do mesmo grupo foram treinados em tempo oportuno numa escada de 1 metro de altura. Cada grupo de 4 ratos fez 10 subidas com uma carga que sucessivamente atingiu 0% da sua massa corporal, 50% e 75% da sua massa corporal. Entre cada subida, os ratos foram deixados repousar por 2 min. e 5 minutos entre cada conjunto.

[00285] Bolsas contendo pesos foram fixadas à base da cauda com fita.

[00286] Após o treinamento, os ratos ainda estavam em jejum e não receberam novo alimento. Administração de droga

[00287] As drogas foram administradas imediatamente após cada sessão de treinamento por gavagem oral.

[00288] Soluções foram preparadas extemporaneamente em 0,5% de CMC. Dissecação e remoção dos músculos

[00289] Duas horas após o treinamento, os ratos foram injetados intraperitonealmente com puromicina 10mM 100μL/25g (Sigma Aldrich, Número de Catálogo P8833) e foram anestesiados via uma injeção intraperitoneal de pentobarbital 150mg.kg-1 (PENTOBARBITAL ®).

[00290] Menos de 30 minutos após a injeção de puromicina, os músculos flexor digitorum profundus (FDP) direito, deltoide and bíceps foram colhidos e colocados em solução de isopentano, congelados rapidamente com nitrogênio líquido e armazenados a -80°C para posterior análise bioquímica. Extração e dosagem de proteína

[00291] 20 mg de cada amostra foram homogeneizados em 10 volumes de tampão de lise (Tris 20 mM pH 6,8, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Triton X-100 1%) com coquetéis de protease inibidores (P8340, Sigma Aldrich). As proteínas musculares totais são extraídas com IKA ULTRA TURRAX T25 digital. O homogenato foi girado 10 min. a 4°C e o sobrenadante coletado. Quantificação da síntese de proteína

[00292] A síntese de proteínas totais foi analisada por Western Blot antipuromicina.

[00293] 50 μg de amostras de proteína foram desnaturadas, separadas em SDS-PAGE 10% e transferidas para membrana de nitrocelulose. O anticorpo primário antipuromicina (anticorpo Anti-Puromicina, clone 12D10 de EMD Milipore (1/3000) foi aplicado durante a noite a 4°C e, subsequentemente, incubado com anticorpo secundário conjugado com peroxidase (ECL IgG anticamundongo de GE Healthcare UK Limited).

[00294] A quantificação da incorporação de puromicina em cadeias de proteínas (via a formação de uma ligação de peptídeo) por análise quantitativa de imagem de western blot é representativa da síntese proteica de novo (indução de síntese de proteína) em músculos in vivo e representa a estimulação da síntese de proteína após uma sessão de treinamento dependendo da administração da droga (Goodman e Hornberger, 2013). A síntese de proteína é, portanto, expressa como taxa relativa da síntese de proteína como uma % da condição de controle (grupo de animais alimentados com veículo) ou outras condições.

[00295] Todos os valores são expressos como média ± SEM. Fishers LSD ANOVA foi empregado para comparar dados. A significância foi ajustada em p<0,05.

[00296] Conforme ilustrado na Fig. 35a, mostrando western blot do músculo flexor digitorum profundus (FDP) de oito animais para cada tratamento e na Figura 35b mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para o grupo de controle negativo, o extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho, mas não extrato de raiz de Rhodiola rosea, foi capaz de estimular de forma significativa a síntese de proteína e numa menor extensão do que quaisquer concentrações (com dose decrescente) da combinação de ambos os extratos.

[00297] A combinação de extratos (para as quatro doses decrescentes testadas: de HED = 1.000mg/dia a 100 mg/dia) era de fato significativamente superior ao extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho ou extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho como mostrado nas Figuras 35d e 35e respectivamente (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de Rhodiola ou grupo de Rhaponticum respectivamente). Mais ainda, o efeito da combinação de extratos (para as quatro doses decrescentes testadas: de HED = 1.000mg/dia a 100 mg/dia) era também significativamente superior a proteínas de soro de leite como mostrado na Figura 35c (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de proteínas de soro de leite). A Tabela 22 ilustra a diferença entre os resultados obtidos utilizando diferentes doses da combinação em comparação com o que poderia ter sido esperado dos resultados do extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho ou extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho. Inesperadamente, o efeito na estimulação da síntese de proteína no FDP da combinação de reduzir pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhodiola rosea e pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides mostrou um efeito melhor do que Rhodiola ou Rhaponticum a concentração total sozinho. Isto é sinergia. Além disso, o efeito da combinação da metade de uma concentração de Rhodiola e metade de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (1,9 vezes mais) do que o esperado. Ainda adicionalmente, o efeito da combinação de um quarto de uma concentração de Rhodiola e um quarto de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (3,0 vezes mais) do que o esperado. Finalmente, o efeito da combinação de 10 vezes menos uma concentração de Rhodiola e 10 vezes menos uma concentração de Rhaponticum mostrou também um efeito maior (5,8 vezes mais) do que o esperado. Estes resultados demonstram claramente a sinergia da combinação de extratos na estimulação da síntese de proteína no músculo FDP após o exercício de resistência aguda a 500 mg/dia, 250 mg/dia e 100 mg/dia da razão de combinação 50:50 (p/p). Tabela 22: Síntese de proteína no músculo FDP (como unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de controle negativo)

fortes resultados inesperados com a combinação de extrato de raiz de Rhodiola rosea e extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides, razão de 50:50 (p/p)

[00298] Conforme ilustrado na Fig. 36a, mostrando western blot do músculo deltoide de oito animais para cada tratamento e na Figura 36b mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para o grupo de controle negativo, nem o extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho, nem o extrato de raiz de Rhodiola rosea, foram capazes de estimular de forma significativa a síntese de proteína, embora a combinação de ambos os extratos estimulasse de forma significativa a síntese de proteína no HED decrescente 1000mg/dia, 500mg/dia e 250 mg/dia.

[00299] A combinação de extratos (para três HED decrescentes: 500mg/dia a 100 mg/dia) era de fato significativamente superior ao extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho como mostrado na Figura 36d (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de Rhodiola). A combinação de extratos (de HED: 1.000mg/dia a 100 mg/dia) era também superior ao extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho como mostrado na Figura 36e (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de Rhaponticum). Mais ainda, o efeito da combinação de extratos (para HED = 1.000mg/dia a 500 mg/dia) era também significativamente superior a proteínas de soro de leite como mostrado na Figura 36c (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de proteínas de soro de leite). A Tabela 23 (abaixo) ilustra a diferença entre os resultados obtidos utilizando diferentes doses da combinação em comparação com o que poderia ter sido esperado dos resultados do extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho ou extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho. Inesperadamente, o efeito na estimulação da síntese de proteína no deltoide da combinação de reduzir pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhodiola rosea e pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides mostrou um efeito melhor do que Rhodiola ou Rhaponticum a concentração total sozinho. Isto é sinergia. Além disso, o efeito da combinação da metade de uma concentração de Rhodiola e metade de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (1,6 vezes mais) do que o esperado. Ainda adicionalmente, o efeito da combinação de um quarto de uma concentração de Rhodiola e um quarto de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (3,4 vezes mais) do que o esperado. Finalmente, o efeito da combinação de 10 vezes menos uma concentração de Rhodiola e 10 vezes menos uma concentração de Rhaponticum mostrou também um efeito maior (5,4 vezes mais) do que o esperado. Estes resultados demonstram claramente a sinergia da combinação de extratos na estimulação da síntese de proteína no músculo deltoide após o exercício de resistência aguda a 500 mg/dia, 250 mg/dia e 100 mg/dia da razão de combinação 50:50 (p/p). Tabela 23: Síntese de proteína no músculo deltoide (como unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de controle negativo)

[00300] Conforme ilustrado na Fig. 37a, mostrando western blot do músculo bíceps de oito animais para cada tratamento e na Figura 37b mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para o grupo de controle negativo, nem o extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho, nem o extrato de raiz de Rhodiola rosea, foram capazes de estimular de forma significativa a síntese de proteína, embora a combinação de ambos os extratos estimulasse de forma significativa a síntese de proteína no HED decrescente 1000mg/dia, 500mg/dia e 250 mg/dia.

[00301] A combinação de extratos (HED: 1.000mg/dia e 500 mg/dia) era de fato significativamente superior ao extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho como mostrado na Figura 37d (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de Rhodiola). A combinação de extratos (HED: 1.000mg/dia e 500 mg/dia) era também superior ao extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho como mostrado na Figura 37e 1.000mg/day (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de Rhaponticum). Mais ainda, o efeito da combinação de extratos (para HED = 1.000mg/dia a 500 mg/dia) era também significativamente superior a proteínas de soro de leite como mostrado na Figura 37c (mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de proteínas de soro de leite). A Tabela 24 (abaixo) ilustra a diferença entre os resultados obtidos utilizando diferentes doses da combinação em comparação com o que poderia ter sido esperado dos resultados do extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho ou extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho. Inesperadamente, o efeito na estimulação da síntese de proteína no bíceps da combinação de reduzir pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhodiola rosea e pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides mostrou um efeito melhor do que Rhodiola ou Rhaponticum a concentração total sozinho. Isto é sinergia. Além disso, o efeito da combinação da metade de uma concentração de Rhodiola e metade de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (2,0 vezes mais) do que o esperado. Ainda adicionalmente, o efeito da combinação de um quarto de uma concentração de Rhodiola e um quarto de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (2,5 vezes mais) do que o esperado. Finalmente, o efeito da combinação de 10 vezes menos uma concentração de Rhodiola e 10 vezes menos uma concentração de Rhaponticum mostrou também um efeito maior (5,0 vezes mais) do que o esperado. Estes resultados demonstram claramente a sinergia da combinação de extratos na estimulação da síntese de proteína no músculo bíceps após o exercício de resistência aguda a 500 mg/dia, 250 mg/dia e 100 mg/dia da razão de combinação 50:50 (p/p).

[00302] Tabela 24: Síntese de proteína no músculo bíceps (como unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de controle negativo)

*: fortes resultados inesperados com a combinação de extrato de raiz de Rhodiola rosea e extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides, razão de 50:50 (p/p)

[00303] Conforme ilustrado na Fig. 38, mostrando unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizadas para carregamento de proteína total quantitativa e para o grupo de controle negativo para todos os músculos combinados (FDP + deltoide + bíceps), o extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho, mas não extrato de raiz de Rhodiola rosea, foi capaz de estimular de forma significativa a síntese de proteína e numa menor extensão do que quaisquer concentrações (com dose decrescente) da combinação de ambos os extratos. A combinação de extratos foi significativamente superior ao extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho para as quatro doses decrescentes testadas (de HED = 1.000 mg/dia a 100 mg/dia) e foi significativamente superior ao extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho a HED = 1.000mg/dia e 500 mg/dia. Mais ainda, todas as doses da combinação de extratos testada (de HED = 1.000mg/dia a 100 mg/dia) foram significativamente superiores a proteínas de soro de leite.

[00304] A Tabela 25 (abaixo) ilustra a diferença entre os resultados obtidos utilizando diferentes doses da combinação em comparação com o que poderia ter sido esperado dos resultados do extrato de raiz de Rhodiola rosea sozinho ou extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides sozinho. Inesperadamente, o efeito na estimulação da síntese de proteína em todos os músculos da combinação de reduzir pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhodiola rosea e pela metade a concentração de extrato de raiz de Rhaponticum carthamoides mostrou um efeito melhor do que Rhodiola ou Rhaponticum a concentração total sozinho. Isto é sinergia. Além disso, o efeito da combinação da metade de uma concentração de Rhodiola e metade de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (1,8 vezes mais) do que o esperado. Ainda adicionalmente, o efeito da combinação de um quarto de uma concentração de Rhodiola e um quarto de uma concentração de Rhaponticum mostrou um efeito maior (3,0 vezes mais) do que o esperado. Finalmente, o efeito da combinação de 10 vezes menos uma concentração de Rhodiola e 10 vezes menos uma concentração de Rhaponticum mostrou também um efeito maior (5,4 vezes mais) do que o esperado. Estes resultados demonstram claramente a sinergia da combinação de extratos na estimulação da síntese de proteína em todos os músculos (FDP + deltoide + bíceps combinados) após o exercício de resistência aguda a 500 mg/dia, 250 mg/dia e 100 mg/dia da razão de combinação 50:50 (p/p). Tabela 25: Síntese de proteína nos músculos FDP, deltoide e bíceps combinados juntos (como unidades arbitrárias de níveis de puromicina normalizados para carregamento de proteína total quantitativa e para grupo de controle negativo)

[00305] As modalidades descritas são suscetíveis a várias modificações e formas alternativas, e exemplos específicos das mesmas foram mostrados a título de exemplo nos desenhos e são aqui descritos em detalhes. Deve ser entendido, no entanto, que as modalidades descritas não serão limitadas às formas particulares ou métodos descritos, mas pelo contrário, a presente divulgação é para cobrir todas as modificações, equivalentes e alternativas.

REFERÊNCIAS

[00306] Goodman CA, Hornberger TA. Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques? Exercise and sport sciences reviews. 2013; 41(2):107-115. doi:10.1097/JES.0b013e3182798a95, aqui incorporadas para referência.

Claims

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de raiz de Rhaponticum e um extrato de raiz de Rhodiola, em que o extrato de raiz de Rhaponticum e o extrato de raiz de Rhodiola são obtidos por extração com etanol em água e a composição compreende o extrato de raiz de Rhodiola em uma quantidade de 1 a 50% em peso da composição e o extrato de raiz de Rhaponticum em uma quantidade de 50 a 99% em peso da composição, ou a composição compreende o extrato de raiz de Rhodiola em uma quantidade de 50 a 99% em peso da composição e o extrato de raiz de Rhaponticum em uma quantidade de 1 a 50% em peso da composição.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteronas, tal como cerca de 0,5% a 3% de ecdiesteronas.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato de Rhaponticum compreende cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteroides, tal como cerca de 0,4% a 5% de ecdiesteroides.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende cerca de 0,1% a 5,0% de 20-hidroxiecdisona.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato de Rhodiola compreende cerca de 1% a 4% de salidrosidas e/ou cerca de 1% a 10% de rosavinas.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato de Rhodiola compreende cerca de 1% a 10% de rosavina.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição compreende cerca de 1% a 99% de extrato de Rhodiola.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o extrato de Rhodiola compreende: cerca de 1% a 4% de salidrosidas, cerca de 0,5% a 10% de rosavina, e cerca de 0,5% a 10% de rosavinas totais; e em que o extrato de Rhaponticum compreende: cerca de 0,1% a 5,0% de 20-hidroxiecdisona, e cerca de 0,1% a 10% de ecdiesteronas totais.

9. Uso de uma composição conforme definida na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para administração oral para aumentar síntese de proteína ou reduzir proteólise de proteína em um indivíduo, em que a composição opcionalmente compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.

11. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a composição conforme definida na reivindicação 1, em que a referida formulação é formulada para administração oral e, opcionalmente, compreende ainda um carreador farmaceuticamente aceitável.

12. Uso da composição conforme definida na reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para administração oral para aumentar síntese de proteína, reduzir sarcopenia, reduzir massa muscular, reduzir atrofia muscular ou desuso ou decondicionamento em um indivíduo, em que a composição opcionalmente compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano ou animal.

14. Uso de uma composição conforme definida na reivindicação 8 caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para administração oral para reduzir proteólise de proteína, aumentar massa muscular ou aumentar resistência muscular em um indivíduo, em que a composição opcionalmente compreende um carreador farmaceuticamente aceitável.

15. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 14, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração em uma quantidade de cerca de 5 a 50 mg por kg do indivíduo por dia da composição, tal como cerca de 50 a 500 mg/dia da composição ou cerca de 50 a 2.000 mg/dia da composição.