CN102727560B

CN102727560B - 红景天在预防和治疗肌萎缩疾病中的应用

Info

Publication number: CN102727560B
Application number: CN201210236548.7A
Authority: CN
Inventors: 陈晓萍; 张鹏; 高月; 范明; 阚光捍; 刘红菊; 白延强
Original assignee: China Astronaut Research and Training Center
Current assignee: China Astronaut Research and Training Center
Priority date: 2012-07-09
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2032-07-09
Also published as: CN102727560A

Abstract

本发明涉及红景天在预防和治疗肌萎缩疾病中的应用。本发明通过实验证明红景天能够抑制肌萎缩发生过程中肌萎缩特异因子Atrogin-1的表达、骨骼肌纤维横截面积的减少，并能调控肌萎缩中肌纤维类型相关蛋白的含量，使慢肌纤维蛋白增加和快肌纤维蛋白减少，从而对抗肌萎缩的发生。因此，本发明证明了利用红景天作为活性成分可制备预防和治疗骨骼肌萎缩性疾病的药物。

Description

红景天在预防和治疗肌萎缩疾病中的应用

技术领域：

本发明涉及植物药红景天的新用途，具体涉及红景天或红景天提取物在预防和治疗肌萎缩疾病中的应用。

背景技术：

骨骼肌按照本身的代谢类型特性可分为慢肌和快肌，分别由慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白组成。生理状态下，骨骼肌蛋白及其快慢肌纤维蛋白的合成和降解处于动态平衡。但临床肌营养不良性疾病（如杜氏肌营养不良、脊髓侧索硬化症等）、废用性肌萎缩（长期卧床、外伤制动、航天飞行中失重性肌萎缩等）、去/失神经性肌萎缩、老年性肌萎缩、恶性疾病（如癌症晚期恶病质、心脏衰竭、肾衰竭、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、艾滋病及长期应用糖皮质激素等疾病）晚期的肌萎缩等，骨骼肌蛋白质代谢失衡，表现为骨骼肌重量明显减轻、肌纤维横截面积的减小、肌纤维类型相关蛋白（即慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白）的选择性丢失等特征性改变，导致肌力下降、运动障碍、易疲劳和代谢紊乱等，严重影响日常工作和生活。但目前临床尚无很好的治疗方法。

骨骼肌中蛋白质的含量占到了肌肉总重量的80%以上，骨骼肌的生理功能主要由蛋白质完成，因此，骨骼肌蛋白质代谢的平衡在维持骨骼肌以及机体的正常状态和功能中起着关键的作用。

国内外研究表明，在肌萎缩过程中，蛋白质合成与降解的动态平衡受到破坏，蛋白质降解增加是导致骨骼肌萎缩的根本原因（Russell AP,Clinical and ExperimentalPharmacology and Physiology,37,378–384,2010;Glass DJ,Curr Opin Clin Nutr MetabCare 13:225–229,2010）。目前已公认，包括骨骼肌营养不良性疾病、废用性肌萎缩、去神经性肌萎缩以及癌症晚期恶病质和艾滋病等严重疾病并发性肌萎缩等几乎所有类型肌萎缩，其最终的共同改变是骨骼肌特异的萎缩因子Atrogin-1表达增加，骨骼肌蛋白降解大于合成，引起骨骼肌纤维横截面积减小以及肌纤维类型相关蛋白改变，导致肌萎缩的发生（Bodine SC,et al.Science,294:1704-1708,2001;Foletta VC,et al.Pflugers Arch-Eur J Physiol,461:325-335,2011）。因此，通过抑制Atrogin-1的表达、增加肌纤维横截面积和调节肌纤维类型相关蛋白含量，可预防和治疗骨骼肌萎缩疾病的发生发展，提高工作和生活能力。

红景天拉丁文学名Rhodiola rosea，英文名Roseroot，是景天科多年生草木或灌木植物，生长在海拔800-2500米高寒无污染地带的珍稀野生植物。尽管已知红景天素有“高原人参”的美称，具有抗缺氧、抗辐射以及对神经、认知和决策能力等的调节保护作用，可开发应用于深海、高原等特殊环境中的工作人员，以提高机体对恶劣环境的适应能力，故称为“适应原”药材（Panossian A，et al.Phytother Res,19(10):819-38,2005）。但迄今为止，未见红景天作为主要有效成分用于预防和治疗骨骼肌萎缩的相关报道。

发明内容：

本发明的目的在于开发红景天的新用途。具体目的是通过实验证明红景天能够抑制肌萎缩发生过程中肌萎缩特异因子Atrogin-1的表达、骨骼肌纤维横截面积的减少，并能调控肌萎缩中肌纤维类型相关蛋白的含量，使慢肌纤维蛋白增加和快肌纤维蛋白减少，从而对抗肌萎缩的发生。最终用红景天制备出预防和治疗骨骼肌萎缩性疾病的药物。

本发明用以下实验证实了红景天的新功能：

1、抑制肌肉萎缩过程中萎缩特异因子Atrogin-1的表达

喂食安慰剂对照组及红景天组猕猴，-10度头低位卧床28天后，利用实时定量realtime PCR方法，检测肌萎缩特异因子Atrogin-1 mRNA表达的变化，检测结果表明：

对照组猕猴肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA的表达增加了1.3倍（^**P<0.01）；

红景天组猕猴比目鱼肌内Atrogin-1mRNA的表达仅增加67%（^**P<0.01），与对照组相比，Atrogin-1mRNA的表达受到了明显抑制（^$P<0.05）。详见实验一。

2、抑制肌肉萎缩过程中肌纤维横截面积的减小

用安慰剂或红景天提取物，按照0.1g/kg的剂量每日喂食猕猴，对照组猕猴头低位卧床28天后，比目鱼肌肌纤维横截面积比卧床前下降了22%（^**P<0.01），而喂食红景天实验组猕猴比目鱼肌肌纤维横截面积下降仅6.8%（^*P<0.05）；下降率较未喂食红景天对照组猕猴的变化显著减少（^$$P<0.01），提示红景天对抗了肌萎缩形成中肌纤维横截面积的下降，即抑制了肌纤维的萎缩。详见实验二。

3、抑制肌肉萎缩过程中慢肌纤维蛋白的丢失和快肌纤维蛋白的增加

对照组猕猴头低位卧床28天后，比目鱼肌内慢肌纤维标志性蛋白（Troponin I-SS）的表达相对于卧床前（0天）减少了26%（^**P<0.01）,快肌纤维蛋白增加；而喂食红景天实验组猕猴比目鱼肌内慢肌纤维标志性蛋白（Troponin I-SS）的表达相对于卧床前（0天）增加了15%（^*P<0.05），与对照组卧床后相比增加了55%（^##P<0.01）；快肌纤维标志性蛋白（Troponin I-FS）的表达与对照组卧床后相比减少了15%（^#P<0.05）。提示红景天抑制了肌萎缩形成过程中慢肌纤维蛋白的丢失和快肌纤维蛋白的增加。详见实验三。

以上实验所用受试品红景天提取物，购买自北京四环制药有限公司,批准文号:军药证字Z2009001。

本发明的有益效果是：

首次发现和证实了红景天对于治疗肌肉萎缩性疾病的新功能。

本发明通过实验证明红景天能够抑制肌肉萎缩发生过程中肌萎缩特异因子的表达和肌纤维横截面积的减小。并发现红景天具有抑制肌萎缩的慢肌纤维减少和快肌纤维增加的作用。

而抑制肌萎缩特异因子的表达，增加肌纤维横截面积和肌肉中慢肌纤维蛋白含量是公认的改善肌萎缩状态的先决条件。因此，本发明证明了利用红景天作为原料药物可用于制备预防和治疗肌肉萎缩性疾病的药物。

附图说明

图1.Real time PCR检测对照组及喂食红景天组猕猴头低位卧床28天前后比目鱼肌内肌萎缩特异因子Atrogin-1 mRNA的表达变化。

图2.组织免疫荧光显示对照组及喂食红景天组猕猴头低位卧床前（0天）及卧床28天后比目鱼肌肌纤维的横截面积。

图3.Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及喂食红景天组猕猴头低位卧床前（0天）及卧床28天后比目鱼肌肌纤维的横截面积的变化。

图4.Western blot检测对照组及喂食红景天组猕猴头低位卧床28天前后比目鱼肌内快、慢肌纤维蛋白（Troponin I-FS、Troponin I-SS）的表达变化。Troponin IFS和TroponinI-SS是肌钙蛋白抑制亚单位存在于快肌纤维和慢肌纤维中的亚型，分别可以反映快肌纤维蛋白和慢肌纤维蛋白的含量；beta Actin为内参，可以反映总蛋白上样量的一致。

图5.Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及喂食红景天组猕猴头低位卧床前（0天）及卧床28天后比目鱼肌内慢肌纤维蛋白的相对表达量。

图6.Image-Pro Plus6.0软件统计对照组及喂食红景天组猕猴头低位卧床前（0天）及卧床28天后比目鱼肌内快肌纤维蛋白的相对表达量。

具体实施方式

以下实验中所用的实验动物及材料来源如下：

实验动物：猕猴30只，年龄6-8岁，体重10-11公斤，体长85-95厘米，雄性。北京协尔鑫生物资源研究所提供，生产许可证号为：SCXK(京)2010-0007。

受试药物：红景天提取物胶囊。受试品红景天提取物，购买自北京四环制药有限公司。其原料为景天科植物大株红景天Rhodiola Kirilowii(Regel)Regel的干燥根及根茎，主要产地为西藏、四川、青海,本品符合中国药典2005版红景天项下有关规定。

其它材料来源：

组织包埋剂购自Thermo公司；

兔源laminin抗体购自Abcam公司；

羊抗兔FITC荧光标记二抗购自Invitrogen公司；

Trizol、反转录酶购自Invitrogen公司；

SYBR购自ABI公司。

兔源Troponin I-SS抗体购自Aviva公司；

兔源Troponin I-FS抗体购自Aviva公司；

兔源beta actin抗体购自Santa Cruz公司；

主要器械：Bio-Rad电泳仪，Bio-Rad电泳槽及湿转电转槽，ABI Step-one plus realtime PCR仪，三洋冰冻切片机，Leica激光共聚焦显微镜。

实验一：红景天对猕猴肌萎缩形成过程中肌萎缩特异因子Atrogin-1表达的影响

1.实验目的：

本实验通过提取对照组及红景天组猕猴卧床前后比目鱼肌RNA，利用realtime PCR的方法，检测红景天对猕猴肌萎缩形成过程中比目鱼肌内肌肉萎缩特异因子Atrogin-1基因水平表达的影响。

2.实验方法：

2.1猕猴骨骼肌萎缩模型的建立及分组

按照国际动物实验伦理学和操作规程要求，根据国际公认的猕猴骨骼肌萎缩模型方法（Shenkman BS，et al.J Gravit Physiol.7(2):P101-2,2000），制备本实验所用的猕猴骨骼肌萎缩模型。主要步骤为通过绑定的方式安全可靠地将猕猴固定于实验床，其装置能精确固定猕猴于－10°头低位卧床状态，饮食装置满足猕猴在此卧床状态下可自由取食、饮水。实验室过程中，最大限度地减少生理损伤和应激反应，使受试猕猴心理感受平稳，确保猕猴的基本生活和生理体征相对稳定。

将30只猕猴按照年龄和体重相近的原则分为两组，在头低位卧床28天期间，按照0.1g/kg的剂量每日喂食安慰剂或红景天胶囊。

2.2组织取材：

猕猴头低位卧床前（0天）及28天后，将对照组及喂食红景天组猕猴用异氟烷将动物全身麻醉，在无菌外科手术间，按照文献实验方法（Fitts RH,et al.Am J PhysiolRegulatory Integrative Comp Physiol,279:R1546–R1557,2000）取材。重要步骤为用外科剪分别在左侧（0天）及右侧（28天）下肢外侧中段剪开一3-4cm切口，钝性分离以暴露比目鱼肌，用外科剪或手术刀循肌纤维走向横向切取比目鱼肌，用于后续研究。

2.3组织RNA的提取、检测与定量

A、组织裂解:取50-100mg组织加入到1ml Trizol中研磨,注意样品总体积不要超过Trizol体积的10%,待充分匀浆后放置30min.

B、各相分离：按0.2ml氯仿/1ml Trizol的比例加入氯仿，盖紧剧烈混匀15秒，室温放置2-3分钟。4℃，12000g离心15分钟。之后吸取上清水相置于另一新的EP管中。

C、沉淀RNA:按0.5ml异丙醇/1ml Trizol的比例，向吸取的水相中加入异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟。4℃，12000g离心10分钟得到RNA沉淀。

D、漂洗RNA:弃去上清，按1ml75%乙醇/1ml Trizol的比例，加入75%的乙醇洗涤RNA沉淀两次，然后4℃，7500g离心沉淀5分钟，弃去上清。

E、重溶RNA：室温空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，以适量DEPC水溶解RNA沉淀,55℃-60℃水溶10分钟。

F、RNA纯度检测及定量：取1μl RNA溶液加入99μl DEPC水中混匀，用紫外分光光度计测定A260/A280的比值和浓度。

2.4反转录反应

25μL反应体系操作步骤：

a取0.5mL EP管，依次加入：

oligodT 1.0μL

RNA样品 2.0μg

加入DEPC水至总体积8μL。

b轻甩后,70℃10min,放-20℃3～5min,轻甩。

c在a管内加入：

5×Buffer 5μL

dNTP 10μL

RNasin 1μL

M-MLV 1μL

d42℃ 90min,95℃ 10min

e合成的cDNA于–20℃保存备用。

2.5引物设计

根据NCBI数据库序列利用DNAMAN软件设计引物，然后根据退火温度和序列特异性选择合适的引物进行合成（见表1）。

表1目的基因Atrogin-1及内参GAPDH引物序列

2.6real time PCR检测Atrogin-1mRNA的表达

50μL反应体系操作步骤：

cDNA 2μL

上游引物 1μL

下游引物 1μL

SYBR mix 25μL

无菌水 21μL

PCR反应条件：94℃变性5分钟。94℃40秒，62℃15秒，72℃20秒，40个循环。72℃延伸10分钟。

3.数据分析

数据以平均值±标准差表示，数据分析采用组间t检验。0.01＜p≤0.05表示具有统计学差异，p≤0.01表示具有显著性统计学差异。

4.实验结果

对照组猕猴头低位卧床28天后，肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA的表达比卧床前增加了1.3倍（^**P<0.01）；喂食红景天组猕猴比目鱼肌内Atrogin-1mRNA的表达比卧床前仅增加67%（^**P<0.01），与对照组相比，Atrogin-1mRNA的表达受到了明显抑制（^$P<0.05）。(见图1)

5.实验结论

红景天可通过抑制猕猴肌萎缩形成中肌萎缩特异因子Atrogin-1mRNA的表达,对抗肌萎缩。

实验二：红景天对猕猴肌萎缩中肌纤维横截面积降低的影响

1.实验目的：

观察红景天对抗猕猴肌萎缩中肌纤维横截面积降低的作用。

2.实验方法：

2.1组织冰冻切片

A、预冷：将盛有异戊烷的小烧杯放在液氮内，预冷10分钟。

B、包埋：用铂纸做成托，滴上包埋剂，将取出的新鲜组织放入包埋剂内，置于异戊烷中30秒-1分钟，待包埋剂变成乳白色。

C、切片：在轮转切片机上切片。

D、固定：将切片放置丙酮中固定5分钟，之后放置-20℃保存。

2.2免疫荧光染色检测肌纤维横截面积变化

A、将切片放置在PBST中，洗5分钟。

B、0.3%Triton X-100室温作用30分钟。

C、5%的羊血清室温封闭1小时。

D、加入抗Laminin一抗(1:500稀释)，4℃过夜。

E、PBST洗3次，每次10分钟。

F、加入FITC-标记IgG二抗（1:1000稀释），室温30分钟。

G、PBST洗3次，每次10分钟。

H、DAPI封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。

2.3应用Image-Pro Plus6.0软件对图像进行分析。

3.统计学分析

4.实验结果

同卧床前相比，喂食安慰剂对照组猕猴头低位卧床28天后，比目鱼肌肌纤维横截面积下降了22%（^**P<0.01），而喂食红景天实验组猕猴比目鱼肌肌纤维横截面积较卧床前下降仅6.8%（^*P<0.05）；下降程度较红景天对照组猕猴的程度显著减轻（^$$P<0.01）（见图2，图3）。

5.实验结论

红景天可通过抑制猕猴肌萎缩形成中肌纤维横截面积的下降，对抗肌萎缩。

实验三：红景天对猕猴肌萎缩形成过程中肌纤维类型相关蛋白表达的影响

1.实验目的：

本实验通过提取对照组及红景天组猕猴卧床前后比目鱼肌蛋白，利用Western blot的方法，检测红景天对猕猴肌萎缩形成过程中比目鱼肌内慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白表达的影响。

2.实验方法

2.1组织蛋白的提取

A、组织蛋白裂解液配制：见表2。

表2组织蛋白裂解液的组成成分及含量

所需试剂	原始浓度	体积
			Tris	1M	1ml
EDTA	0.5M	0.4ml
			NaCl	5M	3ml
Briji96	10%	8.75ml
			NP40	10%	1.25ml

以上成分加ddH2O至100ml，使用时加蛋白酶抑制剂PMSF、Leupeptin、Aprotinin至终浓度100μg/ml、2μg/ml和2μg/ml。

B、取50-100mg肌肉组织加入到1mL组织裂解液中（已加入蛋白酶抑制剂），用匀浆器在冰上充分匀浆。

C、冰上裂解30分钟。

D、4℃，12000g离心20分钟，取上清，置-80℃保存。

E、将0.2mg/ml的BSA稀释成一系列标准溶液(0、25、50、100、200μg/ml)，取标准溶液和适当稀释的待测样品各20μl，加入5倍稀释的蛋白浓度分析试剂中，振荡混匀后，595nm波长下测光密度值。以标准蛋白浓度的光密度值作标准曲线，计算待测样品蛋白浓度。

2.2SDS-PAGE电泳

A、灌胶：分别配制12%的分离胶和5%的积层胶，灌制分离胶和积层胶；

B、样品制备：在样品加入5×凝胶加样缓冲液(终浓度1×)，沸水变性3~5min；

C、上样：组织蛋白80μg/孔，蛋白分子量marker10μl/孔；

D、电泳：恒压电泳（积层胶90V，分离胶180V），电泳至凝胶底部；

E、取下凝胶，放入预冷的电转缓冲液中平衡5min。

2.3转膜（semi-dry）

A、裁剪与凝胶大小相同的厚滤纸和NC膜，在预冷的电转缓冲液中平衡5min.

B、在半干式电转仪的正极极板上依次放置4层厚滤纸、NC膜、凝胶和4层厚滤纸，赶走各层间的气泡，压上负极极板。

C、以1.25mA/cm2的恒流进行电转。

D、电转结束后，将膜置于TBS中漂洗3次，每次5min.

2.4抗原抗体反应

A、封闭：将转印膜放入杂交袋内，加入适量封闭液，室温轻摇2h.

B、一抗反应：倾掉封闭液，按照0.1ml/cm2的比例加入用封闭液稀释的一抗(TroponinI-SS或Troponin I-FS)，除尽气泡，封口，4度轻摇过夜。

C、漂洗：取出转印膜，用TBS-T洗3次，每次10min。

D、二抗反应：将转印膜放入杂交袋内，按照0.1ml/cm2的比例加入封闭液稀释的二抗，赶除气泡后封口，在室温振荡2h.

E、漂洗：取出转印膜，用TBS-T洗3次，每次10min。

2.5ECL显色

A、各取等体积ECL试剂A液、B液混合（按照每平方厘米转引膜0.125ml ECL混合液计算）。

B、将转印膜轻轻接触滤纸吸干液体，有蛋白质的一面朝上放在保鲜膜上。

C、将ECL混合液加到转印膜上，反应1min，提起转印膜，用滤纸吸干液体。

D、用保鲜膜覆盖转印膜，注意表面要平整。

E、用透明胶带将保鲜膜覆盖的转印膜固定在暗盒中，有蛋白的一面朝上。在暗室进行X光曝光，冲片观察结果。

2.6应用Image-Pro Plus6.0软件对图像灰度进行分析。

3.数据分析

4.实验结果

对照组猕猴头低位卧床28天后，比目鱼肌内慢肌纤维蛋白（Troponin I-SS）的表达比卧床前减少了26%（^**P<0.01）（见图4，图5），而喂食红景天组猕猴比目鱼肌内慢肌纤维蛋白的表达比卧床前不仅没有减少，甚至增加了15%（^*P<0.05），与对照组卧床后相比增加了55%（^##P<0.01）（见图4，图5）。

对照组猕猴头低位卧床28天后，比目鱼肌内快肌纤维蛋白（Troponin I-FS）的表达比卧床前增加了6%（见图4，图6），而喂食红景天组猕猴比目鱼肌内快肌纤维蛋白的表达比卧床前不仅没有增加，甚至减少了10%，与对照组卧床后相比减少了15%（^#P<0.05）（见图4，图6）。

5.实验结论

红景天能够增加骨骼肌内慢肌纤维蛋白的含量，并显著抑制肌萎缩中慢肌纤维蛋白（Troponin I-SS）的丢失和快肌纤维蛋白的增加，从而预防和对抗肌萎缩的形成。

Claims

1.红景天作为唯一活性成分在制备预防和治疗肌萎缩的药物中的应用，所述肌萎缩是骨骼肌纤维横截面积减小。

2.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩还包括慢肌纤维蛋白含量减少。

3.权利要求1所述的应用，所述肌萎缩还包括快肌纤维蛋白含量增加。