JP6726196B2 - 筋肉代謝改善のための組成物及び方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりこれ以降本明細書に組み込まれる、２０１５年２月３日に出願された米国特許出願第ＵＳ１４／６１２，９７３号の利益を主張する。

本開示は、筋タンパク質合成を増加させ、筋タンパク質分解を減少させ、筋肉量及び／または筋力を増加させ、ならびに有酸素／無酸素運動性能を向上させるための組成物及び方法を提供する。有用な組成物は、限定されないが、ラポンティクム及びロディオラの抽出物、ならびにそれらの組み合わせを含む。

一態様において、本発明は、ラポンティクム抽出物を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、ラポンティクム抽出物は、少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のエクジステロイド、例えば、約０．１〜１０％のエクジステロイドまたは約０．４％〜５％のエクジステロイド等を含む。いくつかの実施形態において、ラポンティクム抽出物組成物は、少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の２０−ヒドロキシエクジソン、例えば、０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソン等を含む。

別の態様において、本発明は、ロディオラ抽出物を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、ロディオラ抽出物は、少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％，または１０％のサリドロシド、例えば、約１％〜４％等を含む。いくつかの実施形態において、ロディオラ抽出物組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のロザビン類、例えば、約０．５％〜１０％または３％〜６％のロザビン類等を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のロザビン、例えば、約０．５〜１０％のロザビンまたは１％〜５％のロザビン等を含む。いくつかの実施形態において、ロディオラ抽出物組成物は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のロディオラ抽出物、例えば、約５０％〜９９％、６０％〜９５％、７０％〜９５％のロディオラ抽出物等を含む。

一態様において、本発明は、ラポンティクム抽出物及びロディオラ抽出物を含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、ラポンティクム抽出物は、少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のエクジステロイド、例えば、約０．１〜１０％のエクジステロイドまたは約０．４％〜５％のエクジステロイド等を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の２０−ヒドロキシエクジソン、例えば、０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソン等を含む。

いくつかの実施形態において、ロディオラ抽出物は、少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のサリドロシド、例えば、約１％〜４％等を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のロザビン類、例えば、約３％〜６％のロザビン類等を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のロザビン、例えば、約２％〜５％のロザビン等を含む。

いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のロディオラ抽出物、例えば、約５０％〜９９％、６０％〜９５％、７０％〜９５％のロディオラ抽出物等を含む。

別の態様において、本発明は、（ｉ）少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のエクジステロイド、例えば、約０．１〜１０％のエクジステロイドまたは約０．４％〜５％のエクジステロイド等と、（ｉｉ）少なくとも０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のサリドロシド、例えば、約１％〜４％等と、を有する組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の２０−ヒドロキシエクジソン、例えば、０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソン等を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のロザビン類、例えば、約３％〜６％のロザビン類等を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．７５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のロザビン、例えば、約２％〜５％のロザビン等を含む。

他の実施形態において、上記組成物のいずれが薬学的製剤に含まれてもよい。組成物は、意図される投与の経路に依存して、従来のかつ好適な任意の製剤に製剤化されてもよい。経口投与に好適な製剤は、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤を含む。任意選択的に、組成物は、薬学的に許容される賦形剤もしくは担体、または他の薬学的に活性なもしくは不活性な成分をさらに含有する。

本発明の他の態様は、前述の組成物または薬学的製剤のいずれかを対象に投与することによって、対象におけるタンパク質合成を増加させ、筋力を増加させ、かつ／またはタンパク質のタンパク質分解を減少させるための方法を含む。さらなる態様は、前述の組成物または薬学的製剤のいずれかを対象に投与することによって、対象における筋萎縮に関連するかまたはそれを特徴とする状態を治療するための方法を含む。組成物または製剤は、任意の適切な投与経路によって対象に投与されてもよい。一実施形態において、組成物は経口投与される。いくつかの実施形態において、対象は、１日当たり少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日、５０ｍｇ／ｋｇ／日、７５ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、２００ｍｇ／ｋｇ／日、４００ｍｇ／ｋｇ／日、６００ｍｇ／ｋｇ／日、８００ｍｇ／ｋｇ／日、１０００ｍｇ／ｋｇ／日、２０００ｍｇ／ｋｇ／日、３０００ｍｇ／ｋｇ／日、５０００ｍｇ／ｋｇ／日、またはそれ以上を投与される。一実施形態において、経口製剤は、約３０〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日である。別の実施形態において、経口製剤は、約５０〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、約約５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、または２００ｍｇ／ｋｇ／日未満である。さらなる実施形態において、経口製剤は、約２００〜５００ｍｇ／日、または約５０〜２０００ｍｇ／日であり得る。全１日用量は、単回投与量として投与されてもよいか、または異なる時間に投与される複数回投与量（例えば、１日当たり２回、３回、４回、またはそれ以上）に分割されてもよい。

種々の実施形態において、投与量は、患者のタイプ及び／または対象の体重に基づいて変更されてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、ヒト対象用の好適な投与量は、５０〜２０００ｍｇ／日または２００〜５００ｍｇ／日であり得る。いくつかの実施形態において、ヒト対象または反芻動物対象用の望ましい投与量は、５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日または２００ｍｇ／ｋｇ／日未満であり得る。

いくつかの実施形態において、対象は、筋肉減少症、筋肉減少性肥満、癌、多発性硬化症、筋ジストロフィー、固定（例えば、副木またはギプス）を必要とする骨折、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、脳卒中、または悪液質を含む状態について治療され得る。対象は、そのような状態を有し得るかまたは有すると診断され得、そのような状態は、突発性であり得るか、または別の状態に続発し得る。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、ヒトまたは動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、反芻動物等）を含む哺乳動物である。したがって、種々の実施形態において、本明細書に記載される組成物は、ヒトまたは動物用の食物、飼料製品、または栄養補助食品中に使用することができる。

実施例１１の抽出物中に同定された全フェノールのグラフである。 実施例１１の抽出物中に同定された全有機酸のグラフである。 実施例１１の抽出物中に同定された全遊離糖質のグラフである。； ３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物と、低濃度及び高濃度のアミノ酸とを用いてインキュベーションした後の、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるスレオニン３８９上のＳ６Ｋ１リン酸化の決定を示す棒グラフである。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 ３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物と、低濃度及び高濃度のアミノ酸とを用いてインキュベーションした後の、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるスレオニン３０８上のＡｋｔリン酸化の決定を示す棒グラフである。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 ３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物と、低濃度及び高濃度のアミノ酸とを用いてインキュベーションした後の、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定を示す棒グラフである。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 ３つの濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物を用いてインキュベーションした後のＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定を示す棒グラフである。 同上 ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物のみを用いて、または２つの濃度で組み合わせたインキュベーション後のＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定を示す棒グラフである。 同上 同上 同上 同上 ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物が、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるミオスタチン及びアトロジン遺伝子発現に及ぼす効果を示す棒グラフである。 同上 ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の共インキュベーションがＣ２Ｃ１２筋管におけるミオスタチン遺伝子発現に及ぼす効果を示す棒グラフである。 同上 同上 同上 ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の共インキュベーションがＣ２Ｃ１２筋管におけるアトロジン遺伝子発現に及ぼす効果を示す棒グラフである。 同上 同上 同上 ２つの濃度のラポンティクム抽出物の異なる調製物を用いたインキュベーション後のＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定を示す棒グラフである。 同上 同上 ラポンティクムの根の抽出プロセスを表すフローチャートである。 異なる溶媒を用いて得られた画分を表すフローチャートである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットの握力（Ｋｇの力）の増加を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットの握力（力（Ｋｇ）／体重（ｇ））の増加を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットの長指伸筋（ＥＤＬ）重量（グラム）を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットのＥＤＬ重量（全体重のパーセントとして）を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の、対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットのヒラメ筋重量（グラム）を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットのヒラメ筋重量（全体重のパーセントとして）を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群における、Ｗｉｓｔａｒラットの長指伸筋（ＥＤＬ）内タンパク質含有量を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群における、ＷｉｓｔａｒラットのＥＤＬ内タンパク質含有量を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群における、Ｗｉｓｔａｒラットのヒラメ筋のタンパク質含有量を示す棒グラフである。 ラポンティクム及びロディオラ組成物を用いた処理から４２日後の対照群及び実験群におけるＷｉｓｔａｒラットのヒラメ筋のタンパク質含有量を示す棒グラフである。 抗ピューロマイシンを用いて深指屈筋試料から抽出したタンパク質のウエスタンブロットである。 定量的な負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及び乳清タンパク質に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及びロディオラ・ロゼア処理に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及びラポンティクム・カルタモイデス処理に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 抗ピューロマイシンを用いて三角筋試料から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及び乳清タンパク質に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及びロディオラ・ロゼア処理に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及びラポンティクム・カルタモイデス処理に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 抗ピューロマイシンを用いて二頭筋試料から抽出されたタンパク質のウエスタンブロットである。Ｂ： 定量的な負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及び乳清タンパク質に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及びロディオラ・ロゼア処理に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 定量的な負荷量及びラポンティクム・カルタモイデス処理に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示すグラフである。＊有意差ｐ＜０．０５。＊＊有意差ｐ＜０．００１。 短期レジスタンストレーニングの運動後の、ラットの全ての筋肉（ＦＤＰ、三角筋、及び二頭筋の組み合わせ）のタンパク質合成レベルのグラフであり、定量的な負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す。＊陰性対照との有意差ｐ＜０，００１。‡乳清タンパク質との有意差ｐ＜０．０５。◇ロディオラ・ロゼア処理との有意差ｐ＜０．０５。■：ラポンティクム・カルタモイデス処理との有意差ｐ＜０．００１

また、図は、好ましい実施形態の説明を容易にすることを意図しているに過ぎないことにも留意されたい。図は、記載される実施形態のあらゆる態様を示すものではなく、また本開示の範囲を限定しない。

本開示は、タンパク質合成、筋肉量、及び／または筋力を増加させるための、哺乳動物、好ましくはヒトにおける薬学的または栄養補給用途のための新規組成物の例示的な実施形態を提供する実施例は、ロディオラ抽出物及びラポンティクム抽出物の組み合わせ、及び関連する合成組成物が、タンパク質合成を増加させ、タンパク質分解を減少し（アトロジン−１及びミオスタチンの発現を阻害する）、筋肉量及び筋力を増加させることができることを実証する。種々の実施形態において、ロディオラ・ロゼアの抽出物及び／またはラポンティクム・カルタモイデスの抽出物を含む組成物が提供される。合成組成物（すなわち、１つ以上の成分が植物抽出物由来ではない組成物）もまた開示される。

ラポンティクム抽出物
ラポンティクムの抽出物は、ラポンティクム・アコーレ（Ｌ．）ＤＣ．，ラポンティクム・オーリエアテンス（ａｕｌｉｅａｔｅｎｓｅ）Ｉｌｊｉｎ，ラポンティクム・オーストラレ（Ｇａｕｄｉｃｈ．），ラポンティクム・ベラルジオイデス（ｂｅｒａｒｄｉｏｉｄｅｓ）（Ｂａｔｔ．），ラポンティクム・カナリエンスＤＣ．，ラポンティクム・カルタモイデス（Ｗｉｌｌｄ．），ラポンティクム・コニフェルム（Ｌ．）Ｇｒｅｕｔｅｒ，ラポンティクム・コソニアヌム（ｃｏｓｓｏｎｉａｎｕｍ）（Ｂａｌｌ）Ｇｒｅｕｔｅｒ，ラポンティクム・シナロイデスＬｅｓｓ．，ラポンティクム・エグザルタトゥム（Ｗｉｌｌｋ．）Ｇｒｅｕｔｅｒ，ラポンティクム・フォンテクエリ（ｆｏｎｔｑｕｅｒｉ），ラポンチコイデス・ハヤスタナ（ｈａｊａｓｔａｎａ）（Ｔｚｖｅｌｅｖ）Ｍ．Ｖ．Ａｇａｂ．＆Ｇｒｅｕｔｅｒ，ラポンティクム・へレ二イフォリウム（ｈｅｌｅｎｉｉｆｏｌｉｕｍ）Ｇｏｄｒ．＆Ｇｒｅｎ．，ラポンチコイデス・イコニエンシス（ｉｃｏｎｉｅｎｓｉｓ）（Ｈｕｂ．−Ｍｏｒ．）Ｍ．Ｖ．Ａｇａｂ．＆Ｇｒｅｕｔｅｒ，ラポンティクム・インシグネ（Ｂｏｉｓｓ．）Ｗａｇｅｎｉｔｚ，ラポンティクム・インテグリフォリウムＣ．Ｗｉｎｋｌ．，ラポンティクム・カラタビクム（ｋａｒａｔａｖｉｃｕｍ）Ｉｌｊｉｎ，ラポンティクム・ロンギフォリウム（Ｈｏｆｆｍａｎｎｓ．＆Ｌｉｎｋ）Ｄｉｔｔｒｉｃｈ，ラポンティクム・リラツムＣ．Ｗｉｎｋｌ．ｅｘ Ｉｌｊｉｎ，ラポンティクム・ナマンガニクム（ｎａｍａｎｇａｎｉｃｕｍ）Ｉｌｊｉｎ，ラポンティクム・ナヌムＬｉｐｓｋｙ，ラポンティクム・ニティドゥムＦｉｓｃｈ，ラポンティクム・プルクルムＦｉｓｃｈ．＆Ｃ．Ａ．Ｍｅｙ．ラポンティクム・レペンス（Ｌ．）Ｈｉｄａｌｇｏ，ラポンティクム・スカリオスムＬａｍ．，ラポンティクム・セラチュロイデス（ｓｅｒｒａｔｕｌｏｉｄｅｓ） （Ｇｅｏｒｇｉ）Ｂｏｂｒｏｖ，ラポンティクム・ユニフローラム（Ｌ．）ＤＣ．を含む（これらに限定されない）いずれのラポンティクム種に由来してもよい。いくつかの実施形態において、ラポンティクムのハーブ抽出物は、キク科のラポンティクム属、またより具体的にはラポンティクム・カルタモイデス種から選択される植物から作製される。

抽出物は、ラポンティクム植物の任意の部位（複数可）から調製され得るが、根が特に有用である。ラポンティクムの根は、エタノール、メタノール、水、水中のエタノール、酢酸エチル、アセトン、ヘキサン、または任意の他の従来の抽出溶媒からなる群からの溶媒、好ましくは水中のエタノールまたは水、より好ましくは水中１０〜９０％ｖ／ｖのエタノール、またさらにより好ましくは水中３０〜７０％（ｖ／ｖ）のエタノールで抽出され得る。一実施形態において、抽出は、粉砕したラポンティクムの根を１：１〜３０：１の溶媒：植物比で溶媒と混合することにあり、植物は、単回の、または代替として２回の抽出（またはそれ以上の抽出）プロセスを経てもよい。抽出期間は、好ましくは＞１時間、最も好ましくは１．５時間である。好ましい実施形態において、ラポンティクムの根は、１０：１の比で水中のエタノール（５０％ｖ／ｖ）と混合され、３回の連続的な抽出を経る。抽出後、合わせた混合物を、濾過及び／または遠心分離し、上清を３０〜７０％ＤＭ、最も好ましくは５０％ＤＭに濃縮し、最終的には、粉末の形状等の＜１０％の水分を有する固体形状に乾燥することができる。当業者は、植物抽出物を調製する多数のプロセスを認識し、それらは、本明細書に開示される特定のプロセスに加えて本開示に使用され得る。

ラポンティクムの興味深い構成成分は、エクジステロイド、特に２０−ヒドロキシエクジソン（（２β，３β，５β，２２Ｒ）−２，３，１４，２０，２２，２５−ヒドロキシコレスト−７−エン−６−オン）である。この化合物は、調製物の品質を決定するための基準物質として使用することができるが、効果をもたらす唯一の化合物というわけではなく、化合物の混合物が、抽出物を２０ＨＥ単独よりも効果的にする可能性が高い（Ｔｉｍｏｆｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｖｏｌｄｏｖ ｅｔ ａｌ）。

いくつかの実施形態において、ラポンティクムの抽出物は、抽出物の総重量（ｗ／ｗ）に基づいて、少なくとも０．０１％の全エクジステロイド、約０．０５％〜９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％の全エクジステロイド、より好ましくは、抽出物の総重量（ｗ／ｗ）に基づいて、少なくとも約０．１〜１０％の全エクジステロイド、最も好ましくは０．４％〜５％の全エクジステロイドを含む。

いくつかの実施形態において、ラポンティクムの抽出物は、抽出物の総重量（ｗ／ｗ）に基づいて、少なくとも０．０１％の２０−ヒドロキシエクジソン（２０ＨＥ）、約０．０５％〜９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％の２０ＨＥ、より好ましくは、抽出物の総重量（ｗ／ｗ）に基づいて、少なくとも約０．１％〜５．０％の２０ＨＥを含む。

加えて、ラポンティクムの抽出物は、非限定的な例として以下のエクジステロイド等のエクジステロン以外のエクジステロイドも含んでもよい：ポリポジンＢ、マキステロンＡ、２−デオキシエクジステロン、インテグリステロンＡ、インテグリステロンＢ、タキステロン、アジュガステロンＣ、α−エクジソン、レステロン、ラピステロンＤ、イノコステロン、ラピステロン、２０−ヒドロキシエクジソン２，３；２０，２２−ジアセトニド、２０−ヒドロキシエクジソン２，３−モノアセトニド；２０−ヒドロキシエクジソン２０，２２−モノアセトニド；２２−オキソ−２０−ヒドロキシエクジソン、２４（２８）−デヒドロマキステロンＡ；（２４ｚ）−２９−ヒドロキシ−２４（２８）−デヒドロマキステロンＣ；カルタモステロン；ルブロステロン、ジヒドロルブロステロン；ポステロン、イソビテキシロン、ロイゼアステロン、マキステロンＣ、ポリポジンＢ２０，２２−アセトニド；ラピステロンＢ、ラピステロンＣ、ラピステロンＤ２０−アセテート、２４（２４’）（ｚ）−デヒドロアマラステロンＢ、ポリポジンＢ−２２−ベンゾエート；カルタモステロンＡ、カルタモステロンＢ；アマラステロンＡ；カルタモロイステロン；２４（２８）−デヒドロアマラステロンＢ、２２−デオキシ−２８−ヒドロキシマキステロンＣ；３−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン；２４−エピ−マキステロンＡ、１４−エピ−ポナステロンＡ２２−グルコシド；５−α−２０−ヒドロキシエクジソン；２０−ヒドロキシエクジソン２−アセテート、２０−ヒドロキシエクジソン３−アセテート；１β−ヒドロキシマキステロンＣ；２６−ヒドロキシマキステロンＣ；１５−ヒドロキシポナステロンＡ；イノコステロン２０，２２−アセトニド、ターケストン。

ラポンティクムの抽出物は、以下のエクジステロイドも含んでもよい：アブタステロン２５−アセトキシ−２０−ヒドロキシエクジソン３−ｏ−；β−Ｄ−グルコピラノシド；アセチルピナステロール；アキランテステロン；アジュガセタールステロンａ；アジュガセタールステロンｂ；アジュガリドｅ；アジュガステロンｂ；アジュガステロンｂ；アジュガステロンｃ３；２２−ジアセトニド；アジュガステロンｃ２２−エチリデン；アセタール；アジュガステロンｃ２２−モノアセトニド；アジュガステロンｄ；アマラステロンａ；アマラステロンｂ；アスターアスターｂ；アトロトステロンａ；アトロトステロンｂ；アトロトステロンｃ；ブレクノシドａ；ブレクノシドｂ；ボンビコステロール；ボンビコステロール３−ホスフェート；ブラフイステロン；カロニステロン；カルバスターａ；カルバスターｂ；カネッセンステロン；カピタステロン；カルペステロール；カスタステロン；ケイラントンａ；ケイラントンｂ；コロナタステロン；シアノステロンａ；シアステロン；シアステロン３−アセテート；シアステロン２２−アセテート；シアステロン３−モノアセトニド；シアチステロン；ダクリハイナンステロン；デクンベステロンａ；デヒドロアジュガラクトン；デヒドロアジュガラクトン；デヒドロアマラステロンｂ；デヒドロシアステロン２−グルコシド；３−デヒドロエクジソン；２−デヒドロ−３−エピ−２０−ヒドロキシエクジソン；及び／または２２−デヒドロ−１２−ヒドロキシシアステロン、デヒドロ−２０−ヒドロキシエクジソン；３−デヒドロ−２０−ヒドロキシエクジソン；デヒドロ−２４２−ヒドロキシマキステロンｃデヒドロ−１２−ヒドロキシ−２９−ノル−シアステロン；デヒドロ−１２−ヒドロキシ−２９−ノル−センゴステロン；デヒドロ−１２−ヒドロキシ−センゴステロン；（２８）−デヒドロマキステロンａ；２−デヒドロポストステロン；２４−デヒドロプレシアステロン；２−デオキシカスタステロン；２２−デオキシ−２１−ジヒドロキシエクジソン；２２−デオキシ−２６−ジヒドロキシエクジソン；２−デオキシ−２６−ジヒドロキシエクジソン；３−デオキシ−１（α）２０−ジヒドロキシエクジソン；２−デオキシ−２０−ジヒドロキシエクジソン２−デオキシ−ポリポジンｂ；２−デオキシエクジソン；デオキシエクジソン；２−デオキシエクジソン３−アセテート；２−デオキシエクジソン２２−アセテート；２−デオキシエクジソン２２−アデノシン−モノホスフェート；２−デオキシエクジソン２２−ベンゾエート；２−デオキシエクジソン３−４−（１−（β）−ｄ−グルコピラノシル）−フェルラ酸；２−デオキシエクジソン２２−（β）−ｄ−グルコシド；２５−デオキシエクジソン２２−ｏ−（β）−ｄ−グルコピラノシド；２−デオキシエクジソン２２−ホスフェート；２−デオキシエクジソン２５−ラムノシド；（５（α））−２−デオキシ−２１−ヒドロキシエクジソン；２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン；２２−デオキシ−２６−ヒドロキシエクジソン；１４−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン；２−デオキシ−２１−ヒドロキシエクジソン；２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン２５−アセテート；２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン２２−アセテート；（５（α））−２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン３−アセテート；２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン３−アセテート；２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン２２−ベンゾエート；及び／または２−デオキシ−２０−ヒドロキシエクジソン３−クロトネート。

ラポンティクムの抽出物は、ポリフェノール（特に、没食子酸、及びプロシアニジンＢ１としてのポリマー）を含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、フェノール化合物（特に、シナリン及びクロロゲン酸）を含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、フラボノイド、例えば、パツレチン、６−ヒドロキシケンフェロール−７−グルコシド、ケルセタギトリン、ケルセチン、ケルセタゲチン、ルテオリン、ケンフェロール、イソラムネチン、ケルセチン−３−メチルエーテル、ケルセチン−５−ｏ−β−Ｄ−ガラクトシド、イソラムネチン５−ｏ−α−Ｌ−ラムノシド、ケルセタゲチン−７−ｏ−β−グルコピラノシド；アピゲニン、アリオジクチオール、エリオジクチオール−７−β−グルコピラノシド、へスペリン、クリサンテミン、シアニンを含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、リグナン（カルタモゲニン、カルタモシド、トラケロゲニン、トラケロシド）を含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、タンニン（エラグ酸）を含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、セレトニンフェニルプロパノイドを含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、ポリアセチレンを含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、セスキテルペンラクトンを含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、トリテルペノイドグリコシド（ラポンティコシドＡ〜Ｈ）を含んでもよい。

ラポンティクムの抽出物は、トリテルペノイド（パルケオール、パルケイルアセタート）を含んでもよい。

ロディオラ抽出物
本開示はまた、ロディオラ・ロゼア及びロディオラ・クレヌラータを含む、約２００種を有する高地に生息する植物であるロディオラの抽出物も含む（Ｋｅｌｌｙ，Ａｌｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．６：２９３−３０２，（２００１）；Ｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｔｈｅｒ．Ｒｅｓ．１９：７４０−７４３，（２００５））。ロディオラ・ロゼアは、体が様々な物理的、科学的、及び環境的ストレスに適応及び抵抗するのを助けるアダプトゲンである。

本開示の組成物に使用されるロディオラの抽出物は、ロディオラ・ロゼア、ロディオラ・クレヌラータ、ロディオラ・サカリネシス、ロディオラ・サクラ、ロディオラ・アルギダ、ロディオラ・ドゥムローサ、ロディオラ・キリロウイ、ロディオラ・ヘンリ、ロディオラ・ユンナネンシスからなる群の任意の植物から作製することができる。抽出物は、ロディオラ植物の任意の部分から作製することができるが、根及び根茎から調製される抽出物が特に有用である。

ロディオラ種は、フェニルプロパノイド、例えば、ロザビン（（２Ｅ）−３−フェニルプロップ−２−エン−１−イル６−Ｏ−α−Ｌ−アラビノピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシド）、ロジン（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ）−２−（ヒドロキシメチル）−６−＼［（Ｅ）−３−フェニルプロップ−２−エノキシ］オキサン−３，４，５−トリオール）、及びロザリン（（２Ｅ）−３−フェニル−２−プロフェニル６−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシル−（９ＣＩ）；＼［（Ｅ）−３−フェニル−２−プロフェニル］６−Ｏ−α−Ｌ−アラビノフラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド；＼［（Ｅ）−３−フェニル−２−プロフェニル］６−Ｏ−（α−Ｌ−アラビノフラノシル）−β−Ｄ−グルコピラノシド）を含有し得る。ロディオラ種はまた、フェニルエタノール誘導体、例えば、サリドロシド／ロジオロシド（２−（４−ヒドロキシフェニル）エチルβ−Ｄ−グルコピラノシド）及びチロソール（４−（２−ヒドロキシエチル）フェノール）も含有し得る。ロディオラ種は、フラボノイド（例えば、ロジオリン、ロジオニン、ロジオシン、アセチルロダルギン及びトリシン）；モノテルペン（例えば、ロジリドール及びロザリジン）；トリテルペン（例えば、ダウコステロール及びβ−シトステロール）；フェノール酸（例えば、クロロゲン酸、ヒドロキシケイ皮酸、及び没食子酸）；タンニン、必須アミノ酸及び鉱物をさらに含有し得る。ｐ−トリオソール、サリドロシド、ロザビン、ピリドルデ（ｐｙｒｉｄｒｄｅ）、ロジオシン、及びロジオニン等の活性成分は、ほとんどのロディオラ種に見出されているが、その量は異なる。ロディオラ・ロゼアの興味深い１つの生理活性成分は、サリドロシドである。ロザビン類（例えば、ロザリン、ロジン、及びロザビンを合わせたもの）は、この植物から同定された別の生理活性構成要素である。サリドロシド及び／またはロザビン類は、調製物の品質を決定するための基準物質として使用することができる。

いくつかの実施形態において、ロディオラの抽出物は、抽出物の総乾燥重量に基づいて、少なくとも約０．１０％〜９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％のサリドロシド、より好ましくは少なくとも約１％〜４％のサリドロシドを含む。いくつかの実施形態において、ロディオラの抽出物は、抽出物の総乾燥重量に基づいて、少なくとも約０．１０％〜約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％のロザビン、より好ましくは少なくとも約２．０〜５％のロザビンを含む。いくつかの実施形態において、ロディオラの抽出物は、ハーブ抽出物の総重量に基づいて、少なくとも約０．１０％〜９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％のロザビン類（例えば、ロザリン、ロザビン、及びロジンを合わせたもの）、より好ましくは少なくとも約３または６％または１〜６％のロザビン類を含む。

抽出物の組み合わせ
いくつかの実施形態において、ロディオラの抽出物は、組成物の総重量に基づいて、約１〜９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％ｗ／ｗ（例えば、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９９％ｗ／ｗ）を含み、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量に基づいて、約９９％〜１％ｗ／ｗ（例えば、約１％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％もしくは約９９％ｗ／ｗ）を含む。

ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約５０〜９９％ｗ／ｗを含んでもよく、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量の約１〜５０％ｗ／ｗを含んでもよい。ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約１〜５０％ｗ／ｗを含んでもよく、ラポンティクムの抽出物は、約５０〜９９％ｗ／ｗを含んでもよい。ロディオラ及びラポンティクムの種々の好適な例示的割合は、以下の通りである。

ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約９０％ｗ／ｗであり、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量の約１０％ｗ／ｗである。ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約１０％ｗ／ｗを含み、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量の約９０％ｗ／ｗを含む。ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約６０％ｗ／ｗであり、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量の約４０％ｗ／ｗである。ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約４０％ｗ／ｗを含み、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量の約６０％ｗ／ｗを含む。ロディオラの抽出物は、組成物の総重量の約５０％ｗ／ｗであり、ラポンティクムの抽出物は、組成物の総重量の約５０％ｗ／ｗである。いくつかの実施形態において、ラポンティクムとロディオラとの質量比は、約６０：４０〜８０：２０である。一実施形態において、ラポンティクムとロディオラとの質量比は、約７５：２５である。

一実施形態において、抽出成分の総重量／組成物の総重量に基づいて、約５０％ｗ／ｗのロディオラ・ロゼア（根）の抽出物、及び約５０％ｗ／ｗのラポンティクム・カルタモイデス（根）の抽出物を含む組成物が提供される。ロディオラの抽出物は、１〜４％のサリドロシド、２〜５％のロザビン、及び３〜６％のロザビン類を含有し、ラポンティクムの抽出物は、０．３７％の２０ＨＥ及び０．７８％の全エクジステロンを含有する。いくつかの実施形態において、組成物は、約０．１％〜１０％のエクジステロン、または約０．５％の３％エクジステロンを含むことができる。

ロディオラ・ロゼア及びラポンティクム・カルタモイデスのハーブ抽出物の任意の好適な割合の組み合わせが本明細書に開示される組成物によって包含されることが想定される。本明細書に提供されるパーセンテージは、組成物の総重量に対する抽出物部分の乾燥重量のｗ／ｗ比を指す。

薬学的製剤
本明細書に記載される場合、種々の種の植物、ハーブ、またはそれらの一部が、疾患を治療するため及び筋肉代謝の改善を促進するための組成物及び方法の一部として選択されてもよい。そのような種の抽出物は、種々の好適な方法で調製され得る。一実施形態において、植物、ハーブ、またはそれらの一部の抽出物は、水及び／もしくはアルコール、またはその両方によって得られてもよく、次いで、乾燥させて微粉末にする。別の実施形態において、抽出は、超臨界ＣＯ_２抽出によって行われてもよい。

本開示の組成物は、例えば、本明細書に開示される任意の割合の少なくとも２つの抽出物（抽出物のうちの１つ以上）を含む、固体、液体、またはエアロゾル製剤の形態であってもよい。本開示の組成物は、他の構成成分、例えば、限定されないが、最終生成物の０．１〜９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、または１０％ｗ／ｗの量で製剤に加えられるビタミン、医薬品、または賦形剤等をさらに含んでもよく、したがって、抽出物の比はそれに応じて異なり得る。そのような組成物は、種々の製剤に製造することができ、筋成長及び筋力を促進するために哺乳動物に投与される。

一実施形態において、本発明の組成物は、カプセル剤に含有される。経口投与に好適なカプセル剤は、ゼラチンでできたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチン及び可塑剤（グリセロールまたはソルビトール等）でできた密封軟カプセル剤を含む。プッシュフィットカプセル剤は、ラクトース等の増量剤、デンプン等の結合剤、及び／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、ならびに任意選択的に安定剤と混合して活性成分を含有することができる。

投与用の液体は、溶液または懸濁剤であり得る。１つの例において、本発明の組成物は、乾燥粉末として提供される。対象は、好みの飲料（例えば、水、ソフトドリンク、フルーツジュース等）に粉末を溶解または懸濁させ、次いでその飲料を摂取する。代替として、本発明の組成物は、液体形態で提供される。錠剤、成形物質、またはカプセル剤の場合、剤形は、不均一な投薬に適合されるべきである。異なる用量レベルを有する単位は、例えば、ブリスターパックに予め包装し、摂取時間に関する表示を付けることができる。間隔は、ＢＩＤ、ＴＩＤ、ＱＩＤ、またはより頻繁であり得る。カプセル剤の場合、１つ以上の遅延作用性ペレットが、長時間作用性ビーズとともに含まれてもよい。明らかに、製剤化するための他の代替方式が存在する。一例として、長時間作用性微粒子と、好適な量の１つ以上の量のさらなる遅延作用性微粒子を有する粒子とが、混合及びカプセル化されてもよい。マトリックス基質が、２、３、または４つの多層錠剤または圧縮被覆錠剤を形成するために使用され得る。圧縮被覆錠剤は、遅延作用性コアを有することができる。使用時間を示すように放送された被覆及び非被覆錠剤を含み得る、別様に製剤化した多層及び圧縮被覆錠剤が使用されてもよい。不均一な投薬を提供するために、長時間作用性及び遅延作用性の微粒子が非経口液に同様に懸濁されてもよい。

いくつかの実施形態において、そのような選択された種の乾燥及び粉末化等の抽出物が調製され得る。さらなる実施形態において、抽出物は、乾燥する前に濃縮されてもよく、それは抽出物のかさを減少させるために望ましい場合がある。そのような濃度は、天然植物、ハーブ、またはそれらの一部の包括的な特徴及びマーカー化合物のレベルを保持する一方で、抽出物のかさを減少させることができる。

さらなる実施形態において、低水温処理法が使用されてもよい。そのようなプロセスは、多糖類、フラボノイド、テルペン及び有用な揮発性物質、油及び樹脂（これらの一部は、典型的にはアルコールまたはヘキサンによってのみ補足され、それらはどちらも望ましくない痕跡を残す）等の支持構成要素の大部分を補足し得るため、望ましい場合がある。抽出された植物材料は、次いで濃縮されてもよく、濃縮された液体は、例えば、微粉末等を生成する超高速噴霧乾燥機を使用して乾燥させてもよい。いくつかの実施形態において、粉末になるように乾燥させるハーブ抽出物の濃縮は、植物の構成部分の組成を著しく変化させることなく、ハーブ粉末のかさを減少させることができる。そのような方法は、ハーブ材料に導入され得る望ましくない化学的痕跡を減少させるために望ましい場合があり、したがって、より純度の高い、最高のハーブ粉末を得ることができる。例えば、材料のかさを著しく減少させ、カプセル剤として便利な投薬を提供することができる、１０対１〜２０対１の濃度比を得ることができる。

「薬学的に許容される担体」は、調製物の製剤化または安定化の助けとなるように活性成分に加えられてもよく、かつ患者に対して著しく有害な毒物学的影響を引き起こさない物質であるそのような担体の例は当業者には周知であり、水、糖類、例えば、マルトースまたはスクロース、アルブミン、塩、例えば、塩化ナトリウム等を含む。他の担体は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎのＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。そのような組成物は、治療有効量のロディオラ及びラポンティクム抽出物を含有する。

薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散液、及び無菌注射液または分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のための媒体及び媒介の使用は、当該技術分野において既知である。組成物は、好ましくは経口摂取用に製剤化される。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他の秩序構造として製剤化することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。場合によっては、担体は、組成物中に等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含む。

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「担体」は、用いられる投与量及び濃度で担体に曝露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。生理学的に許容される担体は、しばしば、水性ｐＨ緩衝液である。生理学的に許容される担体の例として、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の糖質；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣ等の非イオン界面活性剤が挙げられる。

薬学的に許容される担体はまた、マルトデキストリン、アラビアガム（Ｅ４１４）、二酸化ケイ素（Ｅ５５１）、タピオカデキストリン、デキストリン、アカシアガム等の天然及び非天然の担体を含む。

本発明はまた、上に列挙したものと同じ活性成分を同じ割合で有する合成製剤も含む。これらの成分は、抽出物中に通常存在する任意の他の天然起源の植物材料を含むことなく、精製または合成され、組成物及び製剤に含められ得る。

使用方法
ロディオラ抽出物は、骨格筋細胞においてタンパク質合成を増加させ、かつミオスタチン及び／またはアトロジン遺伝子発現を減少させるために使用され得る。ラポンティクム抽出物は、骨格筋細胞において、タンパク質合成を増加させ、Ａｋｔ経路メンバーのリン酸化を増加させ、Ｓ６Ｋ１リン酸化を増加させ、かつ／またはミオスタチン及び／もしくはアトロジン遺伝子発現を減少させるために使用され得る。

さらなる実施形態において、ロディオラ抽出物及びラポンティクム抽出物の組み合わせは、単独で投与された場合のそれぞれの機能と比較してそれらの機能を増強する量で投与され得る。

さらに別の態様において、哺乳動物に有効量の本明細書に記載される組成物を投与することを含む、哺乳動物における筋肉量及び筋力を改善するための方法が提供される。哺乳動物は、好ましくはヒトであり、より好ましくは運動選手である。本開示のさらなる態様において、哺乳動物に有効量の本明細書に開示される組成物を投与することを含む、哺乳動物における有酸素及び無酸素運動／身体能力を促進させるための方法が提供される。さらに別の態様において、哺乳動物に有効量の本明細書に記載される組成物を投与することを含む、哺乳動物における筋萎縮に関連するかまたはそれを特徴とする状態を治療するための方法が提供される。

いくつかの実施形態において、組成物は、約１〜５０００ｍｇ／日、好ましくは約３０〜１０００ｍｇ／日、より好ましくは約５０〜１０００ｍｇ／日、及びさらにより好ましくは約１００〜６００ｍｇ／日または２００〜５００ｍｇ／日の１日用量で、哺乳動物、好ましくはヒトに経口投与される。約０．５ｍｇ／日というより少ない用量、または５０００ｍｇ／日を超える用量が提供されてもよい。いくつかの実施形態において、１用量当たり１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００ｍｇ、またはそれ以上の複数の１日用量が提供される。

投薬の間隔は、従来、ＱＤ（１日１回）、ＢＩＤ（１日２回）、ＴＩＤ（１日３回）、ＱＩＤ（１日４回）、またはそれ以上の頻度であり、１日当たり５、６、７、８、９、１０用量、またはそれ以上を含む。投与期間は、半減期、用いられる剤形の製剤、全身反応、利便性、自己投与されるかまたは管理されているか、及びその物質が治療的、栄養的、ステロイド性、または抗感染性であるかに基づき得る。

組成物が制御放出されるか、またはＱＤ投与を許容する長い半減期を有しない限り、用量を摂取する時間間隔は不均一であり得る。例えば、物質が起床時及び就寝時に摂取される場合、その間隔は、おそらく１６及び８時間である。起床時、昼日中、及び就寝時に摂取される場合、間隔は５、１１、及び８時間であり得る。覚醒している時間の間に、均一に間を空けて摂取される場合、間隔は、５．３３、５．３３、５．３３、及び８時間であるかもしれない。そのような場合、合理的な投薬は、不均一な時間間隔と一致するように不均一であるべきである。

栄養補給食品及び特定の薬物、ならびにステロイド、抗生物質等の物質は、満腹時に摂取されるのが最善である。そのような日中の時間間隔は不均一であってもよく、最後の日中の用量と翌朝の用量は異なり得る。

疾患の予防もしくは治療のため、または改善された身体機能の促進のために、活性薬剤の適切な投与量は、治療される疾患の種類または標的とされる機能（上に定義される）、疾患の重症度及び経過、薬剤が予防目的または治療目的で投与されるかどうか、以前の治療、対象の臨床履歴及び薬剤に対する反応、ならびに担当医師の裁量に依存する。薬剤は、一度に、または一連の治療にわたって、好適に対象に投与される。組成物の投与量及び望ましい薬物濃度は、想定される特定の用途に依存して異なり得る。適切な投与量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術の範囲内である。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量を決定するための信頼できる指針を提供する。したがって、本開示による任意の特定の組成物または製剤の「有効量」は、特定の状況に基づいて変化し、適切な有効量は、所望の効果を達成するために、日常的な実験のみを使用して当業者によって各適用例において決定され得る。

本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「治療、療法（ｔｈｅｒａｐｙ）」等の用語は、本明細書で使用される場合、治癒的療法、予防的療法、及び健康な対象の治療を含む予防療法を指す。「予防療法」の一例は、標的とする病態または障害の防止または軽減である。治療を必要とする人々は、既に障害を有する者だけではなく、障害を有する傾向がある者、または障害が予防されるべき者を含む。「長期」投与は、初期の治療効果（活性）を長期にわたって維持するために、短期モードとは対照的な連続モードにおける薬剤（複数可）の投与を指す。「断続的」な投与は、中断されずに連続的に行われるのではなく、むしろ本質的に周期的な治療である。１つ以上のさらなる治療剤と「組み合わせた」投与は、任意の順序での同時（併用）投与及び連続投与を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物及び方法は、筋肉減少症、筋肉減少性肥満、癌、多発性硬化症、筋ジストロフィー、固定（例えば、副木またはギプス）を必要とする骨折、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢神経障害、脳卒中、悪液質等を含む、筋萎縮に関連するかまたはそれを特徴とする状態を治療するために使用され得る。そのような状態は、突発性であリ得る、診断された状態に続発し得る等である。

本明細書で使用される場合、「治療有効量」は、対象に治療効果を付与するために必要な活性薬剤（例えば、ロディオラ及びラポンティクム抽出物を含む組成物）の最低量である。例えば、罹患しているかもしくは罹患する傾向がある対象への、または対象が罹患するのを防止するための「治療有効量」は、病理学的症状、疾患進行、前述の障害に関連する生理学的状態またはそれらに屈しない抵抗性における向上を誘発する、改善する、または別様に引き起こす量である。

以下の実施例は、好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、良好に機能するために発見された技術を表しており、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられてもよいことは、当業者には理解されよう。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、実施形態の主旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更が行われてもよく、それでもなお同様または類似の結果が得られることを理解されたい。

抽出物の調製
抽出物は、有機溶媒抽出法を使用して調製することができる。例えば、ラポンティクム・カルタモイデスの根を、粉砕し（例えば、４ｍｍメッシュのサイズに）、粉砕した材料を、反応器または抽出機能を有する任意の容器内で、限定されないが、１００％水、水中１％〜９９％（ｖ／ｖ）のエタノール、水中１％〜９９％（ｖ／ｖ）のメタノール、酢酸エチル、アセトン、ヘキサン、または抽出に従来使用されている任意の他の有機溶媒（例えば、ＥｔＯＨ ５０％）を含む溶媒と混合することができる。溶媒：植物の好適な比は、約１：１〜３０：１、より好ましくは５：１〜１５：１（例えば、１０：１（ｖ／ｗ））である。原料は、例えば、撹拌しながら還流下で抽出されるが、解離を用いても、還流を用いてもまたは用いなくても、撹拌を用いてもまたは用いなくても、及び圧力を印加してもまたはしなくてもよい。抽出温度は、通常、使用される溶媒に依存する。抽出時間は、好ましくは、少なくとも１時間（例えば、１時間３０分である）。

抽出時間後、固体相（ケーク）の液体を分離するために、混合物を濾過または遠心分離することができる。濾過ステップでは、２５ミクロンのフィルタが使用されてもよい。

抽出ステップは、１つより多くのカバーを得るために複数回繰り返されてもよく（例えば、全部で３つのカバーを得るために２回繰り返される）濾液が合わせられる。固体相を廃棄する。

合わせた濾液は、真空下（例えば、０．８Ｐａ）で３０％〜７０％ＤＭ（好ましくは５０％ＤＭ）に濃縮することができる。任意の種類の溶媒蒸発システムが使用され得る。得られた抽出ペーストは、「天然抽出物」と称される。

次いで、天然抽出物を、約９０％〜９９％（例えば、９７％）の％ＤＭ含有量まで乾燥させるが、より低い％ＤＭまで乾燥させてもよい。このステップは、限定されないが、担体を用いてまたは用いずに、噴霧、空気乾燥、オーブン乾燥、天日乾燥等を含む任意の乾燥プロセスによって行うことができる。

実施例１：エタノール５０％（ｖ／ｖ）を用いたラポンティクムの抽出（Ｆ０）
以下の抽出プロセスの概略版を図２９ａに示す。ラポンティクムの生ハーブ（根、無水ベースで６５ｋｇ）を計量し、粗粉末に粉砕した。粉末を抽出チャンバ／反応器に入れ、７００Ｌの水中５０％（ｖ／ｖ、５０％アルコール）のエタノールを原料に加え、約１０：１（ｖ／ｗ））の比とする。混合物を８０〜９０℃で１．５時間撹拌しながら還流下で加熱した。１．５時間後、液体を濾過して放置した。残渣（固体相）を回収し、抽出ステップをさらに２回繰り返した（全部で３つのカバーを得るため）。

濾液を合わせた後、真空下（０．８Ｐａ）で３０〜６０％ＤＭ（例えば、３９％ＤＭ）に濃縮した。全部で２５ｋｇの濃縮ペースト（「Ｆ０−天然抽出物」）を得、生理活性成分について分析した。

このプロセスにおいて、溶媒が常に５０％アルコールであることを確実にするために、エタノールを濾液から再回収して抽出ステップに再利用してもよい。

濃縮された抽出ペーストを、次いで、噴霧により乾燥させて乾燥粉末（水分１０％未満）を得た（Ｆ０−ＥｔＯＨ ５０％乾燥粉末）。乾燥粉末試料を得、生理活性成分分析、微生物分析、重金属分析、農薬分析、及び栄養分析に使用した。

実施例２：遠心分離及び濾過ステップ（図２９ａに示すＦ０）
実施例１に従って調製した１２ｋｇのラポンティクム天然抽出物（３９％ＤＭ）を水で１０％ＤＭに希釈し、次いで遠心分離した。収量は、約１０％ＤＭの希釈天然抽出物４３ｋｇであった（Ｆ０−天然、希釈及び遠心分離）。

この希釈天然抽出物（１０％ＤＭ）４２ｋｇに対して、５ｋＤａ、次いで１ｋＤａで限外濾過（ＵＦ）を行い、＞５ｋＤａ、１〜５ｋＤａ、及び＜１ｋＤａの３つの画分を得た。画分を真空下または噴霧下で乾燥させた（収量は、それぞれ、１．５５ｋｇ、０．９０ｋｇ、及び１．１５ｋｇであった）（Ｆ０−天然ＵＦ）。試料は、生理活性分析に送られた。

実施例３：精製ステップ（図２９ａに示すＦ５’）
実施例２に従って調製した１ｋｇのラポンティクムの希釈天然抽出物（約１０％ＤＭ）（Ｆ０−天然、希釈及び遠心分離）を、吸着樹脂カラムＤ−１０１（樹脂体積１Ｌ）上で精製した。溶出液を濃縮し、乾燥させて微粉末を得た（（１４．５ｇの精製抽出物の粉末を得た）（Ｆ５’−精製ＥｔＯＨ５０％抽出物）。

実施例４：エタノール７０％（ｖ／ｖ）を用いたラポンティクムの抽出プロセス（Ｆ５及びＦ７）
粗粉末に粉砕した既知の量のラポンティクムの根を、１０：１（ｖ／ｗ）の溶媒：植物比で水と混合し、還流せずに８０℃で２時間抽出した。単回抽出を行った。固体相を廃棄して液相を回収し、２５μｍに濾過した。

ロタ蒸発器を使用して濾液の一部を濃縮して大部分の溶媒を除去し、真空下で水分＜１０％まで最終乾燥させた。抽出物は、粉末であった（Ｆ７：ＥｔＯＨ ７０％抽出物）。

濾液の他の部分は、実施例３に記載されるように吸着樹脂カラム上で精製し、濃縮して真空下で水分＜１０％まで乾燥させた。抽出物は、粉末であった（Ｆ５−精製ＥｔＯＨ ７０％抽出物）。

実施例５：水を用いたラポンティクムの抽出プロセス（Ｆ１及びＦ３）
ＥｔＯＨ７０％の代わりに水を使用したことを除いて、実施例４と同じ手順を繰り返した。

粗粉末に粉砕した既知の量のラポンティクムの根を、１０：１（ｖ／ｗ）の溶媒：植物比で水と混合し、還流せずに８０℃で２時間抽出した。単回抽出を行った。固体相を廃棄して液相を回収し、２５μｍに濾過した。

ロタ蒸発器を使用して濾液の一部を濃縮して大部分の水を除去し、真空下で水分＜１０％まで最終乾燥させた。抽出物は、粉末であった（Ｆ１：水性抽出物）。

濾液の他の部分は、実施例３に記載されるように吸着樹脂カラム上で精製し、濃縮して真空下で水分＜１０％まで乾燥させた。抽出物は、粉末であった。（Ｆ３−精製水性抽出物）

実施例６：アセトンを用いたラポンティクムの抽出プロセス（Ｆ２及びＦ４）
ＥｔＯＨ７０％の代わりにアセトンを使用したことを除いて、実施例４と同じ手順を繰り返した。

粗粉末に粉砕した既知の量のラポンティクムの根を、１０：１（ｖ／ｗ）の溶媒：植物比でアセトンと混合し、還流せずに８０℃で２時間抽出した。単回抽出を行った。固体相を廃棄して液相を回収し、２５μｍに濾過した。

ロタ蒸発器を使用して濾液の一部を濃縮して大部分の溶媒を除去し、真空下で水分＜１０％まで最終乾燥させた。抽出物は、粉末であった。（Ｆ２：アセトン抽出物）

濾液の他の部分は、吸着樹脂カラム上で精製し、濃縮して真空下で水分＜１０％まで乾燥させた。抽出物は、粉末であった。（Ｆ４−精製アセトン抽出物）

実施例７：ロディオラ・ロゼアハーブ抽出物の調製
乾燥させたロディオラ・ロゼア材料を水性アルコールを使用して抽出した。例えば、いくつかの調製物では、５０％の水性エタノール、または７０％エタノールが好ましかった。次いで、得られた抽出物を濾過し、上清を濃縮した。濾過した抽出物を遠心分離し、カラムによって透明な上清を精製した。エタノールを使用してカラムを溶出した。次いで、得られたエタノールを濃縮した。いくつかの調製物は、任意選択的な乾燥ステップを含んでいた。

実施例８ ロディオラ・ロゼアハーブ抽出物中のサリドロシド及び全ロザビン類の投与量
Ｍ．Ｇａｎｚｅｒａらによって開発されたＨＰＬＣ法（「Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｒｋｅｒ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｏｆ Ｒｈｏｄｉｏｌａ ｒｏｓｅａ Ｌ．（Ｇｏｌｄｅｎ ｒｏｏｔ） ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」 Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４９（４）４６５−４６７（２００１））を使用して、ロディオラ・ロゼアの根抽出物中のサリドロシド及び全ロザビン類（ロザリン、ロザビン、及びロジン）を含む種々の化合物の量を決定した。端的に述べると、ＵＶ検出器を装備したＨＰＬＣ Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステム上で標的化合物の定量化を行った。化合物の分離は、４５℃に設定したＡＣＥ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（２５０ｘ４．６ｍｍ、５μｍ）上で行った。移動相は、アセトニトリル（溶離液Ａ）及びリン酸緩衝液ｐＨ７（溶離液Ｂ）からなっていた。勾配は次の通りであった：１１％均一濃度Ａ（１０分）、１１〜３０％Ａ（２０分）、３０〜８０％Ａ（５分）、８０％均一濃度Ａ（１０分）、８０〜１１％Ａ（５分）。総実行時間は５０分であった。注入量は５μＬ、流速は１ｍＬ／分であった。サリドロシドの検出には２２５ｎｍ、ロザビン類の検出には２５０ｎｍでＵＶモニタリングを行った。標的化合物の量は、試料のピーク面積を既知の濃度の基準化合物のピーク面積と比較することによって定量化した。

実施例９：異なるラポンティクム根抽出物における２０ＨＥ分析
実施例１〜６のように調製した異なるラポンティクム抽出物中のβ−エクジソン（２０ＨＥ）の量を、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を装備したＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＨＰＬＣシステムを使用して決定した。化合物の分離は、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｐｌｕｓ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（２．１ｘ５０ｍｍ〜１．８ミクロン）上でカラム温度を３５℃に設定して行った。移動相は、メタノール（溶離液Ａ）及び水中０．１％のギ酸（溶離液Ｂ）からなっていた。流速は０．４ｍＬ／分であった。勾配は、１５分で傾斜１０〜１００％Ａであった。注入量は２μＬであった。２５０ｎｍ、ｂｗ８ｎｍでＵＶモニタリングを行った。標的化合物の量は、試料のピーク面積を既知の濃度の基準化合物のピーク面積と比較することによって定量化した。

実施例１０：エタノール性ラポンティクム根抽出物のエクジステロイド分析
実施例１に記載されるように水中５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて抽出することにより、ラポンティクム・カルタモイデスの根の乾燥抽出物（Ｆ０−ＥｔＯＨ ５０％乾燥粉末）を得た。エクジステロイドの同定は、Ｐｈｏｔｏｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ Ｄｅｔｅｃｔｏｒを装備したＨＰＬＣシステムを使用して行った。分離は、４０℃に設定したＡｔｌａｎｔｉｓ Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム（１５０ｘ３ｍｍ〜３μｍ）上で行った。移動相は、０．１％酢酸（ｖ／ｖ、溶離液Ａ）及び水中０．１％（ｖ／ｖ）の酢酸（溶離液Ｂ）を含むメタノールからなっていた。流速は０．６ｍＬ／分であった。勾配プログラムは以下の通りであった：２０％均一濃度Ａ（５分）、２０〜４０％Ａ（２５分）、４０〜７０％Ａ（１５分）、７０〜８５％Ａ（１５分）。全実行時間は６０分であった。モニタリングは２４２ｎｍで行った。

全部で１９のエクジステロイドが、ラポンティクム根抽出物において同定された。それらの化学構造によってのみ同定可能なものもあった。

実施例１１：エタノール性ラポンティクム根抽出物のエタノール性抽出物の植物化学物質及び物理化学分析（エクジステロイドを除く）
実施例１に記載されるように水中５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて抽出することによりラポンティクム・カルタモイデスの根の乾燥抽出物（Ｆ０−ＥｔＯＨ ５０％乾燥粉末）を得、エクジステロイド以外の植物化合物について分析し、また物理分析を行った。組成物中に同定された全フェノール、全有機酸、及び全遊離糖質のグラフを図１ａ、１ｂ、及び２に示す。

ラポンティクム及びロディオラ抽出物の使用方法
以下の実施例では、ラポンティクム抽出物及びロディオラ抽出物が、単独で及び組み合わさって、タンパク質合成及び代謝シグナル伝達経路に及ぼす効果を評価した。

実施例１２：ラポンティクム・カルタモイデス抽出物の異なる調製物のスレオニン３８９上におけるＳ６Ｋ１及びスレオニン３０８上におけるＡｋｔのリン酸化（図２９ａに示すステップ１）
試験は、ラポンティクム抽出物がＡｋｔレベルでタンパク質合成及び代謝経路を刺激する能力を評価するために設計された。セリン／スレオニンキナーゼＡｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）は、Ｔｈｒ^３０８及びＳｅｒ^４７３上のリン酸化を介した様々な刺激によって活性化される。一旦リン酸化されると、Ａｋｔは、細胞核に移動し、そこでグルコース輸送、タンパク質合成、または脂質及びトリグリセリド貯蔵等の様々な細胞プロセスに関与する。

ラポンティクム抽出物がＳ６キナーゼ１のレベルでタンパク質合成を刺激する能力も評価した。ｓｐ７０ Ｓ６キナーゼは、サイトカインに反応して活性化される遍在性の細胞質タンパク質である。該キナーゼは、ｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ経路の下流に位置し、スレオニン３８９を含む多数の残基上でリン酸化される。しかしながら、Ｔｈｒ３８９のリン酸化は、インビボでのｐ７０キナーゼ活性と最も密接に相関している。一旦リン酸化されると、ｐ７０ Ｓ６キナーゼは、Ｓ６タンパク質をリン酸化し、４０Ｓリボソームタンパク質（ｒｐＳ６）上のタンパク質合成プロセスを引き起こす。

Ｃ２Ｃ１２細胞は、圧挫損傷の７０時間後にＣ３Ｈマウスの大腿細胞から培養した筋芽細胞の連続継代を通して、Ｙａｆｆｅ ａｎｄ Ｓａｘｅｌ（１９７７）によって最初に得られた（Ｙａｆｆｅ Ｄ，１９７７）。これらの細胞は、分化が可能であることが示された。Ｃ２Ｃ１２細胞は、筋芽細胞の骨格筋細胞への分化（例えば、ミオシンのリン酸化機構）を研究するための有用なモデルであり、筋タンパク質及びアンドロゲン受容体を発現する。

ラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を調製した：５０％エタノール抽出物、７０％エタノール抽出物、１００％水抽出物、及び本開示の実施例１〜５に記載されるようにカラム上で精製された抽出物（５０％ ＥｔＯＨを除く）。

ラポンティクム抽出物の各調製物について試験した濃度は、ヒドロキシ−エクジソン中最終濃度０．１μＭ、１μＭ、及び１０μＭを有するように調製した。各抽出物において測定されたヒドロキシ−エクジソンの濃度に基づいて、ラポンティクムの各調製物について使用した濃度は以下の通りである：

試験開始時に、Ｆ０抽出物のヒドロキシ−エクジソンの％の値は決定されず、試験した最終濃度は、Ｆ７抽出物中のヒドロキシ−エクジソンの濃度に基づいていた。しかしながら、このＦ０中のエクジソンの濃度は過大評価されていた。Ｆ０抽出物について試験したヒドロキシ−エクジソンの最終濃度が他の画分と異なっていたのはこのためである。

増殖細胞を採取し、６ウェルプレートにウェル当たり１７０，０００細胞の密度で播種した。細胞を５％ＣＯ_２中、３７℃で４８時間増殖させた。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、培地を分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）と交換した。５日後、筋芽細胞が多核筋管に融合した。実験開始の１時間前に、細胞からアミノ酸を欠乏させるために細胞をクレブス培地でインキュベートした。

正常濃度（０．８ｍＭ）または低濃度（０．０８ｍＭ）のアミノ酸の存在下、ＤＭＳＯ ０．００２％を用いて、３つの濃度のラポンティクム植物抽出物の５つの調製物で２時間細胞を処理した。

実験終了時に、細胞を細胞可溶化緩衝液（ウェル当たり１００μＬ）に溶解させ、遠心分離して上清中の可溶性タンパク質を単離した。この細胞アッセイからのタンパク質を、ＬＯＷＲＹ法に由来する比色アッセイを使用して定量化した。したがって、１００μＬの溶解緩衝液中５０μｇの総タンパク質を、ｐＳ６Ｋ１またはｐＡｋｔ抗体で被覆したマイクロウェルストリップに移し、３７℃で２時間インキュベートした。数回洗浄した後、検出抗体を加え、３７℃で１時間インキュベートした。再び数回の洗浄を行い、ＨＲＰ結合二次抗体を加えた。３７℃で３０分のインキュベーション終了時に、ＴＭＢ（３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン）基質を加えたところ、陽性ウェルに青色が発色した。シグナルの飽和を回避するために、黄色を誘導する反応停止液を加えた。黄色の強度は、分光光度計を用いて４５０ｎｍで読み取り可能であり、検出されたｐＳ６Ｋ１またはＡｋｔの量に正比例していた。

各条件を、ｎ＝５またはｎ＝６で試験した。ＩＧＦ１ １００ｎｇ／ｍｌを陽性対照として使用した。

リン酸化されたＡｋｔの結果を、２時間インキュベーションした後のタンパク質１μｇ当たりの吸光度（Ａｂｓ／μｇタンパク質）及び未処理の対照条件の％（１００％）で表す。

リン酸化されたＴ３８９ Ｓ６キナーゼ１の結果を、２時間インキュベーションした後のタンパク質１μｇ当たりの吸光度（Ａｂｓ／μｇタンパク質）及び未処理対照条件の％（１００％）で表す。

全ての結果は、未処理対照の％で表される。未処理対照をＩＧＦ１または植物抽出物と比較するために、得られた値間の差を反復測定ＡＮＯＶＡによって評価し、マン・ホイットニーのＵ検定によってＡＮＯＶＡの有意差が示された場合はダネットの検定を行った：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対未処理対照。

全ての結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。評価した全てのパラメータについて、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定、続いてダンの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）４）を使用して統計分析を行った。２つの条件間の比較は、マン・ホイットニーの検定を使用して行った。０．０５のｐ値を有意であると見なした。

インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ／哺乳動物のラパマイシン（ｍＴＯＲ）経路の標的を活性化することによって骨格筋の発達を誘導することができるタンパク質同化因子として確立されている。Ｓ６Ｋ１及びＡｋｔの両方のリン酸化の刺激は、Ｍｉｙａｚａｋｉらによって既に報告されている（Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｍ，２０１０）。したがって、ＩＧＦ−１が、実験の陽性対照として選択された。Ｓ６Ｋ１の基礎リン酸化は、正常濃度のアミノ酸の存在下において、低濃度のアミノ酸の存在下よりも４倍高かった（０．８ｍＭ対０．０８ｍＭ）。

低濃度のアミノ酸の存在下では、Ｆ７を除く試験した全ての画分において、試験した全ての用量でＳ６Ｋ１リン酸化が増加した（図３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、及び７ｂを参照）。試験した用量では、効果は用量依存性ではなかった。

正常濃度のアミノ酸の存在下において、最低用量のＦ３を除く各画分、ならびに中間濃度のＦ０、Ｆ３、及びＦ５が、Ｓ６Ｋ１リン酸化を刺激した（図３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、及び７ｂを参照）。観察された効果は、ＩＧＦ−１で観察されたものよりも低く、Ｆ０、Ｆ１、及びＦ３画分（最低濃度または中間濃度）の場合にのみ有意であった。試験した中間濃度及び高濃度のＦ７抽出物の部分溶解性条件下では、Ｓ６Ｋ１リン酸化の減少が報告されたことに留意されたい。図３ａ、３ｂ、４ａ、４ｂ、５ａ、５ｂ、６ａ、６ｂ、７ａ、及び７ｂ：３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を用いてインキュベーションした後の、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるスレオニン３８９上でのＳ６Ｋ１リン酸化の決定

３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を、分化したＣ２Ｃ１２筋管の存在下で２時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させ、全可溶性タンパク質を定量化し、スレオニン３８９残基上のＳ６Ｋ１リン酸化レベルを測定してβアクチンタンパク質に対して正規化した。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値。

ＩＧＦ−１は、Ａｋｔリン酸化を刺激すると以前に報告されており、それに関連してアッセイにおける陽性対照物質として選択された（Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｍ，２０１０）。ＩＧＦ−１（１００ｎｇ／ｍＬ、２時間）のインキュベーション後、Ａｋｔのリン酸化が１．６倍活性化された。Ａｋｔリン酸化について同様の結果がＬａｔｒｅｓまたはＭｉｙａｚａｋｉによって以前に公開されている（Ｌａｔｒｅｓ Ｅ，２００５）（Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｍ，２０１０）。

低いまたは正常なアミノ酸濃度の存在下において、最低用量で試験した全ての異なる画分についてＡｋｔリン酸化の非有意な刺激が観察されたが、例外として、低いアミノ酸濃度でインキュベートした画分Ｆ０及び正常なアミノ酸濃度でインキュベートしたＦ３では、中間用量で非有意な増加が観察された。

Ａｋｔリン酸化の基礎レベルは、正常なアミノ酸条件の存在下では、低アミノ酸条件と比較して２倍高かったことに留意されたい。最後に、Ｆ１（高濃度）またはＦ７（中間及び高濃度）抽出物の部分溶解性条件下では、使用されたアミノ酸の濃度にかかわらずＡｋｔリン酸化の減少が確認された。

図８ａ、８ｂ、９ａ、９ｂ、１０ａ、１０ｂ、１１ａ、１１ｂ、１２ａ、１２ｂ：３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を用いてインキュベーションした後の、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるスレオニン３０８上でのＡｋｔリン酸化の決定

３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を、分化したＣ２Ｃ１２筋管の存在下で２時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させ、全可溶性タンパク質を定量化し、スレオニン３０８残基上のＡｋｔリン酸化レベルを測定してβアクチンタンパク質に対して正規化した。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値。

実施例１３：ラポンティクム・カルタモイデス抽出物の５つの異なる調製物がＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成（トリチウム化ロイシンの取り込み）に及ぼす効果（図２９ａに示すステップ１）
試験は、トリチウム化ロイシンの取り込みを測定することによって植物抽出物がタンパク質合成を刺激する能力を評価するために設計された。Ｃ２Ｃ１２細胞及びラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を、実施例１２のように調製した。

タンパク質合成アッセイのために、増殖細胞を採取し、２４ウェルプレートにウェル当たり３０，０００細胞の密度で播種した。細胞を５％ＣＯ_２中、３７℃で４８時間増殖させた。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、培地を分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）と交換した。５日後、筋芽細胞が多核筋管に融合した。タンパク質合成は、トリチウム化したアミノ酸ロイシンの取り込みを測定することによって決定した。端的に述べると、ロイシン曝露の１時間前に、アミノ酸不含培地で細胞をインキュベートした。次いで、正常濃度（０．８ｍＭ）もしくは低濃度（０．０８ｍＭ）のアミノ酸の存在下、ＤＭＳＯ ０．００２％を用いて、放射標識したロイシン５μＣｉ／ｍＬ及びＩＧＦ１ １００ｎｇ／ｍＬまたは植物抽出物の存在下で細胞を２時間３０分インキュベートした。

全ての結果は、未処理対照の％で表される。未処理対照をＩＧＦ１または植物抽出物と比較するために、得られた値間の差を反復測定ＡＮＯＶＡによって評価し、マン・ホイットニーのＵ検定によってＡＮＯＶＡの有意差が示された場合はダネットの検定を行った：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、対未処理対照

全ての結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。評価した全てのパラメータについて、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定、続いてダンの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）４）を使用して統計分析を行った。２つの条件間の比較は、マン・ホイットニーの検定を使用して行った。０．０５のｐ値を有意であると見なした。

ＩＧＦ１は、低濃度（＋４５％、ｐ＜０，００１）または正常濃度（＋２１％、ｐ＜０，００１）のアミノ酸の存在下でタンパク質合成を誘導した。タンパク質合成に関するＩＧＦ−１のデータは、低濃度または正常濃度のアミノ酸を用いたＩＧＦ１の存在下でのタンパク質合成が２０〜５０％増加したことを記載した文献に報告されているデータと類似しているため、この試験の正当性が証明された（Ｋａｚｉ ＡＡ，２０１０）（Ｂｒｏｕｓｓａｒｄ ＳＲ，２００４）。放射活性の取り込みは、低アミノ酸濃度の存在下でより高かったことから、予想されたように、放射活性ロイシンと冷ロイシンとの間の競合は、正常濃度のアミノ酸の存在下でより弱かったことが分かった。

ラポンティクム・カルタモイデスの異なる調製物の中でも、画分Ｆ０（天然ＥｔＯＨ５０％）、Ｆ５（精製ＥｔＯｈ７０％抽出物）、及びＦ７（ＥｔＯＨ７０％抽出物）が、タンパク質合成を有意に刺激することができた。この刺激は、アッセイの基準物質と均等かまたはそれよりも強力であった。ＩＧＦ１（ＩＧＦ−１ １００ｎｇ／ｍＬ＋２１％ ｐ＜０．００１対Ｆ０ １０μｇ／ｍＬ＋４３％ ｐ＜０．００１またはＦ５ ３００μｇ／ｍＬ＋２３％ ｐ＜０．０１またはＦ７ １０μｇ／ｍＬ＋２９％ ｐ＜０．００１）画分Ｆ５は、用量依存性の様式でタンパク質合成を刺激し、１μＭの２０ＨＥの濃度に相当する３０μｇ／ｍＬからの有意な効果が見られた。さらに、Ｆ０及びＦ７画分は、最低用量（それぞれ、０．０４μＭ及び０．１μＭの２０ＨＥに等しい）で最大の効果を示した。１０μｇ／ｍＬの画分Ｆ０によって誘導されたタンパク質合成の刺激は、ＩＧＦ−１で観察されたものより有意に高かった。

画分Ｆ１（水性抽出物）及びＦ３は、低濃度のアミノ酸の存在下では非常にわずかな非有意な効果を及ぼし、これは、より高い濃度のアミノ酸を用いた場合のＦ３にも当てはまることであった。

図１３ａ、１３ｂ、１４ａ、１４ｂ、１５ａ、１５ｂ、１６ａ、１６ｂ、１７ａ、１７ｂ：３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を用いてインキュベーションした後の、Ｃ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定

３つの濃度のラポンティクム抽出物の５つの異なる調製物を、分化したＣ２Ｃ１２筋管及びトリチウム化ロイシン（５μＣｉ）の存在下で２時間３０分インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させ、全可溶性タンパク質を定量化し、細胞に取り込まれたトリチウム化ロイシンのレベルをカウントした。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値。

これらの実験を要約すると、正常濃度のアミノ酸の存在下で、Ｆ０、Ｆ５、及びＦ７画分がタンパク質合成を有意に刺激した。この刺激は、アッセイの基準物質に類似するかまたはそれよりも強力であった：ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−１ １００ｎｇ／ｍＬ、＋２０％、ｐ＜０．００１対Ｆ０ １０μｇ／ｍＬ、＋４３％、ｐ＜０．００１またはＦ５ ３００μｇ／ｍＬ、＋２３％、ｐ＜０．０１またはＦ７ １０μｇ／ｍＬ、＋２９％、ｐ＜０．００１）。これらの画分はまた、試験した低い用量でシグナル伝達経路（Ａｋｔ及びＳ６Ｋ１リン酸化）を刺激した。Ｆ１ １３００μｇ／ｍＬ及びＦ７ １０００μｇ／ｍＬの可溶性の問題が全てのアッセイに認められた。

その一方で、Ｆ１及びＦ３画分は、タンパク質合成を刺激しなかった。しかしながら、これらの画分にはＡｋｔ及びＳ６Ｋ１リン酸化のある程度の刺激が観察された。

結論として、Ｆ０画分、及びそれほどではないがＦ７画分の両方が、最低濃度（０．０４〜０．１μＭ ２０ＨＥに等しい）で、Ａｋｔ及びＳ６Ｋ１リン酸化を増加させ、それはタンパク質合成の有意な増加と相関していた。

実施例１４：ロディオラを含むラポンティクム・カルタモイデス抽出物の１つの選択された調製物がＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成（トリチウム化ロイシンの取り込み）に及ぼす効果（図２９ａに示されるステップ２ａ及びｂ）
我々の実験条件下では、正常なアミノ酸濃度の存在下で最低用量のＦ０画分を用いた場合に最良の結果が観察され、タンパク質合成の刺激及びシグナル伝達の活性化（Ｓ６Ｋ１及びａｋｔリン酸化の誘導）を示した（実施例１３を参照）。したがって、この画分は、活性構成成分としてサリドロシドを含有するロディオラ種に由来する別の植物抽出物の調製物を用いた共インキュベーション実験で試験されるように選択された。

使用したロディオラ抽出物は、以下を含有していた：

試験の前半に、最低用量のＦ０でラポンティクム植物抽出物の最大の効果が確認され、ロディオラ抽出物の用量反応分析と並行してタンパク質合成に関する新しい用量反応評価を０．１−１−１０μｇ／ｍＬで行った、選択されたロディオラの濃度は以下の通りである：１−１０−４０μＭの最終サリドロシド濃度に相当する１０−１０４−４１７μｇ／ｍＬ

この試験のために、実施例１２に記載されるようにＣ２Ｃ１２細胞を得た。タンパク質合成アッセイを実施例１３に記載されるように行ったが、但し、放射標識したロイシン５μＣｉ／ｍＬ及びＩＧＦ１ １００ｎｇ／ｍＬ、１、５、及び１０μｇ／ｍｌのＦ０抽出物、または１０、１０４、及び４１７μｇ／ｍｌのロディオラ抽出物を、正常濃度（０．８ｍＭ）のアミノ酸の存在下でＤＭＳＯ ０．００５％とともに使用した。

図１８ａ及び１８ｂ：３つの濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物でインキュベーションした後のＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定

３つの濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物を、分化したＣ２Ｃ１２筋管及びトリチウム化ロイシン（５μＣｉ）の存在下で２時間３０分インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させ、全可溶性タンパク質を定量化し、細胞に取り込まれたトリチウム化ロイシンのレベルをカウントした。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値。

全ての結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。評価した全てのパラメータについて、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定、続いてダンの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）４）を使用して統計分析を行った。２つの条件間の比較は、マン・ホイットニーの検定を使用して行った。０．０５のｐ値を有意であると見なした。

ＩＧＦ１は、以前に報告されたように（Ｋａｚｉ ＡＡ，２０１０）（Ｂｒｏｕｓｓａｒｄ ＳＲ，２００４）、正常濃度のアミノ酸の存在下でタンパク質合成を誘導した。この結果は、ステップ１で作成された我々の以前のデータを裏付けるものであった（ＩＧＦ−１ステップ１＋２１％、ｐ＜０．００１対ＩＧＦ−１ ステップ２＋２７％、ｐ＜０．０１）。

Ｆ０画分は、１μｇ／ｍＬでタンパク質合成を有意に刺激することができた（図１８ａ及び１８ｂを参照）。この刺激は、アッセイの基準物質に類似していた：ＩＧＦ−１（ＩＧＦ−１ １００ｎｇ／ｍＬまたはＦ０ １μｇ／ｍＬ＋２７％ ｐ＜０．０１）。Ｆ０ １０μｇ／ｍＬでタンパク質合成の刺激が観察されたが、これは統計的有意性には達せず、第１のステップよりも弱かった（＋１６％対＋４３％）。この差は、ロディオラ抽出物の溶解度及び次の共インキュベーション実験の見込みに基づいて、この実験で使用されたより高い濃度のＤＭＳＯに起因し得る。これらの結果は、タンパク質合成に関するＦ０抽出物中の活性化合物（複数可）は、ＤＭＳＯ濃度の影響を受けることを示唆するものであった。

ロディオラ抽出物は、最低濃度でタンパク質合成を誘導した（＋２３％、ｐ＜０．０１）。この活性は、ＩＧＦ−１の活性に類似していた。対照的に、４１７μｇ／ｍＬでは、ロディオラはタンパク質合成を阻害した（図１８ａ及び１８ｂを参照）。しかしながら、この高い用量は、おそらく抽出物の溶解度の限界によるものであり、タンパク質合成に有害な影響をもたらし得る。

したがって、次の共インキュベーション実験のために、最終濃度０．００５％のＤＭＳＯ中、１及び１０μｇ／ｍＬのラポンティクムＦ０抽出物及びロディオラ抽出物を、単独で及び組み合わせて試験することに決定した。可溶度を向上させるために、各調製物を超音波処理した。

第２のステップにおいて、両方の植物抽出物の異なる組み合わせを試験して、タンパク質合成に対する増強効果が確認され得るかどうかを決定した。

この試験のために、実施例１２に記載されるようにＣ２Ｃ１２細胞を得た。タンパク質合成アッセイを実施例１３に記載されるように行ったが、但し、放射標識したロイシン５μＣｉ／ｍＬ及びＩＧＦ１ １００ｎｇ／ｍＬ、１及び１０μｇ／ｍｌのＦ０抽出物、または１及び１０μｇ／ｍｌのロディオラ抽出物、または異なる濃度のＦ０及びロディオラの組み合わせを、正常濃度（０．８ｍＭ）のアミノ酸の存在下でＤＭＳＯ ０．００５％とともに使用した。

図１９ａ、１９ｂ、２０ａ、２０ｂ、及び２１：単独のまたは組み合わせた２つの濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物でインキュベーションした後のＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定

２つの濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物を、分化したＣ２Ｃ１２筋管及びトリチウム化ロイシン（５μＣｉ）の存在下で２時間３０分インキュベートした。さらに、２つの異なる濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の組み合わせを、分化したＣ２Ｃ１２筋管及びトリチウム化ロイシン（５μＣｉ）の存在下で、各々２時間３０分インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させ、全可溶性タンパク質を定量化し、細胞に取り込まれたトリチウム化ロイシンのレベルをカウントした。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値。

ＩＧＦ１は、以前に報告されたように、正常濃度のアミノ酸の存在下でタンパク質合成を有意に誘導した（以前の試験では＋２２％、ｐ＜０．０５対＋２７％、ｐ＜０．０１及び＋２１％、ｐ＜０．００１）。

ロディオラは、以前に報告されたように、１０μｇ／ｍｌでタンパク質合成を強力にかつ有意に誘導した（以前の試験では＋３０％、ｐ＜０．００１対＋２３％、ｐ＜０．０１）（図１９ａ、１９ｂ、２０ａ、２０ｂ、及び２１を参照）。

Ｆ０は、以前に報告されたように、１及び１０μｇ／ｍｌでタンパク質合成を有意に誘導した。ステップ１と同様に、Ｆ０（１０μｇ／ｍＬ）によるタンパク質合成の誘導は、ＩＧＦ−１の効果よりも有意かつ強力であった。ステップ２ａの実験との差は、抽出物の可溶化の間の超音波処理ステップによるものであるかもしれない。同等の用量が検討される場合、タンパク質合成に対するＦ０及びロディオラの効果は同様であった（図１９ａ、１９ｂ、２０ａ、２０ｂ、及び２１）。

低用量の両方の抽出物で増強が観察された（Ｆ０及びロディオラ１：１＋１９％ ｐ＜０．０５対Ｆ０ １μｇ／ｍｌ＋１４％ＮＳ及びロディオラ１μｇ／ｍｌ＋１０％ＮＳ）。組み合わせを用いた場合のタンパク質合成の増加は、ラポンティクムまたはロディオラ抽出物単独の場合の増加よりも優れており、したがって増強効果が観察された。

Ｆ０単独（１０μｇ／ｍｌ）、ロディオラ単独（１０μｇ／ｍｌ）、及びそれらの組み合わせは全て、対照と比較してタンパク質合成を有意に増加させた。それにもかかわらず、各抽出物単独と比較して、高用量のロディオラ及びＦ０の組み合わせではタンパク質合成の増強は観察されなかった（Ｆ０及びロディオラ１０：１０＋２８％ ｐ＜０．００１対Ｆ０ １０μｇ／ｍｌ＋２９％ ｐ＜０．００１及びロディオラ１０μｇ／ｍｌ＋３０％ ｐ＜０．００１）。

高用量の１つの抽出物と低用量の他の抽出物との組み合わせでは、高用量（１０μｇ／ｍｌ）の各抽出物単独よりも低い効果であるが、低用量（１μｇ／ｍｌ）の各抽出物単独よりも強力な効果が観察された（Ｆ０及びロディオラ１：１０＋１６％ＮＳ対Ｆ０ １μｇ／ｍｌ＋１４％ＮＳ及びロディオラ１０μｇ／ｍｌ＋３０％ ｐ＜０．００１またはＦ０＆ロディオラ１０：１＋１９％ ｐ＜０．０５対Ｆ０ １０μｇ／ｍｌ＋２９％ ｐ＜０．００１及びロディオラ１μｇ／ｍｌ＋１０％ＮＳ）。

実施例１５：ミオスタチン及びアトロジン遺伝子ならびにそれらの組み合わせの発現に対する、２つの濃度のラポンティクム抽出物Ｆ０及び２つの濃度のロディオラ抽出物の評価（図２９ａに示されるステップ２ｃ）
抽出物及びそれらの組み合わせがミオスタチン及びアトロジン１遺伝子発現に及ぼす効果を測定することによって、他の生理学的プロセスに増強が見られるかどうか、及び抽出物が単独で及び組み合わさって筋タンパク質分解に及ぼす効果を決定するための試験を行った。ラポンティクム抽出物Ｆ０及びロディオラ抽出物は、実施例１４に記載されるように使用した。

遺伝子発現アッセイのために、増殖細胞を採取し、２４ウェルプレートにウェル当たり３０，０００細胞の密度で播種した。細胞を５％ＣＯ_２中、３７℃で４８時間増殖させた。細胞が８０％コンフルエンスに達した後、培地を分化培地（ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ）と交換した。５日後、筋芽細胞が多核筋管に融合した。

１及び１０μｇ／ｍｌのＦ０抽出物、または１及び１０μｇ／ｍｌのロディオラ抽出物、または異なる濃度のＦ０及びロディオラの組み合わせで細胞を６時間処理した。実験終了時に、Ｃ２Ｃ１２細胞をトリゾール溶液に溶解させてＲＮＡを抽出し、フェノール／クロロホルム法を使用して精製した。抽出後のＲＮＡ量を分光光度計（２６０ｎｍ／２８０ｎｍ／３２０ｎｍ）により定量化し、最終濃度１μｇ／μＬで懸濁した。続いて、製造者（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３６８８１４）によって記載されるようにオリゴ（ｄＴ）プライマー及びＡＭＶ逆転写酵素系を使用して、１μｇのＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡの合成のためのテンプレートとして使用した。次いで、７９００ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び標準的なｑＰＣＲプログラムを使用してｑＰＣＲを行った（１サイクル９５℃で１５分、４０サイクル９５℃で１５秒及び６０℃で１分、ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎプローブで６０〜９５℃の融解曲線）．ＳＹＢＲ ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）においてβアクチンについて熱サイクル実験を行い、１００ｎｇのｃＤＮＡ試料を含有するミオスタチン及びアトロジン遺伝子ならびに最終濃度２００ｎＭのプライマーのセットを、２つの異なるエクソンに設計した。

全ての結果は、平均値±ＳＥＭとして示される。評価した全てのパラメータについて、クラスカル・ウォリスのノンパラメトリック検定、続いてダンの事後検定（ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭ（登録商標）４）を使用して統計分析を行った。２つの条件間の比較は、マン・ホイットニーの検定を使用して行った。０．０５のｐ値を有意であると見なした。

文献において、いくつかの論文が、１０ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ−１で２４時間インキュベーションした後、アトロジン遺伝子発現が約４０％阻害されたことを報告している（Ｌａｔｒｅｓ Ｅ，２００５）（Ｓｔｉｔｔ ＴＮ，２００４）。ほとんどの研究が有害なミオスタチン作用のＩＧＦ−１拮抗に焦点を合わせているため、ＩＧＦ−１によるミオスタチン遺伝子発現の阻害に関するデータは公開されていない（Ｔｒｅｎｄｅｌｅｎｂｕｒｇ ＡＵ，２００９）。しかしながら、我々は独自にミオスタチン遺伝子発現に対するＩＧＦ−１の２０〜４０％阻害効果を確認した。文献及び内部データに基づいて、ＩＧＦ−１が、我々のアッセイにおける陽性対照として選択された。この実験において、ＩＧＦ１は、ミオスタチン及びアトロジン遺伝子発現を有意に阻害した（それぞれ、−２５％、ｐ＜０．００１及び−５９％、ｐ＜０．００１）。

図２３ａ、２３ｂ、２４ａ、及び２４ｂ：ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の共インキュベーションがＣ２Ｃ１２筋管におけるミオスタチン遺伝子発現に及ぼす効果２つの異なる濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の組み合わせを、各々、分化したＣ２Ｃ１２筋管の存在下で６時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させてＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行うためにｃＤＮＡに変換した。平均±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値；＃＃＃ｐ＜０．００１対対照値（マン・ホイットニーの検定）。

ロディオラは、ミオスタチン遺伝子発現を有意にかつ用量依存的に阻害したが（低用量及び高用量で、それぞれ−１５％ＮＳ及び−５４％ ｐ＜０．００１）、最高用量（−１３％ ＮＳ）ではアトロジン遺伝子発現に対してごくわずかな、非有意な効果を及ぼした（図２２ａ及び２２ｂを参照）。

Ｆ０は、ミオスタチン遺伝子発現においてわずかであるが非有意な減少を誘導したが（低用量及び高用量で、それぞれ−１０％ＮＳ及び−２１％ＮＳ）、アトロジン遺伝子発現にはいずれの効果も有しなかった（低用量及び高用量で、それぞれ＋１２％ＮＳ及び−４％ＮＳ）。

図２２ａ及び２２ｂ：ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物がＣ２Ｃ１２筋管におけるミオスタチン及びアトロジン遺伝子発現に及ぼす効果

２つの異なる濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物を、分化したＣ２Ｃ１２筋管の存在下で６時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させてＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行うためにｃＤＮＡに変換した。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値；＃＃＃ｐ＜０．００１対対照値（マン・ホイットニーの検定）。

ミオスタチン遺伝子発現の結果を図２３ａ、２３ｂ、２４ａ、及び２４ｂに示す。

Ｆ０ １０μｇ／ｍＬ及びロディオラ１μｇ／ｍＬの組み合わせは、ミオスタチン遺伝子発現の有意な減少を誘導したが（−２３％；ｐ＜０．０５対対照）、Ｆ０ １０ｕｇ／ｍｌ単独では、わずか−２１％を誘導しただけであり（ＮＳ対対照）、ロディオラ１ｕｇ／ｍｌはわずか−１５％を誘導しただけであった（ＮＳ対対照）。したがって、組み合わせを用いた場合の減少は、各抽出物単独の場合の減少よりも優れており、増強効果が観察された。

Ｆ０及びロディオラ１μｇ／ｍＬは、単独でまたは組み合わさって、ミオスタチン遺伝子発現のわずかではあるが非有意な減少を誘導した。効果の規模は、Ｆ０単独（−１０％）またはロディオラ単独（−１５％ＮＳ）の場合と比較して、組み合わせを用いた場合により強力（−１９％ＮＳ）であった（図２３ａ、２３ｂ、２４ａ、及び２４ｂ）。

ロディオラ１０μｇ／ｍＬは、ミオスタチン遺伝子発現を強力かつ有意に阻害したが、Ｆ０ １μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬの存在下では阻害効果としての増強効果は観察されず、ロディオラ（１０μｇ／ｍＬ）単独の効果よりも系統的に低かった。

図２５ａ、２５ｂ、２６ａ、及び２６ｂ：ラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の共インキュベーションがＣ２Ｃ１２筋管におけるアトロジン遺伝子発現に及ぼす効果

２つの異なる濃度のラポンティクムＦ０及びロディオラ抽出物の組み合わせを、各々、分化したＣ２Ｃ１２筋管の存在下で６時間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させてＲＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行うためにｃＤＮＡに変換した。平均±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値；＃＃＃ｐ＜０．００１対対照値（マン・ホイットニーの検定）。

Ｆ０ １μｇ／ｍＬ及びロディオラ１０μｇ／ｍＬの組み合わせは、アトロジン遺伝子発現の強力かつ有意な減少を誘導したが（−３１％；ｐ＜０．０５対対照）、各画分単独ではそうではなかった：Ｆ０ １ｕｇ／ｍｌ単独では２１％の増加を誘導し（ＮＳ対対照）、ロディオラ１０ｕｇ／ｍｌは−１３％の減少を誘導した（ＮＳ対対照）。したがって、組み合わせを用いた場合の減少は、各抽出物単独の場合の減少よりも優れており、強い増強効果が観察された。

Ｆ０ １０μｇ／ｍＬ及びロディオラ１μｇ／ｍＬの組み合わせは、アトロジン遺伝子発現を非有意な様式で減少させたが（−１０％ＮＳ）、この減少は、Ｆ０単独（−４％ＮＳ）またはロディオラ単独（＋２５％ＮＳ）の場合の減少よりも優れていた。

Ｆ０及びロディオラ１μｇ／ｍＬは、単独でもまたは組み合わさっても、アトロジン遺伝子発現には有意な効果を及ぼさなかった。図２５ａ、２５ｂ、２６ａ、及び２６ｂに示すように、効果の規模は、Ｆ０単独（＋２１％ＮＳ）またはロディオラ単独（＋２５％ＮＳ）と比較して、組み合わせを用いた場合（−３％ＮＳ）により強力であったことに留意されたい。

Ｆ０及びロディオラ１０μｇ／ｍＬは、単独でもまたは組み合わさっても、アトロジン遺伝子発現には非常にわずかではあるが非有意な効果を及ぼし、増強効果は観察されなかった。

結論として、Ｆ０ １マイクロｇ／ｍＬ及びロディオラ１０μｇ／ｍＬの組み合わせは、アトロジン遺伝子発現の阻害に対する増強効果を示した。組み合わせを用いた場合の減少は、各抽出物単独の場合の減少よりも優れており、強い増強効果が観察された。

実施例１６ ２つの濃度のラポンティクム抽出物の画分Ｆ０の４つの新しい調製物の評価（図２９ａに示されるステップ３）
タンパク質合成に関して得られた結果を向上させるため、また、動物モデルにおいて試験を行うためのより良好な、かつより純度の高い生成物を有する可能性を高めるために、画分Ｆ０を別様に処理し、新しい画分を得るようにさらに精製した．初期のＦ０に相当するＦ０ Ｎｅ−ＥＴＯＨは、実施例１２、１３、１４、及び１５において以前に試験を行った。Ｆ１画分は、実施例１２及び１３のＦ１画分に相当する。画分Ｆ０の噴霧後、乾燥した画分Ｆ０が生じた。画分Ｆ０を水溶液中で希釈し、カラム上で精製した後、画分Ｆ５’が生じた。

Ｃ２Ｃ１２骨格筋細胞が、実施例１２のように得られた。タンパク質合成アッセイを実施例１３及び１４のように行ったが、但し、放射標識したロイシン５μＣｉ／ｍＬ及びＩＧＦ１ １００ｎｇ／ｍＬ、１１．４及び２２．９μｇ／ｍｌのＦ０抽出物、または６．５及び１３μｇ／ｍｌのＦ０乾燥抽出物、または１３．４及び２６．７μｇ／ｍｌのＦ１抽出物、または１及び１．９μｇ／ｍｌ Ｆ５’抽出物を、正常濃度（０．８ｍＭ）のアミノ酸の存在下でＤＭＳＯ ０．００５％とともに使用した。実験終了時に上清を廃棄し、細胞を０．１Ｎ水酸化ナトリウムに３０分間溶解させた。次いで、細胞可溶性画分に関連する関連放射活性をカウントし、比色ローリー法を用いてタンパク質の定量を決定した。

各条件を、ｎ＝６で試験した。ＩＧＦ１ １００ｎｇ／ｍｌをタンパク質合成の刺激及びシグナル伝達の陽性対照として使用する。タンパク質合成の結果をｃｐｍ／マイクロＬ／２．５時間及び未処理の対照条件の％（１００％）で表す。

結果を図２７ａ、２７ｂ、及び２８に示す。

ＩＧＦ１は、ステップ１−２ａ−２ｂにおいて以前に報告されたように、正常濃度のアミノ酸の存在下でタンパク質合成を有意に誘導した（＋２５％，ｐ＜０．００１）（ステップ１ ＋２１％、ｐ＜０．００１；ステップ２ａ ＋２７％、ｐ＜０．０１；ステップ２ｂ ＋２１％、ｐ＜０．０５対ステップ３ ＋２５％、ｐ＜０．００１）。正常濃度のアミノ酸の存在下で同様の結果が文献に報告されている（Ｋａｚｉ ＡＡ，２０１０）（Ｂｒｏｕｓｓａｒｄ ＳＲ，２００４）。

ラポンティクム抽出物Ｆ０ ＮＥ−ＥｔＯＨ ５０％（天然ＥｔＯＨ５０％抽出物）は、０．０５μＭ ２０ＨＥ及び０．１μＭ ２０ ＨＥでタンパク質合成を有意に誘導した（それぞれ、＋２０％、ｐ＜０．０１及び＋１８％、ｐ＜０．０５）。画分Ｆ０によるタンパク質合成の刺激は、０．０４μＭ ２０ＨＥで以前に確認されている（ステップ２Ｂで＋２９％、ｐ＜０．００１）。０．０５μＭ及び０．１μＭでは、タンパク質合成に及ぼす効果は有意であるが、０．０４μＭではそれよりも低い。

ラポンティクム抽出物Ｆ０ ＥｔＯＨ５０％（乾燥粉末状）は、両方の濃度でタンパク質合成を誘導したが、最低用量でのみ刺激が強力かつ有意であった（＋３３％、０．０５μＭ ＨＥに相当する６．５μｇ／ｍＬでｐ＜０．００）。この効果は、画分Ｆ０ ＮＥ−ＥｔＯＨ ５０％で観察された効果よりも強力であった。

試験したいずれの２０ＨＥ最終濃度でも、タンパク質合成に対する画分Ｆ５’（精製ＥｔＯＨ５０％抽出物）の効果は観察されなかった。

非精製水性画分Ｆ１は、ＮＥ−ＥｔＯＨ ５０％調製物及びそれに由来する画分と比べてタンパク質合成に対する最も強力な活性を示した。２０ＨＥの最終濃度０．０５μＭでは、Ｆ１画分は、乾燥Ｆ０画分と同様のタンパク質合成刺激のパーセンテージを示した（それぞれ、＋３０％、ｐ＜０．００１及び＋３３％、ｐ＜０．００１）。２０ＨＥの最終濃度にかかわらず、Ｆ１画分がタンパク質合成に及ぼす効果は同様であった。

試験したラポンティクムの異なる画分の中で、Ｆ１（水性抽出物）、Ｆ０ ＮＥ−ＥＴＯＨ ５０％（天然ＥｔＯＨ５０％抽出物）、及び乾燥Ｆ０（Ｆ０ ５０％ＥｔＯＨの噴霧粉末）画分が、タンパク質合成に対する有意な刺激効果を示した。各陽性画分について、２０ＨＥの最低用量（０．０５μＭ）で最大の効果が観察された。タンパク質合成に対する最も強力な効果は、Ｆ０ ５０％ＥｔＯＨの噴霧粉末で観察された。

その一方で、Ｆ０ ＮＥ−ＥＴＯＨ ５０％に由来する、２０ＨＥが豊富なＦ５’画分は、タンパク質合成を刺激しなかった。これらの全ての結果は、タンパク質合成に対するラポンティクム抽出物の効果は、２０ＨＥの濃度のみに依存するのではなく、タンパク質合成を促進することが可能な他の活性構成成分（複数可）が活性抽出物中に存在することを示唆している。図２７ａ、２７ｂ、及び２８：２つの濃度のラポンティクム抽出物の異なる調製物を用いてインキュベーションした後のＣ２Ｃ１２筋管におけるタンパク質合成の決定

２つの濃度のラポンティクム抽出物の４つの異なる調製物を、分化した筋管Ｃ２Ｃ１２及びトリチウム化ロイシン５μＣｉの存在下で２時間３０分インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を溶解させ、全可溶性タンパク質を定量化し、細胞に取り込まれたトリチウム化ロイシンのレベルをカウントした。平均値±ＳＥＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１対対照値。

タンパク質合成アッセイに対するロディオラ（１μｇ／ｍｌ）及びラポンティクム（１μｇ／ｍｌ）の組み合わせで増強を観察した。

タンパク質合成は、ミオスタチン標的の阻害を介して刺激することができる。Ｗｅｌｌｅらは、成獣マウスにおいて、たとえ筋肉が完全に発達した後であっても、ミオスタチンが筋原線維タンパク質合成の速度に持続性抑制効果を発揮することを実証した（Ｗｅｌｌｅ Ｓ，２００８）。ミオスタチンの遮断またはそれが自然に不在であることは、筋肉量の有意な増加をもたらす（Ｌｅｅ ＳＪ，２００５）。我々の実験において、１０μｇ／ｍＬ（１０ｐｐｍに相当する）のロディオラ植物抽出物でＣ２Ｃ１２を２回処理した後に、基準物質ＩＧＦ−１よりも良好なミオスタチン遺伝子発現の減少を確認した。興味深いことに、Ｚｕｂｅｌｄｉａらは、２０ｐｐｍのアジュガツルケスタニカ抽出物（２０ＨＥを含むエクジソン及びツルケステロンを含有する植物抽出物）で６時間処理した筋管が、ミオスタチン遺伝子発現を有意に阻害し、その阻害がタンパク質同化ステロイドであるメトアンドロステノロン（１μＭ）によって誘導される阻害の２倍強力であったことを報告している（Ｚｕｂｅｌｄｉａ ＪＭ，２０１２）。

ラポンティクムＦ０画分は、ミオスタチン遺伝子発現に対して有意な効果を示さなかったが、ロディオラ（１０μｇ／ｍＬ）単独ではそれを有意に減少させた。我々の知る限り、ミオスタチン遺伝子発現に対するロディオラの直接的な効果は文献に報告されていない。さらに、ロディオラ及びラポンティクム抽出物の組み合わせによるミオスタチン遺伝子発現の阻害に対する効果の相乗作用が、我々の研究において観察された。タンパク質合成について観察されたように、両方の抽出物（ラポンティクム及びロディオラ）の増強効果は、以前には確認されていなかった。

筋肉量の増加は、タンパク質合成、タンパク質分解、及び衛星細胞分化のバランスである。アトロジン−１または筋萎縮Ｆボックス（ＭＡＦｂｘ）は、筋萎縮の間、ならびに敗血症、癌性悪液質、及び飢餓等の他の病態において骨格筋で高度に発現される主要な筋萎縮関連Ｅ３ユビキチンリガーゼである（Ｃｏｎｇ Ｈ，２０１１）。我々は、ユビキチンプロテアソーム系について調査した。抽出物単独でアトロジン遺伝子発現に対する有意な効果を示したものはなかった。興味深いことに、対照的に、ラポンティクム抽出物の画分Ｆ０をロディオラ抽出物の存在下において１：１０の比でインキュベートしたときに、アトロジン遺伝子発現の阻害の増強効果が観察された（−３１、ｐ＜０．０５）。Ｃｏｎｇらは、ＳｉＭＡＦｂｘアデノウイルスを使用したアトロジンの減少が、遺伝子発現の５５％阻害、タンパク質レベルの６０％阻害、及び筋肉量の２０％増加を引き起こすことを示した。アトロジンが骨格筋萎縮においてＭｙｏＤの分解を標的としたことが示された（Ｌａｇｉｒａｎｄ−Ｃａｎｔａｌｏｕｂｅ Ｊ， ２００９）。

低濃度のアミノ酸の結果：

低濃度のアミノ酸の存在下では、画分Ｆ０ ＥｔＯＨ ５０％を除いてタンパク質合成の有意な誘導は報告されなかったが、タンパク質合成またはｐＳ６Ｋ１リン酸化の刺激は、ＩＧＦ−１によって誘導される刺激より２倍低かった。ほぼ全ての条件においてｐＳ６Ｋ１シグナル伝達が活性化されたが、生理学的反応を誘導するために必要な閾値にはおそらく達していなかったことが分かった。実際に、低濃度のアミノ酸条件では、ｐＳ６Ｋ１レベルが、正常なアミノ酸濃度の存在下で対照条件において観察されるものよりも低かった（最適な画分の最大１．２対正常なアミノ酸濃度の存在下における対照の２．１）。したがって、正常なアミノ酸濃度の存在下で植物抽出物を使用することが好ましい。

Ｆ３、Ｆ５、及びＦ５’は、水性（青色の画分）またはエタノール（オレンジ色の画分）抽出物から精製された画分である。これら全ての精製画分において、タンパク質合成に対する刺激活性、または母液よりも低いレベルの刺激活性は観察されなかった。これらのデータは、精製ステップの間に活性分子（複数可）が精製プロセスの間に損失することを示している。

２０ＨＥの濃度とタンパク質合成の刺激との間に真の相関は認められなかった。タンパク質合成の最も強い刺激が報告された非精製画分において、２０ＨＥの最適な濃度は０．０５〜０．１μＭであると考えられた。これらの結果は、２０ＨＥがタンパク質合成の活性化に関与する唯一の活性分子ではないことを示唆している。したがって、どの分子カクテルがタンパク質合成の刺激に寄与するかを決定するために、異なる画分の分子プロファイルに関する情報を得ることが特に興味深い。

ラポンティクム植物抽出物の最大活性は、１０μｇ／ｍＬ〜１００μｇ／ｍＬの濃度で観察された。画分が精製ステップのためにその活性の一部を喪失した場合、タンパク質合成に対する同様の効果を観察するためには抽出物をより強力な濃度で試験しなければならないことが観察された。したがって、ラポンティクム植物抽出物のインビボ評価に最適な濃度は、１０〜１００μｇ／ｍＬである。

ラポンティクム及びロディオラ抽出物は、両方ともタンパク質合成に対して活性であった：各抽出物単独でタンパク質合成を２０〜３０％増加させ、アッセイで得ることができる上限に達した。ｐＡｋｔまたはｐＳ６Ｋが測定される場合、刺激の最大限度は１００％超であるため、タンパク質合成に対する増強効果は、そのシグナル伝達経路のレベルで理解されるのがより好ましいであろう。

ロディオラ抽出物は、ミオスタチン遺伝子発現の阻害を誘発したが、ロディオラとラポンティクムのＦ０画分を共インキュベートした場合により低い有益な効果が観察された。結果は、Ｆ０画分中の分子（複数可）がロディオラ抽出物の有益な効果を拮抗することができたことを示す。この／これらの物質（複数可）の同定及び前精製は、共インキュベーションの効果を向上させることができる。

抽出物単独でアトロジン遺伝子発現に対する効果を示したものはなかったが、特定の共インキュベーションの条件下で（Ｆ０ １μｇ／ｍＬ及びロディオラ１０μｇ／ｍＬ）アトロジン遺伝子発現の阻害に対する増強効果が観察された。ロディオラ及びラポンティクム抽出物の相乗的かつ有益な効果が、タンパク質分解について観察された。

結論として、この試験は、ラポンティクムの抽出物のＥｔＯＨ ５０％抽出物が、タンパク質合成の刺激について評価した全ての画分の中で最も強力な画分であることを示した。ロディオラ抽出物も、タンパク質合成を強力に増加させた。ラポンティクムのＦ０ 画分と共インキュベートした場合、各抽出物単独（各抽出物が１μｇ／ｍｌの濃度で混合された場合）と比較してこのパラメータに関してより高い効果が示され得る。

並行して、ロディオラ抽出物は、１０μｇ／ｍｌでミオスタチン遺伝子発現を強力に減少させたが、ラポンティクムＦ０画分と共インキュベートした場合により良好な効果が観察された。ロディオラ（１μｇ／ｍｌ）とラポンティクム（１μｇ／ｍｌ）とを組み合わせた場合にミオスタチン遺伝子発現に対する増強効果が観察され、そのためミオスタチン遺伝子の発現は各抽出物単独と比較して（有意ではないが）低かったことに留意されたい。

アトロジン遺伝子発現に関して抽出物の混合の相乗的な阻害効果が観察できたことから、ラポンティクム及びロディオラ抽出物の混合が、タンパク質合成に対する効果に加えてタンパク質分解に与える有益な効果も示唆される。

実施例１７：ロディオラ抽出物及びラポンティクム抽出物の組み合わせが動物モデルにおいて筋タンパク質合成及び関連経路、筋肉量及び筋力に及ぼす効果を試験する
ロディオラ及びラポンティクム抽出物の組み合わせを、体力、筋肉重量、筋肉Ａｋｔリン酸化及びタンパク質含有量、血漿グルコース及び乳酸に及ぼす効果について試験した。

実施例１に記載されるように水中５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて抽出することにより、ラポンティクム・カルタモイデスの根の乾燥抽出物（Ｆ０−ＥｔＯＨ ５０％乾燥粉末）を得た。抽出物は、好ましくは、ハーブ抽出物の総乾燥重量に基づいて、約（％ｗ／ｗ）０．３９５％の２０ＨＥ、０．７９％の全エクジステロイド、及び１３．４％の全ポリフェノール（フォリン・チオカルト）を含有することができる。

好ましくは、ハーブ抽出物の総乾燥重量に基づいて、約（％ｗ／ｗ）３．４１％のサリドロシド、３．１２％のロザビン、及び４．２０％のロザビン類（ロザリン、ロザビン、及びロジンを合わせたもの）を含むロディオラ・ロゼアの根のエタノール性抽出物を得ることができる。

両方の抽出物は、水分＜５％の粉末状であった。組成物の総重量に基づいて５０：５０（ｗ／ｗ）の比で抽出物を混合した。いくつかの試験では、担体またはさらなる賦形剤は加えられなかった。

このロディオラ・ロゼアの根及びラポンティクム・カルタモイデスの根の２つの抽出物の組み合わせを、標的化合物について分析した。

Ｗｉｓｔｅｒラットのオスを、５０ｍｇ／ｋｇ ｂｗ（ｎ＝１０）の用量の抽出物の組み合わせで、またはビヒクル（ｎ＝１０）で６週間の期間処理した。この組み合わせを経管栄養によって１日１回投与した。

Ｗｉｓｔａｒラットの前肢の握力を、処理の前（０日目）及び４２日後（４３日目）に評価し、０日目から４３日目までの握力をデルタとして算出した（ｄ４３の握力−ｄ０握力）。当該技術分野で周知のように、この握力試験は、ラットの前肢及び後肢の握力を測定することを目的としており、例えば、２０ＨＥの投与後の強度を測定するために、他者によって使用されてきた（Ｆｅｌｄｍａｎ−Ｇｏｒｅｌｉｃｋ ｅｔ ａｌ，２００８，ＪＡＦＣ）。

図３０ａに示されるように、ブレンド処理群におけるデルタ握力の増加は、未処理対照群で観察された増加より４５％高かった。さらに、図３０ｂに示されるように、別様に体重に基づいてデルタ握力が報告される場合（すなわち、力（Ｋｇ）／体重（ｇ））、ブレンド処理群は、以前として未処理対照群で観察された増加より４０％高かった。

処理期間中は毎週ラットの体重を週に２回測定した。処理前及び処理の６週間後（運動前及び運動後）に血漿グルコース及び乳酸を測定した。

４３日の処理の終了時（４４日目）に、握力試験及び血液採取後に動物を屠殺した。Ｗｉｓｔａｒラットの後肢及び前肢の筋肉を除去し（長指伸筋（ＥＤＬ）、ヒラメ筋、四頭筋、脛骨、及び三頭筋）、計量した。図３１ａ及び３１ｂに示されるように、ＥＤＬ重量及びＥＤＬ重量対体重比に５％の増加が観察された（ｐ＜０．０５、両方ともマン・ホイットニー）。さらに、図３２ａ及び３２ｂ示されるように、ヒラメ筋重量及びヒラメ筋重量対体重比にも増加が認められた。他の筋肉には筋肉重量の大きな変化は確認されなかった。

採取した筋肉において、タンパク質含有量及びＡｋｔリン酸化を測定した。６週間５０ｍｇ／ｋｇで投与したラポンティクム及びロディオラの組み合わせは、ＥＤＬ筋のタンパク質の量（組織１ｍｇ当たりのタンパク質μｇ、図３３ａ）及びＥＤＬのタンパク質の総量（筋肉当たりのｍｇ、図３３ｂ）を著しく変化させなかった。しかしながら、Ｗｉｓｔａｒラットのヒラメ筋にタンパク質含有量（組織１ｍｇ当たりのタンパク質μｇ；＋１０％、ｐ＝０．０８、図３４ａ）及びＥＤＬのタンパク質の総量（筋肉当たりのｍｇ；＋１４％、図３４ｂ）の増加が観察された。

実施例１８：レジスタンストレーニングプログラム中に、趣味で運動している男性へのロディオラ抽出物及びラポンティクム抽出物の組み合わせの８週間の補給が、身体組成、筋肉量、筋力、及び運動抵抗に及ぼす効果を試験する
インビトロ試験及び動物試験の結果を踏まえて、レジスタンストレーニング中に、趣味で運動している男性に開示されるブレンドを補給することにより、筋力及び筋肉のサイズを増加させるという点において付加的な利益を提供することができると仮定される。この試験の目的は、８週間の動的な一定外部抵抗（ＤＣＥＲ）トレーニング中に、趣味で運動している男性に補給される開示される調製物が、筋力及び大腿筋断面積に及ぼす効果を決定することである。

この試験の主要目的は、ラポンティクム／ロディオラ抽出物の組み合わせ（ブレンドの説明については実施例１７を参照）の８週間の補給が筋力に及ぼす効果を評価することである（１ＲＭレッグプレス及びベンチプレス）。この治験では、１ＲＭならびにベンチプレス及びレッグプレス運動を用いて４週目及び８週目にテストを行い、身体筋力の上限及び下限を評価することができる。

副次的目的は、ラポンティクム／ロディオラ抽出物の組み合わせの８週間の補給が、レジスタンストレーニングの運動中に身体組成及び筋肉量（ＤＸＡ）、筋タンパク質含量、血中グルコース、ならびに疲労に対する抵抗性／疲労に至る時間に及ぼす効果を評価することである

試験は、無作為二重盲検プラセボ対照並行群間試験であり得る。参加者は、彼らの無作為化に従って、低用量（１００ｍｇ）もしくは高用量（４００ｍｇ）の栄養補助食品またはプラセボを８週間毎日摂取することができる。筋力の変化（身体筋力の上限及び下限）は、１ＲＭならびにベンチプレス及びレッグプレス運動を用いて０週目（ベースライン）、４週目、及び８週目に評価することができる。身体組成及び筋肉量の変化は、ＤＥＸＡを用いて０週目及び８週目に評価することができる。筋生検及び分析は、０週目及び８週目に評価することができる。疲労に対する抵抗性／疲労に至る時間は、０週目（処理前：ベースライン）及び８週目に１ＲＭの反復回数の増大によって測定することができる。精神的疲労は、０週目（処理前：ベースライン）及び８週目に主観的運動強度（ＲＰＥ）質問票を用いて評価することができる。

栄養補助食品の摂取に対する急性代謝反応を検証するために（補給期間の初め及び終わり）、無作為二重盲検交差プラセボ対照試験の後に栄養補助食品の急性摂取を行うことができる。低用量（２００ｍｇ）または高用量（４００ｍｇ）の栄養補助食品またはプラセボの急性摂取後、筋力（身体筋力の上限及び下限）を前述のように評価することができる。血中グルコース及び血中乳酸等の生物学的パラメータを測定することができる。

この試験では、健康な、趣味で運動している学生年齢層の男性（例えば、１８〜３５歳）が本試験に参加するために組み入れられ得る。参加者は、全ての組み入れ基準を満たしており、いずれの除外基準にも該当しない（質問票によって決定される）場合に本試験に登録することができる。倫理的承認は、適切な大学の倫理委員会から得ることができる。

参加者は、以下の場合に本試験に組み込むことができる：
−非喫煙者である
−年齢１８歳〜３５歳
−ＢＭＩ １９〜２９．９ｋｇ／ｍ^２
−体重が安定している（すなわち過去３ヶ月に３ｋｇ／ｍ^２を超える体重の増減がない）
−趣味で運動している、すなわち、約１週間に２回はジムに通っているが、いずれの集中的なトレーニングにも競技プログラムにも従っていない（趣味で実施するスポーツの種類及び頻度／強度は決定される）
−試験開始前の３ヶ月間の間に少なくとも１週間に２回はウェイトトレーニングを実施してきた
−いずれの薬物も摂取していない（試験開始前に限定的な期間を設定）、ならびに／または、治験責任医師が代謝、体重、及び／もしくは食欲に影響を及ぼすと考えるいずれの栄養補助食品も前月から摂取していない
−試験開始前１ヶ月（ｔｂｄ）以内に、筋肉量に影響し得るエルゴジェニックなレベルの栄養補助食品（例えば、クレアチン、ＨＭＢ等）及び／または、タンパク質同化ホルモン／異化ホルモンレベルに影響する可能性がある栄養補助食品（例えば、アンドロステンジオン、ＤＨＥＡ等）を摂取していない

参加者は、以下の場合に除外される：
−喫煙者である
−１週間に２回以上ジムに通っている、及び／またはいずれかの集中的なトレーニングまたは競技プログラムに従っている（望ましくないスポーツの種類及び頻度／強度は決定される）
−現在、著しい医学的状態にあると診断されている
−代謝障害、内分泌障害、または心機能障害の任意の履歴または症状を有する
−いずれかの薬物もしくは栄養補助食品を摂取している、及び／または治験責任医師が代謝、体重、及び／もしくは食欲に影響を及ぼすと考えるいずれかの栄養補助食品を前月から摂取していない、あるいは
−試験開始前１ヶ月（ｔｂｄ）以内に、筋肉量に影響し得るエルゴジェニックなレベルの栄養補助食品（例えば、クレアチン、ＨＭＢ等）及び／または、タンパク質同化ホルモン／異化ホルモンレベルに影響する可能性がある栄養補助食品（例えば、アンドロステンジオン、ＤＨＥＡ等）を摂取している

参加者は、処理またはプラセボの２つの独立した群のうちの一方に割り当てることができる（各群に２０人の参加者）。群は、身体的特徴に基づいて可能な限り厳密に適合させることができる。

試験物は、実施例１７に記載されるロディオラ及びラオンティクムの抽出物の組み合わせであってもよい。本試験では、試験物の低用量（１００ｍｇ）及び高用量（４００ｍｇ）の２つの用量を試験することができる。適合する無作用プラセボをセルロース中に使用することができる。

参加者全員が、補給期間の前（０週目）ならびに４週及び８週目に強度に基づく試験を終了することができる。上半身及び下半身の最大反復回数１（１ＲＭ：特定の運動において正しい姿勢で持ち上げることができる最も重い重量）を、それぞれ、ベンチプレス（スミスマシンを使用）及びレッグプレスにより評価することができる。

栄養補給の前及び８週間後に、参加者の伸長及び体重、ならびに四肢の周囲寸法及び胴囲を記録することができる。身体組成及び筋肉重量は、ベースライン（０週目）及び８週後、１ＲＭ運動の前日にＤＥＸＡによって評価することができる。

リン酸化タンパク質対総タンパク質、タンパク質分析、Ａｋｔ／ｐＳ６Ｋ１経路、及び筋線維直径を測定するために、栄養補給の前及び後の筋生検を行うことができる。血中グルコースも測定することができる。

疲労に対する抵抗性／疲労に至る時間に関して、これらのパラメータは１ＲＭの反復回数の増加によって測定することができる。精神的疲労は、主観的運動強度（ＲＰＥ）質問票を用いて評価することができる。

参加者全員が、参加者間の運動の均一性を確認するために、１週間に２セッションの８週間に及ぶ監視下でのトレーニングプログラムを終了することができる。トレーニング負荷は、ベースラインである１ＲＭ測定値の設定パーセンテージであり得、２週間毎にトレーニングプログラムの強度を高めることができる。参加者は、的確な強度及び調整コーチの監督下、１週間に２〜３回トレーニングを行うことができる。全てのトレーニングセッションは、午前中に行われてもよく、各セッションは約９０分継続し得る。各セッションは、標準的なウォーミングアップ、各運動を４×６繰り返し（セット間に４分の回復時間）、及びクールダウンからなり得る。上半身（例えば、ベンチプレス、ショルダープレス、及び三頭筋加重ディップス）及び下半身（例えば、レッグプレス及びレッグエクステンション、ハムストリングカール）の筋系を標的とする運動が行われ得る。トレーニングセッションの合間に主観的運動強度を記録することができる。参加者全員が、試験開始前に各運動に関して正しい技法を教示され得る。

参加者の食事におけるタンパク質摂取を管理するために、栄養士は、タンパク質摂取に有利な食事について指導し、２４時間分の食事を思い出すという形の食事記録を用いて、０、４、及び８週目に分析することができる。

０、４、及び８週間の平均値を算出することができる。反復測定ＡＮＯＶＡ（または２つの時点のみの場合は一元配置ＡＮＯＶＡ）を用いて、各時点で各群内でのベースラインからの変化を評価することができる。

また、ベースラインからの変化（ΔＴ_ｘ−Ｔ_０）は、各変数について計算することができ、多元配置ＡＮＯＶＡを用いて群間で平均変化を比較することができる。

結果は、筋肉量、筋力（１ＲＭ）、筋線維サイズ、及びタンパク質含有量の増加を示すことが予想される。栄養補給は、疲労に至る時間／疲労に対する抵抗性を増加させ、精神的疲労の閾値を向上させることが予想される。

実施例１９：動物モデルにおけるレジスタンストレーニング後に、ロディオラ抽出物またはラポンティクム抽出物または両方の組み合わせが筋タンパク質合成に及ぼす効果を試験する
ロディオラ抽出物もしくはラポンティクム抽出物単独、または両方の抽出物の組み合わせを、短期レジスタンストレーニングの運動後にそれらが筋タンパク質合成の刺激に及ぼす効果について試験した。

１１週齢のＷｉｓｔａｒ Ｈａｎラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，Ｒｈoｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、一定の室温及び湿度で飼育して１２／１２時間の明暗サイクルに維持した。ラットには、趣味で運動している、栄養補給を受けていないヒトの食事により近づくようにタンパク質、抗酸化物質、及びビタミン（成分の一覧及び食餌の栄養価を示す下表を参照）を枯渇させた、ＳＡＦＥ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｎｉｍａｌ Ｆｏｏｄ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｕｇｙ，Ｆｒａｎｃｅ）から入手した特殊なラット用低タンパク飼料を３０ｇ／日給餌し、水を自由に摂取させた。ラットは、実験開始時には１２週齢であったため、完全に成獣であると見なされた。

実験は、８匹のラットからなる８群に対して行われ、以下に示すような対応する処理を受けた。

群１（対照群）：ビヒクル及び陰性対照として０．５％ＣＭＣ（カルボキシ−メチルセルロース）

群２：０．２１ｍｇ／ｍｌ 乳清タンパク質Ｍｉｌｉｃａｌ

群３：１０ｍｇ／ｍｌ ロディオラ・ロゼア根抽出物

群４：１０ｍｇ／ｍｌ ラポンティクム・カルタモイデス根抽出物

群５：２０ｍｇ／ｍｌ ロディオラ／ラポンチクム、比５０：５０（ｗ／ｗ）

群６：１０ｍｇ／ｍｌ ロディオラ／ラポンチクム、比５０：５０（ｗ／ｗ）

群７：５ｍｇ／ｍｌ ロディオラ／ラポンチクム、比５０：５０（ｗ／ｗ）

群８：２ｍｇ／ｍｌ ロディオラ／ラポンチクム、比５０：５０（ｗ／ｗ）

対応するヒト等価用量（ｍｇ／体重（ｋｇ）及びｍｇ／日）及び対応するラットの投与量（ｍｇ）／体重（ｋｇ）を下の表２１に報告する。

実施例１に記載されるように水中５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを用いて抽出することにより、ラポンティクム・カルタモイデスの根の乾燥抽出物（Ｆ０−ＥｔＯＨ ５０％乾燥粉末）を得た。抽出物は、好ましくは、ハーブ抽出物の総乾燥重量に基づいて、約（％ｗ／ｗ）０．３９５％の２０ＨＥ、０．７９％の全エクジステロイド、及び１３．４％の全ポリフェノール（フォリン・チオカルト）を含有することができる。

好ましくは、ハーブ抽出物の総乾燥重量に基づいて、約（％ｗ／ｗ）２．４５％のサリドロシド、１．１４％のロザビン、及び２．４３％のロザビン類（ロザリン、ロザビン、及びロジンを合わせたもの）を含むロディオラ・ロゼアの根のエタノール性抽出物を得ることができる。

両方の抽出物は、水分＜５％の粉末状であった。組成物の総重量に基づいて５０：５０（ｗ／ｗ）の比で抽出物を混合した。いくつかの試験では、担体またはさらなる賦形剤は加えられなかった。

このロディオラ・ロゼアの根及びラポンティクム・カルタモイデスの根の２つの抽出物の組み合わせを、標的化合物について分析した。

トレーニング
１週間の馴化後、１６匹のラットを８匹のラットからなる２つの群に無作為に分けた。トレーニングの７２時間前に、ラットが梯子に慣れるように学習セッションを行い、実験前に２４時間絶食させた。

実験当日、同じ群からの４匹のラットを高さ１メートルの梯子上で適時トレーニングした。各４匹のラット群を、連続的に体重の０％、体重の５０％及び７５％に達する負荷を加えて１０回昇降させた。各昇降の間にラットを２分間休息させ、各セットの間には５分間休息させた。

荷重を含む袋をテープで尾の付け根に付着した。

トレーニング後、ラットをなおも絶食させ、いずれの食餌も与えなかった。

薬物投与
各トレーニングセッションの直後に経口経管栄養によって薬物を投与した。

０．５％ＣＭＣ中に即席で溶液を調製した。

解剖及び筋肉の除去
トレーニングの２時間後、ラットに１０ｍＭピューロマイシン１００μＬ／２５ｇ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ８８３３）を腹腔内投与し、ペントバルビタール１５０ｍｇ．ｋｇ−１（ＰＥＮＴＯＢＡＲＢＩＴＡＬ（登録商標））の腹腔内投与により麻酔した。

ピューロマイシン注射後３０分以内に、右深指屈筋（ＦＤＰ）、三角筋、及び二頭筋を採取し、イソペンタン溶液に入れ、液体窒素で急冷し、さらなる生化学的分析のために−８０℃で保存した。

タンパク質の抽出及び投与量
２０ｍｇの各試料を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８３４０ｍＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む１０体積の溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ ｐＨ６．８、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ １％）中でホモジナイズした。全ての筋タンパク質をＩＫＡ ＵＬＴＲＡ ＴＵＲＲＡＸ Ｔ２５デジタルで抽出する。ホモジネートを４度で１０分間回転させ、上清を回収した。

タンパク質合成の定量化
総タンパク質合成をウエスタンブロット用抗ピューロマイシンにより分析した。

５０μｇのタンパク質試料を変性させ、１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離させ、ニトロセルロース膜に転写した。一次抗体抗ピューロマイシン（抗ピューロマイシン抗体、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからのクローン１２Ｄ１０（１／３０００）を４℃で一晩適用し、続いて、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした二次抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ Ｌｉｍｉｔｅｄからの抗マウスＩｇＧ ＥＣＬ）でインキュベートした。

ウエスタンブロット画像定量解析によるタンパク鎖へのピューロマイシンの取り込みの定量化（ペプチド結合の形成による）は、インビボでの筋肉における新規タンパク質合成（タンパク質合成の誘導）を表すものであり、薬物投与に応じたトレーニングセッション後のタンパク質合成の刺激を意味する（Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｈｏｒｎｂｅｒｇｅｒ，２０１３）。したがって、タンパク質合成は、対照条件（ビヒクルを給餌された動物の群）または他の条件からの％としてのタンパク質合成の相対的比率として表される。

全ての値は平均値±ＳＥＭとして表される。フィッシャーのＬＳＤ ＡＮＯＶＡを用いてデータを比較した。ｐ＜０．０５のときに有意であると設定した。

各処理用の８匹の動物の深指屈筋（ＦＤＰ）のウエスタンブロットを示す図３５ａに示されるように、また定量的な総タンパク質負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す図３５ｂに示されるように、ロディオラ・ロゼアの根抽出物ではなく、ラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物が単独で、両方の抽出物を組み合わせたいずれの濃度よりも低い濃度で（用量を徐々に減少させて）、タンパク質合成を有意に刺激することができた。

抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日から１００ｍｇ／日に徐々に減少させた４つの試験用量）は、図３５ｄ及び３５ｅにそれぞれ示されるように（定量的な総タンパク質負荷量及びロディオラ群またはラポンティクム群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルをそれぞれ示す）、実際にロディオラ・ロゼアの根抽出物単独またはラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独よりも有意に優れていた。さらに、抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日から１００ｍｇ／日に徐々に減少させた４つの試験用量）の効果はまた、図３５ｃ（定量的な総タンパク質負荷量及び乳清タンパク質群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、乳清タンパク質よりも有意に優れていた。表２２は、ロディオラ・ロゼアの根抽出物単独またはラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独の結果から予想できたものと比較して、異なる用量の組み合わせを用いて得られた結果間の差を示す。予想外に、半分の濃度のロディオラ・ロゼアの根抽出物及び半分の濃度のラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物の組み合わせのＦＤＰにおけるタンパク質合成の刺激に対する効果は、十分な濃度のロディオラまたはラポンティクムよりも良好な効果を示した。これは相乗効果である。さらに、半分の濃度のロディオラ及び半分の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（１．９倍高い）効果を示した。さらに、４分の１の濃度のロディオラ及び４分の１の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（３．０倍高い）効果を示した。最後に、１０倍低い濃度のロディオラ及び１０倍低い濃度のラポンティクムの組み合わせの効果も、予想されたよりも高い（５．８倍高い）効果を示した。これらの結果は、短期レジスタンストレーニング後に、配合比５０：５０（ｗ／ｗ）の５００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、及び１００ｍｇ／日の抽出物の組み合わせが深指屈筋におけるタンパク質合成刺激に与える相乗効果を明らかに示している。

各処理用の８匹の動物の三角筋のウエスタンブロットを示す図３６ａに示されるように、また定量的な総タンパク質負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す図３６ｂに示されるように、ラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独またはロディオラ・ロゼアの根抽出物のいずれも、タンパク質合成を有意に刺激することはできなかったが、両方の抽出物の組み合わせは、徐々に減少させた１０００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、及び２５０ｍｇ／日のＨＥＤでタンパク質合成を有意に刺激した。

抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ：５００ｍｇ／日から１００ｍｇ／日に徐々に減少させた３つ）は、図３６ｄ（定量的な総タンパク質負荷量及びロディオラ群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、実際にロディオラ・ロゼアの根抽出物単独よりも有意に優れていた。抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ：１０００ｍｇ／日から１００ｍｇ／日）はまた、図３６ｅ（定量的な総タンパク質負荷量及びラポンティクム群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、ラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独よりも優れていたさらに、抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日及び５００ｍｇ／日）はまた、図３６ｃ（定量的な総タンパク質負荷量及び乳清タンパク質群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、乳清タンパク質よりも有意に優れていた。表２３（下）は、ロディオラ・ロゼアの根抽出物単独またはラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独の結果から予想できたものと比較して、異なる用量の組み合わせを用いて得られた結果間の差を示す。予想外に、半分の濃度のロディオラ・ロゼアの根抽出物及び半分の濃度のラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物の組み合わせの三角筋におけるタンパク質合成の刺激に対する効果は、十分な濃度のロディオラまたはラポンティクムよりも良好な効果を示した。これは相乗効果である。さらに、半分の濃度のロディオラ及び半分の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（１．６倍高い）効果を示した。さらに、４分の１の濃度のロディオラ及び４分の１の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（３．４倍高い）効果を示した。最後に、１０倍低い濃度のロディオラ及び１０倍低い濃度のラポンティクムの組み合わせの効果も、予想されたよりも高い（５．４倍高い）効果を示した。これらの結果は、短期レジスタンストレーニング後に、配合比５０：５０（ｗ／ｗ）の５００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、及び１００ｍｇ／日の抽出物の組み合わせが三角筋におけるタンパク質合成刺激に与える相乗効果を明らかに示している。

各処理用の８匹の動物の二頭筋のウエスタンブロットを示す図３７ａに示されるように、また定量的な総タンパク質負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す図３７ｂに示されるように、ラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独またはロディオラ・ロゼアの根抽出物のいずれも、タンパク質合成を有意に刺激することはできなかったが、両方の抽出物の組み合わせは、徐々に減少させた１０００ｍｇ／日、５００ｍｇ／日、及び２５０ｍｇ／日のＨＥＤでタンパク質合成を有意に刺激した。

抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ：１０００ｍｇ／日及び５００ｍｇ／日）は、図３７ｄ（定量的な総タンパク質負荷量及びロディオラ群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、実際にロディオラ・ロゼアの根抽出物単独よりも有意に優れていた。抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ：１０００ｍｇ／日及び５００ｍｇ／日）はまた、図３７ｅ（定量的な総タンパク質負荷量及び乳清タンパク質群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、乳清タンパク質よりも有意に優れていた。さらに、抽出物の組み合わせ（ＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日及び５００ｍｇ／日）の効果はまた、図３７ｃ（定量的な総タンパク質負荷量及び乳清タンパク質群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す）に示されるように、乳清タンパク質よりも有意に優れていた。表２４（下）は、ロディオラ・ロゼアの根抽出物単独またはラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独の結果から予想できたものと比較して、異なる用量の組み合わせを用いて得られた結果間の差を示す。予想外に、半分の濃度のロディオラ・ロゼアの根抽出物及び半分の濃度のラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物の組み合わせの二頭筋におけるタンパク質合成の刺激に対する効果は、十分な濃度のロディオラまたはラポンティクムよりも良好な効果を示した。これは相乗効果である。さらに、半分の濃度のロディオラ及び半分の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（２倍高い）効果を示した。さらに、４分の１の濃度のロディオラ及び４分の１の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（２．５倍高い）効果を示した。最後に、１０倍低い濃度のロディオラ及び１０倍低い濃度のラポンティクムの組み合わせの効果も、予想されたよりも高い（５．０倍高い）効果を示した。これらの結果は、短期レジスタンストレーニング後に、配合比５０：５０（ｗ／ｗ）の５００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、及び１００ｍｇ／日の抽出物の組み合わせが二頭筋におけるタンパク質合成刺激に与える相乗効果を明らかに示している

全ての筋肉の組み合わせ（ＦＤＰ＋三角筋＋二頭筋）について定量的な総タンパク質負荷量及び陰性対照群に対して正規化された任意単位のピューロマイシンレベルを示す図３８に示されるように、ロディオラ・ロゼアの根抽出物ではなく、ラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物が単独で、両方の抽出物を組み合わせたいずれの濃度よりも低い濃度で（用量を徐々に減少させて）、タンパク質合成を有意に刺激することができた。抽出物の組み合わせは、徐々に減少させた４つの試験用量（ＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日から１００ｍｇ／日）でロディオラ・ロゼアの根抽出物単独よりも有意に優れており、またＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日及び５００ｍｇ／日のラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独よりも有意に優れていた。さらに、試験した抽出物の組み合わせの全ての用量（ＨＥＤ＝１０００ｍｇ／日から１００ｍｇ／日）が、乳清タンパク質よりも有意に優れていた。

表２５（下）は、ロディオラ・ロゼアの根抽出物単独またはラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物単独の結果から予想できたものと比較して、異なる用量の組み合わせを用いて得られた結果間の差を示す。予想外に、半分の濃度のロディオラ・ロゼアの根抽出物及び半分の濃度のラポンティクム・カルタモイデスの根抽出物の組み合わせの全ての筋肉におけるタンパク質合成の刺激に対する効果は、十分な濃度のロディオラまたはラポンティクムよりも良好な効果を示した。これは相乗効果である。さらに、半分の濃度のロディオラ及び半分の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（１．８倍高い）効果を示した。さらに、４分の１の濃度のロディオラ及び４分の１の濃度のラポンティクムの組み合わせの効果は、予想されたよりも高い（３．０倍高い）効果を示した。最後に、１０倍低い濃度のロディオラ及び１０倍低い濃度のラポンティクムの組み合わせの効果も、予想されたよりも高い（５．４倍高い）効果を示した。これらの結果は、短期レジスタンストレーニング後に、配合比５０：５０（ｗ／ｗ）の５００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日、及び１００ｍｇ／日の用量抽出物の組み合わせが全ての筋肉（ＦＤＰ＋三角筋＋二頭筋を合わせたもの）におけるタンパク質合成刺激に与える相乗効果を明らかに示している。

記載される実施形態は、種々の変形及び代替形態が可能であり、それらの特定の例が、図面において例として示され、本明細書に詳細に記載されている。しかしながら、記載される実施形態は、記載される特定の形態または方法に限定されず、反対内、本開示は、全ての変形例、均等物、及び代替例を包含することを理解されたい。

参考文献
Ｇｏｏｄｍａｎ ＣＡ，Ｈｏｒｎｂｅｒｇｅｒ ＴＡ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｗｉｔｈ ＳＵｎＳＥＴ：ａ ｖａｌｉｄ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ？Ｅｘｅｒｃｉｓｅ ａｎｄ ｓｐｏｒｔ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１３；４１（２）：１０７−１１５．ｄｏｉ：１０．１０９７／ＪＥＳ．０ｂ０１３ｅ３１８２７９８ａ９５（参照により本明細書に組み込まれる）

Claims (27)

1. 対象におけるタンパク質合成の増加または筋タンパク質分解の減少、筋肉減少症の軽減、筋肉量の減少の阻害、筋萎縮または筋廃用または筋失調の軽減に使用するための組成物であって、
   ラポンティクム抽出物及びロディオラ抽出物を含み、
   ラポンティクム抽出物は、水中のエタノールで抽出することにより得られ、
   該組成物中に５０〜９９重量％のラポンティクム抽出物と１〜５０重量％のロディオラ抽出物を含む、または、該組成物中に１〜５０重量％のラポンティクム抽出物と５０〜９９重量％のロディオラ抽出物を含む、組成物。
2. 前記組成物は、約０．１％〜１０％のエクジステロンを含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記組成物は、約０．５％〜３％のエクジステロンを含む、請求項１に記載の組成物。
4. 前記ラポンティクム抽出物は、約０．１〜１０％のエクジステロイドを含む、請求項１に記載の組成物。
5. 前記ラポンティクム抽出物は、約０．４％〜５％のエクジステロイドを含む、請求項１に記載の組成物。
6. 前記組成物は、約０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソンを含む、請求項１に記載の組成物。
7. 前記ロディオラ抽出物は、約１％〜４％のサリドロシドを含む、請求項１に記載の組成物。
8. 前記ロディオラ抽出物は、約１％〜１０％のロザビン類を含む、請求項１に記載の組成物。
9. 前記ロディオラ抽出物は、約１％〜１０％のロザビンを含む、請求項１に記載の組成物。
10. 前記ロディオラ抽出物は、
    約１％〜４％のサリドロシド、
    約０．５％〜１０％のロザビン、及び
    約０．５％〜１０％の全ロザビン類を含み、
    前記ラポンティクムの抽出物は、
    約０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソン、及び
    約０．１％〜１０％の全エクジステロンを含む、請求項１に記載の組成物。
11. 対象におけるタンパク質合成の増加または筋タンパク質分解の減少に使用するための経口投与用の、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記対象は、ヒトである、請求項１１に記載の組成物。
13. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物を含む薬学的製剤であって、前記製剤は、経口投与用に製剤化される、薬学的製剤。
14. 前記製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１３に記載の薬学的製剤。
15. 対象におけるタンパク質合成の増加、筋肉減少症の軽減、筋肉量の減少の阻害、筋萎縮または筋廃用または筋失調の軽減、筋タンパク質分解の減少、筋肉量の増加または筋力増加に使用するための組成物であって、
    約０．１％〜１０％の全エクジステロイド、
    約１％〜４％のサリドロシド、及び
    約１％〜６％の全ロザビン類を含む、組成物。
16. 約０．４％〜５％の全エクジステロイドを含む、請求項１５に記載の組成物。
17. ０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソンを含む、請求項１５に記載の組成物。
18. 約１％〜５％のロザビンを含む、請求項１５に記載の組成物。
19. 約０．４％〜５％のエクジステロイド、
    約０．１％〜５．０％の２０−ヒドロキシエクジソン、及び
    約１％〜５％のロザビンを含む、請求項１５に記載の組成物。
20. 対象におけるタンパク質合成の増加、筋肉減少症の軽減、筋肉量の減少の阻害、筋萎縮または筋廃用または筋失調の軽減に使用するための経口投与用の組成物であって、
    （ｉ）請求項１５に記載の組成物、および、
    （ｉｉ）請求項１に記載の組成物、からなる群から選択される組成物。
21. 前記対象は、ヒトである、請求項２０に記載の組成物。
22. 前記対象は、動物である、請求項２０に記載の組成物。
23. 対象における筋タンパク質分解の減少、筋肉量の増加または筋力増加に使用するための経口投与用の、請求項１５に記載の組成物。
24. 前記対象は、約５〜５０ｍｇ／ｋｇ／日の前記組成物を投与される、請求項１１、２０または２３に記載の組成物。
25. 前記対象は、約５０〜５００ｍｇ／日の前記組成物を投与される、請求項１１、２０または２３に記載の組成物。
26. 前記対象は、約５０〜２０００ｍｇ／日の前記組成物を投与される、請求項１１、２０または２３に記載の組成物。
27. 前記製剤は、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１１、２０または２３に記載の組成物。