JP2014526444A - ニュートリプロテクティブダイエット - Google Patents

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Abstract

本書類は、糖料植物シロップ、糖料植物シロップ抽出物、糖料植物抽出物、またはそれらの組合せのもののニュートリプロテクティブ量を含む、ニュートリプロテクティブダイエットを記載する。また本書類は、対象体におけるニュートリプロテクティブ効果を引き出す方法を記載し、それには、本発明に従うニュートリプロテクティブダイエットのニュートリプロテクティブ量を管理することが含まれる。また、本書類はさらに、本発明に従うニュートリプロテクティブダイエットのニュートリプロテクティブ量を施すことによって、障害を有する対象体を処置する方法を記載する。また、本書類は、吸着剤物質を使用して、メープルシロップからポリフェノール化合物を抽出するためのプロセス、およびそれから得られる抽出物を記載する。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、2011年9月9日付け出願の、米国仮特許出願第61/532808号による優先権を請求し、ここに参照することによりその詳細を組み込む。
背景
（a）分野
本書類は、糖料植物シロップ、糖料植物シロップ抽出物、糖料植物抽出物、糖料植物抽出の廃棄物、またはそれらの組合せのもののニュートリプロテクティブ量を含む、ニュートリプロテクティブダイエットを説明する。また本書類は、対象体においてニュートリプロテクティブ効果を引き出す方法を説明し、それには、本発明に従うニュートリプロテクティブダイエットのニュートリプロテクティブ量を管理することが含まれる。また、本書類はさらに、本発明に従うニュートリプロテクティブダイエットのニュートリプロテクティブ量を施すことによって、障害を有する対象体を処置する方法を説明する。また、本書類は、吸着物質を使用して、メープルシロップからポリフェノール化合物を抽出するためのプロセス、およびそれから得られる抽出物を説明する。
（b）関連先行技術
メープルシロップ（MS）は、味の良い甘味料として消費される自然甘味料で、北米を原産とするシュガーメープル〔Acer saccharum（サトウカエデ）〕 を含む一定のメープル種から収集される樹液を濃縮することによって得られる。世界中の子供たち、大人および高齢者でも多数によって好まれる非常に人気のあるフードである。
異なる集団のダイエットおよびライフスタイルは、癌や他の疾患のそれらの率を決定することがあるという認識のもと、ますます多くの人々は、MSのような天然物において、それがまた、かれらの健康のためによいとうい見込みから、それらの摂取量を増やそうと試みる。
肝疾患または肝機能不全は、たとえば、（真性）糖尿病などのようなあらゆる生活習慣病において密接に関与することが知られている。加えて、低下した肝機能は老化の主要な原因として指摘されている。近代では、そこに、人々は、器官に有害な活性酸素種を増加させる多くの要因、たとえば、タバコ、アルコール、高脂肪ダイエット（食事、食餌）およびストレスのようなものに曝露され、人々が肝機能を損傷する傾向にある環境で生きていると言える。毎日の食事は、メタボリックシンドローム（代謝異常症候群）を含む生活習慣病を予防するための重要な鍵である。肝臓保護機能を有する食物の継続摂取が、それらの予防のために有望でありうる。
肝疾患は、それらの原因に応じて、ウイルス性肝疾患、アルコール性肝疾患、薬物毒性による肝疾患、脂肪肝疾患、自己免疫性肝疾患、代謝性肝疾患および他の肝疾患に分類される。肝疾患は、自覚症状がないために初期の段階での診断が困難であり、それで多くの国における死亡の主因である。しかしながら、肝疾患のための有効な治療上の薬剤および診断方法は依然として存在しない。
肝疾患の予防および処置のための天然材料の使用に関する多くの研究が実行されている。そのような自然素材の典型的な例には、Silybum marianum（マリアアザミ、オオアザミ）の種子から分離されるシリマリン、Schizandra chinensis（チョウセンゴミン）から分離されるゴミシン、カンゾウ（根）から分離されるグリシリジン、および同様な他のものが含まれる。もっとも、どれも、MSの使用に関連しない。
人体の化学的工場である肝臓は、それが直接我々の食物摂取により影響を受ける。MSの世界的な人気、そしてメープルシロップ含有ダイエットの健康促進効果に関して利用可能な科学的な証拠がないという事実を考慮すると、MSの機能のさらなる知識は、肝疾患などのような生活習慣病の予防に役立つであろう。
概略
実施形態に従い、糖料植物シロップ、糖料植物シロップ抽出物、糖料植物抽出物、植物抽出の廃棄物（rejection）、またはそれらの組合せのニュートリプロテクティブ量を含む、ニュートリプロテクティブダイエットを提供する。
糖料植物シロップのニュートリプロテクティブ量は、少なくとも1％の糖料植物シロップで最大99％の糖料植物シロップまでであることができる。
糖料植物シロップのニュートリプロテクティブ量は、少なくとも10％の糖料植物シロップで最大70％の糖料植物シロップまででありうる。
糖料植物シロップのニュートリプロテクティブ量は20％の糖料植物シロップでありうる。
糖料植物シロップ抽出物のニュートリプロテクティブ量は約0.0010％から約0.15％までの糖料植物シロップ抽出物であることができる。
糖料植物シロップ抽出物のニュートリプロテクティブ量は約0.0020％から約0.10％までの糖料植物シロップ抽出物であってよい。
糖料植物シロップ抽出物のニュートリプロテクティブ量は約0.0027％から約0.1023％までの糖料植物シロップ抽出物であってよい。
糖料植物シロップは糖料植物シロップ由来生成物（derived product）であることができる。糖料植物シロップ由来生成物は、バター、グラニュー糖、硬化糖（hardened sugar）、ソフトシュガー（粉末糖）、タフィー、糖料植物シロップろ過残留物、プロダクト生成（生成物発生）の廃棄物、またはそれらの組合せであってよい。
糖料植物抽出物は、逆浸透から生じる濃縮糖料植物水、プレ沸騰ナノろ過から生じる濃縮糖料植物水、パスチャライズ（低温殺菌）糖料植物水、滅菌糖料植物水および樹液、濃縮樹液からの抽出物、糖料植物シロップ、シロップろ過残留物、サマラ（翼果）、果実、種子、茎、葉、枝、根、ハートウッド（心材）、サップウッド（辺材）、およびバーク（皮）、抽出物のいずれか一つの調製物からの廃棄物残さ、またはそれらの組合せであることができる。
糖料植物は、メープルツリー（カエデ、モミジ）、カバノキ、サトウキビ、テンサイ、コーン（トウモロコシ）、イネ、ヤシノキ、およびアゲーブ（リュウゼツラン）から選ぶことができる。
糖料植物シロップ抽出物は、メタノール抽出物、ブタノール抽出物、糖を伴うブタノール抽出物、糖を伴わないブタノール抽出物、エチルアセタート（酢酸エチル）抽出物、エタノール抽出物、メチルターシャリー（tert-）ブチルエーテル抽出物、樹脂精製されたメープルシロップ抽出物（MSX）、またはそれらの組合せから選ぶことができる。
糖料植物シロップ抽出物は肝保護効果を有しうる。
ブタノール抽出物は肝保護効果を有することができる。
第2の実施形態において、対象体におけるニュートリプロテクティブ効果を引き出す方法を開示し、それには、本発明に従うダイエットのニュートリプロテクティブ量を管理する（施す）ことが含まれる。
ニュートリプロテクティブ効果はニュートリセラピーまたは肝保護効果でありうる。
肝保護効果は、肝臓の細胞アミノ酸代謝におけるダウンレギュレーション（下方制御）であることができる。
肝保護効果は、アンモニア形成酵素の肝生産におけるダウンレギュレーションであることができる。
肝保護効果には、アスパルタート（アスパラギン酸）アミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）および/またはラクタート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（LDH）の対象体しょう液（血清）レベルにおけるダウンレギュレーションが含まれうる。
第3の実施形態において、障害を有する対象体の処置方法を開示し、それには、本発明に従うダイエットのニュートリプロテクティブ量を管理することが含まれる。
障害は、肝障害、炎症性疾患、癌、糖尿病、心血管疾患、神経変性疾患、および記憶障害でありうる。
肝障害は、メタボリックシンドローム（代謝症候群）、損傷肝機能（damaged hepatic function）、ヘパティック酸肝（hepatic acid liver）、脂質異常症、肝炎および肝癌でありうる。
別の実施形態において、対象体における障害の処置用の薬を調製するために、本発明に従うニュートリプロテクティブダイエットの使用を開示する。
別の実施形態において、対象体における障害を処置するために、本発明に従うニュートリプロテクティブダイエットの使用を開示する。
障害は、肝障害、炎症性疾患、癌、糖尿病、心血管疾患、神経変性疾患、および記憶障害でありうる。
肝障害は、メタボリックシンドローム、損傷肝機能、ヘパティック酸肝、脂質異常症、肝炎および肝癌でありうる。
別の実施形態において、製薬上および栄養補助上（pharmaceutical and neutraceutical）の化合物、機能性食料（functional food）、および自然健康生産物（natural health products）からなる群より選ばれる少なくとも一つのダイエタリーサプリメントの相乗的な取込みおよび/または管理のために、糖料植物シロップ、糖料植物シロップ抽出物、糖料植物抽出物、またはそれらの組合せを含む、ニュートリプロテクティブキャリヤーを開示する。
キャリヤーは、飲用液体、エナジードリンク、治療上の飲料、およびタンパク質リッチ（豊富）飲料から選ばれうる。
キャリヤーはダイエタリーサプリメント上のコーティングでありうる。
別の実施形態に従い、受動体における障害を予防または処置する方法を提供し、それには、製薬上および栄養補助上の化合物、機能性食物、および自然健康生産物からなる群より選ばれる少なくとも一つのダイエタリーサプリメントを、本発明のキャリヤーと組み合わせて施すことが含まれ、キャリヤーは同時に、またはサプリメントに先立って施される。
実施形態に従い、メープルシロップからポリフェノール化合物を抽出するためのプロセスを提供し、それには、
a）吸着剤物質（adsorbent material）でその上に吸着したメープルシロップポリフェノールフラクション（画分）を有するものと、有機溶媒とを、前記メープルシロップポリフェノールフラクションが溶出し、そして収集されるために、十分な時間の間、および十分な回数にわたり接触させること
が含まれうる。
十分な時間は約30分であることができる。
十分な回数は約1回乃至約3回でありうる。
本発明のプロセスでは、ステップa）に先立ち、メープルシロップ混合物は、前記吸着剤物質上に、前記ポリフェノールフラクションが前記吸着剤物質上に吸着するのに十分な時間の間、吸着され、前記混合物には、水において希釈されるメープルシロップが含まれる。
ポリフェノールフラクションを吸着するのに十分な時間は、約12乃至約20時間でありうる。
ポリフェノールフラクションを吸着するのに十分な時間は、約16時間でありうる。
本プロセスは、さらに吸着剤物質上への吸着に先立って水においてメープルシロップを希釈するステップを含むことができる。
本プロセスは、さらにステップa）に先立って吸着剤物質を水で洗浄するステップを含むことができる。
本プロセスは、さらにステップb）、すなわち
2）有機溶媒を蒸発させ、および乾燥ポリフェノールフラクションを得るために、収集ポリフェノールフラクションを加熱すること
を含むことができる。
加熱は約37℃乃至約40℃の温度である。
有機溶媒は、メタノール、エチルアセタート、ブタノール、エタノール、メチルターシャリーブチルエーテル、およびそれらの組合せから選ばれる。
吸着物質は、AmberliteTM（「アンバーライト」商品名）XAD-4、AmberliteTM XAD-2、AmberliteTM XAD-7 、AmberliteTMXAD 7HP、AmberliteTM XAD16、AmberliteTM XAD16HP、AmberliteTMXAD761、AmberliteTM XAD1180、AmberliteTM XAD1600、AmberliteTMXFS-4257、AmberliteTM XFS-4022、AmberliteTM XUS-40323、AmberliteTMXUS-40322、AmberliteTM FPX66、AmberliteTM強アニオン交換（SAX）、AmberliteTM WAX、ペンタフルオロフェニル誘導体化シリカゲル、HLB（疎水性-親脂性バランスの）タイプのSILIaPrepX相、シリカ上の強アニオン交換（SAX）樹脂、混合モード強アニオン交換（SAX）-C18、水性C18相、C18相、C18タイプSILIaPrepXTM相、珪藻土から選ぶことができる。
本プロセスは、さらにステップa）に先立ち、メープルシロップからの糖（シュガー）の抽出のために、固体の混合物での抽出を含むことができる。
固体の混合物での抽出には、MgSO4、NaCl、および固形吸収剤（solid absorbent）での抽出が含まれる。
固形吸収剤は、アミノ化シリカ樹脂、C18シリカ樹脂、またはその組合せから選ぶことができる。
本プロセスには、さらにステップa）に先立ち、前記メープルシロップの液-液抽出を含むことができる。
液-液抽出には、エチルアセタート抽出、ブタノール抽出、またはその組合せ、次いで約85％の二酸化ケイ素（SiO2）および約15％の酸化マグネシウム（MgO）の比を有するSiO2/MgO固相上での吸着を含むことができる。
実施形態に従い、本発明のプロセスから得られる抽出物を提供する。
下記に以下の用語を定義する。
用語「糖料植物」は、メープルツリー（カエデ、モミジ）、カバノキ、サトウキビ（カンショ）、テンサイ（サトウダイコン）、コーン（トウモロコシ）、イネ、ヤシノキ（シュロノキ）、およびアゲーブ（リュウゼツラン）を意味することを意図する。
用語「メープルツリー」は、現在まで知られている種のメープルツリーを意味することを意図し、たとえば、Acer nigrum（アセル・ニグラム、ブラックメープル）、Acer lanum、Acer acuminatum、Acer albopurpurascens、Acer argutum、Acer barbinerve、Acer buergerianum、Acer caesium、Acer campbellii、Acer campestre、Acer capillipes、Acer cappadocicum、Acer carpinifolium、Acer caudatifolium、Acer caudatum、Acer cinnamomifolium、Acer circinatum、Acer cissifolium、Acer crassum、Acer crataegifolium、Acer davidii、Acer decandrum、Acer diabolicum、Acer distylum、Acer divergens、Acer erianthum、Acer erythranthum、Acer fabri、Acer garrettii、Acer glabrum、Acer grandidentatum、Acer griseum、Acer heldreichii、Acer henryi、Acer hyrcanum、Acer ibericum、Acer japonicum、Acer kungshanense、Acer kweilinense、Acer laevigatum、Acer laurinum、Acer lobelii、Acer lucidum、Acer macrophyllum、Acer mandshuricum、Acer maximowiczianum、Acer miaoshanicum、Acer micranthum、Acer miyabei、Acer mono、Acer mono x Acer truncatum、Acer monspessulanum、Acer negundo、Acer ningpoense、Acer nipponicum、Acer oblongum、Acer obtusifolium、Acer oliverianum、Acer opalus、Acer palmatum、Acer paxii、Acer pectinatum、Acer pensylvanicum、Acer pentaphyllum、Acer pentapomicum、Acer pictum、Acer pilosum、Acer platanoides、Acer poliophyllum、Acer pseudoplatanus、Acer pseudosieboldianum、Acer pubinerve、Acer pycnanthum、Acer rubrum、Acer rufinerve、Acer saccharinum、Acer saccharum、Acer sempervirens、Acer shirasawanum、Acer sieboldianum、Acer sinopurpurescens、Acer spicatum、Acer stachyophyllum、Acer sterculiaceum、Acer takesimense、Acer tataricum、Acer tegmentosum、Acer tenuifolium、Acer tetramerum、Acer trautvetteri、Acer triflorum、Acer truncatum、Acer tschonoskii、Acer turcomanicum、Acer ukurunduense、Acer velutinum、Acer wardii、Acer x peronai、Acer x pseudoheldreichiiまたはまだ知られていない任意の新種のようなものである。
用語「糖料植物シロップ」は糖料植物シロップおよび糖料植物シロップ誘導生成物、たとえば、バター、樹液バター、グラニュー糖、硬化糖（hardened sugar）、ソフトシュガー（粉末糖）、タフィー、砂料植物シロップろ過残留物、およびプロダクト生成のなんらかの廃棄物などのようなものを意味することが意図される
用語「糖料植物抽出物」は、樹液、サマラ（翼果）、果実、種子、茎、葉、枝、根、ハートウッド（心材）、サップウッド（辺材）、バーク（皮）からの抽出物、ならびに逆浸透から生じる濃縮糖料植物水、プレ沸騰ナノろ過から生じる濃縮糖料植物水、パスチャライズ（低温殺菌）糖料植物水、および滅菌糖料植物水を意味することが意図される。
用語「糖料植物シロップ抽出物」は、メタノール抽出物、ブタノール抽出物、糖を伴うブタノール抽出物、糖を伴わないブタノール抽出物、エチルアセタート抽出物、エタノール抽出物、メチルターシャリーブチルエーテル抽出物、精製樹脂抽出物から得られる抽出物、またはそれらの組合せを意味することが意図される。
用語「ニュートリプロテクティブ」は、対象体における任意の障害または疾患のニュートリプロテクティブおよびニュートリセラピーを意味することを意図し、制限されないが、肝障害、炎症性疾患、癌、糖尿病、心血管疾患および神経変性疾患が含まれ、そこでは、肝臓の場合に、それは「ヘパトプロテクティブ（肝保護）」と称される。
用語「ダイエタリーサプリメント」はまた、糖料植物抽出物またはその合成等価物、薬用化粧品、製薬上および栄養補助上の化合物、機能性食物、自然健康生産物を意味することが意図される。
用語「肝保護」は、肝臓の損傷を防止する能力を有するダイエット、化合物、組成物、方法、処置のいずれか一つを意味することが意図される。
添付の図に示すように、本文書の主題の特色および利益は、選ばれた実施形態の以下の詳細な説明に照らし、より一層明らかになるであろう。当然ながら、開示され、およびクレームされた主題は、すべてが請求の範囲から離れることなく、様々な点において修飾が可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示として見なされるべきであり、そして制限としてではなく、および主題のすべての範囲は請求の範囲に述べられる。
試験した対象体についてのダイエットスケジュールおよび生物学的試料分析法を示す。 試験した対象体の体重および総食物摂取を示す。 対象体の血液生化学を示す。 DNAマイクロアレイデータ解析の方法を示す。 階層的クラスター化を示す。 アミノ酸メタボライジング（代謝）酵素のダウンレギュレーション（下方制御）された遺伝子を示す。 セリン/トレオニン（スレオニン）デヒドラターゼおよびヒスチジンアンモニアリアーゼのようなアンモニア形成酵素の細胞アミノ酸代謝プロセスのダウンレギュレーションを示す。 ここに記載する調査の実験的設計を示す。 ここに記載する調査の生化学的測定分析を示す。 ここに記載する調査の生化学的測定分析を示す。 ここに記載する調査の生化学的測定分析を示す。 ここに記載する調査の生化学的測定分析の大要を示す。 ここに記載するDNAマイクロアレイ分析のデータを示す。 ここに記載するマイクロアレイ分析の解析ストラテジーを示す。 ここに記載するマイクロアレイ分析の機能的解析を示す。 ここに記載する分析で観察された脂質代謝関連遺伝子を示す。 ここに記載する分析で観察された炎症および免疫関連遺伝子を示す。 ここで実行する機能的解析の大要を示す。 インスリンシグナル伝達経路に対するMSEダイエットの効果を示す。 インスリン受容体ベータサブユニットに対するMSEの効果を示す。 インスリン受容体基質2に対するMSEの効果を示す。 プロテインキナーゼB（Akt）に対するMSEの効果を示す。 肝臓のシグナル伝達および関連する表現型に対するMSEの効果の大要を示す。 KK-Ayマウスの肝臓代謝に対するMSE摂取の効果の予想作用機序を示す。 ここに記載する調査の実験的設計を示す。 ここに記載する調査の実験結果を示す。 ここに記載する調査の実験結果を示す。 ここに記載する調査の実験結果を示す。 ここに記載する調査の実験結果を示す。 ここに記載する調査の実験結果を示す。 今後の研究の実験的設計を示す。
好適実施形態の詳細な説明
メープルシロップ生成物（ミディアムグレード）は、多少茶色がかった色で、the Federation of Maple Syrup Producers of Quebec（ケベック州のメープルシロップ生産者連盟）（Quebec、カナダ）によって提供される。それは、33％水、61.0％スクロース（ショ糖）、0.5％グルコース（ブドウ糖）、0.3％フルクトース（果糖）、1.8％糖（サッカリド）（オリゴ糖および多糖類）、0.40％のタンパク質誘導化合物、0.25％ミネラル、0.15％有機酸、0.10％ビタミン、0.02％フェノール化合物、0.002％アミノ酸、および0.0001％植物ホルモンからなる。
三週齢の雄性ウィスター（Wistar）ラットは、平均で約51gの重さがあり、Charles River Japan（チャールス・リバー・ジャパン）（神奈川、日本）から購入する。それらを、検疫し、そしてAIN93Gダイエット（食餌）〔Research Diets（リサーチダイエット）、New Brunswick（ニューブランズウィック）、ニュージャージー州、米国〕の投与により以下の条件：温度、24 ± 1℃；相対湿度48±4％；および人工照明、12時間/日（8:00-20:00）で4日間コンディショニングする 。
ラットを、この順化期間中、ダイエットおよび飲料水を自由に摂取させた。フィーディング（給餌）試験のため、それぞれ、メープルシロップおよび糖ミックスシロップのグループのために、それらを二分し（n=7および8）、そしてその後、20％メープルシロップ含有のAIN93Gダイエットを、または同様の糖組成の20％糖ミックスシロップを11日間与える（図1）。メープルシロップまたは糖混合シロップの量を、各ダイエットにおいて添加されたショ糖およびβコーンデンプンの量を考慮することによりアレンジする。その後、双方のダイエット群において、ラットを、解剖のために麻酔作用により犠牲にする前に16時間絶食させる。直後に、Nagahama Life Science Laboratory（長浜ライフサイエンス研究所）（滋賀県、日本）による次の生化学的研究のために、血液試料を各ラットの頸動脈から採取する。
なんらの有意なダイエット差も、合計食物摂取または経時的体重増加のいずれでも観察されない（図2）。ラットがメープルシロップだけでなく、なんら感覚上拒否せずにシミュレートされた糖ミックスシロップを好んだことは注目すべきである。メープルシロップ含有のダイエット（食餌）を与えられたラットの血清生化学的パラメーターは、コントロールを与えたものと比較したとき、血清グルコース、総コレステロールおよびトリグリセリドのレベルにおいて有意な差を示さなかった。これらの代謝パラメーターは互いに類似するが、アスパルタート（アスパラギン酸）アミノトランスフェラーゼ（AST）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）およびラクタート（乳酸）デヒドロゲナーゼ（LDH）の血清レベルにおいて重要な違いが肝障害マーカーとして存在する（図3）。特に、ASTおよびLDHにおいて有意な減少がある（P<0.05）（表1）。
全体のRNAサンプルは肝臓から調製され、そして6つの無作為化されたサンプルはGeneChip Rat Genome（ジーンチップ・ラットゲノム）230 2.0アレイ〔Affymetrix（アフィメトリックス社）、Santa Clara（サンタ・クララ）、CA（カリフォルニア州）、USA（アメリカ合衆国）〕を用いて、マイクロアレイ分析に供する。得られたマイクロアレイデータ（CELファイル）は、統計的言語Rand Bioconductor（ランド・バイオコンダクター）を使用して分布によらない加重法（distribution free weighted method）（DFW）により定量する。
すべてのマイクロアレイデータを、the National Center for Biotechnology Information（国立バイオテクノロジー情報センター）（NCBI）Gene Expression Omnibus（遺伝子発現情報データベース（GEOシリーズID GSE30532）に提出する。遺伝子発現に対するメープルシロップの具体的な効果を決定するために、二群間で異なって発現された遺伝子（DEGS）を、ランクプロダクツ（RP）メソッドを、DFW定量化データに適用することにより識別する。
偽発見率（FDR）有意性<0.05を用い、246のアップレギュレーション（上方制御）および236のダウンレギュレーション（下方制御）された遺伝子を選ぶ。DEGsにおいて大きな比率を占めるGene Ontology（ジーンオントロジー）（GO）タームを識別するために、アノテーション（注釈付け）、ビジュアリゼーション（視覚化）、およびインテグレーテッド・ディスカバリー（統合発見）（DAVID）およびQuickGO（クイックGO）のためにデータベースにおいて機能的なアノテーションツールを用いる。Benjamini（ベンジャミニ）およびHochberg（ホッホバーグ）のFDR修正された0.05より低いP値を有するGOタームは、有意に富んでいるとみなされる。メープルシロップの摂取によりアップ-またはダウン-レギュレーションされる遺伝子について、そのようなGOタームを表2および図5および6に要約する。
アップレギュレートGOタームは、抗原プロセシング‐提示（プレゼンテーション）、カルボン酸（アミノ酸を含む）の代謝、酸化還元、ホルモン代謝、および外部刺激に対する反応（表2A）、ならびに転写、グルタミンファミリーアミノ酸代謝プロセス、有機物質に対する反応、薬物に対する反応の負の調節を含み、それに対し、ダウンレギュレートGOタームには、アミンの異化、細胞アミノ酸代謝、アスパツタート（アスパラギン酸）ファミリー酸代謝プロセス、抗原プロセシング‐提示および化学的刺激に対する反応が含まれる（表2B）。
細胞アミノ酸代謝プロセスのための遺伝子は、ダウンレギュレーションされ、セリン/トレオニンデヒドラターゼおよびヒスチジンアンモニアリアーゼのようなアンモニアを形成する酵素のためのものが含まれることに注目される（図6-7）。概して、体内での遊離アンモニアの過剰形成は、肝臓に有害であり、AST、ALTおよびLDHの増加した値がもたらされる。
若干のケースで、20％カゼインダイエットの投与が、セリン/トレオニンデヒドラターゼを活性化することが報告されている。トレオニンは、代謝し難いアミノ酸として知られており、そしてそれは、カゼインと一緒に摂取されたとき、より一層良好に代謝されえ、2-オキソ酪酸およびアンモニアの産生のためトレオニンデヒドラターゼ活性の誘導が導かれる。AIN93Gダイエットにおいて、カゼインの高含量（20％）は、おそらく、アンモニアを遊離するセリン/トレオニンデヒドラターゼの活性を高めることがある（図6-7 ）。
この酵素のための遺伝子がメープルシロップの投与によってダウンレギュレートされたとき、強化が相殺される可能性がある。他方、ASTのために遺伝子のmRNAレベルがダウンレギュレートされる。これはまた、血清ASTのダウンレギュレーションに関連すべきである。本文書は、摂取したメープルシロップの体の保護効果の一部を説明する最初のものである。
実施形態では、カナディアンメープルシロップ（MS）から、およびメープルツリー〔例は、レッド（アメリカハナノキ）、シルバー（ウラジロサトウカエデ）、またはシュガーメープル〕からのフェノール抽出物および化合物を開示する。化合物および抽出物は、それらの肝保護特性のために使用することができる。
他の実施形態では、クロマトグラフィー法を用いてカナディアンメープルシロップ（MS）のブタノール抽出物から分離（単離）した、二十三のフェノール化合物を開示する。これらの化合物は、それらの核磁気共鳴および質量スペクトルデータから七つのリグナンとして識別される。
リオニレシノール（1）、セコイソラリシレシノール（2）、デヒドロコニフェリルアルコール（3）、5’-メトキシ-デヒドロコニフェリルアルコール（4）、エリスロ-グアイアシルグリセロール-β-O-4’-コニフェリルアルコール（5）、エリスロ-グアイアシルグリセロール-β-O-4’-ジヒドロコニフェリルアルコール（6）、および[3-[4-[(6-デオキシ-α-L-マンノピラノシル)オキシ]-3-メトキシフェニル]メチル]-5-(3,4-ジメトキシフェニル)ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-(ヒドロキシメチル)-2(3H)-フラノン（7）；
二つのクマリン：スコポレチン（8）およびフラキセチン（9）；
スチルベン：(E)-3,3’-ジメトキシ-4,4’-ジヒドロキシスチルベン（10）、および
十三のフェノール誘導体：2-ヒドロキシ-3’,4’-ジヒドロキシアセトフェノン（11）、1-(2,3,4-トリヒドロキシ-5-メチルフェニル)-エタノン（12）、2,4,5-トリヒドロキシアセトフェノン（13）、カテクアルデヒド（catechaldehyde）（14）、バニリン（15）、シリングアルデヒド（16）、没食子酸（17）、トリメチル没食子酸メチルエステル（18）、シリング酸（19）、シリンゲニン（20）、(E)-コニフェロール（21）、C-フェラトロイルグリコール（veratroylglycol）（22）、およびカテコール（23）。
MS抽出物、純粋な化合物、ビタミンC（IC50=58μM）、および合成の商業上の酸化防止剤、ブチル化ヒドロキシトルエン（IC50=2651μM）の抗酸化活性を、ジフェニルピクリルヒドラジル（DPPH）ラジカル捕捉アッセイにおいて評価する。分離物の中で、フェノール誘導体およびクマリンは、リグナンおよびスチルベン（IC50>100μM）と比較して優れた抗酸化活性（IC50<100μM）を示した。
概略的な実験手順
1Hおよび13C核磁気共鳴（NMR）スペクトルは、Bruker（ブルカー）TMの400MHzまたはVarian（バリアン）TMの500 MHzの装置のいずれかで、重水素化メタノール（CD3OD）を溶媒として使用して得られる。エレクトロスプレーイオン化質量スペクトル（ESIMS）データは、Turbo Ionspray（ターボ・イオンスプレー）供給源を備えたQ- Star Elite（スター・エリート）〔Applied Biosystems MDS（アプライド・バイオシステムズMDS）〕質量分析計で取得され、そして純粋な化合物の直接注入により得られる。分析用の高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、L2130ポンプ、L-2200オートサンプラー、およびL-2455 Diode Array Detector（ダイオード・アレイ・デテクター）からなり、それらのすべてはEZChrom（EZクロム）TMElite（エリート）ソフトウェアによって操作されるHitachi Elite LaChrom（ヒタチ・エリート・ラクロム）TMシステム上で実行する。セミ調製用スケールのHPLCを、Beckman System Gold（ベックマン・システム・ゴールド）TM126溶剤モジュールポンプ、168フォトダイオードアレイ（PDA）-UV/VIS検出器、および508オートサンプラーからなり、それらのすべてが32 Karat（カラット）8.0ソフトウェアにより操作されるBeckman-Coulter HPLC（ベックマン・クールターHPLC）システム上で実行する。すべての溶媒は、ACSまたはHPLCグレードのどちらかであり、およびWilkem Scientific（ウィルケム・サイエンティック）〔Pawcatuck（ポーカタック）、RI（ロードアイランド州）〕から入手される。アスコルビン酸（ビタミンC）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、およびジフェニルピクリルヒドラジル（DPPH）試薬は、Sigma-Aldrich（シグマ・アルドリッチ社）〔St Louis（セントルイス）、MO（ミズーリ州）〕から購入する。
メープルシロップ（MS）ブタノール抽出
メープルシロップ（グレードC、20L）は、the Federation of Maple Syrup Producers of Quebec（ザ・フェデレーション・オブ・メープル・シロップ・プロデューサーズ・オブ・ケベック）（カナダ国）によって提供される。シロップは、それを、酢酸エチル（10L×3）、次いでn-ブタノール（10L×3）溶剤で、液‐液パーティショニング（液‐液分配）に供されるときに抽出するまで凍結保存され、酢酸エチル（4.7g）およびブタノール（108g）抽出物を、それぞれ、真空中で溶媒を除去した後に産生する。
分析用HPLC
すべての分析はLuna（ルナ）C18カラム〔250×4.6mm内径、5μM；Phenomenex（フェノメネクス）〕上で0.75mL/分の流速および20 μLの注入量で行う。溶媒A （0.1％トリフルオロ酢酸水溶液）および溶媒B（メタノール、MeOH）からなるグラジエント溶媒系を、以下のように用いる。すなわち、0-10分、10％乃至15％B；10-20分、15％B；20-40分、15％乃至30％B；40-55分、30％乃至35％B；55-65分、35％B；65-85分、35％乃至60％B；85-90分、60％乃至100％B；90-93分、100％B；93-94分、100％乃至10％B；94-104分、10％B。図1Aおよび1Bは、それぞれ、ブタノール抽出物および単離されたフェノール類のすべて（一つの溶液/注入に組み合わせる）のHPLC-UVプロファイルを示す。
MSブタノール抽出物からの化合物の分離
ブタノール抽出物（108g）を、メタノール可溶性（57g；暗褐色粉末）およびメタノール不溶性（51g、オフホワイト粉末）のフラクション（分画）を与えるためにメタノール（100mL×3）で抽出する。メタノール可溶性抽出物の分析用HPLC分析は、220、280および360nmでのフェノール性化合物の多数のピーク特徴を明らかにした（方法論の詳細について上記を参照；クロマトグラムについては図1Aを参照）。したがって、このフラクション（画分）を、さらに精製するために、Sephadex（セファデックス）TMLH-20カラム（4.5×64cm）上での繰り返しクロマトグラフィー、MeOH：H2O（3:7v/v乃至7:3v/v乃至100:0v/v）での、および次いでアセトン：H2O（7:3v/v）での勾配システムによる溶出によって選ぶ。分析用HPLCプロファイル、十二の組み合わせたフラクション基づき、Fr.（フラクション）1-12が得られる。Fr.4（1.5g）を、十二のサブフラクション、Fr.4.1-4.12が与えられるように、SephadexTMLH-20カラム（4.5×64cm）上でMeOH：H2O（3:7v/v乃至7:3v/v）の勾配溶媒システムを用いてカラムクロマトグラフィーに供する。これらを個々に、Waters Sunfire Prep（ウォーターズ・サンファイア・プレップ）TMC18カラム（250×10 mm内径、5μm；2mL/分の流れ）を用い、そしてMeOH：H2O勾配システムで溶出するsemi-prep（セミ調製）HPLC分離の系列に供し、化合物1（4.6mg）、3（3.8mg）、5（4.0mg）、6（41.6mg）、7（6.6mg）、11（3.5mg）、15（0.3mg）、16（0.8mg）、18（0.2mg）、20（1.3mg）、22（1.5mg）および23（3.0mg）を産出する。同様に、Fr. 5（0.47g）を、Waters XBridge Prep（ウォーターズ・Xブリッジ・プレップ）C18カラム（250×19mm内径、5μm；3.5mL/分の流れ）およびMeOH：H2O勾配溶媒系を用い、セミ調製HPLCによって精製し、サブフラクションFr.5.1-5.4を与える。これらのサブフラクションを別に、セミ調製HPLCおよび/またはSephadexTMLH-20カラムクロマトグラフィーとMeOH：H2Oの勾配溶媒系との組合せに供し、化合物2（1.9mg）、4（1.9mg）、8（2.0mg）、9（2.3mg）、14（2.5mg）、17（2.4mg）、19（1.8mg）および21（1.3mg）を与える。同様に、Fr.6（0.2g）は、化合物12（1.4mg）および13（1.3mg）を与え、そしてFr.11は化合物10（4.8mg）を産生した。
MS酢酸エチル抽出物からの化合物の分離
メープルシロップ（グレードC、20L）は、the Federation of Maple Syrup Producers of Quebec（カナダ国）によって提供される。シロップ（20L）は、それが酢酸エチル（10L×3）、続いてn-ブタノール（10L×3）溶媒を用いて液−液パーティショニングを施され、酢酸エチル（4.7g）およびブタノール（108mg）の抽出物がそれぞれ、真空中で溶媒を除去した後に産生されるとき、抽出されるまで、冷凍庫（-20℃）に保存される。酢酸エチル抽出物（4.7g）は、XAD-16、シリカゲル、SephadexTMLH-20、およびC-18カラムクロマトグラフィーを用いたクロマトグラフィーによる分離手順の系列に供される。これらのカラムから得られるセミ精製（Semi-purifed）フラクションは、さらに二十の純粋な化合物を得るために調製用HPLCに供される。
化合物の識別
分離した化合物のすべてを、それらの1Hおよび/または13C NMRおよび質量スペクトルデータの検査によって、および利用可能なとき、これらを刊行された文献報告書と比較することにより識別される（表3）。化合物7、12、および13についてのNMRデータをここに提供する。
別の実施形態では、メープルシロップの酢酸エチル抽出物（MS-EtOAc）から得られた三十のフェノール類を開示する。
化学薬品および試薬。すべての溶媒は、ACSまたはHPLCグレードであり、そしてWilkem Scientific（Pawcatuck、RI）を介して、Sigma-Aldrichから得られる。Sephadex LH-20、アスコルビン酸、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、およびジフェニルピクリルヒドラジル（DPPH）試薬は、Sigma-Aldrich（St. Louis、MO）から購入する。
メープルシロップ酢酸エチル（MS-EtOAc酢酸エチル）化合物の抽出および分離。メープルシロップ（グレードC、20L）は、the Federation of Maple Syrup Producers of Quebec（カナダ国）によって提供される。メープルシロップは凍結して出荷され、および配送時に保存されている。メープルシロップは、真空中で溶媒を除去した後に乾燥酢酸エチル抽出物（MS-EtOAc；4.7g）を得るために、酢酸エチル（10L×3）での液‐液パーティショニングに供する。MS-EtOAc（4.5g）を、最初に、MeOH/H2Oの勾配系（3:7乃至1:0、v/v）を伴うセファデックスLH-20カラム（4×65cm）上で精製し、七つの画分A1-A7を与える。画分A1（2.08g）を、次にMeOH/H2Oの勾配系（3:7乃至1:0、v/v）により溶出するC18 MPLCカラム（4×37cm）にてクロマトグラフィーにかけ、十六のサブフラクション、B1- B16を与える。これらのサブフラクションは、個々に、Phenomenex Luna C18カラム（250×10mm内径、5μm、流量=2mL/分）をMeOH/H2Oの異なるアイソクラティック（定組成）溶出システムと共に用いて、セミ調製HPLC分離の系列に供し、化合物25（0.9mg）、26（2.5mg）、27（0.8mg）、28（0.5mg）、29（17.5mg）、730（0.7mg）、31（1.1mg）、32（3.9mg）、33（1.1mg）、34（2.1mg）、35（2.8mg）、36（3.2mg）、38（2.4mg）、39（5.2mg）、40（0.8mg）、および53（0.5mg）を与える。同様に、フラクションA3（0.71g）は、Waters XBridge Prep C18カラム（250×19mm内径、5μm；流量=3.5mL/分）およびMeOH/H2Oの勾配溶媒系を使用したセミプレパラティブ（セミ調製用）HPLCによって精製し、四つのサブフラクションC1-C4を与える。これらのサブフラクションを別々に、セミ調製用HPLCに、MeOH/H2Oのアイソクラティック溶剤システムと共に供し、化合物24（2.2mg）、37（4.5mg）、42（4.5mg）、43（2.2mg）、44（4.2mg）、50（3.7mg）、および51（1.1mg）を与える。同様に、フラクションA4（0.097g）を、セミ調製用HPLCにより精製し、化合物41（1.4mg）、45（2.6mg）、46（8.0mg）、47（0.4mg）、および49（3.2mg）を与え、およびサブフラクションA5（0.022g）は化合物48（3.6mg）および52（1.1mg）をもたらした。
メープルシロップから食物グレード承認抽出物の調製の準備。
本発明の別の実施形態によれば、メープルツリーからの食物グレード抽出物が開示され、メープルツリーの一部分ならびにシロップ（例は、メープルシロップ‐XAD抽出物）が含まれる。抽出物の生成は、非食物グレードの溶媒および方法の利用を要求し、将来の栄養補助上（nutraceutical）の適用のためのメープルシロップの「食物グレード承認」フェノール類リッチ（フェノール化合物に富む）抽出物が調製される。この目的のため、メープルシロップのメタノール抽出物（MS-MeOH）は、たとえば、ポリマー樹脂のようなもので、FDA食物グレードの樹脂を用いて調製することができ、それには、制限されないが、スチレンおよびジビニルベンゼン樹脂、およびスチレン‐ジビニルベンゼン（SDVB）架橋共重合体樹脂が含まれる。そのような樹脂の例は、制限されないが、Amberlite（アンバーライト）TMXAD-4（ジビニルベンゼン共重合体）、XAD-2（ポリスチレン共重合体樹脂）、XAD-7（脂肪族エステル）、XAD7HP（脂肪族エステル）、XAD16（ポリスチレン‐ジビニルベンゼン）、XAD16HP（ポリスチレン‐ジビニルベンゼン）、XAD761（架橋フェノール‐ホルムアルデヒド重縮合物）、XAD1180（ポリジビニルベンゼン）、XAD1600（ポリスチレン‐ジビニルベンゼン）、FPx-66（マクロ網状芳香族ポリマー）、XFS-4257、XFS-4022（官能化されていないポリスチレンビーズ）、XUS-40323およびXUS-40322を含む。AmberliteTM強アニオン交換（SAX）樹脂、AmberliteTM WAX樹脂、ペンタフルオロフェニル誘導体化シリカゲル、HLB（疎水性‐親脂性バランスのとれた）タイプのSILIaPrepX相、シリカまたは混合モードの強アニオン交換（SAX）-C18上の強アニオン交換（SAX）樹脂、水性C18相、C18相、C18タイプのSILIaPrepXTM相、珪藻土。本発明の一実施形態によれば、ポリメリック（polymeric）は、AmberliteTM XAD-16（Sigma）であってよく、そして吸着クロマトグラフィーは、XAD-16樹脂カラム上にメープルシロップを吸着させることにより行われ、自然糖を除去するために多量の水で溶出させ、次に最終的には真空中で溶媒を除去した後にメープルシロップメタノール抽出物（MS-MeOH）を生じさせるためにMeOHで溶出する。溶出はまた、エタノールが含まれる他の溶媒を用いてもたらすことができる。
1．1kgのAmberliteTM XAD-16（Sigma）は、一晩浸し、そして大きなガラスカラムに充填した。
2．大量の水でXAD-16カラムを溶出した。
3．予め、メープルシロップの溶液が粘着性になりすぎないように水で希釈したものの一定量を吸着させる〔ca.（約）500mL；決定されるべきであり；（それが過剰に負荷されないことを確認する）〕。
4．約1時間の間、XAD-16カラム上にメープルシロップカラムを置く。
5．糖を除去するために大量の水でカラムを溶出する（溶出液を色についてチェックする）。
6．フェノール類を除去するためにメタノールで溶出する。
7．真空中でのロータリーエバポレーターの使用によりメタノール画分を乾燥させ、水浴の温度は37℃からに設定すべきであり、そして40℃を超えるべきではない。
8．乾燥した試料はメープルシロップXAD抽出物であり、またMSXとしても知られる。
9．十分な量を準備するためにこれらのステップを繰り返す。
別の実施形態によれば、また、メープルシロップからのポリフェノール性化合物の抽出のためのプロセスを開する。そのプロセスは、吸着剤物質の上に吸着されたメープルシロップポリフェノール画分を有する吸着剤物質を、前記メープルシロップポリフェノール画分を溶出し、そして収集するのに十分な時間の間および十分な回数の間、有機溶媒と接触させることを含む。
一実施形態によれば、十分な時間は約30分であることができる。十分な回数は約1回から約3回までである。
別の実施形態によれば、メープルシロップ混合物は、吸着剤物質上に、ポリフェノール画分を吸着するのに十分な時間の間、吸着剤物質上に吸着され、そしてその混合物は水において希釈したメープルシロップを含む。
前記ポリフェノール画分を吸着させるのに十分な時間は、約12から約20時間まで、または約12から約19時間まで、または約12から約18時間まで、または約12から約17時間まで、または約12から約16時間まで、または約12から約15時間まで、または約12から約14時間まで、または約12から約13時間までである。前記ポリフェノール画分を吸着させるのに十分な時間は、12、13、14、15、16、17、18、19、20時間でよい。好ましくは、その時間は16時間である。
吸収性（absorbent）物質の例には、制限されないが、AmberliteTM XAD-4（ジビニルベンゼン共重合体）、XAD-2（ポリスチレン共重合体樹脂）、XAD-7（脂肪族エステル）、XAD 7HP（脂肪族エステル）、XAD16（ポリスチレン-ジビニルベンゼン）、XAD16HP（ポリスチレン-ジビニルベンゼン）、XAD761（架橋フェノール-ホルムアルデヒド重縮合物）、XAD1180（ポリジビニルベンゼン）、XAD1600（ポリスチレン-ジビニルベンゼン）、FPx-66（マクロ網状芳香族ポリマー）、XFS-4257、XFS-4022（官能化されていないポリスチレンビーズ）、XUS-40323およびXUS-40322が含まれる。AmberliteTM強アニオン交換（SAX）樹脂、AmberliteTM WAX樹脂、ペンタフルオロフェニル誘導体化シリカゲル、HLB（疎水性‐親脂性バランスのとれた）タイプのSILIaPrepX相、シリカまたは混合モードの強アニオン交換（SAX）-C18上の強アニオン交換（SAX）樹脂、水性C18相、C18相、C18タイプのSILIaPrepXTM相、珪藻土。
別の実施形態によれば、プロセスはさらに、前記吸着剤（adsorbent）物質上の吸着の前に先立ち水においてメープルシロップを希釈するステップを含んでもよい。
別の実施形態によれば、プロセスはさらに、ステップa）の前に、水で吸着剤物質を洗浄するステップを含んでもよい。
別の実施形態によれば、プロセスはさらに、ステップb）を含むことができ、すなわち、収集されたポリフェノール画分を加熱することであり、それで有機溶媒が蒸発し、そして乾燥されたポリフェノール画分が得られる。加熱は約37℃から約40℃までの温度でよい。
別の実施形態によれば、本発明のプロセスに適した有機溶媒は、メタノール、酢酸エチル、ブタノール、エタノール、メチルターシャリーブチルエーテル、およびそれらの組合せから選ぶことができる。
さらに別の実施形態によれば、本発明のプロセスはさらに、ステップa）の前に、前記メープルシロップからの糖の抽出のために固体の混合物による抽出を含むことができる。たとえば、固体の混合物によるそのような抽出には、MgSO4、NaCl、および固形吸収性物質による抽出を含む。好適には、この抽出のために固形吸収剤は、アミノ化されたシリカ樹脂、C18シリカ樹脂、またはそれらの組合せから選ぶことができる。
さらに別の実施形態によれば、本発明のプロセスはさらに、ステップa）の前に、メープルシロップの液‐液抽出が含まれうる。たとえば、液‐液抽出は、酢酸エチル抽出、ブタノール抽出、またはそれらの組合せ、次いで約85％の二酸化ケイ素（SiO2）および約15％の酸化マグネシウム（MgO）の比を有するSiO2/ MgO固形相〔Florisil（フロリジル）(R)（商標）〕上への吸着を含むことができる。
さらに別の実施形態によれば、本発明のプロセスから得られる抽出物を開示する。
糖を伴わないメープルシロップブタノール抽出物の調製（糖を伴わないMS-BuOH）
本発明の別の実施形態によれば、糖を有さないMSブタノール抽出物が開示される。
1．メープルシロップの既知の容量（あなたがたの分液漏斗のサイズに基づいて）を、n-ブタノールで液‐液パーティショニング（1:1 v/v、3回）に供する。メープルシロップはパーティショニングする前に水で希釈するが、その理由はそれが粘着性でありすぎるからである。（通常ならば、本発明者らは1Lのメープルシロップにおよそ300mlの水を加える）。
2．ブタノール分画および乾燥を真空下で前に説明したように組み合わせる。
3．乾燥したブタノール画分は、まだ非常に粘着性であり、それで本発明者は通常なら、それが一貫性のある粉末状を有することを保証するために凍結乾燥または真空乾燥を行う。
4．乾燥ブタノール抽出物粉末をメタノール中で再構成させ、そして白色の固体、すなわち、糖を除去するためにろ過した。液体部分は、前述のように真空で乾燥された一部分である。
5．液体部分から溶媒を除去した後、再び糖を除去するために、一定のメタノールを加える。ろ過および乾燥を繰り返す。
6．最終的な乾燥抽出物は、糖なしのMS-BuOH抽出物である。
7．十分な量を調製するためいステップを繰り返す。
糖を伴うメープルシロップブタノール抽出物の調製（糖を伴うMS-BuOH）
本発明の別の実施形態によれば、糖なしMSブタノール抽出物が開示される。
上記のステップ1-3に従う。この場合、糖はメタノールで除去されない。
Folin-Ciocalteau（ホリン‐シオカルトー）法による総フェノール含量の測定
メープルシロップ抽出物の合計フェノール含量は、Folin-Ciocalteu（ホリン‐チオカルトー）法に従って決定され、そして没食子酸当量（GAEs）として測定される。簡潔には、抽出物をメタノール/H2O（1:1、v/v）で1:100に希釈し、そして各試料の200μLを、メタノール/H2O（1:1、v/v）の3mLおよびFolin-Ciocalteau試薬の200μLと、25℃で10分間インキュベートした。この後、20％Na2CO3溶液の600μLを各チューブに加え、ボルテックス（渦撹拌）した。チューブをさらに、40℃で20分間インキュベーションし、そして後、インキュベーション；試料を直ちに氷浴中で室温まで冷却した。試料および標準（没食子酸）を同じく処理した。吸光度を755nmで測定し、そして最終結果を、Spectramax（スペクトラマックス）プレートリーダーから得られた標準曲線から算出した。
溶媒除去の方法
若干の実施形態に従い、本（presnt）発明の抽出物からの溶媒除去は、減圧下で行うことができる。しかし、他の既知の技術は、たとえば、アトマイゼーション（噴霧）、凍結乾燥、蒸発、結晶化（cristallization）、脱水（dehydratation）、沈殿、遠心分離、または本発明の抽出物のいずれかから水相を排除するために任意の他の適切なプロセスのようなものを採用することができる。
本発明は、以下の例を参照することによって、より一層た容易に理解されるであろうが、それらの例は、本発明の範囲を制限するためよりはむしろ、それを例証するために与えられる。
例1
ニュートリプロテクティブダイエットのメタボリックシンドローム予防効果の評価
本例の目的は、ニュートリプロテクティブダイエットのメタボリックシンドローム改善効果を評価することである。
材料および方法
メープルシロップ抽出物を用い、それはメープルシロップのアンバーグレード（amber grade）からn-ブタノールを用いた処理によって調製され、それは、極めて低い糖の生成物を調製するために有用でありうる。50gのブタノール抽出物、20mgのブタノール抽出物基準（extract basis）の合計量は、20gダイエット/キャピタ（capita）/日にて飼育した8匹のラットを用いた60日間フィーディング（給餌）トライアル（試験）の5回の反復のために必要である。
フィーディング（給餌）
雄性ラット〔Wistar（ウィスター系）〕を、メープルシロップの0.1％のブタノールの抽出物（n=8）でのAIN93Gベースの高脂肪ダイエットで、または同じダイエットで抽出物を伴わないもの（n=8）での2ヶ月について飼育される。フィーディングの間、毎日の体重増加およびダイエット摂取量を日毎に測定する。
ディセクション（切開）
フィーディング後の各ラットは、全身血、小腸上皮、肝臓および脂肪組織をサンプリングするために切開を施す。
血液化学分析
全身血の質を20-50項目について分析する。
ゲノミクス（ゲノム研究）
トランスクリプトミクス（転写学）は、アフィメトリクス遺伝子チップを用いるDNAマイクロアレイ分析によって各器官または組織からの全RNA試料について行う。
結果
高脂肪〔または高カロリー（colorie ）〕ダイエットに対するサプリメントとしてメープルシロップのブタノール抽出物の使用は、脂質および/または糖代謝経路を調節することによって、メタボリックシンドロームの危険性を低減する。
例2
糖尿病（DIABATES）モデルKK-AYマウスにおける肝遺伝子発現プロファイルのグローバル分析（網羅的解析）
ここで図8を参照し、この研究の目的は、T2DMモデルマウス‐KK-Ayマウス（糖尿病マウス）の肝臓に及ぼすメープルシロップのブタノール抽出物（上述のように、 MSE）の効果を明らかにすることである。雄性KK-Ayマウスで、4週齢の、肥満、高血糖およびインスリン抵抗性の研究のためのT2DMモデルマウスとしてのものは、図8に示すように、選択され、および二つの実験群に分離される。すなわち、16匹の雄性の、コントロール群（n=8）で、AIN-93Gダイエットを与えたもの、および実験群（N=8）で、MSE（AIN-93Gダイエット+0.1％MSE ）を与えたものである。動物は、7日間同じ普通のダイエットをプレ供給（prefed）され、その後43日間、実験ダイエットを供給した。それらは、16時間絶食させ、そして肝臓および血清試料を収集する。
ここで図9乃至11を参照する。血清グルコース、インスリンおよびグリコアルブミン（glycoalbumin）レベルの測定は、MSE摂取には、高血糖を改善する傾向があることを示す（図9）。また、図10に示すように、MSEの摂取には、肝臓での脂質b -酸化を大幅に活性化させ、総ケトン体の濃度の増加がもたらされる。さらに、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の活性を測定することによって示されるように（図11）、MSE摂取は、有意に（それぞれ、p<0.01およびp<0.05）、肝障害を緩和する。
図12にまとめるように、KK-AyマウスへのMSEの給餌は、改良された高血糖、ベータ酸化の活性化、および肝障害の軽減をもたらす。
次に、肝臓トランスクリプトーム解析は、Affymetrix Genechip（アフィメトリックス・ジーンチップ）〔Mouse Genome（マウスゲノム）430 2.0〕を用いて行う。マイクロアレイが実行され、そして結果が分布によらない加重法（DFW）により正規化される。二つの実験群は互いとは別にクラスター化し（図13）、両群間に遺伝子発現の顕著な違いがあることが示される。さらに、そこにはMSE群において736の大幅にアップレギュレーション（上方制御）される遺伝子および1078の大幅にダウンレギュレーション（下方制御）される遺伝子がある（FDR<0.05）。
有意に異なって発現される遺伝子は、その後、遺伝子アノテーションエンリッチメント分析（gene annotation enrichment analysis）によって分析され、およびインスリンシグナル伝達は、このシグナル伝達経路の遺伝子の統計的有意性を検証すること、ならびに免疫ブロッティングによって集束される。
遺伝子アノテーションエンリッチメント分析に関して、図15乃至18に示すように、それらの結果は、有意な変化を、脂質代謝、炎症および免疫、材料輸送、アミノ酸代謝、酸化還元、ならびに上皮細胞の発達、化学的恒常性、および細胞酸化還元ホメオスタシスにおいて示す。脂質代謝関連遺伝子に関して、MSE摂取は、肝臓における脂質蓄積をダウンレギュレーションすると考えられる（図16）。炎症および免疫関連遺伝子に関して、MSEは、肝臓における炎症の発症を抑制すると考えられる（図17）。図18にまとめるように、肝臓での脂質蓄積の抑制は、血清中の総ケトン体の増加と一致し、その一方で、炎症の抑制は、減少と一致し、血清ASTおよびALTである。
次に、図19乃至24に示すように、インスリンシグナル伝達経路を分析する（図19）。インスリン受容体およびホスホ‐インスリン受容体（IR）のベータサブユニットの免疫ブロッティングは、各群において、インスリン受容体ベータサブユニットのリン酸化における増加を明らかにする（図20）。インスリン受容体基質2（IRS2）の免疫ブロッティングは、MSE処置動物におけるIRS2のタンパク質発現での増加を明らかにする。プロテインキナーゼB（Akt）タンパク質およびリンタンパク質の免疫ブロッティングは、MSE処置群における増加リン酸化されたAtkを明らかにした（図22）。図23に示すように、KK-AyマウスによるMSE摂取は、KK-Ayマウス肝臓のインスリンシグナル伝達機能の全体的な改善を導く。この結果は、高血糖症の抑制のためにグリコシル化血しょうアルブミンの観察されたダウンレギュレーションと一致する。図24に示すように、KK-Ayマウスの肝臓でのMSEの影響の示唆されたメカニズムは、減少脂質蓄積、改善されたインスリン感受性、増加したβ酸化（- oxidationm）および減少した炎症によるものである。
例3
メープルシロップ抽出物補充高脂肪ダイエットのメタボリックシンドローム予防効果の評価
ここで図25乃至31を参照し、この調査の目的は、高脂肪ダイエットで、メープルシロップエキス（MSX）での補充を伴うもの、または伴うものを与えたマウスを使用して、メープルシロップの肝臓保護効果を明らかにすることである。MSX抽出物は、食物グレードの承認された樹脂XAD-16の使用により、上記のように準備し、メープルシロップからの食物グレード承認抽出物を調製する。MSX抽出物はメープルシロップの50Lから調製される。実験群を以下の表6に定義する。
図25に示すように、3週齢のC57/BL/6J雄性マウス（各群においてN=4）に、7日間の間低ファットダイエットを与え、そして次いで各群を4週間（28日間）の間、それらのそれぞれの実験ダイエットに切り替える。肝臓および血液試料を、4週間の期間の終了時に収集する。図26における結果は、体重増加およびエネルギー摂取が、すべての4つの実験群間で同じであることを示す。
しかしながら、図27に示すように、血しょうコリンエステラーゼのレベルは、MSXで処置した動物において有意に減少する。図28に示すように、血しょうAST、ALTおよびLDHのレベルは、すべて、MSX処置群において用量依存的な様式で低下し、MSXが肝臓保護効果を有し、そして肝臓保護因子がMSXにおいて存在することが示唆される。
図29に示すように、総血しょうタンパク質レベル、アルブミンレベルは各群間でほぼ不変であり、そして血中尿素窒素レベルは0.12％MSX群においてわずかにより一層高いと考えられる。図30に示すように、総血しょうカリウム、カルシウムレベル、総ビリルビンおよびアルカリホスファターゼレベルは、0.12％MSX群での低ファットダイエットのレベルが好まれる傾向（trend toward）に見える。また、総ビリルビンレベルは、各MSX処理群について低脂肪ダイエットのレベルに向かって下降傾向にあると考えられる。結論として、そこには、これらの結果は、コリンエステラーゼレベルがMSTダイエット群において有意に減少し、そしてAST、ALTおよびLDHレベルがMSXダイエット群において用量依存的な様式で減少することを示す。これらの結果は、MSXが肝臓保護効果を有することを示す。これらの結果を確認するために、新たな実験を遂行し、そこでは、各n=14匹の動物の実験群を、低ファットダイエット、高ファットダイエット、または0.6％MSXを補充した高ファットダイエットにより合計で8週間処置する。
例4
メープルシロップからの食物グレード承認抽出物の調製の準備
二つのタイプの樹脂1）FPX 66および2）XAD-16を用い、糖部分を伴わないメープルシロップから生物活性化合物を抽出するための方法論を説明する。これらの二つの樹脂の双方はジビニルベンゼン相である。これらの相上でのポリフェノール類の吸着のメカニズムはもっぱら疎水性相互作用による。
方法体系：
1．メープルシロップの5L（6kg）部分の脱イオン水2,1Lによる希釈。
2．16時間、ウェット（湿式）AmberliteTM FPX66またはXAD-16（5,0-6,7kg乾燥質量）の16,8kg上へのメープルシロップ混合物の吸着。
3．脱イオン水（7×15L）でのカラムの洗浄。
4．変性エタノール（3×15L）での溶出。各溶出の前に、30分間、エタノールを樹脂と接触させる。
5．「ロータリーエバポレーター」でのエタノールの蒸発。水浴の温度を37℃から設定し、そして40℃を超えさせない。
6．MSX画分の分離（15,3g）。
7．脱イオン水の10Lの2つの部分を用いる樹脂のリコンディショニング（再生）。
好適な実施形態を上記に説明し、そして添付の図面に例を挙げたが、この技術における熟練者にとって、なんらかの修飾をこの開示から離れることなく行いうることは明らかであろう。そのような修飾はあり得る変形と考えられ、本開示の範囲に含まれる。

Claims (49)

  1. 糖料植物シロップ、糖料植物シロップ抽出物、糖料植物抽出物、植物抽出の廃棄物、またはそれらの組合せのニュートリプロテクティブ量を含む、ニュートリプロテクティブダイエット。
  2. 糖料植物シロップの前記ニュートリプロテクティブ量は、少なくとも1％の糖料植物シロップで最大99％の糖料植物シロップまでである、請求項１に従うダイエット。
  3. 糖料植物シロップの前記ニュートリプロテクティブ量は、少なくとも10％の糖料植物シロップで最大70％の糖料植物シロップまでである、請求項２に従うダイエット。
  4. 糖料植物シロップの前記ニュートリプロテクティブ量は20％の糖料植物シロップである、請求項２に従うダイエット。
  5. 糖料植物シロップ抽出物の前記ニュートリプロテクティブ量は約0.0010％から約0.15％までの糖料植物シロップ抽出物である、請求項１に従うダイエット。
  6. 糖料植物シロップ抽出物の前記ニュートリプロテクティブ量は約0.0020％から約0.10％までの糖料植物シロップ抽出物である、請求項１に従うダイエット。
  7. 糖料植物シロップ抽出物の前記ニュートリプロテクティブ量は約0.0027％から約0.1023％までの糖料植物シロップ抽出物である、請求項１に従うダイエット。
  8. 前記糖料植物シロップには、糖料植物シロップ由来生成物が含まれる、請求項１に従うダイエット。
  9. 前記糖料植物シロップ由来生成物には、バター、グラニュー糖、硬化糖、ソフトシュガー（粉末糖）、タフィー、糖料植物シロップろ過残留物、プロダクト生成の廃棄物、またはそれらの組合せが含まれる、請求項８に従うダイエット。
  10. 前記糖料植物抽出物には、逆浸透から生じる濃縮糖料植物水、プレ沸騰ナノろ過から生じる濃縮糖料植物水、パスチャライズ糖料植物水、滅菌糖料植物水、樹液からの抽出物、濃縮樹液、糖料植物シロップ、シロップろ過残留物、サマラ、果実、種子、茎、葉、枝、根、ハートウッド、サップウッド、およびバーク、前記抽出物のいずれか一つの調製物からの廃棄物残さ、またはそれらの組合せが含まれる、請求項１に従うダイエット。
  11. 前記糖料植物は、メープルツリー、カバノキ、サトウキビ、テンサイ、コーン、イネ、ヤシノキ、およびアゲーブからなる群より選ぶことができる、請求項１に従うダイエット。
  12. 前記糖料植物はメープルツリーである、請求項１に従うダイエット。
  13. 前記糖料植物シロップ抽出物は、メタノール抽出物、ブタノール抽出物、糖を伴うブタノール抽出物、糖を伴わないブタノール抽出物、エチルアセタート抽出物、エタノール抽出物、メチルターシャリーブチルエーテル抽出物、樹脂精製されたメープルシロップ抽出物（MSX）、またはそれらの組合せから選ばれる、請求項１に従うダイエット。
  14. 前記糖料植物シロップ抽出物は肝保護効果を有する、請求項１に従うダイエット。
  15. 前記ブタノール抽出物は肝保護効果を有する、請求項１３に従うダイエット。
  16. 請求項１乃至１５のいずれか一項に従うダイエットのニュートリプロテクティブ量を管理することを含む、対象体におけるニュートリプロテクティブ効果を引き出す方法。
  17. 前記ニュートリプロテクティブ効果はニュートリセラピーまたは肝保護効果である、請求項１６に請求する方法。
  18. 前記肝保護効果には、肝臓の細胞アミノ酸代謝におけるダウンレギュレーションが含まれる、請求項１７に請求する方法。
  19. 前記肝保護効果には、アンモニア形成酵素の肝生産におけるダウンレギュレーションが含まれる、請求項１７に請求する方法。
  20. 前記肝保護効果には、アスパルタートアミノトランスフェラーゼ（AST）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）および/またはラクタートデヒドロゲナーゼ（LDH）の対象体しょう液レベルにおけるダウンレギュレーションが含まれる、請求項１７に請求する方法。
  21. 請求項１乃至１５のいずれか一項に従うダイエットのニュートリプロテクティブ量を管理することを含む、障害を有する対象体の処置方法。
  22. 前記障害には、肝障害、炎症性疾患、癌、糖尿病、心血管疾患、神経変性疾患、および記憶障害が含まれる、請求項２１に従う方法。
  23. 前記肝障害には、メタボリックシンドローム、損傷肝機能、ヘパティック酸肝、脂質異常症、肝炎および肝癌が含まれる、請求項２２に従う方法。
  24. 対象体における障害の処置用の薬を調製するための、請求項１乃至１５のいずれか一項に従うニュートリプロテクティブダイエットの使用。
  25. 対象体における障害を処置するための請求項１乃至１５のいずれか一項に従うニュートリプロテクティブダイエットの使用。
  26. 前記障害には、肝障害、炎症性疾患、癌、糖尿病、心血管疾患、神経変性疾患、および記憶障害が含まれる、請求項２４または２５に従う使用。
  27. 前記肝障害には、メタボリックシンドローム、損傷肝機能、ヘパティック酸肝、脂質異常症、肝炎および肝癌が含まれる、請求項２６に従う使用。
  28. 製薬上および栄養補助上の化合物、機能性食物、および自然健康生産物からなる群より選ばれる少なくとも一つのダイエタリーサプリメントの相乗的な取込みおよび/または管理のために、糖料植物シロップ、糖料植物シロップ抽出物、糖料植物抽出物、またはそれらの組合せを含む、ニュートリプロテクティブキャリヤー。
  29. 前記キャリヤーは、飲用液体、エナジードリンク、治療上の飲料、およびタンパク質リッチ飲料から選ばれる、請求項２８のキャリヤー。
  30. 前記キャリヤーは前記ダイエタリーサプリメント上のコーティングである、請求項２８のキャリヤー。
  31. 製薬上および栄養補助上の化合物、機能性食物、および自然健康生産物からなる群より選ばれる少なくとも一つのダイエタリーサプリメントを、請求項２８のキャリヤーと組み合わせて施すことを含み、前記キャリヤーは同時に、または前記サプリメントに先立って施される、受動体における障害を予防または処置する方法。
  32. a）吸着剤物質でその上に吸着したメープルシロップポリフェノールフラクションを有するものと、有機溶媒とを、前記メープルシロップポリフェノールフラクションを溶出させ、そして収集するために、十分な時間の間、および十分な回数にわたり接触させること
    を含む、メープルシロップからポリフェノール化合物を抽出するためのプロセス。
  33. 前記十分な時間は約30分である、請求項３２のプロセス。
  34. 前記十分な回数は約1回乃至約3回である、請求項３２のプロセス。
  35. ステップa）に先立ち、メープルシロップ混合物は、前記吸着剤物質上に、前記ポリフェノールフラクションが前記吸着剤物質上に吸着するのに十分な時間の間、吸着され、前記混合物には、水において希釈されるメープルシロップが含まれる、請求項３２のプロセス。
  36. 前記ポリフェノールフラクションを吸着するのに十分な前記時間は、約12乃至約20時間である、請求項３５のプロセス。
  37. 前記ポリフェノールフラクションを吸着するのに十分な前記時間は、約16時間である、請求項３６のプロセス。
  38. さらに前記吸着剤物質上への吸着に先立って水においてメープルシロップを希釈するステップを含む、請求項３５のプロセス。
  39. さらにステップa）に先立って前記吸着剤物質を水で洗浄するステップを含む、請求項３５のプロセス。
  40. さらにステップb）、すなわち
    b）前記有機溶媒を蒸発させ、および乾燥ポリフェノールフラクションを得るために、前記収集ポリフェノールフラクションを加熱すること
    を含む、請求項３２のプロセス。
  41. 加熱は約37℃乃至約40℃の温度である、請求項40のプロセス。
  42. 前記有機溶媒は、メタノール、エチルアセタート、ブタノール、エタノール、メチルターシャリーブチルエーテル、およびそれらの組合せから選ばれる、請求項３２乃至４１のいずれか一項のプロセス。
  43. 前記吸着剤物質は、AmberliteTM XAD-4、AmberliteTMXAD-2、AmberliteTM XAD-7 、AmberliteTM XAD 7HP、AmberliteTMXAD16、AmberliteTM XAD16HP、AmberliteTM XAD761、AmberliteTMXAD1180、AmberliteTM XAD1600、AmberliteTM XFS-4257、AmberliteTMXFS-4022、AmberliteTM XUS-40323、AmberliteTM XUS-40322、AmberliteTMFPX66、AmberliteTM強アニオン交換（SAX）、AmberliteTM WAX、ペンタフルオロフェニル誘導体化シリカゲル、HLB（疎水性-親脂性バランスの）タイプのSILIaPrepXTM相、シリカ上の強アニオン交換（SAX）樹脂、混合モード強アニオン交換（SAX）-C18、水性C18相、C18相、C18タイプSILIaPrepXTM相、珪藻土から選ばれる、請求項３２乃至４２のいずれか一項のプロセス。
  44. さらにステップa）に先立ち、前記メープルシロップからの糖の抽出のために、固体の混合物での抽出が含まれる、請求項３２のプロセス。
  45. 固体の混合物での前記抽出には、MgSO4、NaCl、および固形吸収剤での抽出が含まれる、請求項４４のプロセス。
  46. 固形吸収剤は、アミノ化シリカ樹脂、C18シリカ樹脂、またはその組合せから選ばれる、請求項４４のプロセス。
  47. さらにステップa）に先立ち、前記メープルシロップの液-液抽出が含まれる、請求項３２のプロセス。
  48. 前記液-液抽出には、エチルアセタート抽出、ブタノール抽出、またはその組合せ、次いで約85％の二酸化ケイ素（SiO2）および約15％の酸化マグネシウム（MgO）の比を有するSiO2/MgO固相上での吸着が含まれる、請求項４７のプロセス。
  49. 請求項３２乃至４８のいずれか一項のプロセスから得られる抽出物。
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