BR112017014295B1

BR112017014295B1 - Composição farmacêutica.

Info

Publication number: BR112017014295B1
Application number: BR112017014295-3A
Authority: BR
Inventors: Claudio Milanese; Alessandra CAPEZZONE DE JOANNON; Serena Tongiani; Luca Donati
Original assignee: Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco A.C.R.A.F. S.P.A
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2023-04-25
Also published as: PT3244889T; JP2018501277A; CY1122979T1; US9962372B2; HUE049877T2; GEP20196962B; CA2970060A1; EA035748B1; EA201791483A1; PL3244889T3; AU2016208200B2; WO2016113194A1; AU2016208200A1; EP3244889B1; ME03736B; SI3244889T1; AR103381A1; MX2017008879A; JP6714597B2; CA2970060C

Abstract

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de benzidamina e um ingrediente ativo antimicótico, a dita combinação tendo um efeito sinergístico no tratamento de micose.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de benzidamina e um ingrediente ativo antimicótico, a dita combinação tendo um efeito sinergístico no tratamento de micose.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Os fungos pertencentes ao gênero Candida são uma das causas as mais comuns de infecções fúngicas em todo o mundo.

[003] Muitas espécies de Candida são comensais inofensivos ou endossimbionistas de seus hospedeiros, tais como por exemplo seres humanos.

[004] Os fungos pertencentes às espécies Candida albicans e Candida tropicalis estão normalmente presentes na mucosa da cavidade oral, trato gastrointestinal e vagina. Porém, quando a flora das mucosas é alterada, por exemplo devido a longo tratamento com antibióticos ou mudanças hormonais, os fungos podem se multiplicar anormalmente e causar infecções superficiais, por exemplo na boca ou na vagina, conhecidas como candidíase. Nas pessoas imunossuprimidas, os fungos podem mesmo causar infecções sistêmicas severas, conhecidas como candidemia, que são às vezes fatais.

[005] A vulvovaginite causada por fungos representa hoje cerca de 30-35% das infecções vaginais e é principalmente causada por fungos de Candida albicans.

[006] A vulvovaginite é acompanhada por mudanças do pH vaginal e os principais sintomas são intensa comichão vaginal e/ou vulvar, corrimentos, inflamação e dor.

[007] Tipicamente, o tratamento se dá por administração de drogas antimicóticas tópicas na forma de cremes, óvulos vaginais e soluções para uso externo.

[008] No case de infecções severas e/ou recorrentes, as drogas antimicóticas são administradas oralmente.

[009] Pevaryl™ é um creme comercialmente disponível para o tratamento de micose vulvovaginal, contendo 1% p/p de nitrato de econazol.

[0010] Econazol é um derivado de imidazol, dotado de uma atividade antimicótica de amplo espectro e comumente usado para o tratamento de micose por Candida albicans.

[0011] Diversos pedidos de patente descrevem combinações de ingredientes ativos úteis no tratamento de oral e vulvovaginal.

[0012] WO 96/26724 descreve uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade anti-inflamatória de benzidamina ou um sal da mesma, uma quantidade antimicrobianamente eficaz de um agente antimicrobiano e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0013] US 2009/0208558 se refere ao uso de um agente antimicótico e um inibidor de adesão de célula epitelial ou célula endotelial para produzir uma droga combinada para o tratamento tópico de micose por Candida.

[0014] A maioria das combinações de drogas mostra um efeito aditivo. Em alguns casos, porém, as combinações mostram menos ou mais do que um efeito aditivo. Estas combinações são chamadas antagonistas ou sinergísticas, respectivamente. Efeitos antagonistas ou sinergísticos são imprevisíveis, e são descobertas experimentais inesperadas. Encontrar combinações altamente eficazes, i.e., misturas sinergísticas, de agentes ativos é, todavia, desafiador. O acaso não é uma rota válida pois o número de combinações potenciais de agentes é surpreendentemente grande. A outra estratégia de descoberta normal de deduzir combinações potenciais a partir do conhecimento do mecanismo é também limitada em seu potencial porque muitos pontos finais biológicos de organismos vivos são afetados por múltiplos trajetos. Estes trajetos frequentemente não são conhecidos, e mesmo quando eles o são, os modos pelos quais os trajetos interagem para produzir o efeito biológico final frequentemente são desconhecidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0015] A requerente se disparou com o problema de fornecer uma composição farmacêutica para o tratamento de micose, tendo uma atividade melhorada quando comparada com as composições conhecidas na técnica.

[0016] A requerente constatou que benzidamina pode ser usada em associação com ingredientes ativos antimicóticos derivados de imidazol.

[0017] Em particular, a requerente constatou agora surpreendentemente que a combinação de benzidamina com um ingrediente ativo antimicótico derivado de imidazol tem um efeito sinergístico em inibir o crescimento de os fungos pertencentes ao gênero Candida.

[0018] Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma combinação de benzidamina e um antimicótico de imidazol ou um sal dos mesmos, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, para uso no tratamento de micose por Candida.

[0019] Vantajosamente, benzidamina na composição de acordo com da presente invenção dá alivio para comichão vulvovaginal e dor.

[0020] Preferivelmente, o dito antimicótico de imidazol é selecionado no grupo compreendendo bifonazol, butoconazol, clormidazol, clotrimazol, croconazol, econazol, fenticonazol, cetoconazol, isoconazol, miconazol, neticonazol, omoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol ou sais dos mesmos.

[0021] Mais preferivelmente, o dito antimicótico de imidazol é selecionado no grupo compreendendo bifonazol, butoconazol, clotrimazol, econazol, fenticonazol, cetoconazol, isoconazol, miconazol, omoconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol ou sais dos mesmos.

[0022] Ainda mais preferivelmente, o dito antimicótico de imidazol é selecionado no grupo compreendendo butoconazol, econazol, fenticonazol, isoconazol, miconazol, sulconazol ou sais dos mesmos.

[0023] Vantajosamente, o dito antimicótico de imidazol é econazol, miconazol ou um sal dos mesmos.

[0024] Preferivelmente, a dita micose por Candida é causada por Candida Albicans, Candida lusitaniae, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida, rugosa, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, ou Candida dubliniensis. Mais preferivelmente, a dita micose por Candida é causada por Candida Albicans, Candida lusitaniae ou Candida tropicalis.

[0025] Mais preferivelmente, a dita micose por Candida é candidíase mucosal, candidíase cutânea, onicomicose, candidíase sistêmica, candidíase iatrogênica, candidíase de fralda, candidíase intestinal ou balanite por Candida.

[0026] Ainda mais preferivelmente, a dita candidíase mucosal é oral ou vulvovaginal.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] A figura 1 mostra visualmente os resultados da atividade de cremes A a C do exemplo 7 testados sobre lâminas contendo a cepa Candida albicans ATCC 10231 com o método de diluição em agar usando de 1% a 0,03% p/v de creme.

[0028] A figura 2 mostra graficamente os resultados da análise densitométrica realizada sobre as lâminas da figura 1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0029] Na presente descrição, a expressão "efeito sinergístico" significa que a combinação de benzidamina e do antimicótico de imidazol inibe o crescimento de uma cepa de os fungos pertencentes ao gênero Candida a uma concentração mais baixa do que a soma das concentrações de benzidamina e do antimicótico de imidazol usados isoladamente para a mesma cepa para obter a mesma inibição. Em outras palavras, um efeito sinergístico significa que a combinação de benzidamina e do antimicótico de imidazol é efetiva na produção de mais do que o efeito aditivo de cada componente na mesma cepa.

[0030] Sinergia é definida aqui em termos o índice da concentração inibidora fracionada (FIC), que é a soma das FIC's para as drogas individuais usadas em cada combinação, como descrito por Meletiadis J. et al. em Antimicrobial Agents e Chemotherapy, Feb. 2010, p. 602-609. Sob uma definição científica estrita, e preferida, sinergia é definida por um índice FIC de menos do que 0,5, i.e., quando 50% de inibição resulta de uma combinação de um quarto ou menos da concentração de cada droga requerida para elicitar o mesmo efeito se usado individualmente (i.e., a concentração de inibição mínima (MIC) de cada droga). Um índice FIC de 0,5 sob esta definição estrita define uma resposta aditiva. Sob uma definição mais ampla usada para finalidades aqui, quantidades sinergisticamente efetivas são definidas por um índice FIC de menos do que 1.0, i.e., quando 50% de inibição resulta de uma combinação da metade ou menos da MIC de cada droga. Um índice FIC de 1.0 sob esta definição mais ampla define uma resposta aditiva. Sob este teste, isobologramas podem ser preparados a partir das curvas de resposta de dose para várias combinações de benzidamina e antimicótico de imidazol em cada cepa, com sinergia indicada por pontos abaixo da linha que conecta em linha o índice FIC de 1 para benzidamina com o índice FIC de 1 para antimicótico de imidazol. Este padrão permite que se determine as MIC's para as combinações testadas, de modo a estabelecer a MIC de cada componente necessária para obter uma mistura sinergística. As quantidades exatas vão depender, por exemplo, da cepa particular. Na presente descrição e nas reivindicações que se seguem, a expressão "antimicótico de imidazol" indica ingredientes ativos antimicóticos compreendendo um anel de imidazol na sua estrutura química.

[0031] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém benzidamina em uma quantidade de 0,001% em peso por peso a 1% em peso por peso, mais preferivelmente de 0,05% em peso a 0,5% em peso, e mesmo mais preferivelmente de 0,08% em peso a 0,2% em peso.

[0032] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção contém o antimicótico de imidazol, ou um sal do mesmo, em uma quantidade de 0,01% em peso a 4% em peso, mais preferivelmente de 0,1% em peso a 2% em peso e mesmo mais preferivelmente de 0,5% em peso a 1.5% em peso.

[0033] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é para uso tópico.

[0034] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é preparada em formas de dosagem apropriadas, tais como cremes, unguentos, loções, gel, espumas, óvulos, óvulos de liberação prolongada, duchas vaginais, ou soluções para uso externo.

[0035] Mais preferivelmente, a dita forma de dosagem é creme, unguento, loção, ducha vaginal ou solução para uso externo.

[0036] Ainda mais preferivelmente, a dita forma de dosagem é creme ou ducha vaginal.

[0037] O excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado do grupo compreendendo: emolientes, espessadores, conservantes, estabilizantes, tensoativos, tampões, sais para regular pressão osmótica, emulsificantes e similares.

[0038] Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende um ou mais emulsificantes tendo um HLB variando de 6 a 9 e um ou mais emulsificantes tendo um HLB variando de mais do que 9 a 12.

[0039] Emulsificantes tendo um HLB variando de 6 a 9 utilizável na presente invenção são por exemplo, álcool cetearílico, ceteareth-20, poligliceril-3-diisoestearato, uma mistura de estearato de sorbitano e socoato de sacarose, dilaurato de PEG-4, sesquistearato de metil glucose, laureth-2, laureth-3, dioleato de PEG-8, poligliceril-5-dioleato, lactilato de estearoil sódio, laurato de sorbitano, lauroil macrogol-6 glicerídeos, peroleato de sorbitano PEG-40, poligliceril-3 estearato, poligliceril-2 laurato.

[0040] Emulsificantes tendo um HLB variando de mais do que 9 a 12 utilizáveis na presente invenção são, por exemplo laureth-4, cocoato de glicerila de PEG-7, glicerídeos de amêndoa de PEG-20, poligliceril-3 palmitato, óleo de rícino hidrogenado de PEG-25, estearamida, uma mistura de estearato de glicerila PEG-100, polisorbato 85, olivato de PEG-7, cetearil glucosideo, olivato de cetearila, monoestearato de glicerila, diisostearato de poliglicerila-10, polisorbate 85, oleato de poliglicerila-5, oleato de PEG-8, citrato estearato de glicerila, cocoato de glicerila PEG-7, diestearato de poliglicerila-3 metilglucose.

[0041] Emulsificantes particularmente preferidos tendo HLB variando de mais do que 9 a 12 são Tefose 63, uma mistura de PEG-6 e palmitoestearato de PEG-32 e estearato de glicol, e Gelot 64, uma mistura de monostearato de glicerol e estearato de PEG-75, ambos fabricados por Gattefossé SAS, França.

[0042] Emulsificantes particularmente preferidos tendo HLB variando de 6 a 9 são Labrafil M21 30CS, uma mistura de lauroil macrogol-6 glicerídeos e Labrafil M1944CS, uma mistura de oleoil polioxil-6 glicerídeos, ambos fabricados por Gattefossé SAS, França.

[0043] Os exemplos que se seguem são destinados a ilustração adicional da presente invenção, embora sem limitá-la.

EXEMPLOS

[0044] A meta dos testes descritos nos exemplos 1 a 5 era avaliar a atividade fungicida in vitro da combinação de benzidamina e de um antimicótico de imidazol contra cepas de os fungos pertencentes ao gênero Candida.

Exemplo 1 57.1 Preparação de cepas fúngicas

[0045] Cepas de Candida armazenadas a -80°C foram descongeladas e lisadas sobre lâmina SDA e então uma segunda subcultura foi realizada. Então, suspensões de cepas de Candida foram preparadas como se segue

[0046] Foram colocados 10 ml de solução salina foram colocados em um tubo Falcon de 50 ml com 5 g de contas de vidro. Uma porção das células das colônias da segunda subcultura era transferida para a solução salina e suspensa esfregando a porção contra a parede úmida do tubo para desalojar as células. O tube era então agitado por 3 minutos usando um agitador mecânico.

[0047] O número de células na suspensão era ajustado de 1,5x106 a 5,0x106 unidades formadoras de colônia (CFU)/ml usando solução salina de acordo com o padrão Mc Farland padrão No. 0,5 e lendo a densidade óptica a 550 nm.

[0048] Para contagem, diluições em série 1:10 foram preparadas usando solução salina, para obter diluições a 10-4 e 10-5, da suspensão. Uma amostra de 100 μl de cada diluição era espalhada na lâmina e incubada a 37°C por 48 h. O número de colônias era contado por inspeção visual e verificou-se que a densidade celular estava dentro da faixa desejada.

57.2 Método de diluição com agar

[0049] A metodologia era similar àquela descrita por R. Moody et al., "In Vitro Activities of Miconazol, Miconazol Nitrate, and Ketoconazol Alone and Combined with Rifampin against Candida spp. And Torulopsis glabrata Recovered from Cancer Patients", Antimicrobial Agents and Chemotherapy: 1980, 1 7, 871 -875.

1.2.1 Preparação de soluções de ingredientes ativos

[0050] Pratos Petri padrões (92 mm de diâmetro x 16 mm de altura) foram usados. Depois que o agar foi despejado, deixou-se as lâminas resfriar e elas foram então imediatamente usadas.

[0051] (A) As soluções usadas para calcular a MIC dos ingredientes ativos eram preparadas como descrito aqui abaixo.

[0052] Cada um dentre nitrato de econazol e nitrato de miconazol foi dissolvido em sulfóxido de dimetila (DMSO) a 100% até concentrações de 5,0 mg de droga ativa por ml. Em seguida, diluições 1:2 em série foram, preparadas em DMSO, até concentrações de 5,0 mg/ml a 0,078 mg/ml. Adicionou-se 0,250 ml de cada solução de nitrato de econazol ou miconazol a 24,75 ml (diluição 1:100) de agar Sabouraud em fusão (Difco Laboratoires, Detroit, Mich), e foram misturados e despejados em pratos Petri padrões, até a concentração final de 50 μg/ml a 0,78 μg/ml.

[0053] Benzidamina era dissolvida em água a uma concentração de 12,5 mg/ml. Em seguida, diluições 1:2 em série eram preparadas em água, até concentrações de 12,5 mg/ml a 1,56 mg/ml. Foi adicionado 1 ml de cada solução de benzidamina a 24 ml (diluição 1:25) de agar Sabouraud em fusão, e misturado e despejado em pratos Petri padrões, até a concentração final de 0,5 mg/ml a 0,0625 mg/ml.

[0054] Como controle positivo, Amphotericin B proveniente de uma solução em estoque de 1600 μg/ml era diluída em DMSO até soluções tendo concentrações de 50 μg/ml a 6,25 μg/ml. Estas soluções foram diluídas a 1:100 em agar Sabouraud, misturadas e despejadas em pratos Petri padrões, até a concentração final de 0,5 μg/ml a 0,0625 μg/ml.

[0055] Controles negativos de água, DMSO e água + DMSO eram incluídos no experimento.

[0056] (B) Para estudos de sinergia, outras soluções de nitrato de econazol e miconazol tendo concentrações de 2,5 mg/ml to 0,098 mg/ml foram preparadas em DMSO, com diluições 1:2 em série como descrito no parágrafo 1.2.1(A).

[0057] Também, outras soluções de benzidamina tendo concentrações de 6,25 mg/ml a 1,56 mg/ml foram preparadas em água, com diluições 1:2 em série como descrito no parágrafo 1.2.1(A). Ademais, a solução de benzidamina com uma concentração de 6,25 mg/ml era diluída 1:1,43 em água para dar uma solução de benzidamina tendo uma concentração de 4,37 mg/ml.

[0058] Em seguida, 0,250 ml de cada solução de nitrato de econazol ou miconazol e 1 ml de cada solução de benzidamina foram adicionados a 23,750 ml de agar Sabouraud em fusão (Difco Laboratoires, Detroit, Mich), e misturados e despejados em pratos Petri padrões, resultando assim em concentrações finais de econazol ou miconazol de 25 μg/ml a 0,098 μg/ml e de benzidamina de 0,25 mg/ml a 0,0625 mg/ml e 0,175 mg/ml.

1.2.2 Testes de suscetibilidade

[0059] (A) Para o cálculo da MIC, a superfície de cada prato Petri padrão preparada como descrito no parágrafo 1.2.1(A) era inoculada com quatro pontos (20 μl de volume de inóculo) das suspensões de cepas de Candida preparadas como descrito no parágrafo 1.1.

[0060] Suspensões de teste inoculadas sobre pratos Petri padrões com amphotericin B foram usadas como controle positivo.

[0061] Suspensões de teste inoculadas sobre pratos Petri padrões sem drogas mas contendo água, DMSO e água + DMSO foram usadas como controles negativos.

[0062] Todos os pratos Petri foram incubados a 35°C por 48 h.

[0063] (B) Para estudos de sinergia, a superfície de cada prato Petri preparada como descrito no parágrafo 1.2.1(B) era inoculada com quatro pontos (20 μl de volume de inóculo) das suspensões de cepas de Candida preparadas como descrito no parágrafo 1.1, e incubadas a 35°C por 48 hours.

57.3 Método de diluição em caldo

[0064] A metodologia usada para o método de diluição em caldo era similar àquela descrita em "EUCAST Definitive Document EDef 7.1: method for the determination of broth dilution MICs of antifungal agents for fermentative yeasts" (Clin Microbiol Infect 2008; 14: 398-408).

1.3.1 Preparação de soluções de ingredientes ativos (A) As soluções usadas para calcular a MIC dos ingredientes ativos foram preparadas como descrito aqui abaixo.

[0065] Cada um dentre nitrato de econazol e nitrato de miconazol foi dissolvido em sulfóxido de dimetil (DMSO) a 100% até concentrações de 10,0 mg de droga ativa por ml. Em seguida, diluições 1:2 em série foram preparadas em DMSO, até concentrações de 10,0 mg/ml a 0,078 mg/ml. Estas soluções foram ainda diluídas a 1:100 em RPMI-1640 (GiBCO® por Life Technologies) contendo 2% de3 glucose, ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS, por SIGMA) sem NaHCO3, até a concentração final de 100 μg/ml a 0,78 μg/ml.

[0066] Nitrato de clotrimazol era dissolvido em sulfóxido de dimetil (DMSO) a 100% até concentrações de 1,250 mg de droga ativa por ml. Em seguida, diluições 1:2 em série foram preparadas em DMSO, até concentrações de 1,250 mg/ml a 0,0196 mg/ml. Estas soluções foram ainda diluídas a 1:100 em RPMI-1 640 (GiBCO® por Life Technologies) contendo 2% de glucose, ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS, por SIGMA) sem NaHCO3, até a concentração final de 12,50 μg/ml a 0,196 μg/ml.

[0067] Nitrato de fluconazol era dissolvido em sulfóxido de dimetil (DMSO) a 100% até concentrações de 5,0 mg de droga ativa por ml. Em seguida, diluições 1:2 em série foram preparadas em DMSO, até concentrações de 5,0 mg/ml a 0,3125 mg/ml. Estas soluções foram ainda diluídas a 1:100 em RPMI-1640 (GiBCO® por Life Technologies) contendo 2% glucose, ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS, por SIGMA) sem NaHCO3, até a concentração final de 50 μg/ml a 3,125 μg/ml.

[0068] Benzidamina era dissolvida em água até uma concentração de 25 mg/ml. Em seguida, diluições 1:2 em série foram preparadas em água, até concentrações de 25 mg/ml a 3,125 mg/ml. Foi adicionado 1 ml de cada solução a 24 ml (diluição a 1:25) de RPMI-1640 (GiBCO® por Life Technologies) contendo 2% de glucose, ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS, por SIGMA) sem NaHCO3, até a concentração final de 1 mg/ml a 0,125 mg/ml.

[0069] Como controle positive Amphfotericin B proveniente de uma solução em estoque de 1600 μg/ml era diluída em DMSO até soluções tendo concentrações de 200 μg/ml a 50 μg/ml. Estas soluções foram diluídas a 1:100 em RPMI-1640 (GiBCO®, por Life Technology) contendo 2% de glucose, ácido 3-(N-morfolino) propanossulfônico (MOPS, por SIGMA) sem NaHCO3, até concentrações de 2 μg/ml a 0,5 μg/ml.

[0070] Controles negativos de água, DMSO e água + DMSO eram incluídos no experimento. (B) Para estudos de sinergia, outras soluções de nitrato de econazol, miconazol, clotrimazol e fluconazol tendo concentrações de 100 μg/ml a 0,049 μg/ml foram preparadas em RPMI-1 640 como descrito no parágrafo 1.3.1(A).

[0071] Também, outras soluções de benzidamina tendo concentrações de 1 mg/ml a 0,25 mg/ml foram preparadas em RPMI-1 640 como descrito no parágrafo 1.3.1(A). Ademais, a solução de benzidamina com uma concentração de 1 mg/ml era ainda diluída a 1:1,43 com RPMI-1640 até a concentração de 0,7 mg/ml.

1.3.2 Testes de suscetibilidade

[0072] Lâminas de microdiluição contendo poços com uma capacidade nominal de cerca de 300 μL/cavidade foram usadas.

[0073] As suspensões de cepas de Candida preparadas como descritas no parágrafo 1.1 foram cultivadas sobre meio de agar de Sabouraud SDA (Oxoid). Colônias eram diluídas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e suspensões eram ajustadas a aproximadamente 1-5 x105 CFU/ml usando padrão Mc Farland 0,5 e lendo a densidade óptica a 550 nm.

[0074] Um inóculo padrão foi preparado suspendendo colônias individuais de uma segunda subcultura de cepas de Candida, para obter uma densidade óptica similar ao padrão McFarland 0,5 (cerca de 1-5 x105 CFU/ml). (A) Para o cálculo da MIC, lâminas de microdiluição contendo em cada poço 100 μl de cada solução dos ingredientes ativos obtidos como descrito no parágrafo 1 .3.1(A) foram preparadas. Os poços eram então inoculados com 100 μl de suspensões de cepas de Candida obtidas como descrito acima contendo 1-5 x105 CFU/ml.

[0075] Em cada poço, a densidade final do inóculo e a concentração final dos ingredientes ativos era a metade daquela usada (i.e., a densidade final do inóculo era 0,5-2,5 x105CFU/ml, a concentração de econazol e miconazol era de 50 μg/ml a 0,39 μg/ml, a concentração de clotrimazol era de 6,25 μg/ml a 0,098 μg/ml, a concentração de fluconazol era de 50 μg/ml a 3,125 μg/ml e a concentração de benzidamina era de 0,5 mg/ml a 0,0625 mg/ml).

[0076] Poços contendo 100 μl de amphotericin B inoculada com 100 μl das mesmas suspensões de Candida foram usados como controle positivo.

[0077] Poços contendo 100 μl de água, DMSO e água+DMSO e meio estéril isento de droga inoculado com 100 μl das mesmas suspensões de Candida foram usados como controle negativo.

[0078] As lâminas de microdiluição eram incubadas por 48 hours a 35°C. (B) Para estudos de sinergia, lâminas de microdiluição contendo em cada poço, 50 μl de cada solução de econazol e miconazol e 50 μl de cada solução de benzidamina, obtida como descrito no parágrafo 1.3.1(B), foram preparadas. Em seguida, os poços eram inoculados com 100 μl das suspensões de Candida a 1-5 x105 CFU/ml. Em cada poço, a densidade final do inóculo era a metade daquela usada (i.e., 0,5-2.5 x105 CFU/ml) e a concentração final dos ingredientes ativos era um quarto daquela usada (i.e., a concentração de econazol e miconazol era de 25 mg/ml a 0,098 mg/ml, a concentração de clotrimazol era de 0,78 μg/ml a 0,049 μg/ml, a concentração de fluconazol era de 25 μg/ml a 3,25 μg/ml e a concentração de benzidamina era de 0,25 mg/ml a 0,0625 mg/ml e 0,175 mg/ml).

[0079] As lâminas de microdiluição eram incubadas por 48 horas a 35°C.

57.4 Cálculo da MIC

[0080] A concentração mínima de droga que produzia uma inibição completa de crescimento para uma certa cepa de Candida era encarada como a concentração inibidora mínima (MIC) para a dita cepa.

[0081] O valor da MIC para C. lusitaniae ATCC® 34449 era obtido com o método de diluição em agar descrito no parágrafo 1.2.

[0082] Os valores da MIC para C. albicans ATCC® MYA-427, C. tropicalis ATCC® 750, C. albicans ATCC® 10231 e C. albicans ATCC® MYA-574 resistente a fluconazol eram obtidos com o método de diluição em caldo descrito no parágrafo 1.3.

[0083] Os valores da MIC de nitrato de econazol, nitrato de miconazol, nitrato de clotrimazol, nitrato de fluconazol e benzidamina para as cepas de Candida testadas são descritos na seguinte tabela 1. Tabela 1

[0084] Água, DMSO e água + DMSO usados como controles negativos não apresentaram nenhum efeito inibidor (n/a).

57.5 Efeito sinergístico

[0085] A atividade fungicida da combinação de benzidamina e nitrato de econazol era avaliada contra C. lusitaniae ATCC® 34449 em agar de Sabouraud, com o método de diluição em agar descrito no parágrafo 1.2.

[0086] O efeito sinergístico das combinações compreendendo benzidamina e nitrato de econazol era avaliado calculando a concentração inibidora fracionada (FIC), de acordo com Meletiadis J. et al. em Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Fev. 2010, p. 602-609.

[0087] Os valores da FIC comparavam a atividade antimicótica da combinação compreendendo benzidamina e nitrato de econazol com a atividade antimicótica de cada um dos ingredientes ativos testados isoladamente.

[0088] Os valores da FIC para as combinações compreendendo benzidamina e nitrato de econazol (FIC|combinação b+e|) eram calculados para cada cepa de Candida usando a seguinte equação: FIC|combinação b+e| = FIC|b| + FIC|e| em que:

[0089] FIC|b| é a concentração inibidora fracionada de benzidamina com respeito a uma cepa de Candida específica, calculada como a razão entre MIC de benzidamina na presença de uma quantidade sub-MIC de econazol (MIC(b+e) e a MIC de benzidamina isoladamente (MIC(b)) , como se segue:

[0090] FIC|e| é a concentração inibidora fracionada de econazol com respeito a uma cepa de Candida específica, calculada como a razão entre a MIC de econazol na presença de uma quantidade sub-MIC de benzidamina (MIC(e+b)) e a MIC de econazol isoladamente (MIC(e)), da seguinte maneira:

[0091] Sinergia era definida como uma FIC mais baixa do que 0,5 de acordo com Meletiadis J. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Fev. 2010, p. 602- 609. Tabela 2

[0092] Na Tabela acima, a letra "G" indica que crescimento de C. lusitaniae ATCC® 34449 foi observado.

[0093] A FIC para a combinação de benzidamina e nitrato de econazol (FIC|combinação b+e|) era calculada com a equação descrita acima:

[0094] FIC|b|= 0,125/0,5 = 0,25

[0095] FIC|e|= 0,098/1 .56 = 0,0628

[0096] FIC |combinação b+e| = 0,0628 + 0,25 = 0,3128

[0097] Os resultados acima demonstraram que quando os ingredientes ativos benzidamina e nitrato de econazol eram associados a concentrações sub-MIC, uma atividade fungicida sinergística contra C. lusitaniae ATCC® 34449 era observada.

[0098] Os seguintes exemplos 2 a 5 sumarizam os resultados obtidos para outras cepas de Candida.

Exemplo 2

[0099] A atividade fungicida de benzidamina e nitrato de econazol ou miconazol foi avaliada contra C. albicans ATCC® MYA-427 em RPMI- 1640 com o método de diluição em caldo descrito no parágrafo 1.3.

[00100] Os resultados são sumarizados na Tabela 3.

[00101] Os dados acima mostram claramente que a combinação com benzidamina permitia reduzir a MIC de nitrato de econazol de 25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 1,56 μg/ml e a MIC de nitrato de miconazol de 25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 0,78 μg/ml.

Exemplo 3

[00102] A atividade fungicida de benzidamina e nitrato de econazol ou miconazol era avaliada contra C. Tropicalis ATCC® 750 em RPMI-1640, com o método de diluição de caldo descrito no parágrafo 1.3.

[00103] Os resultados são sumarizados na Tabela 4.

[00104] Os dados acima mostraram claramente que a combinação com benzidamina permitia reduzir a MIC de nitrato de econazol de 12.5 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 1,56 μg/ml e a MIC de nitrato de miconazol de 6,25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 0,78 μg/ml.

Exemplo 3a

[00105] A atividade fungicida de benzidamina e nitrato de clotrimazol ou fluconazol era avaliada contra C. Tropicalis ATCC® 750 em RPMI-1640, com o método de diluição de caldo descrito no parágrafo 1.3. Os resultados são sumarizados na Tabela 4a.

[00106] Os dados acima mostraram claramente que a combinação com benzidamina permitia reduzir a MIC de nitrato de clotrimazol de 6,25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 0,098 μg/ml e a MIC de nitrato de fluconazol de 50 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 6,25 μg/ml.

[00107] A FIC para a combinação de benzidamina e nitrato de clotrimazol (FIC|combinação b+c|), calculada com a equação descrita acima, resultou ser 0,37.

[00108] A FIC para a combinação de benzidamina e nitrato de fluconazol (FIC|combinação b+f|), calculada com a equação descrita acima, resultou ser 0,48.

Exemplo 4

[00109] A atividade fungicida de benzidamina e nitrato de econazol ou miconazol era avaliada contra C. Albicans ATCC® 10231 em RPMI-1640, com o método de diluição de caldo descrito no parágrafo 1.3.

[00110] Os resultados são sumarizados na Tabela 5.

[00111] Os dados acima mostraram claramente que a combinação com benzidamina permitia reduzir a MIC de nitrato de econazol de 25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 3,125 μg/ml e a MIC de nitrato de miconazol de 6,25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 1,56 μg/ml.

Exemplo 5

[00112] A atividade fungicida de benzidamina e nitrato de econazol ou miconazol era avaliada contra C. Albicans ATCC® MYA-574 resistente a fluconazol em RPMI-1640, com o método de diluição de caldo descrito no parágrafo 1.3.

[00113] Os resultados são sumarizados na Tabela 6.

[00114] Os dados acima mostraram claramente que a combinação com benzidamina permitia reduzir a MIC de nitrato de econazol de 25 μg/ml como mostrado na Tabela 1 a 12,5 μg/ml e a MIC de nitrato de miconazol de 50 μg/ml mostrado na Tabela 1 a 12,5 μg/ml.

[00115] Também, a MIC de benzidamina era reduzida de 0,5 mg/ml como mostrado na Tabela 1 a 0,125 mg/ml quando em combinação com econazol e a 0,0625 mg/ml quando em combinação com miconazol.

Exemplo 6

[00116] A Tabela 7 a seguir mostra a formulação de três composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção na forma de creme para aplicação tópica. Todas os valores são expressos como porcentagem, em peso com respeito ao teor total da formulação.

[00117] Miglyol 812: Triglicerídeo Caprílico/Cáprico (Sasol Olefin & Surfactants GmbH, Alemanha

[00118] Compritol 888ATO: Beenato de glicerila (Gattefossé SAS, França)

[00119] Gelot 64: Mistura de monoestearato de glicerol e estearato de PEG-75 - HLB 1 0 (Gattefossé SAS, França)

[00120] Tefose 63: PEG-6 e PEG-32 palmitoestearato/estearato de glicol - HLB 10 (Gattefossé SAS, França)

[00121] Labrafil M1944CS: Oleoil polioxil-6 glicerídeos (Gattefossé SAS, França)

[00122] Labrafil M2130CS: Lauroil macrogol-6 glicerídeos (Gattefossé SAS, França)

[00123] A formulação de creme F1 foi testada para avaliar a liberação de ativos depois de oito horas de aplicação.

[00124] Experimentos de célula de difusão Franz foram usados para analisar as taxas de fluxo transdérmicas in vitro de hidrocloreto de benzidamina através de uma membrana de substrato. Células de difusão Franz são um método comum e bem conhecido para medir taxas de fluxo transdérmicas. O procedimento de célula Franz geral é descrito em Franz, T. J., Percutaneous absorption: on the relevance of in vitro data. J Invest Derm, 64:1 90-195 (1975). A seguir esta a metodologia usada no presente exemplo.

[00125] Uma membrana de celulose regenerada com uma porosidade de 0,45 μm foi usada. A membrana foi condicionada com uma solução de NaCl a 0,9% p/v antes do uso com a finalidade de remover ar de poros.

[00126] A área de contato da membrana com produto era de 0,6 cm2. O compartimento de recepção foi termostatizado a 37°C. Um grama de formulação de creme 1 foi aplicado sobre a membrana no compartimento doador. Cada hora durante um período de oito horas, 0,3 ml de uma solução receptora de NaCl a 0,9% p/v foi retirado e substituído por solução fresca.

[00127] As amostras coletadas foram analisadas usando um método HPLC.

[00128] Os resultados foram reportados como quantidade cumulativa de ingrediente ativo liberado por unidade de área versus tempo. Os resultados do teste são sumarizados na seguinte Tabela 8.

Exemplo 7

[00129] A atividade anti-Candida de uma formulação de creme da presente invenção contendo os mesmos ingredientes de creme F1 da tabela 7 (creme A) foi testada em comparação com a atividade de creme Pevaryl®, um creme comercializado contendo 1% de nitrato de econazol apenas (creme B), e placebo (creme C).

[00130] A cepa candida albicans ATCC 10231 foi usada pata investigar as propriedades antifúngicas dos cremes A a C e em particular para confirmar ainda que a presença de benzidamina tinha efeitos sobre a the atividade fungicida de econazol.

[00131] Para esta finalidade um ensaio de diluição em agar foi configurado de acordo com Asterholm et al (Acta Derm Venereol 2010; 90: 239-245) de modo que a formulação de creme podia ser testada. Devido a necessidades técnicas, os cremes tinham de ser diluídos em agar de modo que as concentrações finais de creme ficavam na faixa de 0,03% a 1% (/v).

[00132] Como reportado nas figuras 1 e 2, inspeção visual e análise densitométrica das lâminas confirmou que a presença de benzidamina aumentava a atividade fungicida de econazol. Na verdade, os dados de análise densitométrica mostraram que uma concentração 4 vezes mais baixa do creme A era bastante para obter uma redução de crescimento similar àquela observada com o creme B.

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma combinação sinergística de benzidamina e um antimicótico de imidazol selecionado do grupo que compreende bifonazol, butoconazol, clormidazol, clotrimazol, croconazol, econazol, fenticonazol, cetoconazol, isoconazol, miconazol, neticonazol, omoconazol, oxiconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol ou um sal do mesmo, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável, para o tratamento de uma micose de Candida.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito antimicótico de imidazol é selecionado do grupo compreendendo bifonazol, butoconazol, clotrimazol, econazol, fenticonazol, cetoconazol, isoconazol, miconazol, omoconazol, sertaconazol, sulconazol, tioconazol ou sais dos mesmos.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o dito antimicótico de imidazol é selecionado do grupo compreendendo butoconazol, econazol, fenticonazol, isoconazol, miconazol, sulconazol ou sais dos mesmos.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o dito antimicótico de imidazol é econazol, miconazol ou um sal dos mesmos.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita micose de Candida é causada por uma espécie de Candida selecionada do grupo que consiste em Candida Albicans, Candida lusitaniae, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida, rugosa, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, e Candida dubliniensis.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a dita micose de Candida é candidíase mucosal, candidíase cutânea, onicomicose, candidíase sistêmica, candidíase iatrogênica, candidíase de fralda, candidíase intestinal ou balanite de Candida.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a dita candidíase é oral ou vulvovaginal.

8. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a dita composição é para uso tópico.

9. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a dita composição tem a forma de creme, unguento, loção, gel, espuma, óvulos, óvulos de liberação prolongada, ducha vaginal ou solução para uso externo.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a dita composição tem a forma de creme, unguento, loção, ducha vaginal ou solução para uso externo.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a dita composição é creme ou ducha vaginal.

12. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizada pelo fato de que benzidamina está presente em uma quantidade compreendida de 0,001% em peso por peso a 1% em peso por peso.

13. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o antimicótico de imidazol, ou um sal do mesmo, está presente em uma quantidade de 0,01% em peso a 4% em peso.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que tem a forma de creme contendo um ou mais emulsificantes tendo um HLB compreendido de 6 a 9 e um ou mais emulsificantes tendo um HLB compreendido de mais do que 9 a 12.