BR112017005235B1 - Vetores virais adeno-associados para o tratamento de glaucoma de miocilina (myoc) - Google Patents

Vetores virais adeno-associados para o tratamento de glaucoma de miocilina (myoc) Download PDF

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Abstract

vetores virais adeno-associados para o tratamento de glaucoma de miocilina (myoc). são aqui fornecidos métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (myoc) utilizando vetores virais adeno-associados (aav). em alguns aspectos, os vetores de aav codificam a r-espondina 1 (rspo1), a r-espondina 2 (rspo2), a r-espondina 3 (rspo3) ou a r-espondina 4 (rspo4) e/ou o rnai que direciona a miocilina (myoc). em um aspecto, as partículas virais são administradas no olho de um indivíduo humano. as partículas virais que codificam a rspo1, a rspo2, a rspo3 e/ou a rspo4 e/ou o rnai de myoc são contempladas. em alguns aspectos, partículas de aav2 variantes que transferem a malha trabecular são fornecidas.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício prioritário do Pedido Provisório U.S. No. 62/051.299, depositado em 16 de Setembro de 2014, o qual é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
SUBMISSÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SOB O ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da seguinte submissão sob o arquivo de texto ASCII é aqui incorporado por referência na sua totalidade: um formulário legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome do arquivo: 159792012540SeqList.txt, data registrada: 15 de Setembro de 2015, tamanho: 31 KB).
CAMPO DE INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se aos vetores de AAV e aos métodos de uso dos vetores de AAV para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC).
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[004] As mutações de miocilina (MYOC) são responsáveis por cerca de 2% a 4% do glaucoma primário de ângulo aberto (POAG; ~90000 pacientes nos U.S.). Em particular, as mutações MYOC glaucomatosas 3P370L ou Y437H são responsáveis por 10% a 30% da forma juvenil de POAG (JOAG, ~6.000 pacientes nos U.S.) e estão associadas com o aumento da pressão intra-ocular (PIO), morte de células ganglionares da retina e dano principal do nervo óptico (ONH) (Shimizu et al. (2000) Am. J. Ophthalmol. 130:165-77; Fan and Wiggs (2010) J. Clin. Invest. 120:3064-72).
[005] Apesar da associação entre as mutações de MYOC e o glaucoma, o efeito dos mutantes de MYOC na função ocular permanece obscuro. Consequentemente, outro esclarecimento da MYOC e da função de MYOC mutante para é necessário para descobrir novas estratégias terapêuticas para o tratamento do glaucoma de miocilina (MYOC).
[006] A invenção fornece métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, que compreende a administrar ao olho do mamífero de um agente que aumenta a sinalização de Wnt no olho do mamífero. Em algumas modalidades, o agente aumenta a sinalização de Wnt em uma célula de malha trabecular (TM) do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o agente aumenta a atividade de R-espondina 1 (RSPO1), R-espondina 2 (RSPO2), R-espondina 3 (RSPO3) e/ou R-espondina 4 (RSPO4) no olho do mamífero. Em algumas concretizações, o agente é utilizado em combinação com um ou mais agentes adicionais que aumentam uma ou mais atividades de RSPO no olho do mamífero. Em certas modalidades, o agente aumenta a RSPO1 na TM do olho do mamífero. Em certas modalidades, o agente é RSPO1 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a RSPO1 é uma RSPO1 truncada. Em algumas modalidades, o agente aumenta a RSPO2 na TM do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o agente é RSPO2 ou uma variante funcional da mesma. Em certas modalidades, o agente é uma partícula de vírus adeno- associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica a RSPO2 ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, a RSPO2 é uma RSPO2 truncada. Em algumas modalidades, o agente aumenta a RSPO3 na TM do olho do mamífero. Em certas modalidades, o agente é RSPO3 ou sua variante funcional. Em algumas concretizações, o agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a RSPO3 é uma RSPO3 truncada. Em algumas modalidades, o agente aumenta a RSPO4 na TM do olho do mamífero. Em certas modalidades, o agente é RSPO4 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica a RSPO4 ou sua variante funcional. Em certas modalidades, a RSPO4 é uma RSPO4 truncada.
[007] Em alguns aspectos, a invenção fornece a administração de um segundo agente que aumenta a sinalização de Wnt no olho do mamífero. Em algumas modalidades, o segundo agente aumenta a sinalização de Wnt na TM do olho do mamífero. Em certas modalidades, o segundo agente reduz ou inibe a expressão da miocilina (MYOC) no olho do mamífero. Em certas modalidades, o segundo agente reduz ou inibe a expressão da MYOC na TM do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o segundo agente é uma partícula de vírus adeno- associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica um ácido nucleico inibitório que direciona a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o ácido nucleico inibitório é um RNAi de MYOC que direciona a expressão de MYOC. Em certas modalidades, o RNAi de MYOC é shRNA de MYOC que direciona a expressão de MYOC.
[008] Em alguns aspectos, o agente da invenção reduz ou inibe a expressão de miocilina (MYOC) no olho do mamífero. Em algumas modalidades, o agente reduz ou inibe a expressão de MYOC na TM do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica um ácido nucleico inibitório que direciona a expressão de MYOC. Em certas modalidades, o ácido nucleico inibitório é um RNAi de MYOC que direciona a expressão de MYOC. Em outras modalidades, o RNAi de MYOC é shRNA de MYOC que direciona a expressão de MYOC.
[009] Em algumas modalidades da invenção, os métodos compreendem ainda a administração de um segundo agente que aumenta a sinalização de Wnt no olho do mamífero. Em algumas modalidades, o segundo agente aumenta a sinalização de Wnt na TM do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o segundo agente aumenta a atividade de R-espondina 1 (RSPO1), R-espondina 2 (RSPO2), R-espondina 3 (RSPO3) ou R-espondina 4 (RSPO4) no olho do mamífero. Em certas modalidades, o segundo agente aumenta a RSPO1 na TM do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o segundo agente é RSPO1 ou uma variante funcional da mesma. Em certas modalidades, o segundo agente é uma partícula de vírus adeno- associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a RSPO1 é uma RSPO1 truncada. Em algumas modalidades, o segundo agente aumenta a RSPO2 na TM do olho do mamífero. Em algumas modalidades, o segundo agente é RSPO2 ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, o segundo agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO2 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a RSPO2 é uma RSPO2 truncada. Em algumas modalidades, o segundo agente aumenta a RSPO3 na TM do olho do mamífero. Em certas modalidades, o segundo agente é RSPO3 ou sua variante funcional. Em certas modalidades, o segundo agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO3 ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, a RSPO3 é uma RSPO3 truncada. Em algumas modalidades, o segundo agente aumenta a RSPO4 na TM do olho do mamífero. Em certas modalidades, o segundo agente é RSPO4 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o segundo agente é uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a RSPO4 é uma RSPO4 truncada.
[0010] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma. Em alguns aspectos, a presente invenção fornece métodos para tratar glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo administrar ao olho do mamífero uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero de um agente que aumenta a sinalização de Wnt no olho do mamífero e um agente que reduz ou inibe a expressão da miocilina no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para tratar o glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou sua variante funcional, e uma partícula de rAAV compreendendo um vetor que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina no mamífero. Em mais outros aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno- associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional, e que codifica um shRNA de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (shRNA de MYOC) no mamífero. Em certas modalidades, o RNAi é um shRNA que direciona a MYOC. Em algumas modalidades, o shRNA reduz ou inibe a expressão de MYOC.
[0011] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo um distúrbio ocular, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional. Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo um distúrbio ocular, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica um ácido nucleico inibitório que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo um distúrbio ocular, que compreende administrar ao olho do mamífero uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo um distúrbio ocular, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional, e uma partícula de rAAV compreendendo um vetor que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo uma distúrbio ocular, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno- associado recombinante (rAAV) que compreende um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional, e que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina no mamífero. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é glaucoma de miocilina (MYOC).
[0012] Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades da invenção, o glaucoma de miocilina (MYOC) está associado com uma mutação em uma miocilina. Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) está associado com uma mutação em uma miocilina humana. Em algumas modalidades, a mutação de miocilina compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de E323K, K398R, Q368X, G364V, P370L, D380A, K423E, Y437H e I477S. Em algumas modalidades, a mutação de miocilina compreende uma substituição de aminoácido P370L. Em algumas modalidades, a mutação de miocilina compreende uma substituição de aminoácidos Y437H. Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é glaucoma primário de ângulo aberto (POAC). Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é a forma juvenil de glaucoma de ângulo aberto primário (JOAC). Em algumas modalidades da invenção, o tratamento reduz um sintoma de glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, a redução de um sintoma de glaucoma de miocilina (MYOC) é uma redução da pressão intraocular, que reduz o acúmulo de MYOC na malha trabecular, reduz a hipertensão ocular ou aumenta a saída aquosa da malha trabecular.
[0013] Em certas modalidades, a RSPO1 é uma RSPO1 humana. Em algumas modalidades, a RSPO1 possui mais do que cerca de 80%, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a RSPO1 humana. Em algumas modalidades, a RSPO1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a RSPO1 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a RSPO1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a RSPO1 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 11. Em algumas modalidades, a RSPO1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, a RSPO1 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, a RSPO2 é uma RSPO2 humana. Em algumas modalidades, a RSPO2 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a RSPO2 humana. Em algumas modalidades, a RSPO2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9. Em certas modalidades, a RSPO2 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a RSPO2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a RSPO2 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: I. . Em algumas modalidades, a RSPO2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a RSPO2 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % da SEQ ID NO: 14. Em certas modalidades, a RSPO3 é uma RSPO3 humana. Em algumas modalidades, a RSPO3 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99 % de identidade com a RSPO3 humana. Em algumas modalidades, a RSPO3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a RSPO3 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a RSPO3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a RSPO3 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 15. Em algumas modalidades, a RSPO3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a RSPO3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a RSPO3 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92%, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a RSPO4 é uma RSPO4 humana. Em algumas modalidades, a RSPO4 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98% ou 99 % de identidade com a RSPO4 humana. Em algumas modalidades, a RSPO4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a RSPO4 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a RSPO4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a RSPO4 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a RSPO4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19. Em algumas modalidades, a RSPO4 possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 12. Em certas modalidades, a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 e/ou sua variante funcional está ligada de maneira operável a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 e/ou sua variante funcional no olho do mamífero. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 e/ou sua variante funcional nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA).
[0014] Em certas modalidades, o RNAi de MYOC que direciona a expressão de MYOC da invenção direciona a MYOC humano. Em certas modalidades, o RNAi é um pequeno RNA inibitório (siRNA), um micro RNA (miRNA), ou um pequeno RNA grampo de cabelo (shRNA). Em certas modalidades, o RNAi de MYOC é um shRNA de MYOC. Em algumas modalidades, o shRNA direciona a sequência de aminoácido de MYOC apresentada na SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o shRNA compreende a sequência em ciclo da SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) está ligado de maneira operável a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) no olho do mamífero. Em outras modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase III. Em algumas modalidades, a expressão de RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) reduz ou inibe a expressão de MYOC no olho do mamífero. Em algumas modalidades, a expressão de RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) reduz ou inibe a expressão de MYOC nas células da malha trabecular do mamífero. Em algumas modalidades, a MYOC é uma MYOC do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a MYOC é uma MYOC mutante. Em algumas modalidades, a MYOC é uma MYOC do tipo selvagem e uma MYOC mutante. Em outras modalidades, a MYOC mutante compreende substituições de aminoácido que correspondem às substituições de aminoácido P370L e/ou Y437H da MYOC humana. Em algumas modalidades, a mutação de miocilina compreende uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de E323K, K398R, Q368X, G364V, P370L, D380A, K423E, Y437H e I477S.
[0015] Em certas modalidades dos aspectos e das modalidades acima descritas, a partícula viral de AAV compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, um capsídeo AAV6 do tipo selvagem ou um capsídeo AAV6 variante tal como ShH10, como descrito na U.S. PG Pub. 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, um capsídeo AAV9 do tipo selvagem ou um capsídeo AAV9 modificada como descrito na U.S. PG Pub. 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, um mutante de capsídeo de tirosina, um mutante de capsídeo de ligação a heparina, um capsídeo de AAV2R471A, um capsídeo de AAVAAV2/2-7m8, um capsídeo de AAV DJ (por exemplo, um capsídeo de AAV-DJ/8, um capsídeo de AAV-DJ/9 ou qualquer outra das capsídeos descritas U.S. PG Pub. 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsídeo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo quimérico de AAV1/AAV2, capsídeo de AAV bovino, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo de rAAV2/HBoV1, ou um capsídeo de AAV descrita na Patente U.S. No 8.283.151 ou Publicação Internacional No. WO/2003/042397. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um capsídeo de AAV que compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições R484, R487, K527, K532, R585 ou R588, numeração baseada em VP1 de AAV2. Em outras modalidades, uma partícula de AAV compreende as proteínas do capsídeo de um sorotipo de AAV de Clados A-F. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de sorotipo 2 de AAV. Em outras modalidades, a capsídeo de sorotipo 2 de AAV compreende a proteína do capsídeo AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa a AAV2 VP1. Em algumas modalidades, o vetor compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV de bovino ou repetições terminais invertidas de sorotipo de AAV de camundongo (ITRs). Em algumas modalidades, o vetor compreende ITRs de sorotipo 2 de AAV. Em certas modalidades, a partícula viral de AAV compreende uma ou mais ITRs e capsídeo derivado do mesmo sorotipo de AAV. Em outras modalidades, a partícula viral de AAV compreende uma ou mais ITRs derivadas de um sorotipo AAV diferente do capsídeo das partículas virais de rAAV. Em certas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de AAV2, e em que o vetor compreende ITRs de AAV2. Em outras concretizações, a capsídeo de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa ao AAV2 VP1.
[0016] Em certas modalidades, pelo menos 1 x 109 cópias de genoma das partículas de rAAV são administradas ao mamífero. Em algumas modalidades, o AAV é administrado na córnea, na retina e/ou na esclera do olho do mamífero. Em certas modalidades, a partícula de AAV é administrada por injeção intravítrea e/ou injeção intracameral. Em algumas modalidades, o rAAV é administrado a mais do que um local do olho.
[0017] Em certas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero em que o mamífero é um ser humano. Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é glaucoma primário de ângulo aberto (POAC). Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é a forma juvenil de glaucoma primário de ângulo aberto (JOAC).
[0018] Em algumas modalidades da invenção, as partículas virais de rAAV estão em uma composição farmacêutica. Em outras modalidades adicionais, a composição farmacêutica compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0019] Em algumas modalidades dos métodos acima, o agente (por exemplo, a partícula de AAV) é utilizado em combinação com um ou mais agentes adicionais que aumentam a atividade de uma R- espondina (por exemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4).
[0020] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas de AAV recombinantes compreendendo um vetor de AAV, em que o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma. Em outros aspectos, a invenção fornece partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica um ácido nucleico inibitório que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em mais outros aspectos, a invenção fornece partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina no mamífero.
[0021] Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO1 ou sua variante funcional, e a RSPO1 ou sua variante funcional é uma RSPO1 humana. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO1 ou sua variante funcional compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 8, 11 e/ou 12. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 8, 11 e/ou 12. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO2 ou sua variante funcional, e a RSPO2 ou sua variante funcional é uma RSPO2 humana. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO2 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO2 ou sua variante funcional compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 9, 13 e/ou 14. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO2 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO2 ou uma variante funcional da mesma compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93%, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, 13 e/ou 14. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO3 ou sua variante funcional é uma RSPO3 humana. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO3 ou sua variante funcional compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 1 e/ou 15 a 17. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO3 ou sua variante funcional compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 1 e/ou 15 a 17. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO4, e a RSPO4 é uma RSPO4 humana. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 10, 18 e/ou 19. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92%, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 10, 18 e/ou 19. Em outras modalidades, a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou sua variante funcional é ligada de maneira operável a um promotor. Em outras modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional no olho do mamífero. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou variante funcional da mesma nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA).
[0022] Em algumas modalidades, o ácido nucleico inibitório que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero é um RNAi. Em algumas modalidades, o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de MYOC da invenção direciona a MYOC humana. Em certas modalidades, o RNAi é um pequeno RNA inibitório (siRNA), um micro RNA (miRNA), ou um pequeno RNA grampo de cabelo (shRNA). Em certas modalidades, o RNAi de MYOC é um shRNA. Em algumas modalidades, o RNAi (por exemplo, shRNA) direciona a sequência de aminoácido de MYOC apresentada na SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o RNAi (por exemplo, shRNA) compreende a sequência em ciclo da SEQ ID NO: 7. Em certas modalidades, o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) está ligado de maneira operável a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) no olho do mamífero. Em outras modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase III. Em algumas modalidades, a expressão de RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) reduz ou inibe a expressão de MYOC no olho do mamífero. Em algumas modalidades, a expressão de RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) reduz ou inibe a expressão de MYOC nas células da malha trabecular do mamífero. Em algumas modalidades, a MYOC é uma MYOC do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a MYOC é uma MYOC mutante. Em algumas modalidades, a MYOC é uma MYOC do tipo selvagem e uma MYOC mutante. Em outras modalidades, a MYOC mutante compreende substituições de aminoácido que correspondem às substituições de aminoácido de MYOC humana de E323K, K398R, Q368X, G364V, P370L, D380A, K423E, Y437H e I477S. Em algumas modalidades, a MYOC mutante compreende substituições de aminoácido que correspondem às substituições de aminoácido P370L e/ou Y437H de MYOC humana. Em algumas modalidades, a mutação de miocilina está associada com o glaucoma primário de ângulo aberto (POAC). Em algumas modalidades, a mutação de miocilina está associada com a forma juvenil de glaucoma primário de ângulo aberto (JOAC).
[0023] Em certas modalidades dos aspectos e modalidades acima descritas, a partícula viral de AAV compreende um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, um capsídeo de AAV6 do tipo selvagem ou um capsídeo de AAV6 variante tal como ShH10, como descrito na U.S. PG Pub. 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, um capsídeo de AAV9 do tipo selvagem ou um capsídeo de AAV9 modificada como descrito na U.S. PG Pub. 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, um mutante de capsídeo de tirosina, um mutante de capsídeo de ligação a heparina, um capsídeo de AAV2R471A, um capsídeo de AAVAAV2/2-7m8, um capsídeo de AAV DJ (por exemplo, um capsídeo AAV-DJ/8, um capsídeo de AAV-DJ/9, ou qualquer outra das capsídeos descritas na U.S. PG Pub. 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsídeo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo quimérico de AAV1/AAV2, capsídeo de AAV bovino, AAV, capsídeo de rAAV2/HBoV1, ou um capsídeo de AAV descrita na Patente U.S. No 8.283.151 ou Publicação Internacional No. WO/2003/042397. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um capsídeo de AAV que compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições R484, R487, K527, K532, R585 ou R588, numeração baseada em VP1 de AAV2. Em outras modalidades, uma partícula de AAV compreende proteínas de capsídeo de um sorotipo de AAV de Clados A-F. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de sorotipo 2 de AAV. Em outras modalidades, a capsídeo de sorotipo 2 de AAV compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa a AAV2 VP1. Em algumas modalidades, o vetor compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino ou repetições terminais invertidas de sorotipo de AAV de camundongo (ITRs). Em algumas modalidades, o vetor compreende ITRs de sorotipo 2 de AAV. Em certas modalidades, a partícula viral de AAV compreende uma ou mais ITRs e capsídeo derivado do mesmo sorotipo de AAV. Em outras modalidades, a partícula viral de AAV compreende uma ou mais ITRs derivadas de um sorotipo AAV diferente do capsídeo das partículas virais de rAAV. Em certas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de AAV2, e em que o vetor compreende ITRs de AAV2. Em outras modalidades, a capsídeo de AAV2 compreende a proteína do capsídeo AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa ao AAV2 VP1.
[0024] A invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo qualquer uma das partículas de AAV recombinantes aqui descritas. A invenção também fornece composições farmacêuticas que são adequadas para qualquer dos métodos aqui descritos. A invenção fornece usos de uma composição farmacêutica e partículas de AAV recombinantes aqui descritas na fabricação de um medicamento para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em certas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é glaucoma primário de ângulo aberto (POAC). Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é a forma juvenil de glaucoma primário de ângulo aberto (JOAC).
[0025] Em alguns aspectos, a invenção fornece kits para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero em que o kit compreende uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma; uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de AAV, em que o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica um ácido nucleico inibitório (por exemplo, RNAi de MYOC incluindo shRNA) que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero; e/ou uma partícula viral de rAAV compreendendo um vetor de AAV, em que o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional, e que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de uma MYOC no mamífero. Em algumas modalidades, o kit compreende ainda instruções de uso no tratamento do glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, o kit compreende ainda tampões e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0026] Em certas modalidades, os kits da invenção compreendem ácido nucleico que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de uma MYOC no mamífero. Em algumas modalidades, o RNAi de MYOC direciona a expressão de uma MYOC humana. Em algumas modalidades, o RNAi de MYOC direciona a sequência de aminoácido de MYOC apresentada na SEQ ID NO: 6. Em certas modalidades, o RNAi é um pequeno RNA inibitório (siRNA), um micro RNA (miRNA), ou um pequeno RNA grampo de cabelo (shRNA). Em algumas modalidades, o RNAi é um shRNA. Em algumas modalidades, o shRNA de MYOC compreende a sequência em ciclo da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, os kits da invenção compreendem um vetor de AAV, em que o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica aRSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO1 ou sua variante funcional é uma RSPO1 humana. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO1 ou variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 8, 11 e/ou 12. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO1 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO1 ou sua variante funcional compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 8, 11 e/ou 12. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO2 ou sua variante funcional, e a RSPO2 ou sua variante funcional é uma RSPO2 humana. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO2 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO2 ou variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 9, 13 e/ou 14. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO2 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO2 ou sua variante funcional compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85%, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, 13 e/ou 14. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO3 ou sua variante funcional é uma RSPO3 humana. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO3 ou variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 1 e/ou 15 a 17. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO3 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO3 ou sua variante funcional compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 1 e/ou 15 a 17. Em algumas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO4 ou uma variante funcional do mesmo é uma RSPO4 humana. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma, e a RSPO4 ou uma variante funcional da mesma compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 10, 18 e/ou 19. Em certas modalidades, o vetor de AAV compreende o ácido nucleico que codifica a RSPO4 ou sua variante funcional, e a RSPO4 ou sua variante funcional da mesma compreende uma sequência de aminoácido que possui 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NOs: 10, 18 e/ou 19. Em algumas modalidades, a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma é ligada de maneira operável a um promotor. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional no olho do mamífero. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o RNAi de MYOC está ligado de maneira operável a um promotor. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC no olho do mamífero. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA). Em certas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase III. Em algumas modalidades, a expressão de RNAi de MYOC reduz ou inibe a expressão de MYOC no olho do mamífero. Em algumas modalidades, a expressão de RNAi de MYOC reduz ou inibe a expressão de MYOC nas células da malha trabecular do mamífero.
[0027] Em algumas modalidades, as partículas de AAV aqui descritas podem ser utilizadas em combinação com um ou mais agentes adicionais que aumentam a atividade de uma R-espondina (por exemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4).
[0028] Em certas modalidades, os kits da invenção compreendem uma partícula viral de AAV compreendendo um vetor e um AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, um capsídeo de AAV6 do tipo selvagem ou um capsídeo de AAV6 variante tal como ShH10, como descrito na PG Pub. 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, um capsídeo de AAV9 do tipo selvagem ou um capsídeo de AAV9 modificada como descrito na U.S. PG Pub. 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, um mutante de capsídeo de tirosina, um mutante de capsídeo de ligação a heparina, um capsídeo de AAV2R471A, um capsídeo de AAVAAV2/2-7m8, um capsídeo de AAV DJ (por exemplo, um capsídeo de AAV-DJ/8, um capsídeo de AAV DJ/9, ou qualquer outra das capsídeos descritas na U.S. PG Pub. 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsídeo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo quimérico de AAV1/AAV2, capsídeo de AAV bovino, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo de rAAV2/HBoV1, ou um capsídeo de AAV descrita na Patente U.S. No 8.283.151 ou Publicação Internacional No. WO/2003/042397. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um capsídeo de AAV que compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições R484, R487, K527, K532, R585 ou R588, numeração baseada em VP1 de AAV2. Em outras modalidades, uma partícula de AAV compreende proteínas do capsídeo de um sorotipo de AAV de Clados A-F. Em algumas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de sorotipo 2 de AAV. Em certas modalidades, a capsídeo de sorotipo 2 de AAV compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa a AAV2 VP1. Em algumas modalidades, o vetor compreende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV de cabra, AAV bovino ou repetições terminais invertidas de sorotipo de AAV de camundongo (ITRs). Em algumas modalidades, o vetor compreende ITRs de sorotipo 2 de AAV. Em certas modalidades, a partícula viral de AAV compreende uma ou mais ITRs e a capsídeo derivado do mesmo sorotipo de AAV. Em certas modalidades, a partícula viral de AAV compreende uma ou mais ITRs derivadas de um sorotipo de AAV diferente do capsídeo das partículas virais de rAAV. Em certas modalidades, a partícula viral de rAAV compreende um capsídeo de AAV2, e o vetor compreende ITRs de AAV2. Em certas modalidades, a capsídeo de AAV2 compreende uma proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa ao AAV2 VP1.
[0029] Em certas modalidades dos kits acima, a partícula de AAV do kit é utilizada em combinação com um ou mais agentes adicionais que aumentam a atividade de uma R-espondina (por exemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4). Em algumas modalidades, os kits da invenção compreendem uma partícula de AAV como aqui descrita e um ou mais agentes adicionais que aumentam a atividade de uma R- espondina (por exemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4).
[0030] A invenção fornece kits adequados para uso em qualquer um dos métodos aqui descritos. A invenção fornece kits que compreendem qualquer uma das partículas de AAV recombinantes aqui descritas. Em alguns aspectos, os kits aqui descritos compreendem ainda instruções de uso no tratamento do glaucoma de miocilina (MYOC). Em alguns aspectos, os kits aqui descritos compreendem ainda tampões e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0031] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de liberação de ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico) na malha trabecular do olho de um mamífero, compreendendo a administração de uma partícula de AAV sorotipo 2 (AAV2) compreendendo um vetor de rAAV no olho do mamífero, em que o vetor de rAAV compreende o ácido nucleico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido de R471A, numeração baseada em VP1 de AAV2. Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de tratamento de um distúrbio ocular em um mamífero compreendendo a administração de uma partícula de AAV2 que compreende um vetor de rAAV no olho do mamífero, em que o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico, e em que a partícula de AAV2 compreende a capsídeo de AAV2 que compreende uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada na VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV é administrada intravitreal e/ou intracameralmente. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV transfere as células da malha trabecular do olho. Em certas modalidades, o transgene terapêutico é expresso na malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é um distúrbio associado com a malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0032] Em alguns aspectos, a invenção fornece partícula de AAV2 recombinante para liberação de ácido nucleico (por exemplo, ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico) à malha trabecular do olho de um mamífero, em que a partícula de AAV2 compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende o ácido nucleico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada na VP1 de AAV2. Em alguns aspectos, a invenção proporciona uma partícula de AAV2 recombinante para o tratamento de um distúrbio ocular em um mamífero em que a partícula de AAV2 compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada na VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV tranfere as células da malha trabecular do olho. Em certas modalidades, o transgene terapêutico é expresso na malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é um distúrbio associado com a malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0033] Em alguns aspectos, a invenção fornece usos de uma partícula de AAV2 recombinante para liberar ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico) na malha trabecular do olho de um mamífero, em que a partícula de AAV2 compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende o ácido nucleico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada na VP1 de AAV2. Em alguns aspectos, a invenção fornece o uso de uma partícula de AAV2 recombinante para o tratamento de um distúrbio ocular em um mamífero em que a partícula de AAV2 compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína de capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada em VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV é administrada intravitreal e/ou intracameralmente. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV transfere as células da malha trabecular do olho. Em certas modalidades, o transgene terapêutico é expresso na malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é um distúrbio associado com a malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0034] Em alguns aspectos, a invenção fornece kits que liberam ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico) à malha trabecular do olho de um mamífero, compreendendo uma partícula de rAAV2 que compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende o ácido nucleico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada em VP1 de AAV2. Em alguns aspectos, a invenção fornece kits para o tratamento de um distúrbio ocular em um mamífero compreendendo uma partícula de rAAV2 que compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, numeração baseada na VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV é administrada intravitreal e/ou intracameralmente. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV transfere células da malha trabecular do olho. Em certas modalidades, o transgene terapêutico é expresso na malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o transgene terapêutico codifica um polipeptídeo terapêutico ou um ácido nucleico terapêutico. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é um distúrbio associado com a malha trabecular do olho. Em algumas modalidades, o distúrbio ocular é glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0035] Todas as referências aqui citadas, incluindo pedidos de patente e publicações, são incorporadas por referência na sua totalidade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0036] A FIG. 1 demonstra que os mutantes de MYOC P370L e Y437H não são secretados e bloqueiam a secreção de MYOC do tipo selvagem ("wtMYOC"). O meio de cultura celular ou os lisados celulares de 293 células transfectadas com construções que expressam mutantes de wtMYOC e/ou MYOC (como marcados) foram sondados por Western blotting utilizando anticorpo de MYOC anti-humano.
[0037] A FIG. 2 mostra que o mutante de MYOC P370L não é secretado e bloqueia a secreção de MYOC do tipo selvagem ("wtMYOC") nas células da malha trabecular humanas transformadas pelo antígeno tanto 293T quanto SV40 T ("hTM-T"). O meio de cultura celular ou lisados celulares de células 293T ou hTM-T transfectadas com construções que expressam wtMYOC e/ou MYOC de P370L (como marcados) foram sondados por Western blotting utilizando anticorpo de MYOC anti-humano.
[0038] A FIG. 3 retrata o efeito da expressão de wtMYOC, MYOC P370L ou Y437H na sinalização de Wnt. Para cada experimento, a barra "sem mWnt3a" está à esquerda e a barra "wt mWnt3a - 400 ng/ml" está à direita.
[0039] A FIG. 4 mostra que a expressão de RSPO3 pode restaurar a sinalização de Wnt após a co-expressão com MYOC P370L ou Y437H. Para cada experimento, a barra "sem mWnt3a"está à esquerda e a barra "mWnt3a - 400ng/ml"está à direita.
[0040] A FIG. 5 mostra que a expressão de RSPO3 pode restaurar a sinalização de Wnt em células hTM-T após a co-expressão com MYOC de P370L. Para cada experimento, a barra "sem mWnt3a"está à esquerda e a barra "400 ng/ml hWnt3a"está à direita.
[0041] A FIG. 6 mostra o efeito do shRNA de MYOC na expressão de MYOC em células 293T. O meio de cultura celular ou os lisados celulares das células 293T foram sondados por Western blotting com anticorpo de MYOC anti-humano. As células foram transfectadas com plasmídeos que expressam wtMYOC (faixa 1); wtMYOC e shRNA de MYOC #79 (2); wtMYOC e shRNA de MYOC #93 (3); wtMYOC e controle de shRNA misturado (4); ou EGFP (5). As faixas de 55/57 kD representam formas glicosiladas (57kD) e não glicosiladas (55 kD) de uma proteína de MYOC de tamanho normal. A faixas de 22 kD representa o terminal N de um produto de clivagem da calpaína II.
[0042] A FIG. 7 mostra o efeito de shRNA de MYOC na expressão de MYOC nas células hTM-T. O meio de cultura celular ou os lisados celulares das células hTM-T foram sondados por Western blotting com anticorpo de MYOC anti-humano. As células foram transfectadas com plasmídeos que expressam wtMYOC (faixa 1); MYOC P370L (2); wtMYOC e MYOC P370L (3); wtMYOC e MYOC P370L e Grp94 shRNA #1 (4); wtMYOC e MYOC P370L e Grp94 shRNA #2 (5); wtMYOC e MYOC P370L e shRNA de MYOC #53 (6); wtMYOC e MYOC P370L e pGIPZ shRNA de MYOC # 79 (7); wtMYOC e MYOC P370L e pGIPZ shRNA de MYOC #93 (8); wtMYOC e MYOC P370L e controle de shRNA misturado (9); ou EGFP (10).
[0043] A FIG. 8 mostra que a expressão de RSPO3 e o silenciamento de MYOC sinergicamente restauram a sinalização de Wnt após a co-expressão com MYOC P370L. As células 293T foram co- transfectadas com a construção repórter TOP-Flash e wtMYOC (“MYOC”), acrescido de MYOC P370L, Grp94 shRNA, pGIPZ shRNas de MYOC # 79 (o primeiro) e #93 (o segundo), e/ou os plasmídeos de RSPO3, como rotulados. A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a recombinante de camundongo (400 ng/ml) e medida por ensaio TOP-Flash. A atividade de luciferase (média ± SD, n = 1 a 3 reservatórios de replicação) foi medida após a transfecção e foi normalizada com o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expresso. Para cada experimento, a barra "sem Wnt adicionado" está à esquerda, e a barra "400 ng/ml Wnt3a adicionado" está à direita.
[0044] A FIG. 9 mostra que o silenciamento de MYOC restaura a sinalização de Wnt após co-expressão com MYOC P370L ou Y437H. As células 293T foram co-transfectadas com a construção repórter TOPFlash e wtMYOC ("MYOC"), acrescida de shRNA de MYOC P370L, MYOC Y437H, shRNA de MYOC e/ou shRNA de controle misturado ("pGIPZ-Nulo"), como rotulado. A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a de camundongo recombinante (400 ng/ml) e medida por ensaio TOP-Flash. A atividade de luciferase (média ± SD, n = 1 a 3 reservatórios de replicação) foi medida após a transfecção e foi normalizada para o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expresso. Para cada experimento, a barra "sem Wnt adicionado" está à esquerda, e a barra "400 ng/ml Wnt3a adicionado" está à direita.
[0045] A FIG. 10 mostra a transdução in vitro (painéis esquerdos) e in vivo (painéis direitos) de células da malha trabecular através das partículas virais de AAV2 do tipo selvagem (painéis superiores) e partículas de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido de R471A da proteína do capsídeo.
[0046] A FIG. 11 mostra um diagrama de domínio de proteínas da família de RSPO humana que descrevem domínios ricos em Cys semelhantes a furina, o domínio tipo 1 de trombospondina, e o domínio C-terminal positivamente carregado, como marcado (figura adaptada de Kim, K.A. et al. (2008) Mol. Biol. Cell. 19:2588-2596).
[0047] A FIG. 12 mostra um diagrama de domínio de genes da família de RSPO humana que descrevem os domínios de proteína listados na FIG. 11. A numeração de sequências de aminoácido é retratada e os mutantes truncados testados para cada membro da família são como marcados (figura adaptada de Kim, K.A. et al. (2006) Cell Cycle 5:23-26).
[0048] A FIG. 13A mostra a sequência de RSPO3 humana de comprimento total (SEQ ID NO: 1) com a sequência de sinal, os domínios FU1, FU2 e TSP1 marcados.
[0049] A FIG. 13B mostra a sequência de um fragmento de RSPO3 humano ativo (SEQ ID NO: 16) com a sequência sinal, os domínios FU1 e FU2 marcados. O fragmento utilizado, que carece do peptídeo sinal, corresponde aos aminoácidos 22 a 146 da SEQ ID NO: 16 e é de 15 kDa incluindo o marcador His.
[0050] A FIG. 13C retrata a estrutura de domínio de hRSPO3 de comprimento total com o peptídeo de sinal, domínios FU1, FU2, TSP1 e BR marcados. As funções putativas para cada domínio estão listadas abaixo.
[0051] A FIG. 13D mostra um Western blot de hRSPO3 de comprimento total e o fragmento de hRSPO3.
[0052] A FIG. 14 retrata os fragmentos de hRSPO3 testados. A estrutura de domínio de hRSPO3 de comprimento total com o peptídeo de sinal, domínios de FU1, FU2, TSP1 e BR marcados e as funções putativas para cada domínio também são fornecidas abaixo.
[0053] A FIG. 15 mostra que a expressão de RSPO3 e fragmentos de RSPO3 de comprimento total pode restaurar a sinalização de Wnt após co-expressão com MYOC Y437H.
[0054] A FIG. 16 mostra que a expressão de membros da família RSPO pode induzir a sinalização de Wnt após a co-expressão com MYOC de Y437H mesmo sem adição de Wnt3a.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0055] A presente invenção fornece métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula viral de vírus adeno-associado recombinante (rAAV). Em algumas modalidades, a sinalização de wnt no olho do mamífero é aumentada; por exemplo, pela expressão de R-espondina 1 (RSPO1), R-espondina 2 (RSPO2), R- espondina 3 (RSPO3) e/ou R-espondina 4 (RSPO4). Em algumas modalidades, a expressão de miocilina (MYOC) (por exemplo, miocilina mutante) é inibida; por exemplo, através do uso da expressão de RNAi que direciona a MYOC. Em alguns aspectos, a partícula de AAV compreende um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4, e/ou uma variante funcional nesse particular. Em outros aspectos, a partícula de rAAV compreende um vetor que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para tratar glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma mistura de partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4 e/ou uma variante funcional da mesma e partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de uma miocilina no mamífero. Em outros aspectos, a invenção fornece métodos para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de rAAV compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4, e/ou uma proteína funcional da mesma, e que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de uma miocilina (shRNA de MYOC) no mamífero. A invenção também fornece composições e kits para o tratamento do glaucoma de miocilina (MYOC) utilizando os vetores de rAAV que codificam RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4 e/ou sua variante funcional e/ou RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA). A invenção também fornece partículas de AAV recombinantes, composições e kits.
[0056] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de direcionamento de AAV2 para transduzir células da malha trabecular. Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas de rAAV2 compreendendo uma mutação de R471A, numeração baseada na VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos e composições para o tratamento de doenças oculares associadas com a malha trabecular (por exemplo, glaucoma de miocilina (MYOC)) utilizando partículas virais de AAV2 que compreendendo a proteína de capsídeo submetida à mutação (por exemplo, uma substituição de aminoácido de R471A).
II. Técnicas Gerais
[0057] As técnicas e os procedimentos aqui descritos ou referenciados são geralmente bem compreendidos e comumente empregados utilizando metodologia convencional por aqueles versados na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 19938); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
III. Definições
[0058] Um "vetor", como aqui utilizado, refere-se a um plasmídeo ou vírus recombinante que compreende um ácido nucleico a ser liberado em uma célula hospedeira, in vitro quer in vivo.
[0059] O termo "polinucleotídeo"ou "ácido nucleico" como aqui utilizado refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos. Assim, este termo inclui, mas não é limitado ao DNA ou RNA de cadeia única, dupla ou múltipla, DNA genômico cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de purina e pirimidina, ou outras bases de nucleotídeo naturais, química ou bioquimicamente modificadas, não naturais ou derivatizadas. A cadeia principal do ácido nucleico pode compreender açúcares e grupos de fosfato (como pode ser tipicamente observado em RNA ou DNA), ou grupos açúcar ou fosfato modificados ou substituídos. Alternativamente, a cadeia principal do ácido nucleico pode compreender um polímero de subunidades sintéticas tais como fosforamidatos e assim pode ser um fosforamidato de oligodesoxinucleosídeo (P-NH2) ou um oligômero misturado de fosforamidato-fosfodiéster. Além disso, um ácido nucleico de filamento duplo pode ser obtido a partir do produto de polinucleotídeo de filamento único de síntese química através da sintetização do filamento complementar e recozimento dos filamentos sob condições apropriadas, ou através da sintetização do filamento complementar de novo utilizando uma DNA polimerase com um iniciador apropriado.
[0060] Os termos "polipeptídeo"e "proteína" são utilizados modo trocável para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácido, e não estão limitados a um comprimento mínimo. Tais polímeros de resíduos de aminoácido podem conter resíduos de aminoácido naturais ou não naturais e incluem, mas não são limitados a estes, peptídeos, oligopeptídeos, dímeros, trímeros e multímeros de resíduos de aminoácido. Tanto as proteínas de comprimento completo quanto os seus fragmentos são incluídos pela definição. Os termos também incluem modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilação, sialilação, acetilação, fosforilação, e outras mais. Além disso, para os propósitos da presente invenção, um "polipeptídeo" refere-se a uma proteína que inclui modificações, tais como eliminações, adições e substituições (de natureza geralmente conservadora), à sequência nativa, contanto que a proteína mantenha a atividade desejada. Estas modificações podem ser deliberadas, como através da mutagênese direcionada ao local, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem as proteínas ou erros devidos à amplificação por PCR.
[0061] Um "vetor viral recombinante" refere-se a um vetor de polinucleotídeo recombinante compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico de origem não viral). No caso de vetores de AAV recombinantes, o ácido nucleico recombinante é flanqueado por pelo menos uma, de preferência duas, sequências de repetições terminais invertidas (ITRs).
[0062] Um "vetor de AAV recombinante (vetor de rAAV)" refere-se a um vetor de polinucleotídico compreendendo uma ou mais sequências heterólogas (isto é, sequência de ácido nucleico não de origem de AAV) que são flanqueadas por pelo menos uma, preferencialmente duas, sequências de repetições terminais invertidas de AAV (ITRs). Tais vetores de rAAV podem ser replicados e acondicionados em partículas virais infecciosas quando presentes em uma célula hospedeira que foi infectada com um vírus auxiliar adequado (ou que esteja expressando funções auxiliares adequadas) e que expressa produtos de genes rep e cap de AAV (isto é, proteínas Rep e Cap de AAV). Quando um vetor de rAAV é incorporado em um polinucleotídeo maior (por exemplo, em um cromossoma ou em outro vetor tal como um plasmídeo utilizado para clonagem ou transfecção), então o vetor de rAAV pode ser referido como um "pró-vetor"que pode ser "resgatado"através da replicação e encapsulação na presença de funções de acondicionamento do AAV e funções auxiliares adequadas. Um vetor de rAAV pode estar em qualquer uma de várias formas, incluindo, mas não se limitando a estas, plasmídeos, cromossomas artificiais lineares, sistemas complexos com lipídeos, encapsulados dentro de lipossomas e, nas modalidades, encapsulados em uma partícula viral, particularmente uma partícula de AAV. Um vetor de rAAV pode ser acondicionado em um capsídeo de vírus AAV para gerar uma "partícula viral adeno-associada recombinante (partícula de rAAV)". As funções auxiliares de AAV (isto é, funções que permitem que o AAV seja replicado e acondicionado por uma célula hospedeira) podem ser fornecidas em qualquer uma de várias formas, incluindo, mas não limitado a estas, vírus auxiliares ou genes de vírus auxiliar que ajudam na replicação do AAV e acondicionamento. Outras funções auxiliares de AAV são conhecidas na técnica.
[0063] Um "vírus rAAV" ou "partícula viral de rAAV" refere-se a uma partícula viral composta de pelo menos uma proteína do capsídeo de AAV e um genoma do vetor de rAAV encapsulado.
[0064] "Heterólogo"significa derivados de uma entidade genotípica distinta do resto da entidade para a qual é comparada ou na qual é introduzida ou incorporada. Por exemplo, um ácido nucleico introduzido por técnicas de engenharia genética em um tipo de célula diferente é um ácido nucleico heterólogo (e, quando expresso, pode codificar um polipeptídeo heterólogo). De modo semelhante, uma sequência celular (por exemplo, um gene ou uma parte do mesmo) que é incorporada em um vetor viral é uma sequência de nucleotídeo heteróloga em relação ao vetor.
[0065] O termo "transgene" refere-se a um ácido nucleico que é introduzido em uma célula e é capaz de ser transcrito no RNA e opcionalmente, transladado e/ou expresso sob condições apropriadas. Nos aspectos, ele confere uma propriedade desejada a uma célula na qual foi introduzido, ou conduz de outro modo a um resultado terapêutico ou diagnóstico desejado. Em outro aspecto, pode ser transcrito em uma molécula que medeia a interferência do RNA, tal como siRNA.
[0066] Os termos "partículas de genoma (gp)", "equivalentes de genoma" ou "cópias de genoma", como utilizados em referência a um título viral, referem-se ao número de vírions contendo o genoma de DNA do AAV recombinante, independentemente da possibilidade de contaminação ou funcionalidade. O número de partículas do genoma em uma preparação de vetor particular pode ser medido por procedimentos tais como descrito nos Exemplos neste documento, ou, por exemplo, em Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.
[0067] Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa" ou "unidade de replicação"como utilizado em referência a um título viral, referem-se ao número de partículas de vetor do AAV recombinante e competente para infecção e replicação como medido pelo ensaio central infeccioso, também conhecido como ensaio central de replicação, como descrito, por exemplo, em McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:19631973.
[0068] O termo "unidade de transdução (tu)" como utilizado em referência a um título viral, refere-se ao número de partículas de vetor de AAV recombinante infeccioso que resultam na produção de um produto transgênico funcional medido em ensaios funcionais tais como aqui descrito nos Exemplos, ou por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; or in Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensaio LFU).
[0069] Uma sequência de "repetição terminal invertida" ou "ITR"é um termo bem compreendido na técnica e refere-se às sequências relativamente curtas encontradas nos terminais de genomas virais que estão em orientação oposta.
[0070] Uma sequência de "repetição terminal invertida do AAV" (ITR), um termo bem compreendido na técnica, é uma sequência de aproximadamente 145 nucleotídeos que está presente em ambos os terminais do genoma de AAV de filamento único nativo. Os 125 nucleotídeos mais externos do ITR podem estar presentes em qualquer uma de duas orientações alternativas, levando à heterogeneidade entre diferentes genomas de AAV e entre as duas extremidades de um único genoma de AAV. Os 125 nucleotídeos mais externos também contêm várias regiões mais curtas de auto-complementaridade (designadas regiões A, A', B, B', C, C' e D), o que permite o emparelhamento de bases intra-filamentos ocorra dentro da mesma parte da ITR.
[0071] Uma "sequência de resolução terminal" ou "trs"é uma sequência na região D da ITR de AAV que é clivada por proteínas rep do AAV durante a replicação de DNA viral. Uma sequência de resolução de terminal mutante é refratária à clivagem por proteínas rep de AAV.
[0072] Um "vírus auxiliar" para AAV refere-se a um vírus que permite que o AAV (que é um parvovírus com defeito) seja replicado e acondicionado por uma célula hospedeira. Vários do mesmos vírus auxiliares foram identificados, incluindo adenovírus, herpesvírus e poxvírus tais como varíola. Os adenovírus abrangem vários subgrupos diferentes, embora o adenovírus tipo 5 do subgrupo C (Ad5) seja o mais utilizado. Numerosos adenovírus de origem de mamífero humano, não humano e aviária são conhecidos e estão disponíveis a partir de depósitos tais como a ATCC. Os vírus da família do herpes, que também estão disponíveis a partir de depósitos tais como ATCC, incluem, por exemplo, o vírus do herpes simples (HSV), o vírus Epstein-Barr (EBV), citomegalovírus (CMV) e o vírus da pseudoraiva (PRV).
[0073] "Porcentagem (%) de identidade de sequência"em relação a um polipeptídeo de referência ou sequência de ácido nucleico é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido ou nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido ou nucleotídeos no polipeptídeo de referência ou sequência de ácido nucleico, após o alinhamento das sequências e lacunas de introdução, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadora como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácido ou ácido nucleico pode ser conseguido de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, utilizando programas de software de computador publicamente disponíveis, por exemplo, aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, section 7.7.18, Table 7.7.1, e incluindo o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Um programa de alinhamento preferido é ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo em todo o comprimento das sequências sendo comparadas. Para os propósitos neste documento, a % de identidade de sequência de aminoácido de uma determinada sequência de aminoácido A com, ou contra uma determinada sequência de aminoácido B (que pode alternativamente ser expressa como uma determinada sequência de aminoácido A que possui ou compreende uma certa % de identidade de sequência de aminoácido, com, ou contra uma dada sequência de aminoácido B) é calculada como se segue: 100 vezes a fração X/Y, em que X é o número de resíduos de aminoácidos marcados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências naquele alinhamento de programa de A e B e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Será observado que onde o comprimento da sequência de aminoácido A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácido B, a % de identidade de sequência de aminoácido de A para B não será igual à % de identidade de sequência de aminoácido de B para A. Para os propósitos neste documento, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de uma determinada sequência de ácido nucleico C com, ou contra uma determinada sequência de ácido nucleico D (que pode alternativamente ser formulada como uma determinada sequência de ácido nucleico C que possui ou compreende uma certa % de identidade de sequência de ácido nucleico com, com ou contra uma dada sequência de ácido nucleico D) é calculada como se segue: 100 vezes a fração W/Z, onde W é o número de nucleotídeos marcados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequências no alinhamento de programa de C e D, onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será observado que onde o comprimento da sequência de ácido nucleico C não é Igual ao comprimento da sequência de ácido nucleico D, a % de identidade de sequência de ácido nucleico de C para D não será igual à % de identidade de sequência de ácido nucleico de D para C.
[0074] Uma molécula ou célula "isolada" (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) significa que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente do seu ambiente natural.
[0075] Uma "quantidade eficaz"é uma quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos (por exemplo, melhora dos sintomas, realização dos parâmetros clínicos, e outros mais). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Em termos de um estado doentio, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para melhorar, estabilizar ou retardar o desenvolvimento de uma doença. Por exemplo, uma quantidade eficaz de uma partícula de rAAV expressa uma quantidade desejada de ácido nucleico heterólogo tal como um polipeptídeo terapêutico ou ácido nucleico terapêutico.
[0076] Um "indivíduo" ou "paciente" é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não são limitados a estes, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não humanos tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o indivíduo ou paciente é um ser humano.
[0077] Como aqui utilizado, "tratamento"é uma abordagem para obter resultados clínicos benéficos ou desejados. Para os propósitos da mesma invenção, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não são limitados a estes, alívio de sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (por exemplo, não pior) da doença, prevenção da propagação (por exemplo, metástase) da doença, protelação ou retardo da progressão da doença, melhora ou alívio do estado doentio, e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável. "Tratamento"também pode significar prolongamento da sobrevivência em comparação com a sobrevivência esperada se não receber tratamento.
[0078] O termo "malha trabecular" tal como aqui utilizado refere-se a um tecido tipo esponja localizado perto da córnea e íris que funciona para drenar o humor aquoso do olho para dentro do sangue. Um tecido tipo esponja localizado perto da córnea e íris que funciona para drenar o humor aquoso do olho para dentro do sangue. A malha trabecular contém espaços alinhados com o endotélio (os espaços intertrabeculares) através dos quais passa o humor aquoso para o canal de Schlemm. Geralmente é dividida em duas partes: a malha corneoescleral que está em contato com a córnea e a esclera e se abre no canal de Schlemm e a malha uveal que está de fronte a câmara anterior.
[0079] O termo "retina central" como aqui utilizado refere-se à mácula externa e/ou à mácula interna e/ou à fóvea. O termo "tipos de células de retina central" como aqui utilizado refere-se aos tipos de células da retina central, tais como, por exemplo, RPE e células fotorreceptoras.
[0080] O termo "mácula"refere-se a uma região da retina central nos primatas que contém uma concentração relativa mais elevada de células fotorreceptoras, especificamente bastonetes e cones, em comparação com a retina periférica. O termo "mácula externa" como aqui utilizado também pode ser referido como a "mácula periférica". O termo "mácula interna" como aqui utilizado também pode ser referido como a "mácula central".
[0081] O termo "fóvea"refere-se a uma pequena região na retina central de primatas de aproximadamente igual ou menor do que 0,5 mm de diâmetro que contém uma concentração relativa mais elevada de células fotorreceptoras, especificamente cones, quando comparada com a retina periférica e a mácula.
[0082] O termo "espaço subretinal" como aqui utilizado refere-se à localização na retina entre as células fotorreceptoras e as células do epitélio pigmentar da retina. O espaço subretinal pode ser um espaço potencial, tal como antes de qualquer injeção subretinal de fluido. O espaço subretinal também pode conter um fluido que é injetado no espaço potencial. Neste caso, o fluido está "em contacto com o espaço subretinal". As células que estão "em contato com o espaço subretinal" incluem as células que delimitam o espaço subretinal, tais como as células RPE e fotorreceptoras.
[0083] O termo "bolha" como aqui utilizado refere-se a um espaço fluido dentro do espaço subretinal de um olho. Uma bolha da invenção pode ser criada por uma única injeção de fluido em um único espaço, através de múltiplas injeções de um ou mais fluidos no mesmo espaço, ou através de múltiplas injeções em múltiplos espaços, os quais, quando reposicionados criam um espaço total de fluido útil para atingir um efeito terapêutico sobre a parte desejada do espaço subretinal.
[0084] "Promotor de ß-actina de galinha (CBA)" refere-se a uma sequência de polinucleotídeo derivada de um gene de ß-actina de galinha (por exemplo, Gallus gallus beta actina, representada por GenBank Entrez Gene ID 396526). Como aqui utilizado, o "promotor de ß-actina de galinha" pode referir-se a um promotor contendo um elemento intensificador precoce de citomegalovírus (CMV), o promotor e primeiro éxon e íntron do gene de ß-actina de galinha e o aceitante de união do gene de beta-globina de coelho, tal como as sequências descritas em Miyazaki, J., et al. (1989) Gene 79(2):269-77. Como aqui utilizado, o termo "intensificador precoce de CVM/promotor de beta- actina de galinha (CAG)" pode ser utilizado de modo trocável.
[0085] "Miocilina (MYOC)" refere-se a uma proteína (ou gene que codifica dita proteína) implicada na função do citoesqueleto, aderência celular, sinalização celular e migração celular, também conhecida como resposta de glucocorticóide induzível pela malha trabecular, GPOA, TIGR, GLC1A, JOAG e JOAG1. A miocilina é expressa como uma proteína secretada em muitos tipos diferentes de células. No olho, a miocilina é suposta de ser secretada no humor aquoso pela malha trabecular, um tecido que é crítico na regulação da pressão intra-ocular (PIO). Conforme descrito acima, a mutações na miocilina são supostas de serem responsáveis por um subconjunto de casos de glaucoma primário de ângulo aberto, particularmente a forma juvenil do distúrbio.
[0086] Como aqui utilizado, a "miocilina" pode referir-se a um precursor de comprimento completo assim como a quaisquer formas processadas da proteína (por exemplo, uma forma secretada de proteína madura a partir de uma célula). Exemplos de proteínas de miocilina podem incluir sem limitação a miocilina humana, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, NCBI Reference Sequences NP_000252, NP_034995, NP_001041495, e NP_001265779. Exemplos de genes de miocilina podem incluir sem limitação os genes de miocilina de ser humano, de rato, de cão e de gato, por exemplo, GenBank Entrez Gene ID 4653 (MYOC, a.k.a. GPOA, JOAG, TIGR, GLC1A, e JOAG1), GenBank Entrez Gene ID 17926 (Myoc, a.k.a. TIGR, GLC1A, e AI957332), GenBank Entrez Gene ID 490344, e GenBank Entrez Gene ID 101087632.
[0087] "R-espondina 1 (RSPO1)" refere-se a um membro da família R-espondina implicada na modulação da sinalização de Wnt. O termo “RSPO1” pode referir-se a uma proteína de RSPO1 ou a um gene que codifica uma proteína de RSPO1. Membros de uma superfamília de proteínas contendo repetição de trombospondina tipo 1 (TSR-1), as R- spondinas incluem um peptídeo de sinal, um domínio de TSR-1 e duas repetições semelhantes a furina. Embora o mecanismo exato não seja claro, os polipeptídeos da família de R-espondina são supostos de ativar a sinalização de Wnt. Para uma outra descrição das conexões entre as R-espondinas e a sinalização de Wnt, ver, por exemplo, Kim, K.A. et al. (2006) Cell Cycle 5:23-26; Kim, K.A. et al. (2008) Mol. Biol. Cell. 19:2588-2596; Jin, Y.R. and Yoon, J.K. (2012) Int. J. Biochem. Cell Biol. 44:2278-2287; e de Lau, W.B., et al. (2012) Genome Biol. 13(3):242.
[0088] Como aqui utilizado, a "RSPO1" pode referir-se a um precursor de comprimento total assim como quaisquer formas processadas da proteína (por exemplo, uma proteína madura secretada de uma célula). Exemplos de proteínas de RSPO1 podem incluir, sem limitação, RSPO1 humana, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, NCBI Reference Sequences NP_001229837, NP_619624, XP_00562890, e XP_003989918. Exemplos de genes de RSPO1 podem incluir sem limitação os genes de RSPO1 de ser humano, de rato, de cão e de gato, por exemplo, GenBank Entrez Gene ID 284654 (RSPO1, a.k.a. RSPO e CRISTIN3), GenBank Entrez Gene ID 192199 (Rspo1, a.k.a. Rspondin e R-spondin), GenBank Entrez Gene ID 608179, e GenBank Entrez Gene ID 101091033. Em algumas modalidades, a RSPO1 é uma variante funcional de uma RSPO1. Em algumas modalidades, uma variante de RSPO1 funcional pode incluir uma ou mais substituições, inserções e/ou eliminações de aminoácido (por exemplo, truncações), mas retém alguma ou toda a atividade em relação a uma ou mais atividades da RSPO1 de comprimento total (por exemplo, atividade de sinalização de Wnt, ensaios para os quais são aqui descritos e/ou exemplificados). Em algumas modalidades, a variante de RSPO1 funcional é uma RSPO1 truncada. Exemplos de polipeptídeos de RSPO1 truncados incluem, sem limitação, as SEQ ID NOs: 11 e 12, ou as formas processadas da SEQ ID NOs: 11 e 12 que carecem do peptídeo de sinal.
[0089] A "R-espondina 2 (RSPO2)" refere-se a um membro da família de R-espondina implicada na modulação da sinalização de Wnt. O termo “RSPO2” pode referir-se a uma proteína de RSPO2 ou a um gene que codifica uma proteína de RSPO2. Membros de uma superfamília de proteínas contendo repetição de trombospondina tipo 1 (TSR-1), as R-espondinas incluem um peptídeo de sinal, um domínio TSR-1 e duas repetições semelhantes a furina. Embora o mecanismo exato não seja claro, os polipeptídeos da família de R-espondina são supostos de ativar a sinalização de Wnt. Para outra descrição das conexões entre as R-espondinas e a sinalização de Wnt, ver, por exemplo, Kim, K.A. et al. (2006) Cell Cycle 5:23-26; Kim, K.A. et al. (2008) Mol. Biol. Cell. 19:2588-2596; Jin, Y.R. and Yoon, J.K. (2012) Int. J. Biochem. Cell Biol. 44:2278-2287; e de Lau, W.B., et al. (2012) Genome Biol. 13(3):242.
[0090] Como aqui utilizado, a "RSPO2" pode referir-se a um precursor de comprimento completo assim como quaisquer formas processadas da proteína (por exemplo, uma proteína madura secretada a partir de uma célula). Exemplos de proteínas de RSPO2 podem incluir sem limitação a RSPO2 de humana, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, NCBI Reference Sequences NP_848660, NP_766403, XP_005627927, e XP_004000104. Exemplos de genes de RSPO2 podem incluir sem limitação os genes de RSPO2 de ser humano, de rato, de cão e de gato, por exemplo, GenBank Entrez Gene ID 340419 (RSPO2, a.k.a. CRISTIN2), GenBank Entrez Gene ID 239405 (Rspo2, a.k.a. ftls, AA673245, D430027K22 e 2610028F08Rik), GenBank Entrez Gene ID 482004, e GenBank Entrez Gene ID 101087380. Em algumas modalidades, a RSPO2 é uma variante funcional de uma RSPO2. Em algumas modalidades, uma variante funcional de RSPO2 pode incluir uma ou mais substituições, inserções e/ou eliminações de aminoácido (por exemplo, truncações), mas retêm alguma ou toda a atividade em relação a uma ou mais atividades da RSPO2 de comprimento total (por exemplo, atividade de sinalização de Wnt, ensaios para os quais são aqui descritos e/ou exemplificados). Em algumas modalidades, a variante de RSPO2 funcional é uma RSPO2 truncada. Exemplos de polipeptídeos de RSPO2 truncados incluem sem limitação as SEQ ID NOs: 13 e 14, ou formas processadas da SEQ ID NOs: 13 e 14 que carecem do peptídeo de sinal.
[0091] "R-espondina 3 (RSPO3)" refere-se a um membro da família de R-espondina implicada na modulação da sinalização de Wnt. O termo “RSPO3” pode referir-se a uma proteína de RSPO3 ou a um gene que codifica uma proteína de RSPO3. Membros de uma superfamília de proteínas contendo repetição de trombospondina tipo 1 (TSR-1), as R- espondinas incluem um peptídeo de sinal, um domínio de TSR-1 e duas repetições semelhantes a furina. Embora o mecanismo exato não seja claro, a RSPO3 é suposta de ativar a sinalização de Wnt e a perda da função de RSPO3 em camundongos e Xenopus resulta em fenótipos de perda de função de Wnt (Kazanskaya, O., et al. (2008) Development 135:3655-64). Para outra descrição das conexões entre as R- espondinas e a sinalização de Wnt, ver, por exemplo, de Lau, W.B., et al. (2012) Genome Biol. 13(3):242.
[0092] Como aqui utilizado, a "RSPO3" pode referir-se a um precursor de comprimento completo assim como a quaisquer formas processadas da proteína (por exemplo, uma proteína madura secretada a partir de uma célula). Exemplos de proteínas de RSPO3 podem incluir sem limitação a RSPO3 humana, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, NCBI Reference Sequences NP_116173, NP_082627, XP_005615677, e XP_003986583. Exemplos de genes de RSPO3 podem incluir sem limitação genes de RSPO3 de ser humano, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, GenBank Entrez Gene ID 84870 (RSPO3, a.k.a. PWTSR, THSD2, e CRISTIN1), GenBank Entrez Gene ID 72780 (Rspo3, a.k.a. Thsd2, Cristin1, AW742308, e 2810459H04Rik), GenBank Entrez Gene ID 476287, e GenBank Entrez Gene ID 101085635. Em algumas modalidades, a RSPO3 é uma variante funcional de uma RSPO3. Em algumas modalidades, uma variante funcional de RSPO3 pode incluir uma ou mais substituições, inserções e/ou eliminações de aminoácido (por exemplo, truncações), mas retém alguma ou toda a atividade em relação a uma ou mais atividades da RSPO3 de comprimento total (por exemplo, atividade de sinalização de Wnt, ensaios para a qual são aqui descritos e/ou exemplificados). Em algumas modalidades, a variante de RSPO3 funcional é uma RSPO3 truncada. Exemplos de polipeptídeos de RSPO3 truncados incluem sem limitação as SEQ ID NOs: 15 a 17, ou formas processadas da SEQ ID NOs: 15 a 17 que carecem do peptídeo de sinal.
[0093] A "R-espondina 4 (RSPO4)" refere-se a um membro da família de R-espondina implicada na modulação da sinalização de Wnt. O termo “RSPO4” pode referir-se a uma proteína de RSPO4 ou um gene que codifica uma proteína de RSPO4. Membros de uma superfamília de proteínas contendo repetição de trombospondina tipo 1 (TSR-1), as R- spondinas incluem um peptídeo de sinal, um domínio de TSR-1 e duas repetições semelhantes a furina. Embora o mecanismo exato não seja claro, os polipeptídeos da família de R-espondina são supostos de ativar a sinalização de Wnt. Para outra descrição das conexões entre as R- espondinas e a sinalização de Wnt, ver, por exemplo, Kim, K.A. et al. (2006) Cell Cycle 5:23-26; Kim, K.A. et al. (2008) Mol. Biol. Cell. 19:2588-2596; Jin, Y.R. and Yoon, J.K. (2012) Int. J. Biochem. Cell Biol. 44:2278-2287; and de Lau, W.B., et al. (2012) Genome Biol. 13(3):242.
[0094] Como aqui utilizada, a "RSPO4" pode referir-se a um precursor de comprimento total assim como a quaisquer formas processadas da proteína (por exemplo, uma proteína madura secretada a partir de uma célula). Exemplos de proteínas de RSPO4 podem incluir sem limitação a RSPO4 humana, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, NCBI Reference Sequences NP_001025042, NP_001035779, XP_542937, e XP_011279253. Exemplos de genes de RSPO4 podem incluir sem limitação genes de RSPO4 de ser humano, de camundongo, de cão e de gato, por exemplo, GenBank Entrez Gene ID 343637 (RSPO4, a.k.a. CRISTIN4 e C20orf182), GenBank Entrez Gene ID 228770 (Rspo4, a.k.a. A730099F22 e A930029K19Rik), GenBank Entrez Gene ID 485813, e GenBank Entrez Gene ID 101091527. Em certas modalidades, a RSPO4 é uma variante funcional de uma RSPO4. Em certas modalidades, uma variante de RSPO4 funcional pode incluir uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido (por exemplo, truncações), mas retém alguma ou toda a atividade em relação a uma ou mais atividades da RSPO4 de comprimento total (por exemplo, atividade de sinalização de Wnt, ensaios para a qual são aqui descritos e/ou exemplificados). Em algumas modalidades, a variante de RSPO4 funcional é uma RSPO4 truncada. Exemplos de polipeptídeos de RSPO4 truncados incluem sem limitação as SEQ ID NOs: 18 e 19, ou formas processadas da SEQ ID NOs: 18 e 19 que carecem do peptídeo de sinal.
[0095] Como aqui utilizado "interferência de RNA (RNAi)"é um processo biológico no qual as moléculas de RNA inibem a expressão de genes, tipicamente através da indução da destruição de moléculas de mRNA específicas. Exemplos de RNAi incluem pequeno RNA inibitório (siRNA), micro RNA (miRNA), pequeno RNA grampo de cabelo (shRNA).
[0096] Como aqui utilizado, um "pequeno RNA grampo de cabelo " ou "RNA grampo de cabelo curto" (shRNA) é uma molécula de RNA que faz um grampo de cabelo estreito girar, o qual pode ser utilizado para silenciar a expressão do gene alvo; por exemplo, através da interferência de RNA.
[0097] "Sinalização de Wnt" refere-se a um grupo de vias de sinalização celular relacionadas que são reguladas pela interação entre uma proteína Wnt e um receptor da família Frizzled (Fz) (para uma revisão, ver, por exemplo, Logan, C.Y., and Nusse, R. (2004) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20:781-810). Estas vias foram implicadas em uma ampla disposição de processos de desenvolvimento e patogênicos. Como aqui utilizado, a não ser que de outra maneira especificada, o termo "sinalização de Wnt" pode referir-se à parte ou a totalidade da via de Wnt canônica, a via de Wnt/polaridade celular planar (PCP) e/ou a via de Wnt/cálcio. Por exemplo, na via de Wnt canônica, a ligação de Wnt ao complexo receptor Frizzled/LRP resulta na modulação da atividade de Disheveled (Dsh), Axin, Adenomatous Polyposis Coli (APC) e glicogênio sintase cinase (GSK-3), em última análise inibindo a degradação da beta-catenina. A beta-catenina é então capaz de translocar para o núcleo e regular a transcrição do gene, por exemplo, em conjunto com os fatores de transcrição fator de ligação ao intensificador de linfóide 1/fator de transcrição específico da célula T (LEF/TCF). Em algumas modalidades, a atividade de beta-catenina pode ser analisada como uma leitura para a sinalização de Wnt (por exemplo, por um ensaio TOP-Flash, tal como aquele caracterizado em Molenaar, M., et al. (1996) Cell 86(3):391-9).
[0098] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) as modalidades que são direcionadas para esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente à "cerca de X" inclui descrição de "X".
[0099] Como aqui utilizado, a forma singular dos artigos "um", "uma", "o" e "a" inclui referências plurais a menos que indicado de outra forma.
[00100] Fica entendido que os aspectos e as modalidades da invenção aqui descritas incluem "compreendendo", "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente de" aspectos e modalidades.
IV. . Métodos de Tratamento
[00101] A invenção fornece métodos de terapia genética para glaucoma de miocilina (MYOC) em que as partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos são administradas ao olho de um mamífero. Em algumas modalidades, o glaucoma primário de ângulo aberto (POAC) de glaucoma de miocilina (MYOC). Em algumas modalidades, o glaucoma de miocilina (MYOC) é a forma juvenil de glaucoma primário de ângulo aberto (JOAC). Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano (por exemplo, um ser humano com POAC ou um ser humano com JOAC). Em certas modalidades, o mamífero com glaucoma de miocilina (MYOC) possui uma MYOC modificada. Em algumas modalidades, a MYOC modificada compreende uma ou mais substituições de aminoácido correspondentes a E323K, K398R, Q368X, G364V, P370L, D380A, K423E, Y437H e I477S de MYOC humana. Em algumas modalidades, o gene de MYOC submetido a mutação compreende uma ou mais substituições de aminoácido que corresponde às substituições de aminoácido P370L e/ou Y437H de MYOC humana. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um ser humano compreendendo a administração no olho do ser humano de uma quantidade eficaz de partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e/ou RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA). Em algumas modalidades, os métodos da invenção são utilizados para reduzir um sintoma de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero; por exemplo, redução da pressão intra-ocular, redução do acúmulo de MYOC na malha trabecular, redução da hipertensão ocular ou aumento da saída aquosa da malha trabecular.
[00102] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo um distúrbio ocular, compreendendo a administração no olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional. Em certas modalidades, a invenção fornece métodos para intensificar a sinalização de Wnt nas células de malha trabecular em um mamífero tendo um distúrbio ocular, compreendendo a administração ao olho do mamífero de uma partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) compreendendo um vetor que codifica um RNA de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) no mamífero. Em certas modalidades, a sinalização de Wnt é melhorada utilizando uma ou mais partículas virais que expressam RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e/ou RNAi de MYOC; por exemplo, a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e RNAi de MYOC podem ser expressas a partir de vetores de rAAV com diferentes genomas virais recombinantes ou do mesmo genoma viral de rAAV.
Vetores terapêuticos
[00103] A invenção fornece métodos de terapia genética para glaucoma de miocilina (MYOC) em que as partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos são liberadas no olho de um mamífero; por exemplo, o vetor terapêutico pode codificar um ácido nucleico terapêutico e/ou um polipeptídeo terapêutico. Um vetor de AAV terapêutico que codifica um ácido nucleico terapêutico e/ou um polipeptídeo terapêutico pode ser gerado utilizando mpetodos conhecidos na técnica, utilizando a síntese padrão e métodos recombinantes. Em certas modalidades, o polipeptídeo terapêutico é um polipeptídeo que estimula a sinalização de Wnt. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico estimula a sinalização de Wnt na presença de uma MYOC mutante. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico estimula a sinalização de Wnt na presença de uma MYOC mutante humana. Em certas modalidades, o polipeptídeo terapêutico estimula a sinalização de Wnt na presença de uma MYOC mutante humana associada com glaucoma. Em certas modalidades, a MYOC mutante compreende uma substituição de aminoácido P370L e/ou Y437H. Em algumas modalidades, a MYOC modificada compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que correspondem a E323K, K398R, Q368X, G364V, P370L, D380A, K423E, Y437H e I477S da MYOC humana.
[00104] Em algumas modalidades, a invenção fornece vetores de rAAV para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em que os vetores de rAAV codificam um polipeptídeo de R-espondina (RSPO) (por exemplo, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma). Em certas modalidades, o polipeptídeo de RSPO1 é uma RSPO1 humana. Em algumas modalidades, a RSPO1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8, ou uma variante funcional da mesma. Um exemplo de uma variante funcional de RSPO1 inclui uma RSPO1 que possui uma ou mais substituições, adições e/ou eliminações de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8. Em certas modalidades, a RSPO1 variante compreende uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 substituições, adições e/ou eliminações da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 enquanto mantém a capacidade de estimular a sinalização de Wnt (por exemplo, na presença de uma MYOC mutante). Em algumas modalidades, a RSPO1 variante possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, a RSPO1 é uma RSPO1 truncada. Em certas modalidades, a RSPO1 truncada pode incluir um ou mais domínios ricos em Cys semelhante a furina (por exemplo, FU1 e/ou FU2), mas carece de um ou mais de: um peptídeo de sinal, um domínio de trombospondina tipo 1 (por exemplo, TSR-1 ou TSP1), e/ou um domínio C-terminal positivamente carregado (por exemplo, incluindo um domínio NLS e/ou BR bipartido; para referência, ver as Figuras 11 a 13C). Em certas modalidades, a RSPO1 truncado pode compreender as SEQ ID NOs: 11 e/ou 12, ou as formas processadas da SEQ ID NOs: 11 e/ou 12 que carecem do peptídeo de sinal. Em certas modalidades, a RSPO1 truncada possui uma identidade de mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % da SEQ ID NOs: 11 e/ou 12. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de RSPO2 é uma RSPO2 humana. Em certas modalidades, a RSPO2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, ou uma variante funcional da mesma. Um exemplo de uma variante funcional de RSPO2 inclui uma RSPO2 que possui uma ou mais substituições, adições e/ou eliminações de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9. Em certas modalidades, a RSPO2 variante compreende uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 substituições, adições e/ou eliminações da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9 enquanto que mantém a capacidade de estimular a sinalização de Wnt (por exemplo, na presença de uma MYOC mutante). Em algumas modalidades, a RSPO2 variante possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95%, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 9. Em algumas modalidades, a RSPO2 é uma RSPO2 truncada. Em certas modalidades, a RSPO2 truncada pode incluir um ou mais domínios ricos em Cys semelhantes a furina (por exemplo, FU1 e/ou FU2) mas carecem de um ou mais de: um peptídeo de sinal, um domínio de trombospondina do tipo 1 (por exemplo, TSR-1 ou TSP1), e/ou um domínio C-terminal positivamente carregado (por exemplo, incluindo um domínio NLS e/ou BR bipartido, para referência, ver as Figuras 11-13C). Em certas modalidades, a RSPO2 truncada pode compreender as SEQ ID NOs: 13 e/ou 14, ou formas processadas da SEQ ID NOs: 13 e/ou 14 que carecem do peptídeo de sinal. Em certas modalidades, a RSPO2 truncada possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91%, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com as SEQ ID NOs: 13 e/ou 14. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de RSPO3 é uma RSPO3 humana. Em certas modalidades, a RSPO3 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, ou uma variante funcional da mesma. Um exemplo de uma variante funcional de RSPO3 inclui uma RSPO3 que possui uma ou mais substituições, adições e/ou eliminações de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a RSPO3 variante compreende uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 substituições, adições e/ou eliminações da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 1 enquanto mantém a capacidade de estimular a sinalização de Wnt (por exemplo, na presença de uma MYOC mutante). Em certas modalidades, a RSPO3 variante possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a RSPO3 é uma RSPO3 truncada. Em certas modalidades, a RSPO3 truncada pode incluir um ou mais domínios ricos em Cys semelhantes a furina (por exemplo, FU1 e/ou FU2) mas carece de um ou mais de: um peptídeo de sinal, um domínio de trombospondina do tipo 1 (por exemplo, TSR-1 ou TSP1), e/ou um domínio C-terminal positivamente carregado (por exemplo, incluindo um domínio NLS e/ou BR bipartido; para referência, ver as FiGS. 11-13C). Em certas modalidades, a RSPO3 truncada pode compreender as SEQ ID NOs: 15, 16 e/ou 17, ou as formas processadas da SEQ ID NOs: 15, 16 e/ou 17 que são desprovidas do peptídeo de sinal. Em certas modalidades, a RSPO3 truncada possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com as SEQ ID NOs: 15, 16 e/ou 17. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de RSPO4 é uma RSPO4 humana. Em algumas modalidades, a RSPO4 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9, ou uma variante funcional da mesma. Um exemplo de uma variante funcional de RSPO2 inclui uma RSPO2 que possui uma ou mais substituições, adições e/ou eliminações de aminoácido da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a RSPO4 variante compreende uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 substituições, adições e/ou eliminações da sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 10 enquanto que mantém a capacidade de estimular a sinalização de Wnt (por exemplo, na presença de uma MYOC mutante). Em algumas modalidades, a RSPO4 variante possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % de identidade com a SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a RSPO4 é uma RSPO4 truncada. Em certas modalidades, a RSPO4 truncado pode incluir um ou mais domínios ricos em Cys semelhantes a furina (por exemplo, FU1 e/ou FU2) mas carece de um ou mais de: um peptídeo de sinal, um domínio de trombospondina do tipo 1 (por exemplo, TSR-1 Ou TSP1), e/ou um domínio C-terminal positivamente carregado (por exemplo, incluindo um domínio NLS e/ou BR bipartido, para referência, ver as Figuras 11-13C). Em certas modalidades, a RSPO4 truncada pode compreender as SEQ ID NOs: 18 e/ou 19, ou as formas processadas da SEQ ID NOs: 18 e 19 que carecem do peptídeo de sinal. Em certas modalidades, a RSPO4 truncada possui mais do que cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94%, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % de identidade com as SEQ ID NOs: 18 e/ou 19.
[00105] Em certas modalidades, o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma ligada de maneira operável a um promotor. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional no olho do mamífero. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional nas células da malha trabecular. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA).
[00106] A invenção fornece métodos de terapia genética para glaucoma de miocilina (MYOC) em que as partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos são liberadas no olho de um mamífero; por exemplo, o vetor terapêutico pode codificar um ácido nucleico terapêutico e/ou um polipeptídeo terapêutico. Um vetor de AAV terapêutico que codifica um ácido nucleico terapêutico e/ou polipeptídeo terapêutico pode ser gerado utilizando métodos conhecidos na técnica, utilizando a síntese padrão e métodos recombinantes. Em algumas modalidades, o ácido nucleico terapêutico codifica um RNA que direciona a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de MYOC. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de uma MYOC mutante. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de uma MYOC humana mutante. Em algumas modalidades, a MYOC humana mutante compreende uma substituição de aminoácidos P370L e/ou uma substituição de aminoácido Y437. Exemplos não limitativos de ácido nucleico terapêutico incluem RNAi, RNA inibitório pequeno (siRNA), micro RNA (miRNA), pequeno RNA grampo de cabelo (shRNA) e/ou ribozimas (tais como ribozimas de cabeça de martelo e grampo de cabelo). Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de MYOC é um shRNA que reduz ou inibe a expressão de MYOC (por exemplo, MYOC do tipo selvagem e mutante).
[00107] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de terapia genética para glaucoma de miocilina (MYOC) em que as partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos são liberadas no olho de um mamífero em que os vetores compreendem ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos terapêuticos. As partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos podem ser geradas utilizando métodos conhecidos na técnica, utilizando a síntese padrão e métodos recombinantes. Em algumas modalidades, o vetor codifica um polipeptídeo terapêutico. Em certas modalidades, o polipeptídeo terapêutico direciona a sinalização de Wnt. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico estimula a sinalização de Wnt.
[00108] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de terapia genética para glaucoma de miocilina (MYOC) em que as partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos são administradas ao olho de um mamífero em que os vetores compreendem ácido nucleico que codifica um ou mais polipeptídeos terapêuticos e um ou mais ácidos nucleicos terapêuticos. As partículas de rAAV compreendendo vetores terapêuticos podem ser geradas utilizando métodos conhecidos na técnica, utilizando a síntese padrão e métodos recombinantes. Em certas modalidades, o polipeptídeo terapêutico direciona a sinalização de Wnt e o ácido nucleico terapêutico direciona a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico estimula a sinalização de Wnt. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de MYOC. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de uma MYOC mutante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de uma MYOC humana mutante. Em algumas modalidades, a MYOC humana mutante compreende uma substituição de aminoácidos P370L e/ou uma substituição de aminoácido Y437. Exemplos não limitativos de ácido nucleico terapêutico incluem RNAi, siRNA, miRNA, shRNA e/ou ribozimas.
[00109] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de terapia genética para glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero em que as partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais polipeptídeos terapêuticos são administradas ao mamífero e as partículas de rAAV compreendem vetores que codificam um ou mais ácidos nucleicos terapêuticos são administradas ao mamífero. Em certas modalidades, o polipeptídeo terapêutico direciona a sinalização de Wnt e o ácido nucleico terapêutico direciona a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o polipeptídeo terapêutico estimula a sinalização de Wnt. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de uma MYOC mutante. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo codifica um RNA que reduz ou inibe a expressão de uma MYOC humana mutante. Em algumas modalidades, a MYOC humana mutante compreende uma substituição de aminoácido P370L e/ou uma substituição de aminoácido Y437. Exemplos não limitativos de ácido nucleico terapêutico incluem RNAi, siRNA, miRNA, shRNA e/ou ribozimas. As partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais polipeptídeos terapêuticos e as partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais ácidos nucleicos terapêuticos podem ser administrados ao mamífero simultânea ou sequencialmente. Em certas modalidades, as partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais polipeptídeos terapêuticos são administradas antes das partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais ácidos nucleicos terapêuticos. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais polipeptídeos terapêuticos são administrados após as partículas de rAAV compreendendo vetores que codificam um ou mais ácidos nucleicos terapêuticos a serem administrados.
[00110] Os ácidos nucleicos da invenção podem codificar polipeptídeos que são proteínas intracelulares, ancorados na membrana celular, permanecem dentro da célula ou são secretados pela célula transduzida com os vetores da invenção. Para polipeptídeos secretados pela célula que recebe o vetor; de preferência o polipeptídeo é solúvel (isto é, não ligado à célula). Por exemplo, os polipeptídeos solúveis são desprovidos de uma região transmembranar e são secretados a partir da célula. As técnicas para identificar e remover as sequências de ácido nucleico que codificam os domínios da transmembrana são conhecidas na especialidade.
[00111] Os vetores que podem ser administrados de acordo com a presente invenção também incluem vetores compreendendo um ácido nucleico que codifica um RNA (por exemplo, shRNA, RNAi, ribozimas, miRNA, siRNA, RNA anti-sentido) que quando transcrito a partir dos ácidos nucleicos do vetor pode tratar o glaucoma de miocilina (MYOC) através da interferência com a translação ou transcrição de uma proteína anormal ou em excesso associada com um estado doentio da invenção; por exemplo, MYOC. Em alguns exemplos, os ácidos nucleicos da invenção podem codificar um RNA que trata uma doença através da eliminação ou redução altamente específica do mRNA que codifica as proteínas anormais e/ou em excesso. As sequências de RNA terapêuticas incluem RNA grampo de cabelo pequeno (shRNA), RNAi, RNA pequeno inibitório (siRNA), micro RNA (miRNA) e/ou ribozimas (tais como ribozimas de cabeça de martelo e grampo de cabelo) que podem tratar as doenças através da eliminação ou redução altamente específica de mRNA que codifica as proteínas anormais e/ou em excesso, tais como aquelas que ocorrem em várias formas de degeneração da retina herdada. Exemplos de sequências de RNA terapêuticas e ácidos nucleicos que codificam estas sequências que podem ser utilizadas na invenção incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. No 6.225.291, cuja divulgação é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00112] Em algumas modalidades da invenção, a sequência de RNA terapêutica é uma sequência de RNAi (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, a sequência de RNAi (por exemplo, shRNA) que direciona a expressão de MYOC é uma sequência de RNAi (por exemplo, shRNA) que reduz ou inibe a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o RNAi (por exemplo, shRNA) reduz ou inibe a expressão de uma MYOC humano. Em algumas modalidades, o RNAi (por exemplo, shRNA) reduz ou inibe a expressão de uma MYOC compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) direciona uma sequência de aminoácido QAMSVIH (SEQ ID NO: 6) de MYOC. Em certas modalidades, as partículas de rAAV codificam um vetor compreendendo mais do que um RNAi (por exemplo, shRNA) que direciona (por exemplo, reduz ou inibe) a expressão de MYOC. Em certas modalidades, a sequência em ciclo do RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) compreende a sequência de ácido nucleico AATAGTGAAGCCACAGATGTATT (SEQ ID NO: 7). Em algumas modalidades, as partículas de rAAV codificam um vetor que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou mais RNAi (por exemplo, shRNA) que direciona (por exemplo, reduz ou inibe) a expressão de MYOC.
[00113] Em certas modalidades, o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) ligado de maneira operável a um promotor. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) no olho do mamífero. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) nas células da malha trabecular. Em certas modalidades, o promotor é um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA). Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase III.
[00114] Em algumas modalidades, o vetor de rAAV compreende ácido nucleico codificando qualquer RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou variante funcional da mesma como aqui descrito e ácido nucleico que codifica qualquer RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) tal como aqui descrito. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e o ácido nucleico que codifica RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) estão sobre os genomas de rAAV diferentes. Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e o ácido nucleico que codifica o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) estão sobre o mesmo genoma de rAAV. Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e o ácido nucleico que codifica o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) estão ligados de maneira operável ao mesmo promotor. Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e o ácido nucleico que codifica RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) estão operativamente ligados aos diferentes promotores. Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou variante funcional da mesma é 5' para o ácido nucleico que codifica o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA). Em certas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou variante funcional da mesma é 3' para o ácido nucleico que codifica o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA). Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e o ácido nucleico que codifica RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) são ligados de maneira operável ao mesmo promotor, em que o ácido nucleico inclui um sítio de entrada de ribossoma interna (IRES) entre as RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional e RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA).
Composições de rAAV
[00115] Em alguns aspectos, a invenção fornece composições compreendendo qualquer uma das partículas de rAAV aqui descritas. Geralmente, as composições para uso nos métodos e sistemas da invenção compreendem uma quantidade eficaz de partículas de rAAV compreendendo vetores de rAAV que codificam um polipeptídeo e/ou RNA, de preferência em um excipiente farmaceuticamente aceitável. Como é bem conhecido na técnica, os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são substâncias relativamente inertes que facilitam a administração de uma substância farmacologicamente eficaz e podem ser fornecidas como soluções ou suspensões líquidas, como emulsões ou como formas sólidas adequadas para dissolução ou suspensão em líquido antes do uso. Por exemplo, um excipiente pode dar forma ou consistência, ou atuar como um diluente. Excipientes adequados incluem, mas não são limitados a estes, agentes estabilizantes, agentes umectantes e emulsificantes, sais para a variação da osmolaridade, agentes encapsulantes, substâncias tampão de pH e tampões. Tais excipientes incluem qualquer agente farmacêutico adequado para a liberação direta no olho que pode ser administrado sem toxicidade indevida. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a estes, sorbitol, qualquer um dos vários compostos TWEEN e líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser incluídos nesse particular, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como cloridretos, bromidretos, fosfatos, sulfatos, e outros mais; e os sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e outros mais. Um debate completo de excipientes farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).
[00116] Geralmente, estas composições são formuladas para a administração por injeção ocular (por exemplo, intravítrea, intracameral, sub-retinal). Consequentemente, estas composições são preferivelmente combinadas com veículos farmaceuticamente aceitáveis tais como solução salina, solução de sal equilibrada de Ringer (pH 7,4), e outros mais. Embora não seja necessário, as composições podem opcionalmente ser fornecidas na forma de dosagem unitária adequada para administração de uma quantidade precisa.
[00117] Em algumas modalidades, a invenção fornece formulações farmacêuticas de rAAV para o tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC). Em certas modalidades, a formulação compreende partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4, ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, a formulação compreende partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA). Em algumas modalidades, a formulação compreende partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e um RNA de MYOC (por exemplo, shRNA). Em algumas modalidades, a formulação compreende partículas de rAAV que compreendem um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um RNA de MYOC (por exemplo, shRNA).
Métodos de liberação ocular de rAAV
[00118] Em alguns aspectos, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero compreendendo a administração de partículas de rAAV no olho do mamífero. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3 e/ou RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e/ou um vetor de rAAV que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA). Em certas modalidades, as partículas de rAAV são administradas no olho através da injeção intravítrea e/ou intracameral. Métodos de administração de partículas de rAAV no olho são conhecidos na técnica.
[00119] Em algumas modalidades, as partículas de rAAV que compreendem vetores de rAAV que codificam a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e/ou RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) são administradas no olho de um mamífero onde a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou sua variante funcional e/ou RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) são expressos na malha trabecular do olho. Em certas modalidades, as partículas de rAAV compreendendo vetores de rAAV que codificam RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional são liberadas no olho de um mamífero onde outras partes do olho são transduzidas (por exemplo, células de gânglio da retina). O uso de partículas de rAAV compreendendo a capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A pode facilitar a transdução das células da malha trabecular.
[00120] Através da transdução segura e eficaz de células oculares (por exemplo, células da malha trabecular) com um vetor compreendendo um polipeptídeo terapêutico ou sequência de ácido nucleico, os métodos da invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo; por exemplo, um ser humano, tendo um glaucoma de miocilina (MYOC), em que as células transduzidas produzem o polipeptídeo terapêutico ou a sequência de RNA em uma quantidade suficiente para tratar o glaucoma de miocilina (MYOC) (por exemplo, POAC ou JOAC). Em algumas modalidades, a transdução de células oculares é melhorada mediante o uso de partículas de rAAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A de proteínas do capsídeo AAV, que numera com base em VP1 de AAV2. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV demonstram transdução aumentada de células da malha trabecular; por exemplo, a transdução de mais do que cerca de 10%, 25%, 50%, 75%, 100% ou qualquer número entre estes de células da malha trabecular.
[00121] Uma quantidade eficaz de rAAV (em algumas modalidades na forma de partículas) é administrada, dependendo dos objetivos do tratamento. Por exemplo, onde uma baixa porcentagem de transdução pode alcançar o efeito terapêutico desejado, então o objetivo do tratamento é geralmente alcançar ou exceder este nível de transdução. Em alguns casos, este nível de transdução pode ser alcançado por transdução de apenas cerca de 1 a 5 % das células alvo (por exemplo, células da malha trabecular), em certas modalidades pelo menos cerca de 20 % das células do tipo de tecido desejado, em algumas modalidades pelo menos cerca de 50 %, em certas modalidades pelo menos cerca de 80 %, em certas modalidades pelo menos cerca de 95 %, em algumas modalidades pelo menos cerca de 99 % das células do tipo de tecido desejado. Como um guia, o número de partículas administradas por injeção está geralmente entre cerca de 1 x 106 e cerca de 1 x 1014 partículas, entre cerca de 1 x io7 e 1 x io13 partículas, entre cerca de 1 x 109 e 1 x 1012 partículas ou cerca de 1 x 109 partículas, cerca de 1 x 1010 partículas, ou cerca de 1 x 1011 partículas. A composição de rAAV pode ser administrada por uma ou mais injeções oculares, durante o mesmo procedimento ou espaçada em dias, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, os múltiplos vetores podem ser utilizados para tratar o ser humano.
[00122] Métodos para identificar células oculares transduzidas por partículas virais de AAV são conhecidos na técnica; por exemplo, a imuno-histoquímica ou o uso de um marcador tal como uma proteína fluorescente verde intensificada pode ser utilizado para detectar a transdução de partículas virais; por exemplo, partículas virais compreendendo um capsídeo de rAAV com uma ou mais substituições de aminoácidos.
[00123] Em algumas modalidades da invenção, os métodos compreendem a administração intravítrea e/ou intracameral de uma quantidade eficaz de partículas virais de AAV ao mamífero para tratamento de um indivíduo com glaucoma de miocilina (MYOC); por exemplo, um ser humano com POAC ou JOAC. Em algumas modalidades, a composição é injetada a um ou mais locais no olho para permitir a expressão de um ácido nucleico heterólogo nas células do olho (por exemplo, células da malha trabecular). Em certas modalidades, a composição é injetada em qualquer um de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de dez locais no olho.
[00124] Em certas modalidades as partículas virais de rAAV compreendendo um capsídeo de rAAV são administradas em mais de um local simultânea ou sequencialmente. Em algumas modalidades, múltiplas injeções de partículas virais de rAAV não são mais do que uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, nove horas, doze horas ou 24 horas de separação.
Métodos de liberação sub-retinal
[00125] Métodos de liberação sub-retinal são conhecidos na técnica. Por exemplo, ver a WO 2009/105690, aqui incorporada por referência. Resumidamente, o método geral para a liberação de partículas de rAAV (por exemplo, partículas de rAAV2) na subretina da mácula e fóvea pode ser ilustrado pelo seguinte breve esboço. Este exemplo destina-se apenas para ilustrar certos aspectos do método, e não pretende de forma alguma ser limitativo.
[00126] Geralmente, o vetor de rAAV pode ser liberado na forma de uma composição injetada intraocularmente (sub-retinalmente) sob observação direta utilizando um microscópio operativo. Em algumas modalidades o vetor é encapsulado em uma partícula de rAAV em que a partícula de rAAV compreende um capsídeo de rAAV compreendendo proteínas do capsídeo de rAAV que compreendem uma ou mais substituições de aminoácido em uma ou mais posições que interage com um sulfato proteoglicano de heparano (por exemplo, reduz ou inibe ou remove a ligação de HSPG), e o vetor de rAAV que compreende um ácido nucleico heterólogo e pelo menos uma repetição terminal invertida do AAV. Este procedimento pode envolver a vitrectomia seguida de injeção de uma suspensão de vetor de rAAV utilizando uma cânula fina através de uma ou mais pequenas retinotomias no espaço subretinal.
[00127] Resumidamente, uma cânula de infusão pode ser suturada no local para manter um volume de globo normal por infusão (por exemplo, solução salina) ao longo da operação. Uma vitrectomia é executada utilizando uma cânula de diâmetro apropriado (por exemplo, calibre 20 a 27), em que o volume de gel vítreo que é removido é substituído por infusão de solução salina ou outra solução isotônica da cânula de infusão. A vitrectomia é vantajosamente executada porque (1) a remoção de seu córtex (a membrana hialóide posterior) facilita a penetração da retina pela cânula; (2) a sua remoção e substituição com fluido (por exemplo, solução salina) cria espaço para acomodar a injeção intraocular do vetor, e (3) a sua remoção controlada reduz a possibilidade de ruptura da retina e desprendimento da retina não planejado.
[00128] Em algumas modalidades, a composição de rAAV é injetada diretamente no espaço subretinal fora da retina central, através da utilização de uma cânula de diâmetro apropriado (por exemplo, calibre 27 a 45), criando assim uma bolha no espaço subretinal. Em outras modalidades, a injeção subretinal de composição de rAAV é precedida pela injeção subretinal de um pequeno volume (por exemplo, de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 ml) de um fluido apropriado (tal como solução salina ou solução de Ringer) no espaço subretinal fora da retina central. Esta injeção inicial no espaço subretinal estabelece uma bolha inicial de fluido dentro do espaço subretinal, o que provoca um deslocamento localizado da retina no local da bolha inicial. Esta bolha inicial de fluido pode facilitar a liberação direcionada da composição de rAAV ao espaço subretinal (através da definição do plano de injeção antes da liberação de rAAV), e minimizar a possível administração de rAAV na coróide e a possibilidade de injeção de rAAV ou refluxo na cavidade vítrea. Em algumas modalidades, esta bolha de fluido inicial pode ser ainda injetada com fluidos compreendendo uma ou mais composições de rAAV e/ou um ou mais agentes terapêuticos adicionais mediante a administração do mesmos fluidos diretamente na bolha de fluido inicial com a mesma cânula ou cânulas de diâmetro interno fino adicionais.
[00129] A administração intra-ocular das composições de rAAV e/ou do pequeno volume inicial de fluido pode ser executada utilizando uma cânula de diâmetro interno fino (por exemplo, calibre 27 a 45) ligada a uma seringa. Em certas modalidades, o êmbolo da mesma seringa pode ser acionado por um dispositivo mecanizado, tal como através da depressão de um pedal. A cânula de diâmetro interno fino é avançada através da esclerotomia, através da cavidade vítrea e para dentro da retina em um local pré-determinado em cada indivíduo de acordo com a área da retina a ser direcionada (mas fora da retina central). Sob visualização direta, a suspensão de vetor é injetada mecanicamente sob a retina neurossensorial, provocando um desprendimento localizado da retina com uma retinotomia auto-vedante não expansível. Como mencionado acima, a composição de rAAV pode ser diretamente injetada no espaço subretinal criando uma bolha fora da retina central ou o vetor pode ser injetado em uma bolha inicial fora da retina central, provocando a sua expansão (e expandir a área de desprendimento de retina). Em certas modalidades, a injeção de composição de rAAV é seguida pela injeção de outro fluido na bolha.
[00130] Sem desejar ser limitado pela teoria, a taxa e a localização das injeções subretinais podem resultar em forças de cisalhamento localizadas que podem danificar a mácula, a fóvea e/ou as células RPE subjacentes. As injeções subretinais podem ser executadas em uma taxa que minimiza ou evita as forças de cisalhamento. Em algumas modalidades, a composição de rAAV é injetada durante cerca de 15 a 17 minutos. Em algumas modalidades, o vetor é injetado durante cerca de 17 a 20 minutos. Em certas modalidades, a composição de rAAV é injetada durante cerca de 20 a 22 minutos. Em certas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa de cerca de 35 a cerca de 65 µl/min. Em algumas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 35 µl/min. Em algumas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 40 µl/min. Em certas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 45 µl / min. Em algumas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 50 µl/min. Em certas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 55 µl/min. Em algumas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 60 µl/min. Em certas modalidades, a composição de rAAV é injetada em uma taxa ao redor de 65 µl/min. Uma pessoa de habilidade prática na técnica reconhecerá que a taxa e o tempo de injeção da bolha podem ser direcionados, por exemplo, pelo volume da composição de rAAV ou pelo tamanho da bolha necessário para criar um deslocamento da retina suficiente para acessar as células da retina central, pelo tamanho da cânula utilizada para liberar a composição de rAAV e pela capacidade de manter com segurança a posição da cânula da invenção.
[00131] Em algumas modalidades da invenção, o volume da composição injetada no espaço subretinal da retina é mais do que cerca de qualquer um de 1 µl, 2 µl, 3 µl, 4 µl, 5 µl, 6 µl, 7 µl , 8 µl, 9 µl, 10 µl, 15 µl, 20 µl, 25 µl, 50 µl, 75 µl, 100 µl, 200 µl, 300 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 700 µl, 800 µl, 900 µl, ou 1 ml, ou qualquer quantidade entre estas.
[00132] Uma ou múltiplas (por exemplo, 2, 3 ou mais) bolhas podem ser criadas. Geralmente, o volume total da bolha ou bolhas criadas pelos métodos e sistemas da invenção não pode exceder o volume de fluido do olho, por exemplo, ao redor de 4 ml em um indivíduo humano típico. O volume total de cada bolha individual é preferivelmente pelo menos ao redor de 0,3 ml, e mais preferivelmente pelo menos ao redor de 0,5 ml de modo a facilitar um deslocamento de retina de tamanho suficiente para expor os tipos de células da retina central e criar uma bolha de dependência suficiente para a manipulação ideal. Uma pessoa de habilidade prática na técnica irá observar que ao criar a bolha de acordo com os métodos e sistemas da invenção, a pressão intraocular apropriada deve ser mantida de modo a evitar danos às estruturas oculares. O tamanho de cada bolha individual pode ser, por exemplo, de cerca de 0,5 a cerca de 1,2 ml, de cerca de 0,8 a cerca de 1,2 ml, de cerca de 0,9 a cerca de 1,2 ml, de cerca de 0,9 a cerca de 1,0 ml, de cerca de 1,0 a cerca de 2,0 ml, de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 ml. Assim, em um exemplo, para injetar um total de 3 ml de suspensão de composição de rAAV, 3 bolhas de cerca de 1 ml cada podem ser estabelecidas. O volume total de todas as bolhas em combinação pode ser, por exemplo, de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 ml, de cerca de 0,8 a cerca de 3,0 ml, de cerca de 0,9 a cerca de 3,0 ml, de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 ml, de cerca de 0,5 a cerca de 1,5 ml, de cerca de 0,5 a cerca de 1,2 ml, de cerca de 0,9 a cerca de 3,0 ml, de cerca de 0,9 a cerca de 2,0 ml, de cerca de 0,9 a cerca de 1,0 ml.
[00133] A fim de transduzir com segurança e eficientemente as áreas da retina alvo (por exemplo, a retina central) fora da borda da localização original da bolha, a bolha pode ser manipulada para reposicionar a bolha na área alvo para transdução. A manipulação da bolha pode ocorrer pela dependência da bolha que é criada pelo volume da bolha, reposicionamento do olho que contém a bolha, reposicionamento da cabeça do ser humano com um olho ou olhos contendo uma ou mais bolhas e/ou por meio de uma troca de fluido-ar. Isto é particularmente relevante para a retina central uma vez que esta área tipicamente resiste ao deslocamento por injeção subretinal. Em certas modalidades, a troca de fluido-ar é utilizada para reposicionar a bolha; o fluido da cânula de infusão é temporariamente substituído por ar, por exemplo, a partir do sopro de ar sobre a superfície da retina. Quando o volume do ar desloca o fluido da cavidade vítrea da superfície da retina, o fluido na cavidade vítrea pode fluir para fora de uma cânula. A falta temporária de pressão do fluido da cavidade vítrea faz com que a bolha se mova e gravite para uma parte dependente do olho. Através do posicionamento apropriado do globo ocular, a bolha da composição de rAAV subretinal é manipulada para envolver áreas adjacentes (por exemplo, a mácula e/ou a fóvea). Em alguns casos, a massa da bolha é suficiente para fazer com que ela gravite, mesmo sem o uso da troca de fluido-ar. O movimento da bolha para a localização desejada pode ainda ser facilitado mediante a alteração da posição da cabeça do indivíduo, de modo a permitir que a bolha gravite para a localização desejada no olho. Assim que a configuração desejada da bolha é alcançada, o fluido é devolvido para a cavidade vítrea. O fluido é um fluido apropriado, por exemplo, solução salina fresca. De um modo geral, a composição de rAAV subretinal pode ser deixada in situ sem retinopexia com a retinotomia e sem tamponamento intra-ocular, e a retina religará espontaneamente dentro de cerca de 48 horas.
[00134] Através da transdução segura e eficaz das células oculares (por exemplo, células da malha trabecular) com um vetor compreendendo um polipeptídeo terapêutico ou sequência de RNA, os métodos da invenção podem ser utilizados para tratar um indivíduo; por exemplo, um ser humano, tendo um glaucoma de miocilina (MYOC), em que as células transduzidas produzem o polipeptídeo terapêutico ou a sequência de RNA em uma quantidade suficiente para tratar o glaucoma de miocilina (MYOC).
[00135] Uma quantidade eficaz de rAAV (em algumas modalidades na forma de partículas) é administrada, dependendo dos objetivos do tratamento. Por exemplo, onde uma baixa porcentagem de transdução pode alcançar o efeito terapêutico desejado, então o objetivo do tratamento é geralmente atingir ou exceder este nível de transdução. Em alguns casos, este nível de transdução pode ser alcançado através da transdução de apenas cerca de 1 a 5 % das células alvo, em algumas modalidades pelo menos cerca de 20 % das células do tipo de tecido desejado, em certas modalidades pelo menos cerca de 50 %, em algumas modalidades pelo menos cerca de 80 %, em algumas modalidades pelo menos cerca de 95 %, em algumas modalidades pelo menos cerca de 99 % das células do tipo de tecido desejado. Como debatido acima, a substituição de um ou mais aminoácidos do capsídeo rAAV que interage com HSPG melhora a transdução de rAAV. Como um guia, o número de partículas administradas por injeção está geralmente entre cerca de 1 x 106 e cerca de 1 x 1014 partículas, entre cerca de 1 x io7 e 1 x io13 partículas, entre cerca de 1 x io9 e 1 x io12 partículas ou cerca de 1 x 1011 partículas. A composição de rAAV pode ser administrada por uma ou mais injeções subretinais, durante o mesmo procedimento ou espaçadas em dias, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, múltiplos vetores podem ser utilizados para tratar o ser humano.
[00136] Em algumas modalidades, a administração ao olho de uma quantidade eficaz de partículas virais de rAAV resulta em mais do que cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % , 45 %, 50%, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 100 % ou qualquer % entre estas de células oculares transduzidas. Em algumas modalidades, cerca de 5 % a cerca de 100 %, cerca de 10 % a cerca de 50 %, cerca de 10 % a cerca de 30 %, cerca de 25 % a cerca de 75 %, cerca de 25% a cerca de 50 %, ou cerca de 30 % a cerca de 50 % das células oculares são transduzidas. Métodos para identificar células oculares transduzidas por partículas virais de AAV compreendendo um capsídeo de rAAV são conhecidos na técnica; por exemplo, a imuno-histoquímica ou a utilização de um marcador tal como uma proteína fluorescente verde intensificada pode ser utilizado para detectar a transdução de partículas virais.
[00137] Em algumas modalidades, a administração à malha trabecular de uma quantidade eficaz de partículas virais de rAAV resulta em mais do que cerca de qualquer um de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 % %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 % ou 100 % ou qualquer % entre estas de células da malha trabecular transduzidas. Em certas modalidades, cerca de 5 % a cerca de 100 %, cerca de 10 % a cerca de 50 %, cerca de 10 % a cerca de 30 %, cerca de 25 % a cerca de 75 %, cerca de 25 % a cerca de 50 %, ou cerca de 30 % a cerca de 50 % das células da malha trabecular são transduzidas. Métodos para identificar células da malha trabecular transduzidas por partículas virais de AAV compreendendo um capsídeo de rAAV são conhecidos na técnica; por exemplo, a imuno-histoquímica ou a utilização de um marcador tal como uma proteína fluorescente verde intensificada pode ser utilizada para detectar a transdução de partículas virais.
[00138] Em algumas modalidades da invenção, os métodos compreendem a administração ao olho de um mamífero de uma quantidade eficaz de partículas virais de AAV para tratar um indivíduo com um glaucoma de miocilina (MYOC); por exemplo, um ser humano com um glaucoma de miocilina (MYOC). Em certas modalidades, a composição é injetada em um ou mais locais no olho para permitir a expressão de um ácido nucleico heterólogo nas células oculares. Em algumas modalidades, a composição é injetada em qualquer uma de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que dez localizações no olho.
[00139] Em algumas modalidades da invenção, os métodos compreendem a administração à malha trabecular de um mamífero de uma quantidade eficaz de partículas virais de AAV para o tratamento de um indivíduo com um glaucoma de miocilina (MYOC); por exemplo, um ser humano com um glaucoma de miocilina (MYOC). Em certas modalidades, a composição é injetada em um ou mais locais na malha trabecular para permitir a expressão de um ácido nucleico heterólogo nas células de malha trabecular. Em algumas modalidades, a composição é injetada em qualquer uma de uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais de dez localizações na malha trabecular.
[00140] Em certas modalidades, as partículas virais de rAAV são administradas a mais do que uma localização simultânea ou sequencialmente. Em algumas modalidades, múltiplas injeções de partículas virais de rAAV não são mais do que uma hora, duas horas, três horas, quatro horas, cinco horas, seis horas, nove horas, doze horas ou 24 horas de intervalo.
Métodos de Injeção Intravítrea
[00141] O método geral para a injeção intravítrea pode ser ilustrado pelo breve esboço que se segue. Este exemplo destina-se apenas para ilustrar certos aspectos do método, e não pretende de forma alguma ser limitativo. Os procedimentos para injeção intravítrea são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Peyman, G.A., et al. (2009) Retina 29(7):875- 912 e Fagan, X.J. e Al-Qureshi, S. (2013) Clin. Experiment. Ophthalmol. 41(5):500-7).
[00142] Resumidamente, um indivíduo para injeção intravítrea pode ser preparado para o procedimento através da dilatação da pupila, esterilização do olho e administração de anestésico. Qualquer agente midriático adequado conhecido na técnica pode ser utilizado para a dilatação pupilar. A dilatação pupilar adequada pode ser confirmada antes do tratamento. A esterilização pode ser conseguida através da aplicação de um tratamento de esterilização ocular, por exemplo, uma solução contendo iodeto tal como Povidona-Iodo (BETADINE®). Uma solução semelhante também pode ser utilizada para limpar a pálpebra, os cílios e quaisquer outros tecidos próximos (por exemplo, pele). Qualquer anestésico adequado pode ser utilizado, tal como lidocaína ou proparacaína, em qualquer concentração adequada. O anestésico pode ser administrado por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, gotas tópicas, géis ou geléias e aplicação subconjuntival de anestésico.
[00143] Antes da injeção, um espéculo de pálpebra esterilizado pode ser utilizado para limpar as pestanas da área. O local da injeção pode ser marcado com uma seringa. O local da injeção pode ser selecionado com base na lente do paciente. Por exemplo, o local da injeção pode estar de 3 a 3,5 mm do limbo em pacientes pseudofácicos ou afácicos, e de 3,5 a 4 mm do limbo em pacientes fácicos. O paciente pode olhar em uma direção oposta ao local da injeção.
[00144] Durante a injeção, a agulha pode ser inserida perpendicularmente à esclera e apontada para o centro do olho. A agulha pode ser inserida de tal modo que a extremidade termine no espaço vítreo, em vez do espaço subretinal. Qualquer volume adequado conhecido na técnica para injeção pode ser utilizado. Após a injeção, o olho pode ser tratado com um agente esterilizante tal como um antibiótico. O olho também pode ser enxaguado para remover o excesso de agente esterilizante.
Métodos de injeção intracameral
[00145] Os métodos de injeção intracameral no olho são conhecidos na técnica. Um exemplo não limitativo de injeção intracameral é fornecido por Buie, et al., (2010) IOVS 51(1):236-248.
[00146] A eficácia da liberação de rAAV por injeção intravítrea ou intracameral pode ser monitorada por vários critérios como aqui descritos. Por exemplo, após tratamento em um indivíduo utilizando os métodos da presente invenção, o indivíduo pode ser avaliado, por exemplo, com relação a uma melhora e/ou estabilização e/ou atraso na progressão de um ou mais sinais ou sintomas do estado doentio por um ou mais parâmetros clínicos incluindo aqueles aqui descritos. Exemplos de tais testes são conhecidos na técnica e incluem medidas objetivas assim como subjetivas (por exemplo, sujeitas a notificação). Por exemplo, para medir a eficácia de um tratamento sobre a função visual de um indivíduo, um ou mais do que se segue pode ser avaliado: a qualidade subjetiva da visão do indivíduo ou a função de visão central melhorada (por exemplo, uma melhora na capacidade do indivíduo de ler fluentemente e reconhecer rostos), a mobilidade visual do indivíduo (por exemplo, uma diminuição no tempo necessário para navegar em um labirinto), acuidade visual (por exemplo, uma melhora na pontuação LogMAR do indivíduo), microperimetria (por exemplo, uma melhora na pontuação dB do indivíduo), perimetria adaptada no escuro (por exemplo, uma melhora da pontuação dB do indivíduo), mapeamento matricial fino (por exemplo, uma melhora na pontuação dB do indivíduo), perimetria de Goldmann (por exemplo, um tamanho reduzido da área escotomatosa (isto é, áreas de cegueira) e melhora da capacidade de resolução de alvos menores), sensibilidades de cintilação da luz (por exemplo, uma melhora em Hertz), autofluorescência e medições eletrofisiológicas (por exemplo, melhora em ERG). Em algumas modalidades, a função visual é medida pela mobilidade visual do indivíduo. Em algumas modalidades, a função visual é medida pela acuidade visual do indivíduo. Em algumas modalidades, a função visual é medida por microperimetria. Em algumas modalidades, a função visual é medida por perimetria adaptada no escuro. Em algumas modalidades, a função visual é medida por ERG. Em algumas modalidades, a função visual é medida pela qualidade de visão subjetiva do indivíduo.
[00147] Para qualquer um dos métodos ou composições aqui descritos, um teste médico para glaucoma de miocilina (MYOC) pode ser utilizado para avaliar a eficácia de um tratamento aqui descrito ou diagnosticar um paciente que pode se beneficiar de um tratamento aqui descrito. Numerosos testes médicos para diagnosticar ou monitorar o glaucoma de miocilina (MYOC) são conhecidos na técnica. Por exemplo, a oftalmoscopia, a polarimetria a laser, a tomografia de coerência ocular e/ou a tomografia por laser de varredura podem ser utilizadas para inspecionar o nervo ótico, que pode ser danificado pelo glaucoma de miocilina (MYOC). A pressão intra-ocular pode ser medida por tonometria. Um paquímetro pode ser utilizado para medir a espessura da córnea central (por exemplo, a espessura fina da córnea central pode ser preditiva de glaucoma de miocilina (MYOC)). Um teste de campo visual pode ser utilizado para avaliar o campo visual.
[00148] Conforme descrito acima, as mutações de miocilina têm sido implicadas no glaucoma primário de miocilina de ângulo aberto (MYOC) (POAG). Portanto, um teste médico para diagnosticar POAG pode ser utilizado para avaliar a eficácia de um tratamento aqui descrito ou diagnosticar um doente que pode se beneficiar de um tratamento aqui descrito. Qualquer teste médico para diagnosticar POAG conhecido na técnica pode ser utilizado, por exemplo, para distinguir o POAG de outra forma de glaucoma de miocilina (MYOC) (tal como glaucoma de ângulo fechado). Por exemplo, a gonioscopia pode ser utilizada para fornecer uma avaliação que auxilia no diagnóstico de POAG.
[00149] A eficácia dos tratamentos para o glaucoma de miocilina (MYOC) pode ser testada em um modelo animal. Os modelos animais para o glaucoma de miocilina (MYOC) são conhecidos na técnica. Por exemplo, os camundongos que expressam MYOC humana Y437H ou MYOC de camundongo Y423H demonstraram desenvolver sintomas de glaucoma de miocilina (MYOC) semelhantes ao POAG (ver Zode et al. (2011) J. Clin. Invest. 121(9):3542-53 e Senatorov, V., et al. (2006) J. Neurosci. 26(46):11903-14). Além disso, os camundongos que carecem da subunidade alfa da guanilato ciclase solúvel no receptor de óxido nítrico são outro modelo de POAG (Buys, E.S., et al. (2013) PLoS ONE 8(3):e60156). Modelos de rato também foram desenvolvidos; ratos que expressam TGF-beta humano liberado por meio da transferência de genes adenovirais mostram aumento de IOP (Shepard, A.R., et al. (2010) Invest. Ophthalmol. 51(4):2067-76). Descrição adicional de outros modelos animais para vários aspectos de POAG, incluindo modelos de primatas, cães e peixe-zebra, pode ser observada em Bouhenni, R.A., et al. (2012) J. Biomed. Biotechnol. 2012:692609).
[00150] Em alguns distúrbios oculares, existe um fenômeno de "célula governante", no qual a melhora da função de um tipo de célula melhora a função de outro. Por exemplo, a transdução do RPE da retina central por um rAAV da invenção pode então melhorar a função dos bastonetes e, por sua vez, a função de bastonete melhorada resulta na função melhorada de outra. Consequentemente, o tratamento de um tipo de célula pode resultar em uma função melhorada em outro. No glaucoma de miocilina (MYOC), a redução de IOP por transdução da TM reduzirá a degeneração da estrutura e função das células ganglionares.
[00151] A seleção de um vetor e composição de rAAV particular depende de um número de fatores diferentes, incluindo, mas não limitado a estes, histórico médico do indivíduo humano e aspectos da condição e do indivíduo sendo tratado. A avaliação de tais aspectos e a concepção de um regime terapêutico apropriado é, em última instância, da responsabilidade do médico que prescreve.
[00152] As composições da invenção (por exemplo, partículas virais de AAV que codificam a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e/ou RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA)) podem ser utilizadas isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para o tratamento de distúrbios oculares. O intervalo entre administração sequencial pode ser em termos de pelo menos (ou, alternativamente, menos do que) minutos, horas ou dias.
[00153] Em certas modalidades, um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados à malha trabecular. Exemplos não limitativos do agente terapêutico adicional incluem prostaglandinas tais como Xalatan, Lumigan, Travatan Z e Rescula; beta-bloqueadores incluindo Timoptic XE, Istalol e Betoptic S; agonistas alfa-adrenérgicos, incluindo Iopidina, Alphagan e Alphagan-P; inibitórios da anidrase carbônica incluindo Trusopt e Azopt, Diamox, Neptazane e Daranide; parassimpaticomiméticos incluindo pilocarpina, carbacol, ecotiofato e demecarium; epinefrinas incluindo Propine; ou tratamentos de combinação incluindo Cosopt, Combigan e DuoTrav. V. . Construções de Expressão
[00154] A invenção fornece métodos de liberação de ácido nucleico heterólogo no olho através da liberação sub-retinal de um vetor de rAAV compreendendo o ácido nucleico heterólogo e em que o vetor de rAAV é encapsulado em um capsídeo de rAAV compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos que interagem com HSPG. Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo (por exemplo, um transgene) está ligado de maneira operável a um promotor. Os promotores exemplares incluem, mas não são limitados a estes, o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), a LTR de RSV, a LTR de MoMLV, o promotor de fosfoglicerato cinase-1 (PGK), um promotor de vírus de símio 40 (SV40) e um promotor de CK6, um promotor de transtirretina (TTR), um promotor de TK, um promotor responsivo a tetraciclina (TRE), um promotor de HBV, um promotor de hAAT, um promotor de LSP, promotores específicos de fígado quiméricos (LSPs), o promotor de E2F, o promotor de telomerase (hTERT); o promotor de intensificador de citomegalovírus/beta-actina de galinha/ß-globina de coelho (promotor CAG, Niwa et al., Gene, 1991, 108(2):193-9) e o promotor 1- alfa do fator de alongamento (EFl-alfa) (Kim et al., Gene, 1990, 91(2):217-23 and Guo et al., Gene Ther., 1996, 3(9):802-10). Em certas modalidades, o promotor compreende um promotor de p-glucuronidase humana ou um intensificador de citomegalovírus ligado a um promotor de ß-actina de galinha (CBA). O promotor pode ser um promotor constitutivo, induzível ou repressível. Em certas modalidades, o promotor é capaz de expressar o ácido nucleico heterólogo em uma célula do olho. Em algumas modalidades, o promotor é capaz de expressar o ácido nucleico heterólogo em células fotorreceptoras ou RPE. Nas modalidades, o promotor é um promotor de rodopsina cinase (RK); por exemplo, um promotor de RK humano. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de opsina; por exemplo, um promotor de opsina humano ou um promotor de opsina de camundongo. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor de RNA polimerase III. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero (por exemplo, um ser humano) através da administração ao olho do mamífero de uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, sob o controle de um promotor de CBA. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero (por exemplo, um ser humano) mediante a administração ao olho do mamífero de uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um RNAi (por exemplo, shRNA) (por exemplo, reduz ou inibe) uma MYOC (por exemplo, uma MYOC humano) sob o controle de um promotor de CBA. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero (por exemplo, um ser humano) através da administração no olho do mamífero de uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional, sob o controle de um promotor de CBA e uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um RNAi (por exemplo, shRNA) que direciona (por exemplo, reduz ou inibe) uma MYOC (por exemplo, uma MYOC humana) sob o controle de um promotor CBA. Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero (por exemplo, um ser humano) através da administração ao olho do mamífero de uma partícula de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, sob o controle de um promotor CBA e um RNAi (por exemplo, shRNA) que direciona (por exemplo, reduz ou inibe) uma MYOC (por exemplo, uma MYOC humana) sob o controle de um promotor de CBA.
[00155] A presente invenção contempla o uso de um genoma viral recombinante para a introdução de uma ou mais sequências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo terapêutico e/ou ácido nucleico para o acondicionamento em uma partícula viral de rAAV. O genoma viral recombinante pode incluir qualquer elemento para estabelecer a expressão do polipeptídeo terapêutico e/ou ácido nucleico, por exemplo, um promotor, um ITR, um elemento de ligação ao ribossoma, um terminador, um intensificador, um marcador de seleção, um íntron, um sinal poliA e/ou origem de replicação.
[00156] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais compreendendo um genoma auto-complementar recombinante. Partículas virais de AAV com genomas auto-complementares e métodos de uso de genomas auto-complementares de AAV são descritos nas Patentes US Nos. 6.596.535; 7.125.717; 7.765.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Um rAAV compreendendo um genoma auto-complementar formará rapidamente uma molécula de DNA de filamento duplo em virtude das suas sequências parcialmente complementares (por exemplo, filamentos de codificação e não codificação complementares de um transgene). Em certas modalidades, a primeira sequência de ácido nucleico heterólogo e uma segunda sequência de ácido nucleico heterólogo são ligadas por uma ITR modificada (por exemplo, a ITR direita). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência polinucleotídica 5’- CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC CAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3’ (SEQ ID NO: 20). A ITR modificada compreende uma anulação da região D compreendendo a sequência de resolução terminal. Como um resultado, ao replicar um genoma viral de AAV, as proteínas rep não irão clivar o genoma viral na ITR modificada e como tal, um genoma viral recombinante compreendendo o seguinte na ordem de 5' a 3'será acondicionado em um capsídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeo heteróloga incluindo sequências reguladoras, a ITR de AAV modificada, o segundo polinucleotídeo heterólogo em orientação inversa ao primeiro polinucleotídeo heterólogo e uma terceira ITR de AAV. VI. Partículas virais e métodos de produção de partículas virais Partículas virais de rAAV
[00157] A invenção fornece métodos de uso de partículas de rAAV para tratar glaucoma de miocilina (MYOC) e fornece composições compreendendo partículas de rAAV. Em algumas modalidades, a partícula viral é uma partícula de AAV recombinante compreendendo um ácido nucleico que compreende uma sequência que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e/ou um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) aqui descrito flanqueado por uma ou duas ITRs. O ácido nucleico é encapsulado na partícula de AAV. A partícula de AAV também compreende proteínas do capsídeo. Em certas modalidades, o ácido nucleico compreende as sequências de codificação de interesse (por exemplo, ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou sua variante funcional e/ou um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA)), componentes ligados de maneira operável na direção da transcrição, sequências de controle incluindo as sequências de início e término da transcrição, formando assim uma cassete de expressão. O cassete de expressão é flanqueado na extremidade 5' e 3' por pelo menos uma sequência de ITR de AAV funcional. Por "sequências de ITR de AAV funcionais" significa que as sequências de ITR funcionam como planejado para o resgate, replicação e acondicionamento do vírion de AAV. Ver Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034- 40; e Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16, todos os quais são aqui incorporados na sua totalidade por referência. Para a prática de alguns aspectos da invenção, os vetores recombinantes compreendem pelo menos todas as sequências de AAV essenciais para a encapsulação e as estruturas físicas para a infecção pelo rAAV. As ITR de AAV para uso nos vetores da invenção não necessitam de ter uma sequência de nucleotídeo do tipo selvagem (por exemplo, como descrito em Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), e podem ser alteradas pela inserção, anulação ou substituição de nucleotídeos ou as ITRs de AAV podem ser derivadas de qualquer um dos vários sorotipos de AAV. Mais do que 40 sorotipos de AAV são atualmente conhecidos e novos sorotipos e variantes de sorotipos existentes continuam a ser identificados. Ver Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; e Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810. O uso de qualquer sorotipo de AAV é considerado dentro do escopo da presente invenção. Em certas modalidades, um vetor de rAAV é um vetor derivado de um sorotipo de AAV, incluindo, sem limitação, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino ou AAV de camundongo, ou coisa parecida. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV compreende uma ITR de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, um AAV de cabra, AAV bovino, ou repetições terminais invertidas de sorotipo de AAV de camundongo (ITRs) ou coisa parecida. Em algumas modalidades, o ácido nucleico no AAV ainda codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma; RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA); ou um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e MYOC tal como aqui descrita. Por exemplo, o ácido nucleico no AAV pode compreender pelo menos uma ITR de qualquer um sorotipo de AAV aqui contemplado e pode ainda codificar um ácido nucleico que codifica um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direciona a SEQ ID NO: 6 e que compreende a da SEQ ID NO: 7 e/ou uma ou mais de: uma RSPO1 compreendendo as SEQ ID NOs: 8, 11 e/ou 12; uma RSPO2 compreendendo as SEQ ID NOs: 9, 13 e/ou 14; uma RSPO3 compreendendo as SEQ ID NOs: 1, 15, 16 e/ou 17; e uma RSPO4 compreendendo as SEQ ID NOs: 10, 18 e/ou 19. Em certas modalidades, o ácido nucleico codifica uma RSPO1 que é pelo menos cerca de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % idênticas às SEQ ID NO: 8, 11 ou 12; uma RSPO2 que é pelo menos ao redor de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica às SEQ ID NOs: 9 , 13 ou 14; uma RSPO3 que é pelo menos ao redor de 80 %, 85 %, 90%, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % idêntica às SEQ ID NOs: 1 ou 15 a 17; ou uma RSPO4 que é pelo menos ao redor de 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97%, 98 % ou 99 % idêntica às SEQ ID NOs: 10, 18 ou 19.
[00158] Em outras modalidades, a partícula de rAAV compreende proteínas do capsídeo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6 (por exemplo, um capsídeo de AAV6 do tipo selvagem ou um capsídeo de AAV6 variante tal como ShH10, como descrito na U.S. PG Pub. 2012/0164106), AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9 (por exemplo, um capsídeo de AAV9 do tipo selvagem ou um capsídeo de AAV9 modificada como descrito na U.S. PG Pub. 2013/0323226), AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, um mutante de capsídeo de tirosina, um mutante de capsídeo de ligação a heparina, um capsídeo de AAV2R471A, um capsídeo de AAVAAV2/2-7m8, um capsídeo de AAV DJ (por exemplo, um capsídeo de AAV-DJ/8, um capsídeo de AAV-DJ/9, ou qualquer outra dos capsídeos descritos na U.S. PG Pub. 2012/0066783), capsídeo de AAV2 N587A, capsídeo de AAV2 E548A, capsídeo de AAV2 N708A, capsídeo de AAV V708K, capsídeo de AAV de cabra, capsídeo quimérico de AAV1/AAV2, capsídeo de AAV bovina, capsídeo de AAV de camundongo, capsídeo de rAAV2/HBoV1, ou um capsídeo de AAV descrito na Patente U.S. No 8.283.151 ou Publicação Internacional No. WO/2003/042397. Em algumas modalidades, a partícula viral de AAV compreende um capsídeo de AAV que compreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posições R484, R487, K527, K532, R585 ou R588, numeração com base na VP1 de AAV2. Em outras modalidades, uma partícula de rAAV compreende proteínas do capsídeo de um sorotipo de AAV de Clados A-F. Em algumas modalidades, uma proteína do capsídeo mutante mantém a capacidade de formar um capsídeo de AAV. Em certas modalidades, as partículas de rAAV compreendem uma proteína do capsídeo que permite a transdução da malha trabecular. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem uma proteína do capsídeo mutante que permite a transdução da malha trabecular. Em algumas modalidades, a partícula de rAAV compreende proteínas do capsídeo de AAV2, em que a proteína do capsídeo compreende uma substituição de aminoácidos R471A, numeração com base na VP1 de AAV2 (Lochrie et al., J Virol (2006) 80(2):821-834). Em algumas modalidades, a invenção fornece partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou sua variante funcional; um capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácidos R471A, numeração com base na VP1 de AAV2; e/ou um vetor que codifica o RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA).
[00159] Em algumas modalidades, a invenção fornece composições e métodos para tratar o glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, em que uma partícula viral de rAAV2 compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, é liberada no olho do mamífero onde partes diferentes do olho podem ser transduzidas (por exemplo, a retina) e uma partícula viral de RAAV2 R471A compreendendo um vetor de rAAV que codifica um RNAi de MYOC é liberada no olho do mamífero onde as células da malha trabecular são transduzidas. Em certas modalidades, a invenção fornece composições e métodos para tratar o glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, em que uma partícula viral de rAAV2 R471A compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e uma partícula viral de rAAV2 R471A compreendendo um vetor de rAAV que codifica um RNAi de MYOC é liberada no olho do mamífero onde as células da malha trabecular são transduzidas. Em algumas modalidades, a invenção fornece composições e métodos para tratar o glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, em que uma partícula viral de rAAV2 R471A compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e que codifica um RNAi de MYOC é liberada no olho do mamífero onde as células da malha trabecular são transduzidas.
[00160] Em alguns aspectos, a invenção fornece composições e métodos para liberar um transgene (por exemplo, um transgene terapêutico na malha trabecular do olho). Em certas modalidades, as composições e métodos utilizam uma partícula de rAAV2 compreendendo um capsídeo mutante onde a capsídeo compreende uma substituição de aminoácido R471A, numeração relativa à VP1 de AAV2. Tais composições e métodos podem ser utilizados no tratamento de doenças oculares; por exemplo, a doença ocular associada com a malha trabecular tal como o glaucoma de miocilina (MYOC).
[00161] Diferentes sorotipos de AAV são utilizados para otimizar a transdução de células alvo particulares ou para direcionar tipos de células específicos dentro de um tecido alvo particular (por exemplo, um tecido doente). Uma partícula de rAAV pode compreender proteínas virais e ácidos nucleicos virais do mesmo sorotipo ou um sorotipo misturado.
Genomas virais de AAV auto-complementares
[00162] Em alguns aspectos, a invenção fornece partículas virais compreendendo um genoma recombinante auto-complementar. Partículas virais de AAV com genomas auto-complementares e métodos de uso de genomas auto-complementares de AAV são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.596.535; 7.125.717; 7.765.583; 7.785.888; 7.790.154; 7.846.729; 8.093.054; e 8.361.457; e Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, cada um dos quais é aqui incorporado por referência na sua totalidade. Um rAAV compreendendo um genoma auto-complementar formará rapidamente uma molécula de DNA de filamento duplo em virtude das suas sequências parcialmente complementares (por exemplo, filamentos de codificação e não codificação complementares de um transgene). Em algumas modalidades, a invenção fornece uma partícula viral de AAV que compreende um genoma de AAV, em que o genoma de rAAV compreende uma primeira sequência de polinucleotídeo heteróloga (por exemplo, miR-708 e/ou um filamento codificação de rodopsina) e uma segunda sequência de polinucleotídeo heteróloga (por exemplo, filamento anti-sentido de miR-708 e/ou um filamento de não codificação ou anti-sentido de rodopsina) em que a primeira sequência de polinucleotídeo heteróloga pode formar pares de bases intra-filamentar com a segunda sequência de polinucleotídeo ao longo da maior parte ou de todo o seu comprimento. Em certas modalidades, a primeira sequência de polinucleotídeo heteróloga e uma segunda sequência de polinucleotídeo heteróloga estão ligadas por uma sequência que facilita a ligação de base intra-filamentar; por exemplo, uma estrutura de DNA grampo de cabelo. As estruturas grampo de cabelo são conhecidas na arte, por exemplo, nas moléculas de siRNA. Em algumas modalidades, a primeira sequência de polinucleotídeo heteróloga e uma segunda sequência de polinucleotídeo heteróloga estão ligadas por uma ITR modificada (por exemplo, a ITR direita). Em algumas modalidades, a ITR compreende a sequência de polinucleotídeo 5'- CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC CAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO:20). A ITR modificada compreende uma anulação da região D que compreende a sequência de resolução terminal. Como um resultado, na replicação de um genoma viral de AAV, as proteínas rep não irão clivar o genoma viral na ITR modificada e como tal, um genoma viral recombinante compreendendo o que se segue na ordem de 5' a 3'será acondicionado em um capsídeo viral: uma ITR de AAV, a primeira sequência de polinucleotídeo heteróloga incluindo sequências reguladoras, a ITR de AAV modificada, o segundo polinucleotídeo heterólogo em orientação inversa ao primeiro polinucleotídeo heterólogo e uma terceira ITR de AAV. Em certas modalidades, a invenção fornece partículas virais de AAV compreendendo um genoma viral recombinante compreendendo uma ITR de AAV2 funcional, uma primeira sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma, e/ou um RNA de MYOC (por exemplo, shRNA), uma ITR de AAV2 modificada compreendendo uma anulação da região D e que carece de uma sequência de resolução terminal funcional, uma segunda sequência de polinucleotídeo que compreende a sequência complementar à sequência que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou sua variante funcional, e/ou um RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA), da primeira sequência de polinucleotídeo e uma ITR de AAV2 funcional.
Produção de partículas de AAV
[00163] As partículas de rAAV podem ser produzidas utilizando métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 6.566.118; 6.989.264; e 6.995.006. Na prática da invenção, as células hospedeiras para produzir partículas de rAAV incluem células de mamífero, células de inseto, células vegetais, microrganismos e levedura. As células hospedeiras também podem ser células de acondicionamento nas quais os genes rep e cap de AAV são mantidos de forma estável na célula hospedeira ou nas células produtoras nas quais o genoma do vetor de AAV é mantido de forma estável. As células de acondicionamentos e produtoras exemplares são derivadas de células 293, A549 ou HeLa. Os vetores AAV são purificados e formulados utilizando técnicas padrão conhecidas na especialidade.
[00164] Em alguns aspectos, um método é fornecido para produzir qualquer partícula de rAAV como aqui divulgado compreendendo (a) o cultivo de uma célula hospedeira sob uma condição em que as partículas de rAAV são produzidas, em que a célula hospedeira compreende (i) um ou mais genes de acondicionamento de AAV, em que cada dito gene de acondicionamento de AAV codifica uma proteína de replicação e/ou encapsulação de AAV; (ii) um pró-vetor de rAAV que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo terapêutico e/ou um ácido nucleico como aqui descrito flanqueado por pelo menos uma ITR de AAV, e (iii) uma função auxiliar de AAV; e (b) a recuperação das partículas de rAAV produzidas pela célula hospedeira.
[00165] Em uma outra modalidade, as partículas de rAAV são purificadas. O termo "purificado" como aqui utilizado inclui uma preparação de partículas de rAAV desprovidas de pelo menos alguns dos outros componentes que também podem estar presentes onde as partículas de rAAV naturalmente ocorrem ou são inicialmente preparadas. Assim, por exemplo, as partículas de rAAV isoladas podem ser preparadas utilizando uma técnica de purificação para enriquecê-las a partir de uma mistura de fonte, tal como um lisado de cultura ou sobrenadante da cultura de produção. O enriquecimento pode ser medido em uma variedade de modos, tais como, por exemplo, pela proporção de partículas resistentes a DNase (DRPs) ou cópias de genoma (gc) presentes em uma solução ou por possibilidade de contaminação, ou pode ser medido em relação a uma segunda substância potencialmente interferente presente na mistura de origem, tal como contaminantes, incluindo os contaminantes de cultura de produção ou contaminantes em processo, incluindo vírus auxiliar, componentes do meio, e outros mais.
[00166] Também são aqui fornecidas composições farmacêuticas compreendendo uma partícula de rAAV que compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo terapêutico e/ou ácido nucleico terapêutico, em que a partícula de rAAV compreende um capsídeo de rAAV compreendendo uma ou mais substituições ou aminoácidos que interagem com HSPG, e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser adequadas para qualquer modo de administração aqui descrito; por exemplo, mediante a administração subretinal.
[00167] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo um rAAV aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para administração ao ser humano. Tais veículos são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Edition, pp. 10351038 and 1570-1580). Em certas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo um rAAV aqui descrito e um veículo farmaceuticamente aceitável são adequadas para injeção ocular. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleo, incluindo aqueles de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, e outros mais. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose, polietileno glicol (PEG) e glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. A composição farmacêutica pode ainda compreender ingredientes adicionais, por exemplo, conservantes, tampões, agentes de tonicidade, antioxidantes e estabilizantes, agentes umectantes ou de clarificação não iônicos, agentes para aumentar a viscosidade, e outros mais. As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser acondicionadas em doses unitárias isoladas ou em formas de múltiplas dosagens. As composições são geralmente formuladas como solução estéril e substancialmente isotônica. VII. Sistemas e kits
[00168] As composições de rAAV como aqui descritas podem estar contidas dentro de um sistema concebido para uso em um dos métodos da invenção como aqui descrita. Em certas modalidades, a invenção fornece um sistema para a liberação de um vetor a um olho de um indivíduo, compreendendo a) uma composição que compreende uma quantidade eficaz de partículas de rAAV, em que o vetor compreende um ácido nucleico heterólogo que codifica um polipeptídeo terapêutico e/ou RNA terapêutico e pelo menos uma repetição terminal de AAV; e b) um dispositivo para a liberação ocular do rAAV. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um vetor de rAAV que codifica um ou mais RNAi de MYOC (por exemplo, shRNAs) que direcionam (por exemplo, reduz ou inibe) a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, as partículas de rAAV compreendem um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, ou uma variante funcional da mesma e um ou mais RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direcionam (por exemplo, reduzem ou inibem) a expressão de MYOC. Em algumas modalidades, o kit ou sistema compreende partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e partículas de rAAV compreendendo um vetor de rAAV que codifica um ou mais RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) que direcionam (por exemplo, reduzem ou inibem) a expressão de MYOC.
[00169] Geralmente, o sistema compreende uma cânula de diâmetro interno fino, em que a cânula é de calibre 27 a 45, uma ou mais seringas (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) e um ou mais fluidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4 ou mais) adequados para uso nos métodos da invenção.
[00170] A cânula de diâmetro interno fino é adequada para injeção subretinal da suspensão de vetor e/ou outros fluidos a serem injetados no espaço subretinal. Em algumas modalidades, a cânula é de calibre 27 a 45. Em algumas modalidades, a cânula de diâmetro interno fino é de calibre 35 a 41. Em algumas modalidades, a cânula de diâmetro interno fino é de calibre 40 ou 41. Em certas modalidades, a cânula de diâmetro interno fino é de calibre 41. A cânula pode ser qualquer tipo adequado de cânula, por exemplo, uma cânula de-Juan® ou uma cânula Eagle®.
[00171] A seringa pode ser qualquer seringa adequada, contanto que seja capaz de ser conectada à cânula para liberação de um fluido. Em algumas modalidades, a seringa é uma seringa de sistema Accurus®. Em algumas modalidades, o sistema possui uma seringa. Em algumas modalidades, o sistema possui duas seringas. Em certas modalidades, o sistema possui três seringas. Em algumas modalidades, o sistema possui quatro ou mais seringas.
[00172] O sistema pode ainda compreender uma bomba de injeção automatizada, que pode ser ativada, por exemplo, através de um pedal.
[00173] Os fluidos adequados para uso nos métodos da invenção incluem aqueles aqui descritos, por exemplo, um ou mais fluidos cada um compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais vetores como aqui descritos, um ou mais fluidos para criar uma bolha inicial (por exemplo, solução salina ou outro fluido apropriado), e um ou mais fluidos compreendendo um ou mais agentes terapêuticos.
[00174] Os fluidos adequados para uso nos métodos da invenção incluem aqueles aqui descritos, por exemplo, um ou mais fluidos cada um compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais vetores tais como aqui descritos, um ou mais fluidos para criar uma bolha inicial (por exemplo, solução salina ou outro fluido apropriado), e um ou mais fluidos compreendendo um ou mais agentes terapêuticos.
[00175] Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é maior do que cerca de 0,8 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é pelo menos cerca de 0,9 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é pelo menos cerca de 1,0 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é pelo menos cerca de 1,5 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de pelo menos cerca de 2,0 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é maior do que cerca de 0,8 a cerca de 3,0 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é maior do que cerca de 0,8 a cerca de 2,5 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é maior do que cerca de 0,8 a cerca de 2,0 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é maior do que cerca de 0,8 a cerca de 1,5 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é maior do que cerca de 0,8 a cerca de 1,0 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 0,9 a cerca de 3,0 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 0,9 a cerca de 2,5 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 0,9 a cerca de 2,0 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 0,9 a cerca de 1,5 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 0,9 a cerca de 1,0 ml. Em algumas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 1,0 a cerca de 3,0 ml. Em certas modalidades, o volume do fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor é de cerca de 1,0 a cerca de 2,0 ml.
[00176] O fluido para criar a bolha inicial pode ser, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 0,5 ml. Em algumas modalidades, o volume total de todos os fluidos no sistema é de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 ml.
[00177] Em algumas modalidades, o sistema compreende um único fluido (por exemplo, um fluido compreendendo uma quantidade eficaz do vetor). Em algumas modalidades, o sistema compreende 2 fluidos. Em certas modalidades, o sistema compreende 3 fluidos. Em algumas modalidades, o sistema compreende 4 ou mais fluidos.
[00178] Os sistemas da invenção podem ainda ser acondicionados em kits, em que os kits podem ainda compreender instruções de uso. Em certas modalidades, os kits compreendem ainda um dispositivo para a liberação subretinal de composições de partículas de rAAV. Em algumas modalidades, as instruções de uso incluem instruções de acordo com um dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, as instruções de uso incluem instruções para a liberação intravítrea e/ou intracameral de partículas de rAAV compreendendo um vetor que codifica um polipeptídeo de RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 ou uma variante funcional da mesma e/ou RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA).
EXEMPLOS
[00179] A invenção será mais completamente compreendida por referência aos seguintes exemplos. Eles não devem, no entanto, ser interpretados como limitativos do escopo da invenção. Fica entendido que os exemplos e as modalidades aqui descritas são apenas para propósitos ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz das mesmas serão sugeridas às pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance do mesmo pedido e escopo das reivindicações anexas.
Exemplo 1: Mutações de MYOC glaucomatosas (por exemplo, P370L e Y437H) bloqueiam a secreção de MYOC
[00180] Para compreender como os mutantes de MYOC afetam a função do olho, particularmente as células tais como as células de malha trabecular que podem contribuir com a IOP, serão fornecidos conhecimentos dentro da patogênese do glaucoma de miocilina (MYOC). Entender a função de MYOC também pode ajudar a descobrir estratégias terapêuticas potenciais para o glaucoma de miocilina (MYOC). Os resultados aqui descritos demonstram que os mutantes de MYOC reduzem a expressão de MYOC do tipo selvagem e bloqueiam a sinalização de Wnt. Além disso, estes resultados sugerem que a expressão de R-espondina 3 (RSPO3) e/ou o silenciamento de MYOC pode restaurar a sinalização de Wnt bloqueada pela expressão de MYOC mutante.
Métodos Vetores Plasmídeos
[00181] Para os plasmídeos de MYOC e RSPO3, o cDNA de MYOC foi fornecidos pela Clone DB-Sanofi Oncology. O cDNA de RSPO3 foi proporcionado pelo Clone DB-Sanofi Oncology.
[00182] Para a construção de pCBA2 em MYOC P370L, o kit QUIKCHANGE® II (Agilent, Santa Clara) foi utilizado para introduzir a substituição de base única desejada seguindo as recomendações do fabricante e os iniciadores 5’- ACCACGGACAGTTCCTGTATTCTTGGGGTGG -3’ (SEQ ID NO: 21) e 5’- CCACCCCAAGAATACAGGAACTGTCCGTGGT-3’ (SEQ ID NO: 22).
[00183] Para a construção de pCBA2 em MYOC Y437H, o kit QUIKCHANGE® Lightning (Agilent, Santa Clara) foi utilizado para introduzir a substituição de base única desejada seguindo as recomendações do fabricante e os iniciadores 5'- TCTGTGGCACCTTGCACACCGTCAGCAGC-3' (SEQ ID NO:23) e 5'- GCTGCTGACGGTGTGCAAGGTGCCACAGA-3' (SEQ ID NO:24).
[00184] Os plasmídeos de shRNA Grp94 foram obtidos da OriGene Technologies, Inc. (Cat. No. TR312309). Os plasmídeos de pGIPZ- MYOC (Dharmacon GE Life Sciences) foram fornecidos pelo Clone DB- Sanofi Oncology. A coleta de shRNA adaptada ao microRNA de GIPZ (Stegmeier, et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102:13212-7). Os projetos de shRNA de GIPZ baseiam-se na transcrição primária nativa de miR-30 para permitir o processamento pela via endógena de RNAi e resultar no silenciamento de genes específicos com toxicidade celular minimizada. O plasmídeo de pGIPZ-Null, um vetor de shRNAmir constitutivo que expressa shRNAmir nulo não alvo, foi fornecido pela Clone DB-Sanofi Oncology.
Cultura Celular e Proteínas Recombinantes
[00185] As células HEK293 (Microbix Biosystems Inc.) foram cultivadas em DMEM, FCS a 10% e CO2 a 5%. A linhagem celular HEK293T (293T) foi obtida da ATCC e cultivada em DMEM, FCS a 10% e CO2 a 5%.
Imortalização de células da Malha Trabecular (hTM) humanas primárias
[00186] O antígeno T grande SV40 (TAg SV40) foi utilizado para a imortalização por meio da transdução com um vetor de antígeno T de AAV2-SV40. As células Passage 7 hTM (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA) mantidas em meio de crescimento de fibroblasto completo (ScienCell) foram semeadas em placas de cultura celular de 10 cm e transduzidas com 1 x 105 DRP de AAV2-SV40-Tag (marcado "hTM-T") ou AAV2-EGFP (controle negativo, rotulado "hTM- ENT") durante 24 horas. Assim que as células alcançaram a confluência, elas foram passadas para placas de 2 x 15 cm (P8). As células foram repetidamente passadas aproximadamente a cada 3 a 4 dias. Na passagem 10, uma alíquota foi tomada para determinar uma contagem de células. O número total de células a partir de células hTM- T foi de 5,2 x 106, em comparação com 2,5 x io5células totais das células hTM-ENT.
[00187] O Western blotting foi executado para determinar a presença de antígeno T de SV40. Resumidamente, uma suspensão de 500 µl de células foi centrifugada, e o sedimento celular resultante foi submetido a lise em 100 µl de tampão RIPA contendo um coquetel de inibitório de protease. 5 µl de lisados celulares foram analisados por SDS-PAGE seguido por imunocoloração utilizando o sistema de transferência rápida iBlot (Life Technologies). A mancha foi bloqueada utilizando um bloqueador livre de proteína TBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e incubada com um anticorpo de antígeno T anti-SV40 monoclonal (GeneTex, Irvine, CA). A mancha foi então incubada com um anticorpo marcado com HRP anti-camundongo (R & D Systems, Minneapolis, MN). As faixas imunorreativas foram visualizadas utilizando o Supersignal West Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher). Uma faixa proeminente de 80 kDa que corresponde ao antígeno T de SV40 foi detectada a partir de hTM-T, mas não células hTM-ENT, indicando a presença e expressão de antígeno T de SV40. O lisado das células 293T serviu como um controle positivo que também continha a faixa de antígeno T de SV40 de 80 kDa. As células hTM-T foram expandidas e os bancos de células foram congelados em meios de congelamento de células (Life Technologies, Grand Island, NY) na passagem 12 (10 frascos em 1 x 106células) e mais tarde na passagem 18 (46 frascos em 106células).
Caracterização de hTM-T
[00188] A comparação de hTM-T e células hTM primárias mostrou uma diferença marcante na morfologia celular, tempos de duplicação da população e eficiência de transfecção de plasmídeo. As células hTM primárias pareciam maiores e semelhantes a fibroblastos com um corpo de células fusiformes longas, enquanto que as células hTM-T imortalizadas eram menores, de forma cúbica e um tamanho relativamente uniforme. A linhagem celular hTM-T demonstrou uma taxa de crescimento aumentada com duplicações da população ocorrendo aproximadamente 3 a 4 vezes mais rapidamente do que as células primárias. Além disso, as células hTM-T continuaram a proliferar para além de 20 passagens celulares, enquanto que as células hTM primárias apresentaram uma taxa de crescimento diminuída pela passagem 10 e eventual interrupção do crescimento pela passagem 12. A eficiência de transfecção foi determinada utilizando um plasmídeo EGFP e lipofectamina em ambos os tipos de células de densidade celular semelhante. Resumidamente, as células hTM-T ou hTM subconfluentes foram transfectadas com um plasmídeo EGFP utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante. Embora as células hTM-T tivessem maior número de células por mm2 de superfície de cultura celular, havia claramente uma maior porcentagem de células EGFP + hTM-T (~50 %) em comparação com as células hTM primárias (~5 %).
Western Blotting
[00189] As células 293T ou hTM-T foram transfectadas com plasmídeos que expressam wtMYOC, MYOC mutantes P370L e Y437H, RSPO3 e/ou shRNAs utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Resumidamente, as células foram submetidas a lise em 50 a 100 µl de tampão RIPA contendo um coquetel de inibitório de protease. De 10 a 13 µl de lisados celulares foram analisados por SDS- PAGE seguido pela imunocoloração utilizando o sistema de transferência rápida iBlot (Life Technologies). A mancha foi bloqueada utilizando Tris Buffered Saline, 0,05 % Tween 20 (TBST). 0,2 % I-Block (reagente de bloqueio à base de caseína, Life Technologies) e incubado com um anticorpo de MYOC anti-humano de camundongo. A mancha foi então incubada com um anticorpo marcado com HRP anti- camundongo (R&D Systems, Minneapolis, MN). As faixas imunorreativas foram visualizadas utilizando ECL Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher) e visualizadas em película BioMax XAR (Carestream Health) desenvolvida com um Kodak X-Omat 2000 Processor.
Ensaio Repórter de Luciferase
[00190] Células 293T ou hTM-T foram semeadas em placas de reservatório brancas ou pretas de 96 reservatórios Costar em 2 x 104 células/reservatório. As transfecções foram executadas 1 a 2 dias após a semeadura de células utilizando o reagente de transfecção Fugene HD (Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00191] Em resumo, o plasmídeo repórter Topflash (Millipore, Billerica, MA) contendo uma relação de 40:1 do gene repórter Firefly Luciferase regulado por Tcf/lef e do gene Renilla Luciferase conduzido por citomegalovírus (CMV) foi misturado 1:1 com plasmídeos alvo. 8 µl de reagente Fugene HD foram adicionados, e as amostras foram imediatamente submetidas a vórtice e depois incubadas durante 15 minutos na temperatura ambiente. Os complexos de DNA de plasmídeo foram adicionados às células e incubados a 37 °C durante 24 horas. As amostras não foram estimuladas ou foram estimuladas com 400 ng/ml de proteína wnt3a humana ou de camundongo recombinante (R&D Systems) e incubadas durante mais 20 a 24 horas. A sinalização de Wnt foi medida utilizando o Dual Luciferase Assay System (Promega) de acordo com o protocolo do fabricante. Os valores de absorvência foram medidos em um luminômetro de microplaca Centro XS3 960 (Berthold Technologies, Oak Ridge, TN) e relatados como unidades de luz relativa (RLUs). Para controlar a eficiência de transfecção, as RLUs de luciferase de vaga-lume foram normalizadas contra as RLUs de luciferase Renilla. Todas as amostras foram executadas em reservatórios em triplicata.
Resultados
[00192] A MYOC do tipo selvagem (wtMYOC) é secretada a partir das células cultivadas, mas pouco a nenhuma MYOC é secretada a partir de células que expressam cinco formas mutantes diferentes de MYOC, e foi relatada que a co-transfecção de células cultivadas com MYOC normal e mutante suprime a secreção de wtMYOC (Jacobson et al. (2001) Hum. Mol. Genet. 10(2):117-25). Para examinar os efeitos da expressão de MYOC mutante na secreção de MYOC, 293 células foram transfectadas com plasmídeos que expressam MYOC do tipo selvagem, MYOC mutante P370L ou MYOC mutante Y437H.
[00193] Conforme ilustrado na FIG. 1, 293 células que expressam MYOC do tipo selvagem apresentaram expressão de proteína de MYOC detectável em ambos os lisados celulares (ver a "mancha de fundo marcada com" CELLS) e secretadas no meio de cultura de células (ver a mancha superior marcada "MEDIUM"). Contudo, as células transfectadas com plasmídeos que expressam MYOC P370L ou Y437H apresentaram expressão intracelular, mas sem secreção no meio de cultura celular. Além do mais, a co-transfecção de 293 células com plasmídeos que expressam a MYOC do tipo selvagem e a MYOC P370L ou Y437H provocou uma falta de secreção de MYOC no meio de cultura de células. Estes resultados sugerem que os mutantes P370L e Y437H deixem de ser secretados das 293 células e também são capazes de bloquear a secreção da MYOC do tipo selvagem.
[00194] Outras experiências foram garantidas para determinar se estes resultados são observados nas células do olho humano. Uma linhagem celular da malha trabecular humana foi imortalizada pela expressão mediada por AAV do antígeno T Grande SV40 (células hTM- T), como descrito acima. As células 293T e hTM-T foram transfectadas com um plasmídeo que expressa a MYOC do tipo selvagem, um plasmídeo que expressa a MYOC P370L, ou transfectadas com ambos os plasmídeos. A FIG. 2 mostra Western blots que examinam a presença de proteína de MYOC intracelular ou secretada nestas células. Embora a MYOC do tipo selvagem tenha sido expressa e secretada pelas células 293T e hTM-T, a MYOC P370L foi expressa, mas não secretada pelas células tanto 293T quanto hTM-T. A MYOC P370L também bloqueou a secreção da MYOC do tipo selvagem nas células tanto 293T quanto hTM-T.
[00195] Estes resultados demonstram que os mutantes de MYOC glaucomatosos (por exemplo, P370L e Y437H) são capazes de bloquear a secreção de MYOC do tipo selvagem nas células humanas. Além do mais, a MYOC mutante também é capaz de bloquear a secreção de MYOC nas células hTM.
Exemplo 2: Mutações de MYOC glaucomatosas (por exemplo, P370L e Y437H) bloqueiam a sinalização de Wnt
[00196] A MYOC é suposta de interagir com componentes das vias de sinalização de Wnt tais como os receptores de Wnt da família Frizzled (Fzd), antagonistas de Wnt da família da proteína relacionada com Frizzled secretada (sFRP) e fator inibitório de Wnt 1 (WIF-1 ), que modulam a organização do citoesqueleto de actina que estimula a formação de fibras de estresse (Kwon et al. (2009) Mol. Cell. Biol. 29:2139-54). A formação de fibras de estresse é crítica para a contratilidade da malha trabecular (TM) e regulação da IOP. No entanto, precisamente como a MYOC está conectada à sinalização Wnt e como essa conexão afeta a IOP, não são claras. Com base nas experiências biológicas celulares, um papel da miocilina como uma proteína matricelular foi proposto (Resch and Fautsch, 2009; Koch et al, 2014). Outros grupos demonstraram que a miocilina é um mediador da diferenciação de oligodendrócitos e está envolvida na mielinização do nervo ótico em camundongos (Kwon et al., 2014).
[00197] Sugeriu-se que a MYOC pode servir como um modulador da sinalização de Wnt e que as proteínas de Wnt podem compensar a ausência de miocilina através da execução de suas funções (Kwon et al. (2009) Mol. Cell. Biol. 29:2139-54). Vários grupos relataram semelhanças entre as ações da miocilina e das proteínas de Wnt que atuam através de um mecanismo independente da b-catenina (Kwon and Tomarev (2011) J. Cell. Physiol. 226(12):3392-402). Relatou-se que a sinalização de Wnt reduzida nas células da TM glaucomatosas (GTM) é devida aos níveis endógenos mais elevados de sFRP1 (Wang et al. (2008) J. Clin. Invest. 118:1056-64; Lin and Hankenson (2011) J. Cell. Biochem. 112:3491-501). Outro grupo mostrou que a via de sinalização de Wnt protege a linhagem celular retinal RGC-5 da pressão elevada (Fragoso et al. (2011) Cell. Mol. Neurobiol. 31(1):163-73).
[00198] Não está claro a partir da literatura se as mutações de MYOC glaucomatosas (por exemplo, P370L ou Y437H) possuem qualquer efeito na sinalização de Wnt na TM. Um relatório mencionou que o efeito das mutações de MYOC glaucomatosas, que inibem a secreção de MYOC da TM, na sinalização de Wnt na TM, não é claro, como medido pelo ensaio de sinalização de Wnt TOP-Flash (Mao et al. (2012) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 53(11):7043-51). Outro grupo relatou que a P370L tinha um efeito estimulante na sinalização de Wnt em células Caco-2, mostrado pelo ensaio de sinalização de Wnt TOP-Flash (Shen et al. (2012) PLoS ONE 7(9):e44902).
[00199] Em contraste, os inventores descobriram que as mutações de MYOC (por exemplo, P370L e Y437H) possuem um efeito inibitório sobre a sinalização de Wnt nas células 293 e TM, como mostrado pelo ensaio de sinalização de Wnt TOP-Flash, que relata a atividade da beta- catenina.
[00200] Para avaliar o efeito dos mutantes de MYOC P370L e Y437H na sinalização de Wnt, as células 293T foram co-transfectadas com construções repórter TOP-Flash e plasmídeos wtMYOC (“MYOC”), MYOC P370L, ou MYOC Y437H. A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a recombinante de camundongo (400 ng/ml) e medida pelo ensaio TOP-Flash. A atividade da luciferase (média + SD, n = 4) foi medida após a transfecção e foi normalizada para o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expressa.
[00201] Conforme ilustrado na FIG. 3, a estimulação de células 293T com Wnt3 recombinante de camundongo provocou um aumento no repórter TOP-Flash. A expressão de MYOC do tipo selvagem não interferiu com a sinalização de Wnt, como analisado por TOP-Flash. No entanto, a co-expressão de MYOC do tipo selvagem com MYOC P370L ou MYOC Y437H bloqueou a ativação de TOP-Flash nas células 293T. Estes resultados indicam que a expressão de mutantes de MYOC glaucomatosos (por exemplo, P370L e Y437H) é capaz de inibir a sinalização de Wnt nas células humanas.
Exemplo 3: Restauração da sinalização de Wnt bloqueada por mutações de MYOC glaucomatosas (por exemplo, P370L e Y437H)
[00202] O Exemplo anterior demonstra que os mutantes de MYOC glaucomatosos P370L e Y437H atuam para bloquear a sinalização de Wnt nas células humanas. Outras experiências foram empreendidas para examinar os mecanismos potenciais pelos quais a sinalização de Wnt pode ser restaurada nas células que expressam estes mutantes de MYOC.
[00203] A R-espondina 3 (RSPO3) é uma proteína codificada pelo gene de RSPO3 que ativa a sinalização de Wnt, e foi examinada se a expressão de RSPO3 é capaz de restaurar a sinalização de Wnt após a sua inibição através da expressão de MYOC mutante. Para estas experiências, semelhante à FIG. 3 acima, as células 293T foram co- transfectadas com a construção repórter TOP-Flash e os plasmídeos de wtMYOC ("MYOC"), MYOC P370L, MYOC Y437H e/ou RSPO3, como marcados. A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a recombinante de camundongo (400 ng/ml) e medida por ensaio TOPFlash. A atividade da luciferase (média + SD, n = 3) foi medida após a transfecção e foi normalizada para o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expressa.
[00204] Conforme ilustrado na FIG. 4, a expressão de RSPO3 provocou um aumento na sinalização de Wnt, como medida por TOPFlash. Com importância, a co-expressão de RSPO3 e MYOC P370L ou MYOC Y437H foi capaz de restaurar a sinalização de Wnt, em comparação com a inibição da sinalização de Wnt observada após a expressão de MYOC P370L ou MYOC Y437H isoladamente. As células 293T foram co-transfectadas com a construção repórter TOP-Flash e os plasmídeos de wtMYOC ("MYOC"), MYOC P370L, MYOC Y437H e/ou RSPO3, como marcados. A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a recombinante de camundongo (400 ng/ml) e medida por ensaio TOP-Flash. A atividade de luciferase foi medida após a transfecção e foi normalizada para o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expressa.
[00205] Para testar se um efeito semelhante é observado nas células hTM, as células hTM-T foram co-transfectadas com a construção repórter TOP-Flash e com os plasmídeos de wtMYOC ("MYOC w.t."), MYOC P370L e/ou RSPO3. A atividade de Wnt foi medida pelo ensaio TOP-Flash como descrito acima (a atividade de luciferase é mostrada como média + SD, n = 3). A FIG. 5 mostra que a expressão de MYOC P370L provocou uma redução na sinalização de Wnt e foi capaz de reduzir a sinalização de Wnt nas células hTM-T que co-expressam a MYOC do tipo selvagem. A expressão de RSPO3 foi capaz de aumentar a sinalização de Wnt nas células hTM-T que expressam a MYOC P370L isoladamente ou MYOC P370L em combinação com a MYOC do tipo selvagem. Os resultados representados nas FIGs. 4 e 5 indicam que a expressão de RSPO3 restaura a sinalização de Wnt nas células que expressam mutantes de MYOC glaucomatosos, tais como as células 293T e hTM-T.
[00206] Surpreendentemente, descobriu-se também que a inibição de Wnt através da expressão de mutantes de MYOC glaucomatosos é invertida por silenciar a MYOC (por exemplo, por RNAi). O efeito de shRNA de MYOC na expressão de MYOC foi testado nas células 293T. Conforme mostrado na FIG. 6, o shRNA de MYOC reduziu a expressão da proteína de MYOC nas células que expressam MYOC do tipo selvagem, em comparação com o controle de shRNA misturado. Esta redução foi observada para a MYOC tanto intracelular quanto secretada.
[00207] A FIG. 7 mostra o efeito do shRNA de MYOC nas células hTM-T. O shRNA de MYOC reduziu a expressão da proteína de MYOC nas células hTM-T que co-expressam a MYOC do tipo selvagem e mutante P370L. Esta redução foi observada para a MYOC tanto intracelular quanto secretada. Ao contrário, o shRNA que direciona o Grp94 não teve nenhum efeito sobre a expressão de MYOC. Grp94 é um chaperone molecular que está envolvido no processamento e transporte de proteínas secretadas e foi recentemente proposto como um terapêutico para pacientes que sofrem de alguns casos de glaucoma de MYOC, porque acredita-se que o Grp94 facilite a depuração de mutantes de MYOC (Suntharalingam et al., (2012) J. Biol. Chem. 287(48):40661-9). Os controles de shRNA misturados de forma semelhante não tiveram nenhum efeito na expressão de MYOC.
[00208] Visto que o shRNA de MYOC afetou a expressão de MYOC, os seus efeitos sobre a sinalização de Wnt foram investigados em seguida. Conforme ilustrado na FIG. 8, a expressão de MYOC P370L reduziu a sinalização de Wnt nas células 293T. O shRNA de Grp94 e os controles de shRNA misturados foram incapazes de restaurar a sinalização de Wnt inibida pela MYOC de P370L. Por outro lado, o shRNA de MYOC aumentou a sinalização de Wnt nas células que expressam a MYOC P370L para níveis aproximadamente selvagems (isto é, nível de sinalização de Wnt observado nas células de controle que não expressam a MYOC de P370L, medido por TOP-Flash). A expressão de RSPO3 também foi observada de aumentar a sinalização de Wnt nas células que expressam a MYOC P370L e a combinação da expressão de RSPO3 com RNAi de MYOC (por exemplo, shRNA) levou a um aumento sinérgico na sinalização de Wnt nas células que expressam a MYOC P370L.
[00209] Embora a inibição de Grp94 tenha sido proposta como um mecanismo para reduzir os efeitos de mutantes de MYOC, estes resultados aqui descritos indicam que a expressão de shRNA de RSPO3 e/ou MYOC pode ser mais eficaz em desreprimir a sinalização de Wnt na presença da expressão de MYOC mutante.
[00210] O efeito de shRNA de MYOC na sinalização de Wnt nas células que expressam MYOC de Y437H também foi examinado. Conforme ilustrado na FIG. 9, a expressão de MYOC P370L ou Y437H reduziu a sinalização de Wnt nas células 293T. No entanto, o shRNA de MYOC foi capaz de restaurar a sinalização de Wnt nas células que expressam MYOC P370L ou Y437H. Este efeito não foi observado após a expressão de um controle de shRNA misturado.
[00211] Em resumo, estes resultados demonstram que a sinalização de Wnt bloqueada por mutantes de MYOC (por exemplo, P370L e Y437H) pode ser restaurada pela expressão de R-espondina 3 (RSPO3) e/ou inibição de MYOC (por exemplo, por RNAi). Exemplo 4: AAV2 R471A converte as células da malha trabecular
[00212] Para determinar se as partículas de AAV poderiam converter as células da malha trabecular, os vetores de AAV2 que codificam EGFP foram acondicionados em partículas de AAV2 do tipo selvagem de partículas de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido de R471A (numeração baseada na VP1). As partículas virais foram avaliadas in vitro através do tratamento de células hTM (descritas acima) com AAV2 EGFP e AAV2 R471A EGFP. Conforme ilustrado na FIG. 10 (painéis esquerdos), o AAV2 R471A EGFP mostrou maior transdução de células da TM em comparação com o AAV2 do tipo selvagem. Para avaliar a transdução de células da TM in vivo, AAV2 EGFP e AAV2 R471A EGFP foram injetados nos olhos de camundongos. Os camundongos foram então sacrificados e analisados com relação à expressão de EGFP. Como representado na FIG. 10 (painéis da direita), o AAV2 R471A EGFP mostrou uma transdução de células da TM mais elevada in vivo em comparação com o AAV2 do tipo selvagem.
Exemplo 5: Expressão de RSPO3 ou RNAs de MYOC em modelos animais de glaucoma de miocilina (MYOC)
[00213] Os Exemplos acima demonstram que as mutações de MYOC glaucomatosas (por exemplo, P370L e Y437H) bloqueiam a sinalização de Wnt, e que esta inibição da sinalização de Wnt pode ser invertida pela expressão de R-espondina 3 (RSPO3) ou RNAsh de MYOC. Sem desejar ser limitado por qualquer teoria particular, pensa- se que as mutações de MYOC (por exemplo, P370L e/ou Y437H) podem provocar a sinalização de Wnt na TM, modulando assim a IOP e contribuindo para POAG. As seguintes experiências testam se a expressão de R-espondina 3 (RSPO3) ou shRNA de MYOC, liberada através do vetor de AAV2, é capaz de melhorar os sintomas de glaucoma em modelos de camundongo da doença.
[00214] Um modelo de camundongo de POAG é utilizado para examinar a eficácia da liberação mediada por AAV da expressão de R- espondina 3 (RSPO3) e/ou RNAsh de MYOC ao olho no tratamento do glaucoma de miocilina (MYOC). Por exemplo, pode ser utilizado um modelo de camundongo que expressa a MYOC Y437H (ver Zode et al. (2011) J. Clin. Invest. 121(9):3542-53). Neste modelo, a MYOC Y437H humana é expressa sob o controle do promotor de CMV em um camundongo transgênico. Utilizando este sistema, a MYOC Y437H é expressa nos tecidos relacionados com o glaucoma de miocilina (MYOC), tal como a malha trabecular e a esclera. Estes camundongos apresentam morfologia visual grosseiramente normal, mas começam a apresentar sintomas semelhantes ao glaucoma de miocilina (MYOC) após três meses de idade, tais como aumento da IOP e degeneração progressiva axonal do nervo ótico.
[00215] Os transgenes que expressam GFP, RSPO3 de camundongo, shRNA que direciona a MYOC de camundongo (sequência alvo e em ciclo de shRNA de MYOC do plasmídeo pGIPZ #93, Dharmacon, GE Healthcare) ou shRNA misturado são clonados em um genoma de AAV2 sob o controle de um promotor híbrido de ß-actina de galinha (CBA) a partir do plasmídeo pCBA (2)-int-BGH, que também contém a sequência sinal de poliadenilação da hormônio de crescimento bovino (Xu, R., et al. (2001) Gene Ther. 8:1323-32). O cassete de expressão é então clonada em um vetor de plasmídeo pré- viral pAAVSP70 contendo repetições terminais invertidas de AAV2 (ITRs) (Ziegler, R.J., et al. (2004) Mol. Ther. 9:231-40). O tamanho total do genoma de AAV resultante no plasmídeo sp70.BR/sFLT01 incluindo a região flanqueada por ITR é de 4,6 kb.
[00216] Os genomas de AAV2 são acondicionados em capsídeos de AAV2 com mutação R471A para permitir a infecção da malha trabecular ou capsídeos de AAV2 do tipo selvagem para permitir a infecção das células ganglionares da retina. Os genomas de AAV2 são acondicionados na capsídeo de AAV2 do tipo selvagem ou R471A utilizando a abordagem do vetor de "gutless" utilizando um método de transfecção tripla (ver, por exemplo, Xiao et al. (1998) J. Virol., 3:222432). Em resumo, os genes rep e cap são substituídos com o gene terapêutico e seus elementos reguladores, ambos intercalados entre uma repetição terminal invertida (ITR) 5' e 3'. Os genes rep e cap são fornecidos em trans sobre um plasmídeo separado, e um terceiro plasmídeo contribui com os genes auxiliares adenovirais requeridos. Alternativamente, os genes auxiliares requeridos são fornecidos por um adenovírus deficiente de replicação e/ou genes auxiliares adenovirais são integrados de forma estável no genoma da célula hospedeira. Sem desejar ser limitado por qualquer teoria particular, postula-se que as capsídeos virais são completamente montadas, e o genoma do vetor flanqueado com ITR é então inserido na capsídeo através de um poro de capsídeo (Myers & Carter (1980) Virology, 102:71-82). As capsídeos contendo o genoma são então formuladas para injeção.
[00217] Os camundongos transgênicos que expressam a MYOC Y437H humana são desenvolvidos em aproximadamente três meses de idade e depois são atribuídos aleatoriamente a grupos de tratamento. Os camundongos são anestesiados e injetados através de injeção intravítrea ou intracameral com vetores de AAV que codificam GFP, RSPO3 de camundongo, shRNA que direciona a MYOC de camundongo ou shRNA misturado. Em um grupo de tratamento, para testar os efeitos nas células ganglionares da retina, um camundongo recebe uma injeção de vetores de AAV2 com a capsídeo de AAV2 do tipo selvagem que expressa a RSPO3 de camundongo e uma injeção de vetores de AAV2 com a capsídeo de AAV2 do tipo selvagem que expressam a GFP no olho contralateral. Em um grupo de tratamento, para testar efeitos na malha trabecular, um camundongo recebe uma injeção de vetores de AAV2 com a capsídeo de AAV2 de R471A que expressa o shRNA que direciona a MYOC de camundongo e uma injeção de vetores de AAV2 com capsídeo de AAV2 de R471A que expressa o shRNA misturado no olho contralateral. Em um grupo de tratamento, um camundongo recebe uma injeção de uma mistura de vetores de AAV que expressam os vetores de RSPO3 e AAV de camundongos que expressam o RNAsh que direciona a MYOC de camundongo em um olho e uma injeção de vetores de AAV que expressam GFP e/ou vetores de AAV que expressam shRNA missturado no olho contralateral. Em um grupo de tratamento, um camundongo recebe uma injeção de vetores de AAV que expressam a RSPO3 de camundongos e expressam shRNA que direciona a MYOC de camundongo em um olho, e uma injeção de vetores de AAV que expressam GFP e que expressam shRNA misturado no olho contralateral.
[00218] Os camundongos são examinados em intervalos regulares após a injeção para sintomas de glaucoma de miocilina (MYOC), comparando o olho que recebe tratamento experimental com o olho que recebe tratamento de controle. A IOP é medida por tonometria (Kim, C.Y., et al. (2007) Eye (Lond.) 21(9):1202-9). A espessura da córnea é medida por um paquímetro de ultra-som (Lively, G.D., et al. (2010) Physiol. Genomics 42(2):281-6). O ângulo iridocorneal é avaliado pela gonioscopia. A função das células ganglionares da retina é medida por meio da análise de respostas de eletrorretinografia padrão aos estímulos visuais utilizando eletrorretinografia padrão (PERG) (Zode et al. (2011) J. Clin. Invest. 121(9):3542-53). Os camundongos podem ser sacrificados e os olhos dissecados para outras caracterizações fenotípicas. Por exemplo, o número de células ganglionares da retina e/ou a morfologia são avaliados por microscopia de imunofluorescência e/ou microscopia eletrônica de transmissão.
Exemplo 6: Uso de proteínas da família de RSPO para restabelecer a sinalização de Wnt bloqueada pela mutação de MYOC glaucomatosa
[00219] Conforme demonstrado no Exemplo 3, a sinalização de Wnt bloqueada por mutantes de MYOC (por exemplo, P370L e Y437H) pode ser restaurada pela expressão de R-espondina 3 (RSPO3). Para entender ainda mais os mecanismos subjacentes a esta restauração da sinalização de Wnt, a capacidade de diferentes membros da família de RSPO e variantes para restaurar a sinalização de Wnt foi examinada.
[00220] As proteínas da família de RSPO humanas hRSPO1, 2, 3 e 4 compartilham uma estrutura de domínio semelhante que inclui domínios ricos em Cys semelhantes a furina, um domínio de trombospondina de tipo I e um domínio de C-terminal positivamente carregado, como ilustrado nas FIGS. 11 e 12. Para examinar os domínios funcionais requeridos para a restauração da sinalização de Wnt, várias variantes truncadas de RSPO3 humana foram geradas. As variantes, e os domínios específicos incluídos e excluídos em cada variante, são mostrados nas FIGs. 11, 12, 13A e 14.
[00221] Para testar o efeito das variantes de RSPO3 na sinalização de Wnt, as células 293T foram co-transfectadas com a construção repórter TOP-Flash e wtMYOC (MYOC) ou MYOC Y437H, e também transfectadas com plasmídeos de RSPO3 de comprimento total ou parcial, como marcados na FIG. 15. A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a humano recombinante (400 ng/ml) e medida por ensaio TOP-Flash. A atividade de luciferase (média ± SD, n = 3) foi medida após a transfecção e foi normalizada para o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expresso.
[00222] Como descrito no Exemplo 3, o mutante de MYOC Y437H inibe a sinalização de Wnt nas células 293T como medido pelo ensaio TOP-Flash. A FIG. 15 mostra o efeito das várias variantes truncadas de hRSPO3 na sinalização de Wnt neste ensaio. Conforme ilustrado na FIG. 15, todas as formas de hRSPO3 testadas, tanto parcial quanto de comprimento total, tinham atividade de restauração de Wnt com RSPO3 de comprimento total apresentando atividade mais potente do que muitas das formas truncadas.
[00223] Para testar o efeito de diferentes membros da família de RSPO na sinalização de Wnt, as células 293T foram co-transfectadas com a construção repórter TOP-Flash e wtMYOC (MYOC) ou MYOC Y437H, e também transfectadas com plasmídeos de RSPO1, RSPO2 ou RSPO4 de comprimeneto total ou parcial, como marcado na FIG. 16 (ver a Fig. 12 para a representação das formas truncadas de RSPO1, 2, 3 e 4). A sinalização de Wnt foi amplificada após a adição de Wnt3a recombinante de camundongo (400 ng/ml) e medida por ensaio TOPFlash. A atividade de luciferase (média + SD, n = 3) foi medida após transfecção e foi normalizada para o controle de transfecção do nível de luciferase Renilla constitutivamente expresso.
[00224] Os resultados do mesmos estudos são mostrados na FIG. 16. Estes resultados indicam que as RSPO1, 2, e 4 de comprimento total e truncadas também possuíam atividade de restauração de Wnt com RSPOs de comprimento total que apresentam atividade mais potente do que as formas truncadas. Todos os membros e formas da família de RSPO trabalharam com Wnt3a. SEQUÊNCIAS Sequência de polipeptídeo de RSPO3 (sequência de sinal sublinhada) MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCA TCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDIN KCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHT MECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAK GNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAI PDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH (SEQ ID NO: 1) Sequência de polinucleotídeo de RSPO3 ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGCTTTTTATCATTTTGAACTTTAT GGAATACATCGGCAGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGC GAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTG CAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACT ATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGT CTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATA TAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAA CAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTG GAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACC ATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAAT GGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCT TCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATC CTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAA AGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGA AAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAA AGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAA GAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCG AAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACA CTAG (SEQ ID NO: 2) Sequência de polipeptídeo de MYOC MRFFCARCCSFGPEMPAVQLLLLACLVWDVGARTAQLRKANDQSG RCQYTFSVASPNESSCPEQSQAMSVIHNLQRDSSTQRLDLEATKAR LSSLESLLHQLTLDQAARPQETQEGLQRELGTLRRERDQLETQTREL ETAYSNLLRDKSVLEEEKKRLRQENENLARRLESSSQEVARLRRGQ CPQTRDTARAVPPGSREVSTWNLDTLAFQELKSELTEVPASRILKES PSGYLRSGEGDTGCGELVWVGEPLTLRTAETITGKYGVWMRDPKPT YPYTQETTWRIDTVGTDVRQVFEYDLISQFMQGYPSKVHILPRPLEST GAVVYSGSLYFQGAESRTVIRYELNTETVKAEKEIPGAGYHGQFPYS WGGYTDIDLAVDEAGLWVIYSTDEAKGAIVLSKLNPENLELEQTWET NIRKQSVANAFIICGTLYTVSSYTSADATVNFAYDTGTGISKTLTIPFKN RYKYSSMIDYNPLEKKLFAWDNLNMVTYDIKLSKM (SEQ ID NO: 3) Sequência de cDNA de MYOC ATGAGGTTCTTCTGTGCACGTTGCTGCAGCTTTGGGCCTGAGATG CCAGCTGTCCAGCTGCTGCTTCTGGCCTGCCTGGTGTGGGATGT GGGGGCCAGGACAGCTCAGCTCAGGAAGGCCAATGACCAGAGTG GCCGATGCCAGTATACCTTCAGTGTGGCCAGTCCCAATGAATCCA GCTGCCCAGAGCAGAGCCAGGCCATGTCAGTCATCCATAACTTAC AGAGAGACAGCAGCACCCAACGCTTAGACCTGGAGGCCACCAAA GCTCGACTCAGCTCCCTGGAGAGCCTCCTCCACCAATTGACCTTG GACCAGGCTGCCAGGCCCCAGGAGACCCAGGAGGGGCTGCAGA GGGAGCTGGGCACCCTGAGGCGGGAGCGGGACCAGCTGGAAAC CCAAACCAGAGAGTTGGAGACTGCCTACAGCAACCTCCTCCGAGA CAAGTCAGTTCTGGAGGAAGAGAAGAAGCGACTAAGGCAAGAAA ATGAGAATCTGGCCAGGAGGTTGGAAAGCAGCAGCCAGGAGGTA GCAAGGCTGAGAAGGGGCCAGTGTCCCCAGACCCGAGACACTGC TCGGGCTGTGCCACCAGGCTCCAGAGAAGTTTCTACGTGGAATTT GGACACTTTGGCCTTCCAGGAACTGAAGTCCGAGCTAACTGAAGT TCCTGCTTCCCGAATTTTGAAGGAGAGCCCATCTGGCTATCTCAG GAGTGGAGAGGGAGACACCGGATGTGGAGAACTAGTTTGGGTAG GAGAGCCTCTCACGCTGAGAACAGCAGAAACAATTACTGGCAAGT ATGGTGTGTGGATGCGAGACCCCAAGCCCACCTACCCCTACACC CAGGAGACCACGTGGAGAATCGACACAGTTGGCACGGATGTCCG CCAGGTTTTTGAGTATGACCTCATCAGCCAGTTTATGCAGGGCTA CCCTTCTAAGGTTCACATACTGCCTAGGCCACTGGAAAGCACGGG TGCTGTGGTGTACTCGGGGAGCCTCTATTTCCAGGGCGCTGAGT CCAGAACTGTCATAAGATATGAGCTGAATACCGAGACAGTGAAGG CTGAGAAGGAAATCCCTGGAGCTGGCTACCACGGACAGTTCCCG TATTCTTGGGGTGGCTACACGGACATTGACTTGGCTGTGGATGAA GCAGGCCTCTGGGTCATTTACAGCACCGATGAGGCCAAAGGTGC CATTGTCCTCTCCAAACTGAACCCAGAGAATCTGGAACTCGAACA AACCTGGGAGACAAACATCCGTAAGCAGTCAGTCGCCAATGCCTT CATCATCTGTGGCACCTTGTACACCGTCAGCAGCTACACCTCAGC AGATGCTACCGTCAACTTTGCTTATGACACAGGCACAGGTATCAG CAAGACCCTGACCATCCCATTCAAGAACCGCTATAAGTACAGCAG CATGATTGACTACAACCCCCTGGAGAAGAAGCTCTTTGCCTGGGA CAACTTGAACATGGTCACTTATGACATCAAGCTCTCCAAGATGTAG (SEQ ID NO: 4) Sequências alvo de shRNA de MYOC GGCCATGTCAGTCATCCAT (SEQ ID NO: 5) QAMSVIH (SEQ ID NO: 6) Sequência em ciclo de shRNA AATAGTGAAGCCACAGATGTATT (SEQ ID NO: 7) Sequência de polipeptídeo de RSPO1 (sequência de sinal sublinhada) MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELC SEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKC IKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTME CSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVG DHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARK ESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA (SEQ ID NO: 8) Sequência de polipeptídeo de RSPO2 (sequência de sinal sublinhada) MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCS KDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNR CARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEET MECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKD TILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQE QHSVFLATDRANQ (SEQ ID NO: 9) Sequência de polipeptídeo de RSPO4 (sequência de sinal sublinhada) MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGC STCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGAT CESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECE LGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVL SESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQ PGLQP (SEQ ID NO: 10) Sequência de polipeptídeo de 1 a 135 de truncação de RSPO1 (sequência de sinal sublinhada) MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELC SEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKC IKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSA (SEQ ID NO: 11) Sequência de polipeptídeo de 1 a 206 de truncação de RSPO1 (sequência de sinal sublinhada) MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELC SEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKC IKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTME CSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVG DHAACSDTKETRRCTVRRVPC (SEQ ID NO: 12) Sequência de polipeptídeo de 1 a 134 de truncação de RSPO2 (sequência de sinal sublinhada) MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCS KDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNR CARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAP (SEQ ID NO: 13) Sequência de polipeptídeo de 1 a 203 de truncação de RSPO2 (sequência de sinal sublinhada) MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCS KDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNR CARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEET MECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKD TILCPTIAESRRCKMTMRHC (SEQ ID NO: 14) Sequência de polipeptídeo de 1 a 135 de truncação de RSPO3 (sequência de sinal sublinhada) MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCA TCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDIN KCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEA (SEQ ID NO: 15) Sequência de polipeptídeo de 1 a 146 de truncação de RSPO3 (sequência de sinal sublinhada) MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCA TCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDIN KCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHT MECVSIV (SEQ ID NO: 16) Sequência de polipeptídeo de 1 a 206 de truncação de RSPO3 (sequência de sinal sublinhada) MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCA TCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDIN KCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHT MECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAK GNLCPPTNETRKCTVQRKKC (SEQ ID NO: 17) Sequência de polipeptídeo de 1 a 128 de truncação de RSPO4 (sequência de sinal sublinhada) MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGC STCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGAT CESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLA (SEQ ID NO: 18) Sequência de polipeptídeo de 1 a 195 de truncação de RSPO4 (sequência de sinal sublinhada) MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGC STCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGAT CESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECE LGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVL SESRKCPIQRP (SEQ ID NO:19) Sequência de polinucleotídeo de ITR modificada CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGAC CAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG (SEQ ID NO: 20) Iniciador da mutagênese avançado de MYOC370L (a substituição está sublinhada) ACCACGGACAGTTCCTGTATTCTTGGGGTGG (SEQ ID NO:21) Iniciador da mutagênese reverso de MYOC370L (a substituição está sublinhada) CCACCCCAAGAATACAGGAACTGTCCGTGGT (SEQ ID NO:22) Iniciador da mutagênese avançado de MYOCY437H (a substituição está sublinhada) TCTGTGGCACCTTGCACACCGTCAGCAGC (SEQ ID NO:23) Iniciador da mutagênese reverso de MYOCY437H (a substituição está sublinhada) GCTGCTGACGGTGTGCAAGGTGCCACAGA (SEQ ID NO:24)

Claims (21)

1. Partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizada pelo fato de que compreende um vetor que codifica RSPO1, RSPO2, RSPO3 ou RSPO4, para uso na fabricação de um medicamento para tratar glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, em que o medicamento é formulado para administração da partícula de rAAV ao olho do mamífero, em que o RSPO1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12; em que o RSPO2 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14; em que o RSPO3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17; e em que o RSPO4 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
2. Partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), caracterizada pelo fato de que compreende um vetor que codifica RSPO1, RSPO2, RSPO3 ou RSPO4, para uso na fabricação de um medicamento para intensificar a sinalização de Wnt em células de malha trabecular em um mamífero apresentando um distúrbio ocular, em que o medicamento é formulado para administração da partícula de rAAV ao olho do mamífero, em que o RSPO1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12; em que o RSPO2 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14; em que o RSPO3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17; e em que o RSPO4 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
3. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o medicamento compreende ainda uma partícula de rAAV compreendendo um vetor que codifica um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 no mamífero, em que o RNAi de MYOC é um shRNA de MYOC compreendendo a sequência de alça de SEQ ID NO: 7.
4. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o vetor codifica ainda um RNAi de MYOC que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 no mamífero, em que o RNAi de MYOC é um shRNA de MYOC compreendendo a sequência de alça de SEQ ID NO: 7.
5. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que: (i) o glaucoma de miocilina (MYOC) é um glaucoma primário de ângulo aberto (POAC); (ii) o glaucoma de MYOC é a forma juvenil de glaucoma primário de ângulo aberto; e/ou (iii) o mamífero é um ser humano e o glaucoma de MYOC é associado com uma mutação em uma miocilina humana selecionada compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido selecionadas de E323K, K398R, Q368X, G364V, P370L, D380A, K423E, Y437H e I477S.
6. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que: (i) o medicamento compreende pelo menos 1 x 109 cópias de genoma da partícula de rAAV para administração ao mamífero; (ii) o medicamento é formulado para administração por injeção intravítrea e/ou injeção intracameral; (iii) o medicamento é formulado para administração em mais do que um local do olho; e/ou (iv) o medicamento é uma composição farmacêutica.
7. Partícula de AAV recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor de AAV, em que o vetor de AAV compreende ácido nucleico que codifica RSPO1, RSPO2, RSPO3 ou RSPO4, opcionalmente em que o ácido nucleico codifica ainda shRNA de MYOC compreendendo a sequência de alça de SEQ ID NO: 7 que direciona a expressão de uma miocilina (MYOC) tendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 6 em um mamífero, em que o RSPO1 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12; em que o RSPO2 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14; em que o RSPO3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17; e em que o RSPO4 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
8. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4 está ligada de maneira operável a um promotor, opcionalmente em que: (i) o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3 ou RSPO4, no olho do mamífero; e/ou (ii) o promotor é capaz de expressar a RSPO1, RSPO2, RSPO3 ou RSPO4 nas células da malha trabecular.
9. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que: a partícula de rAAV compreende um capsídeo de AAV selecionado dentre AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6 ShH10, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 e AAVrh10.
10. Partícula de rAAV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que: (i) o vetor compreende repetições terminais invertidas (ITRs) de sorotipo de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12; e/ou (ii) o vetor compreende ITRs de sorotipo 2 de AAV.
11. Partícula de rAAV, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a partícula de rAAV compreende um capsídeo de sorotipo 2 de AAV, e opcionalmente em que: (i) o capsídeo de sorotipo 2 de AAV compreende uma proteína de capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, que numera em relação a VP1 de AAV2; e/ou (ii) o vetor compreende ITRs de AAV2.
12. Kit para tratamento de glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a partícula de rAAV, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
13. Agente que aumenta a sinalização de Wnt no olho de um mamífero, caracterizado pelo fato de que é para uso na fabricação de um medicamento para tratar glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero, em que o medicamento é formulado para administração do agente ao olho do mamífero, em que o agente aumenta a atividade de R-espondina 1 (RSPO1), R-espondina 2 (RSPO2), R-espondina 3 (RSPO3) ou R- espondina 4 (RSPO4) no olho do mamífero.
14. Partícula recombinante de AAV2, caracterizada pelo fato de que é para uso na fabricação de um medicamento para tratar um distúrbio ocular em um mamífero, em que a partícula de AAV2 compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende ácido nucleico que codifica um transgene terapêutico, e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, que numera com base em VP1 de AAV2, opcionalmente em que: (i) a partícula de rAAV transduz as células da malha trabecular do olho; (ii) o transgene terapêutico é expresso na malha trabecular do olho; (iii) o distúrbio ocular é um distúrbio associado com a malha trabecular do olho; (iv) o distúrbio ocular é glaucoma de miocilina (MYOC); e/ou (v) o mamífero é um ser humano.
15. Partícula de AAV2 recombinante, caracterizada pelo fato de que é para uso na fabricação de um medicamento para liberação de ácido nucleico na malha trabecular do olho de um mamífero, em que a partícula de AAV2 compreende um vetor de rAAV, em que o vetor de rAAV compreende o ácido nucleico e em que a partícula de AAV2 compreende a proteína do capsídeo de AAV2 compreendendo uma substituição de aminoácido R471A, que numera com base em VP1 de AAV2, opcionalmente em que: (i) o ácido nucleico codifica um transgene terapêutico; e/ou (ii) o medicamento é formulado para administração intravítrea e/ou intracameral.
16. Kit para tratamento de um distúrbio ocular em um mamífero, caracterizado pelo fato de que compreende a partícula de rAAV2, como definida na reivindicação 14, opcionalmente em que: (i) o kit compreende ainda instruções de uso; e/ou (ii) o kit compreende ainda tampões e/ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
17. Uso de uma partícula de rAAV, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e/ou de um agente, como definido na reivindicação 13, e/ou de uma partícula de AAV2 recombinante, como definida na reivindicação 14 ou 15, o dito uso sendo caracterizado pelo fato de que é para fabricar um medicamento e/ou um kit e/ou uma composição farmacêutica para: tratar glaucoma de miocilina (MYOC) em um mamífero; e/ou intensificar a sinalização de Wnt em células de malha trabecular em um mamífero apresentando um distúrbio ocular; e/ou liberar ácido nucleico na malha trabecular do olho de um mamífero; e/ou tratar um distúrbio ocular em um mamífero.
18. Partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o vetor codifica RSPO1 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
19. Partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o vetor codifica RSPO2 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 14.
20. Partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o vetor codifica RSPO3 com sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 ou SEQ ID NO: 17.
21. Partícula de vírus adeno-associado recombinante (rAAV), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o vetor codifica RSPO4 com sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 18 ou SEQ ID NO: 19.
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