JP2020105194A - ミオシリン(myoc)緑内障を処置するためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents
ミオシリン(myoc)緑内障を処置するためのアデノ随伴ウイルスベクター Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2014年9月16日に出願した米国仮出願第62/051,299号の優先権の利益を主張するものであり、前記仮出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。
ASCIIテキストファイルでの以下の提出内容は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている:コンピュータ読み取り可能な形式(CRF)の配列表(ファイル名:159792012540SeqList.txt、記録日:2015年9月15日、サイズ:31KB)。
PO1を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO1またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO1またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO1は、短縮型RSPO1である。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO2を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO2は、短縮型RSPO2である。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO3を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO3は、短縮型RSPO3である。いくつかの実施形態において、薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO4を増加させる。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO4は、短縮型RSPO4である。
SPO2またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO2は、短縮型RSPO2である。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO3を増加させる。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO3は、短縮型RSPO3である。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO4を増加させる。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体である。いくつかの実施形態において、第2の薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である。いくつかの実施形態において、RSPO4は、短縮型RSPO4である。
発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるWntシグナル伝達を増進する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含むrAAV)粒子とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるWntシグナル伝達を増進する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン(MYOC)緑内障である。
PO2は、配列番号14のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO2は、配列番号14に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO3は、ヒトRSPO3である。いくつかの実施形態において、RSPO3は、ヒトRSPO3に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号1のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号1に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号15のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号15に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号16のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号17のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO3は、配列番号17に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO4は、ヒトRSPO4である。いくつかの実施形態において、RSPO4は、ヒトRSPO4に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号10のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号10に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号18のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号18に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号12に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、および/またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、および/またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、および/またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである。
きる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである。いくつかの実施形態において、MYOC RNAi(例えば、shRNA)の発現は、哺乳動物の眼におけるMYOCの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、MYOC RNAi(例えば、shRNA)の発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるMYOCの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、MYOCは、野生型MYOCである。いくつかの実施形態において、MYOCは、突然変異型MYOCである。いくつかの実施形態において、MYOCは、野生型MYOCおよび突然変異型MYOCである。さらなる実施形態において、突然変異型MYOCは、ヒトMYOCのP370Lおよび/またはY437Hアミノ酸置換に対応するアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、E323K、K398R、Q368X、G364V、P370L、D380A、K423E、Y437HおよびI477Sから選択される1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。
異体は、ヒトRSPO3である。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO3またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記RSPO3またはその機能的変異体は、配列番号1および/または15〜17のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO3またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記RSPO3またはその機能的変異体は、配列番号1および/または15〜17のアミノ酸配列に対して80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO4をコードする核酸を含み、前記RSPO4は、ヒトRSPO4である。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記RSPO4またはその機能的変異体は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記RSPO4またはその機能的変異体は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列に対して80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態において、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている。さらなる実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、および/またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである。
ノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、原発開放隅角緑内障(POAC)に関連している。いくつかの実施形態において、ミオシリン突然変異は、若年性の原発開放隅角緑内障(JOAC)に関連している。
の機能的変異体をコードするベクターを含むrAAVウイルス粒子;AAVベクターを含むrAAVウイルス粒子であって、該ベクターが、哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸(例えば、shRNAを含む、MYOC RNAi)をコードする核酸を含む、rAAVウイルス粒子;および/またはAAVベクターを含むrAAVウイルス粒子であって、該AAVベクターは、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4もしくはその機能的変異体をコードし、かつ哺乳動物におけるMYOCの発現を標的とするMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードする核酸を含む、rAAVウイルス粒子を含む、前記キットを提供する。いくつかの実施形態において、キットは、ミオシリン(MYOC)緑内障の処置に関する使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、キットは、緩衝剤および/または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む。
は、ヒトRSPO4である。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記RSPO4またはその機能的変異体は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、前記RSPO4またはその機能的変異体は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列に対して80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである。いくつかの実施形態において、MYOC RNAiは、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態において、プロモーターは、哺乳動物の眼においてMYOC RNAiを発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてMYOC RNAiを発現させることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである。いくつかの実施形態において、MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の眼におけるMYOCの発現を低減または阻害する。いくつかの実施形態において、MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるMYOCの発現を低減または阻害する。
は、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAV血清型逆位末端反復配列(ITR)を含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、AAV血清型2 ITRを含む。いくつかの実施形態において、AAVウイルス粒子は、同じAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRおよびカプシドを含む。いくつかの実施形態において、AAVウイルス粒子は、rAAVウイルス粒子のカプシドとは異なるAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRを含む。いくつかの実施形態において、rAAVウイルス粒子は、AAV2カプシドを含み、ベクターは、AAV2 ITRを含む。いくつかの実施形態において、AAV2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む。
V2カプシドタンパク質を含む、前記組換えAAV2粒子を提供する。いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物の眼障害を処置するための組換えAAV2粒子であって、該AAV2粒子はrAAVベクターを含み、該rAAVベクターは治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記組換えAAV2粒子を提供する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される。いくつかの実施形態において、治療用導入遺伝子は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする。いくつかの実施形態において、眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である。いくつかの実施形態において、眼障害は、ミオシリン(MYOC)緑内障である。いくつかの実施形態において、哺乳動物はヒトである。
異型ミオシリン)の発現を;例えば、MYOC発現を標的とするRNAiの使用によって、阻害する。いくつかの態様において、AAV粒子は、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/もしくはRSPO4、ならびに/またはそれらに関する機能的変異体をコードするベクターを含む。他の態様において、rAAV粒子は、哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とするMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするベクターを含む。他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/もしくはRSPO4、ならびに/またはそれらに関する機能的変異体をコードするベクターを含むrAAV粒子と、該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするベクターを含むrAAV粒子との混合物を、該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。他の態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/もしくはRSPO4、ならびに/またはそれらに関する機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリン(MYOC shRNA)の発現を標的とするMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするベクターを含むrAAV粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。本発明は、ミオシリン(MYOC)緑内障を処置するための組成物およびキットであって、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/もしくはRSPO4ならびに/またはそれらに関する機能的変異体ならびに/またはMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするrAAVベクターを使用する、前記組成物およびキットも提供する。本発明は、組換えAAV粒子、組成物およびキットも提供する。
本明細書に記載するまたは本明細書中で参照する技術および手順は一般によく理解されており、当業者によって、例えば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Sambrookら、第4版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2012);Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubelら、2003);the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.);PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson、B.D.HamesおよびG.R.Taylor編、1995);Antibodies、A Laboratory Manual(Harlow and Lane編、1988);Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I.Freshney、第6版、J.Wiley and Sons、2010);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編、1984);Methods in Molecular Biology、Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis編、Academic Press、1998);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.MatherおよびP.E.Roberts、Plenum Pre
ss、1998);Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths、およびD.G.Newell編、J.Wiley and Sons、1993〜8頁);Handbook of Experimental Immunology(D.M.WeirおよびC.C.Blackwell編、1996);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.MillerおよびM.P.Calos編、1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullisら編、1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coliganら、1991);Short Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、J.Wiley and Sons、2002);Immunobiology(C.A.Janewayら、2004);Antibodies(P.Finch、1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty編、IRL Press、1988〜1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.ShepherdおよびC.Dean編、Oxford University Press、2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.HarlowおよびD.Lane、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999);The Antibodies(M.ZanettiおよびJ.D.Capra編、Harwood Academic Publishers、1995);およびCancer:Principles and Practice of Oncology(V.T.DeVitaら編、J.B.Lippincott Company、2011)のような従来の方法論を用いて一般に利用される。
「ベクター」は、本明細書で用いる場合、in vitroまたはin vivoのいずれかで宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。
リン酸化なども含む。さらに、本発明の目的では、「ポリペプチド」は、ネイティブ配列に対する修飾、例えば欠失、付加および置換(一般に、本質的に保存的なもの)を含むタンパク質を指すが、ただし、該タンパク質が所望の活性を維持することを条件とする。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであることもあり、または偶然なもの、例えば、タンパク質を生産する宿主の突然変異もしくはPCR増幅に起因するエラーであることもある。
ることもある。
した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、該参照ポリペプチドまたは核酸配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドと同一である候補配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージと定義する。アミノ酸または核酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1987)、補遺30、セクション7.7.18、表7.7.1に記載されているものを使用する、およびBLAST、BLAST−2、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアを含む、当技術分野における技術の範囲内の様々な方法で達成することができる。好ましいアライメントプログラムは、ALIGN Plus(Scientific and Educational Software、Pennsylvania)である。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。本明細書の目的では、所与のアミノ酸配列Bに対しての、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸同一性%(あるいは、所与のアミノ酸配列Bに対しての、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同一性%を有するまたは含む所与のアミノ酸配列Aと表現することができる)を次のように算出する:100×分数X/Y(ここで、Xは、配列アライメントプログラムによってそのプログラムのAとBのアライメントで同一マッチとしてスコアされるアミノ酸残基の数であり、Yは、B中のアミノ酸残基の総数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと同一でない場合、Bに対してのAのアミノ酸配列同一性%が、Aに対してのBのアミノ酸配列同一性%と同一にならないことは理解されるであろう。本明細書の目的では、所与の核酸配列Dに対しての、それとの、またはそれに対する所与の核酸配列Cの核酸同一性%(あるいは、所与の核酸配列Dに対しての、それとの、またはそれに対する特定の核酸配列同一性%を有するまたは含む所与の核配列Cと表現することができる)を次のように算出する:100×分数W/Z(ここで、Wは、配列アライメントプログラムによってそのプログラムのCとDのアライメントで同一マッチとしてスコアされるヌクレオチドの数であり、Zは、D中のヌクレオチドの総数である)。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと同一でない場合、Dに対してのCの核酸配列同一性%が、Cに対してのDの核酸配列同一性%と同一にならないことは理解されるであろう。
れない。「処置」は、処置を受けていない場合に予期される生存期間と比較して生存期間の延長も意味することができる。
JOAGおよびJOAG1としても公知)に関与するタンパク質(または前記タンパク質をコードする遺伝子)を指す。ミオシリンは、多くの異なる細胞タイプにおいて分泌タンパク質として発現される。眼では、ミオシリンは、眼圧(IOP)の調節に肝要な組織である、線維柱帯網によって房水に分泌されると考えられている。上で説明したように、ミオシリンの突然変異は、原発開放隅角緑内障のサブセット、特に、若年性のこの障害の主原因であると考えられている。
Biol.13(3):242頁を参照されたい。
すべての活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、機能的RSPO1変異体は、短縮型RSPO1である。短縮型RSPO1ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号11および12、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号11および12が挙げられる。
Biol.13(3):242頁を参照されたい。
Wntシグナル伝達間の関連のさらなる説明については、例えば、de Lau,W.B.ら(2012)Genome Biol.13(3):242頁を参照されたい。
Biol.13(3):242頁を参照されたい。
Entrez Gene ID 343637(RSPO4、別名CRISTIN4およびC20orf182)、GenBank Entrez Gene ID 228770(Rspo4、別名A730099F22およびA930029K19Rik)、GenBank Entrez Gene ID 485813、およびGenBank
Entrez Gene ID 101091527を挙げることができる。いくつかの実施形態において、RSPO4は、RSPO4の機能的変異体である。いくつかの実施形態において、機能的RSPO4変異体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および/または欠失(例えば、短縮化)を含むことがあるが、完全長RSPO4の1つまたはそれ以上の活性(例えば、Wntシグナル伝達活性、本明細書に記載および/または例示するアッセイ)に関する一部またはすべての活性を保持することができる。いくつかの実施形態において、機能的RSPO4変異体は、短縮型RSPO4である。短縮型RSPO4ポリペプチドの例としては、これらに限定されるものではないが、配列番号18および19、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号18および19が挙げられる。
本発明は、ミオシリン(MYOC)緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むrAAV粒子が哺乳動物の眼に送達される、前記方法を提供する。いくつかの実
施形態において、ミオシリン(MYOC)緑内障は、原発開放隅角緑内障(POAC)である。いくつかの実施形態において、ミオシリン(MYOC)緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障(JOAC)である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒト(例えば、POACを有するヒトまたはJOACを有するヒト)である。いくつかの実施形態において、ミオシリン(MYOC)緑内障を有する哺乳動物は、突然変異MYOCを有する。いくつかの実施形態において、突然変異MYOCは、ヒトMYOCのE323K、K398R、Q368X、G364V、P370L、D380A、K423E、Y437HおよびI477Sに対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、突然変異MYOC遺伝子は、ヒトMYOCのP370Lおよび/またはY437Hアミノ酸置換に対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトのミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4もしくはその機能的変異体および/またはMYOC RNAi(例えばshRNA)をコードするベクターを含む有効量のrAAV粒子を該ヒトの眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障の症状の軽減;例えば、眼圧の低下、MYOCの線維柱帯網内蓄積の低減、高眼圧の低下、または線維柱帯網からの房水流出の増加、に使用される。
本発明は、ミオシリン(MYOC)緑内障の遺伝子治療の方法であって、治療用ベクターを含むrAAV粒子が哺乳動物の眼に送達され;例えば、該治療用ベクターは治療用核酸および/または治療用ポリペプチドをコードすることができる、前記方法を提供する。治療用核酸および/または治療用ポリペプチドをコードする治療用AAVベクターは、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、作成することができる。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、Wntシグナル伝達を刺激するポリペプチドである。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、突然変異型MYOCの存在下でWntシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、ヒト突然変異型MYOCの存在下でWntシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態において、治療用ポリペプチドは、緑内障に関連するヒト突然変異型MYOCの存在下でWntシグナル伝達を刺激する。いくつかの実施形態において、突然変異型MYOCは、P370Lおよび/またはY437Hアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、突然変異MYOCは、ヒトMYOCのE323K、K398R、Q368X、G364V、P370L、D380A、K423E、Y437HおよびI477Sに対応する1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む。
3は、配列番号1のアミノ酸配列に対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10より多くの置換、付加および/または欠失を含むが、Wntシグナル伝達を(例えば、突然変異型MYOCの存在下で)刺激する能力を維持する。いくつかの実施形態において、変異型RSPO3は、配列番号1に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO3は、短縮型RSPO3である。いくつかの実施形態において、短縮型RSPO3は、1つまたはそれ以上のフューリン様Cysリッチドメイン(例えば、FU1および/またはFU2)を含むことがあり、しかし次のうちの1つまたはそれ以上がないことがある:シグナルペプチド、トロンボスポンジン1型ドメイン(例えば、TSR−1またはTSP1)、および/または正電荷を有するC末端ドメイン(例えば、二分NLSおよび/またはBRドメインを含む;参考のために図11〜13Cを参照されたい)。ある特定の実施形態において、短縮型RSPO3は、配列番号15、16および/もしくは17、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号15、16および/もしくは17を含むことがある。ある特定の実施形態において、短縮型RSPO3は、配列番号15,16および/または17に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO4ポリペプチドは、ヒトRSPO4である。いくつかの実施形態において、RSPO4は、配列番号9のアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。RSPO2機能的変異体の例としては、配列番号10のアミノ酸配列に対する1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加および/または欠失を有するRSPO2が挙げられる。いくつかの実施形態において、変異型RSPO4は、配列番号10のアミノ酸配列に対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10より多くの置換、付加および/または欠失を含むが、Wntシグナル伝達を(例えば、突然変異型MYOCの存在下で)刺激する能力を維持する。いくつかの実施形態において、変異型RSPO4は、配列番号10に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。いくつかの実施形態において、RSPO4は、短縮型RSPO4である。いくつかの実施形態において、短縮型RSPO4は、1つまたはそれ以上のフューリン様Cysリッチドメイン(例えば、FU1および/またはFU2)を含むことがあり、しかし次のうちの1つまたはそれ以上がないことがある:シグナルペプチド、トロンボスポンジン1型ドメイン(例えば、TSR−1またはTSP1)、および/または正電荷を有するC末端ドメイン(例えば、二分NLSおよび/またはBRドメインを含む;参考のために図11〜13Cを参照されたい)。ある特定の実施形態において、短縮型RSPO4は、配列番号18および/もしくは19、またはシグナルペプチドがないプロセシングされた形態の配列番号18および19を含むことがある。ある特定の実施形態において、短縮型RSPO4は、配列番号18および/または19に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%より高い同一性を有する。
酸および/または治療用ポリペプチドをコードすることができる、前記方法を提供する。治療用核酸および/または治療用ポリペプチドをコードする治療用AAVベクターは、標準的合成および組換え法を用いる、当技術分野において公知の方法を用いて、作成することができる。いくつかの実施形態において、治療用核酸は、MYOCの発現を標的とするRNAをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、MYOCの発現を低減または阻害するRNAをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型MYOCの発現を低減または阻害するRNAをコードする。いくつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ヒトMYOCの発現を低減または阻害するRNAをコードする。いくつかの実施形態において、突然変異型ヒトMYOCは、P370Lアミノ酸置換および/またはY437アミノ酸置換を含む。治療用核酸の非限定的な例としては、RNAi、低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)および/またはリボザイム(例えば、ハンマーヘッド型およびヘアピンリボザイム)が挙げられる。いくつかの実施形態において、MYOCの発現を低減または阻害するRNAをコードする異種核酸は、MYOC(例えば、野生型および突然変異型MYOC)の発現を低減または阻害するshRNAである。
くつかの実施形態において、異種核酸は、突然変異型ヒトMYOCの発現を低減または阻害するRNAをコードする。いくつかの実施形態において、突然変異型ヒトMYOCは、P370Lアミノ酸置換および/またはY437アミノ酸置換を含む。治療用核酸の非限定的な例としては、RNAi、siRNA、miRNA、shRNAおよび/またはリボザイムが挙げられる。1つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードするベクターを含むrAAV粒子、および1つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むrAAV粒子は、哺乳動物に同時に投与されることもあり、または逐次的に投与されることもある。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードするベクターを含むrAAV粒子は、1つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むrAAV粒子が投与される前に投与される。いくつかの実施形態において、1つまたはそれ以上の治療用ポリペプチドをコードするベクターを含むrAAV粒子は、1つまたはそれ以上の治療用核酸をコードするベクターを含むrAAV粒子が投与された後に投与される。
RNAi(例えば、shRNA)は、MYOCのQAMSVIH(配列番号6)アミノ酸配列を標的とする。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、MYOCの発現を標的とする(例えば、低減または阻害する)1つより多くのRNAi(例えば、shRNA)を含むベクターをコードする。いくつかの実施形態において、MYOC RNAi(
例えば、shRNA)のループ配列は、AATAGTGAAGCCACAGATGTATT(配列番号7)の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、MYOCの発現を標的とする(例えば、低減または阻害する)1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたはそれ以上のRNAi(例えば、shRNA)を含むベクターをコードする。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載するrAAV粒子のいずれかを含む組成物を提供する。一般に、本発明の方法およびシステムに使用するための組成物は、好ましくは、医薬的に許容される賦形剤中の、ポリペプチドおよび/またはRNAをコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子の有効量を含む。当技術分野において周知であるように、医薬的に許容される賦形剤は、薬理学的に有効な物質の投与を助長する比較的不活性な物質であり、溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前に液体に溶解もしくは懸濁させるのに好適な固体形態として供給することができる。例えば、賦形剤は、形状もしくは稠度を与えることができ、または希釈剤として作用することができる。好適な賦形剤としては、安定剤、湿潤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変えるための塩、封入剤、pH緩衝物質および緩衝剤が挙げられるが、これらに限定されない。
そのような賦形剤は、過度の毒性なく投与することができる、眼への直接送達に好適な任意の医薬品を含む。医薬的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、様々なTWEEN化合物のいずれか、ならびに液体、例えば水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが挙げられるが、これらに限定されない。医薬的に許容される塩、例えば、無機酸塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など;および有機酸の塩、例えば酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などを、そこに含めることができる。医薬的に許容される賦形剤の詳細な論考は、REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Mack Pub.Co.、N.J.1991)において入手することができる。
いくつかの態様において、本発明は、哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、rAAV粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/もしくはRSPO4ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするrAAVベクターと、MYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするrAAVベクターとを含む。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、硝子体内および/前房内注射によって眼に送達される。rAAV粒子の眼への投与方法は、当技術分野において公知である。
網膜下送達方法は、当技術分野において公知である。例えば、参照によって本明細書に組み入れられているWO2009/105690を参照されたい。簡単に言うと、rAAV粒子(例えば、rAAV2粒子)を黄斑および中心窩の網膜下に送達するための一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない
。
ってもよい。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約15〜17分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、ベクターは、約17〜20分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約20〜22分にかけて注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約35〜約65μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約35μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約40μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約45μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約50μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約55μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約60μl/分の速度で注射される。いくつかの実施形態において、rAAV組成物は、約65μl/分の速度で注射される。ブレブの注射速度および時間が、例えば、中心網膜の細胞に接近するのに十分な網膜剥離を生じさせるために必要なrAAV組成物の容量またはブレブのサイズ、rAAV組成物を送達するために使用されるカニューレのサイズ、および本発明のカニューレの位置を安全に維持する能力によって左右されることがあることは、当業者には理解されるであろう。
欠如に起因して、ブレブは移動し、眼の依存部に引き寄せられる。眼球を適切に配置することによって、隣接領域(例えば、黄斑および/または中心窩)を含むように網膜下rAAV組成物のブレブを操作する。場合によっては、ブレブの大部分は、流空気置換を使用しなくてもブレブを引き寄せさせるのに十分なものである。眼内の所望の位置にブレブを引き寄せさせるように対象の頭の位置を変えることによって、所望の位置へのブレブの移動をさらに助長してもよい。ブレブの所望の立体配置を達成したら、流体を硝子体腔に戻す。この流体は、適切な流体、例えば、作りたての食塩水である。一般に、網膜下rAAV組成物を網膜切開に対する網膜裂孔閉鎖術なしで、および眼内タンポナーデなしで、生体内原位置に放置してもよく、網膜は約48時間以内に自然に再付着することになる。
感度緑色蛍光タンパク質などのマーカーの使用を用いて、ウイルス粒子の形質導入を検出することができる。
硝子体内注射の一般的な方法は、以下のおおまかな概要によって説明することができる。この例は、前記方法の特定の特徴を説明することを意図したものに過ぎず、断じて制限を意図したものではない。硝子体内注射の手技は、当技術分野において公知である(例えば、Peyman,G.A.ら(2009)Retina 29(7):875〜912頁、ならびにFagan,X.J.およびAl−Qureshi,S.(2013)Clin.Experiment.Ophthalmol.41(5):500〜7頁を参照されたい)。
眼への前房内注射方法は、当技術分野において公知である。前房内注射の非限定的な例は、Buieら(2010)IOVS 51(1):236〜248頁によって提供されている。
ば、隅角鏡検査を用いて、POAGの診断を助ける評価を得ることができる。
本発明は、異種核酸を含むrAAVベクターの網膜下送達によって眼に異種核酸を送達
する方法であって、該rAAVベクターは、HSPGと相互作用するアミノ酸の1つまたはそれ以上の置換を含むrAAVカプシドに封入されている、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、異種核酸(例えば、導入遺伝子)は、プロモーターに作動可能に連結されている。例示的プロモーターとしては、サイトメガロウイルス(CMV)最初期プロモーター、RSV LTR、MoMLV LTR、ホスホグリセリン酸キナーゼ−1(PGK)プロモーター、サルウイルス40(SV40)プロモーターおよびCK6プロモーター、トランスサイレチンプロモーター(TTR)、TKプロモーター、テトラサイクリン応答性プロモーター(TRE)、HBVプロモーター、hAATプロモーター、LSPプロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター(LSP)、E2Fプロモーター、テロメラーゼ(hTERT)プロモーター;サイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβ−アクチン/ウサギβ−グロビンプロモーター(CAGプロモーター;Niwaら、Gene、1991、108(2):193〜9頁)および伸長因子1−αプロモーター(EF1−α)プロモーター(Kimら、Gene、1990、91(2):217〜23頁およびGuoら、Gene Ther.、1996、3(9):802〜10頁)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターは、ヒトβ−グルクロニダーゼプロモーター、またはニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターに連結されているサイトメガロウイルスエンハンサーを含む。プロモーターは、構成的、誘導性または抑制性プロモーターであることができる。いくつかの実施形態において、プロモーターは、眼の細胞において異種核酸を発現する能力がある。いくつかの実施形態において、プロモーターは、光受容器細胞またはRPEにおいて異種核酸を発現する能力がある。実施形態において、プロモーターは、ロドプシンキナーゼ(RK)プロモーター、例えば、ヒトRKプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、オプシンプロモーター、例えば、ヒトオプシンプロモーターまたはマウスオプシンプロモーターである。いくつかの実施形態において、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト)のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、CBAプロモーターの制御下のRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子を該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト)のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、CBAプロモーターの制御下のMYOC(例えば、ヒトMYOC)を標的とする(例えば、低減または阻害する)RNAi(例えば、shRNA)をコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子を該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト)のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、CBAプロモーターの制御下のRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子と、CBAプロモーターの制御下のMYOC(例えば、ヒトMYOC)を標的とする(例えば、低減または阻害する)RNAi(例えば、shRNA)をコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子とを該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、哺乳動物(例えば、ヒト)のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、CBAプロモーターの制御下のRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体とCBAプロモーターの制御下のMYOC(例えば、ヒトMYOC)を標的とする(例えば、低減もしくは阻害する)RNAi(例えば、shRNA)とをコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子を該哺乳動物の眼に投与することによる、前記方法を提供する。
および/または核酸の発現を確立するための任意の要素、例えば、プロモーター、ITR、リボソーム結合要素、ターミネーター、エンハンサー、選択マーカー、イントロン、ポリAシグナル、および/または複製起点を挙げることができる。
rAAVウイルス粒子
本発明は、ミオシリン(MYOC)緑内障を処置するためにrAAV粒子を使用する方法を提供し、rAAV粒子を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、ウイルス粒子は、1つまたは2つのITRと隣接している、本明細書に記載するRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体および/またはMYOC RNAi(例えばshRNA)をコードする配列を含む核酸を含む組換えAAV粒子である。核酸は、AAV粒子に封入されている。AAV粒子は、カプシドタンパク質も含む。いくつかの実施形態において、核酸は、転写方向に成分が作動可能に連結されている目的(例えば、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体および/またはMYOC RNAi(例えばshRNA)をコードする核酸)のコード配列、転写開始および終結配列を含む制御配列を含み、それによって発現カセットを形成する。発現カセットは、その5’および3’末端に少なくとも1つの機能性AAV ITR配列が隣接している。「機能性AAV ITR配列」は、該ITR配列が、AAVビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングのために意図した通りに機能することを意味する。Davidsonら、PNAS、2000、97(7)3428〜32頁;Passiniら、J.Virol.、2003、77(12):7034〜40頁;およびPechanら、Gene Ther.、2009、16:10〜16頁を参照されたい。これらの参考文献のすべては、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。本発明のいくつかの態様を実施するために、組換えベクターは、カプシド封入に不可欠なAAVの配列のすべておよびrAAVによる感染のための物理的構造を少なくとも含む。本発明のベクターに使用するためのAAV ITRは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要がなく(例えば、Kotin、Hum.Gene Ther.、1994、5:793〜801頁に記載の通り)、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって改変されていてもよく、またはいくつかのAAV血清型のいずれに由
来するものであってもよい。AAVの40より多くの血清型が今では公知であり、新たな血清型、および既存の血清型の変異体が同定され続けている。Gaoら、PNAS、2002、99(18):11854〜6頁;Gaoら、PNAS、2003、100(10):6081〜6頁;およびBossisら、J.Virol.、2003、77(12):6799〜810頁を参照されたい。任意のAAV血清型の使用が本発明の範囲内で考えられる。いくつかの実施形態において、rAAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAVなどを限定ではないが含む、AAV血清型に由来するベクターである。いくつかの実施形態において、AAV中の核酸は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV2R471A、AAV DJ、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAV血清型逆位末端反復配列(ITR)などのITRを含む。いくつかの実施形態において、AAV中の核酸は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体;MYOC RNAi(例えば、shRNA);またはRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体と本明細書に記載のMYOCをさらにコードする。例えば、AAV中の核酸は、本明細書において企図される任意のAAV血清型の、少なくとも1つのITRを含むことができ、配列番号6を標的とし、かつ配列番号7のループ配列を含むMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードする核酸、ならびに/または次のうちの1つもしくはそれ以上をさらにコードすることができる:配列番号8、11および/もしくは12を含むRSPO1;配列番号9、13および/もしくは14を含むRSPO2;配列番号1、15、16および/もしくは17を含むRSPO3;ならびに配列番号10、18および/もしくは19を含むRSPO4。いくつかの実施形態において、核酸は、配列番号8、11もしくは12と少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるRSPO1;配列番号9、13もしくは14と少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるRSPO2;配列番号1もしくは15〜17と少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるRSPO3;または配列番号10、18もしくは19と少なくとも約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%同一であるRSPO4をコードする。
つかの実施形態において、AAVウイルス粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484、R487、K527、K532、R585またはR588位のうちの1カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むAAVカプシドを含む。さらなる実施形態において、rAAV粒子は、クレードA〜FのAAV血清型のカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、突然変異型カプシドタンパク質は、AAVカプシドを形成する能力を維持する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、線維柱帯網への形質導入を可能にするカプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、線維柱帯網への形質導入を可能にする突然変異型カプシドタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、AAV2のカプシドタンパク質であって、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含む前記カプシドタンパク質を含む(Lochrie ら、J Virol(2006)80(2):821〜834頁)。いくつかの実施形態において、本発明は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体をコードするベクター;AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシド;および/またはMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするベクターを含む、rAAV粒子を提供する。
いくつかの態様において、本発明は、組換え自己相補型ゲノムを含むウイルス粒子を提
供する。自己相補性ゲノムを有するAAVウイルス粒子、および自己相補性AAVゲノムの使用方法は、米国特許第6,596,535号、同第7,125,717号;同第7,765,583号;同第7,785,888号;同第7,790,154号;同第7,846,729号;同第8,093,054号;および同第8,361,457号;ならびにWang Z.ら(2003)Gene Ther 10:2105〜2111頁に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられている。自己相補性ゲノムを含むrAAVは、その部分相補性配列(例えば、導入遺伝子の相補性コードおよび非コード鎖)によって二本鎖DNA分子を迅速に形成することになる。いくつかの実施形態において、本発明は、AAVゲノムを含むAAVウイルス粒子であって、該rAAVゲノムが、第1の異種ポリヌクレオチド配列(例えば、miR−708および/またはロドプシンコード鎖)と、第2の異種ポリヌクレオチド配列(例えば、miR−708のアンチセンス鎖および/またはロドプシン非コードもしくはアンチセンス鎖)とを含み、該第1の異種ポリヌクレオチド配列は、その長さの大部分またはすべてにわたって該第2のポリヌクレオチド配列と鎖間塩基対を形成することができる、前記AAVウイルス粒子を提供する。いくつかの実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチド配列と第2の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖間塩基対合を助長する配列;例えば、ヘアピンDNA構造、によって連結されている。ヘアピン構造、例えば、siRNA分子のヘアピン構造は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態において、第1の異種ポリヌクレオチド配列と第2の異種ポリヌクレオチド配列は、突然変異ITR(例えば、右ITR)によって連結されている。いくつかの実施形態において、ITRは、ポリヌクレオチド配列5’−CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG−3’(配列番号20)を含む。突然変異ITRは、末端切断配列を含むD領域の欠失を含む。結果として、AAVウイルスゲノムの複製中に、repタンパク質は、ウイルスゲノムを突然変異ITRで切断しないことになり、したがって、5’から3’の順序で以下のものを含む組換えウイルスゲノムがウイルスカプシドにパッケージングされることになる:AAV ITR、調節配列を含む第1の異種ポリヌクレオチド配列、突然変異AAV ITR、第1の異種ポリヌクレオチドに対して逆向きの第2の異種ポリヌクレオチド、そして第3のAAV ITR。いくつかの実施形態において、本発明は、組換えウイルスゲノムを含むAAVウイルス粒子であって、該組換えウイルスゲノムが、機能的AAV2 ITRと、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体および/またはMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードする第1のポリヌクレオチド配列と、D領域の欠失を含み、機能的末端切断配列がない、突然変異AAV2 ITRと、該第1のポリヌクレオチド配列のRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドもしくはその機能的変異体および/またはMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードする配列に対する相補配列を含む第2のポリヌクレオチド配列と、機能的AAV2 ITRとを含む前記AAVウイルス粒子を提供する。
rAAV粒子は、当技術分野において公知の方法を用いて生産することができる。例えば、米国特許6,566,118号;同第6,989,264号;および同第6,995,006号を参照されたい。本発明を実施する場合、rAAV粒子を生産する宿主細胞としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、微生物細胞および酵母が挙げられる。宿主細胞は、AAV repおよびcap遺伝子が宿主細胞内に安定的に維持されるパッケージング細胞、またはAAVベクターゲノムが安定的に維持されるプロデューサー細胞である場合もある。例示的パッケージングおよびプロデューサー細胞は、293、A549またはヒーラ細胞に由来する。AAVベクターは、当技術分野において公知の標準的技術を用いてを精製され、製剤化される。
本明細書に記載のrAAV組成物を、本明細書に記載の発明の方法の1つで使用するために設計されたシステム内に含めてもよい。いくつかの実施形態において、本発明は、個体の眼へのベクターの送達のためのシステムであって、a)rAAV粒子の有効量を含む組成物[ここで、該ベクターは、治療用ポリペプチドおよび/または治療用RNAをコードする異種核酸と少なくとも1つのAAV末端反復配列とを含む];およびb)該rAAVの眼内送達のためのデバイスを含む、前記システムを提供する。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする、rAAVベクターを含む。いくつかの実施形態
において、rAAV粒子は、MYOC発現を標的とする(例えば、低減または阻害する)1つまたはそれ以上のMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードする、rAAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、rAAV粒子は、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドまたはその機能的変異体と、MYOCの発現を標的とする(例えば、低減または阻害する)1つまたはそれ以上のMYOC RNAi(例えば、shRNA)とをコードするrAAVベクターを含む。いくつかの実施形態において、前記キットまたはシステムは、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子と、MYOC発現を標的とする(例えば、低減または阻害する)1つまたはそれ以上のMYOC RNAi(例えば、shRNA)をコードするrAAVベクターを含むrAAV粒子とを含む。
容量は、少なくとも約1.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約1.5mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、少なくとも約2.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.8超〜約3.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.8超〜約2.5mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.8超〜約2.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.8超〜約1.5mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.8超〜約1.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.9〜約3.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.9〜約2.5mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.9〜約2.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.9〜約1.5mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約0.9〜約1.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約1.0〜約3.0mlである。いくつかの実施形態において、ベクターの有効量を含む流体の容量は、約1.0〜約2.0mlである。
MYOC突然変異体が眼、特に、IOPの一因となることがある細胞、例えば線維柱帯網細胞、の機能にどのような影響を及ぼすのかを理解することは、ミオシリン(MYOC
)緑内障の病態形成を知る上での手がかりとなる。MYOC機能の理解は、ミオシリン(MYOC)緑内障のための、可能性がある治療戦略を見いだすのにも役立つだろう。本明細書に記載する結果は、MYOC突然変異体が野生型MYOC発現を低減させ、Wntシグナル伝達を遮断することを実証する。さらに、これらの結果は、R−スポンジン3(RSPO3)の発現および/またはMYOCのサイレンシングが、突然変異型MYOCの発現によって遮断されたWntシグナル伝達を回復させることができることを示唆する。
プラスミドベクター
MYOCおよびRSPO3プラスミドのためのMYOC cDNAは、Clone DB−Sanofi Oncologyによって提供された。RSPO3 cDNAは、Clone DB−Sanofi Oncologyによって提供された。
HEK293細胞(Microbix Biosystems Inc.)をDMEM、10%FCSおよび5%CO2で培養した。HEK293T(293T)細胞株をATCCから得、DMEM、10%FCSおよび5%CO2で培養した。
SV40ラージT抗原(SV40 TAg)をAAV2−SV40 T抗原ベクターでの形質導入による不死化に使用した。完全線維芽細胞増殖培地(ScienCell)中で維持した第7継代hTM細胞(ScienCell Research Laboratories、Carlsbad、CA)を10cm細胞培養プレートに播種し、1×105DRPのAAV2−SV40−Tag(「hTM−T」と標示した)またはAAV2
−EGFP(陰性対照、「hTM−ENT」と標示した)のどちらか一方を24時間、形質導入した。細胞が集密に達したら、それらを2×15cmプレート(P8)で継代させた。細胞をおおよそ3〜4日ごとに繰り返し継代した。第10継代で、アリコートを採取して細胞数を判定した。hTM−T細胞からの全細胞数は、hTM−ENT細胞からの全細胞2.5×105と比較して、5.2×106であった。
hTM−T細胞と初代hTM細胞の比較は、細胞形態、集団倍加時間、およびプラスミドトランスフェクション効率の著しい差を示した。初代hTM細胞は、長い紡錘形の細胞体で、より大きく、線維芽細胞のように見えたが、不死化hTM−T細胞は、より小さく、立方体状の形状であり、比較的均一なサイズであった。hTM−T細胞株は、増殖速度の増加を示し、集団倍加が初代細胞よりおおよそ3〜4倍速く起こった。加えて、hTM−T細胞は、20細胞継代を超えて増殖し続けたが、初代hTM細胞は、第10継代までに増殖減少を示し、第12継代までに最終的な増殖停止を示した。同様の細胞密度の両方の細胞タイプに対してEGFPプラスミドおよびリポフェクタミンを使用して、トランスフェクション効率を判定した。簡単に言うと、Lipofectamine 2000(Life Technologies)をその製造業者のプロトコルに従って使用して、集密に達していないhTM−TまたはhTM細胞にEGFPプラスミドをトランスフェクトした。hTM−T細胞のほうが細胞培養面のmm2当りの細胞数は多かったが、初代hTM細胞(約5%)と比較してEGFP+ hTM−T細胞のパーセンテージ(約50%)のほうが明確に高かった。
wtMYOC、MYOC突然変異体P370LおよびY437H RSPO3ならびに/またはshRNAを発現するプラスミドを、Lipofectamine 2000(Life Technologies)を使用して293TまたはhTM−T細胞にトランスフェクトした。簡単に言うと、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含有するRIPA緩衝液50〜100μLに細胞を溶解した。細胞溶解物10〜13μLをSDS−PAGEによって分析し、その後、iBlot高速転写システム(Life Technologies)を使用して免疫ブロットした。Tris緩衝食塩水、0.05%Tween 20(TBST)、0.2% I−Block(カゼインベースのブロッキング試薬;Lif
e Technologies)を使用してブロットをブロックし、マウス抗ヒトMYOC抗体とともにインキュベートした。その後、ブロットを抗マウスHRP標的抗体(R&D Systems、Minneapolis、MN)とともにインキュベートした。ECL Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher)を使用して免疫反応性バンドを可視化し、BioMax XARフィルム(Carestream Health)を用いてKodak X−Omat 2000 Processorで現像して可視化した。
293TまたはhTM−T細胞をCostar 96ウェルホワイトまたはブラックウォールプレートに2×104細胞/ウェルで播種した。細胞播種の1〜2日後に、Fugene HDトランスフェクション試薬(Promega、Madison、WI)をその製造業者のプロトコルに従って使用してトランスフェクションを行った。
野生型MYOC(wtMYOC)は培養細胞から分泌されるが、5種の異なる突然変異型のMYOCを発現する細胞からはMYOCが殆どまたは全く分泌されない。また培養細胞への正常MYOCと突然変異型MYOCのコトランスフェクションはwtMYOC分泌を抑制することが報告されている(Jacobsonら(2001)Hum.Mol.Genet.10(2):117〜25頁)。MYOC分泌に対する突然変異型MYOC発現の効果を調査するために、野生型MYOC、P370L突然変異型MYOCまたはY437H突然変異型MYOCを発現するプラスミドを293細胞にトランスフェクトした。
着手した。ヒト線維柱帯網細胞株を、上で説明したようにSV40ラージT抗原(hTM−T細胞)のAAV媒介発現によって不死化した。293TおよびhTM−T細胞に、野生型MYOCを発現するプラスミド、P370L MYOCを発現するプラスミド、または両方のプラスミドをトランスフェクトした。図2は、これらの細胞における細胞内または分泌MYOCタンパク質の存在を探索するウェスタンブロットを示す。野生型MYOCは、293TおよびhTM−T細胞によって発現され、分泌されたが、P370L MYOCは、293T細胞によっても、hTM−T細胞によっても、発現はされたが分泌されなかった。P370L MYOCはまた、293T細胞においても、hTM−T細胞においても、野生型MYOCの分泌を遮断した。
MYOCは、ストレスファイバーの形成を刺激するアクチン細胞骨格の機構を修飾するWntシグナル伝達経路の成分、例えば、Frizzled(Fzd)ファミリーのWnt受容体、分泌Frizzled関連タンパク質(sFRP)ファミリーのWntアンタゴニスト、およびWnt阻害因子1(WIF−1)と相互作用すると考えられている(Kwonら(2009)Mol.Cell.Biol.29:2139〜54頁)。ストレスファイバーの形成は、線維柱帯網(TM)の収縮性およびIOP調節に肝要である。しかし、正確にどのようにMYOCがWntシグナル伝達に関連しているのか、およびこの関連性がIOPにどのような影響を及ぼすのかは不明である。細胞生物学実験に基づいて、マトリックス細胞タンパク質としてのミオシリンの役割が提案されている(ReschおよびFautsch、2009;Kochら、2014)。他のグループにより、ミオシリンはオリゴデンドロサイト分化の媒介因子であり、マウスの視神経のミエリン形成に関与することが立証されている(Kwonら、2014)。
.Ophthalmol.Vis.Sci.53(11):7043〜51頁)。別のグループにより、P370Lには、TOP−Flash Wntシグナル伝達アッセイによって証明される、Caco−2細胞におけるWntシグナル伝達に対する刺激効果があることが報告されている(Shenら(2012)PLoS ONE 7(9):e44902)。
前の実施例は、緑内障性MYOC突然変異体P370LおよびY437Hがヒト細胞におけるWntシグナル伝達を遮断するように作用することを実証した。これらのMYOC突然変異体を発現する細胞においてWntシグナル伝達を回復させることができる可能性があるメカニズムを調査するためのさらなる実験に着手した。
て、Wntシグナル伝達を回復させることができた。標示の通り、TOP−Flashレポーター構築物とwtMYOC(「MYOC」)、P370L MYOC、Y437H MYOCおよび/またはRSPO3プラスミドとを293T細胞にコトランスフェクトした。Wntシグナル伝達は組換えマウスWnt3a(400ng/ml)の添加後に増幅され、それをTOP−Flashアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。
MYOCを発現する細胞におけるWntシグナル伝達を増加させることが判明し、RSPO3の発現とMYOC RNAi(例えば、shRNA)を組み合わせることによって、P370L MYOCを発現する細胞においてWntシグナル伝達の相乗的増加がもた
らされた。
shRNAは、P370L MYOCまたはY437H MYOCのどちらか一方を発現する細胞におけるWntシグナル伝達を回復させることができた。この効果は、スクランブルshRNA対照の発現時には観察されなかった。
AAV粒子が線維柱帯網の細胞に形質導入することができるかどうかを判定するために、EGFPをコードするAAV2ベクターを、(VP1に基づいてナンバリングして)R471Aアミノ酸置換を含むAAV2粒子の野生型AAV2粒子にパッケージングした。AAV2 EGFPおよびAAV2 R471A EGFPでのhTM細胞の処置(上記)によって、ウイルス粒子をin vitroで評価した。図10(左パネル)に示すように、AAV2 R471A EGFPは、野生型AAV2と比較して高いTM細胞形質導入を示した。TM細胞形質導入をin vivoで評価するために、AAV2 EGFPおよびAAV2 R471A EGFPをマウスの眼に注射した。その後、マウスを屠殺し、EGFP発現について分析した。図10(右パネル)に示すように、AAV2 R471A EGFPは、野生型AAV2と比較して高いTM細胞形質導入をin vivoで示した。
上の実施例は、緑内障性MYOC突然変異(例えば、P370LおよびY437H)がWntシグナル伝達を遮断すること、およびWntシグナル伝達のこの阻害をR−スポンジン3(RSPO3)発現またはMYOC shRNAによって反転させることができることを実証した。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、MYOC突然変異(例えば、P370Lおよび/またはY437H)は、TMにおけるWntシグナル伝達に影響を及ぼすことによって、IOPを変更しPOAGに寄与する可能性があると考えた。次の実験では、AAV2ベクターによって送達されるR−スポンジン3(RSPO3)発現またはMYOC shRNAが、緑内障の症状をこの疾患のマウスモデルにおいて改善することができるかどうかを試験した。
9):3542〜53頁を参照されたい)。このモデルでは、ヒトY437H MYOCがトランスジェニックマウスにおいてCMVプロモーターの制御下で発現される。この系を使用して、ミオシリン(MYOC)緑内障に関連する組織、例えば、線維柱帯網および強膜においてY437H MYOCを発現させた。これらのマウスは、肉眼的には正常な眼の形態を示したが、3月齢後にミオシリン(MYOC)緑内障様症状、例えば、IOP上昇、および視神経の漸進的な軸索変性を示し始めた。
び/またはスクランブルshRNAを発現するAAVベクターの注射を反対側の眼に施した。1つの処置群のマウスには、マウスRSPO3を発現し、かつマウスMYOCを標的とするshRNAを発現するAAVベクターの注射を一方の眼に施し、GFPを発現し、かつスクランブルshRNAを発現するAAVベクターの注射を反対側の眼に施した。
実施例3で実証したように、MYOC突然変異体(例えば、P370LおよびY437H)によって遮断されたWntシグナル伝達を、R−スポンジン3(RSPO3)発現によって回復させることができる。Wntシグナル伝達のこの回復の根底にあるメカニズムをさらに理解するために、Wntシグナル伝達を回復させる様々なRSPOファミリーメンバーおよび変異体の能力を調査した。
またはY437H MYOCとを293T細胞にコトランスフェクトし、完全長または部分RSPO1、RSPO2またはRSPO4プラスミドもトランスフェクトした(RSPO1、2、3および4短縮型の描写については図12を参照されたい)。Wntシグナル伝達は組換えマウスWnt3a(400ng/ml)の添加後に増幅され、それをTOP−Flashアッセイによって測定した。ルシフェラーゼ活性(平均±SD、n=3)をトランスフェクション後に測定し、構成的に発現されるウミシイタケルシフェラーゼレベルのトランスフェクション対照に正規化した。
RSPO3ポリペプチド配列(シグナル配列に下線を引く)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKCQKGERGKKGRERKRKKPNKGESKEAIPDSKSLESSKEIPEQRENKQQQKKRKVQDKQKSVSVSTVH(配列番号1)
ATGCACTTGCGACTGATTTCTTGGCTTTTTATCATTTTGAACTTTATGGAATACATCGGCAGCCAAAACGCCTCCCGGGGAAGGCGCCAGCGAAGAATGCATCCTAACGTTAGTCAAGGCTGCCAAGGAGGCTGTGCAACATGCTCAGATTACAATGGATGTTTGTCATGTAAGCCCAGACTATTTTTTGCTCTGGAAAGAATTGGCATGAAGCAGATTGGAGTATGTCTCTCTTCATGTCCAAGTGGATATTATGGAACTCGATATCCAGATATAAATAAGTGTACAAAATGCAAAGCTGACTGTGATACCTGTTTCAACAAAAATTTCTGCACAAAATGTAAAAGTGGATTTTACTTACACCTTGGAAAGTGCCTTGACAATTGCCCAGAAGGGTTGGAAGCCAACAACCATACTATGGAGTGTGTCAGTATTGTGCACTGTGAGGTCAGTGAATGGAATCCTTGGAGTCCATGCACGAAGAAGGGAAAAACATGTGGCTTCAAAAGAGGGACTGAAACACGGGTCCGAGAAATAATACAGCATCCTTCAGCAAAGGGTAACCTGTGTCCCCCAACAAATGAGACAAGAAAGTGTACAGTGCAAAGGAAGAAGTGTCAGAAGGGAGAACGAGGAAAAAAAGGAAGGGAGAGGAAAAGAAAAAAACCTAATAAAGGAGAAAGTAAAGAAGCAATACCTGACAGCAAAAGTCTGGAATCCAGCAAAGAAATCCCAGAGCAACGAGAAAACAAACAGCAGCAGAAGAAGCGAAAAGTCCAAGATAAACAGAAATCGGTATCAGTCAGCACTGTACACTAG(配列番号2)
MRFFCARCCSFGPEMPAVQLLLLACLVWDVGARTAQLRKANDQSGRCQYTFSVASPNESSCPEQSQAMSVIHNLQRDSSTQRLDLEATKARLSSLESLLHQLTLDQAARPQETQEGLQRE
LGTLRRERDQLETQTRELETAYSNLLRDKSVLEEEKKRLRQENENLARRLESSSQEVARLRRGQCPQTRDTARAVPPGSREVSTWNLDTLAFQELKSELTEVPASRILKESPSGYLRSGEGDTGCGELVWVGEPLTLRTAETITGKYGVWMRDPKPTYPYTQETTWRIDTVGTDVRQVFEYDLISQFMQGYPSKVHILPRPLESTGAVVYSGSLYFQGAESRTVIRYELNTETVKAEKEIPGAGYHGQFPYSWGGYTDIDLAVDEAGLWVIYSTDEAKGAIVLSKLNPENLELEQTWETNIRKQSVANAFIICGTLYTVSSYTSADATVNFAYDTGTGISKTLTIPFKNRYKYSSMIDYNPLEKKLFAWDNLNMVTYDIKLSKM(配列番号3)
ATGAGGTTCTTCTGTGCACGTTGCTGCAGCTTTGGGCCTGAGATGCCAGCTGTCCAGCTGCTGCTTCTGGCCTGCCTGGTGTGGGATGTGGGGGCCAGGACAGCTCAGCTCAGGAAGGCCAATGACCAGAGTGGCCGATGCCAGTATACCTTCAGTGTGGCCAGTCCCAATGAATCCAGCTGCCCAGAGCAGAGCCAGGCCATGTCAGTCATCCATAACTTACAGAGAGACAGCAGCACCCAACGCTTAGACCTGGAGGCCACCAAAGCTCGACTCAGCTCCCTGGAGAGCCTCCTCCACCAATTGACCTTGGACCAGGCTGCCAGGCCCCAGGAGACCCAGGAGGGGCTGCAGAGGGAGCTGGGCACCCTGAGGCGGGAGCGGGACCAGCTGGAAACCCAAACCAGAGAGTTGGAGACTGCCTACAGCAACCTCCTCCGAGACAAGTCAGTTCTGGAGGAAGAGAAGAAGCGACTAAGGCAAGAAAATGAGAATCTGGCCAGGAGGTTGGAAAGCAGCAGCCAGGAGGTAGCAAGGCTGAGAAGGGGCCAGTGTCCCCAGACCCGAGACACTGCTCGGGCTGTGCCACCAGGCTCCAGAGAAGTTTCTACGTGGAATTTGGACACTTTGGCCTTCCAGGAACTGAAGTCCGAGCTAACTGAAGTTCCTGCTTCCCGAATTTTGAAGGAGAGCCCATCTGGCTATCTCAGGAGTGGAGAGGGAGACACCGGATGTGGAGAACTAGTTTGGGTAGGAGAGCCTCTCACGCTGAGAACAGCAGAAACAATTACTGGCAAGTATGGTGTGTGGATGCGAGACCCCAAGCCCACCTACCCCTACACCCAGGAGACCACGTGGAGAATCGACACAGTTGGCACGGATGTCCGCCAGGTTTTTGAGTATGACCTCATCAGCCAGTTTATGCAGGGCTACCCTTCTAAGGTTCACATACTGCCTAGGCCACTGGAAAGCACGGGTGCTGTGGTGTACTCGGGGAGCCTCTATTTCCAGGGCGCTGAGTCCAGAACTGTCATAAGATATGAGCTGAATACCGAGACAGTGAAGGCTGAGAAGGAAATCCCTGGAGCTGGCTACCACGGACAGTTCCCGTATTCTTGGGGTGGCTACACGGACATTGACTTGGCTGTGGATGAAGCAGGCCTCTGGGTCATTTACAGCACCGATGAGGCCAAAGGTGCCATTGTCCTCTCCAAACTGAACCCAGAGAATCTGGAACTCGAACAAACCTGGGAGACAAACATCCGTAAGCAGTCAGTCGCCAATGCCTTCATCATCTGTGGCACCTTGTACACCGTCAGCAGCTACACCTCAGCAGATGCTACCGTCAACTTTGCTTATGACACAGGCACAGGTATCAGCAAGACCCTGACCATCCCATTCAAGAACCGCTATAAGTACAGCAGCATGATTGACTACAACCCCCTGGAGAAGAAGCTCTTTGCCTGGGACAACTTGAACATGGTCACTTATGACATCAAGCTCTCCAAGATGTAG(配列番号
4)
GGCCATGTCAGTCATCCAT(配列番号5)
QAMSVIH(配列番号6)
AATAGTGAAGCCACAGATGTATT(配列番号7)
MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPCPEGQKRRKGGQGRRENANRNLARKESKEAGAGSRRRKGQQQQQQQGTVGPLTSAGPA(配列番号8)
MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHCPGGKRTPKAKEKRNKKKKRKLIERAQEQHSVFLATDRANQ(配列番号9)
MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRPCPGERSPGQKKGRKDRRPRKDRKLDRRLDVRPRQPGLQP(配列番号10)
MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSA(配列番号11)
MRLGLCVVALVLSWTHLTISSRGIKGKRQRRISAEGSQACAKGCELCSEVNGCLKCSPKLFILLERNDIRQVGVCLPSCPPGYFDARNPDMNKCIKCKIEHCEACFSHNFCTKCKEGLYLHKGRCYPACPEGSSAANGTMECSSPAQCEMSEWSPWGPCSKKQQLCGFRRGSEERTRRVLHAPVGDHAACSDTKETRRCTVRRVPC(配列番号12)
MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAP(配列番号13)
MQFRLFSFALIILNCMDYSHCQGNRWRRSKRASYVSNPICKGCLSCSKDNGCSRCQQKLFFFLRREGMRQYGECLHSCPSGYYGHRAPDMNRCARCRIENCDSCFSKDFCTKCKVGFYLHRGRCFDECPDGFAPLEETMECVEGCEVGHWSEWGTCSRNNRTCGFKWGLETRTRQIVKKPVKDTILCPTIAESRRCKMTMRHC(配列番号14)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEA(配列番号15)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIV(配列番号16)
MHLRLISWLFIILNFMEYIGSQNASRGRRQRRMHPNVSQGCQGGCATCSDYNGCLSCKPRLFFALERIGMKQIGVCLSSCPSGYYGTRYPDINKCTKCKADCDTCFNKNFCTKCKSGFYLHLGKCLDNCPEGLEANNHTMECVSIVHCEVSEWNPWSPCTKKGKTCGFKRGTETRVREIIQHPSAKGNLCPPTNETRKCTVQRKKC(配列番号17)
MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLA(配列番号18)
MRAPLCLLLLVAHAVDMLALNRRKKQVGTGLGGNCTGCIICSEENGCSTCQQRLFLFIRREGIRQYGKCLHDCPPGYFGIRGQEVNRCKKCGATCESCFSQDFCIRCKRQFYLYKGKCLPTCPPGTLAHQNTRECQGECELGPWGGWSPCTHNGKTCGSAWGLESRVREAGRAGHEEAATCQVLSESRKCPIQRP(配列番号19)
CACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGG
CGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG(配列番号20)
ACCACGGACAGTTCCTGTATTCTTGGGGTGG(配列番号21)
CCACCCCAAGAATACAGGAACTGTCCGTGGT(配列番号22)
TCTGTGGCACCTTGCACACCGTCAGCAGC(配列番号23)
GCTGCTGACGGTGTGCAAGGTGCCACAGA(配列番号24)
Claims (281)
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物の眼におけるWntシグナル伝達を増加させる薬剤を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼の線維柱帯網(TM)細胞におけるWntシグナル伝達を増加させる、請求項1に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼におけるR−スポンジン1(RSPO1)、R−スポンジン2(RSPO2)、R−スポンジン3(RSPO3)またはR−スポンジン4(RSPO4)活性を増加させる、請求項1または2に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO1を増加させる、請求項3に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO1またはその機能的変異体である、請求項4に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO1またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項4に記載の方法。
- RSPO1は、短縮型RSPO1である、請求項6に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO2を増加させる、請求項3に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体である、請求項8に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項8に記載の方法。
- RSPO2は、短縮型RSPO2である、請求項10に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO3を増加させる、請求項3に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体である、請求項12に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項12に記載の方法。
- RSPO3は、短縮型RSPO3である、請求項14に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO4を増加させる、請求項3に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体である、請求項16に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項16に記載の方法。
- RSPO4は、短縮型RSPO4である、請求項18に記載の方法。
- 哺乳動物の眼におけるWntシグナル伝達を増加させる第2の薬剤を投与することをさ
らに含む、請求項3〜19のいずれか1項に記載の方法。 - 第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTMにおけるWntシグナル伝達を増加させる、請求項20に記載の方法。
- 第2の薬剤は、哺乳動物の眼におけるミオシリン(MYOC)の発現を低減または阻害する、請求項20または21に記載の方法。
- 第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTMにおけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項22に記載の方法。
- 第2の薬剤は、MYOCの発現を標的とする阻害性核酸をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項22または23に記載の方法。
- 阻害性核酸は、MYOCの発現を標的とするMYOC RNAiである、請求項24に記載の方法。
- MYOC RNAiは、MYOCの発現を標的とするMYOC shRNAである、請求項25に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼におけるミオシリン(MYOC)の発現を低減または阻害する、請求項1または2に記載の方法。
- 薬剤は、哺乳動物の眼のTMにおけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項27に記載の方法。
- 薬剤は、MYOCの発現を標的とする阻害性核酸をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項28に記載の方法。
- 阻害性核酸は、MYOCの発現を標的とするMYOC RNAiである、請求項29に記載の方法。
- MYOC RNAiは、MYOCの発現を標的とするMYOC shRNAである、請求項30に記載の方法。
- 哺乳動物の眼におけるWntシグナル伝達を増加させる第2の薬剤を投与することをさらに含む、請求項27〜31のいずれか1項に記載の方法。
- 第2薬剤は、哺乳動物の眼のTMにおけるWntシグナル伝達を増加させる、請求項32に記載の方法。
- 第2薬剤は、哺乳動物の眼におけるR−スポンジン1(RSPO1)、R−スポンジン2(RSPO2)、R−スポンジン3(RSPO3)またはR−スポンジン4(RSPO4)活性を増加させる、請求項32または33に記載の方法。
- 第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO1を増加させる、請求項34に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO1またはその機能的変異体である、請求項35に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO1またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項35に記載の方法。
- RSPO1は、短縮型RSPO1である、請求項37に記載の方法。
- 第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO2を増加させる、請求項34に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体である、請求項39に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO2またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項39に記載の方法。
- RSPO2は、短縮型RSPO2である、請求項41に記載の方法。
- 第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO3を増加させる、請求項34に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体である、請求項43に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO3またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項43に記載の方法。
- RSPO3は、短縮型RSPO3である、請求項45に記載の方法。
- 第2の薬剤は、哺乳動物の眼のTM内のRSPO4を増加させる、請求項34に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体である、請求項47に記載の方法。
- 第2の薬剤は、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子である、請求項47に記載の方法。
- RSPO4は、短縮型RSPO4である、請求項49に記載の方法。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を低減または阻害する薬剤を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、該哺乳動物の眼に
おけるWntシグナル伝達を増加させる薬剤と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を低減または阻害する薬剤とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。 - 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含むrAAV粒子とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリン(MYOC shRNA)の発現を標的とするMYOC shRNAをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるWntシグナル伝達を増進する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるWntシグナル伝達を増進する方法であって、該哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるWntシグナル伝達を増進する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子と該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含むrAAV粒子とを該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 眼障害を有する哺乳動物の線維柱帯網細胞におけるWntシグナル伝達を増進する方法であって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体をコードし、かつ該哺乳動物におけるミオシリンの発現を標的とするMYOC RNAiをコードするベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含む前記方法。
- 哺乳動物はヒトである、請求項1〜60のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物はヒトであり、ミオシリン(MYOC)緑内障は、ヒトミオシリンの突然変異を伴う、請求項1〜56のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物はヒトであり、眼障害は、ヒトミオシリンの突然変異を伴うMYOC緑内障である、請求項57〜60のいずれか1項に記載の方法。
- ミオシリン突然変異は、E323K、K398R、Q368X、G364V、P370L、D380A、K423E、Y437HおよびI477Sから選択される1つまたはそれ以上のアミノ酸置換を含む、請求項62または63に記載の方法。
- ミオシリン突然変異は、P370Lアミノ酸置換を含む、請求項62〜64のいずれか
1項に記載の方法。 - ミオシリン突然変異は、Y437Hアミノ酸置換を含む、請求項62または63に記載の方法。
- ミオシリン(MYOC)緑内障は、原発開放隅角緑内障(POAC)である、請求項1〜66のいずれか1項に記載の方法。
- ミオシリン(MYOC)緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障(JOAC)である、請求項1〜67のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、ヒトRSPO1である、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜68のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、ヒトRSPO1に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%アミノ酸配列同一性を有する、請求項69に記載の方法。
- RSPO1は、配列番号8のアミノ酸配列を含む、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、配列番号8のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、配列番号11のアミノ酸配列を含む、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、配列番号11のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、配列番号12のアミノ酸配列を含む、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1は、配列番号12のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3〜7、34〜38、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO2は、ヒトRSPO2である、請求項3、8〜11、34、39〜42、51、55〜57、または59〜70のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO2は、ヒトRSPO2に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%アミノ酸配列同一性を有する、請求項77に記載の方法。
- RSPO2は、配列番号9のアミノ酸配列を含む、請求項3、8〜11、34、39〜
42、51、55〜57、59〜68、または78のいずれか1項に記載の方法。 - RSPO2は、配列番号9のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、8〜11、34、39〜42、51、55〜57、59〜68、または78のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO2は、配列番号13のアミノ酸配列を含む、請求項3、8〜11、34、39〜42、51、55〜57、59〜68、または78のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO2は、配列番号13のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、8〜11、34、39〜42、51、55〜57、59〜68、または78のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO2は、配列番号14のアミノ酸配列を含む、請求項3、8〜11、34、39〜42、51、55〜57、59〜68、または78のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO2は、配列番号14のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、8〜11、34、39〜42、51、55〜57、59〜68、または78のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、ヒトRSPO3である、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、または59〜68のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、ヒトRSPO3に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%アミノ酸配列同一性を有する、請求項85に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号1のアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号1のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号15のアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号15のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号16のアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号16のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91
%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。 - RSPO3は、配列番号17のアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO3は、配列番号17のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、12〜15、34、43〜46、51、55〜57、59〜68、または86のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、ヒトRSPO4である、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、または59〜68のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、ヒトRSPO4に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%アミノ酸配列同一性を有する、請求項95に記載の方法。
- RSPO4は、配列番号10のアミノ酸配列を含む、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、59〜68、または96のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、配列番号10のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、59〜68、または96のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、配列番号18のアミノ酸配列を含む、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、59〜68、または96のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、配列番号18のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、59〜68、または96のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、配列番号19のアミノ酸配列を含む、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、59〜68、または96のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO4は、配列番号19のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項3、16〜19、34、47〜50、51、55〜57、59〜68、または96のいずれか1項に記載の方法。
- RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項3〜19、34〜51、55〜57、または59〜102のいずれか1項に記載の方法。
- プロモーターは、哺乳動物の眼においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる、請求項103に記載の方法。
- プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる、請求項104に記載の方法。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項103〜105のいずれか1項に記載の方法。
- MYOC RNAiは、ヒトMYOCの発現を標的とする、請求項25、26、30、31、53、55、58、または60〜68のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiは、低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または低分子ヘアピン型RNA(shRNA)である、請求項25、26、30、31、53、55、58、60〜68、または107のいずれか1項に記載の方法。
- RNAiは、shRNAである、請求項108に記載の方法。
- MYOC shRNAは、配列番号6に記載のMYOCのアミノ酸配列を標的とする、請求項109に記載の方法。
- MYOC shRNAは、配列番号7のループ配列を含む、請求項109または110に記載の方法。
- MYOC RNAiは、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項25、26、30、31、53、55、58、60〜68、または107〜111のいずれか1項に記載の方法。
- プロモーターは、哺乳動物の眼においてMYOC RNAiを発現させることができる、請求項112に記載の方法。
- プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてMYOC RNAiを発現させることができる、請求項112または113のいずれか1項に記載の方法。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項112〜114のいずれか1項に記載の方法。
- プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項112〜115のいずれか1項に記載の方法。
- MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の眼におけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項112〜116のいずれか1項に記載の方法。
- MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項112〜117のいずれか1項に記載の方法。
- 処置は、ミオシリン(MYOC)緑内障の症状を軽減する、請求項1〜118のいずれか1項に記載の方法。
- ミオシリン(MYOC)緑内障の症状の軽減は、眼圧の低下、MYOCの線維柱帯網内蓄積の低減、高眼圧の低下、または線維柱帯網からの房水流出の増加である、請求項119に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6 ShH10、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、ウシAAV、ヤギAAVもしくはマウスAAV血清型カプシド、またはクレードA〜FからのAAV血清型カプシドを含む、請求項6〜51、53、または55〜120のいずれか1項に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、チロシンカプシド突然変異体、ヘパリン結合カプシド突然変異体、AAV2R471Aカプシド、AAVAAV2/2−7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、またはAAV2/HBoV1カプシドを含む、請求項6〜51、53、または55〜120のいずれか1項に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484、R487、K527、K532、R585またはR588位のうちの1カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むAAVカプシドを含む、請求項6〜51、53、または55〜120のいずれか1項に記載の方法、またはAAVウイルス粒子は、チロシンカプシド突然変異体を含む、請求項6〜51、53、または55〜102のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子は、AAV血清型2カプシドを含む、請求項121に記載の方法。
- AAV血清型2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項124に記載の方法。
- ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAV血清型逆位末端反復配列(ITR)を含む、請求項6〜51、53、または55〜125のいずれか1項に記載の方法。
- ベクターは、AAV血清型2 ITRを含む、請求項126に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、同じAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRおよびカプシドを含む、請求項6〜51、53、または55〜127のいずれか1項に記載の方法。
- AAVウイルス粒子は、rAAVウイルス粒子のカプシドとは異なるAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRを含む、請求項6〜51、53、または55〜128のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子はAAV2カプシドを含み、ベクターはAAV2 ITRを含む、請求項128に記載の方法。
- AAV2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項124または130に記載の方法。
- rAAV粒子の少なくとも1×109ゲノムコピーが、哺乳動物に投与される、請求項6〜51、53、または55〜131のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子は、硝子体内注射および/または前房内注射によって投与される、請求項6〜51、53、または55〜132のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVは、眼の1カ所より多くの位置に投与される、請求項6〜51、53、または55〜133のいずれか1項に記載の方法。
- rAAVウイルス粒子は、医薬組成物中のものである、請求項6〜51、53、または55〜134のいずれか1項に記載の方法。
- 医薬組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項135に記載の方法。
- 薬剤は、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/またはRSPO4の活性を増加させる第2の薬剤と併用される、請求項1〜136のいずれか1項に記載の方法。
- AAVベクターを含む組換えAAV粒子であって、該AAVベクターはRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含む、前記組換えAAV粒子。
- AAVベクターを含む組換えAAV粒子であって、該AAVベクターは、哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸をコードする核酸を含む、前記組換えAAV粒子。
- 哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸は、RNAiである、請求項139に記載の組換え粒子。
- AAVベクターを含む組換えAAV粒子であって、該ベクターは、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードし、かつ哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸をコードする核酸を含む、前記組換えAAV粒子。
- 哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸は、RNAiである、請求項141に記載の組換えAAV粒子。
- MYOC RNAiは、ヒトMYOCの発現を標的とする、請求項140〜142のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- MYOC RNAiは、配列番号6に記載のMYOCのアミノ酸配列を標的とする、請求項140〜143のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- RNAiは、低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または低分子ヘアピン型RNA(shRNA)である、請求項140〜144のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- RNAiは、shRNAである、請求項140〜145のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- MYOC shRNAは、配列番号7のループ配列を含む、請求項146に記載の組換
えAAV粒子。 - AAVベクターは、RSPO1またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO1またはその機能的変異体は、ヒトRSPO1である、請求項138または141〜147のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO1またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO1またはその機能的変異体は、配列番号8、11および/または12のアミノ酸配列を含む、請求項138または141〜148のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- RSPO1は、配列番号8、11および/または12のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項148に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO2またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO2またはその機能的変異体は、ヒトRSPO2である、請求項138または141〜147のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO2またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO2またはその機能的変異体は、配列番号9、13および/または14のアミノ酸配列を含む、請求項138、141〜147、または151のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- RSPO2は、配列番号9、13および/または14のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項151に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO3またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO3またはその機能的変異体は、ヒトRSPO3である、請求項138または141〜147のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO3またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO3またはその機能的変異体は、配列番号1および/または15〜17のアミノ酸配列を含む、請求項138、141〜147、または154のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- RSPO3は、配列番号1および/または15〜17のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項154に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO4をコードする核酸を含み、該RSPO4は、ヒトRSPO4である、請求項138または141〜147のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO4またはその機能的変異体は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸
配列を含む、請求項138、141〜147、または157のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。 - RSPO4は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項157に記載の組換えAAV粒子。
- RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項138または141〜159のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、哺乳動物の眼においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる、請求項160に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる、請求項160または161に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項160〜162のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- MYOC RNAiは、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項140〜147のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、哺乳動物の眼においてMYOC RNAiを発現させることができる、請求項164に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてMYOC RNAiを発現させることができる、請求項164または165に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項164〜166のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項164〜166のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の眼におけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項164〜168のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項164〜169のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6 ShH10、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、ウシAAV、ヤギAAVもしくはマウスAAV血清型カプシド、またはクレードA〜FからのAAV血清型カプシドを含む、請求項138〜170のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子方法。
- AAVウイルス粒子は、ヘパリン結合カプシド突然変異体、AAV2R471Aカプシド、AAVAAV2/2−7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、またはAAV2/HBoV1カプシドを含む、請求項138〜170のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子方法。
- AAVウイルス粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484、R487、K527、K532、R585またはR588位のうちの1カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むAAVカプシドを含む、請求項138〜170のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子方法。
- AAVウイルス粒子は、チロシンカプシド突然変異体を含む、請求項138〜170のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子方法。
- rAAVウイルス粒子は、AAV血清型2カプシドを含む、請求項171に記載の組換えAAV粒子。
- AAV血清型2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項175に記載の組換えAAV粒子。
- ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAV血清型逆位末端反復配列(ITR)を含む、請求項138〜176のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- ベクターは、AAV血清型2 ITRを含む、請求項177に記載の組換えAAV粒子。
- AAVウイルス粒子は、同じAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRおよびカプシドを含む、請求項138〜178のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- AAVウイルス粒子は、rAAVウイルス粒子のカプシドとは異なるAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRを含む、請求項138〜178のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- rAAVウイルス粒子はAAV2カプシドを含み、ベクターはAAV2 ITRを含む、請求項179に記載の組換えAAV粒子。
- AAV2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項175または181に記載の組換えAAV粒子。
- 請求項6〜51、53、または55〜137に記載の方法のいずれか1つに使用するための、請求項138〜154のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子。
- 請求項138〜183のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子を含む、医薬組成物。
- 請求項1〜137のいずれか1項に記載の方法に好適である、医薬組成物。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するための薬物の製造における、請求項184または185に記載の医薬組成物の使用。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するための薬物の製造における、請求項138〜182のいずれか1項に記載の組換えAAVの使用。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するための、請求項184または185に記載の医薬組成物の使用。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するための、請求項138〜182のいずれか1項に記載の組換えAAVの使用。
- 請求項6〜51、53、または55〜137に記載の方法のいずれか1つのための、請求項186〜189のいずれか1項に記載の使用。
- 哺乳動物はヒトである、請求項186〜190のいずれか1項に記載の使用。
- ミオシリン(MYOC)緑内障は、原発開放隅角ミオシリン(MYOC)緑内障(POAC)である、請求項186〜191のいずれか1項に記載の使用。
- 緑内障は、若年性の原発開放隅角緑内障(JOAC)である、請求項186〜192のいずれか1項に記載の使用。
- 組換えAAVは、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/またはRSPO4の活性を増加させる薬剤と併用される、請求項187〜193のいずれか1項に記載の使用。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するためのキットであって、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードするベクターを含むrAAVウイルス粒子を含む前記キット。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するためのキットであって、AAVベクターを含むrAAVウイルス粒子を含み、該AAVベクターは、哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸をコードする核酸を含む、前記キット。
- 阻害性核酸は、MYOC RNAiである、請求項195に記載のキット。
- 哺乳動物のミオシリン(MYOC)緑内障を処置するためのキットであって、AAVベクターを含むrAAVウイルス粒子を含み、該AAVベクターは、RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4またはその機能的変異体をコードし、かつ哺乳動物におけるミオシリン(MYOC)の発現を標的とする阻害性核酸をコードする核酸を含む、前記キット。
- 阻害性核酸は、MYOC RNAiである、請求項198に記載のキット。
- MYOC RNAiは、ヒトMYOCの発現を標的とする、請求項196〜199のいずれか1項に記載のキット。
- MYOC RNAiは、配列番号6に記載のMYOCのアミノ酸配列を標的とする、請
求項200に記載のキット。 - RNAiは、低分子阻害性RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、または低分子ヘアピン型RNA(shRNA)である、請求項197または199〜201のいずれか1項に記載のキット。
- RNAiは、shRNAである、請求項168または199〜202のいずれか1項に記載のキット。
- MYOC shRNAは、配列番号7のループ配列を含む、請求項203に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO1またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO1またはその機能的変異体は、ヒトRSPO1である、請求項195または198〜204のいずれか1項に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO1またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO1またはその機能的変異体は、配列番号8、11および/または12のアミノ酸配列を含む、請求項195または198〜205のいずれか1項に記載のキット。
- RSPO1は、配列番号8、11および/または12のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項205に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO2またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO2またはその機能的変異体は、ヒトRSPO2である、請求項195または198〜204のいずれか1項に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO2またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO2またはその機能的変異体は、配列番号9、13および/または14のアミノ酸配列を含む、請求項195、198〜204、または208のいずれか1項に記載のキット。
- RSPO2は、配列番号9、13および/または14のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項208に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO3またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO3またはその機能的変異体は、ヒトRSPO3である、請求項195または198〜204のいずれか1項に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO3またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO3またはその機能的変異体は、配列番号1および/または15〜17のアミノ酸配列を含む、請求項195、198〜204、または211のいずれか1項に記載のキット。
- RSPO3は、配列番号1および/または15〜17のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項211に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO4またはその機能的変異体は、ヒトRSPO4である、請求項195または198〜204のいずれか1項に記載のキット。
- AAVベクターは、RSPO4またはその機能的変異体をコードする核酸を含み、該RSPO4またはその機能的変異体は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列を含む、請求項195、198〜204、または214のいずれか1項に記載のキット。
- RSPO1は、配列番号10、18および/または19のアミノ酸配列に対して約80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項214に記載のキット。
- RSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体は、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項196または198〜216のいずれか1項に記載のキット。
- プロモーターは、哺乳動物の眼においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる、請求項217に記載のキット。
- プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてRSPO1、RSPO2、RSPO3、RSPO4、またはその機能的変異体を発現させることができる、請求項217または218に記載のキット。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項217〜219のいずれか1項に記載のキット。
- MYOC RNAiは、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項197または199〜204のいずれか1項に記載のキット。
- プロモーターは、哺乳動物の眼においてMYOC RNAiを発現させることができる、請求項221に記載のキット。
- プロモーターは、線維柱帯網の細胞においてMYOC RNAiを発現させることができる、請求項221または222に記載のキット。
- プロモーターは、ハイブリッドニワトリβ−アクチン(CBA)プロモーターである、請求項221〜223のいずれか1項に記載のキット。
- プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIプロモーターである、請求項221〜223のいずれか1項に記載のキット。
- MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の眼におけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項221〜225のいずれか1項に記載のキット。
- MYOC RNAiの発現は、哺乳動物の線維柱帯網の細胞におけるMYOCの発現を低減または阻害する、請求項221〜226のいずれか1項に記載のキット。
- AAVウイルス粒子は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV
6、AAV6 ShH10、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、ウシAAV、ヤギAAVもしくはマウスAAV血清型カプシド、またはクレードA〜FからのAAV血清型カプシドを含む、請求項221〜227のいずれか1項に記載のキット。 - AAVウイルス粒子は、ヘパリン結合カプシド突然変異体、AAV2R471Aカプシド、AAVAAV2/2−7m8カプシド、AAV DJカプシド、AAV2 N587Aカプシド、AAV2 E548Aカプシド、AAV2 N708Aカプシド、AAV V708Kカプシド、AAV1/AAV2キメラカプシド、またはAAV2/HBoV1カプシドを含む、請求項221〜227のいずれか1項に記載のキット。
- AAVウイルス粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR484、R487、K527、K532、R585またはR588位のうちの1カ所またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含むAAVカプシドを含む、請求項221〜227のいずれか1項に記載のキット。
- AAVウイルス粒子は、チロシンカプシド突然変異体を含む、請求項221〜227のいずれか1項に記載のキット。
- rAAVウイルス粒子は、AAV血清型2カプシドを含む、請求項228に記載のキット。
- AAV血清型2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項232に記載のキット。
- ベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAVrh8、AAVrh8R、AAV9、AAV10、AAVrh10、AAV11、AAV12、ヤギAAV、ウシAAVまたはマウスAAV血清型逆位末端反復配列(ITR)を含む、請求項221〜233のいずれか1項に記載のキット。
- ベクターは、AAV血清型2 ITRを含む、請求項234に記載のキット。
- AAVウイルス粒子は、同じAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRおよびカプシドを含む、請求項221〜235のいずれか1項に記載のキット。
- AAVウイルス粒子は、rAAVウイルス粒子のカプシドとは異なるAAV血清型に由来する1つまたはそれ以上のITRを含む、請求項221〜235のいずれか1項に記載のキット。
- rAAVウイルス粒子はAAV2カプシドを含み、ベクターはAAV2 ITRを含む、請求項236に記載のキット。
- AAV2カプシドは、AAV2 VP1を基準にしてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項232または238に記載のキット。
- 請求項6〜51、53、または55〜137に記載の方法のいずれか1つでの使用に好適である、キット。
- 請求項138〜183のいずれか1項に記載の組換えAAV粒子を含む、キット。
- ミオシリン(MYOC)緑内障の処置に使用するための説明書をさらに含む、請求項195〜241のいずれか1項に記載のキット。
- 緩衝剤および/または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項195〜242のいずれか1項に記載のキット。
- 組換えAAVは、RSPO1、RSPO2、RSPO3および/またはRSPO4の活性を増加させる薬剤と併用される、請求項195〜243のいずれか1項に記載のキット。
- 哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸を送達する方法であって、rAAVベクターを含むAAV血清型2(AAV2)粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含み、該rAAVベクターは核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記方法。
- 核酸は、治療用導入遺伝子をコードする、請求項245に記載の方法。
- 哺乳動物の眼障害を処置する方法であって、rAAVベクターを含むAAV2粒子を該哺乳動物の眼に投与することを含み、該rAAVベクターは、治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記方法。
- rAAV粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する、請求項245〜247のいずれか1項に記載の方法。
- 治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される、請求項246〜248のいずれか1項に記載の方法。
- 治療用導入遺伝子は、治療用ポリペプチドまたは治療用核酸をコードする、請求項249に記載の方法。
- 眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である、請求項250に記載の方法。
- 眼障害は、ミオシリン(MYOC)緑内障である、請求項250または251に記載の方法。
- 哺乳動物はヒトである、請求項245〜252のいずれか1項に記載の方法。
- AAV粒子の投与は、硝子体内および/または前房内投与である、請求項245〜253のいずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸を送達するための組換えAAV2粒子であって、該AAV2粒子はrAAVベクターを含み、該rAAVベクターは該核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記組換えAAV2粒子。
- 核酸は、治療用導入遺伝子をコードする、請求項255に記載のrAAV2粒子。
- 哺乳動物の眼障害を処置するための組換えAAV2粒子であって、該AAV2粒子はrAAVベクターを含み、該rAAVベクターは治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記組換えAAV2粒子。
- 眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する、請求項255〜257のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される、請求項256〜258のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である、請求項257に記載のrAAV粒子。
- 眼障害は、ミオシリン(MYOC)緑内障である、請求項257または258に記載のrAAV粒子。
- 哺乳動物はヒトである、請求項255〜261のいずれか1項に記載のrAAV粒子。
- 哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸を送達するための組換えAAV2粒子の使用であって、該AAV2粒子はrAAVベクターを含み、該rAAVベクターは該核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記使用。
- 核酸は、治療用導入遺伝子をコードする、請求項263に記載の使用。
- 哺乳動物の眼障害を処置するための組換えAAV2粒子の使用であって、該AAV2粒子はrAAVベクターを含み、該rAAVベクターは、治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記使用。
- rAAV粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する、請求項263〜265のいずれか1項に記載の使用。
- 治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される、請求項264〜266のいずれか1項に記載の使用。
- 眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である、請求項265に記載の使用。
- 眼障害は、ミオシリン(MYOC)緑内障である、請求項265または268に記載の使用。
- 哺乳動物はヒトである、請求項263〜269のいずれか1項に記載の使用。
- AAV粒子は、硝子体内および/または前房内投与のためのものである、請求項263〜270のいずれか1項に記載の使用。
- 哺乳動物の眼の線維柱帯網に核酸を送達するキットであって、rAAVベクターを含むrAAV2粒子を含み、該rAAVベクターは該核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシド
タンパク質を含む、前記キット。 - 核酸は、治療用導入遺伝子をコードする、請求項272に記載のキット。
- 哺乳動物の眼障害を処置するためのキットであって、rAAVベクターを含むrAAV2粒子を含み、該rAAVベクターは、治療用導入遺伝子をコードする核酸を含み、該AAV2粒子は、AAV2のVP1に基づいてナンバリングしてR471Aアミノ酸置換を含むAAV2カプシドタンパク質を含む、前記キット。
- rAAV粒子は、眼の線維柱帯網の細胞に形質導入する、請求項272〜274のいずれか1項に記載のキット。
- 治療用導入遺伝子は、眼の線維柱帯網において発現される、請求項273〜275のいずれか1項に記載のキット。
- 眼障害は、眼の線維柱帯網に関連する障害である、請求項274に記載のキット。
- 眼障害は、ミオシリン(MYOC)緑内障である、請求項274または277に記載のキット。
- 哺乳動物はヒトである、請求項272〜278のいずれか1項に記載のキット。
- 使用説明書をさらに含む、請求項272〜279のいずれか1項に記載のキット。
- 緩衝剤および/または医薬的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項272〜280のいずれか1項に記載のキット。
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