BR112016011660B1 - Matriz de separação, e, métodos para estabilização de uma bebida fermentada e para fabricação da matriz de separação - Google Patents

Matriz de separação, e, métodos para estabilização de uma bebida fermentada e para fabricação da matriz de separação Download PDF

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Abstract

matriz de separação, e, métodos para estabilização de uma bebida fermentada e para fabricação da matriz d e separação. a invenção descreve uma matriz de separação com um suporte sólido poroso e uma pluralidade de cadeias de polímero de polivinilpirrolidona (pvp) covalentemente fixadas ao suporte sólido. as cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são ou cadeias de copolímeros ou homopolímeros de vinilpirrolidona que compreendem pelo menos 70% em moles de resíduos de monômero de vinilpirrolidona e menos do que 2% em moles de resíduos de monômero carregados negativamente.

Description

Campo técnico da invenção
[001] A presente invenção se refere à estabilização de bebidas, e mais particularmente a matrizes de separação para a estabilização de bebidas fermentadas. A invenção também se refere a um método para a estabilização de bebidas e a um método de fabricação de uma matriz de separação para a estabilização de bebidas fermentadas.
Fundamentos da invenção
[002] Nas bebidas fermentadas tipo cerveja e vinho, turvação indesejável pode se formar durante o armazenamento devido à precipitação/agregação de compostos ativos na turvação (HA). Estes compostos podem compreender polifenóis HA e polipeptídeos HA, assim como, produtos da reação complexa entre os mesmos. Para aumentar a estabilidade coloidal das bebidas e intensificar sua vida útil na prateleira, a bebida pode ser tratada para reduzir as concentrações de compostos HA, que é dito como estabilização de cerveja ou vinho.
[003] Existem várias tecnologias para clarificar cerveja e vinho a fim de melhorar a estabilidade coloidal de turvação. O meio mais comum para remover precursores de turvação é adicionar sílica hidrogel (SHG) e/ou partículas de polivinilpirrolidona reticuladas (polivinilpolipirrolidona ou PVRP) dentro de cerveja não estabilizada. As dosagens são tipicamente 1-40 g PVRP/hl e ~50 g de SHG/hl (CW Bamforth: J Am Soc Brew Chem 57(3), 81-90, 1999). SHG é planejado para reduzir polipeptídeos ativos na turvação e PVRP para reduzir polifenóis. Tanto SHG como PVPP são usados na forma de partículas finas adicionadas a bebida e depois disso removidos por filtração. Tradicionalmente as tortas do filtro têm sido descartadas, mas também foram sugeridos métodos para regenerar as partículas de PVPP em uma instalação de regeneração separada, como descrito em, por exemplo, WO 2012/011808. Isto exigirá, no entanto, operações complexas e espaço para equipamento adicional. Pat. dos Estados Unidos 6.001.406 descreve um método para estabilização de bebida usando um trocador iônico, em particular uma matriz hidrofílica porosa insolúvel em água na qual grupos de troca iônica são covalentemente ligados. Tal sistema tem sido comercializado por Handtmann Armaturenfabri k GmbH & Co. KG e GE Healthcare BioSciences AB com o nome de Combined Stabilization System (CSS), usando contas de agarose reticuladas carregadas positivamente em uma coluna com leito recheado. As contas permanecem na coluna tanto durante os ciclos de estabilização como regeneração e podem ser reusadas durante anos sem qualquer manipulação extra.
[004] Com demandas aumentadas em relação à eficiência do processo e estabilidade da bebida, existe, no entanto, uma necessidade de adsorventes com capacidade melhorada de ligação para compostos HA. Pat. dos Estados Unidos 8.137.559 descreve uma tentativa para alcançar isto com ligantes à base de dietileno glicol sobre contas de agarose, mas ainda existe uma necessidade para adsorventes que apresentem estabilização melhorada e que sejam capazes de estabilizar volumes superiores de bebida antes da regeneração.
Sumário da invenção
[005] Um aspecto da invenção é prover uma matriz de separação com uma capacidade de ligação melhorada para compostos HA nas bebidas fermentadas. Isto é alcançado com uma matriz de separação como definida na reivindicação 1.
[006] Uma vantagem é que a matriz de separação é capaz de melhorar a estabilidade de turvação de bebidas fermentadas em comparação com matrizes da técnica antecedente. Vantagens adicionais são que a matriz de separação pode ser usada e regenerada em leitos recheados, porque ela não produz quaisquer lixiviáveis que preocupem a pureza do alimento ou segurança do alimento e que a matriz pode ser facilmente fabricada.
[007] Um segundo aspecto da invenção é prover um método de estabilizar bebidas fermentadas, permitindo uma carga aumentada de bebida na matriz. Isto é alcançado com um método como definido nas reivindicações.
[008] Um terceiro aspecto da invenção é prover um processo para fabricar uma matriz de separação com capacidade melhorada para compostos HA em bebidas fermentadas. Isto é alcançado com um método como definido nas reivindicações.
[009] Modalidades apropriadas adicionais da invenção são descritas nas reivindicações dependentes.
Definições
[0010] "Vinil pirrolidona" aqui significa l-vinil-2-pirrolidinona, CAS 88-12-0, que é também comumente conhecida como N-vinil pirrolidona. Figuras
[0011] A Fig. 1 mostra exemplos de porções de ligação únicas para as cadeias PVP: a) derivadas de grupos alílicos e b) derivadas de grupos tiol. S é o suporte.
[0012] A Fig. 2 mostra um processo de enxerto da invenção, com um suporte com funcionalidade hidróxi reagido primeiro com éter alil glicidílico (AGE) e vinil pirrolidona (VP) então enxertado sobre o suporte com funcionalidade alila.
[0013] A Fig. 3 mostra uma curva de estabilização típica para a matriz de troca aniônica do adsorvedor CSS.
[0014] A Fig. 4 mostra o ajuste da aplicação do teste de estabilização de cerveja miniaturizada.
[0015] A Fig. 5 mostra dados típicos de produção do método de turvação a frio EBC.
[0016] A Fig. 6 mostra o teor de tanoide em cerveja não estabilizada, cerveja estabilizada com a referência e cerveja estabilizada com três protótipos da invenção.
[0017] A Fig. 7 mostra vistas de gráficos dos resultados normalizados para a análise de turvação a frio. Os três gráficos se referem a três bateladas de cerveja nova, produzidas em três dias diferentes.
[0018] A Fig. 8 mostra a redução do polifenol total para os protótipos.
[0019] A Fig. 9 mostra a correlação entre a redução do polifenol total e turvação a frio.
[0020] A Fig. 10 mostra as curvas de temperatura da reação para experimentos selecionados. 311 - 55°C 1,9% de iniciador; 354 - 55°C 1,0% de iniciador; 374 - 45°C 1,0% de iniciador; 392 - 35°C 1,0% de iniciador; 493 - 45°C 1,0% de iniciador, 1 M de Na2SO4.
Descrição detalhada de modalidades
[0021] Em um aspecto a presente invenção descreve uma matriz de separação compreendendo um suporte sólido poroso e uma pluralidade de cadeias de polímero de polivinilpirrolidona (PVP) covalentemente ligadas a dito suporte sólido. As cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são cadeias de copolímero ou cadeias de homopolímeros de vinilpirrolidona compreendendo pelo menos 70% em moles de resíduos de monômero de vinilpirrolidona e menos do que 2% em moles, ou menos do que 1% em mol de resíduos de monômero carregados negativamente. Cargas negativas são prováveis de repelir os compostos HA na maior parte carregados negativamente e, desse modo reduzem o desempenho da matriz. Também pode ser vantajoso se as cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são livres de resíduos de monômeros carregados negativamente. Apropriadamente, as cadeias de polímero de polivinilpirrolidona não são reticuladas, a fim de prover uma acessibilidade e mobilidade elevada aos compostos HA.
[0022] Em algumas modalidades, as cadeias de polímero de polivinilpirrolidona compreendem até 30% em moles de resíduos de monômero carregados positivamente. Cargas positivas podem dar interações adicionais vantajosas com compostos HA carregados negativamente. Resíduos de monômero carregados positivamente podem ser introduzidos por polimerização de enxerto de vinil pirrolidona com comonômeros do tipo, por exemplo, cloreto de dialildimetil amônio (DADMAC), cloreto de 3- (metacriloilamino)propiltrimetil amônio (MAPTAC), cloreto de 2- (metacriloiloxi)etiltrimetil amônio, vinilpiridina, etc.
[0023] As cadeias de polímero de polivinilpirrolidona podem compreender alternativamente ou adicionalmente resíduos de monômero não carregados diferentes de vinil pirrolidonas. Tais resíduos podem, particularmente se eles contêm porções de ligação hidrofóbica e/ou hidrogênio, modular as interações entre as cadeias e os compostos HA de modo favorável. Monômeros específicos que podem ser usados para este propósito incluem, por exemplo, N-vinil caprolactama, estireno, éteres alquil vinílicos, (hidrofóbicos) e, por exemplo, PEG-monometacrilatos, PEG-éteres monovinílicos, PEG-éteres monoalquílicos, hidroxialquilvinil éteres, álcool alílico (ligação de hidrogênio). Se apenas comonômeros não carregados são usados, sua quantidade pode ser até 30% em moles, e se uma combinação de comonômeros carregados positivamente e não carregados é usada, sua quantidade combinada pode ser de até 30% em moles.
[0024] Em algumas modalidades o suporte sólido pode compreender porções carregadas positivamente que não são parte das cadeias de polímero de polivinilpirrolidona. Tais porções podem, por exemplo, ser introduzidas reagindo grupos hidroxila sobre o suporte (por exemplo, um suporte de polissacarídeo tal como ágar ou agarose) com reagentes carregados positivamente. Exemplos de tais reagentes incluem cloreto de glicidiltrimetilamônio e cloreto de dietilaminoetila.
[0025] Em certas modalidades, o suporte sólido poroso compreende partículas, tais como partículas tendo um diâmetro médio (volume pesado) de 10-500 micrometros. Partículas grandes dão retro-pressões inferiores nos leitos recheados e para este propósito pode ser vantajoso se as partículas têm um diâmetro médio de 150-500 micrometros, tal como 200-400 micrometros. As partículas podem ser apropriadamente esféricas ou substancialmente esféricas, o que facilita o recheio.
[0026] Em algumas modalidades, o suporte sólido poroso tem uma porosidade de 80-98%, tal como 90-98%. Uma porosidade alta é vantajosa porque o suporte pode acomodar uma grande quantidade de cadeias de polímero de polivinilpirrolidona sem bloquear os poros. A porosidade é definida como a fração em volume de poros no suporte e pode ser convenientemente medida medindo o teor de sólidos de um suporte equilibrado com água destilada. Com suportes conformados em membrana ou monolíticos, o suporte equilibrado com água está livre de excesso de água, pesado e seco em um forno a, por exemplo, 100oC e pesado novamente. A fração em volume de poros pode ser então calculada, usando uma estimativa da densidade do material da parede do poro. Suportes conformados com partículas são livres do excesso de água pela sucção suave com vácuo em um filtro de vidro até que uma torta do filtro de partículas é formada. O excesso de água é removido quando o nível de água retrocedeu para abaixo do topo da torta do filtro até que uma primeira rachadura na torta do filtro é formada. Sucção prolongada deve ser evitada para evitar evaporação na torta do filtro. Uma amostra da torta do filtro é então pesada e seca e a porosidade é calculada a partir dos pesos úmidos (mwet) e secos (mdry), usando uma estimativa da densidade do material da parede do poro. Densidades típicas do material da parede do poro (pmat) são: agarose 1,5 g/cm3, estireno- divinilbenzeno 1,1 g/cm3, polímeros de metacrilato 1,15 g/cm3, álcool polivinílico 1,2 g/cm3, sílica 2,2 g/cm3. A porosidade (p) em% em volume pode ser calculada então como: p = 100 * ((mwet - mdry/ph20)/(( mwet - mdry)/ph20 + mdry / pmat) em que ph20 é a densidade da água na temperatura em questão, tipicamente 1,0 g/cm3.
[0027] Alternativamente, a estrutura do poro do suporte pode ser caracterizada por cromatografia por exclusão de tamanho inversa, caso em que um valor Kav é obtido. O valor Kav é uma medida da fração em volume do suporte que é acessível para uma molécula da sonda de um determinado tamanho.
[0028] Tipicamente moléculas de proteína com tamanhos bem definidos são usadas como moléculas de sonda, mas também é possível usar frações de dextrano como moléculas da sonda. Detalhes das medições e cálculos dos valores Kav são dados em Gel Filtration Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology 1991, particularmente p. 10-11, que é incorporado aqui por referência. Em algumas modalidades, Kav para soro de albumina humana (Mw 67 kDa) sobre o suporte é pelo menos 0,4, tal como pelo menos 0,5 ou 0,5-0,9.
[0029] Em certas modalidades, o suporte sólido poroso compreende um polímero selecionado dentre o grupo consistindo de polímeros estirênicos, polímeros de metacrilato, polímeros de éter vinílico, polímeros de álcool vinílico e polissacarídeos.
[0030] Em algumas modalidades, o suporte sólido poroso compreende um polissacarídeo selecionado dentre o grupo consistindo de agarose, ágar, celulose e dextrano. Os polissacarídeos são hidrofílicos, o que minimiza o risco de incrustação devido a interações hidrofóbicas com compostos na bebida. Agarose e ágar podem ser facilmente preparadas na forma de hidrogéis de elevada porosidade (por exemplo, 90-98% de porosidade) com elevada rigidez, por gelificação térmica. Das duas, agarose é mais cara, mas tem a vantagem que é essencialmente livre de cargas negativas. Se ágar é usada, ela pode ser vantajosamente tratada com álcali para remover grupos carregados negativamente hidrolisáveis.
[0031] Suportes de polissacarídeos podem conter apropriadamente menos do que 10 ou menos do que 5 micromoles/ml carregadas negativamente e grupos acídicos. Este teor pode ser determinado por métodos de titulação bem conhecidos na técnica de trocadores catiônicos.
[0032] Os suportes podem compreender adicionalmente extensores, isto é, polímeros conectados a superfície dos poros do suporte. Os extensores podem ser, por exemplo, polímeros com funcionalidade hidróxi, em particular polissacarídeos do tipo dextrano, que podem ser conectados por copulação covalente nos grupos hidroxila dos suportes. Um exemplo específico são contas de ágar ou agarose com polímeros de dextrano conectados sobre hidroxilas de ágar/agarose que tenham sido ativadas por epóxi usando epiclorohidrina ou um diepóxido. Os extensores podem ser conectados apropriadamente por estruturas de ligação compreendendo grupos éter que são estáveis sob regeneração alcalina das matrizes. Extensores podem facilitar as interações entre os compostos HA e as cadeias de PVP e podem aumentar as taxas de transporte de massa.
[0033] Em certas modalidades uma pluralidade das cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são cada, ligadas covalentemente a dito suporte sólido por uma única porção de ligação. A única porção de ligação pode compreender, por exemplo, uma cadeia C3 ligada a éter, tal como em, - O-CH2CHCH2- ou -O-CH2-CH(OH)-CH2-O-CH2CHCH2- como ilustrado na Fig. 1 a). Tais porções de ligação podem ser alcançadas reagindo grupos hidroxila sobre um suporte com um halogeneto de alila ou éter alil glicidílico e polimerizando vinil pirrolidona na presença do suporte. Duas extremidades da cadeia de polímero de polivinilpirrolidona podem ser ligadas pela mesma porção de ligação, se a polimerização prossegue através de um grupo alila. Neste caso, a matriz pode compreender adicionalmente umas poucas cadeias de polímero de polivinilpirrolidona que são ligadas por duas porções de ligação, se a densidade alila é alta o suficiente de modo que uma cadeia pode polimerizar através de dois grupos alila adjacentes. A única porção de ligação pode compreender também uma ligação tioéter, por exemplo, como ilustrado na Fig. 1 b). Neste caso, os grupos tiol foram introduzidos sobre o suporte e estes têm agido como agentes de transferência de cadeia na polimerização de vinilpirrolidona. A ligação por uma única porção de ligação, como oposto a fixação em múltiplos pontos, melhora a mobilidade das cadeias de polímero e, desse modo sua acessibilidade e interação com os compostos HA.
[0034] Em algumas modalidades, a matriz compreende 0,50-4,0, tal como 0,70-3,0 ou 1,0-3,0 micromoles de resíduos de monômero de vinilpirrolidona por ml de matriz. O teor de resíduos de monômero de vinilpirrolidona pode ser determinado espectroscopicamente (por exemplo, NMR OU FTIR) ou, por exemplo, por análise elementar de nitrogênio, onde quaisquer nitrogênios introduzidos por monômeros carregados positivamente podem ser titulados e subtraídos do nitrogênio total. Um teor alto de resíduos de monômero de vinilpirrolidona é vantajoso tanto para a capacidade de ligação como para a estabilidade da bebida tratada.
[0035] Em certas modalidades, a matriz compreende 0,50 - 0,80 g, tal como 0,60-0,80 g de polímero de polivinilpirrolidona por g de matriz seca. Alternativamente, a matriz pode compreender 100-200 mg, tal como 120-180 mg de polímero de polivinilpirrolidona por ml de matriz drenado.
[0036] Um alto teor de polímero de polivinilpirrolidona é vantajoso tanto para a capacidade de ligação como para a estabilidade da bebida tratada. Teores altos de polímero de polivinilpirrolidona são particularmente vantajosos em combinação com porosidades altas como discutido acima. Teores excessivamente altos de polímero de polivinilpirrolidona podem, no entanto, ter uma influência negativa no transporte de massa e/ou nas propriedades mecânicas da matriz.
[0037] Em algumas modalidades, a matriz compreende menos do que 5 microgramas, tal como menos do que 2 ou menos do que 1 micrograma de carbono lixiviáveis por g de matriz seca. Teores lixiviáveis baixos podem ser alcançados lavando cuidadosamente a matriz antes do uso e pelo uso de materiais de suporte que têm eles mesmos teores lixiviáveis baixos. A quantidade de carbono lixiviável pode ser determinada apropriadamente pelos métodos descritos em M Andersson ET AL: Process Biochemistry 33(1), 47-55, 1998, em que 10 ml de água-matriz intumescida são incubados em 50 ml de água de alta pureza durante 1 semana e o teor total de carbono orgânico (TOC) do sobrenadante da água é determinado. É vantajoso minimizar o teor de lixiviáveis/extraíveis devido às preocupações de segurança alimentícia, mas também com relação às preocupações com regulamentações de pureza, por exemplo, cerveja em determinados países.
[0038] A poli(vinil pirrolidona) (nas partes que se seguem denotada PVP) pode ser fixada em uma sequência de reação de enxerto como mostrado na Figura 1.
1. Alilação.
[0039] Nesta etapa grupos alila são introduzidos. Éter alil glicidílico ou um halogeneto de alila é fixado sob condições alcalinas em uma matriz de base com funcionalidade hidroxila (por exemplo, uma matriz de base de agarose reticulada tal como Sepharose™ Big Beads).
2. Enxerto de PVP.
[0040] Vinil pirrolidona (VP) e um iniciador de radical (por exemplo, ADBA) são dissolvidos em uma solução aquosa contendo as partículas aliladas. Água pura ou soluções de sal aquosas (por exemplo, sulfato de sódio) são exemplos de solventes de reação possíveis. A mistura é aquecida, por meio do que o iniciador decompõe e forma radicais livres que iniciam uma polimerização de vinil pirrolidona. As cadeias de PVP em desenvolvimento também podem reagir com os grupos alila nas partículas e desse modo cadeias de PVP são fixadas covalentemente as partículas.
[0041] A estrutura fina das cadeias de PVP não é conhecida em detalhes, por exemplo, o peso molecular, distribuição de peso molecular e quantos dos grupos alila são consumidos.
[0042] Um parâmetro principal que pode ser medido é o peso seco (teor de sólidos) de 1 mL de gel antes e após a reação de enxerto. Deste modo a quantidade de PVP fixada em mg/mL pode ser calculada.
[0043] Outros parâmetros tais como quantidade média de PVP/grupo alila (que dá uma indicação do comprimento médio de cadeia) ou% de PVP na estrutura também podem ser calculados.
[0044] Acredita-se que os parâmetros seguintes afetem a quantidade de PVP que é fixada. • A concentração de VP na mistura da reação. • Concentração de iniciador • Temperatura de polimerização • Quantidade de grupos alila fixados as partículas • Tipo de iniciador • Solvente de reação • Concentração de pasta fluida das partículas (a quantidade de partículas aliladas) • Parâmetros da matriz de base (tamanho de partícula, distribuição de tamanho de poro, peso seco)
[0045] A polimerização de VP é uma reação exotérmica. O aumento potencial de temperatura será afetado pela velocidade da reação, a quantidade total de calor e por quanto solvente de reação que está presente para absorver o calor (isto é, a capacidade de calor do solvente).
[0046] A quantidade total de calor gerado será governada principalmente pela quantidade de VP usada, enquanto a velocidade da reação determinará a quantidade de calor gerado por unidade de tempo. A concentração de iniciador e a temperatura da reação são os parâmetros principais que afetarão a velocidade da reação. Um log de temperatura pode ser usado para rastrear a temperatura no vaso de reação ao longo do tempo.
[0047] Em um aspecto a presente invenção descreve um método para estabilização de uma bebida fermentada, por exemplo, cerveja, compreendendo as etapas de: a) prover uma coluna recheada com uma matriz de separação compreendendo um suporte sólido poroso e uma pluralidade de cadeias de polímero de polivinilpirrolidona covalentemente fixadas a dito suporte sólido, em que ditas cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são cadeias de copolímeros ou cadeias de homopolímeros de vinilpirrolidona compreendendo pelo menos 70% em moles de resíduos de monômero de vinilpirrolidona. A matriz de separação pode, por exemplo, ser uma matriz de separação como descrita acima; b) passar a bebida através de dita coluna e recuperar um fluxo transpassante da coluna como uma bebida estabilizada. Na etapa b), o tempo de residência da bebida na coluna pode ser, por exemplo, 2 minutos ou menos, tal como 1 minuto ou menos ou 10 s - 1 min. O tempo de residência é calculado como a altura do leito (cm) da coluna dividida pela velocidade de fluxo (cm/min) da bebida através do leito da coluna. Um tempo de residência curto é desejável por razões econômicas e as matrizes da invenção têm uma taxa de transporte de massa suficientemente alta para permitir estabilização suficiente e turvação com tempos de residência abaixo de 1 ou 2 minutos. A bebida estabilizada (cerveja) na etapa b) pode ter uma turvação a frio de menor do que 25% da turvação a frio para a bebida antes da passagem em dita coluna. A turvação a frio pode ser medida apropriadamente de acordo com o método EBC bem conhecido (método no. 31.1) e o tempo de residência na coluna pode ser menor do que 1 minuto, tal como 18 s.
[0048] Em certas modalidades o método compreende adicionalmente as etapas de: c) regeneração da coluna com uma solução de regeneração e; d) repetição das etapas a) - c) pelo menos duas vezes, tal como pelo menos 10, pelo menos 50 ou pelo menos 500 vezes. Isto tem a vantagem que a matriz de separação é reusada em diversos ciclos, o que é benéfico para a economia total do processo.
[0049] Em algumas modalidades a solução de regeneração compreende NaOH, tal como pelo menos 0,1 M de NaOH ou 0,1-2 M de NaOH, por exemplo, cerca de 1 M de NaOH. Soluções de NaOH podem remover eficientemente contaminantes adsorvidos e NaOH é também um agente de limpeza aceito a indústria de bebidas, que se o pH é controlado após a limpeza não deixa quaisquer resíduos de sabor desagradável ou tóxicos.
[0050] Em um terceiro aspecto a presente invenção descreve um método de fabricação da matriz de separação como descrita acima. Este método compreende as etapas de: a) prover um suporte sólido poroso compreendendo pelo menos 5 micromoles/ml de porções reativas a radical. As porções reativas a radical podem ser porções polimerizáveis, tais como ligações duplas C=C, porções de transferência de cadeia, tais como tióis ou elas podem ser iniciadores imobilizados; b) contatar o suporte com uma composição de monômero em que pelo menos 70% em moles dos monômeros em dita composição de monômeros é N-vinil pirrolidona e menos do que 1% em mol, ou menos do que 2% em moles dos monômero são carregadas negativamente; c) iniciar uma polimerização por radicais livres para formar uma matriz tendo cadeias de polímero de polivinilpirrolidona covalentemente fixadas o suporte, e; d) lavar a matriz.
[0051] Em certas modalidades a etapa a) compreende ou i) prover um suporte de copolímero de divinil benzeno, que compreende pelo menos 5 micromoles/ml de ligações duplas residuais, ou ii) reagir um suporte com funcionalidade hidroxila com um halogeneto de alila ou éter alil glicidílico.
[0052] Em algumas modalidades a etapa c) é realizada com o suporte em suspensão em uma solução aquosa compreendendo a composição de monômero e 0,05-3 mols/1 de um sal, tal como 0,1 - 2 M de sulfato de sódio ou sulfato de amônio. Uma vantagem do uso de uma solução de sal aquosa é que ela tem uma alta capacidade de aquecimento e que a quantidade de monômero necessária para ter uma determinada quantidade de PVP enxertada pode ser reduzida. Estes fatores significam que o aumento da temperatura devido à geração de calor exotérmica pode ser evitado, o que é importante para a escalabilidade do processo.
Turvação a frio de álcool
[0053] Descrição do ensaio de Pfeuffer GMBH. European brewers convention (EBC) método analítico no 31.1.
[0054] "Quando muito resfriadas as cervejas demonstram uma turbidez reversível que é dependente da condição da cerveja e é causada por complexos de proteína de polifenol precipitados. A adição de etanol reduz a solubilidade dos complexos e desse modo acelera a formação de turbidez. O teste em temperatura baixa, que pode ser realizado rapidamente, torna possível prever a turbidez em longo prazo da cerveja. Mesmo imediatamente após o tratamento de estabilização da cerveja, este teste provê informação precisa do potencial de turbidez da cerveja e a efetividade das medidas de estabilização, que podem ser então avaliadas e mudadas se necessário. Tanoides
Descrição do ensaio de Pfeuffer GMBH.
[0055] "Os tanoides são a quantidade de polifenóis que são PVP precipitáveis. Entre eles estão polifenóis de baixo a médio peso molecular, assim como, polímeros de catequina e antocianogênios. Tanoides vem de malte e lúpulos. Embora eles estejam presentes em pequenas quantidades na cerveja, eles são de grande significância com relação à estabilidade de coloides e a consistência de aroma. O teor de tanoide da cerveja, extratos de mostos, cevada, malte e lúpulos pode ser determinado por meio de precipitação usando PVP. PVP, um composto do tipo proteína, se fixa aos tanoides por ligações por pontes a H e forma complexos insolúveis com os mesmos, levando desse modo a turbidez. Se uma solução de PVP é adicionada continuamente a amostra, a turbidez aumentará até que todas as moléculas de tanoide são fixadas a PVP. Uma batelada adicional de PVP levará a um aumento na turbidez devido a diluição. A quantidade de PVP adicionada até o pico de turbidez que foi alcançada é proporcional ao teor de tanoide ".
Polifenóis totais
[0056] Descrição do ensaio do método EBC 9.11. O ensaio de polifenol total cobre todos os polifenóis. Cervejas com alta quantidade de polifenóis totais >200 mg/L são consideradas como sendo difíceis de estabilizar enquanto cervejas com polifenol total < 150 mg/L são mais fáceis para estabilizar usando tratamentos PVPP. A determinação do polifenol total é feita reagindo polifenóis da cerveja com citrato de amônio ferro em condições básicas. O complexo férrico-polifenol é medido a uma absorção a 600 nm contra uma solução em branco.
Exemplos Exemplos 1. Estudo do enxerto
[0057] O propósito principal do estudo do enxerto foi encontrar condições de reação onde uma quantidade apropriada de PVP pudesse ser fixada, em que a temperatura está sob controle e o ponto de ebulição pode ser evitado. Os parâmetros de síntese seguintes foram incluídos no estudo. • Temperatura de polimerização (variou entre 35 e 55°C) • Concentração de iniciador (variou entre 1,0 e 1,9% peso/peso) • Quantidade de grupos alila (variou entre 82 e 170 μmol/mL) • Concentração de VP (variou entre 10,0 e 39,2% peso/peso) • Concentração de pasta fluida (variou entre 18,5 e 36,9% volume/peso)
[0058] A identidade do iniciador (ADBA) pode ser mantida constante do início ao fim desde que ele seja rapidamente solúvel em água e decomponha em uma faixa de temperatura apropriada. Tabela 1. Visão geral do protótipo
Figure img0001
Quantidade de gel [mL] A quantidade de gel a ser enxertada. Concentração da pasta fluida da reação [volume/peso]:
[0059] Este parâmetro decide quanto concentrada a pasta fluida da reação deve ser. Um valor superior significa que existe menos solução de reação por mL de gel. % de VP + iniciador [% peso/peso]
[0060] Este parâmetro determina quanto da suspensão de reação em% em peso que deveria consistir de VP e iniciador, das substâncias ativas. Concentração de iniciador [% peso/peso]
[0061] Este parâmetro determina quantos% de iniciador deveriam ser usados em relação à quantidade de VP.
[0062] Ver fórmulas típicas abaixo.
Método de alilação (fórmula típica)
[0063] 6% de contas de agarose reticuladas com epiclorohidrina e tendo um diâmetro médio (volume-pesado) de 200 micrometros (uma fração da peneira entre 100 e 300 micrometros) foram usados como a matriz de base.
[0064] 100 mL de gel da matriz de base foram transferidos para um filtro de vidro (taxa de tamanho de poro 2) e sugados secos. Depois disso o gel foi lavado com 2000 mL de água em porções. O gel foi sugado seco após a última lavagem e foi transferido para um frasco com fundo redondo de 500 mL e água foi adicionada para um peso total de 87,14 g. 92,16 g de solução de hidróxido de sódio a 50% (peso/peso) foram adicionados.
[0065] O frasco com fundo redondo foi montado e imerso em um banho que foi mantido a 50°C. Um agitador com duas lâminas de oscilação com 5 cm de diâmetro foi usado e a agitação foi ajustada a 350 rpm. Quando a temperatura alcançou 50°C, 33,0 g de éter alil glicidílico foram adicionados. A reação foi deixada descansar durante 18 horas. A reação foi então neutralizada com 114,98 g de ácido acético a 60% em porções.
[0066] O gel foi lavado com 20xGV de água seguido por 5xGV de etanol, 20xGV de água novamente e finalmente 3xGV de solução de etanol a 20%.
[0067] O teor de alila foi determinado por titulação e foi verificado como sendo 231 micromoles/mL.
Método de enxerto (fórmula típica), ver Tabela 1 para detalhes específicos com relação a outras sínteses.
[0068] 1,0 M de sulfato de sódio foram preparados dissolvendo 284,1 g de sulfato de sódio anidro em um volume final de 2000 mL em um frasco de medição.
[0069] 100 mL de gel = 234,0 g de pasta fluida foram transferidos para um filtro (por. 2) e sugados secos. O gel foi lavado com 5000 mL de água em porções. Então o gel foi lavado com 3 X 150 mL de 1,0 M de sulfato de sódio e sugado seco entre as lavagens.
[0070] O frasco com fundo redondo foi colocado sobre uma balança e ele foi tarado. O gel "seco" foi transferido para o frasco com fundo redondo e o peso total foi ajustado para 244,7g com 1,0 M da solução de sulfato de sódio.
[0071] 26,3 g de vinil pirrolidona e 0,25 g de ADBA foram adicionados.
[0072] O frasco com fundo redondo foi montado. Um motor do agitador de topo com um agitador com duas lâminas de oscilação de 5 cm foi usado. Gás nitrogênio foi borbulhado através da solução de reação (com uma pipeta Pasteur) durante cerca de 25 minutos. A taxa de agitação foi 200 rpm.
[0073] Um banho de glicerol foi ajustado para 45 graus. Quando esta temperatura foi alcançada o frasco com fundo redondo foi imerso no banho de glicerol e a reação foi iniciada.
[0074] Após umas poucas horas, uma suspensão de polímero em água foi formada; as partículas de polímero tinham cerca de 2 mm de diâmetro. A reação foi deixada prosseguir durante a noite. ~ 200 g de água destilada foram adicionadas para diluir a solução de reação. Os grumos de polímero desapareceram e a solução de reação foi facilmente filtrada.
[0075] O gel foi lavado com 20 L de água destilada, e 1 L de etanol a 20%.
[0076] O peso seco foi registrado após a reação de enxerto, e foi registrado como sendo 265mg/mL.
Medição de peso seco
[0077] Uma balança de peso seco ajustada a 120°C foi usada para todas as medições de peso seco. Para medição de peso seco 1 mL de gel é transferido de um filtro de vidro com um topo PTFE projetado para acomodar 1,0 ml de torta do filtro para o copo de alumínio da balança.
[0078] Uma fórmula é obtida que dá 100-200 mg/mL de PVP fixada, em que não existe nenhum aumento significante de temperatura durante a reação e que é em todos os aspectos apropriada para escala de produção. Tabela 2. Visão global dos protótipos adicionais.
Figure img0002
[0079] O primeiro protótipo, 311 tinha um teor de alila de 170 μmol/mL. A quantidade de PVP que foi fixada era 216 mg/mL. A síntese estabelecida para este conjunto de experimentos foi desse modo considerada como sendo OK, embora a exotérmica tenha causado ebulição. Uma solução muito viscosa é formada que é girada em torno do agitador. A viscosidade aumentou simultaneamente com a ocorrência de ebulição. A reação, no entanto, nunca ferveu e foi por esse motivo deixada prosseguir durante a noite.
[0080] O experimento seguinte era 354, onde a quantidade de iniciador foi diminuída de 1,9% para 1,0%. A teoria era que uma concentração inferior de iniciador diminuiria a velocidade da reação e isto poderia reduzir potencialmente o risco de ebulição. Este não foi o caso; ebulição ainda ocorreu. No entanto, a ebulição foi na verdade adiada de 17 minutos para 29 minutos. A quantidade de PVP que foi fixada era de fato superior a do 311, 227 mg/mL comparada a 216 mg/mL. Para todos os experimentos subsequentes a concentração de iniciador foi por esse motivo ajustada para 1,0% já que isto teve um efeito positivo tanto na ebulição como na quantidade de PVP que foi fixada. Este parâmetro poderia, no entanto, ser otimizado adicionalmente em estudos futuros, uma concentração ainda inferior de iniciador poderia, por exemplo, ser interessante de investigar.
[0081] Para os dois experimentos seguintes, 374 e 392, todos os parâmetros foram mantidos constantes exceto temperatura. Os experimentos prévios foram feitos a 55oC enquanto 45 e 35 graus foram usados para 374 e 392 respectivamente. Indo para 45oC a ebulição foi adiada adicionalmente para depois de 59 minutos de reação. Quando 35°C foram usados nenhuma ebulição ocorreu. Os perfis de temperatura para estas reações podem ser encontrados no Apêndice A junto com curvas de temperatura selecionadas dos últimos experimentos. A 45°C existiu ainda mais PVP fixada do que a 55°C, 238 mg/mL comparada a 227 mg/mL. Pode ser que a reação mais controlada a 45°C favoreça a fixação de PVP. A 35°C, no entanto existe uma queda clara na quantidade de PVP que é fixada, apenas 134 mg/mL foram fixadas neste caso. A temperatura da reação teve desse modo um efeito pronunciado tanto na tendência a ebulição como na quantidade de PVP que é fixada. 45°C foram usados para todos os experimentos subsequentes já que nesta temperatura quantidades altas de PVP poderiam ser claramente fixadas, enquanto a tendência à ebulição foi inferior do que a 55°C.
[0082] A fim de evitar totalmente a ebulição, a quantidade de VP na reação foi dividida para 19,6% para os dois experimentos seguintes. O efeito do teor de alila também foi investigado. Para 410 o nível de alila era 170 μmol como para todos os experimentos prévios, enquanto para 431 o teor de alila era 82 μmol/mL. Reduzindo a concentração de VP a ebulição foi evitada, mas a solução de reação ainda se tornou muito viscosa e foi girada em torno do agitador. Este problema também teve que ser resolvido a fim de ter uma fórmula amigável para produção.
[0083] A quantidade de PVP fixada foi também claramente inferior para 410 comparada a 374, 120 mg/mL comparada a 238 mg/mL. É interessante ver que uma redução na metade da concentração de VP resulta na metade da quantidade de VP fixada. O efeito do teor de alila não foi muito pronunciado. Para 431 onde um nível de alila de 82 μmol/mL foi usado, 113 mg/mL de PVP foram fixados comparados a 120 mg/mL para 410 onde o nível de alila era mais do que duas vezes superior, 170 μmol/mL.
[0084] A fim de ver se mais PVP poderia ser fixada com 196% de VP na solução de reação, 0,5 M (458) e 1,0 M de Na2SO4 (474) foram experimentados como solvente de reação. Quando 0,5 M de Na2SO4 foram usados houve um aumento da quantidade de PVP que foi fixada, 154 mg/mL para 458 comparada a 120 mg/mL para 410. Quando a concentração de sulfato de sódio foi aumentada para 1,0 M muito menos PVP foi fixada, apenas 79 mg/mL para 474. No entanto, para ambas as sínteses existiu uma precipitação pronunciada de PVP na solução de reação que provavelmente impediu uma copulação efetiva.
[0085] Para o experimento seguinte 493, a fim de evitar precipitação uma quantidade inferior de PVP foi experimentada, apenas 10% enquanto mantendo 1 M de Na2SO4 como solvente de reação. Isto provou ser um meio de sucesso daí em diante. 192 mg/mL de PVP foram fixadas neste experimento. Uma leve separação da fase com pequenas partículas de polímero pode ser vista, mas quando água é adicionada após a reação estar completa as gotículas de polímero são rapidamente dissolvidas e a solução da reação se torna clara. As partículas podem ser rapidamente lavadas em um filtro. As gotículas de polímero devem ser mantidas sob observação durante a escala para ter certeza que elas estão facilmente dissolvidas.
[0086] Uma razão superior de VP versus partículas (isto é, uma concentração inferior de pasta fluida da reação) foi também experimentada no 518 com em todos os aspectos a mesma fórmula de enxerto como no 493. Para 518 a quantidade de partículas era 50 mL comparada a 100 mL que foram usados para todas as outras sínteses. Foi considerado que isso aumentaria a quantidade de PVP adicionalmente, mas este não foi o caso, tinha menos PVP fixada com esta fórmula, 116 mg/mL para 518 comparada a 194 mg/mL para 493.
[0087] 538 é a reprodução de 493 para assegurar que a fórmula é robusta. Um resultado quase idêntico foi obtido 194 mg/mL na PVP fixada para 538 comparada a 192 mg/mL para 493.
[0088] Um experimento final, 796, foi feito a fim de ver o efeito do teor de alila na fórmula de enxerto otimizada. Para 796 um nível de alila de 82 μmol/mL foram usados comparados a 166 μmol/mL que foram usados para 493. Isto resultou em uma quantidade inferior de PVP fixada 165 mg/mL comparado a 192 mg/mL para 493. O efeito do nível de alila, no entanto não é drástico. • A ebulição pode ser evitada para os experimentos onde 19,6% de VP ou menos são usados. • A temperatura tem um efeito grande quantidade de PVP que é fixada e na tendência a ebulição. Temperaturas acima de 35°C melhoram a eficiência da reação de acoplamento. • A quantidade de VP+iniciador é um parâmetro importante da síntese; ela afeta significantemente a quantidade de PVP que é fixada, a tendência à ebulição e a viscosidade da solução de reação. • O teor de alila afeta a quantidade de PVP que é fixada; teores superiores de alila dão quantidades superiores de PVP fixada. O efeito, no entanto, não é dramático. Quando a quantidade de grupos alila é reduzida de 166 para 82 μmol/mL a quantidade de PVP fixada é reduzida apenas de 192 para 165 mg/mL. • O uso de sulfato de sódio na solução de reação tem um grande efeito positivo na quantidade de PVP que é fixada, desde que a precipitação de PVP seja evitada. • Ebulição, uma solução de reação viscosa ou precipitação de PVP foram evitadas para o protótipo 493 onde 10% de VP em combinação com 1,0 M de Na2SO4 foram usados. Estas condições resultaram em 192 mg/mL de PVP fixada que é similar a quantidade de PVP que foi fixada para o protótipo de referência 9018, 199 mg/mL. Este protótipo teve bom desempenho, e as condições de reação usadas para este protótipo podem ser usadas como um ponto de partida para otimização adicional.
[0089] Os protótipos, mostrados na Tabela 3, exceto 9018, foram avaliados fluindo 750 ml de cerveja do tipo lager não estabilizada através de uma coluna recheada com 1 mL do protótipo de resina a uma vazão de 3,3 mL/min (18 segundos de tempo de residência) e a uma temperatura de <5°C. O fluxo transpassante de cerveja foi analisado com "Turvação a frio de álcool", "Tanoides" e "polifenóis totais" e comparados à cerveja não estabilizada e cerveja não estabilizada que tinha sido processada através do adsorvedor CSS (Q Sefarose BB). Para os três primeiros protótipos testados o teor de Tanoide era zero e o ensaio de teor de Tanoide foi deixado para o resto dos protótipos já que mais cerveja precisaria ser processada através da coluna de 1 mL para avaliar a ruptura de tanoide. Deve ser observado que um nível alto de tanoides foi determinado na cerveja após processamento no adsorvedor CSS, dando a indicação que os protótipos estão funcionando extremamente bem já que o ensaio "tanoides" é considerado como o ensaio que correlaciona o melhor para estabilidade coloidal.
Figure img0003
Tabela 3. Protótipos avaliados com o processo de estabilização de cerveja
Métodos de estabilização de cerveja Recheio da coluna:
[0090] Cada protótipo e referência (adsorvedor CSS lote 10039019) foram recheados em uma coluna Tricorn 5/100 (GE Healthcare) a 2 mL/min. A altura do leito foi ajustada para 5,1 ± 0,1 cm a 2 mL/min para obter um volume de leito de 1,0 mL de resina. O adaptador de topo foi ajustado 1 mm abaixo da marca de 5,1 e a coluna foi equilibrada a 2 mL/min com 5 volumes na coluna de água antes da aplicação da cerveja.
Aplicação da cerveja
[0091] A Figura 4 mostra o ajuste da aplicação de estabilização de cerveja miniaturizada. Uma garrafa Cornelius de 18 L de cerveja não estabilizada foi obtida na cervejaria Slottkallans (Uppsala, Suécia) e colocada dentro de um incubador a 0°C durante três dias. Cerveja nova que foi filtrada estéril deve ser reconstituída durante alguns dias para obter resultados estáveis. O tubo da garrafa de cerveja foi dividido em 2 bombas e 4 cabeçotes de bomba (bombas P-900, GE Healthcare) para ser capaz de operar 4 protótipos simultaneamente. Já que é impossível remover bolhas dos tubos de cerveja a vazão real deve ser calibrada. Todos os cabeçotes da bomba foram ajustados para 4,0 mL/min e frascos volumétricos de 10 mL foram cheios e o tempo para encher os frascos volumétricos até a marca foram observados e a vazão real com cerveja foi calculada para 3,3 mL/min para todos os cabeçotes da bomba. As 4 colunas com protótipos foram colocadas dentro do incubador e os tubos dos cabeçotes das bombas foram conectados as colunas. Garrafas de coleta de 1000 mL foram conectadas após cada coluna no incubador. A primeira coluna na série de testes era sempre a coluna referência contendo adsorvedor CSS lote 10039019. Estas contas tinham diâmetros na faixa de 100-300 micrometros, com diâmetro médio pesado em volume de 200 micrometros e um teor de grupo amônio quaternário de 0,18-0,25 mmol/ml. 750 mL de cerveja foram bombeados através de cada coluna a uma vazão de 3,3 mL/min que corresponde a um tempo de residência de 18 s, isto é, ~3 três vezes mais rápido do que o processo CSS comum. O tempo de processo foi 3,75 h. Cerveja que tinha sido fluida através da coluna foi coletada nas garrafas de 1000 mL.
Métodos de análise de turvação a frio de álcool
[0092] Amostras de cerveja das garrafas de coleta de 1000 mL foram analisadas durante 20 horas após o processo de estabilização de cerveja. Primeiro, cerveja não estabilizada da garrafa Cornelius foi analisada seguido pela amostra de referência do adsorvedor CSS e os protótipos. ~20 mL de cerveja foram transferidos para dentro de um tubo Falcon de 50 mL e o tubo foi agitado rapidamente para remover dióxido de carbono. Após a cerveja ter assentado, 4 x 1,0 mL de cerveja foram pipetados cuidadosamente dentro da cubeta. 120 μL de etanol foram pipetados dentro de uma cubeta limpa e a cubeta foi virada cuidadosamente para cima e para baixo 5 vezes antes da análise. 0,6 mL de etileno glicol foram adicionados na câmara da cubeta no Tanômetro para aumentar o contato térmico entre a cubeta e o resfriador. A cubeta foi colocada na câmara da cubeta e a análise de turvação a frio de álcool foi iniciada. A amostra na cubeta foi congelada para -5°C e a turbidez foi medida após a amostra ter sido incubada durante 40 minutos. Foi mostrado que após ~10 minutos, a turbidez permaneceu a mesma como durante os 40 minutos, assim, para algumas amostras a turbidez foi monitorada após 20 minutos para aumentar a velocidade da análise.
[0093] A turvação a frio de álcool foi calculada subtraindo a turvação final com a turvação inicial em unidades EBC. Ver figura 5.
Métodos Tanoides
[0094] Uma seringa de perfusão, feita de vidro, foi cheia com 0,400 g/L da solução de PVP e colocada sobre o suporte provido no Tanômetro (Pfeuffer GmbH, Alemanha). Amostras de cerveja das garrafas de coleta de 1000 mL foram analisadas dentro de 20 horas após processo de estabilização de cerveja. Primeiro, cerveja não estabilizada da garrada Cornelius foi analisada seguido pela amostra de referência do adsorvedor CSS e dos protótipos. ~20 mL de cerveja foram transferidos para dentro de um tubo Falcon de 50 mL e o tubo foi agitado rapidamente para remover dióxido de carbono. Após a cerveja ter assentado, 4 x 1,0 mL da cerveja foram pipetados cuidadosamente dentro da cubeta. Uma haste de agitação foi colocada na garrafa da cubeta. A amostra foi titulada com solução de PVP da seringa da perfusão a 5 mL/h a 25°C até que 100 mg/L PVP ou até que o pico tanoide alcançou seu máximo e o teor de tanoide foi automaticamente calculado pelo software Tannolab.
Métodos de polifenóis totais
[0095] Amostras de cerveja das garrafas de coleta de 1000 mL foram analisadas dentro de 4 horas após o processo de estabilização de cerveja. Primeiro, cerveja não estabilizada da garrafa Cornelius foi analisada seguido pela amostra de referência do adsorvedor CSS e protótipos. ~50 mL de cerveja foram filtrados através de um filtro de papel Whatman™ em um frasco-E de 200 mL. 2 x 10 mL de cerveja foram pipetados dentro de um frasco volumétrico de 25 mL. 8 mL da solução de CMC/EDTA foram adicionados dentro de frascos volumétricos. 500 μl de reagente férrico foram adicionados apenas em um frasco e 500 μl de solução de amônia foram pipetados dentro de ambos os frascos volumétricos. Água MilliQ™ foi adicionada na marca dos frascos volumétricos. Os frascos foram misturados rapidamente. O frasco sem reagente férrico era a amostra em branco. A absorvência a 600 nm foi medida após >10 min (dentro de 60 min) para amostra e em branco, usando uma cubeta de 10 cm. O polifenol total no frasco foi calculado pela fórmula: TP = (As-Ab) x 820 Em que TP = Polifenóis totais (mg/L) As = Absorvência para a amostra, AU AB = Absorvência para em branco, AU
[0096] A redução do polifenol total foi calculada dividindo os polifenóis totais da amostra de cerveja processada através dos protótipos com os polifenóis totais da cerveja não estabilizada.
[0097] Já que as propriedades químicas e físicas de cerveja não estabilizada mudam rapidamente foi possível apenas operar e analisar os protótipos 3-6 e referência do adsorvedor CSS com cerveja não estabilizada dentro do período de tempo exigido de 24 horas. Por esse motivo, os 12 protótipos foram trabalhados com a aplicação de cerveja em 4 ciclos.
[0098] Primeiro os protótipos foram analisados com o ensaio de teor de Tanoide. Já que os três primeiros protótipos ligaram todos os tanoides na cerveja foi impossível avaliar sua capacidade de ligação de tanoides, assim os protótipos seguintes foram avaliados apenas com a análise de turvação a frio de álcool. Para contas enxertadas com PVP, uma quantidade maior de cerveja por meio mL pode ser necessária para investigar a capacidade tanoide. No entanto, as contas do adsorvedor CSS reduzem apenas o teor de Tanoide de 69,8 para 32,8 mg/L, indicando que os protótipos enxertados com PVP são significantemente mais capazes de ligar tanoides do que o adsorvedor CSS.
[0099] A Figura 6 mostra os resultados do teor de tanoide. Lote "Uppsala 1" foi usado.
[00100] A tabela 4 mostra os resultados da análise de turvação a frio de álcool para os protótipos. A turvação a frio foi normalizada e a porcentagem relativa da turvação a frio comparada à cerveja não estabilizada foi calculada para os protótipos. Lote "Uppsala 1" foi usado. Tabela 4. Resultados da turvação a frio de álcool.
Figure img0004
Figure img0005
[00101] Para estimar a variação dentro do ensaio para julgar se os resultados diferem significantemente ou não, o desvio padrão médio e relativo da referência do adsorvedor CSS que foi trabalhado quatro vezes foi avaliado. N = 4 Média = 42,1% SD = 2,9% RSD = 6,9%
[00102] A tabela 5 e figura 8 mostram os resultados da redução do polifenol total. A redução do polifenol total foi medida para a fração de cerveja de 750 mL e também para a fração de 50 mL, coletada após os 750 mL para investigar se o protótipo ainda estava absorvendo os polifenóis totais. Na figura 6, para cada protótipo a primeira barra é a fração de 750 mL e a segunda barra é a fração de 50 mL. Lote de cerveja "Uppsala 2" foi usado. Tabela 5. Resultados da redução de polifenol.
Figure img0006
Figure img0007
Figure img0008
- Todos os protótipos mostraram menos turvação a frio do que o adsorvedor CSS usando aproximadamente os mesmos ajustes de processo de cerveja que os do processo do adsorvedor CSS usa hoje, 750 mL cerveja/meio mL. - Dois protótipos mostraram divergências fortemente significantes em relação a outros protótipos. Cerveja processada através de 392 não mostrou turvação a frio de modo algum e 474 mostrou uma quantidade superior fortemente significante de turvação a frio em relação aos outros protótipos. - Cerveja processada através de todos os outros protótipos mostraram uma turvação a frio de 1,4-4,4 unidades EBC e elas foram difíceis de diferenciar. - Todos os protótipos mostraram redução superior do polifenol total em relação ao adsorvedor CSS. O protótipo 474 mostrou menos redução no polifenol total em relação aos outros protótipos.
[00103] Deve ser observado que o ensaio de turvação a frio de álcool inclui também flavanóis monoméricos simples que não são capazes de reticular peptídeos acima de 0°C e com menos teor de álcool. Estes flavanóis também não são capazes de polimerizar já que os produtos da oxidação destes polifenóis são estáveis. Cerveja processada por 311, 377 e 431 mostrou zero teor de tanoide e diferiu de 2,8-4,4 unidades EBC na turvação a frio. É por esse motivo principalmente a seletividade para ligar flavanóis monoméricos simples que difere entre os protótipos.
[00104] A partir da perspectiva do projeto do protótipo, para julgar como os resultados dos resultados da aplicação de cerveja se referem aos parâmetros usados na síntese não existe em geral nenhuma correlação exceto para o protótipo 392 (nenhuma turvação a frio foi observada) e 474 (teor relativamente alto de turvação a frio). 392 é o único protótipo que foi sintetizado a 35°C, 10-20°C inferior ao dos outros protótipos. Pode ser especulado que a síntese de ligante a temperatura superior afeta a conformabilidade do polímero de PVP e a temperatura inferior o polímero é mais flexível e é capaz de ligar mesmo polifenóis de baixo peso molecular com poucos grupos hidroxila expostos. 474 teve densidade de ligante muito inferior a dos outros protótipos e a ruptura de polifenóis mais complexos ocorreu durante o processo. A figura 8 mostra a correlação entre polifenóis totais e turvação a frio. A partir desta figura, é fácil distinguir entre os protótipos que têm >100 mg de PVP/meio mL e redução alta de polifenol em comparação com um protótipo com meio de baixo teor de PVP/mL (474) e adsorvedor CSS. Exemplos 2. Exemplos Comparativos
[00105] Contas de agarose enxertadas com dietileno glicol vinil éter (DEGVE) foram preparadas de acordo com os métodos descritos em US20100028505 e Pat. dos Estados Unidos 8.137.559 pela alquilação de contas de agarose reticuladas Sepharose™ 6 FastFlow (GE Healthcare BioSciences AB) com éter alil glicidílico e reagindo 10 g de contas aliladas úmidas com uma solução de 1,6 g de 2,2'-azobis(2- metilbutironitrila) em 40 g de dietileno glicol vinil éter a 70°C durante 18 h sob atmosfera inerte. As contas foram então lavadas com grandes quantidades de água e etanol. O teor de DEGVE enxertado foi medido a partir do aumento do teor seco e foi verificado como sendo 0,76 mmol de resíduos de monômero de DEGVE por mL de contas.
[00106] Alíquotas de 5 ml do protótipo enxertado com DEGVE e uma amostra de contas do adsorvedor CSS foram recheadas em colunas XK 16 (GE Healthcare Bio-Sciences AB) e 1000 ml de cerveja não estabilizada filtrada foram bombeados através de cada coluna a uma vazão de 13 ml/min. A turvação a frio foi medida antes e após a passagem pelas colunas e a redução na turvação foi verificada como sendo apropriadamente a mesma do protótipo DEGVE e do adsorvedor CSS. Consequentemente, como no exemplo prévio, os protótipos enxertados com PVP mostraram redução de turvação significantemente melhor à das contas do adsorvedor CSS, eles também são melhores do que o protótipo DEGVE.
[00107] Esta descrição escrita usa exemplos para descrever a invenção, incluindo o melhor modo, e também para permitir que qualquer versado na técnica pratique a invenção, incluindo produzir e usar quaisquer dispositivos ou sistemas e realizar quaisquer métodos incorporados. O escopo patenteável da invenção é definido pelas reivindicações, e pode incluir exemplos que ocorrem para os versados na técnica. Tais outros exemplos são planejados para estar dentro do escopo das reivindicações se eles têm elementos estruturais que não diferem da linguagem literal das reivindicações, ou se eles incluem elementos estruturais equivalentes com diferenças não substanciais da linguagem literal das reivindicações. Todas as patentes e pedidos de patente mencionados neste texto são incorporados aqui por referência em suas totalidades como se eles fossem individualmente incorporados.

Claims (15)

1. Matriz de separação compreendendo um suporte sólido poroso e uma pluralidade de cadeias de polímero de polivinilpirrolidona covalentemente fixadas a dito suporte sólido, caracterizada pelo fato de que ditas cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são cadeias de copolímeros ou cadeias de homopolímeros de vinilpirrolidona compreendendo pelo menos 70% em moles de resíduos de monômero de vinilpirrolidona e menos do que 2% em moles de resíduos de monômero carregados negativamente, em que dito suporte sólido poroso compreende um polissacarídeo selecionado do grupo que consiste em agarose, ágar, celulose e dextrano, e em que a dita matriz de separação compreende 100-200 polímero de polivinilpirrolidona por ml de matriz.
2. Matriz de separação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ditas cadeias de polímero de polivinilpirrolidona compreendem: a) menos do que 1% em mol de resíduos de monômero carregados negativamente; e/ou b) até 30% em moles de resíduos de monômero carregados positivamente.
3. Matriz de separação de acordo a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que dito suporte sólido poroso: a) compreende partículas, tais como partículas tendo um diâmetro médio de 10-500 micrometros; e/ou b) tem uma porosidade de 80-98%, tal como 90-98%.
4. Matriz de separação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que uma pluralidade de ditas cadeias de polímero de polivinilpirrolidona são cada, ligadas covalentemente a dito suporte sólido por uma única porção de ligação, tal como em que dita única porção de ligação compreende uma cadeia C3 ligada a éter.
5. Matriz de separação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende: 0,5-4,0, tal como 0,7-3,0 micromoles de resíduos de monômero de vinilpirrolidona por ml de matriz; e/ou 0,50-0,80 g de polímero de polivinilpirrolidona por g de matriz seca.
6. Matriz de separação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende 120-180 mg, de polímero de polivinilpirrolidona por ml de matriz; e/ou menos do que 5 microgramas/g de carbono lixiviáveis.
7. Método para estabilização de uma bebida fermentada, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) prover uma coluna recheada com uma matriz de separação conforme definida na reivindicação 1, e b) passar dita bebida através de dita coluna e recuperar um fluxo transpassante da coluna como uma bebida estabilizada.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a matriz de separação é definida como qualquer uma das reivindicações 2 a 6
9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas c) de regeneração da coluna com uma solução de regeneração e; d) de repetição das etapas a) - c) pelo menos duas vezes, tal como pelo menos 10 ou pelo menos 50 vezes, em que dita solução de regeneração compreende opcionalmente NaOH, tal como pelo menos 0,1 M de NaOH ou 0,1-2 M de NaOH.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 79, caracterizado pelo fato de que na etapa b) o tempo de permanência da bebida na coluna é de 2 minutos ou menos, como 1 minuto ou menos.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a bebida fermentada é cerveja, e em que a bebida estabilizada na etapa b) tem uma turvação a frio de menor do que 25% da turvação a frio para a bebida antes da passagem em dita coluna.
12. Método para fabricação da matriz de separação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que dito método compreende as etapas de: a) prover um suporte sólido poroso compreendendo pelo menos 5 micromoles/ml de porções reativas a radical, em que dito suporte sólido poroso compreende um polissacarídeo selecionado do grupo que consiste em agarose, ágar, celulose e dextrano; b) contatar dito suporte com uma composição de monômero em que pelo menos 70% dos monômeros em dita composição de monômero são N-vinil pirrolidona; c) iniciar uma polimerização por radicais livres para formar uma matriz tendo cadeias de polímero de polivinilpirrolidona covalentemente fixadas ao suporte, e; d) lavar dita matriz.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as referidas frações reativas a radicais são ligações duplas C=C.
14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende i) fornecer um suporte de copolímero de divinilbenzeno ou ii) reagir um suporte hidroxifuncional com um halogeneto de alila ou éter alilglicidílico.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que a etapa c) é realizada com o suporte suspenso em uma solução aquosa compreendendo N-vinil pirrolidona e 0,05-3 mol/L de um sal, como 0,1 - 2 M de sulfato de sódio.
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