BR112016007536B1

BR112016007536B1 - compostos, composições e utilizações correspondentes, para a prevenção e/ou o tratamento de dislipidemias

Info

Publication number: BR112016007536B1
Application number: BR112016007536-6A
Authority: BR
Inventors: Thierry FERREIRA; Romain Ferru-Clement; Clarisse Vandebrouck
Original assignee: Centre National De La Recherce Scientifique (Cnrs); Universite De Poitiers
Priority date: 2013-10-08
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2020-10-13
Also published as: JP2016535727A; JP6502335B2; FR3011467A1; ES2674869T3; FR3011467B1; CN105744934A; US10231985B2; CN105828814A; EP3065733A1; US20160287542A1; EP3065732A1; US9821000B2; CA2926582A1; AU2014333853A1; JP2016535725A; CN105744934B; EP3065732B1; US20160256429A1; CA2927951A1; BR112016007536A2

Abstract

COMPOSTOS, COMPOSIÇÕES E UTILIZAÇÕES CORRESPONDENTES, PARA A PREVENÇÃO E/OU O TRATAMENTO DE DISLIPIDEMIAS A presente invenção se refere ao campo da medicina. Mais particularmente refere-se a utilização de compostos para prevenir e/ou tratar lipotoxicidade em um indivíduo, especialmente lipotoxicidade por hipóxia. A invenção refere-se mais particularmente a composições, especialmente composições farmacêuticas e suplementos nutricionais, compreendendo tais compostos bem como a utilização destes para prevenir e/ou tratar lipo-intoxicação, especialmente lipo- intoxicação por hipóxia. Os compostos e composições da invenção podem, em particular, ser vantajosamente utilizados para prevenir e/ou tratar uma patologia selecionada dentre as patologias pulmonares, em particular, fibrose cística ou uma doença pulmonar obstrutiva crônica.

Description

Campo da invenção

[001] A presente invenção se refere ao campo da medicina. Ela se refere mais especialmente à utilização de compostos para prevenir e/ou tratar, em um indivíduo, uma lipo-intoxicação, por hipóxia. A lipo-intoxicação, ou dislipidemia em sua acepção ampla, está tipicamente ligada à presença em excesso nas membranas biológicas, inclusive nas membranas biológicas de células não adipocitárias, de ácidos graxos, em especial de ácidos graxos de cadeias longas saturadas, e/ou de esteróis. A invenção se refere também às composições, em especial às composições farmacêuticas e aos suplementos ou complementos alimentares, que compreendem tais compostos, assim como a suas utilizações para prevenir e/ou tratar uma lipo- intoxicação, notadamente uma lipo-intoxicação por hipóxia. Os compostos e composições de acordo com a invenção podem em especial ser vantajosamente utilizados para prevenir e/ou tratar uma patologia escolhida entre as patologias pulmonares, notadamente a mucoviscidose ou as broncopneumopatias crônicas obstrutivas.

Soluções da técnica anterior

[002] A mucoviscidose é uma doença que afeta notadamente os epitélios glandulares de numerosos órgãos. Essa doença genética letal de transmissão autossômica recessiva está ligada a mutações do gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator)situado no cromossoma 7, que provocam uma alteração da proteína CFTR. Mais de 1900 mutações diferentes já foram identificadas. A mutação mais frequente é a mutação “F508del-CFTR” (ΔF508) que consiste em uma deleção de três nucleotídeos ao nível do décimo éxon do gene, que chega à eliminação de um aminoácido, a fenilalanina, na posição 508. A disfunção da proteína CFTR provoca notadamente um aumento da viscosidade do muco e seu acúmulo nas vias respiratórias e digestivas. De um ponto de vista clínico, a forma mais frequente associa problemas respiratórios, problemas digestivos e problemas do crescimento estaturoponderal. Os problemas pulmonares permanecem a maior causa da morbidez e da mortalidade. A mucoviscidose provoca uma inflamação crônica dos brônquios com superinfecção bacteriana, provocando uma degradação progressiva do estado respiratório, que evolui por acessos, começando por sintomas tais como uma tosse e que chegando a uma insuficiência respiratória severa. Diversos tratamentos paliativos sintomáticos - tais como a fisioterapia, a antibioterapia, a administração de medicamentos mucolíticos - estão disponíveis. Ao contrário, não existe atualmente nenhum tratamento curativo, de natureza medicamentosa ou por um protocolo de terapia gênica. Somente o medicamento Ivacaftor®, que compreende uma molécula potencializadora da proteína CFTR nos indivíduos mucoviscidósicos portadores da mutação G551D, é atualmente comercializado. Por outro lado, vários estudos farmacológicos e/ou clínicos que se referem a moléculas de interesse terapêutico foram relatados. Essas moléculas candidatas visam geralmente corrigir, regular, potencializar e/ou “chaperonar” a proteína CFTR disfuncional (cf. por exemplo Kirby e al., 2014; Pedemonte e al., 2005; Van Goor e al., 2006; Wang e al., 2006; Sampson e al., 2011; Van Goor e al., 2011). Algumas têm notadamente como vocação corrigir o defeito de dobramento da proteína F508del-CFTR, que a impede de adquirir uma conformação tridimensional correta, de avançar ao longo da via de secreção e de ter acesso a seu sítio de destino, a membrana plásmica. No entanto, a grande maioria das moléculas candidatas sofre de uma falta de eficácia nos estudos In vivo e/ou nos ensaios clínicos.

[003] As broncopneumopatias crônicas obstrutivas (BPCO) agrupam doenças crônicas sistêmicas de origem respiratória e que atingem os brônquios. A causa principal dessa doença é o tabagismo. A BPCO se caracteriza notadamente por uma obstrução lenta e progressiva das vias aéreas e dos pulmões, associada a uma distensão permanente dos alvéolos pulmonares. De um ponto de vista clínico, as BPCO estão associadas a problemas respiratórios, com possíveis complicações neurológicas, cardiovasculares ou musculares. As BPCO provocam notadamente uma insuficiência respiratória, que pode ser severa. Diversos tratamentos paliativos sintomáticos - tais como a antibioterapia, a corticoterapia, a utilização de um broncodilatador ou de um suporte ventilador mecânico, e mesmo a oxigenoterapia de longa duração para as formas mais severas - estão disponíveis.

[004] Recentes trabalhos demonstraram que células epiteliais brônquicas recentemente dissociadas a partir de biopsias de pacientes mucoviscidósicos apresentavam um acúmulo anormalmente elevado de ácido palmítico (AGS) dentro das fosfatidilcolinas (PC) das membranas celulares (cf. Payet e al., 2014). Previamente, foi estabelecido que a conversão dos AGS celulares endógenos em AGI é catalisada por enzimas que dependem do oxigênio (Pineau e al., 2008; Pineau e al., 2009). De maneira que, depois de ter colocado em evidência que a hipóxia era induzida em biopsias de pacientes mucoviscidósicos ou, ao contrário, que a hipóxia provocava a lipo-intoxicação de células epiteliais brônquicas, in vitro(cf. Payet e al., 2014), foi concluído que as células epiteliais brônquicas de pacientes mucoviscidósicos eram lipo-intoxicadas por um acúmulo de ácido palmítico causado por hipóxia. Por outro lado, os inventores puderam também realizar o mesmo tipo de observações, que ligam a hipóxia à lipo-intoxicação, em biopsias pseudo-sadias de pacientes fumantes atingidos por um câncer do pulmão (retiradas no exterior da zona pulmonar cancerosa).

[005] Em sua acepção ampla, uma dislipidemia - ou lipo-intoxicação - é definida notadamente como uma concentração anormalmente elevada ou diminuída de lipídeos, tipicamente de ácidos graxos livres ou não esterificados, esteróis (por exemplo colesterol, triglicerídeos ou fosfolipídios no sangue). As dislipidemias são definidas então como uma desregulação da homeostasia lipídica.

[006] Os ácidos graxos não esterificados (AGNE) ou ácidos graxos livres (AGL) representam um elemento energético importante do organismo. Eles são constituídos por uma mistura complexa de ácidos graxos que diferem por seu número de ligações duplas e o número de átomos de carbono que constituem a cadeia hidrocarbonada dos mesmos. De origem endógena, eles são formados por biossíntese no citoplasma das células e são utilizados, sob a forma de acilcoA, para a síntese dos triglicerídeos no tecido adiposo e no fígado, notadamente.

[007] No plasma, são encontrados principalmente quatro ácidos graxos que representam 85 % dos AGNE: ácido oleico, palmítico, linoleico e esteárico. A maioria dos AGNE é ligada à albumina. Eles provêm dos triglicerídeos do tecido adiposo hidrolisados no decorrer do jejum sob a ação da lipoproteína lipase dos tecidos orgânicos e sanguínea em glicerol e ácidos graxos. A concentração dos mesmos varia em grandes proporções em função da idade, da ingestão de refeições e do exercício físico. Geralmente, em período pós-prandial, a liberação dos mesmos é suprimida.

[008] Um esterol é um lipídeo que possui um núcleo de esterano do qual o carbono 3 é portador de um grupo hidroxila. Os esteróis são considerados como uma subclasse dos esteroides. O colesterol, um dos esteróis mais comuns e difundidos, é vital para o funcionamento celular e é um precursor de vitaminas e de hormônios esteroides lipossolúveis.

[009] Tipicamente, em sua acepção ampla, uma dislipidemia, ao nível celular, corresponde a uma concentração anormalmente elevada de lipídeos nas membranas biológicas, e notadamente a um acúmulo de ácidos graxos saturados (AGS) nas membranas biológicas. Fala-se também de dislipidemia celular. Tal acúmulo de AGS nas membranas biológicas leva à perturbação global da plasticidade membranar ao nível celular. Esses fenômenos são denominados lipo- intoxicações. As lipo-intoxicações instaladas são responsáveis por uma perturbação do conjunto dos mecanismos membranares (detectável em todas as etapas da via de secreção das proteínas). No homem, com exceção dos adipócitos (únicos capazes de sintetizar lipídeos neutros e estocar os mesmos), o conjunto dos tipos celulares é assim suscetível de ser concernido pela lipo-intoxicação.

[010] Até agora, somente ácidos graxos insaturados (AGI), em especial o ácido oleico (óleo de oliva), eram conhecidos para neutralizar os efeitos deletérios de uma intoxicação ligada ao acúmulo de AGS (Cunha e al., 2008; Diakogiannaki e al., 2008: Katsoulieris e al., 2009; Pineau e al., 2009; Stein e al., 1997; Wei e al., 2006; Degui e al., 2011). No entanto, a utilização dos mesmos como alimento funcional e/ou medicamento encontra dois limites maiores. Por um lado, os AGI apresentam essencialmente propriedades preventivas e têm, portanto, um interesse limitado no âmbito do tratamento das lipo-intoxicações instaladas, i.e. lipo-intoxicações responsáveis por uma perturbação do conjunto dos mecanismos membranares (detectável em todas as etapas da via de secreção das proteínas). De fato, os AGI agem entrando para isso em competição direta com os AGS, por ocasião da ingestão alimentar, na síntese dos fosfolipídios (PL) membranares. Por outro lado, a toxicidade dos AGI foi demonstrada nas células incapazes de transformer (“tamponar”) e depois estocar o excesso de ácidos graxos livres, notadamente de AGI, em lipídeos neutros, tipicamente em triglicerídeos (TG) e/ou esteróis esterificados. Esse é o caso por exemplo para uma cepa de levedura na qual, devido à ausência das quatro enzimas aciltransferases Lrolp, Dgalp, Ardp e Are2p, uma desregulação da síntese dos lipídeos neutros é observada. Por ocasião de uma exposição dessa cepa mutante a uma fonte de AGI exógenos, a desregulação lipídica se traduz por uma proliferação maciça das membranas intracelulares e depois pela morte das células, por um processo independente da UPR (Unfolded Protein Response; ver abaixo) (Kohlwein & Petschnigg, 2007; Petschnigg e al., 2011). De maneira interessante, fenômenos idênticos puderam ser observados em células de mamíferos (Listenberger e al., 2003). Isso explica porque ácidos graxos insaturados se tornam tóxicos para as células em condições de lipo-intoxicação previa dessa última, estado no qual a capacidade de estocagem dos ácidos graxos insaturados sob a forma de lipídeos neutros, pela célula, é ultrapassada (célula lipo- intoxicada qualificada de “metabolicamente inativa”), ou, alternativamente, em condições normais, para células que apresentam uma capacidade muito pequena de síntese de TG, tais como as células pancreáticas não beta (Cnop M. e al., 2001). No homem, com exceção dos adipócitos (únicos capazes de sintetizar lipídeos neutros e de estocar os mesmos), o conjunto dos tipos celulares é assim suscetível de ser concernido pela lipo-intoxicação. É notadamente conhecido que as perturbações ligadas ao acúmulo de AGS levam à apoptose das células p-pancreáticas responsáveis pela síntese de insulina (Butler e al., 2003) ou àquela dos hepatócitos (Egnatchik e al., 2014).

[011] Assim como evocado precedentemente, nenhuma estratégia terapêutica atual visa restaurar, na base, a funcionalidade das células e órgãos lipo-intoxicados e não é capaz de intervir ao nível de etapas precoces na cascata de efeitos deletérios encontrados nas patologias pulmonares que provocam notadamente uma insuficiência respiratória, tipicamente a montante de cada uma das etapas que são alvos dos tratamentos existentes. Além disso, os trabalhos dos inventores indicam que a não consideração do contexto de lipo-intoxicação, no âmbito das patologias pulmonares notadamente, e da mucoviscidose em especial, poderia ser responsável por uma trava tecnológica e explicar a ausência de tratamento curativo, até agora.

[012] Os inventores descrevem agora moléculas ou compostos, e composições que compreendem tais moléculas ou compostos, que permitem prevenir a sobrevinda de uma lipo-intoxicação dentro das membranas biológicas, tipicamente o acúmulo celular de ácidos graxos, em especial de ácidos graxos saturados, ou tratar uma lipo-intoxicação instalada agindo-se para isso sobre o fenômeno comumente alterado no conjunto dos tecidos lipo-intoxicados: a plasticidade membranar.

Objetivos da invenção

[013] A presente invenção tem como objetivo corrigir inconvenientes da arte anterior, expostos notadamente acima.

[014] Em especial, a invenção tem como objetivo, de acordo com pelo menos um modo de realização, prevenir e/ou tratar em um indivíduo uma lipo-intoxicação por hipóxia. A invenção tem assim em especial como objetivo prevenir e/ou tratar, em um indivíduo, uma lipo-intoxicação por hipóxia ligada à presença em excesso nas membranas biológicas de células não adipocitárias, de ácidos graxos saturados e/ou de esteróis.

[015] Outro objetivo da invenção, de acordo com pelo menos um modo de realização, é prevenir e/ou tratar em um indivíduo uma patologia pulmonar, especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais especialmente uma patologia pulmonar que é a mucoviscidose ou uma broncopneumopatia crônica obstrutiva. A invenção tem assim em especial como objetivo prevenir e/ou tratar a mucoviscidose. A invenção tem também em especial como objetivo prevenir e/ou tratar as broncopneumopatias crônicas obstrutivas.

[016] Outro objetivo da invenção, de acordo com pelo menos um modo de realização, é limitar, e mesmo prevenir, as disfunções ou a apoptose das células não adipocitárias lipo-intoxicadas por hipóxia, associadas notadamente pela diminuição ou supressão da fluidez de sua membrana plásmica e/ou da membrana de suas organelas.

[017] Outro objetivo da invenção, de acordo com pelo menos um modo de realização, é fornecer um composto suscetível de prevenir e/ou de tratar em um indivíduo uma lipo-intoxicação por hipóxia, ao mesmo tempo em que é não tóxico para as células incapazes de sintetizar lipídeos neutros, tipicamente triglicerídeos e/ou esteróis esterificados. A invenção tem notadamente como objetivo fornecer um composto suscetível de prevenir e/ou de tratar em um indivíduo uma lipo-intoxicação por hipóxia, sendo alternativo, e mesmo superior ao ácido oleico em suas propriedades, ao mesmo tempo em que é não tóxico. A invenção tem assim em especial como objetivo fornecer um composto suscetível de prevenir e/ou de tratar em um indivíduo uma lipo-intoxicação por hipóxia, ao mesmo tempo em que é não tóxico, para as células epiteliais brônquicas.

Sumário da invenção

[018] Esses objetivos, assim como outros que aparecerão mais claramente na sequência, são atingidos com o auxílio dos compostos, composições e utilizações correspondentes, de acordo com a presente invenção.

[019] A invenção se refere a uma nova classe de moléculas destinadas à prevenção e/ou ao tratamento das patologias associadas a uma lipo-intoxicação pelos ácidos graxos, tipicamente os ácidos graxos de cadeia longa saturada e/ou trans.Por ácido graxo de cadeias longas, são entendidos tipicamente os ácidos graxos dos quais a cadeia carbonada compreende pelo menos 14 átomos de carbono, tipicamente entre 14 e 24 átomos de carbono, por exemplo pelo menos 16 ou pelo menos 18 átomos de carbono, tipicamente entre 14 e 22 ou entre 14 e 18 átomos de carbono.

[020] A lipo-intoxicação pode se manifestar por uma inversão da relação AGS/ácidos graxos insaturados (AGI) nos fosfolipídios presentes dentro das membranas biológicas, os AGS se tornando majoritários, e mesmo substituindo completamente os AGI.

[021] As moléculas da invenção podem ser destinadas à prevenção e/ou ao tratamento de uma dislipidemia, do da síndrome metabólica, de uma síndrome ou de uma anomalia característica da síndrome metabólica, de preferência à prevenção e/ou ao tratamento do diabetes de tipo 2.

[022] As moléculas da invenção podem ser destinadas à prevenção e/ou ao tratamento de uma lipo-intoxicação de origem endógena (ou lipo-intoxicação “endógena”), especialmente uma lipo-intoxicação por hipóxia (ou lipo-intoxicação “hipóxica”). Por “hipóxia”, é entendida uma inadequação entre as necessidades dos tecidos orgânicos em oxigênio e os aportes, que provoca um estado de oxigenação insuficiente de certas células, certos tecidos e/ou órgãos. Em condição de normoxia, a proporção em O2 e em N2 é tipicamente de 95 % e 5 %. Assim, as moléculas da invenção podem ser destinadas à prevenção e/ou ao tratamento de uma patologia pulmonar, especialmente uma patologia pulmonar associada a uma insuficiência respiratória, mais especialmente a uma patologia pulmonar associada a uma insuficiência respiratória escolhida entre a mucoviscidose ou as BCPO.

[023] De fato, podem ser distinguidas as lipo-intoxicações de origem exógena (ou lipo-intoxicações “exógenas”). As lipo-intoxicações exógenas são induzidas por uma superexposição das células a uma fonte ambiental de AGS. As lipo-intoxicações endógenas são induzidas, no que lhes diz respeito, por uma desregulação do equilíbrio endógeno entre AGI e AGS. Essas lipo-intoxicações aparecem notadamente quando uma célula não é mais capaz de controlar, ou de regular, seu conteúdo em ácidos graxos, de maneira espacial ou temporal, em função das necessidades de balanço entre AGS e AGI, e das restrições de plasticidade membranar específica a um compartimento endomembranar considerado. Com 0 auxílio de um modelo celular levedura cultivado em condições que imitam a hipóxia, os inventores demonstraram que as leveduras acumulam AGS (por exemplo, por não conversão dos AGS endógenos em AGI) e que a lipo-intoxicação induzida provoca um certo número de refeitos deletérios, tais como um estresse do retículo endoplásmico, um desencadeamento da resposta UPR (unfolded protein response, em tradução livre, resposta a proteínas mal enoveladas), um defeito de vesiculação e um defeito de tráfego vesicular nas fases distais da via de secreção das proteínas.

[024] Os inventores partiram da constatação que os quadros clínicos dos pacientes atingidos por mucoviscidose ou por BPCO partilhavam um certo número de semelhanças. Entre esses pontos comuns figuram (1) uma exacerbação da inflamação nos tecidos pulmonares, (2) um embaraço das vias respiratórias ligado à alteração das propriedades de reologia do muco, (3) uma grande predisposição ao desencadeamento da apoptose e (4) uma hipertensão dos brônquios. Eles associaram a esses diferentes pontos a presença de uma lipo-intoxicação com AGS e, em relação à literatura, propuseram que essa característica possa constituir 0 elemento chave do qual proviria 0 conjunto dos sintomas. A fim de confirmar essa hipótese, e a fim de identificar uma possível solução terapêutica, os inventores conduziram então um certo número de pesquisas experimentais.

[025] Em um primeiro tempo, a lipo-intoxicação de tecidos bioquímicos recentemente dissociados, notadamente pelo ácido palmítico, foi colocada em evidência, por análise do conteúdo em ácidos graxos dos fosfolipídios purificados, a partir de biopsias brônquicas sadias ou provenientes de pacientes afetados por mucoviscidose ou por BPCO. Além disso, foi proposto que esse estado fosse correlacionado com as condições de insuficiência respiratória, e com a hipóxia, com base no modo de ação das dessaturases intracelulares, enzimas implicadas na conversão dos AGS endógenos em AGI e dependentes do oxigênio.

[026] Em um segundo tempo, essas conclusões foram validadas com o auxílio de um modelo in vitro que reconstitui artificialmente as lipo-intoxicações observadas nas biopsias dos pacientes. Esse modelo permitiu validar a implicação da insuficiência respiratória, e, a fortiori,da hipóxia, na introdução de formas de lipo- intoxicações por AGS nos epitélios brônquicos.

[027] Em um terceiro tempo, foi observado que a lipo-intoxicação das células epiteliais brônquicas por ácido palmítico desencadeia a via UPR e in fine a apoptose. Os inventores também demonstraram que os compostos e composições de acordo com a presente invenção inibem significativamente o desencadeamento da apoptose, e que esses compostos são consequentemente úteis para prevenir e/ou tratar as lipo-intoxicações, notadamente uma lipo-intoxicação por hipóxia. Nisso, esses compostos e composições de acordo com a invenção podem em especial ser vantajosamente utilizados para prevenir e/ou tratar uma patologia escolhida entre as patologias pulmonares, notadamente a mucoviscidose ou as broncopneumatias crônicas obstrutivas.

[028] De maneira anexa, os inventores demonstraram que os compostos e composições de acordo com a presente invenção exercem um efeito sobre os brônquios dos pacientes afetados pela mucoviscidose ou por BPCO. Nisso, os compostos e composições de acordo com a invenção podem em especial ser vantajosamente utilizados para prevenir e/ou tratar a hipertensão brônquica associada às patologias pulmonares, notadamente a mucoviscidose ou as broncopneumopatias crônicas obstrutivas.

[029] Uma vantagem considerável que as moléculas (ou compostos) da invenção apresentam, em relação aos AGI, em especial o ácido oleico, utilizados na arte anterior para compensar um excesso em AGS, é que contrariamente a esses últimos, elas não geram nenhuma toxicidade celular, em especial nenhuma toxicidade sobre as células incapazes de sintetizar lipídeos neutros, tipicamente as células não adipocitárias, por exemplo as células pancreáticas e as células epiteliais brônquicas.

[030] As moléculas da invenção apresentam uma outra vantagem maior pelo fato de que, contrariamente aos AGI utilizados de maneira preventiva na arte anterior, elas podem também ser utilizadas de maneira terapêutica em razão da aptidão das mesmas para restabelecer a funcionalidade celular, por exemplo agindo para isso sobre a plasticidade membranar. Elas podem assim vantajosamente ser utilizadas para tratar uma lipo-intoxicação instalada, quer dizer uma lipo-intoxicação responsável por uma disfunção celular detectável, tipicamente por uma alteração da capacidade e mesmo de uma incapacidade da célula para exercer suas funções de vesiculação membranar e de trafego vesicular, mecanismos fundamentais de comunicação intracelular entre compartimentos e indispensáveis à vida das células.

[031] Um objeto especial da invenção se refere assim a um composto que compreende uma cabeça polar, que compreende pelo menos um resíduo hidroxila, sobre a qual é enxertado um único ácido graxo insaturado que compreende entre 16 e 24, por exemplo entre 16 e 22 ou entre 16 e 20, átomos de carbono e que tem 1 a 6, por exemplo 3, insaturação(ões) em configuração cis para uma utilização para prevenir e/ou tratar, em um indivíduo, uma lipo-intoxicação por hipóxia.

[032] A dislipidemia - ou lipo-intoxicação - afeta tipicamente as membranas biológicas, inclusive as membranas biológicas de células não adipocitárias. No presente pedido, o termo “dislipidemia” em sua acepção ampla e o termo “lipo- intoxicação” são utilizados de maneira intercambiável. A dislipidemia - ou lipo- intoxicação - está geralmente ligada à presença em excesso nas ditas membranas biológicas de ácidos graxos e/ou esteróis. Os ácidos graxos são em especial ácidos graxos de cadeias longas saturadas. A quantidade de AGS e/ou de esteróis é em especial julgada excessiva quando por exemplo alterando-se a plasticidade membranar ela provoca uma disfunção celular.

[033] Outro objeto da invenção se refere a um composto do qual a cabeça polar tem a fórmula (I):

na qual: - A é um átomo de nitrogênio ou de oxigênio, de preferência um átomo de oxigênio, - n vale 2 ou 3, de preferência n vale 2, e - R é qualquer grupamento químico, para uma utilização para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação em um indivíduo, tipicamente uma lipo-intoxicação tal como definida acima.

[034] Em um modo de realização especial, os compostos de interesse utilizáveis no contexto da invenção são escolhidos por exemplo entre o 1 -oleoil-2-acetil-sn- glicerol, 1 -oleoil-sn-glicerol-3-fosfato, 2-araquidonoilglicerol, mono-oleato de manida, oleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil, N,N-dietanololeamida, propileno glicol mono-oleato, 1-oleoil glicerol, 2-oleoil glicerol, monoéster de ácido oleico com triglicerol, (Z)-9-Ácido Octadecenoico-(2,2-Dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil Éster, Dietileno glicol mono-oleato, e suas misturas; preferencialmente entre o 1 -oleoil-2- acetil-sn-glicerol (OAG), o 1 -oleoil-sn-glicerol-3-fosfato (ácido 1 -oleoila lisofosfatídico ou LPA), o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), o mono-oleato de manida, o oleato de 3- hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil, o N,N-dietanololeamida, o propileno glicol mono- oleato, o monoéster de ácido oleico com triglicerol e o (Z)-9-Ácido Octadecenoico- (2,2-Dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil Éster, e suas misturas.

[035] Em outro modo de realização especial, os compostos de interesse de acordo com a invenção são selecionados entre o mono-oleato de manida, o oleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil, o N,N-dietanololeamida, e suas misturas; alternativamente o N,N-dietanololeamida; alternativamente o mono-oleato de manida, o oleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil, e suas misturas.

[036] Em outro modo de realização especial, os compostos de interesse utilizáveis no contexto da invenção para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação são escolhidos entre o 1-oleoil glicerol, 2-oleoil glicerol, o propileno glicol mono-oleato e o monoéster de ácido oleico com triglicerol, e suas misturas; de preferência o propileno glicol mono-oleato e o monoéster de ácido oleico com triglicerol, e suas misturas.

[037] A invenção se refere por outro lado a um composto tal como descrito no presente texto para uma utilização para prevenir e/ou tratar em um indivíduo uma patologia pulmonar, especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais especialmente uma patologia pulmonar que é a mucoviscidose ou uma broncopneumopatia crônica obstrutiva.

[038] A invenção se refere por outro lado a uma composição, que se apresenta sob a forma de uma composição farmacêutica, de um alimento funcional ou de um suplemento alimentar, que compreende pelo menos um composto de acordo com a invenção. Um objeto especial se refere tipicamente a uma composição farmacêutica que compreende, além do dito pelo menos um composto de acordo com a invenção, pelo menos outro composto (diferente dos compostos de acordo com a invenção) ativo no plano terapêutico (e reconhecido como tal pelo profissional).

[039] A invenção também se refere à utilização de tal composição para prevenir e/ou tratar, em um indivíduo, uma lipo-intoxicação por hipóxia, tipicamente uma lipo- intoxicação por hipóxia nas membranas biológicas, inclusive nas membranas biológicas de células não adipocitárias, em especial uma lipo-intoxicação por hipóxia ligada à presença em excesso nas ditas membranas biológicas, de ácidos graxos, mais especialmente de ácidos graxos de cadeias longas saturadas e/ou trans,e/ou de esteróis. Ela também se refere à utilização de tal composição para prevenir e/ou tratar, em um indivíduo, uma patologia pulmonar, especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais especialmente uma patologia pulmonar que é a mucoviscidose ou uma broncopneumopatia crônica obstrutiva. As utilizações descritas podem também ser vantajosamente executadas em combinação com pelo menos outro composto ativo no plano terapêutico (reconhecido como tal pelo profissional e diferente dos compostos de acordo com a invenção) em especial no tratamento de patologias pulmonares, notadamente a mucoviscidose ou as BPCO.

Descrição detalhada

[040] Os inventores demonstraram que os AGS que provêm de uma fonte exógena (alimentação) ou endógena (hipóxia ou alteração, por mutação, das etapas de dessaturação dos ácidos graxos) se acumulavam dentro dos fosfolipídios que constituem as membranas celulares, perturbando assim numerosos processos, alterando assim a funcionalidade das organelas intracelulares que intervêm na via de secreção das proteínas (cf. Figura 1).

[041] Para trazer essa demonstração, os inventores desenvolveram um modelo unicelular simples (cepa hem1A elaborada a partir da levedura de padaria Saccharomyces cerevisiae) que reproduz o conjunto dos impactos dos AGS e do colesterol observados nas células de mamíferos, em especial o conjunto das anomalias implicadas no desenvolvimento da síndrome metabólica (Pineau e al., 2008 e Pineau e al., 2009).

[042] Em meio YPG (i.e. meio que não contém nem Ergosterol (Erg) nem ácido oleico (Ole)), a cepa hem1A acumula ácidos graxos saturados (notadamente o ácido palmítico, C16:0) em seus fosfolipídios, em especial na fosfatidilcolina (PC). Deve ser notado que o Ergosterol é o esterol majoritariamente presente nas leveduras e constitui, portanto, nas leveduras, o equivalente do colesterol para o homem.

[043] A cepa QM (Petschnigg e al., 2009), na qual os genes que codificam para as enzimas responsáveis pela síntese dos triglicerídeos e de ésteres de esteróis foram deletados, é no que lhe diz respeito incapaz de transformar um aporte exógeno de ácidos graxos livres, tipo ácido oleico C18:1, em lipídeos neutros, de modo que esse aporte provoca um estresse deletério devido à perturbação do equilíbrio da plasticidade membranar que ele gera. A utilização da cepa QM em especial permitiu que os inventores realizassem testes de toxicidade que permitiram demonstrar claramente a toxicidade do ácido oleico em tais circunstâncias (cf. figura 4).

[044] Mais precisamente, os inventores observaram nas cepas hem1A os efeitos negativos do acúmulo de fosfolipídios que levam cadeias saturadas (PL saturados) nas membranas das organelas intracelulares, sobre a formação das vesículas de secreção. Essa lipo-intoxicação (endógena pois o sistema celular das cepas hem1A só sintetiza AGS) perturba o ambiente lipídico da membrana do retículo endoplásmico (RE), altera o processo de dobramento (“misfolding”) das proteínas e desencadeia então uma resposta complexa no dito RE, resposta conhecida sob o nome de “Unfolded Protein Response” (UPR). Uma saturação desse sistema de salvaguarda provoca a morte celular por apoptose. Paralelamente, os inventores puderam observar perturbações da vesiculação do aparelho de Golgi assim como uma alteração do tráfego de proteínas de referência (ex: Fur4p) entre o aparelho de Golgi e a membrana plásmica. Concretamente, os inventores observaram uma alteração, devida à lipo-intoxicação, do conjunto da via de secreção. Em outros termos, a cepa hem1A de levedura permitiu que eles confirmassem ao mesmo tempo os impactos dos AGS sobre o estresse do RE e também sobre o tráfego das proteínas da direção da membrana plásmica.

[045] O retículo endoplásmico (RE) está implicado em vários processos celulares fundamentais, que incluem a síntese lipídica, a regulação da homeostasia cálcica e a síntese das proteínas destinadas aos diferentes organitos e à superfície celular (por exemplo as proteínas membranares tais como os canais iônicos e os transportadores). O RE é também o sítio onde as proteínas membranares ou secretadas são reunidas e dobradas. Consequentemente, a UPR desempenha um papel essencial na manutenção da integridade e da funcionalidade do RE, permitindo para isso que esse organito gerencie o acúmulo de proteínas mal dobradas (Kincaid &Cooper, 2007; Zhang &Kaufman, 2006). Deve ser notado que a toxicidade dos AGS está associada, nas células 3-pancreáticas (responsáveis pela síntese de insulina nos mamíferos) à indução da resposta UPR (Cunha e al., 2008; Diakogiannaki & Morgan, 2008; Laybutt e al., 2007). Alkhateeb e al., (2007) e Kato e al., (2008) observaram, por outro lado, que o acúmulo de AGS altera o endereçamento do receptor na insulina e do transportador da glicose Glu4 na superfície das células musculares.

[046] Schneider e al., (1999) observaram que a membranas do retículo endoplásmico (RE) e do aparelho de Golgi são constituídas muito majoritariamente por fosfolipídios (PL) insaturados, enquanto que a taxa de PL saturados aumenta gradualmente nos compartimentos mais distais na via de secreção para atingir seu máximo na membrana plásmica. Taxas importantes de PL insaturados se traduzem por uma fluidez membranar elevada, um parâmetro crucial para o recrutamento de certas proteínas essenciais para a formação das vesículas. Um exemplo canônico é fornecido pelas proteínas da família das Arf-GAP1, uma entre elas sendo Gcs1 p na levedura. Foi mostrado que Gcs1 p é um mediador do transporte vesicular ao mesmo tempo entre o aparelho de Golgi e o RE, e entre o RE e a membrana plásmica (Robinson e al., 2006). De modo interessante, a deleção do gene GCS1 provoca uma fragmentação do aparelho de Golgi e uma perturbação do tráfego vesicular pós- Golgiano (Poon e al., 2001), outro tanto de fenômenos que os inventores puderam eles próprios constatar no modelo de levedura hem1A, i.e. em condições de acúmulo de AGS (cf. Payet e al., 2013).

[047] As proteínas da família Arf-GAP1 respondem à curvatura membranar se adsorvendo para isso na superfície membranar via um motivo específico chamado Arf-GAP1 Lipid Packing Sensor (ALPS; (Bigay e al., 2005)). Concretamente, o motivo ALPS não reconhece a curvatura membranar per se, quer dizer uma geometria curva, mas reconhece um pequeno empilhamento das cabeças polares dos fosfolipídios (“Loose Lipid Packing”) que é uma consequência da curvatura membranar (Bigay e al., 2005). Os inventores conseguiram demonstrar que as taxas elevadas de PL saturados em condições de lipo-intoxicação estão associadas a um aumento do Lipid Packing membranar (Deguil e al., 2011), e que esse aumento altera o recrutamento pelo aparelho de Golgi do Gcslp em proveniência do citoplasma (Payet e al., 2013). Mais geralmente, eles demonstraram que o acúmulo de ácidos graxos, em especial de AGS, nas membranas biológicas provocava a desregulação funcional das organelas ou organitos intracelulares entre os quais o aparelho de Golgi e o Retículo Endoplásmico (RE), e em especial uma diminuição da taxa de vesiculação responsável por uma diminuição da translocação de certos transportadores e receptores membranares na superfície celular.

[048] As lipo-intoxicações celulares provocadas pelos inventores resultam, In vitro,de uma exposição a uma fonte exógena de ácidos graxos exclusivamente sob a forma saturada (lipo-intoxicação “exógena”) ou, alternativamente, de uma incapacidade intrínseca da célula para produzir formas insaturadas dos ácidos graxos (lipo-intoxicação “endógena”).

[049] Com o auxílio de seu modelo de levedura hem1A, os inventores mostraram que o ácido oleico (Ole), sendo para isso metabolizado nos fosfolipídios (PL) (cf. figura 1 - perda de PL em AGS em favor de PL em AGI), permite restaurar a plasticidade de membranas previamente lipo-intoxicadas por AGS. Eles também demonstraram com o auxílio da levedura QM que o efeito benéfico observado se limitava às células que têm a capacidade de tamponar um excesso de AGI exógenos sob a forma de lipídeos neutros. Nas células que não têm essa capacidade, o excesso de ácido oleico exógeno provoca, in fine, uma proliferação anormal das membranas intracelulares que, estressando para isso as células, vai desencadear a apoptose das mesmas.

[050] Os inventores utilizaram seu modelo de levedura hem1A e a cepa QM para ter como alvo moléculas de interesse suscetíveis de impedir ou de limitar esse fenômeno, idealmente de neutralizar o efeito tóxico dos ácidos graxos saturados presentes em excesso e/ou mal metabolizados (i.e. esterificados) e de corrigir o conjunto dos fenômenos perturbados. Eles descobriram também moléculas capazes, em especial, de restaurar uma funcionalidade celular (restaurando para isso por exemplo a fluidez membranar) comparável àquela encontrada em condições não patológicas.

[051] A eficácia das moléculas pré-selecionadas pelos inventores, i.e. a capacidade das mesmas para restaurar uma funcionalidade celular comparável àquela encontrada em condições não patológicas, mesmo no caso de dislipidemias instaladas, foi em seguida testada e demonstrada por esses mesmos inventores em células 3-pancreáticas de mamíferos, em especial em células 3-pancreáticas de rato (linhagem BRIN-BD11).

[052] A invenção tem assim como objeto um composto que compreende uma cabeça polar, que compreende pelo menos um resíduo hidroxila, sobre a qual é enxertado um único ácido graxo insaturado que compreende entre 16 e 24, por exemplo entre 16 e 20, tipicamente 18, átomos de carbono e que tem 1 a 6, por exemplo 3, insaturação(ões) em configuração cis (identificado no presente texto como “composto de interesse”) para uma utilização para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação em um indivíduo.

[053] O indivíduo em questão é um animal, tipicamente um mamífero, por exemplo, um mamífero escolhido entre um camundongo, um rato, um porco e um ser humano. O indivíduo em questão é de preferência um ser humano.

[054] No contexto da presente descrição, a dislipidemia - ou lipo-intoxicação - da qual a prevenção e/ou o tratamento é procurado afeta tipicamente as membranas biológicas, em especial as membranas biológicas de células não adipocitárias. Ela está geralmente ligada à presença em excesso nas ditas membranas biológicas, de ácidos graxos, mais especialmente de ácidos graxos de cadeias longas saturadas e/ou trans,e/ou de esteróis. A dislipidemia - ou lipo-intoxicação - é tipicamente responsável pela intoxicação das células não adipocitárias na origem da disfunção ou da apoptose das ditas células por diminuição e mesmo supressão da fluidez da membrana plásmica das mesmas e/ou da membrana de suas organelas.

[055] Em um modo de realização especial da invenção, a lipo-intoxicação é associada à presença no indivíduo de uma patologia pulmonar, especialmente de uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória que é a mucoviscidose ou uma BPCO.

[056] Assim como se destaca da presente descrição, a expressão “presença em excesso” de ácidos graxos, em especial de AGS, e/ou de esteróis é sinônimo de “lipo-intoxicação” e designa a presença, em uma célula não adipocitárias, em especial de ácidos graxos saturados e/ou trans,e/ou de esteróis em uma quantidade suficiente para perturbar a via de secreção descrita mais acima e assim alterar o funcionamento celular (tipicamente a via de secreção das proteínas e consequentemente a função das dita proteínas), e mesmo, a um nível superior, alterar consequentemente o funcionamento do órgão correspondente. Na escala celular, uma lipo-intoxicação é diagnosticada tipicamente pela colocação em evidência de uma modificação do conteúdo em ácidos graxos dos PL das membranas biológicas (ao nível das espécies fosfolipídicas de fosfatidilcolina (PC) notadamente) e, em especial, pela depleção das formas de PL em AGI em proveito de PL em AGS. Na imagem do modo operatório descrito na parte experimental da presente descrição, tal assinatura lipidômica pode ser colocada em evidência depois da extração dos lipídeos celulares totais, da purificação de seus fosfolipídios e da análise desses últimos por espectrometria de massa (Deguil e al., 2011).

[057] Por outro lado, essa lipo-intoxicação celular pode se manifestar pela indução da resposta UPR (“Unfolded Protein Response”). Assim como o demonstra a parte experimental, é possível, in vitro,detectar e medir essa resposta UPR pela análise da expressão de um gene repórter (tal como o gene lacZque codifica para a β-galactosidase da qual a atividade enzimática pode ser quantificada) que contém em sua sequência promotora um ou vários, por exemplo 4, elemento(s) de resposta à UPR (“UPRE”) específico(s) de um gene caracteristicamente induzido por ocasião do desencadeamento da dita resposta, por exemplo de um gene escolhido entre CHOP, BiP, GRP78 e ATF4 (Laybutt e al., 2007). Alternativamente, o desencadeamento da UPR em resposta a uma lipo-intoxicação pode ser detectado e medido quantificando-se para a proporção de formas ativas de certas proteínas chaves nessa cascata de eventos celulares. Esse é o caso da proteína elF2a da qual a abundância da forma ativa fosforilada é proporcional ao estado de ativação da UPR. Como explicado na parte experimental, a quantidade da forma ativa fosforilada pode ser avaliada por densitometria das imagens obtidas depois de western blot (Dhayal and Morgan, 2011).

[058] No contexto da presente invenção, a resposta UPR pode ser vantajosamente detectada ou medida por detecção ou medição da expressão de um gene ou da atividade de uma proteína implicado(a) na resposta “UPR”, como explicado abaixo.

[059] Um composto de interesse especial é um composto tal como definido precedentemente do qual a cabeça polar tem a fórmula (I):

na qual: A é tipicamente um átomo de oxigênio ou um grupo NRi, com Ri = H ou um alquila com Ci-C6 eventualmente substituído por um OH, e A é de preferência um átomo de oxigênio ou NH ou NCH3 ou NCH2CH2OH, e de maneira ainda mais preferida A é um átomo de oxigênio, n = 2 ou 3, de preferência n = 2, e R é qualquer grupamento químico e pode ser diferente de um grupamento (CHR) para 0 outro.

[060] Na fórmula (I), a ligação interrompida por ziguezagues representa a ligação entre a cabeça polar e a cadeia carbonada do ácido graxo insaturado, o grupamento C=O da fórmula (I) sendo o C=O do ácido graxo insaturado.

[061] De preferência, R é um grupamento que compreende unicamente átomos de carbono, de hidrogênio e de oxigênio.

[062] De preferência, R é um grupamento saturado que compreende unicamente átomos de carbono, de hidrogênio e de oxigênio.

[063] De preferência, o radical (CHR)n-OH é um derivado do glicerol, do eritritol ou de um monossacarídeo tal como a manose.

[064] Na presente invenção, cada resíduo hidroxila pode ser independentemente fosfatado.

[065] Exemplos de compostos de interesse utilizáveis no contexto da invenção para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação são identificados abaixo:

1 -oleoil-2-acetil-sn-gliceriI (OAG),

1-oleoil-sn-glicerol-3-fosfato (ácido 1 -oleoila lisofosfatídico ou LPA).

2-araquidonoilglicerol (2-AG),

mono-oleato de manida,

oOleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil,

N,N-dietanololeamida,

propileno glicol mono-oleato,

1-oleoil glicerol,

2-oleoil glicerol,

monoéster de ácido oleico com triglicerol,

(Z)-9-Ácido Octadecenoico-(2,2-Dimetil-1,3-dioxolan-4-il)metil Éster

Dietileno glicol mono-oleato.

[066] Compostos de interesse utilizáveis no contexto da invenção para prevenir ou tratar uma dislipidemia são escolhidos por exemplo entre o 1 -oleoil-2-acetil-sn- glicerol (OAG), o 1 -oleoil-sn-glicerol-3-fosfato (ácido 1 -oleoila lisofosfatídico ou LPA), o 2-araquidonoilglicerol (2-AG), o mono-oleato de manida, o oleato de 3-hidróxi-2,2- bis(hidroximetil)propil, o N,N-dietanololeamida, o propileno glicol mono-oleato, o monoésterde ácido oleico com triglicerol e o (Z)-9-Ácido Octadecenoico-(2,2-Dimetil- 1,3-dioxolan-4-il)metil Éster, e suas misturas.

[067] De maneira preferida, os compostos de interesse utilizáveis no contexto da invenção para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação são escolhidos entre o mono- oleato de manida, o oleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil e o N,N- dietanololeamida; alternativamente o N,N-dietanololeamida; alternativamente o mono-oleato de manida, o oleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil, e suas misturas.

[068] Um composto de interesse especialmente preferido para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação é o mono-oleato de manida.

[069] De maneira alternativa, os compostos de interesse utilizáveis no contexto da invenção para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação são escolhidos entre o 1- oleoil glicerol, 2-oleoil glicerol, o propileno glicol mono-oleato e o monoésterde ácido oleico com triglicerol; de preferência o propileno glicol mono-oleato e o monoéster de ácido oleico com triglicerol.

[070] Os compostos de interesse são utilizados no contexto da invenção para prevenir e/ou tratar as lipo-intoxicações tais como a lipo-intoxicação hipóxica, tipicamente restaurando para isso a fluidez das membranas biológicas. Uma característica vantajosa desses compostos é que, diferentemente dos AGI utilizados na arte anterior, eles são não tóxicos para as células incapazes de sintetizar lipídeos neutros, tipicamente triglicerídeos e/ou esteróis esterificados. Esses compostos são em especial não tóxicos para as células pancreáticas (células 3-pancreáticas e células oc-pancreáticas). Eles são também de preferência não tóxicos para as células epiteliais brônquicas. Eles são por outro lado de preferência vantajosamente capazes de restaurar a funcionalidade de uma célula lipo-intoxicada assim como, se for o caso, aquela dos órgãos implicados, tais como as vias respiratórias, e notadamente os brônquios.

[071] Um composto de interesse típico da invenção apresenta vantajosamente as propriedades seguintes: - ele restaura o crescimento de um mutante hem1Δde levedura Saccharomyces cerevisiae lipo-intoxicado, - ele reduz ou suprime a resposta UPR (“Unfolded Protein Response”), - ele não é tóxico para um mutante QM de levedura Saccharomyces cerevisiae, e/ou - ele reduz ou suprime a morte celular por apoptose de uma célula de mamífero lipo- intoxicada.

[072] Compostos especiais utilizados no contexto da invenção são capazes de restaurar o crescimento de um mutante hem1A de levedura Saccharomyces cerevisiaelipo-intoxicado e/ou de reduzir ou suprimir a resposta UPR (“Unfolded Protein Response”), tipicamente a resposta UPR induzida por uma lipo-intoxicação (que essa última seja de natureza endógena ou exógena).

[073] Compostos especiais utilizados no contexto da invenção são não tóxicos para as leveduras de cepa QM.

[074] Compostos especiais utilizados no contexto da invenção são capazes de reduzir ou suprimir a morte celular por apoptose de células de mamífero lipo- intoxicadas.

[075] Em um modo de realização preferido da invenção, os compostos de interesse são utilizados para prevenir e/ou tratar uma patologia pulmonar, especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória que é a mucoviscidose ou uma BPCO.

[076] Em um modo de realização preferido, pelo menos um composto de interesse tal como descrito no presente texto é utilizado para prevenir e/ou tratar a mucoviscidose ou uma BPCO. O mono-oleato de manida é um exemplo de composto de interesse utilizado de maneira preferida para prevenir e/ou tratar a mucoviscidose ou uma BPCO.

[077] Esse pelo menos um composto de interesse pode ser utilizado, em um modo de realização especial da invenção, em combinação com um composto distinto conhecido pelo profissional e utilizado classicamente na prevenção e/ou no tratamento da mucoviscidose ou uma BPCO, o dito composto distinto sendo escolhido de preferência entre os compostos mucolíticos, os antibióticos, os corretores da proteína CFTR.

[078] Outro objeto da invenção se refere por outro lado a uma composição que se apresenta sob a forma de uma composição farmacêutica, de um alimento funcional, de um suplemento ou de um complemento alimentar, que compreende pelo menos um composto de interesse de acordo com a invenção (identificada no presente texto como “composição de interesse”).

[079] Um objeto especial se refere tipicamente a uma composição farmacêutica que compreende além do dito pelo menos um composto de interesse de acordo com a invenção, pelo menos outro composto (diferente dos compostos de interesse utilizados no contexto da invenção para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação por hipóxia sem induzir toxicidade sobre as células na adipocitárias) ativo no plano terapêutico (e reconhecido como tal pelo profissional), em especial um composto ativo na prevenção ou no tratamento de um sintoma ou de uma anomalia característica de uma patologia pulmonar, associada notadamente a uma insuficiência respiratória.

[080] A invenção também se refere a uma composição tal como descrita no presente texto para uma utilização para prevenir e/ou tratar uma lipo-intoxicação por hipóxia, tipicamente uma patologia escolhida entre as patologias pulmonares, de preferência para prevenir e/ou tratar a mucoviscidose ou as BPCO.

[081] O termo “tratamento” designa o tratamento curativo, sintomático ou preventivo. Os compostos da presente invenção podem assim ser utilizados nos indivíduos (como os mamíferos, em especial humanos) afetados por uma doença declarada. Os compostos da presente invenção podem também ser utilizados para retardar ou desacelerar a progressão ou prevenir uma progressão mais avançada da doença, melhorando assim a condição dos indivíduos. Os compostos da presente invenção podem finalmente ser administrados em “prevenção” aos indivíduos não doentes, mas que poderiam desenvolver normalmente a doença ou que têm um risco grande de desenvolver a doença.

[082] O ou os compostos de interesse ou composições de acordo com a invenção podem ser administrados de diferentes maneiras e sob diferentes formas.

[083] Assim, em um modo de realização típico, o ou os compostos de interesse são administrados ao indivíduo, juntos ou separadamente, e o ou os compostos de interesse ou composições de acordo com a invenção são administrados de maneira contínua ou sequencial, uma ou várias vezes por dia (administração quotidiana), uma ou várias vezes por semana (administração semanal), ou uma ou várias vezes por mês (administração mensal), durante todo o tempo de duração do tratamento, i.e. até a melhora dos sintomas da patologia tratada, de preferência o desaparecimento da totalidade ou de parte dos ditos sintomas.

[084] Se for necessário, a dose diária pode por exemplo ser administrada em duas, três, quatro, cinco, seis ou mais ingestões por dia ou por subdoses múltiplas administradas por intervalos apropriados durante o dia.

[085] Esses compostos ou composições podem ser por exemplo administrados de maneira sistêmica, por via oral, parenteral, por inalação ou por injeção, como por exemplo por via intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, transdérmica, intra-arterial, etc. Tratando-se de um tratamento de longo prazo, a via de administração preferida será sublingual, oral, intraperitoneal ou transcutânea.

[086] As composições podem ser formuladas sob a forma de suspensões injetáveis, óleos, supositórios, gélulas, capsulas, aerossóis, etc., eventualmente por meio de formas galênicas ou de dispositivos que asseguram uma liberação prolongada e/ou retardada. Para as injeções, os compostos são geralmente condicionados sob a forma de suspensões líquidas, que podem ser injetadas por meio de seringas ou de perfusões, por exemplo.

[087] Fica entendido que a vazão e/ou a dose injetada podem ser adaptadas pelo profissional em função do paciente, da patologia, do modo de administração, etc. Em geral, a dose diária do composto será a dose mínima para obter o efeito terapêutico.

[088] A quantidade de composto presente na composição terapêutica pode ser modulada de modo a obter uma taxa circulante de princípio ativo necessária para a obtenção do efeito terapêutico desejado para um paciente especial, uma composição, um modo de administração, e isso de preferência sem toxicidade para o paciente. A quantidade escolhida dependerá de múltiplos fatores, em especial da via de administração, do tempo de duração de administração, do momento da administração, da velocidade de eliminação do composto, do ou dos diferentes produtos utilizados em combinação com o composto, da idade, do peso e da condição física do paciente, assim como de sua história médica, e de todas as outras informações conhecidas em medicina.

[089] Tipicamente, os compostos são administrados em doses que podem variar entre 1 pg e 2 g por administração, preferencialmente de 0,1 mg a 1 g por administração. Por outro lado, as composições de acordo com a invenção podem compreender, além disso, outros agentes ou princípios ativos como explicado precedentemente. As composições de acordo com a invenção podem também compreender um ou vários excipientes ou veículos, aceitáveis no plano farmacêutico. Podem ser citadas por exemplo soluções salinas, fisiológicas, isotônicas, tamponadas, etc., compatíveis com um uso farmacêutico e conhecidas pelo profissional. As composições podem conter um ou vários agentes ou veículos escolhidos entre os dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservadores, etc.

[090] A invenção também se refere aos métodos de prevenção ou de tratamento de uma lipo-intoxicação tal como a lipo-intoxicação hipóxica em um indivíduo que compreende a administração a um indivíduo que sofre de uma lipo-intoxicação tal como a lipo-intoxicação hipóxica ou suscetível de desenvolver uma lipo-intoxicação tal como a lipo-intoxicação hipóxica de um composto ou de uma composição de interesse tais como descritos no presente texto para prevenir e/ou tratar a dita lipo- intoxicação.

[091] Ela se refere por outro lado aos métodos de prevenção e/ou de tratamento em um sujeito afetado por uma patologia escolhida entre as patologias pulmonares, especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais especialmente uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória que é a mucoviscidose ou uma BPCO. Esses métodos compreendem todos eles uma etapa de administração a um sujeito que sofre de tal patologia ou que é suscetível de desenvolver tal patologia de um composto ou de uma composição de interesse tais como descritos no presente texto para prevenir e/ou tratar a dita patologia.

[092] As figuras e exemplos seguintes ilustram a invenção sem limitar o alcance da mesma.

Exposição das figuras

[093] As figuras seguintes são descritas:

[094] Figura 1: Via de secreção e plasticidade membranar

[095] Depois da síntese das mesmas, as proteínas membranares ou secretadas (“ferramentas” moleculares das células) devem ser submetidas a etapas de maturação no interior das células. Cada uma das etapas desse processo denominado “via de secreção” ocorre dentro de um compartimento subcelular específico (retículo endoplásmico (RE) e aparelho de Golgi notadamente). A obtenção de proteínas maduras necessita, portanto de um transporte intracelular funcional entre os diferentes sistemas endomembranares. Esse fluxo é influenciado, entre outras coisas, pela plasticidade das membranas dos compartimentos intracelulares que é, ela própria, diretamente correlacionada com a natureza dos fosfolipídios (PL) que compõem as membranas. Em especial é admitido que a presença de AGS nos PL diminui a fluidez membranar enquanto que PL que levam AGI formam membranas mais fluidas.

[096] O efeito benéfico do ácido oleico (Ole) é observado nas células que têm a capacidade de tamponar um excesso de AGI exógenos sob a forma de lipídeos neutros (triglicerídeos (TG) ou esteróis esterificados (SE) estocados sob a forma de gotículas lipídicas (GL)). Nas células que não têm essa capacidade, o excesso de ácido oleico exógeno provoca in fine uma proliferação das membranas intracelulares, que provocando assim um estresse celular vai desencadear a apoptose.

[097] Figura 2: As vias da UPR nos eucariotos superiores (Pineau &Ferreira, 2010)

[098] Figura 3: O ácido oleico, o OAG, e o LPA restauram o crescimento de leveduras lipo-intoxicadas

[099] Figura 3A - Estruturas do ácido oleico, do OAG e do LPA.

[100] Figura 3B - As leveduras hem1A foram cultivadas em condições de acúmulo de AGS, como indicado. Gotas de 5 pl de OAG, de LPA ou de ácido oleico, nas concentrações indicadas, foram em seguida colocadas na superfície do meio gelosado. A restauração de crescimento das leveduras hem1A é constatado pela formação de colônias, depois de 3 dias.

[101] Figuras 4: O OAG e o LPA não são tóxicos para células que não sintetizam triglicerídeos

[102] Gotas de 5 pl de OAG, de LPA ou de ácido oleico foram colocadas, a partir de soluções estoque nas concentrações indicadas, na superfície de um meio gelosado sobre o qual tinha sido previamente espalhada a cepa QM. Depois de três dias, halos de inibição de crescimento (ausência de colônias) podem ser observados no caso do ácido oleico. Esses halos não são, em contrapartida, observados em presença de LPA ou de OAG.

[103] Figuras 5: O OAG e o LPA reduzem a resposta UPR em leveduras lipo- intoxicadas

[104] Uma construção plasmídica que leva um gene de fusão, que corresponde à sequência que codifica do gene LacZcolocada sob dependência de um promotor artificial que contém 4 elementos UPR (UPRE), foi introduzida em uma cepa hem1A de leveduras, como descrito em Pineau e al., (2009). Por ocasião de uma indução da resposta UPR, o fator de transcrição Hac1p/XBP1p é ativado e se fixa nos elementos UPR do gene de fusão, provocando a transcrição do gene LacZ. LacZ codificando para a β-galactosidase, o nível de indução da UPR é, portanto, medido por detecção da atividade enzimática correspondente. A cepa hem1A de leveduras foi cultivada em um meio líquido que induz o acúmulo de AGS sem outra adição (0), ou no mesmo meio suplementado de 200 pM de ácido oleico, de OAG ou de LPA, como indicado. U. A.: unidades arbitrárias.

[105] Figuras 6: O OAG não restaura a produção de fosfolipídios di- insaturados, contrariamente ao ácido oleico e ao LPA, em leveduras lipo- intoxicadas

[106] As leveduras hem1A foram cultivadas em condições padrão (Controle) ou em condições de acúmulo de AGS, sem (0) ou com adição de ácido oleico, de LPA ou de OAG a 100 pM, como indicado.

[107] Figura 6A - Depois de 7 h de incubação, os fosfolipídios (PL) foram extraídos e as diferentes espécies de fosfatidilcolina (PC), que constitui o PL majoritário, foram analisadas por espectrometria de massa em modo positivo, de acordo com Pineau e al., (2008). A espécie 36 :2, que corresponde a uma PC que contém 2 cadeias de ácido oleico, é enquadrada. Como é possível ver, a adição de ácido oleico ou de LPA resulta em um aumento da taxa dessa espécie, o que não é o caso para o OAG.

[108] Figura 6B - O conjunto das espécies de PL detectáveis nessas condições de espectrometria de massa foi analisado para quantificar de maneira global o conteúdo em formas AGS. O índice de saturação assim obtido permitiu colocar em evidência que o OAG, contrariamente ao ácido oleico e ao LPA, não restaura um índice de saturação comparável àquele observado na condição Controle.

[109] Figuras 7: O OAG e o LPA previnem a apoptose das células β- pancreáticas na presença de ácidos graxos saturados, reduzindo para isso a taxa de indução da UPR

[110] Células 3-pancreáticas BRIN-BD11 foram cultivadas em condições de controle ou na presença de uma fonte exógena de ácidos graxos saturados (ácido palmítico, 200 pM), como descrito por Dhayal & Morgan (2011) a fim de gerar condições de lipo-intoxicação, com ou sem adição de OAG ou de LPA.

[111] Figura 7A - A proporção de células mortas foi estimada na ausência (Ctrl) ou na presença de ácido palmítico (Palm), para concentrações crescentes de OAG ou de LPA.

[112] Figura 7B - As taxas de fosforilação de elF2a foram também analisadas nas diferentes condições por western blot, na ausência (0) ou na presença de OAG ou de LPA, e normalizadas nas quantidades de elF2a totais. A taxa de fosforilação sendo correlacionada com a intensidade da resposta UPR, essa experiência demonstra que o OAG reduz a UPR induzida pelo acúmulo de palmitato. U. A.: unidades arbitrárias.

[113] Figuras 8: Os tecidos brônquicos de pacientes afetados por mucoviscidose ou por BPCO são lipo-intoxicados por AGS

[114] Figura 8A - Biopsias pulmonares foram dissociadas a fim de só conservar o componente brônquico (sequência da esquerda para a direita).

[115] Figura 8B - Os lipídeos totais das células epiteliais brônquicas foram extraídos, os fosfolipídios foram purificados e depois as diferentes espécies de fosfatidilcolina (PC), que constituem os PL majoritários, foram analisadas por espectrometria de massa em modo positivo, de acordo com Pineau e al., (2008). As espécies 32 :0 e 36 :2, correspondem a PC que contêm 2 cadeias de ácido palmítico e 2 cadeias de ácido oleico. Como é possível ver, a relação AGS/AGI se inverte quando PC de biopsias de controle são comparadas com PC de biopsias de pacientes afetados por mucoviscidose ou por BPCO.

[116] Figuras 9: Indução da lipo-intoxicação por AGS em linhagens celulares de epitélio brônquicas, 16HBE e CFBE

[117] Figura 9A - As linhagens de células epiteliais brônquicas humanas 16HBE e CFBE foram utilizadas para testar o conteúdo em ácidos graxos de seus fosfolipídios, em condições de cultura in vitro.Contrariamente ao perfil lipidômico observado para biopsias pulmonares de pacientes mucoviscidósicos ou afetados por BPCO (ver a Figura 7B), a relação AGS/AGI nas PC das linhagens 16HBE e CFBE indica uma ausência de lipo-intoxicação.

[118] Figura 9B - CFBE foram cultivadas durante 16 h com quantidades crescentes de ácido palmítico. A análise do perfil lipidômico das células em tais condições revela que aportes exógenos em AGS imitam as lipo-intoxicações observadas em pacientes afetados por mucoviscidose (100 pM Palm) ou por BPCO (250 pM Palm).

[119] Figuras 10: Condições de hipóxia induzem, in vitro,a lipo-intoxicação das linhagens celulares 16HBE e CFBE, reconstituindo artificialmente as lipo- intoxicações hipóxicas observadas nas biopsias de pacientes

[120] As 16HBE e as CFBE foram cultivadas durante 24 h em condições padrão (normoxia: 95 % 02 + 5 % CO2) ou em um ambiente anóxico (hipóxia: 95 % N2 + 5 % CO2). Depois de ter extraído os lipídeos totais e purificado os fosfolipídios, 0 conteúdo global em ácidos graxos foi analisado. As relações AGS/AGI foram calculadas a fim de determinar as taxas de saturação dos fosfolipídios em cada uma das condições. Os resultados indicam que a lipo-intoxicação pode ser induzida, in vitro,por uma hipóxia artificial.

[121] Figura 11: Os compostos anti-AGS contra a influência pró-apoptótica da lipo-intoxicação nas células epiteliais brônquicas

[122] As CFBE foram cultivadas em condições padrão (Controle) ou foram submetidas a uma fonte de AGS exógenos (ácido palmítico 250 pM), durante 16 h, sem (0) ou com adição de 100 pM dos compostos de interesse, como indicado. As células foram então submetidas a uma lise e a apoptose foi quantificada, como indicado na parte Exemplos.

[123] Figuras 12: O mono-oleato de manida dissipa a hipertensão brônquica dos tecidos patológicos

[124] Figura 12A - Anéis brônquicos de pacientes sadios (Controle), afetados por mucoviscidose (muco) ou por broncopneumopatia crônica obstrutiva (BPCO) foram dissecados e depois o tônus de base dos mesmos foi medido. Os resultados indicam que as duas patologias respiratórias estão correlacionadas com uma hipertensão dos brônquios.

[125] Figura 12B - A mesma operação foi realizada depois de uma pré-incubação dos anéis durante 4 h a 37QC em uma solução fisiológica suplementada (+) ou não com 100 pM de mono-oleato de manida, como indicado.

[126] Para cada histograma uma relação N/n é exibida. N corresponde ao número de anéis testados e n ao número de pacientes analisados.

Exemplos

[127] A invenção será melhor compreendida com a leitura dos exemplos seguintes:

A/ Cepas de leveduras, linhagens de células de mamíferos e amostras biológicas

[128] As cepas de leveduras Saccharomyces cerevisiae listadas na tabela 1 são utilizadas para os diferentes testes de restauração de crescimento, para a colocação em evidência das toxicidades, para a análise do conteúdo em ácidos graxos dos fosfolipídios celulares assim como para os testes de desencadeamento da “unfolded protein response” (UPR).

[129] O estado de ativação da UPR e a indução da morte celular por lipo- intoxicação foram também analisados nas linhagens 3-pancreáticas de rato, BRIN- BD11.

[130] Por outro lado, a indução da apoptose, a secreção de II-8 e o perfil lipidômico, em resposta à lipo-intoxicação com AGS, também foram analisados em linhagens de células epiteliais brônquicas humanas 16HBE (homozigoto selvagem para o gene CFTR) e/ou CFBE (homozigoto F508del-CFTF?).

[131] Além disso, experiências in vivo, em biopsias de pacientes sadios, afetados por mucoviscidose ou por BPCO foram realizadas a fim de determinar os perfis lipidômicos correspondentes, assim como a influência dos compostos de interesse sobre o fenômeno de hipertensão pulmonar. As utilizações das biopsias respeitam uma carta ética definida pelo Comitê de Proteção das Pessoas (CPP) Oeste III. Tabela 1: cepas de leveduras utilizadas

B/ Lipo-intoxicações das leveduras hem1Δ

[132] A cepa que leva a mutação hem 1Δ é cultivada, em condições aeróbias, sob agitação e a 28QC, em um meio líquido YPGA (YPG (extrato de levedura 1 % (m/v), peptona 1 % (m/v) e glicose 2 % (m/v)) suplementado com ácido ô-aminolevulínico (ALA) a 80 pg/mL). A lipo-intoxicação por ácidos graxos saturados (AGS) é provocada por depleção em ácidos graxos insaturados (AGI) - cuja síntese é dependente da presença de heme (grupamento prostético da enzima O1e1p notadamente) - por transferência em meio YPG’ (YPG suplementado de ergosterol a 80 pg/mL para compensar a depleção em esterol obtida nessa condição). A lipo- intoxicação pode ser induzida em meio sólido YPG+ + ágar 2 % (m/v) transferindo- se 3500 células (hem1Δprovenientes de uma pré-cultura em YPGA)/cm2 ou, alternativamente, em meio líquido inoculando-se 2.106 células/mL de YPG+. Classicamente, os efeitos da lipo-intoxicação com AGS são analisados 7 h depois da transferência em meio YPG+. A capacidade de um composto para neutralizar os efeitos deletérios de uma lipo-intoxicação com AGS é, no que lhe diz respeito, avaliada sucessivamente na adição desse composto sobre (ou dentro) o meio de transferência YPG+, depois de semeadura com as células.

C/ Lipo-intoxicação das células p-pancreáticas de rato por ácido palmítico

[133] Preparação dos reagentes lipídicos:

[134] As espécies lipídicas são preparadas em etanol antes de ser submetidas a uma complexação com albumina de soro bovino (BSA, inicialmente desprovida de ácidos graxos) por uma incubação de 1 hora a 37QC. O estoque de Palmitac é obtido por adição de um volume de etanol antes que o conjunto seja aquecido a 70QC para homogeneização. As soluções de OAG e de LPA são preparadas em etanol 100 % em temperatura ambiente. Para as incubações de células de mamíferos, as concentrações finais de BSA e de etanol no meio de cultura são respectivamente mantidas a 1 e 0,5 % (m/v).

[135] Testes de viabilidade celular:

[136] A linhagem de células 3-pancreáticas (BRIN-BD11) de rato é cultivada em meio RPMI-1640 completo, que contém glicose a 11 mM e que é suplementado a 10 % (v/v) com soro de vitelo fetal (SVF), 2 mM de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100 pg/mL de estreptomicina. Para cada experiência, as células são inicialmente semeadas a uma densidade de 0,5x105 células/mL em placas de 6 poços durante 24 horas. Na sequência, o meio completo é substituído por um equivalente desprovido de SVF mas que contém os reagentes lipídicos de interesse, nas concentrações desejadas, submetidos a uma complexação com BSA. No caso das condições de controles, quantidades idênticas de BSA e de etanol são nesse caso utilizadas. No fim das incubações, o conjunto das células (mortas e vivas) é coletado e centrifugado a 300 g durante 5 min. O resíduo celular é em seguida recolocado em suspensão em 200 pL de meio e depois o DNA das células mortas (que perderam a integridade de sua membrana plásmica) é marcado com iodeto de propídio (IP) adicionando-se 200 pL de uma solução de IP a 20 pg/mL em tampão FACS (phosphate-buffered saline - tampão fosfato-salino- (PBS), 2 % (v/v) SVF, azotureto de sódio 10 mM). Depois de uma incubação de 10 min. sobre gelo, as amostras assim obtidas são analisadas por citometria em fluxo. Um Beckman Coulter EPICS XL MCL é utilizado para a quantificação, urn canal FL3 serve para a detecção das emissões do IP intercalado no DNA e a análise é realizada com o auxílio do software EXPO32 ADC (Applied Cytometry Systems, V 1.1 build 207).

[137] Western blotting:

[138] As células BRIN-BD11 são semeadas a uma densidade de 0,5x105 células/mL em frascos T25 durante 24 horas. Como indicado precedentemente, o meio completo é então substituído por um equivalente desprovido de SVF mas que contém os reagentes lipídicos de interesse. Depois de 6 horas de incubação, a extração das proteínas totais é realizada com o auxílio de um tampão de lise (Tris 20 mM, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM e Triton-X 1 % (v/v)) que contém inibidores de protease e de fosfatases. Essas proteínas são então submetidas a uma eletroforese em gel de acrilamida 12 % NuPAGE® Novex® Bis-Tris Gels (Invitrogen) antes de ser transferidas para membrana de PVDF e depois sondadas com o auxílio de anticorpos anti-phosphoelF2 (Cell Signaling (New England Biolabs)) diluídos a 1/1000Q. Em um segundo tempo, as membranas são decapadas com o tampão Re-Blot Plus-Strong (Milipore) antes de ser sondadas uma segunda vez com anticorpos anti-elF2α total (Cell Signaling (New England Biolabs)) diluídos a 1/10002. A análise por densitometria da abundância relativa das formas fosforiladas ou não fosforiladas da proteína elF2α é efetuada com o sistema Fluor-S Multi-imager analysis system combinado com o software Quantify One (Biorad UK Ltd.).

D/ Restauração de crescimento

[139] Triagem de compostos: Depois da indução de uma lipo-intoxicação com AGS (para hem1Δcultivadas em um meio sólido) gotas de 5 pL de soluções de diferentes compostos a 10 mM em dimetilsulfóxido (DMSO) ou em etanol (EtOH) são colocados na superfície do ágar. A capacidade de um composto para neutralizar a paralisação de crescimento celular lipo-induzido é estimada pelo aparecimento de um halo de colônias de hem1A no lugar da colocação do dito composto depois de 3 dias de cultura a 28QC (cf. Deguil e al., 2011).

[140] Cinética de proliferação: Conjuntamente à indução de uma lipo- intoxicação com AGS (para hem1A em meio líquido) diferentes compostos são acrescentados às culturas a uma concentração inicial de 200 pM. O acompanhamento de proliferação é realizado medindo-se a densidade celular por espectrometria, em intervalos de tempo regulares (a cada hora no tempo de duração da observação). A um comprimento de onda de 600 nm, uma unidade de densidade óptica (DOeoonm) corresponde a 2.107 células/mL.

E/ Teste de toxicidade

[141] Paralelamente, as cepas selvagens (WT) e QM são cultivadas, em condição aeróbia, sob agitação e a 28QC, em um meio líquido YPG antes de semear 3500 células por cm2 de YPG + ágar 2 % (m/v). Depois dessa transferência para meio sólido, gotas de 1 pL de soluções de diferentes compostos a 1, 10 e 100 mM em DMSO ou ETOH são colocadas na superfície do ágar. Separadamente, depósitos de DMSO e de EtOH são também realizados a fim de avaliar a toxicidade intrínseca desses dois solventes. Depois de 3 dias de cultura a 28]C, a toxicidade dos compostos testados é avaliada comparando-se para isso os diâmetros dos halos de inibição de crescimento obtidos para os depósitos de solventes brutos com aqueles dos depósitos das diferentes concentrações de compostos testados. Contrariamente à cepa WT, a cepa QM é incapaz de tamponar um excesso de ácido oleico exógeno sob a forma de lipídeos neutros (triglicerídeos (TG) ou ésteres de esteróis (ES)) em gotículas lipídicas. Assim, no caso de uma ausência de toxicidade em relação à cepa WT, a observação de uma toxicidade de um composto em relação à cepa QM indica que esse composto é percebido como uma fonte de ácido graxo livre pelas leveduras.

F/ Extração de lipídeos totais

[142] A cepa hem1Δé cultivada em meio líquido YPGA, YPG+ ou YPG+ + 200 pM de composto a testar, em aeróbia, sob agitação e a 28QC durante 7 h, a partir de uma concentração celular inicial de 2.106 células/mL. No final da cultura, 108 células são coletadas a fim de realizar a extração dos lipídeos totais. Depois de ter colocado as células em suspensão em 1 ml_ de água destilada a 4QC, 500 pL de esferas de vidro (0 0,6 mm) são acrescentados e o conjunto é submetido então a 3 sequências de 20 seg. a 5000 rpm em um agitador (os tubos são mantidos sobre gelo entre cada uma das 3 sequências). O lisado celular então obtido, completado com água de enxague das esferas (1 ml_), é em seguida transferido para um tubo feito de vidro de 40 ml_ (Corex™) antes de realizar a extração dos lipídeos utilizando para isso uma relação metanol:clorofórmio 2:1 (v/v). inicialmente, 6 ml_ de metanol são acrescentados e o conjunto é submetido a um vórtice durante 30 seg. e depois incubado durante 15 min. a 65QC. Uma vez que a mistura resfriou até a temperature ambiente, 3 ml_ de clorofórmio são acrescentados e depois o conjunto é de novo submetido a um vórtice durante 30 segundos antes de deixar a extração se desenrolar durante 16 h. Ulteriormente, a amostra é centrifugada durante 12 min. a 10000 g antes de transferir o sobrenadante para um novo tubo Corex™. Depois de adição de 2 ml_ de clorofórmio e depois de 4 ml_ de água destilada, o conjunto é submetido a um vórtice durante 30 seg e depois centrifugado durante 8 min. a 3000 g. Depois de eliminação da fase superior resultante, a fase orgânica inferior é coletada em um tubo de hemólise feito de vidro. Finalmente, o solvente é evaporado sob fluxo de nitrogênio a 80QC para obter as amostras de lipídeos celulares totais.

[143] No caso das biopsias de pacientes, depois de dissecação dos lobos pulmonares e extração dos brônquios, as células epiteliais brônquicas foram enxaguadas três vezes em PBS antes de proceder à preparação dos lipídeos totais como indicado precedentemente, a partir de 105 células.

G/ Purificação de fosfolipídios e análise por espectrometria de massa

[144] As amostras de lipídeos celulares totais são recolocadas em suspensão em 1 ml_ de diclorometano sendo para isso submetidas a um vórtice durante 30 segundos. O conjunto é colocado em uma coluna de sílica (BOND ELUT-SI, 100 mg 1 ml_) pré-condicionada com 3 ml_ de metanol e depois 2 ml_ de diclorometano sucessivamente. A fração retida pela coluna é em seguida lavada com 2 ml_ de diclorometano e depois 3 ml_ de acetona sucessivamente. Finalmente, 2 ml_ de uma mistura de clorofórmio/metanol/água 50:45:5 (v/v) são colocados na coluna e os fosfolipídios assim eluídos são coletados em um tubo de hemólise feito de vidro. O solvente é evaporado sob nitrogênio a 80QC para obter as amostras de fosfolipídios celulares.

[145] Uma vez recolocados em suspensão em 100 pL de mistura Mix’ (isopropanol/acetonitrila/água 2:1:1 (v/v/v) + trietilamina 1 % (v/v) ou de mistura Mix’ (isopropanol/acetonitrila/água 2:1:1 + ácido fórmico 1 % (v/v)), as amostras são analisadas por espectrometria de massa (Electrospray Ionization-Mass spectrometry (ESI-MS)), em modo negativo ou positivo respectivamente, e os resultados obtidos servem para analisar o conteúdo em ácido graxo das diferentes espécies de fosfolipídio.

[146] H/ Teste de desencadeamento da UPR

[147] A cepa hem1Atransformada pelo plasmídeo pPW344 [2p URA3 4xUPRE- LacZ (Patil e al., 2004)] é cultivada em meio líquido YPGA, YPG ou YPG + 200 pM de composto a testar, em condição aeróbia, sob agitação e a 28QC durante 7 h, a partir de uma concentração celular inicial de 2.106 células/mL. No final da cultura 108 células são coletadas a fim de quantificar a atividade beta-galactosidase (β-gal) resultante da expressão do transgene LacZ(no caso de uma ativação da UPR). Em um primeiro tempo, as células são recolocadas em suspensão em 1.5 mL de tampão Z (Na2HPO4 a 60 mM, NaH2PO4 a 40 mM, KOI a 10 mM, MgSO4 a 1 mM e β- mercaptoetanol a 50 mM; solução a pH 7) e depois 1/15Q dessa suspensão é utilizado para realizar uma medição de DOeoo nm. Em um segundo tempo, a suspensão é completada com 100 pL de sódio dodecil sulfato (SDS) 0,1 % (v/v) e 200 pL de clorofórmio e depois submetida a um vórtice em duas sequências de 30 seg sucessivas. Depois de decantação, 400 pL (volume V) da solução assim obtida são transferidos para um tubo de hemólise feito de vidro e depois completados com 600 pL de tampão Z. 200 pL de substrato orto-nitrofenil-β-galactosida (ONPG), a 4 mg/mL em tampão Z, são então acrescentados antes que o conjunto seja homogeneizado com vórtice e depois incubado no banho-maria a 309C para iniciar a reação. Quando o conjunto apresenta uma leve cor amarela, a reação é interrompida (no tempo t), em temperatura ambiente, por adição de 500 pL de Na2CO3 a 1 M. Finalmente, depois de ter centrifugado as amostras durante 5 min. a 800 g e depois coletado os sobrenadantes em novos tubos de hemólise feitos de vidro, os produtos da reação 9Q-nitrofenol) assim como os restos celulares são dosados por espectrometria nos comprimentos de onda 420 e 550 nm respectivamente. Para cada amostra, a atividade β-gal (U) é calculada graças à fórmula U = (1000 x [D420nm - (1,75 x DO550nm)])/(t x V x DOθooπm), expressa em unidade arbitrária.

I/ Lipo-intoxicação in vitrodas linhagens celulares de epitélio brônquicas 16HBEeCFBE

[148] Lipo-intoxicação por ácido palmítico exógeno. Na maneira do que foi apresentado precedentemente para as BRIN-BD11, as 16HBE e as CFBE são cultivadas em MEM suplementado com 5 pg de plasmocina e 10 % (v/v) de soro de cavalo, a 37eC antes de ser expostas a concentrações de ácido palmítico de 50,100 ou 250 pM durante 16 h e de testar as consequências da lipo-intoxicação exógena.

[149] Lipo-intoxicação hipóxica. De maneira padrão, as 16HBE e as CFBE são cultivadas em condição de normoxia. Dessa maneira, as células são conservadas dentro de um recinto alimentado por uma mistura composta por 95 % de O2 e por 5 % de CO2. Em condições de indução da hipóxia, as células são submetidas a uma mistura gasosa anóxica composta por 95 % de N2 e por 5 % de CO2 durante 48 horas antes de testar as consequências da lipo-intoxicação dita hipóxica.

[150] Teste de apoptose. Em condições de lipo-intoxicação exógena, a indução de apoptose foi analisada por utilização do kit cell death detection kit ELISAPLUS (ROCHE). As CFBE são semeadas em uma placa de 96 poços a uma concentração de 10000 células por poço. No final das 16 h de lipo-intoxicação, as células são submetidas a uma lise e a apoptose é medida de acordo com as instruções fornecidas por quantificação dos oligonucleossomas citoplásmicos que são reveladores da degradação do DNA associada à apoptose.

J/ Medição do tônus basal brônquico

[151] Depois de dissecação dos lobos pulmonares, anéis brônquicos são isolados e montados em um dispositivo de análise pela técnica dos órgãos isolados, no qual eles são imersos em um tampão fisiológico KREBS. Depois da estabilização do tônus dos anéis, 0 tônus basal é medido. Alternativamente, os anéis são incubados durante 4 h em um tampão KREBS suplementado com 100 pM de mono- oleato de manida. REFERÊNCIAS - Alkhateeb H, Chabowski A, Glatz JFC, Luiken JFP, Bonen A (2007) Two phases of palmitate-induced insulin resistance in skeletal muscle: impaired GLUT4 translocation is followed by a reduced GLUT4 intrinsic activity. American Journal of Physiology - Endocrinology And Metabolism293: E783-E793 - Bigay J, Casella JF, Drin G, Mesmin B, Antonny B. ArfGAPI responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. EMBO J. 2005 Jul 6;24(13):2244-53. - Boslem E, Macintosh G, Preston AM, Bartley C, Busch AK, Fuller M, Laybutt DR, Meikle PJ, Biden TJ. 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Claims

1. Composto compreendendo uma cabeça polar, que compreende pelo menos um resíduo hidroxila, sobre a qual é enxertado um único ácido graxo insaturado que compreende entre 16 e 24 átomos de carbono e que tem 1 a 6 insaturação(ões) em configuração cis para uma utilização para prevenir e/ou tratar, em um indivíduo, uma lipo-intoxicação por hipóxia ligada à presença, em excesso, em membranas biológicas de células não adipocitárias, de ácidos graxos, em especial de ácidos graxos de cadeias longas saturadas, e/ou de esteróis, o dito composto caracterizado por ser escolhido dentre mono-oleato de manida, oleato de 3-hidróxi-2,2-bis(hidroximetil)propil, N,N-dietanololeamida, e suas misturas; e a dita lipo-intoxicação por hipóxia é associada no dito indivíduo à patologia pulmonar.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a lipo-intoxicação por hipóxia está na origem da disfunção ou da apoptose das ditas células não adipocitárias por diminuição ou supressão da fluidez da membrana plásmica das mesmas e/ou da membrana das organelas das mesmas.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é não toxico para células capazes de sintetizar lipídeos neutros, tipicamente triglicerídeos e/ou esteróis esterificados, em especial para as células epiteliais brônquicas.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser escolhido dentre N,N-dietanololeamida; alternativamente o mono-oleato de manida, oleato de 3-hidróxi-2,2- bis(hidroximetil)propil, e suas misturas.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que, pela restauração da fluidez das membranas biológicas, previne e/ou trata a lipo-intoxicação por hipóxia.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que (i) é capaz de restaurar o crescimento de um mutante hem1A de levedura Saccharomyces cerevisiaelipo-intoxicado, (ii) é capaz de reduzir ou suprimir a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR), (iii) não é tóxico para um mutante QM de levedura Saccharomyces cerevisiae, e/ou (iv) reduz ou suprime a morte celular por apoptose de uma células de mamífero lipo-intoxicadas.

7. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a patologia pulmonar é uma patologia pulmonar que provoca uma insuficiência respiratória, mais particularmente, mucoviscidose ou uma doença pulmonar crônica obstrutiva.

8. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal, tipicamente um mamífero, de preferência, um ser humano.