JP6502335B2 - 脂質異常症の予防または治療のための化合物および該化合物を含む組成物 - Google Patents

Description

本発明は医薬分野に関する。本発明は、より具体的には、対象において、脂質異常症を予防および／または治療するための化合物の使用に関し、該脂質異常症が、食物に由来するものであれ、あるいは細胞の低酸素状態に関連するものであれ、該脂質異常症は、典型的には、非脂肪細胞の生体膜を含む生体膜における脂肪酸、特に飽和長鎖脂肪酸および／またはステロールの、過剰な存在に関連がある。本発明はまた、組成物、特にそのような化合物を含む医薬組成物、および食品サプリメントまたは補足物、並びに脂質異常症を予防および／または治療するためのその使用にも関する。本発明の化合物および組成物は、代謝症候群および／または代謝症候群に典型的な症状もしくは異常から選ばれる病的状態を予防および／または治療するために、好ましくは２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）または肝臓脂肪症を予防および／または治療するために、特に有利に用い得る。

インスリン耐性、インスリン欠乏、高血糖、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、高血圧、心不全、および肝臓脂肪症は、代謝症候群に典型的な症状または異常である。

代謝症候群は、特に、また典型的には（治療をしていない場合）、次の５つのうち少なくとも３つの異常の出現として定義される：腹部肥満、高トリグリセリド血症（ＴＧ＞約１．７ｍＭ）、低ＨＤＬコレステロール濃度（男性の場合ＨＤＬｃ＜約１ｍＭ、および女性の場合ＨＤＬｃ＜約１．３ｍＭ）、高血圧（ＢＰ＞約１３０／８５ｍｍＨｇ）、並びに空腹時血糖＞約５．５ｍＭ（「Syndrome metabolique et diabete chez l'homme. Composition lipidique et oxidation des lipoproteines de basse densite (DL) plasmatiques en relation avec l'activation des plaquettes sanguines」−２０１０年１２月１０日に審査されたRomain Colasの論文原稿を参照のこと）。代謝症候群発症への脂質異常症の関与は、数十年間にわたって知られている。

脂質異常症は、典型的には、遊離もしくは非エステル化脂肪酸、ステロール（例えばコレステロール）、トリグリセリド、またはリン脂質の、異常に高いまたは低い血中脂質濃度として定義される。大部分の脂質異常症は、これらの成分のレベルが増大しており、低減することははるかにまれである。

非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）または遊離脂肪酸（ＦＦＡ）は、生物の重要なエネルギー要素である。これらは、二重結合の数および炭化水素鎖を作っている炭素原子の数が異なる脂肪酸の複合混合物からなる。内因性由来のものは、細胞質において生合成により形成され、脂肪組織および肝臓においてアシル−ＣｏＡの形態でトリグリセリドの合成のために用いられるか、あるいは細胞により酸化される。それらはまた、リン脂質およびスフィンゴ脂質のような生体膜を作っている構造脂質の組成の一員にもなる。血漿中には、主に４つの脂肪酸−ＮＥＦＡの８５％を占める−、すなわち、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、およびステアリン酸が見られる。大部分のＮＥＦＡは、アルブミンに結合する。それらは、組織内および血中のリポタンパク質リパーゼの作用下で、絶食中にグリセロールおよび脂肪酸に加水分解される、脂肪組織のトリグリセリドに由来する。それらの濃度は、年齢、食物摂取量、および運動によって大きく変わる。一般的に、食後ではそれらの放出は抑制される。

ステロールは、その３番目の炭素がヒドロキシル基を持つステランコアを持つ脂質である。ステロールは、ステロイドのサブクラスと見なされる。最もありふれており、どこにでも存在するステロールの一つ、コレステロールは、細胞の機能に不可欠であり、ビタミンおよび脂溶性ステロイドホルモンの前駆体である。

典型的には、異常に高い血中脂質濃度は、生体膜における異常に高い脂質濃度（「細胞の脂質異常症」）に対応する。例えば、異常に高い血中飽和遊離脂肪酸（ＮＥＦＡ）濃度は、生体膜のリン脂質における異常に高い飽和エステル化脂肪酸（ＥＦＡ）濃度に対応する。これらの脂質はリポタンパク質を形成するため、常に特異的なタンパク質に関連して見られる。脂質異常症は、脂質ホメオスタシスの調節異常に起因する。

動物性脂肪を過剰に含む食事は、生体膜において、特に飽和脂肪酸（ＳＦＡ）の蓄積（脂肪中毒）をもたらし、これが、細胞レベルでの膜可塑性の広範囲な崩壊、次いで細胞の代謝の不活性化、そして長期的には細胞のアポトーシスをもたらすことが確立されている（図１）。

これまで、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）のみ、特にオレイン酸（オリーブ油）が、ＳＦＡの蓄積に関連する毒性の有害効果に対抗することが知られていた（Cunha et al., 2008; Diakogiannaki et al., 2008; Katsoulieris et al., 2009; Pineau et al., 2009; Stein et al., 1997; Wei et al., 2006; Deguil et al., 2011）。しかし、機能性食品および／または医薬としてそれらを使用するには、２つの大きな制限に直面する。第一に、ＵＦＡは、本質的に予防的な性質を有し、従って、すでに罹患している脂肪中毒、すなわち全ての膜メカニズム（タンパク質分泌経路の各ステップにおいて検出可能な）の崩壊の原因となる脂肪中毒を治療することに関しては、わずかな利益しかない。実際、食物が摂取されると、膜リン脂質（ＰＬ）の合成において、ＵＦＡは、ＳＦＡとの直接的な競合を介して作用する。第二に、過剰な遊離脂肪酸、特に、ＵＦＡ、中性脂肪、典型的にはトリグリセリド（ＴＧ）および／またはエステル化ステロールを変換（干渉）することができず、その結果、それらを過剰に蓄える細胞において、ＵＦＡの毒性が示された。例えば、４つのアシルトランスフェラーゼ酵素、Ｌｒｏ１ｐ、Ｄｇａ１ｐ、Ａｒｅ１ｐ、およびＡｒｅ２ｐが欠損しているため、中性脂肪の合成の調節異常が観察される酵母株がそれである。この変異株を外因性のＵＦＡ源に暴露すると、脂質調節異常は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ；下記を参照のこと）と無関係な過程により、細胞内膜の大幅な増大として、最終的には細胞死として表される（Kohlwein & Petschnigg, 2007; Petschnigg et al., 2011）。興味深いことに、同じ現象を哺乳類細胞において観察することができた（Listenberger et al., 2003）。このことは、なぜ不飽和脂肪酸が、後の、不飽和脂肪酸を中性脂肪として蓄える細胞の能力を超えている（いわゆる「代謝的に不活性な」脂肪中毒を起こした細胞）状態より前の脂肪中毒条件下で、細胞毒性を示すようになるのか、あるいは、通常の条件下で、膵非β細胞のような非常に弱いＴＧ合成能力しか持たない細胞に対して細胞毒性を示すようになるのか、を説明している（Cnop M et al., 2001）。ヒトにおいて、脂肪細胞（単独で中性脂肪を合成および蓄える能力がある）以外のすべての細胞タイプは、従って脂肪中毒が懸念される可能性がある。特に、ＳＦＡの蓄積に関連する崩壊は、インスリン合成を担う膵β細胞のアポトーシス（Butler et al., 2003）、または肝細胞のアポトーシス（Egnatchik et al., 2014）をもたらすことが知られている。

２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）の場合、ＳＦＡの蓄積の影響は、様々な臓器に現れ、特に膵臓におけるインスリン欠乏（上記の膵β細胞のアポトーシスに関連して）により表されるが、肝臓および筋肉におけるインスリン耐性によっても表される。

今日、世界中に３億８２００万の糖尿病個体がいると推定されている。脂質ホメオスタシスの調節異常が関与していることは、数十年間にわたって確立されてきたが、大部分の現在の治療は、インスリン分泌レベルまたは血糖値に焦点を合わせている。具体的には、いくつかの分子が２型糖尿病の治療に用いられる。これらは、各患者に対して試験され、それらが有効でないと判明した場合は、次いで逐次新しいものに置き換えられる（体重および他の潜在的な副作用への影響に従う）。フランス医薬品安全庁、ＡＦＳＳＡＰＳの２００６年の推奨に従って、低血糖を引き起こすことなくインスリン耐性を低減するため、まず第一にメトホルミン（一種のビグアナイド）が用いられる。第二に、スルホンアミドをベースとする血糖降下剤、またはメグリチナイドのようなインスリン分泌剤が用い得る。さらに、２００８年以来、ＤＰＰ−４阻害剤（グリプチン）および他のＧＬＰ−１類似体（インクレチン模倣薬）もまた、脂質異常症に関する関心なしに、血糖症を治すために利用可能な製品の範囲内に登場した。最後に、最終手段としてインスリン注射が処方される。

上記の戦略はいずれも、脂肪中毒を起こした細胞および臓器の機能性を根本的に回復させることはできず、従って、典型的には、既存治療の標的とされる各ステップより上流の、代謝症候群または２型糖尿病において見られる一連の有害効果における初期ステップに介入することはできない。「病的な」臓器の生理的機能を刺激することを目的とする現代の治療アプローチは、逆効果的に、それらを弱める一因とさえなり得、多くの患者において用いられる医薬に効果がなく、その上、時間の経過に伴って耐性現象が出現することについて説明している。

ここに、本発明者らは、生体膜における脂質異常症の発症、典型的には、脂肪酸、特に飽和脂肪酸および／またはステロールの細胞内蓄積を予防するための、あるいは、脂肪中毒を起こしたすべての組織において共通に変化している現象、すなわち膜可塑性に作用することにより、すでに罹患している脂質異常症を治療するための、分子または化合物、およびそのような分子または化合物を含む組成物について記載する。

本発明は、脂肪酸、典型的には飽和脂肪酸（ＳＦＡ）および／またはステロール、特に飽和長鎖および／またはトランス脂肪酸による脂肪中毒に関連する病理を予防または治療するための分子の新規なクラスに関する。長鎖脂肪酸は、典型的には、その炭素鎖が、少なくとも１４の炭素原子、典型的には１４〜２４の炭素原子、例えば少なくとも１６または少なくとも１８の炭素原子、典型的には１４〜２２の間、もしくは１４〜１８の炭素原子を含む脂肪酸を意味する。

脂肪中毒は、生体膜に存在するリン脂質（ＰＬ）における飽和脂肪酸／不飽和脂肪酸（ＳＦＡ／ＵＦＡ）の割合の逆転として現れ、ＳＦＡが優勢になり、ＵＦＡに完全に取って代わることさえあり得る。従って、本発明の分子は、典型的には、脂質異常症、代謝症候群、代謝症候群に典型的な症状または異常を予防または治療するためのもの、好ましくは２型糖尿病または肝臓脂肪症を予防または治療するためのものである。

本発明の分子（または化合物）の重要な利点は、先行技術において過剰な飽和脂肪酸（ＳＦＡ）を相殺するために用いられる不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）、特にオレイン酸と比べ、これら本発明の分子（または化合物）が、後者とは異なり、細胞毒性を全く引き起こさない、特に中性脂肪を合成することができない細胞、典型的には膵臓細胞などの非脂肪細胞に、毒性を全く引き起こさない点である。本発明の分子は、先行技術において予防的に用いられるＵＦＡとは異なり、細胞機能を回復させる能力があるため、例えば膜可塑性に作用することにより、治療的にも用い得る点で別の大きな利点を持つ。従って、本発明の分子は、すでに罹患している脂質異常症、すなわち、検出可能な細胞機能障害、典型的には、その自然な機能を発揮する細胞の能力の変化、さらには能力の欠如（代謝的不活性化）の原因となる脂質異常症を治療するために、有利に用い得る。

従って、本発明の特定の目的は、対象において、脂質異常症の予防または治療に用いるための、少なくとも１のヒドロキシル残基を含む極性頭部を含む化合物に関し、該ヒドロキシル残基上には、１６〜２４の間、例えば１６〜２２または１６〜２０の炭素原子を含み、かつ、１〜６の、例えば３の不飽和シス型立体配置を持つ、単一の不飽和脂肪酸が結合している。脂質異常症は、典型的には、非脂肪細胞の生体膜を含む生体膜に影響を及ぼす。一般的に、脂質異常症は、該生体膜における飽和脂肪酸、より具体的には飽和長鎖脂肪酸および／またはステロールの、過剰な存在に関連がある。例えば、膜可塑性を崩壊することにより細胞機能障害を引き起こす場合、飽和脂肪酸および／またはステロールの量は特に過剰であると考えられる。本発明の好ましい態様において、該化合物は、ｉ）ジ不飽和リン脂質を産生させない、特に処理細胞の膜においてジ不飽和リン脂質の導入に関与せず、典型的には処理細胞において対応する脂肪中毒を起こしていない細胞の膜リン脂質のものに相当する膜リン脂質の脂肪酸組成を回復せず、ｉｉ）処理細胞にとってのオレイン酸源ではない、典型的には処理細胞の膜可塑性を回復させる能力があるオレイン酸源ではなく、好ましくはｉｉｉ）細胞内カルシウム動員を誘導しない、および／またはリパーゼにより分解されない。

本発明の別の目的は、その極性頭部が式（Ｉ）：
［式中、
Ａは窒素または酸素原子、好ましくは酸素原子であり、
ｎは２または３に等しく、好ましくはｎは２に等しく、かつ、
Ｒは任意の化学基である］
で示される化合物であって、対象において、脂質異常症、典型的には上記で定義したような脂質異常症の予防または治療に用いるための化合物に関する。

ｉ）ジ不飽和リン脂質を産生させないか、あるいは処理細胞の膜においてそのようなリン脂質の導入を引き起こさず、典型的には処理細胞において対応する脂肪中毒を起こしていない細胞の膜リン脂質のものに相当する膜リン脂質の脂肪酸組成を回復せず、ｉｉ）処理細胞にとってのオレイン酸源、典型的には処理細胞の膜可塑性を回復させる能力があるオレイン酸源の構成要素とならない、本発明の好ましい化合物の例は、マンニド モノオレート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、およびＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミド（例えば、１−オレオイル リゾホスファチジン酸またはＬＰＡとは異なる）から選ばれる。

細胞内カルシウム動員を誘導しない本発明の好ましい化合物の例は、マンニド モノオレートおよび３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレートである。細胞内カルシウム動員を誘導する参照分子ＯＡＧ（Marin & Cooper, 2006）、または１−オレイルグリセロールおよび２−オレイルグリセロール（Iwasaki et al., 2008）とは異なり、これらの化合物は、増殖またはアポトーシスのような細胞内のカルシウム依存性の有害な過程による毒性のリスクが低い（Stutzmann GE et al., 2011）点で特に有利である。

リパーゼの分解作用に耐える本発明の好ましい化合物の例は、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミドである。

本発明はさらに、代謝症候群、典型的には代謝症候群に典型的な少なくとも１の症状または異常、好ましくは少なくとも２または３の症状の予防または治療に用いるための本明細書に記載の化合物に関し、該症状は、インスリン耐性、インスリン欠乏、高血糖（典型的には空腹時血糖＞約５．５ｍＭ）、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度（典型的には、男性の場合＜約１ｍＭ、および女性の場合＜約１．３ｍＭ）を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（典型的にはＴＧ＞約１．７ｍＭ）、高血圧（典型的には血圧（ＢＰ）＞約１３０／８２０ｍｍＨｇ）、心不全、および肝臓脂肪症から選ばれ、好ましくは、インスリン耐性、高血糖（典型的には空腹時血糖＞約５．５ｍＭ）、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度（典型的には、男性の場合＜約１ｍＭ、および女性の場合＜約１．３ｍＭ）を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（典型的にはＴＧ＞約１．７ｍＭ）、高血圧（典型的には血圧（ＢＰ）＞約１３０／８２０ｍｍＨｇ）、心不全、および肝臓脂肪症から選ばれる。特定の目的は、２型糖尿病の予防または治療に用いるための本発明の化合物に関する。

特に好ましい本発明の化合物はマンニド モノオレートであり、本発明者らは、飽和脂肪酸により脂肪中毒を起こした哺乳類の膵β細胞を用いて、脂肪中毒および／または２型糖尿病に罹患した対象において、プロインスリンからインスリンへの成熟を促進することにより、インスリン分泌を有利に増大させることができることを示した。

本発明はさらに、医薬組成物、機能性食品または食品サプリメントの形態である、少なくとも１の本発明の化合物を含む、組成物に関する。特定の目的は、典型的には、この少なくとも１の本発明の化合物に加えて、治療的に活性である（そして、当業者によりそのように認識されている）少なくとも１の他の化合物（本発明の化合物とは異なる）を含む、医薬組成物に関する。

本発明はまた、対象において、脂質異常症、典型的には非脂肪細胞の生体膜を含む生体膜における脂質異常症、特に該生体膜における脂肪酸、より具体的には、飽和長鎖および／またはトランス脂肪酸、および／またはステロールの、過剰な存在に関連する脂質異常症を予防または治療するための該組成物の使用にも関する。本発明はまた、対象において、代謝症候群、典型的には代謝症候群に典型的な少なくとも１の症状または異常、好ましくはいくつかの（例えば２、３、４、または５の）症状を予防または治療するための；好ましくは２型糖尿病を予防または治療するための、該組成物の使用にも関する。記載された用途はまた、特に代謝症候群、典型的には、代謝症候群に典型的な少なくとも１の症状または異常、および／または２型糖尿病の治療において、少なくとも１の他の治療的に活性な化合物（当業者により治療的に活性であると認識されており、本発明の化合物とは異なる）と組み合わせても、有利に実施し得る。

以下の図および実施例は、範囲を制限することなしに、本発明を図解する。
図の凡例

図１：分泌経路および膜可塑性 膜または分泌タンパク質（細胞の分子「ツール」）は、合成された後、細胞内で成熟ステップを経る必要がある。この過程の各ステップ−「分泌経路」と称する−は、特定の細胞内コンパートメント（特に小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置）において起こる。従って、成熟タンパク質を得るためには、様々な細胞内膜システム間の機能的な細胞内輸送が必要である。この流れは、特に細胞内コンパートメントの膜可塑性に影響され、この膜可塑性自体は、膜を作っているリン脂質（ＰＬ）の性質と直接関係している。特に、ＰＬに飽和脂肪酸（ＳＦＡ）が存在することにより膜流動性が低減するのに対して、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）を持つＰＬはより流動的な膜を形成すると認識されている。 オレイン酸（Ｏｌｅ）の有益な効果は、過剰な外因性のＵＦＡを中性脂肪（脂肪滴（ＬＤ）の形態で蓄えられるトリグリセリド（ＴＧ）またはエステル化ステロール（ＥＳ））の形態で緩衝する能力を持つ細胞において観察される。この能力を持たない細胞では、過剰な外因性のオレイン酸塩は、最終的に細胞内膜の増大をもたらし、細胞ストレスを引き起こすことにより、アポトーシスを誘発することになる。

図２：高等真核生物におけるＵＰＲ経路（Pineau & Ferreira, 2010）。

図３：オレイン酸、ＯＡＧおよびＬＰＡは、脂肪中毒を起こした酵母の生育を回復させる。 Ａ）オレイン酸、ＯＡＧおよびＬＰＡの分子構造。Ｂ）オレイン酸、ＯＡＧおよびＬＰＡの濃度を増大させて、ＳＦＡ蓄積条件下で培養したｈｅｍ１Δ酵母の生育（３日後）の回復。

図４：ＯＡＧおよびＬＰＡは、トリグリセリドを合成しない細胞に毒性を示さない。 原液から数滴（５μｌ）のＯＡＧ、ＬＰＡまたはオレイン酸を、予めＱＭ株を塗抹した寒天培地の表面上に表示の濃度で沈着させた。オレイン酸の場合、３日後に生育阻害ハロー（ｈａｌｏ）（コロニーの不在）が観察され得る。しかし、ＬＰＡまたはＯＡＧの存在下ではこれらのハローは観察されない。

図５：ＯＡＧおよびＬＰＡは、脂肪中毒を起こした酵母において、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を低減させる。 Pineau et al. (2009)により記載されているように、融合遺伝子−４つのＵＰＲエレメント（ＵＰＲＥ）を含む人工プロモーターの制御下に置かれたｌａｃＺ遺伝子のコード配列に対応する−を持つ完成プラスミドを、ｈｅｍ１Δ酵母株に導入した。ＵＰＲが誘導されている間、転写因子Ｈａｃ１ｐ／ＸＢＰ１ｐは活性化されて融合遺伝子ＵＰＲＥに結合し、ｌａｃＺ遺伝子の転写をもたらす。ｌａｃＺはβ−ガラクトシダーゼをコードするため、従って、対応する酵素活性を検出することにより、ＵＰＲ誘導のレベルを測定する。ＳＦＡの蓄積を誘導する液体培地において、他の添加物（φ）を添加せずに、または示されるように２００μＭ オレイン酸、ＯＡＧもしくはＬＰＡを添加して、ｈｅｍ１Δ酵母株を培養した。

図６：ＯＡＧは、ＵＰＲ誘導レベルを低減させることにより、飽和脂肪酸の存在下で、膵β細胞のアポトーシスを予防する。 脂肪中毒条件を作り出すため、Dhayal & Morgan (2011)により記載されているように、対照条件下、または外因性の飽和脂肪酸（２００μＭ パルミチン酸）源の存在下で、膵β細胞ＢＲＩＮ−ＢＤ１１を、ＯＡＧの添加ありまたはなしで培養した。Ａ）ＯＡＧの濃度の増大に伴う死細胞の割合を、パルミチン酸の非存在下（対照）または存在下で推定した。Ｂ）ＯＡＧの存在下または非存在（φ）下、ウェスタンブロットにより様々な条件下にてｅＩＦ２αのリン酸化レベルも解析し、総ｅＩＦ２αに標準化した。リン酸化レベルはＵＰＲの強度と関係しているため、この実験は、ＯＡＧが、パルミチン酸の蓄積により誘導されるＵＰＲを低減させることを示している。

図７：３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレートおよびマンニド モノオレートは、カルシウム動員を誘導しない。 ヒト上皮細胞ＣＦＢＥに蛍光カルシウムプローブを添加し、次いで１００μＭ ＯＡＧ、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、マンニド モノオレート、またはＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミドに暴露した。次いで、細胞内のカルシウムの動きに関連がある蛍光強度の変化を記録した（Vachel et al., 2013を参照のこと）。得られた結果は、ＯＡＧと比べて、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレートおよびマンニド モノオレートが、細胞のカルシウムの蓄えの枯渇に非常に弱い影響しか及ぼさず（すなわち、それらは細胞内カルシウム動員を誘導しない）、従って、これらの化合物が、非常に限られた細胞毒性のリスクしか持たないことを示している。

図８：３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、マンニド モノオレート、およびＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミドは、飽和脂肪酸の存在下で、膵β細胞のアポトーシスを予防する。 脂肪中毒条件を作り出すため、Dhayal & Morgan (2011)により記載されているように、外因性の飽和脂肪酸（２００μＭ パルミチン酸）源の存在下で、膵β細胞ＢＲＩＮ−ＢＤ１１を培養した後、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、マンニド モノオレート、またはＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミドを添加した。図６のデータと合わせて、これらの結果は、これら３つの対象化合物が、脂肪中毒により誘導される膵β細胞死を予防することを示している。

図９：マンニド モノオレートは、哺乳類膵β細胞において、脂肪中毒条件下で、プロインスリンの成熟を回復させる。 脂肪中毒条件を作り出すため、Boslemら(2011)により記載されているように、対照条件下（φ）、または外因性の４００μＭ パルミチン酸源の存在下（Ｐ）で、膵β細胞ＭＩＮ６を４８時間培養した。生育の最後の２４時間の間に、２００μＭ ＯＡＧ、ＬＰＡ、またはマンニド モノオレートを、記載のように添加したまたは添加しなかった。これらの条件下で、タンパク質サンプルをウェスタンブロットに供し、得られた結果は、マンニド モノオレートのみが、脂肪中毒条件下で、プロインスリンからインスリンへの成熟を回復させることを示している。

図１０：Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミドは、リパーゼの加水分解活性に耐える。 ＯＡＧ（１５μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミドを、３７℃で３０分間、１０Ｕのリパーゼに暴露した（＋）または暴露しなかった（−）。インキュベーションに続いて、脂質種を、サンプルから抽出した後、薄層クロマトグラフィーにより分離した。対象分子種を注釈付けし、結果は、ＯＡＧとは異なり、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミドが、リパーゼによる加水分解に耐えることを示している。

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、外因性源（食事）または内因性源（低酸素症、もしくは突然変異による脂肪酸不飽和化ステップの変化）のＳＦＡが、細胞膜を作っているリン脂質に蓄積し、従ってタンパク質分泌経路に介入する細胞内オルガネラの機能性を改変することにより多数の過程を破壊する（図１を参照のこと）ことを示した。

これを実証するため、本発明者らは、哺乳類細胞において観察されるＳＦＡおよびコレステロールの全ての効果、特に代謝症候群の発症に関与する全ての異常を再現する単純な単細胞モデル（パン酵母サッカロマイセス・セレヴィシエから誘導されたｈｅｍ１Δ株）を開発した（Pineau et al., 2008およびPineau et al., 2009）。

ＹＰＧ培地（すなわちエルゴステロール（Ｅｒｇ）もオレイン酸（Ｏｌｅ）も含まない培地）では、ｈｅｍ１Δ株は、リン脂質、特にフォスファチジルコリン（ＰＣ）に飽和脂肪酸（特にパルミチン酸、Ｃ１６：０）を蓄積する。なお、エルゴステロールは、酵母に存在する主要なステロールであり、従って、酵母では、ヒトにおけるコレステロールに相当するものである。

トリグリセリドおよびステロールエステルの合成を担う酵素をコードする遺伝子を欠失させた４重変異（ＱＭ）株（Petschnigg et al., 2009）は、結果として、外部から供給されるオレイン酸Ｃ１８：１タイプの遊離脂肪酸を中性脂肪に変換する能力がなく、この供給が膜可塑性の平衡を崩壊させるため、有害なストレスがもたらされる。本発明者らは、そのような状況で、特に、ＱＭ株を用いることにより、オレイン酸の毒性を明確に示す毒性試験を実施することができた（図４を参照のこと）。

より正確には、本発明者らは、ｈｅｍ１Δ株において、飽和鎖を持つリン脂質（飽和ＰＬ）およびコレステロールが細胞内オルガネラ膜に蓄積することによる、分泌小胞形成への負の効果を観察した。この脂肪中毒（ｈｅｍ１Δ株の細胞システムはＳＦＡのみを合成するため、内因性である）は、小胞体（ＥＲ）膜の脂質環境を崩壊させ、タンパク質の折り畳み過程を変化させ（誤った折り畳み）、次いで該ＥＲにおける複雑な応答、すなわち小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）として知られる応答を誘発する。このバックアップ・システムの飽和は、アポトーシス細胞死をもたらす。同時に、本発明者らは、ゴルジ装置の小胞形成の崩壊、およびゴルジ装置と細胞膜との間の参照タンパク質（例：Ｆｕｒ４ｐ）の輸送の変化を観察することができた。具体的には、本発明者らは、脂肪中毒を原因とする分泌経路全体の変化を観察した。つまり、ｈｅｍ１Δ酵母株により、本発明者らは、ＥＲストレス、および細胞膜に向かうタンパク質輸送の両方への、ＳＦＡの効果を確認することができた。

小胞体（ＥＲ）は、脂質合成、カルシウムホメオスタシスの調節、並びに、様々なオルガネラおよび細胞表面に向けられたタンパク質（例えば、イオンチャネルおよび輸送体のような膜タンパク質）の合成を含む、いくつかの基本的な細胞過程に関与する。ＥＲはまた、膜または分泌タンパク質が組み立てられ、折り畳まれる場所でもある。それ故、ＵＰＲは、このオルガネラが誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積を扱えるようにすることにより、ＥＲの完全性および機能性を保持する重要な役割を担う（Kincaid & Cooper, 2007; Zhang & Kaufman, 2006）。ＳＦＡの毒性は、膵β細胞（哺乳類においてインスリン合成を担う）において小胞体ストレス応答の誘導に関連があることに留意する（Cunha et al., 2008; Diakogiannaki & Morgan, 2008; Laybutt et al., 2007）。Alkhateebら(2007）およびKatoら(2008)はさらに、ＳＦＡの蓄積によって、筋肉細胞の表面におけるインスリン受容体およびグルコース輸送体Ｇｌｕｔ４のアドレッシングを改変することを観察した。

Schneiderら(1999)は、小胞体（ＥＲ）およびゴルジ装置の膜は、大多数の不飽和リン脂質（ＰＬ）から成るのに対して、飽和ＰＬのレベルは、分泌経路における最末端コンパートメントにおいて徐々に増大し、細胞膜において最大レベルに達することを観察した。高レベルの不飽和ＰＬは、高い膜流動性、すなわち小胞形成に不可欠な特定のタンパク質のリクルートに極めて重要なパラメーターとして表される。Ａｒｆ−ＧＡＰ１ファミリーのタンパク質の標準的な例としては、酵母におけるＧｃｓ１ｐが挙げられる。Ｇｃｓ１ｐは、ゴルジ装置とＥＲとの間、およびＥＲと細胞膜との間の、両方の小胞輸送のメディエイターであることが示されている（Robinson et al., 2006）。興味深いことに、ＧＣＳ１遺伝子の欠失は、ゴルジ装置の断片化、およびポストゴルジ小胞輸送の崩壊を引き起こし（Poon et al., 2001）、本発明者自身も、ｈｅｍ１Δ酵母モデルにおいて、すなわちＳＦＡ蓄積条件下で、同数の現象を観察することができた（Payet et al., 2013を参照のこと）。

Ａｒｆ−ＧＡＰ１ファミリーのタンパク質は、ＡｒｆＧＡＰ１脂質パッキングセンサー（ＡＬＰＳ；（（Bigay et al., 2005）と称する特異的なモチーフを介して膜表面上に吸着されることにより、膜湾曲に応答する。具体的には、ＡＬＰＳモチーフは、膜湾曲それ自体、すなわち湾曲した形状を認識するわけではないが、膜湾曲の結果として生じるリン脂質の極性頭部の緩んだパッキング（緩んだ脂質パッキング）を認識する（Bigay et al., 2005）。本発明者らは、脂肪中毒条件下での高い飽和ＰＬレベルは、膜脂質パッキングの増大に関連があり（Deguil et al., 2011）、この増大は、ゴルジ装置による細胞質からのＧｃｓ１ｐのリクルートを改変する（Payet et al., 2013）ことを示すのに成功した。より一般的には、本発明者らは、生体膜における脂肪酸、特にＳＦＡの蓄積が、ゴルジ装置および小胞体（ＥＲ）を含む細胞内オルガネラの機能的な調節異常、並びに、特に、細胞表面上の特定の膜輸送体および膜受容体の輸送が低減する原因となる小胞形成のレベルの低下を引き起こすことを示した。

本発明者らが引き起こした細胞の脂肪中毒は、インビトロで、もっぱら飽和形態をとる外因性の脂肪酸源（「外因性の」脂肪中毒）へ暴露するか、あるいは細胞が不飽和形態の脂肪酸を産生する内因性の能力を欠如すること（「内因性の」脂肪中毒）によって生じる。

本発明者らは、該発明者らのｈｅｍ１Δ酵母モデルを用いて、オレイン酸（Ｏｌｅ）がリン脂質（ＰＬ）に代謝される（図１を参照のこと、ＰＬからＵＦＡが有利になり、ＰＬからＳＦＡが減少する）ことにより、ＳＦＡにより予め脂肪中毒を起こした膜の可塑性を回復させることを示した。本発明者らはまた、ＱＭ酵母株を用いて、観察された有益な効果が、過剰な外因性のＵＦＡを中性脂肪の形態で緩衝する能力を持つ細胞に限られることも示した。この能力を持たない細胞では、過剰な外因性のオレイン酸は、最終的に細胞内膜の異常な増大をもたらし、これが、細胞にストレスを与えることにより、アポトーシスを誘発することになる。

本発明者らは、この現象を予防または制限する可能性がある対象分子をスクリーニングするために、理想的には、過剰に存在する、および／またはほとんど代謝されない（すなわちエステル化されている）脂肪酸の毒性効果に対抗し、崩壊された全ての現象を治すために、該発明者らのｈｅｍ１Δ酵母モデルおよびＱＭ株を用いた。従って、本発明者らは、特に、非病的状態下で見られるものに相当する細胞機能を回復させる（例えば、膜流動性を回復させることによる）能力がある分子を発見した。

本発明者らにより予め選ばれた分子の有効性、すなわち非病的状態下で見られるものに相当する細胞機能を回復させる能力は、次いで、すでに罹患している脂質異常症の場合であっても、同発明者らにより、哺乳類の膵β細胞において、特にラットの膵β細胞（ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞株）において試験され示された。さらに、本発明者らは、対象化合物が、細胞増殖およびアポトーシスを誘導する原因となるカルシウム動員のような細胞の現象に、非常に限られた影響しか及ぼさないことを実証することができた。従って、対象化合物は、対照的にそのような細胞内カルシウム動員を誘導または促進するＯＡＧのような化合物より毒性が低い。同様に、特定の化合物は、哺乳類の膵β細胞において、特にマウスの膵β細胞（ＭＩＮ６細胞株）において、プロインスリンからインスリンへの変換を回復させるのに特に有効であることが示された。

従って、本発明は、対象において、脂質異常症の予防または治療に用いるための、少なくとも１のヒドロキシル残基を含む極性頭部を含む化合物に関し、該ヒドロキシル残基上には、１６〜２４の間、例えば１６〜２０、典型的には１８の炭素原子を含み、かつ、１〜６の、例えば３の不飽和シス型立体配置を持つ、単一の不飽和脂肪酸が結合している（本明細書において「対象化合物」として特定される）。

本明細書における対象は動物、典型的には哺乳類、例えば、マウス、ラット、ブタおよびヒトから選ばれる哺乳類である。本明細書における対象は、好ましくはヒトである。

本明細書の文脈において、予防または治療が求められる脂質異常症は、典型的には、生体膜、特に非脂肪細胞の生体膜に影響を及ぼす。脂質異常症は、一般的に、該生体膜における脂肪酸、より具体的には、飽和長鎖および／またはトランス脂肪酸、および／またはステロールの、過剰な存在に関連がある。脂質異常症は、典型的には、非脂肪細胞の機能不全またはアポトーシスの発端において、その細胞膜および／またはそのオルガネラ膜の流動性を低減、さらには抑制することにより、該非脂肪細胞の中毒（脂肪中毒）の原因となる。

本発明の特定の態様において、脂質異常症は、対象における代謝症候群、典型的には代謝症候群の少なくとも１の症状、好ましくは少なくとも２または３の症状の存在に関連があり、該症状は、インスリン耐性、インスリン欠乏、高血糖（典型的には空腹時血糖＞約５．５ｍＭ）、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度（典型的には、男性の場合＜約１ｍＭ、および女性の場合＜約１．３ｍＭ）を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（典型的にはＴＧ＞約１．７ｍＭ）、高血圧（典型的には血圧（ＢＰ）＞約１３０／８２０ｍｍＨｇ）、心不全、および肝臓脂肪症から選ばれ、好ましくは、インスリン耐性、高血糖（典型的には空腹時血糖＞約５．５ｍＭ）、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度（典型的には、男性の場合＜約１ｍＭ、および女性の場合＜約１．３ｍＭ）を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（典型的にはＴＧ＞約１．７ｍＭ）、高血圧（典型的には血圧（ＢＰ）＞約１３０／８２０ｍｍＨｇ）、心不全、および肝臓脂肪症から選ばれる。

本明細書から分かるように、脂肪酸、特にＳＦＡおよび／またはステロールの用語「過剰な存在」は、「脂肪中毒」、例えば外因性の脂肪中毒または内因性の脂肪中毒（例えば、低酸素性の）と同義であり、上記の分泌経路を崩壊させ、従って細胞の機能（典型的にはタンパク質分泌経路、およびその結果として該タンパク質の機能）を改変するのに十分な量で、あるいは、さらに高次なレベルで、対応する臓器の機能の結果として改変するのに十分な量で、特に、飽和および／またはトランス脂肪酸、および／またはステロールが非脂肪細胞において存在することを指す。

腎臓の脂肪中毒は、例えば、飽和脂肪酸、特に飽和長鎖脂肪酸が、腎臓および近位尿細管の細胞において蓄えられると現れる。そのような貯蔵により、尿細管間質炎および線維症、さらには腎不全、および大部分の重症例で懸念される対象の死亡がもたらされる。さらなる例として、膵臓の脂肪中毒は、典型的には、飽和脂肪酸、特に飽和長鎖脂肪酸が膵β細胞の膜リン脂質に蓄えられることにより、診断される。

細胞スケールでは、脂肪中毒は、典型的には、生体膜のリン脂質（ＰＬ）（特にフォスファチジルコリン（ＰＣ）のリン脂質種）の脂肪酸含有量の変化を検出することにより、特に、ＰＬからＳＦＡが有利となってＰＬ形態からＵＦＡが枯渇することにより、診断される。そのような脂質プロファイルは、本明細書の実施例項に記載された手順の画像において、全細胞脂質の抽出、リン脂質の精製、および後者の質量分析解析に続いて示され得る（Deguil et al., 2011）。

さらに、この細胞の脂肪中毒は、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）の誘導により現れ得る。実施例項に示されるように、レポーター遺伝子（その酵素活性を定量することができるβ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子等）の発現を解析することにより、このＵＰＲをインビトロで検出および測定することが可能であり、該レポーター遺伝子は、そのプロモーター配列内に、該応答を誘発している間に特徴的に誘導される遺伝子、例えば、ＣＨＯＰ、ＢｉＰ、ＧＲＰ７８およびＡＴＦ４から選ばれる遺伝子に特異的な、１以上の、例えば４のＵＰＲエレメント（ＵＰＲＥ）を含む（Laybutt et al., 2007）。あるいは、脂肪中毒に応答するＵＰＲの誘発は、この細胞事象カスケードにおいて鍵となる特定のタンパク質の活性型の割合を定量することにより、検出および測定され得る。タンパク質ｅＩＦ２αがそれであり、リン酸化された活性型の存在量は、ＵＰＲの活性化状態に比例する。実施例項で説明されるように、リン酸化された活性型の量は、ウェスタンブロット後に得られる画像を密度測定することにより、評価され得る（Dhayal & Morgan, 2011）。

本発明の文脈において、ＵＰＲは、前述のように、遺伝子の発現、またはＵＰＲに関与するタンパク質の活性を検出または測定することにより、有利に検出または測定され得る。

特定の対象化合物は、上記で定義したように、その極性頭部が式（Ｉ）：
［式中、
Ａは典型的には酸素原子、またはＮＲ_１基であり（ここに、Ｒ_１＝Ｈ、もしくはＯＨで適宜置換されたＣ_１−Ｃ_６アルキルである）、好ましくはＡは酸素原子、またはＮＨ、ＮＣＨ_３もしくはＮＣＨ_２ＣＨ_２ＯＨであり、より好ましくはＡは酸素原子であり、
ｎ＝２または３、好ましくはｎ＝２であり、
Ｒは任意の化学基であり、基（ＣＨＲ）ごとに異なり得る］
で示される化合物である。
式（Ｉ）において、ジグザグで分断されている結合は、極性頭部と不飽和脂肪酸の炭素鎖との間の結合を表し、式（Ｉ）のＣ＝Ｏ基は不飽和脂肪酸のＣ＝Ｏである。
好ましくは、Ｒは炭素、水素および酸素原子のみを含む基である。
好ましくは、Ｒは炭素、水素および酸素原子のみを含む飽和基である。
好ましくは、（ＣＨＲ）_ｎ−ＯＨ基はグリセロール、エリトリトールまたはマンノースのような単糖の誘導体である。

本発明において、各ヒドロキシル残基は、独立してリン酸化され得る。

脂質異常症を予防または治療するために、本発明の文脈において使用可能な対象化合物の例は、下記で特定される：
１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、
１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−フォスフェイト（１−オレオイル リゾホスファチジン酸、またはＬＰＡ）、
２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、
マンニド モノオレート、
３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、
Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、
プロピレン グリコール モノオレート、
１−オレオイル グリセロール、
２−オレオイル グリセロール、
トリグリセロールを有するオレイン酸モノエステル、
（Ｚ）−９−オクタデカン酸−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル エステル、
ジエチレン グリコール モノオレート。

脂質異常症を予防または治療するために、本発明の文脈において使用可能な対象化合物は、例えば、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）、１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−フォスフェイト（１−オレオイル リゾホスファチジン酸、またはＬＰＡ）、２−アラキドノイルグリセロール（２−ＡＧ）、マンニド モノオレート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、Ｎ，Ｎ−ジエタノールオレアミド、プロピレン グリコール モノオレート、トリグリセロールを有するオレイン酸モノエステル、および（Ｚ）−９−オクタデカン酸−（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メチル エステルから選ばれる。

好ましくは、脂質異常症、特に２型糖尿病および／または低酸素性脂肪中毒のような代謝性疾患に関連する脂肪中毒を予防または治療するために、本発明の文脈において使用可能な化合物は、マンニド モノオレート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、およびＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミドから選ばれる。

脂質異常症を予防または治療するために、特に、代謝性疾患および／または代謝症候群に典型的な症状もしくは異常、好ましくは２型糖尿病の予防および／または治療に関して、特に好ましい対象化合物は、マンニド モノオレートである。

対象化合物は、典型的には生体膜の流動性を回復させることにより、脂質異常症を予防または治療するために、本発明の文脈において用いられる。これらの化合物の有利な特徴は、先行技術において用いられる不飽和脂肪酸とは異なり、これらの化合物が、中性脂肪、典型的にはトリグリセリドおよび／またはエステル化ステロールを合成することができない細胞に毒性を示さない点である。これらの化合物は、特に膵臓細胞（膵β細胞および膵α細胞）に毒性を示さない。対象化合物はまた、好ましくは、腎臓細胞、肝細胞、心臓細胞、および筋肉細胞にも毒性を示さない。対象化合物はその上、好ましくは、脂肪中毒を起こした細胞の機能性、および必要な場合は関連する臓器の機能性を有利に回復させる能力がある。

本発明の典型的な対象化合物は、以下の性質を有利に持つ：
（ｉ）酵母サッカロマイセス・セレヴィシエの脂肪中毒を起こしたｈｅｍ１Δ変異体の生育を回復させる、
（ｉｉ）小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を低減または抑制する、
（ｉｉｉ）酵母サッカロマイセス・セレヴィシエの４重変異体（ＱＭ）に毒性を示さない、および／または、
（ｉｖ）脂肪中毒を起こした哺乳類細胞のアポトーシス死を低減または抑制する。

本発明の文脈において用いられる特定の化合物は、酵母サッカロマイセス・セレヴィシエの脂肪中毒を起こしたｈｅｍ１Δ変異体の生育を回復させる能力があり、および／または、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）、典型的には脂肪中毒により誘導されるＵＰＲ（後者が本来、内因性のものであれ、外因性のものであれ）を低減または抑制する能力がある。

本発明の文脈において用いられる特定の化合物は、ＱＭ株酵母に毒性を示さない。

本発明の文脈において用いられる特定の化合物は、脂肪中毒を起こした哺乳類細胞のアポトーシス死を低減または抑制することができる。

本発明の文脈において使用可能な記載された化合物の中のいくつかは、脂質含有量、すなわち細胞膜に存在するリン脂質の脂肪酸組成に直接作用する。そのような化合物の例は、１−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−フォスフェイト（１−オレオイル リゾホスファチジン酸、またはＬＰＡ）およびプロピレン グリコール モノオレートである。

本発明の文脈において使用可能な他の化合物は、細胞膜における通常のジ不飽和リン脂質組成を回復させることなしに、膜流動性、従って膜機能性を回復させる。そのような化合物の好ましい例は、１−オレオイル−２−アセチル−ｓｎ−グリセロール（ＯＡＧ）である。より好ましい例は、マンニド モノオレート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、およびＮ、Ｎ−ジエタノールオレアミドである。

本発明の好ましい態様において、対象化合物は、代謝症候群および／または代謝症候群に典型的な症状もしくは異常から選ばれる病的状態を予防および／または治療するために、好ましくは２型糖尿病を予防または治療するために、用いられる。

本発明の特定の態様において、対象化合物は、代謝症候群、典型的には代謝症候群の少なくとも１の症状、好ましくは少なくとも２または３の症状を予防および／または治療するために用いられ、該症状は、インスリン耐性、インスリン欠乏、高血糖（典型的には空腹時血糖＞約５．５ｍＭ）、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度（典型的には、男性の場合＜約１ｍＭ、および女性の場合＜約１．３ｍＭ）を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（典型的にはＴＧ＞約１．７ｍＭ）、高血圧（典型的には血圧（ＢＰ）＞約１３０／８２０ｍｍＨｇ）、心不全、および肝臓脂肪症から選ばれ、好ましくは、インスリン耐性、高血糖（典型的には空腹時血糖＞約５．５ｍＭ）、高コレステロール血症、特に低ＨＤＬコレステロール濃度（典型的には、男性の場合＜約１ｍＭ、および女性の場合＜約１．３ｍＭ）を特徴とする高コレステロール血症、高トリグリセリド血症（典型的にはＴＧ＞約１．７ｍＭ）、高血圧（典型的には血圧（ＢＰ）＞約１３０／８２０ｍｍＨｇ）、心不全、および肝臓脂肪症から選ばれる。

前述のように、２型糖尿病に対する現在の治療アプローチは、初期の脂質異常症より下流に介入するパラメーターを標的にしている。実験室レベルでの生理学的な文脈においては妥当性が実証されているが、これらの治療は、特に、変化した、または機能していない膜流動性（関心のある細胞がもはや機能的でない点で）として現れる、すでに罹患している脂肪中毒の場合に顕著な膜メカニズムの広範囲な崩壊が原因で、有効性が欠如していることが問題である。今日、特に、中性脂肪を合成することができない細胞、特に非脂肪細胞に影響を及ぼす脂質異常症を治療するための分子または化合物はない。

本発明の好ましい態様において、本明細書に記載の少なくとも１の対象化合物が、２型糖尿病を予防および／または治療するために用いられる。マンニド モノオレートは、２型糖尿病を予防および／または治療するために好ましく用いられる対象化合物の例である。

本発明の特定の態様において、この少なくとも１の対象化合物は、当業者に知られており、かつ、２型糖尿病の予防または治療に伝統的に用いられる別の化合物と組み合わせて用い得、この別の化合物は、好ましくは、ビグアナイド、グリタゾン、スルホンアミドをベースとする血糖降下薬、グリニド、ＤＰＰ−４阻害剤、インクレチン模倣薬、およびα−グルコシダーゼ阻害剤から選ばれる。

本発明の別の目的はさらに、少なくとも１の本発明の化合物を含む、医薬組成物、機能性食品、食品サプリメントまたは補足物の形態である組成物（本明細書において「対象組成物」として特定される）に関する。

特定の目的は、典型的には、この少なくとも１の本発明の化合物に加えて、少なくとも１の治療的に活性である（そして、当業者によりそのように認識されている）他の化合物（非脂肪細胞において毒性を誘導することなしに、脂質異常症を予防または治療するために、本発明の文脈において用いられる対象化合物とは異なる）、特に、代謝症候群に典型的な症状もしくは異常、および／または２型糖尿病（例えば、本明細書に記載されているような）の予防または治療に活性がある化合物を含む、医薬組成物に関する。

本発明はまた、脂質異常症、典型的には代謝症候群および／または代謝症候群に典型的な症状もしくは異常から選ばれる病的状態の予防または治療に用いるための、好ましくは２型糖尿病の予防または治療に用いるための、本明細書に記載の組成物にも関する。

用語「治療」は、治癒的な、症候性の、または予防的な治療を指す。従って、本発明の化合物は、記載された疾患に罹患した対象（哺乳類、特にヒト等）において用い得る。本発明の化合物はまた、疾患の進行を遅延または遅くする、あるいはさらなる進行を予防し、従って対象の状態を改善するのにも用い得る。最後に、本発明の化合物は、罹患していないが通常疾患を発症し得る、あるいは疾患を発症するリスクが高い対象に「予防的に」投与され得る。

本発明の対象化合物または組成物は、様々な方法および様々な形態で投与され得る。

従って、典型的な態様において、対象化合物群は、一緒にまたは別々に対象に投与され、本発明の対象化合物群または組成物群は、治療期間を通して、すなわち、治療される病的状態の症状が改善するまで、好ましくは該症状の全てまたは一部が消失するまで、１日当たり１回以上（日投与）、１週間当たり１回以上（週投与）、または１ヶ月当たり１回以上（月投与）、連続してまたは逐次投与される。

必要ならば、１日用量は、例えば、１日当たり２、３、４、５、６またはそれ以上の用量で、あるいはその日の適切な間隔にて投与される複数回のサブ用量で、投与され得る。

該化合物または組成物は、例えば、全身投与、経口投与、非経口投与、吸入による投与、または例えば、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、皮下注射、経皮注射、動脈内注射等のように注射投与され得る。長期治療の場合、好ましい投与経路は、舌下投与、経口投与、腹腔内投与、または経皮投与であろう。

組成物は、適宜、方鉛鉱の成型機または装置を用いて、持続放出および／または遅延放出をもたらす、注射用懸濁液、オイル、坐薬、硬カプセル、軟カプセル、エアロゾル等として製剤化され得る。注射のために、化合物は一般的に、例えば、注射器または灌流を用いて注射され得る液体懸濁液として包装される。

流速および／または注射用量は、患者、病的状態、投与方法等に従って、当業者が適応させることができると理解される。一般的に、化合物の１日用量は、治療効果を得るのに必要な最小量であろう。

治療組成物に存在する化合物の量は、特定の患者、組成物、投与方法について所望の治療効果を、好ましくは患者への毒性なく、得るのに必要な活性成分の血中濃度を得るために調節され得る。選ばれる量は、複数の因子、特に、投与経路、投与期間、投与時間、化合物の排せつ速度、化合物と組み合わせて用いられる様々な製品、患者の年齢、体重、健康状態および病歴、並びに医学において知られている他の任意の情報に依存するであろう。

典型的には、化合物は、投与当たり１μｇ〜２ｇ、好ましくは投与当たり０．１ｍｇ〜１ｇの間で変動する用量で投与される。その上、本発明の組成物はさらに、前述のような他の薬剤または活性成分を含み得る。本発明の組成物はまた、１以上の医薬的に許容される賦形剤または担体も含み得る。医薬的用途に適応し、かつ当業者に知られている、例えば、生理食塩水、生理溶液、等張液および緩衝溶液等が挙げられてもよい。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤等から選ばれる１以上の薬剤または担体を含み得る。

本発明はまた、対象において脂質異常症を予防または治療するための方法にも関し、該方法は、該脂質異常症を予防または治療するために、脂質異常症に罹患した、または脂質異常症を発症する可能性がある対象に、本明細書に記載の対象化合物または対象組成物を投与することを特徴とする。

本発明はさらに、代謝症候群、代謝症候群に典型的な症状または異常、および２型糖尿病から選ばれる病的状態を、対象において予防するための、あるいは罹患している対象において治療するための、方法に関する。これらの方法は全て、該病的状態を予防または治療するために、そのような病的状態に罹患した、またはそのような病的状態を発症する可能性がある対象に、本明細書に記載の対象化合物または対象組成物を投与するステップを含む。

Ａ／酵母株および哺乳類細胞株
表１に記載されているサッカロマイセス・セレヴィシエ酵母株は、細胞のリン脂質の脂肪酸含有量の解析のため、および、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）誘発試験のため、毒性を実証するための様々な生育回復試験のために用いる。
ＵＰＲ活性化状態、および脂肪中毒により誘導される細胞死もまた、ラットの膵β細胞株ＢＲＩＮ−ＢＤ１１においても解析した。
さらに、カルシウム動員試験はヒト上皮細胞ＣＦＢＥにおいて実施し、インスリン成熟実験はマウスの膵β細胞株ＭＩＮ６において実施した。

Ｂ／ｈｅｍ１Δ酵母の脂肪中毒
ｈｅｍ１Δ突然変異を持つ株を、液体ＹＰＧ^Ａ培地（８０μｇ／ｍｌ δ−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）を添加したＹＰＧ（１％酵母エキス（ｗ／ｖ）、１％ペプトン（ｗ／ｖ）、および２％グルコース（ｗ／ｖ））中、好気条件下、２８℃で振とう培養する。飽和脂肪酸（ＳＦＡ）による脂肪中毒は、ＹＰＧ^＋培地（この条件下でもたらされるステロールの枯渇を相殺するために、８０μｇ／ｍｌ エルゴステロールを添加したＹＰＧ）に移すことにより、不飽和脂肪酸（ＵＦＡ）−その合成はヘム（特にＯｌｅ１ｐ酵素の補欠分子族）の存在に依存する−が枯渇することにより、引き起こされる。脂肪中毒は、ｃｍ^２当たり３５００の細胞（ＹＰＧ^Ａ中にて前培養したｈｅｍ１Δ）を移すことにより２％寒天（ｗ／ｖ）を含む固形ＹＰＧ^＋培地上で、あるいは２・１０^６細胞／ｍｌ ＹＰＧ^＋を植菌することにより液体培地中にて、誘導し得る。古典的に、ＳＦＡ脂肪中毒の効果は、ＹＰＧ^＋培地に移してから７時間後に解析する。ＳＦＡ脂肪中毒の有害効果に対抗する化合物の能力は、順に、細胞を播種した後、この化合物をＹＰＧ^＋トランスファー培地上（または該培地中）に加え、引き続いて評価する。

Ｃ／パルミチン酸によるラットの膵β細胞の脂肪中毒
１）脂質試薬の調製：
脂質種は、エタノール中にて調製した後、３７℃で１時間インキュベートすることにより、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、初めは脂肪酸を枯渇している）と複合体を形成させる。当体積のエタノールを加え、全量を７０℃に加熱して均一にすることにより、パルミチン酸の原液を得る。ＯＡＧおよびＬＰＡ溶液は、室温で１００％エタノール中にて調製する。哺乳類細胞のインキュベーションには、培地中のＢＳＡおよびエタノールの終末濃度をそれぞれ、１％および０．５％（ｗ／ｖ）に保つ。

２）細胞の生存試験：
ラットの膵β細胞株（ＢＲＩＮ−ＢＤ１１）を、１１ｍＭ グルコースを含み、かつ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中にて培養する。各実験ごとに、初めに、細胞を、６−ウェルプレート内に０．５・１０^５細胞／ｍｌの密度で２４時間播種する。その後、完全培地を、ＦＣＳは含まないがＢＳＡと複合体を形成させた所望の濃度の対象脂質試薬を含む等価物に置き換える。対照条件下でも、同じ量のＢＳＡおよびエタノールを用いる。インキュベーションの終わりに全ての細胞（死細胞および生細胞）を集め、３００ｇで５分間遠心分離する。次いで細胞ペレットを２００μｌの培地に再懸濁し、次いで２０μｇ／ｍｌ ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液を含む２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、１０ｍＭ アジ化ナトリウム）を加えることにより、ＰＩを用いて、死細胞（完全性が失われた細胞膜を持つ）のＤＮＡを染色する。氷上で１０分間インキュベートした後、このようにして得たサンプルをフローサイトメトリーにより解析する。定量には、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＥＰＩＣＳ ＸＬ ＭＣＬを用い、ＤＮＡにインターカレートしたＰＩの発光の検出には、ＦＬ３チャンネルを用い、解析は、ＥＸＰＯ３２ ＡＤＣソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖ １．１ ｂｕｉｌｄ ２０７）を用いて実施する。

３）ウェスタンブロッティング：
ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞を、Ｔ２５フラスコ内に０．５・１０^５細胞／ｍｌの密度で２４時間播種する。次いで、上記で示したように、完全培地を、ＦＣＳは含まないが対象脂質試薬を含む同等のものに置き換える。６時間インキュベートした後、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ）を用いて、総タンパク質を抽出する。次いでこれらのタンパク質を１２％ＮｕＰＡＧＥ（登録商標） Ｎｏｖｅｘ（登録商標） ビス−トリスゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）アクリルアミド・ゲル上で電気泳動した後、ＰＶＤＦ膜に転写し、次いで１／１０００に希釈した抗−リン酸化−ｅＩＦ２α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））を用いてプローブする。次に、緩衝液Ｒｅ−Ｂｌｏｔ Ｐｌｕｓ−Ｓｔｒｏｎｇ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて膜をストリップした後、１／１０００に希釈した抗−総ｅＩＦ２α抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて２回目のプローブをする。リン酸化された、またはリン酸化されていない形態のｅＩＦ２αタンパク質の相対存在量の密度解析は、Ｑｕａｎｔｉｆｙ Ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ ＵＫ Ｌｔｄ）と組み合わせた、Ｆｌｕｏｒ−Ｓ ＭｕｌｔｉＩｍａｇｅｒ解析システムを用いて実施する。

Ｄ／インスリン成熟のモニタリング（図９を参照のこと）
ＢＲＩＮ−ＢＤ１１細胞の脂肪中毒について上記した方法で、ＭＩＮ６細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、および１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを添加した、完全ＤＭＥＭ−Ｈｉｇｈ グルコース培地（６ｍＭ）中にて培養し、脂肪中毒を、対象化合物の添加ありまたはなしで、ＢＳＡ（終末濃度０．９２％（ｗ／ｖ））に結合している４００μＭ パルミチン酸に４８時間暴露することにより、誘導する（Boslem et al., 2011を参照のこと）。次いで細胞を集め、プロインスリンからインスリンへの成熟を観察するために、抗インスリン抗体を用いて、上記で示したようにウェスタンブロットを実施する。

Ｅ／カルシウム動員試験（図７を参照のこと）
ヒト上皮細胞系、ＣＦＢＥを、ガラスボトムディッシュ上、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン、および０．５μｇ／ｍｌ ピューロマイシンを添加したＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１培地（αＭＥＭ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて培養する。初めに、細胞に、３μＭ 蛍光カルシウムプローブ、フルオ−４−アセトキシメチル エステル（ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（登録商標））を室温で２０分間添加した。次いで、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１倒立顕微鏡を用いて、２５０ｍｓシーケンスのレーザー刺激で４分間、対象領域について蛍光強度の変化を取得することにより、カルシウム動員を記録する。次いで、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ４．８．２ソフトウェア、および関連する生理取得モジュールを用いて、集めたデータを解釈する。最後に、時間ｔ（Ｆ）での各ピクセルにおける強度を、刺激（Ｆ_０）前の該ピクセルにおける蛍光強度で割ることにより、強度プロファイルを標準化する。このようにして得られた画像（（Ｆ−Ｆ_０）／Ｆ_０）により、全記録にわたるカルシウム強度／動員のプロファイルを得ることができる（Vachel et al., 2013を参照のこと）。

Ｆ／生育の回復
１）化合物のスクリーニング：
ＳＦＡ脂肪中毒の誘導（固形培地上で培養したｈｅｍ１Δに対する）に続いて、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはエタノール（ＥｔＯＨ）中に様々な化合物を１０ｍＭで含む溶液の５μｌ滴を、寒天の表面上に沈着させる。脂質により誘導される細胞の生育の停止に対抗する化合物の能力は、該化合物の沈着部位に、２８℃で培養した３日後に、ｈｅｍ１Δコロニーのハローが出現することにより、推定する（Deguil et al., 2011を参照のこと）。

２）増殖動態：ＳＦＡ脂肪中毒の誘導（液体培地中のｈｅｍ１Δに対する）と共に、様々な化合物を２００μＭの初期濃度で培養液に加える。一定時間ごとに細胞密度を分光測光することにより、増殖をモニターする（観察期間にわたって１時間ごと）。６００ｎｍの波長での１吸光度単位（ＯＤ_{６００ｎｍ}）は、２・１０^７細胞／ｍｌに対応する。

Ｇ／毒性試験
野生型（ＷＴ）および４重変異（ＱＭ）株を、同時に、液体ＹＰＧ培地中、好気条件下、２８℃で振とう培養した後、ｃｍ^２当たり３５００の細胞をＹＰＧ＋２％寒天（ｗ／ｖ）に播種する。このように固形培地に移した後、ＤＭＳＯまたはＥｔＯＨ中に様々な化合物を１、１０、および１００ｍＭで含む溶液の１μｌ滴を、寒天表面上に沈着させる。別に、ＤＭＳＯおよびＥｔＯＨもまた、これら２つの溶媒の内因性の毒性を評価するために、沈着させる。２８℃で培養した３日後に、純粋溶媒の沈着に対して得られた生育阻害のハロー直径を、様々な濃度の試験化合物の沈着についてのものと比べることにより、試験化合物の毒性を評価する。ＷＴ株とは異なり、ＱＭ株は、過剰な外因性のオレイン酸を脂肪滴内の中性脂肪（トリグリセリド（ＴＧ）またはエステル化ステロール（ＥＳ））の形態で緩衝する能力がない。従って、ＷＴ株に対して毒性がない場合に、ＱＭ株に対しては化合物の毒性が観察されることは、この化合物が、酵母により遊離脂肪酸源として認識されていることを示している。

Ｈ／総脂質の抽出
ｈｅｍ１Δ株を、２・１０^６細胞／ｍｌの初期細胞濃度から、液体培地（ＹＰＧ^Ａ、ＹＰＧ^＋、またはＹＰＧ^＋＋２００μＭ 試験化合物）中、好気条件下、２８℃で７時間振とう培養する。総脂質の抽出を実施するため、培養の終わりに１０^８の細胞を集める。細胞を４℃で１ｍｌの蒸留水中に懸濁した後、５００μｌのガラスビーズ（φ０．６ｍＭ）を加え、次いで全量を振とう機内で５０００ｒｐｍで２０秒の３回のシーケンス（３回の各シーケンス間、チューブを氷上で保つ）に供する。その結果得られた細胞溶解物にビーズ洗浄溶液（１ｍｌ）を添加し、次いで４０ｍｌガラスチューブ（Ｃｏｒｅｘ（商標））に移した後、２：１（ｖ／ｖ）のメタノール：クロロホルム比を用いて脂質抽出を実施する。初めに６ｍｌのメタノールを加えて全量を３０秒間ボルテックスし、次いで６５℃で１５分間インキュベートする。混合液を室温に冷却したら、３ｍｌのクロロホルムを加え、次いで全量を再び３０秒間ボルテックスした後、抽出を１６時間進行させる。その後、サンプルを１００００ｇで１２分間遠心分離した後、上清を新しいＣｏｒｅｘ（商標）チューブに移す。２ｍｌのクロロホルム、次いで４ｍｌの蒸留水を加えた後、全量を３０秒間ボルテックスし、次いで３０００ｇで８分間遠心分離する。得られた上層を除去した後、下層の有機相をガラス溶血チューブ内に集める。最後に、総細胞脂質サンプルを得るため、窒素気流下、８０℃で溶媒を留去する。

Ｉ／リン脂質の精製および質量分析解析
総細胞脂質サンプルを、３０秒間ボルテックスしながら、１ｍｌのジクロロメタンに再懸濁する。３ｍｌのメタノール、次いで２ｍｌのジクロロメタンを連続して用いて予め調整したシリカカラム（ＢＯＮＤ ＥＬＵＴ−ＳＩ、１００ｍｇ １ｍｌ）上に、全量を沈着させる。次いで、カラムにより保持されているフラクションを、２ｍｌのジクロロメタン、次いで３ｍｌのアセトンを連続して用いて洗浄する。最後に、２ｍｌの５０：４５：５（ｖ／ｖ／ｖ）クロロホルム／メタノール／水混合液をカラム上に沈着させ、その結果溶出されたリン脂質をガラス溶血チューブ内に集める。細胞リン脂質サンプルを得るため、窒素下、８０℃で溶媒を留去する。
１００μｌの混合液Ｍｉｘ⁻（２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）イソプロパノール／アセトニトリル／水＋１％（ｖ／ｖ）トリエチルアミン）、または混合液Ｍｉｘ^＋（２：１：１（ｖ／ｖ／ｖ）イソプロパノール／アセトニトリル／水＋１％（ｖ／ｖ）ギ酸）に再懸濁したら、サンプルを、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により、ネガティブまたはポジティブモードでそれぞれ解析し、得られた結果を、様々なリン脂質種の脂肪酸含有量を分析するために用いる。

Ｊ／ＵＰＲ誘発試験
プラスミドｐＰＷ３４４［２μ ＵＲＡ３ ４×ＵＰＲＥ−ｌａｃＺ（Patil et al., 2004）を参照のこと）］により形質転換したｈｅｍ１Δ株を、２・１０^６細胞／ｍｌの初期細胞濃度から、液体培地（ＹＰＧ^Ａ、ＹＰＧ^＋、またはＹＰＧ^＋＋２００μＭ 試験化合物）中、好気条件下、２８℃で７時間振とう培養する。ｌａｃＺ導入遺伝子の発現（ＵＰＲ活性化の場合）から得られたβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）活性を定量するために、培養の終わりに１０^８の細胞を集める。初めに、細胞を１．５ｍｌのＺバッファー（６０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、４０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、および５０ｍＭ β−メルカプトエタノール；溶液のｐＨは７）に再懸濁し、次いでこの懸濁液の１／１５を、ＯＤ_{６００ｎｍ}測定を実施するのに用いる。次に、懸濁液に、１００μｌの０．１％（ｖ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、および２００μｌのクロロホルムを添加し、次いで連続する２回の３０秒シーケンスでボルテックスする。デカンテーションした後、このようにして得られた溶液の４００μｌ（体積 Ｖ）をガラス溶血チューブに移し、次いで６００μｌのＺバッファーを添加する。次いで４ｍｇ／ｍｌの基質オルト−ニトロフェニル−β−ガラクトシド（ＯＮＰＧ）を含む２００マイクロリッターのＺバッファーを加えた後、全量をボルテックスを用いて均質にし、次いで反応を開始させるために３０℃の水浴内でインキュベートする。全量が淡黄色がかったら、５００μｌの１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３を加えることにより、室温で反応をクエンチする（時間ｔにて）。最後に、サンプルを８００ｇで５分間遠心分離し、次いで上清を新しいガラス溶血チューブ内に集めた後、反応生成物（ｏ−ニトロフェノール）および細胞残渣を、分光分析により、４２０ｎｍおよび５５０ｎｍの波長でそれぞれ分析する。各サンプルについて、任意単位で表される式Ｕ＝（１０００×［ＯＤ_{４２０ｎｍ}−（１．７５×ＯＤ_{５５０ｎｍ}）］）／（ｔ×Ｖ×ＯＤ_{６００ｎｍ}）を用いて、β−ｇａｌ活性（Ｕ）を計算する。

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Claims (7)

1. マンニド モノオレート、３−ヒドロキシ−２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピル オレート、およびＮ，Ｎ−ジエタノールオレアミドから選ばれる化合物を含む、対象において２型糖尿病の予防または治療に用いるための剤。
2. 化合物が、２型糖尿病の予防または治療に伝統的に用いられる別の化合物と組み合わせて使用される、請求項１に記載の剤。
3. 別の化合物が、ビグアナイド、グリタゾン、スルホンアミドをベースとする血糖降下薬、グリニド、ＤＰＰ−４阻害剤、インクレチン模倣薬、およびα−グルコシダーゼ阻害剤から選ばれる、請求項２に記載の剤。
4. 対象が動物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤。
5. 対象が哺乳類である、請求項４に記載の剤。
6. 対象がヒトである、請求項４に記載の剤。
7. 医薬組成物、機能性食品または食品サプリメントである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の剤。