BR112016005611B1 - Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, ácido nucleico, sequência alvo, proteína, vacina, agente imunogênico, conjugado, inibidor de uma calreticulina mutante e seus usos - Google Patents

Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, ácido nucleico, sequência alvo, proteína, vacina, agente imunogênico, conjugado, inibidor de uma calreticulina mutante e seus usos Download PDF

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Abstract

método para avaliar se um pacientesofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência asofrer de uma malignidade mieloide, ácido nucleico,sequência alvo, proteína, vacina, agente imunogênico,conjugado, inibidor de uma calreticulina mutante eseus usos. a presente invenção refere-se a um método paradiagnosticar uma malignidade mieloide compreendendo determinar apresença de um alelo mutante do gene da calreticulina. tambémsequências genômicas, sequências de cdna, sequências de mrna esequências proteicas da calreticulina mutante constituem a matéria dapresente invenção. além disso, a invenção refere-se a usos clínicos deinibidores de calreticulina mutante.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um método para diagnosticar uma malignidade mieloide compreendendo determinar a presença de um alelo mutante do gene da calreticulina. Também sequências genômicas, sequências de cDNA, sequências de mRNA e sequências proteicas da calreticulina mutante constituem a matéria da presente invenção. Além disso, a invenção refere-se a usos clínicos de inibidores de calreticulina mutante.
[002] Mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (ET) e policitemia vera (PV) são distúrbios hematológicos monoclonais que pertencem aos neoplasmas mieloproliferativos (MPN) negativos para BCR-ABL clássicos (Campbell & Green, 2006). Desde a descoberta em 2005 de uma mutação somática no gene da quinase JAK2, já foi feito um enorme progresso em diagnóstico molecular, abordagem clínica, tratamento e compreensão molecular dos MPN. A mutação de valina para fenilalanina (V617F) ativa constitutivamente a quinase Jak2 resultando em fosforilação aumentada de seus substratos (Stat5, Stat3, Erk, etc.) e levando à responsividade aumentada de células mieloides a citocinas (Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Kralovics et al., 2005; Levine et al., 2005). Logo seguiu-se a identificação de mutações adicionais tal como no éxon 12 da JAK2 em PV (Scott et al., 2007) e no gene MPL do receptor de trombopoietina em PMF e ET (Pardanani et al., 2006; Pikman et al., 2006). Embora as três entidades das doenças do tipo MPN sejam diferentes em sua apresentação clínica, elas compartilham muitos aspectos moleculares assim como aspectos clínicos. A mutação JAK2-V617F está presente em cerca de 95% dos casos de PV, 60% dos casos de PMF e 50% dos casos de ET, respectivamente. As mutações no éxon 12 da JAK2 são específicas para cerca de 3% dos casos de PV enquanto as mutações no MPL são restritas a PMF (5%) e ET (3%). Todas as três entidades de MPN são predispostas a um grau variável de trombose, sangramento e transformação leucêmica (Sverdlow et al., 2008). Apesar de os pacientes poderem permanecer na fase crônica do MPN por vários anos, a evolução da doença ocorre na forma de mielofibrose secundária em PV e ET, desenvolvimento de fase acelerada com grau variável de pancitopenia seguida por transformação leucêmica afetando todas as três entidades de MPN (Sverdlow et al., 2008).
[003] Mutações somáticas acumulam-se durante toda a evolução clonal das células-tronco hematopoieticas de MPN. Estas alterações genéticas adquiridas podem ser mutações pontuais, lesões cromossômicas e defeitos epigenéticos e todas elas podem ser contribuir para a adequação do clone em evolução (Klampfl et al., 20 11; Kralovics, 2008). Estas mutações podem acelerar a proliferação por vários meios, diminuir o potencial de diferenciação de progenitores ou deixá-los menos suscetíveis à apoptose. Mutações que afetam esses mecanismos já foram descritas em genes tais como TET2 (Delhommeau et al., 2009), EZH2 (Ernst et al., 2010), DNMT3A (Stegelmann et al., 2011), ASXL1 (Stein et al., 20 11), e TP53 (Harutyunyan et al., 2011) em diferentes tipos de malignidades mieloides incluindo MPN (Milosevic & Kralovics, 2013). No entanto, até agora somente as mutações de JAK2 e MPL são consideradas fortemente associadas a MPN e elas representam os marcadores moleculares mais úteis de MPN.
[004] Apesar do progresso feito na compreensão da patogênese molecular de MPN aproximadamente metade dos pacientes com PMF e ET não têm um marcador molecular para o diagnóstico uma vez que estes pacientes são negativos tanto para as mutações de JAK2 quanto para as de MPL.
[005] Por conseguinte, o problema técnico subjacente à presente invenção é oferecer meios e métodos para o diagnóstico de uma malignidade mieloide.
[006] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo
[007] - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e
[008] - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[009] O problema técnico é resolvido com a oferta das modalidades caracterizadas nas reivindicações.
[0010] A presente invenção resolve o problema técnica identificado acima uma vez que, como documentado mais adiante e nos exemplos em anexo, foi surpreendentemente descoberto que pacientes que sofrem de uma malignidade mieloide, preferivelmente mielofibrose primária (PMF) e trombocitemia essencial (ET), possuem mutações somáticas no gene da calreticulina (CALR). Uma outra descoberta surpreendente foi que essas mutações somáticas específicas para células mieloides no gene da CALR em pacientes com MPN estão fortemente associadas àqueles pacientes que são negativos para as mutações de JAK2 e MPL (a doença previamente descrita causando mutações em MPN). Como mostrado neste relatório, as mutações em CALR são encontradas em 88% dos casos de PMF, e em 68% dos casos de ET duplo negativos para JAK2 e MPL. Por conseguinte, a presente invenção oferece um diagnóstico confiável de malignidades mieloides. A invenção é especialmente útil para pacientes para os quais não existem marcadores confiáveis, tais como pacientes que são negativos para mutações em JAK2 e MPL.
[0011] Além disso, foi constatado nesta invenção que as mutações somáticas oferecidas nesta invenção no gene da calreticulina (CALR) resultam em um termina C da proteína calreticulina que tem características completamente diferentes em comparação com a proteína calreticulina do tipo selvagem. Acredita-se que estas características diferentes causam ou contribuem para o desenvolvimento de uma malignidade mieloide, preferivelmente mielofibrose primária (PMF) e trombocitemia essencial (ET).
[0012] Todas as mutações em CALR identificadas nesta invenção são no último éxon 9 codificando os aminoácidos C-terminais da proteína e são predominantemente mutações por inserção/deleção. A maioria das mutações estavam presentes em um estado heterozigótico e elas causam um "frameshift" para uma fase de leitura aberta alternativa (fase alternativa 1 como mostrado na Figura 3A). Este "frameshift" resulta na substituição dos aminoácidos C-terminais negativamente carregados (ricos em ácido aspártico e em ácido glutâmico) da calreticulina por um polipeptídeo predominantemente carregado positivamente rico em arginina e metionina. Além disso, os 4 últimos aminoácidos da calreticulina (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) contêm o sinal de retenção do retículo endoplasmático. Este sinal está ausente na calreticulina mutante sugerindo que a proteína mutante é menos representado no ER em comparação à proteína do tipo selvagem. Como o C-terminal carregado negativamente da calreticulina é um domínio de ligação de Ca2+ de baixa afinidade e alta capacidade, acredita-se que a função de ligação de Ca2+ da proteína mutante é perdida. Foi demonstrado nesta invenção que as mutações predominantes de CALR são mutações do tipo 1 e do tipo 2 conforme definido neste relatório; vide Fig. 3E. Estes mutantes e seu uso de acordo com a presente invenção são, portanto, preferidos. Sequências de ácidos nucleicos codificando o C-terminal e a sequência de aminoácido do C-terminal de mutações em CALR do tipo 1 e do tipo 2 estão mostradas nas SEQ ID NOs: 5 a 12. Outros ácidos nucleicos de mutações em CALR do tipo 1 e do tipo 2 estão descritos neste relatório.
[0013] A presente invenção refere-se aos seguintes itens:
[0014] 1. Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo
[0015] - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e
[0016] - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[0017] 2. Método de acordo com o item 1, em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante.
[0018] 3. Método de acordo com o item 2, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0019] 4. Método de acordo com o item 2 ou 3, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0020] 5. Método de acordo com qualquer um dos itens 2 a 4, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0021] 6. Método de acordo com qualquer um dos itens 2 a 5, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0022] 7. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 6, onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão em uma região que abrange o éxon 9 do gene da calreticulina.
[0023] 8. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 7, onde o referido alelo mutante possui uma mutação "frameshift" em comparação com o gene da calreticulina do tipo selvagem.
[0024] 9. Método de acordo com o item 8, onde a referida mutação "frameshift" está no éxon 9 do gene da calreticulina.
[0025] 10. Método de acordo com o item 8 ou 9, onde a referida mutação "frameshift" é a deleção de um nucleotídeo ou a adição de dois nucleotídeos.
[0026] 11. Método de acordo com qualquer um dos itens 8 ou 9, onde (1 + (3xn0)) nucleotídeos são deletados do gene da calreticulina.
[0027] 12. Método de acordo com qualquer um dos itens 8, 9 e 11, onde 1, 4, 19, 22, 31, 34, 46, 52 nucleotídeos são deletados.
[0028] 13. Método de acordo com qualquer um dos itens 8, 9, 11 e 12,
[0029] em que 1 nucleotídeo é deletado e em que 6 nucleotídeos são inseridos;
[0030] em que 2 nucleotídeos são deletados e em que 4 nucleotídeos são inseridos;
[0031] em que 3 nucleotídeos são deletados e em que 5 nucleotídeos são inseridos;
[0032] em que 12 nucleotídeos são deletados e em que 5 nucleotídeos são inseridos;
[0033] em que 18 nucleotídeos são deletados e em que 11 nucleotídeos são inseridos;
[0034] em que 18 nucleotídeos são deletados e em que 14 nucleotídeos são inseridos;
[0035] em que 20 nucleotídeos são deletados e em que 1 nucleotídeo é inserido;
[0036] em que 28 nucleotídeos são deletados e em que 6 nucleotídeos são inseridos;
[0037] em que 35 nucleotídeos são deletados e em que 1 nucleotídeo é inserido; ou
[0038] em que 36 nucleotídeos são deletados e em que 2 nucleotídeos são inseridos.
[0039] 14. Método de acordo com o item 8 ou 9, onde (2 + (3xn0)) nucleotídeos são inseridos no gene da calreticulina.
[0040] 15. Método de acordo com o item 14, em que 5 nucleotídeos são inseridos.
[0041] 16. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 15, em que o referido gene da calreticulina compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 290; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 289; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0042] 17. Método de acordo com qualquer um dos itens 10 a 16, em que os referidos nucleotídeos são deletados de e/ou inseridos no éxon 9 do gene da calreticulina.
[0043] 18. Método de acordo com qualquer um dos itens 9 a 17, em que o referido éxon 9 do gene da calreticulina compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:436; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO:435; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0044] 19. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 18, em que o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0045] 20. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 19, em que o referido alelo mutante é DNA, preferivelmente DNA genômico.
[0046] 21. Método de acordo com o item 20, em que a presença do referido DNA é determinada por sequenciamento.
[0047] 22. Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo
[0048] - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e
[0049] - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando o produto genético está presente.
[0050] 23. Método de acordo com o item 22,
[0051] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante.
[0052] 24. Método de acordo com o item 23, em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (f) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (g) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (h) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (j) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (k) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0053] 25. Método de acordo com o item 23 ou 24, em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0054] 26. Método de acordo com qualquer um dos itens 23 a 25, em que a referida proteína calreticulina é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0055] 27. Método de acordo com qualquer um dos itens 23 a 26, em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) em que um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0056] 28. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 27,em que o referido alelo compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 3 11, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0057] 29. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 28, onde o referido produto genético compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0058] 30. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 29, em que o referido produto genético compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0059] 31. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 30, onde o referido produto genético compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0060] 32. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 31, em que o referido produto genético compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 2 11, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0061] 33. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 28, em que o referido produto genético compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0062] 34. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 28 e 33, onde o referido produto genético compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0063] 35. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 28, 33 e 34, onde o referido produto genético compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico sendo degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0064] 36. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 28, e 33 a 35, em que o referido produto genético compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0065] 37. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 36, em que o referido produto genético é mRNA.
[0066] 38. Método de acordo com o item 37, em que a presença ou a quantidade do referido mRNA é determinada por PCR em tempo real, PCR de transcriptase reversa, sequenciamento por shotgun do transcriptoma inteiro (RNAseq), hibridização in situ ou microarranjos.
[0067] 39. Método de acordo com o item 38, em que a determinação por PCR em tempo real ou PCR de transcriptase reversa compreende ainda as etapas de
[0068] (i) contatar o ácido nucleico na amostra com um ou dois oligonucleotídeos:
[0069] (ii) gerar um produto de amplificação contendo a sequência alvo.
[0070] 40. Método de acordo com qualquer um dos itens 22 a 28, e 33 a 36, em que o referido produto genético é uma proteína.
[0071] 41. Método de acordo com o item 40, em que a presença ou quantidade da referida proteína é determinada por imuno-histoquímica (IHC), por imunoensaio, métodos à base de gel ou mancha, IHC, espectrometria de massas, citometria de fluxo, ou FACS.
[0072] 42. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 41, em que o referido paciente é um paciente humano.
[0073] 43. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 42, em que a referida amostra é uma amostra de medula óssea.
[0074] 44. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 42, em que a referida amostra é uma amostra de sangue.
[0075] 45. Método de acordo com o item 43 ou 44, em que a referida amostra de medula óssea é obtida por biópsia.
[0076] 46. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 45, compreendendo ainda administrar um inibidor de uma calreticulina mutante ao paciente.
[0077] 47. Ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 2; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0078] 48. Ácido nucleico de acordo com o item 47, em que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, ou 142; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0079] 49. Ácido nucleico de acordo com o item 47 ou 48, onde o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, 352, 356, 360, 364, 368, 372, 376, 380, 384, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428, ou 432; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0080] 50. Ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 47 a 49, em que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 258, 262, 266, 270, 274, 278, 282, ou 286; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0081] 51. Ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 47 a 50, onde o referido ácido nucleico é cDNA.
[0082] 52. Um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0083] 53. Ácido nucleico de acordo com o item 52, em que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0084] 54. Ácido nucleico de acordo com o item 52 ou 53, onde o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0085] 55. Ácido nucleico de acordo com o item 52 ou 54, em que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0086] 56. Ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 52 a 55, em que o referido ácido nucleico é mRNA.
[0087] 57. Ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0088] 58. Ácido nucleico de acordo com o item 57, em que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137,or 141; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0089] 59. Ácido nucleico de acordo com o item 57 ou 58, onde o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0090] 60. Ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 57 a 59, em que o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, ou 285; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[0091] 61. Ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 57 a 60, em que o referido ácido nucleico é DNA genômico.
[0092] 62. Proteína selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0093] 63. Proteína de acordo com o item 62, onde a referida proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0094] 64. Proteína de acordo com o item 62 ou 63, em que a referida proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0095] 65. Proteína de acordo com qualquer um dos itens 62 a 64, onde a referida proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[0096] 66. Vacina compreendendo a proteína de acordo com o item 62 ou 63.
[0097] 67. Anticorpo que se liga especificamente à proteína de qualquer um dos itens 62 a 65.
[0098] 68. siRNA que visa especificamente o ácido nucleico de qualquer um dos itens 52 a 56.
[0099] 69. siRNA de acordo com o item 68, em que o referido siRNA consiste em uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos dez bases contíguas.
[00100] 70. siRNA de acordo com o item 68 ou 69, onde até 10 % das bases contíguas são não-complementares.
[00101] 71. siRNA de acordo com qualquer um dos itens 68 a 70, onde o referido siRNA compreende ainda pelo menos uma base na extremidade 5' e/ou pelo menos uma base na extremidade 3'.
[00102] 72. Inibidor de uma calreticulina mutante para uso no tratamento de uma malignidade mieloide.
[00103] 73. Método para tratar um paciente com uma malignidade mieloide compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de uma calreticulina mutante ao paciente.
[00104] 74. Inibidor de acordo com o item 72, ou método de acordo com o item 46 ou 73, onde a referida calreticulina mutante é uma proteína calreticulina mutante definida em qualquer um dos itens 62 a 65.
[00105] 75. Inibidor de acordo com o item 72 ou 74, ou método de acordo com qualquer um dos itens 56, 73 ou 74, onde o referido inibidor é um anticorpo.
[00106] 76. Inibidor de acordo com o item 72 ou 74, ou método de acordo com qualquer um dos itens 56, 73 ou 74, onde o referido inibidor é selecionada do grupo que consiste em parceiros de ligação extracelulares, moléculas de ligação pequenas, aptâmeros, e intrâmeros.
[00107] 77. Inibidor de acordo com o item 72, ou método de acordo com o item 46 ou 73, onde a referida calreticulina mutante é um ácido nucleico definido em qualquer um dos itens 52 a 56.
[00108] 78. Inibidor de acordo com o item 72 ou 77, ou método de acordo com qualquer um dos itens 46, 73 e 77, onde o referido inibidor é selecionada do grupo que consiste em siRNA, miRNA, dsRNA, shRNA, stRNA, e moléculas antissenso.
[00109] 79. Inibidor de acordo com qualquer um dos itens 72, e 74 a 78; ou método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 46 e 73 a 78, onde a referida malignidade mieloide é um neoplasma mieloproliferativo.
[00110] 80. Inibidor de acordo com o item 79; ou método de acordo com o item 79, onde o referido neoplasma mieloproliferativo é mielofibrose primária (PMF).
[00111] 81. Inibidor de acordo com o item 79; ou método de acordo com o item 79, onde o referido neoplasma mieloproliferativo é trombocitemia essencial (ET).
[00112] 82. Inibidor de acordo com qualquer um dos itens 72, e 74 a 78; ou método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 46 e 73 a 78, onde a referida malignidade mieloide é uma síndrome mielodisplásica.
[00113] 83. Inibidor de acordo com o item 82; ou método de acordo com o item 82, onde a referida síndrome mielodisplásica é anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T).
[00114] 84. Inibidor de acordo com qualquer um dos itens 72, e 74 a 83; ou método de acordo com qualquer um dos itens 73 to 83, onde o paciente a ser tratado é avaliado como sofrendo de uma malignidade mieloide ou como tendo tendência a sofrer de uma malignidade mieloide de acordo com qualquer um dos itens 1 a 46.
[00115] 85. Proteína de acordo com o item 62 ou 63, o anticorpo de acordo com o item 67, o siRNA de acordo com qualquer um dos itens 68 a 71 ou um inibidor de uma calreticulina mutante definido em qualquer um dos itens 72 a 78 para uso como medicamento.
[00116] 86. Vetor compreendendo o ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 47 a 51 e 57 a 61.
[00117] 87. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico de acordo com qualquer um dos itens 47 a 51 e 57 a 61 ou o vetor de acordo com o item 86.
[00118] 88. Processo para a produção do polipeptídeo de acordo com qualquer um dos itens 62 a 65, o referido processo compreendendo cultivar células hospedeiras de acordo com o item 87 em condições que permitam a expressão do polipeptídeo e recuperar o polipeptídeo produzido a partir da cultura.
[00119] A detecção das mutações em CALR oferecidas nesta invenção no nível de DNA genômico, RNA, cDNA e proteína é útil para o diagnóstico de uma malignidade mieloide, por exemplo, se um paciente tem uma malignidade mieloide, qual o tipo de malignidade mieloide, e aspectos específicos da doença.
[00120] Conforme usado neste relatório, "diagnóstico" refere-se, inter alia, à identificação da natureza de uma doença ou à identificação de um problema fisiológico ou patofisiológico subjacente a um sintoma. Assim sendo, "diagnóstico de uma malignidade mieloide" refere-se a determinar (a) se um paciente tem uma malignidade mieloide e/ou (b) quais os tipos de malignidade mieloide e/ou (c) aspectos da malignidade mieloide específica. O diagnóstico pode ser feito por exemplo com base em exame dos sintomas e/ou testes complementares (por exemplo testes citogenéticos ou moleculares).
[00121] O termo "avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide" e "diagnosticar uma malignidade mieloide" podem ser usados intercambiavelmente neste relatório. O diagnóstico também pode compreender ou estar relacionado com a avaliação se um paciente tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, i.e., se o paciente corre o risco de desenvolver uma malignidade mieloide.
[00122] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00123] Os métodos oferecidos nesta invenção podem compreender uma etapa de obtenção de uma amostra do paciente. "Obtenção" pode abranger o recebimento de uma amostra que é fornecida por terceiros. Por exemplo, sangue ou medula óssea podem ser retirados de um paciente, colocados em um recipiente apropriado, e então oferecidos para análise.
[00124] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - obter uma amostra do referido paciente; - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00125] De acordo com a presente invenção, um paciente é avaliado "positivo" para uma malignidade mieloide, se um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estiverem presentes em uma amostra, preferivelmente uma amostra de sangue, do referido paciente.
[00126] O termo "malignidade mieloide" conforme usado neste relatório refere-se a doenças hematológicas clonais que afetam as linhagens de sangue mieloide incluindo aquelas com curso clínico crônico e aquelas com curso clínico agudo. Malignidades mieloides incluem neoplasmas mieloproliferativos, síndromes mielodisplásicas e leucemias mieloides agudas. É preferível nesta invenção que a malignidade mieloide seja um neoplasma mieloproliferativo, particularmente mielofibrose primária (PMF) ou trombocitemia essencial (ET), ou uma síndrome mielodisplásica, particularmente anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T).
[00127] Portanto, o diagnóstico de malignidade mieloide pode ser diagnosticar ainda subtipos da doença. Em outras modalidades, o diagnóstico utiliza testes adicionais combinados, tais como química sanguínea, citologia, e análise genética. Dependendo da natureza do neoplasma mieloproliferativo, testes diagnósticos adicionais podem incluir determinação da massa de células vermelhas (para policitemia), aspiração da medula óssea e biópsia por trefina, nível de saturação de oxigênio arterial e nível de carbóxi-hemoglobina, nível de fosfatase alcalina neutrofílica, vitamina B12 (ou capacidade de ligação de B12) e uratos no soro. Testes genéticos têm se mostrado cada vez mais importantes em diagnóstico.
[00128] Os testes que se seguem são feitos tradicionalmente para diagnosticas as seguintes doenças. Vide por exemplo Vardiman, et al. (2009). "The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: Rationale and important changes". Blood 114 (5): 937-51.
Leucemia mielogênica crônica (CML)
[00129] Com translocação definidora t(9;22); cromossoma Philadelphia, translocação de BCR-ABL que tem três pontos de ruptura:
[00130] • u-BCR-ABL (p230): leva à CML com neutrofilia e basofilia usuais
[00131] • BCR-ABL menor (p 190): leva à CML que tem tendência a se tornar leucemia linfoblástica aguda (ALL) usualmente precursor B ALL e raramente precursor T ALL
[00132] • BCR-ABL maior (p210): ponto de ruptura usual normal
Trombocitemia essencial (ET)
[00133] ET está associada à mutação JAK2V617F em até 55% dos casos e a uma mutação de MPL (receptor de trombopoietina) em até 5% dos casos:
[00134] • Fase celular - megacariócitos grandes aumentados com fibrose e pouco aumento em outros elementos da medula óssea
[00135] • Fase fibrótica - fibrose colagenosa com falta de elementos da medula
[00136] Estes distúrbios ainda estão sendo revisados de acordo com mutações genéticas mais específicas e com que frequência os pacientes acabam em um evento de medula fibrótica.
Policitemia vera (PV)
[00137] PV é mais frequentemente associada à mutação JAK2V617F em mais de 95% dos casos, ao passo que o restante tem uma mutação no éxon 12 de JAK2:
[00138] • Fase celular - megacariócitos aumentados que se agrupam, fibrose da reticulina, fibrose do tricromo tardia, e precursores mieloides e eritroides aumentados
[00139] • Fase fibrótica - fibrose colagenosa com falta de elementos da medula
Mielofibrose primária (PMF)
[00140] PMF está associada à mutação JAK2V617F em até 50% dos casos, às mutações no éxon 12 de JAK2 em 1-2% dos casos, e à mutação de MPL (receptor de trombopoietina) em até 5% dos casos:
[00141] • Fase celular - megacariócitos aumentados que se agrupam, fibrose da reticulina, fibrose do tricromo (colagenosa) tardia, e precursores mieloides aumentados
[00142] • Fase fibrótica - fibrose colagenosa com falta de elementos da medula
[00143] Anemia refratária com sideroblastos em anel associada à trombocitose acentuada (RARS-T) é frequentemente considerada uma malignidade mieloide. O diagnóstico de RARS-T pode envolver tradicionalmente hematologia e citologia, análise da medula óssea, e falta de anormalidades cariotípicas tais como del (5q), t(3;3)(q21;q26) ou inv(3)(q21;q26). Vide Broseus et al. "Clinical features and course of refractory anemia with ring sideroblast associated with marked thrombocytosis" Haematologica 9(7): 1036-1041 (2012).
[00144] Embora o tipo de malignidade mieloide oriente o diagnóstico e o tratamento, malignidades individuais podem ter mutações específicas que determinam ainda o prognóstico e o curso de tratamento. Marcadores genéticos são particularmente úteis porque eles frequentemente esclarecem a patogênese subjacente da doença.
[00145] A determinação da presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou de um produto genético do mesmo já descrito neste relatório pode ser efetuada como uma análise autossuficiente. Alternativamente, esta análise pode ser seguida ou precedida pela análise de outros marcadores para malignidades mieloides, tais como mutações de JAK2 e MPL. Por exemplo, pacientes com suspeita de sofrer de uma malignidade mieloide, tal como um neoplasma mieloproliferativo (e em particular mielofibrose primária (PMF) ou trombocitemia essencial (ET)), pode ser testado primeiro para uma mutação de JAK2 (em particular a mutação V617F). Se eles forem testados negativos para a mutação de JAK2, eles podem ser testados para calreticulina mutante. Se eles forem testados negativos para calreticulina mutante, eles podem ser testados para mutações de MPL, por exemplo mutações no éxon 10 do gene mpl. Naturalmente, outros marcadores também podem ser testados. Também diferentes ordens ou modos de testar mutações de JAK2, calreticulina mutante e/ou mutações de MPL e, opcionalmente, outros marcadores são previstos nesta invenção. Por exemplo, um teste positivo para mutação de JAK2 pode ser seguido por um teste para calreticulina mutante (e vice-versa) para diagnóstico adicional ou para avaliação prognóstica da malignidade mieloide. Também é prevista a determinação simultânea de tais marcadores, como o teste simultâneo para mutações de JAK2 e calreticulina mutante (e, opcionalmente, outros marcadores), ou o teste simultâneo para mutações de JAK2, calreticulina mutante e mutações de MPL (e, opcionalmente, outros marcadores). Preferivelmente, os pacientes (ou uma amostra dos pacientes) que sofrem de uma malignidade mieloide ou que têm tendência a sofrer de uma malignidade mieloide são negativos para mutações de JAK2 e de MPL, i.e., mutações de JAK2 e MPL estão ausentes em pacientes que foram avaliados como sofrendo de uma malignidade mieloide ou tendo tendência a sofrer de uma malignidade mieloide de acordo com a presente invenção. Em outras palavras, os pacientes (ou uma amostra dos pacientes) que foram avaliados como sofrendo de uma malignidade mieloide ou tendo tendência a sofrer de uma malignidade mieloide de acordo com a presente invenção têm preferivelmente presentes JAK2 e MPL do tipo selvagem. Para diagnóstico adicional, o uso de outros marcadores/testes é contemplado. Por exemplo, testes rotineiros da medula óssea podem ser usados. Tais outros marcadores/testes, como testes da medula óssea, podem ser usados para validar por exemplo um teste positivo para calreticulina mutante pode seguir-se por exemplo a um teste negativo para calreticulina mutante.
[00146] Sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos do tipo selvagem de JAK2 e MPL são conhecidas e podem ser deduzidas a partir das respectivas bases de dados, tais como NCBI. Sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos exemplificativas de JAK2 do tipo selvagem estão mostradas em NM_004972.3 (cDNA de JAK2) e NP_004963.1 (proteína de JAK2), respectivamente. Sequências de ácidos nucleicos e sequências de aminoácidos exemplificativas de MPL do tipo selvagem estão mostradas em NM_005373.2 (MPL cDNA) e NP 005364.1 (proteína de MPL).
[00147] Mutações de JAK2 e MPL em malignidades mieloides já foram descritas mais acima. Tais mutações são, por exemplo, a mutação V617F de JAK2 (mutação de valina em fenilalanina na posição 617 da sequência de aminoácido de JAK2), mutações no éxon 12 da sequência de ácidos nucleicos codificando JAK2 e/ou mutações no éxon 10 de MPL.
[00148] A mutação de valina em fenilalanina (V617F) está descrita em Baxter et al., 2005; James et al., 2005; Kralovics et al., 2005; Levine et al., 2005). Mutações no éxon 12 de JAK2 em PV no gene MPL do receptor de trombopoietina em PMF e ET já foram descritas em Scott et al., 2007 e em Pardanani et al., 2006; Pikman et al., 2006, respectivamente. Todas estas referências estão aqui incorporadas em sua íntegra a título de referência.
[00149] A presença de mutações de JAK2 e MPL pode ser excluída por PCR alelo-específica para JAK2-V617F(ref) e por sequenciamento de Sanger do éxon 12 de JAK2 e do éxon 10 de MPL. Um protocolo exemplificativo que pode ser usado neste contexto está descrito em Kralovics R, Teo SS, Li S, Theocharides A, Buser AS, Tichelli A, Skoda RC. Acquisition of the V617F mutation of JAK2 is a late genetic event in a subset of patients with myeloproliferative disorders. Blood. 2006 Aug 15;108(4):1377-80. Epub 2006 May 4, que está aqui incorporado a título de referência.
[00150] Por conseguinte, a presente invenção oferece um novo grupo de pacientes com malignidade mieloide que é avaliado positivo para calreticulina mutante e negativo para JAK2 mutante e para MPL mutante (ou, em outras palavras, o novo grupo de pacientes com malignidade mieloide é avaliado positivo para calreticulina mutante e positivo para JAK2 do tipo selvagem e para MPL do tipo selvagem).
[00151] Em uma modalidade preferida, os métodos da presente invenção compreendem - uma etapa de determinar a presença de uma proteína de JAK2 do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de JAK2 do tipo selvagem em - uma amostra do paciente; e/ou - uma etapa de determinar a presença de uma proteína de MPL do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de MPL do tipo selvagem em uma amostra do paciente.
[00152] Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos da presente invenção compreendem - uma etapa de determinar a presença de uma proteína de JAK2 do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de JAK2 do tipo selvagem em uma amostra do paciente; e - uma etapa de determinar a presença de uma proteína de MPL do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de MPL do tipo selvagem em uma amostra do paciente.
[00153] As etapas acima de determinar a presença de uma proteína de JAK2 do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de JAK2 do tipo selvagem em uma amostra do paciente; e/ou determinar a presença de uma proteína de MPL do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de MPL do tipo selvagem em uma amostra do paciente podem ser realizadas antes ou depois da etapa de determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente como previsto e definido aqui.
[00154] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; - determinar a presença de uma proteína de JAK2 do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de JAK2 do tipo selvagem em uma amostra do paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00155] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; - determinar a presença de uma proteína de MPL do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de MPL do tipo selvagem em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00156] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; - determinar a presença de uma proteína de JAK2 do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de JAK2 do tipo selvagem em uma amostra do referido paciente; - determinar a presença de uma proteína de MPL do tipo selvagem ou de um ácido nucleico de MPL do tipo selvagem em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00157] Preferivelmente, o método da invenção refere-se somente a avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide.
[00158] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00159] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00160] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00161] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes.
[00162] O método oferecido nesta invenção compreende determinar a presença de preferivelmente apenas um alelo mutante do gene da calreticulina em uma amostra do paciente. Preferivelmente, o método é um método in vitro. As mutações oferecidas e descritas neste relatório do gene da calreticulina são mutações somáticas. Estas mutações podem estar presentes em um estado homozigótico ou em um estado heterozigótico, preferivelmente em um estado heterozigótico.
[00163] O um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina podem compreender um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante. As proteínas do tipo calreticulina mutante descritas e oferecidas nesta invenção caracterizam-se por uma sequência de aminoácido C-terminal comum. Como fica evidente, por exemplo, da Tabela 2 no Exemplo, os C-terminais das proteínas do tipo calreticulina mutante têm uma sequência mínima comum. A referida sequência mínima comum está mostrada como a sequência de aminoácido representada na SEQ ID NO: 4 e é codificada por moléculas de ácido nucleico tendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3.
[00164] Por conseguinte, a proteína calreticulina mutante a ser usada de acordo com a presente invenção é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00165] Em uma modalidade, a proteína calreticulina mutante a ser usada de acordo com a presente invenção é (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; ou (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00166] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00167] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00168] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00169] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00170] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00171] em que a referida proteína calreticulina mutante é (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; ou (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00172] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00173] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00174] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00175] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo (h) determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e (i) avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00176] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00177] em que a referida proteína calreticulina mutante é (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; ou (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00178] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00179] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00180] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00181] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00182] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00183] em que a referida proteína calreticulina mutante é (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; ou (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00184] As proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas e a serem usadas nesta invenção possuem C-terminais característicos, que estão mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, e 144. Estes C-terminais compreendem a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00185] A proteína calreticulina mutante pode, de acordo com o acima exposto, ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00186] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00187] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00188] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00189] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo (h) determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e (i) avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00190] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00191] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00192] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00193] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00194] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00195] Em uma modalidade, a proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00196] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00197] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00198] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00199] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00200] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00201] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00202] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00203] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00204] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00205] Nesta invenção, 36 tipos da proteína calreticulina mutante foram identificados (vide Tabela mostrando os C-terminais das proteínas do tipo calreticulina mutante de comprimento integral). Estas proteínas mutantes são unificadas por suas características comuns dos C-terminais mostrados na SEQ ID NO: 4. As sequências de comprimento integral das proteínas do tipo calreticulina mutante estão mostradas nas SEQ ID NOs: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, e 288.
[00206] Por conseguinte, a proteína calreticulina mutante oferecida e a ser usada nesta invenção pode ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00207] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00208] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00209] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00210] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00211] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00212] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00213] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00214] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00215] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00216] Em uma modalidade, a proteína calreticulina mutante oferecida e a ser usada nesta invenção pode ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00217] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00218] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00219] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00220] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00221] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00222] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00223] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00224] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00225] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00226] Já foi mostrado neste relatório que as mutações identificadas ocorrem no éxon 9 do gene da calreticulina. A descrição a seguir refere- se portanto às mutações no gene da calreticulina do tipo selvagem e no éxon 9 da mesma.
[00227] O gene da calreticulina do tipo selvagem é bastante conhecido. Sua sequência de ácidos nucleicos e sua sequência de aminoácido podem ser obtidas a partir de bases de dados como o NCBI sob o número de acesso NG_029662.1 (gene) e NP_004334.1 (proteína).
[00228] Uma sequência de ácidos nucleicos exemplificativa do gene da calreticulina do tipo selvagem está mostrada na SEQ ID NO: 289. A sequência de aminoácido correspondente está mostrada na SEQ ID NO: 290.
[00229] Por conseguinte, o gene da calreticulina do tipo selvagem pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 290; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 289; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00230] O um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina podem estar em uma região que abrange o éxon 9 do gene da calreticulina descrito acima. A sequência de ácidos nucleicos do tipo selvagem do éxon 9 do gene da calreticulina está mostrado na SEQ ID NO:435. A sequência de aminoácido correspondente está mostrada na SEQ ID NO:436.
[00231] De acordo com o acima exposto, o éxon 9 do gene da calreticulina do tipo selvagem pode compreender uma sequência selecionada do grupo que consiste em: (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:436; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO:435; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00232] Como mostrado neste relatório (vide, por exemplo, Tabela 2), os alelos mutantes aqui oferecidos dos genes da calreticulina têm uma mutação "frameshift" em comparação com o gene da calreticulina do tipo selvagem. A mutação "frameshift" pode estar no éxon 9 do gene da calreticulina do tipo selvagem. Devido à mutação "frameshift", a fase de leitura aberta do gene da calreticulina do tipo selvagem não é mais usada, mas sim uma fase 1 alternativa, que leva à geração do C- terminal característico das proteínas do tipo calreticulina mutante (a sequência de aminoácido mínima comum das proteínas mutantes está mostrada na SEQ ID NO: 4).
[00233] A mutação "frameshift" pode ser causada pela deleção de um ou mais nucleotídeos, pela inserção de dois ou mais nucleotídeos ou uma combinação de inserção de deleção de um ou mais nucleotídeos, contanto que a proteína mutante compreenda o C- terminal característico (como mostrado na SEQ ID NO: 4) ou um fragmento do mesmo.
[00234] Por exemplo, a mutação "frameshift" é (ou é causada por) a deleção de um nucleotídeo da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, ou a inserção de dois nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00235] Por exemplo, (1 + (3xn0)) nucleotídeos podem ser deletados do gene da calreticulina (ou do éxon 9 da mesma), e com isso n0 pode ser qualquer número natural inclusive zero. Exemplos não limitativos do número de nucleotídeos que podem ser deletados do gene da calreticulina (ou do éxon 9 da mesma) para gerar um ácido nucleico codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção são 1, 4, 19, 22, 31, 34, 46, 52 nucleotídeos.
[00236] Similarmente, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a inserção de dois nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma. Por conseguinte, (2 + (3><n0)) nucleotídeos podem ser inseridos no gene da calreticulina (ou no éxon 9 da mesma), e com isso n0 pode ser qualquer número natural inclusive zero. Por exemplo, 5 nucleotídeos podem ser inseridos no gene da calreticulina (ou no éxon 9 da mesma) para gerar um ácido nucleico codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00237] A mutação "frameshift" também pode ser causada por uma combinação de inserção e deleção de um ou mais nucleotídeos no/do gene da calreticulina do tipo selvagem (ou no/do éxon 9 da mesma), contanto que a proteína mutante resultante compreenda o C-terminal característico (mostrado na SEQ ID NO: 4) ou um fragmento do mesmo.
[00238] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de um nucleotídeo da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de seis nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00239] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de dois nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de quatro nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00240] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de três nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de cinco nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00241] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 12 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 5 nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00242] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 18 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 11 nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00243] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 18 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 14 nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00244] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 20 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 1 nucleotídeo na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00245] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 28 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 6 nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00246] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 35 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 1 nucleotídeo na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00247] Por exemplo, a mutação "frameshift" pode ser (ou pode ser causada por) a deleção de 36 nucleotídeos da sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente do éxon 9 da mesma, e pela inserção de 2 nucleotídeos na sequência codificadora do gene da calreticulina do tipo selvagem, particularmente no éxon 9 da mesma.
[00248] Outras combinações de inserção/deleção da invenção que resultam na geração do C-terminal característico das proteínas do tipo calreticulina mutante (a sequência de aminoácido mínima comum das proteínas mutantes está mostrada na SEQ ID NO: 4) ou de um fragmento do mesmo são facilmente concebíveis.
[00249] Devido às inserções, deleções e combinações de inserções/deleções descritas acima, um "frameshift" é introduzido no (na sequência codificadora do) gene da calreticulina do tipo selvagem e particularmente no éxon 9 do mesmo. Por conseguinte, a proteína calreticulina mutante divulgada neste relatório e a ser usada de acordo com a presente invenção compreende uma extensão de aminoácido mutante codificada por estas sequências de éxon 9 mutante.
[00250] Por conseguinte, a proteína calreticulina mutante pode ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00251] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00252] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00253] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00254] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo (h) determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e (i) avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00255] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00256] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00257] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00258] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00259] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00260] Em uma modalidade, a proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00261] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00262] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00263] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00264] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00265] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00266] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00267] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00268] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00269] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00270] A presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina pode ser avaliada no nível genômico, no nível de mRNA ou no nível da proteína.
[00271] Se a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina for avaliada no nível genômico, o alelo mutante pode compreender ou consistir em DNA, preferivelmente DNA genômico.
[00272] Por exemplo, o alelo mutante pode compreender um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00273] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00274] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00275] onde o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00276] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00277] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00278] onde o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 3 11, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00279] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00280] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00281] onde o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 3 11, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00282] Em uma modalidade, o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 3 11, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 4 11, 415, 419, 423, 427, ou 431.
[00283] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00284] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00285] onde o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 4 11, 415, 419, 423, 427, ou 431.
[00286] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00287] onde os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida acima.
[00288] onde o referido alelo da calreticulina mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 3 11, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 4 11, 415, 419, 423, 427, ou 431.
[00289] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes,
[00290] em que os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina compreende um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00291] onde o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431.
[00292] Todos os métodos rotineiramente empregados para análises mutacionais podem ser usados de acordo com a presente invenção. A presença do alelo mutante no nível genômico pode, por exemplo, ser determinada por sequenciamento (tal como sequenciamento de Sanger, por exemplo sequenciamento de Sanger bidirecional) e/ou por estratégias de detecção à base de PCR, tais como ensaios de dimensionamento por PCR (i.e., PCR seguida por análise dos fragmentos por exemplo via eletroforese em agarose gel (como eletroforese em agarose gel de alta densidade)).
[00293] A detecção de uma mutação em um ácido nucleico pode ser feita por métodos conhecidos na literatura, incluindo sequenciamento direto, identificação de polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (RFLPI) do DNA genômico, detecção polimórfica amplificada aleatória (RAPD), detecção de polimorfismo no comprimento do fragmento amplificado (AFLPD), reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento de DNA, sondas de oligonucleotídeo alelo- específicas (ASO), hibridização para microarranjos ou contas de DNA, fusão de alta resolução (HRM), e princípio da sonda TaqMan. O ácido nucleico pode ser DNA genômico, DNA genômico amplificado, mRNA, cDNA, ou cDNA amplificado.
[00294] O sequenciamento é tipicamente efetuado em ácidos nucleicos especificamente amplificados. A análise do tamanho dos fragmentos tipicamente utiliza diferenças nos tamanhos de amplicons subsequente à PCR. A fusão de alta resolução (HRM) detecta mutações no DNA medindo com precisão o ponto de fusão de DNA de cordão duplo. Gundry et al., "Amplicon Melting Analysis with Labeled Primers: A Closed-Tube Method for Differentiating Homozygotes and Heterozygotes" Clinical Chemistry 49: 396-406 (2003). Tipicamente o usuário vai usar PCR para amplificar a região do DNA na qual se encontra a mutação de interesse. O DNA amplificado é então aquecido com precisão de cerca de 50°C até cerca de 95 °C, até os cordões se separarem. Este processo é tipicamente monitorado com corantes fluorescentes.
[00295] Uma abordagem que pode ser empregada nesta invenção utiliza análise do tamanho dos fragmentos, seguida ou não por sequenciamento. Como mencionado acima, ensaios de PCR usando por exemplo DNA genômico de calreticulina mutante como molde podem ser usados para amplificação do DNA. Subsequentemente o DNA amplificado pode ser submetido à análise dos fragmentos por exemplo via eletroforese em agarose gel.
[00296] Métodos para determinar a presença do alelo mutante no nível do mRNA ou no nível da proteína estão descritos mais adiante.
[00297] Para mRNA, muitos dos mesmos métodos usados para DNA podem ser efetuados depois da transcrição reversa para gerar cDNA. Outros métodos incluem PCR em tempo real, PCR de transcriptase reversa, sequenciamento por shotgun do transcriptoma inteiro (RNAseq), hibridização in situ ou microarranjos. PCR em tempo real simultaneamente amplifica e detecta uma sequência de interesse. O uso de iniciadores específicos e marcadores fluorescentes pode distinguir entre tipo selvagem e mutações.
[00298] As proteínas podem ser analisadas por métodos que incluem imuno-histoquímica (IHC), imunoensaio, métodos à base de gel ou blots, espectrometria de massas, citometria de fluxo, ou separação de células ativadas por fluorescência (FACS). Muitos métodos monitoram a ligação de um anticorpo ou grupo de anticorpos a uma proteína de interesse que detecta diferenças entre um tipo selvagem e formas mutantes. Espectrometria de massas detecta diferenças no tamanho de uma proteína e seus fragmentos que revelam informações sobre a sequência subjacente. Por exemplo, anticorpos policlonais que se ligam especificamente à proteína calreticulina mutante podem ser usados, como mostrado no Exemplo 2.
[00299] A presente invenção também aproveita a determinação da presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina para diagnosticar uma malignidade mieloide.
[00300] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando o produto genético está presente.
[00301] Os métodos oferecidos nesta invenção podem compreender uma etapa de obter uma amostra do paciente.
[00302] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - obter uma amostra do referido paciente; - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando o produto genético está presente.
[00303] O método oferecido nesta invenção compreende determinar a presença de um produto genético de preferivelmente apenas um alelo mutante do gene da calreticulina em uma amostra do paciente. Preferivelmente, o método é um método in vitro.
[00304] Preferivelmente, o método da invenção refere-se somente a avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide.
[00305] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide quando o produto genético está presente.
[00306] Malignidades mieloides incluem neoplasmas mieloproliferativos e síndromes mielodisplásicas. É preferível nesta invenção que a malignidade mieloide seja um neoplasma mieloproliferativo,
[00307] particularmente mielofibrose primária (PMF) ou trombocitemia essencial (ET), ou uma síndrome mielodisplásica, particularmente anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T).
[00308] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente.
[00309] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente.
[00310] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente.
[00311] Os um ou mais alelos mutantes podem compreender um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante.
[00312] A proteína calreticulina mutante pode ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00313] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00314] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00315] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00316] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00317] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00318] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00319] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00320] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00321] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00322] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00323] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00324] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00325] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00326] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00327] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00328] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00329] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00330] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00331] A proteína calreticulina mutante pode ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico sendo degenerado como resultado do código genético da sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00332] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00333] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00334] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00335] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método
[00336] compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00337] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00338] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144;
[00339] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00340] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00341] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00342] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00343] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00344] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00345] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00346] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00347] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00348] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00349] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00350] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00351] A proteína calreticulina mutante pode ser selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00352] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00353] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00354] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00355] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00356] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00357] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00358] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00359] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00360] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00361] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00362] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00363] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434;
[00364] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00365] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00366] onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00367] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00368] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante,
[00369] em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00370] O alelo mutante pode compreender um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00371] O produto genético pode ser um mRNA. Por exemplo, o produto genético pode ser um mRNA codificando a sequência de aminoácido C-terminal das proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00372] Por conseguinte, o produto genético pode compreender um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00373] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00374] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00375] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00376] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00377] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00378] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3.
[00379] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00380] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00381] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00382] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00383] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00384] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3.
[00385] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00386] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00387] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00388] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00389] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00390] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3.
[00391] O referido produto genético pode compreender um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00392] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00393] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00394] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00395] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00396] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00397] em que o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143.
[00398] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00399] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00400] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00401] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00402] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00403] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143.
[00404] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00405] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00406] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00407] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00408] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00409] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143.
[00410] O produto genético pode compreender um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 2 11, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00411] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00412] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00413] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 2 11, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00414] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00415] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00416] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 2 11, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287.
[00417] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00418] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00419] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00420] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00421] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00422] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 2 11, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287.
[00423] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente, onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00424] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00425] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00426] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00427] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 2 11, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287.
[00428] O produto genético pode compreender um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00429] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00430] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00431] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00432] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00433] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00434] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433.
[00435] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00436] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00437] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00438] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00439] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00440] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433.
[00441] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00442] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00443] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00444] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00445] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00446] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; e (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433.
[00447] Se o produto genético for mRNA, a presença ou quantidade do referido mRNA pode ser determinada por técnicas de rotina, tais como PCR em tempo real, PCR de transcriptase reversa, sequenciamento por shotgun do transcriptoma inteiro (RNAseq), sequenciamento de Sanger, hibridização in situ ou microarranjos.
[00448] Por conseguinte, a determinação por técnicas de PCR tais como PCR em tempo real ou PCR de transcriptase reversa pode compreender ainda as etapas de (i) contatar o ácido nucleico na amostra com um ou dois oligonucleotídeos; e (ii) gerar um produto de amplificação contendo a sequência alvo.
[00449] Sondas e iniciadores específicos para mutação exemplificativos são oferecidos e usados nesta invenção.
[00450] Oligonucleotídeos (iniciadores) exemplificativos a serem usados de acordo com a presente invenção são Sentido normal: ACAACTTCCTCATCACCAACG (SEQ ID NO: 437) e/ou Sentido invertido: GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID NO: 438) Sentido normal: GGCAAGGCCCTGAGGTGT (SEQ ID NO: 439) e/ou Sentido invertido: GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID NO: 438)
[00451] Outras sondas e iniciadores específicos para mutação adequados para uso na presente invenção podem, por exemplo, ser derivados das sequências de cDNA do gene da calreticulina mutado. Tais sequências de cDNA são oferecidas e descritas abaixo. Sequências de cDNA exemplificativas que podem ser usadas neste contexto estão mostradas na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 258, 262, 266, 270, 274, 278, 282, ou 286; 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, 352, 356, 360, 364, 368, 372, 376, 380, 384, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428, ou 432.
[00452] Outras sequências de cDNA exemplificativas que podem ser usadas para o desenho de sondas e iniciadores específicos para mutação estão representadas na tabela que se segue:
[00453] Sequências de junções de mutação na sequência de cDNA de CALR para o desenho de sondas específicas para mutação ou iniciadores de PCR.
[00454] As letras em negrito indicam as bordas de um evento de deleção; as letras sublinhadas indicam sequências inseridas; as letras em negrito e itálico indicam variantes nucleotídicas únicas.
[00455] A descrição a seguir refere-se a modalidades, onde o produto genético é uma proteína/polipeptídeo.
[00456] O produto genético pode compreender um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00457] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00458] em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00459] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00460] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00461] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00462] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00463] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00464] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00465] em que o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00466] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00467] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00468] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00469] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00470] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00471] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00472] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00473] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00474] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00475] O produto genético pode compreender um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00476] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00477] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00478] onde o referido produto genético é um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico sendo degenerado como um resultadodo código genético da sequência de nucleotídeo de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00479] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00480] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00481] onde o referido produto genético é um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00482] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00483] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00484] onde o referido produto genético é um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00485] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00486] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00487] onde o referido produto genético é um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00488] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00489] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00490] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00491] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00492] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00493] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
[00494] O produto genético pode compreender um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00495] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo
[00496] - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e
[00497] - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00498] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00499] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00500] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00501] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00502] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; e (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00503] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00504] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00505] onde o referido produto genético é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00506] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00507] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00508] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00509] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00510] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando um mutante da proteína calreticulina já definida mais acima, onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00511] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00512] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00513] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
[00514] O produto genético pode compreender um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00515] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00516] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00517] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00518] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de mielofibrose primária ou tem tendência a sofrer de mielofibrose primária quando o produto genético está presente,
[00519] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00520] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00521] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00522] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00523] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico hibridizar em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00524] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de trombocitemia essencial ou tem tendência a sofrer de trombocitemia essencial quando o produto genético está presente,
[00525] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00526] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00527] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00528] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00529] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00530] A presente invenção refere-se a um método para avaliar se um paciente sofre de a anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T), o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) ou tem tendência a sofrer de anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) quando o produto genético está presente,
[00531] onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima,
[00532] onde o referido produto genético é selecionado do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; e (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
[00533] Se o produto genético for uma proteína, a presença ou quantidade da referida proteína pode ser determinada por técnicas de rotina, tal como por imuno-histoquímica (IHC), por imunoensaio, métodos à base de gel ou mancha, IHC, espectrometria de massas, citometria de fluxo, ou FACS.
[00534] Como as mutações em CALR causam um "frameshift" do polipeptídeo transladado, uma sequência de aminoácido C-terminal característica está presente nas proteínas do tipo calreticulina mutada descritas e oferecidas nesta invenção. Esta sequência de aminoácido característica altera a carga total da proteína. Ela também altera a migração da calreticulina mutada durante eletroforese da proteína. É possível aproveitar esta diferença na carga e/ou no comportamento de migração para determinar a presença de uma proteína calreticulina mutada. Por exemplo, anticorpos específicos para proteína calreticulina mutante podem ser usados para identificar a referida proteína mutante por exemplo por análise imunoquímica por Western Blotting. Opcionalmente, também anticorpos específicos para a proteína calreticulina do tipo selvagem podem ser usados (adicionalmente) como um controle. Tais anticorpos podem incluir anticorpos policlonais e monoclonais que podem ser preparados por técnicas de rotina.
[00535] Preferivelmente, o paciente é um paciente humano. O paciente pode estar com suspeita de sofrer de uma malignidade mieloide ou pode estar com suspeita de sofrer de uma malignidade mieloide.
[00536] A descrição a seguir refere-se a amostras a serem usadas de acordo com a presente invenção. A amostra pode ser uma amostra de medula óssea, uma amostra de sangue ou uma amostra de saliva. A amostra é preferivelmente uma amostra de sangue. A amostra de sangue preferivelmente compreende granulócitos periféricos. A amostra pode ser obtida de um paciente por técnicas de rotina, por exemplo, por biópsia.
[00537] O método oferecido mais acima pode compreender ainda administrar um inibidor da calreticulina mutante já definida mais acima ao paciente.
[00538] A descrição a seguir refere-se a cDNA codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00539] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 2; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00540] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, ou 142; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00541] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 258, 262, 266, 270, 274, 278, 282, ou 286; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00542] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, 352, 356, 360, 364, 368, 372, 376, 380, 384, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428, ou 432; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00543] Preferivelmente, o ácido nucleico definido acima é cDNA.
[00544] A descrição a seguir refere-se a mRNA codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00545] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00546] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139, ou 143; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00547] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283, ou 287; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00548] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00549] O ácido nucleico definido acima é preferivelmente mRNA.
[00550] A descrição a seguir refere-se a DNA genômico codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00551] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00552] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, ou 141; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00553] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, ou 285; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00554] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 295, 299, 303, 307, 3 11, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d).
[00555] O ácido nucleico definido acima é preferivelmente DNA genômico.
[00556] A descrição a seguir refere-se a proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00557] A presente invenção refere-se a uma proteína selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00558] A presente invenção refere-se a uma proteína selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00559] A presente invenção refere-se a uma proteína selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, ou 287; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00560] A presente invenção refere-se a uma proteína selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico sendo degenerada como resultado do código genético da sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). (h) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (i) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00561] O significado dos termos "polipeptídeo", "proteína" e "sequências/moléculas de ácidos nucleicos" é bastante conhecido na literatura e os termos são, portanto, usados no contexto da presente invenção. Por exemplo, "sequências/moléculas de ácidos nucleicos" conforme usado neste relatório refere-se a todas as formas de tipos de ocorrência natural e gerados de forma recombinante de ácidos nucleicos e/ou de sequências/moléculas de ácidos nucleicos assim como a sequências/moléculas de ácidos nucleicos sintetizadas quimicamente. Este termo também abrange análogos de ácidos nucleicos e derivados de ácidos. O termo "sequências/moléculas de ácidos nucleicos" pode indicar ácido desoxirribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). As "sequências/moléculas de ácidos nucleicos" podem ser feitas por metodologia química sintética conhecido pelo especialista na técnica, ou pelo uso de tecnologia recombinante, ou podem ser isoladas de fontes naturais, ou por uma combinação das mesmas. O DNA e o RNA podem opcionalmente compreender nucleotídeos não naturais e podem ser de cordão simples ou duplo. "Sequências/moléculas de ácidos nucleicos" também refere-se a DNA e RNA de sentido positivo e também refere-se a DNA e RNA de sentido negativo, isto é, uma sequência nucleotídica que é complementar a uma sequência específica de nucleotídeos no DNA e/ou RNA. Além disso, o termo "sequências/moléculas de ácidos nucleicos" pode indicar DNA ou RNA ou híbridos dos mesmos ou qualquer modificação dos mesmos que seja conhecida no estado da técnica (vide, por exemplo, os documentos US 5525711, US 4711955, US 5792608 ou EP 302175 para exemplos de modificações). As moléculas de ácido nucleico podem ser de cordão simples ou duplo, lineares ou circulares, naturais ou sintéticas, e sem qualquer limitação de tamanho. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico podem ser DNA genômico, cDNA, mRNA, RNA de sentido negativo, ou um DNA codificando tais RNAs ou quimeroplastos (Colestrauss, Science (1996), 1386-1389). As referidas moléculas de ácido nucleico podem estar na forma de um plasmídeo ou de DNA ou RNA viral. "Sequências/moléculas de ácidos nucleicos" também pode indicar um oligonucleotídeo ou oligonucleotídeos, onde qualquer uma das modificações do estado da técnica tais como fosfotioatos ou ácidos nucleicos peptídicos (PNA) estão incluídos.
[00562] Uma sequência de ácidos nucleicos com um certo nível de identidade com as sequências humanas oferecidas nesta invenção pode ser identificada pelo especialista na técnica usando métodos conhecidos na literatura, por exemplo usando ensaios de hibridização ou usando alinhamentos, sejam eles manuais ou pelo uso de programas de computador tais como aqueles mencionados mais adiante em relação com a definição do termo "hibridização" e graus de homologia.
[00563] A sequência de ácidos nucleicos pode ser pelo menos 70% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 1. Mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%), 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 1, onde os valores mais altos são preferidos. Ainda mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 99% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 1.
[00564] A sequência de ácidos nucleicos pode ser pelo menos 70% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 2. Mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%), 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 2, onde os valores mais altos são preferidos. Ainda mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 99% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 2.
[00565] A sequência de ácidos nucleicos pode ser pelo menos 70% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 3. Mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 3, onde os valores mais altos são preferidos. Ainda mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 99% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 3.
[00566] A sequência de ácidos nucleicos pode ser pelo menos 70% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433.
[00567] Mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98%) idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada na SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433, onde os valores mais altos são preferidos.
[00568] Ainda mais preferivelmente, a sequência de ácidos nucleicos é pelo menos 99% idêntica à sequência de ácidos nucleicos mostrada nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 3 11, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433.
[00569] Ensaios de hibridização para a caracterização de ácidos nucleicos com um certo nível de identidade com as sequências de ácidos nucleicos oferecidas nesta invenção são bastante conhecidos na literatura; vide por exemplo Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). O termo "hibridização" ou "hibridiza" conforme usado neste relatório pode indicar hibridizações em condições estringentes ou não estringentes. Se não estiverem especificadas, as condições são preferivelmente não estringentes. As referidas condições de hibridização podem ser estabelecidas de acordo com protocolos convencionais descritos, por exemplo, em Sambrook (2001) loc. cit; Ausubel (1989) loc. cit., ou Higgins e Hames (Eds.) "Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). O especialista na técnica sabe como determinar as condições e estas podem ser determinadas de acordo com protocolos descritos na literatura. Por conseguinte, a detecção de apenas sequências especificamente hibridizantes normalmente vai requerer condições de hibridização e lavagem estringentes tais como, por exemplo, condições de hibridização altamente estringentes de 0.1 x SSC, 0.1% de SDS a 65°C ou 2 x SSC, 60°C, 0.1 % de SDS. Condições de hibridização pouco estringentes para a detecção de homologia ou de sequências não exatamente complementares podem, por exemplo, ser fixadas em 6 x SSC, 1% de SDS a 65°C. Como se sabe, o comprimento da sonda e a composição do ácido nucleico a ser determinada constituem outros parâmetros das condições de hibridização. É contemplado nesta invenção que um ácido nucleico pode ser iniciador ou uma sonda, por exemplo, um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico de uma calreticulina mutante (ou de um fragmento da mesma como já definido neste relatório) ou do ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante (ou codificando o C-terminal da mesma) ou do éxon 9 da calreticulina mutante, entre outros, como já definido e oferecido mais acima. Os iniciadores e sondas geralmente na faixa de 10-30 nucleotídeos. Assim sendo, a invenção refere-se a um ácido nucleico (como um iniciador ou sonda) que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico da calreticulina mutante como já definido e oferecido nesta invenção, onde o referido ácido nucleico hibridizante é menor que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, ou 20 nucleotídeos e é maior que 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 nucleotídeos . Preferivelmente, o ácido nucleico tem um comprimento de 10 a 35 nucleotídeos, mais preferivelmente 15 a 25 nucleotídeos, um comprimento particularmente preferido de 18 a 21, por exemplo 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos.
[00570] De acordo com a presente invenção, os termos "homologia" ou "percentagem de homologia" ou "idêntico" ou "identidade percentual" ou "percentagem de identidade" ou "identidade de sequência" no contexto de duas ou mais sequências de ácidos nucleicos referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são a mesma, ou que têm uma percentagem específica de nucleotídeos que são os mesmos (pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% de identidade, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação (preferivelmente pelo comprimento inteiro), ou em uma região designada medida usando-se um algoritmo de comparação de sequências conhecido na literatura, ou por alinhamento manual e inspeção visual. Sequências tendo, por exemplo, 75% a 90% ou mais de identidade de sequência podem ser consideradas substancialmente idênticas. Tal definição também se aplica ao complemento de uma sequência de teste. Preferivelmente a identidade descrita existe em uma região que tem pelo menos cerca de 15 a 25 nucleotídeos de comprimento, mais preferivelmente, em uma região que tem pelo menos cerca de 50 a 100 nucleotídeos de comprimento e ainda mais preferivelmente pelo comprimento inteiro. Os especialistas na técnica vão saber como determinar a identidade percentual entre sequências usando, por exemplo, algoritmos tais como baseados no programa de CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 46734680) ou FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), conhecidos na literatura.
[00571] Apesar de o algoritmo FASTDB tipicamente não considerar deleções ou adições não coincidentes internas nas sequências, i.e., hiatos, em seu cálculo, isto pode ser manualmente corrigido para evitar uma estimativa excessiva da % de identidade. O CLUSTALW, no entanto, não leva em consideração os hiatos das sequências em seu cálculo de identidade. Também se encontram disponíveis para o especialista na técnica os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 (Altschul, (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). O programa BLASTN para sequências de ácidos nucleicos utiliza como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambos os cordões. A matriz de classificação BLOSUM62 (Henikoff (1989) PNAS 89:10915) utiliza alinhamentos (B) de 50, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambos os cordões.
[00572] Para determinar se um resíduo nucleotídico em uma sequência de ácidos nucleicos corresponde a uma certa posição na sequência nucleotídica por exemplo das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, e 433, respectivamente, o especialista na técnica pode utilizar meios e métodos bastante conhecidos na literatura, por exemplo, alinhamentos, sejam eles manuais ou usando programas de computador como aqueles mencionados neste relatório. Por exemplo, BLAST 2.0, que significa Basic Local Alignment Search Tool BLAST (Altschul (1997), loc. cit; Altschul (1993), loc. cit; Altschul (1990), loc. cit), pode ser usado para buscar alinhamentos de sequências locais. BLAST, como discutido acima, produz alinhamentos de sequências nucleotídicas para determinar a semelhança entre sequências. Por causa da natureza local dos alinhamentos, o BLAST é especialmente útil na determinação de correspondências exatas ou na identificação de sequências similares. A unidade fundamental dos dados de saída do algoritmo BLAST é o "High-scoring Segment Pair" (HSP). Um HSP consiste em dois fragmentos de sequência de comprimentos arbitrários porém iguais cujo alinhamento é localmente máxima e para o qual o escore de alinhamento satisfaz ou excede um escore limítrofe ou de corte estipulado pelo usuário. A abordagem BLAST é usada para buscar HSPs entre uma sequência de pesquisa e uma sequência da base de dados, para avaliar a significância estatística de todas as correspondências encontradas, e para relatar apenas aquelas correspondências que satisfazem um limiar de significância estipulado pelo usuário. O parâmetro E estabelece o limiar estatisticamente significativo para relatar as correspondências de sequências da base de dados. E é interpretado como o limite superior da frequência esperada de ocorrência casual de um HSP (ou conjunto de HSPs) no contexto da busca em toda a base de dados. Qualquer sequência na base de dados cuja correspondência satisfaça E é relatada na saída do programa.
[00573] Técnicas de computador análogas usando BLAST (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit.) são usadas para buscar moléculas idênticas ou relacionadas em bases de dados de nucleotídeos tais como GenBank ou EMBL. Esta análise é muito mais rápida que múltiplas hibridizações baseadas em membranas. Além disso, a sensibilidade da busca computadorizada pode ser modificada para determinar se qualquer correspondência em particular é classificada como exata ou similar. A base da busca é escore de produto, que é definido como: e leva em consideração tanto o grau de semelhança entre duas sequências quanto o comprimento da correspondência das sequências. Por exemplo, com um escore de produto de 40, a correspondência será exata com uma margem de erro de 1-2%; e de 70, a correspondência será exata. Moléculas similares são usualmente identificadas por seleção daquelas que mostram escores de produtos entre 15 e 40, embora escores mais baixos possam identificar moléculas relacionadas. Um outro exemplo para um programa capaz de gerar alinhamentos de sequências é o programa de computador CLUSTALW (Thompson (1994) Nucl. Acids Res. 2:4673-4680) ou FASTDB (Brutlag (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245), conhecidos na literatura.
[00574] As explicações e definições dadas mais acima em relação à "homologia/identidade de sequências e ácidos nucleicos" aplicam-se, mutatis mutandis, às "sequências de aminoácidos" das proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção representadas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente, como explicado abaixo.
[00575] O polipeptídeo a ser usado de acordo com a presente invenção pode ter pelo menos 70 % de identidade/semelhança com as proteínas tendo a sequência de aminoácido, por exemplo, representada na SEQ ID NO: 4, respectivamente. Mais preferivelmente, o polipeptídeo tem pelo menos 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% de identidade/semelhança com as proteínas representadas na SEQ ID NO: 4, respectivamente, onde os valores mais altos são preferidos. Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo tem pelo menos 99% de homologia com a proteína representada em 4.
[00576] O polipeptídeo a ser usado de acordo com a presente invenção pode ter pelo menos 70 % de identidade/semelhança com as proteínas tendo a sequência de aminoácido , por exemplo, representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente. Mais preferivelmente, o polipeptídeo tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ou 98% de identidade/semelhança com as proteínas representadas na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente, onde os valores mais altos são preferidos. Ainda mais preferivelmente, o polipeptídeo tem pelo menos 99% de homologia com a proteína representada em 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente.
[00577] Sem se afastar da essência da presente invenção também (um) fragmento(s) (funcional(ais) ou (um) derivado(s) (funcional(ais)) dos polipeptídeos ou proteínas oferecidos nesta invenção podem ser usados, por exemplo, fragmentos (funcionais) ou derivados (funcionais) do C-terminal mínimo da calreticulina mutante mostrado na SEQ ID NO: 4. Também (um) fragmento(s) (funcional(ais) ou (um) derivado(s) (funcional(ais)) de outros polipeptídeos ou proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidos nesta invenção, por exemplo, fragmentos (funcionais) ou derivados (funcionais) dos polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente.
[00578] Por conseguinte, um fragmento (funcional) dos polipeptídeos/proteínas acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode ser qualquer um dos polipeptídeos específicos acima mostrados em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, and 434, respectivamente, onde um ou mais aminoácidos são deletados.
[00579] Um derivado(s) (funcional(ais)) dos polipeptídeos/proteínas acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode ser qualquer um dos polipeptídeos específicos acima mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente, onde um ou mais aminoácidos são inseridos, adicionados ou substituídos.
[00580] Preferivelmente, a deleção, inserção, adição e/ou substituição de um ou mais aminoácidos está no C-terminal da calreticulina mutante oferecida nesta invenção, i.e., na sequência de aminoácido do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4.
[00581] Preferivelmente, a deleção, inserção, adição e/ou substituição de um ou mais aminoácidos está no C-terminal da calreticulina mutante oferecida nesta invenção, i.e., na sequência de aminoácido dos polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.
[00582] 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 aminoácidos podem ser deletados, inseridos, adicionados ou substituídos preferivelmente no C-terminal da calreticulina mutante oferecida nesta invenção, i.e., na sequência de aminoácido dos polipeptídeos mostrados na SEQ ID NO: 4.
[00583] 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 aminoácidos podem ser deletados preferivelmente do C- terminal da calreticulina mutante oferecida nesta invenção, i.e., da sequência de aminoácido do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 4.
[00584] 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 aminoácidos podem ser deletados, inseridos, adicionados e/ou substituídos preferivelmente no C-terminal da calreticulina mutante oferecida nesta invenção, i.e., na sequência de aminoácido dos polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.
[00585] O termo "um ou mais aminoácidos deletados" refere-se a fragmentos (funcionais) das proteínas do tipo calreticulina mutante específicas oferecidas nesta invenção.
[00586] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção consiste em de 15 a 25 aminoácidos contíguos. Por conseguinte, um fragmento (funcional) dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos.
[00587] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção consiste em de 15 a 25 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00588] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00589] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em de 15 a 25 aminoácidos contíguos dos polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.
[00590] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos dos polipeptídeos mostrados nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.
[00591] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 e até 42 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00592] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 e até 43 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 32 ou 112.
[00593] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 e até 44 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 8, 128, 132 ou 144.
[00594] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e até 45 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 12, 44, 136 ou 140.
[00595] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 e até 46 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 16 ou 124.
[00596] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, e até 47 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 24, 40, 76, 100, ou 120.
[00597] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, e até 48 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 28, 36, 72, 84, 96 ou 116.
[00598] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48 e até 49 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 20, 48, 60, 64, 68, ou 80.
[00599] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48, 49 e até 50 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 52 ou 56.
[00600] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51 e até 52 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 92.
[00601] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51, 52 e até 53 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 88 ou 104.
[00602] Um fragmento (funcional) preferido dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção pode consistir em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48, 49, 50, 51, 52, 53 e até 54 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 108.
[00603] O fragmento ou derivado preferivelmente tem a mesma (ou essencialmente a mesma) atividade biológica que o polipeptídeo de comprimento integral do qual ele é derivado, o polipeptídeo de comprimento integral tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434. Neste sentido, o fragmento ou derivado é um fragmento ou derivado "funcional" a ser usado nesta invenção.
[00604] O polipeptídeo oferecido nesta invenção (mostrado, por exemplo, na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente) pode ter um ou mais aminoácidos deletados, inseridos, adicionados e/ou substituídos contanto que o polipeptídeo conserve essencialmente a atividade biológica que é característica dos polipeptídeos dos quais ele é derivado.
[00605] Preferivelmente, todas essas deleções, inserções, adições e/ou substituições (neste contexto particularmente substituições) são conservativas, i.e., aminoácidos são substituídos por aminoácidos tendo as mesmas características ou características similares. Por exemplo, um aminoácido hidrofóbico será preferivelmente substituído por um outro aminoácido hidrofóbico e assim por diante.
[00606] A característica "atividade biológica" dos polipeptídeos oferecidos nesta invenção pode ser considerada como uma atividade que é causativa para (o desenvolvimento de) uma malignidade mieloide já definida neste relatório, tal como um neoplasma mieloproliferativo (particularmente mielofibrose primária e trombocitemia essencial).
[00607] A presente invenção também oferece inibidores de calreticulina mutante. Estes inibidores podem ser usados como medicamento.
[00608] O termo "antagonista de calreticulina mutante" ou "inibidor de calreticulina mutante" significa no contexto da presente invenção um composto capaz de prevenir ou reduzir total ou parcialmente a atividade fisiológica e/ou o nível de expressão de uma calreticulina mutante. Os termos "antagonista" ou "inibidor" são usados intercambiavelmente neste relatório.
[00609] No contexto da presente invenção o referido antagonista pode, portanto, prevenir, reduzir, inibir ou inativar a atividade fisiológica de uma calreticulina mutante pela ligação do referido composto/substância (i.e., antagonista/inibidor) à referida calreticulina mutante. Conforme usado neste relatório, o termo "antagonista" também abrange antagonistas competitivos, antagonistas não competitivos (reversíveis) ou antagonistas irreversíveis, como descrito, inter alia, em Mutschler, "Arzneimittelwirkungen" (1986), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Alemanha. Tal inibição pode ser medida determinando-se o turnover do substrato.
[00610] Um "antagonista" ou "inibidor" de uma calreticulina mutante também pode ser capaz de prevenir a função de uma calreticulina mutante prevenindo/reduzindo a expressão da molécula de ácido nucleico codificando para a referida calreticulina mutante. Portanto, um antagonista/inibidor de uma calreticulina mutante pode levar a um nível de expressão reduzido da calreticulina mutante (por exemplo nível reduzido de um mRNA de calreticulina mutante e/ou de uma proteína calreticulina mutante); isto pode refletir-se em uma atividade reduzida de calreticulina mutante. A atividade e/ou o nível de expressão reduzidos podem ser medidos/detectados por métodos conhecidos que também estão descritos neste relatório.
[00611] Um "antagonista/inibidor de uma calreticulina mutante" pode, por exemplo, interferir na transcrição de genes de calreticulina mutante, no processamento (por exemplo emenda, exportação do núcleo entre outros) dos produtos genéticos (por exemplo mRNA não emendado ou parcialmente emendado) e/ou na translação do produto genético (por exemplo mRNA maduro). O "antagonista/inibidor de uma calreticulina mutante" também pode interferir em outras modificações (como glicosilação ou fosforilação) do polipeptídeo/proteína codificado pelos genes de calreticulina mutante e assim inibir completa ou parcialmente a atividade das proteínas do tipo calreticulina mutante como descrito mais acima. Além disso, o "antagonista/inibidor de uma calreticulina mutante" pode interferir nas interações das proteínas do tipo calreticulina mutante com outras proteínas (dessa forma, por exemplo, interferindo na atividade de complexos que envolvem proteínas do tipo calreticulina mutante) ou, em geral, em sua síntese, por exemplo interferindo nas etapas a montante da expressão da calreticulina mutante ou nas vias de sinalização nas quais a calreticulina mutante está envolvida. Dependendo do modo de ação, tais antagonistas podem, por exemplo, ser designados "antagonistas sequestrantes" ou "antagonistas sinalizadores".
[00612] Em suma, o antagonista/inibidor de calreticulina mutante descrito neste relatório vai, por conseguinte, levar a uma diminuição ou redução do nível de expressão e/ou da atividade da calreticulina mutante, e assim reduzir sua contribuição para o desenvolvimento ou a proliferação de uma malignidade mieloide já definida neste relatório.
[00613] Os antagonistas podem ser shRNA (RNA em forma de grampo de cabelo pequeno), siRNA (RNA de interferência pequeno), miRNA (microRNA), dsRNA (RNA de dupla fita), stRNA (RNA temporal pequeno), moléculas de sentido negativo, parceiros de ligação extracelulares, moléculas (de ligação) pequenas, aptâmeros, intrâmeros, ou moléculas de anticorpo tais como um anticorpo total (imunoglobulina), um fragmento F(ab), um fragmento F(ab)2, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo quimérico, um anticorpo com CDR enxertada, uma construção de anticorpos bivalente, um anticorpo sintético, um anticorpo de cadeia simples biespecífico ou um anticorpo de clonagem cruzada.
[00614] A presente invenção refere-se a um siRNA ou shRNA que visa especificamente o ácido nucleico codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante, e dessa forma o ácido nucleico é especialmente um mRNA como já definido neste relatório.
[00615] Até 10 % das bases contíguas dos siRNAs ou shRNAs oferecidos nesta invenção podem ser não complementares. O siRNA pode compreender ainda pelo menos uma base na extremidade 5' e/ou pelo menos uma base na extremidade 3'.
[00616] Antagonistas/inibidores que são ácidos nucleicos, tais como siRNAs, shRNAs, moléculas de sentido negativo entre outros podem ser facilmente preparados por técnicas conhecidas usando, por exemplo, as sequências alvo a seguir. Por exemplo, siRNAs, shRNAs entre outros a serem empregados nesta invenção podem compreender ou consistir em uma sequência de RNA correspondente a uma das sequências alvo abaixo. O termo "sequência de RNA correspondente a" significa neste contexto que a sequência de RNA é idêntica a uma das sequências alvo abaixo com a exceção de que os resíduos timidina (T) da sequência alvo são substituídos por um resíduo de uracila (U). O siRNA pode consistir em uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos dez bases contíguas. Por exemplo, o siRNA, shRNA entre outros podem compreender pelo menos dez bases contíguas de uma sequência de RNA correspondente a uma das sequências alvo definidas abaixo. O siRNA, shRNA entre outros podem consistir em dez bases contíguas de uma sequência de RNA correspondente a uma das sequências alvo definidas abaixo.
[00617] O siRNA, shRNA entre outros podem visar uma das sequências alvo abaixo, sequências estas que referem-se às SEQ ID NO: 476 a SEQ ID NO: 1309.
[00618] São contemplados nesta invenção anticorpos que se ligam especificamente às proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas acima. Tais anticorpos podem ser usados para fins de diagnóstico e fins terapêuticos de acordo com a presente invenção. Por exemplo, anticorpos produzidos contra o polipeptídeo singular C-terminal de calreticulina mutada oferecem um teste de diagnóstico para malignidade mieloide. Também, a detecção de peptídeos derivados deste C-terminal singular por espectrometria de massas oferece um teste de diagnóstico para malignidade mieloide. Preferivelmente, tais anticorpos são inibidores de calreticulina mutante.
[00619] Por exemplo, os anticorpos a serem usados nesta invenção podem se ligar especificamente às seguintes proteínas do tipo calreticulina mutante mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente. Particularmente, tais anticorpos podem se ligar especificamente ao C-terminal das proteínas do tipo calreticulina mutante, por exemplo, às proteínas mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.
[00620] É contemplado nesta invenção que os anticorpos podem ligar-se especificamente a fragmentos (funcionais) ou a derivados (funcionais) das proteínas do tipo calreticulina mutante definidas neste relatório, por exemplo também a polipeptídeos tendo pelo menos 70 % ou mais de identidade com as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção.
[00621] Por conseguinte, a presente invenção refere-se ao uso desses anticorpos nos métodos da presente invenção. Por conseguinte, a presente invenção refere-se ao uso do anticorpo/anticorpos descritos mais acima que se ligam especificamente a ou reconhecem especificamente um ou mais dos polipeptídeos das proteínas do tipo calreticulina mutante descritos e oferecidos nesta invenção para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide.
[00622] A presente invenção também refere-se a um anticorpo/anticorpos já definidos acima ou à composição acima compreendendo o referido anticorpo/anticorpos para a preparação de um kit de diagnóstico para uso nos métodos da presente invenção.
[00623] O anticorpo pode ser um anticorpo policlonal, um anticorpo monoclonal, um anticorpo total (imunoglobulina), um fragmento F(ab), um fragmento F(ab)2, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo quimérico, um anticorpo com CDR enxertada, uma construção de anticorpos bivalente, um anticorpo de cadeia simples biespecífico, um anticorpo sintético ou um anticorpo de clonagem cruzada, entre outros.
[00624] Nas policlonais ou monoclonais ou outros anticorpos (derivados dos mesmos) podem ser preparados como de rotina usando, inter alia, protocolos de imunização tradicionais; vide Ed Harlow, David Lane, (December 1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; ou Ed Harlow, David Lane, (December 1998), Portable Protocols (Using Antibodies): A Laboratory Manual 2 edition, Cold Spring Harbor Laboratory.
[00625] Por exemplo, a imunização pode envolver a administração intraperitoneal ou subcutânea da proteína/polipeptídeo calreticulina mutante (e/ou fragmentos, isoformas, homólogos e assim por diante) já definida neste relatório a um mamífero (por exemplo roedores tais como camundongos, ratos, hamsters entre outros). Preferivelmente, são usados fragmentos da proteína/polipeptídeo mutante, onde o fragmento preferivelmente carrega o C-terminal (ou um fragmento do mesmo) já definido neste relatório.
[00626] Um fragmento preferido dos polipeptídeos mencionados (i.e., as proteínas/polipeptídeos do tipo calreticulina mutante) oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção consiste em de 15 a 25 aminoácidos contíguos. Por conseguinte, um fragmento dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos. Um fragmento dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em de 15 a 25 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4. Um fragmento dos polipeptídeos mencionados acima oferecido nesta invenção e a ser usado de acordo com a presente invenção preferivelmente consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00627] Como prova do princípio, um fragmento (RRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA) foi usado para gerar anticorpos policlonais que se ligam especificamente ao anticorpo da calreticulina mutante; vide Exemplo 2. Este fragmento consiste em 24 aminoácidos contíguos da sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4. Estes anticorpos policlonais podem ser usados como uma ferramenta de pesquisa e/ou nos métodos de diagnóstico oferecidos nesta invenção. Este fragmento da proteína calreticulina mutante (ou outros fragmentos oferecidos e definidos neste relatório) também pode ser usado como uma vacina, o que será descrito mais adiante.
[00628] Métodos para a preparação e o rastreamento de anticorpos que se ligam especificamente a e reconhecem especificamente os polipeptídeos mutantes são conhecidos na literatura. Por exemplo, anticorpos que reconhecem a proteína mutante podem ser purificados por afinidade. ELISA é comumente usado para rastrear o soro e/ou analisar frações de coluna de afinidade. Análise de Western Blotting pode ser usada para demonstrar que o anticorpo pode detectar a proteína de interesse verdadeira e para avaliar se o anticorpo reconhece apenas a proteína de interesse, ou se ele reage de forma cruzada com outras proteínas.
[00629] O especialista na técnica está em posição de aplicar e adaptar os ensinamentos desses documentos para a geração e validação de anticorpos que se ligam especificamente a ou que reconhecem especificamente os polipeptídeos definidos neste relatório no contexto da presente invenção.
[00630] A descrição a seguir refere-se ao uso das proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção como vacina. Portanto, as proteínas do tipo calreticulina mutante agem como antígenos. Por conseguinte, os termos "proteína calreticulina mutante" e "antígenos para a proteína calreticulina mutante" e similares podem ser usados intercambiavelmente na descrição que se segue.
[00631] De acordo com o acima exposto, as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção podem ser usadas como vacina. Em outras palavras, as proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção podem ser usadas em imunização ativa. Portanto, a presente invenção refere-se às proteínas do tipo calreticulina mutante definidas e oferecidas nesta invenção (ou ácidos nucleicos (ou vetores compreendendo os mesmos)) codificando as proteínas do tipo calreticulina mutante definidas e oferecidas nesta invenção para uso como vacina. Proteínas do tipo calreticulina mutante, fragmentos e derivados das mesmas já foram descritos detalhadamente mais acima. Essas explicações e definições aplicam-se, mutatis mutandis, neste contexto. Úteis como vacina são, em particular, proteínas compreendendo ou consistindo no C-terminal das proteínas do tipo calreticulina mutante oferecidas nesta invenção mostradas nas SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente, assim como dos fragmentos das mesmas. Particularmente úteis neste contexto nas proteínas do tipo calreticulina mutante que compreendem ou consistem no C-terminal mínimo mostrado na SEQ ID NO: 4 ou um fragmento do mesmo.
[00632] A presente invenção refere-se a uma proteína para uso como vacina, em que a proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e).
[00633] A presente invenção refere-se a uma proteína para uso como vacina, onde a proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (d); e (f) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d).
[00634] A presente invenção refere-se a uma proteína para uso como vacina já definida mais acima, onde a proteína consiste em 15 a 25 aminoácidos contíguos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4.
[00635] Preferivelmente, um fragmento da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 compreendendo ou consistindo em 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 aminoácidos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 é usado como vacina. Particularmente preferidos são fragmentos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 compreendendo ou consistindo em 15 a 25 aminoácidos contíguos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 para uso como vacina. Por conseguinte, um fragmento da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 compreendendo ou consistindo em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos contíguos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 é usado como vacina.
[00636] Tais fragmentos ou derivados da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 podem ser acoplados a proteínas tais como hemocianina linfocítica de lapa com perfuração (KLH), albumina sérica bovina (BSA), ou toxoides bacterianos (por exemplo toxoide tetânico, toxoide diftérico) e usados para imunização.
[00637] A vacina pode ser usada no tratamento das malignidades mieloides definidas neste relatório.
[00638] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento profilático ou terapêutico de uma malignidade mieloide já definida neste relatório, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da vacina já definida mais acima a um paciente. Em outras palavras, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento profilático ou terapêutico de uma malignidade mieloide já definida neste relatório, compreendendo administrar uma quantidade eficaz da proteína calreticulina mutante já definida mais acima a um paciente.
[00639] Por exemplo, apesar de um paciente normalmente não reagir à CALR, por causa da autotolerância, muitas das mutações no éxon 9 de CALR causam "frameshifts" de modo que a porção C-terminal da CALR mutante difere daquela do tipo selvagem e, por conseguinte, não está sujeita à autotolerância. Imunização com o polipeptídeo mutante provocaria uma resposta imunológica contra CALR mutante. Por conseguinte, uma vacina pode ser usada terapeuticamente para atacar o câncer existente.
[00640] Uma vacina também poderia ser usada profilaticamente. Por exemplo, sabe-se que os cânceres podem mutar e evoluir para escapar da resposta imunológica do hospedeiro e do tratamento anticâncer. Assim sendo, um paciente com uma malignidade mieloide que não tem qualquer mutação em CALR, ou tem uma única mutação em CALR, posteriormente pode desenvolver mutações adicionais em CALR. Imunização contra outras formas mutantes de CALR pode, portanto, selecionar contra tais mutantes de CALR.
[00641] Mutantes de CALR também podem ser usadas para gerar anticorpos in vitro ou em outro animal para uso em terapia no paciente. Tal abordagem é particularmente útil porque os anticorpos podem ser produzidos contra epítopos tolerados no paciente. Tais anticorpos também são úteis para terapia porque o título pode ser controlado com precisão, e o anticorpo também pode ser conjugado a toxinas ou radionuclídeos para terapia vetorizada.
[00642] Um protocolo exemplificativo para realizar imunização ativa (ou o uso das vacinas oferecidas nesta invenção acima) está descrito a seguir:
[00643] Por exemplo, camundongos podem ser imunizados com uma vacina (por exemplo um peptídeo derivado da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4 ou um peptídeo que é um fragmento da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4, onde o peptídeo é acoplado com LH ou BS A) antes do transplante de células da medula óssea expressando calreticulina mutante ou do tipo selvagem. Os camundongos receptores imunizados podem receber radiação subletal ou letal para promover enxerto ou podem não receber qualquer radiação. As células transplantadas podem ser uma mistura de células expressando seja calreticulina mutada seja calreticulina do tipo selvagem. Os camundongos imunizados serão acompanhados depois do transplante. Se uma resposta imunológica for obtida contra células expressando calreticulina mutante, o enxerto preferivelmente vai ocorrer com células expressando calreticulina do tipo selvagem. Camundongos de controle sem imunização serão usados. Alternativamente, a imunização pode ser efetuada depois do enxerto dos camundongos com uma mistura 50:50 (ou outra proporção) de células expressando calreticulina do tipo selvagem/mutada. Se uma resposta imunológica for obtida contra células expressando calreticulina mutante, a proporção de 50:50 (ou outra) será convertida a favor das células expressando calreticulina do tipo selvagem. Camundongos de controle sem imunização serão usados para comparação.
[00644] A presente invenção refere-se ao uso de uma proteína calreticulina mutante como antígeno como oferecido nesta invenção e definido mais acima e, opcionalmente, um adjuvante, para a produção de uma composição de vacina para o tratamento ou a prevenção das malignidades mieloides definidas neste relatório.
[00645] A proteína calreticulina mutante pode ser produzida de forma recombinante (i.e., produzida em células hospedeiras apropriadas) ou sintética (i.e., sintetizadas quimicamente). A produção recombinante da proteína calreticulina mutante está descrita neste relatório. Por exemplo, a produção recombinante pode ser obtida usando-se qualquer uma das técnicas de clonagem molecular e expressão recombinante conhecidas na literatura. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificando proteína calreticulina mutante pode ser introduzida em uma célula hospedeira apropriada, tal como uma bactéria uma célula de levedura (por exemplo, uma célula de Pichia), uma célula de inseto ou uma célula de mamífero (por exemplo, célula CHO). A molécula de ácido nucleico codificadora pode ser colocada em uma ligação operável com um promotor capaz de efetuar a expressão do antígeno tipo proteína calreticulina mutante na célula hospedeira. A proteína calreticulina mutante, que é expressa pela célula hospedeira, pode ser facilmente purificada usando-se técnicas de rotina de purificação de proteínas.
[00646] Por exemplo, a sequência nucleotídica apresentada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3 ou uma sequência de ácidos nucleicos codificando o antígeno tipo proteína calreticulina mutante mostrado na SEQ ID NO: 4 ou codificando um fragmento do mesmo, tal como uma proteína consistindo em 15 a 25 aminoácidos contíguos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4, pode ser clonado em um vetor de expressão e colocado em uma ligação operável com um promotor sensível à temperatura. O vetor de expressão pode ser introduzido em Escherichia coli e o antígeno pode ser expresso mediante indução de calor. As células podem ser lisadas e os corpos de inclusão onde o antígeno se acumula são separados por centrifugação. A proteína recombinante nos corpos de inclusão é solubilizada usando-se SDS ou outros agentes de solubilização conhecidos na técnica tais como ureia, cloridrato de guanidina, colato de sódio, taurocolato, e desoxicolato de sódio. De acordo com a presente invenção, uma proteína calreticulina mutante recombinante purificada é combinada com um carreador farmaceuticamente aceitável para formar uma composição de vacina.
[00647] A presente invenção oferece uma composição imunogênica para conferir proteção a um paciente contra malignidade mieloide, a composição compreendendo uma proteína calreticulina mutante. A composição pode ser formulada como uma vacina para administração in vivo a um paciente. A composição pode compreender um adjuvante, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio.
[00648] Além disso, a presente invenção oferece uma composição imunogênica compreendendo uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima para uso como medicamento. Uma composição compreendendo uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima pode ser usada para a produção de um medicamento para imunizar um hospedeiro ou paciente contra uma malignidade mieloide.
[00649] A presente invenção refere-se a uma composição de vacina contendo um antígeno tipo proteína calreticulina mutante já definido neste relatório (ou "uma vacina à base de proteína calreticulina mutante"), que é adequada para administração a pacientes e é capaz de proteger os pacientes contra malignidade mieloide.
[00650] O termo "um carreador farmaceuticamente aceitável" inclui todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimento, adjuvante, agente estabilizante, diluente, preservativo, agente antibacteriano e antifúngico, agente isotônico, agente retardador de absorção, entre outros. Diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol, entre outros. Agentes isotônicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol, e lactose, entre outros. Estabilizantes incluem albumina, entre outros.
[00651] Adjuvantes adequados para uso em uma composição de vacina de acordo com a presente invenção incluem, porém sem limitação, diversas classes de adjuvantes tais como: sais minerais, por exemplo, alúmen, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio; agentes tensoativos e micropartículas, por exemplo, tensoativos não iônicos do tipo polímero em blocos (por exemplo, colesterol), virossomas, saponinas (por exemplo, Quil A, QS-_21 e GPI- _0100), proteossomas, complexos estimulantes imunes, cocleatos, aminas quaternárias (brometo de dimetil diocatadecil amônio (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E; produtos bacterianos tais como o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto da parede celular de Mycobacterum phlei (Detox®), muramil dipeptídeos (MDP) e tripeptidíos (MTP), monofosforil lipídio A, Bacillus Calmete-_Guerin, enterotoxinas de E. coli lábeis ao calor, toxina do cólera, trealose dimicolato, CpG oligodesoxinucleotídeos; citocinas e hormônios, por exemplo, interleucinas (IL-_1, IL-_2, IL- 6, IL-_12, IL-15, IL-_18), fator estimulante de colônias de granulócitos-macrófagos, desidroepiandrosterona, l,25- _di-hidróxi vitamina D3; poliânions, por exemplo, dextrana; poliacrílicos (por exemplo, polimetilmetacrilato, Carbopol 934P); carreadores por exemplo, toxide tetânico, toxoide diftérico, subunidade B da toxina do cólera, enterotoxina lábil ao calor mutante de E. coli enterotoxigênica (rmLT), proteínas de choque térmico; emulsões de óleo em água, por exemplo, AMPHIGEN® (Hydronics, EUA); e emulsões de água em óleo tais como, por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund.
[00652] O antígeno tipo proteína calreticulina mutante oferecido nesta invenção e o carreador farmaceuticamente aceitável podem ser combinados de qualquer maneira conveniente e prática para formar uma composição de vacina, por exemplo, por mistura, solução, suspensão, emulsificação, encapsulação, absorção entre outros, e pode ser feito em formulações tais como comprimidos, cápsulas, pós, xaropes, suspensões que são adequadas para injeção, implantes, inalações, ingestões entre outros. Preferivelmente, a vacina é formulada de modo que ela possa administrada aos pacientes por injeção em uma dose de cerca de 0.1 a 5 ml, ou preferivelmente cerca de 0.5 a 2.5 ml, ou ainda mais preferivelmente, em uma dose de cerca de 1 ml. Quando apropriado, as composições farmacêuticas da presente invenção devem ser transformadas em estéreis por procedimentos bastante conhecidos.
[00653] A quantidade de antígeno tipo proteína calreticulina mutante oferecido nesta invenção nas vacinas deve ser eficaz para imunização e geralmente varia na faixa de 0.5 -1000 pg por dose.
[00654] A quantidade de adjuvantes adequados para uso nas vacinas depende da natureza do adjuvante usado. Por exemplo, quando Quil A e colesterol são usados como adjuvante, Quil A geralmente é usado em uma quantidade de cerca de 1-1000 Pg por dose; e colesterol geralmente é usado em uma quantidade de cerca de 1-1000 Pg por dose.
[00655] De acordo com a presente invenção, uma vacina pode ser administrada por qualquer via conhecida, incluindo as vias oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica e parenteral (por exemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea ou intramuscular). A administração também pode ser feita usando-se dispositivos de distribuição sem agulha. A administração pode ser feita usando-se uma combinação de vias, por exemplo, primeira administração usando uma via parental e em seguida administração usando uma via mucosa. Vias de administração preferidas incluem administração subcutânea e intramuscular.
[00656] A presente invenção oferece vacinas combinadas e métodos para proteger pacientes pela administração de tais vacinas combinadas.
[00657] A presente invenção oferece um agente imunogênico, onde o agente imunogênico é a proteína calreticulina mutante definida e oferecida nesta invenção acima. O referido agente é eficaz para induzir uma resposta imunogênica contra proteínas do tipo calreticulina mutante em um paciente. Portanto, o agente imunogênico pode ser usado no tratamento ou na prevenção de uma malignidade mieloide já definida neste relatório.
[00658] Além disso, a presente invenção oferece um conjugado compreendendo um agente imunogênico ligado a uma proteína carreadora. O agente imunogênico é a proteína calreticulina mutante definida e oferecida nesta invenção acima. A proteína carreadora (tal como albumina sérica entre outras) pode melhorar a resposta imunológica. O conjugado pode ser uma proteína de fusão compreendendo um agente imunogênico (i.e., a proteína calreticulina mutante definida e oferecida nesta invenção acima) fundida a uma proteína carreadora. O agente também pode ser ligado à proteína carreador por reticulação química. O agente pode ser ligado ou fundido ao terminal amino da proteína carreadora. O agente pode ser ligado ou fundido à carboxila da proteína carreadora. O agente pode ser ligado ou fundido internamente à proteína carreadora. Múltiplas repetições ou multímeros do agente podem estar presentes em um conjugado, tal como uma proteína de fusão. O agente pode fazer parte de um polipeptídeo maior que inclui o agente com outros aminoácidos. O agente pode ser um componente de uma partícula. A partícula pode ser um lipossoma ou uma micropartícula. O agente pode ser emulsificado ou encapsulado na partícula, tal como um lipossoma ou uma micropartícula.
[00659] A presença de um polipeptídeo C-terminal único nas proteínas do tipo calreticulina mutadas oferecidas nesta invenção oferece a oportunidade de atacar a proteína mutante deixando a proteína do tipo selvagem intacta. Como a sequência de aminoácido derivada da fase de leitura -1 do éxon 9 da calreticulina codifica um peptídeo que não mostra homologia com qualquer outra proteína de vertebrados, os inibidores definidos acima (como anticorpos (preferivelmente anticorpos inibitórios), siRNA, shRNAs ou drogas de moléculas pequenas) podem ser gerados contra a mesma com um efeito terapêutico. Por exemplo, a sequência de aminoácido C-terminal da proteína calreticulina mutante (tal como a proteína mutante derivada da fase de leitura alternativa do éxon 9) pode ser usado para gerar anticorpos policlonais e monoclonais (preferivelmente anticorpos inibitórios). A calreticulina mutante oferecida nesta invenção representa, portanto, um alvo valioso para imunoterapia em malignidades mieloides. Alternativamente, a imunização de pacientes com o peptídeo mutante ou as proteínas mutantes recombinantes pode ser usada na intervenção terapêutica de malignidades mieloides.
[00660] Já foi mostrado que a calreticulina é secretada das células e pode ser detectada no soro. A calreticulina também é transportada para a superfície celular onde fornece um "sinal de coma-me" para fagocitose de células apoptóticas.
[00661] Por conseguinte, a presente invenção oferece um inibidor de uma calreticulina mutante para uso como medicamento. Além disso, a presente invenção refere-se à proteína calreticulina mutante oferecida nesta invenção, anticorpos que se ligam especificamente à mesma (preferivelmente anticorpos inibitórios), ácidos nucleicos oferecidos nesta invenção (particularmente ácidos nucleicos codificando a proteína calreticulina mutante), o siRNA oferecido nesta invenção para uso como medicamento. Os termos "medicamento" e "composição farmacêutica" são usados intercambiavelmente neste relatório. Por conseguinte, as definições e explicações oferecidas neste relatório referentes a "composições farmacêuticas" aplicam-se, mutatis mutandis, ao termo "medicamento".
[00662] A presente invenção refere-se a um inibidor de uma calreticulina mutante para uso no tratamento de uma malignidade mieloide.
[00663] A presente invenção oferece um método para o tratamento de um paciente com uma malignidade mieloide compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de uma calreticulina mutante ao paciente.
[00664] O paciente a ser tratado pode ser um paciente avaliado "positivo" de acordo com a presente invenção, i.e., um paciente cuja amostra apresentou a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina.
[00665] Por conseguinte, a presente invenção refere-se a um inibidor de uma calreticulina mutante para uso no tratamento de uma malignidade mieloide, com o qual será tratado um paciente que sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, em que foi determinada a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina (ou de um produto genético do mesmo) em uma amostra do referido paciente.
[00666] Todas as definições e explicações dadas mais acima referentes à determinação da presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina (ou de um produto genético do mesmo) em uma amostra do referido paciente aplicam-se, mutatis mutandis, neste contexto.
[00667] A presente invenção oferece um método para o tratamento de um paciente uma malignidade mieloide compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um inibidor de uma calreticulina mutante ao paciente, o método compreendendo avaliar se o paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina (ou de um produto genético do mesmo) em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina (ou um produto genético dos mesmos) estão presentes.
[00668] Todas as definições e explicações dadas mais acima referentes à determinação da presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina (ou de um produto genético do mesmo) em uma amostra do referido paciente aplicam-se, mutatis mutandis, neste contexto.
[00669] A calreticulina mutante pode ser uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima. Se a calreticulina mutante for uma proteína calreticulina mutante, o inibidor pode ser um anticorpo (preferivelmente um anticorpo inibitório), parceiros de ligação extracelulares, moléculas de ligação pequenas, aptâmeros ou intrâmeros.
[00670] A calreticulina mutante pode ser um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante já definida mais acima. Se a calreticulina mutante for tal ácido nucleico (preferivelmente mRNA como fornecido e definido acima), o inibidor pode ser siRNA, miRNA, dsRNA, shRNA, stRNA, e moléculas de sentido negativo.
[00671] Como mencionado acima, malignidade mieloide inclui um neoplasma mieloproliferativo ou uma síndrome mielodisplásica. Um neoplasma mieloproliferativo exemplificativo é mielofibrose primária (PMF). Particularmente preferida nesta invenção é a terapia de um neoplasma mieloproliferativo, particularmente de mielofibrose primária (PMF) ou de trombocitemia essencial (ET). Uma síndrome mielodisplásica exemplificativa sujeita à intervenção terapêutica de acordo com a presente invenção é anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T).
[00672] Os termos "tratamento", "tratar" entre outros são geralmente usados neste relatório para indicar a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenção total ou parcial de uma doença ou de um sintoma da mesma e/ou pode ser terapêutico em termos de cura parcial ou total de uma doença e/ou de um efeito adverso atribuído à doença. O termo "tratamento" conforme usado neste relatório cobre qualquer tratamento de uma doença em um indivíduo e inclui: (a) prevenir uma doença relacionada em um indivíduo que pode ser predisposto à doença; (b) inibir a doença, i.e., interromper seu desenvolvimento; ou (c) aliviar a doença, i.e., causar a regressão da doença.
[00673] Um "indivíduo", "paciente" ou "indivíduo" para os efeitos da presente invenção inclui tanto seres humanos quanto outros animais, particularmente mamíferos, e outros organismos. Portanto, os métodos aplicam-se tanto à terapia humana quanto a aplicações veterinárias. Preferivelmente, o "indivíduo", "paciente" ou "indivíduo" é um mamífero, e ainda mais preferivelmente o "indivíduo", "paciente" ou "indivíduo" é um ser humano.
[00674] O inibidor de uma calreticulina mutante pode ser administrado como um único agente (i.e., na forma de uma monoterapia) ou na forma de uma terapia combinada, por exemplo, terapias convencionais como terapia com hidroxiureia ou interferon alfa.
[00675] A composição farmacêutica será formulada e dosada de uma maneira coerente com a boa prática médica, levando em consideração a condição clínica do paciente individual, o sítio de distribuição da composição farmacêutica, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos pelos especialistas na técnica. A "quantidade eficaz" da composição farmacêutica para os efeitos desta invenção é, portanto, determinada por tais considerações.
[00676] O especialista na técnica sabe que a quantidade eficaz da composição farmacêutica administrada a um indivíduo depende, inter alia, da natureza do composto.
[00677] Por exemplo, se o referido inibidor for uma molécula pequena, a quantidade (farmaceuticamente) eficaz do inibidor na composição farmacêutica administrada por via oral por dose variar na faixa de cerca de 50 mg de inibidor por dia a 1000 mg de inibidor por dia do paciente, embora, como observado acima, esta estará sujeita ao critério terapêutico. Mais preferivelmente, esta dose é de pelo menos 50 mg de inibidor por dia, e ainda mais preferivelmente para seres humanos entre cerca de 50mg e 600 mg de inibidor por dia. Por exemplo, um inibidor pode ser administrado a uma dose de 15 mg/kg de peso corporal por dia. Se dado de forma contínua, o inibidor é tipicamente administrado a uma dose de cerca de 50 mg por dia a cerca de 600 mg por dia. É possível empregar uma solução para bolsa intravenosa. O tempo de tratamento necessário para que sejam observadas alterações e o intervalo subsequente ao tratamento para que ocorram respostas parecem variar dependendo do efeito desejado. As quantidades particulares podem ser determinadas por testes convencionais que são bastante conhecidos pelo especialista na técnica. A duração do tratamento necessária para que sejam observações alterações e o intervalo subsequente ao tratamento para que ocorram respostas parecem variar dependendo do efeito desejado. As quantidades particulares podem ser determinadas por testes convencionais que são bastante conhecidos pelo especialista na técnica.
[00678] A administração das composições oferecidas nesta invenção pode, inter alia, compreender uma administração duas vezes ao dia, uma vez ao dia, em dias alternados, a cada três dias, a cada quatro dias, a cada cinco dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez ao mês, etc.
[00679] Por exemplo, se o referido composto for um (poli)peptídeo ou proteína a quantidade farmaceuticamente eficaz total da composição farmacêutica administrada por via parenteral por dose vai variar na faixa de cerca de 1 μg de proteína/kg/dia a 15 mg de proteína/kg/dia de peso corporal do paciente, embora, como observado acima, esta estará sujeita ao critério terapêutico. Mais preferivelmente, esta dose será de pelo menos 0,01 mg de proteína/kg/dia, e ainda mais preferivelmente para seres humanos entre cerca de 0,01 e 1 mg de proteína/kg/dia. Se dada continuamente, a composição farmacêutica será tipicamente administrada a uma dose de cerca de 1 μg/kg/hora a cerca de 50 μg/kg/hora, seja por 1-4 injeções por dia ou por infusões subcutâneas contínuas, por exemplo, usando-se uma minibomba. Uma solução para bolsa intravenosa também pode ser empregada. O tempo de tratamento necessário para que sejam observadas alterações e o intervalo subsequente ao tratamento para que ocorram respostas parecem variar dependendo do efeito desejado. As quantidades particulares podem ser determinadas por testes convencionais que são bastante conhecidos pelo especialista na técnica.
[00680] As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por vial oral, retal, parenteral, intracistemal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como por pós, pomadas, gotas ou emplastro transdérmico), bucal, ou como um spray oral ou nasal.
[00681] As composições farmacêuticas da invenção compreendem preferivelmente um carreador farmaceuticamente aceitável. Por "carreador farmaceuticamente aceitável" entende-se uma carga atóxica sólida, semissólida ou líquida, um diluente, um material encapsulante ou auxiliar de formulação de qualquer tipo. O termo "parenteral" conforme usado neste relatório refere-se a modos de administração que incluem injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutânea e intra-articular.
[00682] A composição farmacêutica também é adequadamente administrada por sistemas de liberação sistemática. Exemplos adequados de composições de liberação sistemática incluem matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Matrizes de liberação sistemática incluem polilactídeos (Patente US N° 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutâmico e fama-etil-L-glutamato (Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroxietil metacrilato) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), e R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), etileno vinil acetato (R. Langer et al., Id.) ou ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133,988). Composições farmacêuticas de liberação sistemática também incluem compostos aprisionados em lipossomas. Lipossomas contendo a composição farmacêutica são preparados por métodos conhecidos per se: DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88,046; EP 143,949; EP 142,641; Pedido de Patente Japonesa 83-118008; Patente US N°s4,485,045 e 4,544,545; e EP 102,324. Normalmente, os lipossomas são do tipo unilamelar pequeno (cerca de 200-800 Angstroms) nos quais o teor de lipídios é maior que cerca de 30 por cento em mol de colesterol, a proporção selecionada sendo ajustada para a terapia ideal.
[00683] Para administração parenteral, a composição farmacêutica geralmente é formulada por mistura da mesma até o grau de pureza desejado, em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão ou emulsão), com um carreador farmaceuticamente aceitável, i.e., um seja atóxico para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e que seja compatível com os outros princípios da formulação.
[00684] Geralmente, as formulações são preparadas por contato dos componentes da composição farmacêutica de forma uniforme e íntima com carreadores líquidos ou carreadores sólidos finamente divididos ou ambos. Em seguida, se necessário, o produto é transformado na formulação desejada. Preferivelmente o carreador é um carreador parenteral, mais preferivelmente uma solução que é isotônica com o sangue do receptor. Exemplos de tais veículos carreadores incluem água, solução salina, solução de Ringer, e solução de dextrose. Veículos não aquosos tais como óleos fixos e etil oleato também são úteis nesta invenção, assim como lipossomas. O carreador contém adequadamente pequenas quantidades de aditivos tais como substâncias que melhoram a isotonicidade e a estabilidade química. Tais materiais são atóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, e outros ácidos orgânicos ou seus sais; antioxidantes tais como ácido ascórbico; (poli)peptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos), por exemplo, poliarginina ou tripeptídeos; proteínas, tais como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, ou arginina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo celulose ou seus derivados, glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol; contraíons tais como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos tais como polissorbatos, poloxâmeros, ou PEG.
[00685] Os componentes da composição farmacêutica a serem usados para administração terapêutica devem ser estéreis. A esterilidade é facilmente obtida por filtração através de membranas de filtração estéreis (por exemplo, membranas de 0,2 mícron). Os componentes terapêuticos da composição farmacêutica geralmente são colocados em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa para solução intravenosa ou um frasco tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00686] Os componentes da composição farmacêutica normalmente serão armazenados em recipientes de dose única ou de múltiplas doses, por exemplo, ampolas ou frascos selados, como uma solução aquosa ou como uma formulação liofilizada para reconstituição. Como um exemplo de uma formulação liofilizada, frascos de 10 ml são preenchidos com 5 ml de solução aquosa a 1% (p/v) esterilizada por filtração, e a mistura resultante é liofilizada. A solução para infusão é preparada por reconstituição dos compostos liofilizados usando-se água bacteriostática para injeção.
[00687] O objetivo do tratamento para policitemia vera é reduzir o número de células sanguíneas extras. O tratamento de policitemia vera pode incluir flebotomia, quimioterapia com ou sem flebotomia, terapia biológica usando interferon alfa ou interferon alfa peguilado e aspirina em dose baixa.
[00688] O tratamento de mielofibrose primária em pacientes sem sinais ou sintomas geralmente é a espera vigilante. Pacientes com mielofibrose primária podem ter sinais ou sintomas de anemia. A anemia geralmente é tratada com transfusão de células sanguíneas vermelhas para aliviar os sintomas e melhorar a qualidade de vida. Além disso, a anemia pode ser tratada com fatores de crescimento eritropoiéticos, prednisona, danazol, talidomida, lenalidomida ou pomalidomida. O tratamento de mielofibrose primária em pacientes com outros sinais ou sintomas pode incluir terapia vetorizada com ruxolitinib (um inibidor de JAK1 e JAK2), quimioterpia, transplante de células-tronco do doador, talidomida, lenalidomida, ou pomalidomida, esplenectomia, radioterapia para o baço, linfonodos, ou outras áreas fora da medula óssea onde as células sanguíneas se formam, terapia biológica usando interferon alfa ou fatores de crescimento eritropoiéticos, ou a inclusão de um ensaio clínico de outras drogas para terapia vetorizada.
[00689] O tratamento de trombocitemia essencial em pacientes com menos de 60 anos que não apresentam sinais ou sintomas e uma contagem de plaquetas aceitável geralmente é a espera vigilante. Em alguns casos, o paciente pode tomar aspirina para ajudar a prevenir coágulos sanguíneos. O tratamento de outros pacientes pode incluir quimioterapia, hidroxiureia, terapia com Anagrelide, terapia biológica usando interferon alfa ou interferon alfa peguilado, aferese de plaquetas.
[00690] O inibidor de ligação de JAK mostra-se promissor para tratamento curativo e de suporte. Ruxolitinib fora aprovado pelo Food and Drug Administration para uso no tratamento de mielofibrose de alto risco e de risco intermediário em 2011; vide Tefferi March 22, 2012; Blood: 119 (12). Também Ostojic reporta que ruxolitinib é usado na terapia de mielofibrose; vide Ostojic Therapeutics and Clinical Risk Management 2012:8 95-103.
[00691] Inibidores de JAK que são atualmente usados em ensaios clínicos para neoplasmas mieloproliferativos incluem, além do ruxolitinib, SAR302503, CYT387, lestaurtinib, SB1518, AZD1480, BMS911543, LY2784544, NS-018, e XL019; vide Tefferi March 22, 2012; Blood: 119 (12).
[00692] Uma fórmula exemplificativa de ruxolitinib ((3R)-3-ciclopentil- 3-[4-(7H-pirrol[2,3-d]pirimidin-4-il)pirazol-1-il]propanonitrila; nome comercial Jakafi, Jakavi) está mostrada abaixo:
[00693] Anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitose podem requerer transfusões de sangue e outra terapia de suporte para contornar a anemia, inclusive altas doses de pirodoxina (Vitamina B6). Transplante de medula óssea também é uma opção. RARS-T também pode evoluir para leucemia.
[00694] O uso das terapias acima é contemplado para pacientes diagnosticados positivos ou negativos para a presença de calreticulina mutante de acordo com a presente invenção, seja isoladamente ou em combinação com terapias (por exemplo anticorpos) que visam especificamente a calreticulina mutante. Por conseguinte, terapias (por exemplo anticorpos) que visam CALR mutante podem igualmente ser úteis no tratamento se usadas como monoterapia ou em combinação com outras terapias. Por exemplo, terapia com interferon alfa pode ser usada para tratar pacientes com MPN (como pacientes com trombocitemia essencial) diagnosticados positivos para a presença de calreticulina mutante de acordo com a presente invenção.
[00695] Se, por exemplo, o paciente testar positivo para a presença de calreticulina mutante e de mutações de JAK2, o uso de inibidores de JAK (como ruxolitinib) é contemplado nesta invenção. Dependendo dos parâmetros clínicos (por exemplo idade, prognóstico do paciente) também outras terapias, como transplante de células-tronco, podem ser usadas para tratar por exemplo um paciente testado positivo para a presença de calreticulina mutante.
[00696] Inibidores para uso de acordo com a presente invenção são descritos e oferecidos neste relatório. Também o uso de inibidores a serem ainda criados ou compostos conhecidos a serem testados quanto a sua atividade inibitória é contemplado no contexto da presente invenção.
[00697] Portanto, a presente invenção oferece um método para avaliar a atividade de uma molécula candidata que se suspeita ser um inibidor de uma calreticulina mutante definida e oferecida nesta invenção compreendendo as etapas de: (a) contatar uma célula, tecido ou um animal não humano compreendendo uma calreticulina mutante com a referida molécula candidata; (b) detectar uma redução na atividade da referida calreticulina mutante; e (c) selecionar uma molécula candidata que reduz a atividade da referida calreticulina mutante; em que uma redução da atividade indica que a capacidade da molécula selecionada é útil no tratamento de malignidade mieloide já definida neste relatório.
[00698] Também uma redução no nível (de expressão) pode indicar inibidores úteis.
[00699] A presente invenção refere-se a um método para avaliar a atividade de uma molécula candidata que se suspeita ser um inibidor de uma calreticulina mutante definida e oferecida nesta invenção compreendendo as etapas de: (a) contatar uma célula, tecido ou um animal não humano compreendendo uma calreticulina mutante com a referida molécula candidata; (b) detectar uma redução no nível (de expressão) da referida calreticulina mutante; e (c) selecionar uma molécula candidata que reduz o nível (de expressão) da referida calreticulina mutante;
[00700] onde uma redução do nível (de expressão) indica que a capacidade da molécula selecionada é útil no tratamento de malignidade mieloide já definida neste relatório.
[00701] A calreticulina mutante pode ser qualquer uma das proteínas/polipeptídeos do tipo calreticulina mutante já definidas mais acima ou qualquer um dos ácidos nucleicos (particularmente mRNAs) já definidos neste relatório, que codificam as proteínas/polipeptídeos do tipo calreticulina mutante.
[00702] As proteínas do tipo calreticulina mutante podem compreender ou consistir na sequência de aminoácido dos polipeptídeos mostrados em 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, e 434, respectivamente. Também o uso de fragmentos ou derivados dessas proteínas definidas acima é considerado neste contexto.
[00703] Os ácidos nucleicos da calreticulina podem compreender ou consistir nos ácidos nucleicos mostrados em 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, e 433, respectivamente.
[00704] Além disso, a presente invenção oferece o uso de ácidos nucleicos (por exemplo oligonucleotídeos como iniciadores/pares de iniciadores ou sondas descritos mais adiante) ou anticorpos capazes de detectar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina já definidos neste relatório para os métodos da presente invenção, i.e., para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide.
[00705] Os oligonucleotídeos podem ter de cerca de 15 a 100 nucleotídeos de comprimento. O especialista na técnica, com base em seu conhecimento geral e nos ensinamentos oferecidos neste relatório, consegue facilmente identificar e/ou preparar oligonucleotídeos ou polinucleotídeos capazes de detectar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório. Estes oligonucleotídeos ou polinucleotídeos podem ser usados como sondas ou iniciadores nos métodos oferecidos nesta invenção. Normalmente os iniciadores e/ou sondas têm um comprimento de 10 a 30 nucleotídeos. Por conseguinte, a invenção refere-se a ácidos nucleicos (em particular iniciadores ou sondas) capazes de detectar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório, onde o referido ácido nucleico é menor que 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, ou 20 nucleotídeos e é maior que 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 nucleotídeos. Preferivelmente, o ácido nucleico tem um comprimento de 10 a 35 nucleotídeos, mais preferivelmente 15 a 25 nucleotídeos, particularmente preferivelmente um comprimento de 18 a 21, por exemplo 18, 19, 20 ou 21 nucleotídeos. Estes ácidos nucleicos podem hibridizar em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico calreticulina mutante definida e oferecida nesta invenção acima.
[00706] Um especialista na técnica conhece, por exemplo, programas de computador que podem ser úteis para a identificação das sondas/iniciadores correspondentes a serem usados nesta invenção. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos de sequências codificadoras exemplificativas mostradas neste relatório (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 2 11, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, e 433, respectivamente) podem ser usadas neste contexto.
[00707] Também as sequências apresentadas na tabela a seguir podem ser usadas neste contexto.
[00708] Sequências de junções de mutação na sequência de cDNA de CALR para o desenho de sondas específicas para mutação ou de iniciadores de PCR. As letras em negrito indicam as bordas de um evento de deleção; as letras sublinhadas indicam sequências inseridas; as letras em negrito e itálico indicam variantes nucleotídicas únicas.
[00709] Exemplos de oligonucleotídeos (iniciadores) oferecidos nesta invenção e a serem usados de acordo com a presente invenção são Sentido normal: ACAACTTCCTCATCACCAACG (SEQ ID NO: 437) e/ou Sentido invertido: GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID NO: 438) Sentido normal: GGCAAGGCCCTGAGGTGT (SEQ ID NO: 439) e/ou Sentido invertido: GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID NO: 438)
[00710] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a células transgênicas ou a um animal não humano transgênico tendo o ácido nucleico descrito e explicado neste relatório (ou um vetor compreendendo o mesmo), por exemplo um ácido nucleico compreendendo pelo menos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório. Tais células transgênicas ou animais não humanos transgênicos podem ser usados para rastreamento e/ou validação de um medicamento para o tratamento de uma malignidade mieloide.
[00711] O termo "células" conforme usado neste contexto também pode compreender uma pluralidade de células assim como células compreendidas em um tecido. A célula a ser usada no método de rastreamento ou validação pode ser obtida a partir de amostras de um animal não humano (transgênico) ou de um ser humano que sofre de uma malignidade mieloide. A célula tumoral ou célula também pode ser obtida a partir de amostras de pacientes (por exemplo biópsias), em particular uma biópsia de um paciente/indivíduo que sofre de uma malignidade mieloide. Por conseguinte, a célula pode ser uma célula humana. Mais uma vez, tal célula a ser usada nos presentes métodos de rastreamento ou validação podem estar compreendidas em um tecido ou amostra de tecido, como em uma biópsia da amostra.
[00712] O animal não humano ou célula usada pode ser transgênica ou não transgênica. "Transgênico" neste contexto significa particularmente que pelo menos uma das calreticulinas mutantes descritas ou definidas neste relatório é (super)expressa e/ou que a atividade de pelo menos uma das calreticulinas mutantes está presente (ou é aumentada).
[00713] Um animal não humano (transgênico) ou célula (transgênica) preferida no contexto da invenção sofre de uma malignidade mieloide.
[00714] O termo "animal não humano transgênico" ou "célula transgênica" conforme usado neste relatório refere-se a um animal não humano ou célula, não sendo um humano, que compreende material genético diferente do material genético de um animal/célula do tipo selvagem correspondente. "Material genético" neste contexto pode ser qualquer tipo de molécula de ácido nucleico, ou análogos da mesma, por exemplo uma molécula de ácido nucleico, ou análogos da mesma definidos neste relatório. "Diferente" neste contexto significa material genético adicional ou menos material genético em relação ao genoma do animal/células do tipo selvagem e/ou material genético rearranjado, i.e., material genético presente em um lócus diferente do genoma em relação ao genoma do animal/célula do tipo selvagem. Uma panorâmica geral de diferentes sistemas de expressão a serem usados para gerar uma célula/animal transgênico está, por exemplo, contida em Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, em Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) e em Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440).
[00715] Em uma modalidade preferida, o animal não humano (transgênico) ou célula (transgênica) é derivada de um mamífero. Exemplos não limitativos do animal não humano (transgênico) ou célula (transgênica) derivada são selecionados do grupo que consiste em camundongos, ratos, coelhos e porquinhos-da-índia.
[00716] A presente invenção também refere-se a um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico da presente invenção.
[00717] Muitos vetores adequados são conhecidos pelos especialistas em biologia molecular, e a escolha dos mesmos vai depender da função desejada e eles incluem plasmídeos, cosmídeos, vírus, bacteriófagos e outros vetores convencionalmente usados em engenharia genética. Métodos que são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica podem ser usados para construir vários plasmídeos e vetores; vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (loc cit.) e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, os polinucleotídeos e vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para serem distribuídos para células alvo. Como discutido em maiores detalhes mais adiante, um vetor de clonagem foi usado para isolar sequências individuais de DNA. Sequências relevantes podem ser transferidas para onde a expressão de um polipeptídeo em particular é necessária. Vetores de clonagem típicos incluem pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 e pGBT9. Vetores de expressão típicos incluem pTRE, pCAL- n-EK, pESP-1, pOP13CAT.
[00718] Preferivelmente o referido vetor compreende uma sequência de ácidos nucleicos que é uma sequência reguladora operacionalmente ligada à referida sequência de ácidos nucleicos definida neste relatório.
[00719] O termo "sequência reguladora" refere-se a sequências de DNA que são necessárias para efetuar a expressão das sequências codificadoras às quais elas estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Nos procariotas, sequências de controle geralmente incluem promotores, sítios de ligação ribossômicos, e terminadores. Nos eucariotas, sequências de controle geralmente incluem promotores, terminadores e, em alguns casos, intensificadores, transativadores ou fatores de transcrição. O termo "sequência de controle" destina-se a incluir, no mínimo todos os componentes cuja presença é necessária para expressão, e também podem incluir componentes vantajosos adicionais.
[00720] O termo "operacionalmente ligado" refere-se a uma justaposição onde os componentes descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem da maneira pretendida. Uma sequência de controle "operacionalmente ligada" a uma sequência codificadora está ligada de tal maneira que a expressão da sequência codificadora é obtida em condições compatíveis com as sequências de controle. Caso a sequência de controle seja um promotor, fica óbvio para o especialista que um ácido nucleico de cordão duplo é preferivelmente usado.
[00721] Portanto, o vetor mencionado é preferivelmente um vetor de expressão. Um "vetor de expressão" é uma construção que pode ser usada para transformar um hospedeiro selecionado e proporcionar a expressão de uma sequência codificadora no hospedeiro selecionado. Vetores de expressão podem ser por exemplo vetores de clonagem, vetores de binários ou vetores de integração. Expressão compreende transcrição da molécula de ácido nucleico preferivelmente para um mRNA transladável. Elementos reguladores que garantem a expressão em células procarióticas e/ou eucarióticas são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica. No caso de células eucarióticas elas normalmente compreendem promotores que garantem o início da transcrição e opcionalmente sinais de poli-A que garantem o término da transcrição e a estabilização do transcrito. Possíveis elementos reguladores que permitem expressão em células hospedeiras procarióticas compreendem, por exemplo, o promotor PL, lac, trp ou tac em E. coli, e exemplos de elementos reguladores que permitem expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOX1 ou GAL1 em levedura ou o promotor CMV-, SV40-, RSV- (vírus do sarcoma de Rous), intensificador de CMV, intensificador de SV40 ou um íntron de globina em células de mamíferos e de outros animais.
[00722] Além dos elementos que são responsáveis pelo início da transcrição, tais elementos reguladores também podem compreender sinais de término de transcrição, tais como o sítio de SV40-poli-A ou o sítio de tk-poli-A, a jusante do polinucleotídeo. Além disso, dependendo do sistema de expressão usado sequências líderes capazes de direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular o secretar o mesmo no meio podem ser acrescentadas à sequência codificadora da sequência de ácidos nucleicos mencionada e são bastante conhecidas na literatura; vide também os Exemplos em anexo. As sequências líderes são montadas em fase apropriada com sequências de translação, início e término, e preferivelmente, uma sequência líder capaz de direcionar a secreção da proteína transladada, ou de uma porção da mesma, para o espaço periplasmático ou o meio extracelular. Opcionalmente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação N-terminal que confere características desejadas, por exemplo, estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso; vide supra. Neste contexto, vetores de expressão adequados são conhecidos na literatura, tais como o vetor de expressão de cDNA de Okayama-Berg pcDVl (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA ou pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 70217025 e Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) ou pSPORTl (GIBCO BRL).
[00723] Preferivelmente, as sequências de controle de expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar células hospedeiras eucarióticas transfectantes, mas sequências de controle para hospedeiros eucarióticos também podem ser usados. Depois de o vetor ser incorporado no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido em condições adequadas para expressão de alto nível de sequências nucleotídicas, e conforme desejado, pode seguir-se coleta e purificação do polipeptídeo da invenção; vide, por exemplo, os exemplos em anexo.
[00724] Um sistema de expressão alternativo, que pode ser usado para expressar uma proteína que interage com o ciclo celular é um sistema entomológico. O vírus de poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) é usado como um vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência codificadora de uma molécula de ácido nucleico mencionada pode ser clonada em uma região não essencial do vírus, tal como o gene de poliedrina, e colocada sob controle do promotor de poliedrina. Uma inserção bem-sucedida da referida sequência codificadora vai deixar o gene de poliedrina inativo e produzir vírus recombinante sem o revestimento da proteína de revestimento. Os vírus recombinantes são então usados para infectar células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia nas quais a proteína da invenção é expressa (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).
[00725] Elementos reguladores adicionais podem incluir intensificadores transcricionais bem como translacionais. Vantajosamente, os vetores da invenção descritos acima compreendem um vetor selecionável e/ou classificável.
[00726] Genes marcadores selecionáveis úteis para a seleção de células transformadas e, por exemplo, tecido vegetal e plantas são bastante conhecidos pelos especialistas na técnica e compreendem, por exemplo, resistência antimetabólitos como a base de seleção para dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina, canamicina e paromicina (Herrera- Estrella, EMBO J. 2 (1 83), 987-995) e hygro, que confere resistência à higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Genes selecionáveis adicionais já foram descritos, a saber trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar do triptofano; hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar da histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manose-6-fosfato e isomerase que permite que as células utilizem manose (WO 94/20627) e ODC (ornitina descarboxilase) que confere resistência ao inibidor de ornitina descarboxilase, 2-(difluorometil)-DL-omitina, DFMO (McConlogue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) ou desaminase de Aspergillus terreus que confere resistência à Blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).
[00727] Marcadores classificáveis úteis também são conhecidos pelos especialistas na técnica e encontram-se comercialmente disponíveis. Vantajosamente, o referido marcador é um gene codificando luciferase (Giacomin, PI. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) ou β-glicuronidase (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta modalidade é particularmente útil para rastreamento simples e rápido de células, tecidos e organismos contendo um vetor mencionado.
[00728] Como mencionado acima, a molécula de ácido nucleico mencionada pode ser usada isoladamente ou como parte de um vetor para expressar o polipeptídeo da invenção em células para, por exemplo, purificação mas também para terapia genética. As moléculas de ácido nucleico ou vetores contendo as sequências de DNA codificando qualquer um dos polipeptídeos da invenção descritos acima são introduzidas nas células que por sua vez produzem o polipeptídeo de interesse. Terapia genética, que se baseia na introdução de genes terapêuticos em células por técnicas ex vivo ou in vivo, é uma das aplicações mais importantes de transferência de genes. Vetores, métodos ou sistemas de distribuição de genes adequados para terapia genética in vitro ou in vivo estão descritos na literatura e são conhecidos pelo especialista na técnica; vide, por exemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 9 11-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; ou Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. As moléculas de ácido nucleico e vetores mencionados podem ser desenhados para introdução direta ou para introdução via lipossomas, ou vetores virais (por exemplo, adenovirais, retrovirais) na célula. Preferivelmente, a referida célula é uma célula da linhagem germinativa, uma célula embrionária, ou uma célula de óvulo ou derivado da mesma, ainda mais preferivelmente a referida célula é uma célula-tronco. Um exemplo de uma célula-tronco embrionária pode ser, inter alia, uma célula-tronco como aquela descrito por Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.
[00729] A invenção também oferece um hospedeiro transformado ou transfectado com um vetor da invenção. O referido hospedeiro pode ser produzido por introdução do vetor da invenção descrito acima ou da molécula de ácido nucleico da invenção descrita acima no hospedeiro. A presença de pelo menos um vetor ou de pelo menos uma molécula de ácido nucleico no hospedeiro pode mediar a expressão de um gene codificando as construções de anticorpo de cadeia simples descritas acima.
[00730] A molécula de ácido nucleico ou o vetor da invenção descrito acima, que é introduzido no hospedeiro pode integrar-se ao genoma do hospedeiro ou pode ser mantido extracromossomicamente.
[00731] O hospedeiro pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica.
[00732] O termo "procariota" destina-se a incluir todas as bactérias, que podem ser transformadas ou transfectadas com moléculas de DNA ou de RNA para a expressão de uma proteína da invenção. Hospedeiros procarióticos podem incluir bactérias Gram negativas assim como bactérias Gram positivas tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens e Bacillus subtilis. O termo "eucariota" destina-se a incluir células de levedura, de planta superior, de inseto e preferivelmente de mamífero. Dependendo do hospedeiro empregado no procedimento de produção recombinante, a proteína codificada pelo polinucleotídeo da presente invenção pode ser glicosilada ou pode ser não glicosilada. Especialmente preferido é o uso de um plasmídeo ou de um vírus contendo a sequência codificadora do polipeptídeo da invenção e geneticamente fundido ao mesmo um FLAGtag N-terminal e/ou His-tag C-terminal. Preferivelmente, o comprimento do referido FLAG-tag é de cerca de 4 a 8 aminoácidos, ainda mais preferivelmente 8 aminoácidos. Um polinucleotídeo descrito acima pode ser usado para transformar ou transfectar o hospedeiro usando-se qualquer uma das técnicas comumente conhecidos pelos especialistas na técnica. Além disso, métodos para preparar genes fundidos operacionalmente ligados e expressar os mesmos em, por exemplo, células mamíferas e bactérias são bastante conhecidos na literatura (Sambrook, loc cit).
[00733] Preferivelmente, o referido hospedeiro é uma bactéria ou uma célula de inseto, fungo, planta ou animal.
[00734] É particularmente contemplado que o hospedeiro mencionado pode ser uma célula mamífera. Células hospedeiras particularmente preferidas compreendem células CHO, células COS, linhagens celulares de mieloma como SP2/0 ou NS/0. Como ilustrado nos exemplos em anexo, particularmente preferidas como hospedeiros são células CHO.
[00735] Mais preferivelmente a referida célula hospedeira é uma célula humana ou uma linhagem celular humana, por exemplo per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).
[00736] Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se, portanto, a um processo para a produção de um polipeptídeo da invenção, o referido processo compreendendo cultivar um hospedeiro da invenção em condições que permitem a expressão do polipeptídeo da invenção e recuperar o polipeptídeo produzido a partir de cultura.
[00737] Os hospedeiros transformados podem ser desenvolvidos em fermentadores e cultivados de acordo com técnicas conhecidas na literatura para obter desenvolvimento celular ideal. O polipeptídeo da invenção pode ser então isolado do meio de crescimento, de lisados celulares ou de frações da membrana celular. O isolamento e a purificação, por exemplo, dos polipeptídeos da invenção expressos em micróbios podem ser feitos por qualquer meio convencional tal como, por exemplo, separação por cromatografia preparatória e separação imunológica tais como aquelas envolvendo o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais direcionados, por exemplo, contra um tag do polipeptídeo da invenção ou aquelas descritas nos exemplos em anexo.
[00738] Sabe-se na técnica que as condições para o cultivo de um hospedeiro, que permitem a expressão, dependem do sistema hospedeiro e do sistema/vetor de expressão usado em tal processo. Os parâmetros a serem modificados para obter condições que permitem a expressão de um polipeptídeo recombinante são conhecidos na técnica. Portanto, condições adequadas podem ser determinadas pelo especialista na técnica na ausência de dados adicionais da invenção.
[00739] Uma vez expresso, o polipeptídeo da invenção pode ser purificado de acordo com procedimentos tradicionais da técnica, incluindo precipitação em sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, eletroforese em gel entre outros; vide, Scopes, "Protein Purification", Springer- Verlag, N.Y. (1982). Polipeptídeos substancialmente puros com pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidos, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade são mais preferidos, para usos farmacêuticos. Uma vez purificado, parcialmente ou até a homogeneidade como desejado, o polipeptídeo da invenção pode ser então usado terapeuticamente (inclusive extracorporeamente) ou no desenvolvimento e realização de procedimentos de ensaio. Além disso, exemplos de métodos para a recuperação do polipeptídeo da invenção a partir de uma cultura estão descritos em detalhes nos exemplos em anexo.
[00740] Além disso, a presente invenção oferece um kit útil para realização dos métodos da invenção, o kit compreendendo um ácido nucleico ou um anticorpo capaz de detectar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório. Também considerado nesta invenção é o uso do kit descrito neste relatório para a realização dos métodos oferecidos nesta invenção.
[00741] Por exemplo, o referido kit pode compreender um composto ou compostos para determinar especificamente a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório. Além disso, a presente invenção também refere-se ao uso de um composto ou compostos necessários para determinar especificamente a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório para a preparação de um kit para realizar os métodos desta invenção. Com base nos ensinamentos desta invenção, o especialista na técnica sabe quais compostos são necessários para determinar especificamente a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório. Por exemplo, tais compostos podem ser "moléculas de ligação", como, por exemplo, um anticorpo. Particularmente, tais compostos podem ser sondas nucleotídicas, (pares de) iniciador, anticorpos e/ou aptâmeros específicos para pelo menos um alelo mutante do gene da calreticulina ou para um produto genético de pelo menos um alelo mutante do gene da calreticulina definido neste relatório. O kit (a ser preparado no contexto) desta invenção pode ser um kit de diagnóstico. Como mencionado acima, a determinação da presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou de um produto genético do mesmo descrito neste relatório podem ser efetuadas como uma análise autossuficiente. Alternativamente, esta análise pode ser seguida ou precedida pela análise de outros marcadores para malignidades mieloides, tais como mutações de JAK2 e MPL. Também é considerada a determinação simultânea de tais marcadores, como o teste simultâneo para mutações de JAK2 e calreticulina mutante (e, opcionalmente, outros marcadores), ou o teste simultâneo para mutações de JAK2, calreticulina mutante e mutações de MPL (e, opcionalmente, outros marcadores). São considerados nesta invenção kits (ou usos de tais kits) que fornecem meios para tais testes subsequentes ou simultâneos. Por exemplo, o referido kit pode compreender, além dos compostos para determinar especificamente a presença (ou a quantidade) de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina (ou de um produto genético do mesmo), compostos necessários para determinar especificamente a presença mutações de JAK2 e/ou MPL (e opcionalmente outros marcadores), por exemplo anticorpos, sondas nucleotídicas, (pares de) iniciadores, anticorpos e/ou aptâmeros específicos que permitem a detecção específica de mutações de JAK2 e MPL (e opcionalmente outros marcadores).
[00742] O kit (a ser preparado no contexto) desta invenção pode compreender ainda ou ser apresentado com um manual de instrução. Por exemplo, o referido manual de instrução pode orientar o especialista (como) determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório e/ou (como) diagnosticar uma malignidade mieloide. O referido manual de instrução pode compreender orientações para o uso ou a aplicação dos métodos ou usos oferecidos nesta invenção. O kit (a ser preparado no contexto) desta invenção pode compreender ainda substâncias/químicos e/ou equipamentos adequados/necessários para realizar os métodos e usos desta invenção. Por exemplo, tais substâncias/químicos e/ou equipamentos são solventes, diluentes e/ou tampões para estabilizar e/ou guardar compostos necessários para determinar especificamente a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina ou a presença ou quantidade de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina definidos neste relatório.
[00743] Conforme usado neste relatório, os termos "compreendendo" e "incluindo" ou variações gramaticais dos mesmos devem ser considerados como especificando os aspectos, inteiros, etapas ou componentes apresentados, mas não impedem o acréscimo de um ou mais aspectos, inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos. Este termo abrange os termos "consistindo em" e "consistindo essencialmente em".
[00744] Assim sendo, os termos "compreendendo"/"incluindo"/"tendo" significam que qualquer outro componente (ou também aspectos, inteiros, etapas entre outros) pode estar presente.
[00745] O termo "consistindo em" significa que nenhum outro componente (ou também aspectos, inteiros, etapas entre outros) pode estar presente. O termo "consistindo essencialmente em" ou variantes gramaticais do mesmo quando usado neste relatório devem ser considerados como especificando os aspectos, inteiros, etapas ou componentes apresentados mas não impedem o acréscimo de um ou mais aspectos, inteiros, etapas, componentes ou grupos dos mesmos, mas somente os aspectos, inteiros, etapas, ou componentes adicionais ou grupos dos mesmos não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, dispositivo ou método reivindicados.
[00746] Assim sendo, o termo "consistindo essencialmente em" significa que outros componentes específicos (ou também aspectos, inteiros, etapas entre outros) podem estar presentes, a saber aqueles que não afetam materialmente as características essenciais da composição, dispositivo ou método, em outras palavras, o termo "consistindo essencialmente em" (que pode ser intercambiavelmente usado neste relatório com o termo "compreendendo substancialmente"), permite a presença de outros componentes na composição, dispositivo ou método além dos componentes obrigatórios (ou também aspectos, inteiros, etapas entre outros), contanto que as características essenciais do dispositivo ou método não sejam materialmente afetados pela presença de outros componentes.
[00747] O termo "método" refere-se a maneiras, meios, técnicas e procedimentos para a realização de uma dada tarefa incluindo, pesl, as maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos, ou facilmente desenvolvidos a partir de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos por especialistas nas artes química, biológica e biofísica.
[00748] Conforme usado neste relatório, o termo "isolado" refere-se a uma composição que fora removida de sua localização in vivo. Preferivelmente as composições ou compostos isolados da presente invenção são substancialmente livres de outras substâncias (por exemplo, outras proteínas ou outros compostos) que estão presentes em sua localização in (i.e., composições ou compostos purificados ou semipurificados).
[00749] Conforme usado neste relatório o termo "cerca de" refere-se a ± 10%.
[00750] A presente invenção refere-se a um dos seguintes itens: 1. Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes. 2. Método de acordo com o item 1, onde a referida malignidade mieloide é selecionada do grupo que consiste em mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (ET) and anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T). 3. Método de acordo com o item 1 ou 2, onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (d); e (f) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d). 4. Método de acordo com o item 3, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, 433,; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, 434; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, 434; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (d); e (f) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d). 5. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 4, onde o referido alelo mutante possui uma mutação "frameshift" no éxon 9 do gene da calreticulina em comparação com o gene da calreticulina do tipo selvagem, onde a referida mutação "frameshift" é a deleção de um nucleotídeo ou a adição de dois nucleotídeos. 6. Método de acordo com qualquer um dos itens 1 a 5, onde o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 4 11, 415, 419, 423, 427, ou 431; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d); onde o referido alelo mutante is DNA, preferivelmente DNA genômico. 7. Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, o referido método compreendendo - determinar a presença de um produto genético de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando o produto genético está presente. 8. Método de acordo com o item 7, onde os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante, onde a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (d); e (f) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d). 9. Método de acordo com o item 7 ou 8, em que a referida proteína calreticulina mutante é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (f) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d). 10. Método de acordo com qualquer um dos itens 7 a 9, onde o referido produto genético é mRNA ou uma proteína. 11. Ácido nucleico selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO:4; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d). 12. Ácido nucleico de acordo com o item 11, onde o referido ácido nucleico é selecionado do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido como aquela representada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (b) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85 86 87 89 90 91 93 94 95 97 98 99 101 102 103 105 106 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (c) um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar do ácido nucleico definido no item (a) ou (b); (d) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica com pelo menos 70 % de identidade com a sequência nucleotídica dos ácidos nucleicos de qualquer um dos itens (a) a (c); e (e) um ácido nucleico compreendendo uma sequência nucleotídica que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico de qualquer um dos itens (a) a (d). 13. Proteína selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2 ou 3; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (c) uma proteína como aquela definida no item (a) ou (b) onde um ou mais aminoácidos são deletados, inseridos, adicionados ou substituídos; (d) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4; (e) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a) ou (c); (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (d) ou (e). 14. Proteína de acordo com o item 13, onde a referida proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, ou 143; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (d); e (f) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico sendo degenerada como resultado do código genético da sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d). 15. Proteína de acordo com o item 13 ou 14, onde a referida proteína é selecionada do grupo que consiste em (a) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácidos nucleicos como aquela representada na SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 4 11, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432, ou 433; (b) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (c) uma proteína codificada por uma molécula de ácido nucleico codificando uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434; (d) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido nucleico que hibridiza em condições estringentes para a fita complementar de moléculas de ácido nucleico definidas no item (a); (e) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (d); e (f) uma proteína tendo pelo menos 70 % de identidade com a proteína de qualquer um dos itens (a) a (e); e (g) uma proteína compreendendo uma sequência de aminoácido codificada por um ácido que é degenerada como resultado do código genético para a sequência nucleotídica de um ácido nucleico definido no item (a), (c) ou (d). 16. Proteína de acordo com o item 13 ou 14, tal como uma proteína consistindo em 15 a 25 aminoácidos contíguos da proteína mostrada na SEQ ID NO: 4, para uso como vacina. 17. Anticorpo que se liga especificamente à proteína do item 13 ou 14. 18. Inibidor de uma calreticulina mutante para uso no tratamento de mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (ET), ou anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T) para uso no tratamento de mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (ET), ou anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T); ou a proteína para uso como vacina de acordo com o item 16 no tratamento de mielofibrose primária (PMF), trombocitemia essencial (ET), ou anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T); onde a referida calreticulina mutante é uma proteína calreticulina mutante definida em qualquer um dos itens 12 a 14. 19. Inibidor de acordo com o item 18, onde o referido inibidor é um anticorpo inibitório.
[00751] A presente invenção é ainda descrita com referência às figuras e exemplos não limitativos a seguir.
[00752] As Figuras mostram:
Figura 1. Validação das mutações do gene de CALR nos pacientes 191 e 296 pelo sequenciamento de Sanger
[00753] Estão representados traços do sequenciamento de Sanger. As caixas em volta das letras das sequências assinalam as bases que são perdidas devido aos eventos de deleção. A Fig. 1 mostra SEQ ID NOs: 1324 a 1327.
Figura 2. Frequência das mutações de CALR em malignidades mieloides
[00754] A: Distribuição das mutações de JAK2, MPL e CALR nas três entidades patológicas de MPN clássicas. B: A frequência de pacientes com CALR mutante em diferentes malignidades mieloides está indicada pelas barras escuras. N, números totais de pacientes analisados para uma entidade patológica específica. C: Distribuição das mutações de JAK2, MPL, CALR e SF3B1 em 24 pacientes com anemia refratária com sideroblastos em anel associada à trombocitose acentuada. PV, policitemia vera; ET, trombocitemia essencial; PMF mielofibrose primária; dnAML, AML: CML de novo, leucemia mieloide crônica; MDS, síndrome mielodisplásica; CMML, leucemia mielomonocítica crônica; RARS-T, anemia refratária com sideroblastos em anel associada à trombocitose acentuada.
Figura 3. Padrão mutacional das mutações de CALR em pacientes com MPN.
[00755] A barra preta larga representa o éxon 9 de CALR, a barra estreita a 3 ' UTR gene, a linha intrônica as regiões intrônica e intergênica.
[00756] A: estão indicadas as sequências de cDNA no início e no final do éxon 9. Abaixo da sequência de cDNA estão as sequências de aminoácidos derivadas das três fases de leitura alternativas. B: As três fases de leitura resultam em composições peptídicas diferentes, especificamente em termos da carga dos aminoácidos. C: Resumo de todas as mutações detectadas em pacientes com MPN e sua posição no éxon 9 de CALR. As barras indicam eventos de deleções, as letras sequências inseridas. Inserções e deleções independentes estão representadas acima do esquema do éxon 9, eventos de inserção/deleção combinados abaixo. D: A constituição peptídica específica de CALR do tipo selvagem e dos dois tipos de mutação detectados com mais frequência. B, D: Cada caixa representa um aminoácido. As caixas pretas com o sinal '-' são aminoácidos carregados negativamente, as caixas com o sinal '+' são aminoácidos carregados positivamente. As caixas cruzadas representam códons de interrupção. E: Frequências relativas de todos os 36 tipos de mutação observados em CALR.
[00757] A Fig. 3 mostra as SEQ ID NOs: 1328 a 1339. Figura 4. Associação de mutações de CALR com dissomias uniparentais e hierarquias clonais em pacientes com múltiplas mutações somáticas
[00758] Painel A: Dados do arranjo Affymetrix SNP 6.0 estão mostrados para as três amostras que tinham mais de 50% de carga de mutações de CALR. Cada ponto representa um único SNP. O eixo dos x mostra a posição genômica, o eixo dos y representa o estado alélico do SNP. (estado heterozigótico = diferença alélica de 0). Os dados do arranjo mostram dissomia uniparental 19p de tamanhos diferentes nas três amostras. As caixas indicam a região genômica das dissomias uniparentais. À direita de cada gráfico de diferença alélica, estão mostrados os resultados da análise do fragmento do éxon 9 de CALR para a mesma amostra. Em cada caso a carga do alelo mutante é maior que a carga do alelo do tipo selvagem. Painel B: Hierarquias clonais derivadas da análise de colônias de progenitores hematopoiéticos. O paciente H_0191 (top) ancorava mutações somáticas em um total de 4 genes. Como mostrado no gráfico de barras, 51% das colônias tinham mutações em CALR, GAB 2 e METTL11B. A outra metade das colônias (48%) tinha mutações em todos os quatro genes indicando que a mutação em PHF16 foi adquirida posteriormente e deu origem a um subclone. Adicionalmente, uma colônia ancorava uma deleção de um par de bases em CALR, diferente da deleção de 52 pares de base que foi observada na amostra de granulócito e todas as outras colônias desse paciente. Como essa colônia não tinha qualquer das outras mutações observadas no paciente ela representa um clone independente embora esta conclusão baseie-se apenas em uma única colônia. O paciente H_0296 (parte inferior) tinha mutações somáticas em CALR, PIK3R1 e C10ORF71. Todas as colônias analisadas para esse paciente tinham todas as três mutações. Uma colônia mostrou uma deleção de 18 pares de bases em CALR além da deleção de 1 par de bases observada nesse paciente. Ambas as mutações se deram no mesmo alelo.
Figura 5. Significância clínica das mutações de CALR
[00759] Estimativas do desfecho em pacientes com trombocitemia essencial ou mielofibrose primária estratificados de acordo com sua mutação somática. Painel A: Análise de Kaplan-Meier do tempo de sobrevida total em pacientes com mielofibrose primária. Os subgrupos foram comparados usando-se o teste de log-rank. Os pacientes com mielofibrose portadores de uma mutação somática de CALR tiveram o tempo de sobrevida total maior que aqueles com JAK2-V617F [valor médio 21.4 anos (95% CI, 17.1-22.9) vs. 11.0 anos (95% CI, 7.8-14.4), respectivamente; P<0.001] ou mutação de MPL [valor médio 8.2 anos (95% CI, 2.0-não atingido); P<0.001], embora nenhuma diferença tenha sido observada entre os 2 últimos subgrupos. Painel B: Análise de Kaplan-Meier do tempo de sobrevida total em pacientes com trombocitemia essencial. Os subgrupos foram comparados usando-se o teste de log-rank. O valor médio para o tempo de sobrevida total não foi atingido em nenhum dos subgrupos. Os pacientes com mutação de CALR tiveram o tempo de sobrevida total maior em comparação com aqueles portadores de JAK2-V617F. O tempo de sobrevida total em 10 anos foi de 96.9% (95% CI, 91.7-98.8%) no primeiro vs. 91.1% (95% CI, 87.1-93.9%) no segundo (P=0.043). Painel C: Incidência cumulativa de trombose em pacientes com trombocitemia essencial. Morte na ausência do evento de interesse foi considerada como um evento competitivo, e os subgrupos foram comparados com o teste Pepe e Mori. Os pacientes portadores de uma mutação no éxon 9 de CALR tiveram uma incidência cumulativa mais baixa de trombose em comparação com aqueles portadores de JAK2-V617F: a incidência cumulativa em 10 anos foi de 11.0% (95% CI, 6.3-17.1%) no primeiro vs. 21.0% (95% CI, 16.6-25.7%) no segundo (P=0.003).
Figura 6. Análise funcional da mutação tipo 1 de CALR
[00760] Painel A: A viabilidade celular de células Ba/F3 expressando um vetor vazio (GFP), CALR do tipo selvagem (CALR wt-GFP) ou CALR mutante (CALR del52-GFP) foi avaliada depois de 72 horas na presença de concentração crescente de interleucina-3. RLU, unidades de luminescência relativa. As barras de erro representam o erro padrão da média. Painel B: A proliferação celular de células Ba/F3 expressando um vetor vazio (GFP), CALR do tipo selvagem (CALR wt-GFP) ou CALR mutante (CALR del52-GFP), na ausência de interleucina-3 foi determinada durante 7 dias. As barras de erro representam o erro padrão da média. Painel C: mostra a ativação de STAT5 em resposta à interleucina-3. As células Ba/F3 expressando o vetor vazio (GFP), a CALR do tipo selvagem (wt), ou a CALR mutante (del52) foram definhadas por 4 horas em meio livre de soro sem interleucina-3 e foram então estimuladas por 20 minutos com 100 pg/mL e 1 ng/mL de interleucina-3, como indicado. Análise de Western Blotting foi feita nos lisados celulares com anticorpos contra pYSTAT5, STAT5 e CALR. Um anticorpo contra GAPDH foi usado como controle de carga. Painel D: Imunofluorescência foi efetuada contra CALR (terceiro painel) e um marcador específico para o retículo endoplasmático (Calnexina, segundo painel), em HEK293T transfectadas com as respectivas construções. A CALR do tipo selvagem fica colocalizada com calnexina, no retículo endoplasmático (último painel). No entanto, a CALR mutante CALR não fica confinada no retículo endoplasmático. O núcleo é colorido com o corante DAPI (primeiro painel).
Figura 7. A sensibilidade das células Ba/F3 ao SAR302503.
[00761] Células Ba/F3 expressando o vetor vazio (GFP), CALR do tipo selvagem (CALR wt-GFP) ou CALR mutante (CALR del52-GFP) foram analisadas definindo-se a viabilidade celular depois de 48 horas na presença SAR302503 decrescente. Para a viabilidade relativa, as unidades de luminescência relativa foram normalizadas para o controle de DMSO. As barras de erro representam o erro padrão da média.
Figura 8.
[00762] Análise de Western Blotting foi feita examinando-se o soro dos quatro camundongos imunizados, contra lisados de células HEK293T expressando a CALR mutante del52. A figura mostra que o soro de todos os quatro camundongos imunizados não tinha anticorpos contra o peptídeo de calreticulina mutante antes da imunização - p (faixas pré-imunizadas). Eles geraram anticorpos específicos depois de 2 doses de reforço.
Figura 9.
[00763] Análise de Western Blotting foi feita examinando-se o soro dos quatro camundongos imunizados, contra lisados de células HEK293T expressando o Aéxon9 de CALR. A figura mostra que o soro de todos os quatro camundongos imunizados não tinha anticorpos contra o Aéxon9 de CALR nos soros pré-imunizados (p) ou depois das doses de reforço.
Figura 10.
[00764] Análise de Western Blotting foi feita examinando-se o soro dos quatro camundongos imunizados, contra lisados de células HEK293T expressando a CALR mutante del52. A figura mostra que o soro de todos os quatro camundongos imunizados tinha mais anticorpos específica contra calreticulina mutante depois da terceira dose de reforço.
[00765] Os Exemplos ilustram a invenção.
Exemplo 1: Mutações somáticas de calreticulina em mielofibrose primária e trombocitemia essencial Material e Métodos Amostragem de pacientes
[00766] Estudamos pacientes com neoplasmas mieloproliferativos negativos para o cromossoma Philadelphia que foram acompanhados na Medical University of Vienna, Áustria, e no Department of Hematology Oncology, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavia, Itália. As investigações foram aprovadas pelas comissões de ética de ambas as instituições, e todos os pacientes deram consentimento informado por escrito. O diagnóstico de policitemia vera, trombocitemia essencial e mielofibrose primária foi feito de acordo com os critérios de 2008 da Organização Mundial de Saúde (Sverdlow et al., 2008).
Critérios de diagnóstico
[00767] O diagnóstico de policitemia vera, trombocitemia essencial e mielofibrose primária foi feito de acordo com os critérios em uso na ocasião da primeira observação, como previamente relatado (Passamonti et al. 2004). Em 2002 os critérios da Organização Mundial de Saúde (WHO) foram adotados (Vardiman et al., 2002) e em 2008 sua revisão foi implementada (Swerdlow et al., 2008). As análises das mutações de JAK2 e MPL foram feitas da maneira previamente descrita (Passamonti et al., 2010a; Rumi et al., 2013; Passamonti et al., 2011) em Pavia e da maneira apresentada abaixo em Viena. Fibrose da medula óssea foi avaliada semiquantitativamente observando-se as diretrizes europeias de consenso (Thiele et al., 2005). Os eventos trombóticos foram definidos como descrito em detalhes anteriormente (Marchioli et al., 2013). Os pacientes foram tratados de acordo com as recomendações que foram formalizadas pelas European Leukemia Net in 2011 (Barbui et al., 2011).
Avaliação das mutações de JAK2-V617F, JAK2-éxon 12 e MPL-W515L em Viena
[00768] Um ensaio de PCR alelo-específico foi usado para detectar a mutação JAK2-V617F. Uma mistura de iniciadores consistindo em 4 μM de um iniciador de sentido normal comum (gtttcttAGTGCATCTTTATTATGGCAGA (SEQ ID NO: 1340)), 2 μM de um de um iniciador de sentido invertido específico para o alelo do tipo selvagem (TTACTCTCGTCTCCACAGAC (SEQ ID NO: 1341)) e 2 μM de um de um iniciador de sentido invertido específico para o alelo mutante (aaaTTACTCTCGTCTCCACAGAA (SEQ ID NO: 1342)) foi preparado. Os dois iniciadores de sentido invertido foram marcados fluorescentemente com 6-carboxifluoresceína (6-FAM) na extremidade 5'. Uma reação de PCR foi estabelecida usando a DNA polimerase AmpliTaq Gold com tampão Gold e MgCl2 (Applied Biosystems) contendo 1,1 μL do tampão 10x PCR GOLD, 0,66 μL de MgCl225 mM, 0,44 μL de dNTPs 2.5 mM, 1,4 μL da mistura de iniciadores, 0,05 μL da polimerase AmpliTaq Gold (5 U/μL), 6,36 μL de H2O e 1 μL de DNA genômico (10 ng/μL). A PCR foi efetuada da seguinte maneira: 95°C por 5 min - 36 x (94°C por 30 seg, 62.2°C por 30 seg, 72°C por 30 seg) - 72°C por 15 min - 8°C retenção. Os produtos de PCR foram dimensionados em um analisador "3130x1 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems) e os dados foram analisados usando-se o software Gene Mapper (Applied Biosystems).
[00769] O ensaio usado para detectar mutações no éxon 12 de JAK2 já foi relatado (Li et al., 2008). Para testar a presença de MPL-W515L o seguinte ensaio de PCR alelo-específico foi usado. Uma mistura de iniciadores consistindo em 8 μM de um iniciador de sentido normal comum (GTTTCTTCCGAAGTCTGACCCTTTTTG (SEQ ID NO: 1343)), 4 μM de um iniciador de sentido invertido específico para o alelo do tipo selvagem (GTAGTGTGCAGGAAACTGCC (SEQ ID NO: 1344)) e 4 μM de um iniciador de sentido invertido específico para o alelo mutante (AAAGTAGTGTGCAGGAAACTGCA (SEQ ID NO: 1345)) foi preparado. Os dois iniciadores de sentido invertido foram marcados fluorescentemente com 6-carboxifluoresceína (6-FAM) na extremidade 5'. Uma reação de PCR foi estabelecida descrita acima para a mutação JAK2-V617F. A PCR foi efetuada da seguinte maneira: 94°C por 10 min - 36 x (94°C por 30 seg, 62.2°C por 30 seg, 72°C por 30 seg) - 72°C por 15 min - 8°C retenção. Os produtos de PCR foram dimensionados em um analisador "3130x1 Genetic Analyzer" (Applied Biosystems) e os dados foram analisados usando-se o software Gene Mapper (Applied Biosystems).
Sequenciamento do exoma total
[00770] DNA genômico foi isolado de granulócitos do sangue periférico (tecido tumoral) e linfócitos T CD3+ (tecido de controle) de acordo com procedimentos tradicionais. Bibliotecas de DNA foram geradas usando-se o kit "NEB Next DNA Sample prep kit" (conjunto de reagentes) (New England Biolabs, Ipswich, MA) e enriquecimento com exoma total foi feito usando-se o kit "Sure Select Human All Éxon kit" (Agilent, Santa Clara, CA) de acordo com as instruções dos fabricantes. As bibliotecas foram sequenciadas em um sistema Illumina HiSeq2000 (Illumina, San Diego, CA) seguindo-se as recomendações dos fabricantes. Vide Tabela 1 Suplementar para detalhes sobre os parâmetros de sequenciamento de exoma total. Tabela 1 Suplementar Tabela 2 Suplementar: Iniciadores usados para analisar o estado mutacional da CALR
Análise do sequenciamento do exoma total
[00771] As leituras de sequenciamento foram alinhadas contra o genoma humano de referência (hgl8) usando BWA v0.5.9 (Li & Durbin, 2009). O kit de ferramentas para análise do genoma (GAT) v1.5 (McKenna et al., 2010) foi usado para pós-processar os alinhamentos de acordo com as melhores normas práticas v3 de GATK. Os dados de cobertura apresentados na Tabela 1 Suplementar foram calculados a partir dos arquivos de alinhamentos pós-processados usando o CalculateHsMetrics.jar script da Picard (http://picard.sourceforge.net). Os arquivos de alinhamentos pós-processados foram ainda analisados por duas chamadas de variantes ("variant callers"):
[00772] "GATK's Unified Genotipor" (DePristo et al., 2011) foi usado para chamar variantes de nucleotídeo único e pequenas inserções/deleções das amostras de DNA granulocítico. As listas de variantes preliminares foram ainda processadas usando-se o Variant Quality Score Recalibrator (GATK) para gerar listas de variantes recalibradas. As variantes foram então anotadas usando-se ANNOVAR versão 2012-05-25 (Wang et al., 2010). Filtramos as variantes que são encontradas em éxons codificadores e que afetam a composição de aminoácidos da proteína, assim como variantes em sítios de emenda.
[00773] A ferramenta Varscan 2.3.2 (Koboldt et al., 2012) foi usada para chamar variantes somáticas comparando alinhamentos pós- processados da amostra de DNA granulocítico com os alinhamentos das amostras de linfócitos T do mesmo paciente. Varscan foi usado de acordo com as instruções do programador. Samtools 0.1.18 (Li et al., 2009) gerou os arquivos mpileup necessários como a entrada para Varscan. As listas de hits do Varscan foram anotadas por ANNOVAR e filtradas da maneira descrita acima. Interseção das listas de variantes recuperadas de dois pipelines de chamadas de variantes, como a seguir, gerou listas de variantes finais. GATK fornece um escore para a probabilidade de uma variante ser uma variante verdadeira, que é o escore VQSLOD. Varscan fornece um valor p para probabilidade de uma variante ser somática. As exigências básicas para chamada de variante de único nucleotídeo (SNV) final foram o fato de que as variantes tinham que ser chamadas pelos dois pipelines de chamada de variantes e o fato de a variante na amostra de granulócito não ter sido classificada como "baixa qualidade" pelo GATK. De todas as SNVs se enquadrando nesta categoria, foram chamadas todas aquelas que tinham um escore VQSLOD > 0 e um valor p somático de < 0.05. Também chamamos variantes com um VQSLOD [-2;0] mas exigimos um valor p somático de <0.01 para elas. A chamada de variantes por inserção / deleção é mais complexa que a chamada de SNVs. Para não perder variantes verdadeiras, exigimos apenas que uma inserção / deleção fosse encontrada nos dois pipelines. Nenhuma outra medida de qualidade ou valores p foram exigidos para chamar estas variantes.
Sequenciamento de Sanger
[00774] Iniciadores para o sequenciamento de Sanger foram desenhados usando-se a ferramenta PrimerZ (http://ncbi36.genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/beginDesign.do) ou a ferramenta Primer3 (http://www.bioinformatics.nl/cgi- bin/primer3plus/primer3plus.cgi/). Sequências de iniciadores estão listadas na Tabela 2 Suplementar.
[00775] PCRs foram feitas usando-se o AmpliTaq Gold 360 Mastermix (Applied Biosystems / Life Technologies, Paisley, UK).
[00776] Um programa de "touchdown" foi usado para a PCR: 95 °C, 5 min - 10x (94 °C, 30 seg - 67 °C, 30 seg [-1 °C por ciclo] - 72 °C, 30seg.) - 29x (94 °C, 30 seg - 57 °C, 30 seg - 72 °C, 30 seg) -72 °C, 10 min. 10 °C, retenção. Para o sequenciamento de foi usado o kit "BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems) com o seguinte programa: 96 °C, 1 min. -25x (96 °C, 10 seg. - 50 °C, 5 seg. - 60 °C, 4 min.) - 10 °C retenção. Os traços do sequenciamento foram ligados em um 3130x1 Genomic Analyzer (Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Análise das sequências foi feita usando-se o software Sequencher 4.9 (Gene Codes, Ann Arbor, MI).
Análise dos fragmentos de PCR para detecção de mutações no éxon9 de CALR
[00777] Iniciadores foram desenhados para o éxon 9 de CALR e do iniciador de sentido normal foi marcado com 6-FAM (Tabela 2 Suplementar). PCR foi feita da seguinte maneira: 95 °C, 10 min. - 10x (94 °C, 15 seg. - 55 °C, 15 seg. - 72 °C, 30 seg.) - 20x (89 °C, 15 seg. - 55 °C, 15 seg. - 72 °C, 30 seg.) - 72 °C, 20 min - 10 °C, retenção. Os produtos de PCR fora diluídos 1:25 em água e dimensionados em um 3130x1 Genomic Analyzer (Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Os resultados foram analisados usando-se o software Gene Mapper versão 4.0 (Applied Biosystems).
Subclonagem dos produtos de PCR
[00778] Os produtos de PCR foram subclonados com o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen / Life Technologies, Paisley, UK) seguindo-se as instruções do fabricante usando bactérias TOP-10. Colônias bacterianas individuais foram apanhadas no dia seguinte e expandidas em uma cultura de uma noite. Os plasmídeos foram extraídos com o kit "QIAprep Spin Mini Prep kit" (Qiagen, Hilden, Alemanha). Foi estabelecida uma reação de sequenciamento usando o kit "BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit" (Applied Biosystems): 50 - 200 ug de plasmídeo, 4 μL de iniciador, 1 μL da mistura BigDye Terminator, 1 μL de tampão de sequenciamento e água para HPLC até 10 μL. O programa de sequenciamento foi 96 °C, 5 min. -25x (96 °C, 1 min. - 50 °C, 5 seg. - 60 °C, 4 min.) - 10 °C retenção.
Análise de microarranjos de SNP
[00779] Amostras de DNA foram processadas e hibridizadas para arranjos de "Genome-Wide Human SNP 6.0" (Affymetrix) de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante. Os dados brutos foram analisados pelo software Genotyping Console versão 3.0.2 (Affymetrix). As amostras foram avaliadas quanto a aberrações cromossômicas (deleções, ganhos e dissomias uniparentais adquiridas) como implementado no software Genotyping Console.
Clonagem de mutações no éxon 9 de CALR
[00780] A CALR do tipo selvagem e mutante foi amplificada a partir do clone adquirido na Source Biosciences e clonada nos sítios Xhol e EcoRI na construção retroviral pMSCV-IRES-GFP. A CALR do tipo selvagem foi amplificada usando os seguintes iniciadores (FP - ATGCCTCGAGCCGCCACCATGCTGCTATCCGTGCCGCTGCTGCTC (SEQ ID N°: 1346) e RP- ATGCGAATTCCTACAGCTCGTCCTTGGCCTGGCC (SEQ ID NO: 1347) ).
[00781] A CALR mutante foi amplificada em dois fragmentos seguido por PCR aninhada (FP1 -ATGCCTCGAGCCGCCACCATGCTGCTATCCGTGCCGCTGCTGCTC (SEQ ID N°: 1346), RP1 - CCTCATCATCCTCCTTGTCCTCTGCTCCTCGTCCTG (SEQ ID NO: 1348), FP2 - CAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGATGAGG (SEQ ID NO: 1349), RP2 - ATGCCCGCGGCTAGGCCTCAGTCCAGCCCTGGAGG (SEQ ID NO: 1350))
Produção e transdução de vírus
[00782] O retrovírus foi gerado e as células foram transduzidas de maneira já descrita (Zuber et al., 2013). Em resumo, células PlatE (75% confluentes um prato de 10 cm) foram transfectadas com 20 μg do respectivo vetor viral usando-se o kit "Calcium Phosphate Transfection Kit" (Sigma #CAPHOS). O meio foi trocado depois de 24 horas e o sobrenadante viral foi coletado 36, 40, 44 e 60 horas depois da transfecção. 1 milhão de células Ba/F3 foram transduzidas o sobrenadante viral fresco, em placas de 6 poços por espinoculação (4 μg/mL de polibrene, 1350g, 30 minutos a 32°C), em cada ponto de coleta de vírus. As células foram analisadas quanto à eficiência de transdução por citometria de fluxo, 48 horas depois da etapa de transdução final. As células positivas para GFP foram classificadas por FACS e a eficiência de classificação foi analisada por citometria de fluxo.
Ensaios de proliferação e viabilidade
[00783] Para avaliar a viabilidade das células Ba/F3 transduzidas na presença de interleucina-3, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 5000 células por poço em triplicata em uma diluição seriada de interleucina-3 (dose mais alta 25 ng/mL). Depois de 72 horas a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega).
[00784] Para determinar a proliferação celular na ausência de interleucina-3, células Ba/F3 foram plaqueadas em placas de 12 poços a 1000000 células por poço em triplicata e cultivadas por 7 dias em RPMI completo (com 10% de FCS, Pen/Strep e L-glutamina) sem interleucina-3. A cada 24 horas o número de células era avaliada usando-se o contador de células CASY® (Roche Innovatis).
[00785] Para definir a sensibilidade ao inibidor SAR302503 (Sanofi), células Ba/F3 foram plaqueadas em placas de 96 poços a 25000 células por poço em triplicata em uma diluição seriada de SAR302503 (concentração mais alta 40 μM) e na presença de 10 ng/mL de interleucina-3. Depois de 48 horas a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de viabilidade celular luminescente CellTiter-Glo® (Promega).
Estimulação com interleucina-3 e análise de Western Blotting
[00786] Células Ba/F3 foram cultivadas em RPMI completo (10% de FCS, penicilina/estreptomicina, L-glutamina) na presença de 1 ng/mL de interleucina-3. As células foram definhadas em meio livre de soro sem interleucina-3 por 4 horas. A estimulação foi feita com a respectiva concentração de interleucina-3, por 20 minutos. As células foram peletizadas e a extração de proteínas foi feita de maneira já descrita (Corvinus et al., 2005). Em resumo, tampão de extrato de células totais completo (contendo os inibidores de protease e fosfatase) foi adicionado às células, e a lise foi feita por 3 ciclos consecutivos de congelamento- descongelamento com nitrogênio líquido. Os lisados foram coletados depois de centrifugação por 20 minutos a 20.000 g. A concentração de proteína foi medida usando-se o reagente de Bradford. Análise de Western Blotting foi efetuada por técnicas tradicionais e 50 μg de proteína foram carregados por poço. Os seguintes anticorpos foram usados - pYStat5 (Invitrogen, #71-6900), Stat5 (Santa Cruz, sc-836), Calreticulina (Millipore, MABT145), GAPDH (Santa Cruz, sc-32233), HRP anti-coelho (GE, NA934) e HRP anti-camundongo (GE, NA931).
Imunofluorescência
[00787] Células HEK293T foram semeadas em lamínulas de vidro revestidas com 0.1% de gelatina transfectadas com os plasmídeos CMV-CALR wt e CMV-CALR del52 por lipofecção (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante, por 24 horas. A coloração com ER foi visualizada usando-se anticorpo anti-Calnexina (ab31290, abcam); anticorpo secundário anti-camundongo AlexaFluor 546 (Invitrogen). Anticorpo anti-calreticulina (MABT145, Millipore) foi usado para marcar CALR; anticorpo secundário anti-coelho AlexaFluor 594 (Invitrogen). As lâminas foram visualizadas usando-se um microscópio LSM780 (Carl Zeiss, Alemanha) com uma unidade multidetectora GaAsP e dois PMTs. O pinhole foi fixado em 1AU em cada canal. As imagens foram feitas sequencialmente, e os canais selecionados, para reduzir a sobreposição. As imagens foram feitas a 100x e analisadas com ImageJ (NIH, fonte aberta.).
Análise estatística
[00788] A análise estatística foi feita com o uso de métodos tradicionais. O teste de hipóteses foi realizado com uma abordagem não paramétrica. Todos os testes tinham duas caudas e os valores P foram considerados significativos quando inferiores a 0.05. Microsoft Office Excel (Copyright Microsoft Corp), Stata 11.2 (Copyright StataCorp LP) e R 2.15.2 (R Core Team, 2012) foram usados para gerenciamento e análise dos dados. A incidência cumulativa de complicações trombóticas foi estimada com uma abordagem de risco competitivo de acordo com o método de Kalbfleisch-Prentice (Kalbfleisch & Prentice, 1980). Morte na ausência do evento de interesse foi considerada como um evento competitivo.
Resultados Sequenciamento do exoma total revela mutações recorrentes de CALR em PMF (mielofibrose primária)
[00789] DNA genômico de granulócitos do sangue periférico (tecido tumoral) e linfócitos T CD3+ (tecido de controle) de 6 pacientes com PMF foi analisado usando-se sequenciamento do exoma total. Validação independente das variantes detectadas usando sequenciamento de Sanger clássico confirmou mutações somáticas entre dois e doze genes por paciente. O único gene afetado de forma recorrente foi CALR codificando calreticulina. Dois pacientes ancoravam deleções somáticas no éxon 9 de CALR. Subclonagem e sequenciamento do produto de PCR revelaram que o paciente 191 tinha uma deleção de 52 pares de bases e o paciente 296 ancorava uma deleção de um par de bases (Figura 1). Como a deleção de 52 pares de bases no paciente 191 foi anotada incorretamente anotado como sendo uma deleção de um par de bases acoplada com uma variante de único nucleotídeo por nosso pipeline de análise de chamada de variantes, o alinhamento de sequências do paciente 191 foi revisado manualmente. Um desalinhamento das leituras de sequenciamento cobrindo o sítio de mutação foi observado. O alinhamento incorreto foi devido a um elemento repetitivo na região genômica afetada. Dando-se continuidade a esta descoberta os alinhamentos de sequências para os outros quatro pacientes foram investigados e uma inserção de 5 pb recorrente foi detectada em todos os 4 pacientes. As mutações de CALR encontradas nos pacientes por sequenciamento do exoma total foram confirmadas como sendo somáticas por sequenciamento de Sanger das amostras de DNA de linfócitos T correspondentes. Em resumo, todos os seis pacientes com PMF analisados por sequenciamento do exoma total ancoravam mutações somáticas por inserção ou deleção no éxon 9 de CALR.
Frequência de mutações no éxon 9 de CALR em pacientes com neoplasma mieloproliferativo (MPN)
[00790] Para estimar a prevalência de mutações de CALR em MPN uma coorte de 896 pacientes com MPN foi rastreada quanto a mutações por inserção e deleção no éxon 9 de CALR usando dimensionamento de alta resolução de produtos de PCR marcados com corante fluorescente. Esta coorte incluía 382 pacientes com policitemia vera (PV), 311 com trombocitemia essencial (ET) e 203 com mielofibrose primária (PMF) (Tabela 1). 150 amostras ancorando inserções ou deleções em CALR (17%) foram identificadas. As mutações foram independentemente validadas por sequenciamento de Sanger. Em PV não foram observadas mutações de CALR. Em ET e PMF, 78 (25%) e 72 (35%) pacientes tinham mutações em CALR, respectivamente (Tabela 1). Todos os pacientes foram genotipados para a mutação JAK2-V617F. Os pacientes com PV negativos para esta mutação foram examinados quanto a mutações no éxon 12 de JAK2. Os pacientes com ET e PMF com JAK2 do tipo selvagem foram examinados quanto a mutações no éxon 10 de MPL.
[00791] A distribuição das mutações de JAK2, MPL e CALR nas três entidades patológicas de MPN está representada na Figura 2A. Todos os pacientes com CALR mutante tinham JAK2 e MPL LR do tipo selvagem. Por conseguinte, as mutações em CALR estão significativamente associadas à ET (P=9.33x10-45) e PMF (P=1.71x10- 44) que são do tipo selvagem para mutações de JAK2 e MPL. Um total de 67 pacientes com MPN testaram do tipo selvagem para JAK2 e MPL assim como para o éxon 9 de CALR. Destes casos "triplo-negativos", 19 pacientes foram sequenciados por sequenciamento de Sanger para mutações em todos os 9 éxons de CALR porém nenhuma mutação foi detectada.
[00792] As mutações de CALR foram altamente associadas à ET ou PMF tendo JAK2 e MPL do tipo selvagem, outros 211 pacientes que se enquadravam nesta categoria de doenças foram analisados. No total, dos 289 pacientes com ET tendo JAK2/MPL do tipo selvagem 195 tinham CALR mutante (67%). Dos 120 pacientes com PMF tendo JAK2/MPL do tipo selvagem combinados, 105 tinham uma mutação em CALR (88%). Em 150 pacientes com CALR mutante para os quais tínhamos à disposição DNA de linfócito T correspondente, as mutações eram somáticas. Tabela 1. Comparação de mutações de JAK2, MPL, e CALR nos três subtipos de MPN (o número de pacientes estão mostrado).
Frequência de mutações de CALR em outras malignidades mieloides
[00793] Para investigar se mutações de CALR estão presentes em outras malignidades mieloides rastreamos 254 pacientes com AML de novo, 45 com leucemia mieloide crônica, 73 com síndrome mielodisplásica, 64 com leucemia mielomonocítica crônica e 24 com anemia refratária com sideroblastos em anel associada à trombocitose acentuada em busca de mutações no éxon 9 de CALR. Embora a vasta maioria desses pacientes tivessem o éxon 9 de calrr do tipo selvagem, três pacientes com anemia refratária com sideroblastos em anel associada à trombocitose acentuada ancoravam mutações em CALR (Figura 2B), todos eles tendo JAK2 e MPL do tipo selvagem (Figura 2C). Mutações no gene codificando o fator de emenda 3B, subunidade 1 (SF3B1) co-ocorreram com mutações em todos os três genes. Dos 524 indivíduos saudáveis um tinha uma deleção "in-frame" de 3 pb em CALR.
[00794] Mutações "frameshift" de CALR substituem a sequência de aminoácido C-terminal por um novo peptídeo derivado de uma fase de leitura alternativa
[00795] Foi detectado um total de 36 tipos diferentes de mutações em CALR incluindo inserções, deleções, combinações de deleções e inserções, assim como combinações de inserções/deleções com variantes de único nucleotídeo. Todas as mutações observadas resultaram em um "frameshift" para a fase de leitura alternativa 1 de CALR (Figura 3A). Isto leva a uma alteração acentuada na composição de aminoácidos do C-terminal da proteína CALR mutante (Figura 3B). O C-terminal derivado do éxon 9 em CALR do tipo selvagem é altamente carregado negativamente, ao passo que os peptídeos dos mutantes derivados da fase de leitura alternativa 1 são carregados positivamente. Como a fase de leitura alternativa 2 tem inúmeros códons de interrupção, mutações "frameshift" nesta fase resultariam em um término prematuro da translação e do truncamento da proteína (Figura 3B). Nenhuma mutação "frameshift" na fase de leitura alternativa 2 foi observada nos pacientes com MPN estudados. Os 36 tipos de mutações estão representados na Figura 3C. Devido aos diferentes tamanhos e posições das mutações, ganhos e perdas de números variáveis de aminoácidos são encontrados na região C-terminal da proteína (Tabela 2). Todas as mutações "frameshift" geram uma nova sequência de aminoácido C-terminal (Tabela 2). As sequências proteicas de comprimento integral de todos os mutantes estão mostradas nas SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288. As sequências de cDNA em volta das junções com mutação estão dadas na Tabela 3. Tabela 2. Sequências de aminoácidos C-terminais de mutações "frameshift" por inserção/deleção da CALR encontrada em pacientes com MPN. A Tabela 2 mostra as SEQ ID NOs: 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 4, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, e 144, respectivamente, por ordem de aparecimento. Tabela 3. Sequências de junções de mutação na sequência de cDNA de CALR para o desenho de sondas específicas para mutação ou iniciadores de PCR. A Tabela 7 apresenta as SEQ ID NOs: 440-475, respectivamente, por ordem de aparecimento.
[00796] As letras em negrito indicam as bordas de um evento de deleção; as letras sublinhadas indicam sequências inseridas; as letras em negrito e itálico indicam variantes nucleotídicas únicas.
[00797] Mutações somáticas específicas para células mieloides no gene CALR foram identificadas em pacientes com MPN. As mutações estão fortemente associadas com aqueles pacientes que são negativos para ambas as mutações de JAK2 e MPL (a doença previamente descrita causando mutações em MPN). Como as mutações em CALR são encontradas em 88% dos casos de PMF, e em 67% dos casos de ET duplo negativos para JAK2 e MPL, acredita-se que as mutações em CALR estão preenchendo um grande vazio de diagnóstico para ET e PMF JAK2/MPL-negativas. Portanto, a detecção de mutações em CALR no nível de DNA genômico, RNA ou cDNA oferece um teste de diagnóstico importante para MPN.
[00798] Todas as mutações em CALR identificadas estão no último éxon 9 codificando os aminoácidos C-terminais da proteína e são predominantemente mutações por inserção/deleção. A vasta maioria de mutações estavam presentes em um estado heterozigótico e elas causam um "frameshift" à mesma fase de leitura alternativa. Este "frameshift" resulta na substituição de aminoácidos C-terminais carregados negativamente (ricos em ácido aspártico e ácido glutâmico) da calreticulina por um polipeptídeo predominantemente carregado positivamente rico em arginina e metionina. Além disso, os 4 últimos aminoácidos da calreticulina (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) contêm o sinal de retenção do retículo endoplasmático. Este sinal está ausente na calreticulina mutante sugerindo que a proteína mutante é menos representada na ER em comparação com a proteína do tipo selvagem. Como o C-terminal carregado negativamente da calreticulina é o domínio de ligação de Ca2+ de baixa afinidade e alta capacidade, acredita-se que a função de ligação de Ca2+ da proteína mutante é perdida.
[00799] De todos os casos mutados de CALR, as mutações do tipo 1 (deleções de 52 pares de base) e do tipo 2 (inserção de 5 pares de base) representaram 53% e 32%, respectivamente (Figura 3 D, E). Os outros tipos de mutação foram observados com frequências muito mais baixas, muitas delas detectadas somente em um único paciente (Figura 3E). Como todos os 36 tipos de mutação "frameshift" para a fase de leitura alternativa 1, as proteínas CALR mutantes compartilham uma nova sequência de aminoácido comum no C-terminal (Tabela 2). O peptídeo C-terminal derivado da fase de leitura alternativa 1 contém inúmeros aminoácidos carregados positivamente, ao passo que o C- terminal da CALR do tipo selvagem é muito carregada negativamente (Figura 3B). Além disso, a calreticulina do tipo selvagem contém o motivo de retenção do retículo endoplasmático na extremidade C- terminal (sequência de aminoácido KDEL (SEQ ID NO: 1331)). A extremidade KDEL C-terminal (SEQ ID NO: 1331) é perdida em todas as variantes mutantes (Tabela 2). Dependendo do tipo de mutação, as proteínas mutantes conservam quantidades variáveis de aminoácidos carregados negativamente da calreticulina do tipo selvagem. As deleções de 52 pares de base do tipo 1 eliminam praticamente todos os aminoácidos carregados negativamente, ao passo que as inserções de 5 pares de base do tipo 2 conservam aproximadamente metade dos aminoácidos carregados negativamente (Figura 3D). Dadas essas diferenças, lançamos a hipótese de que as mutações do tipo 1 e do tipo 2 podem estar associadas a fenótipos qualitativamente diferentes. Por conseguinte, constatamos que as deleções do tipo 1 eram significativamente mais frequentes na mielofibrose primária em comparação com a trombocitemia essencial (P=0.0007). Além disso, detectamos apenas 3 pacientes homozigóticos para mutações em CALR associadas à dissomia uniparental do cromossoma 19p e todos os 3 casos tinham uma inserção de 5 pares de base do tipo 2 (Figura 4A).
[00800] As mutações em CALR são adquiridas no início da evolução clonal e os clones mutantes são estáveis
[00801] Para investigar se as mutações em CALR são adquiridas no início ou no final do histórico clonal de um paciente, nós analisamos colônias de progenitores hematopoiéticos de dois pacientes para os quais nós tínhamos os perfis mutacionais a partir do sequenciamento do exoma total. As hierarquias clonais dos pacientes H_0191 e H_0296 estão mostradas na Figura 4B. Nós concluímos que as mutações em CALR foram adquiridas logo cedo nos clones principais dos dois pacientes analisados.
[00802] Para 24 pacientes com CALR mutante tivemos amostras de acompanhamento disponíveis, e todas elas eram positivas para a mutação.
Significância clínica de mutações em CALR
[00803] Ao todo foram estudados 1215 pacientes com trombocitemia essencial ou mielofibrose primária Tabela 4. Destes, 63.4% eram portadores de JAK2-V617F, 4.4% eram portadores de mutações ativantes do éxon 10 de MPL, 23.5% eram portadores de mutações do éxon 9 de CALR, e apenas 8.8% não tinham nenhum dos marcadores clonais anteriores. Digno de nota é que a maioria desses últimos pacientes se enquadravam no subgrupo de trombocitemia essencial. Nós usamos o teste de Wilcoxon rank sum (teste de Wilcoxon-Mann- Whitney) para comparar os valores hematológicos em pacientes portadores de diferentes genes mutantes. No grupo de pacientes com trombocitemia essencial, aqueles portadores de uma mutação em CALR apresentaram nível de hemoglobina mais baixo, contagem de células sanguíneas brancas mais baixa, e contagem de plaquetas mais alta no diagnóstico em comparação com pacientes portadores de JAK2 mutante (P<0.001 em todos os casos). No grupo de pacientes com mielofibrose primária, aqueles portadores de uma mutação em CALR apresentaram contagem de células sanguíneas brancas mais baixa (P=0.027) e contagem de plaquetas mais alta (P<0.001) do que pacientes com JAK2 mutante. O tempo de sobrevida total e o risco de trombose foram analisados somente em pacientes portadores de uma mutação em JAK2, MPL, ou CALR, i.e., tendo um marcador clonal. Supondo-se que o estado de mutação não se alterava com o tempo, nós fizemos todas as análises desde o diagnóstico inicial. Como 6 pacientes foram excluídos devido a acompanhamento inadequado, um total de 1102 pacientes foram examinados. O tempo médio de acompanhamento para toda a coorte de pacientes com qualquer um dos três genes mutados foi de 5.7 anos (em uma faixa de 0-31 anos). Como mostrado na Figura 5A, houve uma diferença significativa no tempo de sobrevida total entre os 3 subgrupos de pacientes com mielofibrose primária (P<0.001). Aqueles portadores de uma mutação somática de CALR apresentaram um tempo de sobrevida total melhor que aqueles com uma mutação em JAK2 (P<0.001) ou com uma mutação em MPL (P<0.001), enquanto que nenhuma diferença foi observada entre estes dois últimos subgrupos. Nos pacientes com trombocitemia essencial, que apresentaram um tempo de sobrevida total muito mais longo, houve uma diferença significativa somente entre os pacientes com CALR mutada e os pacientes com JAK2 mutada (P=0.043, Figura 5B). Em uma análise multivariada de regressão de Cox do tempo de sobrevida total incluindo tipo de neoplasma mieloide (trombocitemia essencial versus mielofibrose primária), tipo de gene mutante, e coorte de pacientes (Pavia versus Vienna) como covariáveis, foi constatado que os dois primeiros fatores eram fatores prognósticos independentes. Como esperado, mielofibrose primária foi associada a um tempo de sobrevida total mais curto em comparação com trombocitemia essencial (relação de risco de morte 7.1, P<0.001, CI 4.9-10.2). Além disso, o tipo de gene mutante teve um efeito independente no tempo de sobrevida. De fato, em comparação com pacientes portadores de mutação em CALR, tanto aqueles com JAK2 (relação de risco 3.1, P<0.001, CI 2.0-4.7) quanto aqueles portadores de uma mutação de MPL (relação de risco 3.5, P<0.001, CI 1.8-6.7) apresentaram um risco de morte mais alto. A incidência cumulativa de trombose em trombocitemia essencial foi calculada com uma abordagem de risco competitivo com morte a partir de todas as causas como um evento competitivo, e está relatada na Tabela 5 enquanto que as curvas reais estão mostradas na Figura 5C. Os pacientes com trombocitemia essencial portadores de uma mutação em CALR apresentaram risco de trombose menor que os pacientes portadores de uma mutação em JAK2 (P=0.003), enquanto que nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os outros subgrupos. Deve ser observado que o subgrupo de pacientes portadores de uma mutação em MPL era pequeno. Tabela 4: Descrição das coortes para os 1215 pacientes usados para estimar a significância clínica de mutações de CALR Tabela 5: Incidência cumulativa de trombose comparando pacientes com JAK2, MPL e CALR mutantes
Análise funcional da mutação de CALR tipo 1
[00804] Para estudar os efeitos funcionais da CALR mutante nós clonamos o cDNA da CALR do tipo selvagem e da mutação tipo 1 (deleção de 52 pares de bases) no vetor de expressão retroviral pMSCV-IRES-GFP. Depois da produção retroviral e transfecção de cDNAs de CALR na linhagem de células murinas interleucina-3- dependentes Ba/F3, classificamos as células positivas para o transgene por citometria de fluxo para GFP. Em seguida medimos a proliferação interleucina-3-dependentes de células. As células expressando a mutação de CALR tipo 1 apresentam crescimento interleucina-3- independente e hipersensibilidade à interleucina-3 (Figura 6A). Quando medimos a proliferação de células na ausência de interleucina-3, apenas a mutação por deleção de 52 pares de bases de CALR apresentou acúmulo significativo de células (Figura 6B). Para investigar se a independência de interleucina-3 nas células mutantes por deleção de 52 pares de bases de CALR é causada por ativação da sinalização de JAK-STAT, nós determinamos a sensibilidade das células ao inibidor da quinase JAK2 SAR302503. Como mostrado na Figura 7 tanto o tipo selvagem quando o mutante por deleção de 52 pares de bases de CALR mostraram sensibilidade semelhante ao SAR302503 sugerindo que o crescimento interleucina-3-independente das células de CALR mutantes é dependente de JAK2 ou de uma quinase da família JAK visada pelo SAR302503. Para confirmar esta hipótese, examinamos a fosforilação de STAT5 na presença e na ausência de interleucina-3 nas linhagens celulares de controle e transfectadas com CALR. Detectamos fosforilação aumentada de STAT5 na ausência de interleucina-3 no mutante por deleção de 52 pares de bases de CALR e a uma concentração de 0.1 ng/mL de interleucina-3 (Figura 6C). Assim sendo, a ativação aumentada da sinalização de JAK-STAT é provavelmente responsável pelo crescimento citocina-independente de células expressando o mutante por deleção de 52 pares de bases de CALR.
[00805] Microscopia de imunofluorescência foi usada para determinar a localização de CALR do tipo selvagem e de CALR mutante tipo 1. Após superexpressão em células HEK, CALR do tipo selvagem ficou colocalizada com o retículo endoplasmático (colorido com calnexina). No caso da CALR mutante tipo 1, esta colocalização foi menos proeminente mais provavelmente devido à ausência da sequência KDEL (SEQ ID NO: 1331) do C-terminal da CALR mutante (Figura 6D).
[00806] Identificamos mutações somáticas no gene de CALR em pacientes com mielofibrose primária e trombocitemia essencial. As mutações em CALR são mutuamente exclusivas com mutações em JAK2 e MPL. Nenhuma mutação de CALR foi encontrada em policitemia vera, um neoplasma mieloproliferativo que é especificamente associado a mutações de JAK2. As mutações de CALR são a segunda mutação mais frequente depois de JAK2 em neoplasmas mieloproliferativos. Também estudamos pacientes com outros neoplasmas mieloides, e encontramos mutações de CALR apenas em 12.5% dos casos com anemia refratária com sideroblastos em anel associada à trombose acentuada, um neoplasma mielodisplásico/mieloproliferativo típico (Malcovati et al., 2009). Isto suporta fortemente uma relação causal entre mutações de CALR e produção excessiva de plaquetas.
[00807] Como mutações em CALR são encontradas em cerca de 73% dos pacientes que não são portadores de alterações de JAK2 e MPL, nós acreditamos elas preenchem o atual hiato em diagnóstico molecular em neoplasmas mieloproliferativos. Ao todo, apenas menos de 10% dos nossos pacientes com trombocitemia essencial ou mielofibrose primária não são portadores de uma mutação somática de JAK2, MPL ou CALR. Em alguns desses indivíduos, o clone mutado pode ser pequeno demais para ser detectado com as abordagens atuais. Genes indutores de mutantes raros podem desempenhar algum papel em outras pacientes, embora alguns pacientes possam não ter qualquer doença clonal. Isto é particularmente verdadeiro para pacientes com um diagnóstico clínico de trombocitemia essencial, já que o diagnóstico diferencial entre trombocitose clonal e trombocitose reativa pode ser difícil sem um marcador clonal (Schafer, 2004). Em geral, a avaliação de mutações de CALR melhora acentuadamente a atual abordagem de diagnóstico para trombocitemia essencial ou mielofibrose primária, e deve ser incluída nos critérios da OMS para estes distúrbios (Sverdlow et al., 2008).
[00808] Todas as mutações de CALR que identificamos são mutações por inserção/deleção no último éxon codificando os aminoácidos C-terminais da proteína. A maioria das mutações estão presentes em um estado heterozigótico e causam um "frameshift" para uma fase de leitura alternativa específica. Este "frameshift" resulta na substituição dos aminoácidos carregados negativamente C-terminais da calreticulina por um polipeptídeo carregado positivamente rico em arginina e metionina. Os 4 últimos aminoácidos da calreticulina (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) contêm o sinal de retenção do retículo endoplasmático. Este sinal está ausente na calreticulina mutante. Consequentemente a calreticulina mutante tem uma localização subcelular alterada. Como o C-terminal carregado negativamente da calreticulina é o domínio de ligação de Ca2+ de baixa afinidade e alta capacidade, a função de ligação de Ca2+ da proteína mutante pode ficar prejudicada. A presença da sequência peptídica derivada da fase de leitura alternativa no C-terminal de CALR mutada oferece uma oportunidade para vetorização imunológica uma vez que ela representa um epítopo específico para câncer.
[00809] Para analisar ainda a capacidade oncogênica da calreticulina mutante, geramos células Ba/F3 com superexpressão da CALR do tipo selvagem e da CALR mutante tipo 1 (deleção de 52 pares de bases - del52). Curiosamente, as células Ba/F3 tendo CALR del52 mostraram proliferação independente de citocinas. No entanto, o crescimento de células Ba/F3 expressando calreticulina do tipo selvagem e calreticulina mutante foi igualmente suprimido depois de tratamento com um inibidor da quinase JAK2, sugerindo a necessidade da via de JAK-STAT na independência da citocina induzida por calreticulina mutante. Da mesma forma, pudemos detectar fosforilação aumentada de STAT5 em células Ba/F3 del52, tanto na ausência quanto na presença de estimulação com interleucina-3. Já foi mostrado que calreticulina/Ca2+/calmodulina modulam a atividade de Stats. O complexo de calreticulina com ERp57, no retículo endoplasmático, suprime a fosforilação e a atividade transcricional de Stat3 em fibroblastos embrionários de camundongo (Coe et al., 2010). Além disso, a inibição da quinase II gama dependente de Ca2+/calmodulina resulta em níveis reduzidos de Stat1, Stat3 e Stat5 fosforilados (Si & Collins 2008). Curiosamente, a superexpressão de calreticulina atenua a fosforilação de Stat1 induzida por interferon alfa, resultando em resistência ao interferon (Yue et al., 2012). São necessários estudos adicionais para elucidar o mecanismo da ativação da via de JAK-STAT pela calreticulina mutante em células mieloides. O envolvimento da via de sinalização de JAK-STAT em pacientes positivos para CALR também pode explicar a eficácia da terapia com inibidor de JAK2 em mielofibrose primária. Entretanto, nossos resultados indicam que os inibidores de JAK2 podem não ser seletivos para células expressando a CALR mutada em comparação com as células do tipo selvagem tendo CALR.
[00810] Embora nossas análises de desfecho clínico sejam retrospectivas, elas sugerem fortemente que neoplasmas mieloproliferativos positivos para CALR têm um curso clínico mais benigno que os distúrbios correspondentes associados à mutação de JAK2 ou MPL. Devido ao pequeno número de pacientes tendo MPL mutada, as comparações mais confiáveis são aquelas entre pacientes tendo JAK2 mutada e CALR mutada. Nossas observações mostram nitidamente que pacientes tendo CALR mutada correm menos risco de trombose e têm um tempo de sobrevida total mais alto que pacientes tendo JAK2 mutada. A incidência de complicações tromboembólicas mais baixa pode estar relacionada com o fato de pacientes tendo CALR mutada tinham níveis de hemoglobina mais baixos e contagens de células sanguíneas brancas mais baixa. Um tempo de sobrevida total maior foi observado tanto em pacientes com mielofibrose primária como naquelas com trombocitemia essencial, embora fosse muito mais relevante no primeiro, confirmando os achados anteriores em pacientes com e sem mutações em JAK2 (Campbell et al., 2006b; Rumi et al., 2013). Do ponto de vista clínica, o impacto diferente de genes mutantes pode ser incorporado nos sistemas de classificação de prognóstico existentes para mielofibrose primária e trombocitemia essencial (Passamonti 2010b, Passamonti 2012) e também pode orientar a tomada de decisão terapêutica. Mais especificamente, a caracterização molecular de CALR deveria tornar-se um componente essencial do gerenciamento clínico de trombocitemia essencial e mielofibrose primária.
Exemplo 2: Geração de anticorpos específicos para mutantes de CALR em camundongos
[00811] As mutações de CALR associadas à MPN ocorrem no último éxon do gene (éxon 9). Estas mutações são inserções e/ou deleções que resultam em uma mutação 'frameshift' para uma fase de leitura alternativa muito específica, levando à síntese de um novo peptídeo C- terminal no mutante. Como todas as mutações resultam na geração da mesma fase de leitura alternativa, o peptídeo C-terminal tem a mesma sequência em todos os mutantes de CALR.
[00812] Um peptídeo sintético com a sequência da extremidade C- terminal da proteína calreticulina mutante (Sequência - RRKMSPARPRTSCREACLOGWTEA-), conjugado à hemociana de lapa com perfuração (KLH) foi usado para imunizar quatro camundongos C57B1/6 do tipo selvagem.
[00813] Os camundongos receberam 3 doses de reforço depois da imunização primária. O soro dos camundongos foi testado (antes da imunização e depois dos reforços) quanto à presença de anticorpos específicos para calreticulina mutante por análise de Western Blotting da lisados de células HEK que superexpressavam a CALR del52 e do mutante de CALR gerado artificialmente que não possui o éxon 9 (Aéxon9, que não possui o peptídeo mutante). Os lisados foram examinados em géis de poliacrilamida a 8% e investigados com o soro de camundongo. O anticorpo anti-camundongo conjugado com HRP (GE NA931) foi usado como anticorpo secundário. Depois do segundo reforço, o soro de todos os quatro camundongos tinha anticorpos específicos para mutantes de CALR que detectaram o mutante de CALR del52 (Figura 8), mas não a CALR de éxon 9 deletado de controle (Figura 9). Anticorpo anti-calreticulina (Millipore MABT145) foi usado como controle positivo (Pos), que reconhece todas as três formas de calreticulina - tipo selvagem, mutante del 52 e de éxon 9 deletado. O sinal, proveniente do soro de todos os quatro camundongos, foi mais forte depois que o terceiro reforço foi aplicado (Figura 10).
[00814] O peptídeo C-terminal da calreticulina mutante (mencionada acima) é imunogênico e pode ser usado com sucesso para gerar anticorpos específicos, em particular anticorpos policlonais contra a calreticulina mutante. Estes anticorpos podem ser usados como reagentes de pesquisa assim como para fins de diagnóstico como divulgado neste relatório.
[00815] A presente invenção refere-se às seguintes sequências nucleotídicas e de aminoácidos:
[00816] As sequências oferecidas nesta invenção encontram-se em parte disponíveis na base de dados do NCBI e podem ser encontradas no site www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene; As sequências também referem-se a sequências anotadas e modificadas. A presente invenção também oferece técnicas e métodos onde sequências análogas, e variantes das sequências concisas oferecidas nesta invenção são usadas. Preferivelmente, tais "variantes" são variantes genéticas.
[00817] SEQ ID NO: 1: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[00818] SEQ ID NO: 2: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[00819] SEQ ID NO: 3: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[00820] SEQ ID NO: 4: Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[00821] SEQ ID NO: 5: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00822] SEQ ID NO: 6: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00823] SEQ ID NO: 7: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00824] SEQ ID NO: 8: Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00825] SEQ ID NO: 9: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00826] SEQ ID NO: 10: Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00827] SEQ ID NO: 11 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00828] SEQ ID NO: 12 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00829] SEQ ID NO: 13 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[00830] SEQ ID NO: 14 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[00831] SEQ ID NO: 15 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[00832] SEQ ID NO: 16 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[00833] SEQ ID NO: 17 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[00834] SEQ ID NO: 18 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[00835] SEQ ID NO: 19 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[00836] SEQ ID NO: 20 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[00837] SEQ ID NO: 21 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5
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[00840] SEQ ID NO: 24 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5
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[00859] SEQ ID NO: 43 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[00860] SEQ ID NO: 44 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
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[00876] SEQ ID NO: 60 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
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[00882] SEQ ID NO: 66 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
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[00889] SEQ ID NO: 73 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
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[00897] SEQ ID NO: 81 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
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[00903] SEQ ID NO: 87 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
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[00905] SEQ ID NO: 89 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[00906] SEQ ID NO: 90 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[00907] SEQ ID NO: 91 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[00908] SEQ ID NO: 92 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[00909] SEQ ID NO: 93 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[00910] SEQ ID NO: 94 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[00911] SEQ ID NO: 95 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[00912] SEQ ID NO: 96 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[00913] SEQ ID NO: 97 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[00914] SEQ ID NO: 98 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[00915] SEQ ID NO: 99 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[00916] SEQ ID NO: 100 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[00917] SEQ ID NO: 101 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[00918] SEQ ID NO: 102 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[00919] SEQ ID NO: 103 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[00920] SEQ ID NO: 104 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[00921] SEQ ID NO: 105 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[00922] SEQ ID NO: 106 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[00923] SEQ ID NO: 107 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[00924] SEQ ID NO: 108 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[00925] SEQ ID NO: 109 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[00926] SEQ ID NO: 110 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[00927] SEQ ID NO: 111 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[00928] SEQ ID NO: 112 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[00929] SEQ ID NO: 113 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[00930] SEQ ID NO: 114 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[00931] SEQ ID NO: 115 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[00932] SEQ ID NO: 116 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
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[00934] SEQ ID NO: 118 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[00935] SEQ ID NO: 119 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[00936] SEQ ID NO: 120 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[00937] SEQ ID NO: 121 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
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[00939] SEQ ID NO: 123 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
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[00943] SEQ ID NO: 127 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
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[00946] SEQ ID NO: 130 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[00947] SEQ ID NO: 131 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[00948] SEQ ID NO: 132 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[00949] SEQ ID NO: 133 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[00950] SEQ ID NO: 134 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[00951] SEQ ID NO: 135 Sequência nucleotídica codificando the C- tenninus do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[00952] SEQ ID NO: 136 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
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[00954] SEQ ID NO: 138 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[00955] SEQ ID NO: 139 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[00956] SEQ ID NO: 140 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
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[00958] SEQ ID NO: 142 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[00959] SEQ ID NO: 143 Sequência nucleotídica codificando o C- terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[00960] SEQ ID NO: 144 Sequência de aminoácido do C-terminal do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
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[00962] SEQ ID NO: 146 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00963] SEQ ID NO: 147 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00964] SEQ ID NO: 148 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[00965] SEQ ID NO: 149 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00966] SEQ ID NO: 150 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00967] SEQ ID NO: 151 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[00968] SEQ ID NO: 152 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
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[00970] SEQ ID NO: 154 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
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[00972] SEQ ID NO: 156 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
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[00975] SEQ ID NO: 159 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
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[00981] SEQ ID NO: 165 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[00982] SEQ ID NO: 166 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[00983] SEQ ID NO: 167 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[00984] SEQ ID NO: 168 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
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[00986] SEQ ID NO: 170 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7
[00987] SEQ ID NO: 171 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7
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[00991] SEQ ID NO: 175 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8
[00992] SEQ ID NO: 176 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8
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[00994] SEQ ID NO: 178 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
[00995] SEQ ID NO: 179 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
[00996] SEQ ID NO: 180 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
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[00998] SEQ ID NO: 182 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[00999] SEQ ID NO: 183 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[001000] SEQ ID NO: 184 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
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[001002] SEQ ID NO: 186 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11
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[001004] SEQ ID NO: 188 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11
[001005] SEQ ID NO: 189 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001006] SEQ ID NO: 190 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001007] SEQ ID NO: 191 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001008] SEQ ID NO: 192 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
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[001011] SEQ ID NO: 195 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13
[001012] SEQ ID NO: 196 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13
[001013] SEQ ID NO: 197 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14 2319
[001014] SEQ ID NO: 198 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
[001015] SEQ ID NO: 199 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
[001016] SEQ ID NO: 200 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
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[001018] SEQ ID NO: 202 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001019] SEQ ID NO: 203 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001020] SEQ ID NO: 204 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001021] SEQ ID NO: 205 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001022] SEQ ID NO: 206 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001023] SEQ ID NO: 207 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001024] SEQ ID NO: 208 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001025] SEQ ID NO: 209 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001026] SEQ ID NO: 210 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001027] SEQ ID NO: 211 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001028] SEQ ID NO: 212 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001029] SEQ ID NO: 213 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001030] SEQ ID NO: 214 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001031] SEQ ID NO: 215 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001032] SEQ ID NO: 216 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001033] SEQ ID NO: 217 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001034] SEQ ID NO: 218 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001035] SEQ ID NO: 219 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001036] SEQ ID NO: 220 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001037] SEQ ID NO: 221 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001038] SEQ ID NO: 222 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001039] SEQ ID NO: 223 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001040] SEQ ID NO: 224 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001041] SEQ ID NO: 225 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
[001042] SEQ ID NO: 226 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21 24
[001043] SEQ ID NO: 227 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
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[001045] SEQ ID NO: 229 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001046] SEQ ID NO: 230 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001047] SEQ ID NO: 231 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001048] SEQ ID NO: 232 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001049] SEQ ID NO: 233 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001050] SEQ ID NO: 234 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001051] SEQ ID NO: 235 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001052] SEQ ID NO: 236 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
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[001054] SEQ ID NO: 238 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[001055] SEQ ID NO: 239 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[001056] SEQ ID NO: 240 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
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[001059] SEQ ID NO: 243 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[001060] SEQ ID NO: 244 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
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[001071] SEQ ID NO: 255 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[001072] SEQ ID NO: 256 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
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[001074] SEQ ID NO: 258 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[001075] SEQ ID NO: 259 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
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[001078] SEQ ID NO: 262 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
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[001084] SEQ ID NO: 268 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
[001085] SEQ ID NO: 269 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001086] SEQ ID NO: 270 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001087] SEQ ID NO: 271 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001088] SEQ ID NO: 272 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001089] SEQ ID NO: 273 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001090] SEQ ID NO: 274 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001091] SEQ ID NO: 275 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001092] SEQ ID NO: 276 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001093] SEQ ID NO: 277 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001094] SEQ ID NO: 278 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001095] SEQ ID NO: 279 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001096] SEQ ID NO: 280 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001097] SEQ ID NO: 281 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001098] SEQ ID NO: 282 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001099] SEQ ID NO: 283 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001100] SEQ ID NO: 284 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001101] SEQ ID NO: 285 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001102] SEQ ID NO: 286 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001103] SEQ ID NO: 287 Sequência nucleotídica codificando o mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001104] SEQ ID NO: 288 Sequência de aminoácido do mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001105] SEQ ID NO: 289 Sequência nucleotídica codificando a calreticulina de Homo sapiens do tipo selvagem
[001106] SEQ ID NO: 290 Sequência de aminoácido de calreticulina de Homo sapiens do tipo selvagem
[001107] SEQ ID NO: 291 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[001108] SEQ ID NO: 292 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[001109] SEQ ID NO: 293 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[001110] SEQ ID NO: 294 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1
[001111] SEQ ID NO: 295 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[001112] SEQ ID NO: 296 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[001113] SEQ ID NO: 297 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[001114] SEQ ID NO: 298 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2
[001115] SEQ ID NO: 299 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[001116] SEQ ID NO: 300 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[001117] SEQ ID NO: 301 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[001118] SEQ ID NO: 302 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3
[001119] SEQ ID NO: 303 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[001120] SEQ ID NO: 304 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[001121] SEQ ID NO: 305 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[001122] SEQ ID NO: 306 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4
[001123] SEQ ID NO: 307 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5
[001124] SEQ ID NO: 308 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5
[001125] SEQ ID NO: 309 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5
[001126] SEQ ID NO: 310 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5
[001127] SEQ ID NO: 311 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[001128] SEQ ID NO: 312 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[001129] SEQ ID NO: 313 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[001130] SEQ ID NO: 314 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 6
[001131] SEQ ID NO: 315 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7
[001132] SEQ ID NO: 316 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7
[001133] SEQ ID NO: 317 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7
[001134] SEQ ID NO: 318 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7
[001135] SEQ ID NO: 319 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8
[001136] SEQ ID NO: 320 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8
[001137] SEQ ID NO: 321 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8
[001138] SEQ ID NO: 322 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8 SEQ ID NO: 323 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
[001139] SEQ ID NO: 324 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
[001140] SEQ ID NO: 325 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
[001141] SEQ ID NO: 326 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9
[001142] SEQ ID NO: 327 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[001143] SEQ ID NO: 328 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[001144] SEQ ID NO: 329 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[001145] SEQ ID NO: 330 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10
[001146] SEQ ID NO: 331 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11
[001147] SEQ ID NO: 332 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11
[001148] SEQ ID NO: 333 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11
[001149] SEQ ID NO: 334 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11
[001150] SEQ ID NO: 335 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001151] SEQ ID NO: 336 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001152] SEQ ID NO: 337 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001153] SEQ ID NO: 338 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12
[001154] SEQ ID NO: 339 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13
[001155] SEQ ID NO: 340 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13
[001156] SEQ ID NO: 341 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13
[001157] SEQ ID NO: 342 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13
[001158] SEQ ID NO: 343 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
[001159] SEQ ID NO: 344 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
[001160] SEQ ID NO: 345 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
[001161] SEQ ID NO: 346 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14
[001162] SEQ ID NO: 347 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001163] SEQ ID NO: 348 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001164] SEQ ID NO: 349 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001165] SEQ ID NO: 350 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15
[001166] SEQ ID NO: 351 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001167] SEQ ID NO: 352 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001168] SEQ ID NO: 353 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001169] SEQ ID NO: 354 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16
[001170] SEQ ID NO: 355 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001171] SEQ ID NO: 356 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001172] SEQ ID NO: 357 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001173] SEQ ID NO: 358 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17
[001174] SEQ ID NO: 359 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001175] SEQ ID NO: 360 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001176] SEQ ID NO: 361 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001177] SEQ ID NO: 362 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18
[001178] SEQ ID NO: 363 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001179] SEQ ID NO: 364 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001180] SEQ ID NO: 365 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001181] SEQ ID NO: 366 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19
[001182] SEQ ID NO: 367 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001183] SEQ ID NO: 368 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001184] SEQ ID NO: 369 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001185] SEQ ID NO: 370 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20
[001186] SEQ ID NO: 371 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
[001187] SEQ ID NO: 372 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
[001188] SEQ ID NO: 373 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
[001189] SEQ ID NO: 374 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21
[001190] SEQ ID NO: 375 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001191] SEQ ID NO: 376 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001192] SEQ ID NO: 377 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001193] SEQ ID NO: 378 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22
[001194] SEQ ID NO: 379 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001195] SEQ ID NO: 380 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001196] SEQ ID NO: 381 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001197] SEQ ID NO: 382 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23
[001198] SEQ ID NO: 383 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[001199] SEQ ID NO: 384 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[001200] SEQ ID NO: 385 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[001201] SEQ ID NO: 386 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24
[001202] SEQ ID NO: 387 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[001203] SEQ ID NO: 388 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[001204] SEQ ID NO: 389 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[001205] SEQ ID NO: 390 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25
[001206] SEQ ID NO: 391 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[001207] SEQ ID NO: 392 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[001208] SEQ ID NO: 393 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[001209] SEQ ID NO: 394 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26
[001210] SEQ ID NO: 395 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[001211] SEQ ID NO: 396 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[001212] SEQ ID NO: 397 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[001213] SEQ ID NO: 398 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27
[001214] SEQ ID NO: 399 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[001215] SEQ ID NO: 400 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[001216] SEQ ID NO: 401 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[001217] SEQ ID NO: 402 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28
[001218] SEQ ID NO: 403 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[001219] SEQ ID NO: 404 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[001220] SEQ ID NO: 405 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[001221] SEQ ID NO: 406 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29
[001222] SEQ ID NO: 407 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[001223] SEQ ID NO: 408 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[001224] SEQ ID NO: 409 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[001225] SEQ ID NO: 410 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30
[001226] SEQ ID NO: 411 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
[001227] SEQ ID NO: 412 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
[001228] SEQ ID NO: 413 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
[001229] SEQ ID NO: 414 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31
[001230] SEQ ID NO: 415 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001231] SEQ ID NO: 416 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001232] SEQ ID NO: 417 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001233] SEQ ID NO: 418 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 32
[001234] SEQ ID NO: 419 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001235] SEQ ID NO: 420 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001236] SEQ ID NO: 421 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001237] SEQ ID NO: 422 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33
[001238] SEQ ID NO: 423 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001239] SEQ ID NO: 424 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001240] SEQ ID NO: 425 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001241] SEQ ID NO: 426 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34
[001242] SEQ ID NO: 427 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001243] SEQ ID NO: 428 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001244] SEQ ID NO: 429 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001245] SEQ ID NO: 430 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35
[001246] SEQ ID NO: 431 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001247] SEQ ID NO: 432 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001248] SEQ ID NO: 433 Sequência nucleotídica codificando o mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36
[001249] SEQ ID NO: 434 Sequência de aminoácido do mutante do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36.
[001250] SEQ ID NO: 435 Sequência nucleotídica codificando éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens do tipo selvagem.
[001251] SEQ ID NO: 436 Sequência de aminoácido do éxon 9 de calreticulina de Homo sapiens do tipo selvagem.
[001252] A tabela a seguir oferece um panorama das SEQ ID NOs oferecidas e usadas nesta invenção. Referências Barbui T, Barosi G, Birgegard G, et al. Philadelphia-negative classical myeloproliferative neoplasms: critical concepts and management recommendations from European LeukemiaNet. J Clin Oncol 2011;29:761-70. Baxter EJ, Scott LM, Campbell PJ, East C, Fourouclas N, Swanton S, Vassiliou GS, Bench AJ, Boyd EM, Curtin N, Scott MA, Erber WN, Green AR (2005) Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders. Lancet 365(9464): 1054-1061 Campbell PJ, Green AR (2006a) The myeloproliferative disorders. N Engl J Med 355(23): 2452-2466 Campbell PJ, Griesshammer M, Dohner K, et al. V617F mutation in JAK2 is associated with poorer survival in idiopathic myelofibrosis. Blood 2006b;107:2098-100. Coe H, Jung J, Groenendyk J, Prins D, Michalak M. ERp57 modulates STAT3 signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 2010;285:6725-38. 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[001253] Todas as referências citadas neste relatório estão incorporadas em sua íntegra a título de referência. Tendo agora descrito completamente a invenção, ficará entendido pelo especialista na técnica que a invenção pode ser praticada dentro uma faixa ampla e equivalente de condições, parâmetros entre outros, sem afetar o espírito ou o escopo da invenção ou qualquer modalidade da mesma.

Claims (27)

1. Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, caracterizado pelo fato de que compreende - determinar a presença de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar se o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando os referidos um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina estão presentes, em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico codificando uma proteína calreticulina mutante, em que a molécula de ácido nucleico é selecionada da sequência de ácido nucleico como representada em SEQ ID NO: 1; ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácido com mostrada na SEQ ID NO: 4.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido alelo mutante é DNA genômico, e em que a presença do referido DNA é determinada através de sequenciamento.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido gene da calreticulina compreende uma sequência selecionada de uma sequência de nucleotídeo como representada em SEQ ID NO: 289, ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos como representado em SEQ ID NO: 290.
4. Método para avaliar se um paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, caracterizado pelo fato de que compreende - determinar a presença de um produto do gene de um ou mais alelos mutantes do gene da calreticulina em uma amostra do referido paciente; e - avaliar que o referido paciente sofre de uma malignidade mieloide ou tem tendência a sofrer de uma malignidade mieloide quando o referido produto do gene está presente, em que os referidos um ou mais alelos mutantes compreendem um ácido nucleico que codifica uma proteína calreticulina mutante, em que a molécula de ácido nucleico é selecionada da sequência de ácido nucleico como representada em SEQ ID NO: 1; ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 4
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o referido alelo mutante compreende um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste em uma sequência de nucleotídeo como representada em SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, ou 431; ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácido como representada em SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o referido produto gênico é mRNA, e em que a presença do referido mRNA é determinada por PCR em tempo real, PCR via transcriptase reversa, sequenciamento “shotgun” do transcriptoma inteiro (RNAseq), hibridização in situ ou microarranjos.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o referido produto gênico é uma proteína, e em que a presença ou quantidade da referida proteína é determinada por imuno-histoquímica (IHC), por imunoensaio, métodos à base de gel ou “blot”, espectrometria de massa, citometria de fluxo, ou FACS.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5 e 7, caracterizado pelo fato de que o referido produto gênico compreende um polipeptídeo selecionado da sequência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 4.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4, 5, 7 e 8, caracterizado pelo fato de que o referido produto gênico compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos como mostrado em SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268 , 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370 , 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ou 434.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a referida amostra é uma amostra de medula óssea ou uma amostra de sangue, e em que a referida amostra de medula óssea é obtida por autópsia.
11. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos como representada em SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189 , 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255 , 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 26 7, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 ou 433; ou sequências de nucleotídeos degeneradas da mesma que codificam a mesma sequência de aminoácidos como representada em SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284 ou 288 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ou 434.
12. Proteína, caracterizada pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 4.
13. Proteína, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, ou 144.
14. Proteína, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, ou 434.
15. Proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pelo fato de que é selecionada do grupo que consiste em uma proteína compreendendo a sequência de aminoácido como mostrada em SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, ou 288.
16. Vacina, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína, como definida na reivindicação 12 ou 13.
17. Agente imunogênico, caracterizado pelo fato de que é uma proteína mutante de calreticulina, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 15.
18. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende o agente imunogênico, como definido na reivindicação 17, ligado a uma proteína carreadora.
19. Inibidor de uma calreticulina mutante, ou o agente imunogênico, como definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de uma malignidade mieloide.
20. Inibidor, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a referida calreticulina mutante é uma proteína calreticulina mutante, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 15.
21. Inibidor ou o agente imunogênico, de acordo com a reivindicação 19 ou 20,ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a referida malignidade mieloide é uma neoplasia mieloproliferativa ou em que a referida malignidade mieloide é uma síndrome mielodisplásica; e/ou em que a referida neoplasia mieloproliferativa é a mielofibrose primária (PMF) ou em que a referida neoplasia mieloproliferativa é uma trombocitemia essencial (ET); e/ou em que a referida síndrome mielodisplásica é anemia refratária com sideroblastos em anel e trombocitemia (RARS-T).
22. Inibidor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o paciente a ser tratado é avaliado como sofrendo de uma malignidade mieloide ou com tendência a sofrer de uma malignidade mieloide, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
23. Proteína, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, ou um inibidor de uma calreticulina mutante, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.
24. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o referido ácido nucleico compreende uma sequência de uma junção de mutação mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 440 a 475, preferencialmente em que o referido ácido nucleico é cDNA.
25. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que é um DNA ou RNA antissenso com uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma sequência de nucleotídeos em DNA e/ou RNA, como definido na reivindicação 11 ou 24; e em que o referido ácido nucleico é preferencialmente um oligonucleotídeo, e em que o oligonucleotídeo é: direto: ACAACTTCCTCATCACCAACG (SEQ ID NO: 437) e/ou reverso: GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID NO: 438); ou direto: GGCAAGGCCCTGAGGTGT (SEQ ID NO: 439) e/ou reverso: GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID NO: 438) ou ATGCCTCGAGCCGCCACCATGCTGCTATCCGTGCCGC TGCTGCTC (SEQ ID NO: 1346) e/ou ATGCGAATTCCTACAGCTCGTCCTTGGCCTGGCC (SEQ ID NO: 1347) ou ATGCCTCGAGCCGCCACCATGCTGCTATCCGTGCCGC TGCTGCTC (SEQ ID NO: 1346) e/ou CCTCATCATCCTCCTTGTCCTCTGCTCCTCGTCCTG (SEQ ID NO: 1348), ou CAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGATGAGG (SEQ ID NO: 1349) e/ou ATGCCCGCGGCTAGGCCTCAGTCCAGCCCTGGAGG (SEQ ID NO: 1350); e/ou o referido ácido nucleico é uma molécula antissenso dirigida a uma das sequências alvo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 476 a 1309.
26. Sequência alvo, caracterizada pelo fato de que é como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 476 a 1309.
27. Uso do inibidor de um mutante da calreticulina, ou do agente imunogênico, como definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de uma malignidade mieloide.
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