ES2871325T3

ES2871325T3 - Composición de vacuna que comprende calreticulina mutante

Info

Publication number: ES2871325T3
Application number: ES18215718T
Authority: ES
Inventors: Robert Kralovics; Thorsten Klampfl; Heinz Gisslinger
Original assignee: CEMM Forschungszentrum fuer Molekulare Medizin GmbH
Current assignee: CEMM Forschungszentrum fuer Molekulare Medizin GmbH
Priority date: 2013-09-16
Filing date: 2014-09-15
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2034-09-15
Also published as: JP2020109092A

Abstract

Composición de vacuna que comprende (i) un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprende o consiste en de 15 a 40 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4; y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de vacuna que comprende calreticulina mutante

La presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende

(i) un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprende o consiste en de 15 a 40 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4; y

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.

También secuencias genómicas, secuencias de ADNc, secuencias de ARNm y secuencias de proteína de la calreticulina mutante son objeto de la presente invención. Además, la invención se refiere a usos médicos de inhibidores de calreticulina mutante.

La mielofibrosis primaria (PMF), trombocitemia esencial (ET) y policitemia vera (PV) son trastornos hematológicos monoclonales que pertenecen a las neoplasias mieloproliferativas (MPN) negativas para BCR-ABL clásicas (Campbell y Green, 2006). Desde el descubrimiento en 2005 de una mutación somática en el gen de cinasa JAK2, se ha realizado un gran avance en el diagnóstico molecular, el manejo clínico, el tratamiento y la comprensión molecular de MPN. La mutación de valina a fenilalanina (V617F) activa de manera constitutiva la cinasa Jak2 dando como resultado un aumento de la fosforilación de sus sustratos (Stat5, Stat3, Erk, etc.) y conduciendo a un aumento de la capacidad de respuesta a citocinas de las células mieloides (Baxter et al, 2005; James et al, 2005; Kralovics et al, 2005; Levine et al, 2005). Le siguió pronto la identificación de mutaciones adicionales tales como en el exón 12 de JAK2 en PV (Scott et al, 2007) y en el gen de receptor de trombopoyetina MPL en PMF y ET (Pardanani et al, 2006; Pikman et al, 2006). Aunque las tres entidades de enfermedad de MPN difieren en su presentación clínica, comparten muchas características moleculares así como clínicas. La mutación JAK2-V617F está presente en aproximadamente el 95% de los casos de PV, el 60% de los casos de PMF y el 50% de los casos de ET, respectivamente. Las mutaciones en el exón 12 de JAK2 son específicas para aproximadamente el 3% de los casos de PV mientras que las mutaciones en MPL se restringen a PMF (5%) y ET (3%). Las tres entidades de MPN están predispuestas a un grado variable de trombosis, hemorragia y transformación leucémica (Sverdlow et al, 2008). Aunque los pacientes pueden permanecer en la fase crónica de m Pn durante varios años, se produce progresión de la enfermedad en una forma de mielofibrosis secundaria en PV y ET, desarrollo de una fase acelerada con grado variable de pancitopenia seguido por transformación leucémica que afecta a las tres entidades de MPN (Sverdlow et al, 2008).

Se acumulan mutaciones somáticas durante toda la evolución clonal de células madre hematopoyéticas de MPN. Estas alteraciones genéticas adquiridas pueden ser mutaciones puntuales, lesiones cromosómicas y defectos epigenéticos y pueden contribuir todos al buen estado del clon en evolución (Klampfl et al, 2011; Kralovics, 2008). Estas mutaciones pueden acelerar la proliferación por diversos medios, disminuir el potencial de diferenciación de progenitores o hacerlos menos susceptibles a la apoptosis. Se han descrito mutaciones que afectan a estos mecanismos en genes tales como TET2 (Delhommeau et al, 2009), EZH2 (Ernst et al, 2010), d Nm T3A (Stegelmann et al, 2011), ASXL1 (Stein et al, 2011) y TP53 (Harutyunyan et al, 2011) en diferente tipos de malignidades mieloides incluyendo MPN (Milosevic y Kralovics, 2013). Sin embargo, hasta la fecha sólo se consideran mutaciones de JAK2 y MPL fuertemente asociadas con MPN y representan los marcadores moleculares más útiles de MPN. Hongyan et al., Oncology Reports, 29, págs. 529-534, 2013 describen una vacuna de células enteras recubierta con CALR recombinante.

A pesar del avance realizado en la comprensión de la patogenia molecular de MPN, aproximadamente la mitad de los pacientes con PMF y ET carecen de un marcador molecular para el diagnóstico ya que estos pacientes son negativos para las mutaciones tanto de JAK2 como de MPL.

Por tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es la provisión de medios y métodos para el diagnóstico y la terapia de una malignidad mieloide.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.

El problema técnico se soluciona mediante la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

La presente invención soluciona el problema técnico identificado anteriormente puesto que, tal como se documenta a continuación en el presente documento y en los ejemplos adjuntos, se encontró sorprendentemente que los pacientes que padecen una malignidad mieloide, preferiblemente mielofibrosis primaria (PMF) y trombocitemia esencial (ET), tienen mutaciones somáticas en el gen de calreticulina (CALR). Otro hallazgo sorprendente fue que estas mutaciones somáticas específicas de células mieloides en el gen de CALR en pacientes con MPN se asocian fuertemente con aquellos pacientes que son negativos para las mutaciones tanto de JAK2 como de MPL (la enfermedad descrita anteriormente que provoca mutaciones en MPN). Tal como se muestra en el presente documento, se encuentran mutaciones de CALR en el 88% de los casos de PMF, y el 68% de los casos de ET dobles negativos para JAK2 y MPL. Por tanto, la presente invención proporciona un diagnóstico fiable de malignidades mieloides. La invención es especialmente útil para pacientes para los que no existen marcadores fiables, tales como pacientes que son negativos para las mutaciones tanto de JAK2 como de MPL.

Además, se encontró en el presente documento que las mutaciones somáticas proporcionadas en el presente documento en el gen de calreticulina (CALR) dan como resultado un extremo C-terminal de la proteína calreticulina que tiene características completamente diferentes en comparación con la proteína calreticulina silvestre. Se cree que estas características diferentes provocan o contribuyen al desarrollo de una malignidad mieloide, preferiblemente mielofibrosis primaria (PMF) y trombocitemia esencial (ET).

Todas las mutaciones de CALR identificadas en el presente documento están en el último exón 9 que codifica para los aminoácidos C-terminales de la proteína y son predominantemente mutaciones de inserción/deleción. La mayoría de las mutaciones estaban presentes en un estado heterocigoto y provocan un desplazamiento del marco a un marco de lectura alternativo (marco alternativo 1 tal como se muestra en la figura 3A). Este desplazamiento del marco da como resultado el reemplazo de los aminoácidos cargados negativamente C-terminales (ricos en ácido aspártico y glutámico) de la calreticulina por un polipéptido predominantemente cargado positivamente rico en arginina y metionina. Además, los últimos 4 aminoácidos de calreticulina (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) contienen la señal de retención en el retículo endoplasmático. Esta señal está ausente en la calreticulina mutante lo que sugiere que la proteína mutante está menos representada en el RE en comparación con la proteína silvestre. Ya que el extremo C-terminal cargado negativamente de la calreticulina es un dominio de unión a Ca2+ de alta capacidad y baja afinidad, se cree que se pierde la función de unión a Ca2+ de la proteína mutante. Se ha demostrado en el presente documento que las mutaciones predominantes de CALR son mutaciones de tipo 1 y tipo 2 tal como se definen en el presente documento; véase la figura 3E. Por tanto, se prefieren estos mutantes y su uso según la presente invención. Se muestran secuencias de ácido nucleico que codifican para el extremo C-terminal y la secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutaciones de CALR de tipo 1 y tipo 2 en SEQ ID NO: 5 a 12. Se dan a conocer en el presente documento ácidos nucleicos adicionales de mutaciones de CALR de tipo 1 y tipo 2.

La detección de las mutaciones de CALR proporcionadas en el presente documento a nivel del ADN genómico, ARN, ADNc y proteína es útil para el diagnóstico de una malignidad mieloide, por ejemplo, si un paciente tiene una malignidad mieloide, qué tipo de malignidad mieloide y características específicas de la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, “diagnóstico” se refiere, entre otros, a la identificación de la naturaleza de una enfermedad o a la identificación de un problema fisiológico o fisiopatológico que subyace a un síntoma. Por tanto, “diagnóstico de una malignidad mieloide” se refiere a determinar (a) si un paciente tiene una malignidad mieloide y/o (b) qué tipo(s) de malignidad mieloide y/o (c) características de la malignidad mieloide específica. El diagnóstico puede realizarse por ejemplo basándose en el examen de síntomas y/ pruebas complementarias (por ejemplo pruebas citogenéticas o moleculares).

Los términos “evaluar si un paciente padece una malignidad mieloide” y “diagnosticar una malignidad mieloide” pueden usarse de manera intercambiable en el presente documento. El diagnóstico también puede comprender o estar relacionado con la evaluación de si un paciente es propenso a padecer una malignidad mieloide, es decir si el paciente corre el riesgo de desarrollar una malignidad mieloide.

La presente divulgación se refiere a un método para evaluar si un paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide, comprendiendo dicho método

- determinar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina en una muestra de dicho paciente; y

- evaluar que dicho paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide cuando están presentes dicho uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina.

Los métodos proporcionados en el presente documento pueden comprender una etapa de obtener una muestra del paciente. “Obtener” engloba la recepción de una muestra que proporciona un tercero. Por ejemplo, puede extraerse sangre o médula ósea de un paciente, colocarse en un receptáculo apropiado y luego enviarse para su análisis.

Según la presente invención, se evalúa un paciente como “positivo” para una malignidad mieloide, si uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina están presentes en una muestra, preferiblemente una muestra de sangre, de dicho paciente.

El término “malignidad mieloide” tal como se usa en el presente documento se refiere a enfermedades hematológicas clonales que afectan a los linajes sanguíneos mieloides incluyendo aquéllas con evolución clínica crónica y aguda. Las malignidades mieloides incluyen neoplasias mieloproliferativas, síndromes mielodisplásicos y leucemias mieloides agudas. Se prefiere en el presente documento que la malignidad mieloide sea una neoplasia mieloproliferativa, particularmente mielofibrosis primaria (PMF) o trombocitemia esencial (ET), o un síndrome mielodisplásico, particularmente anemia refractaria con sideroblastos en anillo y trombocitemia (RARS-T).

Por tanto, el diagnóstico de la malignidad mieloide puede ser para diagnosticar adicionalmente subtipos de enfermedad. En realizaciones adicionales, el diagnóstico utiliza pruebas adicionales en combinación, tales como bioquímica sanguínea, citología y análisis genético. Dependiendo de la naturaleza de la neoplasia mieloproliferativa, pruebas de diagnóstico adicionales pueden incluir la determinación de la masa de glóbulos rojos (para policitemia), aspirado de médula ósea y biopsia por trépano, saturación de oxígeno arterial y nivel de carboxihemoglobina, nivel de fosfatasa alcalina de neutrófilos, vitamina B12 (o capacidad de unión a B12) y urato en suero. Se ha demostrado que las pruebas genéticas son cada vez más importantes en el diagnóstico.

Las siguientes pruebas se realizan tradicionalmente para diagnosticar las siguientes enfermedades. Véase por ejemplo Vardiman, et al. (2009). “The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: Rationale and important changes”. Blood 114 (5): 937-51.

Leucemia mielógena crónica (CML)

Con la definición de translocación t(9;22); cromosoma Philadelphia, translocación de BCR-ABL que tiene tres puntos de rotura:

• u-BCR-ABL (p230): conduce a CML con neutrofilia y basofilia habituales

• BCR-ABL menor (p190): conduce a CML que tiene una tendencia a convertirse en leucemia linfoblástica aguda (ALL), habitualmente ALL de células B precursoras y raramente ALL de células T precursoras

• BCR-ABL mayor (p210): punto de rotura habitual normal.

Trombocitemia esencial (ET)

La ET está asociada con la mutación JAK2V617F hasta en el 55% de los casos y una mutación de MPL (receptor de trombopoyetina) hasta en el 5% de los casos:

• Fase celular - aumento de megacariocitos grandes con fibrosis y poco aumento en otros elementos de la médula ósea

• Fase fibrótica - fibrosis colagenosa con ausencia de elementos de la médula

Estos trastornos están revisándose todavía según mutaciones genéticas más específicas y la frecuencia con la que los pacientes terminan en un acontecimiento medular fibrótico.

Policitemia vera (PV)

La PV se asocia con la mayor frecuencia con la mutación JAK2V617F en más del 95% de los casos, mientras que el resto tienen una mutación en el exón 12 de JAK2:

• Fase celular - aumento de megacariocitos que se agrupan, fibrosis de reticulina, posteriormente fibrosis tricrómica y aumento de precursores mieloides y eritroides

• Fase fibrosa - fibrosis colagenosa con ausencia de elementos de la médula.

Mielofibrosis primaria (PMF)

La PMF se asocia con la mutación JAK2V617F hasta en el 50% de los casos, las mutaciones en el exón 12 de JAK2 en el 1-2% de los casos y la mutación de MPL (receptor de trombopoyetina) hasta en el 5% de los casos:

• Fase celular - aumento de megacariocitos que se agrupan, fibrosis de reticulina, posteriormente fibrosis tricrómica (colagenosa) y aumento de precursores mieloides

La anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociada con trombocitosis marcada (RARS-T) se considera a menudo una malignidad mieloide. El diagnóstico de RARS-T puede implicar tradicionalmente hematología y citología, análisis de médula ósea y ausencia de anomalías del cariotipo tales como del (5q), t(3;3)(q21;q26) o inv(3)(q21;q26). Véase Broseus et al. “Clinical features and course of refractory anemia with ring sideroblast associated with marked thrombocytosis” Haematologica 9(7): 1036-1041 (2012).

Aunque el tipo de malignidad mieloide guía el diagnóstico y tratamiento, malignidades individuales pueden tener mutaciones específicas que determinan adicionalmente el pronóstico y el transcurso del tratamiento. Marcadores genéticos son particularmente útiles porque a menudo iluminan la patogenia subyacente de la enfermedad.

La determinación de la presencia de uno (o más) alelos mutantes del gen de calreticulina o de un producto génico del mismo tal como se describe en el presente documento puede realizarse como un análisis independiente. Alternativamente, este análisis puede estar seguido o precedido por el análisis de otros marcadores para malignidades mieloides, tales como mutaciones de JAK2 y MPL. Por ejemplo, pueden someterse a prueba en primer lugar pacientes que se sospecha que padecen una malignidad mieloide, tal como una neoplasia mieloproliferativa (y en particular mielofibrosis primaria (PMF) o trombocitemia esencial (ET)), para detectar una mutación de JAK2 (en particular la mutación V617F). Si se determina que son negativos para la mutación de JAK2, pueden someterse a prueba para detectar calreticulina mutante. Si se determina entonces que son negativos para calreticulina mutante, pueden someterse a prueba para detectar mutaciones de MPL, por ejemplo mutaciones en el exón 10 del gen de mpl. Por supuesto, también pueden someterse a prueba marcadores adicionales. Además, se prevén en el presente documento diferentes órdenes o modos para someter a prueba las mutaciones de JAK2, la calreticulina mutante y/o las mutaciones de MPL y, opcionalmente, marcadores adicionales. Por ejemplo, a una prueba positiva para la mutación de JAK2 puede seguirle una prueba para determinar calreticulina mutante (y viceversa) para la evaluación del pronóstico o diagnóstico adicional de la malignidad mieloide. Además se prevé la determinación simultánea de tales marcadores, como la prueba simultánea para la(s) mutación/mutaciones de JAK2 y calreticulina mutante (y, opcionalmente, marcadores adicionales), o la prueba simultánea de mutación/mutaciones de JAK2, calreticulina mutante y mutación/mutaciones de MPL (y, opcionalmente, marcadores adicionales). Preferiblemente, los pacientes (o una muestra de los pacientes) que padecen una malignidad mieloide o que son propensos a padecer una malignidad mieloide son negativos para las mutaciones tanto de JAK2 como de MPL, es decir están ausentes mutaciones de JAK2 y MPL en pacientes que se evalúa que padecen una malignidad mieloide o que son propensos a padecer una malignidad mieloide según la presente invención. En otras palabras, los pacientes (o una muestra de los pacientes) que se evalúa que padecen una malignidad mieloide o que son propensos a padecer una malignidad mieloide según la presente invención tienen preferiblemente JAK2 y MPL silvestres presentes. Para el diagnóstico adicional, se prevé el uso de marcadores/pruebas adicionales. Por ejemplo, pueden usarse pruebas de médula ósea de rutina. Tales marcadores/pruebas adicionales, como pruebas de médula ósea, pueden usarse para validar por ejemplo una prueba de calreticulina mutante positiva o pueden seguir por ejemplo a una prueba de calreticulina mutante negativa.

Se conocen secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos silvestres de JAK2 y MPL y pueden deducirse de las bases de datos respectivas, tales como NCBI. Se muestran secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo de JAK2 silvestre en NM_004972.3 (ADNc de JAK2) y NP_004963.1 (proteína JAK2), respectivamente. Se muestran secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos a modo de ejemplo MPL silvestre en NM_005373.2 (ADNc de MPL) y NP_005364.1 (proteína MPL).

Se han descrito mutaciones de JAK2 y MPL en malignidades mieloides anteriormente en el presente documento. Tales mutaciones son, por ejemplo, la mutación V617F de JAK2 (mutación de valina a fenilalanina en la posición 617 de la secuencia de aminoácidos de JAK2), mutaciones en el exón 12 de la secuencia de ácido nucleico que codifica para JAK2 y/o mutaciones en el exón 10 de MPL.

La mutación de valina a fenilalanina (V617F) se da a conocer en Baxter et al, 2005; James et al, 2005; Kralovics et al, 2005; Levine et al, 2005). Se han dado a conocer mutaciones en el exón 12 de JAK2 en PV y en el gen de receptor de trombopoyetina Mp L en PMF y ET en Scott et al, 2007 y en Pardanani et al, 2006; Pikman et al, 2006, respectivamente. Todas estas referencias se incorporan en su totalidad en el presente documento como referencia.

La presencia de mutaciones de JAK2 y MPL puede excluirse mediante PCR específica de alelos para JAK2-V617F(ref) y mediante secuenciación de Sanger del exón 12 de JAK2 y el exón 10 de MPL. Se da a conocer un protocolo a modo de ejemplo que puede usarse en este contexto en Kralovics R, Teo SS, Li S, Theocharides A, Buser AS, Tichelli A, Skoda RC. La adquisición de la mutación V617F de JAK2 es un acontecimiento genético tardío en un subconjunto de pacientes con trastornos mieloproliferativos. Blood. 15 de agosto de 2006; 108(4):1377-80. Publicación electrónica del 4 de mayo de 2006, que se incorpora en el presente documento como referencia.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un grupo de pacientes con malignidad mieloide novedoso que se evalúa que son positivos para calreticulina mutante y negativos para JAK2 mutante y MPL mutante (o, en otras palabras, se evalúa que el grupo de pacientes con malignidad mieloide novedoso son positivos para calreticulina mutante y positivo para JAK2 silvestre y MPL silvestre).

En un aspecto preferido, los métodos de la presente divulgación comprenden

- una etapa de determinar la presencia de una proteína JAK2 silvestre o un ácido nucleico de JAK2 silvestre en una muestra del paciente; y/o

- una etapa de determinar la presencia de una proteína MPL silvestre o un ácido nucleico de MPL silvestre en una muestra del paciente.

En un aspecto particularmente preferido, los métodos de la presente divulgación comprenden

- una etapa de determinar la presencia de una proteína JAK2 silvestre o un ácido nucleico de JAK2 silvestre en una muestra del paciente; y

Las etapas anteriores de determinar la presencia de una proteína JAK2 silvestre o un ácido nucleico de JAK2 silvestre en una muestra del paciente; y/o determinar la presencia de una proteína MPL silvestre o un ácido nucleico de MPL silvestre en una muestra del paciente pueden realizarse antes o después de la etapa de determinar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina en una muestra de dicho paciente tal como se proporciona y define en el presente documento.

Preferiblemente, el método de la divulgación se refiere únicamente a la evaluación de si un paciente padece una malignidad mieloide.

El método proporcionado en el presente documento comprende determinar la presencia de preferiblemente un único alelo mutante del gen de calreticulina en una muestra del paciente. Preferiblemente, el método es un método in vitro. Las mutaciones del gen de calreticulina proporcionadas y dadas a conocer en el presente documento son mutaciones somáticas. Estas mutaciones pueden estar presentes en un estado homocigótico o un estado heterocigótico, preferiblemente en un estado heterocigótico.

El uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina pueden comprender un ácido nucleico que codifica para una proteína calreticulina mutante. Las proteínas calreticulina mutantes dadas a conocer y proporcionadas en el presente documento se caracterizan por una secuencia de aminoácidos C-terminal común. Tal como resulta evidente, por ejemplo, a partir de la tabla 2 en el ejemplo, los extremos C-terminales de las proteínas calreticulina mutantes tienen una secuencia mínima común. Dicha secuencia mínima común se muestra en la secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4 y se codifica por moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 1,2 ó 3.

Por consiguiente, la proteína calreticulina mutante que va a usarse según la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 2 ó 3;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4;

(c) una proteína tal como se define en (a) o (b) en la que se delecionan, insertan, añaden o sustituyen uno o más aminoácidos;

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4;

(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria de moléculas de ácido nucleico tal como se define en (a) o (c);

(f) una proteína que tiene una identidad de al menos el 70% con la proteína de uno cualquiera de (a) a (e); y

(g) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que está degenerado como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico tal como se define en (a), (d) o (e).

Las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas y que van a usarse en el presente documento tienen extremos C-terminales característicos, que se muestran en Se Q ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 y 144. Estos extremos C-terminales comprenden la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4.

La proteína calreticulina mutante pueden, según lo anterior, seleccionarse del grupo que consiste en

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21,22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142 ó 143;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 ó 144;

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 ó 144;

(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se híbrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria de moléculas de ácido nucleico tal como se define en (a) o (c);

En el presente documento, se han identificado 36 tipos de proteína calreticulina mutante (véase la tabla 2 que muestra extremos C-terminales de las proteínas calreticulina mutantes de longitud completa). Estas proteínas mutantes se unifican por su extremo C-terminal característico común tal como se muestra en SEQ ID NO: 4. Las secuencias de longitud completa de las proteínas calreticulina mutantes se muestran en SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268; 272, 276, 280, 284 y 288.

Por consiguiente, la proteína calreticulina mutante proporcionada y que va a usarse en el presente documento puede seleccionarse del grupo que consiste en

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261,262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286 ó 287;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284 ó 288;

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284 ó 288;

En el presente documento se ha mostrado que las mutaciones identificadas se producen en el exón 9 del gen de calreticulina. Por tanto, lo siguiente se refiere a las mutaciones en el gen de calreticulina silvestre y en el exón 9 del mismo.

El gen de calreticulina silvestre se conoce bien. Su secuencia de ácido nucleico y secuencia de aminoácidos pueden obtenerse de bases de datos tales como NCBI con el número de registro NG_029662.1 (gen) y NP_004334.1 (proteína).

En SEQ ID NO: 289 se muestra una secuencia de ácido nucleico a modo de ejemplo del gen de calreticulina silvestre. La secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en SEQ ID NO: 290.

El uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina pueden estar en una región que abarca el exón 9 del gen de calreticulina descrito anteriormente. La secuencia de ácido nucleico silvestre del exón 9 del gen de calreticulina se muestra en SEQ ID NO: 435. La secuencia de aminoácidos silvestre correspondiente se muestra en SEQ ID NO: 436.

Tal como se muestra en el presente documento (véase, por ejemplo, la tabla 2), los alelos mutantes proporcionados en el presente documento de los genes de calreticulina tienen una mutación de desplazamiento del marco de lectura en comparación con el gen de calreticulina silvestre. La mutación de desplazamiento del marco de lectura puede estar en el exón 9 del gen de calreticulina silvestre. Debido a la mutación de desplazamiento del marco de lectura, ya no se usa el marco de lectura abierto del gen de calreticulina silvestre, sino un marco alternativo 1 , que conduce a la generación del extremo C-terminal característico de las proteínas calreticulina mutantes (la secuencia mínima común de aminoácidos de las proteínas mutantes se muestra en SEQ ID NO: 4).

La mutación de desplazamiento del marco de lectura puede provocarse mediante la deleción de uno o más nucleótidos, mediante la inserción de dos o más nucleótidos o una combinación de inserción y deleción de uno o más nucleótidos, siempre que la proteína mutante comprenda el extremo C-terminal característico (tal como se muestra en SEQ ID NO: 4) o un fragmento del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura es (o está provocada por) la deleción de un nucleótido de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, o la inserción de dos nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, pueden delecionarse (1 (3xnü)) nucleótidos del gen de calreticulina (o del exón 9 del mismo), mediante 10 cual n0 puede ser cualquier número natural incluyendo cero. Ejemplos no limitativos del número de nucleótidos que pueden delecionarse del gen de calreticulina (o del exón 9 del mismo) para generar un ácido nucleico que codifica para las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento son 1, 4, 19, 22, 31, 34, 46, 52 nucleótidos.

Asimismo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la inserción de dos nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo. Por consiguiente, pueden insertarse (2 (3xn0)) nucleótidos en el gen de calreticulina (o en el exón 9 del mismo), mediante lo cual n0 puede ser cualquier número natural incluyendo cero. Por ejemplo, pueden insertarse 5 nucleótidos en el gen de calreticulina (o en el exón 9 del mismo) para generar un ácido nucleico que codifica para las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento.

La mutación de desplazamiento del marco de lectura también puede estar provocada por una combinación de inserción y deleción de uno o más nucleótidos en el/del gen de calreticulina silvestre (o en el/del exón 9 del mismo), siempre que la proteína mutante resultante comprenda el extremo C-terminal característico (tal como se muestra en SEQ ID NO: 4) o un fragmento del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de un nucleótido de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de seis nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de dos nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de cuatro nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de tres nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de cinco nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 12 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 5 nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 18 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 11 nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 18 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 14 nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 20 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 1 nucleótido en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 28 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 6 nucleótidos en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 35 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 1 nucleótido en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Por ejemplo, la mutación de desplazamiento del marco de lectura puede ser (o puede estar provocada por) la deleción de 36 nucleótidos de la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente del exón 9 del mismo, y por la inserción de 2 nucleótido en la secuencia codificante del gen de calreticulina silvestre, particularmente en el exón 9 del mismo.

Pueden concebirse fácilmente combinaciones adicionales de invenciones de inserción/deleción que dan como resultado la generación del extremo C-terminal característico de las proteínas calreticulina mutantes (la secuencia mínima común de aminoácidos de las proteínas mutantes se muestra en SEQ ID NO: 4) o de un fragmento del mismo.

Debido a las inserciones, deleciones y combinaciones de inserciones/deleciones descritas anteriormente, se introduce un desplazamiento del marco de lectura en el (la secuencia codificante del) gen de calreticulina silvestre y particularmente en el exón 9 del mismo. Por consiguiente, la proteína calreticulina mutante dada a conocer en el presente documento y que va a usarse según la presente invención comprende un tramo de aminoácidos mutante codificado por estas secuencias de exón 9 mutantes.

Por consiguiente, la proteína calreticulina mutante puede seleccionarse del grupo que consiste en

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 ó 433;

(b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ó 434;

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ó 434;

La presencia del uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina puede evaluarse a nivel genómico, a nivel de ARNm o a nivel de proteína.

Si la presencia del uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina va a evaluarse a nivel genómico, el alelo mutante puede comprender o consistir en ADN, preferiblemente ADN genómico.

Por ejemplo, el alelo mutante puede comprender un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288; 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ó 434;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41,45, 49, 53, 57, 61,65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 3511 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411,415, 419, 423, 427 ó 431;

(c) un ácido nucleico que se híbrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria del ácido nucleico tal como se define en (a) o (b);

(d) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos el 70% con la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos según uno cualquiera de (a) a (c); y

(e) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que está degenerado como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico según uno cualquiera de (a) a (d).

Según la presente invención puede usarse cualquier método empleado de manera rutinaria para análisis mutacionales. La presencia del alelo mutante a nivel genómico puede determinarse, por ejemplo, mediante secuenciación (tal como secuenciación de Sanger, por ejemplo secuenciación de Sanger bidireccional) y/o estrategias de detección basadas en PCR, tales como ensayos de determinación del tamaño mediante PCR (es decir PCR seguida por análisis de fragmentos por ejemplo mediante electroforesis en gel de agarosa (tal como electroforesis en gel de agarosa de alta densidad)).

La detección de una mutación en un ácido nucleico puede realizarse mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo secuenciación directa, identificación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLPI) de ADN genómico, detección de polimorfismos ampliados al azar (RAPD), detección de polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLPD), reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación de ADN, sondas de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO), hibridación con perlas o microalineamientos de ADN, fusión de alta resolución (HRM) y principio de sonda de TaqMan. El ácido nucleico puede ser ADN genómico, ADN genómico amplificado, ARNm, ADNc o ADNc amplificado.

La secuenciación se realiza normalmente con ácidos nucleicos amplificados de manera específica. El análisis del tamaño de fragmentos usa normalmente diferencias en los tamaños de amplicones tras la PCR. La fusión de alta resolución (HRM) detecta mutaciones en el ADN midiendo con precisión el punto de fusión de ADN bicatenario. Gundry et al., “Amplicon Melting Analysis with Labeled Primers: A Closed-Tube Method for Diferentiating Homozygotes and Heterozygotes” Clinical Chemistry 49: 396-406 (2003). Normalmente el usuario usará PCR para amplificar la región de ADN en la que se encuentra su mutación de interés. Después se calienta con precisión el ADN amplificado desde aproximadamente 50°C hasta aproximadamente 95°C, hasta que las hebras se separan. Este procedimiento se monitoriza normalmente con tintes fluorescentes.

Un enfoque que puede emplearse en el presente documento usa análisis del tamaño de fragmentos, seguido o no por secuenciación. Tal como se mencionó anteriormente, pueden usarse ensayos de PCR que usan por ejemplo ADN genómico de calreticulina mutante como molde para la amplificación del a Dn . Posteriormente, puede someterse el ADN amplificado a análisis de fragmentos por ejemplo mediante electroforesis en gel de agarosa.

A continuación se describen adicionalmente métodos para determinar la presencia del alelo mutante a nivel de ARNm o a nivel de proteína.

Para el ARNm, pueden realizarse muchos de los mismos métodos usados para ADN tras la transcripción inversa para generar ADNc. Otros métodos incluyen PCR en tiempo real, PCR con transcriptasa inversa, secuenciación al azar de transcriptoma completo (sec. de a Rn ), hibridación in situ o microalineamientos. La PCR en tiempo real amplifica y detecta simultáneamente una secuencia de interés. El uso de cebadores específicos y marcadores fluorescentes puede distinguir entre la forma silvestre y mutaciones.

Pueden analizarse proteínas mediante métodos que incluyen inmunohistoquímica (IHC), inmunoensayo, métodos basados en gel o transferencia, espectrometría de masas, citometría de flujo o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Muchos métodos monitorizan la unión de un anticuerpo o conjunto de anticuerpos a una proteína de interés que detectan diferencias entre formas silvestres y mutantes. La espectrometría de masas detecta diferencias en el tamaño de una proteína y sus fragmentos que revelan información sobre la secuencia subyacente. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos policlonales que se unen específicamente a proteína calreticulina mutante, tal como se muestra en el ejemplo 2.

La presente divulgación también aprovecha la determinación de la presencia de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina con el fin de diagnosticar una malignidad mieloide.

La presente invención se refiere a un método para evaluar si un paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide, comprendiendo dicho método

- determinar la presencia de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina en una muestra de dicho paciente; y

- evaluar que dicho paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide cuando está presente dicho producto génico,

El método proporcionado en el presente documento comprende determinar la presencia de un producto génico de preferiblemente un único alelo mutante del gen de calreticulina en una muestra del paciente. Preferiblemente, el método es un método in vitro.

Las malignidades mieloides incluyen neoplasmas mieloproliferativos y síndromes mielodisplásicos. En el presente documento se prefiere que la malignidad mieloide sea un neoplasma mieloproliferativo, particularmente mielofibrosis primaria (PMF) o trombocitemia esencial (ET), o un síndrome mielodisplásico, particularmente anemia refractaria con sideroblastos en anillo y trombocitemia (RARS-T).

El uno o más alelos mutantes pueden comprender un ácido nucleico que codifica para una proteína calreticulina mutante.

La proteína calreticulina mutante puede seleccionarse del grupo que consiste en

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4.

(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria de moléculas de ácido nucleico tal como se define en (a) o (c); (f) una proteína que tiene una identidad de al menos el 70% con la proteína de uno cualquiera de (a) a (e); y (g) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que está degenerado como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico tal como se define en (a), (d) o (e).

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142 ó 143; (b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 ó 144;

El alelo mutante puede comprender un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137, 141, 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281, 285, 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411,415, 419, 423, 427 ó 431;

(c) un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria del ácido nucleico tal como se define en (a) o (b);

(e) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que está degenerado como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico según uno cualquiera de (a) a (d ).

El producto génico puede ser un ARNm. Por ejemplo, el producto génico puede ser un ARNm que codifica para la secuencia de aminoácidos C-terminal de las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento.

Por consiguiente, el producto génico puede comprender un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en (a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 3;

Dicho producto génico puede comprender un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 ó 144;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83, 87, 91, 95, 99, 103, 107, 111, 115, 119, 123, 127, 131, 135, 139 ó 143;

El producto génico puede comprender un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284 ó 288;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 147, 151, 155, 159, 163, 167, 171, 175, 179, 183, 187, 191, 195, 199, 203, 207, 211, 215, 219, 223, 227, 231, 235, 239, 243, 247, 251, 255, 259, 263, 267, 271, 275, 279, 283 ó 287;

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ó 434;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401,405, 409, 413, 417, 421, 425, 429 ó 433;

Si el producto génico es ARNm, la presencia o cantidad de dicho ARNm puede determinarse mediante técnicas rutinarias, tales como PCR en tiempo real, PCR con transcriptasa inversa, secuenciación al azar de transcriptoma completo (sec. de ARN), secuenciación de Sanger, hibridación in situ o microalineamientos.

Por consiguiente, la determinación mediante técnicas de PCR tales como PCR en tiempo real o PCR con transcriptasa inversa pueden comprender además las etapas de

(i) poner en contacto el ácido nucleico en la muestra con uno o dos oligonucleótidos; y

(ii) generar un producto de amplificación que contiene la secuencia diana.

En el presente documento se proporcionan y se usan sondas y cebadores específicos de mutación a modo de ejemplo.

Oligonucleótidos (cebadores) a modo de ejemplo que van a usarse según la presente invención son

Directo:

y/o

^Inverso:GGCCTCAGTCCAGCCCTG ^{(SEQ ID NO: 438)}

^Directo:GGCAAGGCCCTGAGGTGT ^{(SEQ ID NO: 439)}

y/o

^inverso:GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ |D NO: 438⁾

Las sondas y los cebadores específicos de mutación adecuados adicionales para su uso en la presente divulgación pueden derivarse, por ejemplo, de las secuencias de ADNc del gen de calreticulina mutado. Tales secuencias de ADNc se proporcionan y describen a continuación. Se muestran secuencias de ADNc a modo de ejemplo que pueden usarse en este contexto en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138, 142, 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250, 254, 258, 262, 266, 270, 274, 278, 282 ó 286; 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324328, 332, 336, 340, 344, 348, 352, 356, 360, 364, 368, 372, 376, 380, 384, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428 ó 432.

En la siguiente tabla se representan secuencias de ADNc a modo de ejemplo adicionales que pueden usarse para el diseño de sondas y cebadores específicos de mutación:

Secuencias de uniones de mutación en la secuencia de ADNc de CALR para el diseño de sondas o cebadores de PCR específicos de mutación.

Mutación de CALR Secuencias de unión de ADNc en posiciones mutadas

Tipo 1 GAAGGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGAT (SEQ ID NO: 440) Tipo 2 GAGGAGGAGGCAGAGGACAATTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG (SEQ ID NO:

441 )

Tipo 3 GGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT (SEQ ID NO: 442) Tipo 4 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGAGGCAGAGGACAAGG (SEQ ID NO: 443) Tipo 5 TGAAGGACAAACAGGACGAGGGGCAGAGGACAAGGAGGATGA (SEQ ID NO: 444) Tipo 6 AGGACAAACAGGACGAGGAGCGGAGGCAGAGGACAAGGAGGA (SEQ ID NO: 445) Tipo 7 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGATGATGAGGACAAAG (SEQ ID NO: 446) Tipo 8 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGAGGCAGAGGACAAGGAG (SEQ ID NO: 447) Tipo 9 CAAGAAACGCAAAGAGGAGGAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT (SEQ ID NO: 448) Tipo 10 AGGAGGAGGAGGCAGAGGACATGTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG (SEQ ID NO: 449)

Tipo 11 AAGGACAAACAGGACGAGGACCAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT (SEQ ID NO:

450)

Tipo 12 CAAACAGGACGAGGAGCAGAGGAGGAGGAGGAGGCAGAGGAC (SEQ ID NO: 451) Tipo 13 AACAGGACGAGGAGCAGAGGCAGAGGAGGAGGCAGAGGACAAG (SEQ ID NO: 452) Tipo 14 ACAGGACGAGGAGCAGAGGCTGAGGAGGAGGCAGAGGACAAG (SEQ ID NO: 453) Tipo 15 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGAGGGAGAGGACAAGGAGGATGATG (SEQ ID NO: 454)

Tipo 16 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTCAGAGGAGGCAGAGGACAAGGAG (SEQ ID NO:

455)

Tipo 17 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGAGGCAG7GGACAAGGAGGATGATGAGG (SEQ ID NO: 456)

Tipo 18 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGATGATGAGGACAAAGAT (SEQ ID NO: 457) Tipo 19 GGAGCAGAGGCTTAAGGAGGAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT (SEQ ID NO: 458) Tipo 20 GGCTTAAGGAGGAGGAAGAAGGGAGGAGGCAGAGGACAAGGA (SEQ ID NO: 459) Tipo 21 GGCTTAAGGAGGAGGAAGAAGCGTTTAAGAGGACAAGGAGGATGATGA (SEQ ID NO: 460)

Tipo 22 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACAACGCAAAGAGGAGGAGGAGG (SEQ ID NO: 461) Tipo 23 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACTGCGTGAGGAGGAGGAGGCAGAGGAC (SEQ ID NO: 462)

Tipo 24 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACAGGAGGCAGAGGACAAGGAGG (SEQ ID NO: 463) Tipo 25 TAAGGAGGAGGAAGAAGACAAAAGGCAGAGGACAAGGAGGATG (SEQ ID NO: 464) Tipo 26 TAAGGAGGAGGAAGAAGACAAAAACGCAAAGAGGAGGAGGAG (SEQ ID NO: 465) Tipo 27 AAGGAGGAGGAAGAAGACAAGTGTTTCGCAAAGAGGAGGAGGAGGCA (SEQ ID NO: 466)

Tipo 28 GGAAGAAGACAAGAAACGCAAAAGGAGGATGATGAGGACAAA (SEQ ID NO: 467) Tipo 29 GAAGACAAGAAACGCAAAGAGCCTCCTCTTTGTCTAAGGAGGATGATGAGGACAAA (SEO ID NO: 468)

Tipo 30 AGACAAGAAACCCAAAGAGGACCATCCTTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA (SEO ID NO: 469 )

Tipo 31 AGAGGAGGAGGAGGCAGAGGGCAATTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG (SEQ ID NO: 470)

Tipo 32 GAGGAGGAGGAGGCAGAGGACTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA (SEQ ID NO:

471)

Tipo 33 GAGGAGGAGGCAGAGGACAAATGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG (SEQ ID NO:

472)

Tipo 34 AGGAGGAGGAGGCAGAGGACACTTGTCCGAGGATGATGAGGACAAAGA (SEQ ID NO: 473)

Tipo 35 AGGAGGAGGAGGCAGAGGACATTTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA (SEQ ID NO: 474)

Tipo 36 AGGAGGAGGCAGAGGACAAGTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA (SEQ ID NO:

10 ll_______________.___________. . ____ ___________________ ___ __ ._________ Las letras en negrita indican los bordes de un acontecimiento de deleción; las letras subrayadas indican secuencias insertadas; las letras en negrita y cursiva indican variantes de un único nucleótido

Lo siguiente se refiere a realizaciones, en las que el producto génico es una proteína/un polipéptido.

El producto génico puede comprender un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 1,2 ó 3;

(a) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de ácido nucleico tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142 ó 143;

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172; 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284 ó 288.

(d) una proteína codificada por una molécula de ácido nucleico codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 ó 434. (e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria de moléculas de ácido nucleico tal como se define en (a) o (c); (f) una proteína que tiene una identidad de al menos el 70% con la proteína de uno cualquiera de (a) a (e); y (g) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que está degenerado como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico tal como se define en (a), (d) o (e).

Si el producto génico es una proteína, la presencia o cantidad de dicha proteína puede determinarse mediante técnicas de rutina, tales como mediante inmunohistoquímica (IHC), mediante inmunoensayo, métodos basados en gel o transferencia, IHC, espectrometría de masas, citometría de flujo o FACS.

Dado que las mutaciones de CALR provocan un desplazamiento del marco de lectura del polipéptido traducido, está presente una secuencia de aminoácidos C-terminal característica en las proteínas calreticulina mutadas tal como se describe y proporciona en el presente documento. Esta secuencia de aminoácidos característica altera la carga global de la proteína. También altera la migración de la calreticulina mutada durante la electroforesis de proteínas. Puede aprovecharse esta diferencia en la carga y/o en el comportamiento de migración con el fin de determinar la presencia de una proteína calreticulina mutada. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos específicos para proteína calreticulina mutante para identificar dicha proteína mutante por ejemplo mediante inmunotransferencia de tipo Western. Opcionalmente, también pueden usarse anticuerpos específicos para la proteína calreticulina silvestre (de manera adicional) como control. Tales anticuerpos pueden incluir anticuerpos policlonales y monoclonales que pueden prepararse mediante técnicas de rutina.

Preferiblemente, el paciente es un paciente humano. Puede sospecharse que el paciente padece un malignidad mieloide o puede sospecharse que es propenso a padecer un malignidad mieloide.

Lo siguiente se refiere a muestras que van a usarse según la presente invención. La muestra puede ser una muestra de médula ósea, una muestra de sangre o una muestra de saliva. La muestra es preferiblemente una muestra de sangre. La muestra de sangre comprende preferiblemente granulocitos periféricos. La muestra puede obtenerse de un paciente mediante técnicas de rutina, por ejemplo, mediante biopsia.

El método proporcionado anteriormente en el presente documento puede comprender además administrar un inhibidor de la calreticulina mutante tal como se definió anteriormente en el presente documento al paciente.

Lo siguiente se refiere a ADNc que codifica para las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento.

La presente divulgación se refiere a un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4; y

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 2.

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 ó 144;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82, 86, 90, 94, 98, 102, 106, 110, 114, 118, 122, 126, 130, 134, 138 ó 142;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 146, 150, 154, 158, 162, 166, 170, 174, 178, 182, 186, 190, 194, 198, 202, 206, 210, 214, 218, 222, 226, 230, 234, 238, 242, 246, 250; 254, 258, 262, 266, 270, 274, 278, 282 ó 286;

La presente divulgación se refiere a un ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 292, 296, 300, 304, 308, 312, 316, 320, 324, 328, 332, 336, 340, 344, 348, 352, 356, 360, 364, 368, 372, 376, 380, 384, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428 ó 432;

Preferiblemente, el ácido nucleico definido anteriormente es ADNc.

Lo siguiente se refiere a ARNm que codifica para las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento.

(a) un ácido nucleico que codifica para un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos tal como se representa en SEQ ID NO: 4;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 293, 297, 301, 305, 309, 313, 317, 321, 325, 329, 333, 337, 341, 345, 349, 353, 357, 361, 365, 369, 373, 377, 381, 385, 389, 393, 397, 401,405, 409, 413, 417, 421,425, 429 ó 433;

El ácido nucleico definido anteriormente es preferiblemente ARNm.

Lo siguiente se refiere a ADN genómico que codifica para las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento.

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 1.

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 1, 5, 9, 13, 17, 21,25, 29, 33, 37, 41,45, 49, 53, 57, 61,65, 69, 73, 77, 81, 85, 89, 93, 97, 101, 105, 109, 113, 117, 121, 125, 129, 133, 137 ó 141;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 145, 149, 153, 157, 161, 165, 169, 173, 177, 181, 185, 189, 193, 197, 201, 205, 209, 213, 217, 221, 225, 229, 233, 237, 241, 245, 249, 253, 257, 261, 265, 269, 273, 277, 281 ó 285;

(b) un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos tal como se representa en SEQ ID NO: 291, 295, 299, 303, 307, 311, 315, 319, 323, 327, 331, 335, 339, 343, 347, 351, 355, 359, 363, 367, 371, 375, 379, 383, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427 ó 431;

El ácido nucleico definido anteriormente es preferiblemente ADN genómico.

Lo siguiente se refiere a proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento.

La presente divulgación se refiere a una proteína seleccionada del grupo que consiste en

(f) una proteína que tiene una identidad de al menos el 70% con la proteína de uno cualquiera de (a) a (e); y (g) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico que está degenerado como resultado del código genético con respecto a la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico tal como se define en (a), (d) o (e).

El significado de los términos “polipéptido”, “proteína” y “secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” se conoce bien en la técnica y se usa por consiguiente en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, “secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” tal como se usa(n) en el presente documento se refiere(n) a todas las formas de tipos que se producen de manera natural o generados de manera recombinante de ácidos nucleicos y/o secuencias/moléculas de ácido nucleico así como a secuencias/moléculas de ácido nucleico sintetizadas químicamente. Este término también abarca análogos de ácido nucleico y derivados de ácido nucleico. El término “secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” puede referirse a ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). La(s) “secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” puede(n) prepararse mediante metodología química de síntesis conocida por un experto habitual en la técnica, o mediante el uso de tecnología recombinante, o puede(n) aislarse de fuentes naturales, o mediante una combinación de las mismas. El ADN y ARN pueden comprender opcionalmente nucleótidos no naturales y pueden ser mono o bicatenarios. “Secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” también se refiere a ADN y ARN sentido y antisentido, es decir, una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos específica en ADN y/o ARN. Además, el término “secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” puede referirse a ADN o ARN o híbridos de los mismos o cualquier modificación de los mismos que se conoce en el estado de la técnica (véanse, por ejemplo, los documentos US 5525711, US 4711955, US 5792608 o EP 302175 para ejemplos de modificaciones). La(s) molécula(s) de ácido nucleico puede(n) ser mono o bicatenaria(s), lineal(es) o circular(es), natural(es) o sintética(s), y sin ninguna limitación de tamaño. Por ejemplo, la(s) molécula(s) de ácido nucleico puede(n) ser ADN genómico, ADNc, ARNm, ARN antisentido o un a Dn que codifica para tales ARN o quimeroplastos (Colestrauss, Science (1996), 1386-1389). Dicha(s) molécula(s) de ácido nucleico puede(n) estar en forma de un plásmido o de ADN o ARN viral. “Secuencia(s)/molécula(s) de ácido nucleico” también puede referirse a un(os) oligonucleótido(s), en el/los que se incluyen cualquiera de las modificaciones del estado de la técnica tales como fosfotioatos o ácidos nucleicos peptídicos (ANP).

El experto puede identificar una secuencia de ácido nucleico con un determinado nivel de identidad con las secuencias humanas proporcionadas en el presente documento usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo usando ensayos de hibridación o usando alineaciones, o bien manualmente o bien usando programas informáticos tales como los mencionado a continuación en el presente documento en relación con la definición del término “hibridación” y grados de homología.

La secuencia de ácido nucleico puede ser idéntica en al menos el 70% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 1, en la que se prefieren los valores más altos. Lo más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 99% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 1.

La secuencia de ácido nucleico puede ser idéntica en al menos el 70% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 2. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 2, en la que se prefieren los valores más altos. Lo más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 99% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 2.

La secuencia de ácido nucleico puede ser idéntica en al menos el 70% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 3. Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 3, en la que se prefieren los valores más altos. Lo más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 99% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 3.

La secuencia de ácido nucleico puede ser idéntica en al menos el 70% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 ó 433.

Más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO. 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50; 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 ó 433, en la que se prefieren los valores más altos.

Lo más preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico es idéntica en al menos el 99% a la secuencia de ácido nucleico tal como se muestra en SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352; 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 ó 433.

En la técnica se conocen bien ensayos de hibridación para la caracterización de ácidos nucleicos con un determinado nivel de identidad con las secuencias de ácido nucleico tal como se proporcionan en el presente documento; véase por ejemplo Sambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). El término “hibridación” o “hibridarse” tal como se usa en el presente documento puede referirse a hibridaciones en condiciones rigurosas o no rigurosas. Si no se especifica nada más, las condiciones son preferiblemente no rigurosas. Dichas condiciones de hibridación pueden establecerse según protocolos convencionales descritos, por ejemplo, en Sambrook (2001) ya citado; Ausubel (1989) ya citado, o Higgins and Hames (Eds.) “Nucleic acid hybridization, a practical approach” IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). Establecer las condiciones queda dentro de las habilidades del experto y puede determinarse según protocolos descritos en la técnica. Por tanto, la detección de secuencias que sólo se hibridan específicamente requerirá habitualmente condiciones de hibridación y lavado rigurosas tales como, por ejemplo, las condiciones de hibridación de alta rigurosidad de 0,1 x SSC, SDS al 0,1% a 65°C o 2 x SSC, 60°C, SDS al 0,1%. Las condiciones de hibridación de baja rigurosidad para la detección de secuencias homólogas o no exactamente complementarias pueden establecerse, por ejemplo, a 6 x SSC, SDS al 1% a 65°C. Tal como se conoce bien, la longitud de la sonda y la composición del ácido nucleico que va a determinarse constituyen parámetros adicionales de las condiciones de hibridación. En el presente documento se considera que un ácido nucleico puede ser un cebador o una sonda, por ejemplo, un ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria del ácido nucleico de una calreticulina mutante (o de un fragmento del mismo tal como se define en el presente documento) o del ácido nucleico que codifica para una proteína calreticulina mutante (o que codifica para el extremo C-terminal de la misma) o del exón 9 de la calreticulina mutante y similares tal como se definió y proporcionó anteriormente en el presente documento. Los cebadores y las sondas se encuentran con frecuencia en el intervalo de 10-30 nucleótidos. Por tanto, la divulgación se refiere a un ácido nucleico (tal como un cebador o una sonda) que se hibrida en condiciones rigurosas con la hebra complementaria del ácido nucleico de la calreticulina mutante tal como se definió y proporcionó anteriormente en el presente documento, en el que dicho ácido nucleico de hibridación tiene menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 ó 20 nucleótidos y tiene más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 nucleótidos . Preferiblemente, el ácido nucleico tiene una longitud de 10 a 35 nucleótidos, más preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos, de manera particularmente preferida una longitud de 18 a 21, por ejemplo 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos.

Según la presente invención, los términos “homología” o “homología en porcentaje” o “ idéntico” o “identidad en porcentaje” o “porcentaje de identidad” o “identidad de secuencia” en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos que son iguales (identidad de al menos el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, lo más preferiblemente de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98%, lo más preferiblemente identidad de al menos el 99%), cuando se comparan y se alinean para obtener una correspondencia máxima a lo largo de un intervalo de comparación (preferiblemente a lo largo de la longitud completa), o a lo largo de una región designada tal como se mide usando un algoritmo de comparación de secuencias tal como se conoce en la técnica, o mediante alineación manual e inspección visual. Puede considerarse que las secuencias que tienen, por ejemplo, una identidad de secuencia del 75% al 90% o mayor son sustancialmente idénticas. Una definición de este tipo también se aplica al complemento de una secuencia de prueba. Preferiblemente la identidad descrita existe a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente de 15 a 25 nucleótidos de longitud, más preferiblemente, a lo largo de una región que tiene al menos aproximadamente de 50 a 100 nucleótidos de longitud y lo más preferiblemente a lo largo de la longitud completa. Los expertos en la técnica sabrán cómo determinar la identidad en porcentaje entre secuencias usando, por ejemplo, algoritmos tales como los basados en el programa informático CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680) o FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), tal como se conoce en la técnica.

Aunque el algoritmo FASTDB normalmente no tiene en cuenta deleciones o adiciones internas no coincidentes en las secuencias, es decir, huecos, en su cálculo, esto puede corregirse manualmente para evitar una sobreestimación de la identidad en %. Sin embargo, CLUSTALW sí que tiene en cuenta huecos de secuencia en sus cálculos de identidad. También están disponibles para los expertos en esta técnica los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Altschul, (1997) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410). El programa BLASTN para secuencias de ácido nucleico usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras. La matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff (1989) PNAS 89:10915) usa alineaciones (b ) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas hebras.

Con el fin de determinar si un residuo de nucleótido en una secuencia de ácido nucleico corresponde a una determinada posición en la secuencia de nucleótidos, por ejemplo, de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411,412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421,423, 424, 425, 427, 428, 429, 431,432 y 433, respectivamente, el experto puede usar medios y métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, alineaciones, o bien manualmente o bien usando programas informáticos tales como los mencionados en el presente documento. Por ejemplo, puede usarse BLAST 2.0, que representa herramienta de búsqueda por alineación local básica (Basic Local Alignment Search Tool) BLAST (Altschul (1997), ya citado; Altschul (1993), ya citado; Altschul (1990), ya citado), para buscar alineaciones de secuencias locales. BLAST, tal como se comentó anteriormente, produce alineaciones de secuencias de nucleótidos para determinar la similitud de secuencia. Debido a la naturaleza local de las alineaciones, BLAST es especialmente útil para determinar coincidencias exactas o para identificar secuencias similares. La unidad fundamental de la salida del algoritmo de BLAST es el par de segmentos de alta puntuación (HSP). Un HSP consiste en dos fragmentos de secuencia de longitudes arbitrarias pero iguales cuya alineación es localmente máxima y para los que la puntuación de alineación cumple o supera una puntuación umbral o de corte establecida por el usuario. El enfoque de BLAST es buscar HSP entre una secuencia de consulta y una secuencia de base de datos, evaluar la significación estadística de cualquier coincidencia encontrada y notificar sólo aquellas coincidencias que satisfacen el umbral de significación seleccionado por el usuario. El parámetro E establece el umbral de significación estadística para notificar coincidencias de secuencias de base de datos. E se interpreta como el límite superior de la frecuencia prevista de posibilidad de aparición de un HSP (o conjunto de HSP) dentro del contexto de toda la búsqueda de base de datos. Cualquier secuencia de base de datos cuya coincidencia satisface E se notifica en la salida del programa.

Se usan técnicas informáticas análogas usando BLAST (Altschul (1997), ya citado; Altschul (1993), ya citado; Altschul (1990), ya citado) para buscar moléculas idénticas o relacionadas en bases de datos de nucleótidos tales como GenBank o EMBL. Este análisis es mucho más rápido que múltiples hibridaciones basadas en membrana. Además, la sensibilidad de la búsqueda informática puede modificarse para determinar si cualquier coincidencia particular se clasifica como exacta o similar. La base de la búsqueda es la puntación de producto, que se define como:

% de identidad de secuencia x % de puntuación máximo

Toó

y tiene en cuenta tanto el grado de similitud entre dos secuencias como la longitud de la coincidencia de secuencias. Por ejemplo, con una puntuación de producto de 40, la coincidencia será exacta con un error del 1-2%; y a 70, la coincidencia será exacta. Habitualmente se identifican moléculas similares seleccionando aquellas que muestran puntuaciones de producto de entre 15 y 40, aunque puntuaciones inferiores pueden identificar moléculas relacionadas. Otro ejemplo de un programa que puede generar alineaciones de secuencias es el programa informático CLUSTALW (Thompson (1994) Nucl. Acids Res. 2:4673-4680) o FASTDB (Brutlag (1990) Comp. App. Biosci. 6:237-245), tal como se conoce en la técnica.

Las explicaciones y definiciones facilitadas anteriormente en el presente documento con respecto a la “homología/identidad de secuencias de ácido nucleico” se aplican, cambiando lo que sea necesario, a “secuencias de aminoácidos” de las proteínas calreticulina mutantes proporcionadas en el presente documento tal como se representan en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente, tal como se explica a continuación.

El polipéptido que va a usarse según la presente divulgación puede tener una similitud/identidad de al menos el 70% con las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos tal como se representa, por ejemplo, en SEQ ID NO: 4, respectivamente. Más preferiblemente, el polipéptido tiene una similitud/identidad de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98% con las proteínas representadas en SEQ ID NO: 4, respectivamente, en la que se prefieren los valores más altos. Lo más preferiblemente, el polipéptido tiene una homología de al menos el 99% con la proteína tal como se representa en 4.

El polipéptido que va a usarse según la presente divulgación puede tener una similitud/identidad de al menos el 70% con las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos tal como se representa, por ejemplo, en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente. Más preferiblemente, el polipéptido tiene una similitud/identidad de al menos el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97% o el 98% con las proteínas representadas en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente, en la que se prefieren los valores más altos. Lo más preferiblemente, el polipéptido tiene una homología de al menos el 99% con la proteína tal como se representa en 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente.

Sin apartarse del punto esencial de la presente invención también puede(n) usarse un(os) fragmento(s) (funcional(es)) o un(os) derivado(s) funcional(es) de los polipéptidos o proteínas proporcionados en el presente documento, por ejemplo, fragmento(s) (funcional(es)) o derivado(s) (funcional(es)) del extremo C-terminal mínimo de la calreticulina mutante tal como se muestra en SEQ ID NO: 4. También puede(n) usarse un(os) fragmento(s) (funcional(es)) o un(os) derivado(s) (funcional(es)) de polipéptidos o proteínas de calreticulina mutante adicionales proporcionados en el presente documento, por ejemplo, fragmento(s) (funcional(es)) o derivado(s) (funcional(es)) del/de los polipéptido(s) tal como se muestra(n) en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente.

Por tanto, un fragmento (funcional) del/de los polipéptido(s)/proteína(s) anterior(es) proporcionado(s) en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede ser cualquiera de los polipéptidos específicos anteriores tal como se muestran en una cualquiera de SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente, en el que se delecionan uno o más aminoácidos.

Un(os) derivado(s) (funcional(es)) del/de los polipéptido(s)/proteína(s) anterior(es) proporcionado(s) en el presente documento y que va(n) a usarse según la presente invención puede(n) ser cualquiera de los polipéptidos específicos anteriores tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente, en el/los que se insertan, añaden o sustituyen uno o más aminoácidos.

Preferiblemente, la deleción, inserción, adición y/o sustitución de uno o más aminoácidos está dentro del extremo C-terminal de la calreticulina mutante proporcionada en el presente documento, es decir dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido tal como se muestra en SEQ ID NO: 4.

Preferiblemente, la deleción, inserción, adición y/o sustitución de uno o más aminoácidos está dentro del extremo C-terminal de la calreticulina mutante proporcionada en el presente documento, es decir dentro de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos tal como se muestran en S^eQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.

Pueden delecionarse, insertarse, añadirse o sustituirse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 aminoácidos preferiblemente dentro del extremo C-terminal de la calreticulina mutante proporcionada en el presente documento, es decir dentro de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos tal como se muestran en SEQ ID NO: 4.

Pueden delecionarse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 5, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 aminoácidos preferiblemente del extremo C-terminal de la calreticulina mutante proporcionada en el presente documento, es decir de la secuencia de aminoácidos del polipéptido tal como se muestra en SEQ ID NO: 4.

Pueden delecionarse, insertarse, añadirse y/o sustituirse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 aminoácidos preferiblemente dentro del extremo C-terminal de la calreticulina mutante proporcionada en el presente documento, es decir dentro de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos tal como se muestran en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.

El término “uno o más aminoácidos delecionados” se refiere a fragmentos (funcionales) de las proteínas calreticulina mutantes específicas proporcionadas en el presente documento.

Un fragmento (funcional) preferido de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención consiste en desde 15 hasta 25 aminoácidos contiguos. Por consiguiente, un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos contiguos.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente divulgación consiste preferiblemente en desde 15 hasta 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en desde 15 hasta 25 aminoácidos contiguos de los polipéptidos tal como se muestran en SEQ ID n O: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos contiguos de los polipéptidos tal como se muestran en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 y hasta 42 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42 y hasta 43 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 32 ó 112.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 y hasta 44 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 8, 128, 132 ó 144.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, y hasta 45 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 12, 44, 136 ó 140.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 y hasta 46 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 16 ó 124.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, y hasta 47 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 24, 40, 76, 100 ó 120.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, y hasta 48 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 28, 36, 72, 84, 96 ó 116.

Un fragmento (funcional) de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que va a usarse según la presente invención puede consistir en al menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,

17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47,48 y hasta 49 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 20, 48, 60, 64, 68 ó 80.

17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47,48,

49 y hasta 50 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 52 ó 56.

49, 50, 51 y hasta 52 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 92.

17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47,48,

49, 50, 51, 52 y hasta 53 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 88 ó 104.

49, 50, 51, 52, 53 y hasta 54 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 108.

El fragmento o derivado tiene preferiblemente la misma (o esencialmente la misma) actividad biológica que el polipéptido de longitud completa del que se deriva, teniendo el polipéptido de longitud completa la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72,

76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172,

176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434. En este sentid fragmento o derivado es un fragmento o derivado “funcional” que va a usarse en el presente documento.

El polipéptido proporcionado en el presente documento (tal como se muestra, por ejemplo, en SEQ ID NO: 4, 8, 12,

16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128,

132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente) puede tener uno o más aminoácidos delecionados, insert añadidos y/o sustituidos siempre que el polipéptido conserve esencialmente la actividad biológica que es característica de los polipéptidos de los que se deriva.

Preferiblemente, cualquiera de tales deleciones, inserciones, adiciones y/o sustituciones (en este contexto particularmente sustituciones) son conservativas, es decir se sustituyen aminoácidos por aminoácidos que tienen características iguales o similares. Por ejemplo, un aminoácido hidrófobo se sustituirá preferiblemente por otro aminoácido hidrófobo y así sucesivamente.

La “actividad biológica” característica de los polipéptidos proporcionados en el presente documento puede considerarse como una actividad que es causante (del desarrollo) de una malignidad mieloide tal como se define en el presente documento, tal como un neoplasma mieloproliferativo (particularmente mielofibrosis primaria y trombocitemia esencial).

La presente invención también proporciona inhibidores de calreticulina mutante. Estos inhibidores pueden usarse como medicamento.

El término “antagonista de calreticulina mutante” o “inhibidor de calreticulina mutante” significa en el contexto de la presente invención un compuesto que puede prevenir o reducir total o parcialmente la actividad fisiológica y/o el nivel de expresión de (una) calreticulina mutante. Los términos “antagonista” o “inhibidor” se usan de manera intercambiable en el presente documento.

Por tanto, en el contexto de la presente invención dicho antagonista puede prevenir, reducir, inhibir o inactivar la actividad fisiológica de una calreticulina mutante tras la unión de dicho compuesto/sustancia (es decir antagonista/inhibidor) a dicha calreticulina mutante. Tal como se usa en el presente documento, el término “antagonista” también abarca antagonistas competitivos, antagonistas no competitivos (reversibles) o antagonistas irreversibles, tal como se describe, entre otros, en Mutschler, “Arzneimittelwirkungen” (1986), Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart, Alemania. Una inhibición de este tipo puede medirse determinando la renovación de sustrato.

Un “antagonista” o “inhibidor” de una calreticulina mutante también es posible que pueda prevenir la función de una calreticulina mutante previniendo/reduciendo la expresión de la molécula de ácido nucleico que codifica para dicha calreticulina mutante. Por tanto, un antagonista/inhibidor de una calreticulina mutante puede conducir a un nivel de expresión reducido de la calreticulina mutante (por ejemplo nivel reducido de un ARNm de calreticulina mutante y/o de proteína calreticulina mutante); esto puede reflejarse en una actividad reducida de calreticulina mutante. La actividad y/o el nivel de expresión reducido puede medirse/detectarse mediante métodos conocidos que también se describen en el presente documento.

Un “antagonista/inhibidor de una calreticulina mutante” puede, por ejemplo, interferir con la transcripción de un(os) gen(es) de calreticulina mutante, el procesamiento (por ejemplo corte y empalme, exportación desde el núcleo y similares) del/de los producto(s) génico(s) (por ejemplo ARNm sin someter a corte y empalme o sometido parcialmente a corte y empalme) y/o la traducción del producto génico (por ejemplo ARNm maduro). El “antagonista/inhibidor de una calreticulina mutante” también puede interferir con modificación adicional (tal como glicosilación o fosforilación) del polipéptido/proteína codificado por el/los gen(es) de calreticulina mutante y por tanto inhibir completa o parcialmente la actividad de una(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s) tal como se describió anteriormente en el presente documento. Además, el “antagonista/inhibidor de una calreticulina mutante” puede interferir con interacciones de la(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s) con otras proteínas (interfiriendo por tanto, por ejemplo, con la actividad de complejos que implican proteína(s) calreticulina(s) mutante(s)) o, en general, con su síntesis, por ejemplo interfiriendo con etapas anteriores de la expresión de calreticulina mutante o con ruta de señalización en las que está implicada la calreticulina mutante. Dependiendo del modo de acción, tales antagonistas pueden denominarse, por ejemplo, “antagonistas secuestrantes” o “antagonistas de señalización”.

En resumen, el antagonista/inhibidor de calreticulina mutante descrito en el presente documento conducirá, por consiguiente, a una disminución o reducción del nivel de expresión y/o la actividad de calreticulina mutante, y reducirá de ese modo su contribución al desarrollo o la proliferación de una malignidad mieloide tal como se define en el presente documento.

El/los antagonista(s) puede(n) ser ARNhp (ARN de horquilla pequeño), ARNip (ARN de interferencia pequeño), miARN (microRNA), ARNbc (ARN bicatenario), (ARN temporal pequeño), moléculas antisentido, parejas de unión extracelulares, moléculas (de unión) pequeñas, aptámeros, intrámeros o moléculas de anticuerpo tales como un anticuerpo completo (inmunoglobulina), un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)2, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con injerto de CDR, un constructo de anticuerpo bivalente, un anticuerpo sintético, un anticuerpo de cadena sencilla biespecífico o un anticuerpo con clonación cruzada.

La presente divulgación se refiere a un ARNip o ARNhp que selecciona como diana específicamente el ácido nucleico que codifica para la(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s), mediante lo cual el ácido nucleico es especialmente ARNm tal como se define en el presente documento.

Hasta el 10% de las bases contiguas de los ARNip o ARNhp proporcionados en el presente documento pueden ser no complementarias. El ARNip puede comprender además al menos una base en el extremo 5' y/o al menos una base en el extremo 3'.

Pueden prepararse fácilmente antagonista(s)/inhibidor(es) que son ácidos nucleicos, tales como ARNip, ARNhp, moléculas antisentido y similares, mediante técnicas conocidas usando, por ejemplo, las siguientes secuencias diana. Por ejemplo, ARNip, ARNhp y similares que van a emplearse en el presente documento pueden comprender o consistir en una secuencia de ARN que corresponde a una de las siguientes secuencias diana. El término “secuencia de ARN que corresponde a” significa en este contexto que la secuencia de ARN es idéntica a una de las siguientes secuencias diana con la excepción de que los residuos de timidina (T) de la secuencia diana se sustituyen por un residuo de uracilo (U). El ARNip puede consistir en una molécula de ácido nucleico que comprende al menos diez bases contiguas. Por ejemplo, el ARNip, ARNhp y similar puede comprender al menos diez bases contiguas de una secuencia de ARN correspondiente a una de las siguientes secuencias diana tal como se definieron anteriormente. El ARNip, ARNhp y similar puede consistir en diez bases contiguas de una secuencia de ARN correspondiente a una de las siguientes secuencias diana tal como se definieron anteriormente.

El ARNip, ARNhp y similar puede seleccionar como diana una de las siguientes secuencias diana. Estas secuencias se refieren a SEQ ID NO: 476 a SEQ ID NO: 1309.

En el presente documento se contemplan anticuerpos que se unen específicamente a la(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s) proporcionada(s) anteriormente. Tales anticuerpos pueden usarse para fines terapéuticos y de diagnóstico según la presente invención. Por ejemplo, anticuerpos producidos contra el polipéptido C-terminal único de calreticulina mutada ofrecen una prueba de diagnóstico para detectar malignidad mieloide. También la detección de péptidos derivados de este extremo C-terminal único mediante espectrometría de masas ofrece una prueba de diagnóstico para detectar malignidad mieloide. Preferiblemente, tales anticuerpos son inhibidores de calreticulina mutante.

Por ejemplo, los anticuerpos que van a usarse en el presente documento pueden unirse específicamente a la(s) siguiente(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s) mostrada(s) en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente. Particularmente, tales anticuerpos pueden unirse específicamente al extremo C-terminal de la(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s), por ejemplo, a proteínas tal como se muestran en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente.

Se prevé en el presente documento que los anticuerpos pueden unirse específicamente a fragmentos (funcionales) o derivados (funcionales) de las proteínas calreticulinas mutantes tal como se definen en el presente documento, por ejemplo también a polipéptidos que tienen una identidad de al menos el 70% o más con la(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s) proporcionada(s) en el presente documento.

Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de estos anticuerpos en los métodos de la presente invención. Por tanto, la presente invención se refiere al uso del/de los anticuerpo(s) descrito(s) anteriormente en el presente documento que se une(n) específicamente a o que reconoce(n) específicamente uno o más de los polipéptidos de las proteínas calreticulinas mutantes descritas y proporcionadas en el presente documento para evaluar si un paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide.

La presente invención también se refiere a un(os) anticuerpo(s) tal como se definió anteriormente o a la composición anterior que comprende dicho(s) anticuerpo(s) para la preparación de un kit de diagnóstico para su uso en los métodos de la presente invención.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo completo (inmunoglobulina), un fragmento F(ab), un fragmento F(ab)2, un anticuerpo de cadena sencilla, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo con injerto de CDR, un constructo de anticuerpo bivalente, un anticuerpo biespecífico de cadena sencilla, un anticuerpo sintético o un anticuerpo de clonación cruzada y similares.

Pueden prepararse de manera rutinaria anticuerpos policlonales o monoclonales u otros anticuerpos (derivados de los mismos) usando, entre otros, protocolos de inmunización convencionales; véanse Ed Harlow, David Lane, (diciembre de 1988), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; o Ed Harlow, David Lane, (diciembre de 1998), Portable Protocols (Using Antibodies): A Laboratory Manual 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory.

Por ejemplo, la inmunización puede implicar la administración intraperitoneal o subcutánea del polipéptido/la proteína calreticulina mutante (y/o fragmentos, isoformas, homólogos, etcétera) tal como se definen en el presente documento a un mamífero (por ejemplo roedores tales como ratones, ratas, hámsteres y similares). Preferiblemente, se usan fragmentos de la proteína/polipéptido mutante, en los que el fragmento porta preferiblemente el extremo C-terminal (o un fragmento del mismo) tal como se definen en el presente documento.

Un fragmento preferido de los polipéptidos mencionados anteriormente (es decir el/los polipéptido(s)/la(s) proteína(s) calreticulina(s) mutante(s)) proporcionados en el presente documento y que van a usarse según la presente invención consiste en desde 15 hasta 25 aminoácidos contiguos. Por consiguiente, un fragmento de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que van a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos contiguos. Un fragmento de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que van a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en desde 15 hasta 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4. Un fragmento de los polipéptidos mencionados anteriormente proporcionados en el presente documento y que van a usarse según la presente invención consiste preferiblemente en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4.

Como prueba de principio, se usó un fragmento (RRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA) para generar anticuerpos policlonales que se unen específicamente a anticuerpo frente una calreticulina mutante; véase el ejemplo 2. Este fragmento consiste en 24 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4. Estos anticuerpos policlonales pueden usarse como herramienta de investigación y/o en los métodos de diagnóstico proporcionados en el presente documento. Este fragmento de la proteína calreticulina mutante (u otros fragmentos proporcionados y definidos en el presente documento) también pueden usarse como vacuna, tal como se describe en el presente documento adicionalmente más adelante.

Se conocen en la técnica métodos para la preparación y el examen de anticuerpos que se unen específicamente a o reconocen específicamente los polipéptidos mutantes. Por ejemplo, pueden purificarse por afinidad anticuerpos que reconocen la proteína mutante. Se usa comúnmente ELISA para examinar sueros y/o someter a ensayo fracciones en columna de afinidad. Pueden usarse inmunotransferencias de tipo Western para demostrar que el anticuerpo puede detectar la verdadera proteína de interés y para evaluar si el anticuerpo sólo reconoce la proteína de interés, o si da reacción cruzada con otras proteínas.

Un experto en la técnica está en posición de aplicar y adaptar las enseñanzas de estos documentos para la generación y validación de anticuerpos que se unen específicamente a o que reconocen específicamente los polipéptidos tal como se definen en el presente documento en el contexto de la presente invención.

Lo siguiente se refiere al uso de las proteínas calreticulinas mutantes proporcionadas en el presente documento como vacuna. Por tanto, las proteínas calreticulinas mutantes actúan como antígenos. Por tanto, los términos “proteína calreticulina mutante” y “antígenos de proteína calreticulina mutante” y similares pueden usarse de manera intercambiable a continuación en el presente documento.

Según lo anterior, las proteínas calreticulinas mutantes proporcionadas en el presente documento pueden usarse como vacuna. En otras palabras, las proteínas calreticulinas mutantes proporcionadas en el presente documento pueden usarse en inmunización activa. Por tanto, la presente invención se refiere a proteínas calreticulinas mutantes tal como se definen y proporcionan en el presente documento (o ácidos nucleicos (o vectores que los comprenden)) que codifican para proteínas calreticulinas mutantes tal como se definen y proporcionan en el presente documento para su uso como vacuna. Se han descrito proteínas calreticulinas mutantes, fragmentos y derivados de las mismas anteriormente en el presente documento con gran detalle. Estas explicaciones y definiciones se aplican, cambiando lo que se deba cambiar, en este contexto. Son útiles como vacuna, en particular, proteínas que comprenden o que consisten en el extremo C-terminal de las proteínas calreticulinas mutantes proporcionadas en el presente documento tal como se muestran en SEQ ID NO: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, respectivamente, así como en fragmentos de las mismas. Son particularmente útiles en este contexto proteínas calreticulinas mutantes que comprenden o consisten en el extremo C-terminal mínimo tal como se muestra en SEQ ID NO: 4 o un fragmento del mismo.

La presente invención se refiere a una proteína para su uso como vacuna, en la que la proteína es un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprende o consiste en de 15 a 40 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4.

La presente invención se refiere a una proteína para su uso como vacuna tal como se definió anteriormente en el presente documento, en la que la proteína consiste en de 15 a 25 aminoácidos contiguos de la proteína tal como se muestra en SEQ ID NO: 4.

Preferiblemente, se usa como vacuna un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprende o que consiste en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ó 40 aminoácidos de la proteína tal como se muestra en SEQ ID NO: 4. Se prefieren particularmente fragmentos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprenden o que consisten en de 15 a 25 aminoácidos contiguos de la proteína tal como se muestra en SEQ ID NO: 4 para su uso como vacuna. Por consiguiente, se usa como vacuna un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprende o que consiste en 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ó 25 aminoácidos contiguos de la proteína tal como se muestra en SEQ ID NO: 4.

Tales fragmentos o derivados de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 pueden acoplarse con proteínas tales como hemocianina de lapa californiana (KLH), albúmina sérica bovina (BSA) o toxoides bacterianos (por ejemplo toxoide tetánico, toxoide diftérico) y usarse para inmunización.

La vacuna puede usarse en el tratamiento de malignidades mieloides tal como se definen en el presente documento.

Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a un método para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una malignidad mieloide tal como se define en el presente documento, que comprende administrar una cantidad eficaz de la vacuna tal como se definió anteriormente en el presente documento a un paciente. En otras palabras, la presente divulgación se refiere a un método para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una malignidad mieloide tal como se define en el presente documento, que comprende administrar una cantidad eficaz de la proteína calreticulina mutante tal como se definió anteriormente en el presente documento a un paciente.

Por ejemplo, aunque un paciente no reaccionaría normalmente a CALR, debido a autotolerancia, muchas de las mutaciones en el exón 9 de CALR provocan desplazamientos del marco de lectura de manera que la parte C-terminal de CALR mutante difiere de la silvestre y por tanto no está sujeta a autotolerancia. La inmunización con el polipéptido mutante generaría una respuesta inmunitaria frente a CALR mutante. Por consiguiente, puede usarse una vacuna de manera terapéutica para seleccionar como diana el cáncer existente.

También podría usarse una vacuna de manera profiláctica. Por ejemplo, se conoce que los cánceres pueden mutar y evolucionar para eludir la respuesta inmunitaria del huésped y el tratamiento contra el cáncer. Por tanto, un paciente con una malignidad mieloide que no tiene mutación de CALR, o una única mutación de CALR, puede desarrollar más tarde mutaciones de CALR adicionales. Por tanto, puede seleccionarse la inmunización frente a otras formas mutantes de CALR frente a tales mutantes de CALR.

También pueden usarse mutantes de CALR para generar anticuerpos in vitro o en otro animal para su uso en terapia en el paciente. Un enfoque de este tipo es particularmente útil porque pueden producirse los anticuerpos contra epítopos tolerados en el paciente. Tales anticuerpos también son útiles para terapia porque pueden controlarse con precisión el título, y el anticuerpo también puede conjugarse con toxinas o radionucleidos para terapia dirigida.

A continuación se describe un protocolo a modo de ejemplo para realizar inmunización activa (o el uso de las vacunas proporcionadas anteriormente en el presente documento):

Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones con una vacuna (por ejemplo un péptido derivado de la proteína mostrada en s Eq ID NO: 4 o un péptido que es un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4, en la que el péptido se acopla con KLH o BSA) antes del trasplante de células de médula ósea que expresan calreticulina mutante o silvestre. Los ratones receptores inmunizados pueden irradiarse con dosis subletales o letales para fomentar el injerto o no irradiarse en absoluto. Las células trasplantadas puede ser una mezcla de células que expresan o bien calreticulina mutada o bien calreticulina silvestre. Se hará un seguimiento de los ratones inmunizados después del trasplante. Si se provoca una respuesta inmunitaria frente a células que expresan calreticulina mutante, se producirá preferiblemente el injerto con células que expresan calreticulina silvestre. Se usarán ratones de control sin inmunización. Alternativamente, puede realizarse la inmunización después del injerto de ratones con una mezcla 50:50 (u otra razón) de células que expresan calreticulina silvestre/mutada. Si se provoca una respuesta inmunitaria frente a células que expresan calreticulina mutante, la razón 50:50 (u otra) cambiará a favor de las células que expresan calreticulina silvestre. Se usarán ratones de control sin inmunización para la comparación.

La presente invención se refiere al uso de una proteína calreticulina mutante como antígeno tal como se proporciona en el presente documento y se definió anteriormente en el presente documento y, opcionalmente, un adyuvante, para la fabricación de una composición de vacuna para el tratamiento o la prevención de malignidad mieloide tal como se define en el presente documento.

La proteína calreticulina mutante puede producirse de manera recombinante (es decir producirse en células huésped apropiadas) o sintética (es decir sintetizada químicamente). La producción recombinante de proteína calreticulina mutante se describe en el presente documento. Por ejemplo, la producción recombinante puede lograrse usando una cualquiera de las técnicas de clonación molecular y expresión recombinante conocidas en la técnica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica para proteína calreticulina mutante puede introducirse en una célula huésped apropiada, tal como una bacteria, una célula de levadura (por ejemplo, una célula de Pichia), una célula de insecto o una célula de mamífero (por ejemplo, célula CHO). La molécula de ácido nucleico codificante puede colocarse en un ligamiento operable con un promotor que puede realizar la expresión del antígeno de proteína calreticulina mutante en la célula huésped. La proteína calreticulina mutante, que se expresa por la célula huésped, puede purificarse fácilmente usando técnicas de purificación de proteínas de rutina.

Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos tal como se expone en SEQ ID NO: 1, 2 ó 3 o una secuencia de ácido nucleico que codifica para el antígeno de proteína calreticulina mutante mostrada en SEQ ID NO: 4 o que codifica para un fragmento de la misma, tal como una proteína que consiste en de 15 a 25 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4, puede clonarse en un vector de expresión y colocarse en un ligamiento operable con un promotor sensible a la temperatura. El vector de expresión puede introducirse en Escherichia coli y el antígeno puede expresarse tras inducción con calor. Las células pueden lisarse y los cuerpos de inclusión en los que se acumula el antígeno se separan mediante centrifugación. La proteína recombinante en los cuerpos de inclusión se solubiliza usando SDS u otros agentes de solubilización conocidos en la técnica tales como urea, clorhidrato de guanidina, colato de sodio, taurocolato y desoxicolato de sodio. Según la presente invención, se combina una proteína calreticulina mutante recombinante purificada con un portador farmacéuticamente aceptable para formar una composición de vacuna.

La presente invención proporciona una composición inmunogénica para conferir protección en un paciente frente a malignidad mieloide, comprendiendo la composición una proteína calreticulina mutante. La composición puede formularse como vacuna para administración in vivo a un paciente. La composición puede comprender un adyuvante, tal como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio.

Además, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una proteína calreticulina mutante tal como se definió anteriormente en el presente documento para su uso como medicamento. Una composición que comprende una proteína calreticulina mutante tal como se definió anteriormente en el presente documento puede usarse para la fabricación de un medicamento para inmunizar un huésped o paciente frente a una enfermedad por una malignidad mieloide.

La presente invención se refiere a una composición de vacuna que contiene un antígeno de proteína calreticulina mutante tal como se define en el presente documento (o “una vacuna de proteína calreticulina mutante”), que es adecuada para la administración a pacientes y puede proteger a pacientes frente a una malignidad mieloide.

El término “un portador farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes de retardo de la adsorción, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina, entre otros.

Los adyuvantes adecuados para su uso en una composición de vacuna según la presente invención incluyen, pero no se limitan a varias clases de adyuvante tales como; sales minerales, por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio; agentes tensioactivos y micropartículas, por ejemplo, surfactantes de polímero de bloque no iónico (por ejemplo, colesterol), virosomas, saponinas (por ejemplo, Quil A, QS-21 y g PI-0100), proteosomas, complejos estimulantes inmunitarios, cocleatos, aminas cuaternarias (bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA)), avridina, vitamina A, vitamina E; productos bacterianos tales como el sistema de adyuvante RIBI (Ribi Inc.), esqueleto de pared celular de Mycobacterum phlei (Detox®), muramil dipéptidos (MDP) y tripéptidos (MTP), monofosforil-lípido A, bacilo Calmette-Guerin, enterotoxinas de E. colitérmolábiles, toxina del cólera, dimicolato de trehalosa, oligodesoxinucleótidos CpG; citocinas y hormonas, por ejemplo, interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, deshidroepiandrosterona, 1,25-dihidroxi-vitamina D3; polianiones, por ejemplo, dextrano; compuestos poliacrílicos (por ejemplo, poli(metcrilato de metilo), Carbopol 934P); portadores por ejemplo, toxoide tetánico, toxoide diftérico, subunidad B de la toxina del cólera, enterotoxina mutante termolábil de E. coli enterotoxigénica (rmLT), proteínas de choque térmico; emulsiones de aceite en agua por ejemplo, AMPHIGEN® (Hydronics, EE.UU.); y emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, adyuvantes completo e incompleto de Freund.

El antígeno de proteína calreticulina mutante proporcionado en el presente documento y el portador farmacéuticamente aceptable pueden combinarse de cualquier manera conveniente y práctica para formar una composición de vacuna, por ejemplo, mediante mezclado, disolución, suspensión, emulsionamiento, encapsulación, absorción y similares, y pueden prepararse en formulaciones tales como comprimidos, cápsulas, polvo, jarabe, suspensiones que son adecuadas para inyecciones, implantaciones, inhalaciones, ingestiones o similares. Preferiblemente, la vacuna se formula de manera que puede administrarse a pacientes mediante inyección en una dosis de aproximadamente 0,1 a 5 ml, o preferiblemente de aproximadamente 0,5 a 2,5 ml, o incluso más preferiblemente, en una dosis de aproximadamente 1 ml. Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas de la presente invención deben volverse estériles mediante procedimientos bien conocidos.

La cantidad del antígeno de proteína calreticulina mutante proporcionado en el presente documento en las vacunas debe ser eficaz en la inmunización y está generalmente en el intervalo de 0,5 -1000 pg por dosis.

La cantidad de adyuvantes adecuada para su uso en las vacunas depende de la naturaleza del adyuvante usado. Por ejemplo, cuando se usan Quil A y colesterol como adyuvante, Quil A está generalmente en una cantidad de aproximadamente 1-1000 Pg por dosis; y el colesterol está generalmente en una cantidad de aproximadamente 1 1000 Pg por dosis.

Según la presente divulgación, puede administrarse una vacuna por cualquier vía conocida, incluyendo la oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica y parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea o intramuscular). La administración también puede lograrse usando dispositivos de administración sin agujas. La administración puede lograrse usando una combinación de vías, por ejemplo, una primera administración usando una vía parental y una administración posterior usando una vía mucosa. Las vías de administración preferidas incluyen administraciones subcutáneas e intramusculares.

La presente invención proporciona vacunas y métodos de combinación para proteger a pacientes mediante la administración de tales vacunas de combinación.

La presente invención proporciona un agente inmunogénico, en el que el agente inmunogénico es proteína calreticulina mutante tal como se definió y proporcionó anteriormente en el presente documento. Dicho agente es eficaz para inducir una respuesta inmunogénica frente a proteínas calreticulinas mutantes en un paciente. Por tanto, el agente inmunogénico puede usarse en el tratamiento o la prevención de un malignidad mieloide tal como se define en el presente documento.

Además, la presente invención proporciona un conjugado que comprende un agente inmunogénico ligado a una proteína transportadora. El agente inmunogénico es proteína calreticulina mutante tal como se definió y proporcionó anteriormente en el presente documento. La proteína transportadora (tal como albúmina sérica entre otros) puede potenciar la respuesta inmunitaria. El conjugado puede ser una proteína de fusión que comprende un agente inmunogénico (es decir la proteína calreticulina mutante tal como se definió y proporcionó anteriormente en el presente documento) fusionado a una proteína transportadora. El agente también puede ligarse a la proteína transportadora mediante reticulación química. El agente puede ligarse o fusionarse al extremo amino-terminal de la proteína transportadora. El agente puede ligarse o fusionarse al carboxilo de la proteína transportadora. El agente puede ligarse o fusionarse internamente a la proteína transportadora. Pueden estar presentes múltiples repeticiones o multímeros del agente en un conjugado, tal como una proteína de fusión. El agente puede formar parte de un polipéptido más largo que incluye el agente con otros aminoácidos. El agente puede ser un componente de una partícula. La partícula puede ser un liposoma o una micropartícula. El agente puede emulsionarse o encapsularse en la partícula, tal como un liposoma o una micropartícula.

La presencia de un polipéptido C-terminal único en proteínas calreticulinas mutadas tal como se proporciona en el presente documento ofrece la oportunidad de seleccionar como diana la proteína mutante dejando la proteína silvestre intacta. Como la secuencia de aminoácidos derivada del marco de lectura -1 del exón 9 de calreticulina codifica para un péptido que no muestra homología con ninguna otra proteína de vertebrados, pueden generarse inhibidores tal como se definieron anteriormente (como anticuerpos (preferiblemente anticuerpos inhibidores), ARNip, ARNhp o fármacos de molécula pequeña) frente a la misma con un efecto terapéutico. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos C-terminal de la proteína calreticulina mutante (tal como la proteína mutante derivada del marco de lectura alternativo del exón 9) puede usarse para la generación de anticuerpos policlonales y monoclonales (preferiblemente anticuerpos inhibidores). La calreticulina mutante tal como se proporciona en el presente documento es por tanto una diana valiosa para inmunoterapia en malignidades mieloides. Alternativamente, puede usarse inmunización de pacientes con el péptido mutante o proteínas mutantes recombinantes en la intervención terapéutica de malignidad mieloide.

Se ha mostrado que la calreticulina se secreta de las células y puede detectarse en suero. La calreticulina también circula hasta la superficie celular en la que proporciona una “señal fagocítica positiva” para la fagocitosis de células apoptóticas.

Por consiguiente, la presente invención prevé un inhibidor de una calreticulina mutante para su uso como medicamento. Además, la presente invención se refiere a la proteína calreticulina mutante tal como se proporciona en el presente documento, anticuerpos que se unen específicamente a la misma (preferiblemente anticuerpos inhibidores), ácidos nucleicos tal como se proporcionan en el presente documento (particularmente ácidos nucleicos que codifican para proteína calreticulina mutante), el ARNip tal como se proporciona en el presente documento para su uso como medicamento. Los términos “medicamento” y “composición farmacéutica” se usan de manera intercambiable en el presente documento. Por consiguiente, las definiciones y explicaciones proporcionadas en el presente documento en relación con “composiciones farmacéuticas”, se aplican, cambiando lo que se deba cambiar, al término “medicamento”.

La presente invención se refiere a un inhibidor de una calreticulina mutante para su uso en el tratamiento de una malignidad mieloide.

La presente divulgación proporciona un método para tratar a un paciente con malignidad mieloide que comprende administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de una calreticulina mutante al paciente.

El paciente que va a tratarse puede ser un paciente evaluado como “positivo” según la presente invención, es decir un paciente del que se ha determinado que una muestra tiene uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina presentes.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un inhibidor de una calreticulina mutante para su uso en el tratamiento de una malignidad mieloide, mediante lo cual va a tratarse un paciente, que padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer un malignidad mieloide, mediante lo cual se determinan que están presentes uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina (o de un producto génico del mismo) en una muestra de dicho paciente.

Todas las definiciones y explicaciones facilitadas anteriormente en el presente documento en relación con la determinación de la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina (o de un producto génico del mismo) en una muestra de dicho paciente se aplican, cambiando lo que se deba cambiar, en este contexto.

La presente divulgación proporciona un método para tratar a un paciente con malignidad mieloide que comprende administrar una cantidad eficaz de un inhibidor de una calreticulina mutante al paciente, comprendiendo además el método evaluar si el paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide, que comprende

- determinar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina (o de un producto génico del mismo) en una muestra de dicho paciente; y

- evaluar si dicho paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide cuando están presentes dicho uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina (o un producto génico del mismo).

La calreticulina mutante puede ser una proteína calreticulina mutante tal como se definió anteriormente en el presente documento. Si la calreticulina mutante es una proteína calreticulina mutante, el inhibidor puede ser un anticuerpo (preferiblemente un anticuerpo inhibidor), parejas de unión extracelulares, moléculas de unión pequeñas, aptámeros o intrámeros.

La calreticulina mutante puede ser un ácido nucleico que codifica para una proteína calreticulina mutante tal como se definió anteriormente en el presente documento. Si la calreticulina mutante es un ácido nucleico de este tipo (preferiblemente ARNm tal como se proporcionó y definió anteriormente), el inhibidor puede ser ARNip, miARN, ARNbc, ARNhp, ARNtp y moléculas antisentido.

Tal como se mencionó anteriormente, malignidad mieloide incluye una neoplasia mieloproliferativa o un síndrome mielodisplásico. Una neoplasia mieloproliferativa a modo de ejemplo es mielofibrosis primaria (PMF). Se prefiere en el presente documento la terapia de una neoplasia mieloproliferativa, particularmente la de mielofibrosis primaria (PMF) o de trombocitemia esencial (ET). Un síndrome mielodisplásico a modo de ejemplo sometido a intervención terapéutica según la presente invención es anemia refractaria con sideroblastos en anillo y trombocitemia (RARS-T).

Los términos “tratamiento”, “tratar” y similares se usan en el presente documento para significar generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en cuanto a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en cuanto a curar completa o parcialmente una enfermedad y/o efecto adverso atribuido a la enfermedad. El término “tratamiento” tal como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un sujeto e incluye: (a) prevenir una enfermedad relacionada en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad; (b) inhibir la enfermedad, es decir detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir provocar la regresión de la enfermedad.

Un “individuo”, “paciente” o “sujeto” para los fines de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, particularmente mamíferos, y otros organismos. Por tanto, los métodos son aplicables tanto a terapia de seres humanos como a aplicaciones veterinarias. Preferiblemente, el “individuo”, “paciente” o “sujeto” es un mamífero, y lo más preferiblemente el “individuo”, “paciente” o “sujeto” es humano.

El inhibidor de una calreticulina mutante puede administrarse como un único agente (es decir en forma de una monoterapia) o en forma de una terapia de combinación, por ejemplo, terapias convencionales como terapia con hidroxiurea o interferón alfa.

La composición farmacéutica se formulará y dosificará de un modo que concuerde con la buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual, el sitio de administración de la composición farmacéutica, el método de administración, el programa de administración, y otros factores conocidos por los profesionales. La “cantidad eficaz” de la composición farmacéutica para los fines en el presente documento se determina por tanto mediante tales consideraciones.

El experto sabe que la cantidad eficaz de composición farmacéutica administrada a un individuo dependerá, entre otros, de la naturaleza del compuesto.

Por ejemplo, si dicho inhibidor es una molécula pequeña, la cantidad (farmacéuticamente) eficaz total del inhibidor en la composición farmacéutica administrada por vía oral por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 50 mg de inhibidor al día a 1000 mg de inhibidor al día de paciente, aunque, tal como se indicó anteriormente, esto estará sujeto al juicio terapéutico. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 50 mg de inhibidor al día, y lo más preferiblemente para seres humanos de entre aproximadamente 50 mg y 600 mg de inhibidor al día. Por ejemplo, un inhibidor puede administrarse a una dosis de 15 mg/kg de peso corporal al día. Si se administra de manera continua, el inhibidor se administra normalmente a una tasa de dosis de aproximadamente 50 mg al día a aproximadamente 600 mg al día. También puede emplearse una disolución para bolsa intravenosa. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado. Pueden determinarse las cantidades particulares mediante pruebas convencionales que conoce bien el experto en la técnica. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado. Pueden determinarse las cantidades particulares mediante pruebas convencionales que conoce bien el experto en la técnica.

La administración de las composiciones proporcionadas en el presente documento puede comprender, entre otros, una administración dos veces al día, cada día, cada dos días, cada tres días, cada cuatro días, cada cinco días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez al mes, etc.

Por ejemplo, si dicho compuesto es un (poli)péptido o una proteína, la cantidad farmacéuticamente eficaz total de composición farmacéutica administrada por vía parenteral por dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 |ig de proteína/kg/día a 15 mg de proteína/kg/día de peso corporal del paciente, aunque, tal como se indicó anteriormente, esto estará sujeto a juicio terapéutico. Más preferiblemente, esta dosis es de al menos 0,01 mg de proteína/kg/día, y lo más preferiblemente para seres humanos de entre aproximadamente 0,01 y 1 mg de proteína/kg/día. Si se administra de manera continua, la composición farmacéutica se administra normalmente a una tasa de dosis de aproximadamente 1 |ig/kg/hora a aproximadamente 50 |ig/kg/hora, o bien mediante 1-4 inyecciones al día o bien mediante infusiones subcutáneas continuas, por ejemplo, usando una minibomba. También puede emplearse una disolución para bolsa intravenosa. La duración del tratamiento necesaria para observar cambios y el intervalo tras el tratamiento para que se produzcan respuestas parece variar dependiendo del efecto deseado. Pueden determinarse las cantidades particulares mediante pruebas convencionales que conoce bien el experto en la técnica.

Pueden administrarse las composiciones farmacéuticas de la invención por vía oral, rectal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como mediante polvos, pomadas, gotas o parche transdérmico), bucal, o como pulverización oral o nasal.

Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden preferiblemente un portador farmacéuticamente aceptable. Por “portador farmacéuticamente aceptable” quiere decirse una carga, un diluyente, material de encapsulación o una formulación auxiliar de cualquier tipo no tóxicos sólidos, semisólidos o líquidos. El término “parenteral” tal como se usa en el presente documento se refiere a modos de administración que incluyen inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intraesternal, subcutánea e intraarticular.

La composición farmacéutica también se administra de manera adecuada mediante sistemas de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen polilactidas (patente estadounidense n.° 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (R. Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981) y R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), etileno-acetato de vinilo (R. Langer et al., íd.) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). La composición farmacéutica de liberación sostenida también incluye compuesto atrapado de manera liposómica. Se preparan liposomas que contienen la composición farmacéutica mediante métodos conocidos per se: documento DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); documento EP 52.322; documento EP 36.676; documento EP 88.046; documento EP 143.949; documento EP 142.641; solicitud de patente japonesa 83-118008; patentes estadounidenses n.os 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. De manera habitual, los liposomas son del tipo unilaminar pequeño (de aproximadamente 200-800 ángstrom) en el que el contenido lipídico es mayor de aproximadamente el 30 por ciento molar de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia óptima.

Para administración parenteral, la composición farmacéutica se formula generalmente mezclándola al grado de pureza deseado, en una forma inyectable de dosificación unitaria (disolución, suspensión o emulsión), con un portador farmacéuticamente aceptable, es decir, uno que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas y es compatible con otros componentes de la formulación.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto los componentes de la composición farmacéutica uniforme e íntimamente con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos. Entonces, si es necesario, el producto se conforma para dar la formulación deseada. Preferiblemente, el portador es un portador parenteral, más preferiblemente una disolución que es isotónica con la sangre del receptor. Los ejemplos de tales vehículos portadores incluyen agua, solución salina, solución de Ringer y disolución de dextrosa. Vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo también son útiles en el presente documento, así como los liposomas. El portador contiene de manera adecuada cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y estabilidad química. Tales materiales no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético, y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; (poli)péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez residuos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tales como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o PEG.

Los componentes de la composición farmacéutica que va a usarse para administración terapéutica deben ser estériles. Se logra fácilmente la esterilidad mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Los componentes terapéuticos de la composición farmacéutica se ponen generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa para disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

Los componentes de la composición farmacéutica se almacenarán habitualmente en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como disolución acuosa o como formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan de viales 10 ml con 5 ml de disolución acuosa al 1% (p/v) esterilizada por filtración, y se liofiliza la mezcla resultante. Se prepara la disolución de infusión mediante la reconstitución del/de los compuesto(s) liofilizado(s) usando agua para inyección bacteriostática.

El fin del tratamiento para policitemia vera es reducir el número de células sanguíneas extra. El tratamiento de policitemia vera puede incluir flebotomía, quimioterapia con o sin flebotomía, terapia biológica usando interferón alfa o interferón alfa pegilado y aspirina a baja dosis.

El tratamiento de mielofibrosis primaria en pacientes sin signos o síntomas es habitualmente espera en observación. Los pacientes con mielofibrosis primaria pueden tener signos o síntomas de anemia. La anemia se trata habitualmente con transfusión de glóbulos rojos para aliviar los síntomas y mejorar la calidad de vida. Además, la anemia puede tratarse con factores de crecimiento eritropoyéticos, prednisona, danazol, talidomida, lenalidomida o pomalidomida. El tratamiento de mielofibrosis primaria en pacientes con otros signos o síntomas puede incluir terapia dirigida con ruxolitinib (un inhibidor de JAK1 y JAK2), quimioterapia, trasplante de células madre de donante, talidomida, lenalidomida o pomalidomida, esplenectomía, radioterapia en el bazo, los ganglios linfáticos u otras zonas fuera de la médula ósea donde se forman células sanguíneas, terapia biológica usando interferón alfa o factores de crecimiento eritropoyéticos, o la inclusión en un ensayo clínico de otros fármacos de terapia dirigida.

El tratamiento de trombocitemia esencial en pacientes de menos de 60 años que no tienen signos o síntomas y un recuento de plaquetas aceptable es habitualmente espera en observación. En algunos casos, el paciente puede tomar aspirina para ayudar a prevenir los coágulos sanguíneos. El tratamiento de otros pacientes puede incluir quimioterapia, hidroxiurea, terapia con anagrelida, terapia biológica usando interferón alfa o interferón alfa pegilado, aféresis de plaquetas.

El inhibidor de la unión a JAK ruxolitinib se muestra prometedor para el tratamiento curativo y de apoyo. La Administración de Alimentos y Fármacos ha aprobado ruxolitinib para su uso en el tratamiento de mielofibrosis de alto riesgo y riesgo intermedio en 2011; véase Tefferi 22 de marzo de 2012; Blood: 119 (12) También Ostojic notifica que se usa ruxolitinib en la terapia de mielofibrosis; véase Ostojic Therapeutic and Clinical Risk Management 2012:895 103.

Los inhibidores de JAK que se usan actualmente en ensayos clínicos para neoplasias mieloproliferativas incluyen, además de ruxolitinib, SAR302503, CYT387, lestaurtinib, SB1518, AZD1480, BMS911543, LY2784544, NS-018 y XL019; véase Tefferi 22 de marzo de 2012; Blood: 119 (12).

A continuación se muestra una fórmula de ruxolitinib a modo de ejemplo ((3R)-3-ciclopentil-3-[4-(7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-4-il)pirazol-1-il]propanenitrilo; nombre comercial Jakafi, Jakavi):

La anemia refractaria con sideroblastos en anillo y la trombocitosis pueden requerir transfusiones de sangre y otra terapia de apoyo para remediar la anemia, incluyendo altas dosis de piridoxina (vitamina B6). El trasplante de médula ósea también es una opción. RARS-T también puede progresar a leucemia.

Se contempla el uso de las terapias anteriores para pacientes con diagnóstico positivo o negativo para la presencia de calreticulina mutante según la presente invención, o bien sola o bien en combinación con terapias (por ejemplo anticuerpos) que seleccionan como diana específicamente la calreticulina mutante. Por consiguiente, terapias (por ejemplo anticuerpos) que seleccionan como diana CALR mutante, pueden ser útiles asimismo en el tratamiento si se usan como monoterapia o en combinación con otras terapias. Por ejemplo, puede usarse la terapia con interferón alfa para tratar pacientes con MPN (como pacientes con trombocitemia esencial) con diagnóstico positivo para la presencia de calreticulina mutante según la presente invención.

Si, por ejemplo, el paciente da positivo en la prueba para determinar la presencia de calreticulina mutante y (a) mutación/mutaciones de JAK2, se contempla el uso de inhibidor(es) de JAK (como ruxolitinib) en el presente documento. Dependiendo de parámetros clínicos, (por ejemplo la edad, el pronóstico del paciente) también pueden usarse terapias adicionales, como trasplante de células madre para tratar por ejemplo un paciente que da positivo en la prueba para determinar la presencia de calreticulina mutante.

Se describen y proporcionan inhibidores para su uso según la presente invención en el presente documento. También se prevé el uso de inhibidores que aún han de generarse o compuestos conocidos que van a someterse a prueba para determinar su actividad de inhibición, en el contexto de la presente invención.

Por tanto, la presente invención proporciona un método para evaluar la actividad de una molécula candidata que se sospecha que es un inhibidor de una calreticulina mutante tal como se define y proporciona en el presente documento, que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una célula, un tejido o animal no humano que comprende una calreticulina mutante con dicha molécula candidata;

(b) detectar una disminución en la actividad de dicha calreticulina mutante; y

(c) seleccionar una molécula candidata que disminuye la actividad de dicha calreticulina mutante;

en el que una disminución de la actividad es indicativa de la capacidad de la molécula seleccionada para ser útil en el tratamiento de malignidad mieloide tal como se define en el presente documento.

También una disminución en el nivel (de expresión) puede indicar inhibidores útiles.

La presente invención se refiere a un método para evaluar la actividad de una molécula candidata que se sospecha que es un inhibidor de una calreticulina mutante tal como se define y proporciona en el presente documento, que comprende las etapas de:

(b) detectar una disminución en el nivel (de expresión) de dicha calreticulina mutante; y

(c) seleccionar una molécula candidata que disminuye el nivel (de expresión) de dicha calreticulina mutante;

en el que una disminución del nivel (de expresión) es indicativa de la capacidad de la molécula seleccionada para ser útil en el tratamiento de malignidad mieloide tal como se define en el presente documento.

La calreticulina mutante puede ser cualquiera de los polipéptidos/las proteínas calreticulinas mutantes tal como se definieron anteriormente en el presente documento o cualquiera de los ácidos nucleicos (particularmente ARNm) tal como se definen en el presente documento, que codifican para los polipéptidos/las proteínas calreticulinas mutantes.

Las proteínas calreticulinas mutantes pueden comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos mostrados en 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140, 144, 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288, 294, 298, 302, 306, 310, 314, 318, 322, 326, 330, 334, 338, 342, 346, 350, 354, 358, 362, 366, 370, 374, 378, 382, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430 y 434, respectivamente. También se prevé el uso de fragmentos o derivados de estas proteínas tal como se definieron anteriormente en este contexto.

Los ácidos nucleicos de calreticulina mutante pueden comprender o consistir en los ácidos nucleicos mostrados en 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325, 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431,432 y 433, respectivamente.

Además, la presente invención proporciona el uso de (un) ácido(s) nucleico(s) (por ejemplo oligonucleótido(s) como cebador(es)/par(es)de cebadores o sonda(s) tal como se describen más adelante) o anticuerpo que puede detectar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento para los métodos de la presente divulgación, es decir para evaluar si un paciente padece una malignidad mieloide o es propenso a padecer una malignidad mieloide.

El/los oligonucleótido(s) puede(n) tener aproximadamente de 15 a 100 nucleótidos de longitud. Un experto en la técnica está en posición, basándose en su conocimiento general y las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, fácilmente para identificar y/o preparar (un) un oligo- o polinucleótido que puede detectar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento. Estos oligo- o polinucleótidos pueden usarse como sonda(s) o cebadores en los métodos proporcionados en el presente documento. A menudo los cebadores y/o las sondas tienen una longitud de 10 a 30 nucleótidos. Por consiguiente, la divulgación se refiere a (un) ácido(s) nucleico(s) (en particular (un) cebador(es) o (una) sonda(s)) que puede(n) detectar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento, en el que dicho ácido nucleico tiene menos de 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 ó 20 nucleótidos y tiene más de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 nucleótidos. Preferiblemente, el ácido nucleico tiene una longitud de 10 a 35 nucleótidos, más preferiblemente de 15 a 25 nucleótidos, de manera particularmente preferida una longitud de 18 a 21, por ejemplo 18, 19, 20 ó 21 nucleótidos. Este/estos ácido(s) nucleico(s) puede(n) hibridar en condiciones rigurosas con la hebra complementaria del ácido nucleico de calreticulina mutante tal como se definió y proporcionó anteriormente en el presente documento.

Un experto conocerá, por ejemplo, programas informáticos que pueden ser útiles para la identificación de sondas/cebadores correspondientes que van a usarse en el presente documento. Por ejemplo, la(s) secuencia(s) de ácido nucleico de secuencias codificantes a modo de ejemplo tal como se dan a conocer en el presente documento (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 29, 30, 31, 33, 34, 35, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 57, 58, 59, 61, 62, 63, 65, 66, 67, 69, 70, 71, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 81, 82, 83, 85, 86, 87, 89, 90, 91, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 101, 102, 103, 105, 106, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 121, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 131, 133, 134, 135, 137, 138, 139, 141, 142, 143, 145, 146, 147, 149, 150, 151, 153, 154, 155, 157, 158, 159, 161, 162, 163, 165, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 174, 175, 177, 178, 179, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 189, 190, 191, 193, 194, 195, 197, 198, 199, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 209, 210, 211, 213, 214, 215, 217, 218, 219, 221, 222, 223, 225, 226, 227, 229, 230, 231, 233, 234, 235, 237, 238, 239, 241, 242, 243, 245, 246, 247, 249, 250, 251, 253, 254, 255, 257, 258, 259, 261, 262, 263, 265, 266, 267, 269, 270, 271, 273, 274, 275, 277, 278, 279, 281, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 299, 300, 301, 303, 304, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 313, 315, 316, 317, 319, 320, 321, 323, 324, 325., 327, 328, 329, 331, 332, 333, 335, 336, 337, 339, 340, 341, 343, 344, 345, 347, 348, 349, 351, 352, 353, 355, 356, 357, 359, 360, 361, 363, 364, 365, 367, 368, 369, 371, 372, 373, 375, 376, 377, 379, 380, 381, 383, 384, 385, 387, 388, 389, 391, 392, 393, 395, 396, 397, 399, 400, 401, 403, 404, 405, 407, 408, 409, 411, 412, 413, 415, 416, 417, 419, 420, 421, 423, 424, 425, 427, 428, 429, 431, 432 y 433, respectivamente) pueden usarse en este contexto.

También las secuencias dadas a conocer en la siguiente tabla pueden usarse en este contexto:

Mutación de Secuencias de unión de ADNc en posiciones mutadas

CALR

Tipo 1 GAAGGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGAT

Tipo 2 GAGGAGGAGGCAGAGGACAATTCj TCGGAGGATGATGAGGACAAAG

Tipo 3 GGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 4 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGAGGCAGAGGACAAGG

Tipo 5 TGAAGGACAAACAGGACGAGGGGCAGAGGACAAGGAGGATGA

Tipo 6 AGGACAAACAGGACGAGGAGCGGAGGCAGAGGACAAGGAGGA

Tipo 7 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGATGATGAGGACAAAG

Tipo 3 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGAGGCAGAGGACAAGGAG

Tipo 9 CAAGAAACGCAAAGAGGAGGAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 10 AGGAGGAGGAGGCAGAGGACATGTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG

Tipo 11 AAGGACAAACAGGACGAGGACCAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 12 CAAACAGGACGAGGAGCAGAGGAGGAGGAGGAGGCAGAGGAC

Tipo 13 AACAGGACGAGGAGCAGAGGCAGAGGAGGAGGCAGAGGACAAG

Tipo 14 ACAGGACGAGGAGCAGAGGCTGAGGAGGAGGCAGAGGACAAG

Tipo 15 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGAGGGAGAGGACAAGGAGGATGATG

Tipo 15 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTCAGAGGAGGCAGAGGACAAGGAG

Tipo 17 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGAGGCAG7GGACAAGGAGGATGATGAGG Tipo 18 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGATGATGAGGACAAAGAT

Tipo 19 GGAGCAGAGGCTTAAGGAGGAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 20 GGCTTAAGGAGGAGGAAGAAGGGAGGAGGCAGAGGACAAGGA

Tipo 21 GGCTTAAGGAGGAGGAAGAAGCGTTTAAGAGGACAAGGAGGATGATGA

Tipo 22 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACAACGCAAAGAGGAGGAGGAGG

Tipo 23 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACTGCGTGAGGAGGAGGAGGCAGAGGAC

Tipo 24 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACAGGAGGCAGAGGACAAGGAGG

Tipo 25 TAAGGAGGAGGAAGAAGACAAAAGGCAGAGGACAAGGAGGATG

Tipo 26 TAAGGAGGAGGAAGAAGACAAAAACGCAAAGAGGAGGAGGAG

Tipo 27 AAGGAGGAGGAAGAAGACAAGTGTTTCGCAAAGAGGAGGAGGAGGCA

Tipo 28 GGAAGAAGACAAGAAACGCAAAAGGAGGATGATGAGGACAAA

Tipo 29 GAAGACAAGAAACGCAAAGAGCCTCCTCTTTGTCTAAGGAGGATGATGAGGACAAA Tipo 30 AGACAAGAAACGCAAAGAGGACCATCCTTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA Tipo 31 AGAGGAGGAGGAGGCAGAGGGCAATTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG

Tipo 32 GAGGAGGAGGAGGCAGAGGACTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA

Tipo 33 GAGGAGGAGGCAGAGGACAAATGTCGGAGGATGATGAGGACAAAG

Tipo 34 AGGAGGAGGAGGCAGAGGACACTTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA

Tipo 35 a g g a g g a g g a g g c a g a g g a c a t t t g t c g g a g g a t g a t g a g g a c a a a g a

Tipo 36 AGGAGGAGGCAGAGGACAAGTGTCGGAGGATGATGAGGACAAAGA______________

Las letras en negrita indican los límites de un acontecimiento de deleción; las letras subrayadas indican secuencias insertadas; las letras en negrita y cursiva indican variantes de un solo nucleótido

Oligonucleótidos (cebadores) a modo de ejemplo proporcionados en el presente documento y que van a usarse según la presente invención son

^Directo:ACAACTTCCTCATCACCAACG ^{(SEQ !D NO: 437)}

y/o

^inverso:GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ |D NO: 438)

^Directo:GGCAAGGCCCTGAGGTGT ^{(SEQ ID NO: 439)}

y/o

Inverso: G G C C T C A G T C C A G C C C T G (SEQ ID NO: 438)

En un aspecto, la presente divulgación se refiere una célula transgénica o un animal no humano transgénico que tienen el ácido nucleico tal como se describe y explica en el presente documento (o un vector que lo comprende), por ejemplo un ácido nucleico que comprende al menos uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento. Tal(es) célula(s) transgénica(s) o un(os) animal(es) no humano(s) transgénico(s) puede(n) usarse para examinar y/o validar un medicamento para el tratamiento de una malignidad mieloide.

El término “célula” tal como se usa en este contexto también puede comprender una pluralidad de células así como células comprendidas en un tejido. La célula que va a usarse en el método de examen o validación puede obtenerse de muestras de un animal no humano (transgénico) o ser humano que padece una malignidad mieloide. La célula o célula tumoral también puede obtenerse de muestras de paciente (por ejemplo biopsias), en particular una(s) biopsia(s) de un paciente/sujeto que padece una malignidad mieloide. Por consiguiente, la célula puede ser una célula humana. De nuevo, una célula de este tipo que va a usarse en los presentes métodos de examen o validación puede estar comprendida en un tejido o una muestra de tejido, como en una biopsia de muestra.

La célula o el animal no humano usado puede ser transgénico o no transgénico. “Transgénico” en este contexto significa particularmente que al menos una de las calreticulinas mutantes tal como se describen o definen en el presente documento se (sobre)expresa y/o que la actividad de al menos una de las calreticulinas mutantes está presente (o aumentada).

Una célula (transgénica) o un animal no humano (transgénico) preferido en el contexto de la invención padece una malignidad mieloide.

El término “animal no humano transgénico” o “célula transgénica” tal como se usa en el presente documento se refiere a una célula o un animal no humano, que no es un ser humano, que comprende material genético diferente del material genético de un animal/célula silvestre correspondiente. “Material genético” en este contexto puede ser cualquier clase de una molécula de ácido nucleico, o análogas de la misma, por ejemplo una molécula de ácido nucleico, o análogas de la misma tal como se definen en el presente documento. “Diferente” en este contexto significa material genético adicional o menor con respecto al genoma del animal/célula silvestre y/o material genético reorganizado, es decir material genético presente en un locus diferente del genoma con respecto al genoma del animal/célula silvestre. Una visión general de ejemplos de diferentes sistemas de expresión que van a usarse para generar célula/animal transgénico está contenida, por ejemplo, en Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, en Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) y en Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440).

En una realización preferida, la célula (transgénica) o el animal no humano (transgénico) es o se deriva de un mamífero. Ejemplos no limitativos del animal no humano (transgénico) o célula (transgénica) derivada se seleccionan del grupo que consiste en un ratón, una rata, un conejo y una cobaya.

La presente divulgación también se refiere a un vector que comprende la molécula de ácido nucleico que va a usarse según la presente invención.

Los expertos en biología molecular conocen muchos vectores adecuados, cuya elección dependerá de la función deseada e incluyen plásmidos, cósmidos, virus, bacteriófagos y otros vectores usados de manera convencional en ingeniería genética. Pueden usarse métodos que conocen bien los expertos en la técnica para construir diversos plásmidos y vectores; véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (loc cit.) y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989), (1994). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores que van a usarse según la invención pueden reconstituirse en liposomas para el suministro a células diana. Tal como se comenta con detalles adicionales más adelante, se usó un vector de clonación para aislar secuencias de ADN individuales. Pueden transferirse secuencias relevantes a vectores de expresión cuando se requiere la expresión de un polipéptido particular. Los vectores de clonación típicos incluyen pBluescript SK, pGEM, pUC9, pBR322 y pGBT9. Los vectores de expresión típicos incluyen pTRE, pCAL-n-EK, pESP-1, pOP13CAT.

Preferiblemente dicho vector comprende una secuencia de ácido nucleico que es una secuencia reguladora operativamente unida a dicha secuencia de ácido nucleico definida en el presente documento.

El término “secuencia reguladora” se refiere a secuencias de ADN, que son necesarias para realizar la expresión de secuencias codificantes a las que se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped. En procariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotor, sitio de unión al ribosoma y terminadores. En eucariotas, las secuencias de control incluyen generalmente promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores, transactivadores o factores de transcripción. El término “secuencia de control” pretende incluir, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes ventajosos adicionales.

El término “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que les permite funcionar de su manera pretendida. Una secuencia de control “operativamente unida” a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. En caso de que la secuencia de control sea un promotor, es obvio para un experto que se usa preferiblemente un ácido nucleico bicatenario.

Por tanto, el vector citado es preferiblemente un vector de expresión. Un “vector de expresión” es un constructo que puede usarse para transformar un huésped seleccionado y prevé la expresión de una secuencia codificante en el huésped seleccionado. Los vectores de expresión pueden ser por ejemplo vectores de clonación, vectores binarios o vectores de integración. Expresión comprende transcripción de la molécula de ácido nucleico preferiblemente en un ARNm traducible. Los expertos en la técnica conocen bien elementos reguladores que garantizan la expresión en células procariotas y/o eucariotas. En el caso de células eucariotas, comprenden normalmente promotores que garantizan la iniciación de la transcripción y opcionalmente señales de poli-A que garantizan la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor P^l, lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucariotas son el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, SV40, VSR (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intrón de globina en células de mamífero y otros animales.

Además de los elementos que son responsables de la iniciación de la transcripción, tales elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio de poli-A de SV40 o el sitio de poli-A de tk, en el sentido de 3' del polinucleótido. Además, dependiendo del sistema de expresión usado, pueden añadirse secuencias líder que pueden dirigir el polipéptido a un compartimento celular o secretarlo al medio, a la secuencia codificante de la secuencia de ácido nucleico citada y se conocen bien en la técnica; véanse también los ejemplos adjuntos. La(s) secuencia(s) líder se ensambla(n) en la fase apropiada con secuencias de traducción, iniciación y terminación, y preferiblemente, una secuencia líder que puede dirigir la secreción de la proteína traducida, o una parte de la misma, al espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar para una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que confiere las características deseadas, por ejemplo, estabilización o purificación simplificada de producto recombinante expresado; véase anteriormente. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg, pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADN1, pcADN3 (Invitrogene), pEF-DHFR, pEF-ADA o pEF-neo (Mack et al. PNAS (1995) 92, 7021-7025 y Raum et al. Cancer Immunol Immunother (2001) 50(3), 141-150) o pSPORT1 (GIBCO BRL).

Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas de promotores eucariotas en vectores que pueden transformar células huésped eucariotas en transfección, pero también pueden usarse secuencias de control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha incorporado el vector en el huésped apropiado, se mantiene el huésped en condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las secuencias de nucleótidos, y según se desee, puede seguir la recogida y purificación del polipéptido que va a usarse según la invención; véanse, por ejemplo, los ejemplos adjuntos.

Como sistemas de expresión alternativos, que pueden usarse para expresar una proteína que interacciona con el ciclo celar está un sistema de insecto. En un sistema de este tipo, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. La secuencia codificante de una molécula de ácido nucleico citada puede clonarse en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción satisfactoria de dicha secuencia codificante volverá el gen de la polihedrina inactivo y producirá virus recombinante que carece de proteína de la cubierta. Entonces se usan los virus recombinantes para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se expresa la proteína que va a usarse según la invención (Smith, J. Virol. 46 (1983), 584; Engelhard, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3224-3227).

Elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores transcripcionales así como traduccionales. Ventajosamente, los vectores descritos anteriormente que van a usarse según la invención comprenden un marcador seleccionable y/o puntuable.

Los genes de marcador seleccionable útiles para la selección de células transformadas y, por ejemplo, tejido vegetal y plantas los conocen bien los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, resistencia antimetabolitos como base de la selección para dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994), 143-149); npt, que confiere resistencia a los aminoglicósidos neomicina, kanamicina y paromicina (Herrera-Estrella, EMBO J. 2 (1983), 987-995) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Marsh, Gene 32 (1984), 481-485). Se han descrito genes seleccionables adicionales, concretamente trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047); manosa-6-fosfato isomerasa que permite que las células utilicen manosa (documento WO 94/20627) y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue, 1987, en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.) o desaminasa de Aspergillus terreus que confiere resistencia a blasticidina S (Tamura, Biosci. Biotechnol. Biochem. 59 (1995), 2336-2338).

Los expertos en la técnica también conocen marcadores puntuables útiles y están disponibles comercialmente. Ventajosamente, dicho marcador es un gen que codifica para luciferasa (Giacomin, P1. Sci. 116 (1996), 59-72; Scikantha, J. Bact. 178 (1996), 121), proteína fluorescente verde (Gerdes, FEBS Lett. 389 (1996), 44-47) o pglucuronidasa (Jefferson, EMBO J. 6 (1987), 3901-3907). Esta realización es particularmente útil para un examen sencillo y rápido de células, tejidos y organismos que contienen un vector citado.

Tal como se describió anteriormente, la molécula de ácido nucleico citada puede usarse sola o como parte de un vector para expresar el polipéptido de la invención en células, para purificación, por ejemplo, pero también para fines de terapia génica. Las moléculas de ácido nucleico o los vectores que contienen la(s) secuencia(s) de ADN que codifica(n) para uno cualquiera de los polipéptidos de la invención descritos anteriormente se introducen en las células que producen a su vez el polipéptido de interés. La terapia génica, que se basa en introducir genes terapéuticos en células mediante técnicas ex vivo o in vivo es una de las aplicaciones más importantes de la transferencia génica. Se describen vectores, métodos o sistemas de inserción génica adecuados para terapia génica in vitro o in vivo en la bibliografía y los conoce el experto en la técnica; véanse, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Onodera, Blood 91 (1998), 30-36; Verma, Gene Ther. 5 (1998), 692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther.

9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; documento WO 94/29469; documento WO 97/00957, documento US 5.580.859; documento US 5.589.466; o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Las moléculas de ácido nucleico y los vectores citados pueden diseñarse para la introducción directa o para la introducción mediante liposomas o vectores virales (por ejemplo, adenovirales, retrovirales) en la célula. Preferiblemente, dicha célula es una célula de línea germinal, célula embrionaria u óvulo o derivada de los mismos, lo más preferiblemente dicha célula es una célula madre. Un ejemplo de una célula madre embrionaria puede ser, entre otros, una célula madre tal como se describe en Nagy, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424-8428.

La invención también prevé un huésped transformado o transfectado con un vector de la invención. Dicho huésped puede producirse introduciendo el vector de la invención descrito anteriormente o la molécula de ácido nucleico de la invención descrita anteriormente en el huésped. La presencia de al menos un vector o al menos una molécula de ácido nucleico en el huésped puede mediar en la expresión de un gen que codifica para los constructos de anticuerpo de cadena sencilla descritos anteriormente.

La molécula de ácido nucleico o el vector de la invención descritos, que se introduce en el huésped puede o bien integrarse en el genoma del huésped o bien puede mantenerse de manera extracromosómica.

El huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota.

El término “procariota” pretende incluir todas las bacterias, que pueden transformarse o transfectarse con moléculas de ADN o ARN para la expresión de una proteína de la invención.

Los huéspedes procariotas pueden incluir bacterias Gram-negativas así como Gram-positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. El término “eucariota” pretende incluir células de levadura, plantas superiores, insectos y preferiblemente de mamíferos. Dependiendo del huésped empleado en un procedimiento de producción recombinante, la proteína codificada por el polinucleótido de la presente invención puede estar glicosilada o puede estar no glicosilada. Se prefiere especialmente el uso de un plásmido o un virus que contiene la secuencia codificante del polipéptido de la invención y fusionado genéticamente al mismo una etiqueta FLAG N-terminal y/o una cola de His C-terminal. Preferiblemente, la longitud de dicha etiqueta FLAG es de aproximadamente 4 a 8 aminoácidos, lo más preferiblemente 8 aminoácidos. Puede usarse un polinucleótido descrito anteriormente para transformar o transfectar el huésped usando cualquiera de las técnicas conocidas comúnmente por los expertos habituales en la técnica. Además, se conocen bien en la técnica métodos para preparar genes fusionados, operativamente unidos y expresarlos en, por ejemplo, células de mamífero y bacterias (Sambrook, loc cit.).

Preferiblemente, dicho huésped es una bacteria o una célula de insecto, fúngica, vegetal o animal.

Se prevé particularmente que el huésped citado puede ser una célula de mamífero. Las células huésped particularmente preferidas comprenden células CHO, células COS, líneas celulares de mieloma como SP2/0 o n S/0. Tal como se ilustra en los ejemplos adjuntos, se prefieren particularmente células CHO como huéspedes.

Más preferiblemente, dicha célula huésped es una célula humana o línea celular humana, por ejemplo Per.c6 (Kroos, Biotechnol. Prog., 2003, 19:163-168).

En una realización adicional, la presente invención se refiere por tanto a un procedimiento para la producción de un polipéptido de la invención, comprendiendo dicho procedimiento cultivar un huésped de la invención en condiciones que permitan la expresión del polipéptido de la invención y recuperar el polipéptido producido del cultivo.

Pueden hacerse crecer los huéspedes transformados en fermentadores y cultivarse según técnicas conocidas en la técnica para lograr un crecimiento celular óptimo. El polipéptido de la invención puede aislarse entonces del medio de crecimiento, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de, por ejemplo, los polipéptidos de la invención expresados de manera microbiana pueden ser mediante cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos, por ejemplo, contra una etiqueta del polipéptido de la invención o tal como se describe en los ejemplos adjuntos.

Se sabe en la técnica que las condiciones para el cultivo de un huésped, que permiten la expresión dependen del sistema de huésped y el sistema/vector de expresión usado en tal procedimiento. Los parámetros que han de modificarse para lograr condiciones que permitan la expresión de un polipéptido recombinante se conocen en la técnica. Por tanto, pueden determinarse condiciones adecuadas por el experto en la técnica en ausencia de una entrada inventiva adicional.

Una vez expresado, el polipéptido de la invención puede purificarse según procedimientos convencionales de la técnica, incluyendo precipitación con sulfato de amonio, columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares; véase, Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N.Y. (1982). Se prefieren polipéptidos sustancialmente puros de una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95%, y de una homogeneidad del 98 al 99% o más son los más preferidos, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta la homogeneidad según se desee, el polipéptido de la invención puede usarse entonces de manera terapéutica (incluyendo de manera extracorpórea) o en el desarrollo y la realización de procedimientos de ensayo. Además, se describen ejemplos para métodos para la recuperación del polipéptido de la invención de un cultivo con detalle en los ejemplos adjuntos.

Además, la presente divulgación proporciona un kit útil para llevar a cabo los métodos de la divulgación, comprendiendo el kit un ácido nucleico o un anticuerpo que puede detectar la presencia de a uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento. También se prevé en el presente documento el uso del kit descrito en el presente documento para llevar a cabo los métodos proporcionados en el presente documento.

Por ejemplo, dicho kit puede comprender (un) compuesto(s) requerido(s) para determinar específicamente la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento. Además, la presente divulgación también se refiere al uso de (un) compuesto(s) requerido(s) para determinar específicamente la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento para la preparación de un kit para llevar a cabo los métodos de esta divulgación. Basándose en las enseñanzas de esta divulgación, el experto sabe qué compuesto(s) se requiere(n) para determinar específicamente la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento. Por ejemplo, tal(es) compuesto(s) puede(n) ser (una) “molécula(s) de unión”, como, por ejemplo, (un) anticuerpo. Particularmente, tal(es) compuesto(s) puede(n) ser (una) sonda(s) (nucleotídica(s)), (un) (par(es) de) cebador(es), (un) anticuerpo(s) y/o (un) aptámero(s) específico(s) para al menos un alelo mutante del gen de calreticulina o para un producto génico de al menos un alelo mutante del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento. El kit (que va a prepararse en el contexto) de esta divulgación puede ser un kit de diagnóstico. Tal como se mencionó anteriormente, la determinación de la presencia de uno (o más) alelo mutante del gen de calreticulina o de un producto génico del mismo tal como se describe en el presente documento puede realizarse como análisis independiente. Alternativamente, este análisis puede estar seguido o precedido por el análisis de otros marcadores para malignidades mieloides, tales como mutaciones de JAK2 y MPL. También se prevé la determinación simultánea de tales marcadores, como la prueba simultánea para determinar mutación/mutaciones de JAK2 y calreticulina mutante (y, opcionalmente, marcadores adicionales), o la prueba simultánea de mutación/mutaciones de JAK2, calreticulina mutante y mutación/mutaciones de MPL (y, opcionalmente, marcadores adicionales). Según (un) kit(s) (o usos de tales kits) que se prevé(n) en el presente documento que proporciona(n) medios para tales pruebas subsiguientes o simultáneas. Por ejemplo, dicho kit puede comprender, además de (un) compuesto(s) requerido(s) para determinar específicamente la presencia (o cantidad) de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina (o de un producto génico del mismo), (un) compuesto(s) requerido(s) para determinar específicamente la presencia como mutaciones de JAK2 y/o MPL (y opcionalmente marcadores adicionales), por ejemplo (un) anticuerpo(s), (una) sonda(s) (nucleotídica(s)), (un) (par(es) de) cebador(es), (un) anticuerpo(s) y/o (un) aptámero(s) específico(s) que permite(n) la detección específica de mutaciones de JAK2 y MPL (y opcionalmente marcadores adicionales).

El kit (que va a prepararse en el contexto) de esta divulgación puede comprender además o estar previsto de (un) manual(es) de instrucciones. Por ejemplo, dicho(s) manual(es) de instrucciones puede(n) guiar al experto a (cómo) determinar la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento y/o a (cómo) diagnosticar una malignidad mieloide. Dicho(s) manual(es) de instrucciones puede(n) comprender orientación sobre cómo usar o aplicar los métodos o usos proporcionados en el presente documento. El kit (que va a prepararse en el contexto) de esta divulgación puede comprender además sustancias/productos químicos y/o equipo adecuado/requerido para llevar a cabo los métodos y usos de esta invención. Por ejemplo, tales sustancias/productos químicos y/o equipo son disolventes, diluyentes y/o tampones para estabilizar y/o almacenar (un) compuesto(s) requerido(s) para determinar específicamente la presencia de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina o la presencia o cantidad de un producto génico de uno o más alelos mutantes del gen de calreticulina tal como se definen en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “que comprende” y “que incluye” o variantes gramaticales de los mismos han de tomarse como que especifican las características, números enteros, etapas o componentes establecidos pero no excluyen la adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes adicionales o grupos de los mismos. Este término engloba los términos “que consiste en” y “que consiste esencialmente en”. Por tanto, los términos “que comprende”/“que incluye”/“que tiene” significan que cualquier componente adicional (o asimismo características, números enteros, etapas y similares) pueden estar presentes.

El término “que consiste en” significa que ningún componente adicional (o asimismo características, números enteros, etapas y similares) puede estar presente.

El término “que consiste esencialmente en” o variantes gramaticales del mismo cuando se usan en el presente documento han de tomarse como que especifican las características, números enteros, etapas o componentes establecidos pero no excluyen la adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes adicionales o grupos de los mismos pero sólo si las características, números enteros, etapas, componentes adicionales o grupos de los mismos no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el dispositivo o método reivindicado.

Por tanto, el término “que consiste esencialmente en” significa que componentes adicionales específicos (o asimismo características, números enteros, etapas y similares) pueden estar presentes, concretamente los que no afectan materialmente a las características esenciales de la composición, el dispositivo o método. En otras palabras, el término “que consiste esencialmente en” (que puede usarse de manera intercambiable en el presente documento con el término “que comprende sustancialmente”), permite la presencia de otros componentes en la composición, el dispositivo o método además de los componentes obligatorios (o asimismo características, números enteros, etapas y similares), siempre que las características del dispositivo o método son se vean afectados materialmente por la presencia de otros componentes.

El término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada incluyendo pero sin limitarse a aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos o bien conocidos por, o bien fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las técnicas químicas, biológicas y biofísicas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aislado” se refiere a una composición que se ha retirado de su ubicación in vivo. Preferiblemente, las composiciones o los compuestos aislados de la presente invención están sustancialmente libres de otras sustancias (por ejemplo, otras proteínas u otros compuestos) que están presentes en su ubicación in vivo (es decir composiciones o compuestos purificados o semipurificados.)

Tal como se usa en el presente documento el término “aproximadamente” se refiere a 10%.

La presente invención se describe además con referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitativos.

Las figuras muestran:

Figura 1. Validación de mutaciones del gen CALR en los pacientes 191 y 296 mediante secuenciación de Sanger

Se representan perfiles de secuenciación de Sanger. Los recuadros alrededor de las letras de la secuencia marcan las bases que se pierden debido a los acontecimientos de deleción. La figura 1 muestra SEQ ID NO: 1324 a 1327.

Figura 2. Frecuencia de mutaciones de CALR en malignidades mieloides

A: Distribución de mutaciones de JAK2, MPL y CALR en las entre entidades de enfermedad MPN clásicas. B: La frecuencia de pacientes con CALR mutante en diferentes malignidades mieloides, se indica mediante las barras oscuras. N, números totales de pacientes analizados para una entidad de enfermedad específica. C: Distribución de mutaciones de JAK2, MPL, CALR y SF3B1 en 24 pacientes con anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociados con trombocitosis marcada. PV, policitemia vera; ET, trombocitemia esencial; PMF mielofibrosis primaria; dnAML, AML de novo: CML, leucemia mieloide crónica; MDS, síndrome mielodisplásico; CMML, leucemia mielomonocítica crónica; RARS-T, anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociada con trombocitosis marcada.

Figura 3. Patrón de mutación de mutaciones de CALR en pacientes con MPN.

La barra negra ancha representa el exón 9 de CALR, la barra estrecha la UTR en 3' del gen, la línea delgada regiones intrónicas e intergénicas.

A: Se indican la secuencia de ADN en el comienzo y el final del exón 9. Por debajo de la secuencia de ADNc están las secuencias de aminoácidos derivadas de los tres marcos de lectura alternativos. B: Los tres marcos de lectura dan como resultado diferentes composiciones peptídicas, especialmente con respecto a la carga de los aminoácidos. C: Resumen de todas las mutaciones detectadas en pacientes con MPN y su posición dentro del exón 9 de CALR. Las barras indican acontecimientos de deleción, las letras las secuencias insertadas. Se representan las inserciones y deleciones individuales por encima del esquema del exón 9, los acontecimientos de inserción/deleción combinados por debajo. D: La composición peptídica específica de CALR silvestre y de los dos tipos de mutaciones detectados con la mayor frecuencia. B, D: Cada recuadro representa un aminoácido. Los recuadros negros con un signo “-” son aminoácidos cargados negativamente, los recuadros con un signo “+”son aminoácidos cargados positivamente. Los recuadros tachados en cruz representan codones de terminación. E: Frecuencias relativas de los 36 tipos de mutación observados en CALR. La figura 3 muestra SEQ ID NO: 1328 a 1339.

Figura 4. Asociación de mutaciones de CALR con disomías uniparentales y jerarquías clonales en pacientes con múltiples mutaciones somáticas

Panel A: Se muestran los datos de matriz Affymetrix SNP 6.0 para tres muestras que tenían una carga de más del 50% de mutaciones de CALR. Cada punto representa un único SNP. El eje x muestra la posición genómica, el eje y representa el estado alélico del SNP. (Estado heterocigoto = diferencia alélica de 0). Los datos de matriz muestran disomía uniparental 19p de diferentes tamaños en las tres muestras. Los recuadros indican la región genómica de las disomías uniparentales. A la derecha de cada representación gráfica de diferencia alélica, se muestran los resultados del análisis de fragmentos del exón 9 de CALR para la misma muestra. En cada caso, la carga del alelo mutante es mayor que la carga del alelo silvestre. Panel B: Jerarquías clonales derivadas del análisis de colonias de progenitores hematopoyéticos. El paciente H_0191 (parte superior) albergaba mutaciones somáticas en un total de 4 genes. Tal como se muestra en el diagrama de barras, el 51% de todas las colonias tenían mutaciones en CALR, GAB2 y METTL11B. La otra mitad de las colonias (48%) tenían mutaciones en los cuatro genes indicando que la mutación en PHF16 se adquirió más tarde y dio lugar a un subclón. Adicionalmente, una colonia albergaba una deleción de un par de bases en CALR, diferente de la deleción de 52 pares de bases que se observó en la muestra de granulocitos y todas las demás colonias de este paciente. Como esta colonia no tenía ninguna de las otras mutaciones observadas en el paciente, representa un clon independiente aunque esta conclusión se basa sólo en una única colonia. El paciente H_0296 (parte inferior) tenía mutaciones somáticas en CALR, PIK3R1 y C10ORF71. Todas las colonias analizadas para este paciente tenían las tres mutaciones. Una colonia mostró una deleción de 18 pares de bases en CALR además de la deleción de 1 par de bases observada en este paciente. Ambas mutaciones eran en el mismo alelo.

Figura 5. Significación clínica de mutaciones de CALR

Estimaciones de desenlace en pacientes con trombocitemia esencial o mielofibrosis primaria estratificados según su mutación somática. Panel A: Análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia global en pacientes con mielofibrosis primaria. Se compararon subgrupos usando la prueba de rangos logarítmicos. Los pacientes con mielofibrosis que portaban una mutación somática de CALR tenían una mejor supervivencia global que aquellos con JAK2-V617F [mediana de valores de 21,4 años (IC del 95%, 17,1-22,9) frente a 11,0 años (IC del 95%, 7,8-14,4), respectivamente; P<0,001] o mutación de MPL [mediana de valores de 8,2 años (IC del 95%, 2,0-sin alcanzar); P<0,001], mientras que no se observó ninguna diferencia entre los últimos 2 subgrupos. Panel B: Análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia global en pacientes con trombocitemia esencial. Se compararon subgrupos usando la prueba de rangos logarítmicos. No se alcanzó la mediana de valores para la supervivencia global en cualquier subgrupo. Los pacientes con mutación de CALR tenían una mejor supervivencia global que aquellos que portaban JAK2-V617F. La supervivencia global a los 10 años era del 96,9% (IC del 95%, 91,7-98,8%) en los primeros frente al 91,1% (IC del 95%, 87,1-93,9%) en los últimos (P=0,043). Panel C: Incidencia acumulativa de trombosis en pacientes con trombocitemia esencial. La muerte en ausencia del acontecimiento de interés se consideró como acontecimiento competitivo, y se compararon subgrupos con la prueba de Pepe y Mori. Los pacientes que portaban una mutación del exón 9 de CALR tenían una menor incidencia acumulativa de trombosis en comparación con aquellos que portaban JAK2-V617F: la incidencia acumulativa a los 10 años fue del 11,0% (IC del 95%, 6,3-17,1%) en los primeros frente al 21,0% (IC del 95%, 16,6-25,7%) en los últimos (P=0,003).

Figura 6. Análisis funcionales de mutación de tipo 1 de CALR

Panel A: Se evaluó la viabilidad celular de células Ba/F3 que expresaban un vector vacío (GFP), CALR silvestre (CALR wt-GFP) o CALR mutante (CALR del52-GFP) después de 72 horas en presencia de una concentración creciente de interleucina-3. RLU, unidades de luminiscencia relativas. Las barras de error representan el error estándar de la media. Panel B: Se determinó la proliferación celular de células Ba/F3 que expresaban un vector vacío (GFP), CALR silvestre (CALR wt-GFP) o CALR mutante (CALR del52-GFP), en ausencia de interleucina-3 durante 7 días. Las barras de error representan el error estándar de la media. Panel C: muestra la activación de STAT5 en respuesta a interleucina-3. Se sometieron células Ba/F3 que expresaban el vector vacío (GFP), la CALR silvestre (wt) o la CALR mutante (del52) a privación durante 4 horas en medio libre de suero sin interleucina-3 y entonces se estimularon durante 20 minutos con 100 pg/ml y 1 ng/ml de interleucina-3, tal como se indica. Se realizó inmunotransferencia de tipo Western con los lisados celulares con anticuerpos frente a pYSTAT5, STAT5 y CALR. Se usó un anticuerpo contra GAPDH como control de carga. Panel D: Se realizó inmunofluorescencia frente a CALR (tercer panel) y un marcador específico de retículo endoplasmático (calnexina, segundo panel), en HEK293T transfectadas con los constructos respectivos. La CALR silvestre se localiza conjuntamente con calnexina, en el retículo endoplasmático (último panel). Sin embargo, la CALR mutante no está restringida dentro del retículo endoplasmático. Se tiñe el núcleo con el colorante DAPI (primer panel).

Figura 7. La sensibilidad de células Ba/F3 a SAR302503.

Se analizaron células Ba/F3 que expresaban el vector vacío (GFP), CALR silvestre (CALR wt-GFP) o CALR mutante (CALR del52-GFP) definiendo la viabilidad celular después de 48 horas en presencia de SAR302503 decreciente. Para la viabilidad relativa, se normalizaron las unidades de luminiscencia relativas con respecto al control de DMSO. Las barras de error representan el error estándar de la media.

Figura 8. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western examinando con sonda los sueros de los cuatro ratones inmunizados, frente a lisados de células HEK293T que expresaban el mutante de CALR del52. La figura muestra que los sueros de los cuatro ratones inmunizados no tenían ningún anticuerpo contra el péptido de calreticulina mutante antes de la inmunización - p (carriles antes de la inmunización). Generaron un anticuerpo específico después de 2 dosis de refuerzo.

Figura 9. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western examinando con sonda los sueros de los cuatro ratones inmunizados, frente a lisados de células HEK293T que expresaban el Aexón9 de CALR. La figura muestra que los sueros de los cuatro ratones inmunizados no tenían ningún anticuerpo contra el Aexón9 de CALR tanto en los sueros antes de la inmunización (p) como tras las dosis de refuerzo.

Figura 10. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de tipo Western examinando con sonda los sueros de los cuatro ratones inmunizados, frente a lisados de células HEK293T que expresaban el mutante de CALR del52. La figura muestra que los sueros de los cuatro ratones inmunizados tenían más anticuerpo específico contra calreticulina mutante después de la tercera dosis de refuerzo.

Los ejemplos ilustran la invención.

Ejemplo 1: Mutaciones somáticas de calreticulina en mielofibrosis primaria y trombocitemia esencial

Material y métodos

Toma de muestras de pacientes

Se estudiaron pacientes con neoplasias mieloproliferativas negativas para el cromosoma Philadelphia con seguimiento en la Universidad Médica de Viena, Austria, y el Departamento de Hematología y Oncología, Fondazione IRCCS Policlinico San Matteo, Pavía, Italia. Las investigaciones se han aprobado por el comité ético de ambas instituciones, y todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado por escrito. El diagnóstico de policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria se realizó según los criterios de 2008 de la Organización Mundial de la Salud (Sverdlow et al, 2008).

Criterios de diagnóstico

El diagnóstico de policitemia vera, trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria se realizó según los criterios en uso en el momento de la primera observación, tal como se notificó previamente (Passamonti et al. 2004). En 2002, se adoptaron los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Vardiman et al, 2002) y en 2008 se implementó su revisión (Swerdlow et al, 2008). Se realizaron los análisis de las mutaciones de JAK2 y MPL tal como se describió previamente (Passamonti et al, 2010a; Rumi et al, 2013; Passamonti et al, 2011) en Pavía y tal como se explica resumidamente a continuación en Viena. Se evaluó la fibrosis de la médula ósea de manera semicuantitativa siguiendo las directrices de consenso europeas (Thiele et al, 2005). Se definieron los acontecimientos trombóticos tal como se describió en detalle previamente (Marchioli et al, 2013). Se trataron los pacientes según las recomendaciones que se han formalizado por la Red Europea de Leucemia en 2011 (Barbui et al, 2011).

Evaluación de las mutaciones JAK2-V617F, en el exón 12 de JAK2 y MPL-W515L en Viena

Se usó un ensayo de PCR específica de alelos para detectar la mutación JAK2-V617F. Se preparó una mezcla de cebadores que consistía en 4 pM de un cebador directo común (gtttcttAGTGCATCTTTATTATGGCAGA(SEQ ID NO: 1340) ), 2 pM de un cebador inverso específico para el alelo silvestre (TTACTCTCGTCTCCACAGAC(SEQ ID NO: 1341) ) y 2 pM de un cebador inverso específico para el alelo mutante (aaaTTACTCTCGTCTCCACAGAA(SEQ ID NO: 1342) ). Se marcaron de manera fluorescente los dos cebadores inversos con 6-carboxifluoresceína (6-FAM) en el extremo 5'. Se estableció una reacción PCR usando la ADN polimerasa AmpliTaq Gold con tampón Gold y MgCh (Applied Biosystems) que contenía 1,1 pl del tampón 10x PCR GOLD, 0,66 pl de MgCh 25 mM, 0,44 pl de dNTP 2,5 mM, 1,4 pl de la mezcla de cebadores, 0,05 pl de la polimerasa AmpliTaq Gold (5 U/pl), 6,36 pl de H2O y 1 pl de ADN genómico (10 ng/pl). Se realizó la PCR tal como sigue: 95°C durante 5 min - 36 x (94°C durante 30 s, 62,2°C durante 30 s, 72°C durante 30 s) - 72°C durante 15 min - mantenimiento a 8°C. Se determinó el tamaño de los productos de PCR en un analizador genético 3130xl (Applied Biosystems) y se analizaron los datos usando el software Gene Mapper (Applied Biosystems).

El ensayo usado para detectar mutaciones en el exón 12 de JAK2 se notificó anteriormente (Li et al, 2008)

Para las pruebas para detectar MPL-W515L, se usó el siguiente ensayo de PCR específica de alelos. Se preparó una mezcla de cebadores que consistía en 8 pM de un cebador directo común ( GTTTCTTCCGAAGTCTGACCCTTTTTG(SEQ ID NO: 1343)), 4 pM de un cebador inverso específico para el alelo silvestre (G TAG TG TG CAG G AAACTG CC(SEQ ID NO: 1344)) y 4 pM de un cebador inverso específico para el alelo mutante (AAAGTAGTGTGCAGGAAACTGCA(SEQ ID NO: 1345)). Se marcaron de manera fluorescente los dos cebadores inversos con 6-carboxifluoresceína (6-FAM) en el extremo 5'. Se estableció una reacción PCR tal como se describió anteriormente para la mutación JAK2-V617F. Se realizó la PCR tal como sigue: 94°C durante 10 min - 30 x (94°C durante 30 s, 62,2°C durante 30 s, 72°C durante 30 s) - 72°C durante 15 min - mantenimiento a 8°C. Se determinó el tamaño de los productos de PCR en un analizador genético 3130xl (Applied Biosystems) y se analizaron los datos usando el software Gene Mapper (Applied Biosystems).

Secuenciación de exoma completo

Se aisló ADN genómico de granulocitos de sangre periférica (tejido tumoral) y linfocitos T CD3+ (tejido de control) según procedimientos convencionales. Se generaron bibliotecas de ADN usando el kit de preparación de muestras de ADN NEB Next (conjunto de reactivos) (New England Biolabs, Ipswich, MA) y se realizó el enriquecimiento de exoma completo usando el kit Sure Select Human All Exon (Agilent, Santa Clara, CA) según las instrucciones del fabricante. Se secuenciaron las bibliotecas en un sistema HiSeq2000 de Illumina (Illumina, San Diego, CA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Véase la tabla 1 complementaria para detalles de los parámetros de secuenciación de exoma completo.

Tabla complementaria 1

ID de muestra Fuente de Parámetros Lecturas Cobertura Bases exónicas cubiertas al menos ADNg de totales media 2X 10X 20X 30X secuenciación

H 001OB GD granulocitos 52 pb PE. 51 440.507.278 230 93,92% 82.95% 80,45% 78,86% pb PE

H 001OB TD linfocitos T 70 pb SR. 75 305.708.053 187 95,67% 87.27% 82,73% 79,58% pb PE

H 0191B GD granulocitos 70 pb SR. 51 329.139.581 163 95,93% 88.71% 84,26% 81,04% pb PE

H 0191A TD linfocitos T 70 pb SR. 75 300420.257 173 95,55% 88.26% 84,01% 80.81% pb PE

H 0202B GD granulocitos 70 pb SR. 51 286.094.080 149 95,41% 87.81% 83,32% 79.84% pb PE

H 0202B TD linfocitos T 70 pb SR. 75 262.563.166 160 95,25% 87.80% 83,44% 80,01% pb PE

H 0296C GD granulocitos 70 pb SR. 51 279.769.005 138 95,17% 87.45% 82,68% 78,78% pb PE

H 0296C TD linfocitos T 70 pb SR. 75 266487695 158 95.34% 87.79% 83,36% 79.83% pb PE

H 0333B GD granulocitos 70 pb SR. 51 293.076.867 156 95,65% 88.23% 83,79% 80,41% pb PE

H 0333B TD linfocitos T 70 pb SR. 75 260.476.597 155 94,99% 87.47% 83,03% 79,50% pb PE

H 0386B GD granulocitos 70 pb SR. 51 285.286.604 148 95,58% 88.00% 83,48% 79,96% pb PE

H 0386B TD linfocitos T 70 pb SR. 75 266.364.404 162 95,18% 87.6.9% 83,39% 79,98%

pb PE

mínimo 260.476.597 138 93,92% 82.95% 80,45% 78,78% máximo 440.507.278 230 95,93% 88.71% 84,26% 81,04% promedio 297.991.132 165 95,30% 87.45% 83,16% 79,88% ADNg, ADN genómico; pb, pares de bases; PE, extremo apareado; SR, lectura única

Tabla complementaria 2: Cebadores usados para analizar el estado de mutación de CALR

Exón de

CALR

seleccionado

Aplicación_______ como diana Secuencia de cebador directo Secuencia de cebador inverso Secuenciación de 9

Sanger / ACAACTT CCT CAT CACCAACG GGCCTCAGTCCAGCCCTG (SEQ ID subclonación de (SEQ ID NO: 437) NO: 438)

productos de GGCAAGGCCCTGAGGTGT (SEQ GGCCT CAGT CCAGCCCT G(SEQ ID PCR ID NO: 439) NO: 438)

Análisis de 9 GT CAGGTTGGTTT GAGAGGC GCTAACCCTAACTCCCGCC (SEQ fragmentos de

PCR (SEQ ID NO: 1310) ID NO: 1311)

Secuenciación de 1 GGAT CT CCTTT CCT GT CCCC(SEQ CCACCT GT CCT CCT CCAAG (SEQ Sanger ID NO: 1312) ID NO: 1313)

Secuenciación de 2 GAGGACAGGTGGAGGAAGTG AAATT GTT GCT GGGACTTATT C Sanger (SEO ID NO: 1314) (SEQ ID NO: 1315) Secuenciación de 3

Sanger CAGACCCGAGTT GAAGAACC AGAAGGAAGAAGGT GAGCGG Secuenciación de 4 (SEQ ID NO: 1316) (SEQ ID NO: 1317)

Sanger CT GAT CAACAAGGACAT CCG (SEQ CTCGGGCTTCTTAGCATCAG (SEQ Secuenciación de 5 ID NO: 1318) ID NO: 1319)

Sanger AAGCCT GAGGTT GGT GTTT G (SEQ CTCACCTGGGGTGCCTACC (SEQ Secuenciación de 6-7 ID NO: 1320) ID NO: 1321)

Sanger

Secuenciación de 8 GTGTCAGCGGTGTTCCTTG (SEQ TTAAGCCTCTGCTCCTCGTC (SEO Sanger ID NO: 1322) ID NO: 1323)

Análisis de la secuenciación de exoma completo

Se alinearon las lecturas de secuenciación frente al genoma humano de referencia (hg18) usando BWA v0.5.9 (Li y Durbin, 2009). Se usó el conjunto de herramientas para análisis del genoma (GATK) v1.5 (McKenna et al, 2010) para procesar posteriormente las alineaciones según las directrices de mejores prácticas v3 de GATK. Se calcularon los datos de cobertura presentados en la tabla complementaria 1 a partir de los archivos de alineaciones procesadas posteriormente usando el programa de ejecución CalculateHsMetrics.jar de Picard (http://picard.sourceforge.net). Se analizaron adicionalmente los archivos de alineaciones procesadas posteriormente mediante dos interlocutores variantes:

1. Se usó Unified Genotyper de GATK (DePristo et al, 2011) para designar variantes de un solo nucleótido e inserciones/ deleciones pequeñas de las muestras de ADN de granulocitos. Se procesaron adicionalmente las listas de variantes preliminares usando Variant Quality Score Recalibrator (GATK) para generar listas de variantes recalibradas. Se anotaron las variantes usando a Nn OVAR versión del 25-05-2012 (Wang et al, 2010). Se filtraron variantes que se encontraron en exones codificantes y que afectan a la composición de aminoácidos de la proteína, así como variantes en sitios de corte y empalme.

2. Se usó la herramienta Varscan 2.3.2 (Koboldt et al, 2012) para designar variantes somáticas comparando alineaciones procesadas posteriormente de la muestra de ADN de granulocitos con las alineaciones de la muestra de linfocitos T del mismo paciente. Se usó Varscan según las instrucciones del programador. Samtools 0.1.18 (Li et al, 2009) generó los archivos mpileup necesarios como entrada para Varscan. Se anotaron las listas de coincidencias de Varscan mediante ANNOVAr y se filtraron tal como se describió anteriormente. La intersección de las listas de variantes recuperadas de los dos cauces de designación de variantes, tal como sigue, generó listas de variantes finales. GATK proporciona una puntuación para la probabilidad de que una variante sea una variante verdadera, que es la puntuación de VQSLOD. Varscan proporciona un valor de p para que una variante sea somática. Los requisitos básicos para la designación de una variante de un solo nucleótido (SNV) final fueron que las variantes tenían que designarse por ambos cauces de designación de variantes y que la variante en la muestra de granulocitos no se clasificase como de “baja calidad” por GATK. A partir de todas las SNV que se encuentran dentro de esta categoría, se designaron todas las que tenían una puntuación de VQSLOD > 0 y un valor de p somático de < 0,05. También se designaron variantes con un VQSLOD [-2;0] pero requerían un valor de p somático de <0,01 para ellas. La designación de variantes de inserción / deleción es más compleja que la designación de SNV. Con el fin de no perder variantes verdaderas, tan sólo se requiere que se encuentre una inserción / deleción por ambos cauces. No se requirieron valores de p o medidas de calidad adicionales para designar estas variantes.

Secuenciación de Sanger

Se designaron cebadores para la secuenciación de Sanger usando la herramienta PrimerZ (http://ncbi36.genepipe.ncgm.sinica.edu.tw/primerz/beginDesign.do) o la herramienta Primer3 (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/). En la tabla complementaria 2 se enumeran secuencias de cebador.

Se realizaron las PCR usando la mezcla maestra AmpliTaq Gold 360 (Applied Biosystems / Life Technologies, Paisley, R.U.).

Se usó un programa de toma de contacto para la PCR: 95°C, 5 min - 10x (94°C, 30 s - 67°C, 30 s [-1°C por ciclo] -72°C, 30 s) - 29x (94°C, 30 s - 57°C, 30 s - 72°C, 30 s) - 72°C, 10 min, 10°C, mantenimiento. Para la secuenciación de Sanger, se usó el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) con el siguiente programa: 96°C, 1 min - 25x (96°C, 10 s - 50°C, 5 s - 60°C, 4 min) - mantenimiento a 10°C. Se leyeron los perfiles de secuenciación en un analizador genómico 3130xl (Genetic Analyzer) ((Applied Biosystems). Se realizó el análisis de secuencias usando el software Sequencher 4.9 (Gene Codes, Ann Arbor, MI)

Análisis de fragmentos de PCR para la detección de mutaciones en el exón 9 de CALR

Se diseñaron cebadores para el exón 9 de CALR y se marcó con 6-FAM el cebador directo (tabla complementaria 2). Se realizó la PCR tal como sigue: 95°C, 10 min - 10x (94°C, 15 s - 55°C, 15 s - 72°C, 30 s) - 20x (89°C, 15 s - 55°C, 15 s - 72°C, 30 s) - 72°C, 20 min - 10°C, mantenimiento. Se diluyeron los productos de PCR 1:25 en agua y se determinó su tamaño en un analizador genómico 3130xl (Genetic Analyzer) (Applied Biosystems). Se analizaron los resultados usando el software Gene Mapper versión 4.0 (Applied Biosystems).

Subclonación de productos de PCR

Se subclonaron los productos de PCR con el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen / Life Technologies, Paisley, R.U.) siguiendo las instrucciones del fabricante usando bacterias TOP-10. Se recogieron colonias bacterianas individuales al día siguiente y se expandieron en un cultivo durante la noche. Se extrajeron plásmidos con el kit QIAprep Spin Mini Prep (Qiagen, Hilden, Alemania). Se estableció una reacción de secuenciación usando el kit de secuenciación de ciclo BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems): 50 - 200 ug de plásmido, 4 ul de cebador, 1 ul de mezcla de BigDye Terminator, 1 ul de tampón de secuenciación y agua para HPLC hasta 10 ul. El programa de secuenciación fue 96°C, 5 min - 25x (96°C, 1 min - 50°C, 5 s - 60°C, 4 min) - mantenimiento a 10°C.

Análisis de microalineamientos de SNP

Se procesaron muestras de ADN y se hibridaron con alineamientos de SNP humanos de todo el genoma 6.0 (Affymetrix) según el protocolo suministrado por el fabricante. Se analizaron los datos sin procesar mediante el software Genotyping Console versión 3.0.2 (Affymetrix). Se evaluaron las muestras para determinar aberraciones cromosómicas (deleciones, ganancias y disomías uniparentales adquiridas) tal como se implementa en el software Genotyping Console.

Clonación de mutaciones en el exón 9 de CALR

Se amplificó CALR silvestre y mutante a partir del clon adquirido de Source Biosciences y se clonó en los sitios Xhol y EcoRl en el constructo retroviral pMSCV-IRES-GFP. Se amplificó CALR silvestre usando los siguientes cebadores

(FP - ATGCCTCGAGCCGCCACCATGCTGCTATCCGTGCCGCTGCTGCTC (SEQ ID NO' 1346) y RP-ATGCGAATTCCTACAGCTCGTCCTTGGCCTGGCC (SEQ ID NO: 1347)).

Se amplificó CALR mutante en dos fragmentos seguido por PCR anidada

(FP1 - ATGCCTCGAGCCGCCACCATGCTGCTATCCGTGCCGCTGCTGCTC (SEQ ID NO: 1346), RP1 -CCTCATCATCCTCCTTGTCCTCTGCTCCTCGTCCTG (SEQ ID NO: 1348), FP2 -CAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGATGAGG (SEQ ID NO: 1349), RP2 -ATGCCCGCGGCTAGGCCTCAGTCCAGCCCTGGAGG (SEQ ID NO: 1350)). ’

Producción y transducción de virus

Se generó el retrovirus y se transdujeron células tal como se describió anteriormente (Zuber et al, 2013). En resumen, se transfectaron células PlatE (75% de confluencia en una placa de 10 cm) con 20 pg del vector viral respectivo usando el kit de transfección con fosfato de calcio (Sigma #CAPHOS). Se cambió el medio después de 24 horas y se recogió el sobrenadante viral a las 36, 40, 44 y 60 horas después de la transfección. Se transdujeron 1 millón de células Ba/F3 con el sobrenadante viral fresco, en placas de 6 pocillos mediante espinoculación (4 pg/ml de Polybrene, 1350 g, 30 minutos a 32°C), en cada punto de recogida de virus. Se analizaron las células para determinar la eficacia de transducción mediante citometría de flujo, 48 horas después de la etapa de transducción final. Se clasificaron las células positivas para GFP mediante FACS y se analizó la eficacia de clasificación mediante citometría de flujo.

Ensayos de proliferación y viabilidad

Para evaluar la viabilidad de células Ba/F3 transducidas en presencia de interleucina-3, se sembraron las células en placas de 96 pocillos a 5000 células por pocillo por triplicado en una serie de dilución de interleucina-3 (dosis más alta de 25 ng/ml). Después de 72 horas, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega).

Para determinar la proliferación celular en ausencia de interleucina-3, se sembraron células Ba/F3 en placas de 12 pocilios a 1.000.000 células por pocillo por triplicado y se cultivaron durante 7 días en RPMI completo (con FCS al 10%, pen./estrep. y L-glutamina) sin interleucina-3. Se evaluó cada 24 horas el número de células usando el contador de células CASY® (Roche Innovatis).

Para definir la sensibilidad al inhibidor SAR302503 (Sanofi), se sembraron células Ba/F3 en placas de 96 pocillos a 25.000 células por pocillo por triplicado en una serie de dilución de SAR302503 (concentración más alta de 40 |iM) y en presencia de interleucina-3 10 ng/ml. Después de 48 horas, se determinó la viabilidad celular mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega).

Estimulación con interleucina-3 e inmunotransferencias de tipo Western

Se cultivaron células Ba/F3 en RPMI completo (FCS al 10%, pen./estrep., L-glutamina) en presencia de 1 ng/ml de interleucina-3. Se sometieron a privación las células en medio libre de suero sin interleucina-3 durante 4 horas. Se realizó la estimulación con una concentración respectiva de interleucina-3, durante 20 minutos. Se sedimentaron las células y se realizó la extracción de proteína tal como se describió anteriormente (Corvinus et al, 2005). En resumen, se añadió tampón de extracto de células completas (que contenía los inhibidores de proteasa y fosfatasa) a las células, y se realizó lisis mediante 3 ciclos consecutivos de congelación-descongelación con nitrógeno líquido. Se recogieron los lisados después de centrifugación durante 20 minutos a 20.000 g. Se midió la concentración de proteína usando el reactivo de Bradford. Se realizó la inmunotransferencia de tipo Western mediante técnicas convencionales y se cargaron 50 |ig de proteína por pocillo. Se usaron los siguientes anticuerpos: pYStat5 (Invitrogen, n.° 71-6900), Stat5 (Santa Cruz, sc-836), calreticulina (Millipore, MABT145), GAPDH (Santa Cruz, sc-32233), anti-HRP de conejo (GE, NA934) y anti-HRP de ratón (GE, NA931).

Inmunofluorescencia

Se sembraron células HEK293T sobre cubreobjetos de vidrio recubiertos con gelatina al 0,1%, se transfectaron con los plásmidos CMV-CALR silvestre y CMV-CALR del52 mediante lipofección (Invitrogen), según las instrucciones del fabricante, durante 24 horas. Se visualizó la tinción del RE usando anticuerpo anti-calnexina (ab31290, abcam); anticuerpo secundario anti-ratón AlexaFluor 546 (Invitrogen). Se usó anticuerpo anti-calreticulina (MABT145, Millipore) para teñir CALR; anticuerpo secundario anti-conejo AlexaFlour 594 (Invitrogen). Se visualizaron los portaobjetos usando un instrumento LSM780 (Carl Zeiss, Alemania) con una unidad con detectores múltiples de GaAsP y dos PMT. Se fijó el orificio a 1 U.A. en cada canal. Se tomaron imágenes secuencialmente, y se seleccionaron los canales, para reducir el solapamiento. Se tomaron imágenes a 100x y se analizaron con ImageJ (NIH, código abierto).

Análisis estadístico

Se realizó un análisis estadístico con el uso de métodos convencionales. Se llevaron a cabo pruebas de hipótesis con un enfoque no paramétrico. Todas las pruebas fueron bilaterales y los valores de p se consideraron significativos cuando eran menores de 0,05. Se usaron Excel de Microsoft Office (Copyright Microsoft Corp), Stata 11.2 (Copyright StataCorp LP) y R 2.15.2 (R Core Team, 2012) para la gestión y el análisis de datos. Se estimó la incidencia acumulativa de complicaciones trombóticas con un enfoque de riesgo competitivo según el método de Kalbfleisch-Prentice (Kalbfleisch y Prentice, 1980). La muerte en ausencia del acontecimiento de interés se consideró un acontecimiento competitivo.

Resultados

La secuenciación de exoma completo revela mutaciones recurrentes de CALR en PMF (mielofibrosis primaria)

Se analizó el ADN genómico de granulocitos de sangre periférica (tejido tumoral) y linfocitos T CD3+ (tejido de control) de 6 pacientes con PMF usando secuenciación de exoma completo. Una validación independiente de las variantes detectadas usando secuenciación de Sanger clásica confirmó mutaciones somáticas en entre dos y doce genes por paciente. El único gen que se vio afectado de manera recurrente fue CALR que codifica para calreticulina. Dos pacientes albergaban deleciones somáticas en el exón 9 de CALR. La subclonación y secuenciación de los productos de PCR reveló que el paciente 191 tenía una deleción de 52 pares de bases y el paciente 296 albergaba una deleción de un par de bases (figura 1). Puesto que la deleción de 52 pares de bases en el paciente 191 se anotó incorrectamente como una deleción de un par de bases acoplada con una variante de un solo nucleótido mediante el cauce de análisis de designación de variantes, se revisó manualmente la alineación de secuencias del paciente 191. Se observó una alineación errónea de las lecturas de secuenciación que cubrían el sitio de mutación. La alineación incorrecta se debía a un elemento de repetición en la región genómica afectada. Continuando con este hallazgo, se investigaron las alineaciones de secuencias de los cuatro pacientes restantes y se detectó una inserción de 5 pb recurrente en los 4 pacientes. Se confirmó que las mutaciones de CALR encontradas en los pacientes mediante secuenciación de exoma completo eran somáticas mediante secuenciación de Sanger de las muestras de ADN de linfocitos T coincidentes. En resumen, los seis pacientes con PMF analizados mediante secuenciación de exoma completo albergaban mutaciones somáticas de inserción o deleción en el exón 9 de CALR.

Frecuencia de mutaciones en el exón 9 de CALR en pacientes con neoplasia mieloproliferativa (MPN)

Con el fin de estimar la prevalencia de mutaciones de CALR en MPN, se examinó una cohorte de 896 pacientes con MPN para detectar mutaciones de inserción y deleción en el exón 9 de CALR usando determinación del tamaño de alta resolución de productos de PCR marcados con colorante fluorescente. Esta cohorte incluía 382 pacientes con policitemia vera (PV), 311 con trombocitemia esencial (ET) y 203 con mielofibrosis primaria (PMF) (tabla 1). Se identificaron 150 muestras que albergaban inserciones o deleciones en CALR (17%). Las mutaciones se han validado independientemente mediante secuenciación de Sanger. En PV, no se observaron mutaciones en CALR. En ET y PMF, 78 (25%) y 72 (35%) pacientes tenían mutaciones en CALR, respectivamente (tabla 1). Se genotiparon todos los pacientes para detectar la mutación JAK2-V617F. Se sometieron a prueba pacientes con PV negativos para esta mutación para detectar mutaciones en el exón 12 de JAK2. Se sometieron a prueba pacientes con ET y PMF con JAK2 silvestre para detectar mutaciones en el exón 10 de MPL.

La distribución de las mutaciones de JAK2, MPL y CALR en las tres entidades de enfermedad de MPN se representa en la figura 2A. Todos los pacientes con CALR mutante tenían JAK2 y MPL silvestres. Por tanto, las mutaciones en CALR se asocian significativamente con ET (P=9,33x10‘45) y PMF (P=1,71x10‘44) que son silvestres para mutaciones de JAK2 y MPL. Un total de 67 pacientes con MPN sometidos a prueba eran silvestres para JAK2 y MPL así como para el exón 9 de CALR. De estos casos “triples negativos”, se sometieron a secuenciación de Sanger 19 pacientes para detectar mutaciones en los 9 exones de CALR pero no se detectaron mutaciones.

Puesto que las mutaciones de CALR estaban altamente asociadas con ET o PMF silvestres para JAK2 y MPL, se analizaron otros 211 pacientes que se encontraban dentro de esta categoría de enfermedad. En total, de 289 pacientes con ET silvestre para JAK2/m Pl , 195 tenían CALR mutante (67%). De los 120 pacientes con PMF silvestre para JAK2/MPL combinados, 105 tenían una mutación en CALR (88%). En 150 pacientes con CALR mutante para los que se tenía disponible ADN de linfocitos T coincidente, las mutaciones eran somáticas.

Tabla 1. Comparación de mutaciones de JAK2, MPL y CALR en los tres subtipos de MPN (se muestra el número de pacientes).

Subtipo MPN N JAK2 mutante MPL mutante CALR mutante JAK2/MPL/CALR silvestre

ET 311 184 11 78 38

PMF 203 108 13 72 10

PV 382 363 0 0 19

total: 896 655 24 150 67

Frecuencia de mutaciones de CALR en otras malignidades mieloides

Para investigar si están presentes mutaciones de CALR en otras malignidades mieloides, se examinaron 254 pacientes con AML de novo, 45 con leucemia mieloide crónica, 73 con síndrome mielodisplásico, 64 con leucemia mielomonocítica crónica y 24 con anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociada con trombocitosis marcada para mutaciones en el exón 9 de CALR. Aunque la gran mayoría de estos pacientes tenían un exón 9 de CALR silvestre, tres pacientes con anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociada con trombocitosis marcada albergaban mutaciones en CALR (figura 2B), teniendo todos ellos JAK2 y MPL silvestres (figura 2C). Se producían conjuntamente mutaciones en el gen que codifica para el factor de corte y empalme 3B, subunidad 1 (SF3B1) con mutaciones en los tres genes. De los 524 sujetos sanos, uno tenía una deleción en marco de 3 pb en CALR.

Mutaciones de desplazamiento del marco de lectura de CALR sustituyen la secuencia de aminoácidos C-terminal por un péptido novedoso derivado de un marco de lectura alternativo

Se detectó un total 36 tipos diferentes de mutaciones en CALR incluyendo inserciones, deleciones, combinaciones de deleciones e inserciones, así como combinaciones de inserciones/deleciones con variantes de un solo nucleótido. Todas las mutaciones observadas daban como resultado un desplazamiento del marco de lectura al marco de lectura alternativo 1 de CALR (figura 3A). Esto conduce a un cambio marcado en la composición de aminoácidos del extremo C-terminal de la proteína CALR mutante (figura 3B). El extremo C-terminal derivado del exón 9 en CALR silvestre está altamente cargado negativamente, mientras que los péptidos de los mutantes derivados del marco de lectura alternativo 1 están cargados positivamente. Ya que el marco de lectura alternativo 2 tiene varios codones de terminación, mutaciones de desplazamiento del marco de lectura en este marco darían como resultado una terminación prematura de la traducción y un truncamiento de la proteína (figura 3B). No se observaron mutaciones de desplazamiento del marco de lectura al marco de lectura alternativo 2 en los pacientes con MPN estudiados. Los 36 tipos de mutaciones se representan en la figura 3C. Debido a los diferentes tamaños y posiciones de las mutaciones, se encuentran ganancias y pérdidas de números variables de aminoácidos en la región C-terminal de la proteína (tabla 2). Todas las mutaciones de desplazamiento del marco de lectura generan una secuencia de aminoácidos C-terminal novedosa (tabla 2). Se muestran secuencias de proteína de longitud completa de todos los mutantes en SEQ ID NO: 148, 152, 156, 160, 164, 168, 172, 176, 180, 184, 188, 192, 196, 200, 204, 208, 212, 216, 220, 224, 228, 1232, 236, 240, 244, 248, 252, 256, 260, 264, 268, 272, 276, 280, 284, 288. Las secuencias de ADNc alrededor de las uniones de mutaciones se proporcionan en la tabla 3.

Tabla 2. Secuencias de aminoácidos C-terminales de mutaciones de desplazamiento del marco de lectura de inserción/deleción de CALR encontradas en pacientes con MPN. La tabla 2 da a conocer SEQ ID NO 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 4, 76, 80, 84, 88, 92, 96, 100, 104, 108, 112, 116, 120, 124, 128, 132, 136, 140 y 144, respectivamente, en orden de aparición.

Tipo 1 TRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 2 NCRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 3 QRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 4 RRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 5 GQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 6 RRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 7 RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 8 RRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 9 RQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 10 MCRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 11 DQRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 12 RRRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 13 QRRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 14 RRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 15 RRRERTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 16 QRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 17 RRQWTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 18 RMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 19 RQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 20 GRRQRTRRMMRTRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLGGWTEA-Tipo 21 AFKRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 22 NAKRRRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 23 CVRRRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 24 RRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 25 RQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 26 NAKRRRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 27 CFAKRRRRQRTRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 28 RRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 29 PPLCLRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 30 DHPCRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 31 GNCRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 32 CRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 33 CRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 34 TCRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 35 ICRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA-Tipo 36 CRRMMRTKMRMRRMRRTRRKMRRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA

Tabla 3. Secuencias de uniones de mutaciones en la secuencia de ADNc de CALR para el diseño de sondas específicas de mutación o cebadores de PCR. La tabla 7 da a conocer SEQ ID NO 440-475, respectivamente, en orden de mutación.

Mutación de CALR Secuencias de uniones de ADNc en posiciones mutadas

Tipo 1 GAAGGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGAT

Tipo 2 GAGGAGGAGGCAGAGGACAATTGTCGGAGGAT GAT GAGGACAAAG

Tipo 3 GGACAAACAGGACGAGGAGCAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 4 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTT AGGAGGAGGCAGAGGACAAGG

Tipo 5 TGAAGGACAAACAGGACGAGGGGCAGAGGACAAGGAGGATGA

AG GACAAACAG GACGAGGAG CG GAG GCAGAGGACAAGGAGGA

Tipo 6

Tipo 7 CAGG ACGAGGAGCAGAGGCTTAGGAGGATGAT GAGGACAAAG

Tipo 8 GGACGAGGAGCAGAGGCTTAAGAGGAGGCAGAGGACAAGGAG

Tipo 9 CAAGAAACGCAAAGAGGAGGAGAGGCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 10 AG GAGG AGG AGGCAGAGG ACATGTGTCGGAGGATG ATGAGGACAAAG

Tipo 11 AAGGACAAACAGGACG AGGACCAGAG GCAGAGGACAAGGAGGAT

Tipo 12 CAAACAGGACGAGGAGCAGAG GAGGAGGAGGAGGCAGAGGAC

Tipo 13 AACAGGACGAGGAGCAGAGGCAGAGGAGGAGGCAGAGGACAAG

Tipo 14 ACAGGACGAGGAGCAGAGGCTGAGGAGGAGGCAGAGGACAAG

Tipo 15 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTT AG GAGG AGG GAGAGGACAAGG AGG AT GATG

Tipo 16 CAGGACGAGGAGCAGAGGCTTCAGAGGAGGCAGAGGACAAGGAG

Tipo 17 GGACGAGGAGCAGAGGCTT AAG AGGAGGCAG TGG AC AAGGAGGAT GAT GAGG Tipo 18 G G AC G AG G AGCAG AGGCTT AA G AG GATG ATG AGG AC AAAG AT

Tipo 19 GGAGCAGAGGCTTAAGGAGGAGAGGCAGAGGAC AAGGAGGAT

Tipo 20 GGCTTAAGGAGGAGGAAGAAGGGAGGAGGCAGAGGACAAGGA

Tipo 21 GGCTTAAGGAGGAG GAAGAAGCGTTTAAGAGGACAAG GAGG ATGATG A

Tipo 22 CTTAAGG AGGAGGAAGAAGACAACGCAAAGAGGAGGAGGAGG

Tipo 23 CTTAAGGAGGAGGAAGAAGACTGCG TGAGGAGGAGGAGGCAGAGGAC

Tipo 24 CTTAAGG AGGAGG AAG AAG AC AG GAGG CAG AGGACAAGG AGG

Tipo 25 TAAG G AG G AG G AAGAAGACAAAAGG C AG AG G AC AAG G AG G ATG

Tipo 26 TAAG G AG GAGG AAG AAG AC AAAAACG C AAAG AG G AG G AGG AG

Tipo 27 AAG G AGG AG G AAG AAG AC AAGTGTTTC GCAAAG AG G AG G AG GAG G CA

Tipo 28 GGAAGAAGACAAG AAACGCAAAAGG AGGAT GATGAGGACAAA

Tipo 29 G AAG AC AAG AAACGCAAAGAG CCT CCT CTTT GT CT AAGGAGGAT GAT G AGG ACAAA Tipo 30 AG AC AAG AAACGC AAAG AGG A CCATCCTT GTCGGAGGAT GAT GAGGACAAAG A Tipo 31 AG AGGAGGAGGAGGCAGAGGGCAATTG TCGGAGGATGATGAGGACAAAG

Tipo 32 GAGGAGGAGGAGGCAGAGGACTGT CGGAGGATGAT GAGGACAAAGA

Tipo 33 G AGG AGG AGGC AG AGG AC AAATGTCGG AGG ATG ATGAGGAC AAAG

Tipo 34 AG GAGG AGG AGGCAGAGG ACACTT GT CGGAGGAT GAT GAGGACAAAGA

Tipo 35 AG GAGG AGG AGGCAGAGG ACATTT GTCGGAGGATGAT GAGGACAAAGA

Tipo 36 AGGAGGAGGCAG AGGACAAGT GT CGGAGGAT GAT GAGGACAAAGA

Las letras en negrita indican los bordes de un acontecimiento de deleción; las letras subrayadas indican secuencias insertadas; las letras en negrita y en cursiva indican variantes de un solo nucleótido

Se identificaron mutaciones somáticas específicas de células mieloides en el gen de CALR en pacientes con MPN. Las mutaciones se asocian fuertemente con los pacientes que eran negativos para mutaciones tanto de JAK2 como de MPL (las mutaciones que provocaban enfermedad descritas anteriormente en MPN). Ya que se encuentran mutaciones de CALR en el 88% de los casos de PMF, y en el 67% de los casos de ET dobles negativos para JAK2 y MPL, se cree que las mutaciones de CALR están llenando un gran hueco en el diagnóstico para ET y PMF negativas para JAK2/MPL. Por tanto, la detección de mutaciones de CALR a nivel del ADN genómico, ARN o ADNc ofrece una prueba de diagnóstico importante para MPN.

Todas las mutaciones de CALR identificadas están en el último exón 9 que codifica para los aminoácidos C-terminales de la proteína y son predominantemente mutaciones de inserción/deleción. La gran mayoría de las mutaciones estaban presentes en un estado heterocigoto y provocan un desplazamiento del marco de lectura al mismo marco de lectura alternativo. Este desplazamiento del marco de lectura da como resultado el reemplazo de los aminoácidos cargados negativamente C-terminales (ricos en ácido aspártico y glutámico) de calreticulina por un polipéptido predominantemente cargado positivamente rico en arginina y metionina. Además, los últimos 4 aminoácidos de calreticulina (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) contienen la señal de retención en el retículo endoplasmático. Esta señal está ausente en la calreticulina mutante lo que sugiere que la proteína mutante está menos representada en el RE en comparación con la proteína silvestre. Ya que el extremo C-terminal cargado negativamente de la calreticulina es el dominio de unión a Ca2+ de alta capacidad y baja afinidad, se cree que se pierde la función de unión a Ca2+ de la proteína mutante.

De todos los casos de CALR mutada, las mutaciones de tipo 1 (deleción de 52 pares de bases) y tipo 2 (inserción de 5 pares de bases) representaban el 53% y el 32%, respectivamente (figuras 3D, E). Los otros tipos de mutaciones se observaban a frecuencias mucho más bajas, muchos detectados sólo en un único paciente (figura 3E). Como los 36 tipos de mutaciones de desplazamiento del marco al marco de lectura alternativo 1, las proteínas CALR mutantes resultantes comparten una secuencia de aminoácidos novedosa común en el extremo C-terminal (tabla 2). El péptido C-terminal derivado del marco de lectura alternativo 1 contiene varios aminoácidos cargados positivamente, mientras que el extremo C-terminal de CALR silvestre está fuertemente cargado negativamente (figura 3B). Además, la calreticulina silvestre contiene el motivo de retención en el retículo endoplasmático en el extremo C-terminal (KDEL (SEQ ID NO: 1331) secuencia de aminoácidos). El extremo KDEL C-terminal (SEQ ID NO: 1331) se pierde en todas las variantes mutantes (tabla 2). Dependiendo del tipo de mutación, las proteínas mutantes conservan cantidades variables de los aminoácidos cargados negativamente de calreticulina silvestre. Las deleciones de 52 pares de bases de tipo 1 eliminan casi todos los aminoácidos cargados negativamente, mientras que las inserciones de 5 pares de bases de tipo 2 conservan aproximadamente la mitad de los aminoácidos cargados negativamente (figura 3D). Dadas estas diferencias, se planteó la hipótesis de que las mutaciones de tipo 1 y tipo 2 pueden estar asociadas con fenotipos cualitativamente diferentes. Por consiguiente, se encontró que las deleciones de tipo 1 eran significativamente más frecuentes en mielofibrosis primaria en comparación con trombocitemia esencial (P=0,0007). Además, se detectaron sólo 3 pacientes homocigotos para mutaciones de CALR asociadas con disomía uniparental del cromosoma 19p y los 3 casos tenían una inserción de 5 pares de bases de tipo 2 (figura 4A).

Se adquieren de manera temprana mutaciones de CALR en la evolución clonal y los clones mutantes son estables

Con el fin de investigar si las mutaciones en CALR se adquieren de manera temprana o tardía en la historia clonal de un paciente, se analizaron colonias de progenitores hematopoyéticos de dos pacientes para los que se disponía de perfiles de mutación a partir de la secuenciación de exoma completo. En la figura 4B, se muestran las jerarquías clonales de los pacientes H_0191 y H_0296. Se concluye que estas mutaciones en CALR se adquirieron de manera temprana en los clones principales de los dos pacientes analizados.

Para 24 pacientes con CALR mutante, se disponía de muestras de seguimiento, todas las cuales dieron positivo para la mutación.

Significación clínica de las mutaciones de CALR

En global se estudiaron 1215 pacientes con trombocitemia esencial o mielofibrosis primaria, tabla 4. De estos, el 63,4% portaba JAK2-V617F, el 4,4% portaba mutaciones activantes del exón 10 de MPL, el 23,5% portaba mutaciones del exón 9 de CALR, y sólo el 8,8% no tenía ninguno de los marcadores clonales anteriores. Obsérvese que la mayoría de estos últimos pacientes se agrupaban en el subgrupo de trombocitemia esencial. Se usó la prueba de la suma de rangos de Wilcoxon para comparar valores hematológicos en pacientes que portaban diferentes genes mutantes. Dentro de los pacientes con trombocitemia esencial, aquellos que portaban la mutación de CALR tenían un menor nivel de hemoglobina, un menor recuento de glóbulos blancos y un mayor recuento de plaquetas en el diagnóstico en comparación con pacientes que portaban JAK2 mutante (P<0,001 en todos los casos). Dentro de los pacientes con mielofibrosis primaria, aquellos que portaban una mutación de CALR tenían un menor recuento de glóbulos blancos (P=0,027) y un mayor recuento de plaquetas (P<0,001) que los pacientes con JAK2 mutante. Se analizaron el riesgo de trombosis y la supervivencia global sólo en pacientes que portaban una mutación en JAK2, MPL o CALR, es decir, que tenían un marcador clonal. Suponiendo que el estado de mutación no cambiaba con el tiempo, se realizaron todos los análisis desde el diagnóstico inicial. Puesto que se excluyeron 6 pacientes debido a un seguimiento inadecuado, se examinó un total de 1102 pacientes. La mediana del seguimiento para la cohorte completa de pacientes con cualquiera de los tres genes mutados fue de 5,7 años (intervalo de 0-31 años). Tal como se muestra en la figura 5A, había una diferencia significativa en la supervivencia global entre los 3 subgrupos de pacientes con mielofibrosis primaria (P<0,001). Aquellos que portaban una mutación somática de CALR tenían una mejor supervivencia global que aquellos que tenían una mutación de JAK2 (P<0,001) o MPL (P<0,001), mientras que no se observaron diferencias entre los dos últimos subgrupos. En los pacientes con trombocitemia esencial, que tienen supervivencias globales mucho más largas, había una diferencia significativa sólo entre pacientes con CALR mutada y JAK2 mutada (P=0,043, figura 5B). En un análisis multivariante de regresión de Cox de la supervivencia global que incluía el tipo de neoplasia mieloide (trombocitemia esencial frente a mielofibrosis primaria), el tipo de gen mutante y la cohorte de pacientes (Pavía frente a Viena) como covariables, se encontró que los dos primeros factores eran factores pronóstico independientes. Tal como se esperaba, la mielofibrosis primaria estaba asociada con una supervivencia global más corta en comparación con trombocitemia esencial (razón de riesgos de muerte de 7,1, P<0,001, IC4,9-10,2). Además, el tipo de gen mutante tenía un efecto independiente sobre la supervivencia. De hecho, en comparación con los pacientes que portaban una mutación de CALR, tanto aquellos que portaban una mutación de JAK2 (razón de riesgos de 3,1, P<0,001, IC 2,0-4,7) como aquellos que portaban una mutación de MPL (razón de riesgos de 3,5, P<0,001, IC 1,8-6,7) tenían un mayor riesgo de muerte. Se calculó la incidencia acumulativa de trombosis en trombocitemia esencial con un enfoque de riesgo competitivo con la muerte por cualquier causa como acontecimiento competitivo, y se notifica en la tabla 5 mientras que las curvas reales se muestran en la figura 5C. Los pacientes con trombocitemia esencial que portaban una mutación de CALR tenían un menor riesgo de trombosis que los pacientes que portaban una mutación de JAK2 (P=0,003), mientras que no se encontraron diferencias significativas entre los otros subgrupos. Debe indicarse que el subgrupo de pacientes que portaban una mutación de MPL era pequeño.

Tabla 4: Descripción de cohortes para los 1215 pacientes usados para estimar la significación clínica de las mutaciones de CALR

Diagnóstico JAK2 motada Exón 10 de MPL CALR matada JAK21MPLICALR Todos los (n=770) mutado(n=53) (n=285) silvestre (n=107) pacientes (n=1215) Trombocitemia 581 {65%) 35 (3,9%) 186 (20,8%) 92 (10,3%) 894 esencial

Mielofibrosis 189 (58;9%) 18 (5,6%) 99 (30,8%) 15 {4,7%) 321 primaria

Tabla 5: Incidencia acumulativa de trombosis comparando pacientes con JAK2, MPL y CALR mutantes

Incidencia acumulativa de A los 5 anos A los 10 anos A los 15 anos trombosis

JA.K2 m utada 13% (IC 10-16.4) 21% (IC 16,6-25.7) 27,1% (IC 21,4-33} MPL mulada 9,3% (IC 2,3-22.3} 9,3% (IC 2.3-22.3) 17.6% (IC 4.4-38,1) CALR mulada 6,3% (IC 3,2-10.3} 11% (IC 6,3-17,1) 12.3% (IC 7,3-20)

Análisis funcional de la mutación de CALR de tipo 1

Con el fin de estudiar los efectos funcionales de CALR mutante, se clonó el ADNc de CALR silvestre y la mutación de tipo (deleción de 52 pares de bases) en el vector de expresión retroviral pMSCV-IRES-GFP. Tras la producción retroviral y la transfección de los ADNc de CALR en la línea celular murina dependiente de interleucina-3, Ba/F3, se clasificaron las células positivas para el transgén mediante citometría de flujo para GFP. A continuación se midió la proliferación de células dependiente de interleucina-3. Las células que expresaban la mutación de CALR de tipo 1 presentaban crecimiento independiente de interleucina-3 e hipersensibilidad a interleucina-3 (figura 6A). Cuando se midió la proliferación de células en ausencia de interleucina-3, sólo la mutación de deleción de 52 pares de bases de CALR presentaba una acumulación significativa de células (figura 6B). Para investigar si la independencia de interleucina-3 en las células mutantes por deleción de 52 pares de bases de CALR está provocada por la activación de la señalización de JAK-STAT, se determinó la sensibilidad de las células al inhibidor de la cinasa JAK2, SAR302503. Tal como se muestra en la figura 7, tanto CALR silvestre como el mutante por deleción de 52 pares de bases de CALR mostraron una sensibilidad similar a SAR302503, lo que sugiere que el crecimiento independiente de interleucina-3 de las células con CALR mutante depende de JAK2 o una cinasa de la familia de JAK seleccionada como diana por SAR302503. Para confirmar esta hipótesis, se examinó la fosforilación de STAT5 en presencia y ausencia de interleucina-3 en las líneas celulares de control y transfectadas con CALR. Se detectó un aumento de la fosforilación de STAT5 en ausencia de interleucina-3 en el mutante por deleción de 52 pares de bases de CALR y a una concentración de interleucina-3 de 0,1 ng/ml (figura 6C). Por tanto, el aumento de la activación de la señalización de JAK-STAT es responsable probablemente del crecimiento independiente de citocinas de células que expresan el mutante por deleción de 52 pares de bases de CALR.

Se usó microscopía de inmunofluorescencia para determinar la localización de CALR silvestre y mutante de tipo 1. Tras la sobreexpresión en células HEK, la CALR silvestre se localizaba conjuntamente en el retículo endoplasmático (tinción con calnexina). En el caso de CALR mutante de tipo 1, esta localización conjunta era menos relevante, lo más probablemente debido a la ausencia de la secuencia KDEL (SEQ ID NO: 1331) del extremo C-terminal de la CALR mutante (figura 6D).

Se han identificado mutaciones somáticas en el gen de CALR en pacientes con mielofibrosis primaria y trombocitemia esencial. Las mutaciones de CALR son mutuamente excluyentes con mutaciones tanto en JAK2 como en MPL. No se encontraron mutaciones de CALR en policitemia vera, una neoplasia mieloproliferativa que está asociada específicamente con mutaciones de JAK2. Las mutaciones de CALR son la segunda mutación más común después de JAK2 en neoplasias mieloproliferativas. Se han estudiado también pacientes con otras neoplasias mieloides, y se encontraron mutaciones de CALR sólo en el 12,5% de los casos con anemia refractaria con sideroblastos en anillo asociada con trombocitosis marcada, una neoplasia mielodisplásica/mieloproliferativa típica (Malcovati et al, 2009). Esto respalda fuertemente una relación causal entre mutaciones de CALR y una producción excesiva de plaquetas.

Puesto que se encuentran mutaciones de CALR en aproximadamente el 73% de los pacientes que no portan alteraciones de JAK2 y MPL, se cree que están llenando un hueco en el diagnóstico molecular actual en neoplasias mieloproliferativas. Conjuntamente, sólo menos del 10% de los pacientes con trombocitemia esencial o mielofibrosis primaria no portan una mutación somática de JAK2, MPL o CALR. En algunos de estos sujetos, el clon mutado podría ser demasiado pequeño como para detectarse con los enfoques actuales. Genes impulsores mutantes poco comunes pueden desempeñar un papel en otros pacientes, mientras que algunos pacientes podrían no tener una enfermedad clonal en absoluto. Esto es particularmente cierto para pacientes con un diagnóstico clínico de trombocitemia esencial, ya que el diagnóstico diferencial entre trombocitosis clonal y reactiva puede ser difícil sin un marcador clonal (Schafer, 2004). En total, la evaluación de mutaciones de CALR mejora notablemente el enfoque de diagnóstico actual para trombocitemia esencial o mielofibrosis primaria, y debe incluirse en los criterios de la OMS para estos trastornos (Sverdlow et al, 2008)

Todas las mutaciones de CALR que se identificaron son mutaciones de inserción/deleción en el último exón que codifica para los aminoácidos C-terminales de la proteína. La mayoría de las mutaciones están presentes en un estado heterocigoto y provocan un desplazamiento del marco de lectura a un marco de lectura alternativo específico. Este desplazamiento del marco de lectura da como resultado el reemplazo de los aminoácidos cargados negativamente C-terminales de calreticulina por un polipéptido cargado positivamente rico en arginina y metionina. Los últimos 4 aminoácidos de calreticulina (KDEL (SEQ ID NO: 1331)) contienen la señal de retención en el retículo endoplasmático. Esta señal está ausente en la calreticulina mutante. En consecuencia, la calreticulina mutante tiene una localización subcelular alterada. Ya que el extremo C-terminal cargado negativamente de calreticulina es el dominio de unión a Ca2+ de alta capacidad y baja afinidad, puede verse alterada la función de unión a Ca2+ de la proteína mutante. La presencia de la secuencia peptídica derivada del marco de lectura alternativo en el extremo C-terminal de CALR mutada ofrece una oportunidad de direccionamiento inmunológico ya que representa un epítopo específico de cáncer.

Para analizar adicionalmente la capacidad oncogénica de la calreticulina mutante, se generaron células Ba/F3 con sobreexpresión de CALR silvestre y mutante de tipo 1 (deleción de 52 pares de bases - del52). De manera interesante, las células Ba/F3 CALR del52 mostraron proliferación independiente de citocinas. Sin embargo, el crecimiento de células Ba/F3 que expresan calreticulina silvestre y mutante se suprimió igualmente tras el tratamiento con un inhibidor de la cinasa jAK2, lo que sugiere el requisito de la ruta de JAK-STAT en la independencia de citocinas inducida por calreticulina mutante. De acuerdo con esto, pudo detectarse un aumento de la fosforilación de STAT5 en células Ba/F3 del52, tanto en ausencia como en presencia de estimulación con interleucina-3. Se ha mostrado anteriormente que calreticulina/Ca2+/calmodulina modula la actividad de Stat. El complejo de calreticulina con ERp57, en el retículo endoplasmático, suprime la fosforilación y actividad transcripcional de Stat3 en fibroblastos embrionarios de ratón (Coe et al, 2010). Además, la inhibición de la cinasa II gamma dependiente de Ca2+/calmodulina da como resultado niveles reducidos de Stat1, Stat3 y Stat5 fosforiladas (Si y Collins 2008). De manera interesante, la sobreexpresión de calreticulina atenúa la fosforilación de Stat1 inducida por interferón alfa, dando como resultado resistencia a interferón (Yue et al, 2012). Se requieren estudios adicionales para dilucidar el mecanismo de la activación de la ruta de JAK-STAT por la calreticulina mutante en células mieloides. La implicación de la ruta de señalización de JAK-STAT en pacientes positivos para CALR también puede explicar la eficacia de la terapia con inhibidor de JAK2 en mielofibrosis primaria. Sin embargo, los resultados indican que los inhibidores de JAK2 pueden no ser selectivos para células que expresan la CALR mutada en comparación con las células silvestres para CALR.

Aunque los análisis de desenlace clínico son retrospectivos, sugieren fuertemente que neoplasias mieloproliferativas positivas para CALR tienen una evolución clínica más benigna que los correspondientes trastornos asociados con mutación de JAK2 o MPL. Debido al pequeño número de pacientes con MPL mutada, las comparaciones más fiables son aquéllas entre pacientes con JAK2 mutada y CALR mutada. Las observaciones muestran claramente que pacientes con CALR mutada tienen menor riesgo de trombosis y mejor supervivencia global que pacientes con JAK2 mutada. La menor incidencia de complicaciones tromboembólicas podría estar relacionada con el hecho de que los pacientes con CALR mutada tenían menores niveles de hemoglobina y menores recuentos de glóbulos blancos. Se observó una mejor supervivencia global en pacientes con mielofibrosis primaria y aquellos con trombocitemia esencial, aunque era mucho más relevante en los primeros, confirmando los hallazgos previos en pacientes con y sin mutaciones de JAK2 (Campbell et al, 2006b; Rumi et al, 2013). Desde un punto de vista práctico, el diferente impacto de los genes mutantes podría incorporarse en los sistemas de puntuación de pronóstico existentes para mielofibrosis primaria y trombocitemia esencial (Passamonti 2010b, Passamonti 2012) y también puede guiar la toma de decisiones terapéuticas. Más específicamente, la caracterización molecular de CALR debe convertirse en un componente esencial del manejo clínico futuro de trombocitemia esencial y mielofibrosis primaria.

Ejemplo 2: Generación de anticuerpos específicos de CALR mutante en ratones

Las mutaciones de CALR asociadas con MPN se producen en el último exón del gen (exón 9). Estas mutaciones son inserciones y/o deleciones que resultan de una mutación de “desplazamiento del marco de lectura” a un marco de lectura alternativo muy específico, conduciendo a la síntesis de un péptido C-terminal novedoso en el mutante. Ya que todas las mutaciones dan como resultado la generación del mismo marco de lectura alternativo, el péptido C-terminal tiene la misma secuencia en todos los mutantes de CALR. Se usó un péptido sintético con la secuencia de extremo C-terminal de la proteína calreticulina mutante (Secuencia - RRKMSPARPRTSCREACLQGWTEA- ^ conj Ugad0 con la hemocianina de lapa californiana (KLH) para inmunizar cuatro ratones C57B1/6 silvestres.

Los ratones recibieron 3 dosis de refuerzo después de la inmunización primaria. Se sometieron a prueba los sueros de los ratones (preinmune y tras los refuerzos) para detectar la presencia anticuerpos específicos para calreticulina mutante mediante análisis de inmunotransferencia de tipo Western de lisados de células HEK que sobreexpresaban el mutante de CALR del52 y el mutante de CALR generado artificialmente que carece del exón 9 (Aexón9, que carece del péptido mutante). Se hicieron correr los lisados sobre geles de poliacrilamida al 8% y se estudiaron con sonda con el suero de ratón. Se usó anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP (GE NA931) como anticuerpo secundario. Después del segundo refuerzo, los sueros de los cuatro ratones tenían anticuerpos específicos para mutante de CALR que detectaban el mutante de CALR del52 (figura 8), pero no el CALR con el exón 9 delecionado de control (figura 9). Se usó anticuerpo anti-calreticulina (Millipore MABT145) como control positivo (Pos), que reconoce las tres formas de calreticulina: silvestre, mutante del 52 y exón 9 delecionado. La señal de los sueros de los cuatro ratones era más intensa tras aplicarse el tercer refuerzo (figura 10).

El péptido C-terminal de la calreticulina mutante (mencionado anteriormente) es inmunogénico y puede usarse satisfactoriamente para generar anticuerpos específicos, en particular anticuerpos policlonales contra la calreticulina mutante. Estos anticuerpos pueden usarse como reactivos de investigación así como para fines de diagnóstico tal como se da a conocer en el presente documento.

La presente invención se refiere a las siguientes secuencias de aminoácidos y nucleótidos:

Las secuencias proporcionadas en el presente documento están en parte disponibles en la base de datos del NCBI y pueden recuperarse en www at ncbi.nlm.n¡h.gov/sites/entrez?db=gene: las secuencias también se refieren a secuencias anotadas y modificadas. La presente invención también proporciona técnicas y métodos en los que se usan secuencias homólogas, y variantes de las secuencias concisas proporcionadas en el presente documento. Preferiblemente, tales “variantes” son variantes genéticas.

SEQ ID No. 1: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 2: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 3: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 4: Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 5: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1

SEQ ID No. 6: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1

SEQ ID No. 7: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1

SEQ ID No. 8: Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1 SEQ ID No. 9: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2

SEQ ID No. 10: Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2

SEQ ID No. 11 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2

SEQ ID No. 12 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2 SEQ ID No. 13 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3

SEQ ID No. 14 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3

SEQ ID No. 15 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3

SEQ ID No. 16 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3 SEQ ID No. 17 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4

SEQ ID No. 18 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4

SEQ ID No. 19 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4

S E Q ID N o . 20 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 4

S E Q ID N o . 21 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 5

S E Q ID N o . 22 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 5

SEQ ID No. 23 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5

SEQ ID No. 24 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5 SEQ ID No. 25 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6

SEQ ID No. 26 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6

SEQ ID No. 27 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6

SEQ ID No. 28 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6 SEQ ID No. 29 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 30 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 31 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 32 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7 SEQ ID No. 33 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 34 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 35 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 36 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8 SEQ ID No. 37 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 38 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 39 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 40 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9 SEQ ID No. 41 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 42 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 43 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 44 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 45 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

S E Q ID N o . 46 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 11

S E Q ID N o. 47 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 11

SEQ ID No. 48 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

SEQ ID No. 49 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 50 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 51 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 52 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 53 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 54 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 55 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 56 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 57 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 58 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 59 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 60 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 61 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 62 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 63 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 64 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 65 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 66 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 67 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 68 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

S E Q ID N o. 69 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 17

S E Q ID N o . 70 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 17

SEQ ID No. 71 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 72 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 73 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 74 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 75 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 76 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 77 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 78 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 79 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 80 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 81 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 82 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 83 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 84 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 85 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 86 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 87 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 88 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 89 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 90 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 91 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 92 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

S E Q ID N o. 93 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 24

S E Q ID N o . 94 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H om o sa p ie n s t ip o 24

SEQ ID No. 95 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 96 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 97 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No. 98 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No. 99 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No. 100 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No.101 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 102 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 103 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 104 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 105 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 106 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 107 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No.108 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 109 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 110 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 111 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 112 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 113 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 114 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 115 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

S E Q ID N o . 116 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 29

S E Q ID N o . 117 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a de H o m o sa p ie n s t ip o 30

SEQ ID No. 118 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 119 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 120 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 121 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 122 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 123 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 124 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 125 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32

SEQ ID No. 126 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32

SEQ ID No. 127 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32

SEQ ID No. 128 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32

SEQ ID No. 129 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 130 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 131 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 132 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 133 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 134 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 135 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 136 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 137 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

SEQ ID No. 138 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

SEQ ID No. 139 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

S E Q ID N o . 140 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e l e x tre m o C - te rm in a l d e m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 35

SEQ ID No. 141 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 142 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 143 Secuencia de nucleótidos que codifica para el extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 144 Secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo

36

145 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 146 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 147 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 148 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 1 149 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 150 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 151 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 152 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 2 153 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 154 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3 155 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 3 156 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de

Homo sapiens tipo 3 157 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4 158 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4 159 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 4 160 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de

Homo sapiens tipo 4 161 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5 162 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5 163 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 5 164 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de

Homo sapiens tipo 5 165 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6 166 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6 167 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 6 168 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de

Homo sapiens tipo 6 169 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7 170 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

171 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

172 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de

Homo sapiens tipo 7

S E Q ID N o .173 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra e l m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 8

SEQ ID No. 174 Secuencia de nucleotidos que codifica p a ra e l m u ta n te d e c a lre t ic u h n a d e H o m o sa p ie n s t ip o 8 SEQ ID No. 175 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8 SEQ ID No. 176 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 177 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9 SEQ ID No. 178 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9 SEQ ID No. 179 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9 SEQ ID No. 180 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 181 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10 SEQ ID No. 182 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10 SEQ ID No. 183 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10 SEQ ID No. 184 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 185 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11 SEQ ID No. 186 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11 SEQ ID No. 187 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11 SEQ ID No. 188 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

SEQ ID No. 189 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12 SEQ ID No. 190 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12 SEQ ID No. 191 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12 SEQ ID No. 192 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 193 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13 SEQ ID No. 194 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13 SEQ ID No. 195 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13 SEQ ID No. 196 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 197 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14 SEQ ID No. 198 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14 SEQ ID No. 199 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14 SEQ ID No. 200 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 201 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15 SEQ ID No. 202 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15 SEQ ID No. 203 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15 SEQ ID No. 204 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 205 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16 SEQ ID No. 206 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16 SEQ ID No. 207 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16 SEQ ID No. 208 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 209 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17 SEQ ID No. 210 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17 SEQ ID No. 211 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17 SEQ ID No. 212 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 213 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18 SEQ ID No. 214 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18 SEQ ID No. 215 Secuencia de nucleótidos que codifica para el mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18 SEQ ID No. 216 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 217 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19 SEQ ID No. 218 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19 SEQ ID No. 219 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19 SEQ ID No. 220 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 221 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20 SEQ ID No. 222 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20 SEQ ID No. 223 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20 SEQ ID No. 224 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 225 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21 SEQ ID No. 226 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21 SEQ ID No. 227 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21 SEQ ID No. 228 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 229 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22 SEQ ID No. 230 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22 SEQ ID No. 231 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22 SEQ ID No. 232 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 233 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23 SEQ ID No. 234 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23 SEQ ID No. 235 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23 SEQ ID No. 236 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 237 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24 SEQ ID No. 238 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24 SEQ ID No. 239 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24 SEQ ID No. 240 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 241 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25 SEQ ID No. 242 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25 SEQ ID No. 243 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25 SEQ ID No. 244 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No. 245 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26 SEQ ID No. 246 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26 SEQ ID No. 247 Secuencia de nucleótidos que c o d if ic a p a ra m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 26 SEQ ID No. 248 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 249 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27 SEQ ID No. 250 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27 SEQ ID No. 251 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27 SEQ ID No. 252 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 253 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28 SEQ ID No. 254 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28 SEQ ID No. 255 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28 SEQ ID No. 256 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 257 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29 SEQ ID No. 258 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29 SEQ ID No. 259 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29 SEQ ID No. 260 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 261 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30 SEQ ID No. 262 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30 SEQ ID No. 263 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30 SEQ ID No. 264 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 265 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31 SEQ ID No. 266 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31 SEQ ID No. 267 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31 SEQ ID No. 268 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 269 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32 SEQ ID No. 270 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32 SEQ ID No. 271 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32 SEQ ID No. 272 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 32

SEQ ID No. 273 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33 SEQ ID No. 274 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33 SEQ ID No. 275 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33 SEQ ID No. 276 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 277 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34 SEQ ID No. 278 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34 SEQ ID No. 279 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34 SEQ ID No. 280 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 281 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35 SEQ ID No. 282 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35 SEQ ID No. 283 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35 SEQ ID No. 284 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

S E Q ID N o .285 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 36 SEQ ID No.286 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36 SEQ ID No.287 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36 SEQ ID No.288 Secuencia de aminoácidos de mutante de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 289 Secuencia de nucleótidos que codifica para calreticulina de Homo sapiens silvestre

SEQ ID No. 290 Secuencia de aminoácidos de calreticulina de Homo sapiens silvestre

SEQ ID No. 291 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1

SEQ ID No. 292 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1

SEQ ID No. 293 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1

SEQ ID No. 294 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 1 SEQ ID No. 295 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2

SEQ ID No. 296 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2

SEQ ID No. 297 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2

SEQ ID No. 298 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 2 SEQ ID No. 299 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3

SEQ ID No. 300 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3

SEQ ID No. 301 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3

SEQ ID No. 302 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 3 SEQ ID No. 303 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4

SEQ ID No. 304 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4

SEQ ID No. 305 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4

SEQ ID No. 306 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 4 SEQ ID No. 307 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5

SEQ ID No. 308 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5

SEQ ID No. 309 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5

SEQ ID No. 310 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 5 SEQ ID No. 311 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 6

S E Q ID N o . 312 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 6

S E Q ID N o . 313 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 6

SEQ ID No. 314 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 6

SEQ ID No. 315 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 316 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 317 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 318 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 7

SEQ ID No. 319 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 320 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 321 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 322 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 8

SEQ ID No. 323 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 324 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 325 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 326 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 9

SEQ ID No. 327 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 328 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 329 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 330 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 10

SEQ ID No. 331 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

SEQ ID No. 332 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

SEQ ID No. 333 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

SEQ ID No. 334 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 11

SEQ ID No. 335 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 336 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

SEQ ID No. 337 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 12

S E Q ID N o . 338 S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 12

SEQ ID No. 339 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 340 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 341 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 342 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 13

SEQ ID No. 343 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 344 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 345 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 346 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 14

SEQ ID No. 347 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 348 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 349 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 350 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 15

SEQ ID No. 351 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 352 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 353 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 354 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 16

SEQ ID No. 355 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 356 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 357 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 358 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 17

SEQ ID No. 359 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 360 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 361 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 362 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 18

SEQ ID No. 363 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

S E Q ID N o . 364 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 19

SEQ ID No. 365 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 366 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 19

SEQ ID No. 367 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 368 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 369 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 370 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 20

SEQ ID No. 371 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 372 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 373 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 374 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 21

SEQ ID No. 375 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 376 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 377 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 378 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 22

SEQ ID No. 379 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 380 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 381 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 382 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 23

SEQ ID No. 383 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 384 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 385 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 386 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 24

SEQ ID No. 387 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No. 388 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

S E Q ID N o . 389 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 25

SEQ ID No. 390 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 25

SEQ ID No. 391 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 392 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 393 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 394 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 26

SEQ ID No. 395 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 396 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 397 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 398 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 27

SEQ ID No. 399 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 400 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 401 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 402 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 28

SEQ ID No. 403 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 404 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 405 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 406 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 29

SEQ ID No. 407 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 408 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 409 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 410 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 30

SEQ ID No. 411 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 412 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 413 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

SEQ ID No. 414 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 31

S E Q ID N o . 415 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 32

S E Q ID N o . 416 S e c u e n c ia d e n u c le ó tid o s q u e c o d if ic a p a ra m u ta n te d e e x ó n 9 d e c a lre t ic u lin a d e H o m o sa p ie n s t ip o 32

SEQ ID No. 417 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 32

SEQ ID No. 418 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 32 SEQ ID No. 419 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 420 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 421 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33

SEQ ID No. 422 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 33 SEQ ID No. 423 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 424 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 425 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34

SEQ ID No. 426 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 34 SEQ ID No. 427 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

SEQ ID No. 428 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

SEQ ID No. 429 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35

SEQ ID No. 430 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 35 SEQ ID No. 431 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 432 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 433 Secuencia de nucleótidos que codifica para mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36

SEQ ID No. 434 Secuencia de aminoácidos de mutante de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens tipo 36 SEQ ID No. 435 Secuencia de nucleótidos que codifica para exón 9 de calreticulina de Homo sapiens silvestre SEQ ID No.436 Secuencia de aminoácidos de exón 9 de calreticulina de Homo sapiens silvestre

La siguiente tabla proporciona una visión general de las SEQ ID NO proporcionadas y usadas en el presente documento.

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Claims

REIVINDICACIONES

i . Composición de vacuna que comprende

(i) un fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 que comprende o consiste en de 15 a 40 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4; y

(ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que el fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 comprende o consiste en de 25 a 40 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4.
3. Composición de vacuna según la reivindicación 1 ó 2, en la que el fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 comprende o consiste en 36 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4.
4. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el portador farmacéuticamente aceptable se selecciona del grupo que consiste en disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la adsorción.
5. Composición de vacuna según la reivindicación 4, en la que los diluyentes se seleccionan del grupo que consiste en agua, solución salina, dextrosa, etanol y glicerol.
6. Composición de vacuna según la reivindicación 4 ó 5, en la que los agentes isotónicos se seleccionan del grupo que consiste en cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa.
7. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que los adyuvantes se seleccionan del grupo que consiste en sales minerales, agentes tensioactivos y micropartículas, productos bacterianos, citocinas y hormonas, polianiones, poliacrílicos, portadores, emulsiones de aceite en agua y emulsiones de agua en aceite.
8. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que el portador farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.
9. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que se formula de modo que puede administrarse a pacientes mediante inyección en una dosis de 0,1 a 5 ml.
10. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el fragmento de la proteína mostrada en SEQ ID NO: 4 se produce de manera recombinante o sintética.
11. Composición de vacuna según la reivindicación 1 ó 2, en la que el portador farmacéuticamente aceptable es un adyuvante, en la que el adyuvante es una emulsión de agua en aceite.
12. Composición de vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su uso en el tratamiento de una malignidad mieloide.
13. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 12, en la que la malignidad mieloide se selecciona del grupo que consiste en neoplasia mieloproliferativa, síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda.
14. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 13, en la que la neoplasia mieloproliferativa es mielofibrosis primaria (PMF) o trombocitemia esencial (ET).
15. Composición de vacuna para su uso según la reivindicación 13, en la que el síndrome mielodisplásico es anemia refractaria con sideroblastos en anillo y trombocitemia (RARS-T).