RU2679653C1 - Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе - Google Patents

Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе Download PDF

Info

Publication number
RU2679653C1
RU2679653C1 RU2018128269A RU2018128269A RU2679653C1 RU 2679653 C1 RU2679653 C1 RU 2679653C1 RU 2018128269 A RU2018128269 A RU 2018128269A RU 2018128269 A RU2018128269 A RU 2018128269A RU 2679653 C1 RU2679653 C1 RU 2679653C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
jak2
mpl
calr
mutations
probes
Prior art date
Application number
RU2018128269A
Other languages
English (en)
Inventor
Игорь Алексеевич Ольховский
Марина Александровна Столяр
Алексей Сергеевич Горбенко
Original Assignee
Общество с ограниченной ответственностью "Формула гена"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Общество с ограниченной ответственностью "Формула гена" filed Critical Общество с ограниченной ответственностью "Формула гена"
Priority to RU2018128269A priority Critical patent/RU2679653C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2679653C1 publication Critical patent/RU2679653C1/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для диагностики выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований. Предложен набор, содержащий специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды. Праймеры имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-): JAK2-W-F, JAK2-W-R, JAK2-W-P, JAK2-M-F, JAK2-M-R, JAK2-M-P, CALR-l-F, CALR-l-R, MPL-K-F, MPL-K-R, CALR-1-P, MPL-K-P, CALR-2-F, CALR-2-R, MPL-L-F, MPL-L-R, CALR-2-P, MPL-L-P. В TaqMan зондах на 5' конце применяют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX). Для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце. Также предложен способ диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающий проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Группа изобретений позволяет проводить одновременное исследование нескольких мутаций в одной аналитической серии, что приводит к результату в более короткие сроки. А также обеспечивает точную диагностику хронических Ph-негативных миелопролиферативных опухолей, позволяет выявлять группу пациентов с наличием сочетанных патогенетических мутаций. 2 н.п. ф-лы, 3 ил., 3 табл., 1 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, в том числе к диагностике онкогематологических заболеваний и предназначено для использования при проведении молекулярно-генетических исследований в клинико-диагностических лабораториях с целью диагностики хронических Ph-негативных миелопролиферативных новообразований.
В соответствии с клиническими рекомендациями [Barbui Т., Thiele J., Gisslinger Н., Finazzi G., Vannucchi A.M, Tefferi A. The 2016 revision of WHO classification of myeloproliferative neoplasms: Clinical and molecular advances. Blood Reviews, 2016. 30: 453-459] основным диагностическим критерием для постановки диагноза Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, а именно истинной полицитемии (ИП), эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) и первичного миелофиброза (ПМФ) является выявление одной из пяти наиболее частых патогенетических соматических мутаций в генах янускиназы-2 (V617F JAK2), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143del и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515К).
Известен алгоритм лабораторной диагностики хронических миелопролиферативных новообразований [Ольховский И.А., Горбенко А.С., Субботина Т.Н., Столяр М.А. Современные возможности молекулярно-генетического анализа в диагностике хронических миелоидных опухолей. Медицинский алфавит, 2015. Т.4 (18): 44-46], который включает последовательное выполнение молекулярно-генетических тестов выявления отдельных мутаций. В лабораторной практике используется алгоритм, учитывающий частоту выявляемых мутаций: вначале выполняется тест на наличие мутации V617F JAK2, при его отрицательном результате - выполняют тест на мутации в гене кальретикулина (CALR 1 и 2 типов), а при их отрицательном значении - определяют мутации гена рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K). Выявление хотя бы одной из мутаций считается достаточным основанием для подтверждения диагноза и последующего молекулярно-генетического исследования других более редких патогенетических мутаций как правило не проводится.
Вместе с тем, имеются данные о достаточно частом одновременном сочетании разных патогенетически важных соматических мутаций у одного пациента и предлагается выделять их в отдельную клиническую группу, отличающуюся прогнозом развития заболевания и ответом на терапию [Ahmed RZ, Rashid М, Ahmed N, Nadeem M, Shamsi TS. Coexisting JAK2V617F and CALR Exon 9 Mutations in Myeloproliferative Neoplasms - Do They Designate a New Subtype? Asian Рас J Cancer Prev. 2016; 17(3):923-6].
Поскольку существующие наборы реагентов для выполнения наиболее распространенных в практике клинико-диагностических лабораторий методов детекции мутаций на основе реакции полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени предусматривают возможность проведения исследования только мутаций в отдельных генах, выполнение полного лабораторного тестирования занимает достаточно большой промежуток времени. При этом продолжительность (время проведения) стандартной для медицинских лабораторий ПЦР превышает 3 часа.
Известно одновременное исследование всех возможных мутаций в ДНК с использованием методов секвенирования ДНК [Langabeer SE, Andrikovics Н, Asp J, et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms. Eur J Haematol. 2015, 95:270-279] и микрочипов
(https://tools.mermofisher.com/content/sfs/brochures/genomewide_snp6_datasheet.pdf).
Однако, требования к оборудованию и квалификации персонала, а также высокая трудоемкость выполнения и стоимость тестирования осложняет широкое использование данных методов в реальной практике клинико-диагностических лабораторий.
Известен способ, который заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченных проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд [RU, п. 2445373, МПК C12Q1/68, опубл. 20.03.2012 г., бюл. №8].
Недостатки способа заключаются в невозможности проведения мультиплексной реакции в виду использования одного флуоресцентного зонда общего для двух анализируемых аллелей.
Наиболее близким набором реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, к заявляемому набору в группе изобретений, являются наборы реактивов, предлагаемые фирмой ООО «Генотехнология» для выявления мутации V617F в гене JAK2, мутаций 1 и 2 типа в гене CALR и мутаций W515L и W515K в гене MPL (http://www.genetechnology.ru/?q=node/98). (прототип).
Однако данные наборы позволяют выявлять эти мутации только в отдельных генах и в разных постановках ПЦР с помощью разных наборов, что существенно увеличивает время проведения анализа и затраты на его выполнение.
Наиболее близким способом к заявляемому способу в группе изобретений по совокупности признаков является способ диагностики вирусного иммунодефицита крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием набора для выявления ДНК провируса иммунодефицита крупного рогатого скота содержащего пару специфичных праймеров и ДНК-зонд, следующего состава (5'-3'-): pf-TAGGGTAGTGGGATCTCAGAAATC, pr-ACATCCGTAACATCTCCTACCATC, z-GAGGATGGTAGGAGATGTTACGGAT, при этом реакционную смесь готовят путем смешения буфера 10-кратного для ПЦР - 2,5 мкл, дНТФ (25 мМ) - 0,2 мкл, праймеров pf и рr (10 пмоль/мкл) по 1 мкл, зонда z (10 пмоль/мкл) - 0,5 мкл, Taq полимеразы (5 ед./мкл) - 0,2 мкл, MgCl2 (50 мМ) - 2 мкл, бидистиллированной воды - 7.6 мкл, а амплификацию проводят в следующем режиме: денатурация-95°С-5 мин, циклирование: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 10 раз, циклирование 2 с детекцией: денатурация (95°С - 20 с) - отжиг (55°С - 20 с) - элонгация (72°С - 20 с), причем цикл денатурация - отжиг - элонгация повторяется 25 или 30 раз, при этом флуоресценцию измеряют по каналу Orange при температуре 55°С, и пересечение кривой флуоресценции линии threshold, установленной на уровне 30% от максимального уровня флуоресценции в последнем цикле амплификации, свидетельствует о наличии в образце провируса BIV, причем, чем меньше значение показателя «Ct», тем выше количество провируса BIV в исследуемом образце, в то время как отсутствие пересечения кривой флуоресценции линии threshold свидетельствует об отсутствии провируса BIV в образце [RU, 2595373, МПК C12N 15/49, C12Q 1/68, опубл. 27.08.2016 г., бюл. №24 (прототип)].
Недостаток этого способа заключается в том, что он предусматривает возможность выявления только одной искомой последовательности ДНК.
Задача изобретения - разработка набора реактивов для мультиплексного ПЦР анализа, а также ускоренного и экономичного способа диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований на его основе.
Техническим результатом достигаемым заявляемой группой изобретений является изготовление набора реактивов для мультиплексного ПЦР анализа, сокращение рабочего времени на выполнение лабораторных тестов и экономии расходных материалов.
Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту набор реактивов достигается тем, что в наборе реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, содержащем специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, новым является то, что он имеет следующий нуклеотидный состав (5-3'-):
Figure 00000001
в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце применяют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце.
Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту способу достигается тем, что в способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающем проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буфера, дНТФ, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы, MgCI2 и воды в оптимальных объемах и последующую амплификацию, новым является то, что используют мультиплексный вариант полимеразной цепной реакции, с участием специфичных праймеров и зондов имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):
Figure 00000002
Figure 00000003
а амплификацию проводят в следующем режиме: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд, отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз, результат признают положительным, если значение порогового цикла (Ct) для образца не больше 32.
Заявляемая группа изобретений соответствует требованию единства изобретения, поскольку группа разнообъектных изобретений образует единый изобретательский замысел, причем один из заявляемых объектов - набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предназначен для использования в другом - способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, при этом оба объекта группы изобретений направлены на решение одной и той же задачи с получением единого технического результата.
Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков для каждого из заявляемых объектов группы, изложенных в формулах. Следовательно, каждый из объектов группы изобретений соответствует критерию «новизна».
Из литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о способе мультиплексного ПЦР-анализа и (или) наборе реактивов для одновременного выявления отдельных патогенетических соматических мутаций V617F, с. 1092_1143del, c. 1154_1155insTTGTC, W515L, W515K в генах JAK2, CALR и MPL соответственно, которые были бы идентичны заявляемым, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов:
На фиг. 1 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы без соматических мутаций.
На фиг. 2 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы с одной из пяти соматических мутаций.
На фиг. 3 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы одновременно с двумя соматическим мутациями.
Способ осуществляется следующим образом.
Образцы крови получают из локтевой вены и стабилизируются раствором ЭДТА К2 или 3,8% раствором цитрата натрия в объемном отношении 9:1. В процессе исследования кровь сохраняют в закрытых пластиковых пробирках при комнатной температуре, с соблюдением общепринятых мер предосторожности при работе с клетками крови. В качестве материала для исследования также возможно использование образцов крови в виде сухих капель на целлюлозном носителе, например, на бумаге типа ватман. В этом случае, для выделения ДНК использовали вырезанные фрагменты, пропитанные кровью, на пощади от 0,2 см2. Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови человека и из сухих пятен крови проводится стандартными методами, обеспечивающими выделение ДНК в количестве не менее 40 нг на один образец.
Далее с полученными образцами ДНК проводят мультиплексную ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанного набора, содержащего четыре реакционных смеси: №1 (JAK2-W), №2 (JAK2-M), №3 (С ALR1+MPL-K), №4 (CALR2+MPL-L), Taq-полимеразу, положительный контрольный образец (ПКО) и отрицательный контрольный образец (ОКО). ПКО представляет собой человеческую геномную ДНК с наличием мутантных аллелей всех исследуемых генов. ОКО представляет собой человеческую геномную ДНК здорового донора, не имеющего мутаций в исследуемых генах.
Figure 00000004
Указанные в таблице 1 реакционные смеси входящие в состав набора включают специфичные праймеры и зонды:
Реакционная смесь №1 используется для контроля прохождения реакции и качества выделенной ДНК, содержит праймеры JAK2-W-F, JAK2-W-R и зонд JAK2-W-P;
Реакционная смесь №2 содержит праймеры JAK2-M-F, JAK2-M-R и зонд JAK2-M-P
Реакционная смесь №3 содержит праймеры CALR-l-F, CALR-l-R, MPL-K-F, MPL-K-R и зонды CALR-1-P, MPL-K-P;
Реакционная смесь №4 содержит праймеры CALR-2-F, CALR-2-R, MPL-L-F, MPL-L-R и зонды CALR-2-P, MPL-L-P.
Праймеры и зонды подбирали с использованием программы «Primer 3». Подобранные последовательности были проанализированы в GenBank с помощью программы BLAST (таблица 2). По итогам анализа не было обнаружено последовательностей в геноме человека, гомологичных подобранным праймерам и зондам.
Figure 00000005
Примечание: Tm - температура плавления
Пример:
Мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят в смеси объемом 25 мкл на 1 пробу ДНК. Для каждого анализируемого образца ДНК пациента готовят 4 пробирки, в которые вносят реакционные смеси соответствующие номеру пробирки (таблица 1). В каждую пробирку добавляют Taq-полимеразу (5 ед/мкл) в объеме 0.2 мкл, а затем ДНК исследуемого образца с концентрацией не менее 40 нг в объеме 10 мкл. При каждом исследовании необходимо использовать две дополнительные пробирки в которые вместо ДНК вносят контрольные образцы ОКО и ПКО.
Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «CFX96» («Bio-Rad», США) следующий: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд и отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз.
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией к прибору (фиг. 1-3). Необходимо определять пороговый цикл (Ct) для каждой пробирки. Результат признают положительным в случае, если значение Ct для данного образца было не больше 32. Расчет количества мутантного аллеля осуществляют по формуле:
1. для мутации V617F в гене JАК2:
аллельная нагрузка =
Figure 00000006
2. для мутаций 1 и 2 типа в гене CALR и мутаций W515L, W515К в гене MPL:
аллельная нагрузка =
Figure 00000007
где
CtJAK2M - пороговый цикл мутантного аллеля JAK2;
CtJAK2WT - пороговый цикл аллеля дикого типа JAK2;
X - пороговый цикл одного из мутантных аллелей - CALR 1 типа, CALR 2 типа, MPL W515L, MPL W515K.
Кривые накопления флуоресцентного сигнала для образца, не содержащего ни одной из анализируемых мутаций, имеют вид, представленный на фиг. 1. На фиг. 2 представлены кривые для образца с одной соматической мутацией, в данном случае с мутацией CALR 1 типа. На фиг. 3 представлены кривые интенсивности флуоресценции для образца с двумя одновременно выявленными соматическими мутациями - JAK2 V617F и MPL W515L. Во всех примерах - по оси Х - указаны циклы амплификации, по оси У - уровень флюоресценции освобождающегося в реакции продукта амплификации
Проведенные нами исследования позволили разработать два сочетания четырех праймеров и двух TaqMan-зондов для выявления: мутаций CALR 1 тип + MPL W515K и CALR 2 тип + MPL W515L. При этом для идентификации мутантного гена (CALR или MPL) можно использовать TaqMan-зонды с разными флуоресцентными метками. Для выявления дикого (JAK2-W) и мутантного аллеля (JAK2-M) JAK2 были разработаны две соответствующие реакционные смеси, содержащие по два праймера и по одному TaqMan-зонду.
Была проведена сравнительная оценка результатов, полученных с помощью заявляемого способа с использованием заявляемого набора, с результатами, полученными с использованием праймеров, зондов и условий проведения ПЦР-РВ, описанных в следующих статьях:
1. Коммерческий набор фирмы НПО «Генотехнология»
2. Pancrazzi A, Guglielmelli Р, Ponziani V, et al. A Sensitive Detection Method for MPLW515L or MPLW515K Mutation in Chronic Myeloproliferative Disorders with Locked Nucleic Acid-Modified Probes and Real-Time Polymerase Chain Reaction. The Journal of Molecular Diagnostics. 2008; 10(5):435-441.
3. Chi J, Nicolaou KA, Nicolaidou V, et al. Calreticulin gene exon 9 frameshift mutations in patients with thrombocytosis. Leukemia. 2014; 28(5):1152-1154.
Параллельный анализ 20 образцов клинического материала от человека, установил, что во всех образцах совпали положительные результаты ПЦР (таблица 3).
Figure 00000008
Figure 00000009
Figure 00000010
Преимуществом заявляемого изобретения является то, что разработанный набор реактивов и использование мультиплексной ПЦР позволяют проводить одновременное исследование нескольких мутаций в одной аналитической серии, с использованием стандартного оборудования клинико-диагностических лабораторий и имеющегося уровня квалификации персонала. А одновременное выполнение тестирования нескольких мутаций методом мультиплексной ПЦР в реальном времени позволяет получить результат в более короткие сроки, а также способствует более точной диагностике хронических Ph-негативных миелопролиферативных опухолей позволяя выявлять группу пациентов с наличием сочетанных патогенетических мутаций.

Claims (6)

1. Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, содержащий специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ тем, что имеет следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):
Figure 00000011
в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце применяют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце.
2.Способ диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающий проведение полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буфера, дНТФ, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы, MgCI2 и воды в оптимальных объемах и последующую амплификацию, ОТЛИЧАЮЩИЙСЯ тем, что используют мультиплексный вариант полимеразной цепной реакции с участием специфичных праймеров и зондов, имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):
Figure 00000012
Figure 00000013
а амплификацию проводят в следующем режиме: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы, включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд, отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз, результат признают положительным, если значение порогового цикла (Ct) для образца не больше 32.
RU2018128269A 2018-08-01 2018-08-01 Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе RU2679653C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018128269A RU2679653C1 (ru) 2018-08-01 2018-08-01 Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2018128269A RU2679653C1 (ru) 2018-08-01 2018-08-01 Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2679653C1 true RU2679653C1 (ru) 2019-02-12

Family

ID=65442836

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2018128269A RU2679653C1 (ru) 2018-08-01 2018-08-01 Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2679653C1 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150079091A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Mutant calreticulin for the diagnosis of myeloid malignancies
RU2655635C1 (ru) * 2017-03-16 2018-05-29 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Способ ранней генетической диагностики риска развития сахарного диабета 2 типа

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150079091A1 (en) * 2013-09-16 2015-03-19 Cemm - Forschungszentrum Für Molekulare Medizin Gmbh Mutant calreticulin for the diagnosis of myeloid malignancies
RU2655635C1 (ru) * 2017-03-16 2018-05-29 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Балтийский федеральный университет имени Иммануила Канта" (БФУ им. И. Канта) Способ ранней генетической диагностики риска развития сахарного диабета 2 типа

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VAN ETTEN R. A. et al. The Ph-positive and Ph-negative myeloproliferative neoplasms: some topical pre-clinical and clinical issues //Haematologica. - 2011. - Т. 96. -. 4. - С. 590-601. *
ДУНАЕВА Е. А. и др. КОМПЛЕКС МЕТОДИК, ОСНОВАННЫХ НА ТЕХНОЛОГИИ ПИРОСЕКВЕНИРОВАНИЯ, ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ Ph-НЕГАТИВНЫХ ХРОНИЧЕСКИХ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ НЕОПЛАЗИЙ //МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2017. - 2017. - С. 155-156. *
МЕЛИКЯН А. Л. и др. Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз) //Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т. 59. - N. 4. *
МЕЛИКЯН А. Л. и др. Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз) //Гематология и трансфузиология. - 2014. - Т. 59. - N. 4. VAN ETTEN R. A. et al. The Ph-positive and Ph-negative myeloproliferative neoplasms: some topical pre-clinical and clinical issues //Haematologica. - 2011. - Т. 96. -. 4. - С. 590-601. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Tully et al. A sensitive denaturing gradient-gel electrophoresis assay reveals a high frequency of heteroplasmy in hypervariable region 1 of the human mtDNA control region
US9029084B2 (en) Polynucleotide primers
CN102534031B (zh) 一种高特异性聋病易感基因检测试剂盒及其应用
CN106119362B (zh) 一种用于检测hla-b*1502等位基因的引物组及试剂盒
CN105441562A (zh) Carl基因缺失、插入突变的检测方法及试剂盒
JPWO2017170644A1 (ja) 遺伝子変異検出法
JPWO2018212247A1 (ja) Ｅｇｆｒ変異非小細胞肺がんにおけるｅｇｆｒチロシンキナーゼ阻害剤の治療奏功性の予測方法
RU2679653C1 (ru) Набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе
US20190345489A1 (en) Reagent for use in assessment of remaining very small lesion of neuroblastoma; and method for analyzing biological sample using same
CN103820543A (zh) Hla-b*15:02等位基因检测方法及其试剂盒
CN102534030B (zh) 4个聋病易感基因联合检测试剂盒及其应用
CN113025619B (zh) 一种hook3-fgfr1新融合基因及其应用和检测试剂盒
CN105950766A (zh) 一种用于检测hla-b*5801等位基因的引物组及试剂盒
RU2802421C1 (ru) Набор реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований и способ диагностики на его основе
CN108546753A (zh) 巴氯芬药物相关基因gabbr1基因多态性检测试剂盒
CN103923981B (zh) Hla-b*27等位基因检测方法及其试剂盒
BR112021013612A2 (pt) Métodos e sistemas para a identificação de atrofia muscular espinhal
CN110551821A (zh) 利用荧光定量pcr检测mef2d基因重排的引物和探针及试剂盒
RU2805864C1 (ru) Способ генотипирования гена TLR8 по полиморфизму rs3764880 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации
RU2805860C1 (ru) Способ генотипирования гена TLR2 по полиморфизму rs3804100 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации
RU2805862C1 (ru) Способ генотипирования гена TLR4 по полиморфизму rs4986790 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации
US20170009301A1 (en) Method for diagnosing hematological disorders
RU2805863C1 (ru) Способ генотипирования гена TLR6 по полиморфизму rs5743810 и набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для его реализации
CN105969895A (zh) 一种使用逆转录pcr检测hla-b*5801基因表达的检测方法及试剂盒
WO2023011624A1 (en) Compositions and methods for fast multiplexed screening and monitoring of npm1 mutations