BR112016004324B1 - Anticorpos anti-csf-1r, vetor e composição farmacêutica - Google Patents
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Abstract
anticorpos a presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-csf-1r e fragmentos de ligação do mesmo, dna que codifica o mesmo, células hospedeiras compreendendo o dito dna e métodos de expressar o anticorpo ou fragmento de ligação em uma célula hospedeira. a presente invenção também se estende às composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo e ao uso do anticorpo, fragmento de ligação e composições compreendendo o mesmo no tratamento.
Description
[0001] A presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-CSF-1R e fragmentos de ligação do mesmo, DNA que codifica o mesmo, células hospedeiras compreendendo o dito DNA e métodos de expressar o anticorpo ou fragmento de ligação em uma célula hospedeira. A invenção também se estende às composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo ou um fragmento de ligação do mesmo e uso do anticorpo, fragmento de ligação e composições compreendendo o mesmo no tratamento.
[0002] O fator estimulador de colônia 1 (CSF-1), também conhecido como fator estimulador de colônia de macrófago (M-CSF) é uma citocina produzida por uma variedade de células, incluindo macrófagos, células endoteliais e fibroblastos. CSF-1 é composto de dois polipeptídeos “monoméricos”, que formam uma proteína de CSF-1 dimérica biologicamente ativa. CSF-1 existe em pelo menos três formas maduras devido à junção de RNA alternativa (ver, Cerretti et al., 1988, Molecular Immunology, 25: 761). As três formas de CSF-1 são traduzidas de precursores de mRNA diferentes, que codificam polipeptídeos monoméricos de 256 a 554 aminoácidos, tendo uma sequência de sinal de 32 aminoácidos no terminal amino e uma região de transmembrana putativa de aproximadamente 23 aminoácidos próximos ao terminal carboxila. Os peptídeos precursores são subsequentemente processados pelas clivagens proteolíticas do terminal amino e terminal carboxila para liberar CSF-1 maduro. Os resíduos 1 a 149 de todas as três formas maduras de CSF-1 são idênticos e acredita-se contenham sequências essenciais para a atividade biológica de CSF-1. Os CSF-1 monoméricos in vivo são glicosilados e dimerizados via ligação de dissulfeto. CSF-1 pertence a um grupo de agonistas biológicos que promovem a produção de células sanguíneas. Especificamente, ele atua como um fator de crescimento e diferenciação para as células progenitoras da medula óssea da linhagem fagocítica mononuclear. Além disso, CSF-1 estimula a sobrevivência, proliferação e função de macrófagos via um receptor específico nas células responsivas.
[0003] O receptor de CSF-1 (CSF-1R) também é aludido como o produto de gene c-fms ou CD115. CSF-1R é uma glicoproteína TM tipo 1 de 165 kDa pertencente à família da tirosina cinase receptora do tipo III. Além do CSF-1, a molécula IL-34 estruturalmente similar mas não relacionada na sequência também foi mostrada ser um ligante para CSF-1R (Lin, et al., 2008, Science 320: 807-811). A expressão de CSF-1R é restrita às células da linhagem de monócito-macrófago, populações teciduais tanto circulantes quanto residentes, e osteóclastos. Além disso, o mesmo é expresso em várias células do sistema reprodutivo feminino incluindo oócitos, células deciduais e trofoblastos.
[0004] A ligação do CSF-1 ligante ao receptor de CSF-1 resulta na fosforilação do receptor em um ou mais resíduos de tirosina, através da ação do domínio da tirosina cinase. Esta fosforilação pode ser detectada porque os anticorpos estão disponíveis que se ligam ao receptor apenas depois da fosforilação (por exemplo anticorpo Fosfo-M-CSF-Receptor (Tyr546) #3083 da Cell Signaling Technology).
[0005] A expressão de CSF-1 e CSF-1R correlaciona-se com a progressão de tumor e diagnóstico insuficiente em muitos tipos de câncer. Os macrófagos associados com tumor (TAMs) pode ser o componente principal do estroma de tumor e os altos níveis de CSF-1 e CSF-1R estão associados com altas infiltrações de TAM e prognóstico insuficiente em vários tipos de tumor.
[0006] Os anticorpos para CSF-1R são conhecidos na técnica. Sherr, C. J. et al., 1989, Blood 73: 1786-1793 descrevem anticorpos contra CSF-1R que inibem a atividade de CSF-1 (Sherr, C.J. et al.,1989, Blood 73: 1786-1793). A WO2009/026303 divulga anticorpos anti-CSF-1R que se ligam ao CSF-1R humano e modelos de tumor de camundongo in vivo usando um anticorpo de CSF-1R anti- murino. A WO2011/123381 divulga anticorpos anti-CSF-1R que internalizam CSF-1R e têm atividade de ADCC. A WO2011/123381 também divulga modelos de tumor de camundongo in vivo usando um anticorpo de CSF-1R anti-murino. A WO2011/140249 divulga anticorpos anti-CSF-1R que bloqueiam a ligação de CSF-1 ao CSF-1R e são estabelecidos ser úteis no tratamento de câncer. A WO2009/112245 divulga um anticorpo de IgG1 anti-CSF-1R que inibe a ligação de CSF-1 ao CSF-1R e é estabelecido ser útil no tratamento de câncer, doença inflamatória intestinal e artrite reumatóide. A WO2011/131407 divulga um anticorpo anti-CSF-1R que inibe a ligação de CSF-1 ao CSF-1R e é estabelecido ser útil no tratamento de perda óssea e câncer. A WO2011/107553 divulga um anticorpo anti- CSF-1R que inibe a ligação de CSF-1 ao CSF-1R considerado ser útil no tratamento de perda óssea e câncer. A WO2011/070024 divulga anticorpos anti-CSF-1R que se ligam ao fragmento delD4do CSF-1R humano.
[0007] Existe uma necessidade na técnica para fornecer novos anticorpos anti- CSF-1R adequados para aplicações terapêuticas. Embora a aplicação terapêutica de anticorpos anti-CSF-1R no tratamento de certos cânceres tenha sido anteriormente descrita, existe ainda uma necessidade para fornecer novas aplicações terapêuticas para tais anticorpos.
[0008] O termo ‘doença fibrótica’ se refere a uma resposta à cicatrização de ferimento aberrante em que tecido conectivo fibroso em excesso é formado em um órgão ou tecido. A deposição e acúmulo de componentes da matriz extracelular em excesso, tais como colágeno e fibronectrina, resulta no endurecimento e cicatrização de tecidos que por fim podem levar à insuficiência do órgão.
[0009] Os exemplos de doenças fibróticas incluem fibrose pulmonar, tal como fibrose pulmonar idiopática e fibrose cística, fibrose renal, fibrose hepática, cirrose hepática, colangite esclerosante primária, cirrose biliar primária, fibrose endomiocardial, fibrose mediastinal, mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose maciça progressiva, fibrose sistêmica nefrogênica, Doença de Crohn, quelóide, infartação miocárdica, esclerose sistêmica, escleroderma e artofibrose.
[0010] Ferimento resulta em uma coagulação imediata e a resposta de coagulação com o desenvolvimento de uma matriz extracelular (ECM) provisória. A agregação e ativação de plaqueta ajuda a promover uma resposta inflamatória caracterizada pela vasodilatação e um aumento na permeabilidade dos vasos sanguíneos permitindo o recrutamento de uma variedade de células imunes incluindo neutrófilos, macrófagos, eosinófilos e linfócitos. Neutrófilos e macrófagos desbridam o ferimento reduzindo deste modo o risco de infeção e junto com os linfócitos ativados secretam uma variedade de fatores de crescimento e citocinas que servem para amplificar ainda mais a resposta inflamatória. moléculas tais como TGFβ, PDGF, IL-13 ativam macrófagos e levam ao recrutamento, proliferação e ativação de fibroblastos no local do ferimento. Os fibroblastos ativados ou miofibroblastos, são caracterizados pela expressão de actina do músculo liso α e secretam colágeno e outros componentes de ECM. Os fibroblastos ativados, contraem a estrutura molecular do colágeno, puxando as bordas do ferimento para o centro. As células epiteliais e endoteliais proliferam e migram sobre a matriz temporária para regenerar o tecido danificado completando o reparo do ferimento.
[0011] O insulto ou lesão persistentes ao tecido ou uma desregulagem do caminho do reparo leva a uma resposta ao ferimento inadequada. A deposição excessiva e hiper reticulação do colágeno e ECM ocorrem resultando na formação excessiva e endurecimento do tecido cicatricial no lugar da arquitetura de tecido normal.
[0012] A causa da doença fibrótica pode ser dependente do órgão ou tecido envolvidos e é desconhecida em algumas doenças tais como fibrose pulmonar idiopática (IPF). A fibrose hepática e por fim a cirrose resultam do dano hepático crônico prolongado através da exposição a uma variedade de fatores incluindo fatores ambientais e dietéticos ou agentes infecciosos. As infecções pelas hepatites B e C de longa duração pode causar a fibrose hepática. O consumo excessivo prolongado de álcool ou uma dieta com alto teor de gordura/açúcar também podem levar à cirrose do fígado. Similarmente, a diabete pode danificar e cicatrizar os rins levando à perda de função.
[0013] IPF é uma de sete doenças pulmonares intersticiais a causa das quais é desconhecida. Fatores ambientais tais como exposição à radiação ou partículas pode desempenhar um papel. Indivíduos que fumam também estão em risco mais alto desta doença. Uma vez diagnosticada, a expectativa de vida dos pacientes é muito curta com a taxa de sobrevivência média sendo de 2 a 5 anos.
[0014] O tratamento de doença fibrótica tipicamente inclui agentes anti- inflamatórios e imunossupressivos mas estes são de pouco benefício para o paciente. A falta de eficácia com estes tratamentos contribuíram para a reconsideração de IPF e doença fibrótica no geral, como uma resposta aberrante à cicatrização de ferimento e não uma condição inflamatória. Pirfenidona é um medicamento de molécula pequena que foi aprovada para o uso no tratamento de IPF no Japão em 2008 e Europa em 2011, que é provável funcionar via mecanismos múltiplos de ação. Até agora, nenhuma das terapias alvejadas e nenhuma das terapias de anticorpo foram aprovadas para indicações fibróticas.
[0015] Portanto, existe correntemente uma necessidade médica não atingida quanto ao tratamento melhorado de doença fibrótica. Por exemplo, para IPF existe uma taxa de sobrevivência de 3 anos de 50 % e uma taxa de sobrevivência de 5 anos de apenas 20 % e transplante é requerido em cerca de 20 % dos casos.
[0016] Sumário da Divulgação
[0017] Em um aspecto é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende pelo menos um de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-H1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-H2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR-H3, por exemplo em que CDR-H1 é a SEQ ID NO: 4, a CDR-H2 é a SEQ ID NO: 5 e a CDR-H3 é a SEQ ID NO: 6.
[0018] Em um aspecto os anticorpos ou fragmentos de ligação de acordo com a presente divulgação compreende uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende pelo menos um de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR- L3, por exemplo em que a CDR-L1 é a SEQ ID NO: 1, a CDR-L2 é a SEQ ID NO: 2 e a CDR-L3 é a SEQ ID NO: 3.
[0019] Os anticorpos da divulgação têm uma alta afinidade para a CSF-1R, são capazes de bloquear a ligação de ligante ao CSF-1R, não são ativadores para o CSF-1R e não causam a internalização de CSF-1R.
[0020] A divulgação também se estende a um polinucleotídeo, tal como DNA, que codifica um anticorpo ou fragmento como aqui descrito.
[0021] Também é fornecida uma célula hospedeira compreendendo o dito polinucleotídeo.
[0022] Métodos de expressar um anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo são aqui fornecidos.
[0023] A presente divulgação também diz respeito às composições farmacêuticas compreendendo os ditos anticorpos ou fragmentos de ligação dos mesmos.
[0024] Em uma forma de realização é fornecido um método de tratamento compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, fragmento ou composição como aqui descritos.
[0025] A presente divulgação também se estende a um anticorpo, fragmento de ligação ou composição de acordo com a presente divulgação para o uso no tratamento, particularmente no tratamento de câncer e/ou doença fibrótica.
[0026] Detalhes da divulgação
[0027] Em uma forma de realização os anticorpos fornecidos pela presente invenção são capazes de bloquear a ligação de ligante ao CSF-1R. Bloquear como aqui utilizado se refere a bloquear fisicamente tal como ocluindo o receptor nas também incluirá onde o anticorpo ou fragmentos se liga a um epítopo que causa, por exemplo uma mudança conformacional que significa que o ligante natural não mais se liga ao receptor (aqui aludido como bloqueio alostérico ou inibição alostérica). Em uma forma de realização os anticorpos da presente divulgação liga todos os isótipos de CSF-1R, por exemplo aqueles com variações no domínio ECD, tais como V23G, A245S, H247P, V279M e combinações de dois, três ou quatro das ditas variações.
[0028] Os ensaios adequados para determinar a capacidade de um anticorpo para bloquear CSF-1R são descritos nos Exemplos aqui. CSF-1 e IL-34 são ambos ligantes para a CSF-1R e os anticorpos da invenção preferivelmente inibem a atividade tanto de CSF-1 quanto de IL-34 em um cenário celular funcional. Os anticorpos de acordo com a presente invenção também preferivelmente não causam a ativação de CSF-1R e/ou internalização de CSF-1R. Os anticorpos de acordo com a presente invenção também de modo preferivelmente seletivo esgotam a população não clássica de monócitos in vivo.
[0029] Os monócitos não clássicos no geral se referem aos monócitos com baixa expressão de CD14 e alta expressão de CD16. Esta população de monócitos é considerada ser precursora de macrófagos associado a tumor.
[0030] As moléculas de anticorpo da presente invenção adequadamente têm uma alta afinidade de ligação. A afinidade pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo técnicas tal como ressonância de plasmônica superficial, por exemplo BIAcore, como descrito nos Exemplos aqui, usando CSF-1R natural ou recombinante isolado ou uma proteína/polipeptídeo de fusão adequada. Em um exemplo, a afinidade é medida usando domínio extracelular de CSF-1R humano recombinante como descrito nos Exemplos aqui. Em um exemplo o domínio extracelular de CSF-1R humano recombinante usado é um monomérico. Adequadamente, as moléculas de anticorpo da presente invenção têm uma afinidade de ligação para o CSF-1R humano isolado de cerca de 1 nM ou menos do que 1 nM. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 500 pM ou mais baixa. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 250 pM ou mais baixa. Em uma forma de realização a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de cerca de 200 pM ou mais baixa. Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo anti-CSF-1R com uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou mais baixa. Em uma forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo anti-CSF-1R humanizado com uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou mais baixa, preferivelmente de cerca de 10 pM ou mais baixa, mais preferivelmente de cerca de 5 pM ou mais baixa. Em uma outra forma de realização a presente invenção fornece um anticorpo anti-CSF-1R humanizado com uma afinidade de ligação de cerca de 100 pM ou mais baixa, preferivelmente de cerca de 10 pM ou mais baixa, mais preferivelmente de cerca de 5 pM ou mais baixa.
[0031] Quanto mais baixo o valor numérico da afinidade mais alta a afinidade do anticorpo ou fragmento para o antígeno.
[0032] O CSF-1R humano como aqui utilizado se refere ao nome da proteína humana CSF-1R ou um fragmento biológico ativo da mesma, por exemplo como dada na SEQ ID NO: 39 ou registrada no UniProt sob o número P07333. Naturalmente a proteína madura expressada não compreende a sequência de sinal porque a última é clivada após a tradução.
[0033] Os presentes inventores forneceram novos anticorpos anti-CSF-1R, incluindo anticorpos humanizados. Os anticorpos foram gerados a partir da imunização de ratos com fibroblastos de rato que foram transfectados com um vetor expressando o domínio extracelular de CSF-1R. A triagem primária de sobrenadantes para a ligação de anticorpo de CSF-1R humano identificou aproximadamente 1000 reservatórios contendo anticorpo com atividade anti-CSF- 1R. A triagem secundária para anticorpos capazes de prevenir a ligação humana de CSF-1 ao CSF-1R humano identificou 88 reservatórios positivos. A triagem terciária para anticorpos capazes de prevenir a sobrevivência dependente de CSF-1 de monócitos humanos primários identificaram 18 reservatórios positivos. As regiões variáveis destes 18 reservatórios positivos foram clonados, que levam à clonagem bem sucedida de 14 anticorpos e a expressão subsequente forneceu 9 anticorpos anti-CSF-1R quiméricos que expressaram em níveis suficientes e foram capazes de inibir a ligação de CSF-1. Estes 9 anticorpos foram sequenciados e descobriu-se que todos tinham sequências únicas e foram usados para estudo adicional.
[0034] Os 9 anticorpos anti-CSF-1R quiméricos foram avaliados quanto à atividade de bloqueio de ligante e a capacidade para inibir CSF-1 e A sobrevivência de monócito mediada por IL-34. Quatro dos anticorpos foram priorizados para investigação adicional porque eles demonstraram a inibição completa da ligação de CSF-1 e altos níveis de inibição da sobrevivência de monócito. Estes 4 anticorpos anti-CSF-1R quiméricos foram testados quanto à sua atividade em vários ensaios in vitro para avaliar a afinidade, inibição da ligação de CSF-1, reatividade cruzada com CSF-1R de macaco rhesus, macaco cinomolgo e canino, internalização de CSF-1R e ativação de CSF-1R. Os quatro anticorpos anti-CSF-1R foram também humanizados e a afinidade dos enxertos humanizados foi medida. A humanização de dois dos anticorpos anti-CSF-1R gerou anticorpos totalmente humanizados (nenhum resíduo de doador de rato presente) com afinidade (KD) equivalente ao anticorpo quimérico precursor e uma Tm que indica o anticorpo tendo estabilidade térmica adequada. Ao contrário, os outros dois anticorpos anti-CSF-1R humanizados tiveram uma afinidade reduzida para a CSF-1R, relativa ao anticorpo quimérico, e a Tm foi mais baixa. Por estas razões, apenas os enxertos totalmente humanizados de dois dos anticorpos que retiveram afinidade foram expressados em uma escala maior para análise adicional.
[0035] A análise adicional dos enxertos totalmente humanizados destes dois anticorpos foi realizada e um ensaio de inibição de MCP-1, onde a inibição da sinalização de CSF-1R pelo anticorpo que bloqueia a ligação de CSF-1 causou uma redução nos níveis de secreção de MCP-1. Este ensaio surpreendentemente revelou que os enxertos totalmente humanizados exibiram atividade reduzida comparada ao anticorpo quimérico. Uma série de experimentos em um dos anticorpos preferidos, denominado Ab969, foi realizada para revelar porque o enxerto totalmente humanizado exibiu esta atividade reduzida. Vários enxertos humanizados intermediários de Ab969 foram gerados e testaram no ensaio de inibição de MCP-1. Foi descoberto que os enxertos que contiveram o resíduo doador da cadeia leve variável Y71 no geral mostrou atividade no ensaio de inibição de MCP-1 comparável com aquele do Ab969 quimérico. Foi levantada a hipótese de que esta diferença na atividade dos vários enxertos de anticorpo no ensaio de inibição de MCP-1 foi devido a uma mudança na taxa de associação do anticorpo (Ka diminuída) comparada ao Ab969 quimérico.
[0036] A comparação da análise de estabilidade térmica de Ab969 com outros anticorpos anti-CSF-1R por exemplo, o anticorpo anti-CSF-1R Ab970, sugere que Ab969 pode ser mais estável.
[0037] Outra análise biofísica de enxertos humanizados de Ab969 revelou que alguns enxertos precipitaram quando o anticorpo foi concentrado. Foi mostrado que uma substituição do resíduo de lisina na posição 38 na cadeia leve, por exemplo glutamina, levou a uma estabilidade física melhorada.
[0038] Consequentemente, um enxerto de anticorpo de Ab969, Ab969.g2 (também aludido como Ab969, foi selecionado para outros estudos de caracterização in vitro. Além da afinidade de ligação alta vantajosa ao CSF-1R, alta estabilidade térmica e alta estabilidade física o anticorpo demonstrou boa inibição de ativação de monócito dependente de IL-34 e também foi descoberto ser capaz de ligar às variantes SNP de CSF-1R. Ab969.g2 também foi usado para a análise de marcadores farmacodinâmicos em um macaco cinomolgo onde o mesmo foi mostrado ligar CSF-1R, bloquear a ligação de CSF-1 e seletivamente esgotar a população não clássica de monócitos de macaco cinomolgo in vivo, que são células precursoras de macrófagos associados a tumor.
[0039] Consequentemente, em uma forma de realização, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo uma cadeia pesada e/ou uma cadeia leve, em que a cadeia pesada e/ou cadeia leve compreendem pelo menos uma CDR derivada do anticorpo anti-CSF-1R 969,2.
[0040] O Ab969,2 é uma molécula IgG4 humanizada de tamanho natural; a cadeia leve compreende uma região constante da cadeia capa humana (alotipo Km3) e a cadeia pesada compreende uma região constante da cadeia pesada gama 4 humana com a mutação de estabilização de dobradiça S241P (Angal et al., 1993). Um motivo de isomerização DG potencial está presente dentro da região variável de cadeia leve na junção de CDR-L2 e a armação. As sequências das cadeias pesada e leve do anticorpo inteiro Ab969,2 são mostradas nas SEQ ID NOs: 27 e 19.
[0041] Os resíduos nos domínios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados de acordo com um sistema inventado por Kabat et al., 1987. Este sistema é apresentado em Kabat et al., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (a seguir “Kabat et al. (supra)”). Este sistema de numeração é usado no presente relatório descritivo exceto onde de outro modo indicado.
[0042] As designações de resíduo de Kabat nem sempre corresponde diretamente com a numeração linear dos resíduos de aminoácido. A sequência de aminoácido linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais do que na numeração de Kabat estrita correspondendo a um encurtamento de, ou inserção dentro, um componente estrutural, que na armação ou região determinadora de complementaridade (CDR), da estrutura de domínio variável básica. A numeração de Kabat correta dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo pelo alinhamento dos resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada por Kabat “padrão”.
[0043] As CDRs do domínio variável de cadeia pesada estão localizadas nos resíduos 31 a 35 (CDR-H1), resíduos 50 a 65 (CDR-H2) e resíduos 95 a 102 (CDR- H3) de acordo com o sistema de numeração de Kabat. entretanto, de acordo com Chothia (Chothia, C. e Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), a alça equivalente a CDR-H1 se estende do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim a menos que de outro modo indicado ‘CDR-H1’ como aqui utilizado é intencionado a se referir aos resíduos 26 a 35, como descrito por uma combinação do sistema de numeração de Kabat e definição de alça topológica de Chothia.
[0044] As CDRs do domínio variável de cadeia leve estão localizadas nos resíduos 24 a 34 (CDR-L1), resíduos 50 a 56 (CDR-L2) e resíduos 89 a 97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0045] Os anticorpos para o uso na presente divulgação podem ser obtidos usando qualquer método adequado conhecido na técnica. O polipeptídeo/proteína CSF-1R incluindo proteínas de fusão, células (recombinante ou naturalmente) que expressam o polipeptídeo podem ser usados para produzir anticorpos que especificamente reconhecem CSF-1R. O polipeptídeo pode ser o polipeptídeo ‘maduro’ ou um fragmento biologicamente ativo ou derivado do mesmo. A proteína humana é registrada no UniProt sob o número P07333.
[0046] Os polipeptídeos, para o uso para imunizar um hospedeiro, podem ser preparados pelos processos bem conhecidos na técnica a partir de células hospedeiras geneticamente engendradas compreendendo sistemas de expressão ou podem ser recuperados de fontes biológicas naturais. No presente pedido, os termos “polipeptídeos” incluem peptídeos, polipeptídeos e proteínas. Estes são usados intercambiavelmente a menos que de outro modo especificado. O polipeptídeo CSF-1R pode em alguns casos ser parte de uma proteína maior tal como uma proteína de fusão por exemplo fundido a um rótulo de afinidade ou similar.
[0047] Os anticorpos gerados contra o polipeptídeo CSF-1R podem ser obtidos, onde a imunização de um animal é necessária, pela administração dos polipeptídeos a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando protocolos bem conhecidos e de rotina, ver por exemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Muitos animais de sangue quente, tais como coelhos, camundongos, ratos, ovelha, vacas, camelos ou porcos podem ser imunizados. entretanto, camundongos, coelhos, porcos e ratos são geralmente mais adequados.
[0048] Os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na técnica tal como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4: 72) e a técnica de EBV- hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc.).
[0049] Os anticorpos também podem ser gerados usando métodos de anticorpo linfocítico único pela clonagem e expressão de cDNAs da região variável da imunoglobulina gerados a partir de linfócitos únicos selecionados para a produção de anticorpos específicos, por exemplo, pelos métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848; WO92/02551; WO04/051268 e Pedido de Patente Internacional número WO04/106377.
[0050] A triagem de anticorpos pode ser realizada usando ensaios para medir a ligação ao CSF-1R humano e/ou ensaios para medir a capacidade para bloquear a ligação de ligante ao receptor. Os exemplos de ensaios adequados são descritos nos Exemplos aqui.
[0051] Específico como aqui utilizado é intencionado a se referir a um anticorpo que apenas reconhece o antígeno ao qual o mesmo é específico ou um anticorpo que tem significantemente afinidade de ligação maior para o antígeno para o qual o mesmo é específico comparado com a ligação aos antígenos para os quais o mesmo não é específico, por exemplo afinidade de ligação pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 vezes mais alta.
[0052] As sequências de aminoácido e as sequências de polinucleotídeo de certos anticorpos de acordo com a presente divulgação são fornecidos nas Figuras 1 e 2.
[0053] Em um aspecto da invenção o anticorpo é um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende pelo menos um de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-H1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-H2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR-H3. Preferivelmente o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR- H3.
[0054] Em um segundo aspecto da invenção o anticorpo é um anticorpo anti- CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo, compreendendo uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende pelo menos um de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-L3. Preferivelmente o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-H3. a. Em uma forma de realização o anticorpo da invenção é um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo compreendendo uma cadeia pesada como definida acima e adicionalmente compreendendo uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende pelo menos um de uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2 e uma CDR tendo a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-L3. O domínio variável da cadeia leve preferivelmente compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-L3.
[0055] Em uma forma de realização, pelo menos um aminoácido é substituído com uma substituição conservativa em uma ou mais CDRs selecionadas do grupo consistindo independentemente de:
[0056] qualquer uma de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3;
[0057] qualquer uma das combinações CDR-H1 e H2, CDR-H1 e H3, CDR-H1 e L1, CDR-H1 e L2, CDR-H1 e L3, CDR-H2 e H3, CDR-H2 e L1, CDR-H2 e L2, CDR- H2 e L3, CDR-H3 e L1, CDR-H3 e L2, CDR-H3 e L3, CDR-L1 e L2, CDR-L1 e L3, CDR-L2 e L3;
[0058] CDR-H1, H2 e H3, CDR-H1, H2 e L1, CDR-H1, H2 e L2, CDR-H1, H2 e L3, CDR-H2, H3 e L1, CDR-H2, H3 e L2, CDR-H2, H3 e L3, CDR-H3, L1 e L2, CDR- H3, L1 e L3, CDR-L1, L2, L3;
[0059] qualquer uma das combinações CDR-H1, H2, H3 e L1, CDR-H1, H2, H3 e L2, CDR-H1, H2, H3 e L3, CDR-H2, H3, L1 e L2, CDR-H2, H3, L2 e L3, CDR-H3, L1, L2 e L3, CDR-L1, L2, L3 e H1, CDR-L1, L2, L3 e H2, CDR-L1, L2, L3 e H3, CDR-L2, L3, H1 e H2,
[0060] CDR-H1, H2, H3, L1 e L2, CDR-H1, H2, H3, L1 e L3, CDR-H1, H2, H3, L2 e L3, CDR-L1, L2, L3, H1 e H2, CDR-L1, L2, L3, H1 e H3, CDR-L1, L2, L3, H2 e H3; e
[0061] a combinação CDR-H1, H2, H3, L1, L2 e L3.
[0062] Em uma forma de realização, um domínio da cadeia pesada aqui divulgada inclui a sequência com 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido conservativas, por exemplo em que as substituições estão na armação.
[0063] Em uma forma de realização, a armação da região variável da cadeia pesada compreende 1, 2, 3, ou 4 aminoácidos que foram inseridos, deletados, substituídos ou uma combinação dos mesmos. Em uma forma de realização, o aminoácido substituído é um aminoácido correspondente do anticorpo doador.
[0064] Em uma forma de realização, uma região variável leve aqui divulgada inclui a sequência com 1, 2, 3 ou 4 substituições de aminoácido conservativas, por exemplo em que as substituições estão na armação.
[0065] Em uma forma de realização, a armação da região variável de cadeia leve compreende 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos que foram inseridos, deletados, substituídos ou uma combinação do mesmo. Em uma forma de realização o amino substituído é um aminoácido correspondente de um anticorpo doador.
[0066] Em um aspecto da presente invenção, é fornecido um anticorpo anti-CSF- 1R ou fragmento de ligação do mesmo, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende três CDRs e a sequência de CDR-H1 tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 4, a sequência de CDR-H2 tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 5 e a sequência da CDR-H-3 tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 6. Preferivelmente, o anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo, adicionalmente compreendendo uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende três CDRs e a sequência de CDR-L1 tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 1, a sequência da CDR-L2 tem pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e a sequência da CDR-L3 tem pelo menos 60 % de identidade ou similaridade com a sequência dada na SEQ ID NO: 3.
[0067] Em uma forma de realização uma das regiões variáveis é fornecida com pelo menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 95 % de identidade ou similaridade a uma sequência da região variável aqui divulgada. Em uma outra forma de realização é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R que compete com a ligação de um anticorpo ou fragmento da invenção quanto à ligação ao receptor de CSF-1R, preferivelmente o domínio extracelular do receptor de CSF-1R, mais especificamente ao receptor de CSF-1R das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38 e/ou 39 ou a sequência na base de dados UniProt entrada P07333, em particular ao domínio extracelular do receptor de CSF- 1R da SEQ ID NO: 36 ou os 498 aminoácidos do domínio extracelular divulgado na base de dados UniProt entrada P07333 (aminoácido 20 a 517 da P07333).
[0068] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R que bloqueia cruzado a ligação de um anticorpo compreendendo uma das 6 CDRs dadas na sequência SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2, SEQ ID NO: 3 para a CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para a CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para a CDR-H2 e SEQ ID NO: 6 para a CDR-H3, por exemplo com afinidade de 100 pM ou menos, em particular em que o bloqueio cruzado é alostérico.
[0069] Em uma outra forma de realização, é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo que inibe ou se sobrepõem com a ligação de CSF-1 e/ou IL-34 ao domínio extracelular do receptor de CSF-1R.
[0070] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R que bloqueia cruzado a ligação de um anticorpo compreendendo uma das 6 CDRs dadas na sequência SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2, SEQ ID NO: 3 para a CDR-L3, SEQ ID NO: 4 para a CDR-H1, SEQ ID NO: 5 para a CDR-H2 e SEQ ID NO: 6 para a CDR-H3, por exemplo com afinidade de 100 pM ou menos, em particular em que o anticorpo bloqueia cruzado a ligação pela ligação do mesmo epítopo como o anticorpo que o mesmo bloqueia.
[0071] Em uma forma de realização o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é fornecido em que uma sequência do resíduo do anticorpo de terminal C é clivado, por exemplo o resíduo de terminal C de uma sequência de cadeia pesada, por exemplo uma lisina de terminal. Em uma forma de realização o aminoácido é clivado a partir de uma sequência aqui divulgada. No geral a clivagem resulta das modificações pós-traducionais do anticorpo expressado ou fragmento de ligação.
[0072] Em uma outra forma de realização o anticorpo anti-CSF-1R de qualquer uma das formas de realização supra ou infra é fornecido em que a lisina do terminal C da sequência da cadeia pesada dada na SEQ ID NO: 27 ou SEQ ID NO: 29 é perdida ou deletada. A lisina do terminal C perdida ou deletada por exemplo, a posição 453 da SEQ ID NO: 27 ou posição 472 da SEQ ID NO: 30 pode ser obtida, por exemplo pela expressão do anticorpo anti-CSF-1R em um sistema de expressão sem codificar a lisina terminal. Alternativamente a deleção de um resíduo de terminal C, tal como lisina, pode ser efetuada como uma modificação pós traducional.
[0073] Em uma forma de realização o anticorpo ou fragmentos de ligação de acordo com a invenção são humanizados.
[0074] Como aqui usado, o termo ‘anticorpo humanizado se refere a um anticorpo ou molécula de anticorpo em que as cadeias pesada e/ou leve contêm uma ou mais CDRs (incluindo, se desejado, uma ou mais CDRs modificadas) de um anticorpo doador (por exemplo, um anticorpo monoclonal de murino) enxertado em uma armação da região variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo, um anticorpo humano) (ver, por exemplo, US 5.585.089; WO91/09967). Para uma revisão, ver Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535539, 1998. Em uma forma de realização ao invés da CDR inteira que é transferida, apenas um ou mais dos resíduos determinadores de especificidade de qualquer uma das CDRs descritas aqui acima são transferidas para a armação de anticorpo humano (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36: 25-34). Em uma forma de realização apenas os resíduos determinadores de específicidade de uma ou mais das CDRs descritas aqui acima são transferidos para a armação de anticorpo humano. Em uma outra forma de realização apenas os resíduos determinadores de específicidade de cada uma das CDRs descritos aqui acima são transferidos para a armação de anticorpo humano. Quando as CDRs ou resíduos determinadores de específicidade são enxertados, qualquer sequência da armação da região variável aceitadora apropriada pode ser usada considerando a classe/tipo do anticorpo doador a partir do qual as CDRs são derivados, incluindo as regiões da armação de camundongo, primata e ser humano.
[0075] Adequadamente, o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção tem um domínio variável compreendendo as regiões de armação aceitadora humana assim como uma ou mais das CDRs especificamente aqui fornecidas. Assim, fornecido em uma forma de realização é um anticorpo humanizado que se liga à CSF-1R humana em que o domínio variável compreende as regiões de armação de aceitador humano e CDRs doadoras não humanas.
[0076] Os exemplos de armações humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Kabat et al., supra). Por exemplo, KOL e NEWM podem ser usados para a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usados tanto para a cadeia pesada quanto para a cadeia leve. Alternativamente, as sequências da linha germinativa humana podem ser usados; estas estão disponíveis em: http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/.
[0077] Em um anticorpo humanizado da presente invenção, as cadeias pesada e leve aceitadora não necessita ser necessariamente derivada do mesmo anticorpo e pode, se desejado, compreender cadeias de compósito tendo regiões de armação derivadas de cadeias diferentes.
[0078] Em uma forma de realização uma armação humana compreende 1, 2, 3, ou 4 substituições, adições ou deleções, de aminoácido por exemplo 1, 2, 3 ou 4 substituições ou substituições conservativas de resíduos doadores.
[0079] Em uma forma de realização a sequência utilizada como uma armação humana é 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou mais similar ou idêntica a uma sequência aqui divulgada.
[0080] Uma tal região de armação adequada para a cadeia pesada do anticorpo humanizado da presente invenção é derivada da sequência 3-1 2-70 do subgrupo VH2 humano junto com a região J JH3 (SEQ ID NO: 33).
[0081] Consequentemente, em um exemplo é fornecido um anticorpo humanizado compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 4 para a CDR-H1, a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para a CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para a CDR-H3, em que a região de armação da cadeia pesada é derivada da sequência do subgrupo VH3 1-3 3-07 humano junto com JH4.
[0082] Em um exemplo o domínio variável de cadeia pesada do anticorpo compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 23.
[0083] Uma região de armação adequada para a cadeia leve do anticorpo humanizado da presente invenção é derivada do subgrupo VK1 2-1-(1) O12 da linha germinativa humana junto com a região J JK4 (SEQ ID NO: 31).
[0084] Consequentemente, em um exemplo é fornecido um anticorpo humanizado compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 1 para a CDR-L1, a sequência dada na SEQ ID NO: 2 para a CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 3 para a CDR-L3, em que a região de armação da cadeia leve é derivada do subgrupo VK1 2-1-(1) O12 humano mais a região J JK4.
[0085] Em um exemplo o domínio variável de cadeia leve do anticorpo compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 15.
[0086] Em um anticorpo humanizado da presente invenção, as regiões de armação não precisam ter exatamente a mesma sequência como aquelas do anticorpo aceitador. Por exemplo, resíduos não usuais podem ser trocados para resíduos que ocorrem mais frequentemente para esta classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, os resíduos selecionados nas regiões de armação aceitadoras podem ser trocados de modo que eles correspondam ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo (ver Reichmann et al., 1998, Nature, 332: 323-324). Tais mudanças devem ser mantidas ao mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo doador. Um protocolo para selecionar resíduos nas regiões de armação de aceitador que podem precisar ser trocados é apresentado na WO91/09967.
[0087] Consequentemente, em um exemplo é fornecido um anticorpo humanizado, em que pelo menos o resíduo na posição 78 do domínio variável da cadeia pesada (Numeração de Kabat) é um resíduo doador. Em uma forma de realização o resíduo 78 do domínio variável de cadeia pesada é substituído com alanina.
[0088] O resíduo doador como aqui utilizado se refere a um resíduo do anticorpo não humano (por exemplo, anticorpo e murino) que doou as CDRs.
[0089] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo humanizado em que o domínio variável de cadeia pesada não contém nenhum dos resíduos doadores.
[0090] Consequentemente, em um exemplo é fornecido um anticorpo humanizado, em que pelo menos um dos resíduos nas posições 38, 71 e 87 do domínio variável da cadeia leve (Numeração de Kabat) são resíduos doadores. Em uma forma de realização um dos resíduos selecionados dos resíduos nas posições 38, 71 e 87 do domínio variável da cadeia leve (Numeração de Kabat) é um resíduo doador. Em uma forma de realização dois dos resíduos selecionados dos resíduos nas posições 38, 71 e 87, por exemplo 38 e 71; ou 38 e 87; ou 71 e 87, do domínio variável da cadeia leve (Numeração de Kabat) são resíduos doadores. Em uma forma de realização os três resíduos nas posições 38, 71 e 87 do domínio variável da cadeia leve (Numeração de Kabat) são resíduos doadores.
[0091] Em uma forma de realização o resíduo 38 do domínio variável de cadeia leve é substituído com lisina. Em uma forma de realização alternativa o resíduo 38 do domínio variável de cadeia leve é substituído com glutamina.
[0092] Em uma forma de realização o resíduo 71 do domínio variável de cadeia leve é substituído com tirosina.
[0093] Em uma forma de realização o resíduo 87 do domínio variável de cadeia leve é substituído com fenilalanina.
[0094] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo humanizado em que apenas o resíduo 71 da região variável de cadeia leve é um resíduo doador, preferivelmente tirosina.
[0095] Em uma forma de realização particular, a presente invenção fornece um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo tendo uma cadeia pesada compreendendo a sequência do domínio variável de cadeia pesada dada na SEQ ID NO: 23 e uma cadeia leve compreendendo a sequência do domínio variável de cadeia leve dada na SEQ ID NO: 15.
[0096] Em um outro aspecto da presente invenção, um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo é fornecido que liga CSF-1R preferivelmente ao domínio extracelular de CSF-1R, o mais preferivelmente ao domínio extracelular de CSF-1R humano, em que o anticorpo ou fragmento de ligação compreende o domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 15 e o domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23, preferivelmente em que o anticorpo ou fragmento de ligação do mesmo é um anticorpo monoclonal, é um anticorpo do tipo IgG1, IgG2, IgG4, é um Fab, Fab modificado, Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, anticorpo bi, tri ou tetravalente, Bis-scFv, diacorpo, triacorpo ou tetracorpo.
[0097] Em uma forma de realização a divulgação fornece uma sequência de anticorpo que é 80 % similar ou idêntica a uma sequência aqui divulgada, por exemplo 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 % 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % em parte ou no todo da sequência relevante. Em uma forma de realização a sequência relevante é a SEQ ID NO: 15. Em uma forma de realização a sequência relevante é a SEQ ID NO: 23.
[0098] “Identidade”, como aqui usado, indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. “Similaridade”, como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo similar entre as sequências. Por exemplo, leucina pode ser substituída no lugar de isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos no lugar de um outro incluem mas não são limitados a: - fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas); - lisina, arginina e histidina (aminoácidos tendo cadeias laterais básicas); - aspartato e glutamato (aminoácidos tendo cadeias laterais ácidas); - asparagina e glutamina (aminoácidos tendo cadeias laterais de amida); e - cisteína e metionina (aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre). Graus de identidade e similaridade podem ser facilmente calculados (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991, o software BLAST® disponíveis da NCBI (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410; Gish, W. & States, D. J. 1993, Nature Genet. 3: 266-272. Madden, T. L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S. F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Zhang, J. & Madden, T. L. 1997, Genome Res. 7: 649-656).
[0099] As moléculas de anticorpo da presente invenção podem compreender uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesada e leve de tamanho natural ou um fragmento de ligação do mesmo e pode ser, mas não são limitados a Fab, Fab modificado, Fab’, Fab’ modificado, F(ab’)2, Fv, anticorpos de domínio único (por exemplo, VH ou VL ou VHH), scFv, anticorpos bi, tri ou tetravalentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e epítopo-fragmentos de ligação de qualquer um dos acima (ver por exemplo Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 11261136; Adair e Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). Os métodos para criar e fabricar estes fragmentos de anticorpo são bem conhecidos na técnica (ver por exemplo Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216: 165-181). Outros fragmentos de anticorpo para o uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab’ descritos nos pedidos de patente Internacional WO05/003169, WO05/003170 e WO05/003171. Os anticorpos multivalentes podem compreender especificidades múltiplas por exemplo, biespecífico ou pode ser monoespecífico (ver por exemplo WO92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 e WO2010/035012).
[00100] O fragmento de ligação de um anticorpo como aqui utilizado se refere a um fragmento capaz de ligar um antígeno com afinidade para caracterizar o fragmento como específico para o antígeno.
[00101] Em uma forma de realização o anticorpo de acordo com a presente divulgação é fornecido como proteína de fusão de anticorpo de ligação de CSF-1R que compreende uma porção da imunoglobulina, por exemplo um fragmento Fab ou Fab’, e um ou dois anticorpos de domínio único (dAb) ligado direta ou indiretamente aos mesmos, por exemplo como descrito na WO2009/040562, WO2010/035012, WO2011/030107, WO2011/061492 e WO2011/086091 todas aqui incorporadas por referência.
[00102] Em uma forma de realização a proteína de fusão compreende dois anticorpos de domínio, por exemplo como um emparelhamento pesado variável (VH) e leve variável (VL), opcionalmente ligado por uma ligação de dissulfeto.
[00103] Em uma forma de realização o elemento Fab ou Fab’ da proteína de fusão tem a mesma ou especificidade similar ao anticorpo ou anticorpos de domínio único. Em uma forma de realização o Fab ou Fab’ tem uma especificidade diferente do anticorpo ou anticorpos de domínio único, isto quer dizer a proteína de fusão é multivalente. Em uma forma de realização uma fusão proteína multivalente de acordo com a presente invenção tem um sítio de ligação de albumina, por exemplo um par VH/VL neste ponto fornece um sítio de ligação de albumina.
[00104] Os domínios da região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presente, podem ser selecionados considerando-se a função proposta da molécula de anticorpo, e em particular as funções efetoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios da região constante podem ser domínios de IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM humanos. Em particular, domínios IgG humanos da região constante podem ser usados, especialmente dos isótipos IgG1 e IgG3 quando a molécula de anticorpo é intencionada para usos terapêuticos e as funções efetoras do anticorpo são requeridas. Alternativamente, isótipos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo é intencionada para propósitos terapêuticos e as funções efetoras de anticorpo não são requeridos.
[00105] Em uma forma de realização específica, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG2 ou IgG4.
[00106] Será avaliado que as variantes de sequência destes domínios da região constante também podem ser usados. Por exemplo moléculas IgG4 em que a serina na posição 241 foi mudada para prolina como descrito em Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30: 105-108 pode ser usado. Consequentemente, na forma de realização onde o anticorpo é um anticorpo IgG4, o anticorpo pode incluir a mutação S241P.
[00107] Também será entendido por uma pessoa habilitada na técnica que os anticorpos podem passar por uma variedade de modificações pós-translacionais. O tipo e grau destas modificações frequentemente dependem da linhagem de célula hospedeira usada para expressar o anticorpo assim como as condições de cultura. Tais modificações podem incluir variações na glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperazina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico de terminal carbóxi (tal como lisina ou arginina) devido à ação de carboxipeptidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Consequentemente, a lisina do terminal C da cadeia pesada do anticorpo pode estar ausente.
[00108] Em uma forma de realização a cadeia pesada de anticorpo compreende um domínio CH1 e a cadeia leve de anticorpo compreende um domínio CL, capa ou lâmbda.
[00109] Em uma forma de realização a cadeia pesada do anticorpo compreende um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3 e a cadeia leve do anticorpo compreende um domínio CL, capa ou lâmbda.
[00110] Um anticorpo fornecido pela presente invenção tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 19. Também é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento de ligação do mesmo, em que as cadeias pesada e leve são pelo menos 80 % (preferivelmente 85 %, 90 %, 95 % ou 98 %) idênticos ou similares a uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 19. Em uma forma de realização, a cadeia leve tem ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 19 e a cadeia pesada tem ou consiste da sequência dada na SEQ ID NO: 27. Em uma outra forma de realização, a cadeia leve tem ou consiste da sequência da SEQ ID NO: 19 e a cadeia pesada tem ou consiste da sequência da SEQ ID NO: 27, em que a lisina do aminoácido na posição 453 da SEQ ID NO: 27 é perdida ou deletada.
[00111] Também são fornecidos pela presente invenção uma região ou epítopo específicos de CSF-1R humano que são ligados por um anticorpo fornecido pela presente invenção, em particular um anticorpo 969.g2 compreendendo a sequência da cadeia pesada gH2 (SEQ ID NO: 27) e/ou a sequência da cadeia leve gL7 (SEQ ID NO: 19).
[00112] Esta região ou epítopo específicos do polipeptídeo CSF-1R humano podem ser identificados por qualquer método de mapeamento de epítopo adequado conhecido na técnica em combinação com qualquer um dos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Os exemplos de tais métodos incluem triar peptídeos de comprimentos variáveis derivados de CSF-1R quanto à ligação ao anticorpo da presente invenção com o menor fragmento que possa especificamente ligar ao anticorpo contendo a sequência do epítopo reconhecido pelo anticorpo (por exemplo um peptídeo na região de cerca de 5 a 20, preferivelmente de cerca de 7 aminoácidos no comprimento). Os peptídeos de CSF-1R podem ser produzidos sinteticamente ou pela digestão proteolítica do polipeptídeo de CSF-1R. Os peptídeos que se ligam ao anticorpo podem ser identificados, por exemplo, pela análise espectrométrica de massa. Em um outro exemplo, a espectroscopia de RMN ou a cristalografia de raio X pode ser usada para identificar o epítopo ligado por um anticorpo da presente invenção. Uma vez identificado, o fragmento epitópico que se liga a um anticorpo da presente invenção pode ser usado, se requeridos, como um imunógeno para se obter anticorpos adicionais que se ligam ao mesmo epítopo.
[00113] As moléculas biológicas, tais como anticorpos ou fragmentos, contêm grupos funcionais ácidos e/ou básicos, dando deste modo à molécula uma carga líquida positiva ou negativa. A quantidade de carga global “observada” dependerá da sequência de aminoácido absoluta da entidade, do ambiente local dos grupos carregados na estrutura 3D e das condições ambientais da molécula. O ponto isoelétrico (pI) é o pH no qual uma molécula particular ou superfície acessível a solvente da mesma não carrega nenhuma carga elétrica líquida. Em um exemplo, o anticorpo CSF-1R e fragmentos da invenção podem ser engendrados para ter um ponto isoelétrico apropriado. Isto pode levar aos anticorpos e/ou fragmentos com propriedades mais robustas, em particular perfis de solubilidade e/ou estabilidade adequados e/ou características de purificação melhorada.
[00114] Assim em um aspecto a invenção fornece um anticorpo CSF-1R humanizado engendrado para ter um ponto isoelétrico diferente daquele do anticorpo originalmente identificado. O anticorpo, por exemplo pode ser engendrado pela substituição de um resíduo de aminoácido tal como substituindo um resíduo de aminoácido ácido com um ou mais resíduos de aminoácido básico. Alternativamente, resíduos de aminoácido básicos podem ser introduzidos ou resíduos de aminoácido ácidos podem ser removidos. Alternativamente, se a molécula tem um valor pI inaceitavelmente alto resíduos ácidos podem ser introduzidos para diminuir o pI, como requerido. É importante que quando da manipulação do pI cuidado deve ser tomado para reter a atividade desejável do anticorpo ou fragmento. Assim em uma forma de realização o anticorpo ou fragmento engendrados tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade como o anticorpo ou fragmento “não modificados”.
[00115] Programas tais como ** ExPASY http: //www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, e
[00116] http: //www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html, podem ser usados para prognosticar o ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento.
[00117] Será avaliado que a afinidade de anticorpos fornecidos pela presente invenção pode ser alterada usando qualquer método adequado conhecido na técnica. A presente invenção portanto também diz respeito às variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que têm uma afinidade melhorada para a CSF-1R. Tais variantes podem ser obtidas por vários protocolos de maturação por afinidade incluindo mutar as CDRs (Yang et al., 1995, J. Mol. Biol., 254: 392-403), embaralhamento de cadeia (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10: 779-783), uso de cepas mutadoras da E. coli (Low et al., 1996, J. Mol. Biol., 250: 359-368), embaralhamento de DNA (Patten et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8: 724-733), demonstração de fago (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (Crameri et al., 1998, Nature, 391: 288-291). Vaughan et al. (supra) debateram estes métodos de maturação por afinidade.
[00118] Se desejado um anticorpo para o uso na presente invenção pode ser conjugado a uma ou mais molécula(s) efetora(s). Será avaliado que a molécula efetora pode compreender uma molécula efetora única ou duas ou mais de tais moléculas ligadas de modo a formar uma única porção que pode ser ligada aos anticorpos da presente invenção. Onde é desejado obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efetora, isto pode ser preparado pelos procedimentos químicos ou de DNA recombinante padrão em que o fragmento de anticorpo é ligado diretamente ou via um agente de ligação à molécula efetora. As técnicas para conjugar tais moléculas efetoras aos anticorpos são bem conhecidas na técnica (ver, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62: 119-58 e Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Os procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, aqueles descritos em WO93/06231, WO92/22583, WO89/00195, WO89/01476 e WO03/031581. Alternativamente, onde a molécula efetora é uma proteína ou polipeptídeo a ligação pode ser obtida usando procedimentos de DNA recombinante, por exemplo como descrito na WO86/01533 e EP0392745.
[00119] O termo molécula efetora como aqui usado inclui, por exemplo, agentes antineoplásticos, medicamentos, toxinas, proteínas biologicamente ativas, por exemplo enzimas, outro anticorpo ou fragmentos de anticorpo, polímeros sintéticos ou que ocorrem naturalmente, ácidos nucléicos e fragmentos dos mesmos por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórter, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados pela espectroscopia de RMN ou ESR.
[00120] Os exemplos de moléculas efetoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos incluindo qualquer agente que seja nocivo para (por exemplo, mate) as células. Os exemplos, incluem combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos.
[00121] As moléculas efetoras também incluem, mas não são limitadas a, antimetabólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (antigamente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (por exemplo, dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas ou duocarmicinas), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).
[00122] Outras moléculas efetoras podem incluir radionuclídeos quelados tais como 111In e 90Y, Lu177, Bismuto213, Califórnio252, Irídio192 e Tungstênio188/Rênio188; ou medicamentos tais como mas não limitados a, alquilfosfocolinas, inibidores da topoisomerase I, taxóides e suramin.
[00123] Outras moléculas efetoras incluem proteínas, peptídeos e enzimas. As enzimas de interesse incluem, mas não são limitados a, enzimas proteolíticas, hidrolases, liases, isomerases, transferases. As proteínas, polipeptídeos e peptídeos de interesse incluem, mas não são limitados a, imunoglobulinas, toxinas tais como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína tal como insulina, fator de necrose de tumor, α-interferon, β-interferon, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento derivado de plaqueta ou ativador de plasminogênio tecidual, um agente trombótico ou um agente anti-angiogênico, por exemplo, angiostatina ou endostatina, ou, um modificador de resposta biológica tal como uma linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), fator de crescimento de nervo (NGF) ou outro fator de crescimento e imunoglobulinas.
[00124] Outras moléculas efetoras podem incluir substâncias detectáveis úteis, por exemplo em diagnóstico. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, nuclídeos radioativos, metais que emitem pósitron (para o uso na tomografia de emissão de pósitron), e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Ver no geral a Patente U.S. No. 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados aos anticorpos para o uso como diagnósticos. As enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; os grupos protéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; os materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila e ficoeritrina; materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina, e aequorina; e nuclídeos radioativos adequados incluem 125I, 131I, 111In e 99Tc.
[00125] Em um outro exemplo a molécula efetora pode aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo, e/ou reduzir a imunogenicidade do anticorpo e/ou realçar a liberação de um anticorpo através de uma barreira epitelial para o sistema imune. Os exemplos de moléculas efetoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação de albumina ou compostos de ligação de albumina tal como aquelas descritas em WO05/117984.
[00126] Em uma forma de realização uma meia-vida fornecida por uma molécula efetora que é independente de CSF-1R é vantajosa.
[00127] Onde a molécula efetora é um polímero a mesma, no geral, pode ser um polímero sintético ou um que ocorre naturalmente, por exemplo um polímero de polialquileno, polialquenileno ou polioxialquileno de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituído ou um polissacarídeo ramificado ou não ramificado, por exemplo, um homo- ou hetero- polissacarídeo.
[00128] Os substituintes opcionais específicos que podem estar presentes nos polímeros sintéticos mencionados acima incluem um ou mais grupos hidróxi, metila ou metóxi.
[00129] Os exemplos específicos de polímeros sintéticos incluem poli(etileno glicol), poli(propileno glicol) poli(álcool vinílico) de cadeia reta ou ramificada opcionalmente substituídos ou derivados dos mesmos, especialmente poli(etileno glicol) opcionalmente substituído, tal como metoxipoli(etileno glicol) ou derivados do mesmo.
[00130] Os polímeros que ocorrem naturalmente específicos incluem lactose, amilose, dextrano, glicogênio ou derivados dos mesmos.
[00131] Em uma forma de realização o polímero é albumina ou um fragmento da mesma, tal como albumina sérica humana ou um fragmento da mesma.
[00132] “Derivados” como aqui usado é intencionado a incluir derivados reativos, por exemplo grupos reativos seletivos em tiol tais como maleimidas e os semelhantes. O grupo reativo pode ser ligado diretamente ou através de um segmento ligador ao polímero. Será avaliado que o resíduo de um tal grupo em alguns casos formará parte do produto como o grupo de ligação entre o fragmento de anticorpo e o polímero.
[00133] O tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas geralmente estará em uma faixa de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, por exemplo de 5000 a 40000 Da, tal como de 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero em particular pode ser selecionado com base no uso pretendido do produto, por exemplo capacidade para localizar a certos tecidos tais como tumores ou meia-vida circulante prolongada (para revisão ver Cha pMan, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, onde o produto é pretendido deixar a circulação e penetrar o tecido, por exemplo para o uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular pequeno, por exemplo com um peso molecular em torno de 5000 Da. Para aplicações onde o produto permanece na circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais alto, por exemplo tendo um peso molecular na faixa de 20000 Da a 40000 Da.
[00134] Os polímeros adequados incluem um polímero de polialquileno, tal como um poli(etileno glicol) ou, especialmente, um metoxipoli(etileno glicol) ou um derivado do mesmo, e especialmente com um peso molecular na faixa de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.
[00135] Em um exemplo anticorpos para o uso na presente invenção são ligados às porções de poli(etileno glicol) (PEG). Em um exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas de PEG podem ser ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácido disponível ou grupo funcional de aminoácido terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxila ou carboxila livres. Tais aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser engendrados no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver por exemplo a US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). Em um exemplo a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição à extremidade do terminal C da sua cadeia pesada um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efetora. Adequadamente, os aminoácidos adicionais formam uma região de dobradiça modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais a molécula efetora pode ser ligada. Sítios múltiplos podem ser usados para ligar duas ou mais moléculas de PEG.
[00136] Adequadamente as moléculas de PEG são covalentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode ser covalentemente ligado ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente geralmente será uma ligação de dissulfeto ou, em particular, uma ligação de enxofre-carbono. Onde um grupo tiol é usado como o ponto de ligação apropriadamente moléculas efetoras ativadas, por exemplo derivados seletivos em tiol tais como maleimidas e derivados de cisteína podem ser usados. Um polímero ativado pode ser usado como o material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados por polímero como descrito acima. O polímero ativado pode ser qualquer polímero contendo um grupo tiol reativo tal como um ácido ou éster a-halocarboxílico, por exemplo, iodoacetamida, uma imida, por exemplo, maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfeto. Tais materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo da Nektar, antigamente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados a partir de materiais de partida comercialmente disponíveis usando procedimentos químicos convencionais. As moléculas de PEG particulares incluem metóxi-PEG-amina de 20K (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M-PEG-SPA (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater).
[00137] Em uma forma de realização, o anticorpo é um fragmento Fab modificado, fragmento Fab’ ou diFab que é PEGuilado, isto é, tem PEG (poli(etileno glicol)) covalentemente ligado a este, por exemplo, de acordo com o método divulgado na EP 0948544 ou EP1090037 [ver também “Poly(ethilene glycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications”, 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nova Iorque, “Poly(ethilene glycol) Chemistry and Biological Applications”, 1997, J. Milton Harris e S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC e “Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences”, 1998, M. Aslam e A. Dent, Grove Publishers, Nova Iorque; Cha pMan, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545]. Em um exemplo PEG é ligado a uma cisteína na região de dobradiça. Em um exemplo, um fragmento Fab modificado por PEG tem um grupo maleimida covalentemente ligado a um grupo tiol único em uma região de dobradiça modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligada ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode ser ligado a um polímero de metoxipoli(etileno glicol) tendo um peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. O peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab portanto pode ser de aproximadamente 40.000 Da.
[00138] As moléculas de PEG particulares incluem lisina modificada por 2-[3-(N- maleimido)propionamido]etil amida de N,N’-bis(metoxipoli(etileno glicol) PM 20.000), também conhecida como PEG2MAL40K (obtenível da Nektar, antigamente Shearwater).
[00139] As fontes alternativas de ligadores de PEG incluem NOF que fornecem GL2-400MA3 (em que m na estrutura abaixo é 5) e GL2-400MA (onde m é 2) e n é aproximadamente 450:
[00140]
[00141] Isto quer dizer cada PEG é de cerca de 20.000 Da.
[00142] Assim em uma forma de realização o PEG é 2,3-Bis(metilpolioxietileno- óxi)-1-{[3-(6-maleimido-1-oxohexil)amino]propilóxi} hexano (os 2 braços ramificados de PEG, -CH2) 3NHCO(CH2)5-MAL, Pm 40.000 conhecido como SUNBRIGHT GL2- 400MA3.
[00143] Outra das moléculas efetoras de PEG alternativas do seguinte tipo:
[00144] Em uma forma de realização é fornecido um anticorpo, tal como um anticorpo de tamanho natural, que é PEGuilado (por exemplo com um PEG aqui descrito), ligado através de um resíduo de aminoácido de cisteína no ou em torno do aminoácido 226 na cadeia, por exemplo aminoácido 226 da cadeia pesada (pela numeração sequencial).
[00145] Em uma forma de realização a presente divulgação fornece uma molécula de Fab’PEG compreendendo um ou mais polímeros de PEG, por exemplo 1 ou 2 polímeros tais como um polímero ou polímeros de 40 kDa.
[00146] As moléculas de Fab-PEG de acordo com a presente divulgação podem ser particularmente vantajosas em que elas têm uma meia-vida independente do fragmento Fc.
[00147] Em uma forma de realização é fornecido um scFv conjugado a um polímero, tal como uma molécula de PEG, uma molécula de amido ou uma molécula de albumina.
[00148] Em uma forma de realização o anticorpo ou fragmento são conjugados a uma molécula de amido, por exemplo para aumentar a meia-vida. Os métodos de início de conjugação a uma proteína como descrito na US 8.017.739 aqui incorporado por referência.
[00149] Uma molécula repórter como aqui utilizada é uma molécula que é capaz de ser detectada, por exemplo um corante fluorescente, radiorrotulado ou outra entidade detectável.
[00150] A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a(s) cadeia(s) pesada(s) e/ou leve(s) de uma molécula de anticorpo da presente invenção. Adequadamente, as sequências de DNA codificam a cadeia pesada ou a leve de uma molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido pelo processamento químico, cDNA, DNA genômico ou qualquer combinação do mesmo.
[00151] As sequências de DNA que codificam uma molécula de anticorpo da presente invenção podem ser obtidas pelos métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Por exemplo, as sequências de DNA que codificam parte ou todas das cadeias pesada e leve do anticorpo podem ser sintetizadas como desejado a partir das sequências de DNA determinadas ou com base nas sequências de aminoácido correspondentes.
[00152] O DNA que codifica as sequências de armação aceitadoras é amplamente disponível a aqueles habilitados na técnica e pode ser facilmente sintetizado com base nas suas sequências de aminoácido conhecidas.
[00153] As técnicas padrão de biologia molecular podem ser usadas para preparar sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo. As técnicas de mutagênese locodirigida e reação da cadeia da polimerase (PCR) podem ser usadas como apropriado.
[00154] Os exemplos de sequências de DNA adequadas são fornecidas na Figura 1.
[00155] A presente invenção também diz respeito a um vetor de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Consequentemente, é fornecido um vetor de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA que codifica um anticorpo da presente invenção. Em uma forma de realização o vetor compreende as sequências dadas na SEQ ID NO: 28 e/ou SEQ ID NO: 20. Adequadamente, o vetor de clonagem ou expressão compreende duas sequências de DNA, que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção, preferivelmente a SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 20, respectivamente e sequências de sinal adequadas. Em um exemplo o vetor compreende uma sequência intergênica entre as cadeias pesada e leve (ver a WO03/048208).
[00156] Os métodos gerais pelos quais os vetores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica. A este respeito, referência é feita ao “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nova Iorque e ao Maniatis Manual produzido pela Cold Spring Harbor Publishing.
[00157] Também é fornecida uma célula hospedeira compreendendo um ou mais vetores de clonagem ou expressão compreendendo uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Qualquer sistema de célula hospedeira/vetor adequado pode ser usado para a expressão das sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. Bacteriano, por exemplo E. coli, e outros sistemas microbianos podem ser usados ou sistemas de expressão de célula hospedeira eucarióticos, por exemplo de mamíferos, também podem ser usados. As células hospedeiras de mamífero adequadas incluem células CHO, de mieloma ou hibridoma.
[00158] A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira contendo um vetor da presente invenção sob condições adequadas para levar à expressão da proteína de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção, e isolar a molécula de anticorpo.
[00159] A molécula de anticorpo pode compreende apenas um polipeptídeo de cadeia pesada ou leve, caso em que apenas uma sequência codificadora de polipeptídeo de cadeia pesada ou cadeia leve precisa ser usada para transfectar as células hospedeiras. Para a produção de produtos compreendendo tanto a cadeia pesada quanto a leve, a linhagem de célula pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser usado, o vetor incluindo as sequências que codificam os polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada.
[00160] Os anticorpos e fragmentos de acordo com a presente divulgação são expressos em bons níveis de células hospedeiras. Assim as propriedades dos anticorpos e/ou fragmentos de ligação são adequadas para a expressão em uma escala comercial.
[00161] Assim é fornecido um processo para cultivar uma célula hospedeira e expressar um anticorpo ou fragmento do mesmo, isolar o último e opcionalmente purificar o mesmo para fornecer um anticorpo ou fragmento isolados. Em uma forma de realização o processo compreende ainda a etapa de conjugar uma molécula efetora ao anticorpo ou fragmento isolados, por exemplo conjugar a um polímero de PEG em particular como aqui descrito.
[00162] Em uma forma de realização é fornecido um processo para purificar um anticorpo (em particular um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção) compreendendo realizar a cromatografia de troca de ânion no modo de não ligação tal que as impurezas sejam retidas na coluna e o anticorpo seja eluído.
[00163] Em uma forma de realização a purificação utiliza a captura por afinidade em uma coluna CSF-1R.
[00164] Em uma forma de realização a purificação utilizam azul de cibacron ou similar para a purificação de moléculas de fusão ou conjugadas a albumina.
[00165] As resinas de troca iônica adequada para o uso no processo incluem resina Q.FF (fornecida pela GE-Healthcare). A etapa, por exemplo pode ser realizada em um pH de cerca de 8.
[00166] O processo pode compreender ainda uma etapa de captura inicial utilizando cromatografia de troca de cátion, realizada por exemplo em um pH de cerca de 4 a 5, tal como 4,5. A cromatografia de troca de cátion, por exemplo pode utilizar uma resina tal como a resina CaptoS ou SP sefarose FF (fornecidas pela GE- Healthcare). O anticorpo ou fragmento podem ser depois eluídos da resina utilizando uma solução de sal iônico tal como cloreto de sódio, por exemplo em uma concentração de 200 mM.
[00167] Assim, a etapa ou etapas cromatográficas podem incluir uma ou mais etapas de lavagem, como apropriado.
[00168] O processo de purificação também pode compreender uma ou mais etapas de filtração, tais como uma etapa de diafiltração.
[00169] Assim em uma forma de realização é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento purificados, por exemplo um anticorpo humanizado ou fragmento, em particular um anticorpo ou fragmento de acordo com a invenção, na forma substancialmente purificada de, em particular livre ou substancialmente livre de endotoxina e/ou proteína de célula hospedeira ou DNA.
[00170] A forma purificada como usada supra é intencionada a se referir a pelo menos 90 % de pureza, tal como 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % p/p ou mais puro.
[00171] Substancialmente livre de endotoxina é no geral intencionado a se referir a um teor de endotoxina de 1 EU por mg de produto de anticorpo ou menos tal como 0,5 ou 0,1 EU por mg de produto.
[00172] Substancialmente livre de proteína ou DNA de célula hospedeira é no geral intencionado a se referir ao teor de proteína e/ou DNA de célula hospedeira de 400 μg por mg de produto de anticorpo ou menos tal como 100 μg por mg ou menos, em particular 20 μg por mg, como apropriado.
[00173] A presente invenção também fornece um anticorpo anti-CSF-1R (ou composições farmacêuticas compreendendo o mesmo) de acordo com a divulgação para o uso como um medicamento.
[00174] A presente invenção também fornece um anticorpo anti-CSF-1R (ou composições farmacêuticas compreendendo o mesmo) de acordo com a divulgação, para o tratamento de câncer.
[00175] A presente invenção também fornece o uso de um anticorpo anti-CSF-1R (ou composição farmacêutica compreendendo o mesmo) de acordo com a divulgação na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de câncer.
[00176] A presente invenção também fornece um método para o tratamento de um indivíduo humano que sofre de ou em risco de câncer, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CSF-1R de acordo com a divulgação.
[00177] O anticorpo de acordo com a divulgação pode ser usado para tratar câncer que é selecionado do grupo consistindo de câncer de mama, câncer de próstata, câncer ósseo, mieloma, câncer colorretal, leucemia, linfoma, câncer de pele tal como melanoma, câncer esofágico, câncer gástrico, câncer astrocítico, câncer endometrial, câncer cervical, câncer da bexiga, câncer renal, câncer pulmonar, câncer hepático, câncer da tireóide, câncer da cabeça & pescoço, câncer pancreático e câncer ovariano.
[00178] Em uma forma de realização o câncer é câncer metastatizado de qualquer um dos cânceres originais listados acima, em particular câncer ósseo.
[00179] Surpreendentemente nós fomos capazes de demonstrar que um anticorpo anti-CSF-1R que inibe a atividade de CSF-1R é ativo no tratamento de doença fibrótica. Especificamente, nós fomos capazes de demonstrar que um anticorpo anti- CSF-1R é ativo em modelos de animal in vivo de fibrose pulmonar.
[00180] A presente invenção também fornece um anticorpo anti-CSF-1R (ou composições farmacêuticas compreendendo o mesmo) de acordo com a divulgação, para o tratamento de doença fibrótica.
[00181] A presente invenção também fornece o uso de um anticorpo anti-CSF-1R (ou composição farmacêutica compreendendo o mesmo) de acordo com a divulgação na fabricação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de doença fibrótica.
[00182] A presente invenção também fornece um método para o tratamento de um indivíduo humano que sofre de ou em risco de doença fibrótica, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CSF-1R de acordo com a divulgação.
[00183] No presente pedido, o termo “doença fibrótica” inclui doenças que são caracterizadas por uma resposta aberrante à cicatrização de ferimento em que o tecido conectivo fibroso em excesso é formado em um órgão ou tecido. As doenças fibróticas ilustrativas incluem mas não são limitadas à fibrose pulmonar tal como fibrose pulmonar idiopática e fibrose cística, fibrose renal incluindo atrofia tubular e fibrose intersticial, fibrose hepática, cirrose hepática, colangite esclerosante primária, cirrose biliar primária, fibrose endomiocardial, fibrose mediastinal, mielofibrose, fibrose retroperitoneal, fibrose maciça progressiva, fibrose sistêmica nefrogênica, Doença de Crohn, quelóide, infartação miocárdica, escleroderma, esclerose sistêmica e artofibrose.
[00184] Em uma forma de realização os anticorpos ou fragmentos de acordo com a divulgação são utilizadas no tratamento ou profilaxia de câncer ou doença fibrótica.
[00185] O anticorpo de acordo com a divulgação pode ser usado no tratamento de doenças inflamatórias, como, por exemplo, artrite inflamatória, aterosclerose, esclerose múltipla, doença inflamatória intestinal, Doença de Crohn, colite ulcerativa, espondilite reumatóide, espondilite anquilosante, artrite, artrite psoriática, artrite reumatóide, osteoartrite, eczema, dermatite de contato, psoríase, síndrome do choque tóxico, septicemia, choque séptico, choque endotóxico, asma, doença inflamatória pulmonar crônica, silicose, sarcoidose pulmonar, osteoporose, restenose, lesão de reperfusão cardíaca e renal, trombose, glomerulonefrite, diabete, reação de enxerto vs. hospedeiro, rejeição de aloenxerto, esclerose múltipla, degeneração muscular, distrofia muscular, doença de Alzheimer e acidente vascular cerebral.
[00186] Os anticorpos e fragmentos de acordo com a presente divulgação podem ser utilizados no tratamento ou profilaxia.
[00187] A molécula de anticorpo da presente invenção também pode ser usada no diagnóstico, por exemplo no diagnóstico e imageamento in vivo de estados de doença envolvendo CSF-1R.
[00188] Visto que os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carregador farmaceuticamente aceitável. Consequentemente, é fornecido o uso de um anticorpo da invenção para a fabricação de um medicamento. A composição usualmente será fornecida como parte de uma composição farmacêutica estéril que normalmente incluirá um carregador farmaceuticamente aceitável. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode adicionalmente compreender um adjuvante farmaceuticamente aceitável.
[00189] A presente invenção também fornece um processo para a preparação de uma composição farmacêutica ou de diagnóstico compreendendo adicionar e misturar a molécula de anticorpo da presente invenção junto com um ou mais de um excipiente, diluente ou carregador farmaceuticamente aceitáveis.
[00190] A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente ativo na composição farmacêutica ou de diagnóstico. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado em combinação, por exemplo, simultânea, sequencial ou separadamente, com um ou mais outros ingredientes terapeuticamente ativos. Consequentemente a molécula de anticorpo na composição farmacêutica ou de diagnóstico pode ser realizada por outros ingredientes ativos incluindo outros ingredientes de anticorpo, por exemplo a família do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR, HER-2), receptores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), anticorpos do receptor do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR), ou ingredientes que não anticorpo tais como imatinib, dasatinib, nioltinib, basutinib, gefitinib, erlotinib, tensirolimus, vandetanib, vemurafenib, crizotinib, vorinostat, romidepsin, bortezomib, sorafenib, sunitinib, pazopanib, regorafenib, cabozantinib, Perfenidona, esteróides ou outras moléculas de medicamento, em particular moléculas medicamentosas cuja meia- vida é independente da ligação de CSF-1R.
[00191] O ingrediente ativo como aqui utilizado se refere a um ingrediente com um efeito farmacológico, tal como um efeito terapêutico, em uma dose relevante.
[00192] As composições farmacêuticas adequadamente compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo da invenção. O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” como aqui usado se refere a uma quantidade de um agente terapêutico necessário para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição alvejadas, ou para exibir um efeito terapêutico, farmacológico ou preventivo detectáveis. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser estimada inicialmente nos ensaios de cultura de célula ou em modelos de animal, usualmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. O modelo de animal também pode ser usado para determinar a faixa de concentração e a via apropriadas de administração. Tal informação pode ser depois usada para determinar doses e vias úteis para a administração em seres humanos.
[00193] A quantidade terapeuticamente eficaz precisa para um indivíduo humano dependerá da severidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, peso e gênero do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinação(ões) de medicamento, sensibilidades de reação e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada pela experimentação de rotina e está dentro do julgamento do médico. No geral, uma quantidade terapeuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por exemplo de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg, tal como 100 mg/Kg.
[00194] As composições farmacêuticas podem ser convenientemente apresentadas em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente ativo da invenção por dose.
[00195] As doses terapêuticas dos anticorpos de acordo com a presente divulgação não mostram nenhum dos efeitos de toxicologia aparentes ou limitados in vivo.
[00196] As composições podem ser administradas individualmente a um paciente ou podem ser administradas em combinação (por exemplo, simultânea, sequencial ou separadamente) com outros agentes, medicamentos ou hormônios.
[00197] Em uma forma de realização os anticorpos ou fragmentos de ligação de acordo com a presente divulgação são utilizados com uma ou mais outras opções para o tratamento de câncer, tais como, por exemplo, quimioterapia, terapia de radiação ou cirurgia. Se administrados com um produto quimioterapêutico, o anticorpo pode ser administrado antes ou depois do agente quimioterapêutico ou ao mesmo tempo. Os tratamentos de quimioterapia que podem ser usados em combinação com as proteínas de ligação de antígeno que são fornecidos incluem, mas não são limitados a agentes de alquilação/que danificam o DNA (por exemplo, carboplatina, cisplatina), antimetabólitos (por exemplo, capecitabina, gencitabina, 5- fluorouracila), inibidores mitóticos (por exemplo, paclitaxel, vincristina).
[00198] Os anticorpos a serem usados para tratar várias doenças inflamatórias podem ser usados sozinhos ou combinados com vários outro agentes anti- inflamatórios.
[00199] Os anticorpos a serem usados para tratar várias doenças fibróticas podem ser usados sozinhos ou combinados com vários outros agentes anti-fibróticos. Um exemplo de um tal agente é Perfedidona.
[00200] A dose na qual a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada depende da natureza da condição a ser tratada, da severidade da condição presente e se a molécula de anticorpo está sendo usada profilaticamente ou para tratar uma condição existente.
[00201] A frequência de dose dependerá da meia-vida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito. Se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida curta (por exemplo, de 2 a 10 horas) pode ser necessário dar uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida longa (por exemplo, de 2 a 15 dias) e/ou perfil farmacodinâmico (PD) de longa duração pode ser necessário apenas dar uma dosagem uma vez ao dia, uma vez por semana ou ainda uma vez a cada 1 ou 2 meses.
[00202] A meia-vida como aqui utilizada é intencionada a se referir à duração da molécula em circulação, por exemplo no soro/plasma.
[00203] Farmacodinâmicas como aqui utilizado se refere ao perfil e em particular à duração da ação biológica da molécula de acordo com a presente divulgação.
[00204] O carregador farmaceuticamente aceitável por si só não deve induzir a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxico. Os carregadores adequados podem ser macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como proteínas, polipeptídeos, lipossomas, polissacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido e partículas virais inativas.
[00205] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados, por exemplo sais de ácido mineral, tal como cloridretos, bromidretos, fosfatos e sulfatos, ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.
[00206] Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis nas composições terapêuticas podem adicionalmente conter líquidos tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, substâncias auxiliares, tais como agentes de umectação ou emulsificação ou substâncias tamponantes de pH, podem estar presentes em tais composições. Tais carregadores permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas fluidas e suspensões, para a ingestão pelo paciente.
[00207] As formas adequadas para a administração incluem formas adequadas para a administração parenteral, por exemplo, pela injeção ou infusão, por exemplo pela injeção de bolo ou infusão contínua. Onde o produto é para injeção ou infusão, o mesmo pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão em um veículo oleoso ou aquoso e o mesmo pode conter agentes formulatórios, tais como agentes de suspensão, preservantes, agentes estabilizantes e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode estar na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.
[00208] Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administrado diretamente ao indivíduo. Os indivíduos a serem tratados podem ser animais. entretanto, em uma ou mais formas de realização as composições são adaptadas para a administração aos indivíduos humanos.
[00209] Adequadamente nas formulações de acordo com a presente divulgação, o pH da formulação final não é similar ao valor do ponto isoelétrico do anticorpo ou fragmento, por exemplo se o pH da formulação é 7 então um pI de 8 a 9 ou acima pode ser apropriado. Embora não desejando estar ligado pela teoria é considerado que isto pode por fim fornecer uma formulação final com estabilidade melhorada, por exemplo o anticorpo ou fragmento permanecem em solução.
[00210] Em um exemplo a formulação farmacêutica em um pH na faixa de 4,0 a 7,0 compreende: de 1 a 200 mg/ml de um anticorpo de acordo com a presente divulgação, 1 a 100 mM de um tampão, 0,001 a 1 % de um tensoativo, a) de 10 a 500 mM de um estabilizante, b) de 10 a 500 mM de um estabilizante e de 5 a 500 mM de um agente de tonicidade, ou c) de 5 a 500 mM de um agente de tonicidade.
[00211] As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitadas às vias oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutânea (por exemplo, ver a WO98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intravaginal ou retal. Hipopulverizações também podem ser usadas para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções ou suspensões líquidas. Formas sólidas adequadas para a solução em, ou suspensão em, veículos líquidos antes da injeção também podem ser preparadas.
[00212] A liberação direta das composições no geral serão realizadas pela injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscularmente, ou liberada ao espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas dentro de uma lesão. O tratamento de dosagem pode ser um programa de dosagem única ou um programa de dose múltipla.
[00213] Será avaliado que o ingrediente ativo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, o mesmo será susceptível à degradação no trato gastrointestinal. Assim, se a composição deva ser administrada por uma via usando o trato gastrointestinal, a composição necessitará conter agentes que protejam o anticorpo da degradação mas que libere o anticorpo uma vez que o mesmo tenha sido absorvido a partir do trato gastrointestinal.
[00214] Um debate completo de carregadores farmaceuticamente aceitáveis está disponível no Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
[00215] Em uma forma de realização a formulação é fornecida como uma formulação para administrações tópicas incluindo inalação.
[00216] As preparações inaláveis adequadas incluem pós inaláveis, aerossol de medição contendo gases propelentes ou soluções inaláveis livres de gases propelentes. Pós inaláveis de acordo com a divulgação contendo a substância ativa pode consistir unicamente das substâncias ativas mencionadas acima ou de uma mistura das substâncias ativas mencionadas acima com excipiente fisiologicamente aceitável.
[00217] Estes pós inaláveis podem incluir monossacarídeos (por exemplo, glicose ou arabinose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose, maltose), oligo- e polissacarídeos (por exemplo, dextranos), poliálcoois (por exemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sais (por exemplo, cloreto de sódio, carbonato de cálcio) ou misturas destes um com o outro. Mono- ou dissacarídeos são adequadamente usados, o uso de lactose ou glicose, particularmente mas não exclusivamente na forma de seus hidratos.
[00218] As partículas para deposição no pulmão requerem um tamanho de partícula menor do que 10 mícrons, tal como 1 a 9 mícrons por exemplo de 0,1 a 5 μm, em particular de 1 a 5 μm. O tamanho de partícula do ingrediente ativo (tal como o anticorpo ou fragmento) é de importância primária.
[00219] Os gases propelentes que podem ser usados para preparar os aerossóis inaláveis são conhecidos na técnica. Os gases propelentes adequados são selecionados dentre hidrocarbonetos tais como n-propano, n-butano ou isobutano e halohidrocarbonetos tais como derivados clorados e fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano ou ciclobutano. Os gases propelentes mencionados acima podem ser usados por si só ou em misturas dos mesmos.
[00220] Os gases propelentes particularmente adequados são derivados de alcano halogenados selecionados dentre TG 11, TG 12, TG 134a e TG227. Dos hidrocarrbonetos halogenados mencionados acima, TG134a (1,1,1,2- tetrafluoroetano) e TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) e misturas dos mesmo são particularmente adequados.
[00221] Os aerossóis inaláveis contendo gás propelentes também podem conter outros ingredientes tais como cossolventes, estabilizantes, agentes ativos na superfície (tensoativos), antioxidantes, lubrificantes e meios para ajustar o pH. Todos estes ingredientes são conhecidos na técnica.
[00222] Os aerossóis inaláveis contendo gás propelente de acordo com a invenção podem conter até 5 % em peso de substância ativa. Aerossóis de acordo com a invenção contêm, por exemplo, de 0,002 a 5 % em peso, de 0,01 a 3 % em peso, de 0,015 a 2 % em peso, de 0,1 a 2 % em peso, de 0,5 a 2 % em peso ou de 0,5 a 1 % em peso de ingrediente ativo.
[00223] Alternativamente as administrações tópicas ao pulmão também podem ser pela administração de uma formulação de solução ou suspensão líquidas, por exemplo utilizando um dispositivo tal como um nebulizador, por exemplo, um nebulizador conectado a um compressor (por exemplo, o nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a um compressor Pari Master(R) fabricado pela Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
[00224] O anticorpo da invenção pode ser liberado disperso em um solvente, por exemplo,, na forma de uma solução ou uma suspensão. O mesmo pode ser colocado em suspensão em uma solução fisiológica apropriada, por exemplo, solução salina ou outro solvente farmacologicamente aceitável ou uma solução tamponada. As soluções tamponadas conhecidas na técnica podem conter 0,05 mg a 0,15 mg de edetato de dissódio, 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, 0,15 mg a 0,25 mg de polissorbato, 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anidro, e 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sódio por 1 ml de água de modo a se obter um pH de cerca de 4,0 a 5,0. Uma suspensão pode utilizar, por exemplo, anticorpo liofilizado.
[00225] As formulações de suspensões ou solução terapêuticas também podem conter um ou mais excipientes. Os excipientes são bem conhecidos na técnica e incluem tampões (por exemplo, tampão de citrato, tampão de fosfato, tampão de acetato e tampão de bicarbonato), aminoácidos, uréia, álcoois, ácido ascórbico, fosfolipídeos, proteínas (por exemplo, albumina sérica), EDTA, cloreto de sódio, lipossomas, manitol, sorbitol, e glicerol. As soluções ou suspensões podem ser encapsuladas em lipossomas ou microesferas biodegradáveis. A formulação geralmente será fornecida em uma forma substancialmente estéril utilizando processos de fabricação estéreis.
[00226] Isto pode incluir a produção e esterilização pela filtração do solvente/solução tamponados usados para a formulação, suspensão asséptica do anticorpo na solução de solvente tamponada estéril, e dispensa da formulação em receptáculos estéreis pelos métodos familiares a aqueles de habilidade comum na técnica.
[00227] A formulação nebulizável de acordo com a presente divulgação pode ser fornecida, por exemplo, como unidades de dose única (por exemplo, recipientes e frascos plásticos selados) embalados em envelopes de folha metálica. Cada frasco contém uma dose unitária em um volume, por exemplo, de 2 ml, de solvente/solução tampão.
[00228] Os anticorpos aqui divulgados podem ser adequados para a liberação via nebulização.
[00229] Também é considerado que o anticorpo da presente invenção possa ser administrado pelo uso da terapia de gene. De modo a obter isto, as sequências de DNA que codificam as cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo sob o controle de componentes de DNA apropriados são introduzidos em um paciente tal que as cadeias de anticorpo são expressas a partir de sequências de DNA e montadas in situ.
[00230] Em uma forma de realização a presente divulgação compreende o uso de anticorpos ou fragmentos do mesmo como um reagente ou diagnóstico, por exemplo conjugados a uma molécula repórter. Assim é fornecido anticorpo ou fragmento de acordo com a divulgação que é rotulado. Em um aspecto é fornecida uma coluna compreendendo um anticorpo ou fragmento de acordo com a divulgação.
[00231] Assim é fornecido um anticorpo anti-CSF-1R ou fragmento para o uso como um reagente para usos tais como: 1) purificação da proteína CSF-1R (ou fragmento de ligação da mesma) - sendo conjugada a uma matriz e usada como uma coluna de afinidade, ou (como uma forma modificada de anti- CSF-1R) como um agente de precipitação (por exemplo, como uma forma modificada com um domínio reconhecido por uma outra molécula, que pode ser modificada), que é opcionalmente precipitada por um reagente anti-Fc) 2) detecção e/ou quantificação de CSF-1R nas células ou em células, vivas ou fixas (células in vitro ou em seções de tecido ou célula). Os usos para isto podem incluir a quantificação de CSF-1R como um biomarcador, para seguir o efeito do tratamento com anti-CSF-1R. Para estes propósitos, o candidato seria usado em uma forma modificada (por exemplo, pela adição de uma outra porção, como uma proteína de fusão genética ou conjugado químico, tal como a adição de uma molécula repórter, por exemplo um rótulo fluorescente usado para os propósitos de detecção). 3) purificação ou classificação de células que carregam CSF-1R rotuladas pela ligação ao candidato modificado pelos modos exemplificados em (1) e (2).
[00232] Compreendendo no contexto do presente relatório descritivo é intencionado a significar incluindo.
[00233] Onde tecnicamente apropriado, as formas de realização da invenção podem ser combinadas.
[00234] As formas de realização são aqui descritas como compreendendo certos traços/elementos. A divulgação também se estende às formas de realização separadas consistindo ou consistindo essencialmente do dito traço/elementos.
[00235] Referências técnicas tais como patentes e pedidos são aqui incorporadas por referência.
[00236] Qualquer uma das formas de realização específica e explicitamente aqui citadas pode formar a base de uma ressalva sozinha ou em combinação com uma ou mais outras formas de realização.
[00237] A presente invenção é descrita ainda apenas por via de ilustração nos seguintes exemplos, que se referem às seguintes Figuras:
[00238] Figuras 1A a 1F mostram certas sequências de aminoácido e polinucleotídeo.
[00239] Figuras 2A e 2B mostram alinhamentos de certas sequências.
[00240] Figura 3 mostra a sequência do domínio extracelular de CSF-1R humano codificada por um polinucleotídeo utilizado para transfectar células e expressar a proteína na superfície da célula. Estas células foram depois utilizadas para imunizar animais hospedeiros.
[00241] Figura 4 mostra a inibição da ligação de CSF-1 à células THP-1 pelo anticorpo Ab969.
[00242] Figura 5a mostra a inibição da sobrevivência e proliferação dirigida por CSF-1 pelos monócitos humanos primários pelo anticorpo Ab969.
[00243] Figura 5b mostra a inibição de IL-34 dirigida à sobrevivência e proliferação pelos monócitos humanos primários pelo anticorpo Ab969.
[00244] Figura 6 mostra a inibição da sobrevivência e proliferação dirigida por CSF-1 pelos monócitos de murino primários pelo anticorpo Ab535.
[00245] Figura 7 mostra os níveis de CSF-1R de superfície celular nas células THP-1 incubadas com Ab969, CSF-1 humano e um controle de isótipo.
[00246] Figura 8 mostra o nível relativo de CSF-1R de superfície celular nas células THP-1 tratadas com Ab969 comparadas a um controle de isótipo.
[00247] Figura 9 mostra os níveis de CSF-1R de superfície celular nas células RAW264,7 incubado com Ab 535, CSF-1 e um controle de isótipo.
[00248] Figura 10 mostra o nível relativo de CSF-1R de superfície celular nas células RAW264,7 tratadas com Ab535 comparadas a um controle de isótipo.
[00249] Figura 11 mostra o nível de fosforilação de CSF-1R nas células HEK293F transfectadas com CSF-R na estimulação com CSF-1 ou tratamento com Ab969.
[00250] Figura 12 mostra o nível de secreção de MCP-1 a partir dos monócitos humanos primários quando incubados com Ab969 e com CSF-1.
[00251] Figura 13 mostra o efeito sobre a inibição de sobrevivência de monócito mediada pelo CSF-1 pelo anticorpo humanizado 969.g5 comparado ao Ab969.g0 quimérico.
[00252] Figura 14 mostra o efeito sobre a inibição da sobrevivência de monócito mediada pelo CSF-1 pelos vários enxertos de anticorpo humanizados de Ab969.
[00253] Figura 15a mostra a concentração de CSF-1 em amostras séricas tiradas de macacos cinomolgos tratadas com uma única dose intravenosa de 7 mg/kg de Ab969.g2.
[00254] Figura 15b mostra a concentração de CSF-1 em amostras séricas tiradas de macacos cinomolgos tratados com uma única dose intravenosa de 1,5 mg/kg de Ab969.g2.
[00255] Figura 15c mostra o efeito de administrar o anticorpo Ab969.g2 aos macacos cinomolgos nas dosagens de 7 mg/kg e 1,5 mg/kg sobre os monócitos não clássicos circulantes em pontos de tempo diferentes.
[00256] Figura 16 mostra o efeito antitumor de anticorpo Ab535, vs. um anticorpo de controle, um controle positivo e o controle de veículo em camundongos nus imunodeficientes carregando transplantes subcutâneos do xenoenxerto de câncer de mama humano MCF-7.
[00257] Figura 17 mostra a eficácia antitumoral do anticorpo Ab535 vs. um anticorpo de controle, um controle positivo e o controle de veículo em um modelo de câncer prostático ortotópico PC-3.
[00258] Figura 18a mostra o efeito do tratamento de fibrose pulmonar induzida com bleomicina com Ab535 sobre a concentração de colágeno BALF comparada a um controle de isótipo.
[00259] Figura 18b mostra o efeito do tratamento de fibrose pulmonar induzida por bleomicina com Ab535 sobre a patologia fibrótica das amostras de pulmão medida pela contagem de Ashcroft comparadas com um controle de isótipo.
[00260] Figura 18c mostra o efeito de tratamento da fibrose pulmonar induzida por bleomicina com Ab535 sobre a concentração de albumina no soro comparada a um controle de isótipo.
[00261] Figura 18d o número de macrófagos no fluido BAL de camundongos de um estudo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina e mostra que o tratamento de fibrose pulmonar induzida por bleomicina com Ab535 reduziu o número de macrófagos em fluido BAL comparado aos animais tratados controle de isótipo. Os dados mostrados como médias ± SEM; * Indica diferença significante do isótipo salino; # indica diferença significante de camundongos tratados com bleomicina dosados com anticorpo de controle de isótipo (p < 0,05)
[00262] Figura 19 imagens representativas da análise histopatológica de pulmões de animais tratados com controle salino, bleomicina mais controle de isótipo e bleomicina mais Ab535.
[00263] Figura 20a mostra o efeito do tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 sobre a concentração de colágeno BALF comparado ao tratamento com o controle de isótipo.
[00264] Figura 20b mostra o efeito de tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 sobre a patologia fibrótica de amostras de pulmão medida pela contagem de comparado ao tratamento com o controle de isótipo.
[00265] Figura 20c mostra o efeito do tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 sobre a concentração de albumina no soro comparado ao tratamento com o controle de isótipo.
[00266] Figura 20d mostra o número de macrófagos no fluido BAL de camundongos de um modelo deficiente em ADA de fibrose pulmonar e mostra que o tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 reduziu o número de macrófagos no fluido BAL.
[00267] Figura 21 mostra imagens representativas da análise histopatológica dos pulmões de camundongos normais (ADA+) e camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida (ADA-) ambos tratados com controle de isótipo ou Ab535.
[00268] EXEMPLOS
[00269] Exemplo 1 - Geração de um anticorpo anti-CSF-1 R
[00270] Imunização:
[00271] Ratos Sprague Dawley fêmeas foram imunizados com fibroblastos de rato RFL6 singênico que foram transitoriamente transfectados com um vetor que expressa o domínio extracelular de CSF-1R humano ligado a uma âncora de glicosilfosfatidil-inositol (GPI). A Figura 3 mostra a SEQ ID NO: 39 que é a sequência do domínio extracelular de CSF-1R humano usado na imunização de ratos.
[00272] Os ratos receberam cinco imunizações subcutâneas em intervalos de três semanas de 3 a 9 x 106 células transfectadas por animal. Adjuvante Completo de Freund (50 % em PBS) foi injetado em um sítio adjacente com a primeira imunização de célula. Duas semanas após a imunização final, as células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) e os baços foram colhidos.
[00273] Triagem Primária de Sobrenadantes de Anticorpo
[00274] Os sobrenadantes de anticorpo foram inicialmente triados quanto à sua capacidade para ligar CSF-1R humano expresso nas células HEK293 transfectadas pela tecnologia de ensaio de microvolume de fluorescência (FMAT).
[00275] Aproximadamente 1000 reservatórios com reatividade anti-CSF-1R foram identificados em uma triagem FMAT primária de 600 x placas de 96 reservatórios. No total, aproximadamente 3 x 108 células B (esplenócitos de rato) foram triadas quanto à produção de anticorpos de ligação de CSF-1R por FMAT.
[00276] Triagem Secundária dos Sobrenadantes de Anticorpo
[00277] Um ensaio direto ao meio foi desenvolvido para identificar reservatórios positivos em FMAT que contivessem atividade anti-CSF-1R neutralizante, isto é, anticorpos que tivessem a capacidade para impedir a ligação de CSF-1 humano ao receptor de CSF-1R humano. Os sobrenadantes de anticorpo foram incubados com células THP-1 que expressam CSF-1R antes da incubação com CSF-1 humano. O nível de ligação de CSF-1 às células THP-1 foi medida pela citometria de fluxo usando um anticorpo policlonal anti-CSF-1. Sobrenadantes irrelevantes de anticorpo foram usados como controles negativos.
[00278] A triagem secundária foi aplicada aos sobrenadantes de 779 reservatórios de anticorpo e 88 destes reservatórios demonstraram atividade de bloqueio de CSF- 1 detectável.
[00279] Triagem Terciária dos Sobrenadantes de Anticorpo
[00280] Os sobrenadantes de anticorpo que mostraram neutralizar a atividade na triagem secundária foram testados quanto à sua capacidade para prevenir a sobrevivência dependente de CSF-1 de monócitos humanos primários. Os monócitos foram purificados a partir de sangue humano e 1 x 104 células incubadas com cada sobrenadante de anticorpo na presença de 20 ng/ml de CSF-1 humano. Depois de 72 horas de incubação, o número de monócitos viáveis foi medido pelo ensaio CellTiter Glo.
[00281] A triagem terciária foi aplicada aos sobrenadantes de 59 dos reservatórios de anticorpo identificados na triagem secundária e 18 reservatórios demonstraram uma capacidade para reduzir a sobrevivência de monócito mediada pelo CSF-1.
[00282] Clonagem de regiões variáveis de anticorpo e reanálise da atividade de bloqueio
[00283] A clonagem da região variável (região V) foi tentada a partir dos 18 reservatórios de anticorpo que demonstram atividade de neutralização de CSF-1. As regiões V de imunoglobulina pesada e leve foram amplificadas pela RT-PCR usando iniciadores específicos para as regiões constantes de anticorpo de rato e um conjunto de iniciador redundante que recoze às sequências que codificam peptídeos líder da imunoglobulina de rato. Os genes das regiões V foram recuperados de 14 anticorpos e clonados em vetores de expressão de IgG4 humana de cadeia pesada e leve.
[00284] Os pares de vetor de anticorpo foram transitoriamente transfectados em células HEK293F e o meio condicionado testado quanto à atividade neutralizante de CSF-1 nas células THP-1 (como descrito acima). Nove dos anticorpos tiveram a capacidade para inibir parcial ou totalmente a ligação de CSF-1 comparada ao meio condicionado de controle.
[00285] Análise de sequência de nove anticorpos de neutralização anti-CSF-1R
[00286] Os nove anticorpos neutralizantes foram sequenciados para avaliar a diversidade de sequência. Todos os nove anticorpos foram únicos. Estes anticorpos foram clonados e expressados para outros estudos de definição de perfil.
[00287] Exemplo 2 -Propriedades In Vitro de Ab969 Anti-CSF-1R Humano Quimérico e Ab535 Anti-CSF-1R de Murino
[00288] As regiões variáveis dos nove anticorpos neutralizantes identificados no Exemplo 1 foram clonados em vetores de expressão de cadeia pesada e leve separados e foram expressas como anticorpos IgG4 humanos de tamanho natural.
[00289] Os genes VH foram clonados no vetor pVhg4FL(V19H), que contém DNA que codifica uma sequência líder natural e a região constante da cadeia pesada gama-4 humana com a mutação estabilizante de dobradiça S241P. Os genes VL (capa) foram clonados no vetor pKH10,1(V4L), que contém DNA que codifica uma sequência líder natural e a região constante de cadeia capa humana (alotipo Km3).
[00290] Os anticorpos foram expressos pela co-transfecção transitória de pares de vetor de cadeia pesada e leve adequados dentro das células CHO-K1. A purificação dos anticorpos em PBS pH 7,4 foi realizada de modo que o nível de agregado na preparação final fosse menor do que 1 %.
[00291] O painel de nove anticorpos incluiu um anticorpo designado anticorpo 969. O anticorpo quimérico compreendendo as regiões variáveis de rato e a região constante de cadeia pesada gama 4 humana e a região constante de cadeia capa humana é aludido como anticorpo 969 ou anticorpo 969cHcL ou anticorpo 969.g0 nos seguintes exemplos.
[00292] ii) Ensaio de Bloqueio de Ligante
[00293] A capacidade de cada um dos nove anticorpos para inibir a ligação de CSF-1 às células THP-1 foi avaliada pela citometria de fluxo. As células THP-1 foram incubadas com cada anticorpo a 0,5, 0,125, 0,031, 0,0078 e 0,00195 μg/ml por 30 minutos. Um anticorpo IgG4 irrelevante serviu como um controle de isótipo. Depois da lavagem, as células foram incubadas com 0,5 μg/ml de CSF-1 humano por 30 minutos. Depois de lavagem adicional, o CSF-1 ligado foi detectado pela incubação sequencial com anticorpo anti-CSF-1 biotinilado e estreptavidina conjugada com Alexa488. O ligante ligado ao receptor foi medido pela citometria de fluxo e a intensidade de fluorescência média (MFI) plotada.
[00294] Estes ensaios identificaram quatro anticorpos, incluindo Ab969, que foram superiores aos anticorpos remanescentes testados, demonstrando a inibição completa da ligação de CSF-1 em uma concentração de 31,3 ng/ml. Os resultados para Ab969 são mostrados na Figura 4.
[00295] iii) Inibição da sobrevivência de monócito mediada por CSF-1 & IL-34
[00296] Anti-CSF-1R humano:
[00297] Os anticorpos anti-CSF-1R humanos purificados foram testados quanto à sua capacidade para inibir a sobrevivência e proliferação dirigida por CSF-1 e IL-34 de monócitos humanos primários. Em cada ensaio, o mitógeno (CSF-1 ou IL-34) foi usado em uma concentração que desse a estimulação máxima dos monócitos.
[00298] As PBMCs humanas foram preparadas a partir de sangue integral humano fresco em um gradiente de Ficoll e os monócitos purificados pela seleção negativa. Os monócitos foram incubados com 0,25 μg/ml de anticorpo e 20 ng/ml de CSF-1 por 72 horas e o número relativo de células viáveis determinado usando a análise de CellTiter Glo. A leitura de luminescência correlaciona-se com o número de células viáveis. Resultados mostrados na Figura 5a.
[00299] As PBMCs humanas foram preparadas a partir de sangue integral humano fresco em um gradiente de Ficoll e os monócitos purificados pela seleção negativa. Os monócitos foram incubados com 0,25 μg/ml de anticorpo e 20 ng/ml de IL-34 por 72 horas e o número relativo de células viáveis determinado usando a análise CellTiter Glo. A leitura de luminescência correlaciona-se com o número de células viáveis. Resultados mostrados na Figura 5b.
[00300] Quatro dos anticorpos incluindo Ab969 demonstraram inibição superior de sobrevivência de monócito comparados aos anticorpos remanescentes tanto para a estimulação de CSF-1 (Figura 5a) quanto de IL-34 (Figura 5b), em linha com as suas atividades de bloqueio de ligante.
[00301] CSF-1R Anti-Camundongo:
[00302] Monócitos de CD11b+ de murino primários foram purificados a partir dos baços de camundongo. Os monócitos foram depois incubados com uma titulação de CSF-1 de murino (mCSF-1) por 24 horas. A liberação de MCP-1 no meio de célula foi medida pelo ELISA e uma liberação dependente da dose de MCP-1 pelo mCSF-1 demonstrada. Em um ramo separado do estudo, 10 μg/ml de CSF-1R anti-murino Ab535 foram adicionados junto com a titulação do mCSF-1. A liberação de MCP-1 foi completamente inibida pelo Ab535 em todas as concentrações de CSF-1 testadas (Figura 6).
[00303] O ensaio de liberação de MCP-1 foi realizado usando monócitos de murino primários com uma concentração de CSF-1 constante de 100 ng/ml e uma titulação de Ab535. Uma inibição dependente da dose da liberação de MCP-1 foi demonstrada e uma IC50 calculada. A IC50 média de Ab535 de dois experimentos independentes foi determinada ser de 8,08 ng/ml.
[00304] Conclusão: o tratamento de monócitos de murino com CSF-1 causou uma liberação dependente da dose de MCP-1, que foi completamente inibida pelo tratamento com 10 μg/ml de Ab535. Ab535 inibe a liberação de MCP-1 dirigida por CSF-1 de monócitos de murino em uma maneira dependente da dose, com uma IC50 média de 8,08 ng/ml (n = 2). Este valor IC50 é similar a aquele exibido pelos anticorpos anti-CSF-1R humano.
[00305] iv) Afinidade
[00306] Os anticorpos foram testados quanto à sua capacidade para ligar CSF-1R em um ensaio BIAcore pela medição das cinéticas de ligação a uma proteína de fusão de CSF-1R/Fc recombinante purificada.
[00307] O formato de ensaio foi a captura dos anticorpos anti-CSF-1R pelo anti- IgG humano, F(ab’)2 imobilizado, depois uma titulação de hCSF-1R/Fc na superfície capturada. BIA (Biamolecular Interaction Analysis) foi realizada usando um BIAcore 3000 (GE Healthcare Bio-Sciences AB). Todos os experimentos foram realizados a 25 °C. O fragmento F(ab’)2 Affinipure IgG anti-ser humano de cabra, fragmento F(ab’)2 específico (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado em um CM5 Sensor Chip (GE Healthcare Bio-Sciences AB) por intermédio da química da ligação de amina a um nível de ~5000 unidades de resposta (RU). O tampão HBS-EP (10 mM de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005 % de Tensoativo P20, GE Healthcare Bio-Sciences AB) foi usado como o tampão de condução com uma taxa de fluxo de 10 μ l/min. Uma injeção de um anticorpo anti-CSF-1R foi realizada para dar um nível de captura de aproximadamente 100 RU no IgG anti-humano,F(ab)2 imobilizado.
[00308] CSF-1R/Fc humano recombinante (R&D Systems) foi passado sobre o anticorpo anti-CSF-1R capturado a 5 nM em uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 5 min depois a taxa de fluxo foi aumentada para 100 μl/min por 30 min para a fase de dissociação. A injeção a 5 nM foi realizada duas vezes junto com um controle de tampão correspondente. Estes sensorgramas foram usados para gerar a taxa de dissociação. CSF-1R/Fc humano recombinante foi titulado no anticorpo anti-CSF-1R capturado de 2,5 nM a uma taxa de fluxo de 30 μl/min por 5 min seguido por uma fase de dissociação de 10 min. Estes sensorgramas foram usados para gerar a taxa de associação. A superfície foi regenerada a uma taxa de fluxo de 10 μl/min por uma injeção de 10 μl de HCl a 40 mM seguido por uma injeção de 5 μl de NaOH a 10 mM. As curvas de ligação subtraídas do fundo de referência dupla foram analisadas usando o software BIAevaluation (versão 4.1) seguindo procedimentos padrão. Os parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo de ajuste.
[00309] Três dos quatro anticorpos testados exibiram afinidades (KD) de menos do que 10 pM. Isto compara favoravelmente com o reagente paralelo anti-CSF-1R de murino, Ab535. Os resultados para Ab969 e Ab553 são mostrados na Tabela 1.
[00310] Tabela 1:
[00311] A afinidade dos anticorpos também foi medida por um ensaio com base em célula usando células THP-1. Os anticorpos foram diretamente rotulados com corante fluorescente Alexa-488 e a afinidade medida pela citometria de fluxo quantitativa. Uma análise BIAcore adicional confirmou que a conjugação fluorescente dos anticorpos não alteraram a afinidade com a proteína CSF-1R recombinante. Os resultas são mostrados na Tabela 2.
[00312] Os valores de afinidade absoluta derivados pelas duas metodologias são diferentes, e esta diferença é usualmente observada quando os dois sistemas são comparados. Entretanto, o método com base em célula demonstrou que os anticorpos ligam CSF-1R com alta afinidade.
[00313] Tabela 2
[00314] v) Inibição da ligação de CSF-1 (IC50)
[00315] Quatro anticorpos foram analisados medindo-se a sua potência relativa na ligação de inibição de CSF-1 às células THP-1. Todos os quatro anticorpos exibiram inibição potente de ligação de CSF-1 com valores IC50 de menos do que 5 ng/ml (~30 pM) neste formato de ensaio.
[00316] Tabela 3
[00317] vi) Reatividade cruzada de anticorpo
[00318] Quatro anticorpos foram testados quanto à reatividade cruzada com CSF- 1R de tamanho natural de macaco rhesus, macaco cinomolgo e canino. Todos os quatro anticorpos ligaram CSF-1R de rhesus e cinomolgo além do CSF-1R humano, demonstrando ligação evidente significantemente acima do nível do controle de isótipo.
[00319] Tabela 4
[00320] vii) Internalização de CSF-1R
[00321] Ab969:
[00322] As células THP-1 foram incubadas com Ab969 por 0, 0,5, 2, 4, 24 e 48 horas. As células também foram tratadas com CSF-1 humano e um controle de isótipo que serviu como controles positivo e negativo respectivamente. Em cada ponto de tempo, o nível de CSF-1R de superfície celular foi medida pela citometria de fluxo (Figura 7). O nível relativo de CSF-1R de superfície celular nas células tratadas com Ab969 comparado ao controle de isótipo foi calculado e é mostrado na Figura 8.
[00323] O tratamento de células THP-1 com CSF-1 recombinante causou uma diminuição rápida e prolongada no nível de CSF-1R de superfície celular; o ligante natural se liga ao seu receptor cognato e dirige a internalização do complexo ligante- receptor.
[00324] As células THP-1 tratadas com Ab969 exibiram níveis mais altos da expressão de CSF-1R de superfície celular comparada com as células THP-1 de controle de isótipo não tratadas e tratadas por todo o curso de tempo de 48 horas. Estes dados fortemente sugerem que o tratamento das células THP-1 com Ab969 não causa a internalização de hCSF-1R expresso na superfície da célula até 48 horas após o tratamento.
[00325] Conforme o curso de tempo progrediu houve um aumento notável no CSF-1R expresso na de superfície celular nas células THP-1 não tratadas e tratadas, com a exceção das células tratadas com CSF-1. Isto seria devido às mudanças na expressão durante o período de crescimento de célula no período de tempo de 48 horas do experimento e potencialmente seria uma resposta de estresse.
[00326] De modo a fornecer evidência adicional de que Ab969 não potencia a internalização de receptor, e também impedir a possibilidade de que a linhagem de célula THP-1 não seja de monócitos humanos primários, fisiologicamente relevante também foram usados em um ensaio de internalização. Os dados deste ensaio também demonstrou que Ab969 não causa a internalização rápida de CSF-1R de superfície celular em monócitos humanos primários saudáveis.
[00327] Ab535:
[00328] A linhagem de célula de monócito/macrófago leucêmicos de camundongo RAW264,7 expressa altos níveis de CSF-1R de murino (mCSF-1R) e representa um sistema com base em célula adequado para testar se o anticorpo de CSF-1R anti- murino Ab535 pode evocar a internalização de receptor.
[00329] As células RAW264,7 foram incubadas com Ab535 por 0, 0,5, 2, 4, 24 e 48 horas. As células também foram tratadas com CSF-1 humano e um controle de isótipo que serviu como um controle positivo e negativo respectivamente. Em cada ponto de tempo, o nível de CSF-1R de superfície celular foi medido pela citometria de fluxo (Figura 9). O nível relativo de CSF-1R de superfície celular comparado com o controle de isótipo foi calculado e é mostrado na Figura 10.
[00330] Os dados mostram, que o tratamento de células THP-1 com CSF-1 recombinante causou uma diminuição rápida e prolongada no nível de CSF-1R de superfície celular.
[00331] Uma redução evidente dos níveis de mCSF-1R de superfície celular foi observada nas células RAW264,7 tratadas com CSF-1 humano por 2 horas em relação às células não tratadas e tratadas com controle de isótipo. Esta redução é mantida por todo o estudo de 48 horas. Isto demonstra que CSF-1 humano evoca a internalização de mCSF-1R e valida o sistema experimental para monitorar a internalização de receptor.
[00332] As células RAW264,7 tratadas com Ab535 exibem níveis similares de mCSF-1R de superfície celular comparadas com as células não tratadas e tratadas com controle de isótipo por todo o curso de tempo inteiro das 48 horas. Visto que a internalização de receptor mediada pelo anticorpo seria esperada ocorrer dentro deste período de tempo, estes dados fortemente sugerem que Ab535 não deflagra a internalização de mCSF-1R.
[00333] De modo a fornecer evidência adicional de que Ab535 não potencia a internalização de receptor, monócitos-macrófagos CD11b+ de murino primário foram usados em um ensaio de internalização. Estes resultados também demonstraram que o tratamento de monócito-macrófagos camundongo com Ab535 não causam a internalização de mCSF-1R expresso na superfície celular até 24 horas após o tratamento.
[00334] viii) Ativação de CSF1-R
[00335] CSF-1 se liga ao CSF-1R, causando a formação de dímeros de receptor, que deflagra a fosforilação de receptor rápida levando-se os domínios da cinase junto em proximidade imediata. Isto subsequentemente leva à internalização de receptor e à ativação de vários caminhos de transdução de sinal bem caracterizados incluindo o caminho de Ras-MAPK. É possível que um anticorpo anti-CSF-1R evocaria o agrupamento de receptor e a deflagração da cascata de sinalização a jusante. Isto pode ser uma propriedade indesejada para um anticorpo que deve inibir a sinalização de receptor, deste modo o agonismo de receptor pelo Ab969 foi testado usando dois formatos de ensaio in vitro independentes.
[00336] No primeiro formato de ensaio, os anticorpos foram incubados com células transfectadas com CSF-1R de tamanho natural humano e fosforilação do receptor e moléculas de transdução de sinal a jusante monitorado pela Western blotting.
[00337] A linhagem de célula THP-1 representou um ponto de partida para monitorar a situação de ativação de CSF-1R. Entretanto, o nível de expressão de CSF-1R nesta linhagem de célula é relativamente baixa tornando difícil realizar a análise bioquímica. Portanto um sistema experimental foi desenvolvido de modo que o nível de fosforilação de CSF-1R seria robustamente detectada. A fosforilação de CSF-1R pode ser detectada em dois resíduos de tirosina, Y723 e Y809. Além disso, a fosforilação de p44/42 MAPK (Erk1/2) em T202 e Y204 foi medida como uma leitura independente da atividade de CSF-1R. A estimulação com CSF-1 foi incluído como um controle positivo em todos os experimentos.
[00338] As células HEK293F foram transfectadas com um vetor plasmídico que expressa CSF-1R de tamanho natural. Depois de 24 horas de incubação em condições isentas de soro, as células foram estimuladas com uma titulação de 100 μg/ml a 0,001 μg/ml de titulação de Ab969.g0 por 5 minutos. As células foram também tratadas com 500 ng/ml de CSF-1 recombinante para fornecer um controle positivo. As células não tratadas foram incluídas como um controle negativo. Os lisados de proteína de células tratadas quanto não tratadas foram separadas pela eletroforese em SDS-poliacrilamida e manchada sobre nitrocelulose. O Western immunoblotting foi realizado usando anticorpos para fosfo-Y723 CSF-1R (Cell Signaling Technology #3151), fosfo-Y809 (Cell Signaling Technology #3154), CSF- 1R total (Cell Signaling Technology #3152) e fosfo-ERK1/2 (p44/42 MAPK) (Cell Signaling Technology #5301).
[00339] As células HEK293F transfectadas com CSF-1R não estimulado exibiram um nível basal baixo de fosforilação com CSF-1R. A estimulação de células com CSF-1 resultou em um nível de fosforilação de CSF-1R nos resíduos Y723 e Y809 facilmente observado pela análise de Western blotting (Figura 11). Também houve estimulação evidente da fosforilação de ERK1/2 no tratamento com CSF-1. O tratamento das células HEK293F transfectadas com anticorpo Ab969.g0 não estimulou a fosforilação de CSF-1R ou potenciou a ativação de ERK1/2.
[00340] Em um segundo ensaio, o anticorpo Ab969 (monomérico e reticulado) foi incubado com monócitos humanos primários e a secreção de MCP-1 usada como um marcador da ativação de CSF-1R. O tratamento com CSF-1 de monócitos humano fez com que os mesmos liberassem proteína-1 quimioatraente de monócito (MCP-1). Se os anticorpos anti-CSF-1R têm uma capacidade para ativar o receptor de CSF-1R nos monócitos, uma liberação de MCP-1 seria esperada ocorrer.
[00341] Os ensaios bioquímicos descritos anteriormente usaram apenas anticorpo anti-CSF-1R monomérico. entretanto, é possível que uma IgG1 reticulada tivesse uma capacidade realçada para levar as moléculas de CSF-1R em proximidade imediata e deflagrar a fosforilação da tirosina e sinalização a jusante. Para avaliar isto, o ensaio de MCP-1 também foi realizado usando Ab969.g0 que foi reticulado com um anticorpo anti-Fc humano.
[00342] Os monócitos humanos foram preparados a partir do sangue integral humano como segue: 60 a 100 ml de sangue integral humano foi coletado em Tubos Vacutainer de 10 ml com 171 IU de Heparina de Lítio da BD. O sangue foi dividido em 3 a 4 tubos Leucosep Ficoll (Greiner Bio-A) e completados até o topo com PBS. Os tubos foram centrifugados a 1000g, 20 °C por 10 minutos sem nenhum freio, e a camada de PBMC foi coletada. As células foram pelotizadas, e os monócitos foram depois isolados usando grânulos de CD14 humano de seleção positiva (Miltenyi Biotec 130-050-201) de acordo com o protocolo do fabricante. O anticorpo Ab969.g0 foi reticulado pela adição de anticorpo IgG Fc anti-ser humano de cabra (R&D Systems G-102-C) em uma razão de 2:1 de Ab969.g0:Fc. Os monócitos foram semeados a 20.000 células por reservatório em meio na presença de uma titulação de dose de anticorpo Ab969.g0 ou Ab969.g0 reticulado (série de diluição semi-log compreendendo 16 concentrações, máximo 10 μg/ml). Os reservatórios de controle contidos no anticorpo, na presença e ausência de 100 ng/ml de CSF-1, e na presença e ausência de anticorpo anti-Fc humano (na mesma concentração como presente na concentração de topo do anticorpo Ab969.g0 (5 μg/ml)). As células foram incubadas por 24 horas, as placas foram giradas para pelotizar as células, e o sobrenadante coletado. A MCP-1 secretada foi medida por MSD (K151AYB-2) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00343] O resultado do experimento é mostrado na Figura 12. Nenhum aumento nos níveis de MCP-1 foi detectado para qualquer um dos tratamentos com Ab969.g0, no formato monomérico ou reticulado; a concentração de MCP-1 no meio de células tratadas foi idêntica às células não tratadas. Como esperado, as células tratadas com CSF-1 deram um aumento significante e reprodutível nos níveis de MCP-1.
[00344] Exemplo 3 - Humanização de Anticorpo 969 & seleção de enxerto humanizado
[00345] Quatro anticorpos anti-CSF-1R foram selecionados para a humanização com base na sua afinidade e propriedades medidas no Exemplo 2.
[00346] Os anticorpos 969 e 970 foram humanizado enxertando-se as CDRs das regiões V de anticorpo de rato nas armações da região V de anticorpo da linha germinativa humana.
[00347] As CDRs enxertadas do doador à sequência aceitadora são como definidas por Kabat (Kabat et al., 1987), com a exceção de CDR-H1 onde a definição de Chothia/Kabat combinadas é usada (ver Adair et al., 1991 Humanized Antibodies. WO91/09967).
[00348] A região V humana VK1 2-1-(1) O12 mais a região J JK4 (V BASE, http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foram escolhidas como o aceitador para as CDRs de cadeia leve. A região V humana VH2 3-1 2-70 mais a região J JH3 (V BASE, http: //vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) foram escolhidas como o aceitador para as CDRs de cadeia pesada.
[00349] Vários resíduos de armação das regiões V de rato foram retidas nas sequências humanizadas, como mostrado na Tabela 1.
[00350] Os genes que codificam as sequências da região V das cadeias leve e pesada humanizadas iniciais, denominados gL1 e gH1, respectivamente, foram designados e construídos por um método de síntese automatizado. Outras variantes de regiões V tanto de cadeia leve quanto pesada foram criadas modificando-se os genes gL1 e gH1 pela mutagênese direcionada ao oligonucleotídeo.
[00351] Os genes VK (gL1 a gL9) foram clonados no vetor de expressão de cadeia leve humana pKH10,1, que contém o DNA que codifica a região constante da cadeia Capa humana (alotipo Km3). Os genes VH (gH1 e gH2) foram clonados no vetor de expressão de cadeia pesada gama 4 humano pVhY4P FL, que contém DNA que codifica a região constante de cadeia pesada gama 4 humana com a mutação estabilizadora de dobradiça S241P (Angal et al., 1993, Mol Immunol. 30: 105-8). Combinações diferentes de plasmídeos que codificam as cadeias leve e pesada variantes foram cotransfectadas em HEK293F, resultando na expressão dos anticorpos 969 humanizados, recombinantes.
[00352] Os outros três anticorpos anti-CSF-1R também foram humanizados fornecendo-se um enxerto conservativo contendo vários resíduos doadores nas cadeias pesada e leve prognosticadas ser de importância e um enxerto totalmente humanizado não contendo nenhum dos resíduos doadores.
[00353] ii) Afinidade de anticorpos humanizados
[00354] Cada enxerto humanizado foi avaliado quanto a (i) afinidade de ligação ao CSF-1R humano pelo BIAcore e (ii) temperatura de fusão (Tm) medida pela análise ThermoFluor, ambas relativas ao anticorpo quimérico precursor. Acredita-se que a temperatura de fusão forneça uma indicação inicial da estabilidade de uma molécula de anticorpo, com os anticorpos instáveis tipicamente exibindo uma Tm menor do que 75,0 °C.
[00355] Os enxertos representando os estágios de humanização de Ab969 são mostrados na Tabela 5. A Tabela 5 também mostra o anticorpo quimérico de Ab696 (969cHcL). O enxerto conservativo (969gH1gL1) exibiu uma constante de afinidade (KD) de 2,4 pM, de modo que não houvesse perda aparente de afinidade comparada com a do anticorpo de rato quimérico (969cHcL). A Tm do enxerto conservativo 969gH1gL1 foi de 78,8 °C e portanto acima de um valor limítrofe de 75,0 °C. A substituição do resíduo doador A78 para V78 na cadeia pesada para produzir 969gH2gL1 não reduziu a afinidade de anticorpo (KD = 2,3 pM). Na substituição escalonada dos resíduos doadores K38, Y71 e F87, para Q38, F71 e Y87 respectivamente, nenhuma mudança na afinidade foi observada. O enxerto humanizado 969gH2gL8 final não contendo nenhum dos resíduos doadores exibiu uma afinidade similar ao anticorpo quimérico precursor (4,1 pM).
[00356] Tabela 5
[00357] Ab969 possui um motivo de isomerização DG potencial na junção de CDR-L2 e a armação. Este resíduo de ácido aspártico no sítio DG nos enxertos 969gH2gL7 e 969gH2gL8 foi mutado para serina para dar uma sequência SG inerte. A afinidade para CSF-1R foi medida pelo BIAcore e nenhuma perda aparente de afinidade detectada (Tabela 6). Além disso, os enxertos 969H2gL7(SG) e 969gH2gL8(SG) finais retiveram uma Tm alta de 80,5 °C e 79,9 °C respectivamente.
[00358] Tabela 6
[00359] A humanização de Ab969 e um outro anticorpo anti-CSF-1R Ab970 gerou anticorpos totalmente humanizados (nenhum dos resíduos doadores de rato presentes) com afinidade (KD) equivalente ao anticorpo quimérico precursor e uma Tm que deu um prognóstico inicial de estabilidade de molécula. A versão totalmente humanizada de Ab969 (969gH2gL8 SG)) foi renomeada Ab969.g5. Daqui em diante, a versão quimérica de Ab969 será aludida como Ab969.g0.
[00360] A afinidade de enxertos quiméricos e humanizados purificados de anticorpos Ab969 para CSF-1R recombinante foi medida mais uma vez usando a análise BIAcore. Experimentos BIAcore anteriores realizados durante o processo de humanização foram realizados usando células sobrenadantes brutas ao invés de anticorpo purificado. Uma redução leve na afinidade foi detectada, com valores KD sendo aumentados de aproximadamente 4 pM para 5 pM.
[00361] Tabela 7
[00362] iii) Inibição de sobrevivência de monócito mediada pelo CSF-1 pelo Ab969.g0 e Ab969.g5
[00363] O CSF-1 é requerido para a ativação e sobrevivência de monócitos em cultura; se CSF-1 é removido então os monócitos rapidamente sofrem apoptose. Um ensaio foi desenvolvido que usou MCP-1 (proteína-1 quimiotática monocítica; também conhecida como CCL2, ligante de motivo C-C de quimiocina 2) como uma leitura. Na estimulação com CSF-1, os monócitos humanos secretam MCP-1, que podem ser detectados nos sobrenadantes de célula por um ELISA, tipicamente 24 horas depois da estimulação. A inibição da sinalização de CSF-1R pelos anticorpos que bloqueiam a ligação de CSF-1 causa uma redução na secreção de MCP-1.
[00364] As PBMCs humanas foram preparadas a partir de sangue integral humano fresco em um gradiente de Ficoll e os monócitos CD14+ purificados pela seleção positiva. Um total de 2 x 104 monócitos foram incubados com uma série de diluição semi-log de 10 μg/ml para 0,35 pg/ml de anticorpo na presença de 100 ng/ml de CSF-1 humano por 24 horas. Os controles compreendendo ‘nenhum anticorpo, nenhum CSF-1’ e ‘nenhum anticorpo, com CSF-1’ foram incluídos para fornecer valores mínimo e máximo de liberação de MCP-1. Depois da incubação por 24 horas, as células foram pelotizadas pela centrifugação e o sobrenadante coletado. A concentração de MCP-1 foi medida usando o CCL2/MCP-1 DuoSet ELISA Humano (R&D Systems DY279) seguindo as instruções do fabricante.
[00365] Daqui em diante o ensaio é aludido como o ‘ensaio de inibição de MCP-1’.
[00366] O ensaio de inibição de MCP-1 foi utilizado para comparar a atividade de 969.g5 humanizado com Ab969.g0 quimérico. Cinco ensaios independentes foram realizados usando quatro doadores diferentes de monócitos. Em todos os ensaios, o enxerto Ab969.g5 humanizado exibiu uma atividade inesperada significantemente mais baixa comparada ao precursor de anticorpo quimérico 969.g0. Um único experimento representativo é mostrado na Figura 13. A IC50 média para 969.g0 no ensaio de monócito foi 24,6 ng/ml, comparado aos 333,0 ng/ml para 969.g5. Isto indica uma diminuição de 13,5 vezes na potência do anticorpo quando ambos os anticorpos são comparados usando este formato de ensaio.
[00367] Uma série de experimentos foi realizada usando Ab969 de modo a revelar porque o anticorpo humanizado exibiu uma atividade reduzida no ensaio de inibição de MCP-1. Os dados sugeriram que a perda de atividade de Ab969.g5 observada no ensaio de inibição de MCP-1 foi devido à ordem em que o anticorpo e ligante foram adicionados às células alvo. A atividade tanto de Ab969.g0 quanto de Ab969.g5 foi reduzida quando um formato de ensaio competitivo é aplicado, porém mais importantemente, um diferencial maior na sua atividade de bloqueio foi detectado. Para analisar se uma ‘taxa de associação’ mais baixa de Ab969 humanizado seria responsável pela redução na potência uma análise BIAcore foi realizada. Estes dados identificaram que, embora a KD de Ab969.g0 e Ab969.g5 fossem similares, o Ka foi mais baixo para Ab969.g5, a 1,57 x 106 M-1s-1 comparado a 2,16 x 106 M-1s-1 para 969.g0 (ver a Tabela 5). Em um ensaio competitivo, onde CSF-1 e o anticorpo anti-CSF-1R estão competindo quanto à ligação ao mesmo receptor, uma taxa de associação de anticorpo mais lenta resultaria em atividade de bloqueio reduzida se a taxa de associação para o ligante também é alta e o ligante está presente em uma alta concentração. É conhecido que CSF-1 humano tem uma taxa de associação particularmente alta a 2,19 x 106 M-1s-1, similar aos anticorpos, e o ensaio foi realizado com uma alta concentração de CSF-1 (250 ng/ml).
[00368] De modo a fornecer mais evidência de que a redução na atividade de bloqueio de 969.g5 foi devida a uma propriedade inata do anticorpo, um ELISA que mede a ligação de CSF-1 ao CSF-1R foi desenvolvido. Este método é daqui em diante aludido como o ‘ensaio ELISA bloqueador de ligante’. Este ensaio foi realizado usando a ligação competitiva, onde CSF-1 e anticorpo foram pré- misturados antes da aplicação ao CSF-1R ligado à placa. O ensaio também foi realizado para avaliar a influência da concentração de CSF-1 sobre a atividade do anticorpo.
[00369] Quando a IC50 de 969.g0 e 969.g5 foi medida no ELISA bloqueador de ligante usando uma concentração de CSF-1 de 1 ng/ml, ambos os anticorpos pareceram ter uma atividade similar com uma IC50 de 12,83 ng/ml versus 19,65 ng/ml respectivamente. Quando uma concentração de 10 ng/ml de CSF-1 foi usada no ensaio, a IC50 tanto de Ab969.g0 quanto de Ab969.g5 aumentou, porém mais importantemente, o diferencial entre eles aumentou ainda mais para 79,29 ng/ml versus 268,10 ng/ml respectivamente. A tendência continuou em um ensaio usando 100 ng/ml de CSF-1, onde Ab969.g0 e Ab969.g5 deram valores IC50 de 828,70 ng/ml e 3947,00 ng/ml respectivamente. Um ensaio competitivo demonstra que Ab969.g5 é menos ativo do que Ab969.g0 no bloqueio da ligação de CSF-1 ao CSF-1R. Esta redução na potência torna-se mais pronunciada conforme a concentração de CSF-1 é aumentada.
[00370] iv) Identificação de enxertos humanizados de Ab 969 com atividade equivalente ao Ab 969 quimérico no ensaio de inibição de MCP-1
[00371] Um painel de enxertos intermediários humanizados de Ab969 foram preparados pela expressão transitória de modo que a atividade in vitro pudesse ser comparada (Tabela 8). O anticorpo quimérico correspondente (Ab969.g0) e enxerto totalmente humanizado (Ab969.g5) também foram incluídos na expressão transitória de modo que uma comparação direta de características de anticorpo pudessem ser feitas dentro do mesmo lote.
[00372] Tabela 8:
[00373] A atividade in vitro de cada anticorpo foi testada no ensaio de inibição de MCP-1. O formato de ensaio que usa uma titulação de CSF-1 com uma única concentração de anticorpo foi escolhida, visto que o formato possibilita a triagem rápida de um painel de anticorpo grande e salienta qualquer atividade de bloqueio de CSF-1R diferencial. Neste ensaio, uma liberação dependente da dose de MCP-1 dos monócitos humanos primários foi detectada e a capacidade relativa de cada anticorpo para bloquear a atividade de CSF-1R medida pela concentração de CSF-1 onde MCP-1 foi liberado. Os monócitos foram semeados a 20.000 células por reservatório em meio na presença de uma titulação de CSF-1 humano recombinante (série de diluição de 2 vezes compreendendo 18 concentrações, máximo 500 ng/ml). Uma dose única de 1 μg/ml de anticorpo foi adicionada. As células foram incubadas por 24 h e o sobrenadante coletado. A MCP-1 secretada foi medida pelo ELISA. O ensaio de inibição de MCP-1 revelou que os anticorpos Ab969.g2 e Ab969.g7 retiveram atividade de bloqueio de CSF-1R alta, com ambas as entidades capazes de inibir completamente a secreção de MCP-1 quando CSF-1 foi adicionado aos monócitos em uma concentração maior de 100 ng/ml (Figura 14). Neste ensaio, uma perda clara de atividade foi detectada para Ab969.g5, que apenas inibiria a secreção de MCP-1 até uma concentração de CSF-1 de 10 ng/ml. Similarmente, o anticorpo Ab969.g9 exibiu atividade de bloqueio de CSF-1R reduzida comparado a Ab969.g2 e Ab969.g7.
[00374] A IC50 de enxertos Ab969 humanizados selecionados foi medida no ensaio de MCP-1 para fornecer uma avaliação mais completa da sua capacidade relativa para inibir a ativação de monócito mediada por CSF-1. Foi considerado importante avaliar a atividade de anticorpo usando vários doadores diferentes sem nenhuma reunião de monócitos de fontes mistas. A Tabela 9 mostra valores IC50 dos anticorpos acumulados de ensaios realizados no Ab969 usando 6 doadores diferentes.
[00375] Tanto o enxerto humanizado Ab969.g2 quanto o Ab969.g7 exibiram uma IC50 relativa que é comparável com o anticorpo Ab969.g0 quimérico. Em forte contraste, Ab969.g5, exibe muito menos potência no ensaio (razão IC50 quimérica/enxerto média de uns 19,6).
[00376] Tabela 9:
[00377] v) Afinidade do painel de anticorpo de Ab696 humanizado
[00378] A afinidade de cada enxerto de anticorpo Ab969 humanizado e o anticorpo quimérico precursor foi medida pelo BIAcore (Tabela 10) onde três experimentos independentes foram realizados e os valores médios calculados. Os dados mostram que a afinidade (KD) não parece mudar durante o processo de humanização de molécula quimérica (Ab969.g0) através do anticorpo Ab969.g5 ‘totalmente humanizado’. Entretanto, a ‘taxa de associação’ do anticorpo diminui quando a humanização se processa além do enxerto Ab969.g2; tanto Ab969.g4 quanto Ab969.g5 possuem valores Ka mais baixos do que os enxertos precedentes. Além disso, o Ka para Ab969.g5 é mais baixo do que Ab969.g4, indicando potencialmente que a mutação do sítio de isomerização de DG para SG reduz a taxa de associação de anticorpo ainda mais.
[00379] Tabela 10:
[00380] Conclusões:
[00381] O teste de um painel de enxerto Ab969 humanizado em vários ensaios revelou que o resíduo de tirosina na posição 71 (por exemplo, Y71) dentro da cadeia leve melhorou a atividade do anticorpo. A substituição de Y71 por exemplo, por uma fenilalanina resulta em uma redução da taxa de associação do anticorpo (Ka diminuído) em relação à molécula quimérica precursora. Estes resultados em uma capacidade reduzida do anticorpo para bloquear a ligação de CSF-1 ao CSF-1R, revelados em um ensaio monitorando a atividade de CSF-1R em monócitos humanos primários (ensaio de inibição de MCP-1).
[00382] Exemplo 4 - Estabilidade Molecular do painel Ab696 humanizado
[00383] A estabilidade térmica (medida como temperatura de fusão, Tm) foi determinada por dois métodos independentes; um método monitora o desdobramento pela ligação de corante fluorescente às superfícies hidrofóbicas expostas (método Thermofluor), o outro pela calorimetria (DSC), uma técnica ortogonal.
[00384] A Tm medida pelo Thermofluor para vários enxertos de anticorpo 969 (em PBS pH 7,4) está resumida na Tabela 11.
[00385] Tabela 11
[00386] No geral, a Tm de Fab’ como medida pelo Thermofluor sugere que a maioria dos enxertos 969 são termicamente mais estáveis do que o controle de IgG4.
[00387] ii) O efeito da concentração da amostra sobre a propensão à agregação
[00388] Como um prognosticador da estabilidade das amostras durante a armazenagem, o efeito da concentração de anticorpo sobre a estabilidade em PBS pH 7,4 foi estudado.
[00389] Experimento 1:
[00390] Os anticorpos foram concentrados a >10 mg/ml e incubados na temperatura ambiente por 5 dias. Imediatamente depois da concentração (T0) 969.g7 mostrou-se turvo e 969.g8 mostrou-se levemente opalescente. Ao contrário, a amostra 969.g5 foi julgada estar límpida pela inspeção visual. Depois de 5 dias de incubação na temperatura ambiente a amostra 965.g5 permaneceu límpida, ao passo que a agregação de 969.g7 e 969.g8 progrediram ainda mais, cada uma exibindo um precipitado pesado.
[00391] Para este estudo, foi possível classificar as amostras na ordem de resistência à agregação nestas condições como segue: 969.g5 > 969.g8 > 969g7.
[00392] Experimento 2:
[00393] Antes da concentração, todos as três amostras de anticorpo foram límpidas pela inspeção visual com a exceção de 969.g6 (a 4,68 mg/ml) que se mostrou opalescente. Na concentração a 16 mg/ml, a precipitação de 969.g6 foi observada depois de 24 horas de armazenagem tanto na temperatura ambiente quanto a 4 °C. entretanto, tanto 969.g1 quanto 969.g4 permaneceram visivelmente límpidas. Depois de 5 dias de incubação adicional, partículas grandes foram evidentes para a amostra 969.g1 tanto na temperatura ambiente quanto a 4 °C. Nenhuma agregação foi observada para a amostra 969.g4 na temperatura ambiente ou 4 °C, como julgado pela inspeção visual.
[00394] A partir deste estudo foi possível mostrar que 969.g6 teve alguma instabilidade de agregação quando armazenada em concentração baixa (4,68 mg/ml) em PBS pH 7,4. Além disso, esta precipitação foi exacerbada por outra concentração de anticorpo. 969.g1 concentrada mostrou uma taxa mais lenta de agregação, ao passo que a 969.g4 concentrada permenceu estável até 5 dias em cada temperatura de armazenagem. A ordem de estabilidade à agregação foi portanto: 969.g4 > 969.g1 > 969.g6.
[00395] Experimento 3: Anticorpos 969.g2, 969.g5, 969.g7 e 969.g9
[00396] A análise foi realizada nas amostras imediatamente depois da concentração (T0), depois de uma incubação durante a noite e 5 dias depois da concentração. Todas as amostras foram límpidas pela inspeção visual antes da concentração e não houve nenhuma evidência de formação de partícula. Imediatamente depois da concentração para 23,07 mg/ml, a amostra 969.g7 mostrou precipitação como foi anteriormente observado no experimento 1. Houve leve opalescência observada com 969.g9, que se tornou mais acentuada depois de 24 horas de armazenagem na temperatura ambiente ou 4 °C. Todos os outros enxertos 969 mostraram-se límpidos pela inspeção visual imediatamente após a concentração.
[00397] Depois de 21 dias de incubação não houve nenhuma mudança visível daquela observada depois da incubação durante a noite na temperatura ambiente; os enxertos tanto 969.g7 quanto 969.g9 agregaram como um resultado de concentrar as amostras enquanto não houve nenhuma agregação visível óbvia para as outras amostras.
[00398] No geral a amostra 969.g2 mostrou a tendência mínima para agregar como um resultado de aumentar a concentração. Isto também se correlacionou com a Tm mais alta como medida pelo Thermofluor.
[00399] Conclusão: Durante a expressão e purificação do painel Ab969 humanizado, tornou-se evidente que o aumento da concentração de anticorpo acima de 10 mg/ml resultou em rápida precipitação de alguns enxertos de anticorpo humanizados. Especificamente, Ab969.g1, Ab969.g6 e Ab969.g7 formaram precipitado, enquanto Ab969.g2, Ab969.g4 e Ab969.g5 não formaram. Estes dados indicam que uma substituição do resíduo de lisina na posição 38 (K38) dentro da cadeia leve para glutamina melhora a estabilidade de anticorpo quando concentrada acima de 10 mg/ml.
[00400] Exemplo 5 Análise in vitro de Ab969.g2
[00401] Ab969.g2 contém o enxerto de cadeia leve gL7 e enxerto de cadeia pesada gH2. Os alinhamentos das sequências da região V de anticorpo de rato (doador) com as sequências da região V da linha germinativa humana (aceitadora) são mostradas nas Figuras 2A e 2B, junto com as sequências humanizadas finais para o enxerto de cadeia leve gL7 e enxerto de cadeia pesada gH2.
[00402] Os resíduos de armação da cadeia pesada no enxerto gH2 são todos do gene da linha germinativa humana. O resíduo de Glutamina na posição 1 da armação de cadeia pesada humana foi substituído com ácido glutâmico (E1) para melhorar a expressão e purificação de um produto homogêneo por exemplo, pela conversão de Glutamina para piroGlutamato no terminal N de anticorpos e fragmentos de anticorpo.
[00403] Os resíduos da armação de cadeia leve no enxerto gL7 são todos do gene da linha germinativa humana, com a exceção do resíduo 71 (Numeração de Kabat), onde o resíduo doador Tirosina foi retido. A retenção deste resíduo forneceu potência melhorada do anticorpo humanizado como mostrado no Exemplo 3.
[00404] ii) Inibição da ativação de monócito humano dependente de IL-34
[00405] A atividade de Ab969.g2 comparada ao 969.g0 foi avaliada no ensaio de monócito humano dependente de IL-34. O experimento foi realizado usando dois doadores de monócito separados e a IC50 média para a inibição da estimulação de monócito mediada por IL-34 calculada (Tabela 12). Não houve nenhuma diferença significante na IC50 entre Ab969.g2 e Ab969.g0.
[00406] Monócitos humanos primários foram semeados a 20.000 células por reservatório na presença de 100 ng/ml de IL-34 humana recombinante e uma titulação de dose de anticorpo anti-CSF-1R (série de diluição hemi-log compreendendo 16 concentrações, máxima de 10 μg/ml). As células foram incubadas por 24 horas e o sobrenadante coletado. A MCP-1 secretada foi medida pelo ELISA (R&D systems DY279). O gráfico mostra a inibição percentual da produção de MCP-1 comparada ao controle de apenas CSF-1.
[00407] Tabela 12
[00408] iii) Ligação de Ab969.g2 ao SNPs de CSF-1R humano
[00409] Existem quatro polimorfismos de nucleotídeo único não sinônimos (SNPs) localizados dentro do domínio de ligante-ligação do gene de CSF-1R humano que foi relatado na população humana. Estes SNPs são V32G, A245S, H247P e V279M (Figura 1F). Cada variante de SNP de CSF-1R humano foi gerada e estavelmente expressa nas linhagens celulares. A ligação de Ab969.g2 a cada SNP foi confirmada pela citometria de fluxo.
[00410] Exemplo 6 Análise de marcador farmacodinâmico em macaco cinomolgo
[00411] Um estudo farmacocinético/farmacodinâmico (PK/PD) com o anticorpo monoclonal anti-CSF-1R humanizado 969.g2 foi realizado para demonstrar a atividade farmacológica do anticorpo em um primata não humano (macaco cinomolgo). Grupos de três macacos cinomolgos foram dosados intravenosamente com uma dose única de 7 mg/kg (Grupo 1) ou 1,5 mg/kg (Grupo 2) de anticorpo 969.g2. O anticorpo foi bem tolerado sem nenhum sinal clínico adverso. As amostras foram coletadas em pontos de tempo múltiplos por todos os 25 dias de estudo.
[00412] A concentração sérica de 969.g2 foi medida pelo ELISA e a análise farmacocinética realizada (Tabela 13). Os parâmetros PK foram calculados usando software WinNonlin.
[00413] t1/2 é a meia-vida de anticorpo no soro.
[00414] Cmax é a concentração de pico de anticorpo no soro.
[00415] AUC é a área sob a curva (a integral da curva de concentração-tempo) e fornece uma indicação da exposição total ao medicamento.
[00416] Depuração é o volume de plasma depurado do medicamento por tempo unitário.
[00417] Vol. Dist. é o volume de distribuição, o volume aparente no qual um medicamento é distribuído.
[00418] Houve uma boa correlação entre os valores observado e prognosticado (o animal 2 sendo uma exceção e considerado como um estranho). A Cmax foi proporcional à dose; a AUC foi maior do que o proporcional de dose, indicando depuração mais lenta na dose mais alta. A maioria de 969.g2 foi detectada no soro.
[00419] Tabela 13
[00420] A via primária para a depuração de CSF-1 é através da ligação ao seu receptor cognato, CSF-1R. O bloqueio da ligação de CSF-1 ao CSF-1R é esperada aumentar a concentração sérica de CSF-1 não obstante a prevenção da depuração medida pelo receptor; um fenômeno que foi observado em modelos de murino. Portanto, um aumento na concentração de CSF-1 sérica é um marcador farmacodinâmico de alistamento e inibição de CSF-1R.
[00421] Ambas as doses de 969.g2 instigaram um acúmulo rápido e significante de CSF-1 sérico. O efeito foi dependente da dose, com a dose de 7 mg/kg dando uma concentração de CSF-1 de pico de aproximadamente 10 vezes mais alta do que a dose de 1,5 mg/kg. Uma relação farmacocinética/farmacodinâmica foi observada com a normalização dos níveis de CSF-1 a seguir da depuração do anticorpo. Os níveis de CSF-1 retornaram para a linha de base no final do estudo para ambos os grupos de tratamento. Os resultados são mostrados nas Figuras 15a e 15b.
[00422] A Figura 15a mostra a concentração de CSF-1 nas amostras séricas tiradas de macacos cinomolgos tratados com uma única dose intravenosa de 7 mg/kg de Ab969.g2. A concentração sérica de CSF-1 foi medida em dois ensaios independentes. O gráfico mostra a concentração média de CSF-1 para os três animais no Grupo 1 (7 mg/kg) com erro padrão (quadrados). Também é mostrada a concentração sérica média de Ab969.g2 (círculos).
[00423] A Figura 15b mostra a concentração de CSF-1 nas amostras séricas tiradas de macacos cinomolgos tratados com uma única dose intravenosa de 1,5 mg/kg de Ab969.g2. A concentração sérica de CSF-1 foi medida em dois ensaios independentes. O gráfico mostra a concentração média de CSF-1 para os três animais no Grupo 2 (1,5 mg/kg) com erro padrão (quadrados). Também é mostrada a concentração sérica média de Ab969.g2 (círculos).
[00424] Existem duas populações principais de monócitos circulantes de ser humano e macaco cinomolgo; (i) monócitos ‘clássico’ de CD14+ CD16 e (ii) monócitos ‘não clássicos’ ou ‘residentes’ de CD14+ CD16+. Os modelos de murino demonstraram que macrófagos de tecido residentes, incluindo TAMs, são derivados da população de monócito não clássica. Além disso, os monócitos não clássicos são derivados de diferenciação adicional da população de monócito clássico. As populações de monócito circulante em macacos cinomolgos dosados com 969.g2 foram monitorados pela citometria de fluxo de quatro cores de sangue integral. A citometria de fluxo foi realizada usando anticorpos anti-cino-CD45-PerCP, anti-ser humano-HLA-DR-APC, anti-ser humano-CD14-FITC (clone My4) e anti-ser humano- CD16-PE (clone 3G8). Obstruções foram ajustadas usando o controle de isótipo apropriado para cada anticorpo. Os monócitos clássicos foram definidos como CD45+ HLA-DR+ CD14+ CD16-. Os monócitos não clássicos foram definidos como CD45+ HLA-DR+ CD14+ CD16+.
[00425] Ambas as doses de 969.g2 instigaram uma depleção gradual de monócitos CD14+ CD16+ não clássicos por toda a primeira semana do estudo. A depleção quase total de monócitos não clássicos foi causada pela dose de 7 mg/kg. A redução de monócito não clássico tanto pela dose de 7 mg/kg quanto pela de 1,5 mg/kg mostraram atingir o pico no ponto de tempo do dia 4, com os números retornando para normal pelo dia 11. Os resultados são mostrados na Figura 15c. Os gráficos de barra mostram o número médio de monócitos CD14+ CD16+ não clássicos circulantes nos pontos de tempo por todo o estudo (dias (D) 0, 1, 4, 18 e 25) com erro padrão. A concentração média de CSF-1 sérico também é plotada com erro padrão.
[00426] Este exemplo confirmou que (i) o anticorpo 969.g2 foi capaz de ligar CSF- 1R e bloquear a ligação de CSF-1 no macaco cinomolgo, (ii) demonstrou a atividade farmacológica do anticorpo 969.g2 em um modelo de primata não humano, (iii) demonstrou que o anticorpo 969.g2 seletivamente esgotou a população não clássica de monócitos de macaco cinomolgo in vivo - a população de monócito acreditada ser precursores de macrófagos associados a tumor, e (iv) que a concentração de CSF-1 sérica foi adequada como um biomarcador para medir a atividade de 969.g2.
[00427] Exemplo 7: Inibição do Crescimento de Xenoenxertos de Câncer de Mama MCF-7
[00428] O anticorpo 969.g2 não é capaz de ligação ao CSF-1R de camundongo. Consequentemente, estudos de camundongo in vivo foram realizados usando um anticorpo de CSF-1R anti-murino Ab535 para mostrar a utilidade de Ab969.g2 para tratar câncer e fibrose. Ab535 foi mostrado ter propriedades e atividade comparáveis ao Ab969.g2 em vários experimentos in vitro.
[00429] Ab535 foi mostrado inibir a sobrevivência de monócito mediada pelo CSF- 1 no Exemplo 2 iii), tem uma afinidade comparável no Exemplo 2 iv) e não deflagra a internalização de CSF-1R no Exemplo 2 vii).
[00430] Como estudo in vivo sobre Ab535 o modelo de xenoenxerto de câncer mamário MCF-7 in vivo foi realizado como segue:
[00431] O estudo mediu a eficácia terapêutica do anticorpo Ab535, administrado subcutaneamente (s.c.), vs. um anticorpo de controle, um controle positivo e o controle de veículo em camundongos nus imunodeficientes que carregam transplantes subcutâneos do xenoenxerto de câncer mamário humano MCF-7. A inibição do crescimento de tumor foi usada como parâmetro terapêutico. O câncer mamário humano de MCF-7 foi usado como modelo de xenotransplante subcutâneo em camundongos fêmea NMRI:nu/nu. A linhagem de célula MCF-7 foi obtida do banco do National Cancer Institute (USA). Para o uso experimental, células foram cultivadas in vitro em meio RPMI 1640 + 10 % de FCS. As células foram tiradas de culturas subconfluentes e inoculadas subcutaneamente em camundongos. No tamanho de tumor palpável (4 a 10 mm) o tratamento iniciou. Os compostos de teste e o controle de veículo foram administrados s.c. três vezes por semana. O controle positivo foi administrado intravenosamente uma vez ao dia nos dias 24, 33 e 40. Os volumes de injeção foram individualmente ajustados ao peso corporal no momento da injeção. Os diâmetros de tumor foram medidos três vezes por semana com um calibre. Os volumes de tumor foram calculados de acordo com V = (comprimento x (largura)2)/2. Para o cálculo do volume de tumor relativo (RTV) os volumes em cada dia de medição foram relacionados ao dia do primeiro tratamento. Em cada dia de medição os volumes de tumor intermediários e médios por grupo e também os valores intermediários de tratado para controle (T/C) em porcentagem foram calculados.
[00432] Os resultados são mostrados na Figura 16. Ab535 mostrou um efeito antitumor dependente da dose. Ambas as dosagens do anticorpo IgG de camundongo de controle não induziram uma inibição do crescimento de tumor. Os volumes de tumor relativos foram comparáveis com o controle de veículo e a inibição do crescimento de tumor causada pelo controle positivo.
[00433] Conclusão: o anticorpo de teste Ab535 induziu um efeito antitumor estaticamente significante nos xenoenxertos de câncer mamário humano MCF-7 na dose mais alta (30 mg/kg/dia).
[00434] Exemplo 8: Inibição de Crescimento de câncer prostático ortotópico PC-3
[00435] A eficácia antitumoral e antimetastática de anticorpo Ab535 também foi testada usando um modelo de câncer de próstata ortotópico PC-3 in vivo. A linhagem de célula PC-3 foi geneticamente alterada para expressar continuamente a luciferase possibilitando a análise de imageamento de bioluminescência in vivo, que permitiu monitorar o crescimento de tumor in vivo e realizar a análise de metástase ex vivo nos órgãos selecionados.
[00436] O estudo consistiu de 6 grupos experimentais, cada um contendo 11 (Grupo 5) ou 12 (todos os outros Grupos) camundongos nus em NMRI machos depois da randomização. No dia 0, as células PC-3 foram ortotopicamente implantadas na próstata de todos os camundongos nus em NMRI machos participantes. No dia 3, o início do crescimento de tumor foi verificado por intermédio do imageamento de bioluminescência in vivo. No dia 8, um segundo imageamento de bioluminescência in vivo foi realizado e os animais que carregam tumor foram randomizados em seis grupos de acordo com os resultados do imageamento tal que a intensidade de bioluminescência média e assim o tamanho do tumor foi similar em cada Grupo. No dia seguinte (dia 9), a terapia foi iniciada. Os animais dos Grupos 2 e 3 receberam 30 e 10 mg/kg de Anticorpo de Controle, respectivamente, 3x por semana s.c. até o dia 42. Os animais dos Grupos de Tratamento 4 e 5 receberam 30 e 10 mg/kg de anticorpo Ab535, respectivamente, 3x por semana s.c. até o dia 42. Os animais do Grupo 1 representaram o Controle de Veículo e receberam Veículo (PBS) 3x por semana s.c. até o dia 42. Os animais do Grupo 6 representaram o Controle Positivo e receberam 360 mg/kg de controle i.v. uma vez por semana durante quatro semanas (nos dias 10, 17, 24 e 31). Durante o curso do estudo, o crescimento dos tumores PC-3 ortotopicamente implantados foi monitorado in vivo nos dias 3, 8 (randomização), 15, 22, 29, 36 e 43 usando o imageamento de bioluminescência.
[00437] Uma necropsia foi realizada no final do estudo. O peso e volume do tumor primário foram determinados. Os órgãos selecionados (fígado, baço e pulmão) foram coletados, uma porção de cada um fixada em formalina e o resto analisado com respeito ao padrão de metástase via imageamento de bioluminescência usando um ensaio de luciferase in vitro. Adicionalmente, o fêmur de uma perna e a mesma porção de espinha lombar foram coletados para analisar o padrão de metástase nos ossos usando o ensaio de luciferase in vitro.
[00438] O sinal de bioluminescência in vivo foi composto tanto de tumor primário quanto de metástases (imageamento de corpo inteiro). Com base nestes dados, uma curva de crescimento de tumor pode ser calculada para todos os grupos (Figura 17). O desenvolvimento de tumor foi homogêneo dentro de todos os grupos de estudo até a randomização e início da terapia. No seguinte, o Grupo de Controle de Veículo 1 assim como os dois Grupos 2 e 3 de Anticorpo de Controle RTE11 apresentaram um crescimento de tumor regular. Uma redução altamente significante de crescimento de tumor medido in vivo no dia 43 pôde ser observada para o controle positivo (Grupo 6). O anticorpo Ab535, administrado a 30 ou 10 mg/kg, respectivamente (Grupos 4 e 5), levou a uma redução significante de crescimento de tumor quando monitorado usando o imageamento de bioluminescência in vivo.
[00439] Os volumes e pesos líquidos de tumor primário foram determinados durante a necrópsia no dia 44. O Controle Positivo (Grupo 6), levou a uma redução altamente significante tanto do volume quanto do peso do tumor primário. O anticorpo Ab535 foi administrado a 30 mg/kg (Grupo 4), uma redução significante tanto do volume quanto do peso do tumor primário pôde ser observada. Quando Ab535 foi administrado a 10 mg/kg (Grupo 5), a redução do volume de tumor foi perceptível mas menos do que mostrado pelo Grupo 4. Nenhuma eficácia antitumoral significante pôde ser observada no caso do Anticorpo de Controle.
[00440] Usando a técnica de imageamento de bioluminescência, as atividades de luciferase de tumor primárias foram medidas após a necrópsia. Os resultados obtidos foram comparáveis aos resultados das descobertas de necrópsia e a curva de crescimento in vivo. O controle positivo (Grupo 6) levou a uma redução altamente significante da atividade de luciferase de tumor primário. O anticorpo Ab535, administrado a 30 mg/kg (Grupo 4), levou a uma redução significante da atividade de luciferase do tumor primário, ao passo que a redução foi menor, quando Ab535 foi administrado a 10 mg/kg (Grupo 5). Nenhuma redução significante da atividade de luciferase seria encontrada para o Anticorpo de Controle.
[00441] Vários órgãos adicionais (fígado, baço, pulmão, fêmur e uma parte da espinha lombar) foram analisados usando a técnica de imageamento de bioluminescência ex vivo. No caso do controle positivo, reduções significantes da atividade de luciferase seria mostrado para fêmur e espinha lombar, ao passo que a redução de sinalização foi exatamente abaixo da significância no caso de fígado e baço. No caso do anticorpo Ab535, administrado a 30 mg/kg (Grupo 4), a redução da atividade de luciferase foi significante para o fígado e perceptível para todos os outros órgãos. O Anticorpo de Controle (Grupos 2 e 3) não levaram a nenhuma redução da atividade de luciferase em todos os órgãos testados.
[00442] Em conclusão, uma eficácia antitumoral significante seria demonstrada para o anticorpo Ab535 neste modelo de tumor, combinado com uma eficácia antimetastática perceptível.
[00443] Exemplo 9: Efeito de anticorpo anti-CSF-1R em um modelo in vivo induzido por bleomicina de fibrose pulmonar
[00444] A bleomicina é um antibiótico isolado primeiro a partir de Streptomyces verticillatus e foi usada como um quimioterapêutico para vários cânceres. O modelo de bleomicina de fibrose pulmonar é um modelo bem estabelecido e foi usado essencialmente como descrito em Madtes, DK et al, 1999, Am J Respir Cell Mol Biol, 20, 924-34. O protocolo detalhado pode ser encontrado na seguinte referência Morschl, E., Molina, J. G., Volmer, J., Mohsenin, A., Pero, R. S., Hong, J. S., Kheradmand, F., Lee, J. J. e Blackburn, M. R. (2008), A3 adenosine receptor signaling influences pulmonary inflammation and fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 39: 697-705.
[00445] Todos os camundongos usados foram camundongos C57Blk6 fêmeas do tipo selvagem (20 g) adquiridos da Harlan Labs. Uma instilação de corte intratraqueal (IT) foi usada onde os camundongos foram anestesiados com avertina e uma traqueostomia realizada de modo a instilar uma dose de 3,5 Unidades de bleomicina em 50 μl de solução salina ou apenas 50 μl de solução salina como um controle. O tratamento desta maneira leva a uma fase inflamatória que atinge o pico no dia 7 depois da exposição à bleomicina e uma fase fibrótica que é máxima no dia 21 após a exposição. O efeito do anticorpo Ab535 foi investigado onde o anticorpo foi dosado apenas na fase fibrótica do modelo e foi administrado subcutaneamente a 30 mg/kg, três vezes por semana a partir dos dias 9 a 21. Os animais foram sacrificados no dia 21 e as leituras incluíram a análise histopatológica dos pulmões, a celularidade fluídica BAL (lavagem broncoalveolar) e a medição de colágeno solúvel no fluido BAL. A análise histopatológica foi conduzida para classificar o dano pulmonar usando um sistema de contagem Ashcroft modificado para determinar a severidade da fibrose pulmonar (Hubner RH et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). Os pulmões excisados foram inflados com formalina a 10 % para 25 cm de pressão e processados através de uma série de álcoois e xileno, embutidos em parafina e as seções de tecido desparafinadas antes do processamento e tingimento com Tricromo de Masson.
[00446] As quantidade de colágeno solúvel no fluido BAL foi avaliado usando um kit de ensaio Sircol comercialmente disponível seguindo as instruções do fabricante.
[00447] O efeito sobre a população de macrófago no fluido de BAL foi determinado usando preparações de cytospin. As alíquotas de células BAL foram girados sobre as lâminas de microscópio, tingido com Diff-Quick e macrófagos contados.
[00448] Foi descoberto que o tratamento terapêutico com o anticorpo anti-CSF- 1R, Ab535, com dosagem iniciada no dia 9 resultou na fibrose pulmonar enormemente reduzida induzida por bleomicina. Tanto a severidade quanto o grau de fibrose foram significantemente reduzidos. Os camundongos tratados reduziram a produção de colágeno, melhoraram a patologia fibrótica e melhoraram proteção de barreira pulmonar.
[00449] A Figura 18a mostra que o tratamento de fibrose pulmonar induzida por bleomicina com Ab535 reduziu a concentração de colágeno de BALF comparado ao tratamento com o controle de isótipo.
[00450] A Figura 18b mostra que o tratamento de fibrose pulmonar induzida por bleomicina com Ab535 reduziu a contagem de Ashcroft das amostras comparadas ao tratamento com o controle de isótipo que assim mostra que os camundongos tratados com Ab535 tiveram patologia fibrótica melhorada.
[00451] A Figura 18c mostra que o tratamento de fibrose pulmonar induzida por bleomicina com Ab535 reduziu a concentração de albumina no soro comparado ao tratamento com o controle de isótipo que assim mostra que a permeabilidade vascular dos camundongos tratados com Ab535 foi melhorada.
[00452] A Figura 19 mostra imagens representativas da análise histopatológica de pulmões do controle de solução salina, bleomicina mais controle de isótipo e bleomicina mais animais tratados com Ab535. Os animais tratados com Ab535 tiveram uma fibrose enormemente reduzida dos pulmões comparados aos animais de controle de isótipo, tratados com bleomicina.
[00453] Exemplo 10. Efeito de anticorpo anti-CSF-1R em um modelo de camundongo deficiente de adenosina desaminase de fibrose pulmonar
[00454] A adenosina é um nucleosídeo de sinalização potente, os níveis da qual aumentam quando as células sofrem estresse ou são danificadas e uma ampla variedade de respostas são produzidas quando a adenosina engrena seus receptores ligados à proteína G específica. A adenosina desaminase (ADA) é uma enzima do catabolismo de purina que converte adenosina para inosina. Os camundongos nocautes em ADA foram gerados e mostrados ter níveis aumentados de adenosina no soro assim como nos tecidos tais como rim, fígado e pulmão (Blackburn, MR et al, 1998, J Biol Chem, 273(9): 5093-5100). Estes camundongos exibem traços de doença pulmonar crônica tais como destruição alveolar, inflamação das vias aéreas e produção de muco excessivo que são associados com níveis aumentados de adenosina no pulmão (Blackburn MR et al, 2000, J Exp Med, 192: 159-70). Os efeitos são tais que os camundongos morrem em três semanas de idade devido à angústia respiratória. A administração de ADA exógeno usando um regime de dose baixa reduz os níveis de adenosina e se prolonga a expectativa de vida destes camundongos permitindo um modelo de fibrose pulmonar a ser desenvolvida (Chunn JL et al, 2005, J Immunol 175: 1937-46, Pedrosa M et al, 2011, PLoS A, 6(7): e22667). Neste modelo, a elevação crônica dos níveis de adenosina está associada com um aumento nos mediadores pró-fibróticos incluindo TGFD-1 nos pulmões, deposição de colágeno aumentada no tecido pulmonar e patologia pulmonar fibrótica aumentada. Para investigar o efeito de moléculas com potencial anti-fibrótico, camundongos deficientes em ADA são mantidos em um regime ADA exógena de dose baixa por várias semanas, o tratamento com ADA é depois interrompido e o agente anti-fibrótico potencial administrado.
[00455] O efeito do anticorpo anti-CSF-1R Ab535 foi investigado no modelo de camundongo nocaute em ADA de fibrose pulmonar. Neste modelo, os camundongos deficientes em enzima foram mantidos na terapia com a enzima ADA do dia 1 ao dia 21 após o nascimento. Um conjugado de ADA-polietileno glicol (PEG) foi preparado (Young HW et al, 2004, J Immunol 173: 1380-89) e as injeções intramusculares administradas nos dias 1, 5, 9, 13 e 17 pós natal (0,625, 1,25, 2,5, 2,5 e 2,5 unidades, respectivamente), seguidas por 5 unidades injetadas intraperitonealmente no dia 21. Nenhuma outra enzima foi administrada depois do dia 21. Ab535 foi dosado subcutaneamente a 30 mg/kg, em um volume de 100 μl três vezes/semana a partir do dia 25 (após o nascimento) até que os animais fossem sacrificados no dia 42.
[00456] Os animais foram sacrificados no dia 42 e as leituras incluíram análise histopatológica dos pulmões, a celularidade do fluido BAL e quantificação de colágeno solúvel no fluido BAL. A análise histopatológica foi conduzida para classificar o dano pulmonar usando um sistema de classificação de Ashcroft modificado para determinar a severidade da fibrose pulmonar (Hubner et al, 2008, Biotechniques 44: 507-17). Os pulmões excisados foram inflados com 10 % de formalina até 25 cm de pressão e processados através de uma série de álcoois e xileno, embutidos em parafina e as seções de tecido desparafinadas antes do processamento e tingimento com Tricromo de Masson.
[00457] A quantidade de colágeno solúvel em fluido BAL também foi avaliada usando um kit de ensaio Sircol comercialmente disponível a seguindo as instruções do fabricante.
[00458] O efeito sobre a população de macrófago no fluido BAL foi determinado usando preparações de cytospin. As alíquotas de células BAL foram giradas sobre lâminas de microscópio, tingidas com Diff-Quick e os macrófagos contados.
[00459] Foi descoberto que o tratamento terapêutico com anticorpo anti-CSF-1R Ab535 significantemente reduziu a fibrose pulmonar em camundongos deficientes em ADA. Os camundongos tratados reduziram a produção de colágeno, melhoraram a patologia fibrótica e melhoraram a função e proteção da barreira pulmonar.
[00460] A Figura 20a mostra que o tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 reduziu a concentração de colágeno BALF comparado com o tratamento com o controle de isótipo.
[00461] A Figura 20b mostra que o tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 reduziu a contagem de Ashcroft das amostras comparadas com o tratamento com o controle de isótipo que assim mostra que os camundongos tratados com Ab535 melhoraram a patologia fibrótica.
[00462] A Figura 20c mostra que o tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida com Ab535 reduziu a concentração de albumina no soro comparado ao tratamento com o controle de isótipo que assim mostra que a permeabilidade vascular dos camundongos tratados com Ab535 foi melhorada.
[00463] A Figura 20d mostra que o tratamento de camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida que recebem Ab535 reduziram os números de macrófagos no fluido BAL
[00464] A Figura 21 mostra imagens representativas da análise histopatológica de pulmões de camundongos normais (ADA+) e camundongos deficientes em ADA com fibrose pulmonar induzida (ADA-), ambos tratados com controle de isótipo ou Ab535. Nos camundongos ADA, os animais tratados com Ab535 tiveram uma fibrose enormemente reduzida dos pulmões comparados ao controle de isótipo.
[00465] Consequentemente, foi mostrado em dois modelos de camundongo de fibrose pulmonar que o tratamento com um anticorpo anti-CSF-1R pode eficazmente tratar doença fibrótica.
Claims (9)
1. Anticorpo anti-CSF-1R, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 23 e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 15.
2. Anticorpo anti-CSF-1R de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo é selecionada do grupo consistindo em: uma molécula de anticorpo completa tendo cadeias pesada e leve de tamanho natural ou um fragmento da mesma.
3. Anticorpo anti-CSF-1R de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo é selecionada do grupo compreendendo um fragmento Fab, Fab’ modificado, Fab’, F(ab’)2, Fv, VH, VL e scFv.
4. Anticorpo anti-CSF-1R de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que tem uma cadeia pesada compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 27 e uma cadeia leve compreendendo a sequência dada na SEQ ID NO: 19, em que a lisina do terminal C da cadeia pesada do anticorpo pode estar ausente.
5. Anticorpo anti-CSF-1R de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que tem uma molécula efetora ou uma repórter ligada ao mesmo.
6. Anticorpo anti-CSF-1R de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação para a CSF- 1R humano de 10 pM ou menos do que 10 pM.
7. Anticorpo anti-CSF-1 R, caracterizado pelo fato de que bloqueia cruzado a ligação de um anticorpo de acordo com a reiindicação 1 com afinidade de 100 pM ou menos.
8. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende as sequências dadas na SEQ ID NO: 28 e/ou SEQ ID NO: 20 ou compreende as sequências dadas na SEQ ID NO:24 e/ou SEQ ID NO:16.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, em combinação com um ou mais de um excipiente, diluente ou carregador farmaceuticamente aceitáveis.
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