TR201909478T4

TR201909478T4 - CSF-1R'a karşı antikorlar.

Info

Publication number: TR201909478T4
Application number: TR2019/09478T
Authority: TR
Inventors: Craggs Graham; Jeannine Madeleine Hervé Karine; Marshall Diane
Original assignee: Ucb Biopharma Sprl
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2014-08-26
Publication date: 2019-07-22
Also published as: HK1220142A1; HUE045672T2; MA44922A1; HUE064437T2; CN105658236B; KR102303130B1; MY172484A; PH12016500275B1; CN112321711A; AU2014314304B2; DK3038643T3; AR097464A1; RS64784B1; KR20160044018A; JP6632075B2; HRP20231264T1; AU2014314304A1; SG11201601151PA; EP3038643B1; MA44922B1

Abstract

Mevcut buluş bir anti-CSF-1R antikoruna, bunu kodlayan DNA'ya, söz konusu DNA'yı içeren konak hücrelere ve bir konak hücrede antikoru eksprese etme usullerine ilişkindir. Buluş ayrıca bu antikoru içeren farmasötik bileşimleri ve antikorun ve antikoru içeren bileşimlerin tedavide kullanımını da kapsamaktadır.

Description

TARIFNAME CSF-1R9A KARSI ANTIKORLAR Mevcut bulus bir anti-CSF-lR antikoruna, bunu kodlayan DNA7ya, söz konusu DNA`y1 içeren konak hücrelere ve bir konak hücrede antikoru eksprese etme usullerine iliskindir.

Bulus ayrica bu antikoru içeren farmasötik bilesimleri ve antikorun ve antikoru içeren bilesimlerin tedavide kullanimini da kapsamaktadir.

Makrofaj kolonisi uyarici faktör (M-CSF) olarak da bilinen koloni uyarici faktör 1 (CSF-l) makrofajlar, endotelyal hücreler ve fibroblastlar dahil olmak üzere çesitli hücreler tarafindan üretilen bir sitokindir. CSF-l, biyolojik olarak aktif bir dimerik CSF-l proteinini olusturan iki "monomerli" polipeptitlerden meydana gelir. Alternatif RNA uç birlesmesi nedeniyle CSF-l en az üç olgun formda mevcuttur (bakiniz, Cerretti ve digerleri, 1988, monomerlerini kodlayan, amino terminalde 32 amino asitli bir sinyal dizisine ve karboksil terminale yakin yaklasik olarak 23 amino asitli bir varsayilan transmembran bölgeye sahip farkli rnRNA prekürsörlerinden translasyonla olusur. Daha sonra prekürsör peptitler amino terminalde ve karboksil terminalde proteolitik parçalanmalara tabi olarak olgun CSF-l ,i açiga çikartirlar. CSF -1 ,in üç olgun formunun tamaminda kalinti 1- 149 özdestir ve CSF- l*in biyolojik etkinligi bakimindan sart olan dizileri içerdikleri düsünülmektedir. In vi'vo CSF -1 monomerleri glikozillenir ve disülûir baglantiyla diinerlesir. CSF -1 kan hücrelerinin üretimini tesvik eden bir biyolojik agonistler grubuna aittir. Özellikle, mononükleer fagosit soyundan kemik iligi pro genitör hücreleri için bir büyüme ve farklilasma faktörü islevi görür. Ayrica, CSF-l yanit veren hücrelerde spesifik bir reseptör vasitasiyla makrofajlarin sagkalimini, proliferasyonunu ve islev görmesini uyarir.

CSF-l reseptörü (CSF-lR) c-fms gen ürünü veya CD115 olarak da geçer. CSF-lR, tip III reseptör tirozin kinaz ailesine ait 165kDa bir tip I TM glikoproteindir. CSF-l 'e ilaveten, yapi olarak benzer ancak dizi bakimindan iliskisiz molekül lL-347ün de CSF-lR için bir ekspresyonu hem dolasimdaki hem yerlesik doku popülasyonlarinda monosit-makrofaj soyundan hücrelerle ve osteoklastlarla sinirlidir. ilaveten, kadin üreme sisteminin oositler, desidüal hücreler ve trofoblastlar dahil çesitli hücrelerinde eksprese edilir.

Ligand CSF-17in CSF-l reseptörüne baglanmasi, tirozin kinaz bölgesinin faaliyetiyle bir veya daha fazla tirozin kalintisinda reseptörün fosforlanmasina yol açar. Reseptöre sadece fosforlanma sonrasinda baglanan antikorlarin mevcut olmasi sayesinde bu fosforlanma tespit edilebilmektedir (örnegin Cell Signaling Technology'den Fosfo-M-CSF-Reseptör (Tyr546) antikoru #3083).

CSF-l ve CSF- 1 R ekspresyonu birçok kanser türünde tümör ilerlemesiyle ve kötü taniyla bagintilidir. Tümör baglantili makrofajlar (TAMWer) tümör stromasinin ana bileseni olabilmektedir ve yüksek seviyelerde CSF-l ve CSF-lR birçok tümör türünde yüksek TAM infiltrasyonlariyla ve kötü prognozla baglantilidir. 1793 referansinda CSF-l etkinligini inhibe eden CSF-lRlye karsi antikorlar insan CSF-lRiye baglanan anti-CSF-IR antikorlari ve bir anti-murin CSF-lR antikoru internalize eden ve ADCC etkinligine sahip anti-CSF-lR antikorlari açiklanmaktadir. WO eden ve kanser tedavisinde kullanisli olduklari ifade edilen anti-CSF-IR antikorlari kanser, enflamatuar bagirsak hastaligi ve romatoid artrit tedavisinde kullanisli oldugu ifade CSF-lRlye baglanmasini inhibe eden ve kemik kaybi ve kanserde kullanisli oldugu ifade lR”ye baglanmasini inhibe eden ve kemik kaybi ve kanserde kullanisli oldugu düsünülen delD4,e baglanan anti-CSF-lR antikorlari açiklanmaktadir.

Teknikte terapötik uygulamalar için uygun yeni anti-CSF-IR antikorlarinin saglanmasina ihtiyaç duyulmaktadir. Anti-CSF-lR antikorlarinin bazi kanserlerin tedavisinde terapötik uygulanisi daha önceleri açiklanmis olsa da, bu tür antikorlarin yeni terapötik uygulamalarinin saglanmasina hala ihtiyaç duyulmaktadir. bir yara iyilesmesi yanitina karislik gelir. Asiri hücre disi matris bileseni, örnegin kollajen ve tibronektrin çöküntüsü ve birikimi dokularda sertlesmeye ve skarlasmaya yol açar, ki bu da nihai olarak organ yetmezligine yol açabilir.

Fibrotik hastaliklarin örnekleri pulmoner fibroz, örnegin idiyopatik pulmoner fibroz ve kistik fibroz, renal fîbroz, karaciger fibrozu, karaciger sirozu, primer sklerozan kolanj it, primer biliyer siroz, endomiyokardiyal tibroz, mediastinal fibroz, miyelotîbroz, retroperitonal fibroz, progresif masif fibroz, nefrojenik sistemik fibroz, Crohn hastaligi, keloit, miyokard enfarktüsü, sistemik skleroz, skleroderma ve artof'ibrozu içerir.

Yaralanma geçici bir hücre disi matris (ECM) gelisimi ile birlikte hizli bir koagülasyon ve pihtilasma yanitina yol açar. Trombosit agregasyonu ve etkinlesmesi bir enflamasyon yanitinin tesvik edilmesine yardimci olur ve söz konusu yanit dainar genislemesiyle ve kan damari geçirgenliginde nötrofîller, makrofajlar, eozinofiller ve lenfositler dahil bir dizi immün hücrenin toplanmasina imkan saglayan bir artisin olmasiyla kendini gösterir.

Nötrofiller ve makrofajlar yarada ölü dokuyu atarak enfeksiyon riskini azaltir ve etkinlesmis lenfositlerle birlikte entlamasyon yanitinin daha da büyümesini saglayan çesitli büyüme faktörlerini ve sitokinleri salgilarlar. TGFß, PDGF, IL-l3 gibi moleküller makrofajlari etkinlestirir ve fibroblastlarin yaralanma bölgesinde toplanmasina, çogalinasina ve etkinlesmesine yol açar. Etkinlesmis fibroblastlarin veya miyo fibroblastlarin özelligi (it-yumusak kas aktini ekspresyonu yapmalari ve kollajeni ve diger ECM bilesenlerini salgilamalaridir. Etkinlesmis tibroblastlar yaranin kenarlarini ortaya dogru çekerek kollajen örgüsünü daraltir. Epitelyal ve endotelyal hücreler çogalir ve geçici matrise göç ederek hasar görmüs dokuyu yeniler ve böylece yara onarimi tamamlanmis olur.

Kalici doku travmasi veya hasari veya onarim yolaginda bir düzensizligin olmasi uygun olmayan bir yara yanitina yol açar. Kollajen ve ECM”nin asiri birikimi ve asiri çapraz baglanmasi olusarak normal doku mimarisi yerine asiri skar dokusu olusumuna ve sertlesmesine yol açar.

F ibrotik hastaligin nedeni etkilenen organa veya dokuya bagli olabilir ve idiyopatik pulmoner fibroz (IPF) gibi bazi hastaliklarda bu neden bilinmez. Karaciger fibrozu ve nihai olarak siroz çevresel ve diyetsel faktörler dahil bir dizi faktöre veya enfeksiyöz maddelere maruziyet kaynakli uzun süreli kronik karaciger hasarinin sonucunda ortaya çikar. Uzun süreli hepatit B ve C enfeksiyonlari karaciger fibrozuna neden olabilir. Uzun süre asiri alkol tüketimi veya yüksek kati yagli/ sekerli diyet de karaciger sirozuna yol açabilir. Ayni sekilde, diyabet böbreklerde hasar ve yara olusturarak islev kaybina yol açabilir. maruziyeti veya partiküller gibi çevresel faktörler bir rol oynayabilir. Sigara içen kisiler de bu hastalik açisindan yüksek risk altindadir. Tani konuldugunda hastalarin ömrü çok kisadir ve ortalama sagkalim orani 2-5 yildir.

Fibrotik hastalik tedavisi tipik olarak anti-enflamatuar ve immünosüpresif maddeleri içerir ancak bunlar hastaya çok az fayda saglar. Bu tedavilerle etkinlik saglanmamasi, IPF,nin ve fibrotik hastaligin genel olarak bir enflamasyon durumu olarak degil yara iyilesmesine atipik bir yanit olarak ele alinmasina yol açti. Pirfenidon IPF tedavisinde kullanim için 2008 yilinda Japonyaida ve 2011 yilinda Avrupa,da onay almis muhtemelen çoklu etki mekanizmasiyla çalisan küçük moleküllü bir ilaçtir. Bugüne kadar, fibrotik endikasyonlar için hiçbir hedeflendirilinis tedavi ve antikor tedavisi onay almamistir.

Dolayisiyla, fibrotik hastaligin gelismis tedavisi için günümüzde henüz karsilanmamis bir tibbi ihtiyaç söz konusudur. Örnegin, lPFide 3 yil sagkalim orani %50”dir, 5 yil sagkalim orani ise sadece %203dir ve vakalarin yaklasik %20ssinde transplantasyon gereklidir.

Açiklamanin Özeti Bir yönü itibariyla bir agir zincir içeren bir anti-CSF-lR antikoni saglanmakta olup, burada agir zincir degisken domeni CDR-H] için DIZI ID. NO:4,te verilen diziye sahip bir CDR, CDR-H2 için DIZI ID. NO:5`te verilen diziye sahip bir CDR ve CDR-HP› için DIZI ID.

NO:6”da verilen diziye sahip bir CDRiden en az birini içerir, örnegin burada CDR-HI DIZI ID. NO: 4, CDR-H2 DIZI ID. NO: 5 ve CDR-H3 DIZI ID. NO: 6”d1r.

Bir yönü itibariyla mevcut açiklamaya uygun antikorlar bir hafif zincir içermekte olup, burada hafif zincir degisken domeni CDR-LI için DIZI ID. NO: 1 ,de verilen diziye sahip bir CDR, CDR-L2 için DIZI ID. NO:2`de verilen diziye sahip bir CDR ve CDR-L3 için DIZI ID. NO:3”te verilen diziye sahip bir CDRiden en az birini içerir, örnegin burada CDR-Ll DIZI ID. NO: 1, CDR-L2 DIZI ID. NO: 2 ve CDR-L3 DIZI ID. NO: 3°tür.

Açiklamaya ait antikorlar CSF-lR için yüksek bir afîniteye sahiptir, ligandin CSF-lR”ye baglanmasini bloke edebilirler, CSF-lR”e etkinlestirici degildirler ve CSF-lR internalizasyonuna neden olmazlar.

Açiklama, burada açiklanan bir antikoru veya fragmani kodlayan bir polinükleotidi, örnegin DNA”yi da kapsar.

Söz konusu polinükleotidi içeren bir konak hücre de saglanmaktadir.

Burada, bu antikoru eksprese etme usulleri saglanmaktadir.

Mevcut açiklama söz konusu antikorlari içeren farmasötik bilesimlere de iliskindir .

Bir düzenlemede, burada açiklanan sekilde bir antikorun veya bilesimin terapötik olarak etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren bir tedavi usulü saglanmaktadir.

Mevcut açiklama tedavide, özellikle kanser ve/ veya Iibrotik hastalik tedavisinde kullanim için mevcut açiklamaya uygun bir antikoru veya bilesimi de kapsamaktadir.

Açiklamaya Iliskin Ayrintilar Bir düzenlemede mevcut bulusun sagladigi antikorlar CSF-lR”ye ligand baglanmasini bloke etme kapasitesine sahiptir. Burada kullanildigi sekliyle bloke etme örnegin reseptörün tikanmasi gibi fiziksel bloke etmeye karsilik gelir ancak antikorun bir epitopa baglandigi, bunun örnegin konformasyonal bir degisime neden olarak reseptörün dogal ligandinin artik baglanmamasi anlamina geldigi durumu da (burada allosterik blokaj veya allosterik inhibisyon olarak geçer) içerecektir. Bir düzenlemede mevcut açiklamaya ait antikorlar CSF-lR'nin tüm izotiplerine, örnegin ECD bölgesinde V23G, A24SS, H247P, V279M gibi varyasyonlara ve söz konusu varyasyonlarin iki, üç veya dördünün kombinasyonlarina sahip olanlara baglanir.

Bir antikorun CSF-lR”yi bloke etme kapasitesini belirlemek için uygun analizler burada Örnekler bölümünde açiklanmaktadir. CSF-l ve lL-34iün her ikisi de CSF-lR ligandlaridir ve bulusa ait antikorlar bir fonksiyonel hücresel taramada tercihen hem CSF- 1 ”in hem IL- 34aün etkinligini inhibe eder. Mevcut bulusa uygun antikorlar tercihen CSF-l R etkinlesmesine ve/veya CSF-lR internalizasyonuna da neden olmaz. Mevcut bulusa uygun antikorlar tercihen selektif sekilde in vi'vo klasik olmayan monosit popülasyonunu da tüketir.

Klasik olmayan monositler genellikle düsük CD14 ekspresyonu ve yüksek CD16 ekspresyonu olan monositlere karsilik gelir. Bu monosit popülasyonunun tümör baglantili makrofajlarin prekürsörleri olduklari düsünülmektedir.

Mevcut bulusa ait antikor molekülleri uygun sekilde yüksek bir baglanma atinitesine sahiptir. Afinite teknikte bilinen uygun herhangi bir usulü kullanarak, örnegin ayristirilmis dogal veya rekombinant CSF-1R`nin veya uygun bir füzyon proteininin/polipeptidinin kullanildigi burada Örnekler bölümünde açiklanan yüzey plazmon rezonansi, Örnegin BIAcore teknigi gibi teknikleri kullanarak ölçülebilir. Bir örnekte afinite, burada Örnekler bölümünde açiklanan sekilde rekombinant insan CSF-IR hücre disi domenini kullanarak ölçülür. Bir örnekte kullanilan rekombinant insan CSF-lR hücre disi domeni bir monomerdir. Uygun sekilde mevcut bulusa ait antikor molekülleri ayristirilmis insan CSF- lR için yaklasik lnM veya lnM,den daha az bir baglanma atinitesine sahiptir. Bir düzenlemede mevcut bulusa ait antikor molekülü yaklasik 500 pM veya daha düsük bir baglanma afinitesine sahiptir. Bir düzenlemede mevcut bulusa ait antikor molekülü yaklasik 250 pM veya daha düsük bir baglanma atînitesine sahiptir. Bir düzenlemede mevcut bulusa ait antikor molekülü yaklasik 200 pM veya daha düsük bir baglanma afinitesine sahiptir. Bir düzenlemede, mevcut bulusta yaklasik 100 pM veya daha düsük bir baglanma afinitesine sahip bir anti-CSF -1R antikoru saglanmaktadir. Bir düzenlemede, mevcut bulusta yaklasik 100 pM veya daha düsük, tercihen yaklasik 10 pM veya daha düsük, daha tercihen yaklasik 5 pM veya daha düsük bir baglanma afinitesine sahip hümanize bir anti-CSF-lR antikoru saglanmaktadir. Bir baska düzenlemede, mevcut bulusta yaklasik 100 pM veya daha düsük, tercihen yaklasik 10 pM veya daha düsük, daha tercihen yaklasik 5 pM veya daha düsük bir baglanma atinitesine sahip hümanize bir anti- CSF-lR antikoru saglanmaktadir.

Afinitenin sayisal degeri ne kadar düsükse, antikor veya fragmanin antijen için afinitesi o kadar yüksek olur.

Burada kullanildigi sekliyle insan CSF-lR insan proteini ismi CSF-lR,ye veya bunun biyolojik olarak aktif bir fragmanina, örnegin DIZI ID. NO: 39,da verilene veya P07333 numarasiyla UniProt`ta kayitli olana karsilik gelir. Hiç süphesiz eksprese edilen olgun protein sinyal dizisi translasyon sonrasinda parçalandigi için bu diziyi içermez.

Mevcut bulusu yapanlar hümanize antikorlar dahil yeni anti-CSF-IR antikorlarini saglamislardir. Antikorlar, siçanlarin CSF-IR hücre disi domenini eksprese eden bir vektörle transfekte edilmis siçan fibroblastlariyla asilanmasiyla üretildi. Antikorun insan CSF-lR baglanmasi bakimindan üst fazlarda yapilan birincil tarama anti-CSF- lR etkinligine sahip antikor içeren yaklasik olarak 1000 kuyucuk tanimladi. Insan CSF-1°in insan CSF-l R,ye baglanmasini önleme kapasitesine sahip antikorlar için yapilan ikinci] tarama 88 pozitif kuyucuk tanimladi. Primer insan monositlerin CSF-l ,e bagli sagkalimini önleme kapasitesine sahip antikorlar için yapilan üçüncül tarama 18 pozitif kuyucuk tanimladi. Bu 18 pozitif kuyucugun degisken bölgeleri klonlandi, bu sekilde 14 antikorun basarili sekilde klonlanlanmasi saglandi ve ardindan yapilan ekspresyon yeterli seviyelerde eksprese olan ve CSF-l baglanmasini inhibe edebilecek 9 kimerik anti-CSF-IR antikorunu verdi. Bu 9 antikor dizildi ve hepsinin özgün dizilere sahip oldugu bulundu ve daha ileri arastirma için kullanildi. 9 anti-CSF-IR kimerik antikoru ligand bloke etme etkinligi ve CSF-l ve IL-34 aracili monosit sagkalimini inhibe etme kapasitesi bakimindan incelendi. Tam CSF-l baglanmasi inhibisyonu ve yüksek seviyelerde monosit sagkalimi inhibisyonu göstermis olmalari nedeniyle antikorlarin dördüne ileri arastirma için öncelik tanindi. Bu 4 anti-CSF-IR kimerik antikoru afinite, CSF-l baglanmasi inhibisyonu, makak, sinomolgus maymunu ve köpek CSF-lR ile çapraz reaktiflik, CSF-lR internalizasyonu ve CSF-lR etkinlesmesi degerlendirmeleri için birkaç in vitro analizde etkinlikleri bakiinindan test edildi. Dört anti- CSF-l R antikoru ayrica hümanize edildi ve hümanize grelilerin afinitesi ölçüldü. Anti- CSF-lR antikorlarinin ikisine hümanizasyon parental kimerik antikora esdegerli afinitesi (KD) ve antikorun uygun isil stabiliteye sahip oldugunu gösteren bir Tm°si olan tamamen hümanize antikorlar (siçan verici kalintilari olmayan) ortaya çikardi. Tersine, diger iki hümanize anti-CSF-IR antikoru CSF-lR için kimerik antikora göre düsük bir afiniteye sahip oldu ve Tm daha düsük oldu. Bu nedenlerden ötürü sadece antikorlardan atiniteyi koruyan ikisinin tamamen hümanize greüleri ileri analiz için daha büyük bir ölçekte eksprese edildi.

Bu iki antikorun tamamen hümanize greftlerinde ileri analiz ve CSF-l baglanmasini bloke eden antikorla CSF-lR sinyallesmesi inhibisyonunun MCP-l salgilama seviyelerinde bir azalmaya neden oldugu bir MCP-l inhibisyonu analizi gerçeklestirildi. Bu analiz beklenmedik sekilde tamamen hümanize greftlerin kimerik antikorla karsilastirildiginda düsük etkinlik sergilediklerini açiga çikardi. Tercih edilen antikorlardan Ab969 isimli olan birinde bir dizi deney gerçeklestirerek niçin tamamen hümanize greftin bu düsük etkinligi sergiledigi açiga çikartildi. Ab969aun birkaç ara madde hümanize grefti üretildi ve MCP-l inhibisyonu analizinde test edildi. Degisken hafif zincir verici kalintisi Y7l içeren greftlerin MCP-l inhibisyonu analizinde genel olarak kimerik Ab9695unkiyle karsilastirilabilir etkinlik gösterdikleri bulundu. MCP-l inhibisyonu analizinde çesitli antikor greftlerinin etkinliginde görülen bu farkliligin kimerik Ab969 ile karsilastirildiginda antikor birlesme hizinda (birlesim hizi) görülen bir degisiklige (düsük Ka) bagli oldugu varsayildi.

Ab969”un isil stabilite analizinin diger anti-CSF-l R antikorlariyla, örnegin anti-CSF-lR antikoru Ab970 ile karsilastirilmasi Ab969”un daha stabil olabilecegini ortaya koymaktadir.

Insan özellikli Ab969 greülerinde yapilan ileri biyofiziksel analiz antikor konsantre edildiginde bazi greftlerin çökeldigini ortaya çikardi. Lizin kalintisinin hafif zincirin 38 konumunda, örnegin glutaminle sübstitüsyonunun gelismis bir fiziksel stabiliteye yol açtigi gösterildi. özellik belirleme çalismalari için seçildi. CSF-lR'ye avantajli yüksek baglanma afinitesine, yüksek isil stabiliteye ve yüksek fiziksel stabiliteye ilaveten antikor iyi düzeyde lL-34,e bagimli monosit etkinlesmesi inhibisyonu gösterdi ve CSF-lR SNP varyantlarini baglama kapasitesinin oldugu da bulundu. Ab969.g2 bir sinomolgus maymununda farmakodinamiklere iliskin belirteç analizinde de kullanilmis olup, burada CSF-lRsye baglandigi, CSF-l baglanmasini bloke ettigi ve in vivo tümör baglantili makrofajlarin prekürsör hücreleri olan klasik olmayan sinomolgus maymunu monositleri popülasyonunu selektif olarak tükettigi gösterildigi.

Dolayisiyla, bir düzenlemede mevcut bulusta bir agir zincir ve/veya bir hafif zincir içeren bir antikor saglanmakta olup, burada agir zincir ve/veya hafif zincir anti-CSF- IR antikoiu 969.2”den elde edilen en az bir CDR içerir.

Ab969.2 tam boy hümanize bir IgG4 molekülüdür; haIif zincir bir insan kappa zinciri sabit bölgesi (Km3 allotip) içerir ve agir zincir mentese stabilize edici mutasyon S241P ile birlikte bir insan gamma-4 agir zincir sabit bölgesi içerir (Angal ve digerleri, 1993), CDR- L2 ve çerçeve birlesiminde hafif zincir degisken bölgesinde potansiyel bir DG izomerlesmesi motifi mevcuttur. Ab969.2 tam antikor agir ve hafif zincirleri dizileri DIZI ID. NO: 27 ve l9'da gösterilmektedir.

Antikor degisken domenlerindeki kalintilar geleneksel olarak Kabat ve digerleri (1987) tarafindan tasarlanan bir sisteme göre numaralandirilir. Bu sistem Kabat ve digerleri, 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, ABD (buradan itibaren "Kabat ve digerleri (bkz. yukarisi)") referansinda açiklanmaktadir. Aksi belirtilmedigi sürece, mevcut tarifnamede bu numaralandirma sistemi kullanilmaktadir.

Kabat kalinti gösterimleri her zaman dogrudan amino asit kalintilarinin dogrusal numaralandirilmasina karsilik gelmez. Asil dogrusal amino asit dizisi mutlak Kabat numaralandirmasindakine göre daha az veya ilave amino asit içerebilir; ki bu da temel degisken domen yapisinin, ister çerçeve Ister tamamlayiciligi belirleme bölgesi (CDR) olsun bir yapisal bileseninde bir kisalmaya veya eklentiye karsilik gelir. Kalintilara iliskin dogru Kabat numaralandirmasi verili bir antikor için antikor dizisindeki homoloj i kalintilarinin "standart" Kabat numarali bir diziyle hizalanmasiyla belirlenebilir.

Agir zincir degisken domeni CDR,leri Kabat numaralandirma sistemine göre kalinti bulunur. Bununla CDR-Hl ,e esdegerli ilmik kalinti 26ldan kalinti 32°ye uzanir. Dolayisiyla aksi belirtilmedigi sürece burada kullanildigi sekliyle 'CDR-Hl' Kabat numaralandirma sistemi ve Chothia topolojik ilmik tanimi kombinasyonuyla açiklandigi üzere kalinti 26 ila 35,e karsilik gelir.

Hafif zincir degisken domeni CDR”leri Kabat numaralandirma sistemine göre kalinti bulunur.

Mevcut açiklamada kullanilan antikorlar teknikte bilinen uygun herhangi bir usulü kullanarak elde edilebilir. Füzyon proteinleri dahil CSF- lR polipeptidi/proteini, polipeptidi eksprese eden hücreler (rekombinant olarak veya dogal olarak) spesifik olarak CSF- 1 R,yi taniyan antikorlarin üretiminde kullanilabilir. Polipeptit 'olgun' polipeptit veya bunun biyolojik olarak aktif bir fragmani veya türevi olabilir. Insan proteini UniProt'ta PO7333 numarasiyla kayitlidir.

Bir konagin asilanmasinda kullanilan polipeptitler teknikte gayet iyi bilinen islemlerle ekspresyon sistemlerini içeren genetik mühendislikle yapilmis konak hücrelerden hazirlanabilir veya dogal biyolojik kaynaklardan geri kazanilabilirler. Mevcut basvuruda, sürece bunlar degisimli olarak kullanilir. CSF-lR polipeptidi bazi durumlarda daha büyük bir proteinin, örnegin bir afinite isaretiyle veya benzeriyle füzyon yapan bir füzyon proteininin bir parçasi olabilir.

CSF-lR polipeptidine karsi olusturulmus antikorlar, bir hayvanin asilanmasi gerekli oldugunda gayet iyi bilinen ve rutin protokolleri kullanarak polipeptitlerin bir hayvana, tercihen insan disi bir hayvana uygulanmasiyla elde edilebilir (bakiniz örnegin, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed), Cilt 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Ingiltere, 1986). Birçok sicak kanli hayvan, örnegin tavsanlar, fareler, siçanlar, koyunlar, inekler, develer veya domuzlar asilanabilir. Bununla birlikte, genellikle en uygun olanlar fareler, tavsanlar, domuzlar ve siçanlardir.

Monoklonal antikorlar, örnegin hibridom teknigi (Kohler & Milstein, 1975, Nature, lmmunology Today, 4:72) ve EBV hibridom teknigi (Cole ve digerleri, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, s. 77-96, Alan R Liss, Inc.) gibi teknikte bilinen herhangi bir usulle hazirlanabilir.

Patent Basvurusu”nda açiklanan usullerle spesifik antikorlarin üretimi için seçilmis tekli lenfositlerden olusturulmus immünoglobulin degisken bölge cDNAWarinin klonlandigi ve eksprese edildigi tekli lenfosit antikor usullerini kullanarak da üretilebilir.

Antikorlarin taranmasi, insan CSF-lR,ye baglanmanin ölçüldügü analizleri ve/veya reseptöre ligand baglanmasini bloke etme kapasitesinin ölçüldügü analizleri kullanarak gerçeklestirilebilir. Uygun analiz örnekleri burada Örnekler bölümünde açiklanmaktadir.

Burada kullanildigi sekliyle "spesifik" sadece spesifik oldugu antijeni taniyan bir antikora veya spesifik olmadigi antijenlere baglanmasi ile karsilastirildiginda spesifik oldugu antijene anlamli ölçüde daha yüksek baglanma afinitesine, örnegin en az 5, 6, 7, 8, 9, 10 kat daha yüksek baglanma afinitesine sahip bir antikora karsilik gelir.

Mevcut açiklamaya uygun bazi antikorlarin amino asit dizileri ve polinükleotit dizileri Burada bir agir zincir içeren bir anti-CSF-lR antikoru veya bunun baglanma fragmani açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken domeni CDR-HI için DIZI ID. NO: 4“te verilen diziye sahip bir CDR, CDR-HZ için DIZI ID. NO: 53te verilen diziye sahip bir CDR ve CDR-H3 için DIZI ID. NO: 6°da verilen diziye sahip bir CDR,den en az birini içerir. Tercihen agir zincir degisken domeni CDR-HI için DIZI ID. NO: 43te verilen diziyi, CDR-H2 için DIZI ID. NO: 5,te verilen diziyi ve CDR-113 için DIZI ID. NO: 6”da verilen diziyi içerir.

Burada bir hafif` zincir içeren bir anti-CSF-lR antikoru veya bunun baglanma fiagmani açiklanmakta olup, burada hafif zincir degisken domeni CDR-Ll için DIZI ID. NO: 1'de verilen diziye sahip bir CDR, CDR-L2 için DIZI ID. NO: 27de verilen diziye sahip bir CDR ve CDR-L3 için DIZI ID. NO: 3ste verilen diziye sahip bir CDR'den en az birini içerir. Tercihen hafif zincir degisken domeni CDR-Hl için DIZI ID. NO: l”te verilen diziyi, CDR-HZ için DIZI ID. NO: 2'de verilen diziyi ve CDR-H3 için DIZI ID. NO: 3°te verilen diziyi içerir.

Burada yukarida tanimlanan sekilde bir agir zincir içeren ve ilaveten bir hafif zincir içeren bir anti-CSF-lR antikoru veya bunun baglanma fragmani açiklanmakta olup, burada hafif zincir degisken domeni CDR-L] için DIZI ID. NO: 1”de verilen diziye sahip bir CDR, CDR-L2 için DIZI ID. NO: 2”de verilen diziye sahip bir CDR ve CDR-L3 için DIZI ID.

NO: 3,te verilen diziye sahip bir CDR,den en az birini içerir. Hafif zincir degisken domeni tercihen CDR-LI için DIZI ID. NO: Pte verilen diziyi, CDR-LZ için DIZI ID. NO: 29de verilen diziyi ve CDR-L3 için DIZI ID. NO: 3,te verilen diziyi içerir.

Burada, en az bir amino asidin bir veya daha fazla CDR'de bir koruyucu sübstitüsyonla degistirilmis oldugu bir düzenleme açiklanmakta olup, söz konusu CDR,ler bagimsiz olarak asagidakilerden olusan gruptan seçilir: CDR-Hl, CDR-H2, CDR-H3, CDR-Ll, CDR-LZ, CDR-L3lten herhangi biri; CDR-H3, L1 ve L3, CDR-Ll, L2 ve L3 kombinasyonlarindan herhangi biri; ve H3 kombinasyonlarindan herhangi biri; ve CDR-Hl, H2, H3, L1, L2 ve L3 kombinasyonu.

Burada, yine burada açiklanan bir agir zincir domeninin 1, 2, 3 veya 4 koruyucu amino asit sübstitüsyonu olan diziyi içerdigi bir düzenleme açiklanmakta olup, söz konusu sübstitüsyonlar örnegin çerçeve içindedir.

Burada agir zincir degisken bölgesi çerçevesinin insersiyon, delesyon, sübstitüsyon veya bunlarin bir kombinasyonu uygulanmis l, 2, 3, veya 4 amino asidi içerdigi bir düzenleme açiklanmaktadir. Bir düzenlemede, sübstitüe edilmis amino asit verici antikorun karsilik gelen bir amino asididir.

Burada, yine burada açiklanan bir hafif degisken bölgesinin 1, 2, 3 veya 4 koruyucu amino asit sübstitüsyonu olan diziyi içerdigi bir düzenleme açiklanmakta olup, söz konusu sübstitüsyonlar örnegin çerçeve içindedir Burada hafif zincir degisken bölgesi çerçevesinin insersiyon, delesyon, sübstitüsyon veya bunlarin bir kombinasyonu uygulanmis 1, 2, 3, veya 4 amino asidi içerdigi bir düzenleme açiklanmaktadir. Bir düzenlemede, sübstitüe edilmis amino asit verici antikorun karsilik gelen bir amino asididir.

Burada bir anti-CSF- 1 R antikoru veya bunun baglanma fragmani açiklanmakta olup, burada agir zincir degisken domeni üç CDR içerir ve CDR-HI dizisi DIZI ID. NO:4,te özdeslik veya benzerlik gösterir ve CDR-H-3 dizisi DIZI ID. NO:6”da verilen diziyle en az antikoru veya bunun baglanma fragmani ilaveten bir hafif zincir içermekte olup, burada hafif zincir degisken domeni üç CDR içerir ve CDR-LI dizisi DIZI ID. NO: 1 ,de verilen veya benzerlik gösterir ve CDR-L3 dizisi DIZI ID. NO:3”te verilen diziyle en az %60 özdeslik veya benzerlik gösterir.

Burada, yine burada açiklanan bir degisken bölge dizisiyle en az %60, %70, %80, %90 veya %95 özdeslik veya benzerlik gösteren degisken bölgeler açiklanmaktadir. Bir baska düzenlemede CSF-lR reseptörüne, tercihen CSF-lR reseptörünün hücre disi domenine, girisli diziye sahip CSF-lR reseptörüne, özellikle DIZI ID. NO: 36,ya sahip CSF-lR reseptörünün hücre disi domenine veya P07333 UniProt veri tabani girisinde açiklanan açisindan bulusa ait bir antikorun veya fragmanin baglanmasiyla rekabet eden bir anti- CSF-lR antikoru saglanmaktadir.

Burada CDR-LI için DIZI ID. No:1, CDR-L2 için DIZI ID. NO:2, CDR-L3 için DIZI ID.

No:3, CDR-HI için DIZI ID. NO:4, CDR-HZ için DIZI ID. NO:5 ve CDR-H3 için DIZI ID. No:6 dizisinde verilen 6 CDR,yi içeren bir antikorun örnegin 100 pM veya daha az afinite ile baglanmasini çapraz bloke eden bir anti-CSF-lR antikoru açiklanmakta olup, burada özellikle çapraz bloke etme allosteriktir.

Burada CSF -1 ve/veya lL-34”ün CSF-lR reseptörünün hücre disi domenine baglanmasini inhibe eden veya bununla örtüsen bir anti-CSF-lR-antikoru veya bunun baglanma fragmani açiklanmaktadir.

No:3, CDR-HI için DIZI ID. NO:4, CDR-H2 için DIZI ID. NO:5 ve CDR-H3 için DIZI ID. No:6 dizisinde verilen 6 CDR”yi içeren bir antikorun örnegin 100 pM veya daha az afinite ile baglanmasini çapraz bloke eden bir anti-CSF-IR antikoru açiklanmakta olup, burada özellikle antikor bloke ettigi antikorla ayni epitopa baglanarak baglanmayi çapraz bloke eder.

Burada antikor dizisine ait bir C-terminal kalintisinin, örnegin bir agir zincir dizisi C- terminal kalintisinin, örnegin bir terminal lizininin parçalandigi antikor veya bunun baglanma fragmani açiklanmaktadir. Bir düzenlemede amino asit burada açiklanan bir diziden parçalanir. Genellikle parçalanma eksprese edilen antikorun veya baglanma fragmaninin translasyon sonrasi modifikasyonlarindan kaynaklanir.

Burada yukarida veya asagida belirtilen düzenlemelerden herhangi birine ait bir anti-CSF- lR antikoru açiklanmakta olup, burada DIZI ID. NO: 27 veya DIZI ID. NO: 29”da verilen agir zincir dizisinin C-terminal lizini kayiptir veya silinmistir. Örnegin DIZI ID. NO: 277de konum 453”te veya DIZI ID. NO: 307da konum 472jde kayip veya silinmis olan C- terminal lizini, örnegin anti-CSF- IR antikorunun terminal lizini kodlamadan bir ekspresyon sisteminde ekspresyonuyla elde edilebilir. Alternatif olarak bir C-terminal kalintisi, örnegin lizin delesyonu translasyon sonrasi bir modifikasyon seklinde gerçeklestirilebilir.

Bir düzenlemede bulusa uygun antikor hümanize edilmistir.

Burada kullanildigi sekliyle, 'hümanize antikor' terimi, agir ve/veya hafif zincirin bir verici antikorun (örnegin bir murin monoklonal antikoru) bir alici antikorun (örnegin bir insan antikoru) agir ve/ veya hafif zincir degisken bölge çerçevesi içine greftlenmis bir veya daha fazla CDRlsini (eger istenirse bir veya daha fazla modifiye CDR dahil) içerdigi bir antikora veya antikor molekülüne karsilik gelir (bakiniz örnegin US 5,585,089; WO 539, 1998. Bir düzenlemede CDRlnin tamaminin aktarilmasi yerine, sadece burada yukarida açiklanan CDR*lerin herhangi birinden spesifikligi belirleyen kalintilarin biri veya daha fazlasi insan antikor çerçevesine aktarilir (bakiniz örnegin, Kashmiri ve CDRllerin bir veya daha fazlasindan spesifikligi belirleyen kalintilar insan antikor çerçevesine aktarilir. Bir baska düzenlemede sadece burada yukarida açiklanan CDR`lerin her birinden spesifikligi belirleyen kalintilar insan antikor çerçevesine aktarilir. CDRaler veya spesifikligi belirleyen kalintilar grettlenirken, CDR°lerin elde edildigi fare, primat ve insan çerçeve bölgeleri gibi verici antikor sinifi/türü dikkate alinarak uygun herhangi bir alici degisken bölge çerçeve dizisi kullanilabilir.

Uygun sekilde, mevcut bulusa uygun hümanize antikor insan alici çerçeve bölgelerini ve ayrica burada özel olarak verilen CDRWerden birini veya daha fazlasini içeren bir degisken bölgeye sahiptir. Dolayisiyla, bir düzenlemede insan CSF-lR”ye baglanan bir hümanize antikor saglanmakta olup, burada degisken domen insan alici çerçeve bölgelerini ve insan olmayan verici CDR,lerini içerir.

Mevcut bulusta kullanilabilecek insan çerçeve örnekleri KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEl, LAY ve POMsdir (Kabat ve digerleri, bkz. yukarisi). Örnegin, KOL ve NEWM agir zincir için kullanilabilir, REI hafif zincir için kullanilabilir ve EU, LAY ve POM hem agir Zincir hem hafif zincir için kullanilabilir. Alternatifolarak, insan germ hatti dizileri kullanilabilir; bunlar http://vbase.mrC-cpe.cam.ac.uk/ internet sayfasinda bulunur.

Alici agir ve hafif zincirlerinin ayni antikordari elde edilmesinin sart olmadigi ve eger istenirse farkli zincirlerden elde edilmis çerçeve bölgeleri olan kompozit zincirler içerebilecegi bir hümanize antikor da açiklanmaktadir. l, 2, 3 veya 4 amino asit sübstitüsyonu, ilavesi veya delesyonu, örnegin 1, 2, 3 veya 4 koruyucu sübstitüsyon veya verici kalinti sübstitüsyonlari içeren bir insan çerçevesi de aç iklanmaktadir.

Ayrica burada açiklanan bir diziyle %80, %85, %90, %95 veya daha fazla benzerlik veya özdeslik gösteren bir insan çerçeve olarak kullanilan dizi de açiklanmaktadir.

Mevcut bulusa ait hümanize antikorun agir zinciri için bu tür bir uygun çerçeve bölgesi JH3 J-bölgesi ile birlikte insan alt grup VH2 dizisi 3-1 2-70,ten (DIZI ID. NO: 33) elde Dolayisiyla, bir örnekte CDR-Hl için DIZI ID. NO: 4,te verilen diziyi. CDR-H2 için DIZI ID. NO: 5”te verilen diziyi ve CDR-H3 için DIZI ID. NO: 6,da verilen diziyi içeren bir hümanize antikor saglanmakta olup, burada agir zincir çerçeve bölgesi JH4 ile birlikte insan alt grubu VH3 dizisi 1-3 3-07°den elde edilir.

Bir örnekte antikorun agir zincir degisken bölgesi DIZI ID. NO: 23°te verilen diziyi içerir.

Mevcut bulusa ait hümanize antikorun hafif zinciri için uygun bir çerçeve bölgesi J K4 J- bölgesi ile birlikte insan germ hatti alt grubu VK] 2-1-(1) 012,den (DIZI ID. NO: 31) elde Dolayisiyla, bir örnekte CDR-Ll için DIZI ID. NO: !de verilen diziyi, CDR-L2 için DIZI ID. NO: 2`de verilen diziyi ve CDR-L3 için DIZI ID. NO: Bite verilen diziyi içeren bir hümanize antikor saglanmakta olup, burada hafif zincir çerçeve bölgesi insan alt grubu VKl 2-1-(1) 012 arti JK4 J-bölgesinden elde edilir.

Bir örnekte antikorun hafif zincir degisken bölgesi DIZI ID. NO: 15,te verilen diziyi içerir.

Bir hümanize antikorda, çerçeve bölgelerinin alici antikorunkilerle tamamen ayni diziye sahip olmalari gerekli degildir. Örnegin, olagandisi kalintilar bu alici zinciri sinifi veya türü için daha sik olan kalintilarla degistirilebilir. Alternatif olarak, alici çerçeve bölgelerinde seçili kalintilar verici antikorunda ayni konumda bulunan kalintiya karsilik 324). Bu tür degisiklikler verici antikorun afinitesini korumak için gereken minimumda tutulmalidir. Alici çerçeve bölgelerinde degistirilmesi gerekli olabilecek kalintilarin seçilmesine iliskin bir protokol WO 91/09967”de açiklanmaktadir.

Dolayisiyla, bir örnekte en azindan agir zincir degisken domeninde konum 78,deki (Kabat numaralandirmasi) kalintinin bir verici kalintisi oldugu bir hümanize antikor saglanmaktadir. Bir düzenlemede agir zincir degisken domeninin kalinti 78”i alaninle degistirilir.

Burada kullanildigi sekliyle verici kalintisi CDR,leri asilanmis insan disi antikorun (örnegin murin antikoru) bir kalintisina karsilik gelir.

Bir düzenlemede agir zincir degisken domeni herhangi bir verici kalintisi içermeyen bir hümanize antikor saglanmaktadir.

Dolayisiyla, bir örnekte hafif zincir degisken domeninde konum 38, 71 ve 87'deki (Kabat numaralandirmasi) kalintilardan en az birinin verici kalintisi oldugu bir hümanize antikor saglanmaktadir. Bir düzenlemede hafif zincir degisken domeninde konum 38, 71 ve 877deki (Kabat numaralandirmasi) kalintilardan seçilen kalintilarin biri bir verici kalintisidir. Bir düzenlemede hafif zincir degisken domeninde konum 38, 71 ve 873deki kalintilardan seçilen kalintilarin ikisi verici kalintilaridir. Bir düzenlemede hafif zincir degisken domeninde konum 38, 71 ve 879deki (Kabat numaralandirmasi) üç kalinti verici kalintilaridir.

Hafif zincir degisken domeninde kalinti 38,in lizinle degistirilmesi açiklanmaktadir.

Alternatif olarak hafif zincir degisken domeninde kalinti 38 glutaminle degistirilir.

Hafif zincir degisken domeninde kalinti 7 1 ”in tirozinle degistirildigi bir düzenleme aç iklanmaktadir.

Hafif zincir degisken domeninde kalinti 87°nin fenilalaninle degistirildigi bir düzenleine aç iklanmaktadir.

Hafif zincir degisken domeninde sadece kalinti 71 ,in bir verici kalintisi, tercihen tirozin Oldugu bir hümanize antikor açiklanmaktadir.

DIZI ID. NO: 237te verilen agir zincir degisken domeni dizisini içeren bir agir zincire ve DIZI ID. NO: 15,te verilen hafif zincir degisken domeni dizisini içeren bir hafif zincire sahip bir anti-CSF- lR antikoru veya bunun baglanma fragmani da açiklanmaktadir.

Mevcut bulusun bir baska yönü itibariyla, CSF-lR”ye, tercihen CSF- lR”nin hücre disi domenine, en fazla tercihen insan CSF-lR,nin hücre disi domenine baglanan bir anti-CSF- lR antikoru saglanmakta olup, burada antikor DIZI ID. NO: 15,e sahip hafif zincir degisken domenini ve DIZI ID. NO: 23`e sahip agir zincir degisken domenini içerir, tercihen burada antikor bir monoklonal antikor, IgGl- IgG2-, IgG4-tipi bir antikordur, bir Fab, modifiye Fab, Fab', modifiye Fab', F(ab')2, FV, tek domenli antikorlar (örnegin VH veya VL veya VHH), scFv, iki, üç veya dört degerlikli antikor, Bis-scFv, di-antikor, tri- Burada açiklanan bir dizi ile %80, örnegin ilgili dizinin bir kismina veya tamamina göre antikor dizisi de açiklanmaktadir. Bir düzenlemede ilgili dizi DIZI ID. NO: 15°tir. Bir düzenlemede ilgili dizi DIZI 1D. NO: 23'tür.

Burada kullanildigi sekliyle "özdeslik" hizalanmis dizilerde belli bir konumda amino asit kalintisinin diziler arasinda özdes oldugunu gösterir. Burada kullanildigi sekliyle benzer bir tipte oldugunu gösterir. Örnegin, lösin izolösin veya valinle sübstitüe edilebilir.

Siklikla birbiriyle sübstitüe edilebilecek diger amino asitler, bunlarla sinirli kalmamak 0 fenilalanin, tirozin ve triptofan (aromatik yan zincirlere sahip amino asitler); o lizin, arginin ve histidin (bazik yan zincirlere sahip amino asitler); o aspartat ve glutamat (asidik yan zincirlere sahip amino asitler); . asparajin ve glutamin (amit yan zincirlere sahip amino asitler), ve o sistein ve metionin (kükürt içeren yan zincirlere sahip amino asitler). Özdeslik ve benzerlik dereceleri kolaylikla hesaplanabilir (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. 1993; Computer Analysis ofSequence Data, Bölüm 1, Griffin, A.M., ve Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. ve Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, NCBl'dan temin edilen BLASTTM yazilimi (Altschul, S.F. ve digerleri, 1990, J. Mol. Biol.

Burada tam boy agir ve hafif zincirleri olan bir tam antikor molekülünü veya bunun bir baglanma fragmanini içerebilecek ve bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla Fab, modifiye F ab, F ab', modifiye Fab', F (ab')2, FV, tek domenli antikorlar (örnegin VH veya VL veya VHH), scFv, iki, üç veya dört degerlikli antikorlar, Bis-SCFV, di-antikorlar, tri-antikorlar, tetra-antikorlar ve yukaridakilerden herhangi birinin epitop baglayici fragmanlari olabilecek antikor molekülleri açiklanmaktadir (bakiniz örnegin, Holliger ve Hudson, Online 2(3), 209-217). Bu antikor fragmanlarini yaratma ve iinal etme usulleri teknikte gayet iyi bilinmektedir (bakiniz örnegin, Verma ve digerleri, 1998, Journal of basvurularinda açiklanan Fab ve Fab' &agmanlarini içerir. Çok degerlikli antikorlar çok sayida spesifikligi içerebilir, örnegin bispesifik veya monospesifik olabilir (bakiniz Burada kullanildigi sekliyle bir antikorun baglanma fragmani, bir antijene fragmani antijen için spesifik olarak tanimlayacak afinite ile baglanabilen bir fragmana karsilik gelir.

Burada mevcut açiklamaya uygun bir antikor CSF-1R°ye baglanan antikor füzyon proteini seklinde saglanmakta olup, bir immünoglobulin parçasi, örnegin bir Fab veya Fab' baglanmis bir veya iki tek domenli antikor (dAb) içerir.

Istege bagli olarak bir disüllîir bagla baglanmis, örnegin bir degisken agir (VH) ve degisken haf1f(VL) eslesmeli iki domenli antikorlari içeren füzyon proteini aç iklanmaktadir.

F üzyon proteininin, tek domenli antikora veya antikorlara ayni veya benzer spesifiklik sergileyen F ab veya F ab` parçasi açiklanmaktadir. Bir düzenlemede F ab veya F ab' tek domenli antikora veya antikorlara farkli bir spesifiklik sergiler, yani Iüzyon proteini çok degerliklidir. Bir düzenlemede mevcut bulusa uygun çok degerlikli bir füzyon proteini bir albümin baglanma alanina sahiptir, örnegin buradaki bir VH/VL çifti bir albümin baglanma alani saglar.

Antikor molekülünün öne sürülen islevini ve özellikle gerekli olabilecek efektör islevleri dikkate alarak seçilebilecek antikor molekülü sabit bölge domenleri açiklanmaktadir. Örnegin, sabit bölge domenleri insan lgA, IgD, IgE, lgG veya lgM domenleri olabilir. Özellikle, insan lgG sabit bölge domenleri, bilhassa antikor molekülü terapötik kullanimlara yönelik oldugunda ve antikor efektör islevleri gerekli oldugunda lgGl ve amaçlara yönelik oldugunda ve antikor efektör islevleri gerekli olmadiginda lgG2 ve IgG4 izotipleri kullanilabilir.

Bir lgG2 veya IgG4 antikoru olan bir antikor açiklanmaktadir.

Takdir edilecegi üzere bu sabit bölge domenlerinin dizi varyantlari da kullanilabilecektir . açiklandigi gibi 241 konumundaki serinin prolinle degistirilmis oldugu IgG4 molekülleri kullanilabilir. Dolayisiyla, antikorun bir IgG4 antikoru oldugu düzenlemede, antikor SZ41P mutasyonunu içerebilir.

Teknikte uzman bir kisi tarafindan antikorlarin bir dizi post-translasyonal modifikasyona tabi olabilecekleri de anlasilacaktir. Bu modifikasyonlarin türü ve boyutu çogunlukla antikoru eksprese etmek için kullanilan konak hücre hattina ve ayni zamanda kültür kosullarina baglidir. Bu modifikasyonlar glikozilasyon, metionin oksidasyonu, diketopiperazin olusumu, aspartat izomerizasyonu ve asparajin deamidasyonundaki varyasyonlari içerir. Sik görülen bir modifikasyon karboksipeptidazlarin hareketi nedeniyle karboksi-terminaldeki bir bazik kalintinin (lizin veya arginin gibi) kaybolmasidir.

Dolayisiyla, antikor agir zincirinin C-terminal lizini yok olabilir.

Bir düzenlemede antikor agir zinciri bir CH] domeni içerir ve antikor hafif zinciri gerek kappa gerek lambda bir CL domeni içerir.

Bir düzenlemede antikor agir zinciri bir CHl domeni, bir CH2 domeni ve bir CH3 domeni içerir ve antikor hafif zinciri gerek kappa gerek lambda bir CL domeni içerir.

Mevcut bulusun sagladigi bir antikor DIZI ID. NO: 279de verilen diziyi içeren bir agir zincire ve DIZI ID. NO: l9`da verilen diziyi içeren bir hafif` zincire sahiptir. Agir ve hafif zincirlerin DIZI ID. NO: 277de verilen diziyi içeren bir agir zincirle ve DIZI ID. NO: 19'da özdes veya benzer oldugu bir anti-CSF-IR antikoru da saglanmaktadir. Bir düzenlemede, hafif zincir DIZI ID. NO: 19'da verilen diziye sahiptir veya bundan olusur ve agir zincir DIZI ID. NO: 277de verilen diziye sahiptir veya bundan olusur. Bir baska düzenlemede, hafif` zincir DIZI ID. NO: 191daki diziye sahiptir veya bundan olusur ve agir zincir DIZI ID. NO: 27`deki diziye sahiptir veya bundan olusur, burada DIZI ID. NO: 279de konum 453iteki amino asit lizin kayiptir veya silinmistir.10 Insan CSF- lR`nin, mevcut bulusla saglanan bir antikorla, özellikle agir zincir dizisi gH2°yi (DIZI ID. NO: 27) ve/veya hafif zincir dizisi gL7”yi (DIZI ID. NO: 19) içeren 969.g2 antikoruyla baglanmis bir spesifik bölgesi veya epitopu da saglanmaktadir.

Insan CSF-lR polipeptidinin bu spesifik bölgesi veya epitopu mevcut bulusun sagladigi antikorlardan herhangi biriyle kombinasyon halinde teknikte bilinen herhangi bir uygun epitop haritalama usulüyle tanimlanabilir. Bu usullerin örnekleri, CSF-1R7den elde edilen çesitli uzunluklardaki peptitlerin, spesifik olarak antikorun tanidigi epitop dizisini içeren antikora baglanabilecek en küçük fragmanla (örnegin yaklasik 5 ila 20, tercihen yaklasik 7 amino asit uzunlugundaki bölgede bulunan bir peptit) mevcut bulusa ait antikora baglanma bakimindan taranmasini içerir. CSF-IR peptitleri sentez yoluyla veya CSF-lR polipeptidinin proteolitik sindirimiyle üretilebilir. Antikora baglanan peptitler örnegin kütle spektrometresi analiziyle belirlenebilir. Bir baska örnekte, NMR spektroskopisi veya X- isini kristalografisi mevcut bulusa ait bir antikorla baglanan bir epitopun belirlenmesinde kullanilabilir. Bir kez belirlendiginde, mevcut bulusa ait bir antikorla baglanan epitopik fragman, eger gerekirse ayni epitopa baglanan ilave antikorlari elde etmek için bir immünojen olarak kullanilabilir.

Biyolojik moleküller, örnegin antikorlar veya fragmanlar asidik ve/veya bazik islevsel gruplar içerir, böylece moleküle bir net pozitif veya negatif yük verirler. Toplam gruplarin lokal ortamina ve molekülün çevresel kosullarina bagli olacaktir. Izoelektrik noktasi (pl) belli bir molekülün veya bunun çözücüyle erisilebilir yüzeyinin elektrik yükü tasimadigi pH'tir. Bir örnekte, bulusa ait CSF-lR antikoru ve fragmanlari uygun bir izoelektrik noktasina sahip olacak sekilde tasarlanabilir. Bu daha güçlü özelliklere, özellikle uygun çözünürlük ve/veya stabilite profillerine ve/veya gelismis saflastirma özelliklerine sahip antikorlara ve/veya fragmanlara yol açabilir.

Dolayisiyla bir yönü itibariyla bulusta, orijinal olarak tanimlanmis antikorunkinden farkli bir izoelektrik noktasina sahip olacak sekilde tasarlanmis bir hümanize CSF-lR antikoru saglanmaktadir. Antikor, örnegin bir amino asit kalintisini degistirerek, örnegin bir asidik amino asit kalintisini bir veya daha fazla bazik amino asit kalintisiyla degistirerek tasarlanabilir. Alternatif olarak, bazik amino asit kalintilari ilave edilebilir veya asidik amino asit kalintilari çikartilabilir. Alternatif olarak, eger molekül kabul edilemez düzeyde yüksek bir pl degerine sahipse, gerektigi gibi pl°yi düsürmek için asidik kalintilar eklenebilir. Antikorun veya fragmanin arzu edilen etkinligini korumak için pl”nin düzenlenmesinde özen gösterilmesi önemlidir. Sonuç olarak bir düzenlemede tasarlanan antikor veya fragman "modifiye edilmemis" antikor veya fragmanla ayni veya büyük ölçüde ayni etkinlige sahiptir.

Antikorun veya fragmanin izoelektrik noktasinin öngörülmesinde ** ExPASY http://www.exnasv.ch/tools/ni_t001.htm1. ve http://www.iut-arles.un.univ- mrs.fr/WSbb/d_abim/compo-p.htm1 gibi programlar kullanilabilir.

Takdir edilecegi üzere mevcut bulusla saglanan antikorlarin atinitesi teknikte bilinen uygun bir usulü kullanarak degistirilebilecektir. Dolayisiyla mevcut bulus, mevcut bulusa ait antikor moleküllerinin CSF-IR için gelismis afiniteye sahip varyantlarina da iliskindir.

Bu varyantlar örnegin CDR°lerin mutasyonu tabi tutulmasini (Yang ve digerleri, 1995, J. :779-783), mutasyona neden olan E. coli' suslarinin kullanilmasini (Low ve digerleri, çesitli afinite matürasyonu protokolleriyle elde edilebilir. Vaughan ve digerleri (bkz. yukarisi) bu afinite matürasyonu usullerini açiklamaktadir.

Eger istenirse mevcut bulusta kullanilan bir antikor bir veya daha fazla efektör moleküle(moleküllere) konjuge edilebilir. Takdir edilecegi üzere efektör molekül, mevcut bulusa ait antikorlara ilistirilebilecek tek bir parça olusturmak üzere bu sekilde baglanmis tek bir efektör molekül veya bu tür iki veya daha fazla molekül içerebilecektir. Bir efektör mo leküle baglanmis bir antikor fragmani elde etmek istendiginde, bu durum antikor fragmaninin gerek dogrudan gerek bir kenetleme maddesi vasitasiyla efektör moleküle baglandigi standart kimyasal veya rekombinant DNA usulleriyle hazirlanabilmektedir. Bu efektör moleküllerin antikorlara konjugasyonuna iliskin yöntemler teknikte gayet iyi bilinmektedir (bakiniz, Hellstrom ve digerleri, Controlled Drug Delivery, 2. Baski, protein veya polipeptit oldugunda baglanti rekombinant DNA usullerini, örnegin WO Burada kullanildigi sekliyle efektör molekül terimi, örnegin antineoplastik maddeleri, ilaçlari, toksinleri, biyolojik olarak aktif proteinleri, örnegin enzimleri, diger antikor veya antikor fragmanlarini, sentetik veya dogal olusumlu polimerleri, nükleik asitleri ve bunlarin fragmanlarini, örnegin DNA, RNA ve bunlarin fragmanlarini, radyonüklitleri, özellikle radyoiyodürü, radyoizotoplari, selatlanmis metalleri, nano-parçaciklari ve haberci gruplari, örnegin floresan bilesikleri veya NMR veya ESR spektroskopisiyle tespit edilebilecek bilesikleri içerir.

Efektör moleküllerin örnekleri hücreler için zararli (örnegin öldüren) herhangi bir madde dahil olmak üzere sitotoksinleri veya sitotoksik maddeleri içerir. Örnekleri kombrestatinler, dolastatinler, epotiolonlar, staurosporin, maytansinoitler, spongistatinler, rizoksin, halikondrinler, roridinler, hemiasterlinler, taksol, sitokalasin B, gramisidin D, etidyum bromür, emetin, mitomisin, etopozid, tenopozid, vinkristin, Vinblastin, kolsisin, doksorubisin, daunorubisiii, dihidroksi antrasin dion, mitoksantron, mitramisin, aktinomisin D, l-dehidrotestosteron, glukokortikoitler, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol ve puromisin ve bunlarin analoglari veya homologlarini içerir.

Efektör moleküller, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla antimetabolitler (örnegin metotreksat, 6-merkapt0pürin, 6-tioguanin, sitarabin, 5 -floroürasil dekarbazin), alkilleyici maddeler (örnegin mekloretamin, tioepa klorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) ve lomustin (CCN U), siklotosfamit, busulfan, dibromomannitol, streptozotosin, mitomisin C ve cis-diklorodiamin platin (ll) (DDP) sisplatin), antrasiklinler (örnegin daunorubisin (eski ismiyle dauiiomisin) ve doksorubisin), antibiyotikler (örnegin daktinomisin (eski ismiyle aktinomisin), bleomisin, mitramisin, antramisin (AMC), kalisamisinler veya duokarmisinler) ve anti-mitotik maddeleri de (örnegin vinkristin ve vinblastin) içerir.

Diger efektör moleküller 111ln ve 90Y, Lum, Bizmutm, Kaliforniyumzsz, Iridyum192 ve ”I`ungsten188/Renyum188 gibi selatlanmis radyonüklitleri; veya bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla alkilfosfokolinler, topoizomeraz l inhibitörleri, taksoitler ve suramin gibi ilaçlari Diger efektör moleküller proteinleri, peptitleri ve enzimleri içerir. Ilgili enzimler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla proteolitik enzimleri, hidrolazlari, liyazlari, izomerazlari, transferazlari içerir. Ilgili proteinler, polipeptitler ve peptitler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla immünoglobulinleri, toksinleri, örnegin abrin, risin A, psödomonas ekzotoksin, veya difreri toksinini, insülin, tümör nekroz faktörü, a-interferon, ß-interferon, sinir büyüme faktörü, trombosit türevi büyüme faktörü veya doku plazminojen aktivatörü gibi bir proteini, bir trombotik madde veya bir anti-anjiyojenik maddeyi, örnegin anjiyostatin veya endostatini veya bir biyolojik yanit modifikatörünü, örnegin bir lenfokin, interlökin-l (IL-l), interlökin-Z (IL-2), sinir büyüme faktörü (NGF) veya bir baska büyüme faktörünü ve immünoglobulinleri içerir.

Diger efektör moleküller örnegin tani koymakta kullanisli tespit edilebilir maddeleri içerebilir. Tespit edilebilir maddelerin örnekleri çesitli enzimleri, prostetik gruplari, floresan maddeleri, lüminesan maddeleri, biyolüminesan maddeleri, radyoaktif nüklitleri, pozitron yayan metalleri (pozitron yayici tomografide kullanim için) ve radyoaktif olmayan paramanyetik metal iyonlarini içerir. Tani maddeleri olarak kullanim amaciyla antikorlara konjuge edilebilecek metal iyonlari için genel olarak 4,741,900 sayili ABD patent belgesine bakilabilir. Uygun enzimler yabanturbu peroksidaz, alkali fosfataz, beta- galaktozidaz veya asetilkolinesterazi içerir; uygun prostetik gruplar streptavidin, avidin ve biyotini içerir; uygun floresan maddeler umbelliferon, floresin, floresin izotiosiyanat, rodainin, diklorotriazinilamin tloresin, dansil klorür ve fikoeritrini içerir; uygun lüminesan maddeler luminolü içerir; uygun biyolüminesan maddeler lüsiferaz, lüsiferin ve aekuorini 125 131 111 içerir; ve uygun radyoaktif nüklitler In ve 99Tcsyi içerir.

Bir baska örnekte efektör molekül antikorun in vivo yari ömrünü artirabilir ve/Veya antikorun immünojenisitesini azaltabilir ve/veya antikorun bir epitelyal bariyerden immün sisteme uygulanmasini güçlendirebilir. Bu türden uygun efektör moleküllerin örnekleri polimerleri, albümini, albümin baglayici proteinleri veya albümin baglayici bilesikleri, örnegin WO 05/117984”te açiklananlari içerir.

Bir düzenlemede CS F-l R,den bagimsiz bir efektör molekülün sagladigi yari ömür avantajlidir.

Efektör molekül bir polimer oldugunda, genellikle sentetik veya dogal olusumlu bir polimer, örnegin istege bagli olarak sübstitüe edilmis düz veya dalli Zincirli bir polialkilen, polialkenilen veya polioksialkilen polimer veya dalli veya dalsiz bir polisakarit, örnegin bir homo- veya hetero-polisakarit olabilir.

Yukarida bahsedilen sentetik polimerlerde mevcut olabilecek istege bagli belli basli sübstitüentler hidroksi, metil veya metoksi gruplarindan bir veya daha fazlasini içerir.

Sentetik polimerlerin belli basli örnekleri istege bagli olarak sübstitüe edilmis düz veya dalli Zincirli poli(etilenglikol), poli(pr0pilenglikol) poli(vinilalkol) veya bunlarin türevleri, özellikle istege bagli olarak sübstitüe edilmis poli(etilenglikol), örnegin inetoksipoli(etileng1ikol) veya bunun türevlerini içerir.

Dogal olusumlu özel poliinerler laktoz, amiloz, dekstran, glikojen veya bunlarin türevlerini Bir düzenlemede polimer albümin veya bir fragmani, örnegin insan serum albümin veya bunun bir fragmanidir.

Burada kullanildigi sekliyle "türevler" reaktif türevleri, örnegin maleimitler ve benzeri gibi tiol seçici reaktif gruplari içerir anlamdadir. Reaktif grup dogrudan veya bir baglayici parça vasitasiyla polimere baglanabilir. Bilinecegi gibi bu tür bir grubun kalintisi bazi durumlarda antikor fragmani ve polimer arasinda baglayici grup olarak ürünün bir parçasini olusturur.

Polimerin boyutu arzu edilen sekilde çesitlendirilebilir ancak genellikle 500 Da ila 50000 araliginda olacaktir. Polimer boyutu özellikle ürünün amaçlanan kullanimini, örnegin tümörler gibi bazi dokulari lokalize etme veya dolasimda yari ömrünü uzatina kapasitesini baz alarak seçilebilir (bu hususta örnegin Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545 referansma bakilabilir). Dolayisiyla, örnegin bir tümörün tedavisinde kullanim için ürünün dolasimdan çikmasi ve dokuya nüfuz etmesi amaçlandiginda küçük molekül agirlikli, örnegin 5000 Da civarinda bir molekül agirligina sahip bir polimerin kullanilmasi avantajli olabilir. Ürünün dolasimda kaldigi uygulamalarda, daha yüksek bir polimerin kullanilmasi avantajli olabilir.

Uygun polimerler bir polialkilen polimeri, örnegin bir poli(etilenglikol)°ü veya özellikle bir metoksipoli(etilenglik01),ü veya bir türevini ve özellikle yaklasik 15000 Da ila yaklasik 40000 Da araliginda bir molekül agirligina sahip olani içerir.

Bir örnekte mevcut bulusta kullanilan antikorlar poli(etilenglikol) (PEG) parçalarina baglanir. Özel bir örnekte antikor bir antikor fragmanidir ve PEG molekülleri antikor fragmaninda bulunan mevcut herhangi bir amino asit yan zinciri veya terminal amino asit islevsel grubu, örnegin herhangi bir amino, imino, tiol, hidroksil veya karboksil grubu vasitasiyla baglanir. Bu tür amino asitler antikor fragmaninda dogal olarak bulunabilir veya rekombinant DNA usullerini kullanarak fragman içinde tasarlanabilir (bakiniz Örnegin, US antikor molekülü modifiye edilmis bir Fab fragmani olup, burada modifikasyon bir efektör molekülün baglanmasini saglamak için agir zincirinin C-terminal ucuna bir veya daha fazla ainino asidin eklenmesidir. Ilave amino asitler efektör molekülün uygun sekilde baglanabilecegi bir veya daha fazla sistein kalintisini içeren bir modifiye mentese bölgesi olusturur. Iki veya daha fazla PEG molekülünün baglanmasi için çok sayida bölge kullanilabilir.

Uygun sekilde PEG molekülleri antikor &agmaninda yer alan en az bir sistein kalintisinin bir tiol grubuyla kovalent olarak baglanir. Modifiye edilmis antikor fragmanina baglanan her polimer molekülü fragmanda yer alan bir sistein kalintisinin kükürt atomuna kovalent olarak baglanir. Kovalent baglanti genellikle bir disülfür bag veya özellikle bir kükürt- karbon bag olacaktir. Bir tiol grubu baglanina noktasi olarak kullanildiginda, uygun sekilde etkinlestirilmis efektör moleküller, örnegin maleimitler gibi tiol seçici türevler ve sistein türevleri kullanilabilir. Yukarida açiklanan sekilde polimer modifikasyonlu antikor fragmanlarinin hazirlanmasinda baslangiç maddesi olarak bir etkinlestirilmis polimer kullanilabilir. Etkinlestirilmis polimer bir tiol reaktif grup, örnegin bir oi-halokarboksilik asit veya ester, örnegin iyodoasetamit, bir imit, örnegin maleimit, bir vinil sülfon veya bir disülfür içeren herhangi bir polimer olabilir. Bu tür baslangiç maddeleri ticari olarak piyasadan elde edilebilir (örnegin daha önce Shearsu Polymers Inc. (Huntsville, AL, ABD) olan Nektafdan) veya geleneksel kimyasal usulleri kullanarak ticari olarak piyasada mevcut baslangiç maddelerinden hazirlanabilir. Özel PEG molekülleri 20 K metoksi-PEG- amin (daha önce Shearsu olan Nektar; Rapp Polymere; ve SunBi0°dan elde edilir) ve M- PEG-SPA”yi (daha önce Shearsu olan Nektar”dan elde edilir).10 olarak baglanmis PEG,ye (poli(etilenglikol)) sahip modifiye edilmis bir Fab fragmani, F ab' fragmani veya diFab açiklanmaktadir [ayrica bakiniz, "P01y(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, " Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris ve S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC ve Aslam ve A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug baglanir. Bir örnekte, PEG modifikasyonlu Fab fragmani modifiye edilmis mentese bölgesinde tek bir tiol grubuna kovalent olarak bagli bir maleimit grubuna sahiptir. Bir lizin kalintisi maleimit grubuna kovalent olarak baglanabilir ve lizin kalintisindaki amin gruplarinin her birine yaklasik olarak 20,000 Da bir molekül agirligina sahip bir metoksipoli(etilenglikol) polimer baglanabilir. Dolayisiyla Fab fragmanina baglanan PEG`nin toplam molekül agirligi yaklasik olarak 40,000 Da olabilir. Özel PEG molekülleri PEG2MAL4OK (daha önce Shearsu olan Nektafdan elde edilir) olarak da bilinen N,N'-bis(metoksipo1i(eti1en glikol) MW 20,000) modifiye lizinin 2-[3-(N- maleimid0)pr0pioiiamido]etil amidini içerir.

Alternatif PEG baglayici kaynaklari GL2-400MA3 (burada asagidaki yapida m 5,tir) ve GL2-400MA9yi (burada m 2“dir ve n yaklasik olarak 450ldir) tedarik eden NOF”yi içerir: HJCO-(CHZCHEOL: Haco-(CHQCHQOKjw 54 0 m 2 veya 5,tir Bir baska deyisle her PEG yaklasik 20,000 Da,dir.

Dolayisiyla bir düzenlemede PEG SUNBRIGHT GL2-400MA3 olarak bilinen 2,3- bis(metilp01ioksietilen-oksi)-l-{[3-(6-maleimido-1-0ks0heksil)amino]propiloksi} heksan (2 kolu dalli PEG, -CH2) 3NHCO(CH.

Diger alternatif PEG efektör molekülleri asagidaki türdendir:10 CH3O-(CH2CH20)n CH30-(CHZCH20)n / Bir düzenlemede bir antikor, örnegin tam boy bir antikor saglanmakta olup, söz konusu antikor PEGile edilmistir (örnegin burada açiklanan bir PEG ile), zincirde amino asit 226°da veya civarinda, örnegin agir zincirin amino asit 226lsinda (dizisel numaralandirmaya göre) bir sistein amino asit kalintisiyla baglanmistir.

Bir düzenlemede mevcut açiklamada bir veya daha fazla PEG polimeri, örnegin 1 veya 2 polimer, örnegin 40 kDa bir polimer veya polimerler içeren bir Fab'PEG molekülü saglanmaktadir.

Mevcut açiklamaya uygun Fab-PEG molekülleri Fc fragmanindan bagimsiz bir yari ömüre sahip olmalari nedeniyle özellikle avantajli olabilirler.

Bir düzenlemede bir poliinere, örnegin bir PEG molekülüne, bir nisasta molekülüne veya bir albümin molekülüne konjuge edilmis bir scFv saglanmaktadir.

Bir düzenlemede antikor veya fragman örnegin yari ömrünü artirmak için bir nisasta molekülüne konjuge edilir. Nisastayi bir proteine konjuge etme usulleri US 8,017,739°da açiklanan sekildedir.

Burada açiklanan sekilde bir haberci molekül tespit edilebilir olan bir molekül, örnegin bir Horasan boya, radyoaktif isaret veya bir baska tespit edilebilir maddedir.

Mevcut bulusta, mevcut bulusa ait bir antikor molekülünün agir ve hafif zincirini(zincirlerini) kodlayan ayristirilmis bir DNA dizisi de saglanmaktadir. DNA dizisi uygun sekilde mevcut bulusa ait bir antikor inolekülünün agir veya hafif zincirini kodlar.

Mevcut bulusa ait DNA dizisi, örnegin kimyasal islemle üretilmis sentetik DNA, cDNA, genomik DNA veya bunlarin bir kombinasyonunu içerebilir.

Mevcut bulusa ait bir antikor molekülünü kodlayan DNA dizileri teknikte uzman olanlarca gayet iyi bilinen usullerle elde edilebilir. Örnegin, antikor agir ve hafif zincirlerinin bir kismini veya tamamini kodlayan DNA dizileri belirlenen DNA dizilerinden veya karsilik gelen amino asit dizilerini baz alarak istenilen sekilde sentezlenebilir.

Alici çerçeve dizilerini kodlayan DNA teknikte uzman kisilerce her yerden temin edilebilir ve bilinen amino asit dizileri baz alinarak kolaylikla sentezlenebilir.

Mevcut bulusa ait antikor mo lekülünü kodlayan DNA dizilerinin hazirlanmasinda standart moleküler biyoloji teknikleri kullanilabilir. Istenilen DNA dizileri oligonükleotit sentezi tekniklerini kullanarak tam olarak veya kismen sentezlenebilir. Uygun görüldügünde bölgeye yönlendirilmis mutagenez ve polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri kullanilabilir.

Uygun DNA dizilerinin örnekleri Sekil lide sunulmaktadir.

Mevcut bulus, bir veya daha fazla mevcut bulusa ait DNA dizisini içeren bir klonlama veya ekspresyon vektörüne de iliskindir. Dolayisiyla, mevcut bulusa ait bir antikoru kodlayan DNA dizilerinden birini veya daha fazlasini içeren bir klonlama veya ekspresyon vektörü de saglanmaktadir. Bir düzenlemede vektör DIZI ID. NO: 28 ve DIZI ID. NO: 20'de verilen dizileri içerir. Uygun sekilde, klonlama veya ekspresyon vektörü mevcut bulusa ait antikor molekülünün hafif zincirini ve agir zincirini kodlayan iki DNA dizisini, sirasiyla tercihen DIZI ID. NO: 28 ve DIZI ID. NO: 20°yi ve uygun sinyal dizilerini içerir. Bir örnekte vektör agir ve hafifzincirler arasinda bir genler arasi dizi içerir (bakiniz WO 03/048208).

Vektörlerin yapilabilecegi genel usuller, transfeksiyon usulleri ve kültür usulleri teknikte uzman olanlarca gayet iyi bilinir. Bu hususta, "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley lnterscience, New York ve Cold Spring Harbor Publishing tarafindan üretilen Maniatis Manual referanslarina gönderme yapilmaktadir.

Mevcut bulusa ait bir antikoru kodlayan DNA dizilerinden birini veya daha fazlasini içeren bir veya daha fazla klonlama veya ekspresyon vektörünü içeren bir konak hücre de saglanmaktadir. Mevcut bulusa ait antikor molekülünü kodlayan DNA dizilerinin ekspresyonu için uygun herhangi bir konak hücre/vektör sistemi kullanilabilir. Bakteriyal, örnegin E. 0011' ve baska mikrobiyal sistemler kullanilabilir veya ökaryotik, örnegin memeli konak hücre ekspresyon sistemleri de kullanilabilir. Uygun memeli konak hücreleri CHO, miyelom veya hibridom hücrelerini içerir.

Mevcut bulusta, mevcut bulusa uygun bir antikor molekülünün üretimine iliskin bir islem de saglanmakta olup, söz konusu islem mevcut bulusa ait bir vektörü içeren bir konak hücrenin, mevcut bulusa ait antikor molekülünü kodlayan DNAldan protein ekspresyonunu saglamak için uygun kosullar altinda kültürlenmesini ve antikor molekülünün ayristirilmasini içerir.

Sadece bir agir veya hafif zincir polipeptidini içerebilecek bir antikor molekülü de aç iklanmakta olup, bu durumda konak hücrelerin transfeksiyonu için sadece bir agir zincir veya hafif zincir polipeptidini kodlayan dizinin kullanilinasi gerekli olur. Agir ve hafif zincirlerin her ikisini içeren ürünlerin üretimi için hücre hatti iki vektörle, bir hafif zincir polipeptidini kodlayan bir ilk vektörle ve bir agir zincir polipeptidini kodlayan bir ikinci vektörle transfekte edilebilir. Alternatif olarak, tek bir vektör, yani hafif Zincir ve agir zincir polipeptitlerini kodlayan dizileri içeren vektör kullanilabilir.

Mevcut açiklamaya uygun antikorlar ve fragmanlar konak hücrelerden iyi seviyelerde eksprese edilir. Dolayisiyla antikorlarin ve/veya baglayici fragmanlarin özellikleri ticari ölçekte ekspresyon için uygundur.

Sonuç olarak bir konak hücrenin kültürlenmesi ve bir antikorun veya fragmaninin eksprese edilmesi, bunun ayristirilmasi ve istege bagli olarak saflastirilarak ayristirilmis bir antikorun veya fragmaninin saglanmasi için bir islem saglanmaktadir. Bir düzenlemede islem ayrica ayristirilmis antikora veya fragmana bir efektör molekülün konjuge edilmesi, örnegin özel olarak burada açiklanan sekilde bir PEG polimerinin konjuge edilmesi asamasini içerir.

Bir düzenlemede bir antikorun (özellikle bulusa uygun bir antikorun veya fragmanini) saflastirilmasi için bir islem saglanmakta olup, söz konusu islem katiskilarin kolonda tutulmasini ve antikorun ayristirilmasini saglayan baglayici olmayan modda anyon degistirme kromatografisinin gerçeklestirilmesini içerir.

Bir düzenlemede saflastirmada bir CSF-IR kolonunda afinite yakalama kullanilir.

Bir düzenlemede saflastirmada albümin füzyon veya konjugat moleküllerinin saflastirilmasi için sibakron mavisi kullanilir.

Islemde kullanim için uygun iyon degistirici reçineler Q.FF reçinesini (GE-Healthcarelden temin edilir) içerir. Asama örnegin yaklasik 8 bir pl-Pta gerçeklestirilebilir.

Islem ayrica örnegin yaklasik 4 ila 5, örnegin 4.5 bir pH9ta gerçeklestirilen katyon degistirme kromatografisinin kullanildigi bir baslangiç yakalama asamasini içerebilir.

Katyon degistirme kromatografisinde örnegin CaptoS reçine veya SP Sepharose FF (GE- Healthcare'den temin edilir) gibi bir reçine kullanilabilir. Daha sonra antikor veya fragman örnegin 200 mM bir konsantrasyonda sodyum klorür gibi bir iyonik tuz çözeltisi kullanarak reçineden ayristirilabilir.

Dolayisiyla kromatografi asamasi veya asamalari uygun görüldügünde bir veya daha fazla yikama asamasini içerebilir.

Saflastirma islemi bir dia-filtreleme asamasi gibi bir veya daha fazla filtreleme asamasini da içerebilir.

Sonuç olarak bir düzenlemede büyük ölçüde saflastirilmis formda, özellikle endotoksinden ve/veya konak hücre proteini veya DNAisindan muaf veya büyük ölçüde muaf saflastirilmis bir anti-CSF-lR antikoru veya fragmani, örnegin bir hümanize antikor veya fragman, özellikle belirtmek gerekirse bulusa uygun bir antikor veya fragman saglanmaktadir.

Yukarida kullanildigi sekliyle saflastirilmis form en az %90 safliga, örnegin %91, 92, 93, Endotoksinden büyük ölçüde muaf genel olarak antikor ürün miligraminda l EU veya daha az, örnegin ürün miligraminda 0.5 veya 0.1 EU bir endotoksin içerigine karsilik gelecek anlaindadir.

Konak hücre proteini veya DNAisindan büyük ölçüde muaf genel olarak antikor ürün miligraminda 400 ug veya daha az, uygun görüldügünde örnegin miligramda 100 ug veya daha az, özellikle miligramda 20 ug konak hücre proteini ve/veya DNA,si içerigine karsilik gelecek anlamdadir.

Mevcut bulusta bir ilaç olarak kullanim için açiklamaya uygun bir anti-CSF-lR antikoru da (veya bunu içeren farmasötik bilesimler) saglanmaktadir.

Mevcut bulusta kanser tedavisi için açiklamaya uygun bir anti-CSF-IR antikoru da (veya bunu içeren farmasötik bilesimler) saglanmaktadir.

Mevcut bulusta açiklamaya uygun bir anti-CSF-lR antikorunun (veya bunu içeren farmasötik bilesim) kanser tedavisi veya profilaksisi için bir ilacin imalatinda kullanimi da saglanmaktadir.

Mevcut bulusta kanserden muzdarip veya kanser riski tasiyan bir insan denegin tedavisi için bir usul de saglanmakta olup, söz konusu usul denege açiklamaya uygun bir anti-CSF- 1R antikorunun etkili bir miktarinin uygulanmasini içerir.

Açiklamaya uygun antikor meme kanseri, prostat kanseri, kemik kanseri, miyelom, kolorektal kanser, lösemi, lenfoma, cilt kanseri such as melanom, özofagus kanseri, gastrik kanser, astrositik kanser, endometriyal kanser, servikal kanser, mesane kanseri, renal kanser, akciger kanseri, karaciger kanseri, tiroid kanseri, bas & boyun kanseri, pankreas kanseri ve over kanserinden olusan gruptan seçilen kanserin tedavi edilmesinde kullanilabilir.

Bir düzenlemede kanser yukarida siralanan baslangiç kanserlerinin herhangi birinden, özellikle kemik kanserinden metastaz yapmis kanserdir.

Sasirtici bir sekilde CSF-lR etkinligini inhibe eden bir anti-CSF-lR antikorunun fibrotik hastaligin tedavi edilmesinde etkili oldugunu kanitlayabildik. Özellikle belirtmek gerekirse, bir anti-CSF-lR antikorunun in vi'vo pulmoner fibroz hayvan modellerinde etkili oldugunu kanitlayabildik.

Mevcut bulusta fibrotik hastalik tedavi için açiklamaya uygun bir anti-CSF-lR antikoru da (veya bunu içeren farmasötik bilesiinler) saglanmaktadir.

Mevcut bulusta açiklamaya uygun bir anti-CSF-lR antikorunun (veya bunu içeren farmasötik bilesimin) fibrotik hastalik tedavi veya profilaksisi için bir ilacin imalatinda kullanimi da saglanmaktadir.

Mevcut bulusta Iibrotik hastaliktan muzdarip veya fibrotik hastalik riski altinda bir insan denegin tedavi için bir usul de saglanmakta olup, söz konusu usul denege açiklamaya uygun bir anti-CSF-lR antikorunun etkili bir miktarinin uygulanmasini içerir.

Mevcut basvuruda, "Iibrotik hastalik" terimi yara iyilesmesine bir organ veya dokuda fazla fibroz bag dokusunun olusmasiyla atipik bir yanit vererek kendini gösteren hastaliklari içerir. Örnek fibrotik hastaliklar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla pulmoner fibrozu, örnegin idiyopatik pulmoner fibrozu ve kistik fibrozu, tübüler atrofi ve interstisyel tibroz dahil renal fibrozu, karaciger fibrozu, karaciger sirozu, primer sklerozan kolanjit, primer biliyer siroz, endomiyokardiyal fibroz, mediastinal tibroz, miyelofibroz, retroperitonal fibroz, ilerleyici masif tibroz, nefrojenik sistemik fibroz, Crohn hastaligi, keloit, miyokard enfarktüsü, skleroderma, sistemik skleroz ve artofibrozu içerir.

Bir düzenlemede açiklamaya uygun antikorlar veya fragmanlar kanser veya fibrotik hastalik tedavisinde veya profilaksisinde kullanilir.

Açiklamaya uygun antikor enflamatuar hastaliklarinin, örnegin, enflamatuar artrit, ateroskleroz, multipl skleroz, enflamatuar bagirsak hastaligi, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, romatoid spondilit, ankilozan spondilit, artrit, psöriatik artrit, romatoid artrit, osteoartrit, egzama, kontakt dermatit, psöriyazis, toksik sok sendromu, sepsis, septik sok, endotoksik sok, astim, kronik pulmoner enflamatuar hastalik, silikoz, pulmoner sarkoidoz, osteoporoz, restenoz, kardiyak ve renal reperfuzyon hasari, tromboz, glomerülonefrit, diyabet, greft versus konak reaksiyonu, allogreft reddi, multipl skleroz, kas dejenerasyonu, kas distrofisi, Alzheimer hastaligi ve inmenin tedavisinde kullanilabilir.

Mevcut açiklamaya uygun antikorlar ve fragmanlar tedavide veya profilakside kullanilabilir.

Mevcut bulusa ait antikor molekülü tanida, örnegin CSF-lR'yi içeren hastalik durumlarinin i'n vivo tanisinda ve görüntülenmesinde de kullanilabilir .

Mevcut bulusa ait antikorlar bir patolojik sorunun tedavisinde veya profilaksisinde kullanisli olduklari için mevcut bulusta farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan, seyreltici veya tasiyicidan biri veya daha fazlasiyla kombinasyon halinde mevcut bulusa ait bir antikor molekülünü içeren farmasötik veya tanisal bir bilesim de saglanmaktadir.

Dolayisiyla, bulusa ait bir antikorun bir ilacin imalatinda kullanimi da saglanmaktadir.

Bilesim genellikle normal olarak farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyiciyi içerecek steril, farmasötik bir bilesimin parçasi olarak saglanir. Mevcut bulusa ait bir farmasötik bilesim ilaveten farmasötik olarak kabul edilebilir bir adjuvan içerebilir.

Mevcut bulusta farmasötik veya tanisal bir bilesimin hazirlanmasina iliskin bir islemde saglanmakta olup, söz konusu islem mevcut bulusa ait antikor molekülünün farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan, seyreltici veya tasiyicidan birine veya daha fazlasina eklenmesini ve bunlarla birlikte karistirilmasini içerir.

Antikor molekül farmasötik veya tanisal bilesiindeki tek etken madde olabilir. Alternatif olarak, antikor örnegin eszamanli, ardisik veya ayri olarak bir veya daha fazla baska terapötik olarak etken maddeyle kombinasyon halinde uygulanabilir. Dolayisiyla farmasötik veya tanisal bilesimdeki antikor molekülüne baska etken maddeler, örnegin baska antikor içerik maddeleri, örnegin epidermal büyüme faktörü reseptör ailesi (EGFR, HER-2), vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörleri (VEGFR), trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü (PDGFR) antikorlari veya antikor olmayan içerik maddeler, örnegin imatinib, dasatinib, nioltinib, basutinib, gefitinib, erlotinib, temsirolimus, vandetanib, vemurafenib, krizotinib, vorinostat, romidepsin, bortezomib, sorafenib, sunitinib, pazopanib, regorafenib, kabozantinib, Perfenidon, steroidler veya baska ilaç molekülleri, özellikle yari ömrü CSF-lR baglanmasindan bagimsiz olan ilaç molekülleri eslik edebilir.

Burada kullanildigi sekliyle etken madde bir ilgili dozda farmakolojik bir etki, örnegin terapötik bir etki gösteren bir içerik maddeye karsilik gelir.

Farmasötik bilesimler uygun sekilde bulusa ait antikorun terapötik olarak etkili bir miktarini içerir. Burada kullanildigi sekliyle "terapötik olarak etkili miktar" terimi bir terapötik maddenin hedeflenen bir hastaligi veya rahatsizligi tedavi etmek, iyilestirmek veya önlemek veya tespit edilebilir bir terapötik, farmakolojik veya önleyici etki sergilemek için gerekli olan bir miktarina karsilik gelir. Herhangi bir antikor için terapötik olarak etkili miktar ilk olarak ya hücre kültürü analizlerinde veya hayvan modellerinde, genellikle kemirgenler, tavsanlar, köpekler, domuzlar veya primatlarda hesaplanabilir.

Hayvan inodeli dogru konsantrasyon araliginin ve uygulama yolunun belirlenmesinde de kullanilabilir. Daha sonra bu bilgi insanlarda faydali dozlarin ve uygulama yollarinin belirlenmesinde kullanilabilir.

Bir insan denek için terapötik olarak etkili kesin miktar hastalik durumunun ciddiyetine, denegin genel sagligina, denegin yasina, kilosuna ve cinsiyetine, diyete, uygulama zamanina ve sikligina, ilaç kombinasyonuna(kombinasy0nlarina), reaksiyon duyarliliklarina ve tedaviye verilen toleransa/yanita bagli olacaktir. Bu miktar rutin deneyler yaparak belirlenebilir ve klinik tedavi uzmaninin degerlendirmesine girer. Genel olarak, terapötik olarak etkili bir miktar 0.01 mg/kg ila 500 mg/kg, örnegin 0.] mg/kg ila 200 ing/kg, ömeginlOO mg/kg olacaktir.

Farmasötik bilesimler kolaylikla beher doz için bulusa ait bir etken maddenin önceden belirlenmis bir miktarini içeren birim doz formlarinda sunulabilir.

Mevcut açiklamaya uygun antikorlarin terapötik dozlari in vi'vo bariz veya sinirli toksikolojik etkiler göstermez.

Bilesimler bir hastaya ayri olarak uygulanabilir veya baska maddelerle, ilaçlarla veya hormonlarla kombinasyon halinde (örnegin eszamanli, ardisik veya ayri olarak) uygulanabilir.

Bir düzenlemede mevcut açiklamaya uygun antikorlar veya baglayici fragmanlar bir veya daha fazla baska kanser tedavisi seçenegiyle, örnegin kemoterapi, radyasyon tedavisi veya ameliyatla birlikte kullanilir. Bir kemoterapötikle birlikte uygulanmasi durumunda, antikor kemoterapötik maddeden önce veya sonra veya ayni zamanda uygulanabilir. Saglanan antijen baglayici proteinlerle kombinasyon halinde kullanilabilecek kemoterapi tedavileri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla alkilleyici/DNA hasari yapan maddeleri (örnegin karboplatin, sisplatin), antimetabolitleri (örnegin kapesitabin, gemsitabin, 5-tlor0ürasil), mitotik inhibitörleri (örnegin paklitaksel, vinkristin) içerir. Çesitli enflamatuar hastaliklarin tedavisinde kullanilacak antikorlar tek basina kullanilabilir veya çesitli baska anti-enflamatuar maddelerle kombine edilebilir. Çesitli fibrotik hastaliklarin tedavisinde kullanilacak antikorlar tek basina kullanilabilir veya çesitli baska anti-fibrotik maddelerle kombine edilebilir. Bu tür bir madde örnegi Perfedidondur.

Mevcut bulusa ait antikor molekülünün hangi dozda uygulanacagi tedavi edilecek rahatsizligin yapisina, mevcut rahatsizligin ciddiyetine ve antikor molekülünün profilaktik olarak mi ya da mevcut bir rahatsizligi tedavi etmek için mi kullanilacagina göre degisir.

Doz sikligi antikor molekülünün yari ömrüne ve etkisinin süresine bagli olacaktir. Eger antikor molekülü kisa bir yari ömüre (örnegin 2 ila 10 saat) sahipse, günde bir veya daha fazla dozun uygulanmasi gerekli olabilir. Alternatif olarak, eger antikor molekülü uzun bir yari ömüre (örnegin 2 ila 15 gün) ve/veya uzun süreli farmakodinamik (PD) profiline sahipse, sadece günde bir kerelik, haftada bir kerelik veya hatta her 1 veya 2 ayda bir kerelik bir dozajin uygulanmasi gerekli olabilir.

Burada kullanildigi sekliyle yari ömür molekülün dolasimda, örnegin serum/plazmada Burada kullanildigi sekliyle farmakodinamikler mevcut açiklamaya uygun inolekülün biyolojik etki profiline ve özellikle süresine karsilik gelir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicinin kendisi bilesimi alan kisiye zararli antikorlarin üretilmesini indüklememeli ve toksik olmamalidir. Uygun tasiyicilar büyük, yavas metabolize olan makromoleküller, örnegin proteinler, polipeptitler, lipozomlar, polisakaritler, polilaktik asitler, poliglikolik asitler, polimerik amino asitler, amino asit kopolimerleri ve inaktif virüs parçaciklari olabilir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tuzlar, örnegin mineral asit tuzlari, örnegin hidroklorürler, hidrobromürler, fosfatlar ve sülfatlar veya asetatlar, propionatlar, malonatlar ve benzoatlar gibi organik asitlerin tuzlari kullanilabilir.

Terapötik bilesimlerdeki farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ilaveten su, salin, gliserol ve etanol gibi sivilari içerebilir. Ilaveten, bu bilesimlerde nemlendirici veya emülsifiye edici maddeler veya pH tamponlama maddeleri gibi yardimci maddeler mevcut olabilir. Bu tür tasiyicilar farmasötik bilesimlerin hastanin almasi için tabletler, haplar, drajeler, kapsüller, sivilar, jeller, suruplar, bulamaçlar ve süspansiyonlar seklinde formüle edilmesini saglar.

Uygun uygulama formlari, örnegin enjeksiyon veya iniüzyon, örnegin bolus enjeksiyon veya kesintisiz infüzyon yoluyla parenteral uygulama için uygun formlari içerir. Ürün enjeksiyon veya iniüzyon için oldugunda bir süspansiyon, çözelti veya yagli veya sulu bir vasita içinde emülsiyon formunda olabilir ve süspansiyon Olusturucu, koruyucu, stabilize edici ve/veya dagitici maddeler gibi formülasyon yapma maddelerini içerebilir. Alternatif olarak, antikor molekülü kullanim öncesinde uygun bir steril siviyla sulandirip hazirlanan kuru formda olabilir.

Formüle edildikten sonra bulusa ait bilesimler dogrudan denege uygulanabilir. Tedavi edilecek denekler hayvanlar olabilir. Bununla birlikte, bir veya daha fazla düzenlemede bilesimler insan deneklere uygulamak için uyarlanir.

Uygun sekilde mevcut açiklamaya uygun formülasyonlarda, nihai formülasyonun pHH antikor veya fragmanin izoelektrik noktasi degeriyle ayni degildir, örnegin eger formülasyonun pH317 ise bu durumda 8-9 veya üzeri bir pl uygun olabilir. Teoriyle sinirli kalmayi istemeden bunun sonunda gelismis stabilitesi olan bir nihai formülasyon saglayabilecegi, örnegin antikorun veya fragmanm çözeltide kalacagi düsünülmüstür.

Bir örnekte 40 ila 7.0 araliginda bir pH°taki farmasötik formülasyon 1 ila 200 mg/mL mevcut açiklamaya uygun bir antikor, 1 ila 100 mM bir tampon, %000] ila %1 bir yüzey aktif madde, a) 10 ila 10 ila 500 mM bir stabilizatör ve 5 ila ila 500 mM tonisiteyi ayarlayici bir madde içerir.

Bu bulusa ait farmasötik bilesimler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla oral, intravenöz, intramüsküler, intra-arteriyal, intramedüler, intratekal, intraventriküler, transdermal, transkutane (örnegin, bakiniz WO 98/20734), subkutane, intraperitonal, intranazal, enteral, topikal, sublingual, intravajinal veya rektal yollari içeren çesitli yollardan uygulanabilir.

Bulusa ait farmasötik bilesimlerin uygulanmasinda hipospreyler de kullanilabilir. Tipik olarak, terapötik bilesimler gerek sivi çözeltiler gerek süspansiyonlar seklindeki enjektabller olarak hazirlanabilir. Enjeksiyon öncesinde sivi vasitalar içinde çözelti veya süspansiyon için uygun kati formlar da hazirlanabilir.

Bilesimlerin dogrudan uygulanisi genellikle subkutane, intraperitonal, intravenöz veya intramüsküler yoldan enjeksiyonla gerçeklestirilir veya bir dokunun interstisyel bosluguna uygulanir. Bilesimler bir lezyonun içine de uygulanabilir. Dozaj uygulamasi tek dozlu bir program veya çok dozlu bir program olabilir.

Takdir edilecegi üzere bilesimdeki etken madde bir antikor molekülüdür. Böyle olunca gastrointestinal sistemde bozunmaya egilimli olacaktir. Dolayisiyla, eger bilesim gastrointestinal sistemin kullanildigi bir yoldan uygulanacaksa, bilesimin antikoru bozunmaktan koruyacak ancak gastrointestinal sistemden absorbe edildiginde de antikoru salimi yapacak maddeleri içermesi gerekli olacaktir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilara iliskin ayrintili bir açiklama Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991) referansinda bulunur.

Bir düzenlemede formülasyon inhalasyon dahil topikal uygulamalar için bir formülasyon seklinde saglanir.

Uygun inhale edilebilir preparasyonlar inhale edilebilir tozlari, itici gazlar içeren ölçülü aerosolleri veya itici gazlardan muaf inhale edilebilir çözeltileri içerir. Etken madde içeren açiklamaya uygun inhale edilebilir tozlar sadece yukarida bahsedilen etken maddelerden veya yukarida bahsedilen etken maddelerin fizyoloj ik olarak kabul edilebilir bir eksipiyanla bir karisimindan olusabilir.

Bu inhale edilebilir tozlar monosakaritleri (örnegin glukoz veya arabinoz), disakaritleri (örnegin laktoz, sakaroz, maltoz), oligo- ve polisakaritleri (örnegin dekstranlar), polialkolleri (örnegin sorbitol, mannitol, ksilitol), tuzlari (örnegin sodyum klorür, kalsiyum karbonat) veya bunlarin birbirleriyle karisimlarini içerir. Mono veya disakaritlerin kullanimi, sart olmasa da özellikle hidratlari formunda laktoz veya glukoz kullanimi uygun olur.

Akcigerde birikecek parçaciklar 10 mikrondan daha küçük, örnegin 1-9 mikron, örnegin 0.1 ila 5 um, özellikle 1 ila 5 mm bir parçacik boyutunu gerektirir. Etken maddenin (antikor veya fragman gibi) parçacik boyutunun birincil önemi vardir. inhale edilebilir aerosollerin hazirlanmasinda kullanilabilecek itici gazlar teknikte bilinmektedir. Uygun itici gazlar n-propan, n-bütan veya izobütan gibi hidrokarbonlar ve metan, etan, propan, bütan, siklopropan veya siklobütanin klorlanmis ve/Veya florlanmis türevleri gibi halohidrokarbonlar arasindan seçilir. Yukarida bahsedilen itici gazlar tek baslarina veya bunlarin karisimlari halinde kullanilabilir. Özellikle uygun itici gazlar TG ll, TG 12, TG l34a ve TG227 arasindan seçilen halo jenlenmis alkan türevleridir. Yukarida bahsedilen halojenleninis hidrokarbonlardan, karisimlari özellikle uygundur.

Itici gaz içeren inhale edilebilir aerosoller yardimci çözücüler, stabilizatörler, yüzey aktif maddeler (sürfaktanlar), antioksidanlar, yaglandiricilar ve pH düzenleyici vasitalar gibi baska içerik maddeler de içerebilir. Bu içerik maddelerin hepsi teknikte bilinmektedir.

Bulusa uygun itici gaz içeren inhale edilebilir aerosoller agirlikça %5'e dek etken madde içerebilir. Bulusa uygun aerosoller, örnegin agirlikça %0.002 ila %5, agirlikça %001 ila Alternatif olarak akcigere topikal uygulamalar bir sivi çözelti veya süspansiyon formülasyonunun örnegin bir nebülizatör, örnegin bir kompresöre baglanmis bir nebülizatör gibi bir alet (örnegin, Pari Respiratory Equipment, lnc. (Richmond, Va.) tarafindan imal edilen bir Pari Master(R) kompresöre baglanmis Pari LC-J et Plus(R) nebülizatör) kullanarak uygulanmasiyla da olabilir.

Bulusa ait antikor bir çözücü içinde dagitilmis halde, örnegin bir çözelti veya bir süspansiyon formunda da verilebilir. Uygun bir fizyolojik çözelti, örnegin salin veya bir baska farmakolojik olarak kabul edilebilir çözücü veya tamponlanmis bir çözelti içinde süspansiyon yapilabilir. Teknikte bilinen tamponlanmis çözeltiler yaklasik 4.0 ila 5.0 bir 055 mg sodyum sitrat içerebilir. Bir süspansiyonda, örnegin liyofilize antikor kullanilabilir.

Terapötik süspansiyonlar veya çözelti formülasyonlari bir veya daha fazla eksipiyan da içerebilir. Eksipiyanlar teknikte gayet iyi bilinir ve tamponlari (örnegin, sitrat tampon, fosfat tampon, asetat tampon ve bikarbonat tampon), amino asitleri, üreyi, alkolleri, askorbik asidi, fosfolipitleri, proteinleri (örnegin, serum albümin), EDTA,yi, sodyum klorürü, lipozomlari, mannitolü, sorbitolü ve gliserolü içerir. Çözeltiler veya süspansiyonlar lipozomlar veya biyobozunur mikroküreler içinde kapsüllenebilir.

F ormülasyon genellikle steril imalat islemlerini kullanarak büyük ölçüde steril bir formda saglanacaktir.

Bu, teknikte genel bilgi sahip olanlarin asina oldugu usullerle formülasyonda kullanilan tamponlanmis çözücünün/çözeltinin filtrelenmesi, antikorun steril tamponlanmis çözücü çözeltisinde aseptik süspansiyonu ve formülasyonun steril kaplara dagitilmasi yoluyla üretimi ve sterilizasyonu içerebilir.

Mevcut açiklamaya uygun nebülizasyon formülasyonu örnegin folyo torbalarda paketlenmis tek dozluk birimler seklinde (örnegin, kapatilmis plastik kaplar veya siseler) saglanabilir. Her sise, örnegin 2 mL çözücü/çözelti tampon bir hacimde bir birim doz Burada açiklanan antikorlar nebülizasyon yoluyla verilmek için uygun olabilir.

Mevcut bulusa ait antikorun gen tedavisini kullanarak uygulanabilmesi de tasarlanmistir.

Bunu elde etmek için uygun DNA bilesenlerinin denetimi altinda antikor molekülünün agir ve hafif zincirlerini kodlayan DNA dizileri bir hastaya verilir, bu sekilde antikor zincirleri DNA dizilerinden eksprese olur ve in sim bir araya gelir.

Bir düzenlemede mevcut açiklama antikorlarin veya &agmanlarim örnegin bir haberci moleküle konjuge edilmis bir reaktif veya tam maddesi olarak kullanimini içerir.

Dolayisiyla isaretlenmis halde açiklamaya uygun antikor veya fragman saglanmaktadir. Bir yönü itibariyla açiklamaya uygun bir antikoru veya fragman içeren bir kolon saglanmaktadir.

Sonuç olarak asagidaki kullanimlarda bir reaktif olarak kullanim için bir anti-CSF- 1 R antikoru veya fragmani saglanmaktadir: l) CSF-lR proteininin (veya bunun baglanma fragmaninin) saflastirilmasi- bir matrise konjuge edilir ve bir afinite kolonu veya (anti-CSF-thin modifiye bir formu olarak) bir çökeltme maddesi olarak kullanilir (örnegin modifiye edilmis olabilecek bir baska molekül tarafindan taninan bir domenle modifiye bir form seklinde), istege bagli olarak bir anti-FC reaktifle çökeltilir 2) canli veya sabitlenmis hücreler üzerinde veya hücreler içinde (in vitro hücrelerde veya doku veya hücre kesitlerinde) CSF-lR tespiti ve/veya miktar tayini. Bu amaçla kullanimlar anti-CSF-IR tedavisinin etkisini izlemek için bir biyomarkör olarak CSF-lR,nin miktar tayinini içerebilir. Bu amaçlarla aday modifiye edilmis (örnegin bir genetik füzyon proteini veya kimyasal konjugat olarak bir baska parça ekleyerek, örnegin bir haberci molekül, örnegin tespit amaciyla kullanilan bir floresan isaret ekleyerek) bir formda kullanilabilir. 3) (1) ve (2)”de örneklendirilen yollarla modifiye edilmis adaya baglayarak isaretlenmis CSF-lR tasiyan hücrelerin saflastirilmasi veya siniflandirilmasi.

Mevcut tarifname baglaminda ”bulundurur" içerir anlamina gelir.

Teknik açidan uygun oldugunda bulusa ait düzenlemeler birlestirilebilir.

Burada düzenlemeler bazi özellikleri/parçalari içerir sekilde açiklanmaktadir. Açiklama söz konusu özelliklerden/parçalardan olusan veya esas olarak bunlardan olusan ayri düzenlemeleri de kapsar.

Burada özel olarak ve açik sekilde bahsedilen tüm düzenlemeler gerek tek basina gerek bir veya daha fazla baska düzenlemeyle birlikte bir feragate temel olusturabilir.

Mevcut bulus sadece örnekleme olsun diye asagidaki örneklerde daha ayrintili açiklanmakta olup, söz konusu örneklerde asagidaki Sekillere gönderme yapilmaktadir: Sekil 1A ila lF Sekil 2A ve 2B Sekil Sa Sekil 5b bazi amino asit ve polinükleotit dizilerini göstermektedir. bazi dizilerin hizalanisini göstermektedir. hücrelerin transfeksiyonunda kullanilan ve proteini hücre yüzeyinde eksprese eden bir polinükleotit tarafindan kodlanan insan CSF-l R hücre disi domeninin dizisini göstermektedir. Bu hücreler daha sonra konak hayvanlarin immünize edilmesinde kullanilmistir. antikor Ab969 ile THP-l hücrelerine CSF-l baglanmasinin inhibisyonunu göstermektedir. antikor Ab969sla primer insan monositlerinde CSF-l aracili sagkalim ve proliferasyonun inhibisyonunu göstermektedir. antikor Ab969”la primer insan monositlerinde lL-34 aracili sagkalim ve proliferasyonun inhibisyonunu göstermektedir. antikor Ab5 35 ,le primer murin monositlerinde CSF-l aracili sagkallm ve proliferasyonun inhibisyonunu göstermektedir.

Ab969, insan CSF-l ve bir izotip kontrolle inkübe edilmis THP-l hücrelerinde hücre yüzeyindeki CSF-lR seviyelerini göstermektedir. bir izotip kontrolle karsilastirildiginda Ab969 ile isleme tabi tutulmus THP-l hücrelerinde hücre yüzeyindeki CSF-1R°in orantili seviyelerini göstermektedir.

Ab 535, CSF-l ve bir izotip kontrolle inkübe edilmis RAW264.7 hücrelerinde hücre yüzeyindeki CSF-lR seviyelerini göstermektedir. bir izotip kontrolle karsilastirildiginda Ab5 35 ile isleme tabi tutulmus RAW264.7 hücrelerinde hücre yüzeyindeki CSF-lR*nin orantili seviyesini göstermektedir.

Sekil 15a Sekil 15b Sekil 15c Sekil 18a CSF- 1 ”le uyarma veya Ab969 ile isleme tabi tutmayla birlikte CSF- R ile transfekte edilmis HEK293F hücrelerinde CSF-IR fosforlanmasi seviyesini göstermektedir.

Ab969 ve CSF-l ile inkübe edildiklerinde primer insan monositlerinden MCP-l salgilamasi seviyesini göstermektedir. kimerik Ab969.g0 ile karsilastirildiginda hümanize antikor 969.g5 ile CSF-l aracili monosit sagkalimi inhibisyonu üzerindeki etkiyi göstermektedir.

Ab969,un çesitli hümanize antikor greftleriyle CSF-l aracili monosit sagkalimi inhibisyonu üzerindeki etkiyi göstermektedir.

Ab969.g2“nin 7 mg/kg°lik tek bir intravenöz dozuyla tedavi edilmis sinomolgus maymunlarindan alinan serum nuinunelerinde CSF-l konsantrasyonunu göstermektedir.

Ab969.g2'nin 1.5 mg/kg”lik tek bir intravenöz dozuyla tedavi edilmis sinomolgus maymunlarindan alinan serum numunelerinde CSF-l konsantrasyonunu göstermektedir. farkli zaman noktalarinda sinomolgus maymunlarina 7 mg/kg ve 1.5 mg/kg dozajlarinda antikor Ab969.g2 uygulamaninin dolasimdaki klasik olmayan monositler üzerindeki etkisini göstermektedir. insan meme kanseri ksenogrefti MCP-7 subkutane transplantlarini tasiyan immün yetersizligi olan tüysüz farelerde bir kontrol antikoru, bir pozitif kontrol ve vasita kontrole karsi antikor Ab535”in antitümör etkisini göstermektedir. bir oitotopik prostat kanseri model PC-3,te bir kontrol antikoru, bir pozitif kontrol ve vasita kontrole karsi antikor Ab535”in antitümöral etkinligini göstermektedir. bleomisin indüklü akciger Iibrozunda bir izotip kontrolle karsilastirarak Ab535 ile yapilan tedavinin BALF kollajen konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir.

Sekil 18b Sekil 18c Sekil 18d Sekil 20a Sekil 20b Sekil 20c bleomisin indüklü akciger Iibrozunda bir izotip kontrolle karsilastirarak Ab535 ile yapilan tedavinin akciger numunelerinde Ashcroü puani ile Ölçülmüs fibrotik patoloji üzerindeki etkisini göstermektedir. bleomisin indüklü akciger Iîbrozunda bir izotip kontrolle karsilastirarak Ab535 ile yapilan tedavinin serumda albümin konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. bleomisin indüklü bir akciger fibrozu çalismasindan farelerin BAL sivisinda makrofajlarin sayisini ve bleomisin indüklü akciger fibrozunun Ab535 ile tedavisinin izotip kontrolle tedavi edilmis hayvanlarla karsilastirildiginda BAL sivisinda makrofajlarin sayisini azalttigini göstermektedir. Veri ortalama ± SEM olarak gösterilmektedir; * salin izotipten anlamli fark oldugunu gösterir; # izotip kontrol antikoru ile dozlanmis bleomisinle tedavi edilmis farelerden anlamli fark oldugunu gösterir (p 5 0.05) salin kontrol, bleomisin arti izotip kontrol ve bleomisin arti Ab535 ile tedavi edilmis hayvanlara ait akcigerlerin histopatolojik analizine iliskin temsili görüntüler. indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerde izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirarak Ab535 ile yapilan tedavinin BALF kollajen konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir. indükleninis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerde izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirarak Ab535 ile yapilan tedavinin akciger numunelerinde Ashcroft puani ile ölçülmüs fibrotik patoloji üzerindeki etkisini göstermektedir. indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerde izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirarak Ab535 ile yapilan tedavinin serumda albümin konsantrasyonu üzerindeki etkisini göstermektedir.

Sekil 20d bir pulmoner fibroz ADA yetersizligi modelinde farelerin BAL sivisindaki makro fajlarin sayisini ve indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerin Ab535 ile tedavisinin BAL sivismda makrofajlarin sayisini azalttigini göstermektedir.

Sekil 21 Her ikisi de izotip kontrolle veya Ab535”le tedavi edilmis normal farelere (ADA+) ve indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelere (ADA-) ait akcigerlerin histopatolojik analizine iliskin temsili görüntüleri göstermektedir. ÖRNEKLER Örnek 1 - Bir Anti-CSF-IR Antikorunun Olusturulmasi Asilama: Disi Sprague Dawley siçanlari glikozilfosfatidil-inozitol (GPI) bir sabitleyiciye baglanmis insan CSF-lR hücre disi domenini eksprese eden bir vektörle geçici olarak transfekte edilen genetik olarak özdes RFL6 siçan fibroblastlariyla asilandi. Sekil 3°te siçanlarin asilanmasinda kullanilan lnsan CSF-lR hücre disi domeni dizisi olan DIZI ID. NO: 39 gösterilmektedir.

Siçanlar hayvan basina üç haftalik araliklarla bes subkutane 3-9x106 transfekte hücre asilamasi aldi. Ilk hücre asilamasina bitisik bir alanda Tam Freund Adjuvani (PBS7de %50) enjekte edildi. Son asilamadan iki hafta sonra periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC”ler) ve dalaklar toplandi.

Birinci Antikor Üst Fazi Taramasi Antikor üst fazlari ilk olarak floresans mikro hacim analizi teknolojisiyle (FMAT) transfekte edilmis HEK293 hücrelerinde eksprese olan insan CSF-lR,ye baglanma kapasiteleri bakimindan tarandi. 600 x 96 kuyucuklu plakanin birinci FMAT taramasinda anti-CSF-lR reaktifligi olan yaklasik olarak 1000 kuyucuk belirlendi. FMAT ile CSF-lR”ye baglanan antikor üretimi için toplamda yaklasik olarak 3x108 B hücre (siçan splenositleri) tarandi.

Ikinci Antikor Üst F azi T aram asi Nötrlestirici anti-CSF- lR etkinligi içeren FMAT-pozitif kuyucuklarin, yani insan CSF-l ,in insan CSF-lR reseptörüne baglanmasini önleme kapasitesine sahip antikorlarin belirlenmesi için orta verimli bir analiz tasarlandi. Antikor üst fazlari, insan CSF-l ,le inkübasyon öncesinde CSF-lR eksprese eden THP-l hücreleriyle inkübe edildi. THP-l hücrelerine CSF-l baglanmasi seviyesi bir anti-CSF-l poliklonal antikor kullanarak akis sitoinetresiyle ölçüldü. Ilgisiz antikor üst fazlari negatif kontrol olarak kullanildi.

Ikinci tarama 779 antikor kuyucuguna ait üst fazlara uygulandi ve bu kuyucuklarin 88% tespit edilebilir düzeyde CSF-l bloke etme etkinligi gösterdi. Üçüncü Antikor Üst Fazi Taramasi Ikinci taramada nötrlestirici etkinlik göstermis antikor üst fazlari CSF-1”e bagimli primer insan monositleri sagkalimini önleme kapasiteleri bakimindan test edildi. Monositler insan kanindan saflastirildi ve lxlO4 hücre 20 ng/ml insan CSF-l mevcudiyetinde ayri ayri her antikor üst faziyla inkübe edildi. 72 saat inkübasyondan sonra canli monositlerin sayisi CellTiter Glo analiziyle ölçüldü. Üçüncü tarama ikinci taramada belirlenen 59 antikor kuyucugu üst fazina uygulandi ve 18 kuyucuk CSF-l aracih monosit sagkalimini azaltmaya yönelik bir kapasite gösterdi.

Antikor Degisken Bölgelerinin Klonlanmasi ve Blokaj Etkinligini'n Yeniden Analizi Degisken bölge (V bölgesi) klonlamasi CSF-l nötrlestirici etkinlik gösteren 18 antikor kuyucugunda gerçeklestirildi. Agir ve hafif immünoglobulin V bölgelerine siçan antikoru sabit bölgelerine spesifik primerleri ve siçan immünoglobulin öncü peptitlerini kodlayan dizilere tavlanan bir yedek primer grubunu kullanarak RT-PCR ile amplifikasyon yapildi. 14 antikordan V bölgeleri genleri geri kazanildi ve agir ve hafif zincir insan lgG4 ekspresyon vektörlerine klonlandi.

Antikor vektör çiftleri HEK293F hücrelerine geçici olarak transfekte edildi ve kosullandirilmis ortam THP-l hücrelerinde CSF-l nötrlestirici etkinlik bakimindan test edildi (yukarida açiklanan sekilde). Kosullandirilmis kontrol ortami ile karsilastirildiginda antikorlarin dokuzunda CS F-l baglanmasini kismen veya tamamen inhibe etme kapasitesi Dokuz Nötrlesti'rici Anti-CSF-IR Antikoruna Iliskin Dizi Analizi Dokuz nötrlestirici antikor dizi çesitliligini degerlendirmek üzere dizildi. Dokuz antikorun tamami özgün oldu. Bu antikorlar klonlandi ve ileri profil çalismalari için eksprese edildi. Örnek 2 - Anti-Insan CSF-lR Kimerik Ab969,un ve Anti-Murin CSF-lR Ab535,in In Vitra Özellikleri 1) Kimeri'k Ab969 Ekspresyonu Örnek 1,de belirlenen dokuz nötrlestirici antikorun degisken bölgeleri ayri agir ve hafif zincir ekspresyon vektörlerine klonlandi ve tam boy insan lgG4 antikorlari olarak eksprese VH genleri, bir dogal öncü diziyi kodlayan DNASyi ve mentese stabilize edici SZ4lP mutasyonu olan insan gamma-4 agir zincir sabit bölgesini içeren pth4FL(V19H) vektörüne klonlandi. VL genleri (kappa), bir dogal öncü diziyi kodlayan DNA'yi ve insan kappa zinciri sabit bölgesini (Km3 allotipi) içeren pKHlO. l(V4L) vektörüne klonlandi.

Antikorlar eslesen agir ve hafif zincir vektör çiftlerinin CHO-Kl hücrelerine geçici ortak transfeksiyonuyla eksprese edildi. Antikorlarin PBS (pH 7.4) içinde saflastirilmasi gerçeklestirildi, bu sekilde nihai preparasyonda agregat seviyesi %1 ,den daha az oldu.

Dokuz antikor paneli antikor 969 isimli bir antikoru içerdi. Siçan degisken bölgelerini ve insan gamma-4 agir zincir sabit bölgesini ve insan kappa zinciri sabit bölgesini içeren kimerik antikor asagidaki örneklerde antikor 969 veya antikor 969CHCL olarak veya antikor 969.g0 olarak geçmektedir. ii) Ligand Bloke Etme Analizi Dokuz antikorun her birinin CSF-19in THP-l hücrelerine baglanmasini inhibe etme kontrol islevi gördü. Yikama sonrasinda hücreler 30 dakika 0.5 ug/ml insan CSF-l ile inkübe edildi. Tekrar yikama sonrasinda biyotinlenmis anti-CSF-l antikoru ve Alexa488 konjugasyonlu streptavidinle ardisik inkübasyon yaparak baglanan CSF-l tespit edildi.

Reseptöre baglanan ligand akis sitometresiyle ölçüldü ve ortalama floresans yogunlugu (MFI) isaretlendi.

Bu analizde test edilen antikorlarin geri kalanindan daha üstün Ab969*u da içeren dört antikor belirlendi, ki bu da 31.3 ng/ml bir konsantrasyonda CSF-l baglanmasinin tam inhibisyonunu göstermektedir. Ab969,a iliskin sonuçlar Sekil 4,te gösterilmektedir. iii) CSF-I & IL-34 Aracili Monosit Sagkalimi Inhibisyonu Anti-insan CSF -1R: Saflastirilmis anti-insan CSF-lR antikorlari primer insan monositlerinin CSF-l ve IL-34 aracili sagkalim ve proliferasyonunu inhibe etme kapasiteleri bakimindan test edildi. Her analizde, mitojen (CSF-l veya lL-34) monositlerde maksimum uyarimi veren bir konsantrasyonda kullanildi.

Insan PBMClleri bir Ficoll gradient üzerinde taze insan tam kanindan hazirlandi ve negatif seleksiyonla monositler saflastirildi. Monositler 0.25 ug/ml antikor ve 20 ng/ml CSF-l ,le 72 saat inkübe edildi ve canli hücrelerin nisbi sayisi CellTiter Glo analizini kullanarak belirlendi. Isildama okumasi canli hücrelerin sayisi ile bagintilidir. Sonuçlar Sekil 5a°da gösterilmektedir.

Insan PBMC”leri bir F icoll gradient üzerinde taze insan tam kanindan hazirlandi ve negatif seleksiyoiila monositler saflastirildi. Monositler 0.25 ug/ml antikor ve 20 ng/ml IL-3431e 72 saat inkübe edildi ve canli hücrelerin nisbi sayisi CellTiter Glo analizini kullanarak belirlendi. Isildama okumasi canli hücrelerin sayisi ile bagintilidir. Sonuçlar Sekil 5b7de gösterilmektedir.

Ab969 dahil olmak üzere antikorlarin dördü, ligand bloke edici etkinliklerine paralel olarak hein CSF-l (Sekil Sa) hein lL-34 (Sekil 5b) uyarimi için geri kalan antikorlarla karsilastirildiginda üstün monosit sagkalimi inhibisyonu gösterdi.

Anti-fare CSF-lR: Primer murin CDl lb+ monositleri fare dalaklarindan satlastirildi. Daha sonra monositler 24 saat bir murin CSF-l (mCSF-l) titrasyonuyla inkübe edildi. Hücre ortamina MCP-1 salimi ELISA ile ölçüldü ve mCSF-l ile doza bagli MCP-1 salimi oldugu gösterildi. Çalismanin ayri bir kolunda mCSF-l titrasyonuyla birlikte 10 ug/ml anti-murin CSF-lR Ab535 eklendi. Test edilen tüm CSF-l konsantrasyonlarinda MCP-l salimi Ab535 tarafindan tamamiyla inhibe edildi (Sekil 6).

MCP-l salimi analizi 100 ng/ml bir sabit CSF-l konsantrasyonu ve bir Ab535 titrasyonuyla primer murin monositlerini kullanarak gerçeklestirildi. Doza bagli bir MCP-l salimi inhibisyonu gösterildi ve bir IC50 hesaplandi. Iki bagimsiz deneyde Ab535,in ortalama IC507sinin 8.08 ng/ml oldugu belirlendi.

Sonuç: Murin monositlerinin CSF-l ile isleme tabi tutulmasi doza bagli bir MCP-1 salimina neden oldu ve bu 10 ug/ml Ab535 ile isleme tabi tutarak tamamiyla inhibe edildi.

Ab535, 8.08 ng/ml bir ortalama IC50°yle murin monositlerinden CSF-l aracili MCP-1 salimini doza bagli bir tarzda inhibe eder (n:2). Bu IC50 degeri anti-insan-CSF-l R antikorlarinin sergiledigi degerin benzeridir. iv) Ajînite Antikorlar saflastirilmis bir rekombinant CSF-IR/Fc füzyon proteinine baglanma kinetiklerinin ölçüldügü bir BlAcore analizinde CSF-lR,ye baglanma kapasiteleri bakimindan test edildi.

Analiz formati anti-CSF-lR antikorlarinin sabitlenmis anti-insan lgG,F(ab')2 ile yakalanmasi, ardindan yakalanan yüzey üzerinde bir hCSF-lR/Fc titrasyonu oldu. BIA (Biyomoleküler Etkilesim Analizi) bir BIAcore kullanarak gerçeklestirildi. Tüm deneyler 25 °C”de gerçeklestirildi. AffiniPure F(ab')2 fragmani keçi anti-insan IgG, F(ab')2 fragman spesifik (Jackson ImmunoResearch) amin kenetleme kimyasi vasitasiyla ~5000 yanit birimi (RU) bir seviyeye CMS bir Sensör Çipi (GE Healthcare Bio-Sciences AB) üzerinde sabitlendi. HBS-EP tamponu (10 mM Healthcare Bio-Sciences AB) 10 ul/dk bir akis hizinda akitma tamponu olarak kullanildi.

Sabitlenmis anti-insan IgG,F(ab)2,de yaklasik olarak 100 RU bir yakalama seviyesi saglamak için bir anti-CSF-IR antikoru enjeksiyonu gerçeklestirildi.

Rekombinant insan CSF-IR/Fc (R&D Systems) 5 dakika 30 ul/dk bir akis hizinda 5 nM°de yakalanmis anti-CSF-lR antikoru üzerinden geçirildi, ardindan ayrisma fazi için akis hizi dakika 100 ul/dkiye yükseltildi. Karsilik gelen bir tampon kontrolle birlikte 5 nM”de enjeksiyon iki kere gerçeklestirildi. Bu sensogramlar ayrisma hizinin olusturulmasinda kullanildi. Rekombinant insan CSF-lR/Fc 5 dk 30 ul/dk bir akis hizinda 2.5 nM*den yakalanmis anti-CSF-lR antikoru üzerinden titre edildi, ardindan 10 dk bir ayrisma fazi geldi. Bu sensogramlar birlesim hizinin olusturulmasinda kullanildi. Yüzey 10 ul 40 mM HCl enjeksiyonu, ardindan 5 ul 10 mM NaOH enjeksiyonuyla 10 ul/dk bir akis hizinda yenilendi. BlAevaluation yaziliminin (sürüm 4.1) kullanilmasiyla standart usulleri izleyerek çi& referansli arka planin çikartildigi baglanma egrileri analiz edildi. Kinetik parametreler uydurum algoritmasindan belirlendi.

Test edilen dört antikordan üçü 10 pMlden daha az afiniteler (KD) sergiledi. Bu, anti- murin-CSF-IR paralel reaktif, Ab535 ile karsilastirildiginda daha iyidir. Ab969 ve Ab535°e iliskin sonuçlar Tablo 1°de gösterilinektedir.

Antikor Birlesim Hizi Ayrisim Hizi Aiînite Afinite Antikorlarin afinitesi TH P-l hücrelerinin kullanildigi hücre bazli bir analizle de Ölçüldü.

Antikorlar dogrudan Alexa-488 floresan boyayla isaretlendi ve afinite kantitatif akis sitometresiyle ölçüldü. Bir ilave BIAcore analizi antikorlarin Iloresanla konjugasyonunun rekombinant CSF-lR proteinine yönelik afiniteyi degistirmedigini dogruladi.

Sonuçlar Tablo 2'de gösterilmektedir.

Iki metodolojiyle elde edilen mutlak afinite degerleri farklidir ve genellikle iki sistem karsilastirildiginda bu fark gözleinlenir. Bununla birlikte, hücre bazli usul antikorlarin CSF-lR”ye yüksek afiniteyle baglandiklarini göstermistir.

Antikor Hücre Bazli Atînite KD ± S.D. (nM) BIAcore Afinitesi KD(pM) v) CSF-I Baglanmasi Inhibisyonu (IC50) Dört antikor THP-l hücrelerine CSF-l baglanmasini inhibe etmekte göreli kuvvetlerinin ölçülmesiyle analiz edildi. Bu analiz formatinda dört antikorun tamami 5 ng/ml3den (~30 pM) daha az IC50 degerleriyle kuvvetli CSF-l baglanmasi inhibisyonu sergiledi.

Antikor Ortalama IC50 ± S.D. (ng/ml) Ab969 2.89 ± 1.22 vi) Antikor Çapraz Reakti'jli'gi Dört antikor makak, sinomolgus maymunu ve köpek tam boy CSF-'1R”siyle çapraz reaktiflik bakimindan test edildi. Dört antikorun tamaini insan CSF-1R3ye ilaveten makak ve sinomolgus CSF-lR'ine baglandi, ki bu da izotip kontrol seviyesinin anlamli ölçüde üzerinde bariz baglanmayi göstermektedir. a raz Reaktiflik Antikor Ç p Sinomolgus Makak Köpek Ab969 Evet Evet Hayir Ab969: pozitif ve negatif kontrol islevi gören insan CSF-l ,le ve bir izotip kontrolle de isleme tabi tutuldu. Her zaman noktasinda akis sitometresiyle hücre yüzeyi CSF- lR seviyesi ölçüldü (Sekil 7). izotip kontrolle karsilastirildiginda Ab969 ile isleme tabi tutulan hücrelerde orantili hücre yüzeyi CSF-l R seviyesi hesaplandi ve Sekil 8”de gösterildi.

THP-l hücrelerinin rekombinant CSF-l ile isleme tabi tutulmasi hücre yüzeyi CSF-lR seviyesinde hizli ve sürekli bir düsüse neden oldu; do gal ligand türdes reseptörüne baglanir ve ligand-reseptör kompleksinin internalizasyonunu saglar.

Ab969 ile isleme tabi tutulan THP-'l hücreleri, isleme tabi tutulmayan ve izotip kontrolle isleme tabi tutulan THP-l hücreleriyle karsilastirildiginda 48 saatlik sürenin tamami boyunca daha yüksek seviyelerde hücre yüzeyi CSF-lR ekspresyonu sergiledi. Bu veri THP-l hücrelerinin Ab969 ile isleme tabi tutulmasinin islemden 48 saat sonrasina dek hücre yüzeyinde eksprese olan hCSF-1R°nin intemalizasyonuna neden olmadigini kuvvetle düsündürmektedir.10 Zaman ilerledikçe CSF- 1 ”le isleme tabi tutulan hücreler hariç isleme tabi tutulmamis ve tutulmus THP-l hücrelerinde hücre yüzeyinde eksprese olan CSF-IR,de bariz bir artis oldu. Bunun nedeni 48 saatlik deney zamani boyunca hücre büyümesi süresi sirasinda görülen ekspresyon degisiklikleri olabilir ve muhtemelen bir stres yanitidir.

Ab969`un reseptör internalizasyonunu kuvvetlendirmedigine dair daha fazla kanit saglamak ve ayrica THP-l hücre hattinin fizyolojik olarak uygun olmamasi olasiligini disarda tutmak amaciyla internalizasyon analizinde primer insan monositleri de kullanildi.

Bu analizden elde edilen veriler de Ab969”un saglikli primer insan monositlerinde hücre yüzeyinde CSF-lRîn hizli internalizasyonuna neden olmadigini kanitladi.

Ab535: Fare lösemik monosit/makrofaj hücre hatti RAW264.7 yüksek seviyelerde murin CSF-lR (mCSF- lR) eksprese eder ve anti-murin CSF-lR antikoru Ab535`in reseptör internalizasyonu ortaya çikartabilip çikartamayacaginin test edilmesi için uygun bir hücre bazli sistem sunar. pozitif ve negatif kontrol islevi gören insan CSF-l 'le ve bir izotip kontrolle de isleme tabi tutuldu. Her zaman noktasinda akis sitoinetresiyle hücre yüzeyi CSF-lR seviyesi ölçüldü (Sekil 9). Izotip kontrolle karsilastirildiginda orantili hücre yüzeyi CSF-lR seviyesi hesaplandi ve Sekil lO'da gösterildi.

Veriler THP-l hücrelerinin rekombinant CSF-l ile isleme tabi tutulmasinin hücre yüzeyi CSF- lR seviyesinde hizli ve sürekli bir düsüse neden oldugunu göstermektedir.

Isleme tabi tutulmamis ve izotip kontrolle isleme tabi tutulmus hücrelere göre 2 saat insan CSF-l ile isleme tabi tutulmus RAW264.7 hücrelerinde hücre yüzeyi mCSF-lR seviyelerinde bariz bir düsüs oldugu gözlemlendi. Bu düsüs 48 saatlik çalisma boyunca sürdü. Bu durum insan CSF-l ,in mCSF-lR internalizasyonu ortaya çikardigini kanitlamakta ve deney sisteminin reseptör internalizasyonunun izlenmesinde kullanimini onaylamaktadir.

Ab535 ile isleme tabi tutulmus RAW264.7 hücreleri, 48 saatlik sürenin tainami boyunca isleme tabi tutulmamis ve izotip kontrolle isleme tabi tutulmus hücrelerle karsilastirildiginda hücre yüzeyinde benzer seviyelerde mCSF-IR sergiler. Antikor aracili reseptör internalizasyonunun bu zaman dilimi içinde olusmasi beklenecegi için bu veri kuvvetle Ab535`in mCSF-lR internalizasyonunu tetiklemedigini düsündürtmektedir.

Ab535iin reseptör internalizasyonunu güçlendirmedigine dair daha fazla kanit saglamak amaciyla bir internalizasyon analizinde primer murin CDl lb+ monositleri-makrofajlari kullanildi. Bu sonuçlar da fare monosit-makrofajlarinin Ab535 ,le isleme tabi tutulmasinin islem sonrasi 24 saate dek hücre yüzeyinde eksprese olan mCSF-1R°in internalizasyonuna neden olmadigini kanitlamaktadir. viii') CSF 1 -R Etkinlesmesi CSF-l CSF-lRlye baglanarak reseptör dimerlerinin olusmasina neden olur, ki bu da kinaz domenlerini birbirine çok yakinlastirarak hizli reseptör fosforlanmasini tetikler. Bu duruin daha sonra reseptör internalizasyonuna ve Ras-MAPK yolagi dahil iyi bilinen çesitli sinyal iletimi yolaklarinin etkinlesmesine yol açar. Bir anti-CSF- lR antikorunun reseptör kümelenmesi ortaya çikartabilmesi ve akis asagi sinyallesme sürecini tetikleyebilmesi mümkündür. Bu durum bir antikorda, reseptör sinyallesmesini inhibe edebilecek istenmeyen bir özelliktir, dolayisiyla Ab969 ile reseptör agonizmi iki bagimsiz in vitro analiz formati kullanarak test edildi.

Ilk analiz formatinda antikorlar insan tam boy CSF-IR ile transfekte edilmis hücrelerle inkübe edildi ve reseptörün ve akis asagi sinyal iletimi moleküllerinin fosforlanmasi Western blot ile izlendi.

THP-l hücre hatti CSF -1R”nin etkinlesme durumunun izlenmesi için bir baslangiç noktasi sagladi. Bununla birlikte, bu hücre hattinda CSF-1R9in ekspresyon seviyesi nispeten düsük olup, bu durum biyokimyasal analiz gerçeklestirmeyi zor kilmaktadir. Bu nedenle CSF- lR7nin fosforlanma seviyesinin güçlü sekilde tespit edilebilecegi bir deney sistemi tasarlandi. CSF- 1R”nin fosforlanmasi iki tirozin kalintisinda, Y723 ve Y809lda tespit edilebilecektir. Ilaveten, CSF-IR etkinliginin bagimsiz bir okumasi olarak p T202 ve Y204°teki fosforlanmasi ölçüldü. Tüm deneylere pozitif kontrol olarak CSF-l ile yapilan uyarim dahil edildi.

HEK293F hücreleri tam boy CSF-l R eksprese eden bir plazmit vektörle transfekte edildi. tig/ml bir Ab969.g0 titrasyonuyla uyarildi. Bir pozitif kontrol saglamak için hücreler 500 ng/ml rekombinant CSF-l ile de isleme tabi tutuldu. Isleme tabi tutulmamis hücreler10 negatif kontrol olarak dahil edildi. Isleme tabi tutulmus ve tutulmamis hücrelerden protein lizatlari SDS-poliakrilamit elektroforezle ayrildi ve nitroselüloz üzerine blotlama yapildi.

Western immünoblotlama fosfo-Y, fosfo- Y, total CSF-lR (Cell Signaling Technology kullanarak gerçeklestirildi.

Uyarilmamis CSF-lR transfeksiyonlu HEK293F hücreleri düsük bir baslangiç seviyesinde CSF-l R fosforlanmasi sergiledi. Hücrelerin CSF-l ,le uyarilmasi Y723 ve Y809 kalintilarinda Western blot analiziyle kolaylikla gözlemlenen bir CSF-l R fosforlanmasi seviyesi ortaya çikardi (Sekil 1 l). CSF-l islemiyle ERKl/Z fosforlanmasinda da açik bir uyarim oldu. Transfekte edilmis HEK293F hücrelerinin Ab969.g0 antikoruyla isleme tabi tutulmasi CSF-lR fosforlanmasini uyarmadi veya ERKl/2 etkinlesmesini güçlendirmedi.

Ikinci bir analizde antikor Ab969 (monomerik ve çapraz bagli) primer insan monositleriyle inkübe edildi ve MCP-l salgilamasi bir CSF-lR etkinlesmesi markörü olarak kullanildi.

Insan monositlerinin CSF-l”le islenmesi bunlarin monosit kemoatraktan protein-l (MCP- l) salimi yapmasina neden olur. Eger anti-CSF-IR antikorlari monositlerde CSF-lR reseptörünü etkinlestirme kapasitesine sahipse, bir MCP-1 saliminin olusmasi beklenecektir.

Daha önce açiklanan biyokimyasal analizlerde sadece monomerik anti-CSF- lR antikoru kullanildi. Bununla birlikte, çapraz baglanmis bir IgG 1 ,in CSF-lR moleküllerini çok yakinlastirma ve tirozin fosforlanmasini ve akis asagi sinyallesmeyi tetikleme bakimindan güçlü bir kapasiteye sahip olabilmesi mümkündür. Bunun degerlendirmek için bir anti- insan-Fc antikoruyla çapraz baglanmis Ab969.g0,in kullanildigi MCP-1 analizi de gerçeklestirildi.

Insan monositleri belirtilen sekilde insan tam kanindan hazirlandi: 60-100 ml insan tam kani BD Vacutainer 10 ml Lityum Heparin 171 IU Tüpleri içinde toplandi. Kan 3-4 Leucosep Ficoll tüpe (Greiner Bio-One) bölündü ve PES ile dolduruldu. Tüpler hiç durdurdamadan 10 dakika 20 c>C,de ve 1000 g'de santriiüjlendi ve PBMC tabakasi toplandi. Hücreler peletlendi ve sonra imalatçi firmanin protokolüne göre pozitif` monositler ayristirildi. Ab969.g0 antikoru keçi anti-insan IgG FC antikorunun (R&D Systems G-102-C) 2:l bir Ab969.g0:Fc oraninda ekleninesiyle çapraz baglandi. Monositler Ab969.g0 antikorunun veya çapraz baglanmis Ab969.g0,in bir doz titrasyonu mevcudiyetinde (16 konsantrasyon içeren yari-log seyreltme serileri, maksimum 10 ug/ml) besiyerinde kuyucuk basina 20,000 hücre ekildi. Kontrol kuyucuklari 100 ng/ml CSF-l mevcudiyetinde ve yoklugunda ve anti-insan-Fc antikoru mevcudiyetinde ve yoklugunda (Ab969.g0 antikorunun en üst konsantrasyonunda (Sag/ml) olanla ayni konsantrasyonda) antikor içermedi. Hücreler 24 saat inkübe edildi, plakalar hücreleri pelet haline getirinek üzere çevrildi ve üst faz toplandi. Salgilanan MCP-I imalatçi firmanin protokolüne uygun olarak MSD (K ile ölçüldü.

Deneyin sonucu Sekil l2sde gösterilmektedir. Gerek monomerik gerek çapraz baglanmis formatta Ab969.g0 slemlerinin hiçbirinde MCP-l seviyelerinde artis tespit edilmedi ; isleme tabi tutulmus hücrelerin besiyerindeki MCP-1 konsantrasyonu isleme tabi tutulmamis hücrelerle ayni oldu. Beklendigi gibi CSF-l ile islenmis hücreler MCP-l seviyelerinde anlainli ve çogaltilabilir bir artis ortaya çikardi. Örnek 3 - Antikor 9697un Hümanizasyonu & Hümanize Greft Seçimi Örnek 2sde ölçülen afinitelerine ve özelliklerine dayanarak hümanizasyon için dört anti- CSF-lR antikoru seçildi. i) Hümanize Greftlerin Olusturulmasi Antikor 969 ve 970 siçan antikor V bölgelerine ait CDR°lerin insan gerrn hatti antikoru V bölgesi çerçevelerine grefrlenmesiyle hümanize edildi.

Vericiden alici diziye greftlenen CDR”ler birlesik Chothia/Kabat taniminin kullanildigi KabatSta (Kabat ve digerleri, 1987) tanimlanan sekildedir.

Insan V bölgesi VKl 2-1-(1) 012 arti JK4 J-bölgesi (V BASE, http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) hafif zincir CDR,leri için alici olarak seçildi. Insan V bölgesi VH2 3-1 2- 70 arti JH3 J-bölgesi (V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) agir zincir CDR”leri için alici olarak seçildi.

Tablo llde gösterildigi gibi hümanize dizilerde siçan V bölgelerinden birkaç çerçeve kalintisi kaldi.

Bir otomatik sentez yaklasimiyla ilk hümanize hafif ve agir zincir V bölgesi dizilerini kodlayan genler, yani sirasiyla ng ve ng tasarlandi ve yapildi. Oligonükleotit kontrollü mutagenez yoluyla ng ve ng genlerinin modifiye edilmesiyle hafif ve agir zincir V bölgelerinin baska varyantlari yaratildi.

VK genleri (ng ila gL9), insan Kappa zinciri sabit bölgesini (Km3 allotipi) kodlayan DNA”yi içeren insan hafif zincir ekspresyon vektörü pKHlO.1”e klonlandi. VH genleri (ng ve gH2), mentese stabilize edici S241P mutasyonlu insan gamma-4 agir zincir sabit bölgesini kodlayan DNA,yi içeren insan gamma-4 agir zincir ekspresyon vektörü pVhy4P Zincirlerini kodlayan farkli plazmit kombinasyonlari HEK293F içine birlikte transfekte edildi, bu sekilde hümanize, rekombinant 969 antikorlarinin ekspresyonu saglandi. Önemli olduklari öngörülen agir ve hafif zincirlerde birkaç verici kalinti içeren bir koruyucu grefcin ve verici kalintisi içermeyen tamamen hümanize bir greüin saglanmasiyla diger üç anti-CSF-lR antikoru da hümanize edildi. ii) Hümani'ze Antikorlarm A fînitesi' Her hümanize greft, her ikisi de parental kimerik antikora göre olmak üzere (i) BIAcore ile insan CSF-lRiye baglanma afinitesi ve (ii) ThermoFluor analiziyle ölçülen erime sicakligi (Tm) bakimindan incelendi. Erime sicakliginin bir antikor molekülünün stabilitesine iliskin erken bir gösterge sagladigi düsünülmektedir; stabil olmayan antikorlar tipik olarak 75.0 °Ciden daha düsük bir Tm sergiler.

Ab969iun hüinanizasyon asamalarini temsil eden greftler Tablo Slte gösterilmektedir.

Tablo Site kimerik antikor Ab696 da (969cHcL) gösterilmektedir. Koruyucu greft (969ng ng) sergiledi, dolayisiyla kimerik siçan antikoruyla (969cHcL) karsilastirildiginda bariz afinite kaybi olmadi. 969gH1gL1 koruyucu greftinin için agir zincirde A78 verici kalintisinin V78”le sübstitüsyonu antikor afinitesini azaltmadi sübstitüsyonuyla afinitede degisiklikler gözlemlenmedi. Verici kalintilari içermeyen nihai hümanize grefl 969gH2gL8 parental kimerik antikora benzer bir afinite sergiledi (.

TabloS Antikor VK Verici VH Verici ka(M"s") kd(s") KD(pM) Grefti Kalintilari Kalintilari Ab969 CDR-L2 ve çerçevenin birlesme noktasinda bir potansiyel DG izomerizasyonu kalintisi serin mutasyonuna ugrayarak bir atil SG dizisini verdi. CSF-lR'ye yönelik afinite BIAcore ile ölçüldü ve bariz afinite kaybi tespit edilmedi (Tablo 6). Ayrica. nihai Tmsyi korudu.

Antikor Grefti VK Verici VH Verici ka(M'1s'1) kci (s") KD(pM) Kalintilari Kalintilari Ab9697un ve bir baska anti-CSF-IR antikoni Ab970”in hümanizasyonu parental kimerik antikora esdegerli afiniteye (KD) ve molekül stabilitesinin bir baslangiç kestirimini veren bir Tmiye sahip tamamen hümanize antikorlar (siçan verici kalintilari mevcut degil) yeniden isimlendirildi. Buradan itibaren Ab969”un kimerik çesitlemesi Ab969.g0 olarak geçecektir.

Ab969 antikorlarinin saIlastirilmis kimerik ve hümanize greftlerinin rekombinant CSF- lRlye yönelik afinitesi de yine BlAcore analizini kullanarak ölçüldü. Hümanizasyon islemi sirasinda gerçeklestirilen daha önceki BlAcore deneyleri saflastirilmis antikor yerine islenmemis hücre üst fazlarini kullanarak yapildi. Afînitede hafif bir düsüs tespit edildi; KD degerleri yaklasik olarak 4 pMiden 5 pMiye artis gösterdi.

Antikor Deney ka (M`1s`i) kd (s`1) KD (pM) iii) Ab969.g0 ve Ab969.g5 Ile CSF-I Aracili Monosit Sagkalimi Inhi'bi'syonu l5 Kültürde monositlerin etkinlesmesi ve sagkalimi için CSF-l gereklidir; eger CSF-l alinirsa monositler hizla apoptoza maruz kalir. Okuma olarak MCP-l ,in (monosit kemotaktik protein-l; CCL2, kemokin C-C motifi ligand 2 olarak da bilinir) kullanildigi bir analiz tasarlandi. CSF-l uyarimiyla birlikte insan monositleri, uyarimdan tipik olarak 24 saat sonra bir ELISA ile hücre üst fazlarinda tespit edilebilecek MCP-l salgilamasi yapar. CSF- 1 baglanmasini bloke eden antikorlarla CSF-IR sinyallesmesinin inhibe edilmesi MCP-1 salgilamasinda bir azalmaya neden olur.

Insan PBMClleri bir Ficoll gradient üzerinde taze insan tam kanindan hazirlandi ve ng/ml insan CSF-l mevcudiyetinde 10 tig/ml ila 0.35 pg/ml antikor yari-log seyreltme serileri ile inkübe edildi. Minimum ve maksimum MCP-l salimi degerleri saglamak için inkübasyondan sonra hücreler santriiî'ijleyerek pelet haline getirildi ve üst faz toplandi.

MCP-l konsantrasyonu imalatçi firmanin talimat larini izleyerek Human CCL2/MCP-l DuoSet ELISA (R&D Systems DY279) kullanarak Ölçüldü.

Buradan itibaren analiz 'MCP-l inhibisyonu analizi' olarak geçer.

MCP-1 inhibisyonu analizi hümanize 969.g5`in etkinligini kimerik Ab969.g0ila karsilastirmakta kullanildi. Dört farkli monosit donörü kullanarak bes bagimsiz analiz gerçeklestirildi. Tüin analizlerde Ab969.g5 hümanize grefti parental kimerik antikor 969. g0 ile karsilastirildiginda anlamli ölçüde daha düsük beklenmedik bir etkinlik sergiledi. Tek bir temsili deney Sekil 13”te gösterilmektedir. Monosit analizinde ortalama durum, bu analiz formatini kullanarak her iki antikorun karsilastirilmasi durumunda antikor gücünde 13.5 kat bir azalma oldugunu göstermektedir.

MCP-l inhibisyonu analizinde hümanize antikomn niçin düsük bir etkinlik sergiledigini açiga çikarmak için Ab969 kullanarak bir dizi deney gerçeklestirildi. Veriler MCP-1 inhibisyonu analizinde gözlemlenen Ab969.g5°in etkinlik kaybinin antikorun ve ligandin hedef hücrelere eklenme sirasina bagli oldugunu ortaya koydu. Rekabete dayali bir analiz formati kullanildiginda hem Ab969. g0°1n hem Ab969.g5,in etkinligi azaldi ancak daha önemlisi bloke etme etkinliklerinde daha büyük bir farklilik tespit edildi. Hümanize Ab9695un düsük bir 'birlesim hizinin' güçteki azalmanin nedeni olup olamayacagini analiz etmek için bir BlAcore analizi gerçeklestirildi. Bu veriler Ab969.g0 ve Ab969.g5,in CSF- 1 ,in ve anti-CSF- IR antikomnun ayni reseptöre baglanmak için rekabet ettigi rekabete dayali bir analizde, daha yavas bir antikor birlesim hizi eger ligand için birlesim hizi da yüksekse ve ligand yüksek bir konsantrasyonda mevcutsa düsük bloke etme etkinligine yol açabilecektir. Insan CSF-l ,in antikorlara benzer sekilde 2.19x106M'is`i ”de özellikle yüksek bir birlesim hizina sahip oldugu bilinmektedir ve analiz yüksek bir CSF-l konsantrasyonunda (250 ng/ml) gerçelestirildi. 969. g53in bloke etme etkinligindeki düsüsün antikorun dogasindan kaynaklanan bir özellige bagli olduguna dair daha fazla kanit saglamak için CSF-lRiye CSF-l baglanmasini ölçen bir ELISA gelistirildi. Buradan itibaren bu usul 'ELISA ligand bloke etme analizi' olarak geçer. Bu analiz rekabete dayali baglanmayi kullanarak gerçeklestirilmis olup, burada plakaya bagli CSF- lR,ye uygulanmadan önce CSF-l ve antikor önceden karistirilmis haldedir. Analiz CSF-l konsantrasyonunun antikor etkinligi üzerindeki etkisini inceleinek için de gerçeklestirilmistir. her iki antikorun benzer bir etkinlige sahip oldugu görüldü. Analizde 10 ng/ml bir konsantrasyonda CSF-l kullanildiginda, Ab969.g0 ve Ab969.g5”in her ikisinin de ICsrfsi yükseldi ancak daha önemlisi aralarindaki farklilik daha da yükselerek sirasiyla 268.10 ng/mllye kiyasla 79.29 ng/ml oldu. 100 ng/ml CSF-1,in kullanildigi bir analizde egilim 1C50 degerlerini verdi. Rekabete dayali bir analiz CSF -1 ,in CSF-lRlye baglanmasini bloke etmekte Ab969.g5,in Ab969.g0,dan daha az etkili oldugunu göstermektedir. Güçte görülen bu düsüs CSF-l konsantrasyonu arttikça daha belirgin hale gelir. iv) MCP-1 Inhibisyonu Analizinde Kimerik Ab 969 'a Esdeger Etkinligi Olan Ab 969 Hümanize Greftlerinin T animlanmasi In vitro etkinligi karsilastirabilmek için geçici ekspresyonla bir Ab969 hümanize ara greft paneli hazirlandi (Tablo 8). Geçici ekspresyona karsilik gelen kimerik antikor (Ab969.g0) ve tamamen hümanize greü (Ab969.g5) de dahil edildi, böylece ayni parti içinde antikor özelliklerinin dogrudan bir karsilastirmasi yapilabildi.

Antikor Greft VK Verici Kalintilari VH Verici Kalintilari 969.g0 969CHCL N/A N/A 969.g5 969gH2gL8(SG) - Her antikorun in vitro etkinligi MCP-l inhibisyonu analizinde test edildi. Tek bir antikor konsantrasyonuyla bir CSF-l titrasyonunun kullanildigi analiz formati seçildi çünkü bu format genis bir antikor panelinin hizli taranmasini mümkün kilar ve CSF- 1 R bloke etme etkinligindeki herhangi bir farkliligi vurgular. Bu analizde, primer insan monositlerinden doza bagli bir MCP-1 salimi tespit edildi ve her antikorun CSF-IR etkinligini bloke etmeye dair nispi kapasitesi MCP-1 saliminin oldugu CSF-l konsantrasyonuyla ölçüldü.

Monositler bir rekombinant insan CSF -1 titrasyonu mevcudiyetinde (18 konsantrasyon içeren 2 kat seyreltme serileri, maksimum 500 ng/ml) besiyerinde kuyucuk basina 20,000 hücre olarak ekildi. Tek bir doz l tig/ml antikor eklendi. Hücreler 24 saat inkübe edildi ve üst faz toplandi. Salgilanan MCP-l ELISA ile ölçüldü. MCP-1 inhibisyonu analizi Ab969.g2 ve Ab969.g7 antikorlarinin yüksek CSF-lR bloke etme etkinligini korudugunu, CSF-l monositlere 100 ng/ml'nin üzerinde bir konsantrasyonda eklendiginde her iki maddenin de MCP-1 salgilamasini tamamen inhibe etme kapasitesine sahip oldugunu ortaya koydu (Sekil 14). Bu analizde Ab969.g5 için bariz bir etkinlik kaybi tespit edilmis olup, MCP-l salgilamasini sadece 10 ng/ml bir CSF-l konsantrasyonuna dek inhibe karsilastirildiginda düsük CSF-lR bloke edici etkinlik sergiledi .

Seçili Ab969 hümanize greftlerinin IC50”si CSF-l aracili monosit etkinlesmesini inhibe etme nispi kapasitelerine iliskin daha ayrintili bir inceleme saglamak için MCP-l analizinde ölçüldü. Antikor etkinliginin, karisik kaynaklardan elde edilen monositleri birlestirmeden birkaç farkli donör kullanarak incelenmesi önemli kabul edildi. Tablo 9”da 6 farkli donör kullanarak Ab969 üzerinde gerçeklestirilen analizlerden toplanan antikor lC50 degerleri gösterilmektedir. karsilastirilabilir bir nispi 1C50 sergilemektedir. Bunun tam tersi, Ab969.g5 analizde çok daha az güç sergilemektedir (19.6 bir ortalama kimerik/greû ICso orani).

Antikor VK Verici VH Verici IC” “lg/mi) on 1 Kalintilari Kalintilari Verici 1 Verici 2 Verici 3 Verici 4 Verici 5 Verici 6 Ortalama ± S.E. . 2! ama Kimerik/Greft v) Hümanize Ab 696 Antikor Panelini'n Ajînitesi Her Ab969 hümanize antikor greftinin ve parental kimerik antikonin afinitesi, üç bagimsiz deneyin gerçeklestirildigi ve ortalama degerlerin hesaplandigi BlAcore ile ölçüldü (Tablo ). Veri afinitenin (KD) kimerik mo lekülden (Ab969.g0) 'tamamen hümanize' antikor Ab969.g5*e hümanizasyon islemi sirasinda degismis gibi durmadigini göstermektedir.

Bununla birlikte, hümanizasyon Ab969.g2 greitinin ötesine geçtiginde antikor 'birlesim hizi' azalir; hem Ab969.g4 hem Ab969.g5 önceki greftlerden daha düsük Ka degerlerine sahiptir. Ayrica, Ab969.g5 için Ka Ab969.g4 için olandan daha düsüktür, ki bu da muhtemelen DG izomerlesme alaninin SG”ye mutasyonunun antikor birlesim hizini daha da düsürdügünü gösterir.

Agi?? Asigi?" Verici Verici k,,(M'1s") kd (s-') KD(pM) Kalintilari Kalintilari 969cHcL 969.0 N/A N/A Verici Verici ka(M`1s'1) kd(s") KD(pM) Kalintilari Kalintilari Antikor Antikor Grefti Ismi 969gH2gL8 969.g4 - - 969 HZ L8 SG 969. 5 - - Sonuçlar: Bir Ab969 hümanize greftleri panelinin birkaç analizde test edilmesi hafif zincirde konum 71 °deki (örnegin Y71) tirozin kalintisinin antikorun etkinligini gelistirdigini açiga çikardi.

Y71iin örnegin bir fenilalaninle sübstitüsyonu antikor birlesim hizinda parental kimerik moleküle göre bir düsüse (düsük Ka) neden olur. Primer insan monositlerinde CSF-lR etkinliginin izlendigi bir analizde (MCP-1 inhibisyonu analizi) ortaya çikartildigi üzere, bu durum antikorun CSF-1`in CSF-lR'ye baglanmasini bloke etme kapasitesinde bir düsüse neden olur. Örnek 4 - Hümanize Ab696 Panelinin Moleküler Stabilitesi i) Isil Stabilite açiktaki hidrofobik yüzeylere floresan boya baglayarak açilinanin izlendigi usul (Thermotluor usulü), digeri ise kalorimetreli (DSC) bir ortogonal tekniktir.

Antikor Tm Tablo 11°de özetlenmektedir.

Numune Tml Ortalama (°C) Tml S.D. (°C) Tm2 Ortalama (°C) Tm2 S.D. (°C) Genel olarak, Thermotluor ile ölçülen Fab' Tm 969 greftlerinin çogunun IgG4 kontrollere göre isil olarak daha stabil olduklarini ortaya koymaktadir. ii) Numune Konsantrasyonunun Agregasyon Egitimi Üzerindeki Etkisi Depolama sirasinda numunelerin stabilitesinin bir göstergesi olarak PBS içinde (pH 7.4) antikor konsantrasyonunun stabilite üzerindeki etkisi incelendi.

Antikorlar >10 mg/ ml”ye konsantre edildi ve oda sicakliginda 5 gün inkübe edildi.

Konsantrasyondan hemen sonra (To) 969.g7 bulanik göründü ve 969.g8 hafif opalimsi göründü. Tersine, 969.g5 numunesinin gözle incelemeyle berrak oldugu degerlendirildi.

Oda sicakliginda 5 gün inkübasyondan sonra 965. g5 numunesi berrak kaldi, 969.g7 ve 969.g83in agregasyonu ise daha da ilerledi ve her biri agir bir çökelti sergiledi.

Bu çalismadan yola çikarak bu kosullarda numunelerin agregasyona gösterdikleri dirence Konsantrasyondan önce opalimsi görünen 969.g6 (4.68 mg/mFde) hariç üç antikor numunesinin tainami gözle inceleineyle berrak idi. 16 mg/mPye konsantrasyonla birlikte, oda sicakliginda ve 4 °C°de 24 saat depolama sonrasinda 969.g6”da çökelme oldugu kaydedildi. Bununla birlikte, hem 969. gl hem 969.g4 görülebilir ölçüde berrak oldu. 5 gün daha inkübasyon sonrasinda numune 969. gl için hem oda sicakliginda hem 4 °Cide büyük parçaciklar belirgin oldu. Gözle inceleyerek degerlendirildiginde numune 969.g4 için gerek oda sicakliginda gerek 40 C”de agregasyon gözlemlenmedi.

Bu çalismadan yola çikarak içinde düsük konsantrasyonda (4.68 mg/ml) depolandiginda belli ölçüde agregasyon instabilitesine sahip oldugunu göstermek mümkün oldu. Ayrica, bu çökelme daha yüksek antikor konsantrasyonuyla siddetlendi.

Konsantre edilmis 969.g1 daha yavas bir agregasyon hizi gösterdi, konsantre edilmis 969.g4 ise her iki depolama sicakliginda 5 güne dek stabil kaldi. Dolayisiyla agregasyon Konsantrasyondan hemen sonra (To), gece boyu inkübasyondan sonra ve konsantrasyondan 5 gün sonra numunelerde analiz gerçeklestirildi. Tüm nuinuneler konsantrasyondan önce gözle incelendiginde berrakti ve parçacik olusumu kaniti yoktu. 23.07 mg/mlaye konsantrasyondan hemen sonra 969.g7 numunesi daha önce deney 1,de gözlemlendigi gibi çökelme gösterdi. 969.g9 ile hafif opalimsilik gözlemlendi ve bu gerek oda sicakliginda gerek 4 °Cide 24 saat depolama sonrasinda daha belirgin hale geldi. Diger 969 greftlerinin tamami konsantrasyondan hemen sonra gözle incelemeyle berrak göründü. 21 gün inkübasyon SOnrasinda oda sicakliginda gece boyu inkübasyon sonrasinda gözlemlenenden baska görülebilir degisim olmadi; 969.g7 ve 969.g9 greftlerinin her ikisi numunelerin konsantre edilmesinin bir sonucu olarak agregat olusturdu, diger numunelerde ise görülebilir bariz agregasyon olmadi.

Genel olarak 969.g2 numunesi konsantrasyonu artirmanin bir sonucu olarak agregat olusumuna en düsük egilimi gösteren numune oldu. Bu, Thermofluor ile ölçülen en yüksek Tm ile de bagintili oldu.

Sonuç: Hümanize Ab969 panelinin ekspresyonu ve saIlastirilmasi sirasinda antikor konsantrasyonunu 10 mg/mFnin üzerine çikarmanin bazi hümanize antikor greûlerinde hizli çökelmeye yol açtigi bariz hale geldi. Özellikle belirtmek gerekirse, Ab969.g1, olusturmadi. Bu veri hafifzincirde konum 383deki (K38) lizin kalintisinin glutaminle sübstitüsyonunun 10 mg/ m1”nin üzerine konsantre edildiginde antikor stabilitesini gelistirdigini göstermektedir. Örnek 5 - In Vitro Ab969.g2 Analizi i') Ab969.g2 Dizisi Ab969.g2 gL7 hafif zincir greüini ve gH2 agir zincir greltini içerir. Siçan antikor (donör) V bölgesi dizilerinin insan germ hatti (alici) V bölgesi dizileriyle hizanlanmalari, hafif zincir grefti gL7 ve agir zincir grefti gH2 için nihai hümanize dizilerle birlikte Sekil 2A ve 2B”de gösterilmektedir.

Greft gH2sdeki agir zincir çerçeve kalintilarinin tamami insan germ hatti genindendir.

Insan agir zincir çerçevesine ait konum 1 ,deki Glutamin kalintisi, bir homojen ürünün ekspresyonunu ve saflastirilmasini gelistirmek için örnegin antikorlarin ve antikor fragmanlarinin N-terminalinde Glutamini piroGlutamata çevirerek Glutamik asitle (El) degistirildi.

Greft gLTdeki hafif zincir çerçeve kalintilarinin tamami, verici kalintisi Tirozinin korundugu kalinti 71 (Kabat numaralandirmasi) hariç insan germ hatti genindendir. Bu kalintinin korunmasi Örnek 3,te gösterildigi gibi hümanize antikorun gelismis güce sahip olmasini sagladi. i'i') IL-34 '9 Bagli Insan Manosit Etkinlesmesi Inhibi'syanu 969. gO'la karsilastirilan Ab969.g2 etkinligi IL-34'e bagli insan monosit analizinde incelendi. Deney iki ayri monosit donörü kullanarak gerçeklestirildi ve IL-34 aracili monosit uyarimi inhibisyonu için ortalama IC50 hesaplandi (Tablo 12). Ab969.g2 ve Ab969.g0 arasinda IC50 bakimindan anlamli farklilik olmadi.

Primer insan monositleri 100 ng/ml rekombinant insan lL-34 ve anti-CSF- lR antikorunun bir doz titrasyonu (16 konsantrasyon içeren yari-10 g seyreltme serileri, maksimum 10 tig/ml) inevcudiyetinde kuyucuk basina 20,000 hücre olarak ekildi. Hücreler 24 saat inkübe edildi ve üst faz toplandi. Salgilanan MCP-1 ELISA ile (R&D Systems DY279) ölçüldü.

Grafik sadece CSF-l kontrolle karsilastirarak MCP-1 üretimi inhibisyonu yüzdesini göstermektedir.

Verici 1 Verici 2 Ortalama ± S.E.

Antikor iii) Ab969.g2,ni'n Insan CSF-IR SNP'leri'ne Baglanmasi Insan popülasyonunda varligi bildirilmis, insan CSF-IR geninde ligand baglayici domen içinde yer alan dört esanlamli olmayan tek nükleotit polimorfizmi (SNP°ler) bulunur. Bu lR,nin ayri ayri her SNP varyanti üretilinis ve stabil olarak eksprese edilmistir.

Ab969.g2,nin ayri ayri her SNP”ye baglanmasi akis sitometresiyle dogrulandi. Örnek 6 - Sinomolgus Maymununda Farmakodinamik Markör Analizi Antikorun insan disi bir primatta (sinomolgus maymunu) farmakolojik etkinligini göstermek için hümanize monoklonal anti-CSF-lR antikoru 969. g2 ile bir farmakokinetik/farmakodinamik (PK/PD) çalisma gerçeklestirildi. Üç sinomolgus maymunundan olusan gruplara intravenöz yolla tek doz 7 mg/kg (Grup 1) veya 1.5 mg/kg (Grup 2) 969.g2 antikoru verildi. Antikor olumsuz klinik isaretler gösterineden iyi tolere edildi. 25 günlük çalisma boyunca birden fazla zaman noktasinda serum numuneleri alindi. 969. g2°nin serum konsantrasyonu ELISA ile ölçüldü ve farmakokinetik analiz gerçeklestirildi (Tablo 13). PK parametreleri WinNonlin yazilimini kullanarak hesaplandi. tm antikorun serumdaki yari ömrüdür.

CmakS antikorun serumdaki pik konsantrasyonudur.

AUC egri altindaki alandir (konsantrasyon zaman egrisi integrali) ve ilaca toplam maruziyetin bir ölçüsünü verir.

Atilim birim zamanda ilaçtan temizlenen plazma hacmidir.

Vol. Dist. dagilim hacmi, yani bir ilacin dagildigi görünür hacimdir.

Gözlemlenen ve hesaplanan degerler arasinda iyi bir korelasyon oldu (hayvan 2 bir istisna olusturdu ve bir aykiri deger kabul edildi). CmkS dozla orantili oldu; AUC dozla orantilidan daha büyük oldu, ki bu da daha yüksek dozda daha yavas atilim oldugunu gösterir. 969. g2”nin büyük kismi serumda tespit edildi.

Hayvan Doz t'/2 Cmaks AUCiNp_0iJS Atilim (Clubs) Dagilim Hacmi (V,_0bs) CSF-l atiliini için birincil yol türdes reseptörü CSF-1R°ye baglanmadir. GSF-Pin CSF- lRaye baglanmasinin bloke olmasinin reseptör aracili atilimin önlenmesiyle CSF-l ”in serum konsantrasyonunu artirmasi beklenir; bu murin modellerinde gözlemlenen bir fenomendir. Dolayisiyla, serum CSF-l konsantrasyonunda görülen bir artis CSF-lR baglantisina ve inhibisyonuna iliskin bir farmakodinamik markördür. 969. g2”nin her iki dozu da hizli ve anlamli bir serum CSF-l birikimini tesvik etti. Etki doza bagimli oldu; 7 mg/kg doz 1.5 mg/kg doza kiyasla yaklasik olarak 10 kat daha yüksek bir pik CSF-l konsantrasyonu verdi. Antikorun atilimini takiben CSF-l seviyelerinin normallesmesi ile bir farmakokinetik/farmakodinamik iliski gözlemlendi. Her iki tedavi grubunda çalismanin sonunda CSF-l seviyeleri baslangica geri döndü. Sonuçlar Sekil 15a ve lelde gösterilmektedir.

Sekil 15a9da tek doz intravenöz 7 mg/kg Ab969.g2 ile tedavi edilen sinomolgus maymunlarindan elde edilen serum numunelerinde CSF-l konsantrasyonu gösterilmektedir. Serum CSF-l konsantrasyonu iki bagimsiz analizde ölçüldü. Grafikte standart hatayla birlikte Grup l”deki (7 mg/kg) üç hayvan için ortalama CSF -1 konsantrasyonu gösterilmektedir (kareler). Ayrica Ab969.g2°nin ortalama serum konsantrasyonu da gösterilmektedir (daireler).

Sekil 15b”de tek doz intravenöz 1.5 mg/kg Ab969.g2 ile tedavi edilen sinomolgus maymunlarindan elde edilen serum numunelerinde CSF-l konsantrasyonu gösterilmektedir. Serum CSF-l konsantrasyonu iki bagimsiz analizde ölçüldü. Grafikte standart hatayla birlikte Grup 27deki (1.5 mg/kg) üç hayvan için ortalama CSF-l konsantrasyonu gösterilmektedir (kareler). Ayrica Ab969.g2,nin ortalama serum konsantrasyonu da gösterilmektedir (daireler).

Dolasimdaki insan ve sinomolgus maymunu monositlerinin iki ana popülasyonu vardir; (i) CD14+ CD16- 'klasik' monositler ve (ii) CD 14+ CD16+ 'klasik olmayan' veya 'yerlesik' monositler. Murin modelleri TAMiler dahil yerlesik doku makrofajlarinin klasik olmayan inonosit popülasyonundan türetildigini kanitlamistir. Ayrica, klasik olmayan inonositler klasik monosit popülasyonunun ayrica farklilasmasindan elde edilir. 969.g2 verilmis sinomolgus maymunlarinda dolasimdaki monosit popülasyonlari tam kan dört renkli akis sitometresi ile izlendi. Akis sitometresi anti-sino-CD45-PerCP, anti-insan-HLA-DR-APC, anti-insan-CD14-FITC (My4 klonu) ve anti-insan-CDlö-PE (3G8 klonu) antikorlarini kullanarak gerçeklestirildi. Kapilar her antikor için uygun izotip kontrol kullanarak ayarlandi. Klasik monositler CD45+ HLA-DR+ CD14+CD16` olarak tanimlandi. Klasik olmayan monositler CD45+ HLA-DR+CD14+ CD16+ olarak tanimlandi. 969. g2”nin her iki dozu da çalismanin birinci haftasi boyunca klasik olmayan CD14+ CD16+ monositlerde asamali bir tükenmeyi baslatti. 7 mg/kg doz klasik olmayan monositlerin neredeyse tamamen tükenmesine neden oldu. 7 mg/kg ve 1.5 mg/kg dozlarinin her ikisiyle klasik olmayan monosit düsüsünün 4. gün zaman noktasinda pik yaptigi, 11. günle birlikte ise sayilarin normale döndügü görüldü. Sonuçlar Sekil 15cide gösterilmektedir. Çubuk grafikler, standart hatayla birlikte çalisma boyunca zaman inonositlerinin ortalama sayisini göstermektedir. Standart hatayla birlikte ortalama serum CSF-l konsantrasyonu da isaretlenmistir.

Bu örnekte (i) antikor 969.g2`nin sinomolgus maymununda CSF-lRie baglanma ve CSF-l baglanmasini bloke etme kapasitesine sahip oldugu dogrulanmis, (ii) insan disi bir primat modelinde antikor 969.g2'nin farmakolojik etkinligi kanitlanmis, (iii) antikor 969. g2°nin in vivo sinomolgus maymunu monositlerinin klasik olinayan popülasyonunu - tümör baglantili makrofajlarin prekürsörleri olduklari düsünülen monosit popülasyonu - seçici olarak tükettigi ve (iv) serum CSF-l konsantrasyonunun 969. g2 etkinliginin ölçülmesinde bir biyo markör olarak uygun oldugu kanitlanmistir. Örnek 7: MCP-7 Meme Kanseri Ksenogrefti Büyümesinin inhibisyonu Antikor 969.g2 fare CSF-lR,ye baglanma kapasitesine sahip degildir. Dolayisiyla, kanserin ve fibrozun tedavi edilmesinde Ab969.g2,nin kullanisliligini göstermek için bir anti-murin CSF-lR antikoru Ab535 ”i kullanarak in vivo fare çalismalari gerçeklestirildi.

Bir dizi in vitro deneyde Ab535lin Ab969.g2 ile karsilastirilabilir özelliklere ve etkinlige sahip oldugu gösterildi. karsilastirilabilir bir atiniteye sahip oldugu ve Örnek 2 vii),de CSF-l R internalizasyonunu tetiklemedigi gösterildi.

Ab535 üzerinde in vivo çalisma olarak in vivo MCP-7 meme kanseri ksenogreft modeli asagida açiklanan sekilde gerçeklestirildi: Çalismada, insan meme kanseri ksenogrefti MCF-7°nin subkutane transplantlarini tasiyan immün yetersizligi olan tüysüz farelerde bir kontrol antikoruna, bir pozitif kontrole ve vasita kontrole karsi subkutane yoldan (s.c.) uygulanan Ab535 antikorunun terapötik etkinligi ölçüldü. Terapötik parametre olarak tümör büyümesi inhibisyonu kullanildi. Insan meme kanseri MCP-7 immün yetersizligi olan disi NMRlznu/nu farelerde subkutane ksenotransplantasyon modeli olarak kullanildi. MCP-7 hücre hatti Ulusal Kanser Enstitüsü (ABD) tümör bankasindan elde edildi. Deneysel kullanim için hücreler RPMI 1640 besiyeri + %10 FCS içinde in vitro kültive edildi. Hücreler sub-konIlüent kültürlerden alindi ve subkutane yolla farelere asilandi. Tümör boyutu elle hissedilir oldugunda (4-10 mm) tedavi baslatildi. Test bilesikleri ve vasita kontrol haftada üç kere subkutane yolla verildi. Pozitif kontrol 24., 33. ve 40. günde intravenöz yoldan günde bir kere uygulandi.

Enjeksiyon hacimleri ayri ayri enjeksiyon zainainindaki vücut agirligina göre ayarlandi.

Tümör çaplari bir çap ölçerle haltada üç kere ölçüldü. Tümör hacimleri V = (boy x (en)2)/2” ye göre hesaplandi. Orantili tümör hacmi (RTV) hesaplamasi için her ölçüm günündeki hacimler birinci tedavi gününe göre orantilandi. Her ölçüm gününde grup basina medyan ve ortalama tüinör hacimleri ve ayrica yüzde olarak medyan tedavi edilen/ kontrol (T/C) degerleri hesaplandi.

Sonuçlar Sekil 16”da gösterilmektedir. Ab535 doza bagli bir antitümör etki gösterdi.

Kontrol fare IgG antikorunun her iki dozaji bir tümör büyümesi inhibisyonu indüklemedi.

Orantili tümör haciinleri vasita kontrolle karsilastirilabilir oldu ve pozitif kontrol tümör büyümesi inhibisyonuna neden oldu.

Sonuç: Test antikoru Ab535 en yüksek dozda (30 mg/kg/gün) insan meme kanseri ksenogrefti MCF-7lde istatistiksel açidan anlamli bir antitümör etki indükledi. Örnek 8: PC-3 Ortotopik Prostat Kanserinde Büyüme Inhibisyonu Antikor Ab535 ”in antitümöral ve antimetastatik etkinligi in vi'v0 bir ortotopik prostat kanseri modeli PC-3 kullanarak da test edildi. PC-3 hücre hatti, in vivo tümör büyümesinin izlenmesini ve seçili organlarda ex Viva inetastaz analizinin gerçeklestirilmesini saglayan in vivo biyolüminesans görüntüleme analizini müinkün kilmak amaciyla genetik olarak kesintisiz lüsiferaz eksprese edecek sekilde degistirildi. Çalisma, randomizasyon sonrasinda her biri ya 11 (Grup 5) ya da 12 (diger tüm Gruplar) erkek NMRI tüysüz fare içeren 6 deney grubundan olustu. 0. Günde tüm katilimci NMRI tüysüz farelerinin prostatina ortotopikal yolla PC-3 hücreleri implante edildi. 3. Günde in vivo biyolüminesans görüntülemesiyle tümör büyümesi baslangici dogrulandi. 8. Günde bir ikinci in vivo biyolüminesans görüntülemesi gerçeklestirildi ve tümör tasiyan hayvanlar görüntüleme sonuçlarina göre alti gruba randomize edildi; ortalama biyolüminesans yogunlugu ve dolayisiyla tümör boyutu her Grupta benzer oldu. Ertesi gün (9. gün) tedavi baslatildi. Grup 2 ve 3iteki hayvanlar 42. güne dek S.c. yolla haftada 3 kere sirasiyla 30 ve mg/kg Kontrol Antikoru aldi. Tedavi Grubu 4 ve 5lteki hayvanlar 42. güne dek s.c. yolla haftada 3 kere sirasiyla 30 ve 10 mg/kg antikor Ab535 aldi. Grup l°deki hayvanlar vasita kontrolü temsil etti ve 42. güne dek s.c. yolla haftada 3 kere Vasita (PBS) aldi. Grup 69daki hayvanlar pozitif kontrolü temsil etti ve dört hafta haftada bir kere (10., 17., 24. ve 31. günde) i.v. yolla 360 mg/kg kontrol aldi. Çalisma süreci sirasinda, ortotopikal yolla implante edilmis PC-3 tümörlerinin büyümesi biyolüminesans görüntülemesini kullanarak Çalismanin sonunda bir otopsi gerçeklestirildi. Primer tümör agirligi ve hacmi belirlendi.

Seçili organlar (karaciger, dalak ve akciger) toplandi, her birinin bir kismi formalin içinde fikse edildi ve geri kalan bir in vitro lüsiferaz analizinin kullanildigi biyolüminesans görüntülemesi yoluyla metastaz modeli açisindan analiz edildi. llaveten, in vitro lüsiferaz analizini kullanarak kemiklerde metastaz modelinin analiz edilmesi için bir bacaktan femur ve bel omurgasinin ayni kismi toplandi.

In vi'vo biyolüminesans sinyali hem primer tümörden hem metastazlardan olusur (tüm vücut görüntüleme). Bu verilere dayanarak tüm gruplar için bir tümör büyümesi egrisi hesaplanabildi (Sekil 17). Tümör gelisimi randomizasyona ve tedavinin baslatilmasina dek tüm çalisma gruplarinda homojen oldu. Takiben Vasita Kontrol Grubu 1 ve ayni zamanda iki Kontrol Antikoru RTEll Grubu 2 ve 3 düzenli bir tümör büyümesi gösterdi. Pozitif kontrol (Grup 6) için 43. günde tümör büyümesinde iri vivo ölçülen oldukça anlamli bir azalma gözlemlenebildi. Sirasiyla 30 veya 10 mg/kg uygulanan antikor Ab535 (Grup 4 ve ) in vivo biyolüminesans görüntülemesi kullanarak izlendiginde tümör büyümesinde 44. Günde otopsi sirasinda primer tümör hacimleri ve yas agirliklar belirlendi. Pozitif Kontrol (Grup 6) primer tümör hacminde ve agirliginda oldukça anlamli bir azalmaya yol açti. Antikor Ab535 30 mg/kg (Grup 4) uygulandiginda primer tümör hacminde ve agirliginda anlamli bir azalma gözlemlenebildi. Ab535 10 mg/kg (Grup 5) uygulandiginda tümör hacmindeki azalma belirgin ancak Grup 4”ün gösterdiginden daha az oldu. Kontrol Antikoru söz konusu oldugunda anlamli antitümöral etkinlik gözlemlenemedi.

Biyolüminesans görüntüleme teknigini kullanarak otopsi sonrasinda primer tümör lüsiferaz etkinlikleri ölçüldü. Elde edilen sonuçlar otopsi bulgulari ve in vivo büyüme egrisi sonuçlariyla karsilastirilabilir oldu. Pozitif Kontrol (Grup 6) primer tümör lüsiferaz etkinliginde oldukça anlamli bir azalmaya neden oldu. 30 mg/kg (Grup 4) uygulanan antikor Ab535 primer tümör lüsiferaz etkinliginde anlamli bir azalmaya yol açti, Ab535 10 mg/kg (Grup 5) uygulandiginda ise azalma daha az oldu. Kontrol Antikoru için lüsiferaz etkinliginde anlamli azalma bulunamadi.

Birkaç ilave organ (karaciger, dalak, akciger, femur ve bel omurgasinin bir kismi) ex vivo biyolüminesans görüntüleme teknigini kullanarak analiz edildi. Pozitif kontrol söz konusu oldugunda, femur ve bel omurgasi için lüsiferaz etkinliginde anlamli azalmalar gösterilebildi, karaciger ve dalak söz konusu oldugunda ise sinyal azalmasi anlamlinin hemen altinda oldu. 30 mg/kg (Grup 4) uygulanan antikor Ab535 söz konusu oldugunda, lüsiferaz etkinligindeki azalma karaciger için anlamli ve diger tüm organlar için fark edilebilir oldu. Kontrol Antikoru (Grup 2 ve 3) test edilen organlarin tamaminda lüsiferaz etkinliginde herhangi bir azalmaya yol açmadi.

Sonuç olarak bu tümör modelinde, antikor Ab535 için belirgin bir antimetastatik etkinligin beraberinde anlamli bir antitümöral etkinlik kanitlanabilmis oldu. Örnek 9: Bleomisin Indüklü Bir In Viva Pulmoner Fibroz Modelinde Anti-CSF-IR Antikorunun Etkisi Bleomisin önce Streptomyces verti'ci'llatusitan ayristirilmis ve çesitli kanserlerde bir kemoterapötik olarak kullanilmis bir antibiyotiktir. Akciger fibrozu bleomisin modeli bilinen bir modeldir ve esas itibariyla Madtes, DK ve digerleri, 1999, Am J Respir Cell Mol Biol, 20, 924-34 referansinda açiklanan sekilde kullanilmistir. Ayrintili protokol Morschl, E., Molina, J. G., Volmer, J., Mohsenin, A., Pero, R. S., Hong, J. S., Kheradmand, F., Lee, J. J. ve Blackburn, M. R. (2008), A3 adenosine receptor signaling influences pulmonary inflammation and fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Bi01.39: 697- 705 referansinda bulunabilir.

Kullanilan tüm fareler Harlan Laboratuvarlari'ndan alinan yabani tip C57Blk6 disi fareleridir (20 g). Farelere avertinle anestezi uygulayarak intra-trakeal (IT) kesili bir instilasyon kullanildi ve 50 ul salinde 3.5 birim doz bir bleomisin veya kontrol olarak tek basina 50 u] salin instilasyonu için bir trakeostomi gerçeklestirildi. Bu sekilde yapilan tedavi bleomisin maruziyeti sonrasinda 7. günde pik yapan bir enflamasyon evresine ve maruziyetten sonra 21. günde maksimuma çikan bir fibrotik evreye yol açti. Antikor Ab5357in etkisi, antikorun modelin sadece fibrotik evresinde dozlanmasi ve 9-21 günleri arasinda haftada üç kere subkutane yolla 30 mg/kg uygulanmasiyla incelendi. Hayvanlar 21. günde öldürüldü ve okumalar akcigerlerin histopatolojik analizini, BAL (bronkoalveolar lavaj) sivisi hücresellgini ve BAL sivisinda çözünür kollajen Ölçümünü içerdi. Histopatolojik analiz akciger fibrozu ciddiyetini belirleyen bir modifiye Ashcroü puanlama sistemi kullanarak akciger hasarini belirlemek için gerçeklestirildi (Hubner RH basinca sisirildi ve bir dizi alkol ve ksilenle isleme tabi tutuldu, parafine batirildi ve Masson Trikromu ile isleme ve boyama öncesinde doku kesitleri parafinden arindirildi.

BAL sivisindaki çözünür kollajen miktari imalatçi firmanin talimatlarini izleyerek ticari olarak piyasada mevcut bir Sircol analiz kitini kullanarak hesaplandi.

BAL sivisinda makrofaj popülasyonu üzerindeki etki sitosipin preparasyonlarini kullanarak belirlendi. BAL hücrelerinin temsili miktarlari mikroskop lainlari üzerine yayildi, Diff- Quick ile boyandi ve makrofajlar sayildi.

Anti-CSF-IR antikoru Ab535 ile dozlamayi 9. günde baslatarak yapilan terapötik tedavinin bleomisin indüklü akciger fibrozunda büyük ölçüde azalmaya yol açtigi bulundu. Fibrozun hem ciddiyeti hem boyutu anlamli ölçüde azaldi. Tedavi edilen farelerde düsük kollajen üretimi, gelismis fibrotik patoloji ve gelismis pulmoner bariyer korumasi oldu.

Sekil 18a,da bleomisin indüklü akciger fibrozunun Ab535 ile tedavisinin, izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirildiginda BALF kollajen konsantrasyonunu azalttigi gösterilmektedir.

Sekil 18b9de bleomisin indüklü akciger fibrozunun Ab535 ile tedavisinin, izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirildiginda numunelerde Ashcroft puanini azalttigi gösterilmekte, dolayisiyla Ab535 ile tedavi edilen farelerin gelismis fibrotik patolojiye sahip olduklari gösterilmektedir.

Sekil 18cade bleomisin indüklü akciger fibrozunun Ab535 ile tedavisinin, izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirildiginda serumda albümin konsantrasyonunu azalttigi gösterilmekte, dolayisiyla Ab535 ile tedavi edilen farelerde vasküler geçirgenligin gelismis oldugu gösterilmektedir.

Sekil 197da salin kontrol, bleomisin arti izotip kontrol ve bleomisin arti Ab535 tedavisi görmüs hayvanlara ait akcigerlerin histopatolojik analizine iliskin temsili görüntüler gösterilmektedir. Ab5 35 ile tedavi edilen hayvanlar izotip kontrolle, bleomisinle tedavi edilmis hayvanlarla karsilastirildiginda akcigerlerde oldukça azalmis bir fibroza sahip olinustur. Örnek 10. Pulmoner Fibroza Iliskin Adenozin Deaminaz Yetersizligi Fare Modelinde Anti-CSF-IR Antikorunun Etkg Adenozin, hücreler stres altinda oldugunda veya hasar gördügünde seviyeleri artan kuvvetli bir sinyallesme nükleozidir ve adenozin spesifik G proteinine kenetli reseptörlerini devreye soktugunda genis çesitlilikte yanit üretilir. Adenozin deaminaz (ADA) adenozini inozine çeviren bir pürin katabolizmasi enzimidir. ADA nakavti yapilmis fareler üretilmis ve serumda ve ayrica böbrek, karaciger ve akciger gibi dokularda yüksek seviyelerde adenozine sahip olduklari gösterilmistir (Blackburn, MR ve digerleri, 1998, J Biol Chem, inukus üretimi gibi akcigerde yüksek adenozin seviyeleri ile baglantilandirilan kronik akciger hastaligi özellikleri sergiler (Blackburn MR ve digerleri, 2000, J Exp Med, 192: 159-70). Etkileri, farelerin üç haftalikken solunum güçlügü nedeniyle ölmesine neden olacak denli güçlüdür. Düsük dozlu rejimler kullanarak ekzojen ADA uygulamasi adenozin seviyelerini azaltir ve bu farelerin yasam süresini uzatarak bir pulmoner fibroz modelinin seviyelerindeki kronik yükselis akcigerlerde TGFEi-l dahil pro-fibrotik aracilarda bir artisla, akciger dokusunda yüksek kollajen birikiiniyle ve artan fibrotik akciger patolojisiyle iliskilendirilmistir. Anti-fibrotik potansiyeli olan moleküllerin etkisini incelemek için ADA yetersizligi olan fareler birkaç hafta düsük dozlu bir ekzojen ADA rejiminde tutuldu, ardindan ADA tedavisi sonlandirildi ve potansiyel anti-fibrotik madde verildi.

ADA nakavti yapilmis pulmoner fibroz fare modelinde anti-CSF- lR antikoru Ab535”in etkisi incelendi. Bu modelde, enzim yetersizligi olan fareler dogum SOnrasi 1. günden 21. güne dek ADA enzimi tedavisinde tutuldu. Bir ADA-polietilen glikol (PEG) konjugati birim) uygulandi, ardindan 21. günde intraperitonal yoldan 5 birim enjekte edildi. 21.

Günden sonra baska enzim uygulanmadi. 25. Günden (postnatal) itibaren hayvanlarin 42. günde öldürülinesine dek subkutane yoldan haftada üç kere 100 u] bir hacimde 30 mg/kg Ab535 dozaji verildi.

Hayvanlar 42. günde öldürüldü ve okumalar akcigerlerin histopatolojik analizini, BAL sivisi hücreselligini ve BAL sivisinda çözünür kollajen miktari tayinini içerdi.

Histopatolojik analiz akciger fibrozu ciddiyetini belirleyen bir modifiye Ashcroft puanlama sistemi kullanarak akciger hasarini belirlemek için gerçeklestirildi (Hubner RH ve basinca sisirildi ve bir dizi alkol ve ksilenle isleme tabi tutuldu, parafine batirildi ve Masson Trikromu ile isleme ve boyama öncesinde doku kesitleri parafinden arindirildi.

BAL sivisinda makrofaj popülasyonu üzerindeki etki sitosipin preparasyonlarini kullanarak belirlendi. BAL hücrelerinin temsili miktarlari mikroskop lamlari üzerine yayildi, Diff- Quick ile boyandi ve makrofajlar sayildi.

Anti-CSF- 1R antikoru Ab535 ile yapilan terapötik tedavinin ADA yetersizligi olan farelerde akciger fibrozunu anlamli ölçüde azalttigi bulundu. Tedavi edilen farelerde düsük kollajen üretimi, gelismis fibrotik patoloji ve gelismis pulmoner bariyer islevi ve korumasi Sekil 20a,da indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerin izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirildiginda Ab535 ile tedavi edilmesinin BALF kollajen konsantrasyonunu azalttigi gösterilmektedir.

Sekil 20b7de indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerin izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirildiginda Ab535 ile tedavi edilmesinin numunelerde Ashcroft puanini azalttigi, dolayisiyla Ab535 ile tedavi edilen farelerin gelismis fibrotik patoloji sergiledigi gösterilmektedir.

Sekil 200,(16 indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerin izotip kontrolle yapilan tedaviyle karsilastirildiginda Ab535 ile tedavi edilmesinin serumda albümin konsantrasyonunu azalttigi, dolayisiyla Ab535 ile tedavi edilen farelerde vasküler geçirgenligin gelismis oldugu gösterilmektedir.

Sekil 20d,de Ab535 alan indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerde BAL sivisinda makrofajlarin sayisinda azalma oldugu gösterilmektedir.

Sekil 21ide her ikisi de izotip kontrol veya Ab535 ile tedavi edilen normal farelerin (ADA+) ve indüklenmis akciger fibrozlu ADA yetersizligi olan farelerin (ADA-) akcigerlerine ait histopatolojik analizin temsili görüntüleri gösterilmektedir. ADA- farelerinde, izotip kontrolle karsilastirildiginda Ab535 ile tedavi edilen hayvanlarin akcigerlerinde oldukça düsük bir fibroz görüldü.

Dolayisiyla, iki akciger fibrozu fare modelinde bir anti-CSF-l R antikomyla yapilan tedavinin fibrotik hastaligi etkili sekilde tedavi edebilecegi gösterilmis bulunmaktadir.

Claims

ISTEMLER

l. DIZI ID. NO:27”de verilen diziyi içeren bir agir zincire ve DIZI ID. NO:193da verilen diziyi içeren bir hafif zincire sahip bir anti-CSF-IR antikoru.
2. Istem 1”deki gibi anti-CSF-lR antikoru olup, kendisine baglanmis halde bir efektöre veya bir haberci moleküle sahiptir.
3. Istem 1 ve 2`deki gibi anti-CSF-l R antikoru olup, insan CSF-l R için 10 pM veya 10 pM”den daha az bir baglanma afinitesine sahiptir.
4. Istem 1 ila 3”ten herhangi birindeki gibi bir antikorun agir ve hafif zincirini(zincirlerini) kodlayan bir ayristirilmis DNA dizisi.
5. Istem 4lteki gibi bir veya daha fazla DNA dizisini içeren bir klonlama veya ekspresyon vektörü.
6. Istem 5`teki gibi vektör olup, burada vektör DIZI ID. NO:28 ve DIZI ID. NO:20'de verilen dizileri içerir.
7. Istem 6Sdaki gibi bir veya daha fazla klonlama veya ekspresyon vektörünü içeren bir konak hücre.
8. Istem 1 ila 3”ten herhangi birindeki antikorun üretimi için bir islem olup, Istem 7°deki konak hücreye kültür yapilmasini ve antikorun ayristirilmasini içerir.
9. Farmasötik olarak kabul edilebilir bir eksipiyan, seyreltici veya tasiyicidan biri veya daha fazlasiyla kombinasyon halinde Istem 1 ila 3lten herhangi birindeki gibi bir antikoru içeren bir farmasötik bilesim; burada farmasötik bilesim istege bagli olarak baska etken maddeler içerir.
10. Bir ilaç olarak kullanim için Istem 1 ila 37ten herhangi birindeki gibi antikor veya Istem ll`deki gibi bilesim.
11. Kanserin veya bir Iibrotik hastaligin tedavisi veya profilaksisi için Istem 1 ila 3lten herhangi birindeki gibi antikor veya Istem llideki gibi bilesim.
12. Istem ll”deki gibi kullanim için antikor olup, burada kanser meme kanseri, prostat kanseri, kemik kanseri, kolorektal kanser, lösemi, lenfoma, cilt kanseri, özofagus kanseri, gastrik kanser, astrositik kanser, endometriyal kanser, servikal kanser, mesane kanseri, böbrek kanseri, akciger kanseri, karaciger kanseri, tiroid kanseri, bas ve boyun kanseri, pankreas kanseri ve yumurtalik kanserinden olusan gruptan seçilir.
13. Istem 11”deki gibi kullanim için antikor olup, burada fibrotik hastalik, pulmoner fibroz, örnegin idiyopatik pulmoner fibroz ve kistik fibroz, renal fibroz, karaciger sirozu, endomiyokardiyal fibroz, mediastinal fibroz, miyelofibroz, retroperitonal fibroz, progresif masif fibroz, nefrojenik sistemik fibroz, Crohn hastaligi, keloit, miyokard enfarktüsü, skleroderma ve artrofibrozdan olusan gruptan seçilir.