KR20160044018A - 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항-CSF-1R 항체 및 이의 결합 단편, 이를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 숙주 세포, 및 숙주 세포에서 상기 항체 또는 결합 단편을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 치료에 있어서 상기 항체, 결합 단편 및 이를 포함하는 조성물의 용도까지 확장된다.

Description

항체{ANTIBODIES}

본 발명은 항-CSF-1R 항체 및 이의 결합 단편, 이를 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 숙주 세포, 및 숙주 세포에서 상기 항체 또는 결합 단편을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 치료에 있어서 상기 항체, 결합 단편 및 이를 포함하는 조성물의 용도까지 확장된다.

대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF)로서도 공지된 콜로니 자극 인자 1(CSF-1)은 대식세포, 내피세포 및 섬유모세포를 비롯한 다양한 세포들에 의해 생성되는 사이토카인이다. CSF-1은 생물학적 활성 이량체성 CSF-1 단백질을 형성하는 2개의 "단량체" 폴리펩티드들로 구성된다. CSF-1은 대안적 RNA 스플라이싱(splicing)으로 인해 3개 이상의 성숙 형태들로 존재한다(문헌(Cerretti et al., 1988, Molecular Immunology, 25:761) 참조). CSF-1의 3개 형태들은 아미노 말단에서 32개 아미노산 신호 서열을 갖고 카복실 말단 근처에서 대략 23개 아미노산들의 잠정적 경막 영역을 가진, 256개 내지 554개 아미노산들의 폴리펩티드 단량체를 코딩하는 상이한 rnRNA 전구체로부터 번역된다. 그 후, 전구체 펩티드는 아미노 말단 및 카복실 말단 단백질용해성 절단에 의해 프로세싱되어 성숙 CSF-1을 방출한다. CSF-1의 모든 3개 성숙 형태들의 잔기 1 내지 149는 동일하고 CSF-1의 생물학적 활성에 필수적인 서열을 함유하는 것으로 여겨진다. 생체내 CSF-1 단량체는 글리코실화되고 디설파이드 연결을 통해 이량체화된다. CSF-1은 혈액 세포의 생성을 촉진하는 생물학적 아고니스트들(agonists)의 군에 속한다. 구체적으로, 상기 물질은 단핵 식세포 계통의 골수 원시세포에 대한 성숙 및 분화 인자로서 작용한다. 추가로, CSF-1은 반응 세포 상의 특이적 수용체를 통해 대식세포의 생존, 증식 및 기능을 자극한다.

CSF-1 수용체(CSF-1R)는 c-fms 유전자 생성물 또는 CD115로서도 지칭된다. CSF-1R은 III형 수용체 티로신 키나제(kinase) 패밀리에 속하는 165 kDa 1형 TM 당단백질이다. CSF-1 이외에, 구조적으로 유사하나 서열 면에서 무관한 분자인 IL-34도 CSF-1R에 대한 리간드인 것으로 밝혀졌다(Lin, et al., 2008, Science 320:807-811). CSF-1R의 발현은 단핵구-대식세포 계통의 세포, 순환 조직 집단 및 체류 조직 집단 둘다, 및 파골세포로 제한된다. 추가로, 상기 물질은 난모세포, 탈락막세포 및 영양모세포를 비롯한 여성 생식 시스템의 다수의 세포들에서 발현된다.

리간드 CSF-1과 CSF-1 수용체의 결합은 티로신 키나제 도메인의 작용을 통해 하나 이상의 티로신 잔기 상의 상기 수용체의 인산화를 일으킨다. 이 인산화는 인산화 후에만 상기 수용체에 결합하는 항체(예를 들면, 셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터의 인-M-CSF-수용체(Tyr546) 항체 #3083)가 입수될 수 있기 때문에 검출될 수 있다.

CSF-1 및 CSF-1R의 발현은 많은 유형의 암들에서 종양 진행 및 좋지 않은 진단과 상호관련되어 있다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 종양 간질의 주성분일 수 있고, CSF-1 및 CSF-1R의 높은 수준은 다수의 유형의 종양들에서 높은 TAM 침습 및 좋지 않은 예후와 관련되어 있다.

CSF-1R에 대한 항체는 당분야에서 공지되어 있다. 문헌(Sherr, C.J. et al., 1989, Blood 73:1786-1793)에는 CSF-1 활성을 억제하는, CSF-1R에 대한 항체가 기재되어 있다(Sherr, C.J. et al., 1989, Blood 73:1786-1793). 국제 특허출원 공보 제WO2009/026303호는 인간 CSF-1R에 결합하는 항-CSF-1R 항체 및 항-뮤린 CSF-1R 항체를 사용하는 생체내 마우스 종양 모델을 개시한다. 국제 특허출원 공보 제WO2011/123381호는 CSF-1R을 내재화하고 ADCC 활성을 가진 항-CSF-1R 항체를 개시한다. 국제 특허출원 공보 제WO2011/123381호는 항-뮤린 CSF-1R 항체를 사용하는 생체내 마우스 종양 모델도 개시한다. 국제 특허출원 공보 제WO2011/140249호는 CSF-1과 CSF-1R의 결합을 차단하고 암의 치료에 유용한 것으로 언급되어 있는 항-CSF-1R 항체를 개시한다. 국제 특허출원 공보 제WO2009/112245호는 CSF-1과 CSF-1R의 결합을 억제하고 암, 염증성 장 질환 및 류마티스성 관절염의 치료에 유용한 것으로 언급되어 있는 항-CSF-1R IgG1 항체를 개시한다. 국제 특허출원 공보 제 WO2011/131407호는 CSF-1과 CSF-1R의 결합을 억제하고 골 손실 및 암의 치료에 유용한 것으로 언급되어 있는 항-CSF-1R 항체를 개시한다. 국제 특허출원 공보 제WO2011/107553호는 CSF-1과 CSF-1R의 결합을 억제하고 골 손실 및 암의 치료에 유용한 것으로 생각되는 항-CSF-1R 항체를 개시한다. 국제 특허출원 공보 제WO2011/070024호는 인간 CSF-1R 단편 delD4에 결합하는 항-CSF-1R 항체를 개시한다.

치료 적용에 적합한 신규 항-CSF-1R 항체를 제공할 필요성이 당분야에 존재한다. 항-CSF-1R 항체를 일부 암들의 치료에 치료적으로 적용하는 것은 이미 기재되어 있지만, 이러한 항체의 신규 치료 적용을 제공할 필요성이 여전히 존재한다.

용어 '섬유성 질환(fibrotic disease)'은 과도한 섬유성 결합 조직이 장기 또는 조직에서 형성되는 비정상적인 상처 치유 반응을 지칭한다. 과도한 세포외 매트릭스 성분, 예컨대, 콜라겐 및 피브로넥트린의 침착 및 축적은 궁극적으로 장기 부전을 유발할 수 있는 조직의 경화 및 흉터형성을 초래한다.

섬유성 질환의 예로는 폐 섬유증, 예컨대, 특발성 폐 섬유증 및 낭성 섬유증, 신장 섬유증, 간 섬유증, 간 경화증, 원발성 경화 담관염, 원발성 담관 경화증, 심내막심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대(massive) 섬유증, 신원성(nephrogenic) 전신 섬유증, 크론병, 켈로이드(keloid), 심근경색, 전신 경화증, 피부경화증 및 관절섬유증이 있다.

상처는 임시 세포외 매트릭스(ECM)의 발생과 함께 즉각적인 응고 및 응괴 반응을 초래한다. 혈소판 응집 및 활성화는 호중구, 대식세포, 호산구 및 림프구를 비롯한 다양한 면역 세포들의 동원을 가능하게 하는 혈관확장 및 혈관 투과성의 증가를 특징으로 하는 염증 반응을 촉진하는 데에 도움을 준다. 호중구 및 대식세포는 상처를 세정함으로써 감염의 위험을 감소시키고 활성화된 림프구와 함께 염증 반응을 더 증폭하는 데에 기여하는 다양한 성장인자들 및 사이토카인들을 분비한다. 분자, 예컨대, TGFβ, PDGF 또는 IL-13은 대식세포를 활성화시키고 상처 부위에서 섬유모세포의 동원, 증식 및 활성화를 유발한다. 활성화된 섬유모세포 또는 근섬유모세포는 α-평활근 액틴의 발현을 특징으로 하고 콜라겐 및 다른 ECM 성분을 분비한다. 활성화된 섬유모세포는 콜라겐 격자를 수축하여 상처의 가장자리를 중심 쪽으로 끌어당긴다. 상피세포 및 내피세포는 증식하고 일시적인 매트릭스 상에서 이동하여 손상된 조직을 재생시킴으로써 상처 회복을 완료한다.

영구적인 조직 손상 또는 상처, 또는 회복 경로의 이상조절은 부적절한 상처 반응을 유발한다. 콜라겐 및 ECM의 과도한 침착 및 과다 가교가 일어남으로써, 정상 조직 구조 대신에 흉터 조직의 과도한 형성 및 경화를 초래한다.

섬유성 질환의 원인은 관련된 장기 또는 조직에 의해 좌우될 수 있고 일부 질환들, 예컨대, 특발성 폐 섬유증(IPF)에서 공지되어 있지 않다. 간 섬유증 및 궁극적으로 경화증은 환경적 및 식이적 요인 또는 감염성 물질을 비롯한 다양한 요인들에의 노출을 통해 지속된 만성 간 손상으로부터 비롯된다. 장기간 B형 및 C형 간염 감염은 간 섬유증을 야기할 수 있다. 알코올 또는 높은 지방/당 식사의 지속된 과다소비도 간의 경화증을 유발할 수 있다. 유사하게, 당뇨병은 신장을 손상시키고 흉터를 형성하여 기능의 손실을 유발할 수 있다.

IPF는 원인이 공지되어 있지 않은 7종의 간질 폐 질환들 중 하나이다. 환경적 요인, 예컨대, 방사선 노출 또는 입자가 일정한 역할을 수행할 수 있다. 흡연하는 개체도 이 질환의 보다 더 높은 위험에 있다. 일단 진단되면, 환자의 수명은 평균 생존율이 2년 내지 5년일 정도로 매우 짧다.

섬유성 질환의 치료는 전형적으로 소염성 및 면역억제성 물질들을 포함하나, 이들은 환자에게 별로 이익이 되지 않는다. 이 치료 시 효능의 결여는 IPF 및 섬유성 질환을 일반적으로 염증 상태가 아니라 상처 치유에 대한 비정상적인 반응으로서 재고려하는 데에 기여하였다. 피르페니돈(Pirfenidone)은 2008년 일본 및 2011년 유럽에서 IPF의 치료에 사용되도록 승인되었고 다수의 작용 기작들을 통해 작용할 가능성이 높은 소분자 약물이다. 현재까지, 섬유증 징후에 대한 표적화된 요법 및 항체 요법은 승인되어 있지 않다.

따라서, 섬유성 질환의 개선된 치료를 위한 충족되지 않은 의학적 필요성이 현재 존재한다. 예를 들면, IPF의 경우 3년 생존율은 50%이고 5년 생존율은 단지 20%이고 약 20%의 사례들에서 이식이 요구된다.

한 양태에서, 중쇄를 포함하는 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이 제공되는데, 이때 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1을 위해 서열 번호 4에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-H2를 위해 서열 번호 5에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함하고, 예를 들면, 이때 CDR-H1은 서열 번호 4이고, CDR-H2는 서열 번호 5이고, CDR-H3은 서열 번호 6이다.

한 양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 결합 단편은 경쇄를 포함하는데, 이때 상기 경쇄의 가변 도메인은 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함하고, 예를 들면, 이때 CDR-L1은 서열 번호 1이고, CDR-L2는 서열 번호 2이고, CDR-L3은 서열 번호 3이다.

본 개시내용의 항체는 CSF-1R에 대한 높은 친화성을 갖고, 리간드와 CSF-1R의 결합을 차단할 수 있고, CSF-1R을 불활성화시키고 CSF-1R의 내재화를 야기하지 않는다.

또한, 본 개시내용은 본원에 기재된 항체 또는 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA까지 확장된다.

상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포도 제공된다.

항체 또는 이의 결합 단편을 발현시키는 방법도 본원에서 제공된다.

또한, 본 개시내용은 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 치료 유효량의 본원에 기재된 항체, 단편 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법이 제공된다.

또한, 본 개시내용은 치료, 특히 암 및/또는 섬유성 질환의 치료에 사용되기 위한 본 개시내용에 따른 항체, 결합 단편 또는 조성물까지 확장된다.

본 발명은 하기 도면을 참조하는 하기 실시예에서 단지 예시로 더 기재된다.
도 1a 내지 1f는 특정 아미노산 서열들 및 폴리뉴클레오티드 서열들을 보여준다.
도 2a 및 2b는 특정 서열들의 정렬을 보여준다.
도 3은 세포를 형질감염시키는 데에 사용되었고 세포의 표면 상에서 단백질을 발현하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 인간 CSF-1R 세포외 도메인의 서열을 보여준다. 그 다음, 이 세포는 숙주 동물을 면역화시키는 데에 사용되었다.
도 4는 CSF-1과 THP-1 세포의 결합이 항체 Ab969에 의해 억제되는 것을 보여준다.
도 5a는 CSF-1에 의해 유발된 일차 인간 단핵구에 의한 생존 및 증식이 항체 Ab969에 의해 억제되는 것을 보여준다.
도 5b는 IL-34에 의해 유발된 일차 인간 단핵구에 의한 생존 및 증식이 항체 Ab969에 의해 억제되는 것을 보여준다.
도 6은 CSF-1에 의해 유발된 일차 뮤린 단핵구에 의한 생존 및 증식이 항체 Ab535에 의해 억제되는 것을 보여준다.
도 7은 Ab969, 인간 CSF-1 및 동종형(isotype) 대조군과 함께 항온처리된 THP-1 세포 상의 세포 표면 CSF-1R의 수준을 보여준다.
도 8은 동종형 대조군에 비해 Ab969로 처리된 THP-1 세포 상의 세포 표면 CSF-1R의 상대적 수준을 보여준다.
도 9는 Ab535, CSF-1 및 동종형 대조군과 함께 항온처리된 RAW264.7 세포 상의 세포 표면 CSF-1R의 수준을 보여준다.
도 10은 동종형 대조군에 비해 Ab535로 처리된 RAW264.7 세포 상의 세포 표면 CSF-1R의 상대적 수준을 보여준다.
도 11은 CSF-1을 사용한 자극 또는 Ab969를 사용한 처리 시 CSF-R로 형질감염된 HEK293F 세포 상의 CSF-1R 인산화의 수준을 보여준다.
도 12는 Ab969 및 CSF-1과 함께 항온처리되었을 때 일차 인간 단핵구로부터의 MCP-1 분비의 수준을 보여준다.
도 13은 인간화된 항체 969.g5에 의한 CSF-1-매개된 단핵구 생존의 억제에 대한 영향을 키메라 Ab969.g0과 비교하여 보여준다.
도 14는 Ab969의 다양한 인간화된 항체 이식편들(grafts)에 의한 CSF-1-매개된 단핵구 생존의 억제에 대한 영향을 보여준다.
도 15a는 단회 정맥내 용량의 7 mg/kg Ab969.g2로 치료받은 사이노몰구스(cynomolgus) 원숭이로부터 채취된 혈청 샘플에서 CSF-1의 농도를 보여준다.
도 15b는 단회 정맥내 용량의 1.5 mg/kg Ab969.g2로 치료받은 사이노몰구스 원숭이로부터 채취된 혈청 샘플에서 CSF-1의 농도를 보여준다.
도 15c는 7 mg/kg 및 1.5 mg/kg의 용량으로 항체 Ab969.g2를 사이노몰구스 원숭이에게 투여한 것이 상이한 시점에서 순환 비고전적 단핵구에 미치는 영향을 보여준다.
도 16은 인간 유방암 이종이식편 MCF-7의 피하 이식편을 보유하는 면역결핍 누드 마우스에서 항체 Ab535 대 대조군 항체, 양성 대조군 및 비히클 대조군의 항종양 효과를 보여준다.
도 17은 정위(orthotopic) 전립선암 모델 PC-3에서 항체 Ab535 대 대조군 항체, 양성 대조군 및 비히클 대조군의 항종양 효과를 보여준다.
도 18a는 Ab535를 사용한 블레오마이신(bleomycin)-유도된 폐 섬유증의 치료가 BALF 콜라겐 농도에 미치는 영향을 동종형 대조군과 비교하여 보여준다.
도 18b는 Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 폐 샘플의 섬유증 병상에 미치는 영향(애쉬크로프트(Ashcroft) 점수에 의해 측정됨)을 동종형 대조군과 비교하여 보여준다.
도 18c는 Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 혈청 중의 알부민의 농도에 미치는 영향을 동종형 대조군과 비교하여 보여준다.
도 18d는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 연구로부터의 마우스의 BAL 유체에서 대식세포의 수를 보여주고, Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 동종형 대조군으로 치료된 동물에 비해 BAL 유체에서 대식세포의 수를 감소시켰다는 것을 보여준다. 평균 ± SEM으로서 나타낸 데이터: *는 식염수 동종형과의 유의한 차이를 표시하고; #는 동종형 대조군 항체를 투약받은 블레오마이신-처리된 마우스와의 유의한 차이를 표시한다(p ≤ 0.05).
도 19는 식염수 대조군, 블레오마이신 + 동종형 대조군 및 블레오마이신 + Ab535로 치료받은 동물로부터 수득된 폐의 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다.
도 20a는 Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 BALF 콜라겐 농도에 미치는 영향을 동종형 대조군을 사용한 치료와 비교하여 보여준다.
도 20b는 Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 폐 샘플의 섬유증 병상에 미치는 영향(애쉬크로프트 점수에 의해 측정됨)을 동종형 대조군을 사용한 치료와 비교하여 보여준다.
도 20c는 Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 혈청 중의 알부민의 농도에 미치는 영향을 동종형 대조군을 사용한 치료와 비교하여 보여준다.
도 20d는 폐 섬유증의 ADA 결핍 모델로부터의 마우스의 BAL 유체에서 대식세포의 수를 보여주고, Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 BAL 유체에서 대식세포의 수를 감소시켰다는 것을 보여준다.
도 21은 둘 다 동종형 대조군 또는 Ab535로 치료받은 정상 마우스(ADA+) 및 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스(ADA-)로부터 수득된 폐의 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다.

한 실시양태에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 리간드와 CSF-1R의 결합을 차단할 수 있다. 본원에서 사용된 "차단"은 물리적 차단, 예컨대, 수용체의 폐색을 지칭하나, 항체 또는 단편이 에피토프에 결합하여, 예를 들면, 입체구조적 변화를 야기하는 경우도 포함할 것이고, 이것은 천연 리간드가 수용체에 더 이상 결합하지 못한다는 것(본원에서 알로스테릭(allosteric) 차단 또는 알로스테릭 억제로서 지칭됨)을 의미한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 CSF-1R의 모든 동종형들, 예를 들면, ECD 도메인에서 변이, 예컨대, V23G, A245S, H247P, V279M, 및 상기 변이들 중 2개, 3개 또는 4개의 변이들의 조합물을 가진 동종형에 결합한다.

CSF-1R을 차단하는 항체의 능력을 측정하기에 적합한 분석은 본원의 실시예에 기재되어 있다. CSF-1 및 IL-34는 둘 다 CSF-1R에 대한 리간드이고, 본 발명의 항체는 바람직하게는 기능 세포 스크린에서 CSF-1 및 IL-34 둘 다의 활성을 억제한다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 CSF-1R 활성화 및/또는 CSF-1R 내재화를 야기하지 않는다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 생체내에서 단핵구의 비고전적 집단을 선택적으로 고갈시킨다.

비고전적 단핵구는 일반적으로 CD14의 낮은 발현 및 CD16의 높은 발현을 가진 단핵구를 지칭한다. 단핵구의 이 집단은 종양 관련 대식세포의 전구체인 것으로 생각된다.

본 발명의 항체 분자는 적합하게는 높은 결합 친화성을 가진다. 친화성은 단리된 천연 또는 재조합 CSF-1R 또는 적합한 융합 단백질/폴리펩티드를 사용하면서 기법, 예컨대, 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 표면 플라스몬 공명, 예를 들면, 비아코어(BIAcore)를 비롯한 당분야에서 공지된 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다. 한 예에서, 친화성은 본원의 실시예에 기재된 바와 같은 재조합 인간 CSF-1R 세포외 도메인을 사용함으로써 측정된다. 한 예에서, 사용된 재조합 인간 CSF-1R 세포외 도메인은 단량체이다. 적합하게는, 본 발명의 항체 분자는 단리된 인간 CSF-1R에 대한 약 1 nM 이하의 결합 친화성을 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 500 pM 이하의 결합 친화성을 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 250 pM 이하의 결합 친화성을 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체 분자는 약 200 pM 이하의 결합 친화성을 가진다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 100 pM 이하의 결합 친화성을 가진 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 100 pM 이하, 바람직하게는 약 10 pM 이하, 보다 바람직하게는 약 5 pM 이하의 결합 친화성을 가진 인간화된 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 약 100 pM 이하, 바람직하게는 약 10 pM 이하, 보다 바람직하게는 약 5 pM 이하의 결합 친화성을 가진 인간화된 항-CSF-1R 항체를 제공한다.

친화성의 수치 값이 낮을수록 항원에 대한 항체 또는 단편의 친화성이 높아진다.

본원에서 사용된 인간 CSF-1R은 예를 들면, 서열 번호 39에 제공된 또는 번호 P07333 하에 유니프롯(UniProt)에 등록된 인간 단백질 명칭 CSF-1R 또는 이의 생물학적 활성 단편을 지칭한다. 물론, 발현된 성숙 단백질은 신호 서열이 번역 후 절단되기 때문에 신호 서열을 포함하지 않는다.

본 발명자들은 인간화된 항체를 비롯한 신규 항-CSF-1R 항체를 제공한다. 상기 항체는 CSF-1R 세포외 도메인을 발현하는 벡터로 형질감염된 래트 섬유모세포를 사용한 래트의 면역화로부터 생성되었다. 항체의 인간 CSF-1R 결합에 대한 상청액의 일차 스크리닝은 항-CSF-1R 활성을 가진 항체를 함유하는 대략 1000개의 웰들을 확인하였다. 인간 CSF-1과 인간 CSF-1R의 결합을 방해할 수 있는 항체에 대한 이차 스크리닝은 88개의 양성 웰들을 확인하였다. 일차 인간 단핵구의 CSF-1 의존적 생존을 방해할 수 있는 항체에 대한 삼차 스크리닝은 18개의 양성 웰들을 확인하였다. 이 18개의 양성 웰들의 가변 영역을 클로닝하였는데, 이것은 14개 항체들의 성공적인 클로닝 및 후속 발현을 유발하여, 충분한 수준으로 발현되었고 CSF-1 결합을 억제할 수 있었던 9개의 키메라 항-CSF-1R 항체들을 제공하였다. 이 9개의 항체들을 서열결정하였고 이들이 모두 독특한 서열들을 가진다는 것을 발견하였고 추가 연구를 위해 이들을 사용하였다.

9개의 항-CSF-1R 키메라 항체들을 리간드 차단 활성, 및 CSF-1 및 IL-34에 의해 매개된 단핵구 생존을 억제하는 능력에 대해 평가하였다. 상기 항체들 중 4개의 항체들은 CSF-1 결합의 완전한 억제 및 단핵구 생존의 높은 수준의 억제를 나타내었기 때문에 추가 연구를 위해 이들에게 우선순위를 매겼다. 이 4개의 항-CSF-1R 키메라 항체들을, 친화성을 평가하기 위한 다수의 시험관내 분석들에서의 그들의 활성, CSF-1 결합의 억제, 붉은털(rhesus) 원숭이, 사이노몰구스 원숭이 및 개 CSF-1R과의 교차반응성, CSF-1R 내재화 및 CSF-1R 활성화에 대해 시험하였다. 또한, 상기 4개의 항-CSF-1R 항체들을 인간화하였고 인간화된 이식편의 친화성을 측정하였다. 항-CSF-1R 항체들 중 2개의 항-CSF-1R 항체들의 인간화는 키메라 모항체와 동등한 친화성(K_D), 및 적합한 열안정성을 가진 항체를 시사하는 Tm을 가진 전체 인간화된 항체(래트 공여자 잔기가 존재하지 않음)를 생성하였다. 대조적으로, 다른 2개의 인간화된 항-CSF-1R 항체들은 키메라 항체에 비해 CSF-1R에 대한 감소된 친화성을 가졌고 Tm은 더 낮았다. 이러한 이유로, 추가 분석을 위해 친화성을 보유하는 항체들 중 2개의 항체들의 전체 인간화된 이식편만을 보다 더 큰 규모로 발현시켰다.

이 2개의 항체들의 전체 인간화된 이식편의 추가 분석인 MCP-1 억제 분석을 수행하였는데, 이때 CSF-1 결합을 차단하는 항체에 의한 CSF-1R 신호전달의 억제가 MCP-1 분비 수준의 감소를 야기하였다. 이 분석은 놀랍게도 전체 인간화된 이식편이 키메라 항체에 비해 감소된 활성을 나타내었다는 것을 보여주었다. Ab969로서 명명된, 바람직한 항체들 중 한 항체에 대한 일련의 실험들을 수행하여 전체 인간화된 이식편이 이 감소된 활성을 나타낸 이유를 밝혔다. Ab969의 다수의 중간 인간화된 이식편들을 생성하고 MCP-1 억제 분석에서 시험하였다. 가변 경쇄 공여자 잔기 Y71을 함유하는 이식편은 일반적으로 MCP-1 억제 분석에서 키메라 Ab969의 활성에 필적할만한 활성을 보였다는 것을 발견하였다. MCP-1 억제 분석에서 다양한 항체 이식편들의 활성에서의 이 차이는 키메라 Ab969에 비해 항체 결합 속도의 변화(감소된 K_a)에 기인한다는 가설을 세웠다.

Ab969와 다른 항-CSF-1R 항체, 예를 들면, 항-CSF-1R 항체 Ab970의 열안정성 분석의 비교는 Ab969가 더 안정할 수 있다는 것을 암시한다.

Ab969의 인간화된 이식편의 추가 생물리학적 분석은 항체가 농축되었을 때 일부 이식편들이 참여하였다는 것을 보여주었다. 경쇄의 위치 38에서 예를 들면, 글루타민에 의한 라이신 잔기의 치환은 개선된 물리적 안정성을 유발할 수 있다는 것을 밝혔다.

따라서, 추가 시험관내 특징규명 연구를 위해 Ab969의 한 항체 이식편인 Ab969.g2(Ab969로서도 지칭됨)를 선택하였다. CSF-1R에 대한 유리한 높은 결합 친화성, 높은 열안정성 및 높은 물리적 안정성 이외에, 항체는 IL-34 의존적 단핵구 활성화의 우수한 억제를 나타내었고, CSF-1R의 SNP 변이체에 결합할 수 있다는 것도 발견되었다. Ab969.g2는 사이노몰구스 원숭이에서의 약력학적 마커 분석에도 사용되었는데, 이때 Ab969.g2는 CSF-1R에 결합하고 CSF-1 결합을 차단하고 종양 관련 대식세포의 전구체 세포인 생체내 사이노몰구스 원숭이 단핵구의 비고전적 집단을 선택적으로 고갈시킨다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 항-CSF-1R 항체 969.2로부터 유래된 하나 이상의 CDR을 포함하는 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.

Ab969.2는 전장 인간화된 IgG4 분자이고; 경쇄는 인간 카파 쇄 불변 영역(Km3 동종이인자형(allotype))을 포함하고, 중쇄는 힌지 안정화 돌연변이 S241P(Angal et al., 1993)를 가진 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 포함한다. 잠재적 DG 이성질체화 모티프는 CDR-L2와 골격(framework)의 연접부에서 경쇄 불변 영역 내에 존재한다. Ab969.2 전체 항체 중쇄 및 경쇄의 서열은 서열 번호 27 및 19에 표시되어 있다.

항체 가변 도메인 내의 잔기는 통상적으로 카바트와 그의 동료들(Kabat et al., 1987)에 의해 고안된 시스템에 따라 넘버링된다. 이 시스템은 문헌(Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA)(이하, "(상기) 문헌(Kabat et al.))에 기재되어 있다. 이 넘버링 시스템은 달리 표시되어 있는 경우를 제외하고 본 명세서에서 사용된다.

카바트 잔기 표기는 아미노산 잔기의 선형 넘버링에 항상 직접적으로 상응하지는 않는다. 실제 선형 아미노산 서열은 엄격한 카바트 넘버링에서의 아미노산 수보다 더 적은 또는 더 많은 아미노산을 함유할 수 있는데, 이러한 더 적은 또는 더 많은 아미노산의 함유는 기본 가변 도메인 구조의 골격 또는 상보성 결정 영역(CDR)인 구조적 구성요소의 단축 또는 이러한 구조적 구성요소 내로의 삽입에 상응한다. 항체의 서열 내의 상동성 잔기들을 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 정렬시킴으로써 주어진 항체에 대해 잔기의 정확한 카바트 넘버링을 결정할 수 있다.

중쇄 가변 도메인의 CDR들은 카바트 넘버링 시스템에 따르면 잔기 31-35(CDR-H1), 잔기 50-65(CDR-H2) 및 잔기 95-102(CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 초티아(Chothia)(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 해당하는 루프는 잔기 26부터 잔기 32까지 확장되어 있다. 따라서, 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 시스템과 초티아의 위상 루프 정의의 조합에 의해 기재된 바와 같이 잔기 26-35를 지칭하기 위한 것이다.

경쇄 가변 도메인의 CDR들은 카바트 넘버링 시스템에 따르면 잔기 24-34(CDR-L1), 잔기 50-56(CDR-L2) 및 잔기 89-97(CDR-L3)에 위치한다.

본 개시내용에서 사용될 항체는 당분야에서 공지된 임의의 적합한 방법을 이용함으로써 수득될 수 있다. 융합 단백질을 비롯한 CSF-1R 폴리펩티드/단백질을 (재조합적으로 또는 천연적으로) 발현하는 세포를 사용하여 CSF-1R을 특이적으로 인식하는 항체를 생성할 수 있다. 상기 폴리펩티드는 '성숙' 폴리펩티드 또는 이의 생물학적 활성 단편 또는 유도체일 수 있다. 인간 단백질은 번호 P07333 하에 유니프롯에 등록되어 있다.

숙주를 면역화시키는 데에 사용될 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전학적으로 조작된 숙주 세포로부터 당분야에서 잘 공지된 과정에 의해 제조될 수 있거나, 천연 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본원에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 이들은 상호교환적으로 사용된다. CSF-1R 폴리펩티드는 일부 경우 보다 더 큰 단백질, 예컨대, 융합 단백질, 예를 들면, 친화성 태그 또는 유사한 물질에 융합된 단백질의 일부일 수 있다.

CSF-1R 폴리펩티드에 대해 생성된 항체는 수득될 수 있는데, 이때 잘 공지된 상용적인 프로토콜을 이용하여 상기 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 비인간 동물에게 투여함으로써 동물을 면역화할 필요가 있다(예를 들면, 문헌(Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986) 참조). 많은 온혈 동물들, 예컨대, 토끼, 마우스, 래트, 양, 소, 낙타 또는 돼지가 면역화될 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 가장 적합하다.

단일클론 항체는 당분야에서 공지된 임의의 방법, 예컨대, 하이브리도마 기법(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마(trioma) 기법, 인간 B 세포 하이브리도마 기법(Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc.)에 의해 제조될 수 있다.

항체는 특정 항체의 제조를 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝하고 발현시키는 단일 림프구 항체 방법, 예를 들면, 문헌(Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848); 및 국제 특허출원 공보 제WO92/02551호, 제WO04/051268호 및 제WO04/106377호에 기재된 방법을 이용함으로써 생성될 수도 있다.

항체에 대한 스크리닝은 인간 CSF-1R과의 결합을 측정하기 위한 분석 및/또는 리간드와 상기 수용체의 결합을 차단하는 능력을 측정하기 위한 분석을 이용함으로써 수행될 수 있다. 적합한 분석의 예는 본원의 실시예에 기재되어 있다.

본원에서 사용된 "특이적"은 그 자신에 특이적인 항원만을 인식하는 항체, 또는 그 자신에 비특이적인 항원과의 결합에 비해 그 자신에 특이적인 항원에 대한 유의하게 더 높은 결합 친화성, 예를 들면, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 이상 더 높은 결합 친화성을 가진 항체를 지칭하기 위한 것이다.

본 개시내용에 따른 특정 항체들의 아미노산 서열들 및 폴리뉴클레오티드 서열들은 도 1 및 2에 제공되어 있다.

본 발명의 한 양태에서, 항체는 중쇄를 포함하는 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이고, 이때 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1을 위해 서열 번호 4에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-H2를 위해 서열 번호 5에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 상기 중쇄의 가변 도메인은 CDR-H1을 위해 서열 번호 4에 제공된 서열, CDR-H2를 위해 서열 번호 5에 제공된 서열 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 서열을 포함한다.

본 발명의 제2 양태에서, 항체는 경쇄를 포함하는 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이고, 이때 상기 경쇄의 가변 도메인은 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 바람직하게는, 상기 경쇄의 가변 도메인은 CDR-H1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열, CDR-H2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 본 발명의 항체는 상기 정의된 중쇄를 포함하고 추가로 경쇄를 포함하는 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이고, 이때 상기 경쇄의 가변 도메인은 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함한다. 상기 경쇄의 가변 도메인은 바람직하게는 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 포함한다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산은 독립적으로

CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 어느 하나;

조합물 CDR-H1 및 H2, CDR-H1 및 H3, CDR-H1 및 L1, CDR-H1 및 L2, CDR-H1 및 L3, CDR-H2 및 H3, CDR-H2 및 L1, CDR-H2 및 L2, CDR-H2 및 L3, CDR-H3 및 L1, CDR-H3 및 L2, CDR-H3 및 L3, CDR-L1 및 L2, CDR-L1 및 L3, 및 CDR-L2 및 L3 중 어느 하나;

CDR-H1, H2 및 H3, CDR-H1, H2 및 L1, CDR-H1, H2 및 L2, CDR-H1, H2 및 L3, CDR-H2, H3 및 L1, CDR-H2, H3 및 L2, CDR-H2, H3 및 L3, CDR-H3, L1 및 L2, CDR-H3, L1 및 L3, 및 CDR-L1, L2 및 L3;

조합물 CDR-H1, H2, H3 및 L1, CDR-H1, H2, H3 및 L2, CDR-H1, H2, H3 및 L3, CDR-H2, H3, L1 및 L2, CDR-H2, H3, L2 및 L3, CDR-H3, L1, L2 및 L3, CDR-L1, L2, L3 및 H1, CDR-L1, L2, L3 및 H2, CDR-L1, L2, L3 및 H3, 및 CDR-L2, L3, H1 및 H2 중 어느 하나;

CDR-H1, H2, H3, L1 및 L2, CDR-H1, H2, H3, L1 및 L3, CDR-H1, H2, H3, L2 및 L3, CDR-L1, L2, L3, H1 및 H2, CDR-L1, L2, L3, H1 및 H3, 및 CDR-L1, L2, L3, H2 및 H3; 및

조합물 CDR-H1, H2, H3, L1, L2 및 L3

으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 CDR들에서 보존적 치환으로 대체된다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 중쇄의 도메인은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 가진 서열을 포함하는데, 예를 들면, 이때 상기 치환은 골격에 존재한다.

한 실시양태에서, 중쇄 가변 영역의 골격은 삽입된, 결실된 또는 치환된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 치환된 아미노산은 공여자 항체로부터의 상응하는 아미노산이다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 경쇄 가변 영역은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 보존적 아미노산 치환을 가진 서열을 포함하는데, 예를 들면, 이때 상기 치환은 골격에 존재한다.

한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 골격은 삽입된, 결실된 또는 치환된 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산, 또는 이들의 조합물을 포함한다. 한 실시양태에서, 치환된 아미노산은 공여자 항체로부터의 상응하는 아미노산이다.

본 발명의 한 양태에서, 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이 제공되는데, 이때 중쇄의 가변 도메인은 3개의 CDR들을 포함하고, CDR-H1의 서열은 서열 번호 4에 제공된 서열과 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-H2의 서열은 서열 번호 5에 제공된 서열과 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-H3의 서열은 서열 번호 6에 제공된 서열과 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 가진다. 바람직하게는, 경쇄를 추가로 포함하는 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이 제공되는데, 이때 상기 경쇄의 가변 도메인은 3개의 CDR들을 포함하고, CDR-L1의 서열은 서열 번호 1에 제공된 서열과 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-L2의 서열은 서열 번호 2에 제공된 서열과 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-L3의 서열은 서열 번호 3에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 가진다.

한 실시양태에서, 본원에 개시된 가변 영역 서열과 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 가진 가변 영역이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, CSF-1R 수용체, 바람직하게는 CSF-1R 수용체의 세포외 도메인, 보다 구체적으로 서열 번호 35, 36, 37, 38 및/또는 39, 또는 유니프롯 데이터베이스 입력 P07333의 서열의 CSF-1R 수용체, 특히 서열 번호 36의 CSF-1R 수용체의 세포외 도메인 또는 유니프롯 데이터베이스 입력 P07333에 개시된 세포외 도메인의 498개 아미노산(P07333의 아미노산 20부터 517까지)과의 결합에 대해 본 발명의 항체 또는 단편의 결합과 경쟁하는 항-CSF-1R 항체가 제공된다.

한 실시양태에서, CDR-L1을 위해 서열 번호 1, CDR-L2를 위해 서열 번호 2, CDR-L3을 위해 서열 번호 3, CDR-H1을 위해 서열 번호 4, CDR-H2를 위해 서열 번호 5 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 6개의 CDR들을 포함하는 항체의 결합을 예를 들면, 100 pM 이하의 친화성으로 교차차단하는 항-CSF-1R 항체가 제공되는데, 특히 이때 교차차단은 알로스테릭 교차차단이다.

또 다른 실시양태에서, CSF-1 및/또는 IL-34와 CSF-1R 수용체의 세포외 도메인의 결합을 억제하거나 이러한 결합과 중복되는 결합을 가진 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다.

한 실시양태에서, CDR-L1을 위해 서열 번호 1, CDR-L2를 위해 서열 번호 2, CDR-L3을 위해 서열 번호 3, CDR-H1을 위해 서열 번호 4, CDR-H2를 위해 서열 번호 5 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 6개의 CDR들을 포함하는 항체의 결합을 예를 들면, 100 pM 이하의 친화성으로 교차차단하는 항-CSF-1R 항체가 제공되는데, 특히 이때 상기 항체는 그 자신이 차단하는 항체와 동일한 에피토프에 결합함으로써 상기 결합을 교차차단한다.

한 실시양태에서, 항체 서열의 C-말단 잔기, 예를 들면, 중쇄 서열의 C-말단 잔기, 예를 들면, 말단 라이신이 절단되어 있는 항체 또는 이의 결합 단편이 제공된다. 한 실시양태에서, 아미노산은 본원에 개시된 서열로부터 절단된다. 일반적으로, 절단은 발현된 항체 또는 결합 단편의 번역 후 변형(변경)으로부터 비롯된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 또는 하기 실시양태들 중 임의의 실시양태의 항-CSF-1R 항체로서, 서열 번호 27 또는 서열 번호 29에 제공된 중쇄 서열의 C-말단 라이신이 누락되어 있거나 결실되어 있는 항-CSF-1R 항체가 제공된다. C-말단 라이신, 예를 들면, 서열 번호 27의 위치 453 또는 서열 번호 30의 위치 472의 누락 또는 결실은 예를 들면, 말단 라이신을 코딩하지 않으면서 발현 시스템에서 항-CSF-1R 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, C-말단 잔기, 예컨대, 라이신의 결실은 번역 후 변형으로서 수행될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명에 따른 항체 또는 결합 단편은 인간화된다.

본원에서 사용된 용어 "인간화된 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용자 항체(예를 들면, 인간 항체)의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역 골격 내로 이식된, 공여자 항체(예를 들면, 뮤린 단일클론 항체)로부터의 하나 이상의 CDR들(필요에 따라 하나 이상의 변경된 CDR들을 포함함)을 함유하는 항체 또는 항체 분자를 지칭한다(예를 들면, 미국 특허 제5,585,089호 및 국제 특허출원 공보 제WO91/09967호 참조). 검토를 위해서는 문헌(Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998)을 참조한다. 한 실시양태에서, 전체 CDR이 전달되기보다는 오히려 상기 본원에 기재된 CDR들 중 어느 하나로부터의 특이성 결정 잔기들 중 하나 이상만이 인간 항체 골격에게 전달된다(예를 들면, 문헌(Kashmiri et al., 2005, Methods, 36:25-34) 참조). 한 실시양태에서, 본원에 기재된 CDR들 중 하나 이상으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 골격에게 전달된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 본원에 기재된 CDR들 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 인간 항체 골격에게 전달된다. CDR들 또는 특이성 결정 잔기들을 이식할 때, CDR들이 유래된 공여자 항체(마우스, 영장류 및 인간 골격 영역을 포함함)의 부류/유형을 유념하면서 임의의 적절한 수용자 가변 영역 골격 서열을 사용할 수 있다.

적절하게는, 본 발명에 따른 인간화된 항체는 본원에서 구체적으로 제공된 CDR들 중 하나 이상뿐만 아니라 인간 수용자 골격 영역도 포함하는 가변 도메인을 가진다. 따라서, 한 실시양태에서, 인간 CSF-1R에 결합하는 인간화된 항체가 제공되는데, 이때 가변 도메인은 인간 수용자 골격 영역 및 비인간 공여자 CDR들을 포함한다.

본 발명에서 사용될 수 있는 인간 골격의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(상기 문헌(Kabat et al.)). 예를 들면, KOL 및 NEWM은 중쇄를 위해 사용될 수 있고, REI는 경쇄를 위해 사용될 수 있고, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 다를 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 인간 생식세포계열(germline) 서열이 사용될 수 있고; 이들은 웹사이트(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)에서 입수될 수 있다.

본 발명의 인간화된 항체에서, 수용자 중쇄 및 경쇄는 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없고, 필요에 따라 상이한 쇄들로부터 유래된 골격 영역들을 가진 복합 쇄들을 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 인간 골격은 1개, 2개, 3개 또는 4개의 아미노산 치환, 추가 또는 결실, 예를 들면, 공여자 잔기의 1개, 2개, 3개 또는 4개의 보존적 치환 또는 치환을 포함한다.

한 실시양태에서, 인간 골격으로서 사용된 서열은 본원에 개시된 서열과 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 유사하거나 동일하다.

본 발명의 인간화된 항체의 중쇄를 위한 하나의 이러한 적합한 골격 영역은 JH3 J-영역과 함께 인간 하위군 VH2 서열 3-1 2-70으로부터 유래된다(서열 번호 33).

따라서, 한 예에서, CDR-H1을 위해 서열 번호 4에 제공된 서열, CDR-H2를 위해 서열 번호 5에 제공된 서열 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 서열을 포함하는 인간화된 항체가 제공되는데, 이때 중쇄 골격 영역은 JH4와 함께 인간 하위군 VH3 서열 1-3 3-07로부터 유래된다.

한 예에서, 항체의 중쇄 가변 도메인은 서열 번호 23에 제공된 서열을 포함한다.

본 발명의 인간화된 항체의 경쇄를 위한 적합한 골격 영역은 JK4 J-영역과 함께 인간 생식세포계열 하위군 VK1 2-1-(1) O12로부터 유래된다(서열 번호 31).

따라서, 한 예에서, CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 포함하는 인간화된 항체가 제공되는데, 이때 경쇄 골격 영역은 인간 하위군 VK1 2-1-(1) O12 + JK4 J-영역으로부터 유래된다.

한 예에서, 항체의 경쇄 가변 도메인은 서열 번호 15에 제공된 서열을 포함한다.

본 발명의 인간화된 항체에서, 골격 영역은 수용자 항체의 서열과 정확히 동일한 서열을 가질 필요는 없다. 예를 들면, 희귀 잔기는 그 수용자 쇄 부류 또는 유형에 대해 더 빈번하게 존재하는 잔기로 변화될 수 있다. 대안적으로, 수용자 골격 영역 내의 선택된 잔기들은 이들이 공여자 항체 내의 동일한 위치에서 발견된 잔기에 상응하도록 변화될 수 있다(문헌(Reichmann et al., 1998, Nature, 332:323-324) 참조). 이러한 변화는 공여자 항체의 친화성을 회복하기 위해 필요한 최소한의 수준으로 유지되어야 한다. 변화될 필요가 있을 수 있는 수용자 골격 영역 내의 잔기를 선택하기 위한 프로토콜은 국제 특허출원 공보 제WO91/09967호에 기재되어 있다.

따라서, 한 예에서, 적어도 중쇄의 가변 도메인의 위치 78에 존재하는 잔기가 공여자 잔기인 인간화된 항체가 제공된다(카바트 넘버링). 한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인의 잔기 78은 알라닌으로 대체된다.

본원에서 사용된 "공여자 잔기"는 CDR들을 공여하는 비인간 항체(예를 들면, 뮤린 항체)로부터의 잔기를 지칭한다.

한 실시양태에서, 중쇄 가변 도메인이 임의의 공여자 잔기를 함유하지 않는 인간화된 항체가 제공된다.

따라서, 한 예에서, 경쇄의 가변 도메인의 위치 38, 71 및 87에 존재하는 잔기들 중 하나 이상이 공여자 잔기인 인간화된 항체가 제공된다(카바트 넘버링). 한 실시양태에서, 경쇄의 가변 도메인의 위치 38, 71 및 87에 존재하는 잔기들로부터 선택된 잔기들 중 하나는 공여자 잔기이다(카바트 넘버링). 한 실시양태에서, 경쇄의 가변 도메인의 위치 38, 71 및 87에 존재하는 잔기들로부터 선택된 2개의 잔기들, 예를 들면, 위치 38 및 71, 위치 38 및 87, 또는 위치 71 및 87에 존재하는 잔기들은 공여자 잔기들이다(카바트 넘버링). 한 실시양태에서, 경쇄의 가변 도메인의 위치 38, 71 및 87에 존재하는 3개의 잔기들은 공여자 잔기들이다(카바트 넘버링).

한 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 38은 라이신으로 대체된다. 대안적 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 38은 글루타민으로 대체된다.

한 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 71은 티로신으로 대체된다.

한 실시양태에서, 경쇄 가변 도메인의 잔기 87은 페닐알라닌으로 대체된다.

한 실시양태에서, 경쇄 가변 영역의 잔기 71만이 공여자 잔기, 바람직하게는 티로신인 인간화된 항체가 제공된다.

특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 번호 23에 제공된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 15에 제공된 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편을 제공한다.

본 발명의 추가 양태에서, CSF-1R, 바람직하게는 CSF-1R의 세포외 도메인, 가장 바람직하게는 인간 CSF-1R의 세포외 도메인에 결합하는 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편이 제공되는데, 이때 상기 항체 또는 결합 단편은 서열 번호 15의 경쇄 가변 도메인 및 서열 번호 23의 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 바람직하게는 상기 항체 또는 이의 결합 단편은 단일클론 항체이거나, IgG1, IgG2 또는 IgG4 유형의 항체이거나, Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')₂, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들면, VH, VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody)이다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 서열과 80% 유사하거나 동일한, 예를 들면, 관련 서열의 일부 또는 전체에 걸쳐 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 유사하거나 동일한 항체 서열을 제공한다. 한 실시양태에서, 관련 서열은 서열 번호 15이다. 한 실시양태에서, 관련 서열은 서열 번호 23이다.

본원에서 사용된 "동일성"은 정렬된 서열들에서 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 상기 서열들 사이에 동일하다는 것을 표시한다. 본원에서 사용된 "유사성"은 정렬된 서열들에서 임의의 특정 위치에서 아미노산 잔기가 상기 서열들 사이에 유사한 유형의 아미노산 잔기라는 것을 표시한다. 예를 들면, 이소류신 또는 발린을 류신으로 치환할 수 있다. 종종 서로 치환될 수 있는 다른 아미노산들은 하기 아미노산들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다:

- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판(방향족 측쇄를 가진 아미노산);

- 라이신, 아르기닌 및 히스티딘(염기성 측쇄를 가진 아미노산);

- 아스파르테이트 및 글루타메이트(산성 측쇄를 가진 아미노산);

- 아스파라긴 및 글루타민(아미드 측쇄를 가진 아미노산); 및

- 시스테인 및 메티오닌(황 함유 측쇄를 가진 아미노산). 동일성 및 유사성의 정도는 용이하게 계산될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, the BLAST™ software available from NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656).

본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 가진 완전한 항체 분자 또는 이의 결합 단편을 포함할 수 있고 Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')₂, Fv, 단일 도메인 항체(예를 들면, VH, VL 또는 VHH), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, 비스-scFv, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 및 상기 분자들 중 임의의 분자의 에피토프 결합 단편일 수 있으나 이들로 한정되지 않는다(예를 들면, 문헌(Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136) 및 문헌(Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217) 참조). 이 항체 단편들을 생성하고 제조하는 방법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(예를 들면, 문헌(Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216:165-181) 참조). 본 발명에서 사용될 다른 항체 단편은 국제 특허출원 공보 제WO05/003169호, 제WO05/003170호 및 제WO05/003171호에 기재된 Fab 및 Fab' 단편을 포함한다. 다가 항체는 다중 특이성, 예를 들면, 이중특이성 항체를 포함할 수 있거나 단일특이성 항체일 수 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO92/22853호, 제WO05/113605호, 제WO2009/040562호 및 제WO2010/035012호 참조).

본원에서 사용된 "항체의 결합 단편"은 단편을 항원에 특이적인 단편으로서 특징규명할 정도의 친화성으로 항원에 결합할 수 있는 단편을 지칭한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO2009/040562호, 제WO2010/035012호, 제WO2011/030107호, 제WO2011/061492호 및 제WO2011/086091호(모두 본원에 참고로 도입됨)에 기재된 바와 같이 면역글로불린 모이어티(moiety), 예를 들면, Fab 또는 Fab' 단편, 및 이에 직접적으로 또는 간접적으로 연결된 1개 또는 2개의 단일 도메인 항체(dAb)를 포함하는 CSF-1R 결합 항체 융합 단백질로서 제공된다.

한 실시양태에서, 융합 단백질은 임의적으로 디설파이드 결합에 의해 연결된 2개의 도메인 항체들을 예를 들면, 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 페어링으로서 포함한다.

한 실시양태에서, 융합 단백질의 Fab 또는 Fab' 요소는 단일 도메인 항체 또는 항체들과 동일하거나 유사한 특이성을 가진다. 한 실시양태에서, Fab 또는 Fab'는 단일 도메인 항체 또는 항체들과 상이한 특이성을 가진다. 다시 말해, 융합 단백질은 다가 융합 단백질이다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 다가 융합 단백질은 알부민 결합 부위를 가진다. 예를 들면, 상기 단백질 내의 VH/VL 쌍은 알부민 결합 부위를 제공한다.

항체 분자의 제안된 기능 및 특히 요구될 수 있는 이펙터 기능을 유념하면서 본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인(존재하는 경우)을 선택할 수 있다. 예를 들면, 불변 영역 도메인은 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 구체적으로, 인간 IgG 불변 영역 도메인, 특히 항체 분자가 치료 용도를 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때 IgG 및 IgG3 동종형의 인간 IgG 불변 영역 도메인을 사용할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료 목적을 위한 것이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때 IgG2 및 IgG4 동종형을 사용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 본 발명의 항체는 IgG2 또는 IgG4 항체이다.

이 불변 영역 도메인들의 서열 변이체도 사용할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 예를 들면, 문헌(Angal et al., 1993, Molecular Immunology, 1993, 30:105-108)에 기재된 바와 같이 위치 241에 존재하는 세린이 프롤린으로 교체되어 있는 IgG4 분자를 사용할 수 있다. 따라서, 항체가 IgG4 항체인 실시양태에서, 항체는 돌연변이 S241P를 포함할 수 있다.

당업자는 항체가 다양한 번역 후 변형들을 받을 수 있다는 것도 이해할 것이다. 이 변형들의 유형 및 정도는 항체를 발현시키기 위해 사용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 의해 좌우된다. 이러한 변형은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페라진 형성, 아스파르테이트 이성질체화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변형을 포함할 수 있다. 빈번한 변형은 (문헌(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995)에 기재된 바와 같이) 카복시펩티다제(carboxypeptidases)의 작용으로 인한 카복시-말단 염기성 잔기(예컨대, 라이신 또는 아르기닌)의 상실이다. 따라서, 항체 중쇄의 C-말단 라이신이 존재하지 않을 수 있다.

한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함한다.

한 실시양태에서, 항체 중쇄는 CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하고, 항체 경쇄는 카파 또는 람다 CL 도메인을 포함한다.

본 발명에 의해 제공된 항체는 서열 번호 27에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 가진다. 중쇄 및 경쇄가 서열 번호 27에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19에 제공된 서열을 포함하는 경쇄와 80%(바람직하게는 85%, 90%, 95% 또는 98%) 이상 동일하거나 유사한 항-CSF-1R 항체 또는 이의 결합 단편도 제공된다. 한 실시양태에서, 경쇄는 서열 번호 19에 제공된 서열을 갖거나 이 서열로 구성되고, 중쇄는 서열 번호 27에 제공된 서열을 갖거나 이 서열로 구성된다. 또 다른 실시양태에서, 경쇄는 서열 번호 19의 서열을 갖거나 이 서열로 구성되고, 중쇄는 서열 번호 27의 서열을 갖거나 이 서열로 구성되는데, 이때 서열 번호 27의 위치 453에 존재하는 아미노산 라이신은 누락되어 있거나 결실되어 있다.

본 발명은 본 발명에 의해 제공된 항체, 특히 중쇄 서열 gH2(서열 번호 27) 및/또는 경쇄 서열 gL7(서열 번호 19)을 포함하는 항체 969.g2에 의해 결합되는 인간 CSF-1R의 특정 영역 또는 에피토프도 제공한다.

인간 CSF-1R 폴리펩티드의 이 특정 영역 또는 에피토프는 본 발명에 의해 제공된 항체들 중 어느 하나와 함께 당분야에서 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법을 이용함으로써 확인될 수 있다. 이러한 방법의 예로는 항체에 의해 인식되는 에피토프(예를 들면, 길이에서 약 5개 내지 20개, 바람직하게는 약 7개의 아미노산을 가진 영역 내의 펩티드)의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 가장 작은 단편을 사용하여 본 발명의 항체와의 결합에 대해 CSF-1R로부터 유래된 다양한 길이의 펩티드들을 스크리닝하는 방법이 있다. CSF-1R 펩티드는 합성에 의해 생성될 수 있거나 CSF-1R 폴리펩티드의 단백질용해성 분해에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩티드는 예를 들면, 질량 분광측정 분석에 의해 확인될 수 있다. 또 다른 예에서, NMR 분광법 또는 X-선 결정학을 이용하여 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프를 확인할 수 있다. 일단 확인되면, 본 발명의 항체에 결합하는 에피토프성 단편을 필요에 따라 면역원으로서 사용하여 동일한 에피토프에 결합하는 추가 항체를 수득할 수 있다.

생물학적 분자, 예컨대, 항체 또는 단편은 산성 작용기 및/또는 염기성 작용기를 함유함으로써 순 양전하 또는 음전하를 상기 분자에게 제공할 수 있다. 전체 "관찰된" 전하의 양은 물질의 절대적인 아미노산 서열, 3D 구조에서 하전된 기의 국소 환경, 및 분자의 환경적 조건에 의해 좌우될 것이다. 등전점(pI)은 특정 분자 또는 이의 용매 접근가능한 표면이 순 전기 전하를 보유하지 않는 pH이다. 한 예에서, 본 발명의 CSF-1R 항체 및 단편은 적절한 등전점을 갖도록 조작될 수 있다. 이것은 보다 더 강력한 성질, 특히 적합한 가용성 및/또는 안정성 프로파일, 및/또는 개선된 정제 특성을 가진 항체 및/또는 단편을 이끌어낼 수 있다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 최초로 확인된 항체의 등전점과 상이한 등전점을 갖도록 조작된 인간화된 CSF-1R 항체를 제공한다. 상기 항체는 예를 들면, 아미노산 잔기를 대체함으로써, 예컨대, 산성 아미노산 잔기를 하나 이상의 염기성 아미노산 잔기로 대체함으로써 조작될 수 있다. 대안적으로, 염기성 아미노산 잔기가 도입될 수 있거나 산성 아미노산 잔기가 제거될 수 있다. 대안적으로, 분자가 허용불가능하게 높은 pI 값을 가진 경우, 필요에 따라 산성 잔기를 도입하여 pI를 낮출 수 있다. pI를 조작할 때 항체 또는 단편의 바람직한 활성을 보유하도록 주의를 기울여야 한다는 것이 중요하다. 따라서, 한 실시양태에서, 조작된 항체 또는 단편은 "비변형된" 항체 또는 단편과 동일한 또는 실질적으로 동일한 활성을 가진다.

프로그램, 예컨대, ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html 및 http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html을 이용하여 항체 또는 단편의 등전점을 예측할 수 있다.

당분야에서 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 본 발명에 의해 제공된 항체의 친화성을 변경시킬 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 CSF-1R에 대한 개선된 친화성을 가진, 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이기도 하다. 이러한 변이체는 CDR들의 돌연변이유발(Yang et al., 1995, J. Mol. Biol., 254:392-403), 쇄 셔플링(Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783), 이. 콜라이(E. coli)의 돌연변이유발자 균주의 사용(Low et al., 1996, J. Mol. Biol., 250:359-368), DNA 셔플링(Patten et al., 1997, Curr. Opin. Biotechnol., 8:724-733), 파지 디스플레이(Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적(sexual) PCR(Crameri et al., 1998, Nature, 391:288-291)을 비롯한 다수의 친화성 성숙 프로토콜들에 의해 수득될 수 있다. 상기 문헌(Vaughan et al.)은 이 친화성 성숙 방법들을 논의한다.

원하는 경우 본 발명에서 사용될 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 접합될 수 있다. 이펙터 분자는 단일 이펙터 분자, 또는 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 모이어티를 형성하도록 연결된 2개 이상의 이러한 분자들을 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이펙터 분자에 연결된 항체 단편을 수득하고자 하는 경우, 이것은 항체 단편이 직접적으로 또는 커플링제를 통해 이펙터 분자에 연결되는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 절차에 의해 제조될 수 있다. 이러한 이펙터 분자를 항체에 접합시키는 기법은 당분야에서 잘 공지되어 있다(문헌(Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53); 문헌(Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58); 및 문헌(Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123) 참조). 구체적인 화학적 절차는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO93/06231호, 제WO92/22583호, 제WO89/00195호, 제WO89/01476호 및 제WO03/031581호에 기재된 화학적 절차들을 포함한다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드인 경우, 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO86/01533호 및 유럽 특허 제0392745호에 기재된 재조합 DNA 절차를 이용하여 연결을 달성할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "이펙터 분자"는 예를 들면, 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적 활성 단백질, 예를 들면, 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 생성 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예를 들면, DNA, RNA 및 이들의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성요오드화물, 방사성동위원소, 킬레이팅된 금속, 나노입자 및 리포터 기, 예컨대, 형광 화합물, 또는 NMR 또는 ESR 분광법에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.

이펙터 분자의 예는 세포에게 유해한(예를 들면, 세포를 사멸시키는) 임의의 물질을 포함하는 세포독소 또는 세포독성 물질을 포함할 수 있다. 예로는 콤브레스타틴(combrestatins), 돌라스타틴(dolastatins), 에포틸론(epothilones), 스타우로스포린(staurosporin), 메이탄시노이드(maytansinoids), 스폰기스타틴(spongistatins), 리족신(rhizoxin), 할리콘드린(halichondrins), 로리딘(roridins), 헤미아스터린(hemiasterlins), 탁솔(taxol), 사이토칼라신(cytochalasin) B, 그라미시딘(gramicidin) D, 에티듐 브로마이드, 에메틴(emetine), 미토마이신(mitomycin), 에토포사이드(etoposide), 테노포사이드(tenoposide), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 콜치신(colchicin), 독소루비신(doxorubicin), 다우노루비신(daunorubicin), 디하이드록시 안쓰라신 디온(dihydroxy anthracin dione), 미톡산트론(mitoxantrone), 미쓰라마이신(mithramycin), 악티노마이신(actinomycin) D, 1-데하이드로테스토스테론(dehydrotestosterone), 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 프로카인(procaine), 테트라카인(tetracaine), 리도카인(lidocaine), 프로판올롤(propranolol) 및 퓨로마이신(puromycin), 및 이들의 유사체 또는 상동체가 있다.

이펙터 분자는 항대사물질(예를 들면, 메토트렉세이트(methotrexate), 6-머캡토푸린(mercaptopurine), 6-티오구아닌(thioguanine), 사이타라빈(cytarabine), 5-플루오로우라실 데카바진(fluorouracil decarbazine)), 알킬화제(예를 들면, 메클로레타민(mechlorethamine), 티오에파 클로람부실(thioepa chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 카무스틴(carmustine)(BSNU) 및 로무스틴(lomustine)(CCNU), 사이클로토스프아미드(cyclothosphamide), 부설판(busulfan), 디브로모만니톨(dibromomannitol), 스트렙토조토신(streptozotocin), 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴(cisplatin)), 안쓰라사이클린(anthracyclines)(예를 들면, 다우노루비신(daunorubicin)(이전 명칭: 다우노마이신(daunomycin)) 및 독소루비신(doxorubicin)), 항생제(예를 들면, 닥티노마이신(dactinomycin)(이전 명칭: 악티노마이신(actinomycin)), 블레오마이신(bleomycin), 미쓰라마이신(mithramycin), 안쓰라마이신(anthramycin)(AMC), 칼리케아미신(calicheamicins) 또는 듀오카마이신(duocarmycins)), 및 항유사분열제(예를 들면, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 이펙터 분자는 킬레이팅된 방사성핵종, 예컨대, ¹¹¹In 및 ⁹⁰Y, Lu¹⁷⁷, 비스무쓰²¹³, 캘리포르늄²⁵², 이리듐¹⁹² 및 텅스텐¹⁸⁸/레늄¹⁸⁸; 또는 약물, 예컨대, 알킬포스포콜린(alkylphosphocholines), 토포이소머라제(topoisomerase) I 억제제, 탁소이드(taxoids) 및 수라민(suramin)(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함할 수 있다.

다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심있는 효소는 단백질용해성 효소, 하이드롤라제(hydrolases), 라이아제(lyases), 이소머라제 및 트랜스퍼라제(transferases)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드는 면역글로불린, 독소, 예컨대, 애브린(abrin), 리신(ricin) A, 슈도모나스(pseudomonas) 외독소, 또는 디프테리아(diphtheria) 독소, 단백질, 예컨대, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장인자, 혈소판 유래의 성장인자 또는 조직 플라스미노겐(plasminogen) 활성화제, 혈전제 또는 항혈관신생제, 예를 들면, 안지오스타틴(angiostatin) 또는 엔도스타틴(endostatin), 또는 생물학적 반응 변경제, 예컨대, 림포카인, 인터류킨-1(IL-1), 인터류킨-2(IL-2), 신경 성장인자(NGF) 또는 다른 성장인자 및 면역글로불린을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다른 이펙터 분자는 예를 들면, 진단에 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소들, 보철 기, 형광 물질, 발광 물질, 생체발광 물질, 방사성핵종, (양전자 방출 단층촬영에 사용되는) 양전자 방출 금속, 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 일반적으로, 진단제로서 사용될 항체에 접합될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국 특허 제4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소는 호스라디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase), 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다제(galactosidase) 또는 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase)를 포함하고; 적합한 보철 기는 스트렙타비딘(streptavidin), 아비딘(avidin) 및 바이오틴(biotin)을 포함하고; 적합한 형광 물질은 움벨리페론(umbelliferone), 플루오레세인(fluorescein), 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민(rhodamine), 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실(dansyl) 클로라이드 및 파이코에리쓰린(phycoerythrin)을 포함하고; 적합한 발광 물질은 루미놀(luminol)을 포함하고; 적합한 생체발광 물질은 루시퍼라제(luciferase), 루시페린(luciferin) 및 애쿠오린(aequorin)을 포함하고; 적합한 방사성핵종은 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In 및 ⁹⁹Tc을 포함한다.

또 다른 예에서, 이펙터 분자는 항체의 생체내 반감기를 증가시킬 수 있고/있거나, 항체의 면역원성을 감소시킬 수 있고/있거나 상피 장벽을 가로질러 항체를 면역 시스템에게 전달하는 것을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO05/117984호에 기재된 이펙터 분자들을 포함한다.

한 실시양태에서, CSF-1R과 무관한 이펙터 분자에 의해 제공된 반감기는 유리하다.

이펙터 분자가 중합체인 경우, 이펙터 분자는 일반적으로 합성 또는 천연 생성 중합체, 예를 들면, 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체, 또는 분지된 또는 비분지된 다당류, 예를 들면, 동종 또는 이종 다당류일 수 있다.

상기 언급된 합성 중합체 상에 존재할 수 있는 구체적인 임의적 치환기는 하나 이상의 하이드록시, 메틸 또는 메톡시 기를 포함한다.

합성 중합체의 구체적인 예로는 임의적으로 치환된 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜), 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체, 특히 임의적으로 치환된 폴리(에틸렌글리콜), 예컨대, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체가 있다.

구체적인 천연 생성 중합체는 락토스, 아밀로스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체를 포함한다.

한 실시양태에서, 중합체는 알부민 또는 이의 단편, 예컨대, 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편이다.

본원에서 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들면, 티올-선택성 반응성 기, 예컨대, 말레이미드 등을 포함하기 위한 것이다. 반응성 기는 직접적으로 또는 링커 분절(segment)을 통해 중합체에 연결될 수 있다. 이러한 기의 잔기는 일부 경우 항체 단편과 중합체 사이의 연결 기로서 생성물의 일부를 형성할 것이라는 것이 인식될 것이다.

중합체의 크기는 필요에 따라 변경될 수 있으나, 일반적으로 500 Da 내지 50000 Da, 예를 들면, 5000 Da 내지 40000 Da, 예컨대, 20000 Da 내지 40000 Da의 평균 분자량 범위 내에 있을 것이다. 중합체 크기는 특히 생성물의 의도된 용도, 예를 들면, 특정 조직, 예컨대, 종양에 위치하거나 순환 반감기를 연장시키는 능력을 기초로 선택될 수 있다(검토를 위해서는 문헌(Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545) 참조). 따라서, 예를 들면, 생성물이 순환계를 떠나 조직을 침투하기 위한 것, 예를 들면, 종양의 치료에 사용되기 위한 것인 경우, 소분자량, 예를 들면, 약 5000 Da의 분자량을 가진 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 순환계에 남아있는 적용의 경우, 보다 더 높은 분자량, 예를 들면, 20000 Da 내지 40000 Da의 분자량을 가진 중합체를 사용하는 것이 유리할 수 있다.

적합한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대, 폴리(에틸렌글리콜) 또는 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체, 및 특히 약 15000 Da 내지 약 40000 Da의 분자량을 가진 폴리알킬렌 중합체를 포함한다.

한 예에서, 본 발명에서 사용될 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 모이어티에 부착된다. 한 구체적인 예에서, 상기 항체는 항체 단편이고, PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 말단 아미노산 작용기, 예를 들면, 임의의 자유 아미노, 이미노, 티올, 하이드록실 또는 카복실 기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산들은 항체 단편에 천연적으로 존재할 수 있거나, 재조합 DNA 방법의 이용을 통해 단편 내로 조작될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,219,996호 및 제5,667,425호; 및 국제 특허출원 공개 제WO98/25971호 및 제WO2008/038024호 참조). 한 예에서, 본 발명의 항체 분자는 변형된 Fab 단편이고, 이때 변형은 이펙터 분자의 부착을 허용하도록 하나 이상의 아미노산을 그의 중쇄의 C-말단에 추가하는 것이다. 적합하게는, 추가 아미노산은 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 변형된 힌지 영역을 형성한다. 다수의 부위들을 사용하여 2개 이상의 PEG 분자들을 부착시킬 수 있다.

적합하게는, PEG 분자는 항체 단편에 위치하는 하나 이상의 시스테인 잔기의 티올 기를 통해 공유연결된다. 변형된 항체 분자에 부착된 각각의 중합체 분자는 단편에 위치하는 시스테인 잔기의 황 원자에 공유연결될 수 있다. 공유연결은 일반적으로 디설파이드 결합 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올 기가 부착점으로서 사용되는 경우, 적절하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들면, 티올 선택성 유도체, 예컨대, 말레이미드 및 시스테인 유도체를 사용할 수 있다. 활성화된 중합체는 전술된 바와 같이 중합체-변형된 항체 단편의 제조에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. 활성화된 중합체는 티올 반응성 기, 예컨대, α-할로카복실산 또는 에스테르, 예를 들면, 요오도아세트아미드, 이미드, 예를 들면, 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드를 함유하는 임의의 중합체일 수 있다. 이러한 출발 물질은 상업적으로(예를 들면, 넥타(Nektar)(이전 명칭: 쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드(Shearwater Polymers Inc.), 미국 알라바마주 헌츠빌 소재)로부터) 입수될 수 있거나, 통상적인 화학적 절차의 이용을 통해 상업적으로 입수가능한 출발 물질로부터 제조될 수 있다. 구체적인 PEG 분자는 20K 메톡시-PEG-아민(넥타(이전 명칭: 쉐어워터); 랩 폴리미어(Rapp Polymere); 및 선바이오(SunBio)로부터 입수가능함) 및 M-PEG-SPA(넥타(이전 명칭: 쉐어워터)로부터 입수가능함)를 포함한다.

한 실시양태에서, 항체는 예를 들면, 유럽 특허 제0948544호 또는 제1090037호에 개시된 방법에 따라 PEG화되는, 즉 그 자신에 공유부착된 PEG(폴리(에틸렌글리콜))을 가진 변형된 Fab 단편, Fab' 단편 또는 diFab이다(문헌("Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York), 문헌("Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC), 문헌("Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York), 및 문헌(Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545) 또한 참조). 한 예에서, PEG는 힌지 영역 내의 시스테인에 부착된다. 한 예에서, PEG에 의해 변형된 Fab 단편은 변형된 힌지 영역 내의 단일 티올 기에 공유연결된 말레이미드 기를 가진다. 라이신 잔기가 말레이미드 기에 공유연결될 수 있고, 대략 20,000 Da의 분자량을 가진 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 라이신 잔기 상의 아민 기들 각각에 부착될 수 있다. 따라서, Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 대략 40,000 Da일 수 있다.

구체적인 PEG 분자는 PEG2MAL40K(넥타(이전 명칭: 쉐어워터)로부터 입수가능함)로서도 공지된, N,N'-비스(메톡시폴리(에틸렌 글리콜) MW 20,000)에 의해 변형된 라이신의 2-[3-(N-말레이미도)프로피온아미도]에틸 아미드를 포함한다.

PEG 링커의 대안적 공급원은 GL2-400MA3(이때, 하기 구조에서 m은 5임) 및 GL2-400MA(이때, m은 2임)를 공급하는 NOF를 포함하고, n은 대략 450이다:

즉, 각각의 PEG는 약 20,000 Da이다.

따라서, 한 실시양태에서, PEG는 2,3-비스(메틸폴리옥시에틸렌-옥시)-1-{[3-(6-말레이미도-1-옥소헥실)아미노]프로필옥시}헥산(2 아암(arm) 분지된 PEG, -CH₂)₃NHCO(CH₂)₅-MAL(Mw 40,000, SUNBRIGHT GL2-400MA3으로서 공지됨)이다.

하기 유형의 추가 대안적 PEG 이펙터 분자가 있다:

한 실시양태에서, 쇄의 아미노산 226, 예를 들면, (순차적 넘버링에 의한) 중쇄의 아미노산 226에서 또는 근처에서 시스테인 아미노산 잔기를 통해 부착된 PEG(예를 들면, 본원에 기재된 PEG)를 가진 항체, 예컨대, 전장 항체가 제공된다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 하나 이상의 PEG 중합체, 예를 들면, 1개 또는 2개의 중합체, 예컨대, 40 kDa 중합체 또는 중합체들을 포함하는 Fab'PEG 분자를 제공한다.

본 개시내용에 따른 Fab-PEG 분자는 Fc 단편과 무관한 반감기를 가진다는 점에서 특히 유리할 수 있다.

한 실시양태에서, 중합체, 예컨대, PEG 분자, 전분 분자 또는 알부민 분자에 접합된 scFv가 제공된다.

한 실시양태에서, 예를 들면, 반감기를 증가시키기 위해 항체 또는 단편을 전분 분자에 접합시킨다. 접합 방법은 본원에 참고로 도입되는 미국 특허 제8,017,739호에 기재된 바와 같이 단백질로부터 출발한다.

본원에서 사용된 리포터 분자는 검출될 수 있는 분자, 예를 들면, 형광 염료, 방사성표지 또는 다른 검출가능한 물질이다.

본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다. 적합하게는, 상기 DNA 서열은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들면, 화학적 프로세싱에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합물을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 필요에 따라 결정된 DNA 서열로부터 합성될 수 있거나 상응하는 아미노산 서열을 기초로 합성될 수 있다.

수용자 골격 서열을 코딩하는 DNA는 당업자에 의해 널리 입수가능하고 그의 공지된 아미노산 서열을 기초로 용이하게 합성될 수 있다.

분자생물학의 표준 기법을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 이용하여 원하는 DNA 서열을 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 부위-지정된 돌연변이유발 및 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기법을 적절하게 이용할 수 있다.

적합한 DNA 서열의 예는 도 1에 제공되어 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 벡터는 서열 번호 28 및/또는 서열 번호 20에 제공된 서열을 포함한다. 적합하게는, 클로닝 또는 발현 벡터는 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 2개의 DNA 서열들, 바람직하게는 각각 서열 번호 28 및 서열 번호 20, 및 적합한 신호 서열을 포함한다. 한 예에서, 벡터는 중쇄와 경쇄 사이에 유전자간(intergenic) 서열을 포함한다(국제 특허출원 공보 제WO03/048208호 참조).

벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 형질감염 방법 및 배양 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌("Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing)을 참조한다.

본 발명의 항체를 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공된다. 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열의 발현을 위해 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 사용할 수 있다. 세균, 예를 들면, 이. 콜라이, 및 다른 미생물 시스템을 사용할 수 있거나, 진핵, 예를 들면, 포유동물 숙주 세포 발현 시스템도 사용할 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.

본 발명은 본 발명에 따른 항체 분자를 제조하는 방법으로서, 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA로부터 단백질의 발현을 유도하기에 적합한 조건 하에서 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체 분자를 단리하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.

항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있는데, 어느 경우든 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열이 숙주 세포를 형질감염시키는 데에 사용될 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다를 포함하는 생성물의 제조를 위해, 세포주를 2개의 벡터들, 즉 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 대안적으로, 경쇄 폴리펩티드 및 중쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열들을 포함하는 단일 벡터를 사용할 수 있다.

본 개시내용에 따른 항체 및 단편은 숙주 세포로부터 우수한 수준으로 발현된다. 따라서, 항체 및/또는 결합 단편의 성질은 상업적 규모로 발현시키는 데에 적합하다.

따라서, 숙주 세포를 배양하고 그의 항체 또는 단편을 발현시키고, 상기 항체 또는 단편을 단리하고 임의적으로 이를 정제하여 단리된 항체 또는 단편을 제공하는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터 분자를 단리된 항체 또는 단편에 접합시키는, 예를 들면, 특히 본원에 기재된 PEG 중합체를 접합시키는 단계를 추가로 포함한다.

한 실시양태에서, 불순물이 컬럼 상에 보유되고 항체가 용출되도록 비결합 모드로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 항체(특히, 본 발명에 따른 항체 또는 단편)를 정제하는 방법이 제공된다.

한 실시양태에서, 정제는 CSF-1R 컬럼 상에서의 친화성 포획을 이용한다.

한 실시양태에서, 정제는 알부민 융합 또는 접합체 분자의 정제를 위해 시바크론 블루(cibacron blue) 또는 유사한 물질을 사용한다.

상기 방법에서 사용될 적합한 이온 교환 수지는 Q.FF 수지(지이-헬쓰케어(GE-Healthcare)에 의해 공급됨)를 포함한다. 상기 단계는 예를 들면, 약 8의 pH에서 수행될 수 있다.

상기 방법은 예를 들면, 약 4 내지 5, 예컨대, 4.5의 pH에서 수행되는, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 초기 포획 단계를 추가로 포함할 수 있다. 양이온 교환 크로마토그래피는 예를 들면, 수지, 예컨대, CaptoS 수지 또는 SP 세파로스(sepharose) FF(지이-헬쓰케어에 의해 공급됨)를 사용할 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 200 mM의 농도로 이온성 염 용액, 예컨대, 염화나트륨을 사용하여 항체 또는 단편을 수지로부터 용출할 수 있다.

따라서, 크로마토그래피 단계 또는 단계들은 적절한 경우 하나 이상의 세척 단계를 포함할 수 있다.

정제 방법은 하나 이상의 여과 단계, 예컨대, 정용여과 단계도 포함할 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 정제된 항-CSF-1R 항체 또는 단편, 예를 들면, 실질적으로 정제된 형태, 특히 내독소 및/또는 숙주 세포 단백질 또는 DNA를 갖지 않거나 실질적으로 갖지 않는 인간화된 항체 또는 단편, 특히 본 발명에 따른 항체 또는 단편이 제공된다.

상기 사용된 "정제된 형태"는 90% 이상의 순도, 예컨대, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99 중량/중량% 이상의 순도를 지칭하기 위한 것이다.

내독소를 실질적으로 갖지 않는다는 것은 일반적으로 항체 생성물 mg당 1 EU 이하, 예컨대, 생성물 mg당 0.5 또는 0.1 EU의 내독소 함량을 지칭하기 위한 것이다.

숙주 세포 단백질 또는 DNA를 실질적으로 갖지 않는다는 것은 일반적으로 적절한 경우 항체 생성물 mg당 400 ㎍ 이하, 예컨대, mg당 100 ㎍ 이하, 특히 mg당 20 ㎍의 숙주 세포 단백질 및/또는 DNA 함량을 지칭하기 위한 것이다.

본 발명은 약제로서 사용되기 위한 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체(또는 이를 포함하는 약학 조성물)도 제공한다.

본 발명은 암의 치료를 위한 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체(또는 이를 포함하는 약학 조성물)도 제공한다.

본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체(또는 이를 포함하는 약학 조성물)의 용도도 제공한다.

본 발명은 암을 앓고 있거나 암의 위험에 있는 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.

본 개시내용에 따른 항체는 유방암, 전립선암, 골암, 골수종, 대장암, 백혈병, 림프종, 피부암, 예컨대, 흑색종, 식도암, 위암, 별아교세포암(astrocytic cancer), 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신장암, 폐암, 간암, 갑상선암, 두경부암, 췌장암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택된 암을 치료하는 데에 사용될 수 있다.

한 실시양태에서, 암은 상기 나열된 최초의 암들 중 임의의 암, 특히 골암으로부터 전이된 암이다.

놀랍게도, 본 발명자들은 CSF-1R 활성을 억제하는 항-CSF-1R 항체가 섬유성 질환의 치료에서 활성을 나타낸다는 것을 입증할 수 있었다. 구체적으로, 본 발명자들은 항-CSF-1R 항체가 폐 섬유증의 생체내 동물 모델에서 활성을 나타낸다는 것을 입증할 수 있었다.

본 발명은 섬유성 질환의 치료를 위한 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체(또는 이를 포함하는 약학 조성물)도 제공한다.

본 발명은 섬유성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체(또는 이를 포함하는 약학 조성물)의 용도도 제공한다.

본 발명은 섬유성 질환을 앓고 있거나 섬유성 질환의 위험에 있는 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 유효량의 본 개시내용에 따른 항-CSF-1R 항체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.

본원에서, 용어 "섬유성 질환"은 상처 치유에 대한 비정상적인 반응을 특징으로 하는 질환을 포함하고, 이때 과도한 섬유성 결합 조직이 장기 또는 조직에서 형성된다. 예시적 섬유성 질환은 폐 섬유증, 예컨대, 특발성 폐 섬유증 및 낭성 섬유증, 관형 위축 및 간질 섬유증을 포함하는 신장 섬유증, 간 섬유증, 간 경화증, 원발성 경화 담관염, 원발성 담관 경화증, 심내막심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 켈로이드, 심근경색, 피부경화증, 전신 경화증 및 관절섬유증을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편은 암 또는 섬유성 질환의 치료 또는 예방에 사용된다.

본 개시내용에 따른 항체는 염증성 질환, 예를 들면, 염증성 관절염, 죽상동맥경화증, 다발경화증, 염증성 장 질환, 크론병, 궤양성 대장염, 류마티스성 척추염, 강직 척추염, 관절염, 건선 관절염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 습진, 접촉 피부염, 건선, 독성 쇼크 증후군, 패혈증, 패혈증성 쇼크, 내독소 쇼크, 천식, 만성 폐 염증성 질환, 규폐증, 폐 사르코이드증, 골다공증, 재협착, 심장 및 신장 재관류 손상, 혈전증, 사구체신염, 당뇨병, 이식편 대 숙주 반응, 동종이식편 거부, 다발경화증, 근육 퇴행, 근육 퇴행위축, 알쯔하이머병 및 뇌졸중의 치료에 사용될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항체 및 단편은 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 진단, 예를 들면, 생체내 진단 및 CSF-1R을 수반하는 질환 상태의 영상화에 사용될 수도 있다.

본 발명의 항체가 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자를 포함하는 약학 또는 진단 조성물도 제공한다. 따라서, 약제의 제조를 위한 본 발명의 항체의 용도가 제공된다. 상기 조성물은 통상적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 멸균 약학 조성물의 일부로서 통상적으로 공급될 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 첨가하고 혼합하는 단계를 포함하는, 약학 또는 진단 조성물을 제조하는 방법도 제공한다.

항체 분자는 약학 또는 진단 조성물에서 단독 활성 성분일 수 있다. 대안적으로, 항체는 하나 이상의 다른 치료 활성 성분과 함께, 예를 들면, 동시적으로, 순차적으로 또는 별도로 투여될 수 있다. 따라서, 약학 또는 진단 조성물 중의 항체 분자는 다른 항체 성분, 예를 들면, 표피 성장인자 수용체 패밀리(EGFR, HER-2), 혈관 내피 성장인자 수용체(VEGFR), 혈소판 유래의 성장인자 수용체(PDGFR) 항체, 또는 비-항체 성분, 예컨대, 이마티닙(imatinib), 다사티닙(dasatinib), 닐로티닙(nioltinib), 바수티닙(basutinib), 제피티닙(gefitinib), 에를로티닙(erlotinib), 템시롤리무스(temsirolimus), 반데타닙(vandetanib), 베무라페닙(vemurafenib), 크리조티닙(crizotinib), 보리노스타트(vorinostat), 로미뎁신(romidepsin), 보르테조밉(bortezomib), 소라페닙(sorafenib), 수니티닙(sunitinib), 파조파닙(pazopanib), 레고라페닙(regorafenib), 카보잔티닙(cabozantinib), 페르페니돈(Perfenidone), 스테로이드(steroids) 또는 다른 약물 분자, 특히 CSF-1R 결합과 무관한 반감기를 가진 약물 분자를 비롯한 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.

본원에서 사용된 "활성 성분"은 적절한 용량에서 약리학적 효과, 예컨대, 치료 효과를 가진 성분을 지칭한다.

약학 조성물은 적절하게는 치료 유효량의 본 발명의 항체를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료 유효량"은 표적화된 질환 또는 상태를 치료하거나, 완화시키거나 예방하기 위해, 또는 검출가능한 치료적, 약리학적 또는 예방적 효과를 나타내기 위해 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 항체의 경우, 치료 유효량은 세포 배양 분석 또는 동물 모델, 통상적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 먼저 평가될 수 있다. 동물 모델을 이용하여 적절한 농도 범위 및 투여 경로를 결정할 수도 있다. 그 다음, 이러한 정보를 이용하여 인간에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정할 수 있다.

인간 대상체를 위한 정확한 치료 유효량은 질환 상태의 중증도, 대상체의 일반적인 건강, 대상체의 연령, 체중 및 성별, 식습관, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응에 의해 좌우될 것이다. 이 양은 상용적인 실험에 의해 결정될 수 있고 임상의의 판단 내에 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 0.01 mg/kg 내지 500 mg/kg, 예를 들면, 0.1 mg/kg 내지 200 mg/kg, 예컨대, 100 mg/kg일 것이다.

약학 조성물은 편리하게는 용량당 예정된 양의 본 발명의 활성 물질을 함유하는 유닛 제형으로 제공될 수 있다.

본 개시내용에 따른 항체의 치료 용량은 생체내에서 명백한 또는 한정된 독성학적 효과를 보이지 않는다.

조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나, 다른 물질, 약물 또는 호르몬과 함께(예를 들면, 동시적으로, 순차적으로 또는 별도로) 투여될 수 있다.

한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 결합 단편은 하나 이상의 다른 암 치료법, 예를 들면, 화학요법, 방사선요법 또는 수술과 함께 사용된다. 화학요법제와 함께 투여되는 경우, 상기 항체는 화학요법제 전 또는 후에, 또는 동시에 투여될 수 있다. 제공된 항원 결합 단백질과 함께 사용될 수 있는 화학요법 치료제는 알킬화/DNA 손상 물질(예를 들면, 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin)), 항대사물질(예를 들면, 카페시타빈(capecitabine), 겜시타빈(gemcitabine), 5-플루오로우라실), 유사분열 억제제(예를 들면, 파클리탁셀(paclitaxel), 빈크리스틴(vincristine))를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

다양한 염증성 질환들의 치료에 사용될 항체는 단독으로 사용될 수 있거나 다양한 다른 소염제들과 병용될 수 있다.

다양한 섬유성 질환들의 치료에 사용될 항체는 단독으로 사용될 수 있거나 다양한 다른 항-섬유증 물질들과 병용될 수 있다. 이러한 물질의 한 예는 페르페디돈이다.

본 발명의 항체 분자가 투여되는 용량은 치료될 질환의 성질, 존재하는 질환의 중증도, 및 항체 분자가 예방 목적으로 사용되는지 아니면 기존 질환을 치료하기 위해 사용되는지에 의해 좌우된다.

투약 빈도는 항체 분자의 반감기 및 그의 효과의 지속시간에 의해 좌우될 것이다. 항체 분자가 짧은(예를 들면, 2시간 내지 10시간) 반감기를 가진 경우, 매일 1회분 이상의 용량을 제공할 필요가 있을 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴(예를 들면, 2일 내지 15일) 반감기 및/또는 긴 지속 약력학(PD) 프로파일을 가진 경우, 매일 1회분, 매주 1회분, 또는 심지어 1개월 또는 2개월마다 1회분의 용량만을 제공할 필요가 있을 수 있다.

본원에서 사용된 "반감기"는 순환계, 예를 들면, 혈청/혈장에서의 분자의 지속시간을 지칭하기 위한 것이다.

본원에서 사용된 "약력학"은 본 개시내용에 따른 분자의 프로파일 및 특히 생물학적 작용의 지속시간을 지칭한다.

약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 스스로 유도하지 않아야 하고 독성을 나타내지 않아야 한다. 적합한 담체는 크지만 느리게 대사되는 거대분자, 예컨대, 단백질, 폴리펩티드, 리포좀, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 폴리머성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자일 수 있다.

약학적으로 허용가능한 염, 예를 들면, 무기산 염, 염화수소산염, 브롬화수소산염, 인산염 및 황산염, 또는 유기산 염, 예컨대, 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염 및 벤조산염을 사용할 수 있다.

치료 조성물 중의 약학적으로 허용가능한 담체는 액체, 예컨대, 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대, 습윤화제, 유화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 섭취를 위해 약학 조성물이 정제, 환제, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로서 제제화되게 할 수 있다.

투여에 적합한 형태는 비경구 투여, 예를 들면, 주사 또는 주입, 예를 들면, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 생성물인 경우, 상기 생성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유액의 형태를 취할 수 있고 제제화 물질, 예컨대, 현탁제, 보존제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적절한 멸균 액체로 재구성될 건조된 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 조성물은 일단 제제화되면 대상체에게 직접적으로 투여될 수 있다. 치료될 대상체는 동물일 수 있다. 그러나, 하나 이상의 실시양태에서, 조성물은 인간 대상체에게 투여되도록 개조된다.

적합하게는, 본 개시내용에 따른 제제에서, 최종 제제의 pH는 항체 또는 단편의 등전점의 값과 유사하지 않다. 예를 들면, 제제의 pH가 7인 경우, 8 내지 9 이상의 pI가 적절할 수 있다. 이론에 의해 구속받고자 하지 않지만, 이것은 궁극적으로 개선된 안정성을 가진 최종 제제를 제공할 수 있다고, 예를 들면, 항체 또는 단편이 용액에 남아있다고 생각된다.

한 예에서, 4.0 내지 7.0의 범위 내의 pH에서 약학 제제는 1 내지 200 mg/㎖의 본 개시내용에 따른 항체, 1 내지 100 mM의 완충제, 0.001% 내지 1%의 계면활성제, a) 10 내지 500 mM의 안정화제, b) 10 내지 500 mM의 안정화제 및 5 내지 500 mM의 긴장성(tonicity) 물질, 또는 c) 5 내지 500 mM의 긴장성 물질을 포함한다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수질내, 경막내, 심실내, 경진피, 경피(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO98/20734호 참조), 피하, 복강내, 코내, 장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(Hyposprays)를 사용하여 본 발명의 약학 조성물을 투여할 수도 있다. 전형적으로, 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사제로서 제조될 수 있다. 주사 전 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다.

조성물의 직접적인 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복강내, 정맥내 또는 근육내로 달성될 것이거나 조직의 간질 공간에게 전달될 것이다. 조성물은 병변 내로 투여될 수도 있다. 투약 치료는 단회 용량 일정 또는 다회 용량 일정일 수 있다.

조성물 중의 활성 성분은 항체 분자일 것이라는 것이 인식될 것이다. 따라서, 상기 성분은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용하는 경로에 의해 투여될 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하지만 일단 항체가 위장관으로부터 흡수되면 상기 항체를 방출하는 물질을 함유할 필요가 있을 것이다.

약학적으로 허용가능한 담체의 철저한 논의는 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991))에서 입수될 수 있다.

한 실시양태에서, 제제는 흡입을 포함하는 국소 투여를 위한 제제로서 제공된다.

적합한 흡입가능한 제제는 흡입가능한 분말, 추진제 기체를 함유하는 계량 에어로졸, 또는 추진제 기체를 갖지 않는 흡입가능한 용액을 포함한다. 활성 물질을 함유하는 본 개시내용에 따른 흡입가능한 분말은 상기 언급된 활성 물질, 또는 상기 언급된 활성 물질과 생리학적으로 허용가능한 부형제의 혼합물로만 구성될 수 있다.

이 흡입가능한 분말은 단당류(예를 들면, 글루코스 또는 아라비노스), 이당류(예를 들면, 락토스, 사카로스, 말토스), 올리고당류 및 다당류(예를 들면, 덱스트란), 폴리알코올(예를 들면, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨), 염(예를 들면, 염화나트륨, 탄산칼슘), 또는 서로 혼합된 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 단당류 또는 이당류가 적절하게 사용되고, 배타적으로는 아니지만 특히 수화물 형태의 락토스 또는 글루코스가 사용된다.

폐에서의 침착을 위한 입자는 10 ㎛ 미만, 예컨대, 1 내지 9 ㎛, 예를 들면, 0.1 내지 5 ㎛, 특히 1 내지 5 ㎛의 입자 크기를 요구한다. 활성 성분(예컨대, 항체 또는 단편)의 입자 크기가 일차적으로 중요하다.

흡입가능한 에어로졸을 제조하는 데에 사용될 수 있는 추진제 기체는 당분야에서 공지되어 있다. 적합한 추진제 기체는 탄화수소, 예컨대, n-프로판, n-부탄 또는 이소부탄 및 할로탄화수소, 예컨대, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 사이클로프로판 또는 사이클로부탄의 염소첨가된 및/또는 불소첨가된 유도체로부터 선택된다. 상기 언급된 추진제 기체들은 그들 자체로 또는 그들의 혼합물로 사용될 수 있다.

특히 적합한 추진제 기체는 TG11, TG12, TG134a 및 TG227로부터 선택된 할로겐첨가된 알칸 유도체이다. 상기 언급된 할로겐첨가된 탄화수소 중 TG134a(1,1,1,2-테트라플루오로에탄) 및 TG227(1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판) 및 이들의 혼합물이 특히 적합하다.

추진제 기체 함유 흡입가능한 에어로졸은 다른 성분, 예컨대, 보조용매, 안정화제, 표면 활성 물질(계면활성제), 항산화제, 윤활제, 및 pH를 조절하기 위한 수단도 함유할 수 있다. 이 성분들 모두가 당분야에서 공지되어 있다.

본 발명에 따른 추진제 기체 함유 흡입가능한 에어로졸은 5 중량% 이하의 활성 물질을 함유할 수 있다. 본 발명에 따른 에어로졸은 예를 들면, 0.002 내지 5 중량%, 0.01 내지 3 중량%, 0.015 내지 2 중량%, 0.1 내지 2 중량%, 0.5 내지 2 중량%, 또는 0.5 내지 1 중량%의 활성 성분을 함유한다.

대안적으로, 폐에의 국소 투여는 예를 들면, 장치, 예컨대, 분사기, 예를 들면, 압축기에 연결된 분사기(예를 들면, 파리 레스퍼레이토리 이퀴프먼트 인코포레이티드(Pari Respiratory Equipment, Inc.)(미국 버지니아주 리치몬드 소재)에 의해 제작된 파리 마스터(Pari Master)(R) 압축기에 연결된 파리 LC-젯 플러스(Pari LC-Jet Plus)(R) 분사기)를 이용한 액체 용액 또는 현탁액 제제의 투여일 수도 있다.

본 발명의 항체는 용매에 분산된 형태, 예를 들면, 용액 또는 현탁액의 형태로 전달될 수 있다. 상기 항체는 적절한 생리학적 용액, 예를 들면, 식염수 또는 다른 약리학적으로 허용가능한 용매 또는 완충된 용액에 현탁될 수 있다. 당분야에서 공지된 완충된 용액은 약 4.0 내지 5.0의 pH를 달성하도록 물 1 ㎖당 0.05 mg 내지 0.15 mg의 에데트산이나트륨, 8.0 mg 내지 9.0 mg의 NaCl, 0.15 mg 내지 0.25 mg의 폴리소르베이트, 0.25 mg 내지 0.30 mg의 무수 구연산 및 0.45 mg 내지 0.55 mg의 구연산나트륨을 함유할 수 있다. 현탁액은 예를 들면, 동결건조된 항체를 사용할 수 있다.

치료 현탁액 또는 용액 제제는 하나 이상의 부형제도 함유할 수 있다. 부형제는 당분야에서 잘 공지되어 있고 완충제(예를 들면, 구연산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제 및 중탄산염 완충제), 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질, 단백질(예를 들면, 혈청 알부민), EDTA, 염화나트륨, 리포좀, 만니톨, 소르비톨 및 글리세롤을 포함한다. 용액 또는 현탁액은 리포좀 또는 생체분해가능한 마이크로스피어 내에 캡슐화될 수 있다. 제제는 일반적으로 멸균 제조 공정을 이용함으로써 실질적으로 멸균 형태로 제공될 것이다.

이것은 제제화를 위해 사용되는 완충된 용매/용액의 여과에 의한 생성 및 멸균, 멸균 완충된 용매 용액에서의 항체의 무균 현탁, 및 당분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 익숙한 방법에 의한 멸균 용기 내로의 제제의 분배를 포함할 수 있다.

본 개시내용에 따른 분사가능한 제제는 예를 들면, 포일 외피로 포장된 단회 용량 유닛(예를 들면, 밀봉된 플라스틱 용기 또는 바이알)로서 제공될 수 있다. 각각의 바이알은 일정한 부피, 예를 들면, 2 ㎖의 용매/용액 완충제 중에 유닛 용량을 함유한다.

본원에 개시된 항체는 분사를 통한 전달에 적합할 수 있다.

본 발명의 항체가 유전자 요법의 이용에 의해 투여될 수 있다는 것도 예상된다. 이를 달성하기 위해, 적절한 DNA 구성요소의 조절 하에서 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 DNA 서열을 환자 내로 도입함으로써, 항체 쇄가 상기 DNA 서열로부터 발현되고 제자리에서(in situ) 조립되게 한다.

한 실시양태에서, 본 개시내용은 예를 들면, 리포터 분자에 접합된 시약 또는 진단제로서의 항체 또는 이의 단편의 용도를 포함한다. 따라서, 표지된 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편이 제공된다. 한 양태에서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 단편을 포함하는 컬럼이 제공된다.

따라서, 하기 1) 내지 3)과 같은 용도를 위한 시약으로서 사용될 항-CSF-1R 항체 또는 단편이 제공된다:

1) 매트릭스에 접합되고 친화성 컬럼으로서, 또는 임의적으로 항-Fc 시약에 의해 침전되는 침전제로서(항-CSF-1R의 변형된 형태로서)(예를 들면, 변형될 수 있는, 또 다른 분자에 의해 인식되는 도메인으로 변형된 형태로서) 사용되는 CSF-1R 단백질(또는 이의 결합 단편)의 정제;

2) 살아있거나 고정된 세포(시험관내의 세포, 또는 조직 또는 세포 박편 내의 세포) 상의 또는 내의 CSF-1R의 검출 및/또는 정량(이것에 대한 용도는 항-CSF-1R 치료의 효과를 추적하기 위한 생체마커로서의 CSF-1R의 정량을 포함할 수 있다. 이 목적들을 위해, 후보물질은 (예를 들면, 유전적 융합 단백질 또는 화학적 접합체로서 또 다른 모이어티의 추가, 예컨대, 리포터 분자, 예를 들면, 검출 목적을 위해 사용되는 형광 태그의 추가에 의해) 변형된 형태로 사용될 것이다.); 및

3) 상기 1) 및 2)에 예시된 방식에 의해 변형된 후보물질과의 결합에 의해 표지된 CSF-1R 보유 세포의 정제 또는 분류.

본 명세서의 내용에서 "포함하는"은 "포괄하는"을 의미하기 위한 것이다.

기술적으로 적절한 경우, 본 발명의 실시양태들이 조합될 수 있다.

실시양태들은 본원에서 특정 특징들/요소들을 포함하는 것으로서 기재되어 있다. 또한, 본 개시내용은 상기 특징들/요소들로 구성되거나 본질적으로 이러한 특징들/요소들로 구성된 별개의 실시양태들까지 확장된다.

기술적 참고문헌, 예컨대, 특허 및 출원은 본원에 참고로 도입된다.

본원에서 구체적으로 및 명시적으로 언급된 임의의 실시양태는 단독으로 또는 하나 이상의 추가 실시양태와 함께 부인(disclaimer)의 근거를 형성할 수 있다.

실시예

실시예 1: 항-CSF-1R 항체의 생성

면역화:

글리코실포스파티딜-이노시톨(GPI) 고착제에 연결된 인간 CSF-1R 세포외 도메인을 발현하는 벡터로 일시적으로 형질감염된 동계(syngeneic) RFL6 래트 섬유모세포를 사용하여 암컷 스프라그 다울리(Sprague Dawley) 래트를 면역화시켰다. 도 3은 래트의 면역화에 사용된 인간 CSF-1R 세포외 도메인 서열인 서열 번호 39를 보여준다.

래트는 동물당 3x10⁶개 내지 9x10⁶개의 형질감염된 세포의 5회 피하 면역화를 3주 간격으로 제공받았다. 프로인트 완전 항원보강제(Freund's Complete Adjuvant)(PBS 중의 50%)를 제1 세포 면역화와 함께 인접 부위에서 주사하였다. 최종 면역화로부터 2주 후, 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 비장을 채취하였다.

항체 상청액의 일차 스크리닝

형질감염된 HEK293 세포 상에서 발현된 인간 CSF-1R에 결합하는 항체 상청액의 능력을 형광 마이크로부피 분석 기술(FMAT)로 먼저 스크리닝하였다.

항-CSF-1R 반응성을 가진 대략 1000개의 웰들을 600 x 96-웰 플레이트의 일차 FMAT에서 확인하였다. FMAT로 CSF-1R 결합 항체의 생성에 대해 총 대략 3x10⁸개의 B 세포들(래트 비장세포들)을 스크리닝하였다.

항체 상청액의 이차 스크리닝

중화 항-CSF-1R 활성, 즉 인간 CSF-1과 인간 CSF-1R 수용체의 결합을 방해하는 능력을 가진 항체를 함유하는 FMAT-양성 웰을 확인하기 위해 배지-고속처리(throughput) 분석을 고안하였다. 항체 상청액을 인간 CSF-1과 함께 항온처리하기 전에 CSF-1R 발현 THP-1 세포와 함께 항온처리하였다. THP-1 세포에 결합하는 CSF-1의 수준을, 항-CSF-1 다중클론 항체를 사용하여 유동 세포측정(flow cytometry)으로 측정하였다. 무관한 항체 상청액을 음성 대조군으로서 사용하였다.

이차 스크리닝을 779개의 항체 웰들로부터의 상청액에 적용하였고, 이 웰들 중 88개의 웰들이 검출가능한 CSF-1 차단 활성을 나타내었다.

항체 상청액의 삼차 스크리닝

이차 스크리닝에서 중화 활성을 보인 항체 상청액들을, 일차 인간 단핵구의 CSF-1 의존적 생존을 방해하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 단핵구를 인간 혈액으로부터 정제하고 1x10⁴개의 세포를 20 ng/㎖ 인간 CSF-1의 존재 하에서 각각의 항체 상청액과 함께 항온처리하였다. 72시간의 항온처리 후, 생존 단핵구의 수를 셀타이터 글로(CellTiter Glo) 분석으로 측정하였다.

삼차 스크리닝을 이차 스크리닝에서 확인된 항체 웰들 중 59개의 항체 웰들로부터의 상청액에 적용하였고, 18개의 웰들이 CSF-1에 의해 매개된 단핵구 생존을 감소시키는 능력을 나타내었다.

항체 가변 영역의 클로닝 및 차단 활성의 재분석

CSF-1 중화 활성을 나타내는 18개의 항체 웰들로부터 가변 영역(V-영역) 클로닝을 시도하였다. 래트 항체 불변 영역에 특이적인 프라이머 및 래트 면역글로불린 리더 펩티드를 코딩하는 서열에 어닐링하는 가외의 프라이머 세트를 사용한 RT-PCR로 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 V-영역들을 증폭하였다. 상기 V-영역 유전자들을 14개의 항체들로부터 회수하고 중쇄 및 경쇄 인간 IgG4 발현 벡터 내로 클로닝하였다.

항체 벡터 쌍을 HEK293F 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, 컨디셔닝된 배지를 (전술된 바와 같이) THP-1 세포에 대한 CSF-1 중화 활성에 대해 시험하였다. 항체들 중 9개의 항체들이 대조군 컨디셔닝된 배지에 비해 CSF-1 결합을 부분적으로 또는 전체적으로 억제하는 능력을 가졌다.

9개의 중화 항- CSF -1R 항체들의 서열 분석

9개의 중화 항체들을 서열결정하여 서열 다양성을 평가하였다. 9개의 항체들이 전부가 독특하였다. 이 항체들을 클로닝하고 추가 프로파일링 연구를 위해 발현시켰다.

실시예 2: 항-인간 CSF-1R 키메라 Ab969 및 항-뮤린 CSF-1R Ab535의 시험관내 성질

i) 키메라 Ab969의 발현

실시예 1에서 확인된 9개의 중화 항체들의 가변 영역들을 별개의 중쇄 및 경쇄 발현 벡터들 내로 클로닝하고 전장 인간 IgG4 항체로서 발현시켰다.

천연 리더 서열, 및 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 가진 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터 pVhg4FL(V19H) 내로 VH 유전자를 클로닝하였다. 천연 리더 서열 및 인간 카파 쇄 불변 영역(Km3 동종이인자형)을 코딩하는 DNA를 함유하는 벡터 pKH10.1(V4L) 내로 VL 유전자(카파)를 클로닝하였다.

일치하는 중쇄 및 경쇄 벡터 쌍들을 CHO-K1 세포 내로 일시적으로 공-형질감염시켜 항체를 발현시켰다. 최종 제제 중의 응집체의 수준이 1% 미만이도록 PBS(pH 7.4) 내로의 항체의 정제를 수행하였다.

9개의 항체들의 패널은 항체 969로 명명된 항체를 포함하였다. 래트 가변 영역, 인간 감마-4 중쇄 불변 영역 및 인간 카파 쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체는 하기 실시예들에서 항체 969, 항체 969cHcL 또는 항체 969.g0으로서 지칭된다.

ii) 리간드 차단 분석

CSF-1과 THP-1 세포의 결합을 억제하는 상기 9개의 항체들 각각의 능력을 유동 세포측정으로 평가하였다. THP-1 세포를 0.5, 0.125, 0.031, 0.0078 및 0.00195 ㎍/㎖의 각각의 항체와 함께 30분 동안 항온처리하였다. 무관한 IgG4 항체는 동종형 대조군으로서 사용되었다. 세척 후, 세포를 0.5 ㎍/㎖의 인간 CSF-1과 함께 30분 동안 항온처리하였다. 추가 세척 후, 결합된 CSF-1을 바이오티닐화된 항-CSF-1 항체 및 알렉사488-접합된 스트렙타비딘과 함께 순차적으로 항온처리함으로써 검출하였다. 수용체에 결합된 리간드를 유동 세포측정으로 측정하고 중간 형광 강도(MFI)를 작도하였다.

이 분석은 시험된 남은 항체들보다 더 우수하여 31.3 ng/㎖의 농도에서 CSF-1 결합의 완전한 억제를 나타내는 Ab969를 비롯한 4개의 항체들을 확인시켜주었다.

iii) CSF -1 및 IL-34에 의해 매개된 단핵구 생존의 억제

항-인간 CSF-1R:

일차 인간 단핵구의 CSF-1 및 IL-34-유도된 생존 및 증식을 억제하는 정제된 항-인간 CSF-1R 항체의 능력을 시험하였다. 각각의 분석에서, 유사분열촉진제(mitogen)(CSF-1 또는 IL-34)는 단핵구의 최대 자극을 제공하는 농도로 사용되었다.

피콜(Ficoll) 구배 상에서 신선한 인간 전혈로부터 인간 PBMC들을 준비하고 단핵구를 음성 선택으로 정제하였다. 단핵구를 0.25 ㎍/㎖의 항체 및 20 ng/㎖의 CSF-1과 함께 72시간 동안 항온처리하고 셀타이터 글로 분석을 이용하여 생존 세포의 상대적 수를 측정하였다. 발광 판독치는 생존 세포의 수와 상호관련되어 있다. 결과는 도 5a에 표시되어 있다.

피콜 구배 상에서 신선한 인간 전혈로부터 인간 PBMC들을 준비하고 단핵구를 음성 선택으로 정제하였다. 단핵구를 0.25 ㎍/㎖의 항체 및 20 ng/㎖의 IL-34와 함께 72시간 동안 항온처리하고 셀타이터 글로 분석을 이용하여 생존 세포의 상대적 수를 측정하였다. 발광 판독치는 생존 세포의 수와 상호관련되어 있다. 결과는 도 5b에 표시되어 있다.

Ab969를 비롯한 4개의 항체들은 CSF-1(도 5a) 및 IL-34(도 5b) 자극 둘 다에 대해 남은 항체들에 비해 더 우수한 단핵구 생존 억제를 나타내었는데, 이것은 그들의 리간드 차단 활성과 일치한다.

항-마우스 CSF-1R:

마우스 비장으로부터 일차 뮤린 CD11b+ 단핵구를 정제하였다. 그 다음, 상기 단핵구를 뮤린 CSF-1(mCSF-1)의 적정물과 함께 24시간 동안 항온처리하였다. 세포 배지 내로의 MCP-1의 방출을 ELISA로 측정하였고 mCSF-1에 의한 MCP-1의 용량 의존적 방출을 입증하였다. 연구의 별개의 부문(arm)에서, 10 ㎍/㎖의 항-뮤린 CSF-1R Ab535를 mCSF-1 적정물과 함께 첨가하였다. MCP-1의 방출은 시험된 CSF-1의 모든 농도에서 Ab535에 의해 완전히 억제되었다(도 6).

100 ng/㎖의 일정한 CSF-1 농도를 가진 일차 뮤린 단핵구 및 Ab535의 적정물을 사용하여 MCP-1 방출 분석을 수행하였다. MCP-1 방출의 용량 의존적 억제를 입증하였고 IC₅₀을 계산하였다. 2회 독립적인 실험들로부터의 Ab535의 평균 IC₅₀은 8.08 ng/㎖인 것으로 측정되었다.

결론: CSF-1을 사용한 뮤린 단핵구의 처리는 MCP-1의 용량 의존적 방출을 야기하였고, 이것은 10 ㎍/㎖의 Ab535를 사용한 처리에 의해 완전히 억제되었다. Ab535는 용량 의존적 방식으로 뮤린 단핵구로부터의 CSF-1-유도된 MCP-1 방출을 억제하는데, 이때 평균 IC₅₀은 8.08 ng/㎖(n=2)이다. 이 IC₅₀ 값은 항-인간-CSF-1R 항체에 의해 나타난 IC₅₀ 값과 유사하다.

iv) 친화성

정제된 재조합 CSF-1R/Fc 융합 단백질에 대한 결합 동역학을 측정함으로써 비아코어 분석에서 CSF-1R에 결합하는 항체의 능력을 시험하였다.

분석 형식은 고정된 항-인간 IgG,F(ab')₂에 의한 항-CSF-1R 항체의 포획에 이은 포획된 표면 상에서의 hCSF-1R/Fc의 적정이었다. 비아코어 3000(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 아베(GE Healthcare Bio-Sciences AB))을 이용하여 BIA(생체분자 상호작용 분석)를 수행하였다. 모든 실험들을 25℃에서 수행하였다. 아민 커플링 화학반응을 통해 F(ab')₂ 단편 특이적 어피니퓨어(Affinipure) F(ab')₂ 단편 염소 항-인간 IgG(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))를 약 5000 반응 유닛(RU)의 수준까지 CM5 센서 칩(지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 아베) 상에 고정시켰다. HBS-EP 완충제(10 mM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20, 지이 헬쓰케어 바이오-사이언시스 아베)를 10 ㎕/분의 유속으로 런닝 완충제로서 사용하였다. 항-CSF-1R 항체의 주사를 수행하여 고정된 항-인간 IgG,F(ab)₂에 대한 대략 100 RU의 포획 수준을 제공하였다.

재조합 인간 CSF-1R/Fc(알앤드디 시스템스(R&D Systems))를 5분 동안 30 ㎕/분의 유속으로 5 nM의 포획된 항-CSF-1R 항체 상에 통과시킨 후, 해리 단계를 위해 유속을 30분 동안 100 ㎕/분까지 증가시켰다. 5 nM에서의 주사를 상응하는 완충제 대조군과 함께 2회 수행하였다. 이 센서그램들(sensorgrams)을 사용하여 해리 속도를 생성하였다. 재조합 인간 CSF-1R/Fc를 포획된 항-CSF-1R 항체 상에서 5분 동안 30 ㎕/분의 유속으로 2.5 nM부터 적정한 후, 10분의 해리 단계를 가졌다. 이 센서그램들을 사용하여 결합 속도를 생성하였다. 40 mM HCl의 10 ㎕ 주사에 이은 10 mM NaOH의 5 ㎕ 주사를 통해 표면을 10 ㎕/분의 유속으로 재생시켰다. 표준 절차 후 비아에발루션(BIAevaluation) 소프트웨어(버전 4.1)를 이용하여 이중 기준 배경 차감된 결합 곡선을 분석하였다. 피팅 알고리즘으로부터 동역학적 파라미터를 측정하였다.

시험된 4개의 항체들 중 3개의 항체들이 10 pM 미만의 친화성(K_D)을 나타내었다. 이것은 항-뮤린-CSF-1R 유사 시약인 Ab535와 유리하게 비교된다. Ab969 및 Ab535에 대한 결과는 하기 표 1에 표시되어 있다.

THP-1 세포를 사용한 세포-기초 분석으로 항체의 친화성도 측정하였다. 항체를 알렉사-488 형광 염료로 직접적으로 표지하고 친화성을 정량 유동 세포측정으로 측정하였다. 추가 비아코어 분석은 항체의 형광 접합이 재조합 CSF-1R 단백질에 대한 친화성을 변경시키지 않았다는 것을 확인시켜주었다. 결과는 표 2에 표시되어 있다.

2종의 방법들에 의해 유도된 절대 친화성 값들은 상이하고, 이 차이는 통상적으로 2개의 시스템들이 비교될 때 관찰된다. 그러나, 상기 세포-기초 방법은 항체가 높은 친화성으로 CSF-1R에 결합한다는 것을 입증하였다.

v) CSF -1 결합의 억제(IC ₅₀ )

CSF-1과 THP-1 세포의 결합을 억제하는 데에 있어서 항체의 상대적 효능을 측정함으로써 4개의 항체들을 분석하였다. 4개의 항체들 전부가 이 분석 형식에서 5 ng/㎖(약 30 pM) 미만의 IC₅₀ 값으로 CSF-1 결합의 강력한 억제를 나타내었다.

vi) 항체 교차반응성

붉은털 원숭이, 사이노몰구스 원숭이 및 개 전장 CSF-1R과의 교차반응성에 대해 4개의 항체들을 시험하였다. 4개의 항체들 전부가 동종형 대조군의 수준보다 유의하게 더 높은 명확한 결합을 나타내면서 인간 CSF-1R 이외에 붉은털 원숭이 및 사이노몰구스 CSF-1R에도 결합하였다.

vii) CSF -1R 내재화

Ab969:

THP-1 세포를 0시간, 0.5시간, 2시간, 4시간, 24시간 및 48시간 동안 Ab969와 함께 항온처리하였다. 또한, 세포를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 작용하는 인간 CSF-1 및 동종형 대조군으로 처리하였다. 각각의 시점에서 세포 표면 CSF-1R의 수준을 유동 세포측정으로 측정하였다(도 7). 동종형 대조군에 비해 Ab969로 처리된 세포 상에서의 세포 표면 CSF-1R의 상대적 수준을 계산하였고, 이 수준은 도 8에 표시되어 있다.

재조합 CSF-1을 사용한 THP-1 세포의 처리는 세포 표면 CSF-1R의 수준에서의 신속한 및 지속된 감소를 야기하였고; 천연 리간드는 그의 동족 수용체에 결합하고 리간드-수용체 복합체의 내재화를 유도한다.

Ab969로 처리된 THP-1 세포는 총 48시간의 시간 경과 전체에 걸쳐 비처리된 THP-1 세포 및 동종형 대조군으로 처리된 THP-1 세포에 비해 더 높은 수준의 세포 표면 CSF-1R 발현을 나타내었다. 이 데이터는 Ab969를 사용한 THP-1 세포의 치료가 세포 표면에서 발현된 hCSF-1R의 내재화를 처리 후 48시간까지 야기하지 않는다는 것을 강하게 암시한다.

시간 경과가 진행됨에 따라, CSF-1로 처리된 세포를 제외하고 비처리된 THP-1 세포 및 처리된 THP-1 세포의 세포 표면에서 발현된 CSF-1R에서의 현저한 증가가 있었다. 이것은 48시간의 실험 기간에 걸쳐 세포 생장 기간 동안의 발현 변화에 기인할 것이고 잠재적으로 스트레스 반응일 수 있다.

Ab969가 수용체 내재화를 증강시키지 않는다는 추가 증거를 제공하고 THP-1 세포주가 생리학적으로 적절하지 않을 가능성을 배제하기 위해, 일차 인간 단핵구도 내재화 분석에서 사용하였다. 이 분석으로부터의 데이터도 Ab969가 건강한 일차 인간 단핵구 상의 세포 표면 CSF-1R의 신속한 내재화를 야기하지 않는다는 것을 입증하였다.

Ab535:

마우스 백혈병 단핵구/대식세포 세포주 RAW264.7은 높은 수준의 뮤린 CSF-1R(mCSF-1R)을 발현하고 항-뮤린 CSF-1R 항체 Ab535가 수용체 내재화를 유발할 수 있는지를 시험하기에 적합한 세포-기초 시스템을 대표한다.

RAW264.7 세포를 0시간, 0.5시간, 2시간, 4시간, 24시간 및 48시간 동안 Ab535와 함께 항온처리하였다. 또한, 세포를 각각 양성 대조군 및 음성 대조군으로서 작용하는 인간 CSF-1 및 동종형 대조군으로 처리하였다. 각각의 시점에서 세포 표면 CSF-1R의 수준을 유동 세포측정으로 측정하였다(도 9). 동종형 대조군에 비해 세포 표면 CSF-1R의 상대적 수준을 계산하였고, 이 수준은 도 10에 표시되어 있다.

데이터는 재조합 CSF-1을 사용한 THP-1 세포의 처리가 세포 표면 CSF-1R의 수준에서의 신속한 및 지속된 감소를 야기하였다는 것을 보여준다.

비처리된 세포 및 동종형 대조군으로 처리된 세포에 비해 2시간 동안 인간 CSF-1로 처리된 RAW264.7 세포 상에서 세포 표면 mCSF-1R 수준의 명확한 감소를 관찰하였다. 이 감소는 48시간의 연구 전체에 걸쳐 유지된다. 이것은 인간 CSF-1이 mCSF-1R의 내재화를 유발한다는 것을 입증하고 수용체 내재화를 모니터링하기 위한 발현 시스템을 검증한다.

Ab535로 처리된 RAW264.7 세포는 총 48시간의 시간 경과 전체에 걸쳐 비처리된 세포 및 동종형 대조군으로 처리된 세포와 비교될 때 유사한 수준의 세포 표면 mCSF-1R을 나타낸다. 항체에 의해 매개된 수용체 내재화가 이 기간 내에 일어날 것으로 예측되기 때문에, 이 데이터는 Ab535가 mCSF-1R 내재화를 유발하지 않는다는 것을 강하게 암시한다.

Ab535가 수용체 내재화를 증강시키지 않는다는 추가 증거를 제공하기 위해, 일차 뮤린 CD11b⁺ 단핵구-대식세포를 내재화 분석에서 사용하였다. 이 결과도 Ab535를 사용한 마우스 단핵구-대식세포의 처리가 세포 표면에 발현된 mCSF-1R의 내재화를 처리 후 24시간까지 야기하지 않는다는 것을 입증하였다.

viii) CSF1 -R 활성화

CSF-1은 CSF-1R에 결합함으로써, 키나제 도메인들을 함께 가까이 인접하게 함으로써 신속한 수용체 인산화를 유발하는 수용체 이량체 형성을 야기한다. 그 후, 이것은 수용체 내재화, 및 Ras-MAPK 경로를 비롯한 여러 잘 특징규명된 신호 전달도입 경로들의 활성화를 유발한다. 항-CSF-1R 항체가 수용체 밀집(clustering)을 이끌어낼 수 있고 하류 신호전달 캐스케이드(cascade)를 유발할 수 있는 가능성이 있다. 이것은 수용체 신호전달을 억제할 항체에 바람직하지 않은 성질일 수 있으므로, 2개의 독립적인 시험관내 분석 형식들을 이용하여 Ab969에 의한 수용체 아고니즘(agonism)을 시험하였다.

제1 분석 형식에서, 항체를 인간 전장 CSF-1R로 형질감염된 세포와 함께 항온처리하고, 수용체 및 하류 신호 전달도입 분자의 인산화를 웨스턴 블롯팅으로 모니터링하였다.

THP-1 세포주는 CSF-1R의 활성화 상태를 모니터링하기 위한 출발점을 나타내었다. 그러나, 이 세포주에서 CSF-1R의 발현 수준은 생화학적 분석을 수행하는 것을 어렵게 만들 정도로 상대적으로 낮다. 따라서, CSF-1R 인산화의 수준이 강하게 검출될 수 있도록 실험 시스템을 고안하였다. CSF-1R의 인산화는 2개의 티로신 잔기들인 Y723 및 Y809에서 검출될 수 있다. 또한, T202 및 Y204에서의 p44/42 MAPK(Erk1/2)의 인산화를 CSF-1R 활성의 독립적인 판독치로서 측정하였다. CSF-1을 사용한 자극을 모든 실험들에서 양성 대조군으로서 포함시켰다.

전장 CSF-1R을 발현하는 플라스미드 벡터를 사용하여 HEK293F 세포를 형질감염시켰다. 세포를 무혈청 조건 하에서 24시간 동안 항온처리한 후 5분 동안 Ab969.g0의 100 ㎍/㎖ 내지 0.001 ㎍/㎖ 적정물로 자극하였다. 또한, 세포를 500 ng/㎖의 재조합 CSF-1로 처리하여 양성 대조군을 제공하였다. 비처리된 세포를 음성 대조군으로서 포함시켰다. 처리된 세포 및 비처리된 세포로부터의 단백질 용해물을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분리하고 니트로셀룰로스 상으로 블롯팅하였다. 인-Y723 CSF-1R(셀 시그날링 테크놀로지 #3151), 인-Y809(셀 시그날링 테크놀로지 #3154), 총 CSF-1R(셀 시그날링 테크놀로지 #3152) 및 인-ERK1/2(p44/42 MAPK)(셀 시그날링 테크놀로지 #5301)에 대한 항체들을 사용하여 웨스턴 면역블롯팅을 수행하였다.

비자극된 CSF-1R-형질감염된 HEK293F 세포는 낮은 기초 수준의 CSF-1R 인산화를 나타내었다. CSF-1을 사용한 세포의 자극은 잔기 Y723 및 Y809에서 일정한 수준의 CSF-1R 인산화를 유발하였고, 이것은 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 용이하게 관찰되었다(도 11). CSF-1 처리 시 ERK1/2 인산화의 명확한 자극도 존재하였다. 항체 Ab969.g0을 사용한 형질감염된 HEK293F 세포의 처리는 CSF-1R의 인산화를 자극하지 않았거나 ERK1/2 활성화를 증강시키지 않았다.

제2 분석에서, 항체 Ab969(단량체성 및 가교됨)를 일차 인간 단핵구와 함께 항온처리하였고 MCP-1 분비를 CSF-1R 활성화의 마커로서 이용하였다. 인간 단핵구의 CSF-1 처리는 인간 단핵구가 단핵구 화학유인제 단백질-1(MCP-1)을 방출하게 한다. 항-CSF-1R 항체가 단핵구 상의 CSF-1R 수용체를 활성화시키는 능력을 가진 경우, MCP-1의 방출이 일어날 것으로 예측될 것이다.

이전에 기재된 생화학적 분석들은 단량체성 항-CSF-1R 항체만을 사용하였다. 그러나, 교차연결된 IgG1이 CSF-1R 분자들을 가까이 인접하게 하고 티로신 인산화 및 하류 신호전달을 유발하는 향상된 능력을 가질 가능성이 있다. 이를 평가하기 위해, 항-인간-Fc 항체와 교차연결된 Ab969.g0을 사용하여 MCP-1 분석도 수행하였다.

다음과 같이 인간 전혈로부터 인간 단핵구를 준비하였다: 60 내지 100 ㎖의 인간 전혈을 BD 바큐테이너(Vacutainer) 10 ㎖ 리튬 헤파린 171 IU 튜브 내에 채취하였다. 혈액을 3개 또는 4개의 류코셉 피콜(Leucosep Ficoll) 튜브(그레이너 바이오-원(Greiner Bio-One)) 내로 분할하고 PBS로 토핑하였다. 튜브를 중단 없이 10분 동안 1000g 및 20℃에서 원심분리하고 PBMC 층을 채취하였다. 세포를 펠렛화한 후, 양성 선택 인간 CD14 비드(밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) 130-050-201)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 단핵구를 단리하였다. 2:1 Ab969.g0:Fc의 비로 염소 항-인간 IgG Fc 항체(알앤드디 시스템스 G-102-C)를 첨가함으로써 항체 Ab969.g0을 가교하였다. 단핵구를 항체 Ab969.g0 또는 가교된 Ab969.g0의 용량 적정물(16개의 농도를 포함하는 일련의 절반-로그 희석물들, 최대 10 ㎍/㎖)의 존재 하에서 배지에 웰당 20,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 대조군 웰은 100 ng/㎖ CSF-1의 존재 및 부재 하에서, 및 (항체 Ab969.g0의 최대 농도(5 ㎍/㎖)로 존재하는 동일한 농도의) 항-인간-Fc 항체의 존재 및 부재 하에서 항체를 함유하지 않았다. 세포를 24시간 동안 항온처리하고 플레이트를 회전시켜 세포를 펠렛화하고 상청액을 채취하였다. 분비된 MCP-1을 제조자의 프로토콜에 따라 MSD(K151AYB-2)로 측정하였다.

상기 실험으로부터의 결과는 도 12에 표시되어 있다. 단량체 형식 또는 가교된 형식의 Ab969.g0 처리들 중 어느 처리의 경우에도 MCP-1 수준의 증가가 검출되지 않았다. 즉, 처리된 세포의 배지 중의 MCP-1의 농도는 비처리된 세포와 동일하였다. 예측된 바와 같이, CSF-1로 처리된 세포는 MCP-1 수준의 유의한 및 재현가능한 증가를 제공하였다.

실시예 3: 항체 969의 인간화 및 인간화된 이식편의 선택

4개의 항-CSF-1R 항체들을, 실시예 2에서 측정된 그들의 친화성 및 성질을 기초로 인간화를 위해 선택하였다.

i) 인간화된 이식편의 생성

래트 항체 V-영역으로부터의 CDR들을 인간 생식세포계열 항체 V-영역 골격 상으로 이식함으로써 항체 969 및 970을 인간화하였다.

공여자로부터 수용자 서열로 이식된 CDR들은 조합된 초티아/카바트 정의가 이용된 CDR-H1을 제외하고 카바트(Kabat et al., 1987)에 의해 정의된 바와 같다(국제 특허출원 공보 제WO91/09967호(Adair et al., 1991 Humanised antibodies) 참조).

인간 V-영역 VK1 2-1-(1) O12 + JK4 J-영역(V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)을 경쇄 CDR들에 대한 수용자로서 선택하였다. 인간 V-영역 VH2 3-1 2-70 + JH3 J-영역(V BASE, http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)을 중쇄 CDR들에 대한 수용자로서 선택하였다.

표 1에 표시된 바와 같이, 래트 V-영역으로부터의 다수의 골격 잔기들이 인간화된 서열에 보유되었다.

각각 gL1 및 gH1로서 명명된, 초기 인간화된 경쇄 및 중쇄 V-영역 서열들을 코딩하는 유전자들을 자동화된 합성 방식으로 디자인하고 구축하였다. 올리고뉴클레오타이드-유도된 돌연변이유발로 gL1 및 gH1 유전자들을 변경시킴으로써 경쇄 및 중쇄 V-영역들 둘 다의 추가 변이체를 생성하였다.

인간 카파 쇄 불변 영역(Km3 동종이인자형)을 코딩하는 DNA를 함유하는 인간 경쇄 발현 벡터 pKH10.1 내로 VK 유전자들(gL1 내지 gL9)을 클로닝하였다. 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 가진 인간 감마-4 중쇄 불변 영역을 코딩하는 DNA를 함유하는 인간 감마-4 중쇄 발현 벡터 pVhγ4P FL 내로 VH 유전자들(gH1 및 gH2)을 클로닝하였다(Angal et al., 1993, Mol Immunol. 30:105-8). 변이체 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 플라스미드들의 상이한 조합물들을 HEK293F 내로 공-형질감염시켜 인간화된 재조합 969 항체를 발현시켰다.

중요할 것으로 예측되는, 중쇄 및 경쇄 내의 다수의 공여자 잔기들을 함유하는 보존적 이식편, 및 공여자 잔기를 함유하지 않는 전체 인간화된 이식편을 제공함으로써 다른 3개의 항-CSF-1R 항체들도 인간화하였다.

ii) 인간화된 항체의 친화성

각각의 인간화된 이식편을 (i) 비아코어로 인간 CSF-1R에 대한 결합 친화성에 대해 평가하였고 (ii) 써모플루오르(ThermoFluor) 분석으로 용융 온도(Tm)를 측정하였는데, 이들 둘 다가 키메라 모항체와 비교되었다. 용융 온도는 항체 분자의 안정성의 초기 표시를 제공하는 것으로 생각되는데, 이때 불안정한 항체는 전형적으로 75.0℃ 미만의 Tm을 나타낸다.

Ab969의 인간화의 단계를 대표하는 이식편들이 표 5에 표시되어 있다. 표 5는 Ab696의 키메라 항체(969cHcL)도 보여준다. 보존적 이식편(969gH1gL1)은 2.4 pM의 친화성 상수(K_D)를 나타내었으므로, 키메라 래트 항체(969cHcL)에 비해 명백한 친화성 손실이 없었다. 969gH1gL1 보존적 이식편의 Tm은 78.8℃이었으므로 역치 값 75.0℃보다 더 높았다. 969gH2gL1을 생성하기 위해 중쇄에서 A78 공여자 잔기를 V78로 치환시켰을 때 항체 친화성이 감소되지 않았다(K_D=2.3 pM). K38, Y71 및 F87 공여자 잔기를 각각 Q38, F71 및 Y87로 단계적으로 치환시켰을 때, 친화성의 변화가 관찰되지 않았다. 공여자 잔기를 함유하지 않는 최종 인간화된 이식편 969gH2gL8은 키메라 모항체와 유사한 친화성을 나타내었다(4.1 pM).

Ab969는 CDR-L2와 골격의 연접부에서 잠재적 DG 이성질체화 모티프를 보유한다. 969gH2gL7 및 969gH2gL8 이식편들 내의 이 DG 부위인 아스파르트산 잔기를 세린으로 돌연변이시켜 불활성 SG 서열을 제공하였다. CSF-1R에 대한 친화성을 비아코어로 측정하였고 친화성의 명백한 손실이 검출되지 않았다(표 6). 더욱이, 최종 969H2gL7(SG) 및 969gH2gL8(SG) 이식편들은 각각 80.5℃ 및 79.9℃의 높은 Tm을 보유하였다.

Ab969 및 다른 한 항-CSF-1R 항체인 Ab970의 인간화는 키메라 모항체와 동등한 친화성(K_D), 및 분자 안정성의 초기 예측을 제공한 Tm을 가진 전체 인간화된 항체(존재하는 래트 공여자 잔기 없음)를 생성하였다. Ab969의 전체 인간화된 버전(969gH2gL8 SG)은 Ab969.g5로서 다시 명명되었다. 지금부터 Ab969의 키메라 버전은 Ab969.g0으로서 지칭될 것이다.

비아코어 분석을 이용하여 재조합 CSF-1R에 대한 Ab969 항체의 정제된 키메라 및 인간화된 이식편들의 친화성을 다시 측정하였다. 인간화 과정 동안 수행된 이전 비아코어 실험을, 정제된 항체보다는 오히려 미정제 세포 상청액을 사용하여 수행하였다. 친화성의 약간의 감소가 검출되었는데, 이때 K_D 값은 대략 4 pM부터 5 pM까지 증가되었다.

iii) Ab969.g0 및 Ab969.g5에 의한 CSF -1- 매개된 단핵구 생존의 억제

CSF-1은 배양물 중의 단핵구의 활성화 및 생존을 위해 요구된다. 즉, CSF-1이 제거되는 경우, 단핵구는 신속히 아폽토시스를 겪는다. 판독대상으로서 MCP-1(단핵구 화학주성 단백질-1; CCL2(케모카인 C-C 모티프 리간드 2)로서도 공지됨)을 사용하는 분석을 고안하였다. CSF-1 자극 시, 인간 단핵구는 전형적으로 자극으로부터 24시간 후 ELISA에 의해 세포 상청액에서 검출될 수 있는 MCP-1을 분비한다. CSF-1 결합을 차단하는 항체에 의한 CSF-1R 신호전달의 억제는 MCP-1 분비의 감소를 야기한다.

피콜 구배 상에서 신선한 인간 전혈로부터 인간 PBMC들을 준비하고 CD14⁺ 단핵구를 양성 선택으로 정제하였다. 총 2x10⁴개의 단핵구들을 24시간 동안 100 ng/㎖ 인간 CSF-1의 존재 하에서 10 ㎍/㎖부터 0.35 pg/㎖까지 항체의 일련의 절반-로그 희석물들과 함께 항온처리하였다. '항체 부재 및 CSF-1 부재' 및 '항체 부재 및 CSF-1 존재'를 포함하는 대조군들을 포함시켜 최소 MCP-1 방출 값 및 최대 MCP-1 방출 값을 제공하였다. 24시간의 항온처리 후, 세포를 원심분리로 펠렛화하고 상청액을 채취하였다. 인간 CCL2/MCP-1 듀오셋(DuoSet) ELISA(알앤드디 시스템스 DY279)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 MCP-1의 농도를 측정하였다.

이하, 상기 분석은 'MCP-1 억제 분석'으로서 지칭된다.

MCP-1 억제 분석을 이용하여 인간화된 969.g5의 활성을 키메라 Ab969.g0의 활성과 비교하였다. 단핵구의 4개 상이한 공여자들을 사용하여 5회의 독립적인 분석들을 수행하였다. 모든 분석들에서, Ab969.g5 인간화된 이식편은 키메라 모항체 969.g0에 비해 예상외로 유의하게 더 낮은 활성을 나타내었다. 단일 대표적인 실험이 도 13에 제시되어 있다. 단핵구 분석에서 969.g0에 대한 평균 IC₅₀은 969.g5에 대한 333.0 ng/㎖에 비해 24.6 ng/㎖이었다. 이것은 이 분석 형식을 이용하여 두 항체들을 비교할 때 항체 효능의 13.5배 감소를 표시한다.

인간화된 항체가 MCP-1 억제 분석에서 감소된 활성을 나타낸 이유를 밝히기 위해 Ab969를 사용하여 일련의 실험들을 수행하였다. 데이터는 MCP-1 억제 분석에서 관찰된 Ab969.g5의 활성 손실이 항체 및 리간드를 표적 세포에 첨가한 순서에 기인하였다는 것을 암시하였다. 경쟁 분석 형식이 적용될 때 Ab969.g0 및 Ab969.g5 둘 다의 활성이 감소되었으나, 보다 더 중요한 것은 그들의 차단 활성에서의 보다 더 큰 차이가 검출되었다는 것이다. 인간화된 Ab969의 보다 더 낮은 '결합 속도'가 효능 감소의 원인일 수 있는지를 분석하기 위해, 바이코어 분석을 수행하였다. 이 데이터는 Ab969.g0 및 Ab969.g5의 K_D가 유사하였지만, Ab969.g5에 대한 K_a가 969.g0에 대한 2.16x10⁶ M^-1s^-1의 K_a에 비해 1.57x10⁶ M^-1s^-1로 더 낮았다는 것을 확인시켜주었다(표 5 참조). 경쟁 분석에서, CSF-1 및 항-CSF-1R 항체가 동일한 수용체와의 결합에 대해 경쟁하는 경우, 리간드에 대한 결합 속도도 높고 리간드가 높은 농도로 존재한다면 보다 더 느린 항체 결합 속도는 차단 활성을 감소시킬 수 있다. 인간 CSF-1이 상기 항체들과 유사한 2.19x10⁶ M^-1s^-1의 특히 높은 결합 속도를 가진다는 것은 공지되어 있고, 높은 CSF-1 농도(250 ng/㎖)로 상기 분석을 수행하였다.

969.g5의 차단 활성의 감소가 항체의 고유 성질에 기인하였다는 추가 증거를 제공하기 위해, CSF-1과 CSF-1R의 결합을 측정하는 ELISA를 개발하였다. 이 방법은 지금부터 'ELISA 리간드 차단 분석'으로서 지칭된다. 경쟁 결합을 이용하여 이 분석을 수행하였는데, 이때 CSF-1 및 항체를 플레이트에 결합된 CSF-1R에 적용하기 전에 미리 혼합하였다. 또한, 항체 활성에 대한 CSF-1 농도의 영향을 평가하기 위해 상기 분석을 수행하였다.

1 ng/㎖의 CSF-1 농도를 이용하여 리간드 차단 ELISA에서 969.g0 및 969.g5의 IC₅₀을 측정하였을 때, 이 항체들 둘 다가 각각 12.83 ng/㎖ 대 19.65 ng/㎖의 IC₅₀으로 유사한 활성을 갖는 것으로 보였다. 10 ng/㎖ CSF-1의 농도를 상기 분석에서 사용하였을 때, Ab969.g0 및 Ab969.g5 둘 다의 IC₅₀이 증가하였으나, 보다 중요한 것은 이들 사이의 차이가 각각 79.29 ng/㎖ 및 268.10 ng/㎖까지 더 증가하였다는 것이다. 100 ng/㎖ CSF-1을 사용한 분석에서 상기 경향은 계속되었는데, 이때 Ab969.g0 및 Ab969.g5는 각각 828.70 ng/㎖ 및 3947.00 ng/㎖의 IC₅₀ 값을 제공하였다. 경쟁 분석은 CSF-1과 CSF-1R의 결합을 차단하는 데에 있어서 Ab969.g5가 Ab969.g0보다 더 낮은 활성을 가진다는 것을 입증한다. 효능의 이 감소는 CSF-1의 농도가 증가할 때 더 현저해진다.

iv) MCP-1 억제 분석에서 키메라 Ab969와 동등한 활성을 가진 Ab969의 인간화된 이식편의 확인

시험관내 활성이 비교될 수 있도록 일시적인 발현으로 Ab969 인간화된 중간 이식편들의 패널을 제조하였다(표 8). 항체 특성의 직접적인 비교가 동일한 배치(batch) 내에서 이루어질 수 있도록 상응하는 키메라 항체(Ab969.g0) 및 전체 인간화된 이식편(Ab969.g5)도 일시적인 발현에 포함시켰다.

각각의 항체의 시험관내 활성을 MCP-1 억제 분석에서 시험하였다. 단일 농도의 항체를 사용한 CSF-1 적정을 이용하는 분석 형식이 큰 항체 패널의 신속한 스크리닝을 가능하게 하고 임의의 상이한 CSF-1R 차단 활성을 강조하기 때문에 선택되었다. 이 분석에서, 일차 인간 단핵구로부터의 MCP-1의 용량 의존적 방출을 검출하였고 CSF-1R 활성을 차단하는 각각의 항체의 상대적 능력을 MCP-1이 방출된 경우의 CSF-1 농도로 측정하였다. 재조합 인간 CSF-1의 적정물(18개 농도를 포함하는 일련의 2배 희석물, 최대 500 ng/㎖)의 존재 하에서 단핵구를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 배지에 시딩하였다. 단회 용량의 1 ㎍/㎖ 항체를 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 항온처리하고 상청액을 채취하였다. 분비된 MCP-1을 ELISA로 측정하였다. MCP-1 억제 분석은 항체 Ab969.g2 및 Ab969.g7이 높은 CSF-1R 차단 활성을 보유하였다는 것을 보여주었는데, 이때 상기 두 항체들은 CSF-1이 100 ng/㎖의 농도로 단핵구에 첨가되었을 때 MCP-1 분비를 완전히 억제할 수 있었다(도 14). 이 분석에서, 유일하게 10 ng/㎖의 CSF-1 농도까지 MCP-1 분비를 억제할 수 있었던 Ab969.g5의 경우 활성의 명확한 손실이 검출되었다. 유사하게, 항체 Ab969.g9는 Ab969.g2 및 Ab969.g7에 비해 감소된 CSF-1R 차단 활성을 나타내었다.

선택된 Ab969 인간화된 이식편들의 IC₅₀을 MCP-1 분석에서 측정하여 CSF-1에 의해 매개된 단핵구 활성화를 억제하는 그들의 상대적 능력의 보다 더 철저한 평가를 제공하였다. 혼합된 공급원으로부터의 단핵구들의 풀링(pooling) 없이 여러 상이한 공여자들을 사용하여 항체 활성을 평가하는 것이 중요한 것으로 간주되었다. 표 9는 6개의 상이한 공여자들을 사용하여 Ab969에 대해 수행한 분석으로부터 축적된 항체의 IC₅₀ 값을 보여준다.

Ab969.g2 및 Ab969.g7 인간화된 이식편들 둘 다가 키메라 Ab969.g0 항체에 필적할만한 상대적 IC₅₀을 나타낸다. 완전히 대조적으로, Ab969.g5는 상기 분석에서 훨씬 더 낮은 효능을 나타낸다(19.6의 평균 키메라/이식편 IC₅₀ 비).

v) 인간화된 Ab969 항체 패널의 친화성

각각의 Ab969 인간화된 항체 이식편 및 키메라 모항체의 친화성을 비아코어로 측정하였는데(표 10), 이때 3회의 독립적인 실험들을 수행하였고 평균 값을 계산하였다. 데이터는 키메라 분자(Ab969.g0)부터 '전체 인간화된' 항체 Ab969.g5까지 인간화되는 과정 동안 친화성(K_D)이 변하지 않는 듯하다는 것을 보여준다. 그러나, 인간화가 Ab969.g2 이식편을 넘어 진행될 때 항체 '결합 속도'는 감소한다. 즉, Ab969.g4 및 Ab969.g5 둘 다가 이전 이식편들보다 더 낮은 K_a 값을 보유한다. 더욱이, Ab969.g5에 대한 K_a는 Ab969.g4보다 더 낮은데, 이것은 SG로의 DG 이성질체화 부위의 돌연변이가 항체 결합 속도를 여전히 더 감소시킨다는 것을 잠재적으로 시사한다.

결론:

여러 분석들에서 Ab969 인간화된 이식편들의 패널의 시험은 경쇄 내의 위치 71에 존재하는 티로신 잔기(예를 들면, Y71)가 상기 항체의 활성을 개선하였다는 것을 보여주었다. 예를 들면, 페닐알라닌에 의한 Y71의 치환은 키메라 모분자에 비해 항체 결합 속도를 감소시킨다(감소된 K_a). 이것은 일차 인간 단핵구에서 CSF-1R의 활성을 모니터링하는 분석(MCP-1 억제 분석)에서 밝혀진 바와 같이 CSF-1과 CSF-1R의 결합을 차단하는 항체의 능력을 감소시킨다.

실시예 4: 인간화된 Ab969 패널의 분자 안정성

i) 열안정성

(용융 온도 Tm으로서 측정된) 열안정성을 2종의 독립적인 방법들, 즉 형광 염료를 노출된 소수성 표면에 결합시킴으로써 언폴딩(unfolding)을 모니터링하는 한 방법(써모플루오르 방법) 및 오르토고날(orthogonal) 기법인 열량측정법(DSC)으로 측정하였다.

써모플루오르에 의해 측정된, (PBS(pH 7.4) 중의) 항체 969의 다양한 이식편들에 대한 Tm은 하기 표 11에 요약되어 있다.

종합하건대, 써모플루오르에 의해 측정된 Fab' Tm은 대부분의 969 이식편들이 IgG4 대조군보다 열적으로 더 안정하다는 것을 암시한다.

ii) 응집 성향에 대한 샘플 농도의 영향

저장 동안 샘플 안정성의 예측자로서 PBS(pH 7.4)에서의 안정성에 대한 항체 농도의 영향을 연구하였다.

실험 1:

항체를 10 mg/㎖ 초과의 농도까지 농축하고 5일 동안 실온에서 항온처리하였다. 농축 직후(T₀), 969.g7은 탁하게 보였고 969.g8은 약간 오팔색으로 보였다. 대조적으로, 969.g5 샘플은 시각적 검사에 의해 투명한 것으로 판단되었다. 5일 동안 실온에서 항온처리한 후, 965.g5 샘플은 투명한 상태로 남아있는 반면, 969.g7 및 969.g8의 응집은 각각 무거운 침전물을 나타내면서 더 진행되었다.

이 연구로부터 이 조건들에서 응집에 대한 내성의 순서로 샘플들의 순위를 다음과 같이 매길 수 있었다: 969.g5 > 969.g8 > 969g7.

실험 2:

농축 전, 모든 3개의 항체 샘플들은 오팔색으로 보이는 969.g6(4.68 mg/㎖)을 제외하고 시각적 검사 시 투명하였다. 16 mg/㎖까지 농축하였을 때, 969.g6의 침전은 실온 및 4℃ 둘 다에서의 24시간 저장 후 현저하였다. 그러나, 969.g1 및 969.g4 둘 다가 시각적으로 투명한 상태로 남아있었다. 5일의 추가 항온처리 후, 실온 및 4℃ 둘 다에서 샘플 969.g1의 경우 큰 입자가 눈에 띄었다. 시각적 검사에 의해 판단되었을 때 실온 또는 4℃에서 샘플 969.g4의 경우 응집이 관찰되지 않았다.

이 연구로부터, 969.g6이 PBS(pH 7.4)에서 저농도(4.68mg/㎖)로 저장되었을 때 약간의 응집 불안정성을 가졌다는 것을 보여줄 수 있었다. 더욱이, 이 침전은 추가 항체 농축에 의해 악화되었다. 농축된 969.g1은 보다 더 느린 응집 속도를 보인 반면, 농축된 969.g4는 어느 저장 온도에서든 5일까지 안정한 상태로 남아있었다. 따라서, 응집에 대한 안정성의 순서는 969.g4 > 969.g1 > 969.g6이었다.

실험 3: 항체 969.g2, 969.g5, 969.g7 및 969.g9

농축 직후(T₀), 밤샘 항온처리 후 및 농축으로부터 5일 후, 샘플에 대한 분석을 수행하였다. 시각적 검사 시 모든 샘플들은 농축 전에 투명하였고, 입자 형성의 증거는 없었다. 23.07 mg/㎖까지 농축한 직후, 969.g7 샘플은 실험 1에서 이미 관찰된 바와 같이 침전을 보였다. 969.g9의 경우 관찰된 약간의 오팔색이 있었고, 이것은 실온 또는 4℃에서의 24시간 저장 후 더 현저해졌다. 다른 969 이식편들 전부가 농축 직후 시각적 검사 시 투명한 것으로 보였다.

21일의 항온처리 후, 실온에서 밤새 항온처리한 후 관찰된 시각적 변화로부터의 추가 시각적 변화는 없었다. 즉, 969.g7 및 969.g9 이식편들 둘 다가 샘플 농축의 결과로서 응집된 반면, 다른 샘플의 경우에는 명확히 보이는 응집이 없었다.

종합하건대, 969.g2 샘플은 농도 증가의 결과로서 최소한의 응집 성향을 보였다. 이것은 써모플루오르에 의해 관찰된 가장 높은 Tm과도 상호관련되어 있었다.

결론: 인간화된 Ab969 패널의 발현 및 정제 동안 항체 농도를 10 mg/㎖ 초과의 수준까지 증가시킨 것은 일부 인간화된 항체 이식편들의 신속한 침전을 초래하였다는 것이 명확해졌다. 구체적으로, Ab969.g1, Ab969.g6 및 Ab969.g7은 침전물을 형성한 반면, Ab969.g2, Ab969.g4 및 Ab969.g5는 그러하지 않았다. 이 데이터는 경쇄 내의 위치 38에 존재하는 라이신 잔기(K38)를 글루타민으로 치환시킨 것이 10 mg/㎖ 초과의 수준까지 농축될 때 항체 안정성을 개선한다는 것을 시사한다.

실시예 5: Ab969.g2의 시험관내 분석

i) Ab969.g2의 서열

Ab969.g2는 gL7 경쇄 이식편 및 gH2 중쇄 이식편을 함유한다. 래트 항체(공여자) V-영역 서열과 인간 생식세포계열(수용자) V-영역 서열의 정렬은 경쇄 이식편 gL7 및 중쇄 이식편 gH2에 대한 최종 인간화된 서열과 함께 도 2a 및 2b에 표시되어 있다.

이식편 gH2 내의 중쇄 골격 잔기들은 모두 인간 생식세포계열 유전자로부터 유래된다. 인간 중쇄 골격의 위치 1에 존재하는 글루타민 잔기를 글루탐산(E1)으로 대체하여, 예를 들면, 항체 및 항체 단편의 N-말단에서 글루타민을 피로글루타메이트로 전환시킴으로써 균질한 생성물의 발현 및 정제를 개선하였다.

공여자 잔기 티로신이 보유된 잔기 71(카바트 넘버링)을 제외하고 이식편 gL7 내의 경쇄 골격 잔기들은 모두 인간 생식세포계열 유전자로부터 유래된다. 이 잔기의 체류는 실시예 3에서 입증된 바와 같이 인간화된 항체의 개선된 효능을 제공하였다.

ii) IL-34 의존적 인간 단핵구 활성화의 억제

969.g0에 비해 Ab969.g2의 활성을 IL-34 의존적 인간 단핵구 분석에서 평가하였다. 2개의 별개의 단핵구 공여자들을 사용하여 실험을 수행하였고, IL-34에 의해 매개된 단핵구 자극의 억제에 대한 평균 IC₅₀을 계산하였다(표 12). Ab969.g2와 Ab969.g0 사이에 IC₅₀의 유의한 차이는 없었다.

100 ng/㎖의 재조합 인간 IL-34 및 항-CSF-1R 항체의 용량 적정물(16개의 농도를 포함하는 일련의 절반-로그 희석물, 최대 10 ㎍/㎖)의 존재 하에서 일차 인간 단핵구를 웰당 20,000개 세포의 밀도로 시딩하였다. 세포를 24시간 동안 항온처리하고 상청액을 채취하였다. 분비된 MCP-1을 ELISA(알앤드디 시스템스 DY279)로 측정하였다. 그래프는 CSF-1 단독 대조군에 비해 MCP-1 생성의 백분율 억제를 보여준다.

iii) Ab969.g2와 인간 CSF -1R의 SNP들의 결합

인간 집단에서 보고된 인간 CSF-1R 유전자의 리간드 결합 도메인 내에는 의미가 동일하지 않은 4개의 단일 뉴클레오티드 다형성들(SNP들)이 위치한다. 이 SNP들은 V32G, A245S, H247P 및 V279M이다(도 1f). 인간 CSF-1R의 각각의 SNP 변이체를 생성하고 세포주에서 안정하게 발현시켰다. Ab969.g2와 각각의 SNP의 결합을 유동 세포측정으로 확인하였다.

실시예 6: 사이노몰구스 원숭이에서의 약력학적 마커 분석

인간화된 단일클론 항-CSF-1R 항체 969.g2를 사용한 약동학적/약력학적(PK/PD) 연구를 수행하여 비인간 영장류(사이노몰구스 원숭이)에서 항체의 약리학적 활성을 입증하였다. 단회 용량의 7 mg/kg(군 1) 또는 1.5 mg/kg(군 2) 969.g2 항체를 3마리 사이노몰구스 원숭이들의 군들에게 정맥내로 투약하였다. 상기 항체는 불리한 임상 징후 없이 우수한 내약성을 보였다. 25일의 연구 전체에 걸쳐 다수의 시점들에서 혈청 샘플을 채취하였다.

969.g2의 혈청 농도를 ELISA로 측정하고 약력학적 분석을 수행하였다(표 13). 윈놀린(WinNonlin) 소프트웨어를 이용하여 PK 파라미터를 계산하였다.

t_1/2은 혈청 중의 항체의 반감기이다.

C_max는 혈청 중의 항체의 피크 농도이다.

AUC는 곡선하면적(농도-시간 곡선의 적분)이고 약물에의 총 노출의 표시를 제공한다.

제거(Clearance)는 단위 시간당 약물이 없는 혈장의 부피이다.

부피 분포는 분포의 부피로서 약물이 분포되어 있는 겉보기 부피이다.

관찰된 값과 예측된 값 사이에 우수한 상관관계가 존재하였다(동물 2는 예외이고 이상치로서 간주됨). C_max는 용량에 비례하였고; AUC는 보다 더 크게 용량 비례적이었는데, 이것은 보다 더 높은 용량에서 보다 더 느린 제거를 시사한다. 대부분의 969.g2는 혈청에서 검출되었다.

CSF-1의 제거를 위한 일차 경로는 그의 동족 수용체인 CSF-1R과의 결합이다. CSF-1과 CSF-1R의 결합의 차단은 뮤린 동물에서 관찰된 현상인 수용체-매개된 제거의 방해를 통해 CSF-1의 혈청 농도를 증가시킬 것으로 예측된다. 따라서, 혈청 CSF-1 농도의 증가는 CSF-1R 개입 및 억제의 약력학적 마커이다.

두 용량의 969.g2는 혈청 CSF-1의 신속한 및 유의한 축적을 유발하였다. 효과는 용량 의존적이었는데, 이때 7 mg/kg 용량은 1.5 mg/kg 용량보다 대략 10배 더 높은 피크 CSF-1 농도를 제공하였다. 항체의 제거 후 CSF-1 수준의 표준화 시 약동학적/약력학적 관계가 관찰되었다. 치료군들 둘 다의 경우 CSF-1 수준은 연구의 말기까지 기준 수준으로 복귀되었다. 결과는 도 15a 및 15b에 표시되어 있다.

도 15a는 단회 정맥내 용량의 7 mg/kg Ab969.g2로 치료받은 사이노몰구스 원숭이로부터 채취된 혈청 샘플 중의 CSF-1의 농도를 보여준다. CSF-1의 혈청 농도를 2회의 독립적인 분석들에서 측정하였다. 그래프는 표준 오차(정사각형)와 함께 군 1의 3마리 동물들에 대한 CSF-1의 평균 농도(7 mg/kg)를 보여준다. Ab969.g2의 평균 혈청 농도도 표시되어 있다(원).

도 15b는 단회 정맥내 용량의 1.5 mg/kg Ab969.g2로 치료받은 사이노몰구스 원숭이로부터 채취된 혈청 샘플 중의 CSF-1의 농도를 보여준다. CSF-1의 혈청 농도를 2회의 독립적인 분석들에서 측정하였다. 그래프는 표준 오차(정사각형)와 함께 군 2의 3마리 동물들에 대한 CSF-1의 평균 농도(1.5 mg/kg)를 보여준다. Ab969.g2의 평균 혈청 농도도 표시되어 있다(원).

순환 인간 단핵구 및 사이노몰구스 원숭이 단핵구의 2개 주요 집단들이 존재한다: (i) CD14⁺ CD16^- '고전적인' 단핵구 및 (ii) CD14⁺ CD16^- '비고전적인' 또는 '체류' 단핵구. 뮤린 모델은 TAM들을 비롯한 체류 조직 대식세포가 비고전적 단핵구 집단으로부터 유래된다는 것을 입증하였다. 더욱이, 비고전적 단핵구는 고전적 단핵구 집단의 추가 분화로부터 유래된다. 969.g2를 투약받은 사이노몰구스 원숭이에서 순환 단핵구 집단을 전혈의 4색 유동 세포측정으로 모니터링하였다. 항-사이노-CD45-PerCP, 항-인간-HLA-DR-APC, 항-인간-CD14-FITC(My4 클론) 및 항-인간-CD16-PE(3G8 클론) 항체를 사용하여 유동 세포측정을 수행하였다. 각각의 항체에 대한 적절한 동종형 대조군을 사용하여 게이트를 설정하였다. 고전적 단핵구를 CD45⁺ HLA-DR⁺ CD14⁺ CD16^-로서 정의하였다. 비고전적 단핵구를 CD45⁺ HLA-DR⁺ CD14⁺ CD16⁺로서 정의하였다.

두 용량의 969.g2는 연구의 제1주 전체에 걸쳐 비고전적 CD14⁺ CD16⁺ 단핵구의 점진적인 고갈을 유발하였다. 비고전적 단핵구의 거의 전체 고갈이 7 mg/kg 용량에 의해 야기되었다. 7 mg/kg 및 1.5 mg/kg 용량 둘 다에 의한 비고전적 단핵구 감소는 4일째 날 시점에서 정점에 도달하는 것으로 보였는데, 이때 수는 11일째 날까지 정상으로 복귀되었다. 결과는 도 15c에 표시되어 있다. 막대 그래프는 연구 전체에 걸쳐 일부 시점들(0일째 날, 1일째 날, 4일째 날, 18일째 날 및 25일째 날)에서 순환 비고전적 CD14⁺ CD16⁺ 단핵구의 평균 수를 표준 오차와 함께 보여준다. 혈청 CSF-1의 평균 농도도 표준 오차와 함께 작도되어 있다.

본 실시예는 (i) 항체 969.g2가 사이노몰구스 원숭이에서 CSF-1R에 결합할 수 있었고 CSF-1 결합을 차단할 수 있었다는 것을 확인시켜주었고, (ii) 비인간 영장류 모델에서 항체 969.g2의 약리학적 활성을 입증하였고, (iii) 항체 969.g2가 생체내 사이노몰구스 원숭이 단핵구의 비고전적 집단(이 단핵구 집단은 종양 관련 대식세포의 전구체인 것으로 여겨짐)을 선택적으로 고갈시켰다는 것을 입증하였고, (iv) 혈청 CSF-1 농도가 969.g2 활성을 측정하기 위한 생체마커로서 적합하다는 것을 입증하였다.

실시예 7: MCF-7 유방암 이종이식편의 성장의 억제

항체 969.g2는 마우스 CSF-1R에 결합할 수 없다. 따라서, 암 및 섬유증을 치료하는 데에 있어서 Ab969.g2의 유용성을 입증하기 위해 항-뮤린 CSF-1R 항체 Ab535를 사용하여 생체내 마우스 연구를 수행하였다. Ab535는 다수의 시험관내 실험들에서 Ab969.g2에 필적할만한 성질 및 활성을 가진 것으로 입증되었다.

Ab535는 실시예 2의 iii)에서 CSF-1-매개된 단핵구 생존을 억제하는 것으로 밝혀졌고, 실시예 2의 iv)에서 필적할만한 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌고, 실시예 2의 vii)에서 CSF-1R 내재화를 유발하지 않는 것으로 밝혀졌다.

Ab535에 대한 생체내 연구로서 생체내 MCF-7 유방암 이종이식편 모델을 다음과 같이 수행하였다:

연구는 인간 유방암 이종이식편 MCF-7의 피하 이식편을 보유하는 면역결핍 누드 마우스에서 피하(s.c.) 투여된 항체 Ab535 대 대조군 항체, 양성 대조군 및 비히클 대조군의 치료 효능을 측정하였다. 종양 성장 억제를 치료 파라미터로서 사용하였다. 인간 유방암 MCF-7을 면역결핍 암컷 NMRI:nu/nu 마우스에서 피하 이종이식 모델로서 사용하였다. MCF-7 세포주는 국립암연구소(미국)의 종양 은행으로부터 입수되었다. 실험적으로 사용하기 위해, 세포를 시험관내 RPMI 1640 + 10% FCS에서 배양하였다. 전면생장 전의 배양물로부터 세포를 채취하고 마우스 내로 피하 접종하였다. 종양 크기가 촉진가능할 때(4 내지 10 mm) 치료를 시작하였다. 시험 화합물 및 비히클 대조군을 주당 3회 피하 제공하였다. 양성 대조군을 24일째 날, 33일째 날 및 40일째 날 1일 1회 정맥내 투여하였다. 주사 부피를 주사 시 체중에 맞게 개별적으로 조절하였다. 칼리퍼(calliper)를 이용하여 종양 직경을 매주 3회 측정하였다. V = (길이 x (폭)2)/2에 따라 종양 부피를 계산하였다. 상대적 종양 부피(RTV)를 계산하기 위해, 각각의 측정 날짜의 부피를 첫 번째 치료 날짜와 관련시켰다. 각각의 측정 날짜에 군당 중간 종양 부피 및 평균 종양 부피, 및 중간 치료군 대 대조군(T/C) 값을 퍼센트로 계산하였다.

결과는 도 16에 표시되어 있다. Ab535는 용량 의존적 항종양 효과를 보여주었다. 대조군 마우스 IgG 항체의 용량 둘 다가 종양 성장 억제를 유도하지 않았다. 상대적 종양 부피는 비히클 대조군에 필적할만하였고 양성 대조군은 종양 성장 억제를 야기하였다.

결론: 시험 항체 Ab535는 가장 높은 용량(30 mg/kg/일)에서 인간 유방암 이종이식편 MCF-7에서 통계적으로 유의한 항종양 효과를 유도하였다.

실시예 8: PC-3 정위 전립선암의 성장 억제

생체내 정위 전립선암 모델 PC-3을 이용하여 항체 Ab535의 항종양 및 항전이 효능도 시험하였다. 생체내 생체발광 영상화 분석을 가능하게 하여 생체내 종양 성장을 모니터링할 수 있고 선택된 장기에서 생체외 전이 분석을 수행할 수 있게끔 루시퍼라제를 연속적으로 발현하도록 PC-3 세포주를 유전적으로 변경시켰다.

연구는 무작위배정 후 11마리(군 5) 또는 12마리(모든 다른 군들) 수컷 NMRI 누드 마우스들을 각각 함유하는 6개의 실험군들로 구성되었다. 0일째 날, PC-3 세포를 모든 참여하는 수컷 NMRI 누드 마우스들의 전립선 내로 정위 이식하였다. 3일째 날, 생체내 생체발광 영상화를 통해 종양 성장의 시작을 확인하였다. 8일째 날, 제2 생체내 생체발광 영상화를 수행하였고, 평균 생체발광 강도 및 이로써 종양 크기가 각각의 군에서 유사하도록 영상화 결과에 따라 종양 보유 동물들을 6개의 군들로 무작위로 배정하였다. 다음 날(9일째 날), 치료를 시작하였다. 군 2 및 3의 동물들은 42일째 날까지 각각 30 mg/kg 및 10 mg/kg의 대조군 항체를 매주 3회 피하 제공받았다. 치료군 4 및 5의 동물들은 42일째 날까지 각각 30 mg/kg 및 10 mg/kg의 항체 Ab535를 매주 3회 피하 제공받았다. 군 1의 동물들은 비히클 대조군을 대표하였고 42일째 날까지 비히클(PBS)을 매주 3회 피하 제공받았다. 군 6의 동물들은 양성 대조군을 대표하였고 4주 동안(10일째 날, 17일째 날, 24일째 날 및 31일째 날) 360 mg/mg의 대조군을 매주 1회 정맥내 제공받았다. 연구의 과정 동안, 생체발광 영상화를 이용하여 정위 이식된 PC-3 종양의 성장을 3일째 날, 8일째 날(무작위배정), 15일째 날, 22일째 날, 29일째 날, 36일째 날 및 43일째 날에 생체내에서 모니터링하였다.

연구의 말기에 부검을 수행하였다. 일차 종양 중량 및 부피를 측정하였다. 선택된 장기(간, 비장 및 폐)를 채취하고, 시험관내 루시퍼라제 분석을 이용한 생체발광 영상화를 통해 포르말린에 고정된 각각의 부분 및 나머지를 전이 패턴에 대해 분석하였다. 추가로, 시험관내 루시퍼라제 분석을 이용하여 골에서 전이 패턴을 분석하기 위해 한 다리의 대퇴골 및 요추의 동일한 부분을 채취하였다.

생체내 생체발광 신호는 일차 종양 및 전이(전신 영상화) 둘 다로 구성되었다. 이 데이터를 기초로 모든 군들에 대한 종양 성장 곡선을 계산할 수 있었다(도 17). 종양 발달은 무작위배정 및 치료의 시작까지 모든 연구군들 내에서 균질하였다. 그 다음, 비히클 대조군인 군 1뿐만 아니라 2개의 대조군 항체 RTE11 군 2 및 3도 규칙적인 종양 성장을 보였다. 43일째 날 생체내에서 측정된 종양 성장의 고도로 유의한 감소가 양성 대조군(군 6)의 경우 관찰될 수 있었다. 각각 30 mg/kg 또는 10 mg/kg(군 4 및 5)으로 투여된 항체 Ab535는 생체내 생체발광 영상화를 이용하여 모니터링하였을 때 종양 성장의 유의한 감소를 이끌어내었다.

44일째 날 부검 동안 일차 종양 부피 및 습윤 중량을 측정하였다. 양성 대조군(군 6)은 일차 종양 부피 및 중량 둘 다의 고도로 유의한 감소를 이끌어내었다. 항체 Ab535를 30 mg/kg으로 투여하였을 때(군 4), 일차 종양 부피 및 중량 둘 다의 유의한 감소를 관찰할 수 있었다. Ab535를 10 mg/kg으로 투여하였을 때(군 5), 종양 부피의 감소는 현저하였으나, 군 4에 의해 나타난 감소보다 더 적었다. 대조군 항체의 경우 유의한 항종양 효능을 관찰할 수 없었다.

생체발광 영상화 기법을 이용하여 부검 후 일차 종양 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 수득된 결과는 부검 소견 및 생체내 성장 곡선의 결과에 필적할만하였다. 양성 대조군(군 6)은 일차 종양 루시퍼라제 활성의 고도로 유의한 감소를 이끌어내었다. 30 mg/kg으로 투여된 항체 Ab535(군 4)는 일차 종양 루시퍼라제 활성의 유의한 감소를 이끌어내었지만, 상기 감소는 Ab535가 10 mg/kg으로 투여되었을 때(군 5)보다 더 적었다. 대조군 항체의 경우 루시퍼라제 활성의 유의한 감소를 발견할 수 없었다.

생체외 생체발광 영상화 기법을 이용하여 여러 추가 장기들(간, 비장, 폐, 대퇴골 및 요추의 일부)을 분석하였다. 양성 대조군의 경우, 대퇴골 및 요추에 대한 루시퍼라제 활성의 감소를 볼 수 있었지만, 간 및 비장의 경우 신호 감소는 유의수준 바로 아래에 있었다. 30 mg/kg으로 투여된 항체 항체 Ab535(군 4)의 경우, 간에 대한 루시퍼라제 활성의 감소는 유의하였고 모든 다른 장기들에 대한 루시퍼라제 활성의 감소는 현저하였다. 대조군 항체(군 2 및 3)는 검사된 모든 장기들에서 루시퍼라제 활성의 감소를 전혀 이끌어내지 못하였다.

종합하건대, 이 종양 모델에서 항체 Ab535의 경우 현저한 항전이 효능과 함께 유의한 항종양 효능이 입증될 수 있었다.

실시예 9: 블레오마이신에 의해 유도된 생체내 폐 섬유증 모델에서의 항-CSF-1R 항체의 효과

블레오마이신은 스트렙토마이세스 버티실라투스로부터 최초로 단리된 항생제이고 다양한 암들에 대한 화학요법제로서 사용되고 있다. 폐 섬유증의 블레오마이신 모델은 잘 확립된 모델이고 본질적으로 문헌(Madtes, DK et al., 1999, Am J Respir Cell Mol Biol, 20, 924-34)에 기재된 바와 같이 사용되었다. 상세한 프로토콜은 문헌(Morschl, E., Molina, J. G., Volmer, J., Mohsenin, A., Pero, R. S., Hong, J. S., Kheradmand, F., Lee, J. J. and Blackburn, M. R. (2008), A3 adenosine receptor signaling influences pulmonary inflammation and fibrosis. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.39: 697-705)에서 발견될 수 있다.

사용된 모든 마우스들이 할란 랩스(Harlan Labs)로부터 구입된 야생형 C57Blk6 암컷 마우스들(20g)이었다. 기관내(IT) 절단 점적주입을 이용하였는데, 이때 마우스들을 아버틴(avertin)으로 마취시켰고 50 ㎕ 식염수 중의 3.5 유닛 용량의 블레오마이신 또는 대조군으로서의 50 ㎕ 식염수를 주입하기 위해 기관절개술을 수행하였다. 이 방식의 치료는 블레오마이신 노출 후 7일째 날 정점에 도달하는 염증 단계, 및 노출 후 21일째 날 최대치에 도달하는 섬유증 단계를 유발한다. 항체 Ab535의 효과를 연구하였는데, 이때 항체를 모델의 섬유증 단계에서만 투약하였고 9일째 날부터 21일째 날까지 주당 3회 30 mg/kg으로 피하 투여하였다. 동물을 21일째 날에 희생시켰고 판독대상은 폐의 조직병리학적 분석, BAL(기관지폐포 세척액) 유체 세포질 및 BAL 유체 중의 가용성 콜라겐의 측정을 포함하였다. 변경된 애쉬크로프트 점수화 시스템을 이용하여 폐 손상을 점수화함으로써 폐 섬유증의 중증도를 측정하기 위해 조직병리학적 분석을 수행하였다(Hubner RH et al., 2008, Biotechniques 44: 507-17). 절개된 폐를 10% 포르말린으로 25 cm 압력까지 팽창시키고 일련의 알코올 및 자일렌을 통해 프로세싱하고 파라핀에 매립하고 마슨(Masson)의 트리크롬을 사용한 프로세싱 및 염색 전에 조직 박편으로부터 파라핀을 제거하였다.

상업적으로 입수가능한 시르콜(Sircol) 분석 키트를 제조자의 지시에 따라 사용하여 BAL 유체 중의 가용성 콜라겐의 양을 평가하였다.

사이토스핀(cytospin) 제제를 사용하여 BAL 유체 중의 대식세포 집단에 대한 효과를 측정하였다. BAL 세포의 분취물을 현미경 슬라이드 상에서 회전시키고 딥-퀵(Diff-Quick)으로 염색하고 대식세포의 수를 세었다.

투약이 9일째 날부터 시작된 항-CSF-1R 항체 Ab535를 사용한 치유적 치료는 블레오마이신에 의해 유도된 폐 섬유증을 크게 감소시켰다는 것을 발견하였다. 섬유증의 중증도 및 정도 둘 다가 유의하게 감소되었다. 치료받은 마우스들은 감소된 콜라겐 생성, 개선된 섬유증 병상 및 개선된 폐 장벽 보호를 가졌다.

도 18a는 Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 동종형 대조군을 사용한 치료에 비해 BALF 콜라겐 농도를 감소시켰다는 것을 보여준다.

도 18b는 Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 동종형 대조군을 사용한 치료에 비해 샘플의 애쉬크로프트 점수를 감소시켰다는 것을 보여줌으로써, Ab535로 치료받은 마우스들이 개선된 섬유증 병상을 가졌다는 것을 보여준다.

도 18c는 Ab535를 사용한 블레오마이신-유도된 폐 섬유증의 치료가 동종형 대조군을 사용한 치료에 비해 혈청 중의 알부민의 농도를 감소시켰다는 것을 보여줌으로써, Ab535로 치료받은 마우스들의 혈관 투과성이 개선되었다는 것을 보여준다.

도 19는 식염수 대조군으로 치료받은 동물, 블레오마이신 + 동종형 대조군으로 치료받은 동물, 및 블레오마이신 + Ab535로 치료받은 동물로부터 수득된 폐의 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다. Ab535로 치료받은 동물은 블레오마이신 + 동종형 대조군으로 치료받은 동물에 비해 크게 감소된 폐 섬유증을 가졌다.

실시예 10: 아데노신 데아미나제 ( deaminase ) 결핍 폐 섬유증 마우스 모델에서의 항- CSF -1R 항체의 효과

아데노신은 강력한 신호전달 뉴클레오시드이고, 이의 수준은 세포가 스트레스를 받거나 손상될 때 증가하고, 아데노신이 그의 특이적 G 단백질-커플링된 수용체와 맞물릴 때 매우 다양한 반응들이 생성된다. 아데노신 데아미나제(ADA)는 아데노신을 이노신으로 전환시키는 푸린 이화작용 효소이다. ADA 넉아웃(knockout) 마우스들이 생성되었고 혈청 및 조직, 예컨대, 신장, 간 및 폐에서 증가된 수준의 아데노신을 가진 것으로 밝혀졌다(Blackburn, MR et al., 1998, J Biol Chem, 273(9): 5093-5100). 이 마우스들은 만성 폐 질환의 특징, 예컨대, 폐 내의 증가된 수준의 아데노신과 관련되어 있는 폐포 파괴, 기도 염증 및 과도한 점액 생성을 나타낸다(Blackburn MR et al., 2000, J Exp Med, 192: 159-70). 상기 효과들은 마우스들이 호흡 곤란으로 인해 3주령까지 사망할 정도의 효과이다. 저용량 요법을 이용한 외생성 ADA의 투여는 아데노신 수준을 감소시키고 이 마우스들의 수명을 연장시킴으로써 폐 섬유증 모델이 개발될 수 있게 한다(Chunn JL et al., 2005, J Immunol 175: 1937-46, Pedrosa M et al., 2011, PLoS One, 6(7): e22667). 이 모델에서, 아데노신 수준의 만성 상승은 폐에서 TGFβ-1을 비롯한 전구섬유증 매개자들의 증가, 폐 조직에서의 증가된 콜라겐 침착, 및 증가된 섬유증 폐 병상과 관련되어 있다. 항-섬유증 잠재력을 가진 분자의 효과를 연구하기 위해, ADA 결핍 마우스들을 수주 동안 저용량 외생성 ADA 요법으로 유지한 후, ADA 치료를 중단하고 잠재적 항-섬유증 물질을 투여한다.

항-CSF-1R 항체 Ab535의 효과를 폐 섬유증의 ADA 넉아웃 마우스 모델에서 연구하였다. 이 모델에서, 상기 효소를 결핍한 마우스들을 생후 1일째 날부터 21일째 날까지 ADA 효소 요법으로 유지하였다. ADA-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 접합체를 제조하였고(Young HW et al., 2004, J Immunol 173: 1380-89), 근육내 주사를 생후 1일째 날, 5일째 날, 9일째 날, 13일째 날 및 17일째 날(각각 0.625, 1.25, 2.5, 2.5 및 2.5 유닛)에 투여한 후, 21일째 날에 5 유닛을 복강내 주사하였다. 21일째 날 후에는 추가 효소를 투여하지 않았다. 동물들이 42일째 날에 희생될 때까지 Ab535를 (생후) 25일째 날부터 주당 3회 100 ㎕의 부피로 30 mg/kg씩 피하 투약하였다.

동물들을 42일째 날에 희생시켰고, 판독대상은 폐의 조직병리학적 분석, BAL 유체 세포질 및 BAL 유체 중의 가용성 콜라겐의 정량을 포함하였다. 변경된 애쉬크로프트 점수화 시스템을 이용하여 폐 손상을 점수화함으로써 폐 섬유증의 중증도를 측정하기 위해 조직병리학적 분석을 수행하였다(Hubner et al., 2008, Biotechniques 44: 507-17). 절개된 폐를 10% 포르말린으로 25 cm 압력까지 팽창시키고 일련의 알코올 및 자일렌을 통해 프로세싱하고 파라핀에 매립하고 마슨의 트리크롬을 사용한 프로세싱 및 염색 전에 조직 박편으로부터 파라핀을 제거하였다.

상업적으로 입수가능한 시르콜 분석 키트를 제조자의 지시에 따라 사용하여 BAL 유체 중의 가용성 콜라겐의 양도 평가하였다.

사이토스핀 제제를 사용하여 BAL 유체 중의 대식세포 집단에 대한 효과를 측정하였다. BAL 세포의 분취물을 현미경 슬라이드 상에서 회전시키고 딥-퀵으로 염색하고 대식세포의 수를 세었다.

항-CSF-1R 항체 Ab535를 사용한 치유적 치료는 ADA 결핍 마우스들에서 폐 섬유증을 유의하게 감소시켰다는 것을 발견하였다. 치료받은 마우스들은 감소된 콜라겐 생성, 개선된 섬유증 병상, 및 개선된 폐 장벽 기능 및 보호를 가졌다.

도 20a는 Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 동종형 대조군을 사용한 치료에 비해 BALF 콜라겐 농도를 감소시켰다는 것을 보여준다.

도 20b는 Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 동종형 대조군을 사용한 치료에 비해 샘플의 애쉬크로프트 점수를 감소시켰다는 것을 보여줌으로써, Ab535로 치료받은 마우스들이 개선된 섬유증 병상을 가졌다는 보여준다.

도 20c는 Ab535를 사용한 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스의 치료가 동종형 대조군을 사용한 치료에 비해 혈청 중의 알부민의 농도를 감소시켰다는 것을 보여줌으로써, Ab535로 치료받은 마우스들의 혈관 투과성이 개선되었다는 것을 보여준다.

도 20d는 Ab535를 제공받은, 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스들이 BAL 유체에서 감소된 수의 대식세포를 가졌다는 것을 보여준다.

도 21은 둘 다 동종형 대조군 또는 Ab535로 치료받은 정상 마우스들(ADA+) 및 유도된 폐 섬유증을 가진 ADA 결핍 마우스들(ADA-)로부터 수득된 폐의 조직병리학적 분석의 대표적인 영상을 보여준다. ADA- 마우스에서, Ab535로 치료받은 동물들은 동종형 대조군에 비해 크게 감소된 폐 섬유증을 가졌다.

따라서, 항-CSF-1R 항체를 사용한 치료가 섬유성 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것이 2개의 마우스 폐 섬유증 모델들에서 입증되었다.

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cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ggctaaccgt 1860 ggacaagagc aggtggcagg aggggaatgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct 1920 gcacaaccac tacacacaga agagcctctc cctgtctctg ggtaaa 1966 <210> 29 <211> 472 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 969 gH2 heavy chain (V + constant - hu IgG4P) with signal sequence underlined and italicised <400> 29 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys 20 25 30 Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Thr Tyr Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr 65 70 75 80 Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys 85 90 95 Asn Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala 100 105 110 Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Gly Pro Ile Lys Tyr Pro Thr Ala Pro 115 120 125 Tyr Arg Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met 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Ser Asn Lys Gly 340 345 350 Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 355 360 365 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr 370 375 380 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 385 390 395 400 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 405 410 415 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 420 425 430 Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe 435 440 445 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 450 455 460 Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 465 470 <210> 30 <211> 2023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 969 gH2 heavy chain (V + constant - hu IgG4P, exons underlined) with signal sequence underlined and italicized <400> 30 atggagtggt cctgggtgtt tctgttcttc ctgagtgtga ccaccggggt ccactccgaa 60 gtgacactca aggagtctgg acccgctctg gtgaaaccaa cccaaacact cactttgaca 120 tgtactttta gtggcttctc attgactacc tatggaatgg gcgtgggatg gatcagacag 180 ccacctggca aggctctgga atggctggcc aacatctggt gggatgacga caagtactat 240 aacccgtccc tgaaaaaccg gctgaccatt agcaaggata cttctaaaaa tcaagtggtg 300 ctgaccatga caaatatgga tcccgttgac accgcaacct actactgcgc ccgcattggt 360 cccataaagt accctacggc accttaccga tatttcgact tttggggcca agggacaatg 420 gttactgtct cgagcgcttc tacaaagggc ccatccgtct tccccctggc gccctgctcc 480 aggagcacct ccgagagcac agccgccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa 540 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660 ttgggcacga agacctacac ctgcaacgta gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720 aagagagttg gtgagaggcc agcacaggga gggagggtgt ctgctggaag ccaggctcag 780 ccctcctgcc tggacgcacc ccggctgtgc agccccagcc cagggcagca aggcatgccc 840 catctgtctc ctcacccgga ggcctctgac caccccactc atgcccaggg agagggtctt 900 ctggattttt ccaccaggct ccgggcagcc acaggctgga tgcccctacc ccaggccctg 960 cgcatacagg ggcaggtgct gcgctcagac ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg 1020 cccctgacct aagcccaccc caaaggccaa actctccact ccctcagctc agacaccttc 1080 tctcctccca gatctgagta actcccaatc ttctctctgc agagtccaaa tatggtcccc 1140 catgcccacc atgcccaggt aagccaaccc aggcctcgcc ctccagctca aggcgggaca 1200 ggtgccctag agtagcctgc atccagggac aggccccagc cgggtgctga cgcatccacc 1260 tccatctctt cctcagcacc tgagttcctg gggggaccat cagtcttcct gttcccccca 1320 aaacccaagg acactctcat gatctcccgg acccctgagg tcacgtgcgt ggtggtggac 1380 gtgagccagg aagaccccga ggtccagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat 1440 aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag ttcaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc 1500 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1560 aaaggcctcc cgtcctccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggtgg gacccacggg 1620 gtgcgagggc cacatggaca gaggtcagct cggcccaccc tctgccctgg gagtgaccgc 1680 tgtgccaacc tctgtcccta cagggcagcc ccgagagcca caggtgtaca ccctgccccc 1740 atcccaggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta 1800 ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac 1860 cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaggc taaccgtgga 1920 caagagcagg tggcaggagg ggaatgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca 1980 caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctctgggt aaa 2023 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VK1 2-1-(1) O12 JK4 acceptor framework <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VK1 2-1-(1) O12 JK4 acceptor framework <400> 32 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctctcac tttcggcgga 300 gggaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 33 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH2 3-1 2-70 JH3 acceptor framework <400> 33 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Phe Tyr Ser Thr Ser 50 55 60 Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ile Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 100 105 110 Val Ser <210> 34 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human VH2 3-1 2-70 JH3 acceptor framework <400> 34 caggtcacct tgaaggagtc tggtcctgcg ctggtgaaac ccacacagac cctcacactg 60 acctgcacct tctctgggtt ctcactcagc actagtggaa tgcgtgtgag ctggatccgt 120 cagcccccag ggaaggccct ggagtggctt gcacgcattg attgggatga tgataaattc 180 tacagcacat ctctgaagac caggctcacc atctccaagg acacctccaa aaaccaggtg 240 gtccttacaa tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca cgtattactg tgcacggata 300 gcttttgata tctggggcca agggacaatg gtcaccgtct ct 342 <210> 35 <211> 972 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R <400> 35 Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 35 40 45 Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 165 170 175 Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 180 185 190 Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 195 200 205 Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 210 215 220 Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 225 230 235 240 Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 500 505 510 Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu 515 520 525 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro 530 535 540 Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser 545 550 555 560 Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu 565 570 575 Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala 580 585 590 Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp 595 600 605 Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala 610 615 620 Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu 625 630 635 640 Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly 645 650 655 Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu 660 665 670 Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser 675 680 685 Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu 690 695 700 Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val 705 710 715 720 Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser 725 730 735 Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu 740 745 750 Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe 755 760 765 Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val 770 775 780 Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala 785 790 795 800 Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg 805 810 815 Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr 820 825 830 Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile 835 840 845 Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys 850 855 860 Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe 865 870 875 880 Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu 885 890 895 Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu 900 905 910 Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser 915 920 925 Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu 930 935 940 Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala 945 950 955 960 Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys 965 970 <210> 36 <211> 277 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R <400> 36 Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu 65 70 75 80 Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val 85 90 95 Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp 100 105 110 Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro 115 120 125 Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr 130 135 140 Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala 145 150 155 160 Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val 165 170 175 Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu 180 185 190 Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys 210 215 220 Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn 245 250 255 Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met 260 265 270 Phe Phe Arg Val Val 275 <210> 37 <211> 49 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R <400> 37 Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr Ile 1 5 10 15 His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala Leu 20 25 30 Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val Gln 35 40 45 Lys <210> 38 <211> 493 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence for CSF-1R (SNP V32G, A245S, H247P, V279M, position underlined) <400> 38 Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp 20 25 30 Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser 35 40 45 Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly Thr Tyr Arg 50 55 60 Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Ile His Leu 65 70 75 80 Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gln Glu Val 85 90 95 Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp 100 105 110 Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro 115 120 125 Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr 130 135 140 Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln Cys Ser Ala 145 150 155 160 Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg Leu Lys Val 165 170 175 Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu 180 185 190 Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys Ser Ala Ser 195 200 205 Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn Asn Thr Lys 210 215 220 Leu Ala Ile His Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gln Lys 225 230 235 240 Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His Ala Gly Asn 245 250 255 Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser Thr Ser Met 260 265 270 Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gln 275 280 285 Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys Val 290 295 300 Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp Thr Tyr Leu 305 310 315 320 Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala Thr 325 330 335 Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg Leu 340 345 350 Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro Gly 355 360 365 Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro Glu 370 375 380 Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys 385 390 395 400 Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu Gln Cys Ser 405 410 415 Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln Val Trp Asp 420 425 430 Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His Lys Val Thr 435 440 445 Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gln Thr Tyr 450 455 460 Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe Ile 465 470 475 480 Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 485 490 <210> 39 <211> 512 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> sequence of human CSF-1R extracellular domain <400> 39 Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His 1 5 10 15 Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val 20 25 30 Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val 35 40 45 Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly 50 55 60 Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala 85 90 95 Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala 100 105 110 Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu 115 120 125 Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg 130 135 140 Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His 145 150 155 160 Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln 165 170 175 Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg 180 185 190 Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val 195 200 205 Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys 210 215 220 Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn 225 230 235 240 Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg 245 250 255 Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His 260 265 270 Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser 275 280 285 Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn 305 310 315 320 Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp 325 330 335 Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala 340 345 350 Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu 355 360 365 Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg 370 375 380 Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr 385 390 395 400 Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr 405 410 415 Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu 420 425 430 Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln 435 440 445 Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His 450 455 460 Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn 465 470 475 480 Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp 485 490 495 Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 500 505 510

Claims (34)

1. 중쇄를 포함하는 항-CSF-1R 항체로서, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1을 위해 서열 번호 4에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-H2를 위해 서열 번호 5에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
2. 제1항에 있어서, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1을 위해 서열 번호 4에 제공된 서열, CDR-H2를 위해 서열 번호 5에 제공된 서열 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 서열을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
3. 경쇄를 포함하는 항-CSF-1R 항체로서, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하는 항-CSF-1R 항체로서, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열을 가진 CDR, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열을 가진 CDR 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 가진 CDR 중 하나 이상을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
5. 제4항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1을 위해 서열 번호 1에 제공된 서열, CDR-L2를 위해 서열 번호 2에 제공된 서열 및 CDR-L3을 위해 서열 번호 3에 제공된 서열을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
6. 항-CSF-1R 항체로서, 중쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR들을 포함하고 CDR-H1의 서열이 서열 번호 4에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-H2의 서열이 서열 번호 5에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-H3의 서열이 서열 번호 6에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 것인 항-CSF-1R 항체.
7. 제6항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하는 항-CSF-1R 항체로서, 경쇄의 가변 도메인이 3개의 CDR들을 포함하고 CDR-L1의 서열이 서열 번호 1에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-L2의 서열이 서열 번호 2에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖고, CDR-L3의 서열이 서열 번호 3에 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 것인 항-CSF-1R 항체.
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 서열 번호 23에 제공된 서열을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 경쇄가 서열 번호 15에 제공된 서열을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 분자가 전장 중쇄 및 경쇄를 가진 완전한 항체 분자 또는 이의 단편, 예를 들면, Fab, 변형된 Fab', Fab', F(ab')₂, Fv, VH, VL 및 scFv 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항-CSF-1R 항체.
11. 서열 번호 23에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 15에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항-CSF-1R 항체.
12. 항-CSF-1R 항체로서, 경쇄의 가변 도메인이 제11항의 항체의 경쇄 가변 도메인과 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함하고, 중쇄의 가변 도메인이 제11항의 항체의 중쇄 가변 도메인과 80% 이상의 동일성 또는 유사성을 가진 서열을 포함하는 것인 항-CSF-1R 항체.
13. 서열 번호 27에 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 19에 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 가진 항-CSF-1R 항체.
14. 항-CSF-1R 항체로서, 중쇄 및 경쇄가 제13항의 항체의 상응하는 중쇄 및 경쇄와 80% 이상 동일하거나 유사한 것인 항-CSF-1R 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 그 자신에 부착된 이펙터(effector) 또는 리포터(reporter) 분자를 가진 항-CSF-1R 항체.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CSF-1R에 대한 10 pM 또는 10 pM 미만의 결합 친화성을 가진 항-CSF-1R 항체.
17. CDR-L1을 위해 서열 번호 1, CDR-L2를 위해 서열 번호 2, CDR-L3을 위해 서열 번호 3, CDR-H1을 위해 서열 번호 4, CDR-H2를 위해 서열 번호 5 및 CDR-H3을 위해 서열 번호 6에 제공된 6개의 CDR들을 포함하는 항체의 결합을 예를 들면, 100 pM 이하의 친화성으로 교차차단하는 항-CSF-1R 항체.
18. 제17항에 있어서, 그 자신이 차단하는 항체와 동일한 에피토프에 결합함으로써 결합을 교차차단하는 항-CSF-1R 항체.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄(들) 및/또는 경쇄(들)를 코딩하는 단리된 DNA 서열.
20. 하나 이상의 제19항에 따른 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터.
21. 제20항에 있어서, 서열 번호 28 및/또는 서열 번호 20에 제공된 서열을 포함하는 벡터.
22. 하나 이상의 제21항에 따른 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 항체를 제조하는 방법으로서, 제22항의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 항체를 단리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
24. 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체 중 하나 이상과 함께 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물.
25. 제24항에 있어서, 다른 활성 성분을 추가로 포함하는 약학 조성물.
26. 제1항 내지 제18항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 항체 또는 조성물.
27. 제1항 내지 제18항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 암의 치료를 위한 항체 또는 조성물.
28. 제1항 내지 제18항, 제24항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유성 질환의 치료를 위한 항체 또는 조성물.
29. 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 조성물의 용도.
30. 섬유성 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 조성물의 용도.
31. 암을 앓고 있거나 암의 위험에 있는 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항-CSF-1R 항체, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
32. 섬유성 질환을 앓고 있거나 섬유성 질환의 위험에 있는 인간 대상체를 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항-CSF-1R 항체, 또는 제24항 또는 제25항에 따른 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
33. 제27항, 제29항 및 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암, 전립선암, 골암, 대장암, 백혈병, 림프종, 피부암, 식도암, 위암, 별아교세포암(astrocytic cancer), 자궁내막암, 자궁암, 방광암, 신장암, 폐암, 간암, 갑상선암, 두경부암, 췌장암 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체, 용도 또는 방법.
34. 제28항, 제30항 및 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 섬유성 질환이 폐 섬유증, 예컨대, 특발성 폐 섬유증 및 낭성 섬유증, 신장 섬유증, 간 경화증, 심내막심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 거대 섬유증, 신원성(nephrogenic) 전신 섬유증, 크론병, 켈로이드, 심근경색, 피부경화증 및 관절섬유증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 항체, 용도 또는 방법.

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