BR112016001036B1 - Fusocinas envolvendo citocinas com afinidades de ligação de receptores fortemente reduzida - Google Patents

Fusocinas envolvendo citocinas com afinidades de ligação de receptores fortemente reduzida Download PDF

Info

Publication number
BR112016001036B1
BR112016001036B1 BR112016001036-1A BR112016001036A BR112016001036B1 BR 112016001036 B1 BR112016001036 B1 BR 112016001036B1 BR 112016001036 A BR112016001036 A BR 112016001036A BR 112016001036 B1 BR112016001036 B1 BR 112016001036B1
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
cells
cytokine
cytokines
fusion protein
activity
Prior art date
Application number
BR112016001036-1A
Other languages
English (en)
Other versions
BR112016001036A2 (pt
Inventor
Jan Tavernier
Jennyfer Bultinck
Sarah Gerlo
Gilles Uzé
Franciane Paul
Yann Bordat
Original Assignee
Vib Vzw
Universiteit Gent
Centre National De La Recherche Scientifique
Centre Hospitalier Regional Universitaire De Montpellier
Université Montpellier
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vib Vzw, Universiteit Gent, Centre National De La Recherche Scientifique, Centre Hospitalier Regional Universitaire De Montpellier, Université Montpellier filed Critical Vib Vzw
Publication of BR112016001036A2 publication Critical patent/BR112016001036A2/pt
Publication of BR112016001036B1 publication Critical patent/BR112016001036B1/pt

Links

Images

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/195Chemokines, e.g. RANTES
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20Interleukins [IL]
    • A61K38/2006IL-1
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/2264Obesity-gene products, e.g. leptin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02Immunomodulators
    • A61P37/04Immunostimulants
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521Chemokines
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/521Chemokines
    • C07K14/523Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525Tumour necrosis factor [TNF]
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54Interleukins [IL]
    • C07K14/545IL-1
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555Interferons [IFN]
    • C07K14/56IFN-alpha
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/5759Products of obesity genes, e.g. leptin, obese (OB), tub, fat
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/33Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide
    • C07K2319/70Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

FUSOCINAS ENVOLVENDO CITOCINAS COM AFINIDADES DE LIGAÇÃO DE RECEPTORES FORTEMENTE REDUZIDA A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende pelo menos duas citocinas, dos quais pelo menos uma é uma citocina modificada com uma afinidade de ligação fortemente reduzida ao seu receptor, ou um de seus receptores. De um modo preferido, ambas as citocinas são conectadas por um ligante, preferencialmente um ligante GGS. A invenção refere-se, ainda, à referida proteína de fusão para uso no tratamento de doenças.

Description

[001] A presente invenção refere-se a uma proteína de fusão que compreende pelo menos duas citocinas, dos quais pelo menos uma é uma citocina modificada com uma afinidade de ligação fortemente reduzida ao seu receptor, ou um de seus receptores. De um modo preferido, ambas as citocinas são conectadas por um ligante, preferencialmente um ligante GGS. A invenção refere-se, ainda, à referida proteína de fusão para uso no tratamento de doenças.
[002] As citocinas são proteínas pequenas secretadas ou ligadas à membrana que desempenham um papel essencial na comunicação intercelular. A citocina que se liga ao seu complexo de receptores cognatos aciona uma miríade de eventos de sinalização intracelular que possibilitam que a célula detecte e resposta ao seu meio de acordo com as necessidades dá célula, do tecido e do órgão do qual faz parte. Eles são caracteristicamente pleiotrópicos, o que significa que provocam uma ampla gama de respostas, dependendo da natureza e do estado de desenvolvimento da célula alvo. Além disso, alguns deles são altamente redundantes, já que diversas citocinas têm atividades sobrepostas, o que permite que compensem funcionalmente a perda mútua. As atividades da citocina podem ser autócrinas, parácrinas ou endócrinas, gerando uma ligeira delimitação entre a citocina de termo designado, o hormônio de peptídeo e o fator de crescimento.
[003] Seis classes estruturais diferentes de citocinas são conhecidas: as citocinas de pacote a-helicoidais, que compreendem a maior parte das interleucinas, fatores de estímulo de colônia e hormônios como o hormônio do crescimento e a leptina ( (Nicola e Hilton, 1998), a família do fator de necrose tumoral trimérico (TNF) (Idriss e Naismith, 2000), os factores de crescimento de nó de cisteína (Sun e Davies, 1995), o grupo de aumento β- trifólio que inclui a família da interleucina-1 (Murzin et al., 1992), a família da interleucina 17 (IL-17) ( Gaffen, 2011) e as quimiocinas (Nomiyama et al., 2013).
[004] Descobriram-se aplicações clínicas importantes para diversas citocinas. Exemplos incluem a eritropoietina (EPO), fator de estímulo de colônia granulócita (G-CSF), interferons α2 e -β e hormônio de crescimento. Por outro lado, muitas vezes como consequência de sua natureza pró- inflamatória, ao se antagonizarem as citocinas selecionadas também foram descobertas aplicações médicas específicas. Os principais exemplos aqui são as estratégias para bloquear a atividade de TNFα para combater as doenças autoimunes, como a artrite reumatoide. Devido a esses sucessos, estratégias para otimizar as atividades de citocinas em âmbito clínico tem sido exploradas. Estas incluem uma meia-vida otimizada, imunogenicidade reduzida, administração direcionada a tipos específicos de células e fusões genéticas de duas citocinas, as chamadas fusocinas.
[005] Fusocinas são combinações artificiais de duas citocinas diferentes, as quais são geneticamente ligadas utilizando uma sequência de ligantes. O primeiro exemplo de fusocina é plXY321 ou pixicina, que é uma proteína de fusão de fator de estímulo de colônia granulócito- macrófago (GMCSF) e IL-3 (Donahue et al., 1988) que apresentou efeitos imunológicos e hematopoiéticos superiores em comparação a ou somente a citocina. Este efeito pode ser explicado pelo aumento da ligação aos seus respectivos complexos receptores. É de se observar que ambos os receptores compartilham a subunidade βo de sinalização, impedindo os efeitos sinergísticos no nível de transdução de sinal. Em um teste clínico de fase III, plXY321 não apresentou propriedades superiores em comparação a GM-CSF isoladamente (O'Shaughnessy et al., 1996). Fusocinas à base de GM-CSF com citocinas da família IL-2 também foram exploradas. Estas citocinas todas sinalizam através de complexos receptores que compreendem a subunidade yc. Exemplos dessas fusocinas com GM-CSF incluem IL-2 (Stagg et al., 2004), IL-15 (Rafei et al., 2007) e IL-21 (Williams et al., 2010a), também conhecidas como GIFT2, -15 e -21. Efeitos sinérgicos poderia ser esperados, tanto em nível de sinalização (ou seja, efeitos sinérgicos em uma célula-alvo) quanto em nível celular (ou seja, efeitos sinérgicos entre diferentes tipos de células alvo). Por exemplo, GIFT2 induziu uma ativação mais potente das células NK em comparação à combinação das citocinas não-fundidas (Penafuerte et al., 2009) e GI FT15 induziu uma população de células B imunossupressora potente imprevista (Rafei et al., 2009a) . Da mesma forma, GI FT21 exerceu efeitos pró- inflamatórios inesperados sobre as células monocíticas (Williams et al, 2010b,). Outro exemplo de um fusocina que combina citocinas α-helicoidais é IL-2/IL-12 (Gillies et al, 2002; Jahn et al, 2012).
[006] Outra classe de fusocinmas combina citocinas de diferentes famílias estruturais. Exemplos incluem a fusão de IL-1 8 (um membro da família de citocinas IL-1) e IL-2 (Acres et al., 2005) e a fusão entre IL-18 e EGF (fator de crescimento epidérmico). Visto que a superexpressão do EGFR é seguidamente observada em certos tipos de células tumorais, esta fusocina possibilita direcionar a atividade de IL-18 às células tumorais EGFR+ (Lu et al., 2008). As fusões entre quimiocinas e citocinas de pacote a-helicoidais também foram exploradas de modo mais detalhado. As quimiocinas frequentemente atual utilizando gradientes de concentração para estimular a migração de células imunológicas para regiões de infecção e inflamação. Muitos receptores de quimiocina apresentam um padrão de expressão restrito que permite o direcionamento a células (imunológicas) selecionadas. Além disso, sinalização por meio de receptores de quimiocina acoplada à proteína G, serpentina é fundamentalmente diferente das vias ativadas pelos complexos de receptores de citocinas de pacote a-helicoidal e podem-se esperar mecanismos de diafonia sinérgica positiva e negativa. É importante notas que as versões truncadas N-terminalmente das quimiocinas podem reter suas propriedades de ligação ao receptor mas apresentar comportamento antagonístico. Um exemplo é um fusocina entre GM-CSF e CCL2 truncado N-terminalmente sem os 5 primeiros aminoácidos N-terminais, também conhecidos como GMME1 (Rafei et al., 2009b). Essa fusocina induziu a apoptose de células CCR2+ inflamatórias e os camundongos tratados com GMME1 apresentaram índices reduzidos da doença autoimune induzida experimentalmente, incluindo EAE e CIA para esclerose múltipla (Rafei et al., 2009b) e artrite reumatoide (Rafel et al., 2009c), respectivamente. Da mesma forma, essa fusocina induziu a apoptose de células tumorais CCR2+ (Rafei et al., 201 1).
[007] No entanto, as fusões entre uma citocina de tipo selvagem e uma citocina mutante com afinidade fortemente reduzida quanto ao seu complexo receptor cognato não foram exploradas anteriormente. A vantagem desta abordagem é que a possível toxicidade sistêmica da citocina de tipo selvagem é eliminada. Surpreendentemente, descobriu-se que essas fusocinas permitem o direcionamento específico da célula das atividades da citocina, a partir das quais essa citocina mutante pode recuperar sua atividade sobre as células direcionadas, sem o efeito negativo das citocinas de tipo selvagem. A aplicabilidade geral do princípio foi demonstrada utilizando três fusocinas, cada uma composta de duas citocinas de duas classes de citocinas estruturalmente diferentes, conforme exemplificado abaixo. XCL1 / IFNα2-mutante
[008] XCL1 é uma quimiocina de 93 aminoácidos secretada pelas células T CD8+, células T CD4+ de células polarizadas Th1 e células NK. Ela interage com XCR1, um receptor de quimiocina expressado exclusivamente por células dendríticas. Em camundongos, XCR1 é expresso na grande maioria das células dentríticas CD1 1 c+ CD8α+ esplênicas, enquanto que apenas um subconjunto inferior de células dendríticas de CD8α- expressa esse receptor (Dorner et al. 2009). XCR1 é um marcador seletivo conservado de células de mamíferos (incluindo células de humanos) homólogas às células dendríticas CD8α + de camundongos (Crozat et al. 2010). Curiosamente, demonstrou-se que a ação do interferon de tipo I (IFNα/β) nesse subconjunto de células dendríticas é crítico quanto ao reconhecimento imunológico inato de um tumor em desenolvimento em camundongos (Fuertes et al. 2011).
[009] A terapia sistêmica de IFNα tem uma toxicidade considerável, incluindo efeitos colaterais como fadiga, febre, calafrios, depressão, disfunção da tireoide, doenças da retina, perda de cabelo, pele seca, erupção cutânea, comichão e supressão da medula óssea. Assim, seria altamente vantajoso direcionar a atividade de IFN somente na direção da população celular que deve ser tratada com IFN. Para aplicação em terapias antitumorais, o direcionamento da população de células dendríticas que expressam XCR1 é altamente desejável, visto que tais células são especializadas na apresentação cruzada de antígenos (Bachem et al. 2012). Vários dados experimentais sugerem que a população de células dendríticas que expressam XCR1 representa a principal população celular que deve reagir com o IFN de tipo I no microambiente tumoral a fim de iniciar as respostas imunológicas que, em última análise, permitirão a destruição e a imunização do tumor (Gajewski et al. 2012).
[0010] O mutante IFNα2-Q124R humano tem uma alta afinidade quanto à cadeia IFNAR1 de murinos e uma baixa afinidade quanto à cadeia IFNAR2 de murinos (Weber et al., 1987). Ele apresenta uma atividade muito baixa sobre as células de murinos e, assim, representa um protótipo de um subtipo de IFN de tipo I apropriado para direcionar a atividade de IFN em células de camundongos selecionadas (PCT/EP2013/050787). CCL20/ IL1β
[0011] A quimiocina CC CCL20, também conhecida como quimiocina regulada por ativação e quimiciona do fígado (LARC), proteína 3α inflamatória de macrófagos (MIP-3α) ou Exodus-1 é uma proteína 96 AA que é expressa predominantemente no fígado e no tecido linfoide (Hieshima et al., 1997). Após a secreção, CCL20 exerce a sua atividade por ligação ao receptor de quimiocina CC 6 (CCR6), que pertence à família do receptor acoplado à proteína G (GPCR) 1 (Baba et al., 1997). A expressão de CCR6 é relatada em diferentes subconjuntos de leucócitos, mas é melhor documentada quanto à população de células Th17 (Singh et al., 2008). A função normal de Th17 é indispensável para a imunidade protetora contra uma série de agentes patógenos, incluindo Mycobacterium tuberculosis (Khader et al., 2007), Klebsiella pneumoniae (Ye et al., 2001) e Bordetella pertussis (Higgins et al., 2006).
[0012] Efeitos potenciadores de IL-1 β sobre a expansão e diferenciação dos diferentes subconjuntos de células T, em particular de células Th17 (Sutton et al., 2006; Acosta-Rodriguez et al., 2007; Dunne et al., 2010; Shaw et al., 2012), foram firmemente estabelecidos. Entre os subconjuntos de células T, as células Th17 expressam os níveis mais elevados de IL-1R e IL-1 desempenha um papel importante no acionamento de Th17. A atividade controlada de IL-1 agonístico poderia ter, portanto, aplicações em diferentes processos fisiológicos/patológicos, onde efeitos imunoestimulatórios seriam desejáveis. Uma das principais preocupações relacionadas ao uso de IL-1 em terapias imunoestimulantes é, todavia, quanto à sua forte toxicidade quando administrado sistematicamente. Assim, quando a ação IL-1 pode ser confinada a uma população celualr selecionada, a questão da toxicidade pode ser resolvida, o que abre perspectivas terapêuticas, por exemplo, para o uso na forma de um adjuvante de células T para potencializar a resposta a vacinas fracas (Ben-Sasson et al., 2011). Para direcionar especificamente mutantes de IL- 1 à população de células Th17, são usadas variantes de IL-1 que consiste em IL-1 mutantes fundidos a uma porção de direcionamento de CCL20. Visto que a ativação ficará confinada apenas às células de expressão de CCR6 (isto é, células Th17), nenhuma grande toxicidade sistêmica é esperada. TNFα/leptina mutante
[0013] TNFα é uma citocina com uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo citotoxicidade, regulação de células imunológicas e mediação de respostas inflamatórias. Ela é uma proteína transmembranas homotrimérica de tipo II, de ligação não-covalente, de auto-montagem de 233 aminoácidos. TNFα é ativa na forma de proteína solúvel, bem como ligada à membrana, liberada a partir da membrana celular após a clivagem proteolítica de 76 aminoácidos aminoterminais (pré-sequência) por uma enzina de conversão de TNFα (TACE, também denominada ADAM17). Ela sinaliza através de 2 receptores distintos, TNF-R1 (p55) e TNF-R2 (p75), ambos glicoproteínas transmembranares com um motivo rico em cisteína no domínio extracelular de ligação ao ligante. Apesar da homologia extracelular, eles têm domínios intracelulares distintos e, portanto, sinalizam diferentes atividades de TNF (Hehlgans e Pfeffer, 2005). Geramos uma variante de cadeia única (scTNF) que é composta por três monômeros de TNF acoplados através de ligantes GGGGS, conforme descrito anteriormente por Boschert et al., 2010.
[0014] A leptina é uma citocina adipocítica 16kDa envolvida em uma variedade de processos biológicos, incluindo imunidade, reprodução, crescimento linear, homeostase de glicose, metabolismo ósseo e oxidação de gordura, mas é mais conhecido por seu efeito drástico enquanto sinal de saciedade (Halaas et al., 1995). Devido ao seu efeito sobre as células imunológicas, a leptina também está envolvida em diversas doença autoimunes (likuni et al., 2008). O direcionamento seletivo da atividade da leptina pode ser benéfico tanto para distúrbios metabólicos quanto imunológicos ou relacionados a inflamação.
[0015] Um primeiro aspecto da invenção é uma proteína de fusão, compreendendo pelo menos duas citocinas, das quais pelo menos uma citocina é uma citocina modificada que apresenta uma atividade de ligação fortemente reduzida em relação ao seu receptor ou em relação a pelo menos um de seus receptores, se a ligação em diferentes receptores for uma possibilidade. Uma afinidade de ligação reduzida, tal como se utiliza aqui, significa que a afinidade é inferior a 50%, de preferência menos do que 40%, mais preferencialmente menos do que 30%, mais preferencialmente mais do que 25%, mais preferencialmente menos do que 20%, mais preferencialmente menos de 15%, mais preferencialmente menos do que 10%, mais preferencialmente menos do que 5%, mais preferencialmente menos do que 1% de citocina do tipo selvagem. "Citocina de tipo selvagem", conforme usado aqui, denota a citocina tal como ocorre na natureza, no organismo hospedeiro. A modificação da citocina, resultando em uma redução na afinidade de ligação, pode ser uma modificação que diminui a atividade da citocina de tipo selvagem normal ou pode ser uma modificação que aumenta a afinidade de uma citocina homóloga não-endógena (como, mas sem se limitar à,citocina de camundongos, que se liga a um receptor de citocina de humanos). As modificações podem ser qualquer modificação que reduza ou aumente a atividade, conhecida por aqueles versados na técnica, incluindo, sem se limitar a, modificações químicas e/ou enzimáticas, como glicosilação e peguilação, fusão a outras proteínas e mutações. De um modo preferido, a citocina com afinidade de ligação reduzida ao receptor é uma citocina mutante. A mutação pode ser qualquer mutação conhecida por aqueles versados na técnica, incluindo deleções, inserções, truncações ou mutações pontuais. De preferência, a referida mutação é uma mutação pontual ou uma combinação de mutações pontuais. A afinidade pode ser medida com qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica. Como um exemplo não limitativo, a afinidade do ligante em relação ao receptor pode ser medida por análise de plot Scatchard e por ajuste computadorizado de dados de ligação (por exemplo, de Scatchard, 1949) ou por espectroscopia de interferência reflectométrica sob fluxo através de condições, como descrito por Brecht et al. (1993).
[0016] Alternativamente, a atividade de ligação reduzida pode ser medida na forma de uma redução da atividade biológica do ligante mutante em comparação ao ligante de tipo selvagem. Em uma modalidade preferida, tal atividade biológica é medida em vitro, utilizando um ensaio repórter. Esses ensaios repórteres dependem do sistema receptor de citocina utilizando e são conhecidos por aqueles versados na técnica. Como exemplo não-limitativo, um ensaio repórter de IFN-Y é descrito por Bono et al. (1989) juntamente com a análise de Scatchard. Preferencialmente, a atividade biológica do mutante é inferior a 50%, de preferência menos do que 40%, mais preferencialmente menos do que 30%, mais preferencialmente mais do que 25%, mais preferencialmente menos do que 20%, mais preferencialmente menos de 15%, mais preferencialmente menos do que 10%, mais preferencialmente menos do que 5%, mais preferencialmente menos do que 1% de citocina do tipo selvagem.
[0017] A citocina modificada é fundido a outra citocina, modificado ou não. De um modo preferido, ambas as citocinas são fundidas utilizando uma sequência ligante, preferivelmente um ligante de GGS, compreendendo uma ou mais repetições de GGS. A citocina modificada pode ser colocada na parte do terminal amino da molécula ou na parte carboxiterminal; a proteína de fusão pode compreender ainda outros domínios, como, sem se limitar a, uma sequência de marcação, uma sequência de sinal, outra citocina ou um anticorpo.
[0018] Uma citocina, conforme usada aqui, pode ser qualquer citocina conhecida por aqueles versados na técnica, incluindo, sem se limitar a, citocinas da família de citocinas do grupo helicoidal, a família do fator de necrose tumoral trimérica (TNF) (Idriss e Naismith, 2000), os fatores de crescimento de nó de cisteína (Sun e Davies, 1995), o grupo de dobragem e-trifólia que inclui a família de interleucina-1 (Murzin et al., 1992), a família da interleucina 17 (IL-17) (Gaffen, 201 1), e as quimiocinas (Nomiyama et al., 2013). No caso de um membro da família do TNF trimérico, de preferência, utiliza-se uma versão de cadeia simples. Essas citocinas de cadeia simples são conhecidas por aqueles versados na técnica e são descritas por, entre outros, Krippner-Heidenrich et al. (2008)
[0019] Em uma modalidade preferida, tal proteína de fusão é uma fusão entre um mutante IFNα2 e XCL1, preferencialmente um mutante Q124R. Em uma outra modalidade preferida, tal fusão é uma fusão entre CCL20 e um mutante IL1β. Preferencialmente, o referido mutante IL1β é um mutante Q148G. Em outra modalidade preferida, ainda, tal fusão é uma fusão entre um mutante de leptina e TNFα. Preferencialmente, a referida leptina é um mutante selecionado a partir do grupo que consiste em L86S e L86N.
[0020] Outro aspecto da invenção é uma proteína de fusão, de acordo com a invenção, para uso como medicamento. Em uma modalidade preferida, é uma proteína de fusão de acordo com a invenção para uso no αtratamento de câncer. Em outra modalidade preferida, é uma proteína de fusão, de acordo com a invenção, para uso na modulação da resposta imunológica.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0021] Figura 1: Representação esquemática dos elementos estruturais da proteína de fusão XCL1/IFNα2-Q124R.
[0022] Figura 2: Atividade seletiva da proteína de fusão XCL1/IFNα2- Q124R sobre as células que expressam XCR1.
[0023] A fosforilação de STAT1 Y701 é medida em resposta à proteína de fusão IFNα/β ou XCL1/IFNα2-Q124R em diferentes subconjuntos de esplenócitos de camundongo, caracterizados pela expressão de CD11 c e CD8a. Primeira coluna: subconjunto CD11 c- CD8a+; segunda coluna: subconjunto CD1 1 c- CD8a-; terceira coluna: subconjunto CD1 1 cmeio CD8-; quarta coluna: subconjunto CD1 1 celevado CD8α+ ; quinta coluna: subconjunto CD11celevado CD8a-.
[0024] Figura 3: Representação esquemática dos elementos estruturais de IL-1β-mutante / proteínas de fusão CCL20.
[0025] Figura 4: Atividade seletiva das proteínas de fusão CCL20/ IL- 1β-mutante sobre as células que expressam CCR6. (A) a indução da atividade de NF K B por 5 mutantes IL- 1β diferentes e de tipo selvagem fundidos a CCL20. (B) dependência de concentração da indução da atividade de N FKB por proteínas de fusão CCL20/mutantes de IL-1β Q148G e de tipo selvagem, em células falsamente transfectadas ou células transfectadas com CCR6.
[0026] (C) indução da atividade de N FKB por proteínas de fusão CCL20/mutantes IL-1β Q148G e de tipo selvagem (12,5 ng/ml), em células falsamente transfectadas ou células transfectadas com CCR6 em comparação com indução por veículo.
[0027] Figura 5: Representação esquemática dos elementos estruturais das proteínas de fusão de scTNFα/mutantes de leptina.
[0028] Figura 6: Atividade seletiva das proteínas de fusão mutantes de scTNFα/leptina sobre as células que expressam receptor de leptina.
[0029] O crescimento dependente de leptina induzido por concentrações indicadas de WT direcionado por scTNF ou leptina mutante é medido pelo ensaio de XTT em células Ba/F3-mLR (painel A) ou células Ba/F3-mLR-TNFR1ΔCyt (painel B).
[0030] Figura 7: Direcionamento in vivo da atividade de IFN sobre células do baço de camundongo que expressam XCR1.
[0031] Injetou-se nos camundongos C57BI/6 iv com a quantidade indicada de XCL1-IFNa2-Q124R ou 1 000 000 unidades de PBS ou IFNα/β de murino natural. Após 45 minutos, as células do baço foram analisadas por FACS quanto à expressão de CD11c- e CD8α- (primeiro painel) e quanto a P-STAT1 (outros painéis) na seguinte população de células: CD11c- CD8α- (linha 1), CD11c- CD8α+ (linha 2), CD11c+ CD8α+ (Iinha 3), CD11c+ CD8α- (linha 4).
EXEMPLOS
[0032] Materiais e métodos para os exemplos
[0033] Clonagem e produção dos fusocinas
[0034] Clonagem da proteína de fusão XCL1/IFNα2-Q124R.
[0035] O quadro de leitura aberta XCL1 foi sintetizado por PCR a partir do plasmídeo MR200473 de codificação de XCL1 (Origen Inc.), utilizando o sistema PCR de expansão de alta fidelidade (Roche Diagnostics) e os seguintes iniciadores: Progressivo: 5'GGGGGGGAATTCATGAGACTTCTCCTCCTGAC3' Reverso: 5' GGGGGGTCCGGAGGCCCAGTCAGGGTTATCGCTG3' O produto de PCR foi digerido por EcoRI e BspEI e substituído pelo fragmento EcoRI-BspEI que codifica o nanocorpo no vetor pMET7 SlgK-HA-1R59B-His-PAS-ybbr-IFNA2-Q124R (PCT/EP2013/050787). Produção da proteína de fusão XCL1/IFNα2-Q124R.
[0036] As células Hek 293T foram transfectadas com o construto de fusão de proteína utilizando o método padrão de lipofectamina (Invitrogen). 48 horas após a transfecção, os meios de cultivo foram coletados e armazenados a -20 ° C. A actividade de IFN foi analisada em linhas de células HL116 de humanos e LL171 de murinos, conforme descrito (Uze et al. J. Mol. Biol. 1994) usando a preparação GFP-IFNα2-Q124R de nanocorpo purificado (descrito em PCT/EP2013/050787) como um padrão. Clonagem das proteínas de fusão IL-1 β/CCL20.
[0037] Uma sequência otimizada por códon que codifica a proteína de fusão CCL20/IL-1β de humano adulto foi gerada através de síntese de genes (Invitrogen Gene Art). Em resumo, sintetizou-se uma sequência em que a proteína IL-1β de humano adulto, precedida pelo peptídeo líder SigK, e equipada com um HA N-terminal, fundiu-se em seu término C à sequência ligante 13xGGS, seguida pela sequência para CCL20 de humano adulto com uma marcação HIS C-terminal (Fig. 3).
[0038] Mutantes IL-1β dos quais se esperava uma afinidade de ligação reduzida para IL-1R foram selecionados com base na literatura e análise das estruturas de cristal publicadas de IL-1β humano complexado com o seu receptor. Foram criadas mutações na porção IL-1β através de mutagênese direcionada ao local (QuickChange, Stratagene) utilizando os iniciadores de mutagênese conforme indicados na tabela:
Figure img0001
Produção do mutante IL-1 β: Proteínas de fusão CCL20.
[0039] Proteínas de fusão de IL-1β-CCL20 foram produzidas em células HEK293T. Para produção em pequena escala, células HEK293T foram semeadas em placas de 6 poços a 400000 células/poço em DMEM suplementado com FCS a 10%. Após 24 horas, os meios de cultivo foram substituídos por meios com soro reduzido (DMEM/5% de FCS) e as células foram transfectadas utilizando PEL linear. Em resumo, a mistura de transfecção de PEI foi preparada combinando-se 1 μg do vetor de expressão com 5 μg de PEI em 160 μl de DMEM, incubada por 10 minutos à temperatura ambiente e adicionada gota a gota aos poços. Após 24 horas, as células transfectadas foram lavadas com DMEM e divididas em camas com 1,5 ml de OptiMem/poço para a produção de proteínas. Os meios condicionados foram recuperados após 48 horas, filtrados através de filtros de 0,45 μ e armazenado a -20 ° C. O conteúdo de I L-1 β nos meios condicionados foi determinado por ELISA, de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems). Clonagem das proteínas de fusão de scTNF/leptina.
[0040] As sequências de codificação de leptina de tipo selvagem (WT), L86S e L86N foram sintetizadas por PCR a partir de plasmídeos pMet7 expressando leptina de tipo selvagem, leptina L86S ou leptina L86N, respectivamente, usando os seguintes iniciadores:
[0041] progressivo 5'- GCAGATCTGTCGACATCCAGAAAGTCCAGGATGACACC-3', reverso 5'-CG ATG CG G CCG CACATTCAGG G CTAACATCCAACTGT-3' .
[0042] Isso introduz um local Bglll e Notl nos términos amino e carbóxi, respectivamente, da sequência de codificação de leptina. O produto de PCR foi digerido com Bglll e Notl e clonado em pMET7-SlgK- HA-scTNF WT-6xGGS-FLAG (WT scTNF foi gerado pela síntese de genes, GeneArt) aberto com Bglll e Notl, que residem entre o 6xGGS e FLAG. Isso gerou pMET7-SlgK-HA-scTNF WT-6xGGS-mLeptin-FLAG, pMET7-SlgK- HA-scTNF WT-6xGGS-mLeptina L86S-FLAG e pMET7-SlgK-HA-scTNF WT-6xGGS-mLeptina L86N-FLAG. Produção das proteínas de fusão de scTNF/leptina.
[0043] Células HekT foram transfectadas com os construtos de fusão de proteína utilizando o método padrão de precipitação com fosfato de cálcio. 48 horas após a transfecção os meios de cultivo foram coletados e armazenados a -20°C. A concentração foi determinada com uma ELISA comercial hTNFα (DY210, sistemas R&D). Linhas de células
[0044] A linha de células Hek 293T, HL1 16 e LL171 foi cultivada em DMEM suplementado com 10% de FCS.
[0045] As células Ba/F3-ml_R e Ba/F3-MLR-TNFR1 ΔCyt foram mantidas em RPMI suplementado com 10% de FCS desativado por calor e 100ng/ml de leptina. Ensaios
[0046] Ensaio de fosfo STAT1.
[0047] Suspensões de uma célula simples foram preparadas a partir de baços isolados dos camundongos C57BI/6. Os eritrócitos foram esgotados usando tampão de lise de glóbulos vermelhos (Lonza). Os esplenócitos foram tratados durante 30 minutos com IFNα/β de camundongo ou com a proteína de fusão XCL1-IFNα2-Q124R em RPMI de 5% de soro fetal de vitelo a 37° C e então marcados o anti-STAT1 (pY701) de camundongo PE Phosflow BD juntamente com CD1 1c anti- camundongo marcado com Alexa Fluor 488 (eBioscience #53-01 14-80) e CD8a anti-camundongo marcado com APC (BD Bioscience #553035) ou CD 1 1 c anti-camundongo e CD8αanti-camundongo marcado Alexa 488, de acordo com as instruções da BD Biosciences. Os dados de FACS foram adquiridos utilizando um BD FACS Canto e analisados usando um software Diva (BD Biosciences). Ensaio de genes NF-KB repórteres
[0048] Para avaliar a ativação de IL-1R, utilizamos células I L-1 β HEK-Blue ™ que expressam de forma estável o IL-1R (Invivogen) e as transfectamos transitoriamente com um gene repórter de luciferase NF-KB. Resumidamente, as células IL-1β HEK-Blue™ foram semeadas em meio de cultivo (DMEIW com 10% de FCS) em placas de 96 poços (10000 células/poço) e transfectadas no dia seguinte usando o método de precipitação com fosfato de cálcio, com as quantidades indicadas de plasmídeos de expressão e 5 ng/poço do plasmídeo do gene repórter 3KB- LUC (Vanden Berghe et al., 1998). 24 horas após a transfecção, o meio de cultivo foi substituído por meio de privação (DMEM) e 48 horas após a transfecção as células foram induzidas durante 6 horas com proteínas de fusão IL1 -CCL20. Após a indução, as células foram lisadas e a atividade da luciferase nos lisados foi determinada utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase de Vagalume Promega em um luminômetro LB960 centra Berthold. Ensaio de proliferação de células.
[0049] A linha de células Ba/F3-mLR foi gerado por eletroporação de células Ba/F3 com o vetor pMet7-MLR. As células de expressão estável foram selecionadas pelo seu crescimento em leptina em vez de IL-3. De fato, o crescimento de células Ba/F3 depende de IL-3, mas quando eles expressam, mLR, eles também proliferam com leptina. Para obter a linha de células Ba/F3-MLR-TNFR1ΔCyt, as células Ba/F3-mLR foram co- transfectadas com pMet7-HA-hTNFR1ΔCyt e plRESpuro2 (Clontech) seguida pela seleção de puromicina e pela separação por FACS de células que expressam hTNFRIΔCyt.
[0050] Para avaliar a proliferação celular, as células Ba/F3-mLR e Ba/F3-MLR-TNFR1ΔCyt foram lavadas, semeadas em RPMI/10% de iFCS em placas de 96 poços (10,000 células/poço) e estimuladas com as quantidades indicadas de proteínas de leptina ou de fusão. Quatro dias mais tarde, 50ul de XTT (XTT Kit de Proliferação de Células II, Roche, 11 465 015 001) foi adicionado e incubado por 4 h antes da medição da absorvência a 450 nm. Exemplo 1: A atividade de IFN da proteína de fusão XCL1/IFNα2- Q124R é restaurada em células que expressam XCR1.
[0051] Os esplenócitos de camundongo foram tratados durante 30 minutos com 1 nM XCL1 -IFNα2-Q124R ou com 10000 unidades/ml de IFNα/β de camundongo. As células foram então fixadas, permeabilizadas e coradas com um anticorpo anti-fosfo STAT1 (PE), anti CD1 1 c (Alexa Fluor 488) e anti CD8α (APC) e analisadas por FACS. A Figura 2 mostra que o IFN α/β de camundongo induziu a fosforilação de STAT1 em todos os subconjuntos de esplenócitos analisados. Em contraste, a proteína de fusão XCL1-IFN α 2-Q124R induziu uma resposta de IFN apenas na maioria das células pertencentes ao subconjunto CD1 1 c+ CD8α+ e em uma minoria de células pertencentes ao subconjunto CD1 1 c+ CD8 α -. A distribuição dos subconjuntos de esplenócitos que respondem à proteína de fusão XCL1-IFN α 2-Q124R corresponde perfeitamente à distribuição esperada de XCR1, o receptor XCL1 (Dorner et al. 2009). Exemplo 2: A atividade de IL1β é restaurada nas células que expressam CCR6
[0052] As células IL-1β HEK-Blue™, que expressam de forma estável o IL-1 R, foram transfectadas de maneira transitória com um plasmídeo de gene repórter NF-KB (5 ng/poço) e um vetor vazio ou plasmídeo de expressão de hCCR6 (10 ng/poço). As células falsamente transfectadas e transfectadas com CCR6 foram em seguida tratadas por 6 horas com proteínas de fusão IL1β-CCL20 mutantes ou de tipo selvagem (25 ng/ml), após o que as células foram lisadas e a atividade do gene repórter NF-kB foi determinada. Como é evidente a partir da Fig. 4A, as células que expressam CCR6 responderam com o aumento da atividade do gene repórter NF-KB para todas as proteínas de fusão IL1 β -CCL20 investigadas em comparação com as células transfectadas por simulação. Para avaliar o efeito do mutante IL-1β-Q148G, para o qual o efeito de direcionamento foi mais aparente, em mais detalhes, as células IL-1β HEK-Blue™ que expressam CCR6 ou transfectadas falsamente foram tratadas durante 6 horas com doses crescentes da proteína de fusão IL-1βQ148G-CCL20 ou WT IL-1β. A Fig. 4B demonstra que a superexpressão de CCR6 aumentou a atividade da fusão WT IL-1β -CCL20, mas teve um efeito potenciador mais intenso para a fusão IL-1βQ148G-CCL20. O efeito de direcionamento foi mais proeminente quando se aplicou IL1- β -CCL20 às células a 12,5 ng/ml (Fig. 4C). Exemplo 3: A atividade de leptina é restaurada nas células que expressam TNFR.
[0053] A proliferação de células Ba/F3-MLR e células Ba/F3-MLR- TNFR1ΔCyt após 4 dias de estimulação com as quantidades indicadas de leptina ou as proteínas de fusão de leptina-scTNF foi avaliada. Como se mostra na figura 6A, ambas as linhas de células não proliferam no meio suplementado apenas com soro inativado por calor. Além disso, a capacidade da leptina de induzir a proliferação de Ba/F3 é reduzida quando acoplada a scTNF. A mutação de L86 na leptina WT em uma serina (L86S) ou uma asparagina (L86N) resulta em uma redução moderada ou intensa da afinidade em relação ao receptor de leptina de camundongo, respectivamente. Essa redução da afinidade se traduz em uma indução 3 contra 10 vezes menos potente da proliferação das células Ba/F3-mLR para leptina L86S contra L86N, respectivamente. A transfecção adicional de células Ba/F3-ml_R com o TNF-R1 humano sem o seu domínio intracelular (hTNFRIΔCyt) introduz um receptor não-funcional, o qual pode agir como um marcador extracelular ligado à membrana. Claramente, a resposta proliferativa a partir da estimulação com os mutantes de leptina L86N e L86S acoplados a scTNF é completamente restaurada nas células Ba/F3- mLR que expressam o hTNFRIΔCyt (Figura 6B). Exemplo 4: direcionamento in vivo de uma população de células que expressa XCR1
[0054] De acordo com Bachem et al. (Frontiers in Immunology 3, 1 - 12. 2012), as células que expressam XCR1 representam a maior parte da população de células do baço CD1 1 c+ CD8α+ e uma parte menor da população de células do baço CD11 c+ CD8 α -. Injetou-se nos camundongos C57BI/6 iv com a quantidade indicada de XCL1-IFNα2- Q124R ou 1 000 000 unidades de PBS ou IFNα/β de murino natural. Após 45 minutos, as células do baço foram analisadas por FACS quanto a P- STAT1 na população de células a seguir: CD11c-CD8α -, CD11 c- CD8 α +, CD11 c+ CD8 α +, CD11 c+ CD8α -. Os resultados são mostrados na Figura 7. A partir desses resultados, fica evidente que a construção de fusão pode direcionar e induzir uma resposta de uma fração pequena da população (cerca de 0,1% das células totais), enquanto que as células sensíveis a IFN que não expressam o marcador não são afetadas. Inclusive, o IFN de tipo selvagem também afeta as células CD11c+ CD8α -, enquanto que essas células não são afetadas pela construção de fusão, claramente provando a ação específica da fusão.
[0055] REFERÊNCIAS Acosta-Rodriguez EV, Napolitani G, Lanzavecchia A and Sallusto F. (2007) Interleukins 1 beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells. Nat Immunol. 8, 942-9. - Acres B, Gantzer M, Remy C, Futin N, Accart N, Chaloin O, Hoebeke J, Balloul JM and Paul S. (2005). Fusokine interleukin- 2/interleukin-18, a novel potent innate and adaptive immune stimulator with decreased toxicity. Cancer Res. 65, 9536-46. Baba M, Imai T, Nishimura M, Kakizaki M, Takagi S, Hieshima K, Nomiyama H and Yoshie O. (1997). Identification of CCR6, the specific receptor for a novel lymphocyte-directed CC chemokine LARC. J Biol Chem. 272,14893-8. Bachem A, Hartung E, Guttler S, Mora A, Zhou X, Hegemann A, Plantinga M, Mazzini E, Stoitzner P, Gurka S, Henn V, Mages HW and Kroczek RA. (2012). Expression of XCR1 Characterizes the Batf3- Dependent Lineage of Dendritic Cells Capable of Antigen CrossPresentation. Front Immunol. 3, 214. doi: 10.3389. - Ben-Sasson SZ, Caucheteux S, Crank M, Hu-Li J and Paul WE. (2011 ). IL-1 acts on T cells to enhance the magnitude of in vivo immune responses. Cytokine, 56, 122-5. - Bono MR, Benech P, Coullin P, Alcaide-Loridan C, Grisard MC, Join H, Fischer DG and Fellous M. (1989). Characterization of human IFN- gamma response using somatic cell hybrids of hematopietic and nonhematopoietic origin. Somat. Cell Mol. Genet. 15, 513-23. - Brecht A., Gauglitz G., Polster J. (1993). Interferometric immunoassay in a FIA-system - A sensitive and rapid approach in label-free immunosensing. , Biosens Bioelectron 8 : 387- 392. - Crozat K, Guiton R, Contreras V, Feuillet V, Dutertre CA, Ventre E, Vu Manh TP, Baranek T, Storset AK, Marvel J, Boudinot P, Hosmalin A, Schwartz-Cornil I and Dalod M. (2010). The XC chemokine receptor 1 is a conserved selective marker of mammalian cells homologous to mouse CD8alpha+ dendritic cells. J. Exp. Med. 207, 1283-1292. Donahue RE, Seehra J, Metzger M, Lefebvre D, Rock B, Carbone S, Nathan DG, Garnick M, Sehgal PK, Laston D, et al. (1988). Human IL-3 and GM-CSF act synergistically in stimulating hematopoiesis in primates. Science 241 , 1820-1823 - Domer BG, Dorner MB, Zhou X, Opitz C, Mora A, GGttler S, Hutloff A, Mages HW, Ranke K, Schaefer M, Jack RS, Henn V and Kroczek RA. (2009). Selective expression of the chemokine receptor XCR1 on crosspresenting dendritic cells determines cooperation with CD8+ T cells. Immunity 31 , 823-833. Dunne A, Ross PJ, Pospisilova E, Masin J, Meaney A, Sutton CE, Iwakura Y, Tschopp J, Sebo P and Mills KH. (2010) Inflammasome activation by adenylate cyclase toxin directs Th17 responses and protection against Bordetella pertussis. J Immunol. 185, 171 1 -9. - Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo SR, Kranz DM, Murphy KM and Gajewski TF (201 1 ). Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cellsJ. Exp. Med. 208, 2005-2016. Gaffen SL. (201 1 ). Recent advances in the IL-17 cytokine family. Curr Opin Immunol. 23, 613-9. Gajewski TF, Fuertes MB and Woo SR (2012). Innate immune sensing of cancer: clues from an identified role for type I IFNs. Cancer Immunol Immunother. 61 , 1343-7. - Gillies SD, Lan Y, Brunkhorst B, Wong WK, Li Y, Lo KM. (2002). Bi-functional cytokine fusion proteins for gene therapy and antibody-targeted treatment of cancer. Cancer Immunol Immunother 51 , 449-460 - Halaas JL, Gajiwala KS, Maffei M, Cohen SL, Chait BT, Rabinowitz D, Lallone RL, Burley SK and Friedman JM. (1995). Weight-reducing effects of the plasma protein encoded by the obese gene. Science, 269, 543-6. Hehlgans, T and Pfeffer, K (2005). The intriguing biology of the tumour necrosis factor/tumour necrosis factor receptor superfamily: players, rules and the games. Immunology. 115, 1-20. - Hieshima K, Imai T, Opdenakker G, Van Damme J, Kusuda J, Tei H, Sakaki Y, Takatsuki K, Miura R, Yoshie O and Nomiyama H. (1997). Molecular cloning of a novel human CC chemokine liver and activation- regulated chemokine (LARC) expressed in liver. Chemotactic activity for lymphocytes and gene localization on chromosome 2. J Biol Chem. 272, 5846-53. - Higgins SC, Jarnicki AG, Lavelle EC and Mills KH. (2006). TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T cells. J Immunol. 177, 7980-9. Idriss HT & Naismith JH (2000). TNF alpha and the TNF receptor superfamily: structure- function relationship(s). Microscopy research and technique 50, 184-95. - likuni N, Lam QL, Lu L, Matarese G, La Cava A. (2008). Leptin and Inflammation. Curr Immunol Rev. 4, 70-79. - Jahn T, Zuther M, Friedrichs B, Heuser C, Guhlke S, Abken H, Hombach AA (2012). An IL12-IL2-antibody fusion protein targeting Hodgkin's lymphoma cells potentiates activation of NK and T cells for an anti-tumor attack. PLoS One 7:e44482. - Khader SA, Bell GK, Pearl JE, Fountain JJ, Rangel-Moreno J, Cilley GE, Shen F, Eaton SM, Gaffen SL, Swain SL, Locksley RM, Haynes L, Randall TD and Cooper AM. (2007). IL-23 and IL-17 in the establishment of protective pulmonary CD4+ T cell responses after vaccination and during Mycobacterium tuberculosis challenge. Nat Immunol. 8, 369-77. Krippner-Heidenreich A, Grunwald I, Zimmermann G, Kühnle M, Gerspach J, Sterns T, Shnyder SD, Gill JH, Mannel DN, Pfizenmaier K and Scheurich P. (2008). Single-chain TNF, a TNF derivative with enhanced stability and antitumoral activity. J Immunol. 180, 8176-83. - Lu J, Peng Y, Zheng ZJ, Pan JH, Zhang Y, Bai Y (2008). EGF-IL-18 fusion protein as a potential anti-tumor reagent by induction of immune response and apoptosis in cancer cells. Cancer Lett 260, 187-197. - Murzin AG, Lesk AM & Chothia C (1992). β-Trefoil fold: Patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interleukins-T β and 1α and fibroblast growth factors. Journal of Molecular Biology 223, 531-543. Nicola NA & Hilton DJ (1998). General classes and functions of four- helix bundle cytokines. Advances in protein chemistry 52, 1-65. - Nomiyama H, Osada N and Yoshie O. (2013). Systematic classification of vertebrate chemokines based on conserved synteny and evolutionary history. Genes Cells. 18,1 -16. O'Shaughnessy JA, Tolcher A, Riseberg D, Venzon D, Zujewski J, Noone M, Gossard M, Danforth D, Jacobson J, Chang V, Goldspiel B, Keegan P, Giusti R and Cowan KH. (1996). Prospective, randomized trial of 5-fluorouracil, leucovorin, doxorubicin, and cyclophosphamide chemotherapy in combination with the interleukin-3/granulocyte- macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) fusion protein (PIXY321 ) versus GM-CSF in patients with advanced breast cancer. Blood 87, 2205-221 1 - Penafuerte C, Bautista-Lopez N, Boulassel MR, Routy JP and Galipeau J (2009). The human ortholog of granulocyte macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2 fusion protein induces potent ex vivo natural killer cell activation and maturation. Cancer Res 69, 9020-9028 - Rafei M, Wu JH, Annabi B, Lejeune L, Frangois M and Galipeau J (2007). A GMCSF and IL-15 fusokine leads to paradoxical immunosuppression in vivo via asymmetrical JAK /STAT signaling through the IL-15 receptor complex. Blood 109, 2234-2242 - Rafei M, Hsieh J, Zehntner S, Li M, Forner K, Birman E, Boivin MN, Young YK, Perreault C and Galipeau J. (2009a). A granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-15 fusokine induces a regulatory B cell population with immune suppressive properties. Nat Med 15, 1038-1045 - Rafei M, Campeau PM, Wu JH, Birman E, Forner K, Boivin MN and Galipeau J. (2009b) Selective inhibition of CCR2 expressing lymphomyeloid cells in experimental autoimmune encephalomyelitis by a GM-CSF-MCP1 fusokine. J Immunol. 182, 2620-7. Rafei M, Berchiche YA, Birman E, Boivin MN, Young YK, Wu JH, Heveker N, and Galipeau J. (2009c) An engineered GM-CSF-CCL2 fusokine is a potent inhibitor of CCR2-driven inflammation as demonstrated in a murine model of inflammatory arthritis. J Immunol. 183, 1759-66. Rafei M, Deng J, Boivin MN, Williams P, Matulis SM, Yuan S, Birman E, Forner K, Yuan L, Castellino C, Boise LH, MacDonald TJ and Galipeau J. (201 1 ) A MCP1 fusokine with CCR2-specific tumoricidal activity. Mol Cancer. 10:121. doi: 10.1 186/1476-4598-10-121. Shaw MH, Kamada N, Kim YG and Nunez G. (2012) Microbiota- induced IL-I β, but not IL-6, is critical for the development of steady-state TH 17 cells in the intestine. J Exp Med. 209, 251-8. Singh SP, Zhang HH, Foley JF, Hedrick MN and Farber JM. (2008) Human T cells that are able to produce IL-17 express the chemokine receptor CCR6. J Immunol. 180, 214-21. Scatchard G. (1949). Ann New York Acad Sci 51 , 660-72. Stagg J, Wu JH, Bouganim N and Galipeau J. (2004). Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin-2 fusion cDNA for cancer gene immunotherapy. Cancer Res 64, 8795-8799 Sun PD & Davies DR. (1995). The cystine-knot growth-factor superfamily. Annual review of biophysics and biomolecular structure 24, 269-91. Sutton C, Brereton C, Keogh B, Mills KH and Lavelle EC. (2006). A crucial role for interleukin (IL)-1 in the induction of IL-17-producing T cells that mediate autoimmune encephalomyelitis. J Exp Med. 203, 1685-91. Weber H, Valenzuela D, Lujber G, Gubler M and Weissmann C. (1987). Single amino acid changes that render human IFN-alpha 2 biologically active on mouse cells. EMBO J. 6, 591-8. Williams P, Bouchentouf M, Rafei M, Romieu-Mourez R, Hsieh J, Boivin MN, Yuan S, Forner KA, Birman E and Galipeau J. (2010a). A dendritic cell population generated by a fusion of GM-CSF and IL-21 induces tumor-antigen-specific immunity. J Immunol. 185, 7358-66. Williams P, Rafei M, Bouchentouf M, Raven J, Yuan S, Cuerquis J, Forner KA, Birman E and Galipeau J. (2010b). A fusion of GMCSF and IL- 21 initiates hypersignaling through the IL-21 Ralpha chain with immune activating and tumoricidal effects in vivo. Mol Ther 18, 1293-1301. Ye P, Rodriguez FH, Kanaly S, Stocking KL, Schurr J, Schwarzenberger P, Oliver P, Huang W, Zhang P, Zhang J, Shellito JE, Bagby GJ, Nelson S, Charrier K, Peschon JJ and Kolls JK. (2001 ). Requirement of interleukin 17 receptor signaling for lung CXC chemokine and granulocyte colony-stimulating factor expression, neutrophil recruitment, and host defense. J Exp Med. 194, 519-27. 1/1

Claims (6)

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos duas citocinas, em que as citocinas são XCL1 e IFNα2 or CCL20 e ILβ, e em que pelo menos uma citocina compreende uma mutação que reduz fortemente a atividade de ligação ao seu receptor, e pelo menos uma citocina é uma citocina de tipo selvagem que provê o direcionamento específico da célula que restaura atividade da citocina mutante sobre as células direcionadas.
2. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ligante GGS.
3. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a IFNα2 compreende a mutação.
4. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a mutação é Q124R.
5. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que XCL1 é do tipo selvagem.
6. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que é para o uso como um medicamento.
BR112016001036-1A 2013-07-18 2014-07-03 Fusocinas envolvendo citocinas com afinidades de ligação de receptores fortemente reduzida BR112016001036B1 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13306034 2013-07-18
EP13306034.3 2013-07-18
PCT/EP2014/064227 WO2015007536A2 (en) 2013-07-18 2014-07-03 Fusokines involving cytokines with strongly reduced receptor binding affinities

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BR112016001036A2 BR112016001036A2 (pt) 2017-10-24
BR112016001036B1 true BR112016001036B1 (pt) 2023-02-23

Family

ID=48906191

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112016001036-1A BR112016001036B1 (pt) 2013-07-18 2014-07-03 Fusocinas envolvendo citocinas com afinidades de ligação de receptores fortemente reduzida

Country Status (15)

Country Link
US (3) US10640542B2 (pt)
EP (2) EP3022305B1 (pt)
JP (2) JP6580037B2 (pt)
KR (1) KR102322510B1 (pt)
CN (2) CN105705641B (pt)
AU (2) AU2014292371B2 (pt)
BR (1) BR112016001036B1 (pt)
CA (1) CA2917937C (pt)
DK (1) DK3299466T3 (pt)
ES (2) ES2757501T3 (pt)
HK (1) HK1252831A1 (pt)
IL (1) IL243451B (pt)
MX (1) MX2016000611A (pt)
SG (2) SG11201600163VA (pt)
WO (1) WO2015007536A2 (pt)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3003969A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Orionis Biosciences Nv Bi-functional chimeric proteins and uses thereof
US11661455B2 (en) 2016-02-05 2023-05-30 Orionis Biosciences BV Chimeric protein comprising an interferon alpha 2mutant and a PD-L1 binding moiety
EP4059957A1 (en) 2016-02-05 2022-09-21 Orionis Biosciences BV Bispecific signaling agents and uses thereof
WO2017153402A1 (en) 2016-03-07 2017-09-14 Vib Vzw Cd20 binding single domain antibodies
JP7105200B2 (ja) 2016-05-13 2022-07-22 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ 標的突然変異体インターフェロン-ベータおよびその使用
EP3455245A2 (en) 2016-05-13 2019-03-20 Orionis Biosciences NV Therapeutic targeting of non-cellular structures
US11084859B2 (en) 2016-10-24 2021-08-10 Orionis Biosciences BV Targeted mutant interferon-gamma and uses thereof
CA3052523A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences Nv Targeted chimeric proteins and uses thereof
WO2018144999A1 (en) 2017-02-06 2018-08-09 Orionis Biosciences, Inc. Targeted engineered interferon and uses thereof
EP3580230A1 (en) 2017-02-07 2019-12-18 VIB vzw Immune-cell targeted bispecific chimeric proteins and uses thereof
WO2019032663A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Orionis Biosciences Inc. PD-1 AND PD-L1 BINDING AGENTS
CA3069930A1 (en) 2017-08-09 2019-02-14 Orionis Biosciences Inc. Cd8 binding agents
US11896643B2 (en) 2018-02-05 2024-02-13 Orionis Biosciences, Inc. Fibroblast binding agents and use thereof
CN113767115A (zh) 2019-03-28 2021-12-07 奥里尼斯生物科学股份有限公司 治疗性干扰素α1蛋白
EP4329786A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 KaliVir Immunotherapeutics, Inc. Oncolytic viruses for modified mhc expression
US20240166706A1 (en) * 2022-11-21 2024-05-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Synthetic il6-il1beta fusion cytokine for promoting t cell cytotoxic function, t cell proliferation, and tumoricidal activity

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2055445T3 (es) 1989-08-22 1994-08-16 Immunex Corp Proteinas de fusion que comprenden gm-csf e il-3.
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
US5914254A (en) 1993-08-02 1999-06-22 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Expression of fusion polypeptides transported out of the cytoplasm without leader sequences
MXPA02001417A (es) * 1999-08-09 2002-08-12 Lexigen Pharm Corp Complejos multiples de citosina-anticuerpo.
AU2002236517A1 (en) * 2000-11-29 2002-06-11 University Of Southern California Targetet retoviral vectors for cancer immunotherapy
CN1168740C (zh) * 2001-04-04 2004-09-29 上海美恩生物技术有限公司 细胞因子基因修饰的抗原提呈细胞/肿瘤细胞偶联物、其制法和用途
MXPA04005266A (es) * 2001-12-04 2004-10-11 Merck Patent Gmbh Inmunocitocinas con selectividad modulada.
DE602004031341D1 (de) * 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
EP1598364A1 (en) * 2004-05-21 2005-11-23 AGIRx Limited Chimerical soluble hyper IL-11 receptor and use thereof
CA2585549A1 (en) 2004-11-18 2006-05-26 Vib Vzw Novel type leptin receptor antagonist
WO2006115800A2 (en) 2005-04-15 2006-11-02 The Regents Of The University Of California Enhanced wound healing utilizing an anti-her2 antibody coupled to a tnf alpha
US7947265B2 (en) 2006-08-02 2011-05-24 Mcgill University Fusion proteins and methods for modulation of immune response
WO2008124086A2 (en) * 2007-04-05 2008-10-16 President And Fellows Of Harvard College Chimeric activators: quantitatively designed protein therapeutics and uses thereof
US20110038865A1 (en) 2007-06-26 2011-02-17 University Of Miami Antibody- endostatin fusion protein and its variants
EP2853267B1 (en) 2007-09-21 2016-12-07 The Regents of the University of California Targeted interferon demonstrates potent apoptotic and anti-tumor activities
WO2010036918A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 University Of Massachusetts Intracellular dna receptor
US20110294983A1 (en) 2008-12-08 2011-12-01 Complix Nv Single-chain antiparallel coiled coil proteins
CA2769619C (en) 2009-08-17 2019-04-30 Roche Glycart Ag Targeted immunoconjugates
CA2773426A1 (en) 2009-09-10 2011-03-17 Cytos Biotechnology Ag Use of interleukin-1 beta mutein conjugates in the treatment of diabetes
CN105031618A (zh) * 2009-11-02 2015-11-11 加利福尼亚大学董事会 用于细胞因子递送的穹窿体复合物
CA2785258A1 (en) * 2009-12-23 2011-06-30 Gradalis, Inc. Furin-knockdown and gm-csf-augmented (fang) cancer vaccine
AU2011243965A1 (en) * 2010-04-22 2012-12-06 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center High affinity leptins and leptin antagonists
CN102372780A (zh) * 2010-08-23 2012-03-14 上海市计划生育科学研究所 抗人绒毛膜促性腺激素抗体-白介素2融合蛋白的制备及其应用
EP2718457A4 (en) 2011-06-06 2014-12-24 Immungene Inc GENETICALLY MODIFIED FUSION MOLECULES LIGAND TNFSF-ANTIBODY ELEMENT
KR102096224B1 (ko) 2011-10-28 2020-04-03 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 폴리펩티드 구축물 및 이의 용도
ES2694180T3 (es) * 2012-01-20 2018-12-18 Vib Vzw Citocinas de haz alfa-helicoidal mutantes dirigidas
PL2822575T3 (pl) 2012-03-03 2020-08-10 Immungene, Inc. Zmodyfikowane sposobami inżynierii cząsteczki fuzyjne przeciwciało-mutant interferonu
US10544199B2 (en) * 2014-10-29 2020-01-28 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Interferon alpha 2B variants

Also Published As

Publication number Publication date
ES2757501T3 (es) 2020-04-29
AU2018203868B2 (en) 2019-12-05
IL243451B (en) 2019-10-31
EP3022305B1 (en) 2017-11-01
MX2016000611A (es) 2016-09-29
US10640542B2 (en) 2020-05-05
JP2016525516A (ja) 2016-08-25
IL243451A0 (en) 2016-03-31
SG11201600163VA (en) 2016-02-26
AU2014292371B2 (en) 2018-03-29
DK3299466T3 (da) 2019-11-18
SG10201808738WA (en) 2018-11-29
US11358997B2 (en) 2022-06-14
BR112016001036A2 (pt) 2017-10-24
CN110835376A (zh) 2020-02-25
EP3299466A1 (en) 2018-03-28
KR20160108291A (ko) 2016-09-19
JP2020002155A (ja) 2020-01-09
US20190010199A1 (en) 2019-01-10
US20180155404A1 (en) 2018-06-07
CA2917937C (en) 2022-11-01
WO2015007536A2 (en) 2015-01-22
WO2015007536A3 (en) 2015-03-19
CN105705641B (zh) 2021-07-13
CN110835376B (zh) 2023-08-04
JP6580037B2 (ja) 2019-09-25
JP6853317B2 (ja) 2021-03-31
KR102322510B1 (ko) 2021-11-08
HK1252831A1 (zh) 2019-06-06
ES2657060T3 (es) 2018-03-01
CA2917937A1 (en) 2015-01-22
EP3299466B1 (en) 2019-09-11
US20230054612A1 (en) 2023-02-23
EP3022305A2 (en) 2016-05-25
CN105705641A (zh) 2016-06-22
AU2018203868A1 (en) 2018-06-21
AU2014292371A1 (en) 2016-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230054612A1 (en) Fusokines involving cytokines with strongly reduced receptor binding affinities
RU2711979C2 (ru) Белковый комплекс интерлейкина 15 и его применение
Budagian et al. IL-15/IL-15 receptor biology: a guided tour through an expanding universe
ES2842677T3 (es) Ligandos modificados mediante permutación circular como agonistas y antagonistas
JP6723982B2 (ja) インターロイキン−2/インターロイキン−2受容体アルファ融合タンパク質および使用方法
Han et al. IL-15: IL-15 receptor alpha superagonist complex: high-level co-expression in recombinant mammalian cells, purification and characterization
KR101559330B1 (ko) 암 및 만성 감염 치료를 위한, 효능제 활성을 갖는 인터루킨 2로부터 유도된 폴리펩티드
CN110437339A (zh) 一种以白介素15为活性成分的融合蛋白型药物前体
ES2251610T3 (es) Mutantes de interleuquina-18, su produccion y su uso.
PT1076704E (pt) Agonistas e antagonistas selectivos da il-2
JP2008528039A (ja) Il−31の均質調製物
JP4024366B2 (ja) ポリペプチド
ES2298106T3 (es) Proteinas de fusion que comprenden dos moleculas gp130 solubles.
JP2022533636A (ja) 免疫細胞を増殖させるil-2突然変異体タンパク質
US20210008167A1 (en) T cell receptor fusions and conjugates and methods of use thereof
WO2019067789A1 (en) METHOD OF TREATING COMPLICATIONS RELATED TO ACUTE OR CHRONIC HYPERGLYCEMIA
JP3689111B2 (ja) インターロイキン15

Legal Events

Date Code Title Description
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B25D Requested change of name of applicant approved

Owner name: VIB VZW (BE) ; UNIVERSITEIT GENT (BE) ; CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (FR) ; CENTRE HOSPITALIER REGIONAL UNIVERSITAIRE DE MONTPELLIER (FR) ; UNIVERSITE MONTPELLIER (FR)

Owner name: VIB VZW (BE) ; UNIVERSITEIT GENT (BE) ; CENTRE NAT

B07E Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette]
B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B07A Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 03/07/2014, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS