JP6853317B2 - 高度に低下された受容体結合親和性を有するサイトカインを含むフソカイン - Google Patents

Description

本発明は、少なくとも２種のサイトカインを含み、そのうちの少なくとも１種がその受容体に対して、または受容体のうちの１つに対して高度に低下された結合親和性を有する修飾サイトカインである、融合タンパク質に関する。好ましくは両方のサイトカインは、リンカー、好ましくはＧＧＳリンカーにより連結されている。本発明はさらに、疾患の治療において使用するための前記融合タンパク質に関する。

サイトカインは、細胞間情報伝達において極めて重要な役割を果たす低分子分泌または膜結合タンパク質である。サイトカインの、その同族受容体複合体への結合は、細胞内シグナル伝達事象のカスケードを惹起し、細胞、それが一部をなす組織及び臓器の必要性に応じて細胞を周辺環境に感作及び応答させる。それらは、特徴として多面発現性であり、つまりそれらは標的細胞の性質及び発達状態に応じて広範囲の応答を誘発する。その上、いくつかのサイトカインは、オーバーラップした活性を有することで互いの欠損を機能的に補填することができるため、サイトカインのいくつかは非常に重複的である。サイトカインの活性は、オートクリン、パラクリンまたはエンドクリンになり得るため、サイトカイン、ペプチドホルモン及び成長因子の称号の境界はあいまいである。

サイトカインの６種の異なる構造分類が知られており、以下の通りである：ほとんどのインターロイキンと、コロニー刺激因子と、成長ホルモン及びレプチンのようなホルモンとを含むα−ヘリカルバンドルサイトカイン（Ｎｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｈｉｌｔｏｎ， １９９８）、三量体腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー（Ｉｄｒｉｓｓ ａｎｄ Ｎａｉｓｍｉｔｈ， ２０００）、システインノット成長因子（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， １９９５）、インターロイキン−１ファミリーを含むβ−トレフォイルフォールドグループ（Ｍｕｒｚｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、インターロイキン−１７（ＩＬ−１７）ファミリー（Ｇａｆｆｅｎ， ２０１１）、ならびにケモカイン（Ｎｏｍｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。

いくつかのサイトカインは、重要な臨床用途を見出している。例としては、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロンα２及び−β、ならびに成長ホルモンが挙げられる。反対に多くの場合、それらの炎症促進性の結果、選択されたサイトカインとの拮抗も、特定の医療用途を見出す。この場合の主要な例は、ＴＮＦα活性を遮断して関節リウマチなどの自己免疫疾患と戦う方策である。これらの成功のおかげで、病院においてサイトカイン活性を最適化する方策が、探索されている。これらには、半減期の最適化、免疫原性の低下、特定の細胞型を標的とする送達、及び２種のサイトカインの遺伝子融合、いわゆるフソカインがある。

フソカインは、リンカー配列を用いて遺伝子的に結合された２種の異なるサイトカインの人工的組み合わせである。フソカインの最初の例は、ｐＩＸＹ３２１またはピクシカインであり、それはいずれかのサイトカイン単独と比較して優れた造血及び免疫作用を示した顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）とＩＬ−３との融合タンパク質である（Ｄｏｎａｈｕｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８）。この効果は、それぞれの受容体複合体への結合増強により説明することができ得る。注目すべきは、両方の受容体は、シグナル伝達するβｃサブユニットを共有し、シグナル伝達レベルで相乗効果を妨害する。第三相臨床試験では、ｐＩＸＹ３２１は、ＧＭ−ＣＳＦ単独と比較して優れた性質を示さなかった（Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＩＬ−２ファミリーのサイトカインを含むＧＭ−ＣＳＦベースのフソカインも、同様に探索された。これらのサイトカインは全て、γｃサブユニットを含む受容体複合体を通してシグナル伝達する。ＧＭ−ＣＳＦを含むそのようなフソカインの例としては、ＧＩＦＴ２、−１５及び−２１としても知られるＩＬ−２（Ｓｔａｇｇ ｅｔ ａｌ．， ２００４）、ＩＬ−１５（Ｒａｆｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００７）及びＩＬ−２１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， ２０１０ａ）が挙げられる。シグナル伝達レベル（即ち、標的細胞内での相乗効果）と細胞レベル（即ち、異なる標的細胞型の間での相乗効果）の両方で、相乗効果が予測され得た。例えばＧＩＦＴ２は、非融合サイトカインの組み合わせに比較して、ＮＫ細胞のより強力な活性化を誘導し（Ｐｅｎａｆｕｅｒｔｅ ｅｔ ａｌ．， ２００９）、ＧＩＦＴ１５は、予期せぬ強力な免疫抑制性Ｂ細胞集団を誘導した（Ｒａｆｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９ａ）。同様に、ＧＩＦＴ２１は、単球細胞に対して意外な炎症促進作用を発揮した（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ， ２０１０ｂ）。α−ヘリカルサイトカインを組み合わせるフソカインの別の例は、ＩＬ−２／ＩＬ−１２である（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２； Ｊａｈｎ ｅｔ ａｌ， ２０１２）。

フソカインの別の分類は、異なる構造ファミリーからのサイトカインを組み合わせている。例としては、ＩＬ−１８（ＩＬ−１サイトカインファミリーの一種）とＩＬ−２の融合（Ａｃｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， ２００５）、及びＩＬ−１８とＥＧＦ（上皮成長因子）の融合が挙げられる。ＥＧＦＲの過剰発現は、特定の腫瘍細胞型で観察されることが多いため、後者のフソカインは、ＩＬ−１８活性をＥＧＦＲ＋腫瘍細胞に向ける可能性を示す（Ｌｕ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。α−ヘリカルバンドルサイトカインとケモカインとの融合もまた、より詳細に探求された。ケモカインは多くの場合、濃度勾配を利用して、感染及び炎症の部位への免疫細胞遊走を進める働きがある。多くのケモカイン受容体は、選択された（免疫）細胞に向けさせる限定的な発現様式を示す。その上、蛇行性Ｇタンパク質結合ケモカイン受容体を介したシグナル伝達は、α−ヘリカルバンドルサイトカイン受容体複合体により活性化される経路とは根本的に異なっており、正と負のクロストークメカニズムの相乗効果が、予測され得る。注目すべきことは、ケモカインの設計されたＮ末端欠失型は、それらの受容体結合特性を保持しながら拮抗的挙動を示し得る。例は、ＧＭＭＥ１としても知られる、ＧＭ−ＣＳＦと最初の５つのＮ末端アミノ酸を欠くＮ末端欠失型ＣＣＬ２とのフソカインである（Ｒａｆｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９ｂ）。このフソカインは、炎症性ＣＣＲ２＋細胞のアポトーシスを誘導し、ＧＭＭＥ１で処置されたマウスは、それぞれ多発性硬化症（Ｒａｆｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９ｂ）及び関節リウマチ（Ｒａｆｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２００９ｃ）に関するＥＡＥ及びＣＩＡなどの実験的な自己免疫疾患スコアの低減を示した。同様にこのフソカインは、ＣＣＲ２＋腫瘍細胞のアポトーシスを誘導した（Ｒａｆｅｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。

しかし、野生型サイトカインと、同族受容体複合体に対して高度に低下された親和性を有する変異型サイトカインとの融合は、これまでに探索されていない。このアプローチの利点は、野生型サイトカインの可能性のある全身毒性が排除されることである。驚くべきことに、本発明者らは、そのようなフソカインがサイトカイン活性の細胞特異性標的化を可能にし、そのような変異型サイトカインが野生型サイトカインの負の作用を有さずに標的細胞への活性を復帰し得ることを見出した。以下に例示される通り、この原理の一般的な適用可能性が、構造的に異なるサイトカイン分類の２種のサイトカインでそれぞれが構成されたフソカインの３種を用いて実証された。

ＸＣＬ１／ＩＦＮα２変異体
ＸＣＬ１は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞分極化ＣＤ４^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞により分泌される９３アミノ酸のケモカインである。それは、専ら樹状細胞により発現されるケモカイン受容体であるＸＣＲ１と相互作用する。マウスにおいてＸＣＲ１は、脾臓ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ８α^＋樹状細胞の多数で発現されるが、ＣＤ８α⁻樹状細胞では非常にわずかな一部だけが、この受容体を発現する（Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９）。ＸＣＲ１は、マウスＣＤ８α^＋樹状細胞に相同的な哺乳動物細胞（ヒト細胞を含む）の保存された選択マーカである（Ｃｒｏｚａｔ ｅｔ ａｌ． ２０１０）。興味深いこととして、この樹状細胞サブセットに対するＩ型インターフェロン（ＩＦＮα／β）の作用が、マウスの体内で成長する腫瘍の生来の免疫認識に極めて重要であることが示されている（Ｆｕｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ． ２０１１）。

全身ＩＦＮα療法は、重度の疲労、発熱、悪寒、抑うつ、甲状腺機能不全、網膜疾患、脱毛、皮膚の乾燥、発疹、かゆみ及び骨髄抑制などの副作用をはじめとし、かなりの毒性を有する。このため、ＩＦＮで処置されるべき細胞集団のみにＩＦＮ活性を向けることが、非常に有意義である。ＸＣＲ１発現樹状細胞は、抗原のクロスプレゼンテーションに特化されるので、抗腫瘍療法において適用する場合には、ＸＣＲ１発現樹状細胞の集団を標的化することが、非常に望ましい（Ｂａｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。ＸＣＲ１発現樹状細胞集団が、免疫応答を開始して最終的に腫瘍破壊及び免疫化を可能にするために腫瘍の微小環境においてＩ型ＩＦＮと反応しなければならない重要な細胞集団であることが、多くの実験データから示唆される（Ｇａｊｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０１２）。

ヒトＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ変異体は、ネズミＩＦＮＡＲ１鎖に対して高親和性を、そしてネズミＩＦＮＡＲ２鎖に対して低親和性を有する（Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。それは、ネズミ細胞に対して非常に低い活性を示し、つまりＩＦＮ活性を選択されたマウス細胞に向けるのに適した遺伝子改変Ｉ型ＩＦＮサブタイプの原型である（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５０７８７）。

ＣＣＬ１２０／ＩＬ１β
肝臓及び活性化調節ケモカイン（ＬＡＲＣ）、マクロファージ炎症性タンパク質−３α（ＭＩＰ−３α）またはエクソダス−１としても知られるＣＣケモカインＣＣＬ２０は、主に肝臓及びリンパ球様組織において発現される９６アミノ酸のタンパク質である（Ｈｉｅｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。分泌によりＣＣＬ２０は、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）１ファミリーに属するＣＣケモカイン受容体６（ＣＣＲ６）への結合により活性を発揮する（Ｂａｂａ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ＣＣＲ６発現は、異なる白血球サブセット上で報告されているが、Ｔｈ１７細胞集団について最もよく文書化されている（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。正常なＴｈ１７機能は、結核菌（Ｋｈａｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００７）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．， ２００１）及び百日咳菌（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．， ２００６）をはじめとする様々な病原に対する防御的免疫性に絶対必要である。

異なるＴ細胞サブセット、特にＴｈ１７細胞の増殖及び分化に及ぼすＩＬ−１βの増強効果（Ｓｕｔｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２００６； Ａｃｏｓｔａ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ．， ２００７； Ｄｕｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１０； Ｓｈａｗ ｅｔ ａｌ．， ２０１２）が、確証されている。Ｔ細胞サブセットのうち、Ｔｈ１７細胞は、最高レベルのＩＬ−１Ｒを発現し、ＩＬ−１は、Ｔｈ１７のプライミングにおいて重要な役割を果たす。それゆえ、制御されたアゴニスティックなＩＬ−１活性は、免疫刺激作用が望ましいとされる異なる生理学的／病理学的プロセスにおいて用途を有し得る。しかし、免疫刺激療法にＩＬ−１を使用することに関する主な懸念の１つは、全身投与された場合の重度の毒性である。したがって、ＩＬ−１作用が選択された細胞集団に限定されれば、その毒性の問題は解決される可能性があり、例えば弱いワクチンへの応答を増強するＴ細胞アジュバントとしての使用に関して、治療の展望が広がる（Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１１）。ＩＬ−１変異体をＴｈ１７細胞集団に特異的に標的化させるために、ＣＣＬ２０標的化部分に融合された変異型ＩＬ−１からなるＩＬ−１の変異形が用いられる。活性化がＣＣＲ６発現細胞（即ち、Ｔｈ１７細胞）のみに限定されるため、いかなる主要な全身毒性も予期されない。

ＴＮＦα／レプチン変異体
ＴＮＦαは、細胞毒性、免疫細胞の調節及び炎症反応の仲介といった広範囲の生物活性を有するサイトカインである。それは、２２３のアミノ酸からなる自己組織化する非共有結合性ホモトリマーのＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦαは、膜結合性で、ならびにＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ。ＡＤＡＭ１７とも称される）による７６のアミノ末端アミノ酸（プレシークエンス）のタンパク質分解性切断後に細胞膜から放出される可溶性のタンパク質として活性である。それは、２種の別個の受容体、すなわちＴＮＦ−Ｒ１（ｐ５５）及びＴＮＦ−Ｒ２（ｐ７５）を通してシグナル伝達するが、それらは両者ともリガンド結合細胞外ドメイン内にシステインリッチモチーフを有する膜貫通糖タンパク質である。その細胞外の相同性にもかかわらず、それらは、別個の細胞内ドメインを有し、それゆえ異なるＴＮＦ活性をシグナル伝達する（Ｈｅｈｌｇａｎｓ ＆ Ｐｆｅｆｆｅｒ， ２００５）。本発明者らは、以前にＢｏｓｃｈｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１０により記載された通り、ＧＧＧＧＳリンカーを介して連結された３つのＴＮＦモノマーからなる一本鎖バリアント（ｓｃＴＮＦ）を作製した。

レプチンは、免疫性、生殖、直線増殖、グルコースホメオスタシス、骨代謝及び脂肪酸化をはじめとする複数の生物過程に関与する１６ｋＤａの脂肪細胞サイトカインであるが、満腹シグナルとしての劇的作用が最もよく知られている（Ｈａｌａａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。レプチンは、その免疫細胞への作用のため、複数の自己免疫疾患にも関連づけられる（Ｉｉｋｕｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２００８）。レプチン活性の選択的標的化は、代謝関連障害と、免疫または炎症関連障害の両方に有利になり得る。

本発明の第一の態様は、少なくとも２種のサイトカインを含み、そのうち少なくとも１種のサイトカインが、受容体に対して、または異なる受容体への結合が可能である場合には受容体の少なくとも１つに対して、高度に低下された結合活性を示す修飾サイトカインである、融合タンパク質である。本明細書で用いられる、低下された結合親和性は、親和性が野生型サイトカインの５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満であることを意味する。本明細書で用いられる「野生型サイトカイン」は、宿主生物体において自然に生成するサイトカインを意味する。結合親和性の低下をもたらすサイトカインの修飾は、正常な野生型サイトカインの活性を低下させる修飾であってもよく、またはそれは、相同性の非内在性サイトカイン（非限定的に、ヒトサイトカイン受容体に結合するマウスサイトカインなど）の親和性が上昇する修飾であってもよい。修飾は、非限定的に、ペグ化及びグリコシル化などの化学的及び／または酵素的修飾、他のタンパク質への融合、ならびに突然変異をはじめとする当業者に知られる、活性を低下または上昇させる任意の修飾であってもよい。好ましくは受容体に対して低下された結合親和性を有するサイトカインは、変異型サイトカインである。突然変異は、欠失、挿入、切断または点突然変異をはじめとする、当業者に知られる任意の突然変異であってもよい。好ましくは、前記突然変異は、点突然変異、または点突然変異の組み合わせである。親和性は、当業者に知られる任意の方法で測定することができる。非限定的例として、受容体に対するリガンドの親和性は、結合データのスキャッチャードプロット分析とコンピュータフィッティング（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ， １９４９）、またはＢｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ． （１９９３）により記載されたフロースルー条件下での反射干渉分光法により測定することができる。

あるいは低下された結合活性は、野生型リガンドと比較された、変異型リガンドの生物活性の低下として測定することができる。好ましい実施形態において、前記生物活性は、レポーターアッセイを利用してインビトロで測定される。そのようなレポーターアッセイは、用いられるサイトカイン受容体系に依存し、当業者に知られている。非限定的例として、ＩＦＮ−γレポーターアッセイが、スキャッチャード分析と共に、Ｂｏｎｏ ｅｔ ａｌ （１９８９）により記載されている。好ましくは変異体の生物活性は、野生型サイトカインの５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３０％未満、より好ましくは２５％未満、より好ましくは２０％未満、より好ましくは１５％未満、より好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満、最も好ましくは１％未満である

修飾サイトカインは、修飾された、または修飾されていない別のサイトカインに融合されている。好ましくは両方のサイトカインは、ＧＧＳリピートを１つまたは複数含むリンカー配列、好ましくはＧＧＳリンカーを用いて融合される。修飾サイトカインは、分子のアミノ末端部分、またはカルボキシ末端部分に配置されてもよく、融合タンパク質は、非限定的にタグ配列、シグナル配列、別のサイトカインまたは抗体などの他のドメインをさらに含んでいてもよい。

本明細書で用いられるサイトカインは、非限定的にαヘリカルバンドルサイトカインファミリー、三量体腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリー（Ｉｄｒｉｓｓ ａｎｄ Ｎａｉｓｍｉｔｈ， ２０００）、システインノット成長因子（Ｓｕｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｅｓ， １９９５）、インターロイキン−１ファミリーを含むβ−トレフォイルフォールドグループ（Ｍｕｒｚｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、インターロイキン１７（ＩＬ−１７）ファミリー（Ｇａｆｆｅｎ， ２０１１）、及びケモカイン（Ｎｏｍｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）のサイトカインをはじめとし、当業者に知られる任意のサイトカインであってもよい。三量体ＴＮＦファミリーの一種の場合、好ましくは一本鎖型が用いられる。そのような一本鎖サイトカインは、当業者に知られており、Ｋｒｉｐｐｎｅｒ−Ｈｅｉｄｅｎｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ． （２００８）などに記載されている。

１つの好ましい実施形態において、前記融合タンパク質は、ＸＣＬ１とＩＦＮα２変異体、好ましくはＱ１２４Ｒとの融合である。別の好ましい実施形態において、前記融合は、ＣＣＬ２０とＩＬ１β変異体との融合である。好ましくは、前記ＩＬ１β変異体は、Ｑ１４８Ｇ変異体である。さらに別の好ましい実施形態において、前記融合は、ＴＮＦαとレプチン変異体との融合である。好ましくは前記レプチン変異体は、Ｌ８６Ｓ及びＬ８６Ｎからなる群から選択される。

本発明の別の態様は、薬剤として使用するための本発明による融合タンパク質である。１つの好ましい実施形態において、それは、癌の処置において使用するための本発明による融合タンパク質である。別の好ましい実施形態において、それは、免疫応答の調整において使用するための本発明による融合タンパク質である。

ＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質における構造要素の略図。 ＸＣＲ１発現細胞上のＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質の選択的活性。ＳＴＡＴ１ Ｙ７０１リン酸化が、ＣＤ１１ｃ及びＣＤ８αの発現を特徴とする異なるマウス脾臓細胞サブセットにおいて、ＩＦＮα／βまたはＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質に応答して測定される。第一の縦列：ＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ８α^＋サブセット、第二の縦列：ＣＤ１１ｃ⁻ＣＤ８α⁻サブセット、第三の縦列：ＣＤ１１ｃ^{ｍｅｄｉｕｍ}ＣＤ８α⁻サブセット、第四の縦列：ＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈＣＤ８α^＋サブセット、第五の縦列：ＣＤ１１ｃ^ｈｉｇｈＣＤ８α⁻サブセット。 ＩＬ−１β変異体／ＣＣＬ２０融合タンパク質における構造要素の略図。 ＣＣＲ６発現細胞上のＩＬ−１β変異体／ＣＣＬ２０融合タンパク質の選択的活性。（Ａ）ＣＣＬ２０に融合された野生型及び５種の異なるＩＬ−１β変異体によるＮＦκＢ活性の誘導。（Ｂ）擬トランスフェクト細胞またはＣＣＲ６でトランスフェクトされた細胞における野生型及びＩＬ−１β Ｑ１４８Ｇ変異体／ＣＣＬ２０融合タンパク質によるＮＦκＢ活性誘導の濃度依存性。（Ｃ）ビヒクルによる導入と比較された、擬トランスフェクト細胞またはＣＣＲ６でトランスフェクトされた細胞における野生型及びＩＬ−１β Ｑ１４８Ｇ変異体／ＣＣＬ２０融合タンパク質（１２．５ｎｇ／ｍｌ）によるＮＦκＢ活性誘導。 ｓｃＴＮＦα／レプチン変異体融合タンパク質における構造要素の略図。 レプチン受容体発現細胞上のｓｃＴＮＦα／レプチン変異体融合タンパク質の選択的活性。示された濃度のｓｃＴＮＦ標的化ＷＴまたは変異型レプチンにより誘導されたレプチン依存的成長が、Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞（パネルＡ）またはＢａ／Ｆ３−ｍＬＲ−ＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ細胞（パネルＢ）においてＸＴＴアッセイにより測定される。 ＸＣＲ１を発現するマウス脾臓細胞上のＩＦＮ活性のインビボ標的化。Ｃ５７ＢＩ／６マウスに、示された量のＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒまたは１，０００，０００単位の天然ネズミＩＦＮα／βまたはＰＢＳを静脈注射した。４５分後、脾臓細胞を、ＦＡＣＳにより以下の細胞集団においてＣＤ１１ｃ及びＣＤ８α発現について（最初のパネル）、そしてＰ−ＳＴＡＴ１について（更なるパネル）解析した：ＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α−（ライン１）、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α＋（ライン２）、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋（ライン３）、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−（ライン４）。

実施例の材料及び方法
フソカインのクローニング及び生成
ＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質のクローニング
ＸＣＬ１オープンリーティングフレームを、ＰＣＲにより、エクスパンド・ハイ・フィデリティー・ＰＣＲシステム（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ）（ロッシュ・ダイアグノスティックス）及び以下のプライマーを用いて、ＸＣＬ１コード化プラスミドＭＲ２００４７３（Ｏｒｉｇｅｎ Ｉｎｃ．）から合成した：
順方向: ５’ＧＧＧＧＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＧＡＣ３’
逆方向：５’ＧＧＧＧＧＧＴＣＣＧＧＡＧＧＣＣＣＡＧＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧ３’
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢｓｐＥＩにより消化して、ｐＭＥＴ７ ＳＩｇＫ−ＨＡ−１Ｒ５９Ｂ−Ｈｉｓ−ＰＡＳ−ｙｂｂｒ−ＩＦＮＡ２−Ｑ１２４Ｒベクター内のナノボディーをコードするＥｃｏＲＩ−ＢｓｐＥＩフラグメントに置換した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５０７８７）。

ＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質の生成
Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を、標準的なリポフェクタミン法（インビトロジェン）を利用して、タンパク質融合構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を採取して、−２０℃で貯蔵した。精製ナノボディーＧＦＰ−ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ調製物（ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０５０７８７に記載）を標準として用いて、ＩＦＮ活性を、記載された通り（Ｕｚｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９４）ヒトＨＬ１１６及びネズミＬＬ１７１細胞株でアッセイした。

ＩＬ−１β／ＣＣＬ２０融合タンパク質のクローニング
成熟したヒトＩＬ−１β／ＣＣＬ２０融合タンパク質をコードするコドン最適化配列を、遺伝子合成（インビトロジェン・ジーン・アート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｅｎｅ Ａｒｔ））により作製した。手短に言えば、ＳｉｇＫリーダーペプチドを先頭としＮ末端ＨＡを備えた成熟ヒトＩＬ−１βタンパク質配列を、Ｃ末端で１３×ＧＧＳリンカー配列に、そしてその後、Ｃ末端ＨＩＳタグを有する成熟ヒトＣＣＬ２０の配列に融合した（図３）。

ＩＬ−１Ｒに対して低い結合親和性を有すると予測されるＩＬ−１β変異体を、文献と、受容体と複合体化されたヒトＩＬ−１βの公表されている結晶構造の解析に基づいて選択した。ｈＩＬ−１β部分の突然変異を、表に示された通り突然変異誘発プライマーを用いた部位特異的突然変異誘発（クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）、ストラタジーン）により作製した：

ＩＬ−１β変異体：ＣＣＬ２０融合タンパク質の生成
ＩＬ−１β−ＣＣＬ２０融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で産生した。小規模生成のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＣＳを補充されたＤＭＥＭ中の４００,０００細胞／ウェルとして６ウェルプレートに播種した。２４時間後に、培地を低濃度血清の培地（ＤＭＥＭ／５％ＦＣＳ）と交換し、直鎖ＰＥＩを用いて細胞をトランスフェクトした。手短に言えば、ＤＭＥＭ １６０μｌ中で発現ベクター１μｇをＰＥＩ ５μｇと混和し、室温で１０分間インキュベートし、ウェルに滴下することにより、ＰＥＩトランスフェクションミックスを調製した。２４時間後に、トランスフェクトされた細胞をＤＭＥＭで洗浄して、タンパク質生成のためにオプティメム／ウェル １．５ｍｌで層を形成させた。馴化培地を４８時間後に回収し、０．４５μフィルターでろ過して、−２０℃で貯蔵した。馴化培地中のＩＬ−１β量を、製造業者の使用説明書（Ｒ＆Ｄシステムズ）に従ってＥＬＩＳＡにより測定した。

ｓｃＴＮＦ／レプチン融合タンパク質のクローニング
野生型（ＷＴ）、Ｌ８６Ｓ及びＬ８６Ｎレプチンのコード配列を、ＰＣＲにより、以下のプライマーを用いて、それぞれＷＴレプチン、レプチンＬ８６ＳまたはレプチンＬ８６Ｎを発現するｐＭｅｔ７プラスミドから合成した：
順方向 ５’−ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＴＣＣＡＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣ−３’，
逆方向 ５’−ＣＧＡＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＴＡＡＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧＴ−３’。
これにより、レプチンコード配列の、それぞれアミノ末端及びカルボキシ末端にＢｇＩＩＩ及びＮｏｔＩ部位を導入する。ＰＣＲ産物をＢｇＩＩＩ及びＮｏｔＩで消化して、ＢｇＩＩＩ及びＮｏｔＩにより開かれたｐＭＥＴ７−ＳＩｇＫ−ＨＡ−ｓｃＴＮＦ ＷＴ−６×ＧＧＳ−ＦＬＡＧ（野生ｓｃＴＮＦは、遺伝子合成により作製された。ジーンアート）にクローニングして、６×ＧＧＳとＦＬＡＧの間に存在させた。これにより、ｐＭＥＴ７−ＳＩｇＫ−ＨＡ−ｓｃＴＮＦ ＷＴ−６×ＧＧＳ−ｍレプチン−ＦＬＡＧ、ｐＭＥＴ７−ＳＩｇＫ−ＨＡ−ｓｃＴＮＦ ＷＴ−６×ＧＧＳ−ｍレプチンＬ８６Ｓ−ＦＬＡＧ及びｐＭＥＴ７−ＳＩｇＫ−ＨＡ−ｓｃＴＮＦ ＷＴ−６×ＧＧＳ−ｍレプチンＬ８６Ｎ−ＦＬＡＧを作製した。

ｓｃＴＮＦ／レプチン融合タンパク質の生成
標準的なリン酸カルシウム沈殿法を利用して、ＨｅｋＴ細胞を異なる融合タンパク質構築物でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、培地を採取して、−２０℃で貯蔵した。濃度を、市販のｈＴＮＦα ＥＬＩＳＡ（ＤＹ２１０、Ｒ＆Ｄシステムズ）で測定した。

細胞株
Ｈｅｋ２９３Ｔ、ＨＬ１１６及びＬＬ１７１細胞株を、１０％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭで生育させた。Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ及びＢａ／Ｆ３−ｍＬＲ−ＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ細胞を、１０％熱活性化ＦＣＳ及び１００ｎｇ／ｍｌレプチンを補充されたＲＰＭＩに保持した。

アッセイ
ホスホＳＴＡＴ１アッセイ
単一細胞の懸濁液を、Ｃ５７ＢＩ／６マウスから単離された脾臓から調製した。赤血球を、赤血球細胞溶解緩衝液（ロンザ）を用いて除去した。脾臓細胞を、３７℃のＲＰＭＩ５％ウシ胎仔血清中、マウスＩＦＮα／βまたはＸＣＬ１−ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質で３０分間処理し、その後、ＢＤバイオサイエンシズ の使用説明書に従って、アレクサフロール４８８（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）標識抗マウスＣＤ１１ｃ（ｅバイオサイエンス ＃５３−０１１４−８０）とＡＰＣ標識抗マウスＣＤ８α（ＢＤバイオサイエンス ＃５５３０３５）、または抗マウスＣＤ１１ｃとアレクサ４８８標識抗マウスＣＤ８αと共にＢＤホスフローＰＥ（ＢＤ ｐｈｏｓｆｌｏｗ ＰＥ）マウス抗ＳＴＡＴ１（ｐＹ７０１）で標識した。ＢＤファクスカントを用いてＦＡＣＳデータを得て、いずれかのディーバ（Ｄｉｖａ）（ＢＤバイオサイエンシズ）ソフトウエアを用いて解析した。

ＮＦ−κＢレポータージーンアッセイ
ＩＬ−１Ｒ活性化を評価するために、本発明者らは、ＩＬ−１Ｒを安定発現するＨＥＫ−ブルー（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ）（商標）ＩＬ−１β細胞（インビボゲン）を用い、それらをＮＦ−κＢルシフェラーゼレポータージーンで一過性にトランスフェクトした。手短に言えば、ＨＥＫ−ブルー（商標）ＩＬ−１β細胞を、９６ウェルプレート中の培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）に播種し（１００００細胞／ウェル）、翌日、リン酸カルシウム沈殿法を利用し、示された量の発現プラスミド及び５ｎｇ／ウェル ３κＢ−Ｌｕｃレポータージーンプラスミドでトランスフェクトした（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｅｒｇｈｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。トランスフェクションの２４時間後、培地を飢餓培地（ＤＭＥＭ）に交換し、トランスフェクションの４８時間後、細胞にＩＬ１−ＣＣＬ２０融合タンパク質を６時間導入した。導入後に、細胞を溶解して、溶解物中のルシフェラーゼ活性を、ベルトールド・セントロＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）ルミノメータによるプロメガ・ホタルルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。

細胞増殖アッセイ
Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞株を、ｐＭｅｔ７−ｍＬＲベクターでのＢａ／Ｆ３細胞の電気穿孔により作製した。安定発現する細胞を、ＩＬ−３の代わりにレプチンで生育することにより選択した。実際にＢａ／Ｆ３細胞の生育は、ＩＬ−３に依存するが、それらの細胞がｍＬＲを発現する場合には、それらはレプチンでも増殖する。Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ−ＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ細胞株を得るために、Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞をｐＭｅｔ７−ＨＡ−ｈＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ及びｐＩＲＥＳプロ２（ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２）（クロンテック）で共トランスフェクトし、その後、ｈＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ発現細胞のプロマイシン選択及びＦＡＣＳ選別を行った。

細胞増殖を評価するために、Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ及びＢａ／Ｆ３−ｍＬＲ−ＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ細胞を洗浄し、９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ／１０％ｉＦＣＳ中に播種して（１０．０００細胞／ウェル）、示された量のレプチンまたは融合タンパク質で刺激した。４日後、ＸＴＴ（ロッシュのＸＴＴ細胞増殖キットＩＩ、１１ ４６５ ０１５ ００１）５０uｌを添加して、４時間インキュベートした後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。

実施例１：ＸＣＬ１／ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質のＩＦＮ活性はＸＣＲ１を発現する細胞で回復される
マウス脾臓細胞を、１ｎＭ ＸＣＬ１−ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒまたは１０，０００単位／ｍｌマウスＩＦＮα／βで３０分間処理した。その後、細胞を固定して透過処理し、抗ホスホＳＴＡＴ１（ＰＥ）、抗ＣＤ１１ｃ（アレクサフロール４８８）及び抗ＣＤ８α（ＡＰＣ）で染色して、ＦＡＣＳにより解析した。図２は、マウスＩＦＮα／βが解析された全ての脾臓細胞サブセットにおいてＳＴＡＴ１リン酸化を誘導したことを示している。反対にＸＣＬ１−ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質は、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ８α^＋サブセットに属する細胞の多数、及びＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ８α⁻サブセットに属する細胞の少数だけにＩＦＮの応答を誘導した。ＸＣＬ１−ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒ融合タンパク質に応答する脾臓細胞サブセットの分布は、ＸＣＬ１受容体であるＸＣＲ１の予測された分布と完全に一致する（Ｄｏｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ２００９）。

実施例２：ＩＬ１β活性はＣＣＲ６を発現する細胞で回復される
ＩＬ−１Ｒを安定発現するＨＥＫ−ブルー（商標）ＩＬ−１β細胞を、ＮＦ−κＢレポータージーンプラスミド（５ｎｇ／ウェル）及び空ベクターまたはｈＣＣＲ６発現プラスミド（１０ｎｇ／ウェル）で一過性にトランスフェクトした。次に擬トランスフェクト及びＣＣＲ６トランスフェクトされた細胞を、野生型または変異型ＩＬ１β−ＣＣＬ２０融合タンパク質（２５ｎｇ／ｍｌ）で６時間処理し、その後、細胞を溶解して、ＮＦ−κＢレポータージーン活性を測定した。図４Ａから明白な通り、ＣＣＲ６を発現する細胞は、擬トランスフェクト細胞に比較して、全ての検討された変異型ＩＬ１β−ＣＣＬ２０融合タンパク質に対してＮＦ−κＢレポータージーン活性上昇として応答した。標的効果が最も明白であったＩＬ−１β−Ｑ１４８Ｇ変異体の効果をより詳細に評価するために、擬ランスフェクトされた、またはＣＣＲ６を発現するＨＥＫ−ブルー（商標）ＩＬ−１β細胞を、漸増量の野生ＩＬ−１βまたはＩＬ−１βＱ１４８Ｇ−ＣＣＬ２０融合タンパク質で６時間処理した。図４Ｂは、ＣＣＲ６の過剰発現が野生ＩＬ−１β−ＣＣＬ２０融合物の活性を上昇させたが、ＩＬ−１βＱ１４８Ｇ−ＣＣＬ２０融合物に関してはより強い増強効果を有したことを実証している。標的効果は、ＩＬ１−β−ＣＣＬ２０が１２．５ｎｇ／ｍｌで細胞に適用された場合に最も顕著であった（図４Ｃ）。

実施例３：レプチン活性はＴＮＦＲを発現する細胞で回復される
示された量のレプチンまたはレプチン−ｓｃＴＮＦ融合タンパク質での刺激の４日後に、Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ及びＢａ／Ｆ３−ｍＬＲ−ＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ細胞の増殖を評価した。図６Ａに示される通り、細胞株は両者とも、熱非活性化血清のみを補充された生育培地では増殖しない。その上、レプチンによるＢａ／Ｆ３増殖を誘導する能力は、レプチンがｓｃＴＮＦに結合された場合に低下する。野生レプチン内のＬ８６をセリン（Ｌ８６Ｓ）またはアスパラギン（Ｌ８６Ｎ）のいずれかの中へ突然変異させると、マウスレプチン受容体への親和性が、それぞれ中等度または強度に低下される。この親和性低下は、それぞれレプチンＬ８６Ｓ対Ｌ８６Ｎで、Ｂａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞増殖誘導の３倍対１０倍弱い誘導になる。細胞内ドメイン（ｈＴＮＦＲ１ΔＣｙｔ）を欠くヒトＴＮＦ−Ｒ１によるＢａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞のさらなるトランスフェクションは、膜結合細胞外マーカとして機能し得る非機能的受容体を誘導する。明らかに、ｓｃＴＮＦに結合されたＬ８６Ｓ及びＬ８６Ｎレプチン変異体での刺激による増殖応答が、ｈＴＮＦＲ１ΔＣｙｔを発現するＢａ／Ｆ３−ｍＬＲ細胞において完全に回復される（図６Ｂ）。

実施例４：ＸＣＲ１発現細胞集団のインビボ標的化
Ｂａｃｈｅｍら（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３， １−１２． ２０１２）によれば、ＸＣＲ１発現細胞は、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋脾臓細胞集団の多数及びＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−脾臓細胞集団の少数部分を示す。Ｃ５７ＢＩ／６マウスに、示された量のＸＣＬ１−ＩＦＮα２−Ｑ１２４Ｒまたは１，０００，０００単位の天然ネズミＩＦＮα／βまたはＰＢＳを静脈注射した。４５分後に、脾臓細胞をＦＡＣＳにより、以下の細胞集団中のＰ−ＳＴＡＴ１について解析した：ＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α−、ＣＤ１１ｃ−ＣＤ８α＋、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α＋、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−。結果を図７に示す。これらの結果から、融合構築物が細胞集団の微量分画（細胞全体の約０．１％）を標的とし、それらにおいて応答を誘導し得るが、マーカを発現しないＩＦＮ感受性細胞が影響を受けないことが明らかである。事実、野生型ＩＮＦもまた、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８α−細胞に影響を及ぼしているが、それらの細胞は、融合構築物による影響を受けておらず、この融合体の特異的作用が明瞭に立証される。

参考文献
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− Ｊａｈｎ Ｔ， Ｚｕｔｈｅｒ Ｍ， Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓ Ｂ， Ｈｅｕｓｅｒ Ｃ， Ｇｕｈｌｋｅ Ｓ， Ａｂｋｅｎ Ｈ， Ｈｏｍｂａｃｈ ＡＡ （２０１２）． Ａｎ ＩＬ１２−ＩＬ２−ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｎ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ａｔｔａｃｋ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４４４８２．
− Ｋｈａｄｅｒ ＳＡ， Ｂｅｌｌ ＧＫ， Ｐｅａｒｌ ＪＥ， Ｆｏｕｎｔａｉｎ ＪＪ， Ｒａｎｇｅｌ−Ｍｏｒｅｎｏ Ｊ， Ｃｉｌｌｅｙ ＧＥ， Ｓｈｅｎ Ｆ， Ｅａｔｏｎ ＳＭ， Ｇａｆｆｅｎ ＳＬ， Ｓｗａｉｎ ＳＬ， Ｌｏｃｋｓｌｅｙ ＲＭ， Ｈａｙｎｅｓ Ｌ， Ｒａｎｄａｌｌ ＴＤ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ ＡＭ． （２００７）．ＩＬ−２３ ａｎｄ ＩＬ−１７ ｉｎ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｆｔｅｒ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｕｒｉｎｇ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８， ３６９−７７．
− Ｋｒｉｐｐｎｅｒ−Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ａ， Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｉ， Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ Ｇ， Ｋｕｈｎｌｅ Ｍ， Ｇｅｒｓｐａｃｈ Ｊ， Ｓｔｅｒｎｓ Ｔ， Ｓｈｎｙｄｅｒ ＳＤ， Ｇｉｌｌ ＪＨ， Ｍａｎｎｅｌ ＤＮ， Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ Ｋ ａｎｄ Ｓｃｈｅｕｒｉｃｈ Ｐ． （２００８）． Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ＴＮＦ， ａ ＴＮＦ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０， ８１７６−８３．
− Ｌｕ Ｊ， Ｐｅｎｇ Ｙ， Ｚｈｅｎｇ ＺＪ， Ｐａｎ ＪＨ， Ｚｈａｎｇ Ｙ， Ｂａｉ Ｙ （２００８）． ＥＧＦ−ＩＬ−１８ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｒｅａｇｅｎｔ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ２６０， １８７−１９７．
− Ｍｕｒｚｉｎ ＡＧ， Ｌｅｓｋ ＡＭ ＆ Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ （１９９２）． β−Ｔｒｅｆｏｉｌ ｆｏｌｄ： Ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｋｕｎｉｔｚ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ−１β ａｎｄ １α ａｎｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２３， ５３１−５４３．
− Ｎｉｃｏｌａ ＮＡ ＆ Ｈｉｌｔｏｎ ＤＪ （１９９８）． Ｇｅｎｅｒａｌ ｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｆｏｕｒ−ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５２， １−６５．
− Ｎｏｍｉｙａｍａ Ｈ， Ｏｓａｄａ Ｎ ａｎｄ Ｙｏｓｈｉｅ Ｏ． （２０１３）． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｙｎｔｅｎｙ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ． Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ． １８， １−１６．
− Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ ＪＡ， Ｔｏｌｃｈｅｒ Ａ， Ｒｉｓｅｂｅｒｇ Ｄ， Ｖｅｎｚｏｎ Ｄ， Ｚｕｊｅｗｓｋｉ Ｊ， Ｎｏｏｎｅ Ｍ， Ｇｏｓｓａｒｄ Ｍ，Ｄａｎｆｏｒｔｈ Ｄ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｊ， Ｃｈａｎｇ Ｖ， Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ Ｂ， Ｋｅｅｇａｎ Ｐ， Ｇｉｕｓｔｉ Ｒ ａｎｄ Ｃｏｗａｎ ＫＨ． （１９９６）．Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ， ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ， ｌｅｕｃｏｖｏｒｉｎ， ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ， ａｎｄ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３／ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ− ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ （ＧＭ−ＣＳＦ） ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＰＩＸＹ３２１ ） ｖｅｒｓｕｓ ＧＭ−ＣＳＦ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｂｌｏｏｄ ８７， ２２０５−２２１１
− Ｐｅｎａｆｕｅｒｔｅ Ｃ， Ｂａｕｔｉｓｔａ−Ｌｏｐｅｚ Ｎ， Ｂｏｕｌａｓｓｅｌ ＭＲ， Ｒｏｕｔｙ ＪＰ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ （２００９）． Ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｏｒｔｈｏｌｏｇ ｏｆ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｄｕｃｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６９， ９０２０−９０２８
− Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｗｕ ＪＨ， Ａｎｎａｂｉ Ｂ， Ｌｅｊｅｕｎｅ Ｌ， Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｍ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ （２００７）． Ａ ＧＭＣＳＦ ａｎｄ ＩＬ−１５ ｆｕｓｏｋｉｎｅ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ ｖｉａ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａｌ ＪＡＫ／ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＩＬ−１５ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｂｌｏｏｄ １０９， ２２３４−２２４２
− Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｈｓｉｅｈ Ｊ， Ｚｅｈｎｔｎｅｒ Ｓ， Ｌｉ Ｍ， Ｆｏｒｎｅｒ Ｋ， Ｂｉｒｍａｎ Ｅ， Ｂｏｉｖｉｎ ＭＮ， Ｙｏｕｎｇ ＹＫ， Ｐｅｒｒｅａｕｌｔ Ｃ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２００９ａ）． Ａ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１５ ｆｕｓｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ １５， １０３８−１０４５
− Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｃａｍｐｅａｕ ＰＭ， Ｗｕ ＪＨ， Ｂｉｒｍａｎ Ｅ， Ｆｏｒｎｅｒ Ｋ， Ｂｏｉｖｉｎ ＭＮ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２００９ｂ） Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＣＣＲ２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｍｙｅｌｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｂｙ ａ ＧＭ−ＣＳＦ−ＭＣＰ１ ｆｕｓｏｋｉｎｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８２， ２６２０−７．
− Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｂｅｒｃｈｉｃｈｅ ＹＡ， Ｂｉｒｍａｎ Ｅ， Ｂｏｉｖｉｎ ＭＮ， Ｙｏｕｎｇ ＹＫ， Ｗｕ ＪＨ， Ｈｅｖｅｋｅｒ Ｎ， ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２００９ｃ） Ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＧＭ−ＣＳＦ−ＣＣＬ２ ｆｕｓｏｋｉｎｅ ｉｓ ａ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ＣＣＲ２−ｄｒｉｖｅｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８３， １７５９−６６．
− Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｄｅｎｇ Ｊ， Ｂｏｉｖｉｎ ＭＮ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｐ， Ｍａｔｕｌｉｓ ＳＭ， Ｙｕａｎ Ｓ， Ｂｉｒｍａｎ Ｅ， Ｆｏｒｎｅｒ Ｋ， Ｙｕａｎ Ｌ， Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ Ｃ， Ｂｏｉｓｅ ＬＨ， ＭａｃＤｏｎａｌｄ ＴＪ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２０１１） Ａ ＭＣＰ１ ｆｕｓｏｋｉｎｅ ｗｉｔｈ ＣＣＲ２−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ． １０：１２１． ｄｏｉ： １０．１１８６／１４７６−４５９８−１０−１２１．
− Ｓｈａｗ ＭＨ， Ｋａｍａｄａ Ｎ， Ｋｉｍ ＹＧ ａｎｄ Ｎｕｎｅｚ Ｇ． （２０１２） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＩＬ−１β， ｂｕｔ ｎｏｔ ＩＬ−６， ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ ＴＨ１７ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０９， ２５１−８．
− Ｓｉｎｇｈ ＳＰ， Ｚｈａｎｇ ＨＨ， Ｆｏｌｅｙ ＪＦ， Ｈｅｄｒｉｃｋ ＭＮ ａｎｄ Ｆａｒｂｅｒ ＪＭ． （２００８） Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ａｂｌｅ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ＩＬ−１７ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＣＣＲ６． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８０， ２１４−２１．
− Ｓｃａｔｃｈａｒｄ Ｇ． （１９４９）． Ａｎｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ５１， ６６０−７２．
− Ｓｔａｇｇ Ｊ， Ｗｕ ＪＨ， Ｂｏｕｇａｎｉｍ Ｎ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２００４）． Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｆｕｓｉｏｎ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６４， ８７９５−８７９９
− Ｓｕｎ ＰＤ ＆ Ｄａｖｉｅｓ ＤＲ． （１９９５）． Ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｎｅ−ｋｎｏｔ ｇｒｏｗｔｈ−ｆａｃｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ． Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２４， ２６９−９１ ．
− Ｓｕｔｔｏｎ Ｃ， Ｂｒｅｒｅｔｏｎ Ｃ， Ｋｅｏｇｈ Ｂ， Ｍｉｌｌｓ ＫＨ ａｎｄ Ｌａｖｅｌｌｅ ＥＣ． （２００６）． Ａ ｃｒｕｃｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−１ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１７−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｍｅｄｉａｔｅ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． ２０３， １６８５−９１．
− Ｗｅｂｅｒ Ｈ， Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ Ｄ， Ｌｕｊｂｅｒ Ｇ， Ｇｕｂｌｅｒ Ｍ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ Ｃ． （１９８７）． Ｓｉｎｇｌｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｈａｎｇｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｎｄｅｒ ｈｕｍａｎ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ ２ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｏｎ ｍｏｕｓｅ ｃｅｌｌｓ． ＥＭＢＯ Ｊ． ６， ５９１−８．
− Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｐ， Ｂｏｕｃｈｅｎｔｏｕｆ Ｍ， Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｒｏｍｉｅｕ−Ｍｏｕｒｅｚ Ｒ， Ｈｓｉｅｈ Ｊ， Ｂｏｉｖｉｎ ＭＮ， Ｙｕａｎ Ｓ， Ｆｏｒｎｅｒ ＫＡ， Ｂｉｒｍａｎ Ｅ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２０１０ａ）． Ａ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ＧＭ−ＣＳＦ ａｎｄ ＩＬ−２１ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｕｍｏｒ−ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８５， ７３５８−６６．
− Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｐ， Ｒａｆｅｉ Ｍ， Ｂｏｕｃｈｅｎｔｏｕｆ Ｍ， Ｒａｖｅｎ Ｊ， Ｙｕａｎ Ｓ， Ｃｕｅｒｑｕｉｓ Ｊ， Ｆｏｒｎｅｒ ＫＡ， Ｂｉｒｍａｎ Ｅ ａｎｄ Ｇａｌｉｐｅａｕ Ｊ． （２０１０ｂ）． Ａ ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ＧＭＣＳＦ ａｎｄ ＩＬ−２１ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ ｈｙｐｅｒｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＩＬ−２１Ｒａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８， １２９３−１３０１．
− Ｙｅ Ｐ， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ＦＨ， Ｋａｎａｌｙ Ｓ， Ｓｔｏｃｋｉｎｇ ＫＬ， Ｓｃｈｕｒｒ Ｊ， Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ Ｐ， Ｏｌｉｖｅｒ Ｐ， Ｈｕａｎｇ Ｗ， Ｚｈａｎｇ Ｐ， Ｚｈａｎｇ Ｊ， Ｓｈｅｌｌｉｔｏ ＪＥ， Ｂａｇｂｙ ＧＪ， Ｎｅｌｓｏｎ Ｓ， Ｃｈａｒｒｉｅｒ Ｋ， Ｐｅｓｃｈｏｎ ＪＪ ａｎｄ Ｋｏｌｌｓ ＪＫ． （２００１ ）． Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １７ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ＣＸＣ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ａｎｄ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ， ａｎｄ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ． １９４， ５１９−２７．

Claims (6)

1. 少なくとも２種のサイトカインを含む融合タンパク質を含む組成物であって、前記サイトカインが、ＣＣＬ２０及びＩＬ−１βであり、前記ＩＬ−１βが、野生型ＩＬ−１βと比較してその受容体に対する結合活性を低下させる変異を含み、かつ前記ＣＣＬ２０が、細胞特異的な標的化を提供し、かつ標的細胞上の変異したＩＬ−１βの活性を回復する野生型サイトカインである、組成物。
2. ＧＧＳリンカーをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
3. 前記ＩＬ−１βの変異が、Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３１Ｇ、Ｈ１４６Ａ、Ｑ１４８Ｇ、およびＫ２０９Ａから選択される、請求項１に記載の組成物。
4. 少なくとも２種のサイトカインを含む融合タンパク質を含む細胞における免疫応答を刺激するための組成物であって、前記サイトカインは、ＣＣＬ２０及びＩＬ−１βであり、前記ＩＬ−１βが、野生型ＩＬ−１βと比較してその受容体に対する結合活性を低下させる変異を含み、かつ前記ＣＣＬ２０が、細胞特異的な標的化を提供し、かつ標的細胞上の変異したＩＬ−１βの活性を回復する野生型サイトカインである、組成物。
5. ＧＧＳリンカーをさらに含む、請求項４に記載の組成物。
6. 前記ＩＬ−１βの変異が、Ｒ１２０Ｇ、Ｑ１３１Ｇ、Ｈ１４６Ａ、Ｑ１４８Ｇ、およびＫ２０９Ａから選択される、請求項４に記載の組成物。
   

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