BR112015028411B1

BR112015028411B1 - Formulações estáveis de domínios variáveis únicos de imunoglobulina e uso destas

Info

Publication number: BR112015028411B1
Application number: BR112015028411-6A
Authority: BR
Inventors: Yves Meyvis; Veronique De Brabandere; Hans Ulrichts; Ann Brige; Filip Callewaert
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2014-05-16
Publication date: 2023-01-10
Also published as: KR20160007657A; CN110063935A; CN110063935B; AU2019201307B2; AU2014267222B2; CY1122090T1; HRP20190954T1; AU2019201307A1; BR112015028411A2; ES2731922T3; WO2014184352A1; PH12015502591B1; MX2019005269A; EP3511018A1; PL2996720T3; JP6952019B2; PH12015502591A1; CN110037983A; TR201908663T4; US20190010249A1

Abstract

FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE DOMÍNIOS VARIÁVEIS ÚNICOS DE IMUNOGLOBULINA E USO DESTAS. A presente invenção se refere às formulações estáveis de polipeptídeo, por exemplo, domínios variáveis únicos de imunoglobulina, em particular, domínios variáveis únicos de imunoglobulina direcionados contra o Fator de von Willebrand (vWF). A invenção proporciona formulações que são estáveis durante o armazenamento por períodos prolongados de tempo e ao longo de uma ampla faixa de temperaturas. As formulações da invenção garantem uma elevada estabilidade do polipeptídeo, permitindo vários ciclos de congelamento-descongelamento, sem deterioração física ou química, e proporcionam estabilidade em relação a um estresse mecânico, tal como vibração, agitação ou pressão. Elas são apropriadas para preparações farmacêuticas e de diagnóstico, compatíveis com diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

Description

1. Campo da Invenção

[0001] A presente invenção se refere às formulações estáveis de polipeptídeo, por exemplo, domínios variáveis únicos da imunoglobulina, em particular, os domínio variável único de imunoglobulina direcionados contra Fator de von Willebrand (vWF), tais como domínios variáveis únicos da imunoglobulina de acordo com a SEQ ID NOs: 1 a 19, especificamente a SEQ ID NO: 1, ou seja, o nanocorpo ALX-0081.

[0002] A invenção proporciona formulações que são estáveis durante o armazenamento por períodos de tempo prolongados e ao longo de uma ampla faixa de temperaturas. As formulações da invenção garantem uma elevada estabilidade do polipeptídeo, permitindo que vários ciclos de congelamento-descongelamento, sem deterioração física ou química, e proporcionam estabilidade em relação a um estresse mecânico, tal como vibração, agitação ou pressão. Elas são apropriadas para preparações farmacêuticas e de diagnóstico, compatíveis com diluentes farmaceuticamente aceitáveis, tais como: solução salina, solução de Ringer ou glucose e solução de dextrose.

[0003] A presente invenção também se refere a métodos de preparação, métodos de conservação e uso das formulações. A invenção ainda se refere às formas de dosagem únicas, kits e uso médico das formulações.

2. Antecedentes da Invenção

[0004] Os domínios variáveis únicos de imunoglobulina, tais como os domínios VHH camelizados, domínios VH camelizados ou domínios VHH humanizados, representam uma classe rapidamente crescente de anticorpos terapêuticos. Por exemplo, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina contra vWF foram descritos nos documentos WO2004/015425, WO2004/062551, WO2006/074947, WO2006/122825, WO2009/115614, e WO2011/067160.

[0005] Proteínas, tais como domínios variáveis únicos da imunoglobulina (ISVDs), geralmente devem ser armazenadas e transportadas entre a fabricação e o uso inicial, por exemplo, a administração a um paciente. Os processos de transporte, fabricação, armazenamento e entrega podem exercer vários estresses sobre o domínio variável único da imunoglobulina, como os estresses físicos e químicos. Durante a armazenagem pode ocorrer modificações químicas, tais como, por exemplo, desamidação, racemização, hidrólise, oxidação, isomerização, eliminação beta ou permuta de dissulfureto. O estresse físico pode causar desnaturação e desdobramento, agregação, formação de partículas, precipitação, opalescência ou adsorção.

[0006] Assim, continua havendo a necessidade de proporcionar formulações de domínios variáveis únicos de imunoglobulina, por exemplo, tais como aqui definidas, que aumentem a estabilidade, preservem o agente ativo contra o estresse químico e/ou mecânico, e, portanto, permitem o armazenamento e mudanças de temperatura, sem deterioração física ou química significativa, permanecendo estáveis durante longos períodos de tempo, e/ou que são menos agressivos aos pacientes, por exemplo, em que o agente ativo é solúvel a uma concentração elevada.

3. Resumo da Invenção

[0007] Sabe-se que os estresses acima mencionados podem afetar a integridade físico-química das proteínas terapêuticas, por exemplo, anticorpos terapêuticos. Por exemplo, a agregação, desamidação e oxidação têm sido descritas como a maioria das causas mais comuns de degradação de anticorpo (Cleland et al., 1993, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 10, 307-377). Ao mesmo tempo é fundamental que sejam fornecidas, formulações que preservem a integridade física e química dos domínios variáveis únicos da imunoglobulina. A integridade física e química é necessária para utilização como, por exemplo, um agente terapêutico, e, normalmente, também estão associadas com a atividade biológica. Embora o nosso conhecimento sobre a estabilidade da proteína esteja aumentando, otimizar as condições de formulação para minimizar ou suprimir completamente esses vários estresses e garantir uma vida útil prolongada continua sendo um grande desafio.

[0008] Pouco se sabe sobre formulações adequadas de domínios variáveis únicos da imunoglobulina. O documento WO2010/077422 descreve uma formulação de um nanocorpo de ligação de TNF compreendendo um lioprotetor, agente tensoativo e um tampão escolhido a partir do tampão de histidina e do tampão Tris-HCl a um pH entre 5,0 e 7,5.

[0009] Ligantes específicos vWF, e em particular de domínios variáveis únicos da imunoglobulina com alta afinidade para vWF como ALX-0081 [INN: caplacizumab], têm sido testados como terapêutica adjuvante para pacientes com síndrome coronariana aguda (ACS) submetidos à intervenção coronária percutânea (PCI) e são desenvolvidos como o tratamento de púrpura trombocitopênica trombótica (PTT). Ensaios clínicos da Fase I foram concluídos com êxito e ensaios da Fase II estão atualmente em curso. Até agora, ALX-0081 tem sido apresentado como uma formulação líquida com base de fosfato contendo 5 mg/ml do ingrediente farmacêutico ativo (API) em D-PBS, 200 mM de glicina e 0,02% de Tween-80 (v/v).

[0010] Embora esta formulação provou ser eficaz, esta pode ser melhorada de várias maneiras. Em primeiro lugar, a concentração atual provavelmente necessitaria de múltiplas injeções subcutâneas (assumindo que o volume por injeção subcutânea é limitada a cerca de 1 ml), reduzindo, assim, a agressividade ao paciente. Em segundo lugar, a estabilidade de armazenamento e de vida útil da formulação atual da ALX-0081 (daqui em diante também referido como ALX-0081 atual) pode ser melhorada em temperaturas elevadas. A estabilidade na presente formulação em temperaturas elevadas é determinada principalmente por modificações químicas no polipeptídeo. As modificações químicas podem ser ligadas com a perda de potência. Embora um período de vida útil praticável possa ser conseguido através do armazenamento do produto à temperatura de -20°C, isto, no entanto, não é considerado uma opção favorável para a maioria dos fins práticos.

[0011] Criodessecagem é uma técnica vulgarmente utilizada para preservar proteínas que serve para remover a água a partir da preparação da proteína de interesse. A criodessecagem, ou liofilização, é um processo pelo qual o material a ser seco é primeiro congelado e, em seguida, o gelo ou solvente congelado é removido por sublimação em um ambiente de vácuo. Um excipiente pode ser incluído em formulações de pré-liofilizada para aumentar a estabilidade durante o processo de liofilização e/ou para melhorar a estabilidade do produto liofilizado durante a armazenagem (Arakawa et al. Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)).

[0012] A presente invenção se refere a uma formulação que compreende um ligante do Fator de von Willebrand (vWF) e um tampão de citrato ou de fosfato, preferivelmente um tampão de citrato, com um pH na faixa de 5,0 a 7,5. Em particular, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, em que o referido ligante vWF compreende, pelo menos, um domínio variável único de imunoglobulina de ligação com a SEQ ID NO: 20.

[0013] O referido domínio variável único da imunoglobulina compreende ou consiste essencialmente de, mas não está limitado a, um domínio variável único de imunoglobulina que é uma sequência de domínio variável de cadeia pesada, mais especificamente, um domínio variável único de imunoglobulina, que é uma sequência de domínio variável de cadeia pesada, que é derivada a partir de um anticorpo convencional de quatro cadeias, ou de uma sequência de domínio variável de cadeia pesada, que é derivada de uma cadeia pesada de anticorpo, ou um nanocorpo (incluindo, mas não limitado a uma sequência de VHH), de preferência um nanocorpo.

[0014] Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, em que o referido ligante vWF compreende, pelo menos, uma das SEQ ID NOs: 1 a 19. Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, em que o referido ligante vWF é um polipeptídeo de cadeia simples que compreende um ou mais domínios variáveis únicos da imunoglobulina, de preferência em que o referido ligante vWF é monovalente ou multivalente, no qual o referido ligante vWF é monoespecífico ou multiespecífico e/ou em que um ou mais domínios variáveis únicos da imunoglobulina são enxertado com CDR, humanizado, camelizados, deimunizados, e/ou gerado in vitro (por exemplo, selecionado por exibição em fagos). A presente invenção também se relaciona com uma formulação, tal como aqui descrita, em que o referido ligante vWF compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 1. A presente invenção se relaciona também a uma formulação, tal como aqui descrita, em que o referido ligante vWF tem uma concentração na faixa de 0,1 a 80 mg/ml, e/ou em que o referido tampão tem uma concentração na faixa de 5 a 200 mM.

[0015] Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, compreendendo ainda um excipiente, de preferência o referido excipiente tem uma concentração na faixa de 10 a 500 mM, mais preferivelmente, o referido excipiente é selecionado da lista que consiste em sacarose, glicina, manitol, trealose e NaCl, ainda mais preferencialmente, a referido sacarose tem uma concentração na faixa de 1 a 15%, preferivelmente 2 a 12%, preferencialmente de 4 a 10%, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9% (w/v), mais preferencialmente 7%.

[0016] A presente invenção também se relaciona com uma formulação, tal como aqui descrita, em que o tampão é selecionado a partir de um tampão de citrato, preferencialmente o referido tampão de citrato tem um pH entre 6,0 e 7,0, mais preferencialmente 6,5; e um tampão de fosfato, de preferência o referido tampão de fosfato tem um pH na faixa de 6,5 a 7,5, de preferência 7,1.

[0017] Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, compreendendo adicionalmente um detergente não iônico, tal como Tween-80, de preferência em uma concentração compreendida entre 0,001 e 0,5% (v/v), mais preferivelmente de 0,01 a 0,02% (v/v).

[0018] Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, em que o referido tampão é um tampão de citrato em pH 6,5, por exemplo, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7 ou 6,8, mais especificamente de 6,5, e em que a referida formulação compreende adicionalmente sacarose tendo uma concentração na faixa de 1 a 15%, preferivelmente 2 a 12%, preferencialmente 4 a 10%, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9% (w/v), mais preferencialmente 7%, e preferencialmente compreende adicionalmente um detergente não iônico, tal como Tween-80, de preferência a uma concentração de 0,01% (v/v).

[0019] Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, em que a referida formulação tem uma osmolaridade na faixa de 290 ± 60 mOsm/kg, mais preferivelmente na faixa de 290 ± 20 mOsm/kg.

[0020] A presente invenção se refere ainda a uma formulação compreendendo: (a) um ligante vWF a uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/mL; (b) um excipiente escolhido de sacarose, glicina, manitol, trealose ou NaCl a uma concentração de cerca de 1% a cerca de 15% (w/v); (c) Tween-80 a uma concentração de cerca de 0,001% a 0,5% (v/v); e (d) um tampão selecionado a partir de tampão de citrato a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 200 mM, de tal forma que o pH da formulação é de cerca de 6,0 a 7,0 e um tampão de fosfato a uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 50 mm, de tal modo que o pH da formulação é de cerca de 6,5 a 7,5, em que o ligante vWF na formulação mantém pelo menos cerca de 80% da sua estabilidade após armazenamento durante pelo menos 12 meses a 5°C ou mesmo 24 meses a 5°C.

[0021] A invenção também diz respeito a uma formulação que tem menos do que 5% de espécies de elevado peso molecular (HMW) após o armazenamento durante pelo menos 12 meses a 5°C ou mesmo 24 meses a 5°C; e/ou menos de 5% de espécies de baixo peso molecular (LMW) após armazenamento durante pelo menos 12 meses a 5°C ou mesmo 24 meses a 5°C.

[0022] A invenção diz ainda respeito a uma formulação em que pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 99% do ligante vWF mantém a atividade de ligação, após o armazenamento em comparação com a atividade de ligação antes do armazenamento, a referida atividade de ligação, conforme medido por ELISA e/ou Biacore.

[0023] Além disso, a invenção se refere a uma formulação, tal como aqui descrita, em que a referida formulação está na forma líquida, liofilizada, em pó, congelada ou liofilizada reconstituída, mais especificamente, a invenção se refere a uma formulação liofilizada reconstituída ou líquida compreendendo: (a) um ligante vWF em uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/ml; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 15% (w/v); (c) Tween-80 a uma concentração de cerca de 0,001% a 0,5% (v/v); e (d) um tampão de citrato em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 200 mM, preferencialmente 200 mM, de tal forma que o pH da formulação é de cerca de 6,0 a 7,0.

[0024] A formulação liofilizada pode então ser reconstituída conforme necessário pela mistura da forma liofilizada com um diluente adequado (por exemplo, água) para ressolubilizar os componentes da formulação original a uma concentração desejada.

[0025] A presente invenção também se relaciona com uma formulação é uma formulação de armazenamento a granel que compreende: (a) um ligante vWF em uma concentração de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 80 mg/ml, de preferência 12,5 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 15% (w/v); (c) Tween-80 em uma concentração de cerca de 0,001% -0,5% (w/v); e (d) um tampão de citrato a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 200 mM, de tal forma que o pH da formulação é de cerca de 6,0 a 7,0, em que, pelo menos, 100 litros da formulação são armazenados em condições de congelamento abaixo.

[0026] Além disso, a presente invenção se refere a uma formulação, em que a referida formulação é adequada para administração parentérica a um sujeito, por exemplo, um sujeito humano (por exemplo, um doente possuindo um distúrbio relacionado com vWF). A formulação pode ser administrada ao sujeito, por injeção (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular ou intraperitoneal).

[0027] Além disso, a presente invenção proporciona uma formulação, tal como aqui descrita, para utilização em um método de tratamento de um sujeito humano ou animal, de preferência para utilização no tratamento de distúrbios relacionados vWF, tais como, por exemplo, síndrome coronariana aguda (ACS), acidente isquêmico cerebral transitório, instável ou estável, angina, acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio ou púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), mais preferencialmente para utilização no tratamento de TTP ou ACS. Além disso, a presente invenção se refere a um método ou processo de preparação da formulação, tal como aqui descrito. O método ou processo inclui expressar o ligante vWF em uma cultura de células; purificar o ligante vWF, por exemplo, pela passagem do ligante vWF através de, pelo menos, uma de uma etapa de purificação por cromatografia, uma etapa de ultrafiltração/diafiltração; ajustar a concentração do ligante vWF, por exemplo, a cerca de 0,1 a 80 mg/mL em uma formulação contendo um lioprotetor, um tensoativo e um tampão, tal como aqui descrito, por exemplo, sacarose a uma concentração de cerca de 1% a cerca de 15%; Tween-80 a uma concentração de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% (w/v); e um tampão de citrato a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 200 mM, de tal forma que o pH da formulação é de cerca de 6,0 a 7,0; e, opcionalmente, compreendendo uma etapa de confecção da formulação em uma forma de unidade de dosagem.

[0028] A invenção também apresenta um método ou processo para a preparação de uma formulação reconstituída contendo um ligante vWF, por exemplo, ALX-0081 como aqui descrito. O método inclui: a liofilização de uma mistura de um ligante vWF, um lioprotetor, um tensoativo e um tampão, formando assim uma mistura liofilizada; e reconstituindo a mistura liofilizada em um diluente, preparando-se assim uma formulação, tal como aqui descrita. Em particular, a formulação inclui (a) um ligante vWF, por exemplo, ALX-0081 a uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 80 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de cerca de 1% a cerca de 15% (w/v); (c) Tween-80 em uma concentração de cerca de 0,001% a cerca de 0,5% (v/v); e (d) um tampão de citrato a uma concentração de cerca de 5 a cerca de 200 mM, de tal forma que o pH da formulação é de cerca de 6 a 7,0; e, opcionalmente, compreendendo uma etapa de confecção da formulação em uma forma de unidade de dosagem.

[0029] A presente invenção diz ainda respeito a um método para a estabilização de um ligante vWF, de preferência, um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1 a 19 para armazenamento, compreendendo a preparação de uma formulação, tal como aqui definida.

[0030] Além disso, a invenção se refere a um método para o armazenamento de um ligante vWF, de preferência, um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1 a 19, compreendendo a preparação de uma formulação, tal como aqui definida.

[0031] Também são proporcionadas composições farmacêuticas ou de diagnóstico que compreende qualquer uma das formulações aqui descritas ou obtidas pelos métodos aqui descritos.

[0032] Além disso, a invenção caracteriza um método de análise de um produto ou de um processo, por exemplo, um processo de fabricação. O método inclui o fornecimento de uma formulação de um agente de ligação de vWF, por exemplo, ALX- 0081, tal como aqui descrito, e a avaliação de um parâmetro da formulação, tais como cor, limpidez, viscosidade ou uma quantidade de uma ou mais espécies de HMW, LMW, tal como aqui descrito. A avaliação pode incluir a avaliação de um ou mais parâmetros, tais como a determinação de se o parâmetro satisfaz um critério pré-selecionado, por exemplo, determinar se o critério pré-selecionado está presente, ou está presente em um intervalo pré-selecionado, analisando, assim, o processo. Por exemplo, a avaliação do processo inclui uma medida da estabilidade da formulação do ligante vWF. A Estabilidade da formulação ALX-0081 pode ser medida, por exemplo, pela formação de agregados, que é ensaiada, por exemplo, por cromatografia líquida de alta pressão de exclusão de tamanho (SE-HPLC), pela cor, clareza, ou viscosidade, tal como aqui descrito.

[0033] Além disso, o método pode ainda compreender a comparação de duas ou mais formulações de amostra em um método para monitorar ou controlar a variação de lote para lote, comparando uma preparação para um padrão de referência, classificação, seleção, aceitação ou descarte, processar a liberação ou retenção de um medicamento, transportar, mover para um local diferente, formular, rotular, embalar a formulação, baseado na comparação. Além disso, o método pode ainda compreender proporcionar um registro que inclui dados relacionados com o parâmetro avaliado da formulação e, opcionalmente, inclui um identificador para um lote de formulação; submeter o dito registro para um tomador de decisão; opcionalmente, receber uma comunicação do referido tomador de decisão; opcionalmente, decidir de liberar ou comercializar o lote da formulação com base na comunicação do tomador de decisão.

[0034] Também são fornecidos kits ou artigos de fabricação compreendendo a formulação da invenção e instruções de uso para, por exemplo, um profissional da área de saúde. Os kits ou artigos de fabricação podem incluir um frasco ou seringa que contém a formulação da presente invenção, tal como aqui descrito. De preferência, o frasco ou seringa é composto por vidro, plástico, ou um material polimérico escolhido a partir de um polímero de olefina cíclica ou copolímero. Além disso, a formulação também pode estar presente em um dispositivo injetável (por exemplo, uma seringa injetável, por exemplo, uma seringa injetável pré-preenchido).

[0035] A invenção proporciona adicionalmente formas de dosagem únicas farmacêuticas que compreendem as formulações estáveis da presente invenção que são adequadas para administração parentérica (por exemplo, por via intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa e subcutânea) da formulação da invenção em um paciente humano.

[0036] Além disso, as formulações da invenção podem ser usadas para o armazenamento de um ligante vWF, de preferência, um polipeptídeo compreendendo pelo menos uma das SEQ ID NOs: 1 a 19, tais como ALX-0081 como aqui descrito, em que o dito armazenamento é de 1 a 36 meses, tais como 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ou 36 meses, de preferência pelo menos 12 meses, por exemplo, a uma temperatura entre -70°C e +40°C, tal como -70°C, -20°C, +5°C, +25°C ou +40°C, de preferência a uma temperatura entre 70°C e +25°C.

[0037] A presente invenção também se refere a um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado ao vWF, tal como, por exemplo, síndrome coronariana aguda (ACS), ataque isquêmico cerebral transitório, angina estável ou instável, acidente vascular cerebral, infarto do miocárdio ou púrpura trombocitopênica trombótica (TTP); o referido método compreende administrar, a um sujeito, uma composição farmacêutica compreendendo a formulação da presente invenção, reduzindo, assim um ou mais sintomas associados com a referida desordem relacionada com vWF. Em particular, o referido distúrbio relacionado com vWF é TTP.

4. Breve Descrição das Figuras

[0038] Figura 1 - Fluxograma representando as diferentes etapas do programa de liofilização 65h padrão realizadas para ALX 0081.

[0039] Figura 2A - Parte relevante do cromatograma de RP- HPLC de ALX-0081 após a armazenagem em 1 e 2 meses a -70°C, +5°C e +25°C; mAU: mili unidades de absorbância.

[0040] Figura 2B - Aproximação da parte relevante dos cromatogramas de RP-HPLC de ALX-0081 depois de 0,4 e 8 semanas de incubação a 37°C. Fracionamento do pico principal de RP- HPLC é observado como resultado da incubação prolongada a 37°C (0,4, 8W); mAU: Mili unidades de absorbância.

[0041] A figura 3A - Sobreposição dos perfis de SE-HPLC do Tampão de citrato em branco (BCB) e ALX-0081 em 20 mM de citrato com pH 7,0 em 55,9 mg/mL antes (a) e depois 10 ciclos de congelamento-descongelamento (FT) a -20°C (c) e -70°C (b) (X = 280 nm). Um pico menor de citrato foi observado para as amostras pré-diluídas em tampão continuo; mAU: Mili unidades de absorbância.

[0042] A Figura 3B - Sobreposição dos perfis de SE-HPLC do Tampão de citrato em branco (BCB) e ALX-0081 em 20 mM de citrato com pH 7,0 em 55,9 mg/mL após ± 1 semana de armazenamento a +4°C (X = 280 nm). ALX-0081 foi resolvido em um pico principal (97%) com o ALX-0081 correspondente não modificado, intacto; e pequenos pré-picos representam apenas 3% da área total da superfície. Um pico menor do citrato foi observado para ALX-0081, previamente diluído em tampão contínuo; mAU: Mili unidades de absorbância.

[0043] A Figura 4A - Intensidade de dispersão das amostras ALX-0081 agitadas em 50 mM de citrato com pH 6,0; 50 mM de citrato com pH 6,0 + 0,01% Tween-80 (v/v) e 50 mM citrato com pH 6,0 + 0,02% Tween-80 (v/v) a +25°C. ‘+’ representam amostras em 50 mM de citrato com pH 6,0 (y=0,0044x + 3,5962, R2=0,9549); ‘o’ representa amostras em 50 mM de citrato com pH 6,0 + 0,02% Tween-80 (v/v) (y=0,0002x + 1,0447, R2=0,4673); ‘x’ representa amostras em 50 mM de citrato com pH 6,0 + 0,01% Tween-80 (v/v) (y=0,0004x + 0,5125, R2=0,6804); (eixo x = tempo em segundos; eixo y = intensidade de dispersão).

[0044] Figura 4B - Intensidade de dispersão de amostras ALX- 0081 agitadas em 50 mM de citrato com pH 6.5; 50 mM de citrato com 6,5 + 0,1% Tween-80 (v/v) e 50 mM de citrato com 6,5 + 0,02% Tween-80 (v/v) em +25°C. ‘+’ representa amostras em 50 mM de citrato com pH 6,5 (y=0,0041x + 4,7667, R2=0,9431); ‘o’ representa amostras em 50 mM de citrato com pH 6,5 + 0,02% Tween-80 (v/v) (y=0,0004x - 0,0208, R2=0,9391); ‘x’ representa amostras em 50 mM de citrato com pH 6.5 + 0,01% Tween-80 (v/v) (y=0,0001x - 1,8853, R2=0,0376); (eixo x = tempo em segundos; eixo y = intensidade de dispersão).

[0045] Figura 5 - Sobreposição dos perfis de cIEF ALX-0081 em 5 mg/mL em D-PBS +200 mM de glicina + 0,01% de Tween-80 depois de 1 mês de armazenamento em +40°C (a) , e -70°C (b) ; (X = 280 nm). AU: unidade de absorbância; pxl pós: posição em pixel.

[0046] Figura 6 - Imagens de formulações ALX-0081 liofilizadas (forma 3 = citrato/sacarose pH 6,0; forma 7 = citrato/sacarose pH 6,5; forma 17 = D-PBS/glicina) antes (painel A) e após reconstituição com água Milli-Q (painel B).

[0047] Figura 7 - Imagens de formulações ALX-0081 liofilizadas à base de citrato/sacarose.

[0048] Figura 8 - Imagens de formulações líquidas de ALX- 0081s em 28 mg/mL contendo 15, 20, 25, 30, 40, e 50 mM de citrato com pH 6,5, após 4 dias de armazenamento a +25°C (painel A) ou +5°C (painel B). Tampão de citrato vazio (50 mM) é incluído como referência.

[0049] Figura 9 - Imagens de formulações líquidas de ALX- 0081s em 20 mg/mL contendo 15 mM de citrato com pH 6,5 e diferentes quantidades de sacarose e de Tween-80, após o armazenamento por 4 dias a +25°C (painel A) ou +5°C (painel B). Tampão de citrato vazio (50 mM) é incluído como referência.

[0050] Figura 10 - Previsão da porcentagem de piroglutamato no produto farmacêutico liofilizado ALX-0081 em função do tempo quando armazenado a +5°C.

[0051] A Figura 11 - Previsão da porcentagem de piroglutamato no produto farmacêutico liofilizado ALX-0081 em função do tempo quando armazenado a +25°C.

5. Descrição detalhada da invenção

[0052] Salvo indicação em contrário, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritos em detalhes podem ser realizados e foram executados em uma maneira conhecida por si, como estará claro para uma pessoa versada. A referência, por exemplo, é novamente feita aos manuais padrão e fundamentos técnicos gerais mencionados anteriormente e às novas referências citadas na presente; bem com, por exemplo, Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5 6): 640-56; Levin and Weiss, MoI. Biosyst. 2006, 2(1): 49-57; Irving et al, J. Immunol. Métodos, 2001, 248(1-2), 31-45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A, S106-12, Gonzales et al., Tumour Biol, 2005, 26(1), 31-43, que descrevem técnicas para a engenharia de proteínas, tais como maturação de afinidade e outras técnicas para melhorar a eficiência como especificidade e outras propriedades desejadas dessas proteínas, tais como as imunoglobulinas.

[0053] Verificou-se agora surpreendentemente que os ligantes vWF, e, em particular, ALX-0081 (SEQ ID NO: 1), podem ser administrados em determinados regimes de dosagem em seres humanos. Foi observado que os ligantes vWF, e, em particular, ALX-0081, produzem um efeito farmacodinâmico, com um rápido início de ação imediatamente no final da dosagem e mantém a sua eficácia durante até cerca de 12 a 24 h. Além disso, ligantes vWF, e, em particular, ALX-0081 (SEQ ID NO: 1), foram considerados por serem seguros e bem tolerados em voluntários saudáveis do sexo masculino. Estes resultados indicam que os ligantes vWF e, em particular, ALX-0081 (SEQ ID NO: 1) são apropriados para o tratamento agudo em pacientes com angina estável submetidos à intervenção coronária percutânea eletiva (daqui em diante também referido como "PCI") e tratamento em pacientes com púrpura trombocitopénica trombótica (daqui em diante também referido como "TTP").

[0054] No entanto, as atuais formulações dos ligantes vWF e, em particular, ALX-0081 (SEQ ID NO: 1) administradas a receptores humanos foram passíveis de melhoramento.

[0055] A reformulação da invenção para os ligantes vWF, e, em particular, ALX-0081, aqui descritos rendeu uma nova formulação à base de citrato/sacarose com solubilidade aumentada (até 80 mg/mL) e melhorou significativamente a estabilidade de armazenagem líquida (por exemplo, menos oxidação ocorreu durante o armazenamento da nova formulação em relação à sua formulação original no seu estado líquido). Além disso, na forma liofilizada, essencialmente nenhuma oxidação ou isomerização asp pode ser detectada após 12 meses de armazenamento a +40°C ou até mesmo 24 meses de armazenamento a +40°C. Uma formação residual de pequenas quantidades de piroglutamato ainda foi observada. Além disso, a otimização da concentração de citrato e sacarose resultou em uma redução do teor de umidade do produto liofilizado, minimizando, assim, a taxa de formação de piroglutamato residual.

[0056] Assim, a presente invenção fornece líquido estável e formulações liofilizadas de ligantes anti-vWF (por exemplo, ALX-0081) e suas utilizações para o tratamento ou prevenção de desordens relacionadas com o vWF.

5.1 Polipeptídeo(s) da invenção

[0057] Os ligantes vWF utilizados na presente invenção são tipicamente proteínas ou polipeptídeo que se ligam ao Fator de von Willebrand humano (vWF, SEQ ID NO: 20). Preferencialmente, os agentes ligantes vWF são proteínas ou polipeptídeo compreendendo ou consistindo em pelo menos uma sequência de imunoglobulina, tal como um domínio variável único de imunoglobulina (ISVD). Ainda mais preferencialmente, os ligantes vWF da presente invenção são proteínas ou polipeptídeos compreendendo ou consistindo das SEQ ID NOs: 1 a 19, e preferivelmente da SEQ ID NO: 1. Os ligantes vWF podem ser utilizados como terapia adjuvante para pacientes com ACS submetidos à PCI ou como tratamento de púrpura trombocitopénica trombótica (TTP). O termo "proteína", "polipeptídeo" e "sequência de aminoácidos" são aqui utilizados indiferentemente. Assim, uma sequência de aminoácidos da presente invenção é um ligante vWF.

[0058] Assim, por exemplo, os ligantes vWF adequados para utilização na presente invenção pode incluir os compostos da Tabela A-1, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 a 19, ou um composto tendo 80% ou mais, mais preferencialmente 85% ou mais, mais preferencialmente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, da identidade da sequência de aminoácidos para um composto na Tabela A-1 (ver seção de definição da "identidade da sequência").

[0059] De preferência, os ligantes vWF para utilização na presente invenção são compostos semelhantes 12A02H1. Para os fins da presente descrição um composto tipo 12A02H1 é um composto que compreende 12A02H1 (isto é, SEQ ID NO: 19) ou um composto possuindo 80% ou mais, mais preferencialmente 85% ou mais, mais preferencialmente 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais, da identidade da sequência de aminoácidos (conforme aqui definido) para 12A02H1 (SEQ ID NO: 19). Um ligante vWF particularmente preferido é ALX-0081 (SEQ ID NO: 1).

[0060] Todos os ligantes vWF acima mencionados são bem conhecidos da literatura. Isto inclui a sua fabricação (ver, em particular, por exemplo, WO2006/122825, mas também WO2004/062551). Por exemplo, ALX-0081 é preparado, por exemplo, como descrito no WO2006/122825 ou WO2009/115614.

[0061] Salvo indicação em contrário, o termo "sequência de imunoglobulina" - é aqui utilizado para se referir a um anticorpo de cadeia pesada ou a um anticorpo de 4 cadeias convencional - é usado como um termo geral para incluir tanto anticorpo de tamanho natural, quanto as cadeias individuais dele, como todas as partes, domínios ou fragmentos deste (inclusive, mas não limitado a, domínios de ligação ao antígeno ou fragmentos como domínios VHH ou domínios VH/VL, respectivamente). Os termos molécula de ligação ao antígeno ou proteína de ligação ao antígeno são usados alternadamente com a sequência de imunoglobulina, e incluem domínios variáveis únicos da imunoglobulina, tais como Nanobodies®.

[0062] As modalidades da invenção se referem às sequências de imunoglobulina que são domínios variáveis únicos da imunoglobulina, tais como as sequências de domínio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência VL), ou sequências de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência VH); mais especificamente, as sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo convencional de quatro cadeias, ou sequências de domínio variável de cadeia pesada que são derivadas de um anticorpo de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência VHH).

[0063] O termo "domínio variável único da imunoglobulina" define moléculas em que o sítio de ligação do antígeno está presente e formada por um domínio único de imunoglobulina ou fragmentos adequados deste. Isto define domínios variáveis únicos da imunoglobulina além das imunoglobulinas "convencionais" ou seus fragmentos, em que dois domínios de imunoglobulina, em particular dois domínios variáveis, interagem para formar um sítio de ligação ao antígeno. Tipicamente, as imunoglobulinas convencionais, um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) interagem de modo a formar um sítio de ligação ao antígeno. Neste caso, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) tanto de VH quanto VL contribuirão para o sítio de ligação ao antígeno, isto é, um total de 6 CDRs que estarão envolvidos na formação sítio de ligação ao antígeno.

[0064] Em contraste, o sítio de ligação de um domínio variável único da imunoglobulina é constituído por um domínio único de VH ou VL. Assim, o sítio de ligação ao antígeno de um domínio variável único da imunoglobulina é constituído por no máximo de três CDRs.

[0065] O termo "imunoglobulina de domínio variável único", portanto, não compreende imunoglobulinas convencionais ou os seus fragmentos, que exigem a interação de, pelo menos, dois domínios variáveis para a formação de um sítio de ligação ao antígeno. Este também é o caso de modalidades da invenção que "compreende" ou "inclui" um domínio variável único de imunoglobulina. No contexto da presente invenção, tais modalidades não incluem imunoglobulinas convencionais ou seus fragmentos. Assim, uma composição que "compreende" ou "contém" um domínio variável único de imunoglobulina pode se referir, por exemplo, as construções compreendendo mais do que um domínio variável único de imunoglobulina. Em alternativa, pode haver mais do que outros domínios variáveis únicos de imunoglobulina, por exemplo, agentes constituintes auxiliares de tipos diferentes, etiquetas proteicas, corantes, tinturas, etc. No entanto, estes termos não compreendem fragmentos de imunoglobulinas convencionais em que o local de ligação do antígeno é formado por um domínio variável único.

[0066] De acordo com a invenção, o polipeptídeo da invenção, mais especificamente, as sequências de imunoglobulina, podem consistir, ou compreender um ou mais dos seguintes: anticorpos de domínio, ou sequências de aminoácidos que são adequadas para utilização como anticorpos de domínio, anticorpos de domínio simples, ou sequências de aminoácidos que são adequadas para utilização como anticorpos de domínio simples, "dAb", ou sequências de aminoácidos que são adequadas para utilização como dAb, ou Nanobodies®, incluindo mas não se limitando às sequências de VHH, tais como sequências de VHH humanizadas ou sequências camelizadas VH, e preferivelmente são Nanobodies®.

[0067] A presente invenção abrange fragmentos adequados de domínios variáveis únicos da imunoglobulina. "Fragmentos adequados" dos domínios variáveis únicos da imunoglobulina se referem ao polipeptídeo que contêm menos aminoácidos do que um domínio variável único da imunoglobulina nativa, mas continuam a apresentar atividade de ligação ao antígeno (o que, então, geralmente contêm, pelo menos, alguns dos resíduos de aminoácidos que formam pelo menos um dos CDRs, como adicionalmente aqui descrito). Tais domínios variáveis únicos da imunoglobulina e fragmentos compreendem, mais preferencialmente, uma dobra de imunoglobulina ou são capazes de formar, sob condições adequadas, uma dobra de imunoglobulina. Mais especificamente, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina e os seus fragmentos são tais que eles são capazes de se ligar ao antígeno alvo. Como tal, o domínio variável único de imunoglobulina pode, por exemplo, compreender uma sequência de domínio variável de cadeia leve (por exemplo, uma sequência VL) ou um seu fragmento adequado; ou uma sequência de domínio variável de cadeia pesada (por exemplo, uma sequência de VH ou sequência VHH) ou um seu fragmento adequado; desde que seja capaz de formar uma unidade de ligação ao antígeno única (isto é, uma unidade de ligação ao antígeno funcional, que consiste essencialmente de um domínio variável único, de tal forma que o domínio de ligação ao antígeno único não precise interagir com outro domínio variável para formar uma unidade de ligação ao antígeno funcional, como é, por exemplo, o caso dos domínios variáveis que estão presentes em, por exemplo, anticorpos convencionais e nos fragmentos scFv que necessitam interagir com outro domínio variável - por exemplo, através de uma interação de VH/VL - de modo a formar um domínio de ligação ao antígeno funcional).

[0068] As sequências de imunoglobulina da invenção são, de preferência, essencialmente na forma isolada. As sequências de imunoglobulinas da invenção também podem fazer parte de uma proteína ou polipeptídeo da invenção (como aqui definidos), a qual pode compreender ou consistir essencialmente de uma ou mais sequências de aminoácidos da invenção e que pode, opcionalmente, ainda compreender uma ou mais sequências de aminoácidos (todas opcionalmente ligadas por meio de um ou mais ligantes adequados). Por exemplo, e sem limitação, uma ou mais sequências de aminoácidos da invenção pode ser utilizada como uma unidade de ligação, de tal proteína ou polipeptídeo, que pode opcionalmente conter um ou mais sequências de aminoácidos que pode servir como uma unidade de ligação, de modo a proporcionar um polipeptídeo monovalente, multivalente ou multiespecífico da invenção, respectivamente, como todos aqui descritos. Tais polipeptídeos ou proteínas também podem ser essencialmente em forma isolada.

[0069] A invenção se refere a sequências de imunoglobulina de origem diferente, compreendendo sequências de imunoglobulina de rato, camundongo, coelho, burro, camelos e humanos. A invenção também inclui sequências de imunoglobulina completa de humanos, humanizadas ou quiméricas. Por exemplo, a invenção compreende as sequências de imunoglobulina de camelídeos e as sequências de imunoglobulina de camelídeos humanizadas ou anticorpos domínios camelizados, por exemplo, dAd camelizados DAB como descrito por Ward et al. (ver, por exemplo, WO 94/04678 e Davies e Riechmann (1994 e 1996)). Além disso, A presente invenção compreende sequências de imunoglobulinas fundidas, por exemplo, formando uma construção multivalente e/ou multiespecífica (para polipeptídeos multivalentes e multiespecíficos que contêm um ou mais domínios Vhh e a sua preparação, referência também é feita ao Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 7346-7350, 2001, bem como aos, por exemplo, documentos WO96/34103 e WO99/23221), e sequências de imunoglobulina compreendendo etiquetas ou outras partes funcionais, como por exemplo toxinas, rótulos, radioquimicos e etc., que são deriváveis das sequências de imunoglobulina da presente invenção. Os domínios variáveis únicos da imunoglobulina também foram descritos em tubarões (também referidos como "IgNARs", como por exemplo descrito no documento WO03/014161 ou Streltsov, 2005).

[0070] Em uma modalidade particular, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina da invenção são Nanobodies®, em particular os domínios Vhh camelídeos, os domínios Vhh humanizados ou domínios Vh camelizados. Uma pessoa versada na técnica está bem familiarizada com domínios Vhh humanizados ou Vh camelizados.

[0071] A sequência de aminoácidos e a estrutura de uma sequência de imunoglobulina, em particular um Nanobody® podem sem, no entanto, estarem limitada a estas- serem compostas por quatro regiões de armação ou "FR’s", que são referidas na arte e aqui como "região de armação 1" ou "FR1", como "região de armação 2" ou "FR2", como "região de armação 3" ou "FR3" e como região de armação 4" ou "FR4", respectivamente; cujas regiões de armação são interrompidas por três regiões que determinam a complementaridade ou "CDR", que são referidos na arte como "região que determinam a complementaridade 1" ou "CDR1", como "região que determinam a complementaridade 2" ou "CDR2" e como "região que determinam a complementaridade 3" ou "CDR3", respectivamente.

[0072] O número total de resíduos de aminoácidos em um Nanobody® pode está nas regiões de 110 a 120, de preferência 112 a 115, e é mais preferível em 113. No entanto, deve notar- se que as partes, fragmentos, análogos ou derivados (como adicionalmente descrito aqui) de um Nanobody® não estão particularmente limitados quanto aos seus comprimentos e/ou tamanhos, desde que tais partes, fragmentos, análogos ou derivados satisfaçam as exigências adicionais aqui descritas e também são de preferência adequados para as propostas aqui descritas.

[0073] Assim, em geral, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina serão sequências de aminoácidos que consistem em, ou consistem essencialmente de 4 regiões estruturais (FR1 a FR4, respectivamente) e 3 regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3, respectivamente). "Consistem essencialmente", neste contexto, significa que os elementos adicionais, tais como, por exemplo, etiquetas usadas para a purificação ou a rotulagem podem estar presente, mas esses elementos adicionais são pequenos, em comparação com o domínio variável único da imunoglobulina, por si só, e não interferem com a atividade de ligação ao antígeno do domínio variável único da imunoglobulina.

[0074] Tais como aqui utilizados, os termos "sequências de imunoglobulina" ou "domínios variáveis único da imunoglobulina" se referem tanto às sequências de ácidos nucléicos que codificam o polipeptídeo, como o polipeptídeo por si só. Qualquer significado mais limitativo será evidente a partir do contexto específico.

[0075] Em particular, a sequência de aminoácidos da invenção pode ser um Nanobody® ou um fragmento deste adequado. Para uma descrição mais detalhada de VHH’s e Nanocorpos, a referência também é feita a Muyldermans (2001, Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302), assim como para os seguintes pedidos de patente, que são mencionados como antecedentes da arte geral: WO 94/04678, WO 95/04079 e WO 96/34103 da Vrije Universiteit Brussel, WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 e WO 02/48193 da Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 e WO 03/055527 de Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB), WO 03/050531 da Algonomics NV e Ablynx NV; WO 01/90190 do National Research Council of Canada; WO 03/ 025020 (= EP 1 433 793) do Institute of Antibodies, bem como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551, WO 05/044858, WO 06/40153, WO 06/ 079372, WO 06/122786, WO 06/122787 e WO 06/122825 da Ablynx N.V. os novos pedidos de patentes publicados da Ablynx N.V., a referência também é feita à arte anterior também mencionada nestes pedidos e, em particular, a lista de referências citadas nas páginas 41 a 43 do pedido de patente internacional WO 06/040153, cuja lista e referências são aqui incorporadas por referência. Tal como descrito nestas referências, Nanocorpos (em particular, sequências VHH e parcialmente Nanocorpos humanizados) podem em particular ser caraterizados pela presença de um ou mais "resíduos" Hallmark em uma ou mais das sequências da estrutura. Uma descrição mais detalhada dos Nanocorpos, incluindo humanização e/ou camelização de Nanocorpos, bem como outras modificações, partes ou fragmentos, derivados ou "fusões de nanocorpos", construções multivalentes (incluindo alguns exemplos não limitativos de sequências ligantes) e diferentes modificações para aumentar a meia-vida dos Nanocorpos e suas preparações podem ser encontradas, por exemplo, em WO 07/104529.

[0076] Os domínios variáveis únicos da imunoglobulina proporcionados pela invenção são, de preferência, em forma isolada ou essencialmente na forma isolada. As sequências de imunoglobulinas da invenção também podem fazer parte de uma proteína ou polipeptídeo da invenção, que pode compreender ou essencialmente consistir de um ou mais domínios variáveis únicos da imunoglobulina e que pode, opcionalmente, ainda compreender uma ou mais sequências adicionais de aminoácidos (todos opcionalmente ligados através de um ou mais ligantes adequados). Por exemplo, e sem limitação, um ou mais domínios variáveis únicos da imunoglobulina podem ser utilizados como uma unidade de ligação, de tal proteína ou polipeptídeo, que pode opcionalmente conter uma ou mais sequências de aminoácidos que podem servir como uma unidade de ligação, assim como para fornecer um polipeptídeo monovalente, multivalente ou multiespecífico da invenção, respectivamente, todos como aqui descritos. Tal proteína ou polipeptídeo pode também ser na forma isolada ou essencialmente isolada. Assim, de acordo com a invenção, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina compreendem construções compreendendo duas ou mais unidades de ligação ao antígeno sob a forma de domínios individuais, conforme descrito acima. Por exemplo, dois (ou mais) domínios variáveis únicos da imunoglobulina com a mesma ou diferente especificidade do antígeno podem ser ligados para formar, por exemplo, uma construção bivalente, trivalente ou multivalente. Através da combinação dos domínios variáveis únicos da imunoglobulina de duas ou mais especificidades, biespecífico, triespecífico e etc., construções podem ser formadas. Por exemplo, um polipeptídeo de acordo com a invenção pode compreender dois domínios variáveis únicos da imunoglobulina direcionados contra um alvo A, e um domínio variável único de imunoglobulina contra o alvo B, tornando-se bivalente para A e monovalente para B. Tais construções e modificações do mesmo, que podem facilmente ser concebidas por uma pessoa versada na técnica, estão todos abrangidas pela presente invenção. Em modalidades particulares, a invenção se refere a construções bi-paratópica compreendendo, pelo menos, dois domínios variáveis únicos de imunoglobulina direcionados para epítopos diferentes no mesmo antígeno alvo.

[0077] Todas estas moléculas são também referidas como "polipeptídeo da invenção", o que é sinônimo de "sequências de imunoglobulina" ou "domínios variáveis únicos da imunoglobulina" da invenção.

[0078] Além disso, o termo "sequência" como usado na presente (por exemplo, em termos como “sequência de imunoglobulina”, “sequência de anticorpo”, “sequência de domínio variável”, “sequência de VHH” ou “sequência de proteína”) deve ser geralmente entendido para incluir tanto sequência aminoácida relevante como sequências ácidas nucléicas ou sequências de nucleotídeos que codificam o mesmo, a menos que o contexto requeira uma interpretação mais limitada.

[0079] De acordo com uma modalidade não limitativa da invenção, as sequências de imunoglobulina, Nanobody® ou polipeptídeo da invenção é glicosilada. De acordo com outra modalidade não limitativa da invenção, as sequências de imunoglobulina, Nanobody® ou polipeptídeo da invenção é não glicosilada.

5.2 “Ligante” para um antígeno

[0080] A invenção se refere a sequências de imunoglobulina que podem se ligar e/ou ter afinidade a um antígeno, tal como aqui definido, por exemplo, o fator de von Willebrand. No contexto da presente invenção, "ligar-se a e/ou ter afinidade a" certo antígeno tem o seu significado habitual da técnica, como compreendido, por exemplo, no contexto de anticorpos e seus respectivos antígenos.

[0081] Em modalidades particulares da invenção, o termo "ligar-se a e/ou ter afinidade a" significa que a sequência de imunoglobulina interage especificamente com um antígeno, e é utilizado de forma intercambiável com sequências de imunoglobulina "contra" o referido antígeno.

[0082] O termo "especificidade" se refere ao número de diferentes tipos de antígenos ou determinantes antigênicos, onde uma determinada molécula de ligação de antígeno ou proteína de ligação de antígeno (tal como um domínio variável único de imunoglobulina, um Nanobody® ou um polipeptídeo da invenção) podem se ligar. A especificidade uma proteína de ligação de antígeno pode ser determinada baseada na afinidade e/ou avidez. A afinidade, representada pelo equilíbrio constante para a dissociação de um antígeno com uma proteína de ligação de antígeno (KD), é uma medida para a força de ligação entre um determinante antigênico e um sítio de ligação de antígeno na proteína de ligação de antígeno: o menor o valor do KD, quanto mais forte a força de ligação entre um determinante antigênico e a molécula de ligação de antígeno (alternativamente, a afinidade também pode ser expressa como a afinidade constante (KA), que é 1/KD). Como estará claro para uma pessoa versada na arte (por exemplo, com base na revelação adicional dada aqui), a afinidade pode ser determinada por uma maneira conhecida por si, dependendo do antígeno específico de interesse. A avidez é a medida da força da ligação entre uma molécula de ligação de antígeno (tal como um domínio variável único de imunoglobulina, um Nanobody® ou polipeptídeo da invenção) e o antígeno pertinente. A avidez está relacionada tanto à afinidade entre um determinante antigênico e sítio de ligação de antígeno na molécula de ligação de antígeno como ao número de sítios de ligação presentes pertinente na molécula de ligação de antígeno.

[0083] Tipicamente, as sequências de imunoglobulina da presente invenção (tais como as sequências de aminoácidos, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina, Nanobodies® e/ou polipeptídeo da invenção) se ligaram ao seu antígeno com uma constante de dissociação (Kd) de 10-5 a 10-12 moles/litro ou menos, e preferencialmente a 10-7 a 10-12 moles/litro ou menos, e mais preferencialmente de 10-8 a 10-12 moles/litro (isto é, com uma constante de associação (ka) de 105 a 1012 litros/mol ou mais, e de preferência 107 a 1012 litros/mole ou mais, e mais preferencialmente 108 a 1012 litros/mol) e/ou se ligam ao antígeno como aqui definido, com uma taxa Kon de entre 102 M-1s-1 e cerca de 107 M-1s-1, de preferência entre 103 M-1s-1 e 107 M- 1s-1, mais preferencialmente entre 104 M-1s-1 e 107 M-1s-1, tal como entre 105 M-1s-1 e 107 M-1s-1; e/ou ligam-se ao antígeno como aqui definido, com uma taxa de koff entre 1s-1 (t1/2 = 0,69 s) e 10-6 s-1 (fornecendo um complexo irreversível próximo com um t1/2 de vários dias), de preferência entre 10-2 s-1 e 10-6 s-1, mais preferencialmente entre 10-3 s-1 e 10-6 s-1, tal como entre 10-4 s-1 e 10-6 s-1.

[0084] Qualquer valor de Kd maior do que 10-4 M (ou qualquer valor KA inferior a 104 M-1) é geralmente considerado para indicar a ligação não específica.

[0085] De preferência, uma sequência de imunoglobulina monovalente da invenção se ligará ao antígeno desejado com uma afinidade inferior a 500 nM, preferivelmente menos de 200 nM, mais preferivelmente menos de 10 nM, como menos de 500 pM.

[0086] A ligação específica de uma proteína de ligação de antígeno a um antígeno ou determinante antigênico pode ser determinada em qualquer maneira conveniente conhecida por si, inclusive, por exemplo, análise de Scatchard e/ou ensaios de ligação competitivos, como rádio-inumoensaios (RIA), imunoensaios de enzima (EIA) e ensaios de competição de sandwitch, e as variantes diferentes destas conhecidas per se na técnica; bem como as outras técnicas aqui mencionadas.

[0087] A constante de dissociação pode ser constante de dissociação aparente ou real, como ficará evidente para aqueles versada na arte. Métodos para determinação da constante de dissociação serão evidentes para aqueles versados na arte, e, por exemplo, incluir as técnicas mencionadas. A este respeito, será igualmente evidente que não é possível medir as constantes de dissociação de mais do que 10-4 moles/litro ou 10-3 moles/litro (isto é, 10-2 moles/litro). Opcionalmente, como também se tornará evidente para um técnico no assunto, a constante de dissociação (real ou aparente) pode ser calculada com base na constante de dissociação (KA) (real ou aparente), por meio da relação [KD = 1/KA].

[0088] A afinidade denota a força ou estabilidade uma interação molecular. A afinidade é comumente dada por KD, ou constante de dissociação, que tem unidades de mol/litro (ou M). A afinidade pode ser expressa como uma constante de dissociação, KA, o que equivale a 1/KD e tem unidade de (mol/litro) ("ou" M-1). Na presente especificação, a estabilidade da interação entre duas moléculas (como uma sequência de aminoácidos, nanocorpo ou polipeptídeos da invenção e seu alvo pretendido) será principalmente expressa em termos do valor KD de sua interação, ficando claro para aqueles versados que, na perspectiva da relação KA = 1/KD, especificando a força de interação molecular pelo seu valor KD também pode ser usado para calcular o valor KA correspondente. O valor KD caracteriza a força de interação molecular também no sentido termodinâmico quando este está relacionado com a energia livre (DG) da ligação pela bem conhecida relação DG = RT.ln.(KD) (equivalentemente DG = -RT. M (KA)), onde R é igual a constante do gás, T é igual à temperatura absoluta e denota o logaritmo natural.

[0089] A KD para as interações biológicas, tais como as ligações das sequências de imunoglobulina da invenção para vWF tais como aqui definida, que são consideradas significativas (por exemplo, específicas) estão tipicamente na faixa de 10-10 M (0,1 nm) a 10-5 (10000 nM). Quanto mais forte for a interação menor é a sua KD. A KD também pode ser expressa como a relação entre a taxa constante de dissociação de um complexo, denominada Koff, para a taxa de sua associação, e indicada como kon (de modo que KD = Koff/kon e KA = kon/Koff). A taxa Off Koff tem unidades M1 S-1.

[0090] No que se refere às sequências de imunoglobulina da invenção, a taxa on pode variar entre 102 M-1 s-1 a aproximadamente 107 M-1 s-1, aproximando-se a taxa da constante bimolecular. A taxa OFF está relacionada com a meia-vida de uma dada interação molecular por uma relação ty2 = ln(2)/Koff. A taxa OFF pode variar entre 10-6 s-1 (perto do complexo irreversível com t^ de vários dias) a 1 s-1 (t^ = 0,69 s) .

[0091] A afinidade de uma interação molecular entre duas moléculas pode ser medida através de diferentes técnicas conhecidas em si, bem como técnicas de biosensor para a ressonância de plásmons de superfície (RPS) (ver, por exemplo, Ober et al, Intern. Immunology, 13, 1551 - 1559, 2001), onde uma molécula é imobilizada no chip biossensor e a outra molécula é passada sobre a molécula imobilizada sob condições de fluxo rendendo kon, medições Koff e, consequentemente, valores KD (ou KA). Isto pode, por exemplo, ser realizada por meio de instrumentos BIACORE conhecidos.

[0092] Também será claro para um técnico no assunto que a KD medida pode corresponder a KD aparente se o processo de medição de alguma forma influenciar na afinidade de ligação intrínseca das moléculas implícita, por exemplo, por artefatos relacionados com o revestimento biosensor de uma molécula. Além disso, uma KD aparente pode ser medida se uma molécula contém mais de um local de reconhecimento para a outra molécula. Em tal situação a afinidade medida pode ser afetada pela avidez da interação entre as duas moléculas.

[0093] Outra abordagem que pode ser usada para avaliar a afinidade é ELISA etapa 2 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) procedimento de Friguet et al. (J. Immunol. Métodos, 77, 305 19, 1985). Este método estabelece medir o equilíbrio da ligação de fase da solução e evita possíveis artefatos relativos à adsorção de uma das moléculas em um suporte como o plástico.

[0094] No entanto, a medida exata de KD pode ser bastante trabalhosa e, como consequência, muitas vezes valores KD aparente são determinados para avaliar a força de ligação de duas moléculas. Deve-se notar que, enquanto todas as medições são feitas de uma forma consistente (por exemplo, mantendo as condições de ensaio inalteradas) medições KD aparentes podem ser usadas como uma aproximação KD verdadeira e, portanto, no presente documento KD e KD aparente deverão ser tratadas com igual importância ou relevância.

[0095] Finalmente, deve-se notar que em muitas situações, o cientista julgou ser conveniente determinar a afinidade de ligação em relação a certas moléculas de referência. Por exemplo, para avaliar a força de ligação entre as moléculas A e B, por exemplo, pode-se usar uma molécula de referência C que se liga a B e que está devidamente rotulada com um grupo cromóforos ou fluoro foros ou fração ou outros produtos químicos, como a biotina de fácil detecção em ELISA ou separação celular ativada por fluorescência (FACS) ou outro formato (o flúor para a detecção de fluorescência, o cromóforo para a detecção de absorção da luz, a biotina para detecção ELISA da estreptavidina mediada). Normalmente, a molécula de referência C é mantida a uma concentração fixa e a concentração de A varia para uma dada concentração ou quantidade de B. Como resultado, um valor IC50 é obtido corresponde à concentração de A no qual o sinal medido para C na ausência de A é a porção. A Fornecida a KD ref, a KD da molécula de referência, é conhecida, bem como a concentração total cref da molécula de referência, KD aparente para a interação A-B pode ser obtida a partir da seguinte fórmula: KD=IC5o/(l+Cref/KD ref). Note que Cref << KD ref, KD - IC50. Fornecida a medida IC50 é realizada de uma forma consistente (por exemplo, mantendo cref fixo), para os ligantes que são comparados, a força ou a estabilidade uma interação molecular pode ser avaliada pelo IC50 e esta medida é considerada como equivalente a KD ou KD aparente ao longo deste texto.

5.3 Antígeno alvo

[0096] Os domínios variáveis únicos da imunoglobulina da presente invenção se ligam e/ou têm afinidade para vWF. No contexto da presente invenção, "vWF" inclui, mas não está limitado, ao vWF de macaco cinomolgos, babuíno, porco, porquinho da índia, rato e/ou humano e de preferência vWF humano, isto é, SEQ ID NO: 20 ou a entrada do GenBank: NP_000543.

5.4 Modalidades especificas de sequências de imunoglobulina

[0097] A presente invenção se refere aos domínios variáveis únicos de imunoglobulina descritos nos documentos WO 2004/015425, WO 2004/062551, WO 2006/074947, WO 2006/122825, WO 2009/115614 ou WO2011/067160 todos no nome da presente requerente, ou em, ou pode ser obtidos pelos métodos descritos nestes.

[0098] A invenção também abrange variantes otimizadas destas sequências de aminoácidos. Geralmente, uma "variante optimizada" de uma sequência de aminoácidos de acordo com a invenção é uma variante que compreende uma ou mais substituições benéficas, tais como substituições que aumentam i) o grau de "humanização", ii) a estabilidade química, e/ou iii) o nível de expressão; enquanto a potência (medida, por exemplo, pelo ensaio de potência, tal como descrito na parte experimental do WO 2006/122,825 permanece comparável (isto é, dentro de um desvio de 10%) com o tipo selvagem 12A02 (tal como definido no documento WO 2006/122825) ou comparável com a variante 12A02H1 (SEQ ID NO.: 19), também como definido no documento WO 2006/122825. De preferência, em comparação com a sequência do tipo selvagem 12A02, uma sequência de aminoácidos da invenção contém, pelo menos, uma desta substituição, e de preferência pelo menos duas destas substituições, e de preferência pelo menos três substituições de humanização e preferivelmente pelo menos 10 de tais substituições de humanização.

[0099] Em um aspecto particular, as sequências de aminoácidos da invenção contêm um total de entre 1 e 15, de preferência entre 2 e 14, tal como entre 9 e 13, por exemplo, 10, 11 ou 12 substituições de aminoácidos em comparação com a sequência de tipo selvagem 12A02. Tal como mencionado, estas diferenças de preferência pelo menos compreendem uma, de preferência, pelo menos duas, tal como três, quatro ou cinco ou dez substituições de humanização, e pode, opcionalmente, compreender uma ou mais das substituições adicionais (tal como qualquer uma de, ou qualquer combinação adequada de qualquer duas ou mais das, as substituições adicionais (a) a (c) como aqui mencionado). Mais uma vez, com base na descrição aqui e, opcionalmente, depois de um limitado grau de tentativa e erro, os versados na arte serão capazes de selecionar (uma combinação adequada de) uma ou mais substituições adicionais e/ou de humanização adequadas.

[00100] A presente invenção engloba sequências de polipeptídeo que são altamente semelhantes a qualquer um dos exemplos específicos aqui proporcionados, ou qualquer um dos exemplos específicos definidos pela referência acima. Significa muito semelhante, uma identidade de aminoácidos de pelo menos 90%, por exemplo, 95, 97, 98 ou 99%. As sequências polipeptídicas altamente semelhantes terá a mesma função que a sequência das quais são derivadas, ou seja, se ligarão ao vWF, mais especificamente se ligam e inibem a interação entre vWF e as plaquetas.

[00101] Em uma modalidade particular, a invenção se refere às sequências altamente semelhantes a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 19, em especial SEQ ID NO: 1. No entanto, para cada sequência variante, a estabilidade da formulação, tal como aqui definida, tem de ser avaliada, de tal forma que a invenção, em particular, se refere a variantes ou sequências semelhantes que são altamente estáveis nas formulações, tal como aqui definido.

[00102] Métodos para gerar sequências polipeptídicas da invenção são amplamente conhecidas e incluem, por exemplo, a expressão recombinante ou a síntese. Uma pessoa versada na arte está bem familiarizada com a tecnologia de expressão adequada, por exemplo, vetores recombinantes e células hospedeiras adequadas, por exemplo, As células hospedeiras de leveduras ou bacterianas. A pessoa versada na arte também está bem familiarizada com as técnicas de purificação e protocolos adequados.

5.5 Formulações da invenção

[00103] A presente invenção proporciona formulações de polipeptídeo direcionados contra vWF, por exemplo, domínios variáveis únicos da imunoglobulina (ISVDs) ou polipeptídeo que imunoglobulina, que sejam estáveis, e de preferência adequados para utilizações farmacêuticas, que compreendem a preparação de medicamentos.

[00104] Uma formulação de um ligante vWF, por exemplo, um ISVD, inclui um ISVD, um composto que pode servir como um agente crioprotetor e/ou lioprotetor, e um tampão. O pH da formulação é geralmente um pH de 5 a 7,5. Em algumas modalidades, uma formulação é armazenada como um líquido. Em outras modalidades, uma formulação é preparada como um líquido e, em seguida, é secada, por exemplo, por liofilização ou secagem por pulverização, antes do armazenamento. Uma formulação secada (ou seja, o liofilizado) pode ser utilizada como um composto seco, por exemplo, como um aerossol ou pó, ou reconstituída para a sua concentração original, ou outra, por exemplo, utilizando água, um tampão, ou qualquer outro líquido apropriado (diluente).

[00105] O processo de purificação do ligante vWF é concebido para permitir a transferência do ligante vWF em uma formulação adequada para o armazenamento a longo prazo, por exemplo, como um líquido congelado e/ou subsequentemente durante a criodessecagem (por exemplo, utilizando uma formulação citrato/sacarose). A formulação é liofilizada com a proteína, por exemplo, ligante vWF em uma concentração específica. A formulação liofilizada pode então ser reconstituída, conforme necessário, com um diluente adequado (por exemplo, água) para ressolubilizar os componentes da formulação original até uma concentração desejada, geralmente a mesma ou maior concentração em comparação com a concentração antes da liofilização. A formulação liofilizada pode ser reconstituída para produzir uma formulação que tem uma concentração que varia desde a concentração inicial (ou seja, antes da liofilização), dependendo da quantidade de diluente adicionada ao liofilizado em relação ao volume de líquido que foi originalmente liofilizado. As formulações adequadas podem ser identificadas através da análise de um ou mais parâmetros de integridade do ligante vWF. Os parâmetros testados são, em geral, a porcentagem de espécies de alto peso molecular (HMW) ou a porcentagem de espécies de baixo peso molecular (LMW) por exclusão de tamanho HPLC (SE-HPLC).

[00106] Por conseguinte, a presente invenção proporciona formulações caraterizadas por um grau adequado de pureza e em concentrações adequadas como requerido, por exemplo, para fins farmacêuticos. As formulações fornecem os polipeptídeo, por exemplo, domínios variáveis únicos da imunoglobulina ou polipeptídeo que compreendem pelo menos um domínio variável único de imunoglobulina, como aqui definido, em uma forma estável ao longo de uma grande faixa de concentrações, e uma grande variedade de condições de armazenamento, por exemplo, temperaturas, incluindo condições de estresse, tais temperaturas elevadas (por exemplo, +25°C ou superior), liofilização, agitação ou outras formas de estresse físico.

[00107] A formulação compreende um veículo aquoso. O veículo aquoso é, em particular, um tampão.

[00108] A invenção, no entanto, também abrange produtos que podem ser obtidos por processamento posterior de uma formulação líquida, tal como, um produto congelado, liofilizado ou seco por atomização. Após a reconstituição, estes produtos sólidos podem tornar-se formulações líquidas, tais como aqui descritas (mas não se limitam a estas). No seu sentido mais amplo, por conseguinte, o termo "formulação" inclui tanto formulações sólidas quanto líquidas. No entanto, as formulações sólidas são entendidas como produzidas a partir de formulações líquidas (por exemplo, por congelamento, criodessecagem ou secagem por atomização), e, portanto, têm várias caraterísticas que são definidos pelas caraterísticas especificadas para formulações líquidas aqui. A invenção não exclui a reconstituição que conduz a uma composição que se desvia da composição original antes, por exemplo, da secagem por atomização ou congelamento.

[00109] As formulações da presente invenção compreendem pelo menos um ligante vWF, em particular, os domínios variáveis únicos de imunoglobulinas ou um polipeptídeo que compreende pelo menos um domínio variável únicos da imunoglobulina, tal como aqui definido. Em modalidades particulares, a formulação compreende um ou mais polipeptídeo selecionados a partir de SEQ ID NOs: 1 a 19, de preferência a SEQ ID NO: 1. Os polipeptídeos podem adicionalmente ter meia-vida, por exemplo, prolongado pela incorporação de um peptídeo de ligação de albumina sérica ou domínio de ligação, que podem ser de qualquer peptídeo de ligação de albumina sérica ou domínio de ligação capaz de aumentar a meia-vida da construção (em comparação com a mesmo construção sem o peptídeo de ligação da albumina sérica ou domínio de ligação), e pode, em particular, ser peptídeos de ligação de albumina sérica, tal como descrito no WO 2008/068280 da requerente (e, em particular, WO 2009/127691 e WO 2011/095545, ambos da requerente), ou um domínio variável único da imunoglobulina que se liga a albumina sérica (tal como um nanocorpo que se liga à albumina sérica, como por exemplo, Alb-1 ou uma versão humanizada da Alb-1, tal como Alb-8, cuja referência é feita, por exemplo, no documento WO 06/122787). Meios alternativos para estender a meia-vida, que também são englobados pela presente invenção incluem, por exemplo, peguilação (PEG) como amplamente conhecido na técnica, incluindo sítio específico ou peguilação aleatória, de preferência peguilação de sítio específico. PEG pode ser utilizado com um peso molecular superior a 5000, por exemplo, entre 10.000 e 200.000, preferencialmente na faixa entre 20.000 e 100.000. Em qualquer aspecto da extensão da semi-vida, prevê-se que a atividade do polipeptídeo, tal como aqui definido não é comprometida, por exemplo, retém pelo menos 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% da atividade do mesmo polipeptídeo sem a extensão da semi-vida. A atividade pode se relacionar, por exemplo, a ligação para o antígeno alvo, e/ou a potência em um bioensaio. Uma pessoa versada na arte avaliará que a escolha da tecnologia de extensão da meia-vida é adequada na medida em que não aumenta, ou mesmo diminui a imunogenicidade.

5.5.1 Tampão

[00110] A formulação da invenção compreende um tampão selecionado a partir de pelo menos um tampão de citrato ou de fosfato, preferivelmente um tampão de citrato. Em uma modalidade particular, o tampão de citrato é preparado utilizando ácido cítrico monohidratado e citrato tri-sódio di- hidratado, por exemplo, 0,2154 g/L de ácido cítrico monohidratado e 5,5805 g/l citrato tri-sódio di-hidratado. Conforme determinado por medição de temperaturas de fusão em um exemplo não limitativo, estes tampões aumentam a estabilidade dos ligantes vWF, em comparação com outros tampões testados.

[00111] A formulação de acordo com a invenção compreende um tampão de citrato em uma concentração na faixa de 5-200 mM, p.ex. 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mM, de preferência 5 a 100 mM, mais preferencialmente 7,5 a 80 mM, ainda mais preferivelmente 10 a 50, por exemplo, 10, 15, 20, 25 ou 30 mM, e mais preferencialmente de 20 mM, em que cada valor é entendido por abranger opcionalmente um intervalo de ± 5 mm. A formulação de acordo com a invenção pode compreender um tampão de fosfato a uma concentração na faixa de 5 a 200 mM, p.ex. 5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 ou 200 mM, de preferência 5 a 80 mM, mais preferencialmente 7,5 a 60 mM, ainda mais preferivelmente 10 a 40, por exemplo, 10, 15, 20, 25 ou 30 mM, e mais preferencialmente de 10 mM, em que cada valor é entendido por abranger opcionalmente um intervalo de ± 5 mm. Deve entender-se que uma concentração mais baixa do tampão tem um efeito sobre a osmolaridade final, e, correspondentemente, sobre os solutos adicionais que podem ter que ser adicionados.

[00112] O pH da formulação da presente invenção está na faixa de 5,0 a 7,5, em que cada valor é compreendido por abranger uma faixa de ± 0,2. Exemplos específicos de valores de pH preferido para as formulações da invenção podem ser selecionados a partir da lista não limitativa compreendendo pH de 5,0, 5.5, 5,8, 6,0, 6,2, 6,5, 6,7, 7,0, 7,1, 7,2 ou 7,5, de preferência 6,0 a 7,0, mais preferencialmente 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9, por exemplo, 6,5, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 0,2.

[00113] Inesperadamente, os tampões de citrato e fosfato sobrepuseram os valores de pH, por exemplo, dos tampões de histidina e Tris-HCl, favorecendo a estabilidade.

[00114] O pH mais vantajoso dependerá do tampão compreendido na formulação. Assim, a invenção se refere particularmente a uma formulação compreendendo um tampão de fosfato, que preferencialmente tem um pH na faixa de 6,5 a 7,5, preferencialmente 6,9, 7,0, 7,1, por exemplo, 7.1.

[00115] Mostrou-se que uma formulação compreendendo um tampão de citrato foi formidavelmente adequada para o armazenamento e uso. No entanto, em contraste com o conhecimento convencional, as formulações líquidas que compreendem um tampão de citrato eram mais estáveis a um pH de cerca de 6,0, enquanto que as formulações liofilizadas compreendendo um tampão de citrato eram mais estáveis com um pH de cerca de 6,5. Assim, a presente invenção se refere a uma formulação compreendendo um tampão de citrato, que tem de preferência um pH entre 6,0 e 7,0, mais preferencialmente 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8 ou 6,9, por exemplo, 6,5, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 0,2.

5.5.2 Concentração

[00116] As formulações da invenção compreendem os ligantes vWF, tais como aqui definidos, em particular, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina ou polipeptídeos que imunoglobulina em uma concentração que é adequada para fins clínicos, que inclui as concentrações utilizadas em soluções de estoque para diluição prévia para usar no paciente. Além da melhoria da estabilização, as formulações da presente invenção permitem que concentrações elevadas de ligantes vWF, por exemplo, ISVDs ou polipeptídeo. Em particular, as formulações da invenção permaneceram fisicamente estáveis, isto é, a ausência de turvação e/ou de formação de pequenas partículas, tal como confirmado por inspeção visual, microscopia, SE-HPLC e SDS. O armazenamento em temperaturas elevadas durante períodos prolongados e ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, aparentemente, não afetam a estabilidade física dos ligantes vWF nestas formulações.

[00117] As concentrações típicas de agente ativo, por exemplo, ligantes vWF ou polipeptídeo da invenção, em formulações da presente invenção compreendem exemplos não limitativos de concentrações na faixa de 0,1 a 80 mg/ml, preferivelmente 1 a 70 mg/mL, 5 a 60 mg/ml, 7,5 a 50 mg/ml, ou 10 a 40 mg/ml, tais como 5, 7,5, 10, 12,5, 15, 17,5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou 60 mg/mL, preferivelmente 12,5 mg/mL ou 10 mg/mL, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 20% (por exemplo, um valor de 10 engloba opcionalmente uma faixa de 8 a 12 mg/mL).

5.5.3 Excipientes

[00118] As formulações de acordo com a invenção pode também compreender opcionalmente um ou mais excipientes. O termo "excipiente" como aqui utilizado se refere a uma substância inerte, que é comumente utilizada como um diluente, veículo, conservante, lioprotetor, aglutinante ou agente de estabilização para os compostos que conferem uma propriedade física benéfica a uma formulação. Aqueles versados na arte estão familiarizados com excipientes adequados para fins farmacêuticos, que podem ter funções específicas na formulação, tais como lioprotecão, estabilização, preservação, e etc. Normalmente, estabilizadores e conservantes são bem conhecidos para aqueles versados na arte (ver, por exemplo, WO 2010/077422). Veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nestas composições incluem, mas não estão limitados aos permutadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina do soro humano, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos saturados vegetais, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato dissódico, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polioxipropileno de polietileno, polietilenoglicol e lanolina. Em concretizações vantajosas, o excipiente pode ser um ou mais selecionados entre a lista que consiste de NaCl, trealose, sacarose, manitol ou glicina.

[00119] Na apreciação da invenção, os versados na arte podem facilmente determinar as concentrações adequadas dos excipientes a serem adicionados às formulações. Em modalidades exemplificativas, NaCl tem uma concentração na faixa de 10 a 500 mM, tais como 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ou 500 mM, de preferência 50 a 150 mM, por exemplo, 75 ou 140 mM, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 5 mM; e/ou manitol tem uma concentração de 1 a 10%, de preferência 2 a 4%, por exemplo, 2, 3 ou 4% (w/w), em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 0,5%; e/ou tem uma concentração de sacarose de 1 a 15%, preferencialmente 2 a 12% ou 4 a 10%, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9% (w/w), e mais preferencialmente 7%, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 0,5%; e/ou glicina tem uma concentração na faixa de 10 a 500 mM, tal como 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 250 ou 500 mM, preferivelmente 50 a 400 mM, 75 a 300 mM, 100 a 250 mM, por exemplo, 140 ou 200 mM, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 5 mm; e/ou trealose tem uma concentração na faixa de 10 a 500 mM, tal como 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 100, 150, 250 ou 500 mM, de preferência 100 a 300 mM, 150 a 280 mM, por exemplo, 160 mM ou 260 mM, em que cada valor é compreendido por englobar opcionalmente um intervalo de ± 5 mm.

[00120] Em uma modalidade preferida, as formulações de acordo com qualquer aspecto da presente invenção são isotônicas em relação ao sangue humano. Soluções isotônicas possuem a mesma pressão osmótica que o plasma sanguíneo, e assim podem ser administradas por infusão intravenosa em um sujeito, sem alterar a pressão osmótica do plasma do sangue do sujeito. Tonicidade pode ser expressa em termos de pressão osmótica, que pode ser uma osmolaridade teórica, ou de preferência uma osmolaridade determinada experimentalmente. Tipicamente, a osmolaridade estará na faixa de 290 ± 60 mOsm/kg, preferencialmente 290 ± 20 mOsm/kg.

[00121] Assim, na seleção de excipientes (se houver) da pessoa versada na arte considerará a concentração do tampão e as concentrações de um ou mais excipientes e, de preferência chegará a uma formulação com uma osmolaridade nos intervalos especificados acima. Aqueles versados na arte estarão familiarizados com os cálculos para estimar a osmolaridade (ver, por exemplo, WO 2010/077422). Se necessário, aqueles versados na arte também podem incluir ainda um composto para ajustar a osmolaridade da formulação. Os compostos excipientes acima mencionados, e/ou um ou mais entre sorbitol, metionina, dextrose, inositol, arginina ou cloridrato de arginina.

[00122] Tem sido demonstrado que uma formulação compreendendo sacarose era particularmente adequada para manter a estabilidade física, por exemplo, durante armazenamento e congelamento-descongelamento dos polipeptídeo. Por conseguinte, a presente invenção se refere a formulações compreendendo cerca de 5 a 9%, mais preferivelmente 6 a 8%, e ainda mais preferencialmente de 7% de sacarose, em que cada valor é entendido como, opcionalmente, englobando uma faixa de ± 0,5%.

[00123] As formulações da invenção podem também compreender compostos que são especificamente úteis para proteger o polipeptídeo da invenção durante a liofilização. Tais compostos também são conhecidos como lioprotetores, e são bem conhecidos para os versados na arte. Os exemplos específicos incluem, mas não estão limitados aos açúcares, tais como sacarose, sorbitol ou trealose; aminoácidos, tais como glutamato, em particular, glutamato monossódico ou histidina; betaína, sulfato de magnésio, álcoois de açúcar, propileno glicol, polietileno glicóis e suas combinações. Pela apreciação da invenção, a quantidade necessária de tal composto a ser adicionado pode ser facilmente determinada pelos versados na arte tendo em consideração a estabilidade da formulação na forma líquida e, quando submetida à liofilização. As formulações que são particularmente adequadas para liofilização podem ainda compreender agentes de volume. Os agentes adequados são bem conhecidos para os versados na arte. Demonstrou-se que uma formulação compreendendo sacarose não foi apenas particularmente adequada para manter a estabilidade física, por exemplo, durante o armazenamento e a congelamento-descongelamento dos ligantes vWF, mas também como lioprotetor.

5.5.4 Detergente

[00124] Em outra modalidade da invenção, a formulação de acordo com qualquer aspecto da invenção pode ainda compreender um detergente ou tensoativo. Detergentes ou tensoativos adequados para utilização com a invenção incluem, mas não estão limitados aos ésteres de ácido graxo sorbitano polioxietileno, por exemplo, polissorbato-20, -40, -60, -65, - 80 ou -85. Marcas comuns para polisorbatos incluem Alkest, Canarcel e Tween. Aqueles versados na arte conhecem outros exemplos não limitativos de detergentes, tais como aqueles, por exemplo, listados no WO 2010/077422. Em uma modalidade preferida, o detergente é um detergente não iônico. Mais especificamente, o detergente é o polissorbato-80, também designado como Tween-80 a seguir. Os versados na arte podem facilmente determinar uma concentração adequada de detergente para uma formulação da invenção. Normalmente, a concentração será tão baixa quanto possível, mantendo ao mesmo tempo os efeitos benéficos dos detergentes, por exemplo, um efeito de estabilização em condição de estresse de corte, por exemplo, a agitação, que reduz a agregação dos agentes ligantes vWF formulados. Em modalidades exemplificativas, não limitativas, a concentração do detergente pode estar na faixa de 0,001 a 0,5%, por exemplo, 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4% ou 0,5%, de preferência em uma concentração entre 0,01 e 0,05%, mais preferivelmente entre 0,01 e 0,02%, por exemplo, 0,01% (v/v).

5.5.5 Combinações

[00125] As várias modalidades como descritas acima nas Secções 5.5.1 a 5.5.4 podem ser combinadas em formulações da invenção sem limitações. Por exemplo, as faixas de valores usando uma combinação de qualquer um dos valores acima citados como limites superiores e/ou inferiores destinam-se a ser incluídos. No entanto, os exemplos preferidos não limitativos de formulações incluem formulações em que o tampão é um tampão de citrato com pH a cerca de 6,5, de preferência a uma concentração de 20 mM, e a formulação compreende ainda sacarose, de preferência a uma concentração de cerca de 7% (w/v), e, opcionalmente, compreende ainda um detergente não iônico, tal como Tween-80, de preferência a uma concentração de 0,01% (v/v).

5.6 Processamento adicional

[00126] Tal como referido, qualquer das formulações acima pode ser também processada, por exemplo, por liofilização, secagem por atomização ou congelamento, por exemplo, congelamento em massa. O produto processado resultante tem caraterísticas derivadas a partir da formulação líquida de partida, como definido acima. Sempre que necessário, agentes adicionais podem ser incluídos para processamento adicional, tal como, por exemplo, lioprotetores, etc.

5.6.1 Congelamento

[00127] Em alguns casos, as formulações que contêm ligantes vWF são congelados para armazenamento. Por conseguinte, é desejável que a formulação seja relativamente estável sob estas condições, tais como ciclos de congelamento e descongelamento (FT). Um método para determinar a adequação de uma formulação é submeter a amostras da formulação a, pelo menos dois, por exemplo, três, quatro, cinco, oito, dez ou mais ciclos de congelamento (em, por exemplo, -20°C ou -70°C) e descongelamento (por exemplo, por descongelamento rápido em um em um banho de água de 25°C ou degelo lento entre +2°C a +8°C), a determinação da recuperação de massa do produto de origem e a presença e/ou quantidade de espécies LMW e/ou espécies HMW que se acumulam após os ciclos de FT e comparando-a com a quantidade de espécies de LMW ou espécies HMW presentes na amostra antes do processo FT, por exemplo, por SE-HPLC. Um aumento nas espécies LMW ou HMW indica a diminuição da estabilidade.

5.6.2 A liofilização

[00128] As formulações podem ser armazenadas após a liofilização. Portanto, uma formulação de teste para a estabilidade do componente de polipeptídeo da formulação após liofilização é útil para determinar a adequação de uma formulação. O método é semelhante ao que se descreveu acima para o congelamento, a não ser que a amostra da formulação seja liofilizada em vez de congelada, reconstituída ao seu volume original, e testada para a presença de espécies LMW e/ou espécies HMW. A amostra da formulação liofilizada é comparada com uma amostra da formulação correspondente que não foi liofilizada. Um aumento na espécie LMW ou HMW na amostra liofilizada em comparação com a amostra correspondente indica diminuição da estabilidade na amostra liofilizada. Em geral, um protocolo de liofilização inclui o carregamento de uma amostra em um liofilizador ou criodessecador, um período pré- arrefecimento, iniciação de vácuo, aumentar a temperatura de secagem primária, temperatura de secagem, aumentar a temperatura de secagem secundária, secagem secundária, e tamponamento da amostra. Embora o processo de liofilização seja bem conhecido na técnica, vários fatores determinam as caraterísticas de criodessecagem de uma amostra, incluindo: a temperatura de transição vítrea (Tg') e temperatura de colapso (Tc). Parâmetros adicionais que podem ser selecionados por um protocolo de liofilização incluem vácuo (por exemplo, em microns) e temperatura do condensador.

[00129] Taxas de aumento de temperatura apropriada situam-se entre cerca de 0,1°C/min. a 2°C/min., por exemplo, 0,1°C/min. a 1,0°C/min., 0,1°C/min. a 0,5°C/min., 0,2°C/min. a 0,5°C/min., 0,1°C/min., 0,2°C/min., 0,3°C/min., 0,4°C/min., 0,5°C/min., 0,6°C/min., 0,7°C/min., 0,8°C/min., 0,9°C/min., e 1,0°C/min. Temperaturas de armazenamento adequadas durante o congelamento para um ciclo de liofilização são, em geral, desde cerca de -55°C a -5°C, -25°C a -5°C, -20°C a -5°C, -15°C a -5°C, -10°C a -5°C, -10°C, -11°C, -12°C, -13°C, -14°C, 15°C, -16°C, -17°C, -18°C, -19°C, -20°C, -21°C, -22°C, -23°C, -24°C ou -25°C. Temperaturas de armazenamento podem ser diferentes para a secagem primária e secagem secundária, por exemplo, a secagem primária pode ser efetuada a uma temperatura mais baixa do que a secagem secundária. Em um exemplo não limitativo de secagem primária pode ser executada a 0°C ou, alternativamente, a +5°C e a secagem secundária a +25°C. Em alguns casos, um protocolo de recozimento é usado durante o congelamento antes de iniciar o vácuo. Em tais casos, o tempo de recozimento deve ser escolhido e a temperatura é geralmente superior à temperatura de transição vítrea da composição. Em geral, o tempo de recozimento é de cerca de 2 a 20 horas, de cerca de 3 a 19 horas, de cerca de 2 a 10 horas, de cerca de 3 a 5 horas, de cerca de 3 a 4 horas, de cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 5 horas, sobre 8 horas, cerca de 10 horas, cerca de 12 horas, cerca de 15 horas ou cerca de 19 horas. A temperatura para recozimento que é geralmente de cerca de -35°C a cerca de -5°C, por exemplo, de cerca de -25°C até cerca de -8°C, cerca de -20°C até cerca de -10°C, cerca de -25°C, cerca de -20°C, cerca de -15°C, cerca de 0°C,ou cerca de -5°C. Em alguns casos, a temperatura de hibridação é geralmente a partir de -35°C a +5°C, por exemplo, de -25°C a - 8°C, -20°C a -10°C, -25°C, -20°C, -15°C, 0°C, +5°C.

[00130] A estabilidade das formulações aqui descritas pode ser testada utilizando uma variedade de parâmetros de liofilização, incluindo: temperaturas de armazenamento de secagem primária de -25°C a +30°C, e as durações de secagem secundária de 2 horas a 33 horas de 0° a 30°C. A temperatura de secagem secundária deve ser tão alta quanto possível, sem provocar a degradação do ingrediente farmacêutico ativo.

[00131] Um excipiente a ser utilizado em uma formulação da presente invenção deve preferencialmente satisfazer um ou mais dos seguintes parâmetros: ser farmacologicamente inerte; ser compatível com os requisitos de processamento; ser bem tolerado pelo paciente; não ser prejudicial para o material ativo; fornecer um produto absorvível solúvel; proporcionar um produto estável durante o armazenamento; e fornecer um produto comercialmente aceitável.

[00132] Em uma modalidade, a formulação da presente invenção é preparada por criodessecagem, por exemplo, como descrito na Figura 1 ou na Tabela 14.

[00133] Foi demonstrado que a liofilização das formulações à base de citrato/sacarose melhora drasticamente a estabilidade dos ligantes vWF. Em particular, as formulações à base de citrato/sacarose, essencialmente, previnem modificações químicas que ocorrem na forma líquida, mas com a exceção de pequenas quantidades de formação de piroglutamato. Inesperadamente, baixando a concentração de citrato e ao mesmo tempo aumentando a concentração de sacarose melhorou a estabilidade química, por exemplo, diminuindo a formação de piroglutamato. O ligante vWF demonstrou ser robusto após a liofilização do produto em temperaturas extremas. De fato, o perfil de estabilidade foi idêntico para o material que tinha sido preparado utilizando uma variedade de ciclos de criodessecagem.

[00134] Em geral, um ciclo de liofilização pode ser executado a partir de 10 horas a 100 horas, por exemplo, 20 horas a 80 horas, 30 horas a 70 horas, 40 horas a 60 horas, 45 horas a 50 horas, e 50 horas a 66 horas.

[00135] Em um exemplo não limitativo, uma formulação de 20 mM de citrato, 7% de sacarose, 0,01% de Tween-80, pH 6,5, a uma concentração de proteína de 12,5 mg/ml de ligante vWF foi formulada e liofilizada em grandes quantidades. Exemplos não limitativos da faixa de temperaturas para o armazenamento de uma formulação da presente invenção é de cerca de -20°C a cerca de +50°C, por exemplo, cerca de -15°C a cerca de +40°C, cerca de -15°C a cerca de + 30°C, cerca de -15°C a cerca de +20°C, cerca de +5°C a cerca de +25°C, cerca de +5°C a cerca de +20°C, cerca de +5°C a cerca de +15°C, cerca de +2°C a cerca de + 12°C, cerca de +2°C a cerca de +10°C, cerca de +2°C a cerca de +8°C, cerca de +2°C a cerca de +6°C, ou cerca de +2°C, +3°C, +4°C, +5°C, +6°C, +7°C, +8°C, +10°C, +15°C, +25°C, +30°C ou +40°C. Não obstante as temperaturas de armazenagem, em certos casos, as amostras são estáveis sob as mudanças de temperatura que podem ocorrer durante condições de armazenagem e de transporte transitórias que podem ser previstas para tais composições.

[00136] Foi estabelecido que, trabalhando com as formulações da invenção, tal como aqui definido, é possível obter um pó seco resultante que exibe um tamanho de partícula adequado para a retenção confortável e uma rápida dissolução do material ativo. A formulação seca de acordo com a invenção compreende partículas que permanecem estáveis e uniformes em todo o processamento, acabamento final, armazenagem e distribuição. A formulação é estável em armazenamento e de fluxo livre, não apresenta problemas quando dispensada para o seu recipiente final e é simples de ser administrada pelo paciente.

5.6.3 Secagem por atomização

[00137] Em alguns casos, uma formulação é secada por atomização, em seguida, armazenada. A secagem por atomização é realizada usando métodos conhecidos na arte, e pode ser modificado para utilizar secagem por atomização líquida ou congelada (por exemplo, utilizando métodos, tais como os da Niro Inc. (Madison, WI), Upperton Particle Technologies (Nottingham, Inglaterra), ou publicação de patente US Nos. 2003/0072718 e 2003/0082276), ou Buchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY).

5.6.4 Diluente

[00138] As formulações liofilizadas tal como aqui descritas podem ser reconstituídas quando necessário por mistura da forma liofilizada com um diluente adequado para ressolubilizar os componentes originais da formulação até uma concentração desejada. O termo "diluente" tal como aqui utilizado se refere a um veículo farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um ser humano) solvente para alterar ou alcançar uma concentração apropriada, tal como aqui descrito. Exemplos de diluentes incluem, mas não estão limitados à água estéril (por exemplo, WFI, água Milli-Q), soro fisiológico, glucose, dextrose, Ringer e soluções aquosas de tampão.

5.7 Composições farmacêuticas

[00139] As formulações da presente invenção são preferencialmente adequadas para o uso em métodos de terapia do corpo animal ou humano. Assim, a invenção se refere a composições farmacêuticas ou de diagnóstico que compreende uma formulação de polipeptídeo de acordo com qualquer aspecto da presente invenção ou que possa ser obtida por qualquer método ou processo da invenção.

[00140] As formulações da invenção são preferivelmente formulações farmacêuticas. Em particular, as formulações são adequadas para administração parentérica a um ser humano, por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intradérmica ou intraperitoneal, de preferência por via intravenosa ou subcutânea. A administração compreende qualquer forma de administração de uma formulação líquida, em particular injeção. Outras formas de administração sistémica, por exemplo, através de dispositivos implantáveis, bombas de micro-infusão (opcionalmente implantável), e/ou formulações de liberação contínua (implantáveis, por exemplo, depósitos, géis, formulações de polímeros biodegradáveis) também estão dentro do âmbito da presente invenção. As composições farmacêuticas são estéreis e estáveis durante a fabricação e armazenamento, como produtos derivados/degradação dos ligantes vWF são indesejáveis em um cenário clínico. A composição também será de alta pureza, por exemplo, excluindo a presença de produtos bacterianos, tais como LPS. As formulações podem ser esterilizadas por qualquer meio adequado, por exemplo, filtração estéril, irradiação, suas combinações, e etc. De preferência, as composições farmacêuticas são adaptadas para administração parentérica (especialmente intravenosa, intra-arterial ou transdérmica). A administração intravenosa é considerada como sendo de particular importância. De preferência, o ligante vWF está sob a forma de uma forma parentérica, mais preferencialmente formas subcutâneas e intravenosas.

[00141] Para ser uma formulação farmacêutica apropriada, as formulações da presente invenção compreenderão, tipicamente, o polipeptídeo da invenção (isto é, o agente ativo) em uma proporção adequada para o volume. Por exemplo, para injeção subcutânea, a concentração do agente ativo pode ser maior, a fim de permitir que a dose farmacêutica necessária seja administrada em um volume menor, em comparação com uma formulação para injeção intravenosa. No entanto, em algumas modalidades a concentração do agente ativo será idêntica para a injeção subcutânea ou intravenosa, e podem estar nas faixas exemplificativas como aqui definidas.

[00142] Em algumas modalidades, as formulações da invenção podem compreender agentes adicionais, por exemplo, agentes ativos adicionais, excipientes, estabilizadores, conservantes, tais como agentes antimicrobianos, etc.

[00143] As formulações da invenção são, preferivelmente, em uma dose aplicada a um paciente na necessidade da mesma. No entanto, o modo particular de administração e a dosagem podem ser prescritos pelo médico assistente levando em conta as particularidades do paciente, especialmente a idade, peso, estilo de vida, nível de atividade, e condição médica geral tal como apropriado. Mais especificamente, ALX-0081 é administrado por via intravenosa ou por via subcutânea em doses com um intervalo de 24 h. Ainda mais preferencialmente, ALX-0081, é administrado por via intravenosa ou por via subcutânea em doses com um intervalo de 24 h após consideração da atividade da agregação, por exemplo, medida por RIPA, agregação plaquetária induzida pela ristocetina - (Favaloro EJ. Clin Haematol 2001; 14: 299-319) e/ou Ensaio de aglutinação de plaquetas de cofator de ristocetina - (Howard MA, Firkin BG. Ristocetin - a new tool in the investigation of platelet aggregation. Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 1971; 26: 362-9). Por exemplo, uma dose adicional não é administrada, se a atividade da agregação é calculada para ficar abaixo de 10%, medida por RIPA ou ficar abaixo de 20%, medida por RICO para as próximas 6 horas (inibição clinicamente relevante).

[00144] No entanto, em geral, a dosagem dos agentes ligantes vWF pode depender de vários fatores, tais como a eficácia e duração da ação do ingrediente ativo, espécies de sangue quente, e/ou sexo, idade, peso e condição individual do animal de sangue quente.

[00145] Normalmente, a dosagem é tal que uma dose única de um agente de ligação vWF, é, por exemplo, estimada com base nos resultados in vitro, ou por exemplo, com base em resultados de um estudo de escalonamento de dose para testar a toxicidade subcrônica em macacos cinomolgos. Com base em tal conjunto de dados pré-clínicos, o escalonamento da dose de partida e subsequente para um ligante vWF pode ser determinada. Por exemplo, uma dose pode ser de 0,5 a 50 mg, especialmente 1 a 30 mg, sendo administrada a um animal de sangue quente pesando aproximadamente 75 (+/-30) Kg (mas pode ser diferente, assim como para esta norma). Se desejar, esta dose também pode ser feita em várias doses, parciais, opcionalmente iguais ("mg" significa mg de drogas por mamíferos - incluindo o ser humano - a ser tratado).

[00146] A dose acima mencionada - quer seja administrada em dose única (que é uma modalidade) ou em várias doses parciais - pode ser repetida, tal como mencionado acima, por exemplo, uma vez a cada seis horas, uma vez a cada 12 horas ou uma vez por dia. Em outras palavras, as composições farmacêuticas podem ser administradas em regimes que variam de uma terapia contínua de 6 em 6 horas à terapia de dosagem com intervalos mais longos.

[00147] Preferencialmente, os agentes ligantes vWF são administrados em doses que estão na mesma ordem de grandeza que as usadas no tratamento adjunto em doentes com necessidade de PCI, tal como aqui sugerido para ALX-0081. Por exemplo, para os 12A02H1 contendo ligantes vWF preferidos, por exemplo, ALX-0081 e variantes funcionais dos mesmos, as doses de ligantes vWF na faixa de cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, de preferência de cerca de 1 a cerca de 35 mg, ou de cerca de 2 a cerca de 30 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 25 mg ou de cerca de 4 a cerca de 20 mg, ou de cerca de 5 até cerca de 17,5 mg, ou mesmo de cerca de 6 a cerca de 16 mg, ou de cerca de 7,5 a cerca de 15 mg, ou mesmo de cerca de 10 até cerca de 14 mg, mais preferencialmente cerca de 10, cerca de 12,5 ou cerca de 13,8 mg, podem ser utilizadas para o tratamento agudo em pacientes humanos.

[00148] Formulações na forma de unidades de dose única contêm preferencialmente desde cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, de preferência de cerca de 1 a cerca de 35 mg, ou de cerca de 2 a cerca de 30 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 25 mg ou de cerca de 4 a cerca de 20 mg, ou de cerca de 5 até cerca de 17,5 mg, ou mesmo de cerca de 6 a cerca de 16 mg, ou de cerca de 7,5 a cerca de 15 mg, ou mesmo de cerca de 10 até cerca de 14 mg, mais preferencialmente cerca de 10, cerca de 12,5 ou cerca de 13,8 mg e as formulações que não estão em forma de unidades de dose única contêm preferencialmente cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, de preferência de cerca de 1 a cerca de 35 mg, ou de cerca de 2 a cerca de 30 mg, ainda mais preferivelmente de cerca de 3 a cerca de 25 mg ou de cerca de 4 a cerca de 20 mg, ou de cerca de 5 até cerca de 17,5 mg, ou mesmo de cerca de 6 a cerca de 16 mg, ou de cerca de 7,5 a cerca de 15 mg, ou mesmo de cerca de 10 até cerca de 14 mg, mais preferencialmente cerca de 10, cerca de 12,5 ou cerca de 13,8 mg do ingrediente ativo.

[00149] As preparações farmacêuticas para administração parentérica são, por exemplo, aquelas em formas de unidade de dosagem, tais como ampolas. Elas são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de processos convencionais de mistura, dissolução ou liofilização. As formulações parentéricas são especialmente fluidos injetáveis que são eficazes em várias maneiras, tais como no local de PCI, intra-arterialmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intranasalmente, intradermicamente, subcutaneamente ou preferencialmente por via intravenosa. Tais fluidos são preferencialmente soluções aquosas isotônicas ou suspensões que podem ser preparadas antes da utilização, por exemplo, a partir de preparações liofilizadas ou concentradas que contenham o ingrediente ativo sozinho ou juntamente com um veículo farmaceuticamente aceitável. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes umidificadores e/ou emulsionantes, solubilizantes, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões.

[00150] As formulações adequadas para aplicação transdérmica incluem uma quantidade eficaz do ingrediente ativo com o veículo. Veículos vantajosos incluem solventes absorvíveis farmacologicamente aceitáveis para auxiliar a passagem através da pele do hospedeiro. Caracteristicamente, os dispositivos transdérmicos estão na forma de uma bandagem compreendendo um membro de apoio, um reservatório contendo o composto opcionalmente com veículos, opcionalmente uma barreira controladora da taxa de entregar do ingrediente ativo na pele do hospedeiro em uma taxa controlada e predeterminada por um período de tempo prolongado, e meios para prender o dispositivo à pele.

[00151] A tabela a seguir fornece alguns exemplos não limitativos de formulações à base de tampão de citrato e fosfato da presente invenção. Todas as formulações podem ser ajustadas para uma osmolaridade de 290±6 0mOsm/kg por adição de um excipiente adequado, se desejado. As formulações podem compreender qualquer um ou mais dos polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 a 19, em especial SEQ ID NO: 1.

[00152] As concentrações de tampão nesta tabela são compreendidos por opcionalmente, englobar ±5 mM. Os valores de pH são compreendidos por opcionalmente, englobar ±0.2. Cada um dos tampões acima pode ser combinado com um ou mais excipientes selecionados a partir de, por exemplo, NaCl em uma concentração de, por exemplo, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ou 500 mM; manitol em uma concentração de, por exemplo, 2, 3 ou 4% (w/v); glicina em uma concentração de, por exemplo, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ou 500 mM; trealose em uma concentração de, por exemplo, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 100, 150, 250 ou 500 mM e sacarose em uma concentração de, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9% (w/v), e/ou um agente tensoativo, por exemplo, Tween-80 em uma concentração de 0,001%, 0,002%, 0,003%, 0,004%, 0,005%, 0,01%, 0,015%, 0,02%, 0,025%, 0,03%, 0,035%, 0,04%, 0,045%, 0,05%, 0,1 %, 0,2%, 0,3%, 0,4% ou 0,5% (v/v).

5.8 Efeitos da invenção

[00153] A invenção fornece formulações estáveis de ligantes vWF, por exemplo, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina como aqui definido, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 a 19, em especial SEQ ID NO: 1. "Estável" geralmente significa que os domínios variáveis únicos da imunoglobulina não sofrem alterações físicas ou químicas significativas por armazenagem durante períodos prolongados de tempo, por exemplo, 1 mês a 36 meses, mesmo se forem expostos a uma ou mais estresses químicas ou físicas, tais como temperaturas elevadas (igual ou superior a +25°C), ou estresse físico, tais como vibração ou agitação. Mais em particular, "estável" significa que após a armazenagem durante períodos prolongados (como definido), sob condições (como definido) existe apenas uma formação limitada (como definido) de um ou mais dos produtos de degradação, por exemplo, derivados (fragmentos) de baixo peso molecular (LMW) dos polipeptídeos da invenção; e/ou derivados químicos ou modificações como, por exemplo, variantes de piroglutamato; e/ou derivados (oligômeros ou polímeros) de alto peso molecular (HMW) formados, por exemplo, por agregação.

[00154] A pessoa versada na arte está bem familiarizada com as técnicas para avaliar o tamanho da proteína, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho HPLC ou para avaliar a formação de derivados químicos, por exemplo, HPLC de fase reversa. A pessoa versada na arte também está familiarizada com os aparelhos e ferramentas de software, normalmente usados para realizar tais análises. Por exemplo, aqueles versados na arte sabem que o software para analisar cromatográfica, por exemplo, é executado em termos da área do pico relativo. Exemplos incluem (mas não estão limitados a) Agilent 1200 HPLC system equipado com ChemStation software (Agilent Technologies, Palo Alto, USA, Rev B) ou Dionex Ultimate 3000 HPLC system equipado com Chromeleon software (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8).

[00155] As técnicas gerais que podem ser usadas para avaliar a estabilidade de uma proteína, por exemplo, um domínio variável único de imunoglobulina, incluem dispersão de luz estática, filtração de fluxo tangencial, espectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier, dicroísmo circular, desnaturação da proteína induzida pela ureia, fluorescência intrínseca do triptofano e/ou proteína ligadora de ácido 8- anilino-1-naftaleno-sulfônico. Além disso, a formulação da presente invenção mostra pequena ou nenhuma perda de potência/atividade biológica no decurso do armazenamento e/ou sob a influência de um ou mais estresses como aqui definido. Atividade e/ou potência biológica pode ser determinado, por exemplo, como descrito no documento WO 2006/122825.

5.8.1 Estabilidade Térmica

[00156] As formulações da presente invenção são caraterizadas por fornecer um elevado fornecimento de estabilidade térmica aos ligantes vWF, por exemplo, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina como aqui definido. A estabilidade térmica pode ser avaliada, por exemplo, através da determinação da temperatura de fusão (Tm). As técnicas adequadas para a determinação da temperatura de fusão são conhecidas e incluem, por exemplo, um ensaio de desvio térmico (TSA), por exemplo, tal como aqui descrito. Mais especificamente, as formulações da presente invenção conduzem a um aumento da Tm para os domínios variáveis únicos da imunoglobulina, tal como determinado pela TSA em comparação com outras formulações. Este efeito é exemplificado na Tabela 1 da seção experimental.

[00157] Como pode ser verificado na seção experimental, uma elevada estabilidade térmica, ou seja, alta Tm pode ser tomada como uma indicação de estabilidade de armazenamento.

[00158] De acordo com a presente invenção, as formulações da presente invenção têm uma influência positiva na Tm em um amplo intervalo de valores de pH, por exemplo, entre 6,0 e 7,0 para o tampão de citrato, e 6,5 a 7,5 para o tampão de fosfato. O efeito mais vantajoso na Tm pode ser observado para tampão de citrato em pH 6 a 7, e em particular para pH 6,5±0,2 e tampão de fosfato em pH 6,5 a 7,5, em particular pH 7,1±0,2.

[00159] A adição de excipientes pode ter outro efeito positivo ou negativo sobre a Tm (Tabela 1). Por exemplo, a trealose pode aumentar Tm (no contexto de um tampão particular), por exemplo, entre 150 mM e 300 mM. Também manitol ou sacarose teve um efeito positivo claro sobre a Tm. Estes excipientes podem encontrar utilização em modalidades particulares da invenção, por exemplo, as formulações em que um agente de volume ou lioprotetores são vantajosos. Estas modalidades exemplificativas não excluem a utilização de lioprotetores ou agentes de volume mais conhecidos, quer isoladamente quer em combinação com manitol ou sacarose.

[00160] Como evidenciado pela seção experimental da presente descrição, a TM como determinada por TSA serve como um indicador valioso para a estabilidade dos ligantes vWF, por exemplo, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina da invenção.

5.8.2 Estabilidade

[00161] As formulações da invenção são caraterizadas por uma elevada estabilidade no que diz respeito aos estresses mecânicos, tais como agitação, agitação ou cisalhamento. Um possível ensaio para avaliar a estabilidade sob o estresse mecânico é monitorar o sinal de dispersão de 500 nm em um espectrofluorímetro ou através de espectrofotometria de UV, por exemplo, a 340 nm. Um aumento na absorção de UV ou de dispersão reflete a formação de agregados. Quando os agregados são formados (HMW), o aumento ao longo do tempo segue uma curva linear para que uma inclinação (intensidade de dispersão/tempo ou unidades de absorbância/s) possa ser invenção são caraterizadas por uma inclinação de menos de 0,0006, por exemplo, menos do que 0,0005, por exemplo, entre 0 e 0,0004 (conforme, figuras 4 A e B).

[00162] As formulações que compreendem tampões de citrato são particularmente preferidas e tem um efeito positivo sobre a recuperação de proteína, por exemplo, após agitação, tal como definido acima. Por exemplo, a recuperação de massa é, pelo menos, 90%, 95%, 98% ou 100%. A recuperação de proteína é determinada em comparação com o teor total de proteína antes de estressar a amostra, por exemplo, por agitação. As formulações que compreendem os tampões fosfato resultam em uma recuperação de, pelo menos, 75%, 80%, 85% ou mesmo mais, após agitação, tal como definido acima.

[00163] Em uma concentração exemplificativa não limitativa de 5 mg/ml, as formulações da invenção, formam apenas agregados reversível em resposta a agitação, na ausência de Tween. Assim, as formulações da presente invenção evitam a formação de agregados irreversíveis sob estresse mecânico. Por conseguinte, em uma outra modalidade da invenção, as formulações da invenção podem compreender um detergente não iônico, tal como definido acima, por exemplo, Tween-80, por exemplo, em uma concentração, tal como definida acima, por exemplo, entre 0,01% e 0,02% (v/v). A adição do detergente pode melhorar ainda mais a estabilidade física da formulação. limitativa de 5 mg/ml, a adição do detergente pode prevenir a formação de agregados (reversível e irreversível), tal como determinado por exemplo, por monitorização dos sinais de dispersão a 500 nm em um espectrofluorímetro ou por espectrofotometria de UV (340 nm) (figuras 4A e B).

[00164] A estabilidade física das formulações da presente invenção também pode ser demonstrada por meio de SE-HPLC. Diferentes formulações, não limitativas, de domínios variáveis únicos da imunoglobulina da presente invenção podem resistir ao estresse mecânico, por exemplo, agitação, sem formar oligômeros (HMW) ou produtos de degradação (LMW). As formulações da invenção permanecem estáveis, sem degradação ou a oligomerização, tal como determinado, por exemplo, após 1,5 horas de agitação por meio de análise de SE-HPLC.

[00165] Nenhuma oligomerização ou degradação (por exemplo, como determinado por RP-HPLC (apenas degradação) ou o perfil de SE-HPLC) é detectada em qualquer uma das formulações. Assim, de acordo com uma modalidade preferida da invenção, as formulações compreendem um tampão de citrato e mostram uma recuperação de pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo cerca de 100%, por exemplo, sob as condições descritas acima, em que a recuperação é determinada, por exemplo, por RP-HPLC ou SE-HPLC, em comparação com uma amostra sem estresse. De um modo vantajoso, o excipiente no contexto de um tampão de citrato pode ser sacarose, e recuperado, tal como definido acima é de, pelo menos, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ou mesmo cerca de 100%.

5.8.3 Teste de estabilidade de formulações líquidas 5.8.3.1 Estabilidade de armazenamento

[00166] As formulações liquidas da presente invenção proporcionam uma boa estabilidade quando armazenadas, por exemplo, a uma temperatura de -70°C, -20°C, +5°C, +25°C ou +40°C, por exemplo, por 1 a 36 meses, tais como 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ou 36 meses. Os resultados mais vantajosos podem ser obtidos com formulações à base de tampão de citrato, tal como exemplificado na Tabela 5.

[00167] Aqueles versados na arte reconhecerão ainda que o armazenamento a +25°C, e mais em particularmente a +40°C, representam condições de armazenagem tensas. Tais condições devem aumentar e acelerar quaisquer sinais de instabilidade, por exemplo, instabilidade química ou física. Assim, o armazenamento relativamente curto, por exemplo, a +25°C ou +40°C, fornece uma boa indicação da estabilidade para a armazenagem em longo prazo em condições mais suaves (por exemplo, +5°C ou congelados).

5.8.3.2 Estabilidade de armazenamento em termos de recuperação de proteína

[00168] Por exemplo, as formulações da presente invenção proporcionam uma recuperação de proteína de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96, 97, 98, 99 ou mesmo cerca de 100% após o armazenamento a uma temperatura entre -70°C e +40°C. A recuperação da proteína pode ser determinada por qualquer meio conhecido para quantificar as proteínas, por exemplo, por RP- HPLC ou SE-HPLC, tal como exemplificado na Tabela 5, em comparação com uma amostra de referência se manteve a -70°C. Estes resultados podem ser observados, por exemplo, após a armazenagem na temperatura indicada por 1 mês, 1,5 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses ou até aos 36 meses.

5.8.3.3 Estabilidade de armazenamento em termos de derivados/produtos químicos de degradação

[00169] Além disso, as formulações da presente invenção minimizam a produção de derivados químicos, por exemplo, variantes de piroglutamato, inferior a 5,0% no tamanho do pico, tal como determinado, por exemplo, por RP-HPLC (ver Tabela 5). Neste tipo de análise, a área de um determinado pico é comparada com a área total do cromatograma, e uma área relativa é atribuída a cada pico. Uma pessoa versada na arte conhece meios de análise apropriados, por exemplo, um software adequado, para analisar os cromatogramas (exemplos não limitativos incluem Agilent 1200 HPLC sistema equipado com ChemStation software (Agilent Technologies, Palo Alto, USA, Rev B) ou Dionex Ultimate 3000 HPLC sistema equipado Chromeleon software (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, USA, V6.8). Assim, de preferência, a variante de piroglutamato contribui para uma área de pico inferior a 5%, de preferência inferior a 4,6%, por exemplo 4,5, 4,3, 4,2, 4,0 ou mesmo inferior a 3,8%, tal como determinado por RP-HPLC após o armazenamento em temperaturas entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C, por exemplo, após o armazenamento durante uma duração tal como definido acima, por exemplo, 1 mês.

[00170] As formulações da presente invenção também minimizar a oxidação, tais como a formação de produtos oxidados (conforme determinado, por exemplo, por RP-HPLC) ao longo de um período de armazenamento, tal como definido acima, por exemplo, 1 mês a uma temperatura entre -70°C e +40°C (cf. Tabela 5). Assim, as formulações da presente invenção resultam em variantes de oxidação com uma área de pico menor do que 3%, de preferência menor do que 2,7%, de preferência menor do que 2,5%, por exemplo, menor do que 2,3%, 2,2%, por exemplo, 2,0, ou ainda menor do que 1,7%, ou 1,5% após o armazenamento em temperaturas entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C, por exemplo, após o armazenamento durante uma duração tal como definido acima, por exemplo, 1 mês (por exemplo, tal como determinado por RP-HPLC).

5.8.3.4 Estabilidade de armazenamento em termos de oligomerização

[00171] As formulações da invenção preveem também a estabilidade de armazenamento, de tal modo que nenhum material oligomérico solúvel aparente seja formado (tal como definido, por exemplo, por SE-HPLC), em temperaturas de armazenamento entre -70°C e +40°C, após períodos de duração de armazenamento, tal como definido acima, por exemplo, 1 mês; ou menos do que 1%, de preferência inferior a 0,5%, por exemplo 0,3% de material oligomérico solúvel é formado (tal como definido, por exemplo, por SE-HPLC), em temperaturas de armazenamento entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C, após períodos de duração de armazenamento, tal como definido acima, por exemplo, 1 mês.

[00172] A presente invenção também tem o efeito de proporcionar um índice de agregação, tal como determinado por valores de absorbância [(100xA340)/(A280-A340)] que permanece abaixo de 0,15, de preferência abaixo de 0,1 após o armazenamento entre -70°C ou +40°C para períodos de duração de armazenamento, tal como definido acima, por exemplo, 1 mês.

5.8.3.5 Estabilidade de armazenamento como refletido na recuperação do produto principal

[00173] As formulações da presente invenção têm o efeito de que a área de pico do produto principal, tal como determinado, por exemplo, por RP-HPLC (cf. Tabela 5) é cerca de 90% após o armazenamento entre -70°C e +40°C após um período de armazenamento, tal como indicado acima, por exemplo, 1 mês; ou o pico do produto principal, tal como determinado, por exemplo, por RP-HPLC (cf. Tabela 5) é, pelo menos, 85%, ou mais, tal como 86%, 87% ou 88%. Mais preferivelmente, o pico principal é de 90%, 92% ou 95%, por exemplo, pelo menos 97%, mais preferencialmente de 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C após um período de armazenamento, tal como indicado acima, por exemplo, 1 mês; ou o pico do produto principal, tal como determinado, por exemplo, por SE-HPLC é pelo menos 85%, pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98% ou mesmo cerca de 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C, após um período de armazenamento, tal como indicado acima, por exemplo, 1 mês.

[00174] As formulações de acordo com a presente invenção também tem o efeito de que a área do pico principal como determinada por RP-HPLC após o armazenamento, por exemplo, a uma concentração de até 20 mg/mL, entre -70°C e +25°C, durante 1 a 3 meses permanece inalterada em comparação com a formulação antes da armazenagem, e representa pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% dos picos totais, em que a amostra de referência contém um pico principal de, por exemplo, 95%. Após o armazenamento a +40°C, durante 1 mês, a formulação da presente invenção mantém o pico principal como determinado por RP-HPLC de, pelo menos, 80%, 85% ou 90%; após armazenamento durante 2 meses de pelo menos 80%, ou 85%, e após armazenamento durante 3 meses a pelo menos 75% ou 80%.

[00175] Além disso, tal como determinado por cIEF, a formulação da presente invenção tem o efeito de proporcionar a recuperação do produto principal após o armazenamento a uma concentração de, por exemplo, até 20 mg/mL por entre 1 a 3 meses a uma temperatura entre -70°C e +40°C, que é comparável à da amostra de referência (formulação sem armazenamento, o pico principal é pelo menos 98%), por exemplo, o pico principal é, pelo menos, 85%, ou mais, tal como 86%, 87% ou 88%. Mais preferivelmente, o pico principal é de 90%, 92% ou 95%, por exemplo, pelo menos 97%, mais preferencialmente de 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C.

5.8.3.6 Estabilidade em condições de congelamento e descongelamento

[00176] Além de proporcionar a estabilidade das formulações em condições de armazenamento, que permanecem constantes ao longo do tempo (por exemplo, armazenamento a +5°C), ou incluir um único ciclo FT (por exemplo, armazenamento a -20°C ou - 70°C), um efeito adicional da invenção é a estabilidade em condições de ciclos FT repetidos. Cada transição entre o estado congelado e líquido e vice-versa impõe condições particularmente estressantes sobre os domínios variáveis únicos de imunoglobulina.

[00177] As formulações da invenção também têm o efeito de proporcionar boa estabilidade sob condições FT. Por exemplo, as formulações da invenção podem ser submetidas, por exemplo, a 10 ciclos FT entre -70°C e a temperatura ambiente (por exemplo, +25°C), ou -20°C e a temperatura ambiente. Os domínios variáveis únicos da imunoglobulina compreendidos nas formulações resistirão a essas condições sem deterioração significativa, como por exemplo, como determinado por RP-HPLC ou SE-HPLC. Foi avaliado o efeito de ciclos FT repetitivos em diferentes modalidades não limitativas de formulações da presente invenção, e revelam que em todos os casos a integridade química e física dos ligantes vWF, por exemplo, dos domínios variáveis únicos da imunoglobulina, foi preservada. A recuperação global foi na faixa entre 95 e 100%, de preferência pelo menos 95, 98 ou 99%. A proporção relativa dos diferentes picos manteve-se inalterada em comparação com um controle submetido a um único ciclo de FT.

[00178] Mais especificamente, em uma concentração entre 5 mg/mL e 20 mg/mL, 10 ciclos FT resultou em uma recuperação (como determinado na base, por exemplo, da área de pico total, ou seja UA do polipeptídeo, tal como determinado por RP-HPLC ou SE-HPLC, que é, pelo menos, 90%, 95%, 98% ou 100%, em que em uma modalidade particular, o perfil de RP-HPLC ou de SE- HPLC foi inalterado, em comparação com uma amostra de referência (1 ciclo FT).

5.8.3.7 Estabilidade em termos de potência

[00179] Uma pessoa versada na arte conhece vários modos para determinar a potência dos ligantes vWF, em particular os domínios variáveis únicos da imunoglobulina, mais especificamente polipeptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 19, por exemplo, SEQ ID NO: 1 (ver, por exemplo, a seção experimental do WO2006/122825, por exemplo, Exemplos 3 a 6, 18 e 19, ou a seção experimental do WO2009/115614).

[00180] Em uma modalidade, a potência do polipeptídeo da presente invenção pode ser determinada através da ligação ao seu antígeno através de um ensaio convencional, por exemplo, ELISA, Biacore, RIA, FACS, e etc.

[00181] A potência dos ligantes vWF permaneceram aceitáveis nas formulações da invenção como testado sob condição de estresse, ou seja, 4 semanas de armazenamento a +40°C.

5.8.3.8 Estabilidade em termos de compatibilidade

[00182] As formulações da presente invenção também são compatíveis com uma variedade de diferentes diluentes. Por exemplo, as formulações podem ser misturadas/diluídas com diluentes tais, sem afetar a estabilidade química e física dos domínios variáveis únicos da imunoglobulina.

[00183] Assim, as formulações da presente invenção também proporcionam estabilidade ao longo de uma ampla faixa de concentrações, tal como aqui definido.

5.8.3.9 Resumo dos efeitos estabilizadores

[00184] As formulações da presente invenção têm o efeito de manter a integridade física e química dos polipeptídeos da prolongado, por exemplo, para durações como definidas acima, a temperaturas entre -70°C e +25°C.

[00185] O armazenamento de domínios variáveis únicos de imunoglobina, tal como aqui definido, em particular, ALX-0081 em temperatura de -70°C durante 1 mês não influencia as suas caraterísticas físico-químicas para qualquer uma das formulações da invenção, em particular os exemplos não limitativos de tampões testados na Seção Experimental. O armazenamento não teve um efeito significativo sobre perfis RP-HPLC, SE-HPLC ou cIEF.

5.8.4 Teste de estabilidade de formulações liofilizadas

[00186] Além disso, a invenção proporciona formulações estáveis de ligantes vWF, por exemplo, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina como aqui definido, por exemplo, SEQ ID NOs: 1 a 19, de preferência a SEQ ID NO: 1, que são particularmente úteis para a liofilização. As formulações da invenção resultaram em uma melhor solubilidade e estabilidade de armazenamento após a liofilização.

5.8.4.1 Estabilidade de armazenamento

[00187] As formulações da invenção podem proporcionar uma boa estabilidade quando armazenadas depois da liofilização, por exemplo, a uma temperatura de -70°C, -20°C, +5°C, +25°C ou +40°C, por exemplo, por 1 a 36 meses, tais como 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ou 36 meses. Os resultados mais vantajosos podem ser obtidos com formulações à base de tampão de citrato, por exemplo, formulações 3 e 7 como exemplificado na seção experimental (por exemplo, boa formação em que não há sinais visuais de decomposição, figura 6). Uma pessoa versada na arte pode reconhecer que na discussão abaixo os valores preferidos refletem composições de tampão de citrato, por exemplo, tal como exemplificado na Tabela 8.

[00188] Os versados na arte também reconhecerão que o armazenamento a +25°C, e mais em particular +40°C, representam condições de armazenagem tensas. Tais condições devem aumentar e acelerar quaisquer sinais de instabilidade, por exemplo, instabilidade química ou física. Assim, o armazenamento relativamente curto, por exemplo, a +25°C ou +40°C, fornece uma boa indicação da estabilidade para a armazenagem em longo prazo em condições mais suaves (por exemplo, +5°C ou congelados).

5.8.4.2 Estabilidade de armazenamento em termos de recuperação de proteína

[00189] Por exemplo, as formulações da presente invenção proporcionam uma recuperação de proteínas após liofilização de pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 96, 97, 98, 99 ou mesmo cerca de 100% após o armazenamento a uma temperatura entre -70°C e +40°C. A recuperação da proteína pode ser determinada por qualquer meio conhecido para quantificar as proteínas, por exemplo, pelo índice, RP-HPLC ou SE-HPLC. Estes resultados podem ser observados, por exemplo, após o armazenamento em uma temperatura indicada por 1 a 36 meses, tal como 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ou 36 meses.

5.8.4.3 Estabilidade de armazenamento em termos de derivados/produtos químicos de degradação

[00190] Além disso, as formulações da presente invenção minimizam a produção de derivados químicos depois da liofilização, tal como confirmado por, por exemplo, SE-HPLC.

5.8.4.4 Estabilidade de armazenamento em termos de oligomerização

[00191] As formulações da invenção podem também prever a estabilidade de armazenamento, de tal modo que nenhum material oligomérico solúvel aparente seja formado (tal como definido, por exemplo, por SE-HPLC), em temperaturas de armazenamento entre -70°C e +40°C, após períodos de duração de armazenamento, tal como definido acima, por exemplo, 1 mês; ou menos do que 1%, de preferência inferior a 0,5%, por exemplo 0,3% de material oligomérico solúvel é formado (tal como definido, por exemplo, por SE-HPLC), em temperaturas de armazenamento entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C, após períodos de duração de armazenamento, tal como definido acima, por exemplo 1 a 36 meses, tal como 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ou 36 meses.

5.8.4.5 Estabilidade de armazenamento como refletido na recuperação do produto principal

[00192] As formulações da invenção podem também ter como efeito que, após liofilização o pico do produto principal, tal como determinado, por exemplo, por SE-HPLC (ver Tabela 18 e Tabelas 27 a 29) é de cerca de 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C após um período de armazenamento, tal como indicado acima, por exemplo, 1, 3, 6, 9, 12, 18 ou 24 meses; ou o pico do produto principal, tal como determinado, por exemplo, por SE-HPLC (ver Tabela 18 e Tabelas 27 a 29) é, pelo menos, 85%, ou mais, tal como 86%, 87% ou 88%. Mais preferivelmente, o pico principal é de 90%, 92% ou 95%, por exemplo, pelo menos 97%, mais preferencialmente 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C, por exemplo, +25°C após um período de armazenamento, tal como indicado acima, por exemplo, 1, 3, 6, 9, 12, 18 ou 24 meses; ou o pico do produto principal, tal como determinado, por exemplo, por SE-HPLC é pelo menos 85%, pelo menos 90%, de preferência pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 98% ou mesmo cerca de 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C, por exemplo, +40°C, após um período de armazenamento, tal como indicado acima, por exemplo, 1, 3, 6, 9, 12, 18 ou 24 meses.

[00193] As formulações de acordo com a presente invenção também tem o efeito de que, após a liofilização do pico principal como determinada por RP-HPLC, por exemplo, após o armazenamento a uma concentração de 12,5 mg/mL a entre 70°C e +40°C entre 1 e 12 meses permanecem inalteradas em comparação com a formulação antes da armazenagem, e representa pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 93% do picos totais, em que a amostra de referência contém um pico principal de, por exemplo, 93% (ver tabela 15). Durante o armazenamento, após liofilização a +40°C por até 12 meses, a formulação da presente invenção mantém o pico principal como determinado por RP-HPLC, por pelo menos, 91%, 92% ou 93%.

[00194] Além disso, tal como determinado por cIEF (cf. Tabelas 27 a 29), as formulações da presente invenção têm o efeito de proporcionar após liofilização a recuperação do produto principal após o armazenamento a uma concentração de, por exemplo, 12,7 mg/mL por entre 1 a 24 meses em uma temperatura entre -70°C e +40°C, que é comparável à da amostra de referência (sem formulação de armazenamento, o pico principal é, pelo menos, 96%), por exemplo, o pico principal é, pelo menos, 85%, ou mais, tal como 86%, 87% ou 88%. Mais preferivelmente, o pico principal é de 90%, 92%, 93%, 94%, 95% ou 96%, por exemplo, pelo menos 97%, mais preferencialmente de 100% após o armazenamento entre -70°C e +40°C.

5.8.4.6 Estabilidade sob condições de congelamento e descongelamento

[00195] As formulações da invenção também têm o efeito de proporcionar boa estabilidade após liofilização sob condições FT. Por exemplo, as formulações da invenção podem ser submetidas a, por exemplo, 5 ciclos FT entre -20°C e a temperatura ambiente (por exemplo, +25°C). Os domínios variáveis únicos da imunoglobulina compreendidos nas formulações resistirão a essas condições sem deterioração significativa, como por exemplo, como determinado por RP-HPLC ou SE-HPLC. Em todos os casos a integridade física e química dos ligantes vWF, por exemplo, os domínios variáveis únicos da imunoglobulina foram preservados. A recuperação global foi na faixa entre 95 e 100%, de preferência pelo menos 95, 98 ou 99% em comparação com uma amostra líquida de controle armazenada a -70°C.

[00196] Mais especificamente, a uma concentração de 16 mg/ml, 5 ciclos FT resultaram em uma recuperação (como determinado a partir, por exemplo, da superfície total, ou seja, UA) do polipeptídeo, tal como determinado por RP-HPLC ou SE-HPLC, que é menor do que, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100%; em que em uma modalidade particular, o perfil de RP-HPLC ou de SE-HPLC foi inalterado, em comparação com uma amostra de referência (amostra líquida de controle armazenada a -70°C) (cf. Tabela 12).

5.8.4.7 Estabilidade em termos de potência

[00197] Uma pessoa versada na arte conhece vários modos para determinar a potência dos ligantes vWF, em particular os domínios variáveis únicos da imunoglobulina, mais especificamente polipeptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 19, por exemplo, SEQ ID NO: 1 (ver, por exemplo, a seção experimental do WO2006/122825, por exemplo, Exemplos 3 a 6, 18 e 19, ou a seção experimental do WO2009/115614). A potência dos ligantes vWF após liofilização não foi afetada depois de ciclos repetidos FT nas formulações. Em particular, a potência dos ligantes vWF permaneceu estável nas formulações da invenção, tal como testado em condição de estresse, isto é, até 12 meses de armazenamento a +40°C (Tabela 23) e até um máximo de 24 meses de armazenamento a +40°C (Tabela 29). Em uma modalidade, a potência do polipeptídeo da presente invenção depois da liofilização pode ser determinada através da ligação ao seu antígeno através de um ensaio convencional, por exemplo, ELISA, Biacore, RIA, FACS, e etc. Mais especificamente, nas formulações da presente invenção, pelo menos 80%, de preferência pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 99% do ligante vWF que retém a atividade de ligação após o armazenamento sob as condição de estresse acima em comparação com a atividade de ligação antes do armazenamento.

[00198] Em outro aspecto, as formulações da presente invenção apresentam quase nenhuma perda de atividade biológica quando comparada a formulação líquida de ALX-0081 para a formulação liofilizada, tal como avaliado através de vários ensaios imunológicos, incluindo, mas não limitado ao ensaio de Biacore, ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA), ensaio da atividade do cofator induzida pela ristocetina (RICO) e/ou ensaio baseado em Gyrolab (ver Seção 7.13 e Tabela 24).

5.8.4.8 Resumo dos efeitos estabilizadores

[00199] As formulações da presente invenção têm o efeito após liofilização de manter a integridade física e química dos polipeptídeos da presente invenção, em particular, ALX-0081, isto é, mesmo após o armazenamento prolongado, por exemplo, para as durações como definidas acima, as temperaturas entre -70°C e +40°C, o perfil de pureza/impureza do produto é essencialmente inalterado. Por exemplo, o armazenamento prolongado após a liofilização não teve um efeito significativo em perfis RP-HPLC, SE-HPLC ou cIEF como suportado pela seção experimental.

5.9 Métodos da invenção

[00200] Os ligantes vWF da invenção podem ser produzidos por qualquer método normalmente usado. Exemplos típicos incluem a expressão recombinante em sistemas hospedeiros adequados, por exemplo, bactérias ou leveduras. Os ligantes vWF passarão por um regime de purificação adequado, antes de serem formulados de acordo com a presente invenção.

[00201] A presente invenção abrange métodos para a produção das formulações, como aqui definido.

[00202] As etapas de purificação e formulação podem coincidir, por exemplo, quando os ligantes vWF da invenção são eluídos de uma coluna utilizando um tampão de acordo com a presente invenção. Alternativamente, as formulações da invenção podem ser preparadas pela troca de um tampão, por qualquer meio adequado, por exemplo, meios amplamente usados na arte, tais como diálise, ultrafiltração, etc.

[00203] Em algumas modalidades do método de produção de uma formulação da invenção também pode se relacionar à reconstituição de uma formulação liofilizado ou secada por atomização, por exemplo, por adição de água ou um tampão adequado (o qual pode, opcionalmente, compreender outros excipientes).

[00204] Os métodos para a preparação de uma formulação de acordo com a presente invenção podem incluir etapas adicionais, tais como enchimento em frascos adequados para uso clínico, tais como recipientes selados e/ou confecção em uma forma de unidade de dosagem. Os métodos podem também compreender outras etapas, tais como secagem por pulverização, liofilização ou congelamento, por exemplo, congelamento em massa. A invenção também engloba os recipientes, formas de unidade de dosagem, ou outros produtos que podem ser obtidos por qualquer dos métodos aqui descritos.

[00205] As formulações da presente invenção podem ser utilizadas para armazenar os ligantes vWF, por exemplo, ISVDs como aqui definido. Assim, a invenção abrange um método de armazenamento de um ligante vWF, tal como aqui utilizado, caraterizado pela utilização de uma formulação, tal como aqui definido. Mais especificamente, a invenção abrange métodos para a estabilização de um ligante vWF, tal como aqui definido para o armazenamento, por exemplo, que compreende a preparação de uma formulação, tal como aqui descrita. O armazenamento pode ser de 1 a 36 meses, tais como 1, 1,5, 3, 6, 9, 12, 18, 24, 30 ou 36 meses, por exemplo, pelo menos 12 ou mesmo 24 meses, opcionalmente a uma temperatura entre -70°C e +40°C, tal como -70°C, -20°C, +5°C, +25°C ou +40°C, preferivelmente a uma temperatura entre -70°C e +25°C, mais preferivelmente a uma temperatura entre -20°C e +5°C. Assim, o armazenamento pode abranger congelamento, criodessecagem (liofilização) e/ou de secagem por pulverização. Os métodos de armazenagem podem compreender, além disso, a avaliação da integridade física e química dos ligantes vWF, tal como aqui definido.

[00206] A presente invenção também se refere a métodos para a análise de formulações que compreendem pelo menos um dos ligantes vWF, tal como aqui definido. As formulações podem ser analisadas quanto aos sinais de instabilidade física ou química dos ligantes vWF, tais como aqui definidos. Por exemplo, as formulações podem ser avaliadas quanto à presença de produtos de degradação, por exemplo, derivados de baixo peso molecular, tais como os fragmentos proteolíticos; e/ou para derivados químicos, por exemplo, variantes piroglutamato; e/ou para derivados de alto peso molecular, tais como agregados, aglomerados, e etc. A formulação também pode ser avaliada quanto ao índice de proteína total e/ou potência. Cada um dos vários métodos de ensaio, tal como aqui referido pode ser usado no método de análise da presente invenção.

[00207] Assim, a presente invenção também se relaciona com um método para monitorar e/ou avaliar a qualidade e/ou estabilidade de uma formulação, por exemplo, durante um ou mais de fabricação, armazenamento e utilização. A invenção também se refere a um método de controle de qualidade de uma formulação, por exemplo, para avaliar que a formulação atende às especificações dos produtos, conforme também aqui descrito. A invenção, em qualquer destes aspectos compreende um ou mais selecionados a partir da comparação com uma ou mais amostras de referência, a análise da variação de lote para lote, e o monitoramento contínuo de um processo de produção.

[00208] A presente invenção se refere a qualquer produto que está associado com as formulações da presente invenção, por exemplo, por compreendê-los, ou por ser necessário para a sua produção ou confecção, sem quaisquer limitações.

[00209] Por exemplo, a presente invenção se refere a um artigo de fabricação, por exemplo, um recipiente vedado compreendendo uma ou mais das formulações de acordo com a presente invenção. A invenção também se refere a uma forma de dosagem única farmacêutica, por exemplo, uma forma de dosagem adequada para administração parentérica a um paciente, preferivelmente um paciente humano, que compreende uma ou mais da formulação de acordo com qualquer modalidade aqui descrita. A forma de unidade de dosagem pode ser, por exemplo, sob a forma de uma seringa pré-cheia, uma ampola, um cartucho ou frasco. A seringa, ampola, frasco ou cartucho podem ser fabricados de qualquer material adequado, tal como vidro ou plástico e podem incluir materiais de borracha, tais como rolhas de borracha para frascos e êmbolos de borracha e vedante de borracha para seringas e cartuchos. A invenção também se refere a um kit compreendendo uma ou mais das formulações de acordo com a presente invenção. O kit pode compreender ainda instruções de uso e/ou um folheto clínico informativo. Em qualquer modalidade dos produtos, tal como aqui definido, a invenção também abrange a presença de material de embalagem, instruções de uso, e/ou folhetos clínicos informativos, por exemplo, como exigido por aspectos regulatórios.

5.10 Definições 5.10.1 Identidade

[00210] Para efeitos de comparação de duas ou mais sequências de aminoácidos, a porcentagem da "identidade da sequência" entre uma primeira sequência de aminoácidos e uma segunda sequência de aminoácidos (também aqui referidas como "identidade de aminoácidos") pode ser calculada dividindo-se [o número de resíduos de aminoácidos na primeira sequência de aminoácidos que são idênticos aos resíduos de aminoácido nas posições correspondentes na segunda sequência de aminoácidos] pelo [o número total de resíduos de aminoácidos na primeira sequência de aminoácidos] e multiplicando por [100%], nos quais cada eliminação, inserção, substituição ou adição de um resíduo de aminoácido na segunda sequência de aminoácido - em comparação com a primeira sequência de aminoácidos - é considerada como a diferença em um resíduo de aminoácido único (posição), ou seja, como uma "diferença de aminoácido", tal como aqui definido.

[00211] Em alternativa, o grau da identidade das sequências entre duas ou mais sequências de aminoácidos pode ser calculado usando um algoritmo de computador conhecido para alinhamento de sequência como NCBI Blast v2.0, usando configurações padrão.

[00212] Algumas outras técnicas, algoritmos de computador e configurações para determinar o grau de identidade da sequência, por exemplo, são descritos em WO 04/037999, EP 0 967284, EP 1085089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 e a GB 2357768-A.

[00213] Normalmente, com a finalidade de determinar a porcentagem da "identidade de sequência" entre duas sequências de aminoácidos de acordo com o método de cálculo descrito acima, a sequência de aminoácidos com o maior número de resíduos de aminoácidos será tomada como a "primeira" sequência de aminoácidos, e a outra sequência de aminoácidos será tomada como a "segunda" sequência de aminoácidos.

[00214] Além disso, na determinação do grau da identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos, a pessoa versada na arte pode considerar as assim chamadas substituições aminoácidas "conservadoras", que podem ser geralmente descritas como substituições aminoácidas nas quais um resíduo aminoácido é substituído com outro resíduo aminoácido da estrutura química semelhante e que não tem pouco ou essencialmente nenhuma influência na função, atividade ou outras propriedades biológicas do polipeptídeo. Tais substituições aminoácidas conservadoras são bem conhecidas na técnica, por exemplo, de WO 04/037999, a GB 2357768-A, WO 98/49185, WO 00/46383 e WO 01/09300; e os tipos (preferidos) e/ou as combinações de tais substituições podem ser selecionados com base nos ensinos pertinentes de WO 04/037999 bem como WO 98/49185 e das novas referências citadas aqui. Essas substituições conservadoras preferivelmente são substituições nas quais um aminoácido dentro dos grupos seguintes (a) - (e) é substituído por outro resíduo aminoácido dentro do mesmo grupo: (a) pequeno alifático, resíduos não polares ou ligeiramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro e Gly; (b) polar, resíduos negativamente carregados e His (não carregado) amidas: Asp, Asn, Glu e G1n; (c) polar, resíduos positivamente carregados: His, Arg e Lys; (d) grande alifático, resíduos não polares: Met, Leu, Ile, Val e Cys; e (e) resíduos aromáticos: Phe, Tyr e Trp. As substituições conservadoras em particular preferenciais são como se segue: Ala em Gly ou em Ser; Arg em Lys; Asn em Gln ou no Seu; Asp em Glu; Cys em Ser; Gln em Asn; Glu em Asp; Gly em Ala ou em Pro; His em Asn ou em Gln; Ile em Leu ou em Val; Leu em Ile ou em Val; Lys em Arg, em Gln ou em Glu; Met em Leu, em Tyr ou em Ile; Phe em Met, em Leu ou em Tyr; Ser em Thr; Thr em Ser; Trp em Tyr; Tyr em Trp; e/ou Phe em Val, em Ile ou em Leu.

[00215] Qualquer substituição aminoácida aplicada aos polipeptídeos descritos na presente também pode ser baseada na análise das freqüências de variações aminoácidas entre a proteína homóloga da espécie diferente desenvolvida por Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, nas análises de estrutura que formam potenciais desenvolvidos por Chou e Fasman, Bioquímica 13: 211, 1974 e Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, e na análise de modelos de hidrofobicidade em proteína desenvolvida por Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte e Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, e Goldman et al., Ann. Ver. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todos incorporado na presente no seu conjunto por referência. Informação na estrutura primária, secundária e terciária de Nanobodies® dado na descrição na presente e no estado da técnica geral citado acima. Além disso, para esta finalidade, cristalina de um domínio VHH de uma lhama, por exemplo, é dada por Desmyter et al., Natureza Biologia Estrutural, volume 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Nature Structural Biology, (1996); 3, 752-757; e Decanniere et al., Structure, volume 7, 4, 361 (1999). Outras informações sobre alguns resíduos de aminoácidos que nos domínios VH convencionais formam a interface VH/VL e as substituições de camelização potencial dessas posições podem ser encontradas no estado da técnica citado acima. 6. Abreviações

[00216] A invenção será agora adicionalmente descrita por meios de aspectos, exemplos e figuras preferidos não limitativos.

[00217] Todo o conteúdo de todas as referências (incluindo referências bibliográficas, patentes concedidas, pedidos de patentes publicados, e pedidos de patentes co-pendentes) citados ao longo deste pedido são aqui expressamente incorporados por referência, em particular para o ensinamento que é referenciado acima.

7. EXEMPLOS

[00218] Um conjunto de experimentos foi projetado de modo a obter um tampão de formulação melhorada, destinado a satisfazer uma ampla faixa de objetivos aparentemente diferentes e incongruentes. Em particular, as formulações exemplificativas aqui fornecidas são capazes de manter a estabilidade, a atividade biológica, a pureza e a qualidade de ALX-0081 e isto por um período de tempo prolongado, estável a vários estresses, tais como congelamento, liofilização, calor e/ou a reconstituição.

[00219] O ALX-0081 DS atual foi apresentado como uma formulação líquida contendo 5 mg/ml do ingrediente farmacêutico ativo (API) em um tampão à base de fosfato (D- PBS), contendo 200 mM de glicina e 0,02% de Tween-80 (v/v), pH 7,1 (DS). Embora esta formulação tenha sido aplicada durante os ensaios clínicos iniciais, pode ser melhorada de várias maneiras. Em primeiro lugar, a concentração relativamente baixa, provavelmente necessitaria de múltiplas injeções subcutâneas (assumindo que o volume por injeção subcutânea é limitado a cerca de 1 ml), reduzindo assim facilidade de uso do paciente. Em segundo lugar, a estabilidade de armazenamento de 3 a 8°C ou à temperatura ambiente da formulação atual de ALX-0081 é limitada. O período de vida útil limitado na presente formulação é determinado principalmente pela modificação química (ver seção 7.2). As modificações químicas podem ser ligadas com a perda de potência. Embora um período de vida útil praticável possa ser obtido através do armazenamento do produto à temperatura de -20°C, isto é, no entanto, não é considerado para ser uma opção favorável para a maioria dos fins práticos.

7.1 Métodos

[00220] As amostras foram analisadas essencialmente de acordo com os procedimentos operacionais padrões para avaliar o conteúdo, potência e pureza, precipitação, concentração, degradação, agregação e potência. Além disso, todas as amostras foram inspecionadas visualmente para turvação ou presença de agregados de proteína ou precipitação. O teor de umidade residual das amostras liofilizadas específicas foi determinado por meio de titulação de Karl-Fischer.

[00221] Três programas de liofilização diferentes foram utilizados neste estudo para liofilizar ALX-0081 - um de execução padrão 65h (Figura 1), um de execução encurtada 37h e um ciclo de liofilização longo 66h optimizado para reduzir o teor de umidade residual, tal como descrito na Tabela 14.

[00222] Resumidamente, no início do processo de liofilização encurtado 37h a temperatura de armazenamento foi de +20°C e foi levada para -50°C em 2 horas. Em seguida, um vácuo de 0,04 mbar foi criado em 1 hora. Depois de atingir o vácuo de 0,04 mbar a temperatura de armazenamento foi mantida a -50°C durante 4 horas. Após estas 4 horas a temperatura foi gradualmente aumentada para 0°C em 15 horas (isto é, a etapa de secagem primária, a remoção da água congelada). A temperatura de armazenamento de 0°C foi mantida por 7 horas, mantendo um vácuo de 0,04 mbar. Após 7 horas, a temperatura foi aumentada para +25°C em 3 horas e subsequentemente mantida a 25°C durante 5 horas (isto é, a etapa de secagem secundária, a remoção da água não congelada). Os frascos foram fechados sob um vácuo de ± 0,400 mbar, após a qual a pressão normal foi restaurada.

[00223] O mesmo método foi aplicado para a execução padrão 65h e difere apenas na segunda etapa de secagem, que foi prolongada com 28h a +25°C sob vácuo resultando em um tempo total do ciclo de cerca de 65h. Uma visão geral esquemática das diferentes etapas da execução de liofilização padrão 65h é mostrada na Figura 1. Durante o processo de liofilização, a temperatura do produto dos três frascos em posições estratégicas foi monitorada. Finalmente, a execução padrão 65h foi modificada durante a execução de acordo com a leitura das sondas de temperatura, resultando em ciclos de liofilização prolongados, tais como descritos na Tabela 14.

7.2 Estabilidade química da formulação ALX-0081 atual

[00224] RP-HPLC é um dos métodos mais informativos para avaliar a estabilidade química de uma substância medicamentosa (DS).

[00225] RP-HPLC resolveu o ALX-0081 DS para um número de espécies diferentes. Para além do pico principal, pré-picos (substância eluindo antes que o material não modificado intacto) e um certo número de pós-picos pode ser discernido. Nos lotes produzidos até agora, os pré-picos e pós-pico 1 consistentemente representado a cerca de 2% e 3,6% da DS, respectivamente, a etapa que os outros pós-picos representam menos de 1% da DS.

[00226] No entanto, durante o armazenamento sob condições acelerada (+5°C) ou forçada (+25°C e +37°C/+40°C), a abundância relativa de certas variantes relacionadas com o produto aumentou com o tempo e temperatura, como representado na Figura 2A. Além disso, o pico principal de RP-HPLC parece dividir-se em várias espécies diferentes após a incubação prolongada, especialmente a temperaturas elevadas (> +25°C) (Figura 2B). Os dados indicam que algumas novas espécies moleculares de eluição anteriores são geradas durante o armazenamento.

[00227] As modificações mais importantes que estavam presentes na ALX-0081 DS no momento da fabricação ou que surgiram durante o armazenamento são as seguintes: (i) um pré- pico 1 (oxidação); (ii) pós-pico 1 (variante nor-leu); (iii) pós-pico 2 (formação de piroglutamato), e (iv) fraccionamento do pico principal (isomerização). As modificações (i), (ii) e (iii) não afetaram significativamente a potência (dados não mostrados). Em contraste, a isomerização dos resíduos de ácido aspártico nas posições 105 e 236 da SEQ ID NO: 1, que estão localizadas na região CDR3, demonstrou que é o mecanismo molecular predominante subjacente a uma perda potencial de potência de ALX-0081 (cf. (iv) acima).

[00228] Alguns dos ALX-0081 variantes relacionados com o produto, presente no momento da fabricação ou que surgiram durante o armazenamento, pode também ser detectados por cIEF. Este foi o caso para a modificação do piroglutamato que apareceu como uma pós-pico (cf. (iii) acima). Além disso, semelhante ao que foi observado na análise de RP-HPLC, os eventos de isomerização na posição 105, em ambos os domínios 12A02H1 resultaram no alargamento do pico principal e, eventualmente, na divisão do pico principal cIEF (cf. (iv) acima).

7.3 Seleção de tampão e excipiente

[00229] A fim de desenvolver ainda mais a formulação de ligantes vWF, um conjunto complexo de experimentos foi projetado elaborando vários parâmetros em que todos se influenciam mutuamente, incluindo (i) diferentes tampões, (ii) em diferentes concentrações, (iii) cada tampão em vários pH; e (iv) cada um combinado com diferentes excipientes.

[00230] Os sistemas tampão devem ter uma capacidade de tamponamento tão baixa quanto possível, de modo a não perturbar significativamente o sistema de tamponamento do corpo quando injetado. Além disso, o tipo de tampão e a concentração na atividade do ingrediente farmacêutico ativo (API) devem ser avaliados com muito cuidado.

[00231] Em geral, maiores níveis de estabilidade da proteína foram atribuídos às altas temperaturas de fusão. Por conseguinte, as propriedades térmicas de ALX-0081 foram monitoradas na presença de várias composições. Em particular, um experimento TSA foi realizado em 192 formulações isotônicas diferentes, para as quais os resultados foram alimentados a um projeto de experimentos (DOE) para avaliar o efeito do tampão, concentração, força iónica, pH e excipientes sobre a estabilidade térmica de ALX- 0081. A leitura feita foi na temperatura de fusão (Tm) de ALX 0081, que é um indicativo da estabilidade térmica da proteína nas diferentes composições testadas.

[00232] Resumidamente, o ensaio de desvio térmico empregado (TSA) segue as mudanças do sinal de fluorescência de um corante, tal como Sypro laranja, enquanto a proteína sofre desdobramento térmico. Quando Sypro laranja é adicionado a uma solução de proteína corretamente dobrada, não pode ligar-se a qualquer superfície na proteína e o seu sinal de fluorescência é extinto. Quando a temperatura sobe, a proteína sofre desdobramento térmico e expõe sua região de núcleo hidrofóbica. O sypro laranja se liga então para as regiões hidrofóbicas e não extintas, o que resulta no aumento do sinal de fluorescência. O ensaio foi realizado em soluções contendo diferentes formulações a serem testadas, ALX-0081 a 0,2 mg/mL e 10x Sypro laranja. O programa consistiu nas seguintes etapas: aquecer a 37°C a uma taxa de rampa de 4,4°C/s e manter por 10s; aquecer a 90°C a uma velocidade de rampa contínua de 0,02°C/s (20 aquisições por °C); e arrefecer a 37°C a uma taxa de rampa de 2,2°C/s e manter por 10 segundos.

[00233] O seguinte conjunto de tampões com variações de concentrações (10 a 200 mm), os valores de pH e excipientes foram aqui explorados:

[00234] As temperaturas de fusão obtidas (Tm) foram importadas no programa Design Expert para análise do experimento de triagem fatorial para predizer 50 formulações com maior estabilidade térmica (ver Tabela 1).

[00235] Os maiores valores de Tm foram previstos para fosfato (pH 7,0 a 7,5) e citrato (pH 6,2 a 7,0) contendo trealose, sacarose, manitol ou glicina. De modo totalmente inesperado, os resultados do estudo sugeriram que o tampão Tris-HCl (pH 7,8 a 8,0) e histidina-HCl (pH 6,5), baseados em tampões retornem em temperaturas de fusão significativamente mais baixas, apesar de terem sido previamente eleito como o sistema tampão de escolha para controlar o pH da solução de domínios variáveis únicos da imunoglobulina, tal como descrito no WO2010/077422.

[00236] Por conseguinte, concluiu-se que as formulações de fosfato e de citrato contendo trealose, sacarose, glicina ou manitol, foram especialmente realizadas, por exemplo, para a estabilização dos ligantes vWF ALX-0081.

7.4 Teste de solubilidade

[00237] A fim de avaliar se a solubilidade de ALX-0081 pode ser ainda melhorada, uma triagem inicial foi realizada em várias formulações. ALX-0081 foi trocado de tampão para a formulação de interesse (excluindo Tween-80) e, além disto, foi concentrado em uma célula de agitação (por exemplo, tipo Amicon) equipada com filtro de corte 5 kDa. Assim que a precipitação ou turvação visível ocorreu, a amostra foi filtrada e a concentração de proteína foi medida. A Tabela 2 mostra um resumo dos resultados obtidos.

[00238] A concentração em fosfato e histidina à base de tampões resultou na turvação da amostra e na formação de precipitação em concentrações proteicas relativamente baixas (<10 mg/mL). Em contraste, ALX 0081 permaneceu fisicamente estável em tampão de citrato, mesmo depois de ter atingido uma concentração de ~56 mg/mL. Além da inspeção visual, a ausência de partículas ou espécies HMW foi confirmada pela microscopia de fluorescência (coloração com Vermelho do Nilo, por SE-HPLC e DLS). Além disso, submetendo a solução a 56 mg/ml e a 10 ciclos FT a 20°C ou 70°C, ou armazenando a +4°C durante cerca de 1 semana não pareceu afetar a estabilidade física da molécula como evidenciado pela análise de SE-HPLC (ver Figuras 3A e 3B, respectivamente).

[00239] A solubilidade comparativamente elevada de ALX-0081 no tampão de citrato foi confirmada por um ensaio de precipitação de PEG (dados não mostrados).

7.5 Tween-80

[00240] A fim de determinar se o polissorbato tensoativo não iônico, também designado Tween, (Monolaurato de polioxietileno (N) sorbitano; em que N = 20, 40, 60, 65, 80 ou 85) é necessário na formulação de ALX-0081, várias experiências de agitação foram realizados em 50 mM de tampão de citrato com pH 6,0 e 6,5. O efeito de diferentes concentrações de Tween-80 (sem Tween-80 vs 0,01% vs 0,02% (v/v)) sobre a estabilidade física de ALX 0081 foi avaliado em 5 mg/mL através do monitoramento do sinal de dispersão de 500 nm em um espectrofluorímetro.

[00241] Tween-80 impediu um aumento no sinal de dispersão em ambos os tampões que demonstram o seu efeito protetor (Figuras 4A e 4B). Não foram observadas diferenças significativas entre as amostras que contêm 0,01% ou 0,02% de Tween-80 (v/v). Além disso, os perfis de SE-HPLC das amostras antes e depois da agitação não mostraram quaisquer diferenças: 95 a 100% de recuperação foram atingidos e nenhuma oligomerização ou degradação foi detectada.

[00242] Com base nestes resultados, foi decidido incluir 0,01% de Tween-80 (v/v) na formulação dos ligantes vWF, por exemplo, ALX-0081.

7.6 Tween

[00243] A fim de determinar se os outros elementos da gama de polissorbato, que diferem pelo comprimento da cadeia de polioxietileno e a porção do éster de ácido graxo, por exemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-65 e Tween-85 são necessários na formulação dos ligantes anti-vWF, várias experiências de agitação são realizadas em 50 mM de tampão de citrato com pH 6,0 e 6,5, essencialmente como descrito na seção 7.5 acima. O efeito de diferentes concentrações dos vários elementos-Tween (sem Tween vs 0,01% vs 0,02% (v/v)) sobre a estabilidade física do ligante vWF é avaliado a 5 mg/mL através do monitoramento do sinal de dispersão de 500 nm em um espectrofluorímetro.

[00244] Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-65 e Tween-85 produzem substancialmente o mesmo resultado benéfico do Tween- 80.

7.7 Teste de estabilidade das formulações líquidas

[00245] Um estudo mais abrangente foi realizado para avaliar a estabilidade de ALX-0081 em diferentes formulações isotônicas com base em citrato a uma concentração de 20 mg/mL. A Tabela 3 dá uma visão geral das diferentes formulações que foram testadas.

[00246] O principal objetivo foi avaliar o efeito do pH (6,0 a 6,5 a 7,0) e o tipo de excipiente (NaCl, manitol, sacarose ou glicina) sobre a estabilidade do produto líquido. Para fins de controle e comparação direta do estudo também foi incluído ALX-0081 atual formulado a 5 mg/mL em D-PBS e glicina (idêntica à formulação atual, exceto para a menor concentração de Tween-80), bem como para a solução de ALX-0081 isotônica baseada em citrato diferente mencionada anteriormente, mas formulado a uma concentração de 5 mg/ml em vez de 20 mg/mL. No total, isto resultou em 17 formulações líquidas diferentes (formulação de número 1 a 17.) que foram submetidas a estudos profundos de estabilidade. A fim de excluir o efeito de diferenças na concentração de Tween, todas as formulações continham 0,01% de Tween-80 (v/v).

7.7.1 Estabilidade de congelamento e descongelamento

[00247] O efeito de ciclos repetitivos FT sobre a estabilidade de ALX-0081 como uma formulação líquida foi avaliada. As alíquotas das diferentes formulações (0,5 mL/tubo) foram submetidas até 10 ciclos FT a -70°C ou -20°C. Um ciclo incluído congelamento a ± 20 min, seguido por descongelamento por 5 min em um banho de água a +25°C. Após este tratamento, todas as formulações permaneceram visivelmente claras. As análises RP-HPLC mostraram boa recuperação (95 a 100%) e nenhuma diferença significativa no perfil pode ser detectada, o que sugere que a qualidade de ligantes vWF, por exemplo, ALX-0081 não é afetada pelo congelamento-descongelamento repetido nas 17 formulações líquidas diferentes testadas.

7.7.2 Estabilidade de armazenamento

[00248] A estabilidade das 17formulações diferentes também foram avaliadas por alíquotas de armazenamento (0,5 mL/tubo), sob condição de estresse, isto é +40°C; a condição de armazenamento a -70°C por longo prazo foi incluída como referência. As análises focadas em RP-HPLC, por causa deste método são geralmente conhecidas como um método particularmente informativo para revelar modificações químicas que ocorrem durante o armazenamento (ver Tabela 4). Esta seção dá uma visão geral dos dados obtidos após um mês de armazenamento; os resultados confirmaram os resultados dos pontos de tempo anteriores, isto é, após 1 semana e 2 semanas.

(a) RP-HPLC

[00249] Como previamente indicado na seção 7.2 acima, a análise RP-HPLC solucionou ALX-0081 DS atual (formulação D- PBS/glicina) em alguns produtos em relação a variantes e impurezas. Resumidamente, sob condição de estresse (por exemplo, +40°C), a pureza (% de pico principal) decresceu concomitantemente com o aumento em alguns dos pré/pós-picos existentes, bem como a formação de alguns picos adicionais. Os dados de RP-HPLC obtidos no presente estudo estão resumidos na Tabela 5.

[00250] No geral, os resultados obtidos indicam essencialmente que as mesmas modificações ocorreram em diferentes tampões de citrato como observado no presente tampão da formulação (isto é, D-PBS/glicina), embora algumas diferenças na área relativa do pico foram observadas. Em particular, o aumento na área pré-pico (oxidação) foi mais lenta nas formulações de citrato (especialmente com pH 6,0) em comparação com a formulação D-PBS/glicina. Com respeito a este pré-pico construído, a glicina pareceu ser a menos favorável entre os diferentes excipientes. O perfil dos diferentes pós- picos após armazenamento durante 1 mês a +40°C foi comparável a todas as formulações, embora o segundo pós-pico (isto é, a variante de piroglutamato) pareceu ser mais acentuada a pH 7,0 do que a pH 6,0 a 6,5. O grau de ampliação/divisão do pico principal - o resultado da isomeração asp - é difícil de quantificar devido à baixa resolução; a porcentagem da área de pico secundário não pôde ser estimada com precisão e, por conseguinte, foi incluído na área de superfície relativa apresentados na Tabela 5 para o pico principal. No entanto, os cromatogramas de RP-HPLC correspondentes (dados não mostrados) permitiram fazer uma avaliação qualitativa; estes dados sugerem que o grau de isomerização seja bastante semelhante nas várias formulações.

(b) cIEF

[00251] Semelhante a RP-HPLC, o método cIEF permite a detecção de certas variantes do produto que ocorrem durante o armazenamento em condição de estresse (ver seção 7.2 para maiores detalhes). Isto é exemplificado na Figura 5, comparando os eletroferogramas de ALX-0081 atual após armazenamento durante um mês em temperatura de -70°C e +40°C.

[00252] Os dados cIEF obtidos no presente estudo (dados não mostrados), basicamente confirmam as conclusões da análise RP- HPLC, ou seja, o mesmo tipo de alterações ocorre aproximadamente na mesma medida nos diferentes tampões de citrato, como observado no presente tampão da formulação, aqui representada pela fórmula 17 como representada na Figura 5 (isto é, D-PBS/glicina). No entanto, algumas diferenças na área relativa do pico podem ser observadas. Em particular, o pós-pico (isto é, a variante de piroglutamato) pareceu ser mais acentuada em pH 7,0 do que em pH 6,0 a 6,5, que está de acordo com os encontrados por RP-HPLC como anteriormente resumidos na Tabela 5.

(c) de SE-HPLC

[00253] Análise de SE-HPLC foi realizada para examinar a estabilidade física de ALX-0081, isto é, para detectar espécies HMW e/ou produtos de degradação que poderiam ser formados durante o armazenamento sob condição de estresse. Para todas as formulações que foram testadas aqui, o teste de estresse não pareceu ter um efeito significativo sobre os cromatogramas de SE-HPLC.

(d) Conclusão

[00254] Um resumo dos resultados mais importantes no que diz respeito à estabilidade de armazenamento das diferentes formulações líquidas de ALX-0081 é apresentado na Tabela 5. Apenas os dados mais informativos com base na análise de RP- HPLC foram listados. Estes dados sugerem uma maior estabilidade química em citrato a 50 mM com pH 6,0 a 6,5. Com a exceção da glicina, o tipo de excipiente não tem um efeito significativo sobre a estabilidade. No que diz respeito à estabilidade física, nenhuma diferença pode ser observada entre as diferentes formulações. Por último foi evidenciado pela recuperação de ± 100% observada para todas as amostras nas diferentes análises de HPLC, bem como para os cromatogramas de SE-HPLC, demonstrando a ausência de agregação/degradação.

[00255] Com base nos resultados acima, foi decidido continuar a explorar o potencial das formulações de citrato/sacarose a pH 6,0 a 6,5.

7.8 Teste de estabilidade de formulações liofilizadas

[00256] O efeito da liofilização foi avaliado pela comparação da estabilidade de armazenamento de ALX-0081 em líquido e formulações liofilizada de citrato/sacarose (20 mg/ml de API em pH 6,0 a 6,5). Uma visão geral das formulações testadas é dada na Tabela 6. Na arte anterior a formulação baseada em D- PBS/glicina (5 mg/ml de API) foi incluída para comparação. O líquido (isto é, antes da liofilização) e ALX-0081 liofilizado foram mantidos congelados (-70°C para as amostras líquidas e - 20°C para as formulações liofilizadas), bem como em +5°C, +25°C e 40°C e as amostras foram analisadas após 2 semanas e 1,5 meses de armazenamento.

[00257] O painel A da Figura 6 mostra uma imagem dos frascos após o processo de liofilização usando a execução padrão 65h como representado na figura 1. A liofilização das formulações contendo citrato/sacarose resultada na boa formação, enquanto amostras formuladas em D-PBS/glicina não produzem uma formação satisfatória. Todas as amostras puderam ser prontamente ressolubilizadas com água Milli-Q e as soluções eram límpidas e incolores (Figura 6, painel B).

7.8.1 Avaliação do produto antes e depois da liofilização

[00258] Análises de RP-HPLC e SE-HPLC não revelaram diferenças significativas em termos de caraterísticas físico- químicas entre o produto líquido de partida (mantido a <-70°C) e o produto depois de liofilização e reconstituição para qualquer uma das formulações testadas. Além disso, a recuperação da amostra completa foi demonstrada para todas as formulações (Tabela 7).

7.8.2 Avaliação do produto liofilizado após 1,5 meses de armazenamento (a) Conteúdo e inspeção visual

[00259] A formação das amostras liofilizadas não mostrou sinais visuais de decomposição após 1,5 meses de armazenamento a -20°C, +5°C, +25°C ou +40°C.

[00260] As amostras eram claras e incolores após a reconstituição com água Milli-Q. Além disso, o armazenamento não teve um efeito significativo sobre o conteúdo, medido após a reconstituição (Tabela 8).

(b) A RP-HPLC

[00261] Os perfis das 3 diferentes formulações liofilizadas (N° 3, 7 e 17) foram comparados após 1,5 meses de armazenamento a -20°C, +5°C, +25°C e +40°C respectivamente. Uma comparação com as condições mais rigorosas (+40°C) revela melhor o impacto da liofilização na estabilidade química.

[00262] Os resultados são resumidos na Tabela 8. Como se pode ver, o armazenamento na forma congelada não parece afetar ALX- 0081, em qualquer uma das formulações testadas neste estudo.

[00263] Em geral, a conclusão prevalecente dos dados obtidos é que a liofilização de uma formulação à base de citrato/sacarose essencialmente impede que modificações químicas ocorram sob a forma líquida, com a exceção de quantidades menores da modificação do piroglutamato. Nestas formulações liofilizadas, não houve um aumento na porcentagem da área pré-picos nem um sinal de alargamento/divisão do pico principal. Em contraste, a liofilização da formulação à base de D-PBS/glicina não resultou em uma melhoria significativa da estabilidade química. A formação de piroglutamato na formulação liofilizada de citrato/sacarose parecia ser ligeiramente mais acentuada a pH 6,0 do que a pH 6,5. Isto é substanciado pelos dados em +25°C, nos quais a temperatura da taxa de formação de piroglutamato é menor, mas mostra a mesma dependência do pH. Como esperado, o armazenamento durante até 1,5 meses a -20°C ou +5°C não provoca qualquer deterioração detectável de ALX-0081 liofilizado (dados não mostrados).

[00264] Surpreendentemente, a +40°C foi obtida uma estabilidade melhorada nas formulações baseadas em citrato/sacarose em comparação com a formulação baseada em D- PBS/glicina, a última mostrando significativamente maior susceptibilidade a modificações químicas.

[00265] Para as formulações líquidas armazenadas por até 1,5 meses à temperatura de -70°C, +5°C e +25°C não teve nenhum efeito significativo sobre ALX-0081 (dados não mostrados). A deterioração observada após 1,5 meses de armazenamento a +40°C, é mais ou menos de acordo com observações anteriores (ver Seção 7.7.2).

(c) cIEF

[00266] Os resultados obtidos por análise cIEF estão de liofilização de uma formulação à base de citrato/sacarose não é capaz de evitar completamente a modificação do piroglutamato. Na verdade, o armazenamento do produto liofilizado em +40°C durante 1,5 meses resultou em um aumento no pós-pico. Mais uma vez, a formação mais rápida de piroglutamato foi observada em Tampão de citrato/sacarose com pH 6,0 do que com pH 6,5.

(d) SE-HPLC/MALS/DLS

[00267] O armazenamento até 1,5 meses a -70°C/-20°C, +5°C e +25°C não teve efeito sobre os perfis de SE-HPLC de formulações de ALX 0081 líquidas ou liofilizadas (dados não mostrados). No entanto, a +40°C o alargamento do pico e a formação de picos secundários pode ser observada em todas as formulações líquidas. A análise MALS mostrou que esses picos secundários correspondem ao ALX-0081 monomêrico (dados não mostrados). Os dados sugerem uma alteração conformacional em uma subpopulação de ALX-0081, como resultado do armazenamento estressado. Surpreendentemente, o perfil de SE-HPLC de formulações de citrato/sacarose liofilizada não foi afetado pelo teste de estresse +40°C, indicando que estas formulações liofilizadas também melhoram a estabilidade física de ALX- 0081. Isto, contudo, não foi o caso para a formulação de D-PBS/glicina liofilizada; estressando esta formulação a +40°C não só resultou em um pico secundário, mas aparentemente também em algumas espécies de alto peso molecular, visíveis como um amplo pré-pico (Tabela 8). A análise DLS não detectou quaisquer grandes espécies oligoméricas, em qualquer das formulações (dados não mostrados).

(e) Conclusão

[00268] Um resumo dos resultados mais importantes no que diz respeito à estabilidade de armazenamento das formulações ALX- 0081 liofilizadas testadas é mostrado na Tabela 8. Em geral, somente diferenças limitadas foram observadas na estabilidade entre as formulações de citrato/sacarose, embora inesperadamente ALX-0081 pareceu ser menos propenso a formação de piroglutamato, a pH 6,5 do que a pH 6,0. Assim, o trabalho de reformulação para ALX-0081 foi focado em formulações à base de citrato/sacarose em pH 6,5.

7.9 Otimização adicioanal da formulação baseada em citrato/sacarose

[00269] Os dados coletados até agora mostram que uma formulação à base de citrato/sacarose melhora a solubilidade e que a liofilização desta formulação melhora dramaticamente a estabilidade de armazenamento de ALX-0081. No entanto, o armazenamento de ALX 0081 liofilizado em temperaturas mais altas, ainda que limitada, ainda resulta na formação de piroglutamato. É razoável supor que esta modificação pode limitar a vida útil do produto liofilizado (mesmo quando armazenado a +5°C). Estes continua a ser elucidado, pois a liofilização não foi capaz de impedir essa modificação.

[00270] Na hipótese de que a água restante no produto liofilizado desempenha um papel fundamental.

[00271] Se esta hipótese for verdadeira, então a água restante pode ser minimizada através da otimização dos parâmetros físicos de liofilização, tais como tempo de secagem, temperaturas, vácuo, e etc., conforme listado acima, mas, ao mesmo tempo, os outros parâmetros do ligante vWF devem permanecer constantes. Outra abordagem é a modificação da formulação, mas mais uma vez, ao mesmo tempo, os outros parâmetros do ligante vWF devem permanecer constantes. Além disso, os parâmetros físicos de liofilização em combinação com a modificação da formulação podem ser ajustados.

7.9.1 Otimização de parâmetros de liofilização

[00272] Otimização dos parâmetros físicos de liofilização, incluindo (i) tempo de secagem, (ii) temperaturas das diferentes etapas, (iii) vácuo, e uma combinação de (i) a (iii) não era satisfatória, ou seja, sem ou efeito insuficiente sobre teor de umidade residual ou que afetem os parâmetros dos ligantes vWF.

7.9.2 Otimizando a formulação para liofilização

[00273] O efeito do teor de umidade sobre a estabilidade química do produto liofilizado foi investigado através do ajuste das concentrações do tampão de citrato e o excipiente de sacarose. Além disso, um tempo de secagem secundário, durante o programa de liofilização foi investigado.

7.10 Efeito do teor de umidade sobre a estabilidade do produto liofilizado

[00274] Três formulações isotônicas diferentes de ALX-0081 com diferentes concentrações de citrato e sacarose (todos os três em pH 6,5) foram submetidas a dois programas de liofilização diferentes: a execução padrão de 65h de um lado e uma execução encurtada de 37h, por outro lado. Uma visão geral das formulações testadas é dada na Tabela 9. A Figura 7 mostra os frascos obtidos após liofilização. A liofilização resultou em uma boa formação para todas as formulações.

[00275] As amostras liofilizadas de ALX-0081 foram analisadas após 2 e 4 semanas de armazenamento tanto a -20°C como a +40°C. Na presente experiência, decidiu-se realizar um teste exaustivo de modo a fundamentar ainda mais a utilidade das formulações.

[00276] Em primeiro lugar, durante o armazenamento a +40°C durante até 4 semanas, a formação das amostras liofilizadas permanecia intacta e a reconstituição proporcionou soluções claras. O ciclo de liofilização não pareceu ter qualquer efeito significativo sobre o teor (medido espectrofotometricamente a 277 nm) ou osmolaridade. De acordo com experiências anteriores, o armazenamento por 4 semanas a +40°C não tem um efeito sobre a estabilidade física de ALX- 0081 baseado nas análises de SE-HPLC, MALS, e DLS (dados não mostrados). Além disso, verificou-se que a potência de ALX- 0081, conforme determinado pelo ensaio à base de Biacore não foi afetada pelo processo de liofilização e o armazenamento subsequente (dados não mostrados). No entanto, as análises por RP-HPLC demonstraram que o armazenamento novamente resultou na formação de pequenas quantidades da variante de piroglutamato. Isto foi ligeiramente mais acentuado para a formulação contendo concentração mais elevada de citrato e menor concentração de sacarose (Tabela 10). Além disso, para cada formulação liofilizada, o teor total de umidade foi determinado por meio de titulação de Karl Fisher. Um resumo destes dados, juntamente com a quantidade de piroglutamato detectada nas amostras de estressadas correspondentes é mostrado na Tabela 10. Verifica-se a partir dos dados obtidos para cada um dos programas de liofilização separadamente que um maior teor de umidade resulta em uma maior susceptibilidade para a formação de piroglutamato. Isto sugere que a água residual presente no produto liofilizado promove modificações químicas.

[00277] Em conclusão, os resultados indicam que a redução do teor de umidade dos ligantes vWF liofilizados, por exemplo, ALX-0081, é benéfico para a sua estabilidade química.

7.11 Efeito de reduzir a força de tampão e aumentar o teor de sacarose

[00278] Os dados obtidos na seção anterior mostram que reduzir a concentração de citrato reduz enquanto aumenta a concentração de sacarose (mantendo-se assim uma solução isotônica) é benéfico para a estabilidade do produto liofilizado. Ao mesmo tempo, foi obtida evidência de que ALX- 0081 requer uma concentração suficientemente elevada de citrato para obter uma solubilidade melhorada. Por conseguinte, foi decidido avaliar o efeito das concentrações de citrato e de sacarose sobre a aparência da solução durante o armazenamento a +5°C e +25°C, e para reavaliar a estabilidade de congelamento-descongelamento na presença de concentrações mais baixas de citrato.

7.11.1 Avaliação do impacto da concentração de citrato/sacarose

[00279] Em uma primeira experiência, 12 formulações diferentes de ALX-0081 foram armazenadas a +5°C e +25°C, durante até 4 dias. As amostras foram inspecionadas em uma base regular para a turvação ou presença de precipitado. As fotografias tiradas das amostras após 4 dias de armazenagem são apresentadas nas Figuras 8 e 9. Uma descrição geral das diferentes formulações e resultados correspondente é apresentada na Tabela 11. Após 4 dias de armazenamento a +25°C todas as amostras permaneceram límpidas e incolores (Figura 8, painel A). Em contraste, a +5°C mais formulações de citrato sem excipientes tornou-se turva (Figura 8, painel B). Evidentemente, o grau de turvação é inversamente proporcional à concentração de citrato, com a formulação de 50 mM de citrato permaneceu clara. Além disso, a recuperação da amostra para a amostra contendo 15 mM de citrato foi de 68% (com base em A277 após 20h de armazenamento), enquanto outras recuperações variaram de 90 a 100% (dados não mostrados). A adição de sacarose a 15 mM da formulação de citrato evitou amostra turvas, embora na concentração mais baixa de sacarose (por exemplo, 5%) de uma ligeira turvação foi detectada a +5°C (Figura 9, painel B).

[00280] As observações confirmam a importância de uma concentração suficientemente alta de citrato na manutenção de ALX-0081 solúvel, particularmente em baixa temperatura. No entanto, o aumento da concentração de citrato resultou em um aumento de umidade. Inesperadamente, a redução da concentração de citrato pode ser compensada pela adição de sacarose. Nenhum efeito de Tween-80 foi observado na solubilidade.

7.11.2 Avaliação da estabilidade FT

[00281] Seguindo o experimento focado na estabilidade FT de várias formulações à base de citrato/sacarose. Nove formulações diferentes de ALX-0081 foram submetidas a 5 ciclos consecutivos FT a -20°C. Uma visão geral das formulações testadas e os resultados correspondentes são apresentados na Tabela 12. Todas as amostras permaneceram límpidas e os ciclos de FT não afetaram a estabilidade física dos ligantes vWF, por exemplo, ALX 0081, baseados na análise do conteúdo e dados de SE-HPLC.

7.11.3 Otimização da concentração de citrato e sacarose em vista da isotonicidade

[00282] Com base nos resultados de armazenamento e FT acima mencionados, a concentração ideal do tampão de citrato foi selecionada como 20 mM. Uma experiência final foi realizada em três formulações diferentes na concentração de sacarose. O objetivo deste experimento foi determinar a concentração de sacarose ideal para alcançar uma fórmula isotônica e para confirmar a estabilidade de FT ALX-0081 a 20 mg/mL. Além dos 5 ciclos de FT consecutivos, cada formulação foi também submetida a um ciclo de FT seguido de armazenamento por 24 horas a +25°C e um ciclo de FT adicional, para imitar as etapas de manuseamento durante a fabricação.

[00283] Um resumo dos resultados é dado na Tabela 13. Todas as formulações testadas foram claras e varios manuseamentos não tiveram efeito sobre o conteúdo/recuperação ou osmolaridade. Com base nos valores de osmolaridade, parece que uma concentração de 7% de sacarose é ideal para se obter uma solução isotônica.

7.12 Estudo de estabilidade de formulações ALX-0081 liofilizadas armazenadas em várias temperaturas de até 12 meses

[00284] ALX-0081 formulado a 12,5 mg/mL em 20 mM de tampão de citrato de pH 6,5, 7% de sacarose (w/v) e 0,01% de Tween-80 (v/v) foi liofilizado de acordo com as condições estabelecidas na Tabela 14. As amostras foram subsequentemente armazenadas a -20°C (±5°C), +5°C (±3°C), +25°C (±2°C/60±5% RH) e +40°C (±2°C/75±5% RH).

[00285] A estabilidade das formulações liofilizadas foi avaliada em momentos diferentes, isto é, inicial, 1 mês, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 12 meses, e foi avaliada pela pureza, aparência, propriedades físico-químicas e potência. Dados detalhados de caraterização da amostra são fornecidos nas Tabelas 15 a 23.

[00286] A pureza das amostras foi avaliada por RP-HPLC, em que a porcentagem média de área do pico foi determinada, bem como a porcentagem das áreas de pré e pós-pico. A concentração de proteína foi determinada por absorbância no UV.

[00287] Além disso, as amostras foram inspecionadas visualmente liofilizadas, reconstituídas, e a formulação reconstituída foi inspecionada visualmente. O pH das amostras após a reconstituição foi medido e o teor de umidade do pó liofilizado foi determinado por titulação colorimétrica (Karl Fischer). Medidas de contagem de partículas foram realizadas para contar partículas >10 μm e >25 μm. As amostras foram ainda caraterizadas para a função biológica utilizando um ensaio baseado em Biacore. A potência foi expressa como a porcentagem da potência relativa do material de referência.

[00288] Os dados de estabilidade obtidos mostram que as caraterísticas do produto liofilizado ALX-0081 não é significativamente afetada por 12 meses de armazenamento a -20°C ou a +5°C. Os dados coletados ao longo do estudo de estabilidade a essas temperaturas foram considerados comparáveis a aqueles gerados no tempo zero.

[00289] Foram observadas várias pequenas alterações para as amostras armazenadas a +25°C ou +40°C que podem ser atribuídas às condições de armazenameto acelerados ou estressados. As principais observações foram: • em +25°C e +40°C um aumento no pós-pico 2 foi observado em RP-HPLC durante de 12 meses de armazenamento, o que corresponde com a formação da variante de piroglutamato de 0,7% a 1,1% ou 2,4%, respectivamente. • em +40°C, um aumento do teor de umidade entre 0,7% e 2,1% (w/w) após 12 meses de armazenamento foi notado. Isto poderia potencialmente ser atribuído à entrada de umidade do ambiente de armazenamento (isto é, 75% de HR) no batente, com a difusão gradual subsequente ao produto.

[00290] Os resultados obtidos em condição de estresse sugerem uma correlação entre o teor de umidade e a estabilidade química do produto; isto corresponde com os dados reportados anteriormente na Seção 7.10.

[00291] Assim, estes dados indicam a importância de controlar o teor de umidade do produto DP durante o armazenamento.

[00292] Considerando-se que +40°C de armazenamento pode ser considerado previsto para a estabilidade em longo prazo a +25°C, os dados de estabilidade de 12 meses aqui incluídos, fornecem uma boa indicação para a estabilidade de armazenamento em longo prazo à temperatura ambiente (tal como 18, 24, 30 ou 36 meses) e estabilidades prolongadas mesmo quando armazenadaas sob condições mais suaves (por exemplo, +5°C ou congelados).

7.13 Estudo de comparabilidade in vitro sobre a atividade biológica da formulação do produto farmacológico líquida e liofilizada do nanocorpo anti-vWF caplacizumab (ALX- 0081) 7.13.1 Obj etivo

[00293] Utilizou-se um número de ensaios para avaliar a comparabilidade in vitro de ALX-0081 DP atual [a formulação líquida contendo 5 mg/ml do ingrediente farmacêutico ativo (API) em um tampão à base de fosfato (D-PBS), contendo 200 mM de glicina e 0,02% de Tween-80 (v/v), pH 7,1] e a formulação ALX-0081 DP liofilizada, tal como apresentada acima [formulada em 12,5 mg/mL em 20 mM de tampão de citrato pH 6,5, 7% de sacarose (w/v) e 0,01 % de Tween-80 (v/v)] em relação à atividade biológica e ligação ao alvo: a) ensaio de potência baseado em Biacore b) ensaio de potência baseado em ELISA c) ensaio farmacodinâmico biomarcador da atividade do cofator induzida pela ristocetina (RICO) d) determinação da afinidade baseada em Gyrolab

[00294] Estes ensaios permitiram uma comparação lado a lado do produto farmacológico ALX-0081 líquido e liofilizado (caplacizumab). Critérios de comparabilidade predefinidos foram usados para avaliar a comparabilidade para cada ensaio, e são listados na Tabela 24. 7.13.2 Métodos a) O ensaio Biacore baseia-se na tecnologia de ressonância de plásmons de superfície (SPR), e medidas de ligação Avid de ALX-0081 para o domínio A1 imobilizado vWF humano em um chip sensor. O ensaio foi selecionado para os testes de potência no lançamento e na estabilidade. b) O ensaio de potência baseado em ELISA é um método ortogonal para os testes de potência de ALX-0081, que foi desenvolvido para posterior caraterização da capacidade de neutralização do alvo caplacizumab. Este ensaio mede a inibição da ligação induzida por ristocetina do Fator de von Willebrand (vWF) para plaquetas ligadas pelo caplacizumab. c) O ensaio RICO é utilizado como marcador farmacodinâmico para a atividade farmacológica do caplacizumab. O ensaio mede a taxa e o grau em que as plaquetas liofilizadas humanas formam agregados após a adição do antibiótico de ristocetina, que imita a ativação induzida de cizalhamento do vWF. d) O ensaio baseado em Gyrolab analisa as interações cinéticas de caplacizumab com o seu alvo multimérico vWF e determina a constante de afinidade do caplacizumab para o vWF humano multimérico. Resumidamente, a determinação de afinidade sobre a plataforma Gyroloab foi estabelecida como se segue: foram utilizados Gyrolab Bioaffy 1000 CDs. Como ferramenta de captura, 3000 nM de vWF biotinilado purificado produzido internamente (HaemateP purificado usando cromatografia de exclusão por tamanho) foi aplicado nas colunas que foram pré-embaladas com contas revestidas com estreptavidina. Foi utilizado D-PBS contendo 0,01% de Tween-20, esterilizado por filtração para diluição da ferramenta de captura. Uma série de diluição 1/3 de Haematep vWF purificado foi pré-incubado por 24 horas a temperatura ambiente (+20°C) em uma placa de 96 poços em um rotor a 600 rpm, com uma concentração fixa de caplacizumab (5 pM) em tampão de AD1 (Ensaio Tampão Diluente para a curva de resposta à dose). Após 24 horas, a placa foi centrifugada por 1 min em 200g. 70 μl da mistura de pré-incubação, que contêm moléculas livres de caplacizumab, foi levada para uma placa PCR de poços profundos. Em seguida, esta mistura fluiu através da coluna de modo que caplacizumab livre pode se ligar a vWF biotinilado imobilizado na coluna. O sistema Gyrolab automaticamente transferiu a mistura em triplicado para os CDs. Caplacizumab livre foi detectado com 50 nM de anticorpo monoclonal anti- caplacizumab marcado por AlexaFluor647 diluído em tampão Rexxip M (tampão de deteção disponível comercialmente). Três experiências independentes foram realizadas para determinar a KD final. Os fluorocromos foram excitados com o laser vermelho e os sinais de modo fluorescentes foram obtidos e amplificados por um tubo fotomultiplicador (PMT). O nível de amplificação do presente ensaio foi de 1% PMT. Um modelo de análise ligante desconhecido foi utilizado para a determinação de KD do caplacizumab. A análise foi realizada com o software XL fit da Gyrolab workstation. 7.13.3 Resultados a) A potência relativa das amostras de teste de ALX-0081 líquidas e liofilizadas foi medida em um ensaio de potência Biacore, relativa ao material de referência ALX-0081 utilizado no ensaio de potência, também designado padrão de referência master 2 (MRS-2). A potência relativa foi de 102,8% e 102,9%, respectivamente, indicando a comparabilidade completa no que diz respeito à potência biológica determinada através de Biacore (ver Tabela 24). b) A potência relativa das amostras de teste de ALX-0081 líquidas e liofilizadas foi determinada no ensaio de potência baseado em ELISA, em relação ao MRS-2. Os valores de potência relativa foram 99,4% e 109,5%, respectivamente, e, portanto, bem dentro dos critérios de comparabilidade (ver Tabela 24). Portanto, estes resultados indicam que ambas as formulações são comparáveis no que diz respeito à potência determinada através de ELISA. c) atividade RICO das amostras de teste de ALX-0081 líquidas e liofilizadas foi medida em uma comparação lado a lado, e a concentração para bloquear completamente a atividade RICO (<20%) foi determinada. A concentração para bloquear completamente a atividade RICO (<20%) foi < 0,4 μg/mL para ambas as formulações. Estes resultados estão bem dentro dos critérios de comparabilidade (ver Tabela 24) e indicam comparabilidade completa no que diz respeito à atividade farmacodinâmica de ambas as formulações. d) A constante de afinidade (valor KD) das amostras de teste de ALX-0081 líquidas e liofilizadas também foi determinada em uma comparação lado a lado no ensaio baseado em Gyrolab. Os valores KD foram 6,84 pM e 4,46 pM, respectivamente, com sobreposição dos intervalos de confiabilidade. Portanto, estes resultados indicam a comparabilidade completa de ambas as formulações em relação à afinidade para o alvo multimérico vWF (ver Tabela 24).

7.13.4 Conclusão

[00295] O objetivo deste estudo foi avaliar a comparabilidade in vitro do produto farmacológico ALX-0081 líquido e liofilizado (caplacizumab) por meio de quatro ensaios, capazes de avaliar a atividade biológica e a ligação ao alvo in vitro: a) ensaio de potência baseado em Biacore b) ensaio de potência baseado em ELISA c) ensaio farmacodinâmico biomarcador da atividade do cofator induzido pela ristocetina (RICO) d) determinação da afinidade baseada em Gyrolab

[00296] Todos os ensaios in vitro preencheram os critérios de aceitação predefinidos e mostraram que ambas as formulações de ALX-0081 são comparáveis em termos de atividade biológica e ligação ao alvo (ver Tabela 24). As formulações de ALX-0081 DP líquidas e liofilizadas testadas mostraram: • uma potência relativa semelhante determinada através de ensaio ELISA e Biacore • uma atividade farmacodinâmica comparável in vitro (neutralização alvo) através de ensaio RICO • uma afinidade alvo comparável via ensaio Gyrolab.

7.14 Ensaios de estabilidade acelerada e em longo prazo de formulações de ALX-0081 líquidas e liofilizadas.

[00297] Em complemento ao Exemplo 7.12, experiências de estabilidade independentes foram realizadas usando um lote diferente de ALX-0081 da mesma formulação [20 mM de Tampão de citrato pH 6,5, 7% de sacarose (w/v) e 0,01% de Tween-80 (v/v)].

[00298] A estabilidade tanto da formulação líquida quanto liofilizada foi testada em diferentes temperaturas: - A formulação líquida de 13,8 mg/mL de ALX-0081 em 20 mM de tampão de citrato de pH 6,5, 7% de sacarose (w/v) e 0,01% de Tween-80 (v/v) foi armazenada a temperaturas < -60°C e +5°C (± 3°C) e testada quanto à estabilidade em diferentes pontos de tempo, isto é, inicial, 9 meses, 12 meses, 18 meses e 24 meses. - A formulação liofilizada de 12,7 mg/mL de ALX-0081 em 20 mM de Tampão de citrato pH 6,5, 7% de sacarose (w/v) e 0,01% de Tween-80 (v/v) foi armazenada a +5°C (± 3°C), +25°C (± 2°C/60 ± 5% RH) e +40°C (± 2°C/75 ± 5% RH). Semelhante à formulação líquida, a estabilidade da formulação liofilizada foi determinada em 0, 9, 12, 18 e 24 meses.

[00299] Em cada ponto de tempo, a estabilidade química e física das amostras foi monitorada utilizando um número de técnicas analíticas, incluindo cIEF, RP-HPLC, SE-HPLC, aparência visual, pH e absorção de UV. O teor de umidade do pó liofilizado foi determinado por titulação coulométrica. A potência relativa das amostras líquidas e liofilizadas foi medida em relação a um Biacore para um ALX-0081 de referência padrão produzido internamente.

[00300] Dados de caraterização da amostra detalhados para as formulações liquidas e liofilizadas são fornecidos nas Tabelas 25 a 26 e Tabelas 27 e 29, respectivamente. As amostras que preencheram os critérios estabelecidos na coluna 2 de cada uma das tabelas acima mencionadas foram consideradas dentro das especificações do produto.

[00301] Os dados obtidos demonstram que a formulação inventada é altamente estável durante pelo menos 24 meses. As caraterísticas físico-químicas, bem como a atividade biológica do ALX-0081 liofilizado não foram significativamente afetadas pelo armazenamento de 24 meses tanto em +5°C como em +25°C. Ao estressar ALX-0081 por 24 meses a +40°C, um aumento no pós- pico 2 foi observado, correspondente com a formação da variante de piroglutamato de 1,1% no material de partida de 2,8%, 3,2%, 4,2% e 6,2% após 9, 12, 18 e 24 meses, respectivamente.

[00302] Armazenar formulações líquidas de ALX-0081 durante pelo menos 24 meses a temperaturas < -60°C ou +5°C, não afetou de forma significativa a sua estabilidade físico-química: os valores de conteúdo foram estáveis, as amostras permaneceram límpidas e os perfis de IEF, RP-HPLC e SE-HPLC do material inicial foram comparáveis com os das amostras de estabilidade.

[00303] As alterações relatadas para amostras liofilizadas armazenadas a +40°C, podem ser atribuídas às condições de armazenagem estressadas e fornecem uma boa indicação para a estabilidade de armazenamento em longo prazo em condições mais suaves.

Previsão de estabilidade em longo prazo

[00304] As especificações dos produtos farmacológicos atuais afirmam que o percentual permitido de piroglutamato é < 4%. Com base no presente relatório descritivo e nos dados de estabilidade correntes, a equação de Arrhenius foi utilizada para predizer a vida útil do produto farmacológico liofilizado em +5°C e +25°C. A equação de Arrhenius é uma fórmula precisa que descreve a dependência da temperatura das taxas de reação, que é comumente utilizada na indústria farmacêutica. Como mostrado nas Figuras 10 e 11, o produto farmacológico liofilizado deverá manter-se dentro das especificações por, pelo menos, 500 meses quando armazenado a +5°C e durante pelo menos 60 meses quando armazenado a +25°C.

7.15 Conclusão geral

[00305] A reformulação da invenção para ligantes de vWF, e especialmente ALX-0081, aqui descrita rendeu uma nova formulação à base de citrato/sacarose com solubilidade melhorada (até 80 mg/mL) e melhorou significativamente a estabilidade de armazenamento líquido (por exemplo, menos oxidação em comparação com a sua formulação original). Além disso, na forma liofilizada, essencialmente nenhuma oxidação ou isomerização asp pode ser detectada após o armazenamento por 12 meses ou mesmo 24 meses a +40°C. Além disso, a otimização da concentração de citrato e sacarose resultou em uma redução do teor de umidade do produto liofilizado, minimizando, assim, a taxa de formação de piroglutamato. Mostrou-se que cada uma das caraterísticas físico-químicas do ligante vWF foi diferentemente influenciada pelos diferentes constituintes, físico bem como químicos da formulação, tais como a escolha do tampão, pH, concentração, excipiente, e etc. Várias formulações são fornecidas aqui otimizadas para remediar ou prevenir que diferentes estresses físicos e/ou químicos.

[00306] Um tampão de formulação foi concebido para preencher os critérios mais importantes: 20 mM de citrato com pH 6,5 + 7,0% de sacarose (w/v) + 0,01% de Tween-80 (v/v). Usando esta formulação, ALX-0081 mostrou-se estável durante pelo menos 12 ou mesmo 24 meses a -20°C, +5°C, +25°C e +40°C. Estes dados apontam claramente para uma vida útil consideravelmente mais longa a +5°C do que a formulação líquida atual.

[00307] Além disso, os inventores mostraram extensivamente que a formulação de ALX-0081 atual que foi usada em estudos clínicos até à agora é comparável ao da nova formulação a do ALX-0081 liofilizada otimizada, apresentada aqui em termos de atividade biológica in vitro e ligação ao alvo. Tabela A-1: Exemplos de ligantes vWF

Tabela 1. Visão geral de 50 combinações diferentes de tampão/excipiente previstos pelo programa Design Expert para produzir as mais elevadas temperaturas de fusão para ALX-0081. As combinações de tampão/excipiente são classificadas de acordo com o valor Tm. Tipos de tampão diferentes são mostrados em diferentes tonalidades de cinza.

Tabela 2. Ensaio de Solubilidade de ALX-0081 em diferentes tampões de formulação

Tabela 3. Visão geral das formulações líquidas de ALX-0081s avaliadas em um ensaio de armazenamento e estabilidade FT, em conjunto com os valores de pH e osmolaridade medidos.

Tabela 4. Visão geral do estudo da estabilidade de armazenamento das diferentes formulações ALX-0081. Os pontos de tempo, as temperaturas de armazenagem e os métodos são indicados.

Tabela 5. Dados da estabilidade de armazenamento para as diferentes formulações líquidas de ALX-0081. superficiais relativas dos picos mais relevantes de RP-HPLC após 1 mês de armazenagem a +40°C estão mostrados. Piro = piroglutamato, principal = pico principal (incluindo o pico secundário, quando presente), oxidação = pré-picos coletivamente. O código de cores indica a pureza relativa da amostra: mais alta pureza em branco, pureza intermediária em cinza, e baixa pureza em preto. A recuperação foi ± 100% para todas as amostras.

Tabela 6. Visão geral das formulações Liofilizada/líquida de ALX-0081 avaliadas em um ensaio de estabilidade de armazenamento.

Tabela 7. Recuperação de ALX-0081 em diferentes formulações após a liofilização e reconstituição com base nas áreas totais relatadas por RP-HPLC e SE-HPLC.

Tabela 8. Visão geral dos dados de estabilidade de armazenamento de diferentes formulações liofilizadas de ALX- 0081 (1,5 meses de armazenamento a -20°C, +5°C, +25°C e +40°C). O código de cor representa uma avaliação qualitativa da estabilidade da amostra, variando de branco (maior estabilidade), de tons de cinza ao preto (menor estabilidade). N.T. = Não testado. (* Em comparação com a amostra líquida de controle mantida a -70°C)

Tabela 9. Visão geral das formulações de ALX-0081 avaliadas em um teste de estabilidade de armazenamento.

Tabela 10. Teor de umidade de amostras de ALX-0081 liofilizadas e das quantidades relativas de piroglutamato detectado em RP-HPLC após o armazenamento por 4 semanas a +40°C.

Tabela 11. Os resultados de inspeção visual da formulação ALX- 0081 durante o armazenamento a +5°C e +25°C. "+" = clara, "+/-" = ligeiramente turvo, "-" = turva, "h" = hora, "d" = dias.

Tabela 12. Resultados da inspeção visual, teor e análise de SE-HPLC das formulações ALX-0081 após 5 ciclos FT consecutivos a -20°C (* em comparação com amostras líquidas de controle mantidas a <-70°C).

Tabela 13. Resultados da inspeção visual, medições de recuperação e osmolaridade das formulações ALX-0081 após 5 ciclos consecutivos FT a -20°C ou após 1 ciclo FT +24h de armazenamento + 1 ciclo FT (* em comparação com amostras líquidas de controle mantidas a <- 70°C).

Tabela 14. Parâmetros de liofilização.

Tabela 15. Análise do pico principal (pureza) de RP-HPLC da formulação de ALX-0081 [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 16. Análise do pré e pós-pico RPC da formulação ALX- 0081 [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 17. Resultados da concentração de proteína por UV para a formulação ALX-0081 [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 18. Análise SE-HPLC da formulação ALX-0081 [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 19. Resultados de testes físicos sobre ALX-0081 liofilizado armazenado a -20°C [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 20. Resultados de testes físicos sobre ALX-0081 liofilizado armazenado a +5°C [12,5 mg/ml de API, (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 21. Resultados de testes físicos sobre ALX-0081 liofilizado armazenado a +25°C/60% RH [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 22. Resultados de testes físicos sobre ALX-0081 liofilizado armazenado a +40°C/v75% RH [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 23. Resultados da potência da formulação ALX-0081 [12,5 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 24. Comparação dos resultados in vitro de caplacizumab.

Tabela 25. Resultados da estabilidade no ALX-0081 líquido armazenado em < -60°C API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 26. Resultados da estabilidade no ALX-0081 líquido armazenado a +5°C ± 3°C [13,8 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM tampão de citrato a pH 6,5].

Tabela 27. Resultados de estabilidade no ALX-0081 liofilizado armazenado a +5°C ± 3°C [12,7 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 28. Resultados de estabilidade no ALX-0081 liofilizado armazenado a +25°C (± 2°C/v60 ± 5% de HR) [12,7 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Tabela 29. Resultados de estabilidade no ALX-0081 liofilizado armazenado a +40°C (± 2°C/75 ± 5% de HR) [12,7 mg/ml de API, 0,01% de Tween-80 (v/v) e 7% de sacarose (w/v) em 20 mM de tampão de citrato com pH 6,5].

Equivalentes

[00308] A especificação escrita anteriormente é considerada suficiente para permitir que uma pessoa versada na arte pratique a invenção. A presente invenção não é para ser limitada pelo escopo dos exemplos proporcionados, uma vez que os exemplos pretendem ser uma simples ilustração de um aspecto da invenção e outras modalidades funcionalmente equivalentes estão dentro do âmbito da invenção. Várias modificações da invenção em adição às apresentadas e descritas aqui serão evidentes para aqueles versados na arte a partir da descrição dada e recaem dentro do âmbito das reivindicações anexas. As vantagens e objetivos da presente invenção não estão necessariamente englobados por cada modalidade da invenção.

[00309] Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados ao longo deste relatório são aqui incorporados por referência na sua totalidade, em particular para o uso ou assunto aqui referido.

Claims

1. Formulação compreendendo um ligante do fator de von Willebrand (vWF), um tampão de citrato, sacarose, e Tween-80, CARACTERIZADA pelo fato de que: (a) o ligante do vWF tem uma concentração de 10 mg/mL a 40 mg/mL; (b) a sacarose tem uma concentração de 7% (p/v); (c) o Tween-80 tem um concentração de 0,01% (v/v); e (d) o tampão de citrato tem uma concentração de 20mM, de tal forma que o pH da formulação é 6,5, e em que o referido ligante do vWF consiste da SEQ ID NO: 1.

2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que: (a) o ligante do vWF tem uma concentração de 10mg/mL a 12,5 mg/mL.

3. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, CARACTERIZADA por compreender: (i) menos de 5% das espécies de alto peso molecular (HMW) após armazenamento por pelo menos 12 meses a 5°C; e/ou (ii) menos do que 5% das espécies de baixo peso molecular (LMW), após o armazenamento por pelo menos 12 meses a 5°C.

4. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que o ligante de vWF na formulação mantém pelo menos 80% da sua estabilidade após armazenagem por pelo menos 12 meses a 5°C.

5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, CARACTERIZADA pelo fato de que pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou mesmo pelo menos 99% do ligante do vWF mantém a sua atividade de ligação após o armazenamento em comparação com a atividade de ligação antes do armazenamento, a referida atividade de ligação, conforme medido por ELISA e/ou Biacore.

6. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma formulação liofilizada ou líquida reconstituída que compreende: (a) um ligante do vWF em uma concentração de 10 mg/mL a 12,5 mg/ml; (b) sacarose em uma concentração de 7% (p/v); (c) Tween-80 a uma concentração de 0,01% (v/v); e (d) um tampão de citrato em uma concentração de 20 mM, de tal forma que o pH da formulação é 6,5.

7. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que é uma formulação de armazenamento de tampão em que, pelo menos, 100 litros da formulação são armazenados abaixo das condições de congelamento.

8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, CARACTERIZADA pelo fato de que está na forma líquida, liofilizada, em pó, congelada ou liofilizada reconstituída.

9. Método ou processo para preparar uma formulação conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método ou processo compreende as etapas de: - expressar o ligante do vWF em uma cultura de células; - purificar o ligante do vWF pela passagem do ligante vWF através de, pelo menos, uma etapa de purificação por cromatografia e uma etapa de ultrafiltração/diafiltração; - ajustar a concentração do ligante do vWF de 10mg/mL a 12,5 mg/mL, em uma formulação contendo: (i) sacarose em uma concentração de 7% (p/v); (ii) Tween-80 a uma concentração de 0,01% (v/v); e (iii) um tampão de citrato em uma concentração de 20 mM, de tal forma que o pH da formulação é 6,5.

10. Método de preparação de uma formulação reconstituída conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido método compreende as etapas de: (i) liofilizar uma mistura de um ligante do vWF, um lioprotetor, um tensioativo e um tampão, formando assim uma mistura liofilizada; e (ii) reconstituir a mistura liofilizada em um diluente, preparando-se assim a formulação, em que a formulação reconstituída compreende: (a) um ligante do vWF em uma concentração de 10 mg/mL a 12,5 mg/mL; (b) sacarose em uma concentração de 7% (p/v); (c) Tween-80 em uma concentração de 0,01% (v/v); e (d) um tampão de citrato em uma concentração de 20 mM, de tal forma que o pH da formulação é 6,5.

11. Kit ou artigo de fabricação, CARACTERIZADO pelo fato de que a formulação está presente em um frasco ou uma seringa injetável.