BR112015026207B1 - Uso de uma preparação na fabricação de uma composição nutricional, composição nutricional e uso de uma composição nutricional - Google Patents

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Abstract

uso de uma preparação na fabricação de uma composição nutricional, composição nutricional, uso de uma composição nutricional, uso de uma composição, composição, e método para tratamento ou fornecimento de gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria. a presente invenção refere-se a composições alimentares compreendendo composição nutricional para uso no tratamento do gerenciamento nutricional de fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia para preservar ou melhorar a função cerebral em pku e hiperfenilalaninemia. a composição compreende uma fonte de proteína específica, ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa e pelo menos uma de uridina ou citidina.

Description

HISTÓRICO DA INVENÇÃO
[001] Fenilcetonúria (PKU) é a aminoacidopatia inata mais comum causada por uma deficiência em fenilalanina hidroxilase, resultando em um acúmulo de fenilalanina (Phe) e é convertida em fenilpiruvato, também conhecida como fenilcetona. Esse acúmulo também ocorre no cérebro.
[002] A característica de mutações genéticas para Fenilcetonúria (PKU) prejudice o devido funcionamento da enzima fenilalanina hidroxilase (PAH), que normalmente converte fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr). Essa mutação faz com que a Phe acumule no sangue e cérebro em níveis tóxicos. Adicionalmente, como Tyr é o precursor para os neurotransmissores Dopamina e Noradrenalina, um aumento na síntese de Tyr interrompe a biossíntese dessas catecolaminas. Em paralelo, Phe compete com Tyr e Triptofano (Trp, o precursor para Serotonina) nos transportadores de aminoácido através da barreira hematoencefálica (BBB) e como uma consequência, as altas concentrações de Phe no sangue também leva a uma entrada reduzida no cérebro de Tyr e Trp, impactando ainda mais sua disponibilidade para neurotransmissor e biossíntese de proteína nos neurônios.
Similarmente, as mutações na coenzima tetraidrobiopterina (deficiência de tetraidrobiopterina) prejudicam a devida conversão de Phe em Tyr, resultando no principal de funções cognitivas mais elevadas. Em pacientes com PKU ainda em dieta e com concentrações de Phe no plasma controlada dentro dos níveis recomendados, o metabolismo de Dopamina e Serotonina foi proposto a ser deficiente, conforme as medições de fluido cerebroespinhal mostraram níveis reduzidos de metabólitos desses neurotransmissores. Em paralelo, estudos envolvendo crianças tratadas precoce e continuamente com PKU demonstraram déficits no funcionamento executivo, incluindo processamento estratégico, velocidade de processamento, solução de problema, inteligência não verbal, memória de trabalho e flexibilidade de atenção.
Concluindo, PKU atrapalha o desenvolvimento cerebral e leva ao retardo mental progressivo e déficit cognitivo. Felizmente, alguns deficits cognitivos, bem como certo comprometimento anatômico observado em pacientes com PKU parece ser reversível. Por exemplo, o tempo de reação, um parâmetro para processar a velocidade e que foi encontrado reduzido em pacientes com PKU, se mostrou reversível quando pacientes com PKU sem dieta retornam a uma dieta sem proteína suplementada com aminoácidos. Adicionalmente, déficits de substância branca e mais especificamente déficits de mielinação foram associados com níveis de Phe no sangue. Similarmente aos efeitos da dieta reiniciada em funções cognitivas, foi observado com Formação de Imagem de Ressonância Magnética que esses déficits de mielina podem ser parcialmente revertidos. Lili Liang et al. relataram em NeuroReport 2011, 22:617-622 que comprometimento cerebral relacionado à PKU é acompanhado com anormalidades de espinhas dendítricas e sinapses em um modelo de camundongo BTBR-Pah.
Fora da área de PKU, o documento EP2162019 divulga uma composição que compreende uma mistura lipídica opcionalmente em combinação citidina ou uridina para melhorar a função cerebral na doença de Alzheimer. A disfunção sináptica na doença de Alzheimer está intimamente relacionada à toxicidade beta-amilóide e deposição de placa beta-amilóide como causa para disfunção sináptica e neurodegeneração. A doença de Alzheimer é, portanto, vista como uma perda das sinpases existentes (em funcionamento).
As observações acima apontam em direção a uma oportunidade em potencial para uma melhoria na intervenção dietética destinada a restaurar a função neuronal e cognitiva associada com PKU que é o objeto da presente invenção. O tratamento dietético com baixa Phe atual previne o retardo mental, mas resultado cognitivo permanece abaixo do ideal. Portanto, permanece uma necessidade de melhorar o tratamento nutricional da PKU e dano neurológico relacionado à PKU como está presentemente disponível na técnica, e melhorar o tratamento nutricional de PKU melhorando as funções cerebrais.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os inventores perceberam que em pacientes com PKU os déficits cognitivos relacionados à diminuição da funcionalidade nas células cerebrais em pacientes com PKU podem ser melhorados usando uma terapia nutricional destinada à redução dos níveis de fenilalanina no cérebro em combinação com o estímulo de síntese e/ou liberação do neurotransmissor e por estímulo de processos protetores e/ou de apoio nas células cerebrais. Em contraste com os distúrbios neurodegenerativos, aumentos em fenilalanina em PKU e hiperfenilalaninemia são doenças hereditárias, que se desenvolvem a partir do nascimento resultando na diminuição da síntese de proteína cerebral, prejudicando assim potencialmente a formação de sinapse na rede neuronal do cérebro. O mecanismo subjacente aos problemas neurológicos na doença de Alzheimer e demência é, portanto, muito diferente dos mecanismos subjacentes em PKU e hiperfenilalaninemia.
Uma realização preferida de acordo com a presente invenção é uma composição nutricional que compreende frações de proteína, gordura e carboidrato, em que a fração de proteína é essencialmente livre de fenilalanina e compreende aminoácidos livres e/ou opcionalmente glicomacropeptídeo (GMP), a fração de gordura compreende pelo menos uma selecionado do grupo consistindo em ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos, e em que a composição opcionalmente compreende uma fração de carboidrato entre 5 e 70% de energia digerível e opcionalmente entre 1 e 5 % de energia de carboidratos não digeríveis com base no teor de energia total da composição, e em que a composição ainda compreende um ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres do mesmo. A invenção também pertence ao uso da composição em gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria e/ou para uso na preservação e melhora da função cognitiva e redução do déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia.
Uma realização preferida é uma composição nutricional para uso no gerenciamento nutricional ou tratamento de hiperfenilalaninemia ou para uso no gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com fenilcetonúria ou para melhorar a função cerebral ou cognitiva em pacientes com PKU, particularmente uma composição nutricional para uso no gerenciamento nutricional de hiperfenilalaninemia ou para uso no tratamento de pacientes com fenilcetonúria ou para melhorar a função cerebral ou cognitiva em pacientes com PKU, compreendendo (a) fração de proteína, (b) uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e (c) pelo menos um de ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos. Preferencialmente, a composição ainda compreende colina, preferencialmente entre 200 e 600 mg de colina por dose diária. É peferido que a composição compreenda pelo menos ácido docosa-hexaenoico (DHA), monofosfato de uridina (UMP), e preferencialmente também colina. A fração de proteína preferencialmente compreende aminoácidos livres, ou a proteína do leite glicomacropeptídeo (GMP) ou combinações dos mesmos, e é preferencialmente essencialmente livre de fenilalanina. Preferencialmente, a composição ainda compreender uma fração de carboidrato que compreende entre 5 e 70% de energia digerível e opcionalmente entre 1 e 5% de energia de carboidratos não digeríveis com base no teor de energia total da composição. Redigida de forma diferente, a invenção também se refere ao uso da composição acima na fabricação de um produto para tratamento ou fornecimento de gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria, particularmente para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo e/ou preservar e melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia.
Outra realização preferida de acordo com a invenção refere-se ao uso de uma composição compreende (a) uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e (b) pelo menos um de ácido docosa- hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos, preferencialmente pelo menos UMP e DHA, para uso em um suplemento no gerenciamento dietético de pacientes com PKU em conjunto com uma composição nutricional que compreende uma fração de proteína substancialmente desprovida de fenilalanina, em que a ingestão diária total de ambos os suplementos e a composição nutricional está entre 40 e 80 g de proteína, entre 25 e 45 g de carboidratos, e entre 0,3 e 4 g de ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa de ômega 3 identificados acima, preferencialmente entre 0,3 e 4 g de ácido docosa-hexaenoico (DHA).
A invenção também pertence aos métodos para tratamento ou fornecimento de gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria, particularmente para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo e/ou preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, o dito método envolvendo a administração aos ditos pacientes das composições conforme descrito em todo o pedido de patente.
LISTA DE REALIZAÇÕES PREFERIDAS
[Realização 1]. Uso de uma preparação na fabricação de uma composição nutricional i) para o gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou ii) para o gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com fenilcetonúria; e/ou iii) para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduz o déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, preferencialmente uma composição nutricional para gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes de fenilcetonúria e/ou para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir os déficits cognitivos em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, a dita nutricional composição compreendendo; a. uma fração de proteína, b. uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e c. pelo menos um de ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos.
[Realização 2]. Uso de acordo com a realização 1, em que a fração de proteína contém menos de 0,1% em peso de fenilalanina com base no conteúdo total da proteína.
[Realização 3]. Uso de acordo com a realização 1 ou 2, em que a fração de proteína compreende pelo menos 50% de aminoácidos livres, preferencialmente pelo menos 90% de aminoácidos livres, e em que a fração de proteína opcionalmente compreende glicomacropeptídeo na forma intacta ou hidrolisada.
[Realização 4]. Uso de acordo com realização 1 ou 2, em que a fração de proteína compreende pelo menos 50% em peso de glicomacropeptídeo (GMP) com base no conteúdo total da proteína.
[Realização 5]. Uso de acordo com quaisquer das realizações anteriores, em que a composição ainda compreende colina, preferencialmente entre 200e 600 mg de colina por dose diária.
[Realização 6]. Uso de acordo com quaisquer das realizações anteriores, em que a composição é uma composição líquida ainda compreendendo uma combinação de pectina e pelo menos um carboidrato não digerível selecionado do grupo de goma xantana e/ou goma guar.
[Realização 7]. Uso de acordo com realização 6, em que a viscosidade da composição está entre 5 e 1500 mPa.s, a 20 graus Celsius em uma taxa de cisalhamento de 100/s.
[Realização 8]. Uma composição nutricional que compreende uma fração de proteína, uma fração de gordura e uma fração de carboidrato, em que a fração de proteína é essencialmente livre de fenilalanina e compreende aminoácidos livres e opcionalmente glicomacropeptídeo, a fração de gordura compreende pelo menos um de ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos, e em que a composição opcionalmente compreende uma fração de carboidrato compreendendo entre 5 e 70% de energia digerível e opcionalmente entre 1 e 5 % de energia de carboidratos não digeríveis baseados no conteúdo de energia total da composição, e em que a composição ainda compreende uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos.
[Realização 9]. A composição nutricional de acordo com realização 8 que compreende entre 30 e 65 % de energia de proteína, e entre 1 e 15% de energia de gordura, e entre 1 e 60% de energia de carboidratos digeríveis, e em que a composição é um líquido com uma densidade calórica total entre 50 e 300 kcal/100ml.
[Realização 10]. Uso da composição nutricional de acordo com realização 8 ou 9 para o gerenciamento dietético de PKU ou hiperfenilalaninemia.
[Realização 11]. Uso da composição de acordo com realização 8 ou 9 na fabricação de um produto para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir os déficits cognitivos associados com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia.
[Realização 12]. Uso de uma composição compreendendo (a) uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e (b) ácido docosa- hexaenoico (22:6; DHA), na fabricação de um suplemento no gerenciamento dietético de PKU ou hiperfenilalaninemia, em que o dito suplemento é administrado em conjunto com uma composição nutricional que compreende uma fonte de proteína substancialmente desprovida de fenilalanina, em que a ingestão diária total de ambos os suplementos e a composição nutricional está entre 40 e 80 g de proteína, entre 25 e 45 g de carboidratos, e entre 0,3 e 4 g de ácido docosa-hexaenoico (DHA).
[Realização 13]. Uma composição nutricional para uso em i) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou ii) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes fenilcetonúria; e/ou iii) preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, particularmente para uso em gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria e/ou para uso na preservação ou melhora da função cognitiva e redução do déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, a dita composição nutricional compreendendo: a. uma fração de proteína, b. uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e c. pelo menos um de ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos, em que a fração de proteína é essencialmente livre de fenilalanina e compreende aminoácidos livres e opcionalmente glicomacropeptídeo, e em que a composição opcionalmente compreende uma fração de carboidrato compreendendo entre 5 e 70% de energia de carboidratos digeríveis.
[Realização 14]. Uma composição compreendendo (a) uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e (b) ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), para uso em um suplemento no gerenciamento dietético de PKU ou hiperfenilalaninemia, em que o dito suplemento é administrado em conjunto com uma composição nutricional que compreende uma fonte de proteína substancialmente desprovida de fenilalanina, em que a ingestão diária total de ambos suplemento e composição nutricional está entre 40 e 80 g de proteína, entre 25 e 45 g de carboidratos, e entre 0,3 e 4 g de ácido docosa-hexaenoico (DHA).
[Realização 15]. Um método para tratamento ou fornecimento de gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria, particularmente para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo e/ou preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, o dito método envolvendo a administração aos ditos pacientes de uma composição compreendendo: a. uma fração de proteína, b. uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e c. pelo menos um de ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos, em que a fração de proteína é essencialmente livre de fenilalanina e compreende aminoácidos livres e opcionalmente glicomacropeptídeo, e em que a composição opcionalmente compreende uma fração de carboidrato que compreende entre 5 e 70% de energia de carboidratos digeríveis.
[Realização 16]. Um método para tratamento ou fornecimento de i) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou ii) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com fenilcetonúria; e/ou iii) preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, preferencialmente um método para tratar ou fornecer gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria, particularmente para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo e/ou preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, o dito método envolvendo a administração aos ditos pacientes de uma composição compreendendo (a) uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; e (b) ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), em que o dito suplemento é administrado em conjunto com uma composição nutricional que compreende uma fonte de proteína substancialmente desprovida de fenilalanina, em que a ingestão diária total de ambos o suplemento e a composição nutricional está entre 40 e 80 g de proteína, entre 25 e 45 g de carboidratos, e entre 0,3 e 4 g de ácido docosa-hexaenoico (DHA).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO PROTEÍNA
A proteína no produto de acordo com a invenção, seja para uso como um suplemento ou uma composição nutricional equilibrada, deve ser baixa em fenilalanina. Porque a PKU é uma doença crônica, é importante que o produto seja bem palatável. A fração de proteína é entendida por compreender principalmente aminoácidos livres, e/ou uma fonte de proteína não alergênica tal como GMP. De acordo com a presente invenção, aminoácidos livres são aminoácidos não acoplados a outros aminoácidos, mas ainda incluem sais de aminoácidos ou di- e tripeptídeos tais como cistina ou gly- gly dipeptídeos. Um produto livre de fenilalanina absoluta pode ser obtido ao usar os aminoácidos livres, e a composição dos aminoácidos pode ser facilmente adaptada às exigências nutricionais que dependem da idade dos pacientes. Tais composições proteicas adaptadas aos pacientes com PKU estão disponíveis na técnica.
A desvantagem da maioria das composições de aminoácido livre é que a palatabilidade é baixa, particularmente devido aos aminoácidos organolepticamente pobres Met, Cys, Lys e Trp. Substituição dos aminoácidos livres por um glicomacropeptídeo (GMP) de proteína intacta, que é uma proteína que se origina da caseína e é baixa em fenilalanina, pode melhorar o sabor significativamente, sem significativamente aumentar o conteúdo da fenilalanina da fórmula. Portanto, uma realização preferida de acordo com a presente invenção compreende uma mistura de GMP suplementada com aminoácidos livres. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos 50% em peso de GMP com base no conteúdo total da proteína. Ainda mais preferencialmente, a composição de acordo com a presente invenção compreende entre 50 e 95% em peso de GMP, ainda mais preferencialmente entre 70 e 90% em peso de GMP, suplementado a 100% com aminoácidos livres. GMP é um peptídeo do soro de leite derivado de caseína. Quando o leite é tratado com quimosina durante a fabricação de queijo, a proteína do leite (k-caseína) é hidrolisada em dois peptídeos. A proteína de GMP pode, por exemplo, ser trazida de Davisco.
Com os termos ‘substancialmente desprovido de Phe’ ou ‘essencialmente livre de fenilalanina’ usados em todo o pedido de patente, é entendido que o material proteico de acordo com a invenção preferencialmente contém menos de 1,0 % de fenilalanina, mais preferencialmente menos de 0.5 % em peso de Phe, mais preferencialmente menos de 0,2% em peso de Phe, ainda mais preferencialmente menos de 0,1 % em peso de Phe, com base no conteúdo proteico total da composição. Em uma realização, não há Phe presente como aminoácido livre.
Uma composição de aminoácido preferida de acordo com a presente invenção tem um conteúdo relativamente alto de leucina, isoleucina e valina de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA). Esses aminoácidos podem bloquear potencialmente o transporte de fenilalanina sobre a barreira intestinal e também sobre a barreira hematoencefálica, ajudando assim na diminuição dos níveis de fenilalanina no cérebro. Preferencialmente, a fração de proteína compreende pelo menos 15% em peso de BCAA, mais preferencialmente entre 15 e 35 % em peso, ainda mais preferencialmente entre 18 e 26% em peso com base no conteúdo total da proteína.
Em uma realização, a composição é usada como um produto nutricional complete, substituindo pelo menos todas as outras fontes de proteína na direta do paciente com PKU; é preferido que todos os aminoácidos essenciais estejam presentes no produto. Os aminoácidos essenciais são aminoácidos que não podem ser sintetizados de novo pelos humanos, e, portanto, devem ser suplementados na dieta. Os aminoácidos essenciais são os três BCAAs identificados acima e histidina, metionina, lisina, treonina e triptofano (fenilalanina também é um BCAA, mas - conforme explicado acima - suas quantidades devem ser mantidas tão baixas quanto possível). Uma realização preferida de acordo com a presente invenção, portanto, compreende a leucina, isoleucina e valina de BCAA, histidina, metionina, lisina, treonina e triptofano. Preferencialmente, pelo menos 50% em peso da fração de proteína compreende leucina, isoleucina, valina, histidina, metionina, lisina, treonina e triptofano, mais preferencialmente pelo menos 55%, 60%, 65%, 70% em peso da fração de proteína compreende esses aminoácidos essenciais, como a soma desses aminoácidos seja na forma livre ou parte de uma fonte de proteína não alérgica tal como GMP. É preferido que entre 50 e 100% em peso, mais preferencialmente entre 70 e 100% da fração de proteína compreenda leucina, isoleucina, valina, histidina, metionina, lisina, treonina e triptofano. DHA/EPA/DPA
A composição compreende pelo menos um ácido graxo 0-3 poli-insaturado (LC PUFA; tendo um comprimento de cadeia de 18 e mais átomos de carbono) selecionado do grupo consistindo em ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5 0-3; DPA), preferencialmente pelo menos um de DHA e EPA. Preferencialmente, a presente composição contém pelo menos DHA, mais preferencialmente DHA e EPA. EPA é convertido em DPA (0-3), aumentando a subsequente conversão de DPA em DHA no cérebro. Por isso, a presente composição preferencialmente contém uma quantidade significativa de EPA, para assim ainda estimular a formação de DHA in vivo.
O DHA, EPA e/ou DPA são preferencialmente providos como triglicerídeos, diglicerídeos, monogçlicerídeos, ácidos graxos livres ou seus sais ou ésteres, fosfolipídios, lisofosfolipídios, glicerol éteres, lipoproteínas, ceramidas, glicolipídios ou combinações dos mesmos. Preferencialmente, a presente composição compreende pelo menos DHA na forma de triglicerídeo.
Em termos de dosagem diária, o presente método preferencialmente compreende a administração de 400 a 5000 mg de DHA+EPA+DPA (preferencialmente DHA+EPA) por dia, mais preferencialmente 500 a 3000 mg (preferencialmente DHA+EPA) por dia, mais preferencialmente 1000 a 2500 mg (preferencialmente DHA+EPA) por dia. DHA é preferencialmente administrado em uma quantidade de 300 a 4000 mg por dia, mais preferencialmente de 500 a 2500 mg por dia.
A presente composição preferencialmente compreende de 1 a 40 % em peso de DHA com base nos ácidos graxos totais, preferencialmente de 3 a 36% em peso de DHA com base nos ácidos graxos totais, mais preferencialmente de 10 a 30 % em peso de DHA com base nos ácidos graxos totais. A presente composição preferencialmente compreende de 0,5 a 20 % em peso de EPA com base nos ácidos graxos totais, preferencialmente de 2 a 10 % em peso de EPA com base nos ácidos graxos totais, mais preferencialmente de 5 a 10% em peso de EPA com base nos ácidos graxos totais. As quantidades mencionadas acima levam em consideração e otimizam vários aspectos, incluindo o sabor (por exemplo, níveis muito altos de LCP reduzem o sabor, resultando em uma conformidade reduzida).
A presente composição preferencialmente contém pelo menos um óleo selecionado de óleo de peixe, óleo de alga e lipídios de ovos. Preferencialmente, a presente composição contém óleo de peixe compreendendo DHA e EPA.
A proporção dos pesos de DHA a EPA é preferencialmente maior que 1, mais preferencialmente 2:1 a 10:1, mais preferencialmente 3:1 a 8:1. As proporções e quantidades mencionadas acima levam em consideração e otimizam vários aspectos, incluindo sabor níveis muito altos de LCP reduzem o sabor, resultando em uma conformidade reduzida), equilíbrio entre DHA e precursores do mesmo para garantir eficácia ideal enquanto mantém as formulações com baixo volume.
Fontes de DHA, possíveis fontes de DHA: óleo de atum, (outros) óleos de peixe, ésteres de alquila ricos em DHA, óleo de algas, gema de ovo, o fosfolipídio enriquecidos com n-3 LCPUFA, por exemplo, DHA de fosfatidilserina.
A presente composição preferencialmente contém uma quantidade muito baixa de ácido araquidônico (AA). Preferencialmente, a proporção em peso DHA/AA na presente composição é pelo menos 5, preferencialmente pelo menos 10, mais preferencialmente pelo menos 15, preferencialmente até, por exemplo, 30 ou mesmo até 60. O presente método preferencialmente compreende a administração de uma composição compreendendo menos de 5 % em peso de ácido araquidônico com base nos ácidos graxos totais, mais preferencialmente abaixo de 2,5% em peso, por exemplo, abaixo de 0,5% em peso. URIDINA, UMP
A composição de acordo com a invenção compreende uma de mais de uridina, citidina e/ou equivalente da mesma, incluindo sais, fosfatos, derivados de acila e/ou ésteres. A composição preferencialmente compreende pelo menos uma uridina ou um equivalente da mesma selecionada do grupo consistindo em uridina (isto é, ribosil uracila), desoxiuridina (desoxirribosil uracil), fosfatos de uridina (UMP, dUMP, UDP, UTP), nucleobase uracila e derivados de uridina acetilada. Em uma realização, citidina, CMP, citicolina (CDP-colina) também podem ser aplicadas. Preferencialmente, a composição a ser administrada de acordo com a presente invenção compreende a fonte de uridina selecionada do grupo consistindo em uridina, desoxiuridina, fosfatos de uridina, uracila, e uridina acetilada.
Preferencialmente, a composição de acordo com a invenção compreende um fosfato de uridina selecionado do grupo consistindo em monofosfato de uridina (UMP), difosfato de uridina (UDP) e trifosfato de uridina (UTP); e/ou a fosfato de citidina (CMP, CDP, CTP, preferencialmente CMP). Em uma realização preferida, a composição compreende pelo menos um dos fosfatos de uridina mencionados acima. Mais preferencialmente, a presente composição compreende UMP, já que UMP É mais eficiente sendo absorvido pelo corpo. Preferencialmente, pelo menos 50% em peso da uridina na presente composição são providos por UMP, mais preferencialmente pelo menos 75 % em peso, mais preferencialmente pelo menos 95 % em peso. Doses administradas são dadas como UMP. A quantidade de fontes de uracila pode ser calculada considerando o equivalente molar para quantidade de UMP (peso molecular de 324 Dáltons).
O presente método preferencialmente compreende a administração de uridina (a quantidade cumulativa de uridina, desoxiuridina, fosfatos de uridina, nucleobase uracila e derivados de uridina acilada) em uma quantidade de 0,08 a 3 g por dia, preferencialmente de 0,1 a 2 g por dia, mais preferencialmente de 0,2 a 1 g por dia. O presente método preferencialmente compreende a administração de uma composição que compreende uridina em uma quantidade de 0,08 a 3 g de UMP por 100 ml de produto líquido, preferencialmente de 0,1 a 2 g de UMP por 100 ml de produto líquido, mais preferencialmente de 0,2 a 1 g por 100 ml produto líquido.
Preferencialmente, de 1 a 37,5 mg de UMP por quilograma de peso corporal são administrados por dia, mais preferencialmente de 5 a 35, ainda mais preferencialmente de 5 a 30 mg de UMP/kg de peso corporal. As quantidades acima também consideram quaisquer quantidades de citidina, fosfato de citidina e citicolina incorporadas na composição o método.
Preferencialmente, a presente composição compreende fosfato de uridina, preferencialmente monofosfato de uridina (UMP). A UMP é muito eficazmente absorvida pelo corpo. Por isso, a inclusão de UMP na presente composição permite uma elevada eficácia ou eficácia na dosagem mais baixa e/ou a administração de um volume baixo para o indivíduo.
COLINA
Em uma realização preferida, a composição de acordo com a presente invenção contém colina, um sal de colina ou éster de colina. Para o restante do parágrafo, o termo ‘colina’ deve ser considerado por englobar todos esses equivalentes. O sal de colina é preferencialmente selecionado de cloreto de colina, bitartarato de colina e/ou estearato de Colina. O éster de colina é preferencialmente selecionado de uma fosfatidilcolina e lisofosfatidilcolina. O presente método preferencialmente compreende a administração de mais de 50 mg de colina por dia, preferencialmente de 80 a 2000 mg de colina por dia, mais preferencialmente de 120 a 1000 mg de colina por dia, mais preferencialmente de 200 a 600 mg de colina por dia. A presente composição preferencialmente compreende de 50 mg a 3000 gramas de colina por 100 ml da composição líquida, preferencialmente de 200 mg a 1000 mg de colina por 100 ml. Os números acima são baseados em colina, as quantidades de equivalentes ou fontes de colina podem ser calculadas considerando o equivalente molar para colina em consideração, com base na massa molar 104 g de colina / mol.
FOSFOLIPÍDIOS
Preferencialmente, a composição de acordo com a presente invenção compreende fosfolipídios, preferencialmente de 0,1 a 50 % em peso de fosfolipídios com base no peso total dos lipídios, mais preferencialmente de 0,5 a 20 % em peso, mais preferencialmente entre 1 e 10% em peso, mais preferencialmente entre 1 e 5 % em peso com base no peso total dos lipídios. A quantidade total de lipídios é preferencialmente entre 10 e 30 % em peso de matéria seca, e/ou entre 2 e 10 g de lipídio por 100 ml para uma composição líquida. A composição preferencialmente compreende entre 0,01 e 1 grama de lecitina por 100 ml, mais preferencialmente entre 0,05 e 0,5 grama de lecitina por 100 ml. Foi descoberto que uma composição com essas quantidades preferidas é muito eficaz. Em uma realização, os fosfolipídios compreendem pelo menos dois fosfolipídios selecionados do grupo consistindo em fosfatidilcolina, fosfatidi etanolamina, fosfatidi inositol e fosfatidilserina, preferencialmente pelo menos PC e PE.
VITAMINAS
A composição de acordo com a presente invenção preferencialmente compreende pelo menos uma vitamina do complexo B. A vitamina B é selecionada do grupo da vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina ou niacinamida), vitamina B5 (ácido pantotênico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxal ou piridoxamina, ou cloridrato de piridoxina), vitamina B7 (biotina), vitamina B9 (ácido fólico ou folato), e vitamina B12 (várias cobalaminas). Os equivalentes funcionais estão englobados dentro desses termos.
Preferencialmente, pelo menos uma vitamina B é selecionada do grupo de vitamina B6, vitamina B12 e vitamina B9. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos duas selecionadas do grupo consistindo em vitamina B6, vitamina B12 e vitamina B9. Em particular, bons resultados foram alcançados com uma combinação compreendendo vitamina B6, vitamina B12 e vitamina B9. Novamente, os equivalentes funcionais estão englobados dentro desses termos...
A vitamina B deve ser administrada em uma dose eficaz, dose que depende do tipo de vitamina B usada. Como um princípio básico, uma dose adequada mínima ou máxima pode ser escolhida com base nas recomendações dietéticas conhecidas, por exemplo, conforme recomendado pelo Instituto de Medicina (IOM) da Academia Nacional Norte-americana de Ciências ou pelo Comitê Científico de Alimento (um comitê científico da UE), a informação reveladas nesse documento e opcionalmente uma quantidade limitada de teste de rotina. Uma dose mínima pode ser baseada na exigência média estimada (EAR), embora uma dose inferior já possa ser eficaz uma dose máxima preferencialmente não excede os níveis toleráveis de ingestão superior (UL), conforme recomendado pelo IOM.
Se presente na composição nutricional ou medicamento, a vitamina B6 está preferencialmente presente em uma quantidade para prover uma dosagem diária na faixa de 0,1 a 100 mg, em particular na faixa de 0,5 a 25 mg, mais em particular na faixa de 0,5 a 5 mg. A presente composição preferencialmente compreende de 0,1 a 100 mg de vitamina B6 por 100 g (líquido) do produto, mais preferencialmente de 0,5 a 5 mg de vitamina B6 por 100 g (líquido) do produto, mais preferencialmente de 0,5 a 5 mg de vitamina B6 por 100 g (líquido) do produto.
Se presente na composição nutricional ou medicamento, a vitamina B12 está preferencialmente presente em uma quantidade para prover uma dosagem diária na faixa de 0,5 a 15 μg, em particular na faixa de 1 a 10 μg, mais em particular na faixa de 1,5 a 5 μg. A presente composição preferencialmente compreende de 0,5 a 15 μg de vitamina B12 por 100 g (líquido) do produto, mais preferencialmente de 1 a 10 μg de vitamina B12 por 100 g (líquido) do produto, mais preferencialmente de 1,5 a 5 μg de vitamina B12 por 100 g (líquido) do produto. O termo “vitamina B12” incorpora todos os equivalentes de cobalamina conhecidos na técnica.
Em todo o pedido, os termos “ácido fólico”, “folato” e “B9” são usados indistintamente. Se presente na composição nutricional ou medicamento, a vitamina B9 está preferencialmente presente em uma quantidade para prover uma dosagem diária na faixa de 50 a 1000 μg, em particular na faixa de 150 a 750 μg, mais em particular na faixa de 200 a 500 μg. A presente composição preferencialmente compreende de 50 a 1000 μg de ácido fólico por 100 g (líquido) do produto, mais preferencialmente de 150 a 750 μg de ácido fólico por 100 g (líquido) do produto, mais preferencialmente de 200 a 500 μg de ácido fólico por 100 g (líquido) do produto. Os folatos incluem ácido fólico, ácido folínico, formas de folatos metiladas, meteniladas ou formiladas, seus sais ou ésteres, bem como seus derivados com um ou mais ácido glutâmico, e todos na forma reduzida ou oxidada.
VITAMINAS C, E
Vitamina C, ou um equivalente funcional da mesma, pode estar presente em uma quantidade para prover uma dosagem diária na faixa de 20 a 2000 mg, em particular na faixa de 30 a 500 mg, mais em particular na faixa de 75 a 150 mg. Em uma realização, a vitamina C, ou um equivalente funcional da mesma, está presente em uma quantidade na faixa de 20 a 2000 mg, em particular na faixa de 30 a 500 mg, mais em particular na faixa de 75 a 150 mg por 100 ml da composição.
Tocoferol e/ou um equivalente do mesmo (isto é, um composto que tem a atividade da vitamina E) pode estar presente em uma quantidade para prover uma dosagem diária na faixa de 10 a 300 mg, em particular na faixa de 30 a 200 mg, mais em particular na faixa de 35 a 100 mg, para prevenir dano oxidativo resultante da PUFA dietética. Em uma realização, tocoferol e/ou equivalente está presente em uma quantidade na faixa de 10 a 300 mg, em particular na faixa de 30 a 200 mg, mais em particular na faixa de 35 a 100 mg por 100 ml da composição. O termo “tocoferol e/ou um equivalente do mesmo”, e ‘alfa-TE’, conforme usado nessa descrição, compreende tocoferóis, tocotrienóis, derivados aceitáveis farmacêuticos e/ou nutricionais dos mesmos. Os números acima correspondem à quantidade de alfa-tocoferol, reconhecido na técnica.
SELÊNIO
A presente composição preferencialmente contém selênio, por causa de sua atividade antioxidante. Preferencialmente, o presente método provê a administração de uma composição compreendendo 0,01 e 5 mg de selênio por 100 ml do produto líquido, preferencialmente de 0,02 e 0,1 mg de selênio por 100 ml do produto líquido. A quantidade de selênio administrada por dia é preferencialmente mais de 0,01 mg, mais preferencialmente de 0,01 a 0,5 mg.
Em uma realização preferida, a composição ainda compreende, por dose diária ou preferencialmente por 100 ml da composição: de 200 a 600 mg de colina, de 50 a 1000 mg de fosfolipídios, de 0,5 a 3 mg de vitamina B6, de 50 a 500 μg de ácido fólico, e de 1 a 30 μg de vitamina B12.
Mais preferencialmente, a composição compreende, por dose diária ou preferencialmente por 100 ml da composição: 100 a 500 mg, preferencialmente 200 a 400 mg de EPA, 1000 a 1500 mg, preferencialmente 1100 a 1300 mg de DHA, 50 a 600 mg, preferencialmente 60 a 200 mg de fosfolipídios, 200 a 600 mg, preferencialmente 300 a 500 mg de colina, 400 a 800 mg, preferencialmente 500 a 700 mg de UMP (monofosfato de 20 a uridina), 60 mg, preferencialmente 30 a 50 mg de vitamina E (alfa 60 a -TE) 100 , mg, preferencialmente 70 a 90 mg de vitamina C, 40 a 80 μg, preferencialmente 50 a 70 μg de selênio, 1 a 5 μg, preferencialmente 2 a 4 μg de vitamina B12, 0,5 a 3 mg, preferencialmente 0,5 a 2 mg de vitamina B6, e 200 a 600 μg, preferencialmente 300 a 500 μg de ácido fólico.
Em um aspecto da invenção, as composições, seja como nutrição completa ou como um suplemento, conforme detalhadas acima, são destinadas para uso no gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia, para uso no tratamento de pacientes com fenilcetonúria ou para melhorar a função cerebral ou cognitiva nesses pacientes, particularmente pacientes com PKU.
O termo 'melhorar a função cerebral ou cognitiva' inclui prevenir ou minimizar o risco de déficits cerebrais ou cognitivos, atrasar o retardo mental e diminuir o risco de convulsões e tremores e melhorar os déficits de atenção (isto é, problemas de concentração).
A invenção é particularmente direcionada para preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo que está associado com acúmulo de phe, particularmente seres humanos identificados como pacientes com PKU.
Em um aspecto, a invenção pertence ao método para tratamento ou fornecimento de i) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou ii) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com fenilcetonúria; e/ou iii) preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, preferencialmente um método para tratar ou fornecer gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria, particularmente para preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo e/ou preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, o dito método envolvendo a administração aos ditos pacientes das composições conforme definidas aqui acima.
Em outro aspecto, a invenção pertence às composições acima (como uma nutrição completa ou um a suplemento) para uso em i) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou ii) gerenciamento nutricional u tratamento de pacientes com fenilcetonúria; e/ou iii) preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, preferencialmente uma composição para uso no tratamento ou gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com fenilcetonúria, particularmente para uso na preservação ou melhora da função cognitiva e reduzir déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia e/ou preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia.
Em outro aspecto, a invenção pertence ao uso de uma composição, conforme definido aqui acima, na fabricação de um produto (como uma nutrição completa ou um suplemento) para i) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou ii) gerenciamento nutricional ou tratamento de pacientes com fenilcetonúria; e/ou iii) preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia, preferencialmente um produto para tratamento ou gerenciamento nutricional de pacientes com hiperfenilalaninemia e/ou pacientes com particularmente para preservar ou melhorar função cognitiva e reduzir déficit cognitivo em pacientes com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia e/ou preservar ou melhorar a função cognitiva e reduzir o déficit cognitivo associado com fenilcetonúria ou hiperfenilalaninemia.
EXEMPLOS
Nos exemplos abaixo, os pacientes com PKU consumirão suplementos de aminoácido livre de Phe para compensar a redução das fontes naturais de proteína que é necessária para prevenir a ingestão de Phe em excesso. Esses suplementos são enriquecidos com vitaminas, minerais, oligoelementos, e/ou ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa para equilibrar as mudanças introduzidas pela dieta restritiva, de baixa proteína que o paciente está aderindo. Quando, por exemplo, é exigido que um paciente adulto tome 60g de Proteína Equivalente (PE) por dia, isso pode ser dividido em 3 porções iguais de 20g de PE, para serem tomadas ao longo do dia.
EXEMPLO 1
4 porções por dia; 3 suplementos padrão + 1 porção de um suplemento de acordo com a invenção. As exigências nutricionais diárias são providas por 3 porções de um suplemento contendo micronutrientes e aminoácidos + 1 porção contendo as quantidades diárias de nutrientes divulgadas nesse pedido.
A composição desse suplemento adicional é especificamente adaptada para certificar se que é adequada para pacientes com PKU. Além disso, os níveis de vitaminas, minerais, oligoelementos e ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa são adaptadas de tal maneira que as ingestões diárias pretendidas para esses nutrientes podem ser alcançados exceder os limites toleráveis superiores. TABELA 1 DO EXEMPLO 1
Figure img0001
* Todas as outras vitaminas, minerais e oligoelementos são adicionados em níveis que são suficientes para cobrir as exigências diárias.
As exigências nutricionais diárias são produzidas por 2 porções de um suplemento contendo aminoácidos e micronutrientes padrão + 1 porção contendo as quantidades diárias necessárias dos nutrientes revelados neste pedido bem como as mesmas quantidades de aminoácidos, vitaminas, minerais e oligoelementos como os outros 2 suplementos.
Esse suplemento adicional é especificamente adaptado para certificar-se que é adequado para pacientes com PKU. Além disso, os níveis de vitamina, minerais, oligoelementos e ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa são adaptados de tal maneira que as ingestões diárias pretendidas desses nutrientes podem ser alcançadas sem exceder os limites toleráveis superiores. TABELA 2 DO EXEMPLO 2
Figure img0002
Figure img0003
* Todas as outras vitaminas, minerais e oligoelementos são adicionados em níveis que são suficientes para cobrir as exigências diárias.
EXEMPLO 3
3 porções por dia; 3 porções de uma nova fórmula
Exigências nutricionais diárias são providas por 3 porções de um suplemento contendo aminoácidos e micronutrientes que também contêm as quantidades diárias exigidas de nutrientes revelados nesse pedido.
Cada porção provê 1/3 das ingestões diária pretendidas de vitaminas, minerais, oligoelementos e ácidos graxos poli-insaturados de cadeia longa, bem como 1/3 da quantidade diária dos nutrientes revelados nesse pedido. A fórmula é especificamente adaptada aos pacientes com PKU. TABELA 3 DO EXEMPLO 3
Figure img0004
Figure img0005
* Todas as outras vitaminas, minerais e oligoelementos são adicionados em níveis que são suficientes para cobrir as exigências diárias.
EXEMPLO 4
Efeito positivo da composição nutricional de acordo com a invenção na função cognitiva comportamental e plasticidade sináptica no cérebro. Material e Métodos Animais e Dietas usadas na experiência (FC)
FC é o suplemento ativo que foi adicionado a três níveis diferentes de Phe em uma ração animal basal animal. O suplemento foi composto de uma combinação específica de nutrientes incluindo uridina-5'-monofosfato, colina, e os ácidos graxos n-3 poli-insaturados (PUFAs), ácido docosa- hexaenoico (DHA) e ácido eicosapentaenoico.
Nessa experiência, o modelo de camundongo C57Bl/6 Pahenu2 foi usado. Os camundongos homozigoto macho e fêmea (PKU) e ninhada tipo selvagem (WT) foram obtidos de nossa própria criação. Os camundongos macho e fêmea foram alojados em salas separadas sob o mesmo ciclo claro/escuro de 12:12, temperatura e condições de umidade. Os 60 camundongos PKU individuais e 10 WT foram subdivididos em sete grupos experimentais, recebendo diferentes dietas. A fórmula basal para todas as dietas foi AIN93G (Research Diet Services, Wijk bij Duurstede). Os WT individuais receberam ração normal com um teor de Phe de 8,8 g/kg. Seis grupos de camundongos PKU surgiram quando a suplementação de FC e de três diferentes teores de Phe foi randomizada.
Isso resultou nos grupos a seguir: os primeiros dois grupos receberam a mesma ração normal AIN93G conforme anteriormente descrito para WT individuais (teor de Phe de 8,8 g/kg). Um desses grupos recebeu a dieta sem FC, o outro grupo recebeu a dieta, porém com FC: indicado como Phe8.8 e Phe8.8+FC, respectivamente. Os últimos grupos receberam uma dieta com Phe baixa. Essa dieta continha 4,0 g/kg de Phe com ou sem FC: indicado Phe4.0 e Phe4.0+FC, respectivamente. Finalmente, um grupo de teor de Phre médio foi criado em que os conjuntos de níveis de Phe foram ajustados entre os grupos de Phe elevada e Phe baixa. O conteúdo da dieta com Phe média foi de 6,4 g/kg: indicado Phe6.4 e Phe6.4+FC, respectivamente. Os níveis de aminoácidos dentro do alimento são descritos na tabela 1. Todas as dietas atendem à exigência mínima nutricional para animais de laboratório. Os animais tinham ad libitum accesso a essas dietas e água por 12 semanas. No começo da experiência (dia pós-natal (PND) 28), os animais foram desmamados e uma amostra de sangue foi tirada por punção da veia da cauda. No PND 31, os animais foram expostos a uma arena circular de campo aberto e subsequentemente colocados nas diferentes dietas por 12 semanas. Todos os animais foram pesados diariamente entre 16:00 e 18:00 na primeira semana da experiência (PND 31 a PND 38) e a partir de então semanalmente. A ingestão de alimento foi medida diariamente. Dentro dessas 12 semanas, a coleta de sangue foi realizada no PND 59 e 87. No PND 115, todos os animais foram submetidos à mesma arena de campo aberto e foram subsequentemente submetidos à eutanásia através de uma punção no coração para coletar sangue, seguido pela perfusão. Todos os procedimentos relacionados aos animais dentro desse estudo foram aprovados pelo comitê ético da Universidade de Groningen, Holanda. Tabela 1. Níveis de aminoácido nas diferentes composições nutricionais dos grupos de tratamento Phe 8.8, Phe 6.4 e Phe 4.0.
Figure img0006
GENOTIPAGEM
Para estabelecer o genótipo dos animais, a análise de PCR quantitativa (PCRq) foi realizada no DNA extraído do tecido da cauda. O procedimento de isolamento do DNA foi iniciado através da incubação do tecido da cauda em 0,5 mL do tampão de lise da cauda do camundongo (Tris-HCl a 100 mM, pH 8,5; EDTA a 5 mM, pH 8,0; NaCl a 200 mM; 0,2% (p/v) SDS) e proteinase K (100 μg/ml, razão de 100:1) durante a noite a 55°C em 600 ciclos/minuto (rpm). No dia seguinte, as amostras foram submetidas a vórtex e centrifugadas por 10 minutos a 13.000 rpm. Subsequentemente, 450 μL do sobrenadante foram transferidos para um novo tubo contendo 0,5 mL de isopropanol. Após misturar suavemente essas soluções, o tubo foi centrifugado por 10 minutos a 6000 rpm. O sobrenadante foi removido e o DNA peletizado foi seco ao ar por pelo menos 30 minutos. Para preparar o DNA para PCRq, o DNA peletizado foi ressuspenso em 200 μl de tampão TE (Tris-HCl a 10 mM; 1 mM EDTA), submetido a vórtex, e incubado por 10 minutos a 55°C. Subsequentemente, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 15.000 força centrífuga relativa (rcf), 50 vezes diluídas com água mineralizada, submetidas a vórtez e novamente centrifugadas por 10 minutos a 15.000 rcf. Uma placa de 96 poços (Biorad, HSP-9601) foi carregada com 2 μl das amostras com 5 μL de Mastermix. Esse mastermix continha: Tampão TE
Mistura de PCR (Kit de Sonda de Bioline SensiMixTM (500 reações)) WT/PAH-enu2 CCG TCC TGT TGC TGG CTT AC para frente WT/PAH-enu2 CAG GTG TGT ACA TGG GCT TAG ATC WT probe CCG AGT CZZ LCA LTG CA reverso PAH-enu2 CCG AGT CZL LCA CTG CA sonda
Os iniciadores foram baseados no Genbank e replicados de acordo com orientações de Eurogentec. A sonda WT foi marcada com um fluoróforo FAM e a sonda PKU foi marcada com um fluoróforo Amarelo Yakima (Epoch Biosciences). A placa foi executada em um sistema de detecção de sequência ABI Prism 7500. Os parâmetros de ciclo foram 95 °C por 10 minutos, 95°C por 0,15 minutos e 60°C por 1 minuto. Esse ciclo foi repetido 39 vezes.
MEDIÇÕES COMPORTAMENTAIS
No PND 31 e 115, todos os animais foram submetidos a um campo aberto. Nesse paradigma comportamental, os animais foram deixados explorados um campo aberto circular (r= 40 cm) com uma superfície branca e laterais cinzas. Vários minutos antes de começar trilha, a arena foi limpa com 30% de etanol. No começo da trilha, o animal foi colocado no centro da arena na qual ele poderia explorar livremente a arena por 10 minutos. Cada trilha foi gravada e monitorada com o sistema EthoVision (Noldus, Holanda). Os comportamentos a seguir foram obtidos a partir desse sistema: tempo, frequência e latência para a primeira zona central de entrada, zona média e zona de borda, distância movida, velocidade, e número de transições de zona... Os resultados são plotados na Figura 1. A figura 1A mostra a definição das diferentes zonas; um campo aberto de 80 cm foi usado. O programa de análise distinguiu entre três zonas: central, média e de borda. Na figura 1B, o tempo para deixar a zona central é apresentado para a diferente intervenção e grupos de controle.
IMUNO-HISTOQUÍMICA
Para imuno-histoquímica, os cérebros dos animais foram coletados através de perfusão com paraformaldeído (PFA). Imediatamente após punção cardíaca, o animal foi preparado de tal a maneira que o curacao estivesse visível. A agulha, conectada a um sistema de bomba, foi inserida no ventrículo esquerdo. Subseqüentemente, o átrio direito foi cortado e a solução de enxague (0,9% NaCl; 5mL de heparina/L) foi passada em uma velocidade de 9,25 rpm equivalente a 15ml/min. Quando o fígado se tornou pálido, a solução de enxágue foi alterada para solução de fixação (4% de PFA em tampão de fosfato a 0,1M (PB); pH7,4). Após perfusão, o cérebro foi coletado e pós-fixado por 24 horas em solução de fixação. Após 24 horas, os cérebros foram armazenados em solução salina tamponada de fosfato a 0,1M (PBS) a 4 °C. Em lotes, os cérebros foram colocados em uma solução de sacarose (30% de sacarose, PB a 0,01M). Essa solução foi usada para agir como um crioprotetor. Os cérebros foram congelados com nitrogênio líquido imediatamente após eles terem decido para o fundo do recipiente (aproximadamente 16 horas após submersão dos cérebros na solução de sacarose) e armazenados a -80 °C. Os cérebros foram cortados em dois lotes no criostato Leica CM3050. As fatias foram cortadas em 20μM e a câmara e temperatura do objeto foi mantida entre -16°C e - 14°C. As fatias foram armazenadas em PBS a 0,01M com 0,1% de azida de sódio (NaN3) a 4°C.
Coloração de Imunoquímica de PSD-95 foi realizada como segue: seções flutuantes livres (5 fatias de hipocampo, 5 pré-frontal e 5 estriato) foram enxaguadas 3 vezes com solução salina tamponada de Tris a 0,01M, pH7,4 (TBS) antes da incubação com 0,3% de H2O2 em TBS. As seções foram enxaguadas novamente 4 vezes com PBS e incubadas com camundongo monoclonal 1:1000 Anti-PSD-95, Millipore, MABN68, 1% de NGS e 0,5% de Triton-X em TBS por 2 horas em banho com água a 37 °C. após incubação a 37 °C, as seções foram deixadas à temperatura ambiente no agitador por 24 horas e subsequentemente armazenadas por 48 horas a 4 °C. As seções foram enxaguadas 6 vezes com TBS antes da incubação da solução de anticorpo secundária (1:500 Biotin-SP-conjugado Cabra-Anticamundongo affiniPure, Jackson, código: 115- 0.65166 Lot# 110630, 1% de NGS e 0,5% de Triton-X em TBS) por 2 horas à temperatura ambiente. As seções foram enxaguadas 4 vezes com TBS, armazenadas a 4 °C durante a noite e enxaguadas novamente 2vezes antes da incubação com complexo AB 1:400, Vectastaína PK-6100 padrão em TBS por 2 horas. Após incubação, as fatias foram enxaguadas 6 vezes com TBS e colocadas em uma solução de 3,3’-diaminobenzidina (DAB; 7 mg/15 mL). O desenvolvimento da cor foi iniciado pela introdução de 100 μL de 0,1% de H2O2 em H2O para a solução de DAB. A reação foi interrompida durante o enxágue 3 vezes com TBS. As sessões foram armazenadas durante a noite a 4 °C antes da montagem com solução de gelatina (1% de Gelatina; 0,05% de Aluína em H2O). As lâminas com as fatias montadas foram executadas através de uma série de 7 banhos (2,3 a 100% de Álcool, 4 a 70% de Álcool 30% de Xilol, 5 a 30% de Álcool, 70% de Xilol,6,7,8- a 100% de Xilol) antes de lamínulas com DPX. As lâminas foram secadas ao ar pelo menos 7 dias antes da análise.
Para quantificação, o sistema de análise de imagens Quantimet 550 (Leica, Cambridge, UK) foi usado. Uma macro foi projetada para medir em uma ampliação de 10 vezes a densidade óptica corrigida a partir de uma região desenhada à mão. As regiões a seguir foram medidas: Estrato Oriens, CA1 células piramidais, Estrato radiatum, duas sub-regiões da camada molecular (camada molecular (IV) camada molecular (V) no lado dorsal do giro dentado e camada molecular (IX) e camada molecular (X) no lado ventral do giro dentado), a lâmina interna e a lâmina externa do giro dentado, o hilo, estrato lucidum e as células granulares do CA3. A densidade óptica dessas regiões foi corrigida para a densidade óptica do copo caloso.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
O peso corporal e ingestão de alimento foram medidos semanalmente. Para ambos os conjuntos de dados, as medições repetidas ANOVA com um teste Bonferroni post-hoc foram usadas.
Vários parâmetros no campo aberto não foram normalmente distribuídos. Portanto, o teste Kruskal- Wallis foi usado para examinar as diferenças na distância movida, velocidade e tempo gasto nas diferentes zonas. Os dados obtidos a partir da transição entre zonas e latência para deixar a zona central foram normalmente distribuídos. Portanto, os testes t foram usados para examinar as diferenças entre WT e PKU no PND 31 e PND 115. Uma ANOVA de Uma Via foi usada para examinar as diferenças entre todos os grupos no último parâmetro.
Finalmente, os dados imuno-histoquímicos de PSD-95 não foram normalmente distribuídos. Portanto, os testes Kruskal-Wallis foram usados para examinar se havia diferenças entre os grupos. O Teste de Comparação Múltipla de Dunn foi usado para decifrar quais grupos diferiam significativamente um do outro. Fenótipo indistinto de camundongo C57Bl/6 PKU no campo aberto redondo
O paradigma do campo aberto foi usado para examinar diferenças no comportamento espontâneo entre WT e o PKU nas diferentes dietas. Para estabelecer um fenótipo do camundongo PKU, os parâmetros a seguir foram comparados entre o WT e PKU individuais no PND 31 e WT e PKU individuais na Phe elevada sem FC no PND 115: Tempo, frequência e latência para a primeira zona central, zona média e zona de borda, distância movida, velocidade e transições de zona. Macho e fêmea foram agrupados juntos enquanto não foram encontradas diferenças significativas em nenhum parâmetro para gênero. Não foram encontradas diferenças significativas para velocidade, distância movida e tempo gasto nas diferentes zonas no PND 31. Foram encontradas diferenças na transição de zona na qual os PKU individuais mostram menos transições de zona da zona central para média e da zona média para a de borda (zona central para média: teste T (t=2.759 df=68) p=0,007, zona média para de borda: teste T (t=2,140 df=68) p= 0,036).
Uma diferença significativa foi encontrada entre o WT e PKU individuais em Phe elevada sem grupo FC na latência para deixar a zona central (teste T (t=2.709 df=12) p=0,019).
Tratamento nutricional restaura redução de PSD-95 nas sinapses do hipocampo proximal em PKU individuais em dieta com Phe elevada.
Para investigar o efeito de FC na formação de sinapse e plasticidade de sinapses excitatórias, PSD- 95 foi usado como uma marcador pós-sinápticos. A densidade óptica corrigida foi calculada para 12 subáreas do hipocampo. Essas 12 áreas poderia ser grosseiramente subdivididas em sinapses proximais e distais. As áreas de sinapse proximal incluíam:
CA3, lâmina interna e externa do giro dentado e o CA3. As áreas de sinpase distal incluíam: Estrato Oriens, Estrato radiatum, a camada molecular subdividida em camada molecular (IV), camada molecular (V), camada molecular (IX) e camada molecular (X), hilo e Estrato lucidum. O teste nçao paramétrico revelou uma diferença significativa entre as dietas na densidade óptica corrigida na lâmina interna e externa do giro dentado (lâmina interna; p=0,041, lâmina externa p=0,024). O Teste de Comparação Múltipla de Dunn mostrou uma diferença significativa entre o WT: Phe8.8 e o PKU na mesma dieta (p< 0,05). Esse resultado poderia explicar o efeito positive do tratamento nutricional no comportamento do grupo Phe8.8.
CONCLUSÃO:
O fenótipo observado de camundongo PKU em grupo de Phe elevada foi restaurado ao nível do WT quando a composição de acordo com a invenção (FC) foi suplementada no mesmo grupo do conteúdo de Phe (Figura 1). FC aumenta a expressão de PSD- 95 nas sinapses proximais do hipocampo no grupo de Phe elevada, indicando que a função de sinapse neuronal foi melhorada no camundongo PKU. Essas descobertas sugerem que FC tem um efeito benéfico nas sinapses proximais do giro dentado, uma área que recebe entrada excitatória do córtex entorrinal. O hipocampo, mas também o córtex entorrinal são áreas que estão envolvidas no aprendizado e memória. O efeito benéfico de FC nessa área indica um efeito benéfico no aprendizado e memória nesse modelo de PKU.

Claims (4)

1. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, caracterizada por compreender a) uma fração de proteína consistindo em aminoácidos livres e pelo menos 50% em peso de glicomacropeptídeo, em que a fração de proteína tem menos de 1,0% em peso de fenilalanina, b) uma ou mais de uridina e citidina, ou sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres dos mesmos; c) pelo menos um de ácido docosa-hexaenoico (22:6; DHA), ácido eicosapentaenoico (20:5; EPA) e ácido docosapentaenoico (22:5; DPA), ou ésteres dos mesmos, e d) colina, sendo que, a dita composição contém: (i) 0,08-3 g da quantidade cumulativa de um ou mais dentre uridina e citidina, ou seus sais, fosfatos, derivados de acila ou ésteres, (ii) 400-5000 mg por dia da soma de DHA e EPA e seus ésteres; e (iii) mais de 50 mg de colina.
2. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender entre 30 e 65% de energia de proteína, e entre 1 e 15% de energia de gordura, e entre 1 e 60% de energia de carboidratos digeríveis, e pela composição ser um líquido com uma densidade calórica total entre 50 e 300 kcal/100ml.
3. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela colina estar presente em uma quantidade de 200 a 1000 mg por 100 ml.
4. COMPOSIÇÃO NUTRICIONAL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela uridina estar presente em uma quantidade de 100 a 2000 mg por 100 ml.
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