BR112015010455B1 - Método para produção, isolamento e purificação de antitripsina humana recombinante (osraat) a partir de sementes de arroz - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUÇÃO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE ANTITRIPTASE HUMANA RECOMBINANTE (OsrAAT ) A PARTIR DE SEMENTES DE ARROZ, segundo os quais são previstos genes de arroz geneticamente otimizado por códons OsrAAT, um vetor relacionado ao referido gene, um método para produção de OsrAAT em sementes de arroz transgênico através do uso do referido vetor, e um método para isolamento e purificação de OsrAAT; uma semente de arroz transgênica que expressa OsrAAT é preparada pelo vetor de expressão específico do endosperma; a pureza de OsrAAT isolado purificado de grãos de arroz transgênico atingiu 97% com grau de pureza HPLC; o rendimento de OsrAAT foi de até 18,89 ± 3,19% das proteínas totais solúveis; assim, 0,366 g de OsrAAT por quilograma pode ser produzido a partir de arroz integral.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente invento pertence ao campo de invenção de engenharia genética e se relaciona particularmente a um gene de arroz otimizado por códons OsrAAT, vetor relacionado e um método para produção, isolamento e purificação de antitripsina humana e combinante (OsrAAT) de sementes de arroz, transgênicas.

DESCRIÇÃO DO ESTADO DA TÉCNICA

[002] A antitripsina humana α 1 (AAT), também conhecida como inibidor de protease humana (α1- PI), é um inibidor de protease enriquecido por serina no sangue humano periférico. É sintetizado principalmente no fígado e inibe a elastase neutrofílica no pulmão (Blank, Brantly, 1994). A deficiência de AAT é uma doença hereditária associada a enfisema e doença hepática (Eriksson, 1996). A entrega de antitripsina α1 humana derivada do plasma (AAT derivada do plasma, pAAT) através de injeção intravenosa é o único tratamento clínico viável para pacientes com deficiência de AAT (Heresi e Stoller, 2008). Além disso, a AAT possui muitos usos terapêuticos, como por exemplo a prevenção de diabetes Tipo I em camundongos, tratamento de doenças de pele (Lewis, Shapiro et al., 2005; Brown, 2006) e desempenha um efeito anti-inflamatório importante no sistema imune inato (Xu, Dai et al., 2001).

[003] Atualmente, pAAT disponível comercialmente é produzido em sua maioria a partir de plasma humano, porém a saída desse é limitada pelo fornecimento de sangue. Por sua vez, pAAT de origem humana possui o risco de transmissão de agentes patogênicos conhecidos ou desconhecidos. Assim, parece ser muito complexo para assegurar a sua segurança (Kamaukhova, Ophir, et al., 2006). Além disso, a fim de satisfazer as exigências do mercado, abordagens alternativas foram desenvolvidas para a produção de antitripsina α1 (rTTA) com boa relação custo-eficácia.

[004] Em 1983, Escherichia coli foi utilizada pela primeira vez para a produção de rAAT inativa (Bollen et al., 1983). Depois disso, o rAAT expresso em Escherichia coli atingiu 38 mg / L (Kamaukhova et al., 2004). No entanto, uma vez que o sistema de expressão de Escherichia coli carece de modificação pós-transcricional, o rAAT expresso só é utilizado para estudos de laboratório. Levedura como um sistema de expressão eucariótico pode realizar modificações de glicano do tipo manose elevada (Cregg, Cereghino et al., 2000), mas tais modificações são diferentes de estruturas de glicano humanas. A deleção e anormalidade de glicosilação são os principais problemas que interferem na expressão da glicoproteína recombinante no sistema de expressão de levedura. Por cultura descontínua com alimentação de levedura, a produção em larga escala de rAAT atingiu um rendimento elevado de 1,23 g/L (Tamer e Chisti, 2001), no entanto, estudos farmacocinéticos mostram que o rAAT produzido pela levedura é rapidamente eliminado do sangue (Casolaro, Fells et al., 1987).

[005] Além disso, alguns estudos utilizaram Aspergillusniger para expressar rAAT devido ao seu padrão de glicosilação se assemelhar mais ao de mamíferos (Maras, van Die et al., 1999; Gerngross 2004; Ward, Lin et al., 2004; Nevalainen, Te'o et al., 2005). No entanto, as modificações de glicano no sistema não foram estudadas e o nível de expressão de 50 mg/L ainda é muito baixo. Portanto, o rAAT expresso neste sistema também é limitado a estudos de laboratório.

[006] Sistemas de expressão de animais, tais como ratos, coelhos, cabras e ovelhas também foram utilizados com sucesso para expressar rAAT (Carlson, Rogers et al., 1989; Archibald, McClenaghan et al., 1990; Massoud, Bischoff et al., 1991; Wright, Carver et al., 1991; Carver, Wright et al., 1992; Ziomek, 1998). Uma escala de rAAT também foi produzida a partir de leite de ovelha (palrymple e Garner, 1998) e de leite de cabra (Ziomek, 1998). A pureza de rAAT isolado de leite de ovelha transgênico atingiu 99,9%, no entanto, em corpos humanos, quantidades vestigiais de AAT natural de ovelhas e antiquimotripsina α1 pode induzir uma resposta de anticorpos sistêmica (Spencer, Humphries et al., 2005).

[007] Sistemas de expressão de plantas também foram utilizados para a produção de rAAT, incluindo cultura de células de arroz (Terashima, Murai et al., 1999), tomate transgênico (Agarwal, Singh et al., 2008) e cloroplastos (Nadai, Bally et al., 2009). Entre eles, os níveis de expressão de rAAT em tomate transgênico e cloroplastos atingiu 1,55% e 2% da proteína total solúvel, respectivamente. O rendimento de rAAT em cultura de células de arroz atingiu 200 mg/L. Descobriu-se recentemente que as células do endosperma de cereais são sistemas de expressão com potencial de utilização para a produção de proteína recombinante. Endosperma de arroz tem sido utilizado para expressar várias proteínas recombinantes farmacêuticas, tais como a lactoferrina humana (Suzuki, Kelleher et al., 2003), lisozima humana (Yang, Guo et al., 2003), fusão de rhlGF-1 e fator de estimulo de colônias de granulócitos macrófagos e humanos (Ning, Xie et al, 2008; Xie, Qiu et al., 2008). Recentemente, as sementes de arroz são aplicadas com sucesso para a produção em larga escala de albumina recombinante de soro humano recombinante (He, Ning et al., 2011). Estes estudos indicaram que endosperma de arroz é uma plataforma de expressão econômica e segura para as proteínas farmacêuticas. Embora a expressão rAAT com diferentes sistemas de expressão tenha progredido, a produção em larga escala antitripsina humana recombinante de derivada de plantas ainda é limitada pelo nível de expressão. Além disso, ainda não pode ser utilizado endosperma de arroz para a produção, isolamento e purificação em larga escala de antitripsina humana recombinante a partir de sementes de arroz.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[008] Um objetivo desta invenção é obter um gene de arroz otimizado por códons recombinantes de gene de antitripsina humana, para melhorar o nível de expressão do gene da antitripsina humana em sementes de arroz. Nesta invenção, ele é chamado de gene OsrAAT (Oryza sativa AAT), e a sequência é mostrada na SEQ ID N°1.

[009] Além disso, a presente invenção também fornece um vetor contendo o gene acima, preferencialmente um vetor de expressão específico de endosperma de arroz ou ainda um vetor que tenha a estrutura mostrada na Figura 3.

[010] Outro objetivo da invenção é obter o uso dos vetores acima para a preparação de sementes de arroz transgênicas contendo OsrAAT.

[011] Mais um objetivo da invenção é proporcionar um método para a preparação de sementes de arroz transgênicas contendo OsrAAT, que compreende os seguintes etapas: (1) preparação de gene OsrAAT que possua a sequência mostrada em SEQ ID N°1; (2) construção de um vetor de expressão OsrAAT que seja especificamente expresso em endosperma de arroz e um vetor de gene marcador selecionável; (3) co-transformação dos vetores obtidos na etapa 2 em tecido de calo de arroz; (4) cultivo do tecido de calo, seguido pelo rastreio e indução para obtenção de uma planta de arroz transgênico contendo OsrAAT; (5) cultivo da planta de arroz transgênico contendo OsrAAT para obtenção de uma semente de arroz transgênico contendo OsrAAT; no qual, o vetor de expressão de OsrAAT referido preferencialmente possua a estrutura mostrada na Figura 3 e no qual, o vetor de gene marcador selecionável referido possua a estrutura mostrada na Figura 4.

[012] Outro objetivo da invenção é proporcionar um método de isolamento e purificação de OsrAAT de sementes de arroz transgênicas, compreendendo as seguintes etapas: (1) preparação de extrato de OsrAAT das sementes de arroz transgênicas contendo OsrAAT como matéria-prima; (2) submissão do extrato de OsrAAT à cromatografia de permuta aniônica como uma purificação preliminar, para se obter a fração de eluição de OsrAAT primária, na qual a resina da cromatografia de permuta aniônica é sefarose FF DEAE ou equivalentes; (3) submissão da fração de eluição OsrAAT primária à cromatografia de permuta catiônica composta com cromatografia de quelantes metálicos como uma purificação secundária, para se obter a fração de eluição OsrAAT secundária, na qual a resina do complexo de cromatografia seja Macroprep CHT-I ou equivalentes; (4) submissão da fração de eluição OsrAAT secundária à cromatografia de permuta aniônica composta com cromatografia hidrofóbica como uma purificação final, para se obter OsrAAT purificada, na qual a resina de cromatografia composta é Capto Adhere ou equivalentes.

[013] Além disso, o método compreende as seguintes etapas: (1) utilização de sementes de arroz transgênicas contendo OsrAAT como matéria-prima, descasque do arroz em arroz meio polido e moagem desse em arroz polido com uma aptidão de 80-100 mesh; mistura do arroz polido com um tampão de extração em uma razão peso (kg) / volume (L) de 1:5 - 1:10 e extração durante 1 hora à temperatura ambiente; submissão da mistura resultante à filtração sob pressão com um pressionador de filtro e placa tipo pano-filtro para se obter extrato de OsrAAT claro; no qual os componentes do tampão de extração são: tampão de fosfato de 20-25mM, 1 mercaptoetanol - 4mm, pH 6,9-7,1; (2) realizar a purificação primária em uma coluna de cromatografia em Sefarose FF DEAE, equilibrar com 8-12 volumes de coluna de tampão de fosfato de 20-25mM pH 6,9-7,1, com uma taxa de fluxo de 100-180cm/h; utilização do extrato de OsrAAT do passo 1 como amostra de carregamento, no qual a amostra possui uma condutividade de 2-3,5ms/cm e um pH de 6,8-7,0; eluição da amostra com tampão de 100-110mM PB e pH 6,8-7,1 a uma taxa de fluxo de 100-180cm/h e coleta da fração de eluição contendo OsrAAT para obtenção da fração de eluição OsrAAT primária; (3) realização da purificação secundária numa coluna de cromatografia Macroprep CHT-I, equilibrar com 8-12 volumes de coluna de tampão de fosfato de 5-12mM e pH 6,9-7,2, com uma taxa de fluxo de 100-150cm/h; diluição da fração de eluição OsrAAT primária da etapa 2 em quatro dobras sobre o volume original como uma amostra de carga, na qual a amostra possua uma condutividade de 2-3,5ms/cm e um pH de 6,8-7,0; eluição da amostra com tampão de 100-110mM PB e pH 6,8-7,1 a uma taxa de fluxo de 100-180cm/h, e coleta da fração de eluição contendo OsrAAT, para obtenção da fração de eluição OsrAAT secundária; (4) realização da purificação final numa coluna de cromatografia Capto Adhere, equilibrar com 8-12 volumes de coluna de tampão de fosfato de 8-12mM e pH 7,5-8,2 com uma taxa de fluxo de 100-180cm/h; utilização da fração de eluição OsrAAT secundária como uma amostra de carga, na qual a amostra possua uma condutividade de 2-3,5ms/cm e um pH de 6,8-7,1; eluição da amostra com tampão de NaCl de 400 mM, 46mM PB e pH 6,6-7,0 a uma taxa de fluxo de 100-180cm/h, e coleta da fração de eluição contendo OsrAAT para obtenção OsrAAT purificada.

[014] Além disso, o método compreende as seguintes etapas: (1) utilização de sementes de arroz transgênicas contendo OsrAAT como matéria-prima, descasque e transformação do arroz em arroz parcialmente polido e moagem e transformação desse arroz em arroz polido com uma aptidão de 80-100 mesh; mistura do arroz polido com um tampão de extração com razão volume/peso de 1kg:10L e extração durante 1 hora à temperatura ambiente; submissão da mistura resultante à filtração sob pressão com um pressionador de filtro e placa tipo pano-filtro para se obter extrato de OsrAAT claro; onde os componentes do tampão de extração são: tampão fosfato 20mM, mercaptoetanol 1mM, pH 7,0; (2) embalagem de uma coluna de cromatografia Econo-column 15/20 com 20 ml de Sefarose FF DEAE, equilibrando a coluna com 200 ml de tampão de fosfato 20 mM pH 7,0 a uma taxa de fluxo de 150 cm/h; utilização do extrato de OsrAAT como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 2,6ms/cm e um pH de 6,95; eluição da amostra com tampão de 108mM PB pH 7,0 a uma taxa de fluxo de 150 cm/h e coleta da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter a fração de Eluição de OsrAAT primária; (3) embalagem de uma coluna de cromatografia Econo-column 15/20 com 20 ml de Macroprep CHT-I, equilibrando a coluna com 200 ml de tampão de fosfato 20mM pH 7,0, a uma taxa de fluxo de 150 cm/h; diluição da eluição de OsrAAT primária da etapa (2) em quatro dobras sobre o volume original como uma amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 3,0ms/cm e um pH de 6,9; eluição da amostra com tampão 108mM PB pH 7,0, a uma taxa de fluxo de 150cm/h, e coleta da fração de Eluição contendo OsrAAT, para obter fração de eluição de OsrAAT secundária; (4) embalagem de uma coluna de cromatografia Econo-column 15/20 com 10ml de Capto Adhere, equilibrando a coluna com 200ml de tampão de fosfato de 10mM, pH 8,0, a uma taxa de fluxo de 150cm/h; utilização da fração de eluição de OsrAAT secundária como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 3,0 ms/cm e pH de 6,9; eluição da amostra com tampão de NaCl 400mM, 46mM PB, pH 6,8 a uma taxa de fluxo de 150cm/h, e coleta da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter OsrAAT purificado.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[015] A Figura 1 é um diagrama esquemático da estrutura do plasmídeo pOsPMP02.

[016] A Figura 2 é um diagrama esquemático da estrutura do plasmídeo pOsPMP131.

[017] A Figura 3 é um diagrama esquemático da estrutura do plasmídeo pOsPMP132.

[018] A Figura 4 é um diagrama esquemático da estrutura do plasmídeo pOsPMP135.

[019] A Figura 5 é o resultado da hibridização Western, mostrando que o OsrAAT expresso foi obtido nas células de endosperma em 9 linhagens de arroz transgênico diferentes.

[020] A Figura 6 é o resultado da hibridização Southern, na qual a digestão de enzima foi realizada com EcoRI, HindIII e ambos EcoRI e HindIII, respectivamente.

[021] A Figura 7 mostra os níveis de expressão de OsrAAT em plantas diferentes.

[022] A Figura 8 é um eletroforograma de cromatografia de permuta aniônica realizada em diferentes resinas de cromatografia como a purificação primária; na qual, Fig. 8A: resina de Sefarose FF DEAE; Fig. 8B: resina Macroprep DEAE; Fig. 8C: resina Capto Q; M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT, Elu1: impureza de pico de eluição, Elu2: OsrAAT pico de eluição, CIP: limpeza no local.

[023] A Figura 9 é um eletroforograma de cromatografia composta realizada em Macroprep CHT-I como purificação primária; na qual, M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT, CIP: limpeza no local.

[024] A Figura 10 é um eletroforograma de cromatografia hidrofóbica realizada em diferentes resinas de cromatografia como purificação secundária; na qual, a Fig. 10A: resina Fenil Sefarose HP, Fig. 10B: resina FF HS fenil sefarose, Fig. 10C: resina Octylsepharose FF, M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT, CIP: limpeza no local.

[025] A Figura 11 é um eletroforograma de cromatografia composta realizada em diferentes resinas de cromatografia como purificação secundária; na qual, a Fig. 11A: resina Macroprep CHT-I, Fig. 11B: resina Capto MMC, Fig. 11C: Capto Adhere; M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT, Elu1: impureza de pico da eluição, Elu2: pico de eluição OsrAAT, CIP: limpeza no local.

[026] A Figura 12 é um eletroforograma de cromatografia composta realizado em Capto Adhere como purificação final; na qual, M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT, CIP: limpeza no local.

[027] A Figura 13 é um eletroforograma de cromatografia de afinidade realizada em diferentes resinas de cromatografia como purificação final; na qual, a Fig. 13A: resina de seleção de AAT, Fig. 13B: Resina sefarose 6B ConA, M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT.

[028] A Figura 14 é um eletroforograma de extrato contendo rAAT bruto que foi purificado sequencialmente através de cromatografia de permuta aniônica, cromatografia de permuta de catiônica com agentes quelantes de metal e cromatografia de permuta aniônica hidrófoba; na qual da esquerda para a direita, as resinas são Sefarose FF DEAE, Macroprep CHT-I e Capto Adhere; M: marcador molecular, S: amostra carregada, FT: pico de fluxo, Elu: pico da eluição OsrAAT.

[029] A Figura 15 é um cromatograma de HPLC de OsrAAT purificado (HPLC- SEC).

[030] A Figura 16 mostra os resultados da análise da atividade biológica de OsrAAT; na qual, à esquerda estão os resultados da análise de SDS-PAGE de desvio de bandas; à direita estão os resultados de hibridização Western; M: marcador molecular, 1: OsrAAT de plantas de arroz de geração 132-17 T1, 2: AAT do plasma humano, 3: OsrAAT com elastase porcina, 4: AAT de plasma humano com elastase porcina, 5: extrato da variedade de arroz Zhonghua 11.

[031] A Figura 17 mostra os resultados da determinação da atividade inibidora da elastase porcina de OsrAAT.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[032] As características e vantagens desta invenção serão descritas detalhadamente em conjunto com os desenhos anexos. Os exemplos são fornecidos apenas para ilustrar esta invenção, mas não pretendem limitar qualquer outro conteúdo divulgado pelo invento.

[033] Nos exemplos a seguir descritos, Macroprep CHT-I foi disponibilizado pela empresa Bio-Rad; DEAE Fast Flow, Macroprep-DEAE, Capto Q, Phenyl Sepharose HP, fenil sepahrose FF HS, Octyl Sepharose FF, Capto MMC, Capto Adhere, AAT-select e dConA Sepharose 6B foram disponibilizados pela empresa GE Healthcare; coluna cromatográfica Econo-column 15/20 foi comprado da empresa Bio-Rad; coluna cromatográfica XK16/20 foi comprado da empresa GE Healthcare. Salvo disposição em contrário, outros materiais e reagentes foram adquiridos por comércio comum.

[034] Exemplo 1: Construção de Vetor de Antitripsina Recombinante Humana Especificamente Expresso em Arroz e Preparação de Planta de Arroz Transgênica.

[035] Genes AAT humanos (número de acesso GenBank: M001002235) foram sintetizados pela Blue Heron Biotech Corporation de acordo com códons genéticos preferenciais de arroz. 46,5% dos códons genéticos de antitripsina α1 humana (AAT) foram otimizados e 18,1% dos nucleotídeos de antitripsina α1 humana foram alterados, como mostrado particularmente na SEQ ID N° 1, mas a sequência de aminoácidos correspondente não foi alterada. Esta invenção utilizou promotor de arroz específico Gt13a e o seu peptídeo sinalizador para expressar gene de antitripsina humana recombinante em células de endosperma de arroz, em particular o vetor de antitripsina humana recombinante expresso especificamente no arroz desta invenção foi construído e as plantas de arroz transgênicas foram rastreadas de acordo com o método de publicação de patente número CN100540667, no qual a albumina de soro humano recombinante dos mesmos foi substituída com antitripsina humana recombinante da presente invenção.

[036] O plasmídeo pOsPMP02 mostrado na Figura 1 foi utilizado para construir o cassete de expressão arroz específico de endosperma de arroz. O gene AAT humano otimizado por códons sintetizado (SEQ ID NO: 1) foi digerido com Myli e Xhol e clonado em pOsPMP02, a construção resultante foi designada como pOsPMP131, como mostrado na Figura 2; e, em seguida, pOsPMP131 foi digerido com HindIII e EcoRI, fragmento 2832bp contendo o promotor Gtl3a e peptídeo sinalizador, gene ATT otimizado por códons e o Terminador Nos (como mostrado na SEQ ID N° 2) foi ligado num vetor binário JH2600, um plasmídeo mediado por Agrobacterium, a construção resultante foi designada como pOsPMP132, como mostrado na Figura 3.

[037] O plasmídeo pOsPMP132 e o plasmídeo pOsPMP135, como mostrado na Figura 4, foram transformados em linhagem EHA105 Agrobacterium tumefaciens, respectivamente (empresa Invitrogen, EUA). pOsPMP132 e pOsPMP135 foram co-transformados em no calo derivado de uma variedade de arroz, transformação Zhonghua 11via mediada por Agrobacterium tumefaciens. E então eles foram cultivados, rastreados e induzidos a gerar plântulas.

[038] As plantas positivas transformadas com resistência à higromicina foram em seguida identificados por amplificação por PCR com o iniciador direto de um peptídeo sinalizador (5'-GAGGGTGTGGAGGCTCTTGT-3') e a sequência reversa do gene de AAT (5' GCCCTTGAAGAAGATGTAGTTC 3 '). Um total de 23 plantas de arroz transgênicas independentes contendo antitripsina α1 recombinante humana e 12 plantas de arroz transgênicas independentes contendo antitripsina α1 recombinante humana de alto rendimento foram obtidas.

[039] Posteriormente, a transferência de Western foi utilizada para identificar se o OsrAAT expresso nos grãos de arroz transgênico foi colhido a partir das células do endosperma. Cerca de 200 mg de sementes de arroz foi polido com 600μl PBS a 4 ° C, e depois centrifugado a 10,620 xg durante 5 minutos, para se obter 40 ml de extrato de proteína bruta. Os extratos de proteína bruta e 200 ng da AAT derivada de soro humano, foram submetidos a 12% de gel SDS- PAGE e, finalmente, coradas com 0,1% de azul brilhante de Coomassie R-250.

[040] Como mostrado na Figura 5, nove linhas de arroz transgênico foram identificadas expressas OsrAAT no endosperma de arroz. Além disso, a transferência de Southern foi usada para identificar as plantas T1 acima de duas linhagens de arroz transgênico, 132-17 e 132-10. Mais detalhadamente, cerca de 100mg de folhas foram respectivamente colocadas em nitrogênio líquido e extraídas com sistema de extração de DNA do genoma de plantas do tipo rápido (Tiangen Biotech Co., LTD, China) para obter DNA genômico. O DNA genômico foi digerido com EcoRI, HindIII, bem como com EcoRI/HindIII (New Engle Biolabs) a 37 ° C durante 8 horas, respectivamente. E, em seguida, eles foram separados por gel de agarose 0,8% e transferidos para membranas MILLIPORE NY+. Os procedimentos foram descritos conforme as instruções da DIG High Prime DNA Labeling e Detection Starter Kit I (Roche). A sonda de 645 pb contendo a região de codificação de AAT foi amplificada utilizando iniciadores (5’- GCATCCATAAATCGCCCCATAG -3’ e 5’- GCCCTTGAAGAAGATGTAGTTC -3’), o qual foi utilizado para a hibridização. Os resultados mostraram que os dois fragmentos puderam ser detectados após a digestão com EcoRI ou HindIII, o que era consistente com os resultados das análises genéticas. Os resultados da digestão dupla com EcoRI / Hindi II indicam que a inserção contém todo o cassete de expressão, que era o mesmo que o vetor de expressão digerido com as mesmas enzimas, como mostrado na Figura 6.

[041] Neste exemplo, os níveis de expressão de OsrAAT em nove linhas de arroz transgênico foram medidos por ensaio de atividade inibidora de elastase porcina. Os resultados mostraram o nível de expressão de OsrAAT alcançado de 0,4-2,24mg por grama de arroz integral, tal como mostrado na Figura 7. A linha mais alta 132-17 com o nível de expressão OsrAAT foi escolhida para seguir para a próxima geração estudos. Para caracterizar a linhagem transgênica, 132-17, a segregação genética de suas sementes T1 foi analisada. Os resultados mostraram que 51 sementes expressaram OsrAAT, 5 sementes não expressaram OsrAAT, encaixando com dois modelos de loci (15: 1, CHITEST p = 0,408). Finalmente, obtiveram-se as linhas de arroz transgênico com nível elevado de expressão OsrAAT.

[042] Exemplo 2: Otimização das Resinas de Cromatografia e Condições de Eluição para Isolamento e Purificação de OsrAAT de Grãos Transgênicos

[043] As condições cromatográficas otimizadas para isolar e purificar OsrAAT de sementes de arroz nesta invenção são as seguintes:

[044] 1. Purificação Primária de OsrAAT.

[045] 1.1 Otimização de Resinas de Cromatografia Aniônica e Condições de Eluição em Passo de Purificação Primária.

[046] Os inventores definiram as resinas aniônicas com elevada taxa de fluxo como desejáveis para cromatografia, incluindo tais como Macro-prep DEAE (da empresa Bio-Rad), DEAE Sepharose FF e Capto Q (da empresa GE).

[047] Verificou-se que Macro-prep de DEAE, DEAE Sepharose FF e Capto Q podem ser utilizadas para a purificação de OsrAAT. No entanto, a melhor eficiência de purificação de OsrAAT foi obtida a partir DEAE SepharoseFF e Macro-prep DEAE, enquanto Capto Q foi melhor sob condição de baixo sal. No entanto, sob as mesmas condições de carregamento, as duas resinas aniônicas fracas mostraram um tempo de retenção mais longo e uma melhor eficiência de separação do que Capto P.

[048] Devido ao elevado teor de pigmentos e polissacáridos nas sementes de arroz, eles poderiam se ligar às resinas aniônicas, resultando numa diminuição da capacidade de carregamento e pureza. Era mais óbvio em resina Capto Q. Com o aumento da concentração de sal para remover as impurezas durante os procedimentos de equilíbrio, DEAE Sepharose FF mostrou tolerância óbvia a concentração de sal mais elevada, o que pode efetivamente separar a proteína alvo das proteínas hospedeiras. No entanto, a proteína alvo fluiu para fora e a Macro-prep DEAE foi usada e a concentração de sal foi maior do que 10mM PB. Nossos resultados indicaram que DEAE Sepharose FF apresentava taxa de fluxo mais elevada do que Macro-prep DEAE sob a condição de capacidade de purificação equivalente, porque DEAE Sepharose FF possui um tamanho médio de partícula de 75 μm, enquanto Macro-prep DEAE possui um tamanho médio de partícula de 50 μm.

[049] Extrato contendo OsrAAT com pH 7,0 e condição de baixa condutividade foi carregado em uma coluna de cromatografia embalada com DEAE Sepharose FF para assegurar que OsrAAT pudesse ligar-se totalmente a coluna. Uma vez que a proteína alvo teve perda de atividade importante a um pH baixo, método de eluição de gradiente PB foi escolhido ao invés de Eluição por gradiente de pH. Os resultados indicaram que a proteína alvo foi eluída principalmente entre 10-20% de PB 500mM, mas nenhuma impureza foi eluida sob a condição de menos do que 10% de PB 500 mM. Isso significa que não há necessidade de uma etapa de remoção de impurezas antes de a proteína alvo ser eluida. Assim, compreendeu-se que sob esta condição de pH, era difícil melhorar a pureza da proteína alvo, aumentando apenas a concentração de sal na solução de eluição. No que diz respeito à pureza e taxa de recuperação da proteína alvo, 108mM PB, pH 7,0 são as condições de eluição otimizadas.

[050] 1.2 Seleção de Resina de Cromatografia Composta para a Purificação Primária.

[051] No que diz respeito à estabilidade da proteína alvo, os procedimentos de purificação só podem ser realizados sob condição de pH neutro, na qual a resina de permuta catiônica convencional inevitavelmente fará com que a proteína alvo não seja absorvida na coluna, mas as resinas de permuta catiônica tem vantagens para a remoção de impurezas, tais como pigmentos. O presente inventor, portanto, selecionou Macroprep CHT-I (de troca de cátions com capacidade de quelação de metal) para a purificação primária.

[052] As amostras interagiram com a resina através de íons de fosfato carregado negativamente e cálcio carregado positivamente de Macroprep CHT- I. Os resultados mostraram que Macroprep CHT-I tinha enriquecido de maneira eficaz a proteína alvo, mas a sua taxa de fluxo e capacidade de carga foram ligeiramente menores do que as de DEAE Sepharose FF. Infelizmente, os pigmentos presentes nos extratos estavam fortemente ligados à resina, embora a amostra de extrato ter sido carregada na resina apenas uma vez, de modo que cerca de 5% do volume da coluna de resina não pudesse ser regenerada. Portanto, não é adequado utilizar a resina para a purificação primária apesar de Macroprep CHT-I ter um melhor efeito de purificação.

[053] 1.3 Determinação das Condições de Resina de Cromatografia e Eluição para a Purificação Primária.

[054] Em relação a vários fatores, DEAE Sepharose FF é a resina de cromatografia preferencial e 108mM PB e pH 7,0 são condições de eluição otimizadas para a purificação primária.

[055] 2. Purificação Secundária de OsrAAT.

[056] 2.1 Seleção de Resina de Cromatografia Hidrofóbica e Otimização de Condições de Eluição para Purificação Secundária

[057] Resinas hidrofóbicas tem uma maior capacidade para remoção de impurezas não-específicas do arroz transgênico. Várias resinas hidrofóbicas com propriedades semelhantes foram testadas para esta etapa de purificação, respectivamente, incluindo Fenil Sepharose HP, Fenil-Sepharose FF (HS) e Octyl Sepharose FF. As diferenças entre Phenyl Sepharose FF (HS) e Phenyl Sepharose HP são os diâmetros de substratos esféricos e densidades de ligantes. O tamanho médio das partículas do primeiro é cerca de 3 vezes maior do que a do último. Assim, Phenyl Sepharose FF possui taxa de fluxo de trabalho maior apesar de causar inconveniência para o aplicativo, enquanto Phenyl Sepharose HP tem o tamanho fino de partícula, maior resolução e pode alcançar melhor efeito de purificação. A concentração de sal da amostra foi ajustado para alcançar uma concentração final de sulfato de amônia de 0,75 M, 1,2 M, 1,5 M e carregado em uma coluna de cromatografia embalada com Phenyl Sepharose HP como fração de fluxo, e, em seguida, 50% fração eluída em água e fração eluída em água pura foram coletadas. Cada fração foi detectada por eletroforese. Os resultados mostraram que bom efeito de remoção de impurezas foi obtido sob cada concentração de sulfato de amônia e a pureza da proteína alvo da fração de fluxo atingiu 70%. No entanto, a proteína alvo retida na coluna foi aumentada com o aumento da concentração de sulfato de amônia, o que não só afeta de maneira importante a recuperação da proteína alvo, mas também reduz a atividade biológica da rAAT na amostra de fluxo.

[058] Verificou-se que a hidrofobicidade de Phenyl Sepharose FF foi maior do que a de Fenil Sepharose HP. Sob a condição de 0,8 M de sulfato de amônia, 80% da proteína alvo foi retida na coluna. Fração de fluxo, fração eluida em água a 50% e fração eluída em água pura foram coleatdas, as quais foram detectadas por eletroforese. Os resultados mostraram que a pureza da proteína alvo foi significativamente melhorada, a pureza da proteína da fração eluída em água a 40% atingiu 80%, mas a atividade biológica ainda estava seriamente perdida.

[059] Comparada às resinas acima, Octyl Sepharose FF possui a mesma matriz, mas diferentes ligantes. Assim, sua hidrofobicidade é mais fraca. Uma vez que a rAAT expressa no arroz transgênico possui diferentes graus de modificação por glicolização, a diferença dos diversos rAAT pode separá-los seletivamente em resina Octyl. A concentração de sulfato de amônia da amostra foi ajustada para 1M e então carregada para coluna de cromatografia de Octyl SepharoseFF, fração de fluxo, fração eluída em água a 40% e fração eluída em água pura foram coletadas e então detectadas por eletroforese. Os resultadas mostraram que a pureza da proteína alvo aumentou significativamente e a perda de atividade biológica diminuiu de maneira perceptível quando comparada a Phenyl sepharose FF(HS) e a Phenyl Sepharose HP, mas a recuperação de atividade ainda não foi alta o suficiente.

[060] Em resumo, as três resinas hidrofóbicas possuem alta capacidade de purificar OsrAAT, mas elas não são adequadas para a purificação de OsrAAT devido a sua influência na atividade da proteína alvo. Quando a amostra passa pela resina hidrofóbica, o ambiente hidrofóbico pode alterar a estrutura terciária da proteína alvo para causar perda de atividade biológica.

[061] 2.2 Seleção de Resina Cromatográfica e Condições de Eluição para Cromatografia para Purificação Secundária.

[062] Os inventores definiram as resinas compostas com alta taxa de fluxo como resinas de cromatografia desejáveis, incluindo tais como Macroprep CHT-L, Capto MMC e Capto Adhere.

[063] Capto MMC é uma resina de cromatografia com características de permuta catiônica e hidrofobia. Duas concentrações de sal das amostras com baixo sal de 100 mM PB e alto sal de sulfato de amônio de 1,5 M foram testadas. Verificou-se que algumas das proteínas alvo altamente hidrofóbicas ainda ficaram retidas na resina quando a amostra continha baixa concentração de sal. A pureza da proteína alvo foi relativamente baixa em amostras de fluxo e amostras de fração de eluição. A alta pureza da proteína alvo foi obtida quando condição de carregamento alto de sal foi utilizada. A pureza da proteína da fração de fluxo atingiu 85%, mas a atividade biológica ainda estava baixa.

[064] Verificou-se que o melhor efeito de purificação e a recuperação de atividade mais alta foram obtidas usando Macroprep CHT-I. Apesar de Capto MMC sob alta condição de sal ter apresentado melhor efeito de purificação relativo, a atividade biológica não foi boa suficiente. Capto Adhere teve baixo efeito de purificação, mas alta recuperação de atividade, onde tanto Macroprep CHT-I quanto Capto Adhere podem ser utilizados para purificação de antitripsina humana recombinante. Macroprep CHT-I pode remover mais impurezas, enquanto Capto Adhere pode remover especialmente algumas proteínas de impurezas que não posem ser removidas por Macroprep CHT-I. Resina Macroprep CHT-I também possui vantagens de facilidade de embalagem na coluna devido a sua matriz rígida, estabilidade excelente sob altas concentrações de hidróxido de sódio, limpeza simples, eficiência de processo e custo em relação à Capto Adhere. Leve-o diversos fatores em consideração, Macroprep CHT-I é uma resina de cromatografia composta preferível. Capto Adhere poderia ser uma resina de cromatografia adequada para purificação final.

[065] Baseando-se nas características de resina CHT, é necessário um pH igual ou maior do que 7,0 e sensibilidade a fosfato. Nós empregamos as condições básicas de Eluição de 108 mM PB, pH 7,0, de acordo com o estudo de eluição de gradiente de fosfato. As condições de eluição foram posteriormente otimizadas. As condições de Macroprep CHT-I para remoção complete de impurezas foram empregadas de acordo com o método de eluição de gradiente de cloreto de sódio e comparadas com as condições de Eluição originais. Os resultados mostraram que a pureza melhorou de maneira perceptível, com pureza de HPLC de até 85%, mas a recuperação foi reduzida em aproximadamente 10% após a adição de uma etapa de lavagem para remoção de impurezas. Esperava-se que essas impurezas fossem removidas na etapa de purificação subsequente.

[066] Levando-se em conta o efeito de purificação e recuperação em consideração, condições de eluição otimizadas são 108 mM PB, pH 7,0 em resina Macroprep CHT-I, sem a etapa de lavagem de impurezas.

[067] 2.3 Determinação de Resina de Cromatografia e Condições de Eluição para Purificação Secundária

[068] Tanto resinas hidrofóbicas quanto resinas compostas com característica hidrofóbica possuem efeito de purificação óbvios, mas todas elas levam certa perda de atividade biológica, com exceção de Capto Adhere com permuta aniônica e hidrofobicidade. Capto Adhere como resina de cromatografia para purificação secundária não afeta a atividade biológica e exibe uma capacidade de remoção muito boa de algumas impurezas, mas a capacidade de remoção da maioria delas não é boa o suficiente. A resina Macroprep CHT-I possui vantagens significativas na capacidade de remoção da maioria das impurezas e recuperação de atividade. Assim, a resina Macroprep CHT-I é a melhor escolha de resina de cromatografia e 108 mM PB, pH 7,0 são as condições de eluição otimizadas para purificação secundária.

[069] 3. Purificação Final de OsrAAT.

[070] 3.1 Seleção de Resina de Cromatografia e Otimização das Condições de Eluição para Purificação Final.

[071] Em estudo prévio, Capto Adhere demonstrou muito boa capacidade de remover impurezas de alto peso molecular que não podem ser removidas pela resina Macroprep CHT-I durante purificação secundária. Assim, ela foi determinada como resina preferencial para etapa de purificação final.

[072] Extrato contendo OsrAAT com pH 7,0 e uma condutividade de 3,0 ms/cm foi carregado em uma em uma coluna de cromatografia embalada com Capto Adhere. Protocolo de eluição de gradiente de NaCl e de eluição de gradiente de pH, foram utilizados respectivamente para estudar as condições primárias de eluição. Os resultados mostraram que OsrAAT foi gradualmente eluido com o aumento de pH e a diminuição de condutividade. Quando o pH da eluição foi de 6,8 e a condutividade de aproximadamente 40ms/cm, aproximadamente 80% da proteína alvo estava eluída. Levando a eficiência de purificação e taxa de recuperação em consideração, cloreto de sódio 0,4M contendo 46mMPB e pH 6,8 são as condições de eluição preferenciais para a etapa de purificação final.

[073] 3.2 Seleção de Resina de Afinidade de Cromatografia e Condições de Eluição para Purificação Final.

[074] Os inventores definiram as resinas desejáveis como resinas de afinidade com alta taxa de fluxo de trabalho, incluindo ConA Sepharose 6B e AAT-select. Os resultados do experimento indicaram que tanto ConA Sepharose 6B quanto AAT-select tiveram um bom efeito de purificação e podem ser usados para a purificação de antitripsina humana recombinante. A proteína alvo recombinante é uma coleção de proteínas com diferentes graus de glicosilação. ConASepharose 6B pode separar o OsrAAT glicosilado e não glicosilado. O ensaio de atividade biológica indicou que a atividade de OsrAAT não é dependente dos graus de glicosilação. A alta pureza de OsrAAT pode ser obtida da fração de eluição, enquanto OsrAAT não glicosilado com atividade atravessa e é perdido. Então, a quantidade de proteína e recuperação de atividade não foi alta. Existem várias vantagens do AAT-select como uma resina de cromatografia de afinidade especialmente para purificação de AAT. Ela pode recuperar toda OsrAAT, tanto glicosilado quanto não glicosilado.

[075] Assim, toda OsrAAT com diferentes graus de modificação por glicosilação pode ser capturada e efetivamente separada de impurezas. Além disso, o processo de limpeza e cyclelife foram superiores ao de ConA- Sepharose 6B. AAT-select é a resina de cromatografia de afinidade preferencial.

[076] 3.3 Determinação de Resina de Cromatografia e Condições de Eluição de Purificação final.

[077] Tanto Capto Adhere como AAT-select podem ser usadas para purificação de OsrAAT. No entanto, Capto Adhere pode remover agregados de OsrAAT enquanto AAT-select não pode. Sua pureza chegou a 97%, determinado pelo ensaio de HPLC, que foi muito maior aos 85% da AAT-select. Proteína alvo eluida da AAT-select necessitou de 2M MgCl2 de tampão de eluição, o que aumentou o custo. Além disso, era difícil manusear o eluente resultante com concentração elevada de sal. CaptoAdhere é mais fácil de operar do que a AAT-select, incluindo o processo de limpeza e eficiência de custo.

[078] Levadas em consideração em conjunto, CaptoAdhere é a resina preferencial para a purificação final. As condições de eluição otimizadas dão 46 mM PB, pH 6,8, cloreto de sódio 0,4M.

[079] Exemplo 3: Isolamento e Purificação de OsrAAT.

[080] Este exemplo integra as três etapas de purificação, incluindo a resina preferencial e condições de eluição otimizadas para cada cromatografia para o isolamento e purificação de OsrAAT, os quais estão descritos no Exemplo 2.

[081] 1. Preparação de Amostra de OsrAAT para Cromatografia.

[082] O arroz com casca da linha de arroz transgênicos N° 132-17 foi descascado para obter grãos meio-polidos e depois triturados com uma espessura de 80-100 mesh. O arroz polido foi misturado com o tampão de extração (tampão fosfato 20 mM, pH 7,0, mercaptoethanol1mM) e extraiu-se durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura resultante foi submetida à filtração sob pressão para obter extrato OsrAAT claro para cromatografia futura utilizando o pressionador de filtro e placa tipo pano-filtro.

[083] 2. Purificação Primária.

[084] 2.1 Purificação Primária por Cromatografia de Permuta Aniônica.

[085] 2.1.1 Cromatografia de Permuta Aniônica Praticada por DEAE Sepharose Fast Flow.

[086] Cerca de 20 ml de resina DEAE Sepharose Fast Flow foram embalados na coluna de cromatografia Econo-column 15/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 20 mM; pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm / h, até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 2,6ms / cm e pH de 6,95 foi carregada. A amostra foi eluída com o tampão de eluição (108mMPB, pH 6,8) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h. A fração contendo OsrAAT foi coletada e β- mercaptoethanol foi adicionada para atingir uma concentração final de 4 mM. Os resultados da cromatografia são mostrados na Figura 8A.

[087] 2.1.2 Cromatografia de Permuta Aniônica Praticada por Macroprep- DEAE.

[088] Cerca de 16 ml de resina Macroprep-DEAE foram embalados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 20mM, pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 5,3ms/cm e pH de 6,95 foi carregada. A amostra foi eluída com tampão de eluição (108mMPB, pH7,0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. A fração de fluxo e a fração de eluição foram coletadas. Os resultados da cromatografia são mostrados na Figura 8B.

[089] 2.1.3 Cromatografia de Permuta Aniônica Praticada por Capto Q.

[090] Cerca de 15ml de resina Capto Q foram embalados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 20mM; pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 5,3ms/cm e pH de 6,95 foi carregada. A amostra foi eluída com tampão de eluição (108mMPB, pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. A fração contendo OsrAAT foi coletada e β- mercaptoethanol foi adicionada para atingir uma concentração final de 4 mM. Os resultados da cromatografia são mostrados na Figura 8C.

[091] 2.2 Purificação Primária pelas resinas de Cromatografia Composta.

[092] Permuta Aniônica com Cromatografia de Quelação de Metais Praticada por resina Macroprep CHT-I.

[093] Cerca de 20 ml de resina de Macroprep CHT-I foi embalada em coluna de cromatografia Econo-column 15/20. Ela foi equilibrada com 200ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 10mM, pH7,0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 1,5ms/cm e pH de 6,9 foi carregada. A amostra foi eluída com tampão de eluição (108mMPB, pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. Fração contendo OsrAAT foi coletada e β- mercaptoethanol foi adicionada para atingir uma concentração final de 4mM. Os resultados de cromatografia são mostrados na Figura 9.

[094] O efeito de cromatografia da cromatografia de permuta realizada nas quatro diferentes resinas são mostradas nas Figuras 8 e 9. A fração contendo OsrAAT eluída de DEAE Sepharosse Fast Flow demonstrou o melhor efeito de purificação e, por isso, foi utilizada para a etapa a purificação secundária subsequente.

[095] 3. Purificação secundária.

[096] 3.1 Purificação Secundária utilizando resinas de Cromatografia Hidrofóbicas.

[097] 3.1.1 Cromatografia Hidrofóbica Praticada por resina Phenyl Sepharose HP.

[098] Cerca de 20 ml de Phenyl Sepharose HP foram carregados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 108mM, pH 7,0) com sulfato de amônia (0,75 M, 1,2 M, 1,5 M, respectivamente;) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. Fração contendo OsrAAT do item 2.1.1 (DEAE SepharoseFast Flow) foi ajustada com sulfato de amônia até atingir concentração de 0,75M, 1M e 1,5M, mostrando condutividade de 95, 135, 165.0ms/cm, respectivamente. O pH foi ajustado para 6,9. As amostras foram então carregadas na coluna sob taxa de fluxo de 150cm/h. A fração de fluxo foi coletada e β-mercaptoethanol foi adicionada para atingir a concentração final de 4mM. Os resultados são mostrados na Figura 10A.

[099] 3.1.2 Cromatografia Hidrofóbica Praticada por resina Phenyl Sepahrose FF HS.

[100] Cerca de 20ml de resina Phenyl Sepahrose FF HS foram carregados na coluna de cromatografia Econo-column 15/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 108mM, sulfato de amônia 1,0M, pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. Fração contendo OsrAAT do item 2.1.1 (DEAE Sepharose Fast Flow) foi ajustada com sulfato de amônia até atingir concentração de 1M, Levando a condutividade a 135ms/cm e o pH a 6,9. A amostra foi então carregada na coluna a uma taxa de fluxo de 150 cm/h. A fração de fluxo foi coletada e β-mercaptoethanol foi adicionado para atingir concentração de 4mM. Os resultados finais são mostrados na Figura 10B.

[101] 3.1.3 Cromatografia Hidrofóbica Praticada por resina Octyl Sepharose FF.

[102] Cerca de 20 ml de resina OctylSepharose FF foram carregados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 20mM; sulfato de amônia 1,0M; pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. Fração contendo OsrAAT do item 2.1.1 (DEAE Sepharose Fast Flow) foi adicionada de sulfato de amônia até atingir concentração de 1M, Levando a condutividade a 120,0ms/cm e o pH ajustado a 6,9. A amostra foi então carregada na coluna sob uma taxa de fluxo de 150 cm/h. A fração de fluxo foi coletada e β-mercaptoethanol foi adicionado para atingir concentração de 4mM. Os resultados finais são mostrados na Figura 10C.

[103] 3.2 Purificação Secundária por resinas de Cromatografia Composta.

[104] 3.2.1 Permuta Aniônica com Cromatografia de Afinidade de Quelação de Metal Praticada por Macroprep CHT-I.

[105] 20ml da Fração contendo OsrAAT do item 2.1.1 (DEAE Sepharose Fast Flow) foram diluídos em quatro vezes o seu volume original usando água pura.

[106] Cerca de 20 ml de resina Macroprep CHT-I foram embalados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 10mM; pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 3,0ms/cm e pH de 6.9 foi carregada. A amostra foi eluída com tampão de eluição (108mMPB, pH7,0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. Fração contendo O OsrAAT foi coletada e β-mercaptoethanol foi adicionada para atingir uma concentração final de 4mM. Os resultados são mostrados na Figura 11A.

[107] 3.2.2 Permuta Aniônica com Cromatografia Hidrofóbica Praticada por resina Capto MMC.

[108] Cerca de 20 ml de resina Capto MMC foram embalados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 20mM pH 7,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 3,0ms/cm e pH 6,9 foi carregada. A amostra foi eluída com tampão de eluição (108mMPB, pH7.0) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. A fração de fluxo e a fração de eluição foram coletadas. Os resultados são mostrados na Figura 11B.

[109] 3.2.3 Permuta Catiônica com Cromatografia Hidrofóbica Praticada por Capto Adhere.

[110] Cerca de 20 ml de resina Capto Adhere foram embalados na coluna de cromatografia Econo-column 15/20. Ela foi equilibrada com 200ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 10mM, pH 8,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 3,0ms/cm e pH de 6,9 foi carregada. A amostra foi eluida com tampão de eluição (46mMPB, 400mMNaCl, pH 6,8) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. Fração contendo OsrAAT foi coletada e β- mercaptoethanol foi adicionada para atingir uma concentração final de 4mM. Os resultados são mostrados na Figura 11C.

[111] Baseando-se no resultado prévio, a fração contendo OsrAAT de Macroprep CHT-I foi usada para a purificação final.

[112] 4. Purificação Final.

[113] 4.1 Purificação Final por Resinas de Cromatografia Composta.

[114] 4.1.1 Permuta Catiônica com Cromatografia Hidrofóbica Praticada por Capto Adhere.

[115] Cerca de 10 ml de resina Capto Adhere foram embalados na coluna de cromatografia Econo-column 15/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (tampão de fosfato 10mM; pH 8,0) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 3,0ms/cm e pH de 6,9 foi carregada. A amostra foi eluida com tampão de eluição (46mMPB, 400mMNaCl, pH6,8) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. Fração contendo OsrAAT foi coletada. O eletroforetograma é mostrado na Figura12.

[116] 4.2 Cromatografia de Afinidade como Purificação Final.

[117] 4.2.1 Cromatografia de Afinidade praticada por AAT-Select.

[118] Cerca de 20 ml de resina AAT-Select foram embalados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (20 mMTris, 150mMNaCl, pH 7,4) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 10,9 ms/cm e pH de 6,9 foi carregada. A amostra foi eluída usando tampão de eluição (20 mMTris, 2M MgCl2, pH 7,4) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h. Fração contendo OsrAAT foi coletada. O eletroforetograma é mostrado na Figura13A.

[119] 4.2.2 Cromatografia de Afinidade Praticado por ConASepharose FF 6B

[120] Cerca de 10 ml de resina de ConASepharose FF 6B foram embalados na coluna de cromatografia XK16/20. Ela foi equilibrada com 200 ml de tampão de equilíbrio (20mMTris-HCl pH 7,4, 0,5M NaCl, lmM Mn2+, lmM Ca2+) a uma taxa de fluxo de 150 cm/h até que os valores de pH e condutividade fossem constantes com o valor basal. A amostra com condutividade de 10,9ms/cm e pH de 6.9 foi carregada. A amostra foi eluída com tampão de eluição (glicose 0,1M) a uma taxa de fluxo de 150cm/h. Fração contendo OsrAAT foi coletada. O eletroforetograma é mostrado na Figura 13B.

[121] Levados em consideração em conjunto, os electroforetogramas dos passos de purificação primária, secundária e final são mostrados na Figura 14. A OsrAAT resultante foi detectada por HPLC, mostrando que a pureza de OsrAAT era de 97% por HPLC, conforme mostrado na Figura 15. Conforme mostrado na Tabela 1, a recuperação de OsrAAT atingiu até 18,89±3,19%, correspondendo a 0,336 g de OsrAAT por quilograma de arroz integral.

[122] Tabela 1 Recuperação de Proteína de Cada Passo de Purificação

[123] Exemplo 4: Atividade Biológica de OsrAAT.

[124] Desvio de banda e método de atividade inibitória de elastase porcina (Huang et al.) foram utilizados para ensaio de atividade biológica de OsrAAT que foi expressa no endosperma de arroz. Observou-se a partir dos resultados de desvio de banda que a banda se moveu, o que foi o complexo ligado covalentemente a elastase porcina, quando o extrato de proteína bruta foi utilizado, consistindo com os resultados de transferência de Western de AAT derivado de plasma (pAAT). Conforme mostrado na Figura 16, o resultado demonstrou que OsrAAT pode efetivamente se ligar ao substrato específico. Para confirmar se OsrAAT possui a mesma atividade inibidora de elastase porcina da pAAT, método de atividade inibidora de elastase porcina foi realizado. Conforme mostrado na Figura 17, os resultados mostraram que a atividade inibidora de elastase porcina de OsrAAT foi idêntica àquela de pAAT. Referências: • Agarwal, S., R. Singh, et al. (2008). 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Claims (3)

1) “MÉTODO PARA PRODUÇÃO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE ANTITRIPSINA HUMANA RECOMBINANTE (OsrAAT) A PARTIR DE SEMENTES DE ARROZ”, caracterizado por compreender as seguintes etapas: (1) preparo do extrato de OsrAAT a partir das sementes de arroz transgênico contendo OsrAAT como matéria prima; (2) sujeição do extrato de OsrAAT a cromatografia de troca de ânions como purificação primária, para obter uma fração de eluição primária de OsrAAT; (3) sujeição da fração de eluição primária de OsrAAT a cromatografia de troca de cátions composta com cromatografia de metal quelado como purificação secundária, para obter uma fração de eluição secundária de OsrAAT; e (4) sujeição da fração de eluição secundária de OsrAAT a cromatografia composta de troca de ânions com cromatografia hidrofóbica como purificação final, para obter OsrAAT purificado.

2) “MÉTODO PARA PRODUÇÃO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE ANTITRIPSINA HUMANA RECOMBINANTE (OsrAAT) A PARTIR DE SEMENTES DE ARROZ”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelas seguintes etapas: (1) uso de sementes de arroz transgênico contendo OsrAAT como matéria prima, descascando o arroz com casca para obter arroz integral, e moendo esse arroz para obter arroz moído com ajuste de malha de 80-100 mesh; mistura do arroz moído com solução tampão de extração com relação peso/volume de 1:5-1:10 e extração por 1 hora à temperatura ambiente; sujeição da mistura resultante a filtração sob pressão com prensa de filtro tipo pano de filtro com placa e quadro para obter extrato límpido de OsrAAT; onde os componentes da solução tampão de extração são: tampão fosfato 20-25mM, mercaptoetanol 1-4mM, pH 6,9-7,1; (2) realização da purificação primária em coluna de cromatografia DEAE Sepharose FF, equilibrando a coluna com 8-12 volumes de coluna do tampão fosfato (pH 6,9-7,1; 20-25mM) a uma taxa de vazão de 100-180 cm/h, usando o extrato de OsrAAT da etapa (1) como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 2-3,5 ms/cm e pH de 6,8-7,0; eluição da amostra com solução tampão PB (pH 6,8-7,1; 100-110mM) a uma taxa de vazão de 100-180 cm/h, e recolhimento da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter a fração de eluição primária de OsrAAT; (3) realização da purificação secundária em coluna de cromatografia de troca de cátions com capacidade de quelação de metais, equilibrando a coluna com 8-12 volumes de coluna de tampão fosfato (pH 6,9-7,2; 5-12mM) a uma taxa de vazão de 100-150 cm/h; diluição da fração de eluição primária de OsrAAT da etapa (2) para até quatro vezes seu volume original como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 2-3,5 ms/cm e pH de 6,8-7,0; eluição da amostra com solução tampão PB (pH 6,8-7,1; 100-110mM) a uma taxa de vazão de 100-180 cm/h, e recolhimento da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter a fração de eluição secundária de OsrAAT; e (4) realização da purificação final em coluna de cromatografia composta de troca aniônica com características hidrofóbicas, equilibrando a coluna com 8-12 volumes de coluna do tampão fosfato (pH 7,5-8,2; 8-12mM) a uma taxa de vazão de 100-180 cm/h, usando a fração de eluição secundária de OsrAAT como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 2-3,5 ms/cm e pH de 6,8-7,1; eluição da amostra com solução tampão (pH 6,6-7,0; 46mM PB, 400mM NaCl) a uma taxa de vazão de 100-180 cm/h, e recolhimento da fração de eluição de OsrAAT contendo OsrAAT, para obtenção do OsrAAT purificado.

3) “MÉTODO PARA PRODUÇÃO, ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO DE ANTITRIPSINA HUMANA RECOMBINANTE (OsrAAT) A PARTIR DE SEMENTES DE ARROZ”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas seguintes etapas: (1) uso de sementes de arroz transgênico contendo OsrAAT como matéria prima, descascando o arroz com casca para obter arroz parcialmente polido e moagem do mesmo para obter arroz moído com ajuste de malha de 80-100 mesh, misturando o arroz moído com uma solução tampão de extração com relação peso/volume de 1:10 e extração por 1 hora à temperatura ambiente, submetendo a mistura resultante a filtração sob pressão com uma prensa filtro do tipo pano de filtro com placa e quadro para obter extrato límpido de OsrAAT; onde os componentes da solução tampão de extração são: tampão fosfato 20 mM, mercaptoetanol 1 mM, pH 7,0; (2) realização da purificação primária em coluna de cromatografia DEAE Sepharose FF, equilibrando a coluna com 10 volumes de coluna de tampão fosfato (pH 7,0; 20 mM) a uma taxa de vazão de 150 cm/h; uso do extrato de OsrAAT da etapa (1) como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 2,6 ms/cm e pH de 6,95; eluição da amostra com solução tampão PB (pH 7,0; 108 mM) a uma taxa de vazão de 150 cm/h, e recolhimento da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter uma fração de eluição primária de OsrAAT; (3) realização da purificação secundária em coluna de cromatografia de troca de cátions com capacidade de quelação de metais, equilibrando a coluna com 10 volumes de coluna de tampão fosfato (pH 7,0; 10 mM), a uma taxa de vazão de 150 cm/h; diluição da fração de eluição primária de OsrAAT da etapa (2) para até quatro vezes seu volume original como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 3,0 ms/cm e pH de 6,9; eluição da amostra com tampão PB (pH 7,0; 108mM) a uma taxa de vazão de 150 cm/h, e recolhimento da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter uma fração de eluição secundária de OsrAAT; e (4) realização da purificação final em coluna de cromatografia composta de troca aniônica e características hidrofóbicas, equilibrando a coluna com 10 volumes de coluna de tampão fosfato (pH 8,0; 10 mM) a uma taxa de vazão de 150 cm/h; usando a fração de eluição secundária de OsrAAT como amostra de carga, onde a amostra possui condutividade de 3,0 ms/cm e um pH de 6,9; eluição da amostra com solução tampão (pH 6,8; 46 mM PB, 400 mM NaCl) a uma taxa de vazão de 150 cm/h, e recolhimento da fração de eluição contendo OsrAAT, para obter OsrAAT purificado.

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