BR112015007212B1

BR112015007212B1 - Método para produzir l-metionina, método para a produção de s-adenosilmetionina, método para a produção de cisteína, método para a produção de glutationa e método para a produção de 2-oxo-4-metiltiobutanoato

Info

Publication number: BR112015007212B1
Application number: BR112015007212-7A
Authority: BR
Inventors: Muriel Merkamm; Dominique Louis; Dominique Thomas; Karine Jaillardon; Philippe Marliere
Original assignee: Adisseo France S.A.S.
Priority date: 2012-10-26
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2022-07-05
Also published as: JP2015533280A; US20150275247A1; US9803225B2; CN104755625B; MY176164A; IN2015DN02439A; WO2014064244A3; CN104755625A; RU2015119400A; EP2912185A2; KR102126318B1; JP6438402B2; BR112015007212A2; RU2650859C2; KR20150076159A; WO2014064244A2

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR L-METIONINA, USO DE UMA PROTEÍNA, PROTEÍNA, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, USO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE S-ADENOSILMETIONINA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE CISTEÍNA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE GLUTATIONA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2-OXO-4 METILTIOBUTANOATO A presente invenção refere-se a um método para a produção de L-metionina no qual a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol são enzimaticamente convertidos em L-metionina e H3PO4. Tal conversão é realizada por uma enzima chamada metionina sintase dependente da O-fosfo- L-homosserina (OPHS). São também descritas as metionina sintases dependentes de O-fosfo-L-homosserina (OPHS), ou seja, proteínas que são capazes de converter enzimaticamente a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina e H3PO4, bem como os microrganismos que foram geneticamente modificados de modo a serem capazes de produzir L-metionina a partir de O-fosfo-L-homosserina e metanotiol. São adicionalmente descritos os métodos para testar enzimas que catalisam a conversão de O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4.

Description

[001] A presente invenção refere-se a um método para a produção de L-metionina no qual a O-fosfo-L-homosserina e metanotiol são enzimaticamente convertidos em L-metionina e H3PO4. Tal conversão é realizada por uma enzima chamada metionina sintase dependente da O-fosfo-L- homosserina (OPHS). A presente invenção também fornece metionina sintases dependentes da O-fosfo-L-homosserina sintases de metionina dependente, ou seja, proteínas que são capazes de converter enzimaticamente a O-fosfo-L- homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. A presente invenção também refere-se aos microrganismos que foram geneticamente modificados, de modo a serem capazes de produzir L-metionina a partir de O-fosfo-L- homosserina e metanotiol.

[002] As enzimas e os processos descritas também podem ser vantajosamente usados para sintetizar derivados da metionina, como a S- adenosilmetionina, glutationa, cisteína, S-adenosil-homocisteína e metiltioadenosina. A presente invenção também fornece métodos para testar enzimas que catalisam a conversão de O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4.

[003] L-metionina é um aminoácido essencial originário do metabolismo do L-aspartato por ativação em L-aspartil fosfato, seguido pela redução no semialdeído de L-aspartato e L-homosserina. Em bactérias, assim como em fungos, a L-homosserina sofre a O-acetilação para formar uma succinila ou um éster acetílico que, em si, é submetido à condensação com enxofre diretamente com sulfeto (SH2) para formar L-homocisteína ou indiretamente com L-cisteína, para formar a L-cistationina, antes da conversão em homocisteína. A metilação da homocisteína garante, usando metiltetra- hidrofolato, a formação da L-metionina.

[004] Nas plantas, o éster de L-homosserina usado como um precursor da cistationina é a O-fosfo-L-homosserina. A cistationina é, em seguida, convertida em homocisteína pela ação de uma cistationina beta liase. A metilação da homocisteína, em seguida, leva à metionina. O-fosfo-L- homosserina também ocorre no metabolismo de bactérias, plantas, fungos e células de mamíferos, como o precursor direto da L-treonina, pela ação da enzima piridoxal-fósforo treonina sintase (CE 4.2.3.1). Nas plantas, existe uma regulamentação estrita para controlar o fluxo de carbono para a metionina e a treonina no ponto de ramificação da O-fosfo-L-homosserina (Amir et al., TRENDS Plant Science 7 (2002), 153). Foi relatado na literatura (consulte, por exemplo, Kreft et al, Plant Physiol. 104 (1994), 1215; Ravanel et al., Arch. Biochem. Biophys. 316 (1995), 572) que tanto a L-cisteína quanto o sulfeto (SH2) podem ser condensados pela cistationina gama sintase vegetal com O-fosfo-L- homosserina em L-cistationina e L-homocisteína com a liberação simultânea do fosfato. Também foi relatado que a gama de substratos tiol é muito restrita, com apenas alguns substratos sendo aceitos além da L-cisteína.

[005] Embora seja um aminoácido essencial, a metionina não é sintetizada de novo em animais, que devem ingerir metionina ou proteínas contendo metionina ou compostos contendo enxofre relacionados. Em particular, a metionina é essencial para a alimentação de aves domésticas e do gado, e não está presente em quantidades suficientes na matéria vegetal que eles comem. A agricultura eficiente, portanto, necessita de uma fonte externa de metionina. Até o momento, a maior parte, se não toda a metionina usada para alimentar os animais, é derivada da química do petróleo. Uma limitação da produção de metionina é o custo de energia da redução do enxofre. Assim, há uma necessidade de ser capaz de fornecer formas alternativas para produzir esse aminoácido, preferencialmente usando recursos renováveis que permitiriam o uso de microrganismos nos quais a síntese de metionina é compatível com uma produção em escala industrial.

[006] A presente invenção aborda essa necessidade fornecendo um método para a produção da L-metionina, no qual a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol são enzimaticamente convertidas em L-metionina e H3PO4. Em tal método, a fonte de enxofre é o metanotiol. Nesse composto, o enxofre é fornecido como um sulfeto, já reduzido. Além disso, o uso da O-fosfo-L- homosserina como um precursor poupa pelo menos dois átomos por molécula de metionina sintetizada, em comparação com a via metabólica padrão que baseia-se no uso de derivados da homosserina acetilados ou succinilados. No total, essa via permite possibilita rendimentos muito melhores na síntese da metionina e de seus derivados.

[007] Assim, a presente invenção refere-se a um método para a produção de L-metionina, no qual a L-metionina é produzida enzimaticamente de acordo com o seguinte esquema reacional: O-fosfo-L-homosserina + CH3-SH < = > L-metionina + H3PO4

[008] Não há relatos até o momento de que há, na natureza, uma proteína que tem a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina. Os presentes inventores consideraram a opção de produzir L- metionina, de uma forma econômica, a partir de O-fosfo-L-homosserina e metanotiol e, para essa finalidade, proteínas foram manipuladas que não ocorrem naturalmente e que têm a capacidade de converter O-fosfo-L- homosserina e metanotiol em L-metionina. Tal como é evidente a partir dos exemplos em anexo, os presentes inventores desenvolveram um sistema que permite a criação de enzimas que têm a capacidade de converter O-fosfo-L- homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. Além disso, os inventores foram bem sucedidos em aplicar esse sistema para criar novas variantes de enzima, derivadas das enzimas existentes, que têm a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. Para essa finalidade, enzimas existentes foram utilizadas que não possuíam inicialmente a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4, prepararam-se mutantes a partir de tais enzimas existentes e enzimas foram selecionadas que apresentaram a capacidade de converter O-fosfo-L- homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. Assim, os inventores puderam estabelecer uma nova atividade enzimática que não havia sido anteriormente descrita e forneceram métodos confiáveis e reprodutíveis para fornecer as enzimas correspondentes. As enzimas correspondentes são referidas no contexto da presente invenção como metionina sintases dependentes da O-fosfo-L-homosserina.

[009] Assim, a presente invenção, em particular, refere-se a um método para a produção de L-metionina, no qual a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol são enzimaticamente convertidos em L-metionina e H3PO4, de acordo com o seguinte esquema de reação: O-fosfo-L-homosserina + CH3-SH < = > L-metionina + H3PO4 em que a conversão enzimática é realizada mediante o uso de uma metionina sintase dependente de O-fosfo-L-homosserina.

[010] A princípio, qualquer metionina sintase dependente da O- fosfo-L-homosserina, ou seja, qualquer proteína que tenha a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4, pode ser empregada no método de acordo com a invenção. A presente invenção, pela primeira vez, descreve proteínas mostrando essa capacidade e fornece métodos para fornecer mais proteínas apresentando essa capacidade. Em particular, a presente invenção revela que é possível criar, a partir de uma cistationina gama sintase de origem vegetal (EC 2.5.1.48), que não tem naturalmente a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina, variantes que têm esta capacidade por mutação e seleção.

[011] As metionina sintases dependentes da O-fosfo-L- homosserina serão descritas abaixo no contexto da proteína de acordo com a invenção, e qualquer metionina sintase dependente da O-fosfo-L-homosserina descrita pode ser utilizada no método de acordo com a invenção.

[012] Tal como é evidente a partir dos exemplos em anexo, os inventores foram bem sucedidos em criar várias proteínas diferentes, que apresentam a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. As sequências dessas proteínas são mostradas nas SEQ ID NOs: 6 a 29. Essas proteínas são criadas por mutação e seleção em um sistema de triagem, conforme é descrito nos exemplos a partir de uma cistationina gama sintase de origem vegetal (EC 2.5.1.48), que não tem naturalmente a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina.

[013] Além disso, a partir das sequências mostradas nas SEQ ID NOs: 6 a 29 é possível fornecer mais proteínas que retêm a atividade para converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. Por exemplo, é possível aumentar ainda mais a afinidade das proteínas pelo substrato O-fosfo-L-homosserina e/ou pelo substrato metanotiol, ou melhorar outras propriedades da proteína, como descrito mais abaixo. Assim, em uma modalidade preferencial do método de acordo com a presente invenção, a conversão enzimática da O-fosfo-L-homosserina e do metanotiol em L-metionina e H3PO4 é conseguida fazendo uso de uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos, como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29; e (b) uma proteína que tem uma identidade de sequência de pelo menos 60% com qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29, e com a atividade enzimática de converter a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina e H3PO4.

[014] A atividade enzimática de conversão da O-fosfo-L- homosserina e do metanotiol em L-metionina e H3PO4 pode, por exemplo, ser avaliada por um ensaio, conforme descrito nos Exemplos em anexo. Para essa finalidade, é possível, por exemplo, usar uma cepa de S. cerevisiae que tem um fenótipo auxotrófico para a metionina. Exemplos para tal cepa são cepas nas quais as enzimas homosserina transacetilase e homocisteína sintase são removidas ou tornam-se disfuncionais. Preferencialmente, ambas as enzimas são removidas ou são disfuncionais. Como mostrado na Figura 1, a S. cerevisiae depende o uso obrigatório da O-acetil-homosserina para sintetizar a homocisteína que é, então, convertida em metionina. A enzima homosserina transacetilase responsável pela síntese da O-acetil-homosserina é codificada pelo gene MET2. Após inativar o MET2, a homosserina não pode mais ser convertida em O-acetil-homosserina e todo o fluxo de homosserina é desviado para a fosfo-homosserina. Como a reação catalisada pelo MET2 é a única fonte de O-acetil-homosserina em leveduras, a inativação do gene MET2 resulta em cepas de levedura que exibem um estrito fenótipo de auxotrofia para a metionina. No entanto, a homocisteína (o último precursor de metionina) pode derivar da cisteína (através da via de transulfuração) ou da reciclagem da S- adenosilmetionina. Para ter certeza de que nenhuma metionina pode ser sintetizada, o MET6, o gene que codifica a homocisteína metiltransferase, responsável pela síntese da metionina a partir de homocisteína e metiltetra- hidrofolato também é deletado.

[015] Assim, em um ensaio para testar a capacidade de uma proteína para converter a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina e H3PO4, pode-se, preferencialmente, usar uma cepa de S. cerevisiae, na qual os genes MET2 e/ou MET6, preferencialmente ambos, são deletados ou interrompidos. Uma cepa met2Δ met6Δ dupla interrompida é incapaz de crescer na ausência de metionina e, particularmente, não pode crescer na presença do metanotiol, como a fonte de enxofre. Tal cepa não é mais capaz de sintetizar a O-acetil-homosserina, mas produz a O-fosfo-homosserina. Tal cepa de levedura pode, então, ser transformada com uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína a ser testada quanto à capacidade de converter a O-fosfo-L- homosserina e o metanotiol em L-metionina e H3PO4. A cepa é cultivada em/sobre um meio que contém metanotiol como a única fonte de enxofre, e a capacidade de crescer em tal meio é indicativa de que a proteína expressa é capaz de converter a O-fosfo-L-homosserina (OPHS) e o metanotiol na L- metionina e no H3PO4. É ainda mais preferível usar uma cepa na qual o gene que codifica a treonina sintase também torna-se inativo, por exemplo, por deleção ou interrupção. Nas cepas met6Δ met2Δ, a OPHS é sintetizada em uma reação catalisada pela homosserina quinase codificada pelo gene THR1, mas ele não pode se acumular eficientemente por causa de sua conversão ativo em treonina pela treonina sintase codificada pelo gene THR4. Tais cepas mutantes met2Δ met6Δ thr4Δ triplas, assim, permitem detectar a atividade muito baixa da metionina sintase dependente de OPHS, e foram usadas como uma primeira triagem das células para isolar novas proteínas com atividade da metionina sintase dependente de OPHS.

[016] Essa atividade enzimática também pode ser confirmada por um ensaio in vitro, no qual a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol são incubados in vitro sob condições apropriadas com um extrato celular de uma cepa de levedura que expressa uma proteína a ser testada ou com uma proteína (parcialmente) purificada a ser testada, e no qual a produção de metionina é detectada por cromatografia líquida/espectrometria de massa/espectrometria de massa (LC/MS/MS) usando a metionina C13 como um controle interno (Ravanel et al. Archives of Biochemistry and Biophysics 316 (1995), 572-584).

[017] A O-fosfo-L-homosserina usada em tal ensaio in vitro, como um substrato, pode ser fornecida, por exemplo, por um processo conforme mostrado na figura 2 (Barclay et al., J. Chem. Soc, Chem. Com (1994) 815-816).

[018] Como mencionado acima, exemplos para proteínas que mostram a atividade enzimática de conversão da O-fosfo-L-homosserina e do metanotiol em L-metionina e H3PO4 são aqueles que têm uma sequência de aminoácidos, como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29. Assim, em uma modalidade preferencial, o método de acordo com a presente invenção faz uso de uma proteína que compreende uma sequência de aminoácidos, conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29. No entanto, também é claramente possível utilizar variantes dessas proteínas, ou seja, proteínas cuja sequência de aminoácidos mostra um alto grau de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos, conforme mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29, e que mostram a atividade enzimática da conversão da O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. A identidade de sequência é igual a pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% e mais preferencialmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% em relação a uma sequência, conforme mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29.

[019] Preferencialmente, o grau de identidade é determinado comparando a respectiva sequência com uma sequência de aminoácidos, conforme é mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29. Quando as sequências que são comparadas não têm o mesmo comprimento, o grau de identidade refere-se, preferencialmente, à porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência mais curta, que são idênticos com os resíduos de aminoácidos na sequência mais longa, ou à porcentagem de resíduos de aminoácidos na sequência mais longa que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência mais curta. O grau de identidade de sequência pode ser determinado de acordo com métodos bem conhecidos na técnica, usando algoritmos de computador preferencialmente adequados, como o CLUSTAL.

[020] Ao usar o método de análise Clustal para determinar se uma determinada sequência é, por exemplo, 80% idêntica com uma sequência de referência, parâmetros predefinidos podem ser utilizados, ou as configurações são preferencialmente as seguintes: Matriz: blosum 30; penalidade de lacuna aberta: 10,0; penalidade de lacuna de extensão: 0,05; divergência de atraso: 40; distância de separação de lacuna: 8 para comparações de sequências de aminoácidos. Para comparações de sequência de nucleotídeos, a penalidade de lacuna estendida é preferencialmente definida como 5,0.

[021] Preferencialmente, o grau de identidade é calculado em relação ao comprimento total da sequência. Além disso, se o termo "homologia" é usado no contexto da presente invenção, esse termo preferencialmente significa “identidade de sequência”.

[022] O método de acordo com a invenção também possibilita produzir outros compostos contendo enxofre que são derivados da L-metionina. Exemplos de tais compostos são a S-adenosilmetionina, glutationa, cisteína, S- adenosil-homocisteína, metiltioadenosina e 2-oxo-4-metiltiobutanoato.

[023] Desse modo, a presente invenção também refere-se a um método para produzir a S-adenosilmetionina, que compreende o método para produzir L-metionina de acordo com a invenção, conforme descrito acima e em que a L-metionina é adicionalmente convertida em S-adenosilmetionina, de acordo com a reação a seguir: Metionina + ATP => S-adenosilmetionina + PPi +Pi

[024] Essa reação enzimática é conhecida na técnica, e as enzimas que catalisam essa reação são conhecidas na técnica. Essas enzimas são chamadas S-adenosilmetionina sintases (EC 2.5.1.6). Exemplos das enzimas correspondentes, em leveduras, são a SAM1 e a SAM2. Assim, no caso onde tal método é realizado em um organismo, esse organismo preferencialmente superexpressa a(s) enzima(s) correspondente(s)que é/são capazes de converter a L-metionina em S-adenosilmetionina.

[025] Também pode ser vantajoso adicionalmente modificar um organismo para evitar o fluxo de S-adenosilmetionina para outras vias metabólicas. Em leveduras pode ser, por exemplo, vantajoso inativar a atividade da adenosina quinase (EC 2.7.1.20 codificada pelo gene ADO1 em leveduras) para diminuir o fluxo de S-adenosilmetionina para S-adenosil-homocisteína.

[026] Além disso, a presente invenção também refere-se a um método para produzir a cisteína, que compreende um método para produzir L- metionina de acordo com a invenção, conforme descrito acima, e em que a L- metionina é adicionalmente convertida em cisteína. A conversão da L-metionina em cisteína é conhecida na técnica anterior, e pode ser realizada utilizando os meios e métodos conhecidos para a pessoa versada na técnica.

[027] Por exemplo, a L-metionina pode ser primeiramente convertida em S-adenosilmetionina que é, em seguida, adicionalmente convertida em S-adenosil-homocisteína, de acordo com a seguinte reação: S-adenosilmetionina + um aceptor de metila => S-adenosil-homocisteína + um aceptor metilado.

[028] Essa reação é catalisada pelas metiltransferases dependentes de S-adenosilmetionina.

[029] A S-adenosil-homocisteína pode ser, em seguida, convertida em L-homocisteína, de acordo com a seguinte reação: S-adenosil-homocisteína <=> L-homocisteína + adenosina

[030] Essa reação é catalisada pela S-adenosil-homocisteína hidrolase, EC 3.3.1.1.

[031] Posteriormente, a L-homocisteína pode ser convertida em L- cistationina, de acordo com a reação a seguir: L-homocisteína + L-serina <=> L-cistationina + H2O

[032] Essa reação é catalisada pela cistationina beta-sintase (EC 4.2.1.22).

[033] Finalmente, a L-cistationina é convertida em cisteína, de acordo com a seguinte reação: L-cistationina + H2O <=> L-cisteína + NH3 + oxobutanoato

[034] Essa reação é catalisada pela cistationina gama-liase (EC 4.4.1.1).

[035] Se esse método for realizado em levedura, é vantajoso superexpressar os seguintes genes: SAM1, SAM2, SAH1, STR4 e STR1. Além disso, o gene STR2 que codifica a cistationina gama sintase de levedura deve ser deletado para diminuir a síntese reversa da cisteína para a homocisteína. Da mesma forma, tal levedura também compreende vantajosamente uma mutação MET6, abolindo a metionina sintase dependente de metiltetra-hidrofolato, bem como uma deleção do gene DUG2 que está envolvido na principal via de degradação da glutationa.

[036] Além disso, a presente invenção também refere-se a um método para produzir glutationa, que compreende o método para produzir L- metionina de acordo com a invenção, conforme descrito acima, e em que a L- metionina é adicionalmente convertida em glutationa. A conversão da L- metionina em glutationa é conhecida na técnica anterior e pode ser realizada utilizando os meios e métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica. Por exemplo, a L-metionina pode ser primeiramente convertida em S- adenosilmetionina que é, em seguida, adicionalmente convertida em cisteína, como descrito acima, e a cisteína assim produzida é adicionalmente convertida em Glu-Cys (gama-L-glutamil-L-cisteína), de acordo com a seguinte reação: ATP + L-glutamato + L-cisteína <=> gama-L-glutamil-L-cisteína + ADP + Pi

[037] Essa reação é catalisada pela glutamato cisteína ligase (EC 6.3.2.2).

[038] A Glu-Cys assim produzida é, em seguida, convertida em glutationa de acordo com a seguinte reação: ATP + gama-L-glutamil-L-cisteína + glicina = glutationa + ADP + Pi

[039] Essa reação é catalisada pela glutationa sintase (EC 6.3.2.3).

[040] Se esse método for realizado em levedura, é preferível que a levedura seja manipulada conforme descrito acima, juntamente com o método para a produção da cisteína, e tal levedura também deve superexpressar os genes GSH1 e GSH2 que estão envolvidos na transformação da cisteína em glutationa. Em uma modalidade particularmente preferencial, o gene GSH1 expressa uma enzima resistente à retroalimentação.

[041] Além disso, a presente invenção também refere-se a um método para produzir o 2-oxo-4-metiltiobutanoato, que compreende o método para produzir a L-metionina de acordo com a invenção, conforme descrito acima, e em que a L-metionina é adicionalmente convertida em 2-oxo-4- metiltiobutanoato de acordo com a reação a seguir: Metionina + um ácido 2-oxo => 2-oxo-4-metiltiobutanoato + um L-aminoácido

[042] Essa reação enzimática é conhecida na técnica, e as enzimas que catalisam essa reação são conhecidas na técnica. Estas enzimas chamam-se metionina transaminase (EC 2.6.1.88). Exemplos de enzimas correspondentes são ARO8, BAT1 e BAT2, em levedura. Assim, no caso onde tal método é realizado em um organismo, esse organismo preferencialmente superexpressa a(s) enzima(s) correspondente(s)que é/são capazes de converter a L-metionina em 2-oxo-4-metiltiobutanoato.

[043] Também pode ser vantajoso adicionalmente modificar tal organismo para evitar o fluxo de 2-oxo-4-metiltiobutanoato para outras vias metabólicas. Em leveduras pode ser vantajoso, por exemplo, inativar a atividade da fenilpiruvato descarboxilase (EC 4.1.1.43, codificada pelo gene ARO10 em levedura) ou a atividade da piruvato descarboxilase (EC 4.1.1.1, codificada pelos genes PDC1, PDC5 e PDC6 em leveduras) a fim de diminuir o fluxo de 2-oxo-4- metiltiobutanoato para 3-(metiltio)propionaldeído.

[044] O método de acordo com a presente invenção pode ser realizado in vitro ou in vivo. Uma reação in vitro é compreendida como uma reação em que células não são utilizadas, ou seja, uma reação sem células. Dessa forma, in vitro preferencialmente significa em um sistema isento de células. O termo "in vitro", em uma modalidade, significa na presença da enzima isolada. Em uma modalidade, a enzima utilizada no método é usada na forma purificada.

[045] Para realizar o processo in vitro, os substratos para a reação e a enzima são incubados sob condições (tampão, temperatura, etc.) que permitem que a enzima seja ativa e que a conversão enzimática ocorra. É permitido que a reação prossiga por um tempo suficiente para produzir a L- metionina. A produção de L-metionina pode ser medida pelos métodos conhecidos na técnica.

[046] A enzima pode estar em qualquer forma adequada, permitindo que a reação enzimática ocorra. Ela pode ser purificada ou parcialmente purificada, ou estar sob a forma de extratos celulares brutos ou de extratos parcialmente purificados. Também é possível que as enzimas sejam imobilizadas em um veículo adequado.

[047] Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção é realizado em cultura, na presença de um organismo, preferencialmente um microrganismo, produzindo uma proteína que tem a capacidade de converter O- fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. A proteína é uma proteína conforme descrito na presente invenção.

[048] O organismo utilizado em tal método é, preferencialmente, uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção, conforme descrito nesse documento.

[049] A presente invenção refere-se também a uma proteína que tem a capacidade de converter, enzimaticamente, O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina. No contexto da presente invenção, tal enzima é referida como uma metionina sintase dependente de OPHS. Como mencionado acima, não há nenhum relato até o momento de que existe na natureza uma proteína que tem a capacidade de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina, e a presente invenção é a primeira a fornecer tais proteínas que permitem produzir L-metionina de acordo com o método da invenção, conforme descrito acima.

[050] Em uma modalidade preferencial, a proteína de acordo com a invenção que tem a capacidade de converter enzimaticamente O-fosfo-L- homosserina e metanotiol em L-metionina é derivada de uma cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) por mutação. Tal mutação pode ser uma substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos e/ou uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos, e/ou a adição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de uma cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48).

[051] As cistationina gama-sintases são conhecidas e descritas por vários organismos. Por exemplo, para plantas, mais de 350 sequências para a cistationina gama sintase são conhecidas, inter alia, para a A. thaliana, Nicotiana tabacum, Triticum aestivum, Solanum lycopersicum, Lemna paucicostata, Solanum tuberosum, Spinacia oleracea, Astragalus racemosus, Astragalus bisulcatus, Astragalus sinicus e Neptunia amplexicaulis.

[052] As cistationina gama-sintases são também conhecidas de bactérias e fungos. Para bactérias, mais de 22.000 sequências foram descritas, e exemplos para as sequências de bactérias ou fungos são aquelas da Saccharomyces cerevisiae, Neurospora crassa, Salmonella erterica, Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, Alcaligenes faecalis, Aneurinibacillus aneurinilyticus, Bacillus pumius, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Helicobacter pylori, Lysinibacillus sphaericus, Mycobacterium tuberculosis, Pectobacterium carotovorum, Pseudomonas dacunhae, Pseudomonas putida e Streptomyces phaeochromogenes.

[053] Métodos para fornecer proteínas apresentando a atividade de conversão da O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4 são descritos nos exemplos em anexo, e serão descritos mais detalhadamente abaixo. A princípio, qualquer cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) pode ser usada como material de partida para fornecer uma proteína mostrando a atividade de conversão da O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4. É preferível que a proteína exibindo a atividade de conversão da O- fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4, que é derivada de uma cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) apresente pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, ainda mais preferencialmente pelo menos 90% e mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de uma cistationina gama sintase de ocorrência natural.

[054] Em uma modalidade preferencial, a cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) da qual a metionina sintase dependente de OPHS deriva é uma cistationina gama sintase de origem vegetal (EC 2.5.1.48), preferencialmente a cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) CGS1 de Arabidopsis thaliana, e mais preferencialmente uma cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) mostrando a sequência de aminoácidos, conforme mostrado na SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade ainda mais preferencial, a metionina sintase dependente de OPHS utilizada em um método de acordo com a presente invenção é derivada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 2. Essa sequência corresponde à SEQ ID NO: 1, além do fato de que o resíduo de glicina na posição 84 é substituído por um resíduo de serina. Esta substituição, ou seja, uma mutação mto, alivia a repressão da tradução exercida por uma S- adenosilmetionina sobre o CGS1 (Onoue et al. Journal of Biological Chemistry 286 (2011), 14903-14911). Em uma modalidade particularmente preferencial, a metionina sintase dependente de OPHS utilizada em um método de acordo com a presente invenção é derivada da sequência mostrada na SEQ ID NO: 3. Essa sequência corresponde à SEQ ID NO: 2, além do fato de que a sequência de alvejamento de cloroplasto aminoterminalmente localizada (resíduos de aminoácidos 1 a 57) foi removida, e um resíduo de metionina é adicionado no N- terminal.

[055] Exemplos de uma metionina sintase dependente de OPHS que pode ser utilizada em um método de acordo com a presente invenção são: (1) metionina sintases dependentes de OPHS que são derivadas de uma cistationina gama sintase com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 por substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido na SEQ ID NO: 3, selecionado a partir do grupo que consiste em: (a) prolina 10; (b) asparagina 11; (c) glutamina 15; (d) isoleucina 27; (e) alanina 30; (f) leucina 45; (g) serina 47; (h) valina 60; (i) alanina 68; (j) fenilalanina 150; (k) treonina 178; (l) aspartato 183; (m) isoleucina 185; (n) treonina 220; (o) metionina 232; (p) valina 245; (q) alanina 257; (r) asparagina 259; (s) fenilalanina 261; (t) fenilalanina 275; (u) isoleucina 287; (v) histidina 289; (w) tirosina 324; (x) glicina 326; (y) prolina 356; (z) treonina 371; (aa) valina 396; (bb) prolina 405; (cc) aspartato 431; (dd) isoleucina 436; (ee) isoleucina 457; (ff) aspartato 459; (gg) prolina 470; (hh) glutamato 472; (ii) alanina 506; (jj) isoleucina 507. Ou (ii) metionina sintases dependentes de OPHS que são derivadas de uma cistationina gama sintase, cuja sequência de aminoácidos apresenta pelo menos 60% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, por substituição ou deleção de pelo menos um resíduo de aminoácido que corresponde a qualquer um de (a) a (ii) listados acima na SEQ ID NO: 3. Preferencialmente, a identidade de sequência é igual a pelo menos 70%, ainda mais preferencialmente igual a pelo menos 80%, e mais preferencialmente igual a pelo menos 90%.

[056] O termo "substituição" significa que o aminoácido que ocorre na posição indicada é substituído por um outro resíduo de aminoácido. No contexto da presente invenção, "substituído com outro resíduo de aminoácido" significa que os respectivos resíduos de aminoácidos na posição indicada podem ser substituídos com quaisquer outros resíduos de aminoácidos possíveis, preferencialmente com resíduos de aminoácidos selecionados do grupo consistindo em alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina. Substituições preferenciais para determinadas posições são indicadas abaixo.

[057] Os resíduos de aminoácidos localizados em uma posição correspondente a uma posição selecionada do grupo consistindo nas posições (a) a (jj) listadas acima na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 podem ser identificados pela pessoa versada na técnica, pelos métodos conhecidos na arte. Por exemplo, tais resíduos de aminoácidos podem ser identificados pelo alinhamento da sequência em questão com a sequência mostrada na SEQ ID NO: 3, e identificando as posições que correspondem às posições acima indicadas da SEQ ID NO: 3. O alinhamento pode ser feito com os meios e métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica, por exemplo, usando um algoritmo computacional conhecido como o algoritmo do método de Lipman-Pearson (Science 227 (1985), 1435) ou o algoritmo CLUSTAL. É preferível que, em tal alinhamento, a máxima homologia seja atribuída aos resíduos de aminoácidos conservados presentes nas sequências de aminoácidos.

[058] Quando as sequências de aminoácidos são alinhadas usando esse método, independentemente das inserções ou deleções que ocorrem nas sequências de aminoácidos, as posições dos resíduos de aminoácido correspondentes podem ser determinadas em uma determinada sequência.

[059] De acordo com uma modalidade, metionina sintases dependentes de OPHS da presente invenção têm uma sequência de aminoácidos na qual (i) o resíduo de aminoácido na posição 10 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com leucina; e/ou (ii) o resíduo de aminoácido na posição 11 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com aspartato; e/ou (iii) o resíduo de aminoácido na posição 15 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com arginina; e/ou (iv) o resíduo de aminoácido na posição 27 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (v) o resíduo de aminoácido na posição 30 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com treonina; e/ou (vi) o resíduo de aminoácido na posição 45 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (vii) o resíduo de aminoácido na posição 47 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com treonina; e/ou (viii) o resíduo de aminoácido na posição 60 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com aspartato; e/ou (ix) o resíduo de aminoácido na posição 68 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com treonina; e/ou (x) o resíduo de aminoácido na posição 150 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com leucina; e/ou (xi) o resíduo de aminoácido na posição 178 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com isoleucina; e/ou (xii) o resíduo de aminoácido na posição 183 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com glutamato; e/ou (xiii) o resíduo de aminoácido na posição 185 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com valina; e/ou (xiv) o resíduo de aminoácido na posição 220 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (xv) o resíduo de aminoácido na posição 232 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com leucina; e/ou (xvi) o resíduo de aminoácido na posição 245 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com alanina; e/ou (xvii) o resíduo de aminoácido na posição 257 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com treonina; e/ou (xviiii) o resíduo de aminoácido na posição 259 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com aspartato ou serina; e/ou (xviii) o resíduo de aminoácido na posição 261 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (xx) o resíduo de aminoácido na posição 275 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com leucina; e/ou (xxi) o resíduo de aminoácido na posição 287 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com valina ou fenilalanina; e/ou (xxii) o resíduo de aminoácido na posição 289 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com tirosina ou arginina; e/ou (xxiii) o resíduo de aminoácido na posição 324 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com fenilalanina; e/ou (xxiv) o resíduo de aminoácido na posição 326 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (xxv) o resíduo de aminoácido na posição 356 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com treonina; e/ou (xxvi) o resíduo de aminoácido na posição 371 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com alanina; e/ou (xxvii) o resíduo de aminoácido na posição 396 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com alanina; e/ou (xxviii) o resíduo de aminoácido na posição 405 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (xxix) o resíduo de aminoácido na posição 431 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com glicina; e/ou (xxx) o resíduo de aminoácido na posição 436 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com treonina; e/ou (xxxi) o resíduo de aminoácido na posição 457 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com leucina; e/ou (xxxii) o resíduo de aminoácido na posição 459 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com asparagina; e/ou (xxxiii) o resíduo de aminoácido na posição 470 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com serina; e/ou (xxxiv)o resíduo de aminoácido na posição 472 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com glicina; e/ou (xxxv) o resíduo de aminoácido na posição 506 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3 ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com glicina; e/ou (xxxvi)o resíduo de aminoácido na posição 507 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, é substituído com valina.

[060] A invenção também refere-se às variantes, conforme definidas em (i) a (xxxvi) acima, em que o resíduo de aminoácido indicado como substituindo o resíduo de aminoácido na posição na SEQ ID NO: 3, não é aquele resíduo de aminoácido particular, mas um resíduo de aminoácido que é conservador em relação ao aminoácido substituto indicado.

[061] Pode-se considerar um aminoácido como sendo conservador em relação a outro aminoácido de acordo com os meios e métodos conhecidos na técnica. Uma possibilidade é a matriz PAM 250; alternativamente, as matrizes da família Blosum podem ser usadas.

[062] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a uma metionina sintase dependente de OPHS com uma sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 3, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 60% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 3, em que os resíduos de aminoácidos na posição 356 na sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 3, ou em uma posição que corresponde a essa posição, são substituídos por outro resíduo de aminoácido. Em uma modalidade preferencial, a presente invenção refere-se a tal proteína, na qual pelo menos um resíduo de aminoácido adicional é substituído em uma posição selecionada do grupo consistindo nas posições 10, 11, 15, 27, 28, 30, 32, 45, 47, 60, 68, 104, 150, 178, 183, 185, 220, 232, 245, 257, 259, 261, 275, 287, 289, 324, 326, 371, 396, 405, 431, 436, 457, 459, 470, 472, 506 e 507, preferencialmente selecionada do grupo consistindo nas posições 10, 11, 15, 30, 32, 45, 47, 68, 104, 150, 178, 183, 185, 220, 232, 245, 257, 259, 261, 275, 287, 289, 326, 371, 396, 405, 431, 436, 459, 470, 472, 506 e 507, e ainda mais preferencialmente selecionada do grupo consistindo nos resíduos 275 e 396.

[063] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes:

[064] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 10, 27, 60, 324 e 457.

[065] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 32, 287, 289 e 356.

[066] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 10, 232, 245, 259, 356, 431 e 436.

[067] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 11, 15, 30, 45, 47, 68, 178, 356, 371 e 459.

[068] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 32 e 356.

[069] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 32, 60, 324 e 457.

[070] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 32, 287, 289 e 356.

[071] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 32, 232, 245, 259, 356, 431 e 436.

[072] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 32, 45, 47, 68, 178, 356, 371 e 459.

[073] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 232, 245, 259, 356, 431 e 436.

[074] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 178, 356, 371 e 459.

[075] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 150, 257, 259, 261, 275, 289, 356 e 506.

[076] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 185, 356 e 405.

[077] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 356, 396 e 472.

[078] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 326, 356 e 396.

[079] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 220, 275, 356 e 396.

[080] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 183, 275, 356, 396 e 507.

[081] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 287, 356, 396 e 507.

[082] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 356, 396 e 470.

[083] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 356 e 507.

[084] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 356 e 396.

[085] Em uma modalidade, as posições nas quais as substituições e/ou deleções ocorrem são as seguintes: as posições 275, 287 e 356.

[086] As substituições preferenciais nessas posições são aquelas indicadas acima.

[087] As metionina sintases dependentes de OPHS, que podem ser utilizadas em um método de acordo com a presente invenção, também são enzimas que podem ser derivadas de qualquer uma das metionina sintases dependentes de OPHS acima descritas, pela deleção de um ou mais aminoácidos N-terminais que correspondem aos aminoácidos 1 a 103 da sequência de aminoácidos conforme mostrada na SEQ ID NO: 3. Como mostrado nos exemplos, também as formas truncadas de metionina sintases dependentes de OPHS acima descritas, por exemplo, as formas truncadas nas quais, em comparação com a SEQ ID NO: 3, 31 resíduos de aminoácidos ou 103 resíduos de aminoácidos são deletados do N-terminal, ainda apresentam uma eficiente atividade da metionina sintase dependente de OPHS.

[088] Em uma modalidade preferencial, a metionina sintase dependente de OPHS de acordo com a invenção também exibe a atividade enzimática da conversão da O-fosfo-L-homosserina e sulfeto em L-homocisteína + H3PO4. Preferencialmente, o sulfeto é um sulfeto metálico, tal como Na2S. Nesse caso, a conversão ocorre de acordo com o seguinte esquema reacional:

[089] O-fosfo-L-homosserina + Na2S <=> L-homocisteína + H3PO4

[090] A atividade de conversão, que converte a O-fosfo-L- homosserina (OPHS) e o sulfeto metálico em L-homocisteína e H3PO4, pode ser detectada em um ensaio que é basicamente igual àquele descrito acima, em conexão com a detecção da atividade para converter a O-fosfo-L-homosserina (OPHS) e metanotiol em L-metionina e H3PO4. Nesse caso, uma cepa de levedura met2Δ met25Δ dupla é usada e cultivada em um meio com Na2S como a única fonte de sulfato. De fato, o MET25 codifica a única atividade da homocisteína sintase conhecida em levedura, catalisando a condensação da O- acetil-L-homosserina com o sulfeto. A sensibilidade do ensaio pode ser facilmente melhorada usando cepas de S. cerevisiae que foram manipuladas para compreender, além das mutações duplas met2 e met25, a mutação thr4, que leva ao acúmulo de O-fosfo-L-homosserina.

[091] Essa atividade enzimática também pode ser adicionalmente confirmada por um ensaio in vitro, no qual a O-fosfo-L-homosserina e o Na2S são incubados in vitro sob condições apropriadas com um extrato celular de uma cepa de levedura que expressa uma proteína a ser testada ou com uma proteína (parcialmente) purificada a ser testada, e em que a produção de homocisteína é detectada por um método colorimétrico (Becker et al., Journal of Biochemical Chemistry 244(1969), 2418).

[092] A presente invenção refere-se também às moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína de acordo com a invenção. A molécula de ácido nucleico pode ser um DNA ou RNA, e preferencialmente, ela é um DNA.

[093] Além disso, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial, o vetor é um vetor que permite a expressão do ácido nucleico de acordo com a invenção, de modo a permitir a produção de uma proteína de acordo com a invenção. Assim, em uma modalidade preferencial, o ácido nucleico de acordo com a invenção está operavelmente ligado às sequências de controle de expressão que permitem a expressão em uma célula hospedeira desejada ou em um sistema de célula hospedeira. O termo "operativamente ligado" ou "operavelmente ligado", como usado ao longo da presente descrição, refere-se a uma ligação entre uma ou mais sequências de controle de expressão e a região codificadora na molécula de ácido nucleico a ser expressa, de modo que a expressão seja efetuada em condições compatíveis com a sequência de controle da expressão.

[094] A expressão compreende a transcrição da sequência de DNA heteróloga, preferencialmente, em um RNAm traduzível. Elementos reguladores que garantem a expressão em células vegetais, células animais e em fungos, bem como em bactérias, são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica. Eles compreendem promotores, intensificadores, sinais de terminação, sinais de direcionamento e similares. Exemplos são fornecidos mais abaixo, juntamente com explicações detalhadas sobre os vetores.

[095] Os promotores para uso juntamente com a molécula de ácido nucleico podem ser homólogos ou heterólogos em relação à origem dos mesmos e/ou em relação ao gene a ser expresso. São promotores adequados, por exemplo, os promotores que atuam na expressão constitutiva. No entanto, também podem ser usados os promotores que são ativados em um ponto no tempo determinado por influências externas. Promotores artificiais e/ou quimicamente induzíveis podem ser usados nesse contexto.

[096] O vetor de acordo com a presente invenção pode ser introduzido em um (micr)organismo de modo a ser expresso e a levar à produção de uma proteína que é capaz de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina

[097] Uma visão geral dos diferentes sistemas de expressão está, por exemplo, contida em Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, em Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) e em Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffiths et al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427440). Uma visão geral dos sistemas de expressão de levedura é, por exemplo, fornecida por Hensing et al. (Antonie van Leuwenhoek 67 (1995), 261-279), Bussineau et al. (Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19), Gellissen et al. (Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer (Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496), Vedvick (Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745) e Buckholz (Bio/Technology 9 (1991), 1067- 1072).

[098] Os vetores de expressão foram amplamente descritos na literatura. Via de regra, eles não contêm apenas um gene marcador de seleção e uma origem de replicação, garantindo a replicação no hospedeiro selecionado, mas também um promotor bacteriano ou viral e, na maioria dos casos, um sinal de terminação para a transcrição. Entre o promotor e o sinal de terminação há, em geral, pelo menos um sítio de restrição ou um poliligante que possibilita a inserção de uma sequência de DNA codificante. A sequência de DNA que naturalmente controla a transcrição do gene correspondente pode ser usada como a sequência promotora, se ela estiver ativa no organismo hospedeiro selecionado. No entanto, essa sequência também pode ser trocada por outras sequências promotoras. É possível usar promotores garantindo a expressão constitutiva do gene e promotores induzíveis que permitem um controle deliberado da expressão do gene. As sequências promotoras bacterianas e virais possuindo essas propriedades são detalhadamente descritas na literatura. As sequências reguladoras para a expressão em microrganismos (por exemplo, em E. coli, S. cerevisiae) são suficientemente descritas na literatura. Os promotores que permitem uma expressão particularmente elevada de uma sequência a jusante são, por exemplo, o promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., em Rodriguez e Chamberlin (Eds), Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25) e os lp1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100). Os promotores induzíveis são preferencialmente usados para a síntese dos polipeptídeos. Esses promotores muitas vezes levam a rendimentos de polipeptídeo mais elevados do que os promotores constitutivos. Para obter uma quantidade ideal de polipeptídeo, um processo de dois estágios é frequentemente usado. Em primeiro ligar, as células hospedeiras são cultivadas sob condições otimizadas até uma densidade de células relativamente alta. Na segunda etapa, a transcrição é induzida dependendo do tipo de promotor usado. Sob este aspecto, um promotor tac é particularmente adequado, que pode ser induzido pela lactose ou IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosideo) (deBoer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Os sinais de terminação para a transcrição também são descritos na literatura.

[099] A transformação da célula hospedeira com um polinucleotídeo ou vetor, de acordo com a invenção, pode ser realizada por métodos padrão como, por exemplo, descrito em Sambrook e Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA; Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990. A célula hospedeira é cultivada em meios nutrientes que atendem aos requisitos da célula hospedeira particular utilizada, particularmente no que diz respeito ao valor de pH, temperatura, concentração de sal, aeração, antibióticos, vitaminas, oligoelementos, etc.

[0100] A presente invenção refere-se também a uma célula hospedeira que contém/é transformada com uma molécula de ácido nucleico ou um vetor de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferencial, tal célula hospedeira expressa uma proteína de acordo com a presente invenção, e é capaz de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina. Em princípio, a célula hospedeira pode ser qualquer célula hospedeira concebível, por exemplo, uma célula animal, uma célula vegetal, uma célula fúngica ou uma célula bacteriana. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula bacteriana ou uma célula fúngica. Em uma modalidade particularmente preferencial, a célula hospedeira é uma célula bacteriana, por exemplo, do gênero Escherichia, Corynebacterium, Clostridium, Bacillus ou Acinetobacter, e mais preferencialmente, das espécies E. coli, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis ou Acinetobacter villandi.

[0101] Em outra modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma célula fúngica, por exemplo, do gênero Saccharomyces, Candida, Ashbya, Kluyveromyces, Pichia, Yarrowia, Zygosaccharomyces, Aspergillus, Debaryomyces ou Torulopsis, mais preferencialmente, da espécie S. cerevisiae, Saccharomyces maximus, Candida maltosa, Ashbya gossypii, Kluveromyces lactis, Pichia pastoris Pichia stipitis, Yarrowia lipolitica, Aspergillus niger, Aspergillus nidullans, Debaryomyces hansenii ou Torulopsis utilis.

[0102] Em uma modalidade particularmente preferencial, a célula hospedeira é uma célula de levedura.

[0103] Como definido acima, a presente invenção refere-se também a um método para a preparação de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que é capaz de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina. Tal método compreende as seguintes etapas: (i) efetuar mutações em uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) a fim de produzir cistationina gama-sintases mutantes; (ii) expressar as moléculas de ácidos nucleicos modificadas obtidas na etapa (i) em uma célula hospedeira e em condições de cultura que permitem a seleção de moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína que é capaz de converter enzimaticamente a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina; (iii) identificando as células hospedeiras que expressam uma proteína que é capaz de converter enzimaticamente a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina; e (iv) obter, de uma célula hospedeira identificada na etapa (iii) a molécula de ácido nucleico que codifica a cistationina gama sintase modificada que é capaz de converter enzimaticamente a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina. [00105] A presente invenção também refere-se a um método para a preparação de uma proteína que é capaz de converter enzimaticamente a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina, o dito método compreendendo a etapa de expressar uma molécula de ácido nucleico obtida de acordo com o método descrito acima de acordo com a invenção e recuperar a proteína codificada.

[0104] O termo “cistationina gama sintase” (EC 2.5.1.48)” refere-se a qualquer enzima que tem a atividade enzimática de uma cistationina gama sintase. Uma cistationina gama sintase é uma enzima que catalisa a seguinte reação O4-succinil-L-homosserina + L-cisteína ■ L-cistationina + succinato

[0105] Essa atividade pode ser medida por métodos conhecidos na técnica (Ravanel, Biochem. J. 331 (1998), 639-648).

[0106] De acordo com a etapa (i) do método descrito acima de acordo com a invenção, uma versão mutante de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cistationina gama sintase é preparada a fim de produzir uma cistationina gama sintase mutante. Métodos para modificar as moléculas de ácidos nucleicos são bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. Assim, é possível inserir os diferentes tipos de mutações nas moléculas de ácidos nucleicos pelos métodos comumente utilizados em biologia molecular (consulte, por exemplo, Sambrook and Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA), levando à síntese de uma cistationina gama sintase com uma sequência de aminoácidos modificada em comparação com a sequência inicial. A princípio, qualquer tipo de mutação a nível da molécula de ácido nucleico é concebível, como deleções, adições e/ou substituições. Em uma modalidade preferencial, a mutação realizada no ácido nucleico causa uma substituição de um aminoácido a nível da sequência de aminoácidos.

[0107] É possível realizar apenas uma mutação por molécula de ácido nucleico, mas obviamente, também é possível efetuar uma ou mais mutações na molécula de ácido nucleico, que causam uma ou mais mutações a nível de aminoácidos. Não há, em princípio, limite superior para o número de mutações. No entanto, é preferível que a molécula de ácido nucleico modificada tenha ainda, pelo menos, pelo menos 60% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 70% de identidade de sequência, ainda mais preferencialmente pelo menos 80% de identidade de sequência, particularmente preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência e, mais preferencialmente, pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência inicial que codifica uma cistationina gama sintase usada na etapa (i) do método descrito acima.

[0108] Em uma modalidade preferencial, a molécula de ácido nucleico modificada obtida na etapa (i) do método codifica a versão mutante da cistationina gama sintase, que apresenta não mais de 20 alterações nos resíduos de aminoácidos em comparação com a cistationina gama sintase codificada pela molécula de ácido nucleico inicial ou, preferencialmente, não mais que 15 alterações, ainda mais preferencialmente no máximo 10 alterações e, de modo particularmente preferencial, não mais de 5 alterações.

[0109] O termo "uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48)" na etapa (i) do método de acordo com a invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína com a atividade enzimática de uma cistationina gama sintase, conforme especificado acima. A princípio, qualquer molécula de ácido nucleico que codifica tal enzima pode ser utilizada no método de acordo com a invenção, como matéria-prima. As cistationina gama-sintases foram descritas detalhadamente acima, bem como a sua ocorrência na natureza. Qualquer ácido nucleico que codifica qualquer uma dessas cistationina gama-sintases pode ser usado na etapa (i) do método de acordo com a invenção. Em uma modalidade preferencial, a molécula de ácido nucleico usada na etapa (i) é uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cistationina gama sintase de origem vegetal. Ainda mais preferencialmente, a cistationina gama sintase é oriunda da A. preferencialmente uma sequência de nucleotídeos que codifica a cistationina gama sintase da A. thaliana, como mostrado na SEQ ID NO: 1.

[0110] A sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico utilizada na etapa (i) pode ser adaptada para uso na célula hospedeira, que é utilizada na etapa (ii). Por exemplo, é possível alterar o uso do códon de modo a corresponder mais com o uso do códon da maquinaria de tradução das células hospedeiras utilizadas. Assim, a molécula de ácido nucleico pode ser modificada a fim de apresentar um uso de códon otimizado em relação à célula hospedeira utilizada na etapa (ii).

[0111] Além disso, outras modificações podem ser necessárias ou desejáveis para adaptar uma certa molécula de ácido nucleico, como uma molécula de ácido nucleico que codifica uma cistationina gama sintase de origem vegetal para o método de acordo com a invenção. Por exemplo, as cistationina gama-sintases de origem vegetal geralmente contêm uma sequência de direcionamento a cloroplasto na extremidade aminoterminal, que direciona a proteína para os cloroplastos. Dependendo de qual célula hospedeira é utilizada na etapa (ii), pode ser necessário ou desejável remover essa sequência alvo. Se, por exemplo, as células de levedura são utilizadas na etapa (i), é desejável remover essa sequência alvo do cloroplasto. Além disso, as cistationina gama- sintases de origem vegetal podem conter uma região reguladora (também referida como região mto) que permite a regulação da tradução mediada pelo aumento do pool intracelular da planta da S-adenosilmetionina (SAM). A SAM é capaz de se ligar ao peptídeo da cistationina gama sintase nascente durante a tradução em um bolso que é formado por essa região mto e uma parte do ribossomo, levando assim a uma interrupção da tradução. Pode ser desejável evitar essa regulação ao praticar o método de acordo com a invenção. Portanto, em uma modalidade preferencial, na etapa (i), uma cistationina gama-sintase de origem vegetal que codifica a sequência é usada, a qual é modificada a fim de evitar a regulação pela SAM. Tais mutações foram descritas na técnica anterior, por exemplo, em Onoue al. (Journal of Biological Chemistry 286 (2011), 1490314911). Além disso, também pode ser possível usar, como uma molécula de ácido nucleico inicial, uma sequência que leva a uma versão mais estável da cistationina gama sintase. Sabe-se que a identidade do segundo aminoácido N- terminal determina a estabilidade da proteína completa (Varshavsky, Annual Review of Biochemistry 81 (2012), 167-176). Assim, é vantajoso evitar resíduos desestabilizantes (em particular Tyr, Gln, Leu, Phe, Asp, Lys e Arg) e preferir estabilizar os resíduos como Val ou Ser (Varshavsky, Annual review of Biochemistry 81 (2012), 167-176).

[0112] A expressão da molécula de ácido nucleico modificada, de acordo com a etapa (ii) do método, pode ser alcançada por métodos conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Sistemas de expressão também já foram descritos acima juntamente com os vetores e as células hospedeiras de acordo com a invenção.

[0113] Na etapa (ii) do método de acordo com a invenção, uma célula hospedeira é utilizada para expressar a cistationina gama sintase modificada, que permite a seleção de moléculas de ácidos nucleicos que codificam uma proteína capaz de converter enzimaticamente a O-fosfo-L- homosserina e o metanotiol em L-metionina. Nesse contexto é, por exemplo, possível utilizar células hospedeiras que podem apenas sobreviver quando são cultivadas em um meio contendo, como a única fonte de enxofre, o metanotiol, se elas forem capazes de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L- metionina. Um exemplo de tais células hospedeiras são as células de Saccharomyces cerevisiae que foram geneticamente modificadas para serem menos desprovidas da função do met2. O gene MET2 codifica a homosserina transacetilase, que catalisa a conversão da homosserina e da acetil-CoA em O- acetil-homosserina e CoA. A inativação do gene MET2 resulta em cepas de leveduras que exibem um fenótipo de auxotrofia para a metionina. Preferencialmente, também o gene met6 deve se tornar disfuncional em tal cepa de levedura, que é desprovida da função MET2. O gene MET6 codifica a homocisteína metiltransferase, que converte homocisteína e metiltetra- hidrofolato em metionina. Uma vez que a S. cerevisiae não tem outra maneira de sintetizar o aminoácido essencial metionina a partir da homocisteína, uma cepa de S. cerevisiae desprovida da função MET2 (e, opcionalmente, também da função MET6) só pode sobreviver se puder produzir metionina por outros meios.

[0114] As condições de cultura na etapa (ii) também são adaptadas de modo que a célula hospedeira seja capaz de sobreviver apenas se puder transformar O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina. Isso pode ser conseguido fornecendo metanotiol como a fonte única de enxofre no meio de cultura.

[0115] É ainda mais preferível que, além dos genes MET2 e o MET6, também o gene THR4 seja inativado. Essa inativação visa aumentar o pool intracelular de OPHS. Nesse caso, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio suplementado com treonina e metanotiol, no lugar da metionina. Se tal célula hospedeira for usada, é possível isolar os mutantes que apenas apresentam uma atividade muito fraca de metionina sintase dependente de OPHS.

[0116] As células hospedeiras identificadas na etapa (iii) do método são, em seguida, usadas para obter moléculas de ácidos nucleicos que codificam a cistationina gama sintase modificada que é capaz de converter enzimaticamente a O-fosfo-L-homosserina e o metanotiol em L-metionina. Isso pode ser feito pelos métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.

[0117] A molécula de ácido nucleico isolada pode ser, desse modo, usada para expressar a enzima correspondente, ou pode ser introduzida em outras células hospedeiras.

[0118] Em uma modalidade preferencial, o método para a preparação de uma molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que é capaz de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina compreende vários ciclos de triagem, ou seja, a mutação e o isolamento de mutantes correspondentes apresentando a atividade desejada.

[0119] Nesse contexto, é preferível que, em um primeiro ciclo de triagem, uma célula hospedeira seja usada, na qual os genes MET2, MET6 e THR4 estejam inativados. Como foi explicado acima, ao usar tal célula hospedeira é possível isolar os mutantes que apenas apresentam uma atividade muito fraca de metionina sintase dependente de OPHS. Os mutantes isolados são, em seguida, submetidos a um outro ciclo de mutagênese e são, subsequentemente, selecionados para a atividade da metionina sintase dependente de OPHS em uma célula hospedeira, na qual apenas os genes MET2 e MET6 são inativados, mas que têm um gene thr4 ativo. Tal teste é mais rigoroso pois parte da OPHS é utilizada pela treonina sintase. Nesse caso, as células hospedeiras usadas para a seleção de clones com a propriedade enzimática desejada são cultivadas em um meio suplementado com metanotiol como uma fonte de enxofre.

[0120] O segundo ciclo de triagem pode ser realizado iterativamente, e a pressão de seleção pode aumentar diminuindo a quantidade de metanotiol adicionado ao médio e selecionando as cepas transformadas que exibem a taxa de crescimento mais rápida.

[0121] A figura 1 mostra uma vista simplificada da via de biossíntese da metionina em S. cerevisiae (extraído de: Thomas D. E Y. Surdin- Kerjan; Microbiological and Molecular Reviews 61 (1997); Metabolism of sulfur amino-acids in Saccharomyces cerevisiae., páginas 503 a 532).

[0122] A figura 2 mostra uma via química para a síntese da O-fosfo-L-homosserina.

[0123] A figura 3 mostra uma representação esquemática das formas truncadas de CGS1 usadas como material de partida para criar versões mutantes da enzima.

[0124] A figura 4 mostra o crescimento das cepas YA246-4A expressando a variante de CGS1 AD242 ou AD328 ou com o vetor de controle pAL06 no meio A suplementado com metionina 0,05 mM.

[0125] A figura 5 mostra o crescimento das cepas com base em YA246-4A expressando as famílias mutantes CGS1-4 (A), CGS1-5 (B) e CGS1- 1 (C), respectivamente, no meio A suplementado com 0,1 mM de metanotiol. O CGS1-4 (G84S) e os controles negativos com o vetor vazio pAL06 são mostrados em todos os gráficos.

[0126] A figura 6 mostra o crescimento de cepas com base no YA247-5A expressando a família de mutantes CGS1-4 AD242, AD328, MUT24 e MUT27 no meio A suplementado com 1 mM (A) ou 0,1 mM (B) de metanotiol. O CGS1-4 (G84S) e os controles negativos com pAL06 são mostrados em todos os gráficos.

[0127] A figura 7 mostra um alinhamento dos mutantes identificados de CGS1.

DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0128] A SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de aminoácidos da cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) CGS1 de Arabidopsis thaliana (AAC25687.1).

[0129] A SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos da cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) CGS1 de Arabidopsis thaliana (AAC25687.1) em que a glicina 84 é substituída pela serina. Essa sequência é também referida como CGS1 G84S ou CGS1-0.

[0130] A SEQ ID NO: 3 mostra a sequência de aminoácidos da cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) CGS1 de Arabidopsis thaliana (AAC25687.1) em que a glicina 84 é substituída pela serina e na qual os 57 aminoácidos N-terminais foram removidos e um resíduo de metionina é adicionado no N-terminal. Essa sequência é também referida como CGS1 1-4 G84S.

[0131] A SEQ ID NO: 4 mostra uma forma truncada da sequência de aminoácidos da cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) CGS1 de Arabidopsis thaliana (AAC25687.1), na qual os 88 aminoácidos N-terminais foram removidos e um resíduo de metionina é adicionado no N-terminal. Essa sequência é também referida como CGS1 1-5 G84S.

[0132] A SEQ ID NO: 5 mostra uma forma truncada da sequência de aminoácidos da cistationina gama sintase (EC 2.5.1.48) CGS1 de Arabidopsis thaliana (AAC25687.1), na qual os 160 aminoácidos N-terminais foram removidos e um resíduo de metionina é adicionado no N-terminal. Essa sequência é também referida como CGS1 1-1 G84S.

[0133] A SEQ ID NO: 6 mostra a sequência do mutante MUT02.

[0134] A SEQ ID NO: 7 mostra a sequência do mutante MUT04.

[0135] A SEQ ID NO: 8 mostra a sequência do mutante MUT13.

[0136] A SEQ ID NO: 9 mostra a sequência do mutante MUT18.

[0137] A SEQ ID NO: 10 mostra a sequência do mutante MUT19.

[0138] A SEQ ID NO: 11 mostra a sequência do mutante AD309.

[0139] A SEQ ID NO: 12 mostra a sequência do mutante AD310.

[0140] A SEQ ID NO: 13 mostra a sequência do mutante AD311.

[0141] A SEQ ID NO: 14 mostra a sequência do mutante AD312.

[0142] A SEQ ID NO: 15 mostra a sequência do mutante AD313.

[0143] A SEQ ID NO: 16 mostra a sequência do mutante AD242.

[0144] A SEQ ID NO: 17 mostra a sequência do mutante AD328.

[0145] A SEQ ID NO: 18 mostra a sequência do mutante AD329.

[0146] A SEQ ID NO: 19 mostra a sequência do mutante MUT24.

[0147] A SEQ ID NO: 20 mostra a sequência do mutante MUT27.

[0148] A SEQ ID NO: 21 mostra a sequência do mutante MUT67.

[0149] A SEQ ID NO: 22 mostra a sequência do mutante MUT68.

[0150] A SEQ ID NO: 23 mostra a sequência do mutante MUT70.

[0151] A SEQ ID NO: 24 mostra a sequência do mutante MUT71.

[0152] A SEQ ID NO: 25 mostra a sequência do mutante MUT72.

[0153] A SEQ ID NO: 26 mostra a sequência do mutante MUT74.

[0154] A SEQ ID NO: 27 mostra a sequência do mutante MUT75.

[0155] A SEQ ID NO: 28 mostra a sequência do mutante MUT78.

[0156] A SEQ ID NO: 29 mostra a sequência do mutante MUT79.

[0157] O conteúdo dos documentos citados nesse documento é aqui incorporado por referência em suas totalidades.

[0158] Outros aspectos e vantagens da invenção serão descritos nos exemplos a seguir, que são fornecidos para fins de ilustração, e não a título de limitação.

EXEMPLOS EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DAS FORMAS TRUNCADAS DE CGS1 USADAS COMO MATERIAL DE PARTIDA PARA PREPARAR MUTANTES

[0159] O gene CGS1-4 é um gene sintético. A síntese foi realizada por Eurofins MWG Operon, (Ebersberg) usando o algoritmo GENEius para otimizar o uso do códon para melhorar a sua expressão em S. cerevisiae. A tabela de uso de códon da S. cerevisiae usada foi extraída do Banco de Dados de Uso de Códons Kazusa (http://www.kazusa.or.jp/codon). As formas truncadas, CGS1-5 e CGS1-1 foram preparadas por PCR usando CGS1-4 como uma matriz, com os oligonucleotídeos normais GTACCGCTCGAGATGGTTGCTGGTAAGTGGTCTAACAATC para CGS1-5 e GTACCGCTCGAGATGTCTGTTCAATTGACCGATTCTAAG para CGS1-1. Para ambas as formas CGS1-5 e CGS1-1, foi usado um oligonucleotídeo reverso idêntico AGTACGGGATCCTCAAATGGCTTCCA.

[0160] As formas modificadas truncadas descritas de CGS1 são mostradas esquematicamente na figura 3.

EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DOS MUTANTES DAS FORMAS TRUNCADOS DE CGS1

[0161]As formas truncadas dos genes CGS1 foram clonadas no plasmídeo pAL06, um vetor replicativo de levedura derivado do vetor pRS316 (Sikorski RS & Hieter P., Genetics, 1989, 122:19-27). O plasmídeo pAL06 permite a expressão do gene clonado sob o controle do promotor de levedura forte TEF1. As bibliotecas de CGS1 foram geradas por PCR hipermutagênico com concentrações de trifosfato de desoxinucleotídeo (dNTP) enviesadas usando o protocolo descrito por Vartanian JP et al., (Nucleic Acids Res. 1996 24:2627-2631). Ambos os desvios [dTTP] > [dCTP] e [dGTP] > [dATP] foram usados durante as PCRs mutagênicas. [dTTP]/[dCTP] = [dGTP]/[dATP] = 1000 μM / 200 μM ou [dTTP]/[dCTP] = [dGTP]/[dATP] = 1000 μM / 150 μM foram usados na presença de MnCl2 0,5 mM.

EXEMPLO 3: TRIAGEM PARA MUTANTES QUE PODEM PRODUZIR L-METIONINA A PARTIR DA O-FOSFO-L-HOMOSSERINA E METANOTIOL

[0162]As bibliotecas CGS1 foram transformadas nas cepas de leveduras YA247-5A (MAT-α, ade2, his3, leu2, met2::loxP, met6::HIS3, trp1, ura3) ou YA246-4A (MAT-a, ade2, his3, leu2, met2::loxP, met6::HIS3, thr4::loxP, trp1, ura3) em meio mínimo suplementado com metionina, mas sem a uracila para selecionar o marcador do plasmídeo. Após 48 horas de crescimento, as células foram coletadas, lavadas e ressuspensas em meio líquido mínimo com metilmercaptano como uma fonte de enxofre. Após 7 dias, as culturas foram coletadas e diluídas no mesmo meio líquido, a uma OD600nm de cerca de 0,2. Foram realizados três ciclos de diluições sucessivas. [0166] Os plasmídeos presentes nas células de levedura em crescimento resultantes foram, então, extraídos, amplificados em E. coli e o DNA resultante foi usado para retransformar as s cepas YA247-5A (MAT-α, ade2, his3, leu2, met2::loxP, met6::HIS3, trp1, ura3) ou YA246-4A (MAT-a, ade2, his3, leu2, met2::loxP, met6::HIS3, thr4::loxP, trp1, ura3). As leveduras transformadas foram, em seguida, selecionadas em meio sólido mínimo contendo metionina, mas sem uracila. A capacidade de cada colônia individual crescer com metilmercaptano como uma fonte de enxofre foi, em seguida, avaliada pelo crescimento de clones individuais no meio líquido contendo metanotiol como uma fonte de enxofre. Em cada ciclo de evolução, os plasmídeos contidos nas colônias de leveduras exibindo as melhores taxas de crescimento na presença de metanotiol foram extraídos e sequenciados. Os mutantes selecionados foram transformados na cepa YA247-5A para análise in vitro e foram usados como um materiais de partida para um novo PCR hipermutagênico.

[0163]Usando o procedimento de triagem acima descrito, um grande número de mutantes de CSG1 foi identificado, que foram capazes de crescer em metanotiol como a fonte única de enxofre e que são, portanto, considerados capazes de converter O-fosfo-L-homosserina e metanotiol em L-metionina. A partir desses mutantes, as sequências foram determinadas e os mutantes estão resumidos na tabela 1A a seguir, em que as posições das mutações são indicadas com referência à sequência fornecida na SEQ ID NO: 3 (CGS 1-4). Os mutantes também estão resumidos na figura 7, na qual eles estão alinhados.

[0164] A tabela 1B a seguir lista todos os mutantes analisaram e indicou as posições das mutações encontradas em relação à sequência completa da SEQ ID NO: 1 (CGS1). A posição em relação à sequência inicial correspondente é indicada entre parênteses.

[0165] A sequência inicial 1-4 corresponde à SEQ ID NO: 3.

[0166] A sequência inicial 1-5 corresponde à SEQ ID NO: 4

[0167] A sequência inicial 1-1 corresponde à SEQ ID NO: 5

[0168] A tabela 1C a seguir lista todos os mutantes analisados e indica as posições das mutações encontradas em relação à sequência da SEQ ID NO: 3 (CGS1-4). A posição em relação à sequência inicial correspondente é indicada entre parênteses.

EXEMPLO 4: TESTE DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA NA LEVEDURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE

[0169]A expressão de qualquer um dos mutantes descritos acima nas cepas de Saccharomyces cerevisiae YA247-5A (MAT-α, ade2, his3, leu2, met2::loxP, met6::HIS3, trp1, ura3) e YA246-4A (MAT-α, ade2, his3, leu2, met2::loxP, met6::HIS3, thr4::loxP, trp1, ura3) alivia as tensões de suas auxotrofias em relação à metionina.

[0170]Em outras palavras, após expressar qualquer um dos mutantes acima, a cepas de leveduras YA247-5A e YA246-4A defeituosas para a síntese de metionina são cultivadas em um meio mínimo suplementado com adenina, histidina, leucina, triptofano e uracila.

DESIGN EXPERIMENTAL DO TESTE

[0171]As sequências nucleotídicas mutantes foram individualmente clonadas no plasmídeo replicativo pAL06 (um derivado do pRS316) a jusante de um promotor de transcrição (pTEF1) e a montante de um terminador de transcrição (tADH1).

[0172]Os doze plasmídeos obtidos dessa forma foram individualmente transformados nas cepas de levedura YA247-5A e YA246- 4A. Os transformantes foram cultivados em meio A (para leveduras Difco™, com 6,7% de base de nitrogênio, 2% de glicose, adenina 0,3 mM, leucina 0,75 mM, histidina 1,3 mM, triptofano 0,1 mM) suplementado com metionina 0,2 mM.

[0173]Cada um dos transformantes foi, em seguida, inoculado (OD590 = 0,015) no meio A suplementado com metionina 0,05 mM, ou no meio A suplementado com metanotiol 0,1 ou 1 mM.

[0174]O crescimento foi monitorizado acompanhando a densidade óptica a 590 nm (OD590). O crescimento respectivo de cada clone nos dois meios foi comparado com o crescimento dos controles negativos YA246-4A ou YA247-5A, transformados com um vetor vazio pAL06.

[0175]No meio A com metionina, todas as cepas testadas têm um tempo de geração de cerca de 4h. Por exemplo, o cultivo de cepas YA246-4A expressando os mutantes CGS 1-4 (G84S), AD242 e AD328 e o vetor de controle pAL06 é mostrado na figura 4.

[0176]Crescimento em um contexto de acúmulo de fosfo- homosserina:

[0177]O crescimento de cepas baseadas em YA246-4A que acumulam fosfo-homosserina e expressam os mutantes da proteína CGS1 no meio a suplementado com metanotiol 0,1 mM é apresentado na figura 5.

[0178]Em todos os casos, nenhum crescimento foi observado para o controle CGS1-4 (G84S) e para as cepas com o plasmídeo pAL06.

[0179]Para a família CGS1-4 (figura 5A), o tempo de geração está compreendido entre 13h para MUT19 e 42h para MUT02. Para a família CGS1-5 (Figura 5B), o tempo de geração está compreendido entre 9,5 h para AD312 e AD313 e 12,5 h para AD310. Para a família CGS1-1 (5C), o tempo de geração é igual a cerca de 9,5 h para AD242, AD328 e AD329.

[0180]Crescimento em um contexto sem acúmulo de fosfo- homosserina:

[0181]O crescimento de cepas baseadas em YA247-5A, que não acumulam fosfo-homosserina e expressam os mutantes da proteína CGS1 no meio A suplementado com metanotiol 1 mM ou metanotiol 0,1 mM é mostrado nas figuras 6A e 6B, respectivamente.

[0182]Com metanotiol 1 mM, nenhum crescimento foi observado para o CGS1-1 e para o controle negativo transformado com o vetor vazio pAL06. Os tempos de geração são de cerca de 21 h para AD242 ou AD328, de 10,5 h para MUT27 e de 8 h para MUT24. Com 0,1 mM de metanotiol, o crescimento foi observado apenas com os mutantes MUT24 e MUT27. Os tempos de geração são, respectivamente, 19 h e 40 h.

EXEMPLO 5: ATIVIDADE IN VITRO DA METIONINA SINTASE DEPENDENTE DE OPHS

[0183]A atividade in vitro da enzima expressa em levedura foi testada em um lisado bruto de levedura.

[0184]A atividade foi acompanhada pelo monitoramento da síntese de metionina no lisado na presença de O-fosfo-L-homosserina (OPHS) e metanotiol (CH3SNa). Os lisados das células de levedura YA246- 5A, YA246-5A com um plasmídeo vazio pAL06, YA246-5A expressando CGS1-4 e YA246-5A, expressando os mutantes AD246, AD239, MUT24, MUT27, MUT67 ou MUT79 foram comparados. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PREPARAÇÃO DO LlSADO

[0185]As células de levedura foram primeiramente cultivadas em um meio completo. Essa primeira cultura foi utilizada para inocular 100 mL de meio A (OD590nm = 0,3) que foi incubado a 28 °C sob agitação durante 16 horas.

[0186]A quantidade total de proteína foi determinada utilizando um ensaio de Bradford.

[0187] Para iniciar a reação, de 0,03 a 0,06 mg de proteína total foi incubada a 37 °C em Tris 100 mM pH 8, piridoxal fosfato 0,2 mM, CH3SNa 5 mM e OPHS 25 mM em um volume total de 100 μL durante 15 minutos. Alíquotas de 10 μL da m istura de reação foram coletadas em 15 e 60 minutos, e a reação foi interrompida pela adição de 90 μL de ácido perclórico. A quantidade de metionina nessas alíquotas foi determinada por LCMS usando 13CMet como padrão interno. A quantidade de metionina formada foi normalizada pela quantidade de proteína utilizada no ensaio.

[0188] Os resultados são mostrados na tabela 2 a seguir: TABELA 2 Atividade (nmol.min-1.mg-1) Desv. Pad.

EXEMPLO 6: ENSAIO IN VITRO PARA MEDIR A ATIVIDADE DA HOMOCISTEÍNA SINTASE

[0189] A atividade da homocisteína sintase das enzimas expressadas na levedura foi testada em um ensaio in vitro usando um lisado bruto de leveduras.

[0190] A atividade foi acompanhada pelo monitoramento da síntese de metionina no lisado na presença de O-fosfo-L-homosserina (OPHS) e metanotiol (CH3SNa). Os lisados das células de levedura YA246-5A, YA246-5A com um plasmídeo vazio pAL06, YA246-5A expressando CGS1-4 e YA246-5A, expressando os mutantes AD242, AD328, MUT24, MUT27, MUT67 ou MUT79 foram comparados.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL PREPARAÇÃO DO LlSADO

[0191] As células de levedura foram primeiramente cultivadas em um meio completo. Essa primeira cultura foi utilizada para inocular 100 mL de meio A (OD590nm = 0,3) que foi incubado a 28 °C sob agitação durante 16 horas. A quantidade total de proteína foi determinada utilizando um ensaio de Bradford. A quantidade de homocisteína formada é determinada por um ensaio colorimétrico.

[0192] Para iniciar a reação, de 0,03 a 0,06 mg de proteína total foi incubada em Tris 0,1 M pH 8, piridoxal fosfato 0,2 mM, Na2S 10 mM, OPHS 12,5 mM em 100 μL.: - Incubar durante 15 minutos a 30 °C; - Adicionar 500 μl de NaNO2 1% (dissolvido em H2SO4 0,4 N) incubar durante 5 minutos; - Adicionar 100 μL de NH4SO3NH2 incubar durante 2 minutos - Adicionar 750 μL de 1 volume de HgCl2; - Adicionar 4 volumes de sulfanilamida; - Adicionar 2 volumes de cloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina Incubar durante 15 minutos ; Realizar a leitura de DO a 450 nm (aumenta proporcionalmente com a quantidade de homocisteína - a quantidade é determinada por comparação com os resultados obtidos com um intervalo de homocisteína conhecido).

[0193] Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Claims

1. MÉTODO PARA PRODUZIR L-METIONINA, caracterizado pela O-fosfo-L-homosserina (OPHS) e metanotiol serem enzimaticamente convertidos em L-metionina e H3PO4, de acordo com o seguinte esquema de reação: O-fosfo-L-homosserina + CH3-SH < = > L-metionina + H3PO4, em que a conversão enzimática é realizada mediante o uso de uma metionina sintase dependente de OPHS, que é uma proteína derivada de uma cistationina gama-sintase (EC 2.5.1.48) por mutação; e a metionina sintase dependente de OPHS é uma proteína selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma proteína que consiste em uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29; e (b) uma proteína que possui qualquer uma das SEQ ID NOs: 6 a 29 e que possui uma atividade enzimática de conversão de O-fosfo-L- homoserina e metanotiol em L-metionina e H3PO4.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser realizado in vitro.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo método ser realizado usando um microrganismo que produz ametionina sintase dependente de OPHS, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 2.

4. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE S- ADENOSILMETIONINA, caracterizado por compreender a produção de L- metionina pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e conversão da L-metionina em S-adenosilmetionina.

5. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE CISTEÍNA, caracterizado por compreender a produção de L-metionina pelo método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e conversão da L- metionina em cisteína.

6. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE GLUTATIONA, caracterizado por compreender a produção de L-metionina pelo método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e conversão da L- metionina em glutationa.

7. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE 2-OXO-4- METILTIOBUTANOATO, caracterizado por compreender a produção de L- metionina pelo método conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e conversão da L-metionina em 2-oxo-4-metiltiobutanoato.