BR112014032741B1 - Método para seletivamente preparar um éster de alquila de ácido graxo - Google Patents
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Abstract
LIPASE EM ESTERIFICAÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS DE CADEIA CURTA. A presente invenção refere-se a patatina, uma lipase que pode ser obtida de batatas, que descobriu-se ter vantagens na reação de esterificação de ácidos graxos, para render ésteres de alquila de ácidos graxos. Métodos para aplicação dessa atividade de lipase são descritos, como também o uso de patatina em vários processos industriais.
Description
[0001] É bem sabido que as lipases são capazes de catalisar aformação de ésteres no meio orgânico. Desse modo, usando lipases, os ácidos carboxílicos podem ser convertidos para ésteres na presença de suficientes compostos substituídos por hidróxi livre.
[0002] O uso de lipases é comum na indústria. Exemplos incluemresolução de fármacos racêmicos, modificação de gordura e lipídeos, síntese de sabor e produção de farma e nutracêuticos. A vasta maioria de lipases que estão presentemente em uso, é obtida usando sistemas de fermentação fúngica ou bacteriana, embora lípases derivadas de animal tem algum uso também. Lipases derivadas de planta são relativamente raras para aplicações industriais.
[0003] A maioria das lípases, industrialmente aplicáveis, são obtidas de mistura de fermentação bacteriana. Subsequentemente, as lipases têm que ser isoladas, usando processamento à jusante ineficiente. Este é um processo difícil e dispendioso, que limita sua disponibilidade. Desta maneira, tais lipases tendem a ser de baixa pureza em ambas, uma base total- e uma base de proteína, e também contêm grandes quantidades de carboidratos, sais e possíveis atividades laterais indesejáveis. Além do mais, preparações de lipase comercial geralmente contêm uma ampla variedade de material de não proteína, sais e enzimas não lipases (Bjurlin et al 2001 JAOCS 78-2 p 153-160).
[0004] Normalmente, as reações de esterificação, que exigem ácidos graxos, confiam no uso de lamas de fermentação contendo altas quantidades de ácidos graxos livres. Isto leva a misturas altamente variáveis, em que os ácidos graxos livres estão presentes como um componente entre muitas impurezas. Fosfolipídios, presentes em membranas de células, são um importante constituinte dessas impurezas. Por exemplo, a enzima de lipase comumente usada, Novozyme 435, requer óleos de desgomagem a fim de produzir ésteres do óleo; a presença de fosfolipídios inibe a reação de esterificação. Lipases geralmente têm dificuldades de lidar com altas quantidades de impurezas, que levam à síntese ineficiente de ésteres de ácido graxo.
[0005] Uma enzima de lipase derivada de planta pode ser obtidada batata. As proteínas de batata podem ser divididas em três categorias: (i) a família patatina, glicoproteínas 43 kDa acídicas altamente homólogas (40-50 % em peso das proteínas de batata), (ii) inibidores de protease 5-25 kDa básicos (30-40 % em peso de proteínas de batatas) e (iii) outras proteínas, na maior parte proteínas de peso molecular alto (10-20 % em peso das proteínas de batatas). A família de patatina é conhecida por ter alguma atividade de lipase, e pode ser obtida através de um processo cromatográfico de uma etapa única, seguido por concentração e secagem. Um processo altamente conveniente, entre outros, para o isolamento de patatina com alta pureza, é descrito no pedido WO2008/069650.
[0006] Na prática, entretanto, proteínas de batata, incluindo a lipase de proteína de batata chamada patatina, têm sido principalmente usadas como matéria prima alimentícia para animais, por causa de uma falta de uso comercial prático.
[0007] A invenção provê um meio de usar patatina para a síntesede ésteres específicos. Desse modo, a patatina pode ser usada para fazer ésteres de ácidos graxos C4-C26, preferivelmente ácidos graxos C4-C12 e mais preferivelmente ácidos graxos C6-C10, muito preferivelmente ácidos graxos C8 - C10. Ésteres obtidos com o método da invenção são preparado de álcoois C1-C3, preferivelmente mono- hidroxialcoóis, mais preferivelmente etanol ou metanol, e muito preferi- velmente metanol.
[0008] Figura 1: Atividade de lipase residual em concentraçõesvariadas de metanol
[0009] Figura 2: Cromatograma de camada fina de Ésteres de Alquila de Ácido Graxo (FAAE) sintetizado por patatina. A faixa 1 contém ácido graxo livre (FFA, especificamente ácido láurico, C12), a faixa 2 contém óleo de coco baseado em FAME, faixas 3 até 7 contêm os produtos de reação de ácido láurico com metanol, etanol, n-propanol, isopropanol e n-butanol, respectivamente.
[00010] Figura 3: Precipitação de ácidos graxos na presença de concentração de sal aumentada. Esquerda: ácido octanoico não precipitado em um sistema bifásico de ácido octanoico e água desmineralizada (demi-água). Direita: precipitação de ácido octanoico de ácido graxo em um sistema bifásico de ácido octanoico e uma solução aquosa saturada KC1.
[00011] Para o escopo da presente invenção, patatina é entendida para significar a alta fração de peso molecular (HMW) de isolados de proteína de batata nativa, uma família de glicoproteínas altamente homólogas, tendo um peso molecular de 30 kDa ou mais, preferivelmente 35 kDa ou mais e mais preferivelmente de cerca de 43 kDa, e um ponto isoelétrico de menos do que 5,8, preferivelmente entre 4,8 e 5,5, que perfaz cerca de 40 a 50 % em peso das proteínas de batata. Pata- tina é uma família de glicoproteínas que exibe reatividade de acil- hidrolase e é responsável por até 40 % em peso da proteína solúvel total em tubérculos de batata. No pedido WO2008/069650 uma descri-ção elaborada do isolamento da patatina do suco de fruta de batata (PFJ) ou água de fruto de batata (PFW) é descrita, que está incorporada aqui por referência.
[00012] Esse processo requer submeter suco de fruta de batata a uma floculação através de um cátion de metal divalente metal em um pH de 7 a 9, e centrifugando o suco de fruta de batata floculada, desta maneira formando uma sobrenadante. Subsequentemente, a subrena- dante é submetida à cromatografia de adsorção de leito expandido, operada em um pH de menos do que 11, e uma temperatura de 5 a 35 °C, usando um adsovente capaz de ligação de proteína de batata, desta maneira absorvendo a proteína de batata nativa para o adsovente.
[00013] Finalmente, pelo menos uma proteína de batata nativa isolada, é depurada do adsovente com um depurador. Este método resulta, entre outros, em patatina nativa isolada de alta pureza, com um mínimo de proteína desnaturada presente e caracterizada por uma solubilidade estável.
[00014] O suco de fruta de batata é pré-tratado com um cátion de metal divalente em um pH de 7 a 9, preferivelmente 7,0 a 7,5, para flocular material indesejável, seguido por uma separação de flocos por centrifugação. Um cátion de metal divalente particularmente apropriado é Ca2+. Este pré-tratamento remove do suco de fruta de batata, material indesejável tal como polímeros, pectinas, glicoalcaloides e microorganismos negativamente carregados. Em particular, a remoção de pectinas e glicoalcaloides é vantajosa, uma vez que esses compostos aderem às proteínas de batata e podem causar floculação, desse modo levando a uma proteína instável isolada em termos de solubilidade e outras propriedades físicas.
[00015] Na segunda etapa do processo, a sobrenadante é submetida à cromatografia de adsorção de leito expandido. É vantajoso manter a temperatura do material de partida abaixo de 35 °C para uma melhor estabilidade de patatina. Além do mais, é preferido usar uma taxa de fluxo moderadamente alta, tipicamente na faixa de 600 a 1 200 cm/h. A cromatografia de adsorção de leito expandido é operada em um pH de menos do que 11, preferivelmente em um pH de menos do que 10.
[00016] As proteínas de batata nativas, no suco de fruta de batata pré-tratado, são isoladas da sobrenadante ligando-as em um adsoven- te apropriado na coluna de adsorção de leito expandido. Materiais de coluna que ligam certas quantidades de proteínas de batata nativas incluem, adsorvência de modo misturado tal como Amersham Streamline™ Direct CST I (GE Healthcare), Adsorvência de linha rápida (Upfront Chromatography A/S), absorvência de macroporos tal como Amberlite™ XAD7HP (Rohm & Haas Company) e adsorventes de troca de íons. O adsorvente com proteínas de batata nativas adsorvidas é subsequentemente depurado com um depurador apropriado, a fim de recuperar a proteína de batata isolada nativa, tal como patatina. O depurador preferivelmente tem um pH na faixa de 4 a 12, mais preferivelmente na faixa de 5,5 a 11,0.
[00017] Em uma modalidade preferida, usando adsorvência de modo misturado, as proteínas podem ser fracionadas para ambos, ponto isoelétrico e peso molecular. Isto permite a separação de, por exemplo, patatina e frações de inibidor de protease. Isolados de patatina são depurados em um pH de 5,7 a 8,7, preferivelmente em um pH de 5,8 a 6,5.
[00018] A reatividade de acil-hidrolase é geralmente entendida como a capacidade de uma (classe de) enzima(s) catalisar a hidrólise de uma ligação de éster por uma molécula de água para formar o ácido carboxílico e álcool constituintes. Essa reação pode ser invertida por adaptação apropriada das condições de reação, caso em que a esteri- ficação de um ácido carboxílico e um álcool ocorre. As condições de reação que podem influenciar a direção da reação incluem, por exemplo, temperatura, identidade de reagente, e/ou a quantidade de água, ácido carboxílico e álcool presente.
[00019] De acordo com a presente invenção foi descoberto que a patatina tem uma resistência relativamente firme contra um ambiente orgânico. Em adição, por causa da patatina ser isolada de material de planta comum, é fácil obter em grandes quantidades, mais fácil do que lípases isoladas obtidas de um caldo de fermentação e processamento a jusante ineficiente.
[00020] Por este motivo, a patatina é altamente apropriada para preparação de ésteres de C4-C26 ácidos graxos, preferivelmente C4-C12 ácidos graxos e mais preferivelmente C6-C10 ácidos graxos, muito preferivelmente C8 - C10 ácidos graxos. Os ésteres são obtidos pela reação com álcoois, preferivelmente álcoois moleculares pequenos, isto é, C1-C3 álcoois. Os álcoois moleculares pequenos podem ser supridos puros ou como uma mistura de diversos álcoois moleculares pequenos. Preferivelmente, mono-hidroxialcoóis são usados, ainda mais pre-ferivelmente etanol ou metanol, e muito preferivelmente metanol.
[00021] Em uma modalidade preferida, metil e etil ésteres de C4-C26 ácidos graxos, preferivelmente C4-C12 ácidos graxos e mais preferivelmente C6-C10 ácidos graxos, muito preferivelmente C6 - C10 ácidos graxos são preparados, usando C1 ou C2 mono-hidroxialcoóis, isto é, metanol ou etanol, ou uma mistura dos mesmos.
[00022] De acordo com a presente invenção foi descoberto que a reatividade de acil hidrolase de patatina, de acordo com a presente invenção, pode resultar em esterificação de ácidos graxos com álcoois moleculares pequenos. Desta maneira, a reatividade de acil-hidrolase de patatina pode ser usada para sintetizar ésteres. Para este fim, a patatina pode ser usada em método para a produção de ésteres de alquila de ácido graxo de cadeia pequena, mesmo se essa mistura contém grandes quantidades de impurezas.
[00023] Desse modo, a presente invenção é dirigida para o método para preparar, preferivelmente seletivamente, um éster de alquila de ácido graxo compreendendo prover um meio líquido compreendendo um ou mais C4 - C26 ácidos graxos, um ou mais C1-C3 álcoois e patati- na nativa, e permitindo o um ou mais ácidos graxos reagirem com o um ou mais álcoois para obter o éster de alquila de ácido graxo.
[00024] Em método de acordo com a presente invenção, os ácidos graxos são C4- C26 ácidos graxos, preferivelmente C4 - C12 ácidos gra- xos, mais preferivelmente C6- C10 ácidos graxos e muito preferivelmente C8 - C10 ácidos graxos.
[00025] O um ou mais C1 — C3 álcoois são contidos, preferivelmente, em um ou mais mono-hidroxialcoóis, entre os quais n-propanol, i- propanol, etanol e/ou metanol, e mais preferivelmente metanol e/ou etanol são usados.
[00026] Em uma modalidade muito preferida, o álcool é metanol e/ou etanol, o ácido graxo é um C4 - C12 ácido graxo, e o éster de alquila de ácido graxo é um éster de metila ou etila de um C4 - C12 ácido graxo.
[00027] Cadeias de ácido graxo são categorizadas pelo comprimento da cadeia como pequenas ou muito longas:
[00028] Ácidos graxos de cadeia pequena (SCFA) são ácidos gra- xos mais curtos do que C6.
[00029] Ácidos graxos de cadeia média (MCFA) are C6 - C12 ácidos graxos.
[00030] Ácidos graxos de cadeia longa (LCFA) são C13 - C21 ácidos graxos
[00031] Ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA) são ácidos graxos mais longos do que C22.
[00032] Geralmente, lipases são sensíveis às impurezas presentes na mistura de esterificação. Patatina, por outro lado, é muito menos sensível às impurezas, em particular a fosfolipídios. Desse modo, uma vantagem do método da presente invenção é que a matéria prima de alimentação de ácido graxo pode conter quantidades maiores de impurezas, em particular fosfolipídios, do que para outras lipases.
[00033] Em outras reações de esterificação baseada em enzima, a presença de fosfolipídios muitas vezes inibe a reação de esterificação. Por este motivo, os fosfolipídios têm que ser removidos da matéria prima alimentícia de ácido graxo. Isto leva a uma matéria prima alimentícia mais dispendiosa, e desse modo a um produto mais dispendioso. Desse modo, os produtos de éster podem ser feitos muito mais baratos, usando patatina do que outros processos de esterificação baseados em lipase.
[00034] Os ácidos graxos, no método da presente invenção, podem ser supridos por uma matéria prima alimentícia de ácido graxo. Essa matéria prima alimentícia é um meio sólido ou líquido compreendendo, entre outros, ácidos graxos para uso na presente invenção. Preferivelmente, a matéria prima alimentícia é um meio líquido. O meio líquido pode compreender um solvente, mas é também possível realizar o método da invenção sem o uso de um solvente, por exemplo, sob condições em que o meio é fundido.
[00035] A matéria prima alimentícia de ácido graxo compreende pelo menos um dos C4-C26 ácidos graxos, ou qualquer mistura de C4-C26 ácidos graxos, para resultar em ésteres de C4-C26 ácidos graxos. Em particular, a matéria prima alimentícia para reação com um álcool, de acordo com a presente invenção, compreende pelo menos uma ou qualquer mistura de ácidos graxos de cadeia curta ou média, isto é, C4-C12 ácidos graxos. Mais preferivelmente a matéria prima alimentícia compreende pelo menos uma ou qualquer mistura de C6-C10 ácidos graxos, mais preferivelmente C8 - C10 ácidos graxos. Isto resulta em ésteres de C4-C12 ácidos graxos, preferivelmente de C6-C10 ácidos graxos, muito preferivelmente de C8 - C10 ácidos graxos.
[00036] Os ácidos graxos, na matéria prima alimentícia de ácido graxo, podem estar presentes em qualquer forma, tal como ligado a glicerol na forma de mono, di, e/ou triglicerídeos, mas a matéria prima alimentícia pode também compreender fosfolipídios ou fosfolipídios parcialmente hidrolisados. Além disso, ácidos graxos podem estar presentes em uma matéria prima alimentícia como ácidos graxos livres. Também, uma mistura de qualquer um ou de todos esses componentes podem estar presente, como também outros componentes de ligação de não ácido graxo. Preferivelmente, entretanto, os ácidos graxos estão presentes na matéria prima alimentícia, pelo menos em uma quantidade significativa, como ácidos graxos livres. Uma quantidade significativa, neste contexto, é 6 g/L, preferivelmente maior do que 90 g/L.
[00037] É uma vantagem do presente método que os ácidos graxos livres podem estar presentes em quantidades relativamente grandes. Muito preferível, a quantidade de ácidos graxos livres, expressa como uma percentagem da quantidade total de ácidos graxos presentes na matéria prima alimentícia de ácido graxo, é pelo menos 25 % em peso, preferivelmente maior do que 40 % em peso, baseada no peso da matéria prima alimentícia.
[00038] Exemplos de matéria prima alimentícia de ácidos graxo apropriadas são gorduras ou óleos animais, óleos vegetais, entre os quais óleos vegetais hidrolizados e/ou oxidados, tais como por exemplo óleo usado para fritar, gordura de manteiga estragada e sebo de baixa qualidade.
[00039] Em uma modalidade alternativa, entretanto, a matéria prima alimentícia de ácido graxo é um lodo de fermentação. Por causa do uso de patatina, de acordo com o presente método, aumentar a tolerância a impurezas, uma matéria prima alimentícia de lodo de fermentação é bem apropriada para esterificação dos ácidos graxos que contêm álcoois. É uma vantagem distinta da presente invenção que impu- rezas, entre as quais de maneira importante fosfolipídios, podem estar presentes no meio de reação em grandes quantidades, sem impedir a reação de esterificação.
[00040] Os álcoois para uso na presente invenção são, pelo menos, um C1-C3 álcool, preferivelmente um mono-hidroxiálcool, e mais preferivelmente metanol e/ou etanol. Ésteres desses álcoois com ácidos graxos de cadeia curta tendem a ser altamente fragrantes, enquanto ésteres com ácidos graxos de cadeia média o longa vantajosamente podem funcionar como biodiesel. Preferivelmente, os C1-C3 mono- hidroxialcoóis são álcoois terminais, isto é, metanol, etanol e 1- propanol. Mais preferivelmente, entretanto, o álcool é um C1-C2 álcool, isto é, metanol ou etanol. Muito preferido, entretanto, é o uso de metanol como um aceptor de ácido graxo. Álcoois de cadeia mais curta são preferidos por causa de sua reatividade mais elevada com ácidos gra- xos na presença de patatina.
[00041] No método de acordo com a presente invenção, patatina pode estar presente imobilizada em um veículo, mas preferivelmente é usada sem um veículo. Veículos para a imobilização de lipases são bem conhecidos na técnica. Um exemplo é celite. Desse modo, ela pode estar presente em uma forma dissolvida ou molecularmente dispersa, dependendo da natureza do meio de reação. É preferido que a patatina seja livremente suspense no meio de reação.
[00042] Uma desvantagem de lipases é que elas geralmente requerem grandes quantidades de sais, tal como até 50 % de sais de potássio, para estabilizá-las em solução livre. Os sais, entretanto, têm um efeito de impedimento na reação de esterificação de ácidos graxos, porque eles induzem a cristalização. Por este motivo, na técnica anterior, lipases são tipicamente usadas na forma imobilizada em um veículo. Patatina não requer estabilização de sal para ser usada sem um veículo, isto é, em livremente suspensa no meio, razão pela qual ela é particularmente apropriada para esterificar ácidos graxos com álcoois de baixo peso molecular de acordo com a invenção.
[00043] Como já mencionado, o meio de reação em que o método da invenção é realizado, é preferivelmente líquido, e compreende pelo menos a matéria prima alimentícia de ácido graxo e ou mais álcoois da invenção. Além disso, o meio pode compreender um solvente tal como água e/ou um composto orgânico tal como um solvente, por exemplo, um composto alifático, um éter, éster ou composto aromático.
[00044] É uma vantagem do uso de patatina que uma significativa quantidade de água pode estar presente durante a reação de esterifi- cação. Desse modo, a invenção pode funcionar com um teor de água no meio de reação de até 91 % em volume, baseada no volume do meio de reação. Preferivelmente, entretanto, o teor de água é menos do que 73 % em volume, ainda mais preferivelmente manos do que 40 % em volume, mais preferivelmente abaixo de 19 % em volume, com base no volume do meio de reação. No caso, o teor de água no meio de reação é acima de 50 % em volume, baseado no volume do meio de reação, é chamado aquoso.
[00045] Entretanto, o método da invenção pode também ser realizado em um meio essencialmente orgânico, em um teor de água abaixo de 50 % em volume, baseado no volume do meio de reação. Nesse caso, o teor de água no frasco de reação pode ser tão baixo como 5 % em volume, ou mesmo tão baixo quanto 2 % em volume, baseado no volume do meio de reação. É preferido que pelo menos alguma água, isto é, pelo menos 2 % em volume, baseado no volume do meio de reação, é presente, mesmo se o método é realizado em um meio es-sencialmente orgânico.
[00046] No caso do meio ser um meio essencialmente orgânico, a matéria prima alimentícia de ácido graxo é diluída com pelo menos o álcool da presente invenção, que pode funcionar como um solvente como também uma reagente, nesta modalidade. É também possível usar um solvente diferente, que pode ser apropriadamente selecionado para realizar uma pronta dissolução de todos os componentes da reação. Exemplos apropriados incluem octano, iso-octano, pentano, hexano, heptano, éter de petróleo e butanol. Solventes preferidos são octano e iso-octano. Será compreendido que é também possível usar uma combinação de solventes, incluindo uma combinação de um ou mais solventes e o álcool funcionando como solvente.
[00047] A concentração de ácidos graxos no meio de reação é preferivelmente entre 12 e 84 % em peso, baseado no peso do meio de reação. Preferivelmente, esses ácidos graxos estão presentes na forma de ácidos graxos livres.
[00048] A concentração do álcool no meio de reação é preferivelmente em ligeiro excesso molar em relação aos ácidos graxos livres. Em meio fundido, o ácido graxo livre está preferivelmente presente em concentrações acima de 80 % em peso, mais preferivelmente acima 84 % em peso, baseado no peso do meio de reação. Em solvente orgânico, o ácido graxo livre está presente em concentrações acima 10 % em peso, mais preferivelmente 12 % em peso, baseado no peso do meio de reação.
[00049] Geralmente, a patatina está presente em uma concentração de 1 % em peso, mais preferivelmente 10 % em peso, baseado na quantidade de ácido graxo.
[00050] Desse modo, a invenção também descreve um método para a preparação, preferivelmente seletivamente, de um éster de alquila de ácido graxo, compreendendo misturar em qualquer ordem patatina nativa com ácidos graxos, um ou mais álcoois e opcionalmente outros componentes, em que a mistura compreende significativas quantidades de fosfolipídios, e permitir ocorrer a esterificação, em que os ácidos graxos preferivelmente compreendem ácidos graxos de cadeia curta ou média, e em que os álcoois são C1-C3 mono-hidroxialcoóis, preferivelmente metanol e/ou etanol, e em que o alquil éster de ácido graxo é um C1-C3 éster de um C4 - C12 ácido graxo, preferivelmente um metil ou etil éster. Se a patatina é usada sem ser imobilizada em um veículo, que é preferido, a mistura é preferivelmente realizada de tal maneira que a patatina será livremente suspensa no meio de reação. Em uma modalidade alternativa, o álcool pode vantajosamente ser adicionado em alíquotas em intervalos distintos ou continuamente ao longo de toda a reação para controlar a taxa de reação e para evitar desnaturação da enzima. Naturalmente, a fim de alcançar um bom rendimento da reação, a quantidade total de álcool terá que ser suficiente para realizar a conversão desejada.
[00051] Em uma modalidade preferida, o método de acordo com a invenção é realizado na ausência de um solvente adicional. Nesse caso, o meio de reação compreende matéria prima alimentícia de ácido graxo, compreendendo ácidos graxos de cadeia curta ou média, e o álcool, preferivelmente metanol ou etanol. De acordo com esta modalidade, o método é preferivelmente realizado sob condições em que o meio é fundido.
[00052] As condições de reação podem ser otimizadas pela pessoa versada, com base no seu conhecimento geral comum. Por exemplo, a temperatura da reação não é crítica, desde que ela não afete a estabilidade e reatividade da patatina. Preferivelmente, a reação é realizada sob condições ambientais, ou em uma temperatura acima do ponto de fusão da matéria prima alimentícia de ácido graxo. Temperaturas de reação apropriadas geralmente ficam entre 10 e 75°C, preferivelmente entre 15 e 60°C, mais preferivelmente entre 20 e 45°C.
[00053] Preferivelmente, os ésteres de alquila de ácido graxo que obtidos são isolados da mistura de reação, e opcionalmente ainda purificados, por exemplo, por destilação, extração líquido-líquido, ou ex- tração supercrítica de CO2.
[00054] O método da presente invenção pode convenientemente ser usado para produzir biodiesel. Desse modo, a presente invenção descreve método para produzir biodiesel, compreendendo misturar patatina com uma matéria prima alimentícia de ácido graxo e com um ou mais C1-C3 álcoois, em que a matéria prima alimentícia de ácido graxo compreende um ou mais C4-C26 ácidos graxos, e permitindo o um ou mais ácidos graxos reagirem com o um ou mais álcoois. Neste método, a patatina é preferivelmente livremente suspensa na matéria prima alimentícia.
[00055] É especialmente vantajoso usar patatina neste método, porque a patatina é facilmente acessível de uma planta comum, e pode ser isolada em grandes quantidades. Além disso, a patatina pode produzir biodiesel de uma matéria prima alimentícia, compreendendo quantidades relativamente grandes de impurezas tais como fosfolipí- dios. Finalmente, a presença do sal eleva o ponto de fusão de ácidos graxos para serem convertidos para biodiesel. Porque em contraste com outras lipases, a estabilização do sal de patatina livremente suspensa não é requerida, o efeito negativo da presença do sal, durante a produção de biodiesel, é evitado quando usando patatina. Isto resulta em ésteres de alquila de ácido graxo, de acordo com a presente invenção, que pode ser usado como biodiesel.
[00056] A invenção é ainda ilustrada pelos exemplos não restritivos a seguir.
[00057] Muitos processos lipolíticos são realizados em solventes orgânicos ou em misturas aquosas de tais solventes. Um exemplo inicial é a produção de biodiesel de triglicerídeos ou ácidos graxos livres. Nestes casos, álcoois MW baixos são usados como aceptores de acila para formar ésteres de alquila de ácido graxo (FAAEs). Os álcoois são ambos, reagente e solvente. Metanol é o álcool preferido por causa do preço e da qualidade do biodiesel resultante.
[00058] Tal abordagem pode tolerar água na mistura de reação, mas requer enzimas que sobrevivam a altas concentrações de álcool para prover a força motriz para a reação ocorrer.
[00059] Patatina (Solanic 206P) foi colocada em contato com 1 mM do butirato de paranitrofenila cromogênica em tampão de 10 mM pH 6,5 em concentrações variadas de metanol. As atividades de patatina nestes sistemas foram determinadas medindo o aumento em absorção a 405 nm em uma leitora de placa 680 Modelo BioRad, e são expressas em mOD / minuto. Os resultados mostram que patatina pode tolerar até 20 % de metanol sem perda de atividade, e que mais de 40 % de metanol pode estar presente antes de toda atividade ser perdida.
[00060] 10 mg de patatina (Solanic 206P) em 100 μL de demiáguaforam colocados em contato com 5 mmoles (1,0 g) de ácido láurico (Merck 8.05333 ) e uma quantidade equimolar de metanol (Merck 1.06007), etanol (Prolabo 83804.360), n-25 de propanol (Alfa Aesar A19902), isopropanol (Prolabo 437423R) ou n-butanol (Merck 1.01990). Água desmineralizada foi adicionada para criar 20% (v:v) de solução alcoólica em água. As misturas foram incubadas durante a noite a 45°C sob agitação vigorosa.
[00061] Uma referência de ácido graxo de metil éster (FAME) foi preparada dissolvendo 1 grama de gordura de coco (SigmaAldrich C1758) em 100 mL de metanol contém 1,85% de ácido clorídrico concentrado (Merck 1.00317) e refluxar a mistura por 4 horas. O produto da reação foi evaporado para render um óleo amarelo claro.
[00062] Produtos de reação foram analisados por TLC em placas de sílica (Uniplate Z26529-2) que foram pré-tratadas com 2,4% de áci- do bórico (Fluka 15663) em 50% de etanol aquoso.
[00063] Todas as amostras foram diluídas 20 vezes em TLC eluen- tes consistindo em n-hexano (Merck 1.04367), éter (Merck 1.00921) e ácido acético (Prolabo 20104.334) em uma proporção de 80:20:2 e um volume capilar único foi marcado na placa. A placa foi processada nos eluentes e seca no ar. A placa foi pulverizada com ácido sulfúrico concentrado (Merck 1.00371). Este tratamento fez o ácido láurico e seus esteres aparecerem como pontos brancos contra um fundo azul (Figura 10).
[00064] A placa TLC desenvolvida mostra ácido láurico livre na faixa 1 em aproximadamente a metade na altura, e FAMEs processando próximo da frente na faixa 2.
[00065] Ácido láurico, incubado com patatina e álcoois, mostra quantidades residuais de ácido graxo livre a meio caminho do fundo, e ésteres de alquila de ácido graxo na frente, próximo ao topo da placa. A patatina catalisa a formação de FAAEs dos ácidos graxos livres e álcoois pequenos, com a mais alta conversão ocorrendo para metanol, etanol e n-propanol, nessa ordem.
[00066] Ácido octanoico (Merck 8.00192.1000) e 20% de metanol (Merck liChrosolv 1.06007.1000) foram misturados em isooctano (Sig- maAldrich 360597) de maneira que o ácido octanoico e metanol foram em quantidades aproximadamente equimolares (11,0 mL de ácido oc- tanoico e 16,8 mL de 20% de metanol em isooctano). 500 mg de pata- tina (Solanic 206P) e 40 mg de água foram adicionadas. Uma amostra em branco foi preparada da mesma maneira, mas excluindo a patati- na. A reação foi realizada em tubos fechados que foram aquecidos em um banho de água com uma tampa fechada. As soluções foram incubadas durante quatro horas a 50C. Alíquotas foram tiradas dos frascos de reação e diluídas 10 vezes em acetonitrila pura (Merck LiChrosolv 1.00030.25007) e analisadas por HPLC. O HPLC foi equipado com uma coluna de sílica gel de fase invertida (C18 sefarose), A operação do detector de UV- 202 nm (Knauer Smartline UV Detector 2600) e um misturador gradiente (Smartline Manager 5000 misturador de depura- dor). Um gradiente de acetonitrila foi aplicado aos experimentos de HPLC.
[00067] 50% de eluentes de acetonitrila foi preparado misturandocom milliQ de água e 0,5 μm de filtração. A coluna foi pré- condicionada com eluentes. Amostras foram injetadas diretamente em acetonitrila e eluídas em 50 a 100% de gradiente de acetonitrila durante o curso de 20 minutos. A quantificação de metal éster de ácido gra- xo foi realizada contra uma curva de calibragem preparada de octano- ato de metil puro (SigmaAldrich 260673-23G).
[00068] A amostra de patatina mostrou 12% de conversão de ácido octanoico no metil éster correspondente, indicando esterificação bem sucedida.
[00069] Fosfolipídios de comprimentos distintos de cadeia de acila foram dispersos em soluções aquosas contendo 0,5% de goma arábica e 100 mM de Triton X100, através de sonicação por 30 minutos. Patatina foi adicionada em quantidades até 100 mg, e o consumo de hidróxido de sódio foi monitorado por meio de um stat de pH operando em pH 7,5.
[00070] Diacil-glicerofosfocolinas de comprimentos de cadeia de até 9 são suscetíveis para hidrólise de patatina. Tabela 2: Atividade de patatina para vários substratos em mmol/minuto/g de patatina a temperatura ambiente.
[00071] Este experimento mostra que patatina é capaz de hidrolisar fosfolipídios, razão pela qual é esperado não ser desativada pela presença de fosfolipídios em um meio de esterificação.
[00072] 1 mL aliquotas de ácido octanoico (Merck 8.00192.1000)foram misturados com água desmineralizada ou uma solução de cloreto de potássio saturado (SigmaAldrich P9311) e ligeiramente aquecidas a 50°C. Diante da refrigeração, a mistura de solução de ácido oc- tanoico-sal mostrou turvação na fase orgânica e uma espuma de sabão na interface, enquanto a mistura de ácido octanoico-água permaneceu clara e sem sabão. A turvação indica precipitação parcial. Os resultados mostram que a presença de sal torna mais difícil o manuseio de ácidos graxos livres.
Claims (5)
1. Método para seletivamente preparar um éster de alquila de ácido graxo, caracterizado pelo fato de compreenderfornecer um meio líquido compreendendo um ou mais C4C26 ácidos graxos, um ou mais C1-C3 álcoois e patatina nativa, epossibilitar o um ou mais ácidos graxos reagirem com o um ou mais álcoois para obter o éster de alquila de ácido graxo,em que o meio de reação apresenta um teor de água abaixo de 50 % em volume, com base no volume do meio de reação,em que a patatina está presente em uma forma dissolvida ou molecularmente dispersa, eem que o álcool é pelo menos um C1-C3 mono- hidroxiálcool.
2. Método de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido graxo é um C4 - C12 ácido graxo, e em que o éster de alquila de ácido graxo é um éster de metila ou etila de um C4 - C12 ácido graxo.
3. Método de acordo com reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o meio compreende apenas matéria prima alimentícia de ácido graxo compreendendo ácidos graxos de cadeia curta ou média, e metanol ou etanol, com um teor de água de no máximo 5% em volume.
4. Método de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o meio é fundido.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o álcool é metanol.
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