BR112014030452B1 - Processo para a produção de meios de cultura de células e meio de cultura de células em pó - Google Patents
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Abstract
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE MEIOS DE CULTURA DE CÉLULAS. A presente invenção refere-se a um processo para a produção de meios de cultura de células na forma de pó seco. A preparação e o uso de partículas mistas geradas por coliofilização levam a meios de cultura de células misturados de forma homogênea.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um processo para aprodução de meios de cultura de células na forma de pó seco. A preparação e o uso de partículas mistas geradas por coliofilização leva a meios de cultura de células misturados de forma homogênea.
[002] Meios de cultura de células em solução aquosa podemproporcionar um ambiente que suporta e mantém o crescimento de células e/ou mantém uma condição celular fisiológica desejada propícia para a produção direcionada de certos produtos.
[003] Meios de cultura de células compreendem uma misturacomplexa de componentes, às vezes mais de uma centena de componentes diferentes, dependendo do tipo de organismo cujo crescimento e/ou estado fisiológico alvo será suportado.
[004] Os meios de cultura de células requeridos para apropagação de células de mamíferos, insetos ou plantas são tipicamente muito mais complexos que os meios para suportar o crescimento de bactérias, leveduras ou fungos.
[005] Os primeiros meios de cultura de células que foramdesenvolvidos consistiam em componentes indefinidos, tais como plasma, soro, extratos de embrião, ou outros extratos biológicos não definidos ou peptonas. Houve, portanto, um avanço significativo no desenvolvimento de meios quimicamente definidos. Os meios quimicamente definidos frequentemente compreendem, mas não se limitam exclusivamente a, aminoácidos, vitaminas, sais metálicos, antioxidantes, quelantes, fatores de crescimento, tampões, hormônios, e muito mais substâncias conhecidas pelos especialistas na técnica.
[006] Alguns meios de cultura de células são oferecidos como líquidos aquosos estéreis. A desvantagem dos meios de cultura de células líquidos é sua vida de prateleira e dificuldades de remessa e armazenamento. Como consequência, muitos meios de cultura de células são atualmente apresentados como misturas de pó finamente moído. Elas são produzidas com a finalidade de serem dissolvidas em água e/ou em soluções aquosas e no estado dissolvido são desenhadas, frequentemente com outros suplementos, para fornecer às células uma base de nutrientes substancial para o crescimento e/ou a produção de biofármacos a partir das mesmas referidas células.
[007] A produção de meios de cultura de células na forma de pósé muito crítico. Os meios em pó são tipicamente produzidos por combinação de componentes secos do meio de cultura via um processo de misturação e moagem, por exemplo, moagem em um moinho de esferas.
[008] Nos processos de moagem, por outro lado, geralmente édifícil gerar misturas homogêneas uma vez que os ingredientes com até 9 ordens de grandeza de diferença em termos de concentração precisam ser homogeneizados. Isto significa que componentes dos quais menos de um micrograma está presente em um quilograma de uma composição de meio precisam ser homogeneamente distribuídos no meio de cultura de células.
[009] Também já tentou superar essas dificuldades através daliofilização de um meio de cultura líquido feito previamente. No entanto, em um processo de liofilização alguns dos componentes do meio podem ficar insolúveis ou agregar com a liofilização, de modo que sua ressolubilização fica difícil ou impossível. Adicionalmente, muitos dos suplementos de meios, particularmente suplementos séricos tais como FBS, mostram uma perda de atividade substancial ou ficam completamente inativos no caso de se tentar produzir suplementos em pó por processos tais como liofilização.
[0010] Consequentemente, há uma clara necessidade de seencontrar um processo aperfeiçoado para a produção de meios de cultura de células em pó que não apresentem as desvantagens mencionadas acima.
[0011] Foi descoberto que meios de cultura de células em pó comuma distribuição homogênea especialmente dos componentes que estão presentes em baixas quantidades podem ser produzidos. Isto é conseguido por meio do preparo de partículas mistas de pelo menos um componente pouco abundante e um componente veículo que está presente no meio em concentrações mais altas. Essas partículas misturas são preparadas por coliofilização e podem ser então acrescentadas à mistura de componentes que é submetida à moagem.
[0012] A presente invenção refere-se, portanto, a um processo aprodução de meios de cultura de células pora) coliofilização de pelo menos dois componentes do meio de cultura de célulasb) misturação do um ou mais coliofilizados gerados na etapa a) com os outros componentes do meio de cultura de célulasc) sujeição da mistura da etapa b) à moagem.
[0013] Em uma modalidade preferida, na etapa a) a quantidade deum componente, o componente pouco abundante, é inferior a 5% (em peso) da quantidade do outro componente, o componente muito abundante. Isto significa que se forem usados 100 g do componente muito abundante, menos de 5 g do componente pouco abundante serão usados.
[0014] Em uma modalidade preferida, o componente muitoabundante é cloreto de sódio (NaCI), cloreto de potássio (KCI), cloreto de cálcio (CaCI2), sulfato de magnésio (MgSO4) ou cloreto de magnésio (MgCl2).
[0015] Em uma outra modalidade preferida na etapa a) acoliofilização é efetuada gerando-se uma solução aquosa dos componentes, congelando-se a mistura e removendo-se o líquido à pressão reduzida.
[0016] Em uma outra modalidade preferida, a mistura da etapa b) émoída em um moinho de um moinho de pino, um moinho fitz ou um moinho de jatos.
[0017] Em uma outra modalidade preferida, a mistura da etapa b) éresfriada para uma temperatura abaixo de 0°C antes da moagem.
[0018] Em uma outra modalidade, na etapa a) dois ou maiscoliofilizados diferentes são produzidos, cada um deles por coliofilização de pelo menos dois componentes do meio de cultura de células.
[0019] A presente invenção refere-se ainda a meios de cultura decélulas em pó produzidas pelo método de acordo com a presente invenção.
[0020] A presente invenção refere-se ainda a meios de cultura decélulas em pó compreendendo um ou mais coliofilizados.
[0021] Em uma modalidade preferida, os meios de cultura decélulas em pó compreendem dois ou mais coliofilizados.
[0022] Em uma modalidade preferida, em pelo menos umcoliofilizado a quantidade de pelo menos um componente é inferior a 1 % da quantidade de pelo menos outro componente.
[0023] Em uma outra modalidade preferida, pelo menos umcoliofilizado compreende cloreto de sódio (NaCI), cloreto de potássio (KCI), cloreto de cálcio (CaCI2), cloreto de magnésio (MgCI2) ou sulfato de magnésio (MgSO4).
[0024] A Figura 1 mostra a densidade celular viável integrada decélulas CHO S atingida com meios de acordo com a presente invenção em comparação com outros meios. Maiores detalhes podem ser encontrados no Exemplo 3.
[0025] A Figura 2 mostra o título volumétrico expressandoanticorpos monoclonais atingido com meios de acordo com a presente invenção em comparação com outros meios. Maiores detalhes podem ser encontrados no Exemplo 3.
[0026] A Figura 3 mostra a distribuição de tamanho de partículas detrês bateladas do meio de cultura de células produzido de acordo com o processo da presente invenção. Maiores detalhes podem ser encontrados no Exemplo 3.
[0027] Um meio de cultura de células de acordo com a presenteinvenção é qualquer mistura de componentes que mantém e/ou suporta o crescimento de células in vitro e/ou suporta um estado fisiológico particular. Ele pode ser um meio complexo ou um meio definido quimicamente. O meio de cultura de células pode compreender todos os componentes necessários para manter e/ou suportar o crescimento de células in vitro ou apenas alguns componentes de modo que outros componentes são acrescentados separadamente. Exemplos de meios de cultura de células de acordo com a presente invenção são meios completos que compreendem todos os componentes necessários para manter e/ou suportar o crescimento de células in vitro, suplementos de meios ou nutrientes ("feeds"). Em uma modalidade preferida o meio de cultura de células é um meio completo.
[0028] Tipicamente, os meios de cultura de células de acordo coma invenção são usados para manter e/ou suportar o crescimento de células em um biorreator e/ou para suportar um estado fisiológico particular.
[0029] Um meio de cultura de células de mamífero é uma misturade componentes que mantém e/ou suporta o crescimento de células de mamífero in vitro. Exemplos de células de mamífero são células humanas ou animais, de preferência células CHO, células COS, células I VERO, células BHK, células AK-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma ou células humanas.
[0030] Meios de cultura de células quimicamente definidos sãomeios de cultura de células qualquer não compreendem quaisquer substâncias quimicamente indefinidas. Isto significa que a composição química todas as substâncias químicas usadas nos meios é conhecida. Os meios quimicamente definidos não compreendem tecidos de leveduras, animais ou plantas; eles não compreendem células alimentadoras, soro, extratos ou substâncias digeridas de outros componentes que possam contribuir com proteínas quimicamente e pobremente definidos para os meios. Componentes quimicamente indefinidos ou pobremente definidos são aqueles cuja composição química e estrutura são desconhecidas, estão presentes em composição variável ou só poderiam ser definidos com enorme esforço experimental - equiparável à avaliação da composição química e estrutura de uma proteína como albumina ou caseína.
[0031] Um meio de cultura de células em pó é um meio de culturade células resultante de um processo de moagem. Isto significa que o meio de cultura de células em pó é um meio particulado seco - não um meio líquido.
[0032] As células a serem cultivadas com os meios de acordo coma presente invenção podem ser células procarióticas como células bacterianas ou células eucarióticas como células vegetais ou animais. As células podem ser células normais, células imortalizadas, células doentes, células transformadas, células mutantes, células somáticas, células germinativas, células-tronco, células precursoras ou células embrionárias, qualquer uma delas podendo ser linhagens celulares estabelecidas ou transformadas ou obtidas de fontes naturais.
[0033] O tamanho de uma partícula significa o diâmetro médio dapartícula. O diâmetro da partícula é determinado por espalhamento de luz laser em óleo de silicone.
[0034] Liofilização de acordo com a presente invenção é secagempor congelamento por congelamento do material e em seguida redução da pressão ambiente para permitir que a água congelada no material sublime diretamente da fase sólida para a fase gasosa.
[0035] Conforme usado neste relatório, "coliofilizado" ou"coliofilizado" refere-se a um produto resultante da liofilização, secagem por congelamento, ou secagem a vácuo de mais de um composto em solução no mesmo recipiente. Por exemplo, duas soluções podem ser combinadas no mesmo recipiente e a combinação de soluções resultante é liofilizada, liofilizando assim os componentes nas soluções simultaneamente. Alternativamente, dois ou mais compostos, também chamados de componentes do meio, podem ser dissolvidos no mesmo líquido e em seguida liofilizados em conjunto. O produto resultante de tal coliofilização é um coliofilizado consistindo no material sólido que compreende uma mistura de todos os componentes que foram coliofilizados.
[0036] Uma atmosfera inerte é gerada enchendo-se o respectivorecipiente ou aparelho com um gás inerte. Gases inertes adequados são gases nobres como argônio ou de preferência nitrogênio. Estas fases inertes são não reativos e previnem a ocorrência de reações químicas indesejáveis. No processo de acordo com a presente invenção, gerar uma atmosfera inerte significa que a concentração de oxigênio é reduzida abaixo de 10% (v/v) absolutos, por exemplo, pela introdução de nitrogênio líquido ou nitrogênio gasoso.
[0037] Diferentes tipos de moinhos são conhecidos peloespecialista na técnica.
[0038] Um moinho de pinos, também chamado de moinho deimpacto centrífugo, pulveriza sólidos sendo que através dele pinos protuberantes em discos giratórios de alta velocidade proporcionam a energia de ruptura. Moinhos de pinos são por exemplo, vendidos por Munson Machinery (EUA), Premium Pulman (India) ou Sturtevant (EUA).
[0039] Um moinho de jatos utiliza gás comprimido para acelerar aspartículas, fazendo com que elas se choquem umas contra as outras na câmara de processo. Moinhos de jato são por exemplo, vendidos por Sturtevant (EUA) ou PMT (Áustria).
[0040] Um moinho fitz comercializado pela Fitzpatrick (EUA) utilizaum rotor com lâminas para moagem.
[0041] Um processo que opera continuamente é um processo quenão opera intermitentemente. Se um processo de moagem for operado continuamente isto significa que os ingredientes do meio são permanente e constantemente introduzidos no moinho durante um certo tempo.
[0042] Os meios de cultura de células que são produzidos de acordocom o método da presente invenção tipicamente compreendem pelo menos um ou mais componentes do tipo sacarídeo, um ou mais aminoácidos, uma ou mais vitaminas ou precursores de vitamina, um ou mais sais, um ou mais componentes do tipo tampão, um ou mais cofatores e um ou mais componentes do tipo ácido nucleico.
[0043] Os meios também podem compreender piruvato de sódio,insulina, proteínas vegetais, ácidos graxos e/ou derivados de ácidos graxos e/ou ácido plurônico e/ou componentes tensoativos como tensoativos não iônicos preparados quimicamente. Um exemplo de um tensoativo não iônico adequado é tensoativos de copolímeros em blocos difuncionais terminando em grupos hidroxila primária também chamados de poloxâmeros, por exemplo, disponíveis sob o nome comercial pluronic ® da BASF, Alemanha.
[0044] Componentes do tipo sadarídeo são todos osmonossacarídeos ou dissacarídeos, como glicose, galactose, ribose ou frutose (exemplos de monossacarídeos) ou sacarose, lactose ou maltose (exemplos de dissacarídeos).
[0045] Exemplos de aminoácidos de acordo com a invenção são osaminoácidos proteinogênicos, especialmente os aminoácidos essenciais, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina, assim como os aminoácidos não proteinogênicos como D-aminoácidos.
[0046] Exemplos de vitaminas são Vitamina A (Retinol, retinal,vários retinoides, e quatro carotenoides), Vitamina B1 (tiamina), Vitamina B2 (riboflavina), Vitamina B3 (niacina, niacinamida), Vitamina B5 (ácido pantotênico), Vitamina B6 (piridoxina, piridoxamina, piridoxal), Vitamina B7 (biotina), Vitamina B9 (ácido fólico, ácido folínico), Vitamina B12 (cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), Vitamina C (ácido ascórbio), Vitamina D (ergocalciferol, colecalciferol), Vitamina E (Tocoferóis, tocotrienóis) e Vitamina K (filoquinona, menaquinonas). Precursores de vitamina também estão incluídos.
[0047] Exemplos de sais são componentes compreendendo íonsinorgânicos tais como bicarbonato, cálcio, cloreto, magnésio, fosfato, potássio e sódio ou elementos de traço tais como Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V e Zn. Exemplos são sulfato de cobre (II) penta- hidratado (CuSO4.5H2O), cloreto de sódio (NaCI), cloreto de cálcio (CaCI2.2H2O), cloreto de potássio (KCI), sulfato de ferro (ll), fosfato de sódio monobásico anidro (NaH2PO4), sulfato de magnésio anidro (MgSO4), fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4), cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCI2.6H2O), sulfato de zinco hepta- hidratado.
[0048] Exemplos de tampões são CO2/HCO3 (carbonato), fosfato,HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS e TRIS.
[0049] Exemplos de cofatores são derivados de tiamina, biotina,vitamina C,
[0050] NAD/NADP, cobalamina, flavina mononucleotídeo ederivados, glutationa, heme nucleotídeo fosfatos e derivados.
[0051] Componentes to tipo ácido nucleico, de acordo com apresente invenção, são as nucleobases, como citosina, guanina, adenina, timina ou uracila, os nucleosídeos como citidina, uridina, adenosina, guanosina e timidina, e os nucleotídeos como monofosfato de adenosina ou difosfato de adenosina ou trifosfato de adenosina.
[0052] Congelamento de acordo com a presente invenção significaresfriamento para uma temperatura abaixo de 0°C.
[0053] A essência da presente invenção é oferecer meios de culturade células em pó por moagem. Moagem é uma maneira muito simples e confiável e, por conseguinte, conveniente de produzir meios de cultura de células em pó. Até agora a principal desvantagem da moagem era uma distribuição ineficiente dos componentes pouco abundantes. É possível entender facilmente que um componente pouco abundante do qual somente um cristal muito pequeno é acrescentado a uma mistura de um quilo ou mais de outros componentes dificilmente consegue ser distribuído homogeneamente mo meio de cultura de células em pó moído. A presente invenção oferece um aperfeiçoamento fácil e confiável. Um ou mais componentes pouco abundantes do meio de cultura de células são coliofilizados com um ou mais componentes de preferência muito abundante do meio de cultura de células quefuncionam como um veículo. Devido a esta coliofilização oscomponentes pouco abundantes são homogeneamente distribuídos no coliofilizado sólido resultante. Como a maior parte da massa do coliofilizado é gerada pelo componente muito abundante, ele pode ser acrescentado ao meio de cultura de células em uma quantidade mais alta em comparação com o componente pouco abundante puro e pode, portanto, ser medido mais facilmente e é distribuído de forma muito mais homogênea no meio resultante por moagem.
[0054] Componentes pouco abundantes são aqueles componentesdos quais menos de 1%, de preferência menos de 0,1% (% em peso no meio na forma de pó seco), está presente no meio de cultura de células em pó.
[0055] Componentes muito abundantes são aqueles componentesdos quais mais de 5%, de preferência mais de 10% em peso (% em peso no meio na forma de pó seco) estão presentes no meio de cultura de células em pó.
[0056] Exemplos de componentes pouco abundantes de meios decultura de células são conhecidos pelo especialista na técnica. Eles podem diferir dependendo do tipo do meio de cultura de células. Exemplos típicos são: estanho ou sais de estanho, manganês ou sais de manganês, níquel ou sais de níquel, vanádio ou sais de vanádio, cádmio ou sais de cádmio, molibdênio ou sais de molibdênio, cobre ou sais de cobre, selênio ou selenitos, biotina e metassilicato assim como outros compostos químicos abrangendo um ou mais dos elementos mencionados acima. Exemplos de componentes pouco abundantes de meios de cultura de células ou de componentes químicos compreendendo um componente pouco abundante de meios de cultura de células são:selenito de sódio ácido selenioso acetato de bário dióxido de germânio iodeto de potássio nitrato de pratacloreto de zirconila 8H2Ocloreto de alumínio, 6H2O metavanadato de amônio molibdato de amônio, 4H2O cloreto de cádmio, anidrocloreto de cromo, 6H2Ocloreto de cobalto, 6H2Osulfato manganoso, H2Osulfato de níquel, 6H2O brometo de potássio cloreto de rubídiocloreto estanoso, 2H2O
[0057] Um elemento de traço e, portanto, um componente poucoabundante que frequentemente está presente em meios de cultura de células de acordo com a presente invenção é selênio, por exemplo na forma de selenito de sódio ou ácido seleniosos.
[0058] Exemplos de componentes muito abundantes de meios decultura de células são conhecidos pelo especialista na técnica. Eles podem diferir dependendo do tipo do meio de cultura de células. Exemplos típicos são: glicose e outros componentes do tipo monossacarídeo, ou sais como cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio (CaCI2.2H2O), cloreto de magnésio (MgCI2) ou sulfato de magnésio (MgSO4). Sais são preferidos, especialmente preferido é cloreto de sódio.
[0059] A coliofilização é de preferência efetuada coliofilizando pelomenos um componente pouco abundante com pelo menos um componente muito abundante. Em uma modalidade preferida, um componente pouco abundante é coliofilizado com um componente muito abundante.
[0060] A quantidade do componente pouco abundante que ésubmetido à coliofilização é inferior à quantidade do componente muito abundante. De preferência, a quantidade do componente pouco abundante é inferior a 5% da quantidade do componente muito abundante. Isto significa que se forem usados 100 g do componente muito abundante, menos de 5 g do componente pouco abundante serão usados. Como o componente pouco abundante pode estar presente na forma de um sal no qual apenas partes dos componentes químicos do sal é o componente pouco abundante necessário para o crescimento de células, o cálculo acima e as quantidades dadas acima referem-se à massa pura do componente químico pouco abundante necessário para o crescimento de células. Por exemplo, o componente que é usado é sulfato de cádmio hidratado (3CdSO4x8H2O) mas cádmio é o componente pouco abundante necessário para o crescimento de células. Isto significa que o peso molecular do sulfato de cádmio hidratado é 769.51 g/mol enquanto que o peso molecular do cádmio é 337,23 g/mol. Consequentemente a quantidade de componente pouco abundante necessária seria calculada com base na percentagem de cádmio presente no referido componente.
[0061] Para coliofilização, em uma primeira etapa, todos oscomponentes a serem coliofilizados são dissolvidos em um solvente.
[0062] Os componentes podem ser solubilizados em um solvente.Alternativamente, cada componente pode ser dissolvido em um solvente separado e as duas ou mais soluções resultantes de componentes diferentes podem ser misturadas. Tipicamente, todas as soluções a serem misturadas têm o mesmo solvente.
[0063] Solventes adequados são aqueles nos quais todos oscomponentes são solúveis. Exemplos de solventes adequados são solventes orgânicos ou água ou misturas dos mesmos. Água é preferida.
[0064] Depois de o solvente ser escolhido e os componentes teremsido dissolvidos, a mistura resultante é congelada e liofilizada até a secura. Às vezes um solvente adicional é acrescentado à mistura para facilitar a liofilização. Tipicamente a liofilização é efetuada a uma temperatura abaixo de -20 °C, de preferência em torno de -80°C. O líquido é tipicamente removido por aplicação de pressão reduzida. O coliofilizado resultante também pode ser chamado de partículas mistas ou sólido misto.
[0065] O sólido misto é então de preferência moído, por exemplo,em um moinho de esferas, para gerar partículas de tamanho homogêneo. As partículas resultantes tipicamente têm um tamanho de partícula inferior a 200 μm. De preferência elas têm um tamanho de partícula inferior 100 μm. Tamanhos de partícula convenientes variam entre 15 μm e 100 μm.
[0066] O coliofilizado moído pode ser então submetido àquantificação dos elementos de traço para determinar a concentração do componente pouco abundante no coliofilizado. Se necessário, a concentração do componente pouco abundante pode ser reduzida pelo misturação de outras quantidades do componente muito abundante.
[0067] O coliofilizado final com uma concentração definida docomponente pouco abundante pode ser então armazenado ou usado para a produção de meios de cultura de células.
[0068] Para este último caso, uma quantidade adequada docoliofilizado é misturada com os outros componentes do meio de cultura de células. Também é possível gerar dois ou mais coliofilizados e misturar dois ou mais coliofilizados com os outros componentes do meio de cultura de células. A misturação dos componentes é conhecida pelo especialista na técnica de produzir meios de cultura de células na forma de pó seco por moagem. De preferência, todos os componentes são completamente misturados de modo que todas as partes da mistura têm praticamente a mesma composição. Quanto maior a uniformidade da composição, melhor a qualidade do meio resultante em relação a um crescimento homogêneo de células.
[0069] A moagem pode ser efetuada com qualquer tipo de moinhoadequado para produzir meios de cultura de células em pó. Exemplos típicos são moinhos esferas, moinhos de pinos, moinhos fitz ou moinhos de jatos. Preferido é um moinho é pinos, um moinho fitz ou um moinho de jatos, muito preferido é um moinho de pinos.
[0070] O especialista na técnica sabe como operar esses moinhos.
[0071] Um moinho de grande escala com um diâmetro de disco decerca de 40 cm é por exemplo, tipicamente operado a 1-6500 revoluções por minuto no caso de um moinho de pinos, de preferência a 1-3000 revoluções por minuto.
[0072] A moagem pode ser feita em condições tradicionais demoagem resultando em pó com tamanho de partícula entre 10 e 300 μm, mais preferivelmente entre 25 e 100 μm.
[0073] De preferência, todos os componentes da mistura que ésubmetida à moagem são secos. Isto significa que, se eles compreenderem água, eles só podem compreender água de cristalização, porém não mais que 10%, de preferência não mais que 5%, mais preferivelmente não mais que 2% em peso de moléculas de água não ligadas ou não coordenadas. O meio resultante da moagem de tal componente seco também é chamado de meio de cultura de células na forma de pó seco.
[0074] Em uma modalidade preferida, a moagem é efetuada emuma atmosfera inerte. O gás protetor inerte preferido é nitrogênio.
[0075] Em uma outra modalidade preferida, todos os componentesda mistura são congelados antes da moagem. O congelamento dos ingredientes antes da moagem pode ser feito por qualquer meio que garante um resfriamento dos ingredientes até uma temperatura abaixo de 0°C e mais preferivelmente abaixo de - 20°C. Em uma modalidade preferida o congelamento é feito com nitrogênio líquido. Isto significa que os ingredientes são tratados com nitrogênio líquido, por exemplo, vertendo-se nitrogênio líquido no recipiente no qual os ingredientes são armazenados antes da introdução no moinho. Em uma modalidade preferida, o recipiente é um alimentador. Se o recipiente for um alimentador o nitrogênio líquido é de preferência introduzido no lado ou próximo ao lado do alimentador no qual os ingredientes são introduzidos.
[0076] Tipicamente, os ingredientes são tratados com o nitrogêniolíquido durante 2 a 20 segundos.
[0077] De preferência, o resfriamento dos ingredientes é feito demaneira que todos os ingredientes que entram no moinho estão a uma temperatura abaixo de 0°C, mais preferivelmente abaixo de - 20°C.
[0078] Em uma modalidade preferida, todos os ingredientes sãocolocados em um recipiente do qual a mistura é transferida para um alimentador, mais preferivelmente para um alimentador de parafuso dosador. No alimentador os ingredientes são às vezes adicionalmente misturados - dependendo do tipo de alimentador - e adicionalmente resfriados. A mistura congelada é então transferida do alimentador para o moinho de modo que a mistura que é moída no moinho ainda tem de preferência uma temperatura abaixo de 0°C, mais preferivelmente abaixo de -20 °C.
[0079] Tipicamente o tempo de misturação, que significa o tempode permanência da mistura de ingredientes no alimentador, é maior que um minuto, de preferência entre 15 e 60 minutos.
[0080] Um alimentador de parafuso dosador, também chamado decaracol de dosagem ("dosage snail"), é tipicamente operado a uma velocidade de 10 a 200 revoluções por minuto, e de preferência ele é operaddo a 40 a 60 revoluções por minuto.
[0081] Tipicamente, a temperatura do moinho é mantida entre -50 e+30°C. Em uma modalidade preferida, a temperatura é mantida em torno de 10°C.
[0082] O nível de oxigênio durante a moagem de preferência ficaabaixo de 10% (v/v).
[0083] O processo pode ser operado, por exemplo,intermitentemente ou continuamente. Em uma modalidade preferida o processo de acordo com a presente invenção é feito continuamente por um certo tempo, introduzindo permanentemente a mistura de ingredientes em um alimentador para resfriar e introduzindo permanentemente a mistura fria proveniente do alimentador no moinho.
[0084] Foi constatado que ao contrário de outros processos demoagem o processo de acordo com a presente invenção proporciona misturas homogêneas mesmo que um ou mais componentes pouco abundantes estejam presentes em quantidades inferiores a 1 μg/kg de meio de cultura de células.
[0085] A presente invenção refere-se ainda a um meio de cultura decélulas seco compreendendo pelo menos um coliofilizado. Tal meio é obtenível pelo processo de acordo com a presente invenção.
[0086] Tipicamente, o coliofilizado é um coliofilizado de umcomponente pouco abundante e um componente muito abundante.
[0087] De preferência, o meio de cultura de células compreende 1a 10 coliofilizados diferentes.
[0088] Para uso do meio em pó moído, um solvente, de preferênciaágua (mais particularmente água destilada e/ou desionizada ou água purificada ou água para injeção) ou um tampão aquoso é adicionado ao meio e os componentes são misturados até que o meio esteja totalmente dissolvido no solvente.
[0089] O solvente também pode compreender solução salina, íonsácido ou básicos solúveis proporcionando uma faixa de pH de 1.0-10.0, estabilizantes, tensoativos, preservativos, e álcoois ou outros solventes orgânicos polares.
[0090] Também é possível acrescentar outras substâncias comosubstâncias tampão para ajuste do pH, soro de bezerro fetal, açúcares etc., à mistura do meio de cultura de células e do solvente. O meio de cultura de células líquido resultante é então colocado em contato com as células a serem cultivadas ou mantidas.
[0091] A presente invenção, portanto, refere-se ainda a umprocesso para a cultura de células por
[0092] fornecer um meio de cultura de células de acordo com apresente invenção
[0093] misturar o referido meio de cultura de células com água ouum tampão aquoso
[0094] misturar as células a serem cultivadas com o meio de culturade células da etapa b) em um biorreator
[0095] incubar a mistura da etapa c).
[0096] Um biorreator é qualquer recipiente, vaso ou tanque no qualcélulas podem ser cultivadas. A incubação é tipicamente feita em condições adequadas como temperatura adequada etc. O especialista na técnica sabe quais são as condições de incubação adequadas para suportar ou manter o crescimento/cultura de células.
[0097] Com o uso dos coliofilizados para a produção de meios aquantidade total dos elementos de trações (componentes pouco abundantes) ainda continua a mesma que aquela mencionada na receita, mas como os componentes pouco abundantes são combinados com o sal veículo a precisão na pesagem de uma substância em uma quantidade maior e na misturação dos componentes pouco abundantes é significativamente maior.
[0098] A presente invenção é ainda ilustrada pelo figura e peloexemplo que se seguem, contudo, não está limitada aos mesmos.
[0099] A descrição completa de todos os pedidos, patentes, epublicações mencionados acima e acima e do pedido EP correspondente EP 12004517.4, depositado em 15 de junho de 2012, está aqui incorporada a título de referência.
[00100] Os exemplos a seguir representam aplicações práticas da invenção.
[00101] Os coliofilizados acima foram usados para a preparação de meios de cultura de células quimicamente definidos para células de ovário de hamster chinês.
[00102] Com o uso dos coliofilizados a quantidade total dos elementos de trações (componentes pouco abundantes) ainda continua a mesma que aquela mencionada na receita, mas como eles são combinados com o sal veículo a precisão na pesagem de uma substância em uma quantidade maior e na misturação dos liofilizados é significativamente maior.
[00103] Todos os ingredientes do meio inclusive os coliofilizados são misturados, e moídos usando um caracol de dosagem e um moinho de pinos. No caracol de dosagem os ingredientes são tratados com nitrogênio líquido.
[00104] A moagem é feita nas seguintes condições:Temperatura - moinho: 10°CNível de oxigênio: inferior a 10% absolutosrpm - moinho: até 2800 1/minTempo de misturação: 30 minrpm do caracol de dosagem: 40 1/min
[00105] O meio de cultura de células em pó resultante é adequada para cultura de células CHO (células de ovário de hamster chinês).
[00106] A reprodutibilidade na produção de um meio na forma de pó seco quimicamente definido com as propriedades físico-químicas desejadas e o desempenho celular é testado da maneira descrita abaixo em crescimento intermitente mostrando a densidade de células viáveis integrais (IVCD) ao longo do tempo de células CHO S em comparação com outros meios. Os meios foram produzidos usando-se a tecnologia de moinho de pinos usando condições inertes. Alfa CHO (Lote Piloto 1, 2 e 3) sendo os meios produzidos de acordo com o método da presente invenção.
[00107] A Figura 1 mostra a densidade de células viáveis integradas. Os outros meios que não foram produzidos de acordo com o método da presente invenção têm uma composição diferentes, mas todos específicos para células CHO.
[00108] Adicionalmente o desempenho dos meios foi testado em um título volumétrico expressando um anticorpo monoclonal.
[00109] A Figura 2 mostra o título volumétrico.
[00110] Para análise da produção consistente lote a lote dos meios na forma de pó seco além do teste celular, a distribuição de tamanho de partículas das três produções foi testada para os três de produção independentes. A Figura 3 mostra a distribuição de tamanho de partículas.
Claims (10)
1. Processo para a produção de meios de cultura de células, caracterizado por ser pora) coliofilização de pelo menos dois componentes do meio de cultura de células, através do qual a quantidade de pelo menos um componente, o componente menos abundante, é menos de 5 % em peso da quantidade de pelo menos um outro componente, o componente de alta abundância;b) misturação do um ou mais coliofilizados gerados na etapa a) com os outros componentes do meio de cultura de células;c) sujeição da mistura da etapa b) à moagem.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente mais abundante é cloreto de sódio (NaCI), cloreto de potássio (KCI), cloreto de cálcio (CaCl2), cloreto de magnésio (MgCI2) ou sulfato de magnésio (MgSO4).
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a) a coliofilização é efetuada gerando-se uma solução aquosa dos componentes, congelando-se a mistura e removendo-se o líquido à pressão reduzida.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa b) é moída em um moinho de um moinho de pino, um moinho fitz ou um moinho de jatos.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a mistura da etapa b) é resfriada para uma temperatura abaixo de 0°C antes da moagem.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que na etapa a) dois ou mais coliofilizados diferentes são produzidos, cada um deles por coliofilização de pelo menos dois componentes do meio de cultura de células.
7. Meio de cultura de células em pó, caracterizado por compreender um ou mais coliofilizados.
8. Meio de cultura de células em pó, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender dois ou mais coliofilizados.
9. Meio de cultura de células em pó, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que em pelo menos um coliofilizado a quantidade de pelo menos um componente é inferior a 1 % da quantidade de pelo menos um outro componente.
10. Meio de cultura de células em pó, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um coliofilizado compreende cloreto de sódio (NaCI), cloreto de potássio (KCI), cloreto de cálcio (CaCI2), cloreto de magnésio (MgCI2) ou sulfato de magnésio (MgSO4).
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