WO2007111210A1 - 難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法及びビール類混濁乳酸菌の検査培地 - Google Patents

難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法及びビール類混濁乳酸菌の検査培地 Download PDF

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Koji Suzuki
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Asahi Breweries, Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing difficult-to-cultivate beer-turbid lactic acid bacteria and a test medium for beer-turbid lactic acid bacteria, and more particularly to a method for producing difficult-to-cultivate beer-turbid lactic acid bacteria and beer-turbid lactic acid bacteria. And a method for testing lactic acid bacteria in beer using the test medium.
  • the product beer is a hard-to-cultivate harmful strain belonging to Lactobacillus lindneri or L. paracollinoides that cannot be detected by a normal lactic acid bacteria detection medium such as MRS medium.
  • MRS medium normal lactic acid bacteria detection medium
  • a manufacturer that develops and sells a beer-harmful microorganism detection medium or detection device has difficulty even if it possesses the bacterial species that can grow on a normal lactic acid bacteria inspection medium such as an MRS medium.
  • the problem is that it is difficult to develop an effective detection method for the cultivated bacterial species because they often do not have Lactobacillus lindneri or Lattobacillus lindneri in culture and paracollinoides. was there.
  • the mainstream is a method of detecting microorganisms harmful to products in a medium.
  • beer-turbid lactic acid bacteria detection media have problems such as poor ability to detect difficult-to-culture lactobacilli and low selectivity for non-turbid bacteria.
  • beer turbidity can be determined at the time of detecting microorganisms. Such a beer turbid lactobacillus screening medium is required because the inspection can be carried out.
  • Non-Patent Document 1 EBC ANALYTICA MICROBIOLOGICA 11 (1992); Section 4 Detection of contaminants
  • An object of the present invention is to provide a biological material for producing a harmful strain of difficult-to-cultivate beer under an artificial environment and devising an effective countermeasure against the bacteria.
  • the first object of the present invention is to provide a method for producing difficult-to-culture harmful strains that cannot be detected with a normal test medium.
  • a second object of the present invention is to provide a beer turbid lactic acid bacteria test medium that can detect cultivated lactic acid strains without omission and has high selectivity.
  • test medium for testing beer-turbid lactic acid bacteria which can determine the turbidity of beer when detecting microorganisms and can carry out microbial tests on beer in a laboratory without genetic testing. It is intended.
  • a third object of the present invention is to provide a method for testing lactic acid bacteria in beers using such a test medium.
  • the present invention according to claim 1 is a method of inoculating anaerobic culture by inoculating lactic acid bacteria on beer adjusted to pH 4.0 to 5.5, and planting the obtained culture solution to beer adjusted to the pH.
  • a method for producing a difficult-to-cultivate beer turbid lactic acid bacterium characterized by performing a heat treatment at 50 to 65 ° C for 5 to 15 minutes after repeating the operation of bacterium 5 times or more. is there.
  • the present invention according to claim 2 is an operation for inoculating lactic acid bacteria into beer adjusted to pH 4.0 to 5.5, anaerobically culturing, and inoculating the obtained culture solution into beer adjusted to the pH.
  • This method provides a method for producing difficult-to-culture beer-turbid lactic acid bacteria, characterized in that the above is repeated more than 20 times.
  • the present invention according to claim 3 provides a screening medium for beer turbid lactic acid bacteria obtained by adding a powder MRS medium not containing agar to 16 g or less of 1 L of beer.
  • the present invention according to claim 4 provides a screening medium for beer-mixed lactic acid bacteria according to claim 3, further comprising 10-30 g of agar added to 1 L of beer.
  • the present invention according to claim 5 provides a screening medium for beer-turbid lactic acid bacteria according to claim 3 or 4, wherein 3 g or less of sodium acetate is further added to 1 L of beer.
  • the present invention according to claim 6 adds 16 g or less, 10 to 30 g of agar, 3 g or less of sodium acetate, and 5 to 50 mg of cycloheximide to 1 L of beer.
  • the present invention according to claim 7 provides a test medium for beer-turbid lactic acid bacteria according to any one of claims 3 to 6, which is a powder.
  • the present invention provides a test medium for beer-turbid lactic acid bacteria according to any one of claims 3 to 7, capable of detecting difficult-to-culture beer-turbid lactic acid bacteria.
  • the present invention relates to a lactic acid bacterium in a beer characterized in that the lactic acid bacterium in a beer is characterized by using the beer-turbid lactic acid bacterium test medium according to any one of claims 3 to 8. This is to provide a screening method.
  • the current culture medium using the difficult-to-culture harmful strain as described above as a biological material A medium capable of compensating for the above disadvantages, that is, a highly selective beer turbid lactic acid bacteria test medium that can detect a difficult-to-cultivate lactic acid strain without omission and is provided.
  • a beer turbid lactic acid bacteria test medium that can determine the turbidity of beer at the time of detection of microorganisms and can carry out a microbial test for beer in a laboratory without genetic testing.
  • a difficult culture obtained by producing, under an artificial environment, a difficult-to-culture harmful bacterium that does not grow on a normal detection medium, from a culturable strain available from a public strain storage organization.
  • strains as biological materials, it is possible to develop a new detection medium or a rapid harmful bacteria detection device that does not depend on the medium.
  • the detection medium provided by the present invention may be used as a detection medium (test medium) for beer turbid lactic acid strains including Lactobacillus lindneri and Lactobacillus' L. paracollinoides. It was shown to be useful as a medium for verifying the heat sterilization effect of beverages.
  • the present invention according to claim 1 relates to a method for producing difficult-to-cultivate beer turbid lactic acid bacteria, obtained by inoculating lactic acid bacteria in beer adjusted to pH 4.0 to 5.5 and anaerobically culturing the beer.
  • the above-mentioned culture solution is inoculated into beer adjusted to the above pH five times or more, and then subjected to a heat treatment at 50 to 65 ° C. for 5 to 15 minutes.
  • lactic acid bacteria are inoculated into beer adjusted to pH 4.0 to 5.5 and anaerobically cultured.
  • the type of beer may be any type such as top fermented beer or bottom fermented beer.
  • beer not only beer but also so-called happoshu and other miscellaneous wines, etc. are required for adjusting the pH to 4.0 to 5.5, preferably 4.2 to 5.0. is there. If the pH of beer is less than 4.0, the growth of lactic acid bacteria is very bad, whereas if the pH of beer is more than 5.5, the damage caused by hops to lactic acid bacteria is reduced, and Since the acclimatization becomes difficult, the object of the present invention cannot be achieved.
  • the pH may be adjusted by means such as hydrochloric acid or sodium hydroxide.
  • Lactic acid bacteria are not particularly limited as long as they can make beer turbid and difficult to culture.
  • lactic acid bacterial strains that belong to difficult-to-cultivate harmful bacterial species that are difficult to detect with a normal inspection medium (MRS medium) before being difficult to culture are preferred.
  • Anaerobic culture may be performed for 2 to 10 days, preferably 4 to 7 days, more preferably about 5 to 7 days.
  • the obtained culture broth is inoculated into beer adjusted to the pH, that is, pH 4.0 to 5.5, preferably 4.2 to 5.0.
  • This inoculation operation that is, the transplanting operation is repeated 5 times or more, preferably 10 times or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually limited to 30 times. Therefore, it is usually repeated 5 to 30 times, preferably 10 to 30 times.
  • the lactic acid bacteria originally showing viability in beer are acclimatized by the above process.
  • calo-heat treatment is performed at 50 to 65 ° C for 5 to 15 minutes, preferably at 52 to 60 ° C for 5 to 15 minutes.
  • lactic acid bacteria acquire resistance to hops, and if it is not subjected to subsequent heat treatment, it was found that it grows in both beer and normal medium (MRS medium). By applying, a strain that grows in beer and does not grow in a normal medium (MRS medium) can be obtained.
  • the heat treatment temperature is less than 50 ° C, or if the heat treatment time is less than 5 minutes, a strain that grows on a normal medium (MRS medium) is also obtained, and the beer turbid lactic acid bacteria that are difficult to culture are obtained. Les, who can only get.
  • the heat treatment temperature exceeds 65 ° C or the heat treatment time exceeds 15 minutes, the lactic acid bacteria will die.
  • the present invention according to claim 2 relates to a method for producing difficult-to-culture beer-turbid lactic acid bacteria, and anaerobic culture by inoculating lactic acid bacteria into beer adjusted to pH 4.0 to 5.5.
  • the operation of inoculating the obtained culture solution into beer adjusted to the above pH is repeated more than 20 times.
  • lactic acid bacteria are inoculated into beer adjusted to pH 4.0 to 5.5 and anaerobically cultured.
  • the type of beer is not limited, such as top-fermented beer and bottom-fermented beer.
  • so-called happoshu and other hybrids are also included.
  • Vinoles should be adjusted to a pH of 4.0 to 5.5, preferably 4.2 to 5.0. If the pH of beer is less than 4.0, the growth of lactic acid bacteria is very bad, while if the pH of beer exceeds 5.5, the damage caused by hops to lactic acid bacteria is reduced, and the beer becomes habitually familiar. This makes it difficult to achieve the object of the present invention.
  • the pH may be adjusted by means such as hydrochloric acid or sodium hydroxide.
  • the lactic acid bacterium is not particularly limited as long as it makes beer turbid and difficult to cultivate, but for example, Lactobacillus lindneori, Ratatobacillus' paracollinoides, etc.
  • lactic acid bacterial strains that belong to difficult-to-cultivate harmful bacterial species that are difficult to detect with a normal test medium (MRS medium) before being difficult to culture are preferred.
  • Anaerobic culture may be performed for 2 to 10 days, preferably 4 to 7 days, more preferably about 5 to 7 days.
  • the obtained culture broth is inoculated into beer adjusted to the aforementioned ⁇ , that is, 4.0 to 5.5, preferably 4.2 to 5.0.
  • This inoculation operation that is, the transplanting operation is repeated more than 20 times, preferably 40 times or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but is usually limited to 70 times.
  • the difficult-to-cultivate lactic acid strain obtained by the present invention according to claim 2 is the present invention according to claim 1. Compared to the lactic acid strain obtained in the light, it takes time to obtain a difficult-to-cultivate strain, but it is different from the present invention according to claim 1 in that no stress is applied by heating.
  • the hard-to-cultivate lactic acid strain obtained in the invention according to claim 2 is expected to have a different property from the hard-to-cultivate lactic acid strain obtained in the invention according to claim 1, and the hard-to-cultivate beer-harmful strain It seems to have great value as a biological sample.
  • the present invention examines not only difficult-to-cultivate beer turbid lactic acid bacteria but also other beer turbid lactic acid bacteria prepared by the method of claims 1 and 2. This relates to a detection medium (detection medium) that can be removed.
  • the present invention provides a screening medium for beer-mixed lactic acid bacteria, wherein a powder MRS medium not containing agar is added at a ratio of 16 g or less to 1 L of beer. is there.
  • the beer is not limited to beer, such as top-fermented beer and bottom-fermented beer.
  • the strength, bitterness value, including Happoshu and other miscellaneous sakes is preferably 10-30 BU.
  • the powdered MRS medium containing no agar is usually used as a medium for lactic acid bacteria, particularly because it supports good growth of the whole lactic acid bacteria. It is like this.
  • powdered MRS medium without agar is referred to as “powdered MRS medium”.
  • powdered MRS medium those commercially available from Difco, Merck, Biokar, etc. can be used.
  • the amount of powder MRS medium added to beer is 16 g or less, preferably ⁇ or 0.5 to 10 g, more preferably f or 2.0 to 6. Og per 1 L of beer. .
  • the amount of powder MRS medium added to beer is S, and beer turbid lactic acid bacteria that are sufficiently difficult to grow even with Og grows against 1 L of beer, but 2.0 to 6. Growth can be observed quickly.
  • the amount of powdered MRS medium added to beer exceeds 16 g per 1 L of beer, growth of difficult-to-culture beer turbid lactic acid bacteria becomes difficult.
  • the turbidity of beer according to claim 4 is obtained by further adding agar to the test medium for turbid lactic acid bacteria of beer according to the present invention according to claim 3 to form a plate medium.
  • Test medium for lactic acid bacteria is obtained by further adding agar to the test medium for turbid lactic acid bacteria of beer according to the present invention according to claim 3 to form a plate medium.
  • the amount of agar added is 10-30g per 1L of beer.
  • the amount of sodium acetate added is 3 g or less, preferably 0.25 to 2 g, per 1 L of beer.
  • cycloheximide can be added to suppress the growth of yeast.
  • the addition amount of cycloheximide is 5 to 50 mg per 1 L of beer.
  • the test medium for beer-turbid lactic acid bacteria according to any one of claims 3 to 6 can be further improved in convenience by being powdered.
  • this powder medium When preparing a liquid medium, this powder medium only needs to be dissolved in a predetermined amount of water, which is very convenient.
  • a known method such as a heat drying method or a freeze drying (freeze drying) method can be used. Although not particularly limited, deterioration and decomposition of medium components can be suppressed. Therefore, the freeze-drying method is preferable.
  • the pre-freezing temperature in the freeze-drying method is preferably _25 ° C or lower, and the freezing time is preferably 16 hours or longer. In order to increase the drying efficiency, the medium needs to be frozen sufficiently. It is preferable to set the temperature so that the product temperature is about 40 ° C when drying the frozen product in the freeze dryer under a reduced pressure of ImmHg or less.
  • beer-turbid lactic acid bacteria test medium according to any one of claims 3 to 7 as described above is capable of detecting difficult-cultured beer-turbid lactic acid bacteria.
  • the present invention according to claim 9 provides a method for inspecting lactic acid bacteria in beer using the test medium for beer turbid lactic acid bacteria according to the present invention according to claims 3-8.
  • the present invention according to claim 9 relates to a test method (detection method) for lactic acid bacteria in beer, and in testing lactic acid bacteria in beer, the beer according to any one of claims 3 to 8 is used. It is characterized by using a test medium for turbid lactic acid bacteria.
  • an appropriate amount of beer as a test target is added to a test medium of beer-turbid lactic acid bacteria according to the present invention according to claims 3 to 8 as described above. Cultivate the collected bacteria.
  • beer turbid lactic acid bacteria that are difficult to culture in beer beer turbid lactic acid bacteria that are difficult to culture in beer
  • cloudy lactic acid bacteria in beer can be detected with one medium without omission.
  • test medium for beer cloudy lactic acid bacteria according to the present invention according to claims 3 to 8 described above is used not only for testing difficult-to-culture beer cloudy lactic acid bacteria but also for setting conditions for heat sterilization. can do.
  • Lactobacillus lindneri DSM20692 strain was adjusted to pH 5.0 so that it was about 10 6 cells / ml.
  • Pilsna 'type degassed beer (bitter taste 20B.U. Inoculated. Anaerobic culture was performed at 25 ° C. for 1 week, and 100 ⁇ 1 of the grown culture solution was transferred to 10 ml of degassed beer adjusted to ⁇ 5.0.
  • the strain culture solution obtained by repeating 15 times of transplanting with degassed beer adjusted to ⁇ ⁇ 5 ⁇ 0 was heat-treated at 60 ° C for 10 minutes to make it difficult to culture Lactobacillus '' Lindneri DSM20692VN strain was prepared.
  • sample solution bacterial solution of the resulting strain (hereinafter, referred to as sample solution) to measure the number of viable bacteria in 10 times the sample solution, subjected to 100-fold, 1000-fold, etc. and dilution, P H5.
  • sample solution bacterial solution of the resulting strain
  • the sample solution 10 / l was inoculated into the degassed beer adjusted to 4.2, which was selected as a representative sample beer of product beer. About 1 month after inoculation, the beer became turbid and the growth was confirmed. This demonstrated the toxicity of the resulting strain to product beer.
  • MRS broth was added to Merck's powdered MRS medium without agar, 52.2 g of the above powder medium was added to 1 L of purified water, mixed well, heated with stirring, 1 It was boiled for minutes and completely dissolved, and dispensed into a culture vessel, and then used at 121 ° C for 15 minutes under high-pressure steam sterilization (autoclave) to make a liquid medium (hereinafter the same).
  • the Lactobacillus lindonelli DSM20692 strain grows in about 4 days in the MRS broth when the series of treatments described in the present invention is not carried out (that is, when it is not difficult to culture) and about 100 inoculations. Can be confirmed.
  • degassed beer (pH 4.2) showed growth potential within 3 weeks, indicating that a quality accident could occur during the product distribution period even though it was not detected in the test medium.
  • the number of strains in the sample solution 0.1 ⁇ 1 was estimated by the most probable number method described in Example 1 to be 93.
  • the difficult-to-culture strain obtained in Example 1 is suitable for the development of a microbe detection method of a beer maker that manages the process by heat sterilization, and the difficult-to-cultivate strain obtained in Example 2 is a sterilized finolator. It is suitable for the development of microbial screening methods for beer manufacturers that manage processes by Conceivable.
  • Example 3 (Test medium for difficult-to-culture beer-turbid lactic acid bacteria)
  • Powdered M R S medium added 0 2. 61 5. 22 15. 66 26. 1 52. 2
  • NCBD medium The detection sensitivity of the medium (hereinafter referred to as NCBD medium) that was found useful in (1) above was investigated.
  • N 2
  • the NCBD medium is considered to be a medium that can detect difficult-to-cultivate lactic acid strains with high sensitivity. It was.
  • Example 4 Preparation of difficult-to-culture beer-turbid lactic acid bacteria 2
  • sample solution The number of viable bacteria in the bacterial solution of the obtained strain (hereinafter referred to as sample solution) was measured by the most probable number method described in Example 1. As a result, the number of viable bacteria in 10 ⁇ 1 of the sample solution was 460. It was estimated.
  • Example 2 the ability of the obtained strain to show beer toxicity was investigated.
  • 10 ⁇ of the sample solution was inoculated into the degassed beer adjusted to ⁇ 4.2, and turbidity was generated in the beer within 2 weeks, and growth was confirmed. This demonstrated the toxicity of the resulting strain to product beer.
  • Lactobacillus' Pallorinoides JCM11969 T strain does not carry out the series of treatments described in the present invention (that is, if it is not difficult to culture), about 100 inoculations grow in MRS broth in about 4 days. Can be confirmed.
  • Lactobacillus' lindneri 'DSM20692 strain was inoculated into 10ml of Pilsna' type degassed beer (bitter taste 20B.U.) adjusted to pH 4.2 to be about 10 6 cellZml. Anaerobic culture was performed at 25 ° C for 1 week, and 100 ⁇ of the grown culture solution was transferred to 10 ml of degassed beer adjusted to pH 4.2. Planting with degassed beer adjusted to pH 4.2 was repeated 40 times to produce a strain that was difficult to culture.
  • sample solution The number of viable bacteria in the bacterial solution (hereinafter referred to as sample solution) of the obtained strain was measured by the most probable number method described in Example 1. As a result, the number of viable bacteria in 1 ⁇ 1 of the sample solution was 2400. It was estimated.
  • Example 2 it was investigated whether the obtained strain was beer harmful. As in Example 1, 1 ⁇ l of the sample solution was inoculated into the degassed beer adjusted to ⁇ 4.2, and turbidity was generated in the beer on the 6th day, and growth was confirmed. This demonstrated the toxicity of the resulting strain to product beer.
  • the Lactobacillus lindonelli DSM20692 strain grows in about 4 days in the MRS broth when the series of treatments described in the present invention is not carried out (that is, when it is not difficult to culture) and about 100 inoculations. Can be confirmed.
  • the number of viable bacteria in the bacterial solution of the obtained strain (hereinafter referred to as the sample solution) was measured by the most probable number method described in Example 1. As a result, the number of viable bacteria in the sample solution 0.01 ⁇ ⁇ was 1100. Estimated. Next, it was investigated whether the obtained strain was beer harmful. As in Example 1, 0.01 ⁇ 1 of the sample solution was inoculated into the degassed beer adjusted to ⁇ 4.2, and turbidity was generated in the beer on the fifth day, and growth was confirmed. This showed the toxicity of the resulting strain to product beer.
  • Lactobacillus pallorinoides JCM11969 T strain is not subjected to the series of treatments described in the present invention (that is, when it is not difficult to culture), in about 100 inoculations, the MRS broth grows in about 4 days. Can be confirmed.
  • the plate medium was used as the test medium, and the selectivity of the test medium for 14 kinds of miscellaneous bacteria frequently appearing from the environment was investigated.
  • the composition of the screening medium is as follows.
  • the beer used was Asahi Super Dry (registered trademark) manufactured by Asahi Vinore.
  • test medium obtained by adding sodium acetate to the test medium of Example 7 at the ratio shown in Table 3 was used.
  • About lOOcells of the test strain is smeared on the test medium as described above and at 25 ° C under anaerobic conditions.
  • ABD medium a medium having the following composition was prepared (hereinafter referred to as ABD medium), and a beer-turbid lactic acid bacteria detection medium recommended by the Euro pean Brewery Convention (VLB S_7, Raka-Ray, MRS agar), American The BMB medium recommended by the Society of the Brewing Chemists and the NBB-A medium recommended by Professor Back of Kunststoff Institute of Technology were compared with the selectivity of the medium and the detectability of the medium.
  • Asahi Beer's Asahi Super Dry registered trademark
  • VLB S_7 beer-turbid lactic acid bacteria detection medium
  • the selectivity of the culture medium was evaluated using 14 types of beer factory environment frequently used and 9 beer non-turbid lactic acid bacteria. The results are shown in Table 4.
  • test method was carried out by smearing about lOOcells of the test strain on the medium and culturing at 25 ° C. for 14 days under anaerobic conditions.
  • test method was carried out by smearing about lOOcells of the test strain on the medium and culturing at 25 ° C. for 14 days under anaerobic conditions.
  • the ABD medium may require a few days to detect, but the number of bacteria detected is difficult to culture with a known medium that has the ability to fade with other media.
  • the lactic acid bacterial strain showed extremely excellent detection power.
  • the ABD medium is a very excellent medium for performing a microorganism screening without leaking with one medium.
  • ABD medium has a characteristic that other mediums do not have the ability to determine turbidity when microorganisms are detected. For beer factories that don't have a high level of value, it was considered a high value medium and medium. [0062] [Table 4]
  • Example 9 Three liters of the ABD medium described in Example 9 was placed on a stainless steel tray and pre-frozen at ⁇ 30 ° C. for 20 hours in a lyophilizer. Transfer the tray to a freeze-dryer, set the shelf temperature to 75 ° C under a reduced pressure of ImmHg or less, and set the shelf temperature to 75 ° C and let it dry for 24 hours. 60 g of powder medium was obtained.
  • the biological material for producing the beer cloudy lactic acid bacterial strain hard-cultured in an artificial environment and devising an effective countermeasure with respect to the said microbe is provided.
  • a test medium that can be detected in a short period of time without leaking beer-mixed lactobacilli, including difficult-to-culture beer-turbid lactic acid bacteria.
  • the present invention can be effectively used in the field of beer production and the like.

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Abstract

　人工的な環境下で難培養化したビール類混濁乳酸菌株を作製し、当該菌に対する有効な対抗施策を考案するための生物材料を提供すること。 　ｐＨ４．０～５．５に調整したビール類に乳酸菌を植菌して嫌気培養し、得られた培養液を前記ｐＨに調整したビール類に植菌する操作を５回以上繰り返した後、５０～６５°Cにて５～１５分間の加熱処理を行うことを特徴とする、難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法；ｐＨ４．０～５．５に調整したビール類に乳酸菌を植菌して嫌気培養し、得られた培養液を前記ｐＨに調整したビール類に植菌する操作を２０回より多く繰り返すことを特徴とする、難培養化したビール混濁乳酸菌の作製方法；ビール類１Ｌに対して、寒天を含まない粉末ＭＲＳ培地を１６ｇ以下の割合で添加してなる、ビール類混濁乳酸菌の検査培地；前記のビール類混濁乳酸菌の検査培地を用いることを特徴とする、ビール類中の乳酸菌の検査方法を提供する。

Description

明 細 書
難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法及びビール類混濁乳酸菌 の検查培地
技術分野
[0001] 本発明は、難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法及びビール類混濁乳酸 菌の検査培地に関し、詳しくは難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法と、ビ ール類混濁乳酸菌の検査培地と、前記検査培地を用いたビール類中の乳酸菌の検 查方法と、に関する。
背景技術
[0002] ビール類産業における微生物検查法では、製品に対して有害な微生物を培地で 検出する手法が主流である（例えば、非特許文献 1参照）。
しかしながら、ラクトバチルス 'リンドネリ（Lactobacillus lindneri)やラクトバチルス'パ ラコリノイデス（L. paracollinoides)等に属す、 MRS培地等の通常の乳酸菌検查培地 で検出することができない難培養有害菌株が製品ビール類で微生物事故を引き起こ す事例が発生しており、適切な微生物管理を実施していても品質事故が起こるリスク が存在する。
[0003] その一方で、ビール類有害微生物検查培地或いは検出装置を開発'販売するメー カーでは、 MRS培地等の通常の乳酸菌検査培地で生育可能な当該菌種を保有し ていても、難培養状態のラクトバチルス 'リンドネリ（Lactobacillus lindneri)やラタトバ チルス'パラコリノイデス（し paracollinoides)を保有していないことが多いため、難培 養状態にある当該菌種に対する有効な検出法の開発が難しいという問題があった。
[0004] 上記したように、ビール産業における微生物検査法では、製品に対して有害な微生 物を培地で検出する手法が主流である。
し力 ながら、現在公知にされているビール混濁乳酸菌検出培地には、難培養乳 酸菌の検出力が弱いこと、非混濁菌株に対する選択性が低レ、ことなどが問題とされ ている。
また、これまで、 1枚の培地では漏れなくビール混濁乳酸菌を検出することは困難 であり、 3枚以上の異なる培地を併用すること力 European Brewery Conventionで推 奨されている。
しかしながら、上記推奨策は、工場における品質管理を煩雑にするだけでなぐ非 混濁株が擬陽性株として検出される可能性を高めることにつながり現実的でない。 難培養乳酸菌株を漏れなく検出でき、かつ、選択性の高い培地を開発できれば、 微生物検出時にビール混濁性の判定が行えるため、遺伝学的検查法を持たなレヽ検 查室でもビールの微生物検査が実施可能となることから、そのようなビール類混濁乳 酸菌検查培地が求められている。
[0005] 非特許文献 1： EBC ANALYTICA MICROBIOLOGICA 11(1992); Section 4 Detection of contaminants
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明の目的は、人工的な環境下で難培養ビール類有害菌株を作製し、当該菌 に対する有効な対抗施策を考案するための生物材料を提供することにある。
即ち、本発明は、第一に、通常の検査培地で検出することができない難培養有害 菌株を作製する方法を提供することを目的とするものである。
本発明は、第二に、難培養乳酸菌株を漏れなく検出でき、かつ、選択性の高いビ ール類混濁乳酸菌検査培地を提供することを目的とするものである。
換言すると、微生物検出時にビール類混濁性の判定が行え、遺伝学的検査法を持 たなレ、検査室でもビール類の微生物検査が実施可能となる、ビール類混濁乳酸菌 検査培地を提供することを目的とするものである。
本発明は、第三に、そのような検査培地を用いたビール類中の乳酸菌の検査方法 を提供することを目的とするものである。
課題を解決するための手段
[0007] 請求項 1に係る本発明は、 pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌して 嫌気培養し、得られた培養液を前記 pHに調整したビール類に植菌する操作を 5回 以上繰り返した後、 50〜65°Cにて 5〜： 15分間の加熱処理を行うことを特徴とする、 難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法を提供するものである。 請求項 2に係る本発明は、 pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌して 嫌気培養し、得られた培養液を前記 pHに調整したビール類に植菌する操作を 20回 より多く繰り返すことを特徴とする、難培養化したビール混濁乳酸菌の作製方法を提 供するものである。
請求項 3に係る本発明は、ビール類 1Lに対して、寒天を含まない粉末 MRS培地を 16g以下の割合で添加してなる、ビール類混濁乳酸菌の検查培地を提供するもので ある。
請求項 4に係る本発明は、ビール類 1Lに対して、さらに 10〜30gの寒天を添カロし てなる、請求項 3記載のビール類混濁乳酸菌の検查培地を提供するものである。 請求項 5に係る本発明は、ビール類 1Lに対して、さらに 3g以下の酢酸ナトリウムを 添加してなる、請求項 3又は 4記載のビール類混濁乳酸菌の検查培地を提供するも のである。
請求項 6に係る本発明は、ビール類 1Lに対して、寒天を含まない粉末 MRS培地を 16g以下、 10〜30gの寒天、 3g以下の酢酸ナトリウム、 5〜50mgのシクロへキシミド をそれぞれ添加し、 ρΗ4. 5〜5· 5に調整してなる請求項 4記載のビール類混濁乳 酸菌の検査培地を提供するものである。
請求項 7に係る本発明は、粉末であることを特徴とする、請求項 3〜6のいずれかに 記載のビール類混濁乳酸菌の検査培地を提供するものである。
請求項 8に係る本発明は、難培養化したビール混濁乳酸菌の検出が可能な、請求 項 3〜7のいずれかに記載のビール類混濁乳酸菌の検査培地を提供するものである 請求項 9に係る本発明は、ビール類中の乳酸菌を検查するにあたり、請求項 3〜8 のいずれかに記載のビール類混濁乳酸菌の検查培地を用いることを特徴とする、ビ ール類中の乳酸菌の検查方法を提供するものである。
発明の効果
本発明によれば、通常の検査培地で検出することができない難培養有害菌株を作 製すること力 Sできる。
次に、本発明によれば、上記のような難培養有害菌株を生物材料として、現行培地 の欠点を補うことのできる培地、つまり難培養乳酸菌株を漏れなく検出でき、かつ、選 択性の高いビール類混濁乳酸菌検査培地が提供される。
換言すれば、微生物検出時にビール類混濁性の判定が行え、遺伝学的検査法を 持たなレ、検查室でもビール類の微生物検査が実施可能となる、ビール類混濁乳酸 菌検查培地が提供される。
さらに、本発明によれば、そのような検查培地を用いたビール類中の乳酸菌の検查 方法が提供される。
従って、本発明によれば、公的菌株保存機関より入手可能な培養可能株から、通 常の検出培地で生育しない難培養有害菌を人工環境下で作製することにより、得ら れた難培養菌株を生物材料として、新規検出培地の開発、或いは培地に依存しない 迅速有害菌検出装置の開発が可能となる。
また、本発明により提供される検查培地は、ラクトバチルス 'リンドネリ（Lactobacillus lindneri)及びラクトバチルス 'パラコリノイデス（L. paracollinoides)を含めたビール類 混濁乳酸菌株の検出培地 (検査培地）として、或いはビール類飲料の加熱殺菌効果 を検証する培地として有用であることが示された。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 請求項 1に係る本発明は、難培養化したビール類混濁乳酸菌の作製方法に関し、 pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌して嫌気培養し、得られた培養 液を前記 pHに調整したビール類に植菌する操作を 5回以上繰り返した後、 50〜65 °Cにて 5〜： 15分間の加熱処理を行うことを特徴とするものである。
[0010] 請求項 1に係る本発明では、 pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌し て嫌気培養する。
ここでビール類としては、上面発酵ビールや下面発酵ビールであるなど、その種類 を問わない。また、ビールのみならず、いわゆる発泡酒やその他の雑酒等も含まれる ビーノレ類は、 pH4. 0〜5. 5、好ましくは 4. 2〜5. 0に調整しておくこと力 S必要であ る。ビール類の pHが 4. 0未満では、非常に乳酸菌の生育が悪ぐ一方、ビール類の pHが 5. 5を超えると、乳酸菌へのホップが与えるダメージが小さくなり、ビールへの 馴化がしにくくなるため、本発明の目的を達成することができない。
pHの調整は、例えば塩酸あるいは水酸化ナトリウム等の手段により行えばよい。
[0011] 乳酸菌としては、ビール類を混濁させ、し力も難培養化するようなものであれば特に 制限されないが、例えばラクトバチルス 'リンドネリ（Lactobacillus lindneri)やラタトバ チルス.パラコリノイデス（L. paracollinoides)等、通常の検查培地（MRS培地）で検出 しにくい難培養有害菌種に属する、難培養化する前の乳酸菌株が好適である。 嫌気培養は、 2〜： 10日、好ましくは 4〜7日、より好ましくは 5〜7日程度行えばよい
[0012] 次いで、得られた培養液を、前記 pH、つまり pH4. 0〜5. 5、好ましくは 4. 2〜5. 0 に調整したビール類に植菌する。
この植菌操作、つまり植え継ぎ操作を 5回以上、好ましくは 10回以上繰り返す。上 限は特に制限されないが、通常、 30回までとする。従って、通常、 5〜30回、好ましく は 10〜30回繰り返す。
以上の如き工程により、本来ビール類中で生育力を示す乳酸菌が馴化される。
[0013] し力る後、 50〜65oCにて 5〜： 15分間、好ましくは 52〜60oCにて 5〜： 15分間のカロ 熱処理を行う。
前述したビール中での乳酸菌の馴化により、乳酸菌はホップへの耐性を獲得する 、その後の加熱処理を行わない場合、ビール及び通常培地（MRS培地）の両方で 生育することが判明し、加熱処理を施すことにより、ビールで生育し、通常培地 (MR S培地）で生育しない菌株を取得することができる。
ここで加熱処理温度が 50°C未満であったり、或いは加熱処理時間が 5分間未満で あったりすると、通常培地 (MRS培地）で生育する菌株も得られ、難培養化したビー ル類混濁乳酸菌のみを得ることができなレ、。一方、加熱処理温度が 65°Cを超えたり 、或いは加熱処理時間が 15分間を超えたりすると、乳酸菌が死滅してしまう。
[0014] このような加熱処理工程を行うことにより、通常の検查培地 (MRS培地）で生育する ことができず、検出することができない、難培養化したビール類混濁乳酸菌を人工的 に作製することができる。
[0015] 一旦難培養化したビール類混濁乳酸菌は、その後、加熱処理を施さなくても、ビー ル類での植え継ぎにより難培養状態を維持することができる。
[0016] 次に、請求項 2に係る本発明は、難培養化したビール混濁乳酸菌の作製方法に関 し、 pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌して嫌気培養し、得られた培 養液を前記 pHに調整したビール類に植菌する操作を 20回より多く繰り返すことを特 徴とするものである。
[0017] 請求項 2に係る本発明では、 pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌し て嫌気培養する。
ここで、ビール類としては、上面発酵ビールや下面発酵ビールであるなど、その種 類は問わない。また、ビールのみならず、いわゆる発泡酒やその他の雑種等も含まれ る。
ビーノレ類は、 pH4. 0〜5. 5、好ましくは 4. 2〜5. 0に調整しておくことカ必要であ る。ビール類の pH4. 0未満では、非常に乳酸菌の生育が悪ぐ一方ビール類の pH が 5. 5を超えると、乳酸菌へのホップが与えるダメージが小さくなり、ビール類への馴 ィ匕がしにくくなるため、本発明の目的を達成することができない。
pHの調整は、例えば塩酸あるいは水酸化ナトリウム等の手段により行えばよい。
[0018] 乳酸菌としては、ビール類を混濁させ、し力も難培養化するようなものであれば特に 制限はないが、例えばラクトバチルス 'リンドネリ（Lactobacillus lindneori)やラタトバチ ルス'パラコリノイデス (し paracollinoides)等、通常の検査培地（MRS培地）で検出し にくい難培養有害菌種に属する、難培養化する前の乳酸菌株が好適である。
嫌気培養は、 2〜： 10日、好ましくは 4〜7日、より好ましくは 5〜7日程度行えばよい
[0019] 次いで、得られた培養液を、前記 ρΗ、つまり 4. 0〜5. 5、好ましく 4. 2〜5. 0に調 整したビール類に植菌する。
この植菌操作、つまり植え継ぎ操作を 20回より多ぐ好ましくは 40回以上繰り返す。 上限は特に制限されないが、通常 70回までとする。
以上のごとき工程により、ビール類中で生育し、通常培地 (MRS培地）で生育しな レヽ菌株を取得することができる。
[0020] 請求項 2に係る本発明で得られる難培養化した乳酸菌株は、請求項 1に係る本発 明で得られる乳酸菌株に比べ、難培養化した株を取得するまでに時間を要するもの の、加熱によるストレス負荷を行っていない点で、請求項 1に係る本発明とは異なる。 請求項 2に係る発明で得られた難培養化した乳酸菌株は、請求項 1に係る発明で 得られた難培養化した乳酸菌株とは性状が異なることが期待され、難培養ビール有 害菌株の生物試料としての価値が大いにあると思われる。
[0021] 次に、請求項 3に係る本発明は、請求項 1及び 2の方法により作製された、難培養 化したビール類混濁乳酸菌はもとより、それ以外のビール類混濁乳酸菌をも検査 (検 出）することのできる検查培地 (検出培地）に関するものである。
即ち、請求項 3に係る本発明は、ビール類 1Lに対して、寒天を含まない粉末 MRS 培地を 16g以下の割合で添加してなる、ビール類混濁乳酸菌の検查培地を提供す るものである。
ここでビール類としては、請求項 1及び 2に係る本発明についての説明中で述べた ように、上面発酵ビールや下面発酵ビールであるなど、その種類を問わず、ビールの みならず、いわゆる発泡酒やその他の雑酒等も含まれる力 苦味価が 10〜30BUで あることが好ましい。
[0022] 寒天を含まない粉末 MRS培地は、特に乳酸菌全体の良好な生育を支持している こと力ら、乳酸菌用の培地として通常用いられているものであって、その糸且成は次の 如きものである。
[寒天を含まない粉末 MRS培地組成 (精製水 1Lあたり）]
'ペプトン 10.0g
'肉エキス 8.0g
'酵母エキス 4.0g
'ブドウ糖 20.0g
•リン酸一水素カリウム 2.0g
'モノォレイン酸ソルビタン（ポリソルベート 80) l.Og
•酢酸ナトリウム 5.0g
'タエン酸アンモニゥム 2.0g
'硫酸マグネシウム 0.2g '硫酸マンガン 0.04g
[0023] 上記粉末培地 52. 2gを 1 Lの精製水にカ卩えてよく混和し、撹拌しながら加熱し、 1分 間沸騰させて完全に溶解し、これを培養容器に分注し、 1 21 °Cで 15分間、高圧蒸気 滅菌（オートクレープ）し液体培地化して使用する。
これ以降、「寒天を含まない粉末 MRS培地」を「粉末 MRS培地」という。 粉末 MRS培地は、 Difco社、 Merck社、 Biokar社などから市販されているものを 用いることができる。
[0024] ビール類への粉末 MRS培地の添加量は、ビール類 1Lに対して、 16g以下、好まし く ίま 0. 5〜： 10g、より好ましく fま 2. 0〜6. Ogである。
ここでビール類への粉末 MRS培地の添加量力 S、ビール類 1Lに対して Ogでも十分 に難培養化したビール類混濁乳酸菌は生育するが、 2. 0〜6. Og添加することにより 、より早く生育が観察できる。一方、ビール類への粉末 MRS培地の添加量力 ビー ル類 1 Lに対して 16gを超えると、難培養化したビール類混濁乳酸菌の生育が困難と なる。
[0025] このような請求項 3に係る本発明による、ビール類混濁乳酸菌の検査培地に、さら に寒天を添加することにより、平板培地化したものが、請求項 4に記載のビール類混 濁乳酸菌の検査培地である。
寒天の添加量は、ビール類 1Lに対して、 10〜30gである。
[0026] また、請求項 3に係る本発明による、ビール類混濁乳酸菌の検査培地又は上記し た請求項 4による、ビール類混濁乳酸菌の検査培地に、さらに酢酸ナトリウムを添カロ したもの力 請求項 5に記載のビール類混濁乳酸菌の検査培地である。
酢酸ナトリウムの添カ卩量は、ビール類 1Lに対して、 3g以下、好ましくは 0. 25〜2g である。
酢酸ナトリウムを添加することにより、腸内細菌の増殖を抑制することができる。
[0027] さらに、酵母の生育抑制のため、シクロへキシミドを添カ卩することができる。シクロへ キシミドの添加量は、ビール類 1Lに対して、 5〜50mgである。
このようにして、ビール類 1Lに対して、寒天を含まない粉末 MRS培地（粉末 MRS 培地）を 16g以下、 10〜30gの寒天、 3g以下の酢酸ナトリウム、 5〜50mgのシクロへ キシミドをそれぞれ添カ卩し、 ρΗ4· 5〜5· 5に調整することにより、ビール類混濁乳酸 菌の検査培地として好適なものが得られる。
[0028] 請求項 3〜6のいずれかに記載のビール類混濁乳酸菌の検査培地は、粉末化する ことにより、より利便性を向上することができる。液体培地を調製するときに、本粉末培 地を所定量水に溶解するだけでよいので、非常に便利である。粉末化には、加熱乾 燥法、凍結乾燥 (フリーズドライ)法等の公知の方法を使用することができ、特に制限 されるものではないが、培地成分の劣化、分解等を抑えることができることから、凍結 乾燥法が好ましい。
凍結乾燥法における予備凍結温度は、 _ 25°C以下が好ましぐまた、凍結時間は 16時間以上が好ましい。乾燥効率を上げるためには、十分に培地が凍結している必 要がある。凍結乾燥機における凍結物の乾燥は、 ImmHg以下の減圧下で行うのが よぐ温度は、品温が 40°C程度になるように設定するのが好ましい。
[0029] 上記した如き請求項 3〜7のいずれかに記載のビール類混濁乳酸菌の検査培地は 、難培養化したビール混濁乳酸菌の検出が可能なものである。
[0030] そして請求項 3〜8に係る本発明による、ビール類混濁乳酸菌の検査培地を用いて 、ビール類中の乳酸菌を検査する方法を提供するのが、請求項 9に係る本発明であ る。
即ち、請求項 9に係る本発明は、ビール類中の乳酸菌の検査方法 (検出方法）に関 し、ビール類中の乳酸菌を検査するにあたり、請求項 3〜8のいずれかに記載のビー ル類混濁乳酸菌の検査培地を用いることを特徴とするものである。
検査方法 (検出方法）として具体的には、前記した如き請求項 3〜8に係る本発明 による、ビール類混濁乳酸菌の検查培地に、検查対象 (検出対象）であるビール類を 適量メンブラン集菌を行ったものを培養すればょレ、。
このようにして、ビール類中の乳酸菌、特に難培養化したビール類混濁乳酸菌を検 查すること力 Sできる。
即ち、請求項 9に係る本発明によれば、通常の検查培地 (MRS培地）で検出するこ とができなレ、、ビール類中の難培養有害菌株を検出することができる。
請求項 9に係る本発明によれば、ビール類中の難培養化したビール類混濁乳酸菌 はもとより、ビール類中の混濁乳酸菌を 1枚の培地で漏れなく検出することができる。
[0031] なお、前記した請求項 3〜8に係る本発明による、ビール類混濁乳酸菌の検査培地 は、難培養化したビール類混濁乳酸菌の検査のみならず、加熱殺菌の条件の設定 にも利用することができる。
実施例
[0032] 以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例 に限定されるものではない。
[0033] 実施例 1 (難培養化したビール混濁乳酸菌の作製 1)
ラクトバチルス.リンドネリ（し lindneri) DSM20692株を約 106cells/mlとなるように、 pH5. 0に調整したピルスナ一'タイプのガス抜きビール（苦味価 20B.U. スーパード ライ等） 10mlに植菌した。 25°Cで 1週間嫌気培養し、生育した当該株培養液 100 μ 1 を同様に ρΗ5· 0に調整したガス抜きビール 10mlに植え継いだ。 ρΗ5· 0に調整した ガス抜きビールでの植え継ぎを 15回繰り返して得られた当該株培養液に対して、 60 °Cにて 10分間の加熱処理を行って、難培養化したラクトバチルス 'リンドネリ（し lindn eri) DSM20692VN株を作製した。
[0034] まず、得られた菌株の菌液（以下、試料液という）における生菌数を計測するために 、試料液を 10倍、 100倍、 1000倍等と段階希釈を行い、 PH5. 0に調整したガス抜 きビールへ植菌し、 25°Cで 2週間以内にすなわち生育が確認された場合、希釈試料 液に生菌を含むと判断した。なお、生育の確認はビール中における目視での混濁の 有無で判断した。本計測法では、それぞれの希釈段階の試料液に対して 3本のガス 抜きビール (pH5. 0)を用意し、試料液中の生菌数は、段階希釈試料液中に含まれ る生菌の有無に基づき、最確数法にて求めた。その結果、試料液 10 μ ΐ中の生菌数 は 460個と推定された。
次に、得られた菌株がビール有害性を示すか否かを調查するため、製品ビールの 代表サンプノレとして選択した ΡΗ4. 2に調整したガス抜きビールに、試料液 10 / lを 植菌した。植菌後、約 1ヶ月でビール中に混濁が生じ、生育性が確認された。これに より、得られた菌株の製品ビールへの有害性が示された。
[0035] 一方、培養試験においては、試料液 10 μ 1を MRSブロスに植菌し、 25°Cで 2週間 嫌気培養したが、 目視による生育性の確認ができなかった。
ここで、 MRSブロスは、 Merck社製の、寒天を含まない粉末 MRS培地を用レ、、上 記粉末培地 52. 2gを 1Lの精製水に加えてよく混和し、撹拌しながら加熱し、 1分間 沸騰させて完全に溶解し、これを培養容器に分注し、 121°Cで 15分間、高圧蒸気滅 菌 (オートクレープ)し液体培地化して使用した（以下、同様)。
以上から、得られた菌株ラタトバチルス 'リンドネリ DSM20692VN株は、検查培地 (MRS培地)では検出できないにもかかわらず、本株により、製品流通期間中の品質 事故が発生する可能性が示された。
なお、ラクトバチルス 'リンドネリ DSM20692株は、本発明で記載する一連の処理 を実施しない場合 (つまり難培養化していない場合）、 100個程度の植菌では、 MRS ブロスにおいて、 4日程度で生育を確認することができる。
[0036] 実施例 2
実施例 1で PH4. 2に調整したガス抜きビールで生育した、難培養化したラタトバチ ノレス'リンドネリ（し lindneri) DSM20692VN株について、混濁ビール液 0· 1 /i 1を M RSブロス並びに ρΗ4· 2に調整したガス抜きビールに熱処理を付加することなく植菌 した。 25°Cで 2週間嫌気培養を行った結果、ビール生育株は MRSブロスでは生育 性を示さなかった。
一方、ガス抜きビール (pH4. 2)では、 3週間以内に生育性を示し、検査培地で検 出されないにも関わらず、製品流通期間中に品質事故が発生する可能性が示され た。また、試料液 0. 1 β 1中の当該株生菌数は、実施例 1に記載した最確数法で求め た結果、 93個と推定された。
[0037] 以上の結果から、一旦難培養状態に陥ったラクトバチルス 'リンドネリ (L. lindneri) D SM20692VN株は、加熱処理を付加しなくても、難培養状態を維持することが示唆 され、本手法により得られた難培養株も、検出培地或いは迅速検出装置の開発及び 評価のための生物材料として有用であると考えられた。
なお、実施例 1で得られた難培養株は、加熱殺菌により工程管理を行っているビー ノレメーカーの微生物検查法開発に適し、実施例 2で得られた難培養株は除菌フィノレ ターにより工程管理を行っているビールメーカーの微生物検查法開発に適していると 考えられる。
[0038] 実施例 3 (難培養化したビール混濁乳酸菌の検査培地）
(1)難培養化したビール混濁乳酸菌の検査培地の検討
難培養状態に陥った当該菌株を検出する培地を検討するため、ガス抜きビール 1L に、寒天を含まない粉末 MRS培地（以降、単に「粉末 MRS培地」という。 Merck社 製）を、それぞれ 0g 2. 61g 5. 22g 15. 66g 26. lg 52. 2gとなるよう添カロした 後、 pH5. 0に調整し、当該菌株、つまり難培養化したラクトバチルス 'リンドネリ（し lin dneri) DSM20692VN株の生育性を調べた。この試験は 2点併存で実施した。 粉末 MRS培地添加量と、難培養化したラクトバチルス 'リンドネリ（し lindneri) DSM 20692VN株の生育性との関係を表 1に示す。なお、表 1中、「―」は、培養期間中生 育が認められなかったことを示す。
[0039] [表 1]
粉末 M R S培地添加 0 2. 61 5. 22 15. 66 26. 1 52. 2
( g )
検出所要日数 10 , 10 7, 7 8 , 8 1 1 , 一 —， — 一， —
[0040] 表 1に示すように、ビーノレ 1Lに対して、 26. lg以上の粉末 MRS培地を含む場合、
25°Cで 2週間以内に生育性を示さないことが判明した。
一方、表 1に示すように、ビール 1Lに対して、粉末 MRS培地を 2. 61g含む培地に おいて、当該株の生育性は最も良ぐ培養 7日目で検出可能なことが判明した。 従って、ビール 1Lに対して、粉末 MRS培地を 16g以下の割合で添加することによ り、難培養化したビール混濁乳酸菌の検査培地が得られることが分かる。
[0041] (2)難培養化したビール混濁乳酸菌の検査培地の検出感度の検討
上記（1)で有用性が認められた培地（以下、 NCBD培地と称する。）の検出感度を 調査した。
上記（1)で示した一連の難培養化処理を実施した、ラクトバチルス 'リンドネリ（L. lin dneri) DSM20692VN株を最確数法で 2. 3個含むと推定された試料液を NCBD培 地に接種した結果、 N = 2の試験において、 7日及び 8日で検出することができた。こ のため、 NCBD培地は、難培養乳酸菌株を高感度に検出できる培地であると考えら れた。
[0042] また、通常、ビールの熱殺菌条件を検討する際、 MRS培地等の一般培地を使用 することが多い。し力 ながら、実施例 1に示すように、 60°Cにて 10分加熱後、ラクト バチルス 'リンドネリ（し lindneri) DSM20692VN株が 460個存在すると推定される 場合でも、 MRS培地では生菌数なしと誤判定してしまうこととなり、誤った加熱殺菌 条件を設定してしまう可能性が高い。このため、 NCBD培地を利用した加熱殺菌効 果検証試験は、従来の一般培地を使用した加熱殺菌条件検証試験よりも信頼度が 高いと考えられる。
[0043] 実施例 4 (難培養化したビール混濁乳酸菌の作製 2)
ラクトバチルス.パラコリノイデス（L. paracollinoides)JCM11969T株を約 106cells/m 1となるように、 pH4. 2に調整したガス抜きビールに 10ml植菌した。 25°Cで 5日間嫌 気培養し、生育した当該株培養液 100 μ ΐを、同様に ρΗ4. 2に調整したガス抜きビ ール 10mlに植え継レ、だ。 ρΗ4· 2に調整したガス抜きビールでの植え継ぎを 30回繰 り返して得られた当該株培養液に対して、 52°Cにて 5分間の加熱処理を行って、難 培養化したラクトバチルス 'パラコリノイデス（L. paracollinoides)JCM11969TVN株を 作製した。
[0044] 得られた菌株の菌液 (以下、試料液という）における生菌数を実施例 1記載の最確 数法にて計測したところ、試料液 10 μ 1中の生菌数は 460個と推定された。
次に、得られた菌株がビール有害性を示すか否力を調査した。実施例 1と同様に、 ΡΗ4. 2に調整したガス抜きビールに、試料液 10 μ ΐを植菌し、 2週間以内でビール 中に混濁が生じ、生育性が確認された。これにより、得られた菌株の製品ビールへの 有害性が示された。
[0045] 一方、培養試験においては、試料液 10 μ 1を MRSブロスに植菌し、 25°Cで 2週間 嫌気培養したが、 目視による生育性の確認ができなかった。
以上から、得られた菌株ラタトバチルス 'パラオリノイデス JCM11969TVN株は、検 查培地 (MRS培地）では検出できないにもかかわらず、本株により、製品流通期間中 の品質事故が発生する可能性が示された。
また、試料液を NCBD培地に接種した場合、 6日で検出することができ、難培養化 したラクトバチルス 'パラォリノイデス JCM11969TVN株に対しても、 NBCD培地は 有用であることが判明した。
なお、ラクトバチルス 'パラォリノイデス JCM11969T株は、本発明で記載する一連 の処理を実施しない場合（つまり難培養化していない場合）、 100個程度の植菌では 、 MRSブロスにおいて、 4日程度で生育を確認することができる。
[0046] 実施例 5 (難培養化したビール混濁乳酸菌の作製 3)
ラクトバチルス 'リンドネリ（し lindneri ) DSM20692株を約 106cellZmlとなるよう p H4. 2に調整したピルスナ一'タイプのガス抜きビール（苦味価 20B. U. ) 10mlに植 菌した。 25°Cで 1週間嫌気培養し、生育した当該株培養液 100 μ ΐを同様に pH4. 2 に調整したガス抜きビール 10mlに植え継いだ。 pH4. 2に調整したガス抜きビール での植え継ぎを 40回繰り返して、当該菌株の難培養化した株を作製した。
[0047] 得られた菌株の菌液（以下、試料液という）における生菌数を実施例 1記載の最確 数法にて計測したところ、試料液 1 μ 1中の生菌数は 2400個と推定された。
次に、得られた菌株がビール有害性を否かを調査した。実施例 1と同様に、 ρΗ4. 2に調整したガス抜きビールに、試料液 1 μ 1を植菌し、 6日目でビール中に混濁が生 じ、生育性が確認された。これにより、得られた菌株の製品ビールへの有害性が示さ れた。
[0048] 一方、培養試験においては、試料液 10 μ 1を MRSブロスに植菌し、 25°Cで 2週間 嫌気培養したが、 目視による生育性の確認ができなかった。
以上から、得られたラクトバチルス 'リンドネリ DSM20692株の難培養化株は、検査 培地 (MRS培地）では検出できないにもかかわらず、本株により、製品流通期間中の 品質事故が発生する可能性が示された。
なお、ラクトバチルス 'リンドネリ DSM20692株は、本発明で記載する一連の処理 を実施しない場合 (つまり難培養化していない場合）、 100個程度の植菌では、 MRS ブロスにおいて、 4日程度で生育を確認することができる。
[0049] 実施例 6 (難培養化したビール混濁乳酸菌の作製 4)
ラクトバチルス.パラコリノイデス（L. paracollinoides)JCM11969T株を約 106cell/ mlとなるよう pH4. 2に調整したピルスナ一'タイプのガス抜きビール（苦味価 20B. U . ) 10mlに植菌した。 25°Cで 1週間嫌気培養し、生育した当該株培養液 100 / 1を同 様に ρΗ4· 2に調整したガス抜きビール 10mlに植え継いだ。 ρΗ4· 2に調整したガス 抜きビールでの植え継ぎを 70回繰り返して、当該菌株の難培養化した株を作製した
[0050] 得られた菌株の菌液（以下、試料液という）における生菌数を実施例 1記載の最確 数法にて計測したところ、試料液 0. 01 μ冲の生菌数は 1100個と推定された。 次に、得られた菌株がビール有害性を否かを調査した。実施例 1と同様に、 ρΗ4. 2に調整したガス抜きビールに、試料液 0. 01 μ 1を植菌し、 5日目でビール中に混濁 が生じ、生育性が確認された。これにより、得られた菌株の製品ビールへの有害性が 示された。
[0051] 一方、培養試験においては、試料液 0. 01 μ 1を MRSブロスに植菌し、 25°Cで 2週 間嫌気培養したが、 目視による生育性の確認ができなかった。
以上から、得られたラクトバシルス 'パラォリノイデス JCM11969T株の難培養化株 は、検査培地 (MRS培地）では検出できないにもかかわらず、本株により、製品流通 期間中の品質事故が発生する可能性が示された。
なお、ラクトバシルス 'パラォリノイデス JCM11969T株は、本発明で記載する一連 の処理を実施しない場合（つまり難培養化していない場合）、 100個程度の植菌では 、 MRSブロスにおいて、 4日程度で生育を確認することができる。
[0052] 実施例 7
実施例 3で有用性を認められた培地 (NBCD培地）に寒天をカ卩えることにより、平板 培地化して検査培地とし、環境から頻出される雑菌 14種に対する検査培地の選択 性を調査した。検查培地の組成は次のとおりである。なお、ビールは、アサヒビーノレ 社製のアサヒ.スーパードライ (登録商標）を用いた。
(1)検查培地成分（1Lあたり）
•寒天を含まなレ、粉末 MRS培地 2. 61g
•寒天 15g
'シクロへキシミド 10mg
'ビール 1000ml 以上の成分を 5N NaOHで pH5.0に調整したものを用いた。
[0053] (2)選択性評価
表 2に記載のビール工場頻出 14菌種について、約 lOOcellsを上記（1)の検査培地 に塗抹し、嫌気条件下で 25°Cにて 14日間培養して、雑菌 14種に対する上記（1)の 検查培地の選択性を調査した。結果を表 2に示す。
その結果、ビール非混濁性環境細菌については、概ね極めて良好な選択性を示し た力 場合によっては Pantoea属のような腸内細菌科が生育することが認められた。
[0054] [表 2] 歸重 賺 漏 ί 生育性
Lactococcus lactis ABBC269 - -
OostndL beij imkii HC350 ― -
^&raia rrwcescens HOT7 - ―
Gtrd ter frm/ if HC 17 -
E &^obact^ oaceae HC 32 ― -
Figure imgf000017_0001
tr i HC 37 ™ 一
f q^orvhactenum Η^^ΙΟ ―
Bacilli th n&msis I 44J ― ―
F^nto^ ^lomerans HC4¾ - +
Pa&vbadllus
Figure imgf000017_0002
HC 59 - ―
Raeriha ilus j iiae HC466 ― -
^p^fococcus ^dermicfis HC475 一 ―
Klebsiella oxytoca HCS34 ― 一
Figure imgf000017_0003
実施例 8
培地選択性の改善を行うため、酢酸ナトリウムの添加を行った。
即ち、実施例 7の検査培地に、表 3に示す割合で、酢酸ナトリウムを添加したものを 検査培地とした。なお、酢酸ナトリウムの添カ卩量は、ビール 1Lに対するものである。 供試菌株約 lOOcellsを、上記した如き検査培地に塗抹し、嫌気条件下で 25°Cにて
14日間培養した。
その結果、表 3に示すように、酢酸ナトリウム 0. 5gあるいは 1. Ogを培地 1Lあたり添 加することにより、難培養乳酸菌株の生育を抑制することなぐ腸内細菌科の生育を 抑制できることが分かった。
[0056] [表 3]
Figure imgf000018_0001
[0057] 実施例 9
実施例 8の結果から、以下の組成の培地を作製し (以下、 ABD培地とする。）、 Euro pean Brewery Conventionが推奨するビール混濁乳酸菌検出培地（VLB S_7、 Raka- Ray、 MRS agar)、 American Society of the Brewing Chemistsが推奨する BMB培地な らびにミュンヘン工科大学 Back教授が推奨する NBB-A培地と、培地の選択性及び 培地の検出力について、それぞれ比較を行った。なお、ビールは、アサヒビール社製 のアサヒ 'スーパードライ（登録商標）を用いた。
European Brewery Conventionが推奨するビール混濁乳酸菌検出培地（VLB S_7、 Raka- Ray ^ MRS agar;とし飞は、 European Brewery onvention, Detection or contain inants. In: EBC Analytica Microbiologica II， Analytica Micro Diologica Sub—committe e, Eds. , Fachverlag Hans Carl: Neurnberg, 1992, Section 4, pp. 1-51.に己載された ものを用いた。
次に、 American Society of the Brewing Chemistsが推奨する BMB培地としては、 Ba rney, Μ·し. , Kot, E.j . and し hicoye, E.， し ulture medium for detection of り eer sponag e microorganisms. 1990， U. S. Patent 4,906,573.に記載されたものを用いた。
さらに、ミュンヘン工科大学 Back教授が推奨する NBB-A培地としては、 Back, W.， N achweis von Bierscnaedlingen mittels NBB. In: Farbatlas und Handbuch der Getraen kebiologie, Verlag Hans Carl: Neurnberg, 1994, vol.1 , pp. 145—155.に己載されたも のを用いた。 [0058] (1)培地の組成（1Lあたり）
'寒天を含まない粉末 MRS培地 2. 61g
'酢酸ナトリウム 0. 5g
'寒天 15g
'シクロへキシミド lOmg
•ビーノレ 1000ml
以上の成分を 5N NaOHで pH5.0に調整したものを用いた。
[0059] (2)培地の選択性
ビール工場環境頻出 14菌種ならびにビール非混濁乳酸菌 9株を用いて、培地の 選択性を評価した。結果を表 4に示す。
試験方法は、実施例 7および 8と同様、供試菌株約 lOOcellsを培地に塗抹し、嫌気 条件下で 25°Cにて 14日間培養して行った。
その結果、表 4に示すように、 ABD培地のビール非混濁細菌に対する特異性は極 めて高く、公知の培地と比較して圧倒的な優位性を示した。
[0060] (3)培地の検出力
漏れなく検出する必要があるビール混濁乳酸菌株について、公知のビール混濁乳 酸菌検出培地と比較した。結果を表 5に示す。
試験方法は、実施例 7および 8と同様、供試菌株約 lOOcellsを培地に塗抹し、嫌気 条件下で 25°Cにて 14日間培養して行った。
その結果、表 5に示すように、 ABD培地は、検出に若干の日数を要する場合がある ものの、検出菌数では他の培地と遜色がなぐし力も公知の培地で従来検出が困難 な難培養性乳酸菌株では極めて優れた検出力を示した。
[0061] 以上のことから、 ABD培地は、 1枚の培地で漏れのない微生物検查を行うために非 常に優れた培地であることが明らかとなった。
さらに、選択性を併せて考慮すると、 ABD培地は微生物が検出された時点で混濁 性の判定ができるという他の培地にはない特性を持っているため、培地の検出以降 有効なビール混濁性判定を持たなレ、ビール工場にとっては、価値の高レ、培地である と考察した。 [0062] [表 4]
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[0063] [表 5]
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2S*ftで ¾¾糞麹^ tt堵饔爾闢申藝 寶が なか こと.*«す， 養乳靉瞿《を*す，
[0064] 実施例 10
実施例 9記載の ABD培地 3リットルを、ステンレス製のトレーに盛り付け、凍結乾燥 庫にて、—30°Cにて 20時間予備凍結した。トレーをフリーズドライ機に移し、 ImmH g以下の減圧下で、品温が 40°Cになるよう、棚温度 75°Cに設定し、 24時間乾燥させ 粉末培地 60gを得た。
産業上の利用可能性
本発明によれば、人工的な環境下で難培養化したビール類混濁乳酸菌株を作製 し、当該菌に対する有効な対抗施策を考案するための生物材料が提供される。 また、本発明によれば、難培養化したビール類混濁乳酸菌を含むビール類混濁乳 酸菌をもれなぐ短期間で検出できる検査培地が提供される。
それ故、本発明は、ビール類製造分野等において有効に利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌して嫌気培養し、得られた培養 液を前記 pHに調整したビール類に植菌する操作を 5回以上繰り返した後、 50〜65 °Cにて 5〜： 15分間の加熱処理を行うことを特徴とする、難培養化したビール類混濁 乳酸菌の作製方法。
[2] pH4. 0〜5. 5に調整したビール類に乳酸菌を植菌して嫌気培養し、得られた培養 液を前記 pHに調整したビール類に植菌する操作を 20回より多く繰り返すことを特徴 とする、難培養化したビール混濁乳酸菌の作製方法。
[3] ビール類 1Lに対して、寒天を含まない粉末 MRS培地を 16g以下の割合で添加し てなる、ビール類混濁乳酸菌の検査培地。
[4] ビール類 1Lに対して、さらに 10〜30gの寒天を添カ卩してなる、請求項 3記載のビー ル類混濁乳酸菌の検査培地。
[5] ビール類 1Lに対して、さらに 3g以下の酢酸ナトリウムを添加してなる、請求項 3又 は 4記載のビール類混濁乳酸菌の検査培地。
[6] ビール類 1Lに対して、寒天を含まない粉末 MRS培地を 16g以下、 10〜30gの寒 天、 3g以下の酢酸ナトリウム、 5〜50mgのシクロへキシミドをそれぞれ添加し、 pH4.
5〜5. 5に調整してなる請求項 4記載のビール類混濁乳酸菌の検查培地。
[7] 粉末であることを特徴とする、請求項 3〜6のいずれかに記載のビール類混濁乳酸 菌の検查培地。
[8] 難培養化したビール混濁乳酸菌の検出が可能な、請求項 3〜7のいずれかに記載 のビール類混濁乳酸菌の検查培地。
[9] ビール類中の乳酸菌を検查するにあたり、請求項 3〜8のいずれかに記載のビール 類混濁乳酸菌の検査培地を用いることを特徴とする、ビール類中の乳酸菌の検査方 法。
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