JPH03130071A

JPH03130071A - 乳酸菌増殖用培地

Info

Publication number: JPH03130071A
Application number: JP7623189A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Taguchi; 博田口; Motoo Okochi; 大河内　基夫
Original assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Current assignee: Kirin Brewery Co Ltd
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1989-03-28
Publication date: 1991-06-03

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の背景〕〈産業上の利用分野〉本発明は、乳酸菌を急速に増殖させることができる乳酸
菌用培地に関する。

さらに具体的には、本発明は、ビールの醸造に有害な乳
酸菌の検出に有用な乳酸菌増殖用培地に関する。

〈従来の技術及び問題点〉ビールの醸造は厳重な微生物管理の下に行なわれており
、そのような技術に付随するものとして、雑菌、特に乳
酸菌、の検出手段は不可欠なものである。

このような場合の乳酸菌の検出は、それがビールのよう
な大量生産品の品質管理の一環であるところから、操作
が簡便であるだけでなく、結果が迅速に得られる、とい
うことが必要である。

乳酸菌の検出はその培養によって行なうことがふつうで
ある。

乳酸菌は、炭水化物を分解して乳酸を生成することによ
ってエネルギーを獲得する微生物のうち細菌に属するも
ののゝ総称であり、代表的な属には、ストレプトコツカ
ス属、ペデイオコッカス属、ロイコノストック属及びラ
クトバチルス属がある（東京化学同人社「生化学辞典」
）。

このうち、ビール中で増殖する乳酸菌（以後「ビール乳
酸菌」と呼ぶ）は、ベディオコッカス属及びラクトバチ
ルス属のものである。

このビール乳酸菌は、複雑な栄養要求性を示すことが知
られている。なお、ビール乳酸菌の詳細については、Ｂ
ａｃｋ、Ｗ、：Ｂｒａｕ−ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ、
ｖｏｌ　　３１゜ｐ２３７　（１９７８）およびＥｓｃｈｅｎｂｅｃｈｅｒ、Ｆ、：１ｂｉｄＶｏｌ　　
２１．ｐ４２４　（１９６８）を参照すしたい。

このビール乳酸菌を迅速に検出することを目的として、
数多くの乳酸菌用培地が報告されているしかし、従来の
乳酸菌用培地では、ビール乳酸菌の増殖は遅く、コロニ
ーの目視観察に７日程度（増殖が極めて遅く、目視的に
検出可能なコロニー形成に１０日以上を必要とする株も
ある。）の培養期間が必要である。このため、従来の乳
酸菌用培地よりも迅速性、回収性に優れた培地の開発が
望まれる。

く考えられる解決策〉乳酸菌の増殖を促進する物質としては、アミノ酸、ビタ
ミン、ペブタイド、核酸及び核酸関連物質等が知られて
いる（　Ｋａｎｄｌｅｒ、　Ｏ，、Ｗｅｌｓｓ、　Ｎ、
：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅ
ｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

第ｔ２０９頁（Ｓｎｅａｔｈ、　Ｐ、Ｈ，Ａ、　ｅｔ　
ａ１編、米国１（ｉｌｌｉａｉｓ　ａｎｄν１ｌｋｌｎ
ｓ刊、１９８６年）〕、宮本等：日本農芸化学会昭和６
１年度大会講演要旨集、ｐ、５７６）。

従来の乳酸菌用培地では、これらの増殖促進物質は、も
っばら酵母エキス、肝浸出液あるいは蛋白質の加水分解
生成物等の天然物を培地成分として用いることにより供
給されている。しかし、これらは微生物に対する増殖阻
害物質をも含んでいるため、培地中に多量添加すること
は望ましくない（坂崎利−著「新細菌培地学講座・上」
）。

なお、核酸関連物質を直接添加する培地としては、微生
物の特定の性質を把握するために考案された合成培地（
Ｂａｃｔｏ　Ｂｌｏｔｉｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｍｅｄｉｕａ
＋　。

Ｂａｃｔｏ　ＣｈｏｌＩｎ　Ａｓ５ａｙ　Ｍｅｄｉｕｍ
等、（ＤＩＰＣＯＭａｎｕａｌ））がある。しかし、こ
れらは乳酸菌の増殖を積極的に増強することを意図して
考案された培地ではなく、乳酸菌のある特定の種類ない
し株の分別培養には有用であっても、ビール乳酸菌を総
合的に検出するのには使用することができない。

また、ビール乳酸菌用の培地成分として、ビール、麦芽
汁あるいはその発酵液を用いた培地も報告されている（
ｃａｓｅｙ　ｃ、　ｐ、等：　Ｂｒｅｗｅｒｓ　Ｄｉｇ
ｅｓｔＶｏｌ、　５Ｂ、　Ｎｏ、３．　ｐ４８１９８１
）　、　しかし、これらに含まれるホップ樹脂にはグラ
ム陽性微生物（乳酸菌を含む）に対する抗菌作用がある
ことが知られており、ビール中に含まれる増殖阻害物質
−の除去を目的として活性炭処理したビールあるいはホ
ップ無添加ビール等を培地成分として用いた培地も報告
されている（Ｃａｓｅｙ、Ｇ、Ｐ、等：前記）しかし、
ビールの活性炭処理が煩雑であることはいうまでもない
し、またホップ無添加ビールを乳酸菌検出のためだけに
製造することはそれ自身が無駄である。また、ビール等
を添加しても、乳酸菌の増殖は満足すべきほどには改善
されない。

〔発明の概要〕

本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、シチ
ジン及びチミジン並びに麦芽汁発酵物を乳酸菌増殖促進
物質として利用することによってこの目的を達成しよう
とするものである。

〈要旨〉従って、本発明による乳酸菌増殖用培地は、シチジン及
びチミジン並びに麦芽汁発酵物を添加してなるものであ
る。

く効果〉本発明による乳酸菌増殖用培地は、従来の乳酸菌増殖用
培地に比べてビール乳酸菌の生育を良好に支持すること
ができる。従って、コロニーの目視検出に必要な培養期
間が短縮され、さらに、ビール等の醸造に有害な乳酸菌
を広範囲に検出することができる。

本発明による乳酸菌増殖用培地では核酸ないし核酸関連
物質として特定のもの、すなわちシチジン及びチミジン
、を選択使用しているのであるが、本発明による効果は
アデノシン及びグアノシンでは認められない（後記実験
例参照）。本発明による効果がシチジン及びチミジンに
ついてのみ認められたことは、思いがけなかったことと
いうべきである。

本発明の好ましい実施態様は固体培地の形態であるが、
固体培地にすれば麦芽汁発酵物が製品ビールであっても
、含有されているホップ樹脂による乳酸菌に対する生育
阻害が抑制される（後記実験例参照）。固体培地による
この効果も思いがけなかったことと解される。

〔発明の詳細な説明〕

く基本培地〉本発明によってシチジン及びチミジン並びに麦芽汁発酵
物を添加すべき乳酸菌用培地は、乳酸菌の生育が可能な
ものであれば任意のものが対象となる。

乳酸菌用培地は既に各種のものが知られていて、教科書
ないし綜説、たとえばＣａ５ｅｙ、Ｇ、Ｐ、等（前記）
に紹介されているが、本発明ではこれらをそのま＼で、
あるいは添加されている天然物を減量ないし削除して、
本発明での基本培地として使用することができる。

これらの乳酸菌増殖用培地は、液体培地であっても、固
体培地であってもよい。固体化剤としては、寒天、ゼラ
チン、その他があって、これもまた教科書等に記載され
ているところである。

く生育促進剤および本発明培地〉上記のような基本培地に添加して乳酸菌を増殖させるべ
き生育促進剤は、シチジン及びチミジン並びに麦芽汁発
酵物である。

シチジン及びチミジンは、核酸ないし核酸関連物質とし
ていずれも周知の物質である。本発明ではシチジン及び
チミジンそのものあるいはこれらの誘導体を生育促進剤
として利用することができる。

本発明による生育促進剤のもう一つの成分である麦芽汁
発酵物は、麦芽汁のみの発酵物、ホップを添加した麦芽
汁の発酵物、製品ビール、並びに製品ビールからその成
分の一種または二種以上、たとえば含有ホップ樹脂およ
び（または）二酸化炭酸および（または）アルコール、
を一部または完全に抜取ったもの、を包含する概念であ
る。ここで、「製品ビールｊとは、一般消費者がビール
として飲用しうる状態の加ホップ麦芽汁発酵物を意味す
る。

好ましい麦芽汁発酵物は、製品ビール、並びに製品ビー
ルから含有ポツプ樹脂および（または）二酸化炭素を低
減ないし除去したものである。

製品ビールおよび二酸化炭素除去ビールは、−般に、そ
こに含有されているホップ樹脂が乳酸菌の生育を阻害す
るが、この現象は本発明による生育促進物質、就中シチ
ジン及びチミジン、を添加した場合にも大なり小なり認
められる。しかし、本発明によれば、ホップ樹脂の乳酸
菌生育阻害作用は培地が固体化されたものであると抑制
されることが判明している。

従って、本発明で乳酸菌生育促進物質として使用する麦
芽汁醗酵物の好ましい具体例は、製品ビールまたは製品
ビールから二酸化炭素を抜いたものである。

本発明による乳酸菌増殖用培地でのシチジン及びチミジ
ン並びに麦芽汁醗酵物の添加量は、液体培地換３！！［
１リットル当り、シチジン０，０２〜１ｇ、チミジン０
．０２〜１ｇおよび麦芽汁発酵物５０〜１，０００ｍ１
、である。

本発明で検出しようとする乳酸菌は、前記のような「ビ
ール乳酸菌」が代表的である。これらはペデイオコッカ
ス属及びラクトバチルス属の乳酸球菌または乳酸桿菌で
ある。迅速検出が可能な本発明は、対象とする乳酸菌が
生育速度の遅いものであるときにその効果を最大限に享
受するということができる。

く実験例〉本実験例に用いた供試菌株は、いずれもビール工場で分
離されたビール乳酸菌である。すなわち、Ｓ−２、Ｓ−
６，５−２３，５−２５，５−３０゜およびＳ−１６６
はペデイオコッカス属の乳酸球菌であり、Ｒ−３２およ
びＲ−１０６はラクトバチルス属の乳酸桿菌であって、
いずれもＢ　ａ　ｃ　ｋ。

Ｗ、およびＥｓｃｈｅｎｂｅｃｈｅｒ、Ｆ　（前出ンに
よって報告されているものと等価のものである。

下記の実験においては、供試菌株を濾過除菌したガス抜
きビール（１０ｍｌ／試験管）に接種して２５℃で培養
し、これを前培養液として用いた。

培地の殺菌は、高圧蒸気滅菌（オートクレイプ）で実施
した。沈殿物が生じる場合には、必要に応じて、高圧蒸
気滅菌後、濾過除菌した。

実施例１　（Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、３培地との比較
：平板塗抹法）本発明の培地（組成第１表）及び従来の乳酸菌用培地（
Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培地二組成第２表）各々
２０ｍ１を９０關φのプレートに入れて、寒天平板培地
を作成した。この寒天平板培地に、前培養液を滅菌水で
適宜希釈し、５０〜３００ＣＦＵ（ＣＦ　Ｕ　：　Ｃｏ
１ｏｎｙ　ＦｏｒｒＡｉｎｇ　Ｕｎｌｔｓ）の供試菌株
を塗抹し、ガスパック（ベクトンデッキンソン社製）嫌
気条件下、２５℃で培養した。

増殖コロニーが目視的に観察し易い大きさになった時点
（乳酸桿菌で３日間、乳酸球菌で７日間）で、その増殖
状態を比較した。

本発明培地（第１表）で検出されたコロニー数を１００
とした場合のＲａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培地でのコ
ロニー数（相対コロニー数）を第１図に、また、各培地
での供試菌株のコロニーの直径を第２図に示す。

従来の乳酸菌用培地（Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培
地）では７日間の培養期間で目視的に観察されない乳酸
球菌（Ｓ−６，５−３０株）についても、本発明培地（
第１表）を用いることにより目視的にコロニーを確認す
ることが可能となった。また、コロニーの直径に関して
も、本発明培地（第１表）はＲａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、
　３培地と比較して同程度以上の大きさのコロニー形成
が認められた。

さらに、コロニー数でも、本発明培地（第１表）が従来
の乳酸菌用培地（Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、３培地）よ
りもまさっていた。

以上の結果より、本発明培地（第１表）は従来の乳酸菌
用培地（Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培地）に比べて
、ビール乳酸菌に対する増殖支持能が高いことが明らか
である。

第１表　本発明培地組成の１例（培地１１あたり）ビール　　　　　　　　　　　　　　　８００ｍ１（あ
るいは、ヘキサン処理ビール　８００ｍ１）Ｔｒｙｐｔ
ｉｃａｓｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ　（ＢＢＬ）　　　　　　
　　５　ｇＨａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　　　　（Ｄｉｆ
ｃｏ）　　　　　２．　５　ｇＹｅａｓｔ　Ｅｘｔｒｃ
ｔ　　　　（Ｄｉｒｃｏ）　　　　　２．　５　ｇＬｌ
ｖｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ　　（Ｓ１ｇＩＩｌａ
２０２−３）　　　　　１　ｚＭａｌｔｏｓｅ　　　　
　　　　　　　　　　　　　５　ｇＧｌｕｃｏｓｅ　　
　　　　　　　　　　　　　　　５　ｇＬ−Ｍａｌｊｃ
　Ａｃ１ｄ　　　　（Ｓｉｇｍａ）　　　　　０．　５
　ｇＴｗｅｅｎ−８０１ｍ１Ｋ２ＨＰＯ４０，５ｇＭｇＳＯ４・７Ｈ２００、１２５ｇＭｎ　Ｓ　Ｏ・４Ｈ２００，０２５ｇＣｙｔｊｄｌｎｅ　　　　　　（Ｓｉｇｍａ）　　　　
　０　、　２　ｇＴｈｙｍｉｄｌｎａ　　　　　　（Ｓ
ｉｇｍａ）　　　　　０　、　２　ｇＣｙｓｔｅｉｎｅ
　１１ｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｌｄｅ　　　　　０
．　５　ｇ（Ａｇａｒ　　　　　　　　　　　２０ｇ／
１）ｐＨ５，４第２表　Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、３培地組成（培地ＩＹｅａｓｔ　Ｅｘｔｒｃｔ　　　　（ＢＢＬ）ｒｒｙｐ
ｔｉｃａｓｅ　ｐｅｐｔｏｎｅ　（ＢＢＬ）ＭａｌＬｏ
ｓｅＦｒｕｃｔｏｓｅ２ＨＰ０４ＭｇＳＯ・７Ｈ２０Ｍ　ｎ　Ｓ　Ｏ４”　４　Ｈ２０（ＮＨ４）２ＨＣ６Ｈ５０７Ｔｗｅｅｎ−８０Ｌｉｖｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅＢｅｔａｉｎａ　ＨＣＩＰｏｔａｓｓｉｕｍ　ＡｓｐａｒｔａｔｅＰｏｔａｓｓ
ｉｕｍ　ＧｌｕｔａｍａｔｅＮ−Ａｅｅｔｈｙ＋−ＧＩ
ＬＩｅＯＳａｌｌｉｎｅ（Ａｇａｒｌあたり）２．５ｇ２０、　　ｏｇ１０．０ｇ１０．０ｇ２．０ｇ２．０ｇｏ、５ｇ２．０ｇ０ｍ１１ｇ２．０ｇ２．５ｇ２．５ｇ０．５ｇ２０ｇ／ｌ）（Ｓ１ｇＩ！ａ２０２−３）ｐＨ５，４実施例２　　（Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培地との
比較：メンプランフィルター法）供試菌株８３株の前培養液を各々滅菌水で適宜希釈し、
約３Ｘ１０１〜２ＣＦＵ／１０ｍ１の菌懸濁液（４本／
株）を調製した。この菌懸濁液をニトロセルロースメン
ブランフィルタ−（アトパンチツク東洋■製、４７關φ
、孔径０．４５μｍ）で吸引濾過した後、このメンブラ
ンフィルタ−（４枚／株）をＲａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、
　３培地及び第１表の本発明培地（５ｍｌ寒天培地１５
０關φプレート、１枚／プレート、２枚／各培地）に移
し、嫌気条件（ガスバック使用）下、２５℃で培養した
。培養４日及び７日後に、メンブランフィルタ−上のコ
ロニーを目視的に観察して、比較した。

結果を第３表に示す。

Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培地では、７日間の培養
で桿菌５３株はいずれも検出可能であったが、球菌３０
株中量５株は検出することはできなかった。これに対し
て、本発明培地（第１表）では供試菌株８３株はいずれ
も目視的に検出可能であった。また、培養期間を４日間
に短縮した場合でも、　Ｒａｋａ−ＲａｙＮｏ、３培地
では供試菌株の約３７％は検出可能であったが、本発明
培地（第１表）では約５０％が、目視的に検出可能であ
った。

本実施例からも、実際の品質管理のために実行される集
菌培養法（メンブランフィルタ−法）においても、本発
明培地（第１表）の有効性が明らかである。

第３表　Ｒａｋａ−Ｒａｙ　Ｎｏ、　３培地と本発明培
地（第１表）の性能評価（メンブランフィルタ−法）実
施例１．２で明らかなように、本発明培地（第１表）は
、従来の乳酸菌用培地（Ｒａｋａ−ＲａｙＮｏ、　３培
地）と比較して、迅速性、回収性に優れた培地である。

実施例３　（ホップ樹脂濃度を低下させたビールを用い
た培地の対比試験：液体培地）実施例１．２で示したように、本発明培地は（第１表）
通常のビールを用いて調製しても、従来の乳酸菌用培地
を凌駕する培地である。

しかし、ビール中のホップ樹脂の低減化について検討し
た結果、ヘキサン処理によりビール乳酸菌の生育がさら
に改善されることが判った。

以下にホップ樹脂濃度を低下させたビールを用いて調製
した培地の対比試験について実施例を記載する。

ホップ樹脂濃度を低下させたビール（ヘキサン処理ビー
ル）は、ビール１２００ｍ１にヘキサン５００ｍ１を加
え、分液ロートを用いて抽出を行なった後、ビール層を
分取し、沸騰石を入れて沸騰（１０分間）させたものを
放冷して調製した。

通常のビールあるいはへキサン処理ビールを用いて調製
した本発明培地（第１表）１０ｍｌを試験管（１８ｍｍ
φＸ１８０ｍｍ）に入れ、供試菌株（約１０３ＣＦＵ／
試験管）を接種した。２５℃で静置培養し、培地での増
殖が確認された時点で、両培地のＯ，Ｄ、　　　　ｎｍ
を測定した。

００通常のビールを用いて調製した培地をコントロール（１
００％）とした場合の増殖結果を第３図に示す。

ヘキサン処理ビールを用いた場合は、すべての菌株の増
殖が著しく促進されており、増殖支持能が更に改善され
たことが明らかである。

実施例４　（シチジン及びチミジンの増殖促進効果：酸
体培地）本発明培地からシチジン及びチミジンを除いた培地（シ
チジン、チミジン無添加培地）を調製して、シチジン及
びチミジンの増殖促進効果を調査した。なお、両培地の
調製には、通常のビールを用いた。

本発明培地（第１表）及びシチジン、チミジン無添加培
地１０ｍ１を試験管（１８ｍｍφ／１８０ａｎ）に入れ
、供試菌株（約１０３ＣＦＵ／試験管）を接種した。２
５℃で静置培養し、増殖が確認された時点で、両培地で
の０．Ｄ、　　　　ｎｍを測定し８０口た。

シチジン及びチミジン無添加培地での０、Ｄ、　　　ｎｍをコントロール（１００％）と００した場合の本発明培地（第１表）での増殖結果を第４図
に示す。

菌）に対する明らかな増殖促進効果が認められた。

実施例５　（ホップ樹脂濃度を低下させたビールを用い
た培地の対比試験：寒天平板培地）通常のビールあるいはへキサン処理ビールを用いて調製
した本発明培地（第１表）各々２０ｍ１を９０ａ＋ｓφ
のプレートに入れ、寒天平板培地を作成した。この寒天
平板培地に、前培養液を滅菌水で適宜希釈し、５０〜３
００ＣＦＵの供試菌株を塗抹し、ガスバ・ツク（ベクト
ンデツキンソン社製）嫌気条件下、２５℃で７日間培養
した後、その増殖状態を比較した。

通常のビールを用いて調製した培地で検出されたコロニ
ー数を１００％として、ヘキサン処理ビールを用いて調
製した培地で回収されたコロニ数（相対値）を第５図に
、また、両培地での供試菌株のコロニーの直径を第６図
に示す。

寒天平板培地の場合には、通常のビールあるいはへキサ
ン処理ビールのいずれを用いても、回収されるコロニー
数及びコロニーの直径には差は認められなかった。

寒天平板培地では、通常のビールを添加した場合でもホ
ップ樹脂による増殖の抑制は認められず、良好な生育支
持能を有する培地を調製することが可能であることが明
らかである。即ち、実際の品質管理で常用される寒天平
板培養では、ビールのへキサン処理が不要である。

実施例６　（核酸関連物質の殖促進効果：液体培地）本発明培地（第１表）からシチジン及びチミジンを除い
た培地をコントロール培地として用いた。

コントロール培地にアデノシン、グアノシン、シチジン
あるいはチミジンを各々０．２ｇ／ｌ添加して、各核酸
関連物資の増殖促進効果を調査した。

なお、培地の調製には、通常のビールを用いた。

各々の培地１０ｍ１を試験管（１８ｍ＋ｓφ×１８０ｍ
１に入れ、供試菌株約１０３ＣＰＬＩ／試験管を接種し
た。２５℃で静置培養し、コントロール培地で増殖が確
認された時点で、コントロール培地でのＯ，Ｄ、　　　
　　ｎｍを１００％とした場００合の、各培地での増殖結果を第７図に示す。

シチジンの添加により、顕著な増殖促進が認められる株
もあったが、供試菌株全てに対して、有効ではなかった
。一方、菌株によっては、核酸関連物質添加により増殖
が抑制される場合が認められた。

シチジン及びチミジンを共に培地に添加することにより
全ての供試菌株に対して増殖促進効果が認められること
は、第４図に示したところである。

【図面の簡単な説明】

図面は、いずれも、種々の培地上での種々の乳酸菌の増
殖の程度を示す棒グラフである。

Claims

【特許請求の範囲】１、シチジン及びチミジン並びに麦芽汁発酵物を添加し
てなる乳酸菌増殖用培地。２、固体培地の形態である、請求項１記載の乳酸菌増殖
用培地。３、麦芽汁発酵物が製品ビールである、請求項１または
２の乳酸菌増殖用培地。