BR112014023272B1

BR112014023272B1 - Método para preparar células para uso cosmético em um procedimento relacionado ao epitélio

Info

Publication number: BR112014023272B1
Application number: BR112014023272-5A
Authority: BR
Inventors: Andrew Quick; William Dolphin
Original assignee: Avita Medical Ltd
Priority date: 2012-03-22
Filing date: 2013-03-14
Publication date: 2022-06-07
Also published as: AU2013202587B2; US20200093952A1; HK1207662A1; BR112014023272A2; EP2828378A1; EP2828378B1; AU2013202587A1; EP3896152A1; US20200093951A1; ES2864772T3; CA2874091C; CA2874091A1; CN104685049A; US20220193301A1; EP2828378A4; US20150079153A1; WO2013142254A1

Abstract

SUSPENSÃO CELULAR E SUA UTILIZAÇÃO. A presente invenção prevê métodos e dispositivos adequados para a produção de uma suspensão de células transplantável de tecidos vivos adequada para promover a regeneração tecidual em um procedimento relacionado ao epitélio, bem como composições produzidas a partir dos mesmos. A suspensão de células pode incluir células viáveis e funcionais em vários estágios de diferenciação, incluindo as células progenitoras/não diferenciadas, bem como aquelas entre essas classificações. Em certas modalidades, a suspensão celular pode ser submetida a um estresse para induzir uma resposta de choque térmico na mesma, ou ser exposta a um agente fornecido exogenamente, tal com o uma proteína de choque térmico ou um fragmento da mesma , ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas e/ou fatores de crescimento. A suspensão de células pode ser aplicada diretamente ao sítio receptor do paciente para a regeneração in vivo, ou ser cultivada ou semeada em uma matriz para o crescimento/regeneração in vitro .

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Esse pedido reivindica a prioridade ao e o benefício dos Pedidos de Patente Provisórios Norte- Americanos Nos. 61/614.112, depositado em 22 de março de 2012, e 61/614.115, depositado em 22 de março de 2012, cujas divulgações são incorporadas na presente invenção por referência em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] Essa invenção refere-se a um método simples, rápido e barato para preparar uma suspensão celular, particularmente uma suspensão compreendendo células epiteliais viáveis, como células não diferenciadas/progenitoras e/ou células diferenciadas. Tal suspensão é útil para tratar um paciente que necessita de um procedimento relacionado ao epitélio. O dispositivo para tal preparação e o uso de sua suspensão também são fornecidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] A regeneração tecidual em seres humanos é extremamente limitada e constitui um grande desafio para a reparação da função do órgão danificado. O tratamento de ferimentos é uma área típica onde a regeneração tecidual é necessária. Ferimentos (lacerações ou aberturas) em tecidos de mamíferos podem resultar no rompimento do tecido e na coagulação da microvasculatura na face da ferida. O reparo de tal tecido representa uma resposta celular ordenada e controlada à lesão. Todos os ferimentos de tecido mole, independentemente do tamanho, cicatrizam de forma semelhante. Os mecanismos de crescimento e reparo tecidual são sistemas biológicos em que a proliferação celular e angiogênese ocorre na presença de um gradiente de oxigênio. As alterações morfológicas e estruturais sequenciais que ocorrem durante o reparo do tecido foram caracterizadas em grandes detalhes e, em alguns casos, elas foram quantificadas. Consulte Hunt, T. K., et al., "Coagulation and macrophage stimulation of angiogenesis and wound healing," The surgical wound, pp. 1-8, ed. F. Dineen & G. Hildrick-Smith (Lea & Febiger, Philadelphia: 1981).

[004] A regeneração de tecidos em vários órgãos, como a pele ou o coração, depende do tecido conjuntivo que restaura o fornecimento de sangue e permite que as células específicas de órgãos residuais, como queratinócitos ou células musculares, restabeleçam a integridade do órgão. Assim, uma função relevante das células mesenquimais, por exemplo, dos fibroblastos ou, além disso, das células endoteliais da vasculatura é a secreção de fatores que melhoram o processo de cicatrização, por exemplo, fatores que promovem a formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese) ou fatores que promovem a re-epitelização por proliferação e migração dos queratinócitos.

[005] A morfologia celular de um ferimento consiste em três zonas distintas. O espaço do ferimento avascular central é deficiente em termos de oxigênio, acidótico e hipercárbico, e tem níveis elevados de lactato. É adjacente ao espaço do ferimento uma zona de gradiente de isquemia local, que é preenchida por fibroblastos em divisão. Atrás da zona principal está uma área de síntese de colágeno ativa caracterizada por fibroblastos maduros e vários capilares recém-formados (ou seja, neovascularização). Embora o crescimento de novos vasos sanguíneos (angiogênese) seja necessário para a cicatrização do tecido ferido, os agentes angiogênicos geralmente são incapazes de atender a necessidade de longas datas de proporcionar os efeitos biossintéticos adicionais de reparação tecidual. Além do ferimento agudo (por exemplo, queimadura ou laceração causada por trauma), ferimento artificialmente criado (por exemplo, em um sítio doador de enxerto, indicação estética, procedimento plástico ou tratamento dérmico), o ferimento crônico (por exemplo, úlceras venosas ou diabéticas) e outras indicações, como remodelação de cicatriz, lesões de perda de pele lisa, problemas de pigmentação, vitiligo, leucoderma e procedimentos de rejuvenescimento cosmético também requerem substâncias terapêuticas rápidas e eficientes. Apesar da necessidade de cicatrização de feridas mais rápida (por exemplo, queimaduras graves, incisões cirúrgicas, lacerações e outros traumas), até o momento, tem havido somente sucesso limitado na aceleração da cicatrização de feridas com agentes farmacológicos.

[006] O objetivo principal no tratamento convencional dos ferimentos é conseguir o fechamento do ferimento. Ferimentos cutâneos abertos representam uma grande categoria de ferimentos. Essa categoria inclui úlceras cirúrgicas e traumáticas, por exemplo, crônicas, ferimentos de queimadura, bem como ferimentos crônicos, como úlceras neuropáticas, feridas de pressão, (estase) arterial e venosa ou úlceras arteriovenosas mistas, e úlceras diabéticas. Ferimentos cutâneos abertos curam rotineiramente por um processo que compreende seis componentes principais: i) inflamação, proliferação de fibroblastos ii), proliferação de vasos sanguíneos, iv) síntese do tecido conjuntivo, v) epitelização e vi) contração do ferimento. A cicatrização de feridas é prejudicada quando esses componentes, individualmente ou como um todo, não funcionam corretamente. Vários fatores podem afetar a cicatrização de feridas, incluindo desnutrição, infecção, agentes farmacológicos (por exemplo, fármacos citotóxicos e corticosteroides), diabetes e idade avançada. Consulte See Hunt et al, in Current Surgical Diagnosis & Treatment (Way; Appleton & Lange), pp. 86-98 (1988).

[007] Ferimentos de pele que não saram facilmente podem causar sofrimento físico, emocional e social considerável ao indivíduo, bem como elevada despesa financeira. Consulte, por exemplo, Richey et al, Annals of Plastic Surgery 23(2): 159-65 (1989). De fato, ferimentos que não conseguem cicatrizar corretamente podem exigir tratamentos cirúrgicos agressivos, como enxerto de pele autólogo (onde as folhas da pele são enxertadas) ou enxerto de derme cultivado. Por exemplo, procedimentos de autoenxerto epitelial cultivado (CEA) fazem com que as células da pele do paciente desenvolvam novas células de pele em folhas em um laboratório. As novas folhas são utilizadas como enxertos. No entanto, a taxa de transferência desses enxertos não é satisfatória. Consulte, por exemplo, Sood et al, Journal of Burn Care Research 31(4):559-68 (2010). Procedimentos de enxerto mais recentes combinam CEA com uma matriz, para maior suporte. Por exemplo, são atualmente disponíveis como derme cultivada ou manipulada produtos tendo diferentes matrizes, nas quais os fibroblastos são incorporados, como TransCyte® e Dermagraft®. No entanto, esses produtos não são eficientes na indução de epitelização em grandes ferimentos. A pele cultivada/manipulada incorporando células epidérmicas e fibroblastos são disponíveis, como Apligraf® (NOVARTIS Pharma) e VivoDerm® (Bristol-Myers Squibb). No entanto, há problemas em relação à afinidade entre a camada epidérmica cultivada e a camada dérmica, e insuficiência no efeito clínico pode ocorrer.

[008] Uma necessidade por uma cicatrização de feridas melhorada e, mais amplamente, a técnica de regeneração tecidual existe. A presente invenção fornece uma suspensão celular autóloga adequada para aplicação em vários sítios receptores, que podem ser usados sem considerar o tipo ou o tecido do ferimento ou a natureza da população de pacientes. Métodos para preparar e/ou usar a dita suspensão, bem como dispositivos para preparação, também são fornecidos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção refere-se a uma única suspensão celular e a um método para a sua preparação, que seja rápida, eficiente e simples de preparar e aplicar. Ela também refere-se a um método para o tratamento de um paciente que necessita de um procedimento relacionado ao epitélio usando a suspensão celular única, que não promove apenas a cicatrização/fechamento da ferida, mas também a regeneração tecidual. A presente invenção pode ser aplicada a qualquer procedimento relacionado ao epitélio para promover a regeneração tecidual, incluindo o epitélio da pele (por exemplo, o epitélio glabro), epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio glandular, epitélio córneo e similares. Um aparelho adequado para uso no método de preparação e/ou tratamento também é fornecido. O uso do dispositivo descrito é útil para a prática do método da presente invenção, e verificou-se que ele reduz significativamente o tempo usado em procedimentos alternativos e a complexidade associada ao uso das tecnologias de enxerto convencionais. Além disso, a suspensão celular da presente invenção fornece células vivas e funcionais que podem ser estar presentes em uma grande área em ou sobre o corpo do paciente, ou em uma matriz, estrutura ou substrato in vitro ou in situ, em um sítio receptor. Os clínicos poderiam, de outro modo, ter acesso limitado ou ausente a tais células epiteliais autólogas.

[0010] De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecida uma suspensão celular para uso em um procedimento relacionado ao epitélio. A suspensão celular inclui uma população de células, incluindo células viáveis, uma população de células incluindo células viáveis derivadas de uma amostra de tecido epitelial. As células viáveis podem estar em várias etapas de diferenciação e serem funcionais (por exemplo, efetuar as suas funções pré- programadas, como sinalização, produção de certas proteínas, secreção de determinados fatores, migração ou proliferação). As células podem incluir células maduras/diferenciadas, bem como células capazes de dividir ou se diferenciar. As células viáveis também podem estar em um estado migratório e proliferativo. A população de células, antes de serem utilizadas em um procedimento relacionado ao epitélio, é exposta a uma condição selecionada do grupo consistindo em estresse e um agente exógeno. Em algumas modalidades, a população de células pode apresentar uma característica induzida por estresse. Em tais modalidades, tal característica induzida por estresse pode fazer com que as células expressem a(s) proteína(s) que medeia(m) o processo de cura. Em certas modalidades, o(s) agente(s) ou componente(s) exógeno(s), como a(s) proteína(s) de choque térmico, ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, fator(es) de crescimento, citocina(s) e/ou células tronco adiposas podem ser fornecidos à população de células. A população de células, com ou sem o(s) agente(s) exogenamente fornecido(s), quando usada no dito referido procedimento relacionado ao epitélio e aplicada ao sítio receptor do paciente in vivo, pode promover o tratamento, cura, reconstrução, reaparecimento, repigmentação e/ou regeneração dos tecidos epiteliais. A população de células também pode ser semeada em uma matriz ou estrutura de substrato (in vitro ou in situ), onde as células podem, por exemplo, crescer para formar um tecido ou órgão artificial.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição para uso em um procedimento relacionado ao epitélio. A composição inclui uma população de células, incluindo células viáveis, uma população de células incluindo células viáveis derivadas de uma amostra de tecido epitelial. As células viáveis podem estar em vários estágios de diferenciação, e incluem células maduras/diferenciadas que estão funcionando, bem como células capazes de se dividir ou diferenciar. As células também podem estar em um estado migratório e proliferativo. A população de células, antes de serem utilizadas em um procedimento relacionado ao epitélio, é exposta a uma condição selecionada do grupo consistindo em estresse e um agente exógeno. A composição pode incluir, por exemplo, uma proteína de choque térmico expressa pelas células sob estresse, ou uma proteína de choque térmico isolada ou recombinante, ou um fragmento da mesma. A proteína de choque térmico pode estar em uma quantidade eficaz para promover a cicatrização da pele em um paciente em necessidade disso. Em algumas modalidade, a composição pode incluir ainda um agente exógeno ou fornecido externamente, ou um componente como o ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas fator(es) de crescimento, citocina(s) e/ou células tronco adiposas. A composição, quando usada em um procedimento relacionado ao epitélio e aplicada ao sítio receptor do paciente in vivo, pode promover o tratamento, cura, reconstrução, reaparecimento, repigmentação e/ou regeneração dos tecidos epiteliais. A composição também pode ser aplicada a uma matriz, estrutura ou substrato in vitro ou in situ, onde as células podem crescer (por exemplo, ser cultivadas in vitro ou se multiplicar in situ) para formar, por exemplo, um órgão ou tecido artificial.

[0012] Em ainda outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a preparação e uso de células em um procedimento relacionado ao epitélio. O método inclui: fornecer uma população de células, incluindo células viáveis e funcionais, derivadas de uma amostra de tecido epitelial; e expor a população de células a uma condição selecionada do grupo consistindo em estresse e um agente exógeno. As células viáveis podem estar em vários estágios de diferenciação, e incluem células maduras/diferenciadas que estão funcionando, bem como células capazes de se dividir ou diferenciar. As células também podem estar em um estado migratório e proliferativo. Em algumas modalidades, o método inclui induzir a expressão de uma proteína de choque térmico pela população de células, obtendo assim as células para uso em um procedimento relacionado ao epitélio que têm um elevado nível da dita proteína de choque térmico em comparação com um nível controle da dita proteína de choque térmico, sem a dita condição de estresse. Em algumas modalidades, o agente exógeno pode ser um ou mais dentre ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, fator(es) de crescimento, citocina(s) e/ou células tronco adiposas.

[0013] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a preparação e uso de células em um procedimento relacionado ao epitélio. O método inclui: aplicar, a um sítio receptor em um paciente em necessidade disso, uma população de células, incluindo células viáveis derivadas de uma amostra de tecido epitelial; e fornecer à população de células uma condição selecionada do grupo consistindo em estresse e um agente exógeno para promover o tratamento epitelial, cicatrização, reconstrução, reaparecimento, repigmentação e/ou regeneração no dito paciente. Em algumas modalidades, a condição é o estresse, que pode induzir as células a expressar uma proteína de choque térmico, ou uma proteína de choque térmico isolada ou recombinante, ou um fragmento da mesma fornecido exogenamente, em uma quantidade eficaz para promover o tratamento, cura, reconstrução, reaparecimento, repigmentação e/ou regeneração do epitélio no dito paciente. Em algumas modalidades, a proteína de choque térmico exógena pode ser fornecida separadamente ou em combinação com a população de células ao sítio receptor no paciente. Em certas modalidades, o agente exógeno pode ser um ou mais dentre ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, fator(es) de crescimento, citocina(s) e/ou células tronco adiposas.

[0014] Em certas modalidades, quando a amostra de tecido epitelial é uma amostra de tecido da pele, as células viáveis podem ser derivadas de uma camada dérmica, uma camada epidérmica ou de uma camada dérmica e uma camada epidérmica da amostra de tecido da pele, e a população de células pode compreender queratinócitos, melanócitos, fibroblastos, células de Langerhans ou qualquer combinação das mesmas. Em algumas modalidades, a população de células pode incluir células-tronco da pele e/ou outras células da pele.

[0015] Em algumas modalidades, a característica induzida por estresse é um nível elevado de expressão de uma proteína selecionada do grupo consistindo em Hsp90 e Hsp90a. A característica induzida por estresse pode estar associada com hipóxia, calor, trauma mecânico, privação de nutrientes, exposição de enzima ou outras manipulações indutoras de estresse.

[0016] Em certas modalidades, quando a amostra de tecido epitelial é a amostra de tecido da pele, o procedimento relacionado ao epitélio compreende o tratamento de ferimento da pele, enxerto de tecido da pele, procedimento estético da pele ou tratamento dérmico. O ferimento da pele pode ser um ferimento agudo, ferimento artificialmente criado ou um ferimento crônico. A amostra de tecido epitelial também pode ser obtida do epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio da córnea ou epitélio glandular, e as células derivadas dos mesmos podem ser usadas para tratar doenças epiteliais correspondentes.

[0017] Outros aspectos e vantagens da invenção serão evidentes para as pessoas versadas na técnica a partir da descrição a seguir, que prossegue tendo como referência aos seguintes desenhos ilustrativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0018] A figura 1 ilustra uma típica estrutura e composição de um tecido da pele.

[0019] A figura 2A ilustra uma vista em perspectiva de um aparelho exemplificador com a tampa aberta e um segundo membro no lugar.

[0020] A figura 2B ilustra uma vista em perspectiva do aparelho exemplificador com a tampa aberta e o segundo membro removido e invertido.

[0021] A figura 3A ilustra uma vista em perspectiva de um primeiro membro do aparelho exemplificador.

[0022] A figura 3B ilustra uma vista posterior em perspectiva do primeiro membro do aparelho exemplificador.

[0023] A figura 4 ilustra uma vista em perspectiva da base do aparelho exemplificador.

[0024] A figura 5 mostra os resultados do ensaio de viabilidade celular dos queratinócitos usando diferentes hidrogéis do ácido hialurônico.

[0025] A figura 6 mostra os resultados do ensaio de migração entre poços dos queratinócitos usando diferentes hidrogéis do ácido hialurônico.

[0026] A figura 7 mostra os resultados do ensaio de arranhão in vitro dos queratinócitos usando diferentes hidrogéis do ácido hialurônico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0027] As pessoas versadas na técnica perceberão que a invenção descrita na presente invenção é adaptável às variações e modificações além daquelas especificamente descritas. Deve ser compreendido que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados no relatório descritivo, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações, ou quaisquer duas ou mais das etapas ou características.

[0028] A presente invenção não deve ser limitada em escopo pelas modalidades específicas descritas na presente invenção, que são destinadas apenas para fins de exemplificação. Produtos, composições e, onde for apropriado, métodos funcionalmente equivalentes estão claramente dentro do escopo da invenção, conforme descrito na presente invenção.

[0029] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações a seguir, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra “compreendem”, ou variações como "compreende" ou "compreendendo" serão compreendidas como significando a inclusão de um número inteiro estabelecido ou grupo de números inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

[0030] Tendo em conta o acima exposto, essa invenção fornece um método e um dispositivo exclusivo adequados para a produção de uma suspensão celular de tecido vivo, adequado para a aplicação a um paciente em um procedimento relacionado ao epitélio. Ao aplicar o método e/ou ao usar o dispositivo, um tecido doador (por exemplo, o epitélio da pele como epitélio glabro, epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio da córnea e epitélio glandular) é coletado de um paciente e submetido a um meio de dissociação de tecido, e as células adequadas para aplicar novamente a um sítio receptor do mesmo paciente são coletadas. Em algumas modalidades, as células assim coletadas podem ser cultivadas e expandidas in vitro antes da aplicação a um sítio receptor. As células também podem ser semeadas a uma estrutura, matriz ou substrato, onde as células podem crescer e/ou proliferar em um órgão ou tecido regenerado.

[0031] Em determinadas modalidades, as células incluem células-tronco (por exemplo, células capazes de se dividir ou diferenciar) e células que não são células tronco (por exemplo, células em vários estágios de diferenciação, incluindo células diferenciadas e funcionais). Vários órgãos baseiam-se em células tronco e progenitoras não diferenciadas para a regeneração tecidual. No entanto, não está claro se as células tronco residentes são capazes de regenerar toda a massa de tecido necessária para uma determinada lesão. Além disso, as células tronco não foram ainda identificadas para uma série de tecidos, e naqueles tecidos em que as células tronco foram identificadas, os fatores necessários para induzir a sua propagação e diferenciação para adquirir os destinos das células nestes tecidos não são totalmente compreendidos. Desse modo, há uma necessidade por métodos de indução de células diferenciadas bem definidos de identidade conhecida, para contribuir para a substituição celular e regeneração tecidual in vivo. A presente invenção, incluindo tanto as células tronco quanto as células que não são células tronco em uma suspensão celular, fornece um meio para a regeneração tecidual melhorada.

[0032] As células podem ser apresentadas sob a forma de uma suspensão celular (usada de forma intercambiável com a “suspensão celular” neste documento) em uma solução que é apropriada para a dispersão imediata (por exemplo, imediatamente após a coleta e/ou filtração sem o cultivo in vitro das células) no sítio receptor. A suspensão celular pode ser dispersa (imediatamente após a coleta ou depois do cultivo in vitro) no sítio receptor sozinha ou em combinação com fator(es) adicional/adicionais, como a(s) proteína(s) de choque térmico, ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, fator(es) de crescimento e/ou células tronco adiposas, para facilitar, por exemplo, a cicatrização de feridas, o ressurgimento da pele ou outros tratamentos epiteliais. A suspensão celular pode ser dispersa através de pulverização, gotejamento ou qualquer outro processo de aplicação. A suspensão celular também pode ser injetada diretamente em um tecido.

[0033] A invenção do assunto tem muitas vantagens sobre as técnicas de enxerto de tecido anteriormente conhecidas, sendo algumas das quais ilustradas como a seguir: 1. A invenção do assunto fornece um método eficiente em termos de tempo para a preparação de uma suspensão celular, que pode ser prontamente fornecida a um sítio receptor em um cenário clínico. Por exemplo, as células podem ser rapidamente coletadas e processadas, quando necessário, no momento da cirurgia. Isso é conseguido por um tempo de preparação muito curto das células, permitindo que o tratamento epitelial seja realizado de modo perioperatório, ou nos consultórios de um médico especialista ou clínico geral. 2. A invenção do assunto fornece um método e um aparelho que reduz significativamente a complexidade associada com o uso de métodos convencionais, e é particularmente útil em casos de lesão urgente (por exemplo, queimadura) que não foram apresentadas ao médico a tempo. Em alguns casos, as células para enxerto podem não estar disponíveis no momento da cirurgia, devido ao encaminhamento atrasado de um paciente com uma queimadura não cicatrizada ou simplesmente porque o tempo necessário para o cultivo autoenxertos excedeu a preparação que o receptor poderia fixar. A presente invenção acelera significativamente a preparação da célula e a melhora o problema de tempo de preparação do enxerto em comparação com o CEA. 3. A invenção do assunto auxilia na obtenção de uma rápida cobertura celular em áreas dos sítios doador para o receptor. Ela fornece um meio para reduzir o tamanho dos sítios doadores, uma vez que o sítio doador da biopsia utilizado na presente invenção é consideravelmente menor do que um sítio doador de enxerto necessário pelos métodos convencionais. Como tal, a presente invenção melhora a taxa de expansão da cobertura celular dos sítios doador ao receptor; ela também melhora a taxa de cicatrização de ferimentos agudos (como queimaduras e lacerações) e ferimentos crônicos (como úlceras venosas ou diabéticas), é útil para reconstruções de pele (tal como a remoção de cicatrizes ou outras indicações estéticas) e melhora a qualidade da cicatriz e/ou minimiza as cicatrizes. 4. A invenção do assunto melhora problemas associados com o uso de meios ou soluções utilizados durante o processo convencional de cultivo de tecidos que requerem soro xenogênico para o paciente. De acordo com o método de preparação e tratamento da presente invenção, as células podem estar sob a forma de uma suspensão celular, em uma solução nutriente que é isenta de soro xenogênico para o paciente. Tal suspensão celular pode, então, ser aplicada, dispersa ou colocada diretamente sobre o sítio receptor, reduzindo ou eliminando as chances de infecções, transmissões virais ou outras complicações associadas com o soro xenogênico. 5. A invenção do assunto fornece um meio para o tratamento de várias anormalidades, distúrbios ou doenças da pele. Por exemplo, ela pode ser usada para o reaparecimento da epiderme, a substituição após perda de pele, a correspondência de sítio durante a repigmentação de uma área da pele, o tratamento de ferimentos de queimadura, o tratamento de leucodermia, o tratamento do vitiligo, o tratamento do piebaldismo, o tratamento de cicatrizes (causadas, por exemplo, por cicatrização de feridas incorreta, direção imprópria de cicatriz ou distorção de cicatriz da contração do ferimento), tratamento de cicatrizes de acne, dermoabrasão cosmética de renovação, melhoria de indicações estéticas, como em procedimentos plásticos ou reconstrutivos, renovação após tratamento com laser e em associação com a reconstrução dérmica, tratamento de “ferimento” artificial, onde a pele estava intacta, mas um "ferimento" é criado (por exemplo, através de laser ou queimadura dérmica, ou dermoabrasão, ou em um sítio doador de enxerto), acelerando a cicatrização de feridas e/ou a minimização de ferimentos. Além disso, o método, a suspensão celular e a composição da presente invenção podem ser utilizados para terapia de reposição celular, incluindo, por exemplo, o tratamento de substituição de células nervosas, o tratamento de substituição de células epiteliais (tais como células uroteliais, célula da mucosa bucal e células epiteliais respiratórias), tratamento de substituição de células endoteliais e tratamento de substituição de células precursoras osteogênicas. Além disso, a presente invenção pode ser aplicada a qualquer procedimento relacionado ao epitélio, incluindo o epitélio da pele, tal como o epitélio glabro, epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio glandular, epitélio córneo e similares. Ou seja, enquanto algumas modalidades são descritas juntamente com um procedimento relacionado à pele, as mesmas podem ser aplicadas aos tecidos epiteliais que não são da pele, com pequenas modificações que estão bem compreendidas no nível de habilidades comuns na técnica. 6. A presente invenção fornece um meio para produzir uma suspensão de células de vários tipos diferentes, em que a quantidade de cada tipo de células está em uma razão em relação a outra que é comparável, ou substancialmente igual à razão dos tipos celulares detectáveis in situ no sítio doador e/ou receptor do paciente. Ou seja, devido à forma original de preparação da suspensão celular, a porcentagem relativa dos diferentes tipos celulares (no caso do tecido da pele, tais como os queratinócitos, células de Langerhans, fibroblastos e melanócitos) normalmente tem a mesma porcentagem que a do sítio doador, onde as células são coletadas (no caso do tecido da pele, perto da junção dérmica-epidérmica). As células assim preparadas também apresentam taxas de sobrevivência maiores em comparação com as técnicas de cultura de tecidos padrão, onde o cultivo de células seletivo padrão pode resultar na perda de certos tipos celulares, enquanto outros tipos de células crescem mais que elas. Isso fornece, por exemplo, a vantagem de permitir a correta renovação ou repigmentação da pele após um enxerto de pele ou outro tratamento ou procedimento. 7. A invenção do assunto permite uma cirurgia e cicatrização mais rápida, reduzindo através disso o trauma para pacientes durante o tratamento médico. 8. A invenção do assunto fornece, no caso dos tecidos da pele, uma suspensão de células-tronco da pele a. Como as células-tronco da pele são geralmente encontradas na camada basal da epiderme e na base dos folículos pilosos, a presente invenção permite a coleta orientada dessas células de perto da junção dérmica-epidérmica e das camadas dérmica e/ou epidérmica da pele. As células tronco da pele podem incluir células tronco epidérmicas e células tronco foliculares. Normalmente, as células tronco epidérmicas são responsáveis pela regeneração das diferentes camadas da epiderme. As células tronco dos melanócitos dão origem aos melanócitos, e as células tronco foliculares podem dar origem aos folículos pilosos e à epiderme. Além disso, a base dos folículos pilosos também é uma fonte rica de melanócitos, que pode ser útil para a cicatrização de feridas e pode ser incluída na suspensão celular da presente invenção.

Preparação da suspensão celular

[0034] De acordo com o primeiro aspecto da invenção, é fornecido um método para a preparação de uma suspensão celular adequada para o uso no tratamento, cura, reconstrução, renovação e/ou regeneração dos tecidos epiteliais.

[0035] Em uma modalidade, o tecido da pele (de preferência de natureza autóloga à do paciente receptor) pode ser coletado de um paciente por meios conhecidos na técnica de enxerto ou regeneração de tecidos. Isto pode ser conseguido tomando-se uma biópsia de tecido de espessura total ou de espessura dividida, de um sítio doador do paciente. Com a coleta da biópsia, consideração inclui a profundidade da biópsia e o tamanho da área superficial. A profundidade e o tamanho da biópsia podem afetar a facilidade com a qual o procedimento pode ser realizado e/ou a velocidade com a qual o paciente se recupera do procedimento. Em uma modalidade, o sítio doador pode ser escolhido para corresponder com o sítio receptor, por exemplo, o tecido pós-auricular para a cabeça e pescoço, a coxa para os membros inferiores, o braço interno superior para os membros superiores, ou a palma da mão para a sola, ou vice-versa.

[0036] A biópsia ou amostra de tecido coletado do sítio doador pode, em seguida, ser submetida a meios de dissociação físicos e/ou químicos capazes de dissociar o estrato celular na amostra de tecido, quebrando, dessa forma, a amostra de tecido em pedaços menores, ou pelo menos tornando camadas diferentes (por exemplo, da derme e epiderme) da amostra de tecido mais facilmente separáveis.

[0037] Vários métodos para a desassociação de camadas celulares dentro dos tecidos conhecidos na técnica podem ser usados. Por exemplo, os meios de dissociação podem ser um meio físico ou um meio químico, ou uma combinação de ambos. Os meios físicos de desassociação podem incluir, por exemplo, raspagem da amostra de tecido com um bisturi, moagem de tecido, separação das camadas por corte físico, usando um pilão, almofariz de malha ou ralador para dissociar e/ou perfundir o tecido. Meios de dissociação química podem incluir, por exemplo, digestão com enzimas como tripsina, dispase, colagenase, tripsina- EDTA, termolisina, pronase, hialuronidase, elastase, papaína e pancreatina. Soluções não enzimáticas para a dissociação do tecido também podem ser usadas.

[0038] Em certas modalidades, a dissociação da amostra de tecido pode ser conseguida colocando-se a amostra de tecido em uma solução enzimática que contém uma quantidade de enzima suficiente para dissociar o estrato celular da amostra de tecido. Isso pode ser conseguido, por exemplo, usando uma solução de tripsina. Outras enzimas ou proteases também podem ser usadas, como a dispase, colagenase, tripsina-EDTA, termolisina, pronase, hialuronidase, pancreatina, elastase e papaína. Sem desejar se ater à teoria, acredita-se que tais enzimas façam com que as células se solvem de outras células, ou formem superfícies sólidas através de proteólise das proteínas extracelulares. Quando a enzima utilizada é a tripsina, a solução enzimática pode ser isenta de cálcio e magnésio. Uma tal solução, por exemplo, é solução salina tamponada com fosfato isenta de íons cálcio e magnésio.

[0039] Onde a amostra de tecido é derivada da pele do paciente (que inclui tanto a epiderme quanto a derme), a quantidade de tripsina ou outra enzima usada no método pode ser entre cerca de 0,1% e 5% de tripsina ou outra enzima por volume de solução. Em certas modalidades, a tripsina ou outra concentração de enzima pode ser de cerca de 0,25% a 2,5%, ou de cerca de 0,5%. As pessoas versadas na técnica compreenderão que a experimentação da concentração ideal da enzima é a experimentação de rotina.

[0040] A duração de tempo necessária para a qual a amostra de tecido é submetida à solução enzimática pode variar, dependendo do tamanho da amostra (por exemplo, espessura e área superficial). Tipicamente, quanto maior é o tamanho da amostra, mais tempo a amostra deve ser submetida à solução enzimática. Em algumas modalidades, a amostra de tecido pode ser colocada na solução por um tempo suficiente para enfraquecer a ligação, ou a ligação entre as camadas de tecido (por exemplo, entre a epiderme e a derme). Por exemplo, onde a amostra de tecido é coletada da pele do paciente, a amostra pode ser colocada na solução enzimática desde alguns segundos até algumas horas, ou por um período de 5 a 60 minutos. Preferencialmente, a amostra de tecido é imersa na solução enzimática durante entre 10 e 30 minutos, ou de 15 a 20 minutos. As pessoas versadas na técnica compreenderão que a experimentação do tempo ideal de tratamento da enzima é experimentação de rotina.

[0041] Após a amostra de tecido tem sido imersa na solução de tripsina (ou outra solução de enzima) por um período de tempo suficiente, a amostra pode ser removida da solução e lavada com uma solução nutriente. A lavagem da amostra de tecido pode envolver a imersão completa ou parcial da amostra tratada com enzima na solução nutriente. Alternativamente, a solução de lavagem pode ser gotejada ou dispersa sobre a amostra de tecido em um volume suficiente para remover e/ou diluir significativamente qualquer solução enzimática em excesso da amostra de tecido. Em certas modalidades, após diluição ou lavagem, não resta mais de 0,05% de tripsina ou outra enzima.

[0042] A solução nutriente pode reduzir ou remover significativamente o efeito da enzima por diluição e/ou neutralização. A solução nutriente pode ser: (i) isenta de soro xenogênico ao paciente, (ii) capaz de manter a viabilidade das células coletadas e (iii) ser adequada para a aplicação direta a um sítio receptor no paciente. A solução nutriente pode ser qualquer uma desde uma solução salina básica até uma solução nutriente mais complexa. Em algumas modalidades, a solução nutriente pode conter vários sais que se assemelham àqueles encontrados nos líquidos corporais, como uma solução salina fisiológica. A solução nutriente pode ser completamente isenta de soro. Fosfato ou outras substâncias não tóxicas também podem tamponar a solução para manter o pH em níveis aproximadamente fisiológicos. Uma solução nutriente adequada é a solução de Hartmann.

[0043] Depois de lavar a amostra de tecido com a solução nutriente, a amostra de tecido pode ser suavemente retirada, permitindo que as células viáveis e funcionais sejam coletadas da amostra de tecido. As células podem incluir células tronco capazes de se reproduzir (por exemplo, por divisão ou diferenciação), bem como células que não são células tronco diferenciadas que realizam funções específicas (por exemplo, função de melanócitos para produzir melanina). É uma vantagem da presente invenção a inclusão de células que não são células tronco que são funcionais, que podem ajudar a promover o tratamento, cura, reconstrução, renovação, repigmentação e/ou a regeneração dos tecidos epiteliais. Onde a amostra de tecido é a pele, a camada da epiderme pode ser raspada primeiro para expor a junção dérmica-epidérmica, onde a superfície inferior da epiderme e a superfície superior da derme se encontram; em seguida, as células na junção dérmica-epidérmica e a camada dérmica também podem ser raspadas. As células assim coletadas incluem as células tronco e as células que não são células tronco da pele.

[0044] Conforme ilustrado na figura 1, a epiderme da pele contém queratinócitos, melanócitos, células de Langerhans e células de Merkel. A epiderme forma a superfície da pele. Ela é composta de várias camadas de células chamadas queratinócitos. Os queratinócitos na camada basal, germinativa ou estrato (também conhecidos como células basais queratinócitos ou queratinócitos basais) sofrem mitose e se proliferam. Os queratinócitos que sofrem diferenciação se movem progressivamente em direção ao estrato espinhoso, onde eles passam a apresentar forma poliédrica e começam a produzir filamentos tono. Os queratinócitos são o tipo celular mais abundante na epiderme. Os melanócitos se localizam na camada basal da epiderme e representam de uma em cada cinco a dez células na mesma. Os melanócitos produzem o pigmento melanina e, portanto, desempenham um papel importante na pigmentação da pele e do folículo piloso. As células de Langerhans residem suprabasalmente, e representam cerca de 1% das células da epiderme.

[0045] Ainda com referência à figura 1, a derme se encontra abaixo da epiderme e contém apêndices de pele: folículos pilosos, glândulas sebáceas (oleosas) e glândulas sudoríparas. Os tipos de células na derme incluem fibroblastos dérmicos, que produzem a matriz de apoio intercelular (por exemplo, colágenos e elastina) e podem ter um papel na cicatrização de feridas, bem como os mastócitos, macrófagos, melanócitos, células de Merkel e células pertencentes ao sistema imunológico e apêndices de pele.

[0046] As células capazes de se reproduzir podem incluir células tronco da pele e/ou fibroblastos. As células tronco da pele podem incluir células tronco epidérmicas, células tronco de melanócitos e células tronco foliculares. As células tronco epidérmicas são encontradas na camada basal da epiderme e são responsáveis pela regeneração diária das diferentes camadas da epiderme. As células tronco dos melanócitos são responsáveis pela regeneração dos melanócitos. As células tronco foliculares garantem a constante renovação dos folículos pilosos e também podem regenerar a epiderme e as glândulas sebáceas, se esses tecidos estiverem danificados. As células tronco do folículo piloso são encontradas em todos os folículos pilosos.

[0047] As células coletadas de toda a amostra de pele, incluindo a epiderme, derme e a junção dérmica- epidérmica, portanto, podem incluir células tronco e/ou fibroblastos. Em certas modalidades, as células coletadas podem incluir queratinócitos, células tronco dos melanócitos, melanócitos, fibroblastos e/ou as células de Langerhans. Essas células podem ser coletadas da amostra de tecido por qualquer meio apropriado conhecido na técnica. Por exemplo, as células podem ser removidas da superfície da amostra, começando desde a epiderme até substancialmente todas as células na amostra serem coletadas, utilizando um instrumento como um bisturi. As células também podem ser desagregadas sendo forçadas através de uma tela de malha de tamanho apropriado. Em uma modalidade, as células assim coletadas incluem, mas não se limitam, aos queratinócitos, células de Langerhans, fibroblastos e melanócitos. Após a coleta das células da amostra de tecido, elas estão presentes na solução nutriente em uma forma suspensa (por exemplo, dispersas).

[0048] A suspensão celular pode, então, ser filtrada. A filtração pode ser usada para remover ou coletar congregados de células excessivamente grandes, a fim de evitar o entupimento do aplicador e facilitar uma distribuição uniforme da suspensão celular ao sítio receptor. Qualquer meio de filtração capaz de separar congregados de células excessivamente grandes da suspensão pode ser utilizado nesta etapa preferencial da invenção. Em uma modalidade, o tamanho do filtro pode ser entre 50 μm e 200 μm, entre 75 μm e 150 μm ou igual a cerca de 100 μm.

[0049] Antes da aplicação/dispersão ao sítio receptor ou imediatamente após a filtração, a suspensão celular pode ser diluída para proporcionar uma densidade celular apropriada adequada, com a finalidade para a qual a suspensão deve ser usada.

Uso da suspensão celular

[0050] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecida uma suspensão celular aquosa produzida pelo método descrito na presente invenção. A suspensão celular fornecida por esse método é adequada para uso em vários procedimentos relacionados ao epitélio. Uma importante vantagem do uso de tal suspensão nos procedimentos relacionados ao epitélio é a possibilidade de expandir muito a área, o tamanho ou o volume de um ferimento ou sítio receptor que pode ser tratado rapidamente pela multiplicação in situ de um número limitado de células capazes de se reproduzir. Onde a pele está envolvida, o procedimento relacionado ao epitélio pode ser o tratamento do ferimento da pele, enxerto de tecido da pele, procedimento estético da pele ou outro tratamento epidérmico e/ou dérmico. A aplicação da suspensão celular uniformemente sobre o ferimento mimetiza a capacidade de cicatrização da pele pré-natal, de modo que a ferida pode sarar uniformemente e fechar rapidamente, sendo completamente coberta pela suspensão celular, resultando em estrutura e função otimizadas. O ferimento da pele pode ser um ferimento agudo (por exemplo, queimadura ou laceração causada por trauma), ferimento artificialmente criado (por exemplo, em um sítio doador de enxerto, indicação estética, procedimento plástico ou tratamento dérmico) ou ferimento crônico (por exemplo, úlceras venosas ou diabéticas). Outras indicações adequadas incluem remodelação de cicatriz, lesões de perda de pele lisa, problemas de pigmentação, vitiligo, leucoderma e procedimentos de rejuvenescimento cosmético. Em várias modalidades, o número e/ou a concentração de células semeadas sobre o sítio receptor pode variar, dependendo do procedimento e/ou do sítio receptor, por exemplo, por modificação da concentração de células na suspensão e/ou usando uma quantidade adequada de suspensões que são distribuídas em uma determinada área ou volume do sítio receptor.

[0051] Ao colocar as células em uma solução nutriente que é pelo menos (i) isenta de soro xenogênico ao paciente, (ii) é capaz de manter a viabilidade das células coletadas e (iii) adequado para aplicação direta a um sítio receptor no paciente, verificou-se que o resultado do tratamento do paciente é melhorado. Sem desejar se ater à teoria, uma explicação parcial pode ser atribuível à exclusão do soro xenogênico e, em certas modalidades, de qualquer soro da suspensão celular. O soro xenogênico é um aditivo comum no meio de cultura de enxerto padrão e era suspeito de causar problemas de hipersensibilidade e potencial infeccioso. Tal soro, no entanto, é geralmente necessário para a expansão in vitro padrão das células e para neutralizar a ação da tripsina. A solução nutriente usada na presente invenção não precisa de tal soro porque a população de células na suspensão não requer expansão ou multiplicação antes da aplicação ao sítio receptor. Em vez disso, a multiplicação celular ocorre no sítio receptor, ao contrário de um sistema de cultivo in vitro. Embora o cultivo in vitro é desejado, um meio isento de soro também pode ser usado, opcionalmente suplementado com fatores de crescimento adequados, agentes como o ácido hialurônico e/ou proteínas recombinantes, como proteínas de choque térmico e angiopoietinas.

[0052] Além disso, a solução nutriente pode conter agente(s) exógeno(s) ou componente(s), como proteína(s) de choque térmico, ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, fator(es) de crescimento, citocina(s) e/ou células tronco adiposas, de modo que a composição final para a dispersão ao sítio receptor pode conter tal/tais agente(s). Alternativamente, tais agentes podem ser fornecidos separadamente ao sítio receptor. Um ou mais desses agentes podem ser suplementados em um sistema de cultivo in vitro (em uma cultura de células, ou onde as células são semeadas para uma matriz extracelular ou substrato biológico ou sintético). As proteínas de choque térmico e de ácido hialurônico são descritas em mais detalhes na presente invenção. O plasma enriquecido com plaquetas (também referido como PRP) é o plasma sanguíneo que foi enriquecido com plaquetas obtidas por remoção das hemácias do sangue periférico por separação centrífuga sob baixa velocidade. PRP contém uma grande quantidade de fatores de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) contido nas plaquetas, o fator de crescimento transformador β (TGF-β), fator de crescimento fibroblástico (FGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) e similares, e tem efeitos como a angiogênese, osteogênese, promoção da cicatrização de feridas, regeneração tecidual e similares, por uma ação sinérgica desses fatores. Fatores de crescimento e citocinas úteis incluem, mas não se limitam, ao fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento transformador α e β, fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de crescimento fibroblástico 1 e 2, fator de crescimento semelhante à insulina 1 e 2, interleucina 8, fator de crescimento do tecido conjuntivo e fator de crescimento de queratinócitos. As células tronco adiposas incluem várias células tronco com potenciais de proliferação e diferenciação coletados dos tecidos adiposos. As células tronco adiposas podem sofrer diferenciação adipogênica, osteogênica, condrogênica, neurogênica e/ou miogênica in vitro. O(s) agente(s) ou componente(s) exógenos(s) também pode(m) ser fornecido(s) em uma etapa separada.

[0053] Outra característica única da suspensão celular produzida de acordo com o método da presente invenção é que a composição de células na suspensão celular é comparável, ou seja, semelhante a ou substancialmente igual à composição in situ do sítio doador (por exemplo, adjacente à junção dérmica-epidérmica, no caso da pele). Uma possível explicação é que, em técnicas padrão, o cultivo da preparação celular de pele utiliza o cultivo seletivo para queratinócitos, resultando na perda parcial ou total dos constituintes celulares, como fibroblastos e melanócitos, no caso da pele. Ao contrário, a suspensão celular produzida de acordo com a presente invenção tem uma composição celular, ou seja, razão ou porcentagem relativa de diferentes tipos celulares tipos de células, semelhantes a ou substancialmente iguais que a composição de células in situ. Outra característica da suspensão celular produzida de acordo com a presente invenção é que as células mantiveram uma alta viabilidade conforme elas passaram por mínimas etapas de tratamento e mínimo tempo de coleta, e são coletas em uma solução nutriente suave.

[0054] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método de tratamento de um paciente que necessita de um procedimento relacionado ao epitélio. Por esse método, a suspensão celular produzida de acordo com a presente invenção pode ser aplicada diretamente, após a coleta e filtragem, a um sítio receptor do paciente. O sítio receptor pode ser um sítio de ferimento agudo (por exemplo, queimadura ou laceração causada por trauma), ferimento artificialmente criado (por exemplo, em um sítio doador de enxerto, indicação estética, procedimento plástico ou tratamento dérmico) ou ferimento crônico (por exemplo, úlceras venosas ou diabéticas). O sítio receptor pode ser qualquer leito da ferida preparado, incluindo a tradicional "região doadora" em um procedimento de enxerto padrão, do qual a pele é retirada, a tradicional "região receptora" que exige enxerto de pele tradicional, bem como leito da ferida em pacientes que não necessitam de um enxerto de pele tradicional. Por exemplo, queimaduras ou ferimentos relativamente pequenos que não exigem cirurgia de enxerto tradicional pelo padrão de atendimento normal podem ser tratadas pelo procedimento de “enxerto celular” da presente invenção. Tal enxerto celular pode ser aplicado como um procedimento autônomo, ou em combinação com ou complementar à cirurgia de enxerto tradicional. Por exemplo, onde um tecido de enxerto de malha é utilizado em um enxerto tradicional, a suspensão celular da presente invenção pode ser aplicada ao enxerto em malha para melhorar a regeneração epitelial.

[0055] O procedimento relacionado ao epitélio que pode ser tratado pelo enxerto celular da presente invenção inclui, sem limitação, tratamento de ferimento na pele enxerto de tecido da pele, tratamento de doenças de pele (por exemplo, vitiligo ou leucoderma, e úlceras crônicas), procedimento estético de pele (por exemplo, rugas e cicatrizes de acne) ou outro tratamento epidérmico e/ou dérmico.

[0056] Uma suspensão líquida contendo células da presente invenção pode ser distribuída sobre o sítio receptor por qualquer uma de várias técnicas, incluindo, sem limitação, pulverização, espalhamento, pipetagem e/ou pintura. Da mesma forma, a suspensão pode ser aplicada a um curativo para ferimento que é, em seguida, aplicado ao ferimento, ou introduzido sob um curativo no local, ou semeado sobre um curativo antes da aplicação. Em uma modalidade, a suspensão celular pode ser pulverizada sobre um sítio receptor. A suspensão pode ser pulverizada por meio de qualquer tipo de bocal que transforma o líquido em pequenas gotículas transportadas pelo ar. Essa modalidade está sujeita a duas considerações. Primeiro, as células na solução não devem ser submetidas a forças de cisalhamento ou pressões excessivas que possam danificar ou matar um número substancial de células. Em segundo lugar, a suspensão de células não deve ser misturada com um líquido propelente que seja tóxico ou prejudicial para as células no mesmo ou o leito da ferida. Uma variedade de bicos que são comumente disponíveis são adequados para uso. Esses bicos podem ser conectados de qualquer forma adequada a um reservatório que contém a suspensão de células.

[0057] Alternativamente, a suspensão celular pode ser administrada através de uma pipeta, um dispositivo tipo conta-gotas, uma seringa e agulha e/ou outros dispositivos semelhantes para colocar pequenas quantidades da suspensão celular em um sítio receptor. A suspensão celular também pode ser injetada no tecido no sítio receptor.

[0058] Após a suspensão celular ter sido aplicada ao sítio receptor, o sítio ou o leito da ferida pode ser revestido com um curativo para ferimento. Vários tipos de curativos podem ser usados, incluindo filmes (por exemplo, filmes de poliuretano), hidrocoloides (partículas coloidais hidrofílicas acopladas à espuma de poliuretano), hidrogel (polímeros reticulados, contendo pelo menos cerca de 60% de água), espumas (hidrofílicas ou hidrofóbicas), alginatos de cálcio (compostos não tecidos de fibras de alginato de cálcio), derivados do ácido hialurônico (por exemplo, ésteres) e celofane (celulose com um plastificante). Consulte Kannon et al, Dermatol. Surg. 21: 583-590 (1995); Davies, Burns 10:94 (1983). Em uma modalidade o curativo pode ser Surfasoft™, que é um curativo de náilon trançado ou Hyalomatrix®, que é uma matriz de éster do ácido hialurônico. Em geral, a cura do leito da ferida é seguida por protocolos padrão para tratamento de enxerto de pele, conhecido pelas as pessoas versadas na técnica.

[0059] A suspensão celular da presente invenção também pode ser aplicada a um sistema de regeneração de tecido ou órgão (in vivo ou in vitro), como uma matriz extracelular ou material de matriz (por exemplo, como no recrescimento da traqueia). Em várias modalidades, a matriz extracelular ou o material de matriz usada pode ser sintético ou biológico, como colágeno, alginato, grânulos de alginato, agarose, fibrina, cola de fibrina, fibrinogênio, pérolas de fibrina do plasma sanguíneo, plasma total ou componentes do mesmo, lamininas, fibronectinas, proteoglicanos, HSP, quitosana, heparina, e/ou outras estruturas de polímero ou polímero sintético, e materiais de suporte sólido, como curativos para feridas, que poderiam ser retidos ou aderidos às células. Em determinadas modalidades, a suspensão celular, tal como aplicada ao sistema de regeneração, pode facilitar a regeneração epitelial na mesma. Após a conclusão, o sistema regenerado pode ser transplantado para um paciente em necessidade do mesmo.

Dispositivo para fazer e usar uma suspensão celular

[0060] De acordo com ainda outro aspecto da presente invenção, é fornecido um aparelho para o desenvolvimento de uma solução de regeneração tecidual. O aparelho pode ter um meio de aquecimento adequado para aquecer uma solução enzimática até uma determinada temperatura predeterminada e capaz de manter aquela solução na temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo. O aparelho também pode incluir um meio de filtração, que é capaz de separar os grandes congregados celulares (por exemplo, com um diâmetro maior que cerca de 200 μm) de uma suspensão de células.

[0061] Em uma modalidade, o aparelho também pode incluir um reservatório capaz de manter uma amostra de tecido imersa em uma solução nutriente capaz de manter a viabilidade das células na amostra de tecido. Em certas modalidades, o reservatório pode ser de um tamanho suficiente para permitir a manipulação da amostra de tecido, por exemplo, permitindo a separação do estrato celular tecidual (por exemplo, a epiderme e a derme) e a coleta de células da epiderme e/ou da derme, produzindo assim uma suspensão celular para uso em um procedimento relacionado ao epitélio.

[0062] O aparelho também pode incluir um ou mais poços de contenção de fluido ou bolsas para armazenar fluidos, tal como a solução nutriente. Os poços podem alternativamente servir como um receptáculo para um recipiente, como um frasco de frasco ou vidro que retém a solução nutriente. Preferencialmente, o poço é capaz de reter pelo menos um volume de 10 mL. Tais poços permitirem a aplicação conveniente dos fluidos à amostra de tecido. O armazenamento de tais fluidos em grande proximidade, também proporciona a vantagem de reduzir o risco de vazamento acidental de líquidos, e permite o fácil acesso aos fluidos para a liberação precisa da amostra de tecido ou da suspensão celular.

[0063] Em algumas modalidades, o aparelho pode incluir um primeiro e um segundo membro, em que: (1) o primeiro membro inclui: (a) pelo menos um meio de aquecimento adequado para aquecer uma solução enzimática até uma temperatura predeterminada e capaz de manter aquela solução na temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo; (b) pelo menos um meio de filtração capaz de separar os grandes congregados celulares de uma suspensão de células; e (c) pelo menos um recipiente de líquido para o armazenamento de uma solução nutriente; (2) o segundo membro forma um reservatório capaz de reter uma amostra de tecido imersa na solução nutriente; e em que o primeiro membro fornece um local, sobre o qual o segundo membro pode ser colocado durante a manipulação da amostra de tecido.

[0064] Em uma outra modalidade, o primeiro membro pode fornecer um compartimento de armazenamento no qual as ferramentas e soluções utilizadas nos métodos aqui descritos podem ser armazenadas. Onde tal compartimento é fornecido no aparelho, o segundo membro pode fornecer a tampa ou fechamento para aquele compartimento. Durante o uso, a tampa pode ser removida do topo do compartimento e pode ser invertida. O lado inferior da tampa preferencialmente forma o reservatório no mesmo, permitindo que o segundo membro sirva para uma dupla finalidade. As ferramentas e as soluções usadas no método podem ser acessadas do compartimento. A tampa invertida pode então ser colocada de volta sobre o compartimento nisso, proporcionando o reservatório para o aparelho.

[0065] O aparelho pode ser feito de metal, plástico ou qualquer outro material adequado. Além disso, o recipiente pode ser de qualquer tamanho apropriado, dependendo do seu uso tencionado e da necessidade de esterilização, tal como por tratamento com irradiação gama e/ou óxido de etileno.

[0066] Deve ser notado que o meio de aquecimento utilizado no aparelho pode ser um bloco ou blocos de aquecimento, no topo do primeiro membro. Para evitar o derramamento acidental do recipiente sendo aquecido, em uma modalidade, um ou mais meios de aquecimento podem ser alojados dentro de um recesso no primeiro membro. Também pode estar localizado dentro daquele recesso pelo menos um recipiente no qual a amostra de tecido pode ser colocada para exposição à solução enzimática. Em uma modalidade alternativa, um ou mais meios de aquecimento podem ser alojados na base do aparelho. Em tal configuração, o primeiro membro pode conter pelo menos uma abertura para receber um recipiente para reter um líquido, a qual pode fornecer acesso do recipiente ao meio de aquecimento.

[0067] Será notado que, se o aparelho foi desenvolvido para múltiplos usos, o meio de aquecimento pode ser repetidamente aquecido e resfriado. Alternativamente, várias unidades de aquecimento podem ser fornecidas com o aparelho para facilitar vários eventos de aquecimento, onde cada unidade de aquecimento pode ser desenvolvida para uso individual.

[0068] Em uma configuração exemplar do aparelho, um colar de aquecimento pode estar localizado dentro de um recesso no mesmo, formando um recesso de aquecimento no primeiro membro, dentro do qual um recipiente (por exemplo, um frasco) para a enzima está localizado. O recipiente pode ser mantido no lugar por pelo menos um meio de restrição, que preferencialmente circunda pelo menos parte da porção superior do recipiente, evitando assim a liberação acidental do recipiente do aparelho. Em determinadas modalidades, onde o aparelho destina-se a um uso único, o meio de restrição pode ser formado como parte integrante do primeiro membro, desse modo, o recipiente não pode ser removido a menos que o primeiro membro seja fisicamente quebrado ou danificado.

[0069] O meio de aquecimento usado no aparelho pode ser controlado por circuitos, que permitem a ativação do elemento de aquecimento, quando necessário. Por exemplo, o meio de aquecimento pode ser ligado, pressionando um botão de início localizado, por exemplo, sobre a superfície do primeiro membro, ou através de uma interface de usuário touchscreen. Alternadamente, o meio de aquecimento pode ser ativado pressionando o recipiente para baixo, com força suficiente para ativar um interruptor localizado na base do aparelho. Uma pessoa normalmente versada na técnica perceberá que uma vasta gama de meios eletrônicos pode ser usada para ativar a unidade de aquecimento fornecida no aparelho.

[0070] A unidade de aquecimento também pode ser operavelmente ligada a um mecanismo temporizador, que pode ser adaptado para aquecer a solução enzimática por um período de tempo predefinido. Em certas modalidades onde o aparelho destina-se a múltiplos usos, o temporizador pode ser configurado para desativar o elemento de aquecimento ao passar uma quantidade predeterminada de tempo. Em seguida, um alarme pode ser ativado para informar ao usuário que o tempo acabou. O alarme pode ser audível ou sob a forma de um visor luminoso.

[0071] Em uma outra modalidade preferencial, o meio de aquecimento pode ser fornecido com um controle de temperatura ajustável. Quando o ajuste de temperatura é necessário, tal ajuste pode ser alcançado através da adaptação dos circuitos de controle de aquecimento, para incluir ou se comunicar com um mecanismo de controle de temperatura que permite que a temperatura da unidade de aquecimento varie constantemente dentro de um intervalo constante, ou ele pode apresentar um intervalo de temperaturas selecionadas nas quais o meio de controle de temperatura pode estar definido. Um meio de controle de temperatura pode ser incluído no aparelho onde o mesmo deve ser usado na coleta e preparação de diferentes tipos celulares e/ou onde diferentes enzimas são usadas no método de coleta, para o qual o aparelho tem aplicação única.

[0072] Em algumas modalidades, o aparelho pode ser desenvolvido para um único uso. Em tais casos, o mecanismo temporizador pode ser parte do circuito que controla o meio de aquecimento. Uma vez ativado o meio de aquecimento, ele aquece a solução por um período de tempo predefinido e, em seguida, se autodestrói. Deve ser observado pelas pessoas versadas na técnica que tal aparelho pode ser adaptado com vários meios de monitoramento, que são capazes de indicar um ou mais dentre: se a solução enzimática atingiu a temperatura predeterminada; a duração de tempo no qual a enzima esteve na solução; e/ou a quantidade de tempo restante antes do circuito se autodestruir. Apenas a título de exemplo, os meios de monitoramento podem consistir em uma série de LEDs que ativam quando ocorrerem determinados eventos. Em uma modalidade, o elemento de aquecimento permanece no modo de aquecimento durante um máximo de 45 minutos a 1 hora.

[0073] O meio de aquecimento pode ser alimentado por qualquer meio conhecido na técnica. Preferencialmente, a fonte de alimentação é fornecida pela bateria/baterias. Em um exemplo, a fonte de alimentação é uma bateria ou uma pluralidade de baterias localizadas na base do aparelho.

[0074] Em uma outra modalidade da invenção, o aparelho pode ser munido com um ou mais meios para facilitar a mistura das soluções utilizadas na invenção, por exemplo, uma solução enzimática. Sob esse aspecto, e apenas a título de exemplo, o aparelho pode incluir um meio para agitar sob vórtice a solução, tal como um sistema eletromagnético que é adaptado para agitar uma esfera magnética. Onde o aparelho inclui um sistema de mistura eletromagnético, a esfera magnética pode ser fornecida no recipiente (por exemplo, um frasco) no qual a solução é armazenada no aparelho. Alternativamente, a esfera magnética pode ser adicionada à solução quando a mistura é desejada.

[0075] Em uma modalidade, os meios de mistura podem ser combinados com os meios de aquecimento como uma única unidade ou como unidades separadas, para facilitar o constante aquecimento da solução de forma uniforme. O uso de tal meio de mistura pode evitar o superaquecimento da solução mais próxima da unidade de aquecimento, enquanto a solução é aquecida. Tal sistema pode proporcionar um aquecimento constante da solução. Meios alternativos para misturar a solução são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, meios mecânicos, físicos, elétricos e eletromagnéticos. Enquanto qualquer meio de mistura pode ser utilizado no aparelho, de preferência o meio de mistura é selecionado para minimizar a vibração do aparelho ou incorporado no aparelho de modo a minimizar tal vibração. Sob esse aspecto, o meio de mistura pode ser alojado sobre um ou mais amortecedores de vibração, ou o aparelho pode incluir um ou mais amortecedores de vibração em sua base.

[0076] Onde um meio de mistura é incorporado no aparelho, o meio pode ser ativado automaticamente após a ativação da unidade de aquecimento ou, alternativamente, pode haver um sistema de ativação separado. Além disso, a velocidade da mistura pode ser fixa ou variável. Preferencialmente, há um sistema de ativação separado para o meio de mistura.

[0077] Pode haver um recesso de filtro incorporado no aparelho, que pode ser de qualquer tamanho ou forma que facilita a filtragem de uma suspensão de células, para remover ou coletar grandes congregados de células (por exemplo, com mais de 200 μm, mais de 150 μm ou mais de 100 μm). Além disso, o recesso pode ser adaptado para receber e reter pelo menos um tubo ou frasco, no qual a suspensão celular pode ser filtrada. O recesso pode ter uma base cônica que proporciona fácil acesso a todo o volume da suspensão celular após a filtragem. O meio de filtração também pode ser um filtro em linha.

[0078] Em algumas modalidades, um recesso é projetado para receber um filtro de células de 100 μm que é capaz de remover ou coletar congregados de células maiores que cerca de 100 μm. O uso do filtro também pode evitar que o pulverizador/bico entupa pelos grandes congregados. O recesso pode acomodar um filtro de células de 100 μm conectado a um tubo cônico. Preferencialmente, o tubo tem graduações de área/volume marcadas no lado.

[0079] O aparelho também pode incluir um conjunto de ferramentas necessárias para a coleta de células. Será notado, pelas pessoas versadas na técnica, que quaisquer ferramentas necessárias para a coleta de células podem ser incluídas com o dispositivo. Preferencialmente, o conjunto de ferramentas é estéril. Como exemplo, o conjunto de ferramentas pode incluir um recipiente de vidro da enzima de separação; uma solução estéril para suspensão da enzima; uma solução nutriente estéril; bisturi; fórceps; seringa; conta-gotas, filtro de célula; curativos para ferimentos e/ou bicos de pulverização. Em uma modalidade, o conjunto de ferramentas é armazenado em um compartimento formado no primeiro membro do aparelho, que é coberto pelo segundo membro, quando não está em uso.

[0080] Em uma modalidade, o aparelho é usado para coletar e preparar uma suspensão de células, e adicionalmente, para aplicar a suspensão de células a um sítio receptor de qualquer forma adequada.

[0081] Por exemplo, uma alíquota de água estéril pode ser misturada com uma porção da enzima de separação liofilizada e colocada no recesso de aquecimento. O meio de aquecimento é, em seguida, ativado, o qual aquece o conteúdo (ou seja, a solução enzimática) do receptor até uma temperatura de trabalho compreendida entre cerca de 30 e 37 °C, preferencialmente entre cerca de 33 e 37 °C, ou a título de exemplo, de cerca de 37 °C, dentro de um curto período de tempo (por exemplo, cerca de 5 minutos, cerca de 3 minutos, cerca de 2 minutos ou cerca de 1 minuto) e mantém a temperatura de trabalho por um período de tempo suficiente para permitir que a digestão enzimática continue (por exemplo, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 0 minutos, ou mais ou menos tempo). Uma vez que uma temperatura operacional tenha sido alcançada, uma amostra de tecido retirada de um sítio doador é colocada na solução enzimática e incubada na temperatura de trabalho. A amostra de tecido é incubada por um tempo suficiente (por exemplo, entre 5 a 60 minutos, entre 10 a 45 minutos, entre 20 a 30 minutos, ou mais ou menos). As pessoas versadas na técnica perceberiam que o tempo necessário para atingir a separação das camadas da amostra de tecido depende da espessura e do tamanho da amostra de tecido, e da temperatura de incubação, e pode ser determinado através de experimentação rotineira. Uma vez alcançada a separação enzimática das camadas de tecido, a amostra de tecido é removida, lavada com uma solução nutriente e colocada no reservatório, onde as camadas de tecido são mantidas no lugar, usando instrumentos cirúrgicos, tais como fórceps.

[0082] Uma alíquota cuidadosamente medida da segunda solução (por exemplo, uma solução nutriente) é em seguida retirada do poço de contenção de líquido por aspiração em uma seringa e, em seguida, aplicada às camadas. As células de toda a amostra de tecido (por exemplo, incluindo a epiderme, derme e a junção dérmica- epidérmica) são removidas usando um bisturi e são suspensas pela mistura com a solução nutriente. A suspensão celular é em seguida coletada, preferencialmente usando uma seringa e cânula.

[0083] A suspensão coletada de células, em seguida, passada por um filtro de células localizado no recesso de filtro para mover grandes congregados de células e outros materiais indesejados, e a suspensão filtrada de células é coletada no recesso de filtro. O reservatório pode ser, opcionalmente, enxaguado com um volume adicional da segunda solução, e esta suspensão adicional resultante de células também pode ser filtrada e coletada no recesso de filtro.

[0084] A suspensão filtrada das células pode, então, ser opcionalmente aspirada em um meio de dispersão (por exemplo, seringa) e aplicada diretamente ao sítio receptor. A suspensão também pode ser aplicada indiretamente na área que precisa de reparo, por exemplo, uma estrutura/substrato ou curativo, tanto in vitro quanto in situ.

[0085] Em outras modalidades, o processo de preparação da suspensão pode ser automatizado. Um dispositivo automatizado pode incluir uma unidade de processamento capaz de usos múltiplos, juntamente com materiais de consumo para um único uso. Por exemplo, um dispositivo automatizado com cartuchos descartáveis pode ser fornecido. Os cartuchos descartáveis podem ter blisters contendo a água, a enzima e o tampão. Rolos ou placas de pressão podem ser usados para criar pressão para estourar as válvulas unidirecionais, introduzindo o conteúdo dos blisters em uma câmara de processamento que contém a biópsia. Após a incubação da enzima, a biópsia pode ser processada de forma semelhante ao almofariz e pilão, onde a base pode conter uma malha ou qualquer outro dispositivo de raspagem para concluir a etapa de raspagem. Em algumas modalidades, o dispositivo pode ter mais de um cartucho descartável e, portanto, pode processar mais de uma biópsia em paralelo.

Uso da Proteína de Choque Térmico

[0086] As Proteínas de Choque Térmico (HSPs) foram inicialmente descobertas como proteínas que foram acentuadamente induzidas por choque térmico e outros estresses químicos (por exemplo, compostos) ou físicos. Desde aquela época, elas têm sido consideradas como chaperonas moleculares, orientando e modificando as estruturas das proteínas pelas suas capacidades intrínsecas de redobrá-las, de uma estrutura desnaturada para uma estrutura nativa. Essas interações e o equilíbrio para as proteínas funcionais totalmente naturais exige que as HSPs sejam abundantes. As HSPs foram geralmente classificadas em várias classes, dependendo de seus pesos moleculares. Por exemplo, os genes Hsp27, 40, 70 e 110 evoluíram para serem particularmente eficazes para a síntese de massa, após ou durante o estresse com poderosa ativação transcricional, eficiente estabilização do RNA mensageiro (mRNA) e tradução seletiva do mRNA. Os níveis de Hsp27, 70, 90 e 110 aumentam para se tornarem as proteínas predominantemente expressas após o estresse.

[0087] As proteínas de choque térmico podem desempenhar um papel importante na proteção da pele de estresses ambientais e participam na prevenção e reparação dos danos causados pela exposição à luz, calor, lesões químicas e outros traumas. Além disso, a irradiação de UV-B também pode induzir a resposta ao choque térmico, que protege a pele humana de danos celulares e faz parte das defesas naturais após a exposição à radiação solar. No entanto, na cicatrização de feridas fisiológicas, algumas células são estressadas em qualquer momento específico e, portanto, a maioria das células não são ativadas, ou secretam HSPs ou se proliferam.

[0088] Portanto, os processos de cicatrização de feridas podem se beneficiar da indução exógena de uma resposta de choque térmico. Por exemplo, ao colocar a suspensão celular da presente invenção sob condições de estresse, as células podem apresentar uma resposta de choque térmico. Condições de estresse adequadas incluem, sem limitação, hipóxia, choque térmico, alteração de pH, mudança na pressão osmótica e/ou atmosférica, compostos químicos, radiação, trauma mecânico, privação de nutrientes e/ou jejum ou restrição calórica. A hipóxia pode ser alcançada por incubação das células em um ambiente sem suprimento adequado de oxigênio. Além disso, como o método do presente invenção remove a biópsia do seu suprimento vascular normal, as células na biópsia, bem como as células coletadas da biópsia, podem experimentar estresse e expressar o estado estressado e/ou ativado devido à redução ou ausência de suprimento vascular. O processo de choque térmico pode ser feito em uma incubadora de CO2, incubadora de O2 ou em um banho-maria quente. Além disso, o estresse pode ser induzido durante todo o procedimento de preparação e/ou dispersão da suspensão de células, por exemplo, da remoção da biópsia da irrigação vascular, da desagregação da biópsia em uma suspensão de células (por exemplo, através de meios enzimáticos e/ou mecânicos), e/ou da formação de aerossol ou, de outro modo, dispersão das células. Sob estresse, as células podem exibir uma característica induzida pelo estresse, por exemplo, um nível elevado de expressão de uma proteína de choque térmico. A proteína de choque térmico pode ser Hsp90 e/ou Hsp90a.

[0089] Hsp90 é uma das várias classes de HSPs, que são geralmente sintetizados em resposta ao estresse celular, bem como são constitutivamente expressos em alguns casos. Esses tipos de estresse são de diversas origens, mas incluem o choque térmico, toxicidade causada por metal, privação de nutrientes e estresse oxidativo, bem como vários estados patológicos. Hsp90 é uma das proteínas chaperonas mais prevalentes presentes na célula - ela pode representar de 1 a 2% da proteína da célula não estressada e até 6%, na célula estressada. Ela tem a capacidade de fornecer complexos multicomponentes que têm demonstrado incluir p60/Hop, p50Cdc37, HDJ2/Hsp40, p23, Hsp70 e uma de uma série de imunofilinas (como FKBP51 e FKBP52).

[0090] Hsp90 está geralmente presente em duas formas, Hsp90a e B. Ambas as proteínas são altamente relacionadas e parecem ter atividades idênticas; no entanto, a primeira é induzível, enquanto que a última é constitutivamente expressa. Hsp90 também é uma fosfoproteína e tem duas ou três moléculas de fosfato ligadas por monômero e existe como um homodímero. Uma das claras distinções que a tornaram um alvo potencial do medicamento é o fato de que uma quantidade significativa de suas proteínas clientes são as proteínas quinases. Essas proteínas clientes incluem ErbB2/Her-2, EGFR, Hifla, c-Met, Akt/PKB, Raf-1, Cdk-1 e 4, Aurora B, Askl, CHK1 e CKII, bem como p53 mutante. Além disso, devido à natureza da rede interativa e complexa que está associada com a regulação da proliferação celular e morte celular, a abordagem de identificação de um alvo específico (fármaco) e o bloqueio ou ativação disso pode resultar na simples alteração da regulação da célula, a fim de manter o fenótipo.

[0091] Recentemente, verificou-se que os HSPs são ativamente secretados pelas células e realizam importantes funções extracelulares, incluindo a estimulação da produção de citocina imunológica, ativação de células apresentadoras de antígeno (APCs) e funções anticâncer. A hipóxia causa a secreção de Hsp90a nas células epidérmicas e dérmicas. A Hsp90a secretada, por sua vez, promove a migração dessas células. Uma vez que as proteínas HSP não têm quaisquer sequências sinais no terminal amino, essas proteínas não podem ser secretadas através da via de transporte clássica do retículo endoplasmático/Golgi. Em vez disso, essas proteínas são secretadas para fora das células por uma população discreta de nanovesículas (30 a 90 nm de diâmetro), chamada exossomos. Portanto, a secreção do exossomo constitui um modo potencial de comunicação intercelular e abre novas estratégias terapêuticas e de diagnóstico. TGFa "empurra" o Hsp90a para fora dos queratinócitos humanos através da via do exossomo que, por sua vez, promove a migração das células epidérmicas e dérmicas através do receptor de superfície celular CD91/LRP-1 ("LRP" significando proteína 1 relacionada ao receptor LDL).

[0092] Por conseguinte, em certas modalidades, a suspensão celular da presente invenção, ou uma porção da mesma, pode ser coadministrada a um sítio receptor com uma proteína de choque térmico, ou um fragmento da mesma, para facilitar a cicatrização de feridas ou, de outro modo, para promover o tratamento, regeneração ou renovação de tecidos epiteliais em um procedimento relacionado ao epitélio. A suspensão celular e a HSP podem ser fornecidos em uma mistura e dispersos para o sítio receptor. Alternativamente, a suspensão celular e o HSP podem ser aplicados ao sítio receptor separadamente. Vários aplicações ou dispersões da suspensão celular e/ou da HSP também podem ser usados para atingir o resultado de cicatrização de feridas. A HSP, ou um fragmento da mesma, pode estar em uma quantidade eficaz para promover a cicatrização de feridas. A HSP pode ser Hsp90 e/ou Hsp90a. A HSP, ou um fragmento da mesma, pode ser formulada em uma concentração de cerca de 0,1 μg/μL a cerca de 100 μg/μL, de cerca de 0,3 μg/μL a cerca de 50 μg/μL, ou de cerca de 1 μg/μL a cerca de 10 μg/μL.

[0093] A Patente Norte-Americana No. 8.022.037, cuja divulgação inteira é incorporada na presente invenção por referência, divulga a Hsp90a, especificamente seu domínio médio mais a sequência carregada, como um fator de pró-motilidade extracelular para o queratinócito epidérmico humano (HKC), o fibroblasto dérmico (DF) e a migração da célula endotelial microvascular (HDMEC).

[0094] Em várias modalidades, a HSP (por exemplo, Hsp90 e Hsp90α), ou um fragmento da mesma, pode ser produzido em grande quantidade e purificado utilizando a tecnologia convencional de clonagem e DNA recombinante. A HSP pode ser fornecida como um componente do aparelho da presente invenção, por exemplo, em um formato de pó seco, ou fornecida em uma aplicação líquida ou em uma bandagem. A HSP também pode ser usada como um tratamento autônomo, e fornecida em vários formatos; quando é fornecida em uma aplicação líquida, a HSP pode ser pulverizada, gotejada, dispersa ou, de outro modo, aplicada a um sítio receptor; quando fornecida em uma bandagem, a HSP pode ser formulada como uma formulação de liberação lenta, usando métodos conhecidos na técnica. Também é possível usar a HSP juntamente com uma monocultura com um único tipo de células, por exemplo, células tronco da pele, fibroblastos, queratinócitos, etc., ou com uma mistura de suas células.

[0095] Em várias modalidades, a HSP pode auxiliar ou aumentar a cicatrização de feridas e a regeneração tecidual aumentando tanto o processo de re-epitelização quanto o recrutamento das células. Sem desejar se ater à teoria, o mecanismo pode ser que queratinócitos "positivamente estressados" (por exemplo, de uma forma hipóxica e por meio do processamento de ReCell) podem produzir maior liberação de proteínas chaves (por exemplo, HSP90), plaquetas (que liberam PDGF) e células tronco (liberando proliferadores, por exemplo, VEGF), citocinas (imunomoduladores) e quimiocinas (migradores) que podem regular e controlar o processo de regeneração; HSP90 pode bloquear a ação da TGFb, desinibindo a resposta ao VEGF e PDGF pelas células endoteliais e fibroblastos, resultando na proliferação e diferenciação dos tipos de células chaves, acompanhado pelo rápido desenvolvimento de vasos sanguíneos e nervos. A interação da inibição, desinibição e ativação gera uma cascata de retroalimentação positiva, resultando em maior liberação dos fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas.

Uso do Ácido Hialurônico

[0096] O termo "ácido hialurônico", conforme é usado na presente invenção, inclui sais de metais alcalinos, como sais de sódio, potássio e lítio do ácido hialurônico. O termo "ácido hialurônico" também tenciona incluir não apenas o ácido hialurônico elementar, mas também o ácido hialurônico com outro traço de elementos ou em diversas composições com outros elementos, enquanto que as propriedades físicas e químicas do ácido hialurônico permanecem inalteradas. Além disso, o termo "ácido hialurônico", como utilizado no presente pedido, destina-se a incluir fórmulas naturais, fórmulas sintéticas ou combinação dessas fórmulas naturais e sintéticas.

[0097] O ácido hialurônico (também conhecido como hialuronano ou hialuronato, ou HA) é um glicosaminoglicano distribuído extensamente pelos tecidos conjuntivo, epitelial e neural. Mais especificamente, o HA é um polissacarídeo linear e não ramificado feito de unidades alternadas de N-acetil-D-glucosamina e ácido D-glucurônico, e pode atingir comprimentos de corrente de até 20.000 unidades de dissacarídeos ou mais. Sendo um dos componentes principais da matriz extracelular, o HA contribui significativamente para a proliferação e migração celular. A presença de HA no tecido epitelial demonstrou promover a proliferação de queratinócitos e aumentar a presença do ácido retinoico, efetuando a hidratação da pele. A interação do ácido hialurônico com CD44 impulsiona a síntese de colágeno e a função normal da pele. Presente predominantemente na matriz extracelular dos queratinócitos basais, o HA é crítico para a integridade estrutural da matriz dérmica de colágeno.

[0098] Na pele normal, o HA é encontrado em concentrações relativamente elevadas na camada basal da epiderme, onde são encontrados queratinócitos em proliferação. O CD44 é colocado com o HA na camada basal da epiderme, onde foi demonstrado que ele é preferencialmente expresso na membrana plasmática voltada para as bolsas da matriz rica em HA. Manter o espaço extracelular e fornecer uma estrutura aberta e hidratada para a passagem de nutrientes são as principais funções do HA na epiderme.

[0099] O HA também pode afetar ou promover a cicatrização de feridas. A cicatrização de feridas de pele é um processo complexo e inclui muitos processos de interação iniciados pela hemostasia e a liberação de fatores derivados de plaquetas. As etapas seguintes incluem inflamação, formação de tecido de granulação, re- epitelização e remodelagem. O HA pode desempenhar uma função multifacetada na mediação desses eventos celulares e da matriz. Em primeiro lugar, no processo de inflamação, muitos fatores biológicos, tais como fatores de crescimento, citocinas, eicosanoides, etc., são gerados. Esses fatores são necessários para as etapas subsequentes de cicatrização de feridas devido às suas funções na promoção da migração de células inflamatórias, fibroblastos e células endoteliais no local da ferida. O tecido ferido, na fase inflamatória inicial de reparação do ferimento, contém muito HA, provavelmente um reflexo do aumento da biossíntese do HA. O HA pode agir como um promotor da inflamação inicial, que é crucial no processo de cicatrização de feridas de pele como um todo.

[00100] O tecido de granulação é o tecido conjuntivo fibroso perfundido, que substitui um coágulo de fibrina na cicatrização de ferimentos. O HA é abundante na matriz do tecido de granulação. Uma variedade de funções celulares que são essenciais para o tecido e reparo do ferimento podem ser atribuídas a essa rede rica em HA, incluindo a facilitação da migração celular em uma matriz do ferimento temporária, proliferação celular e organização da matriz do tecido de granulação. Por exemplo, a rede rica em HA ou a matriz extracelular podem agir como um ambiente condutor para a migração de células na matriz temporária do ferimento.

[00101] HA também funciona no processo de re- epitelização. Ele serve como parte integrante da matriz extracelular dos queratinócitos basais, que são os principais constituintes da epiderme; sua função na proliferação de queratinócitos e migração também é importante. No processo de cicatrização de feridas, o HA é expresso na margem do ferimento, na matriz de tecido conjuntivo, e a colocação com a expressão de CD44 nos queratinócitos de migração, onde o HA e o CD44 atuam juntos para regular a migração e proliferação de queratinócitos. O HA também pode agir para reduzir a deposição do colágeno e, portanto, levar à cicatrização reduzida.

[00102] Assim, em certas modalidades, a suspensão celular da presente invenção, ou uma porção da mesma, pode ser coadministrada a um sítio receptor com HA (ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, como hialuronato de sódio), para facilitar a cicatrização de feridas. A suspensão celular e o HA podem ser fornecidos em uma mistura e dispersos para o sítio receptor. Alternativamente, a suspensão celular e o HA podem ser aplicados ao sítio receptor separadamente. Vários aplicações ou dispersões da suspensão celular e/ou do HA também podem ser usadas para atingir o resultado de cicatrização de feridas desejado. O HA pode ser fornecido em uma quantidade eficaz para promover a cicatrização de feridas, por exemplo, de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 60 mg/mL, de cerca de 1 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, de cerca de 5 mg/mL a cerca de 40 mg/mL, de cerca de 10 mg/mL a cerca de 30 mg/mL ou de cerca de 20 mg/mL, a cerca de 25 mg/mL. Por exemplo, a quantidade de HA nas composições de acordo com a invenção pode ser igual a 0,1, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 mg/mL. O HA pode ter qualquer peso molecular adequado, que varia desde alguns KDa até milhões de daltons, dependendo da fonte, da degradação e do procedimento de purificação. O HA pode ter de cerca de 0,01 a 9 x 106 Da, de cerca de 0,5 a 9 x 105 Da, ou de cerca de 0,8 a 8 x 105 Da, ou ser maior ou menor.

[00103] Em várias modalidades, o HA de peso molecular desejável pode ser produzido em grande quantidade e purificado usando a tecnologia do DNA recombinante e clonagem convencional (por exemplo, usando a hialuronano sintase e/ou outros genes de biossíntese do HA, nas células recombinantes). O HA também pode ser obtido comercialmente de rooster combs, certas cepas atenuadas do grupo C. Os estreptococos que sintetizam esse composto naturalmente como parte de sua cápsula externa, ou de humor vítreo ou bovino. Além disso, as frações de massa molecular do HA purificado podem ser compradas de fontes comerciais, incluindo, mas sem se limitar a Fluka Chemical Corporation (Ronkonkoma, N.Y., EUA), Genzyme Corporation (Cambridge, Mass., EUA), Lifecore Inc. (Chaska, Minn., EUA), Hyal Pharmaceutical Corporation (Mississauga, Ontário, Canadá) e Bioniche Life Sciences, Inc. (Belleville, Ontário, Canadá).

[00104] O HA pode ser fornecido em várias formas, como em solução, hidrogel, ou como nanopartículas ou micropartículas. As Patentes Norte-Americanas Nos. 6.660.853 e 7.371.399 descrevem métodos para fazer o HA e um gel de polímero contendo HA, e são incorporados na presente invenção por referência.

[00105] O HA pode ser fornecido como um componente do aparelho da presente invenção, por exemplo, em um formato de pó seco, ou fornecido em uma aplicação líquida ou em uma bandagem. O HA também pode ser usado como um tratamento autônomo, e fornecido em vários formatos; quando é fornecido em uma aplicação líquida, o HA pode ser pulverizado, gotejado, disperso ou, de outro modo, aplicado a um sítio receptor; quando fornecido em uma bandagem, o HA pode ser formulado como uma formulação de liberação lenta, usando métodos conhecidos na técnica. Também é possível usar o HA juntamente com uma monocultura com um único tipo de células, por exemplo, células tronco da pele, fibroblastos, queratinócitos, etc., ou com uma mistura de suas células.

EXEMPLOS

[00106] Outras características da presente invenção são descritas nos exemplos não limitantes a seguir. Deve ser compreendido, no entanto, que esses exemplos são incluídos exclusivamente para fins de exemplificação da presente invenção. Eles não devem ser interpretados, de forma alguma, como uma restrição à ampla descrição da invenção, como definida acima.

[00107] Os exemplos a seguir são colocados adiante a fim de fornecer, para as pessoas versadas na técnica, uma descrição exemplar de como as composições e/ou métodos aqui reivindicados são feitos e avaliados, e se destinam a ser puramente exemplares da invenção, e não a limitar o escopo do que os inventores consideram sua invenção. Modificações e variações dos vários aspectos dos exemplos a seguir serão evidentes para as pessoas versadas na técnica e estão incluídas no escopo da presente invenção. Por exemplo, embora alguns exemplos sejam descritos juntamente com um procedimento relacionado à pele, os mesmos podem ser aplicados aos tecidos epiteliais que não são da pele, (como epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio glandular, epitélio córneo e similares) com pequenas modificações que estão bem compreendidas no nível de habilidades comuns na técnica.

Exemplo 1 Preparação do Sítio Receptor

[00108] Para otimizar o sucesso do procedimento relacionado ao epitélio, a ferida foi limpa e avaliada como apresentando a profundidade apropriada. Além disso, estabeleceu-se a homeostase sanguínea e a ferida analisada para buscar evidências de celulite ou infecção adjacente. As técnicas para preparar a área incluíam, sem limitação, dissecção cortante, dermoabrasão ou renovação a laser.

Biópsia do Sítio Doador

[00109] O sítio doador foi escolhido para corresponder adequadamente ao sítio receptor. O sítio doador foi infiltrado com anestésico local e adrenalina sob a pele, perto do tecido subcutâneo. Isso permitiu que o sítio doador estivesse firme e auxiliou a conseguir uma biópsia. As dimensões da biópsia foram determinadas pelo tamanho da área superficial do sítio receptor a ser coberto. Tipicamente, a presente invenção possibilita um tamanho de biópsia que tem uma razão de expansão de cerca de 1:10 a 1:80 (tamanho de biópsia do doador:tamanho do sítio receptor). Em um exemplo, um tamanho de biópsia de 2 cm x 2 cm foi tomado do sítio doador, fornecendo uma razão de expansão de 1:60.

Renovação da Pele Usando a técnica ReCell®

[00110] O tratamento da ferida foi realizado usando o aparelho de coleta de células ReCell Rapid Technique, que é explicado em mais detalhes no exemplo 2 abaixo. O aparelho continha todos os instrumentos, soluções, enzimas e curativos necessários para o tratamento do ferimento.

[00111] O elemento de aquecimento foi ativado pressionando o “botão iniciar”. A solução A (água estéril para injeção) (10 mL) foi transferida do recipiente plástico fornecido marcado como solução A em um recipiente de vidro contendo a enzima de separação (tripsina liofilizada) para produzir uma concentração final de 0,5% de tripsina. A solução enzimática foi, em seguida, misturada junto, transferida para um frasco já localizado no recesso do elemento de aquecimento e aquecida até cerca de 37 °C.

[00112] O frasco contendo a solução B (solução nutriente) foi transferido de seu recipiente fornecido para o poço de contenção de líquido.

[00113] A amostra de tecido anteriormente obtida foi em seguida colocada na solução enzimática e incubada a cerca de 37 °C durante entre 10 a 15 minutos. Após a incubação, a amostra de tecido foi removida da solução enzimática com um par de pinças, enxaguada por imersão no poço de contenção de líquido contendo a solução B e colocada com o lado da derme para baixo, e o lado da epiderme para cima no reservatório.

[00114] A solução B foi, em seguida, aspirada do poço para dentro de uma seringa e gotejada da seringa sobre ambas as camadas da biópsia.

[00115] As camadas da pele, a derme e a epiderme foram manipuladas usando um fórceps e bisturi. A partir da superfície superior da epiderme e seguido pela zona da junção dérmica-epidérmica, onde a superfície inferior da epiderme e a superfície superior da derme se encontram, as células são removidas da amostra até substancialmente todas as células na amostra serem coletadas, para desenvolver uma grande quantidade de células no reservatório. As células foram, a seguir, misturadas na solução B por agitação e/ou pipetagem. A grande quantidade de células foi, em seguida, puxada para dentro da seringa através de uma cânula calibre 19.

[00116] O filtro fornecido (filtro de células de 100 μm) foi montado no recesso de filtro e a grande quantidade de células na solução B passou pelo filtro. Mais uma pequena quantidade de solução B foi, em seguida, usada para enxaguar o reservatório (por exemplo, uma placa de Petri) e recolher quaisquer células remanescentes, que também foram passadas pelo filtro.

[00117] A suspensão resultante de células coletadas no recesso cônico foi aspirada para uma seringa e um bocal foi anexado à seringa para pulverizar ou gotejar sobre a área do ferimento.

[00118] O ferimento foi reverificado para garantir que o mesmo estava limpo e isento de fragmentos, e que não havia nenhuma evidência de contaminação bacteriana. Além disso, o ferimento foi verificado para determinar se a homeostase havia sido alcançada. Uma vez que o sítio receptor estava pronto, a suspensão de células foi aplicada à superfície do ferimento, usando o bocal.

[00119] O ferimento foi coberto com Surfasoft™, um curativo de náilon trançado, que foi fornecido com o aparelho. A cicatrização do ferimento foi acompanhada usando protocolos padrão para o tratamento de enxerto de pele.

Exemplo 2

[00120] A modalidade mostrada na figura 2A é direcionada para um aparelho de coleta de células ReCell® Rapid Technique 10 para uso na produção de uma suspensão de células transplantável de tecido vivo, adequada para aplicação a um paciente em um procedimento relacionado ao epitélio.

[00121] Conforme ilustrado na figura 2A, o aparelho inclui uma tampa de fechamento 12 com um mecanismo de travamento 14 adaptado para acoplar, de modo liberável, uma porção de base 16. O mecanismo de travamento 14 fornece um meio para fechar o aparelho 16 quando não estiver em uso. Está localizado dentro da porção de base 16 um primeiro membro 18, dentro do qual é fornecida uma abertura 20, na qual está localizado um frasco 22 para a enzima. É fornecido adjacente à abertura um interruptor de ativação 24 capaz de ativar o meio de aquecimento (não mostrado). O primeiro membro também fornece um poço de contenção de líquido 26 e um recesso de filtro 28. Tal como é apresentado nessa ilustração, o filtro 29 é mostrado localizado no recesso de filtro. Normalmente, o filtro é um item opcional incluído como um item separado no aparelho.

[00122] A abertura 20 no primeiro membro 18 é desejavelmente de um diâmetro tal que permita que o gargalo do frasco 22 se projete através e acima do primeiro membro 18. A periferia da abertura 20 está adaptada com um colar 21, que é ligeiramente menor do que o diâmetro do corpo do frasco 22. Assim, quando está em uso, o frasco 22 não pode ser removido do aparelho 10, uma vez que ele é mantido no lugar pelo colar 21 localizado ao redor da periferia da abertura 20.

[00123] Localizado adjacente à abertura 20, o poço de contenção de líquido 26 e o recesso de filtro 28 é o segundo membro 30 que é posicionado em um local (não mostrado) localizado dentro de um compartimento de armazenamento (não mostrado) dentro do primeiro membro 18. Quando invertido, o segundo membro 30 forma um reservatório no qual as manipulações de tecido podem ser realizadas. Para facilitar a separação do segundo membro 30 do primeiro membro 18, um entalhe 32 é fornecido no lado de uma porção do segundo membro 30, que é de um tamanho tal que uma pessoa pode levantar o segundo membro do lugar no qual ele reside no primeiro membro 18.

[00124] Dentro do recesso de filtro 28 está localizado um filtro 29 (fornecido separadamente com os outros componentes) com uma malha no mesmo capaz de separar o material celular com mais de 100 μm de um sobrenadante de células.

[00125] A figura 2B fornece uma vista em perspectiva parcialmente explodida do aparelho 10, em que o segundo membro 30 é removido do primeiro membro 18 e invertido. A inversão do segundo membro 30 revela as paredes laterais 32 do segundo membro 30, que formam a barreira de contenção de líquido do reservatório e uma área de reservatório 34 na qual as manipulações de tecido podem ser realizadas.

[00126] A remoção do segundo membro 30 do primeiro membro 18 também revela um compartimento de armazenamento 36 no primeiro membro 18, no qual as soluções e ferramentas podem ser armazenadas quando o aparelho 10 não estiver em uso. Dentro do compartimento de armazenamento 36 está localizado um lugar 38, no qual o segundo membro 30 pode residir. O lugar 38 situa-se preferencialmente em torno da periferia do compartimento de armazenamento 36 em uma profundidade abaixo da superfície do primeiro membro 18 que é equivalente à altura das paredes laterais 32 do segundo membro 30.

[00127] A figura 3A fornece uma vista em perspectiva do primeiro membro 18 mostrando o compartimento de armazenamento 36, o interruptor de ativação do aquecedor 24, a abertura 20, o poço de contenção de líquido 26 e o recesso de filtro 28 formado dentro do primeiro membro. A figura 3B fornece uma vista posterior do primeiro membro 18, mostrando o recesso de filtro 28, o poço de contenção de líquido 26, o interruptor de ativação do aquecedor 24, o colar de abertura 21 e a parede posterior do compartimento de armazenamento 36. Tal como pode ser visto nesta figura, o recesso de filtro tem uma base cônica, proporcionando assim um meio para facilitar o acesso à suspensão celular que é filtrada através dele. Há localizado adjacente ao poço de contenção de líquido e sobre o lado oposto do poço de contenção de filtro um membro de posicionamento de bateria 40 que se projeta em direção à base 16 do aparelho (não mostrada) e fornece um meio para fixar as pilhas no lugar, que são necessárias para ativar o meio de aquecimento.

[00128] A figura 4 fornece uma vista em perspectiva da base 16 do aparelho 10, mostrando o frasco 22 localizado dentro de um campo de contenção 42. Entre o campo de contenção 42 e o frasco 22, está localizado (um) colar(es) de aquecimento 44, que circundam o corpo do frasco. Situa- se adjacente ao campo de contenção uma placa de circuito 46, que é mantida em posição pelo meio de contenção da placa de circuito 48, 50 e 52. A dita placa de circuito 46 está em comunicação elétricas com o(s) colar(es) de aquecimento 44 pelos fios 54. A placa de circuito também encontra-se em comunicação elétrica por meio dos fios 58 com o interruptor de ativação do aquecedor (não mostrado). É fornecido adjacente ao circuito 46 um meio de contenção de bateria 58, que possui 4 pilhas AA em posição imóvel (não mostrado). As baterias estão em comunicação elétrica com a placa de circuito 46 por meio dos fios 60. Quando o primeiro membro 18 está adaptado à base 16, as baterias são mantidas no lugar pelo meio de contenção de bateria 58, o meio de posicionamento de bateria 40 e a base de cada um do poço de contenção de líquido 26 e do recesso de filtro 28. Preferencialmente, a base cônica do recesso de filtro 28 também se projeta entre as pilhas no mesmo, proporcionando um meio adicional para fixar as pilhas na posição imóvel.

Exemplo 3

[00129] Foi testado se is hidrogéis de HA aumentam a viabilidade e a migração dos queratinócitos da epiderme basal do estrato humano de doadores adultos. Vários hidrogéis foram testados usando ensaios incluindo a migração celular entre poços, o ensaio da Proliferação Celular Aquosa em CellTiter® 96 e o Ensaio de Arranhão in vitro descrito abaixo. Protocolo para a Migração Celular entre Poços 1. Manter as culturas estoque dos queratinócitos epidérmicos primários (PEK), células normais, humanas e adultas no meio basal de células dérmicas suplementado com o kit de crescimento de queratinócitos e solução B de gentamicina-anfotericina (meio completo). Subcultivar as culturas estoque das células até 2,5 x 104 células/mL (estimativa) e realimentar com meio a cada 2 dias, ou quando é atingida uma densidade próxima da confluência. 2. A cada poço de uma placa com 24 poços, adicionar 500 μL de meio. Inserções com um poro de 8 μm e uma área de 0,3 cm2 serão pré-revestidas com material de teste e colocadas em um poço de uma placa de cultura com 24 poços. Raia A, colunas 1 a 3: branco, sem células, apenas meio. Raia B, colunas 1 a 3: linha de base, apenas células, sem revestimento. Raia C, colunas 1 a 3: colágeno tipo 1 (controle positivo) Raia D, colunas 1 a 3, e raias A a D, colunas 4 a 6: substâncias de teste em uma série de diluição em série. (Ilustrado abaixo).

3. Coletar as células e lavar as células PEK em meio por centrifugação a 150 x g durante 3 a 5 minutos. 4. Determinar a viabilidade (por exclusão por azul trypan) e o número de células, e suspender as células até uma concentração final de 3 x 10 células/mL em meio. 5. Colocar as inserções na placa. 6. Dispensar 100 μL de suspensão celular (30.000 células) em todos os poços da placa preparada na etapa 2. O volume total em cada poço deve ser igual a 165 μL. 7. Incubar a placa durante 6 a 12 horas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. 8. Lavar suavemente o filtro com PBS, removendo as células não migratórias na superfície superior, com um cotonete. 9. Fixar as células na superfície inferior com paraformaldeído 4% durante 2 horas. 10. Marcar as células na superfície inferior com hematoxilina de Harris durante 30 minutos. 11. Para cada membrana, contar quatro campos aleatoriamente selecionados com ampliação de 400 X, e determinar a média. Imagens podem ser capturadas das membranas. O Protocolo para os Testes de Viabilidade Celular usando o Ensaio de Proliferação Celular Aquoso em CellTiter 96® 1. Manter as culturas estoque dos queratinócitos epidérmicos primários (PEK), células normais, humanas e adultas no meio basal de células dérmicas suplementado com o kit de crescimento de queratinócitos e solução B de gentamicina-anfotericina (meio completo). Subcultivar as culturas estoque das células até 2,5 x 104 células/mL (estimativa) e realimentar com meio a cada 2 dias, ou quando é atingida uma densidade próxima da confluência é atingida. 2. Adicionar 50 μL/poço de amostras ou padrões para serem medidos e diluídos em meio completo. Raia A, colunas 1 a 3: branco, sem células, apenas meio. Raias B e C, colunas 1 a 3: linha de base, apenas células. Raias D a H, colunas 1 a 3: sanguinarina, resposta de dose (toxina) (50, 10, 5, 1 e 0,1 μM) Raias A a H colunas 4 a 6, 7 a 9 e 8 a 12: substâncias de teste em uma série de diluição em série Equilibrar a placa a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada, durante a coleta de células para ensaio. 3. Coletar as células e lavar as células PEK em meio completo por centrifugação a 150 x g durante 3 a 5 minutos. 4. Determinar a viabilidade (por exclusão por azul trypan) e o número de células, e suspender as células até uma concentração final de 6 x 105 células/mL em meio completo. 5. Dispensar 50 μL de suspensão celular (30.000 células) em todos os poços da placa preparada na etapa 2. O volume total em cada poço deve ser igual a 100 μL. 6. Incubar a placa durante 48 a 72 horas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. 7. Adicionar 20 μL por poço da solução de MTS/PMS. 8. Incubar a placa durante 1 a 4 horas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. Para medir a quantidade de formazana solúvel produzida por redução celular do MTS, proceda imediatamente com a etapa 9. Observação: para medir a absorbância em um momento posterior, adicione 25 μL de SDS 10% a cada poço para interromper a reação. Armazenar as placas tratadas com SDS, protegê-las da luz em uma câmara umidificada em temperatura ambiente durante até 18 horas. Prosseguir para a etapa 9. 9. Registrar a absorvância a 490 nm usando um leitor de placa de ELISA. 10. Representar graficamente a absorvância corrigida a 490 nm (eixo Y) versus a concentração dos produtos de teste (eixo X) e determinar o valor de ED50 determinando o valor do eixo x, correspondente à metade da diferença entre os valores de absorvância máximo (platô) e mínimo (sem controle do fator de crescimento). ED50 = concentração do fator de crescimento necessária para gerar metade da resposta máxima. Observação: dependendo da resposta observada a partir dos substratos de teste, uma curva padrão de células/poço pode ser realizada para estimar numericamente a proliferação. Isso poderia ser realizado por plaqueamento de um número conhecido variável de células por poço e medindo a produção de fomazana. Protocolo para Ensaio de Arranhão - Migração Celular 1. Manter as culturas estoque dos queratinócitos epidérmicos primários (PEK), células normais, humanas e adultas no meio basal de células dérmicas suplementado com o kit de crescimento de queratinócitos e solução B de gentamicina-anfotericina (meio completo). Subcultivar as culturas estoque das células até 2,5 x 104 células/mL (estimativa) e realimentar com meio a cada 2 dias, ou quando é atingida uma densidade próxima da confluência é atingida. 2. A cada poço de uma placa de 24 poços, adicionar as substâncias de teste adequadas. Raia A, colunas 1 a 3: branco, sem células, apenas meio. Raia B, colunas 1 a 3: linha de base, apenas células, sem revestimento. Raias C e D, colunas 1 a 3, e raias A a D, colunas 4 a 6: substâncias de teste em uma série de diluição em série determinada anteriormente, conforme for necessário. 3. Coletar as células e lavar as células PEK em meio por centrifugação a 150 x g durante 3 a 5 minutos. 4. Determinar a viabilidade (por exclusão por azul trypan) e o número de células, e suspender as células até uma concentração final de 5 x 104 células/mL em meio. 5. Dispensar 600 μL de suspensão celular (30.000 células) em todos os poços da placa preparada na etapa 2. 6. Incubar a placa durante 24 horas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. 7. Com uma ponta de pipeta, arranhar a monocamada de células para criar uma zona livre de células no centro do poço. 8. Aspirar o meio usado e as células. 9. Lavar com 300 μL de meio para remover todos os fragmentos celulares e as células soltas. 10. Recobrir a superfície desnuda com as substâncias de teste (ou meio) durante 1 hora a 37 °C, em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. 11. Aspirar o meio usado/as substâncias de teste. 12. Lavar as camadas de células uma vez com meio. 13. tornar a encher com 600 μL de meio. 14. Incubar a placa durante 16 horas a 37 °C em uma atmosfera de CO2 a 5% umidificada. As imagens serão coletadas 16 horas após o ferimento. Observação: dependendo dos resultados observados, as células podem ser pré-tratadas com mitomicina C. Esse pré- tratamento irá avaliar a contribuição relativa da migração celular para o fechamento do ferimento in vitro na ausência de proliferação.

[00130] As células utilizadas para todos os experimentos foram obtidas junto à Coleção Americana de Cultura de Células (No. de Catálogo PCS-200-011, lote 59098517). Essas células eram queratinócitos epidérmicos primários de um humano adulto normal. As células foram mantidas em meio basal de células dérmicas (No. ATCC: PCS 200-030) suplementado com kit de crescimento de queratinócitos (No. ATCC PCS 200-040) que continha extrato de pituitária bovino, TGF-β humana recombinante, L- glutamina, hemissuccinato de hidrocortisona, insulina, epinefrina e apotransferrina. Uma solução de gentamicina- anfotericina B também foi adicionada ao meio (No. ATCC: 999-025). As células foram descongeladas, cultivadas e subcultivadas de acordo com as recomendações da ATCC.

[00131] Ácido hialurônico (HA) e os hidrogéis NINJA™ (ácido hialurônico com colágeno) foram preparados como a seguir.

[00132] Ácido hialurônico foi preparado através de um método descrito na Patente Norte-Americana No. 6.660.853. Em resumo, o ácido hialurônico bruto proveniente de rooster combs é dissolvido em água pura a uma concentração estimada de entre 1 e 5 mg/mL. Usando uma membrana de filtro Pall de 30 kDa de MWCO tipo Centramate, com uma configuração de canal aberto, a solução foi, em seguida, diafiltrada contra 5 volumes de água pura. O tipo de membrana foi uma membrana de polietersulfona da Omega com uma área de filtro de 1,0 pé quadrado (929 cm2). Uma pressão transmembranar (TMP) de no máximo 8,0 psig (55,16 kPag) foi mantida, assim como uma vazão transversal de pelo menos 1.000 mL/min. A bomba usada para realizar a diafiltração foi uma Masterflex® L/S.RTM da Cole-Parmer. A Bomba da Tubulação Padrão de Precisão foi capaz de bombear mais de 1700 mL/min, No. SKU EW-77911-00. A esterilização foi realizada por meio de filtros de náilon bionerte Pall de 0,22 mícrons. A solução foi, em seguida, liofilizada e utilizada na formulação asséptica utilizando solução salina a 0,9% ou meio celular, conforme necessário. As soluções foram feitas inicialmente para 30 mg de HA/mL ("HA30") e, em seguida, diluídas conforme necessário (por exemplo, até 10 mg/mL, "HA10").

[00133] NINJA™ foi formulado usando o ácido hialurônico purificado acima, e combinando-o com um colágeno tipo I/III nativo (não reticulado) em um método semelhante ao da Patente Norte-Americana No. 7.371.399. A solução foi, em seguida, liofilizada e utilizada na formulação asséptica utilizando solução salina a 0,9% ou meio celular, conforme necessário. As soluções foram feitas inicialmente para 30 mg de polímero/mL ("NINJA30") e, em seguida, diluídas conforme necessário (por exemplo, até 10 mg/mL, "NINJA10").

[00134] Um kit comercialmente disponível [CellTiter, Promega] foi comprado e usado para testar a viabilidade celular (ensaio de proliferação celular MTS) de acordo com as instruções do fabricante. O ensaio é um método colorimétrico para a determinação da atividade das enzimas mitocondriais. Em resumo, queratinócitos foram semeados em placas de 96 poços a uma densidade de 3 x 104 células por poço e foram incubados de um dia para o outro, com e sem hidrogéis. Vinte microlitros do reagente CellTiter contendo o composto tetrazólio e reagentes de acoplamento de elétrons foram, em seguida, adicionados em cada poço a ser catalisado por enzimas desidrogenase mitocondrial em células metabolicamente ativas. As placas foram incubadas durante 1 a 4 h e a absorvância colorimétrica foi registrada a 490 nm por um leitor de microplaca. Além disso, as leituras foram feitas nos poços em branco e poços em contagem de células total. Os poços da contagem de células total foram lidos, subtraídos dos brancos e a % de viabilidade foi determinada. Os resultados estão representados graficamente na figura 5.

[00135] Observou-se uma redução na viabilidade celular in vitro em concentrações acima de 0,3 mg/ml dos hidrogéis de HA. Isto ocorre provavelmente devido a uma das duas situações. Primeiramente, é possível que a viscosidade dos hidrogéis reduza a difusão de nutrientes para as células. Isto é suportado pela diminuição na viabilidade observada no hidrogel NINJA em concentrações superiores a 1,25 mg/mL. O NINJA é mais viscoso em concentrações de polímero equivalente do que o HA. Em segundo lugar, é igualmente possível que as células não morreram, de fato, em concentrações de polímero mais altas. É muito provável que o corante, MTS, não foi capaz das se difundir nas células e, portanto, ele não foi capaz de ser processado em formazana através das enzimas redutase mitocondriais. Isso também poderia aparecer como uma absorvância baixa nas leituras de 490 a 500 nm e atuar como uma leitura de baixa viabilidade falsa. Deve-se notar, no entanto, que o mecanismo de difusão molecular pode não ser o mecanismo dominante in vivo. Situações in vivo podem envolver a degradação enzimática, transferência de massa convectiva (fornecimento de sangue) e outros mecanismos ainda não quantificados. Portanto, em cenários in vivo, pelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, ou altas concentrações de polímero mais altas do que o limite in vitro de 0,3 mg/mL podem ser toleradas.

[00136] O ensaio de migração entre poços foi realizado de acordo com o protocolo acima. Em resumo, inserções de cultura de células equipadas com um membro de 8 μm de poro de 0,3 cm2, revestido com hidrogéis, foram colocadas em placas de cultura de 24 poços, formando os compartimentos superior e inferior do ensaio, respectivamente. Os queratinócitos (3 x 104 por poço), cultivados em meio de controle, foram semeados em diferentes poços com topo revestido com hidrogel de diferentes viscosidades e meio de controle, e incubados durante 3 dias. Todas as incubações foram realizadas sob ar/CO2 a 95/5%, a 37 °C. Após os experimentos, os filtros foram lavados duas vezes com PBS, e as células na superfície superior foram removidas usando cotonetes. As células na superfície inferior do filtro foram fixadas em paraformaldeído 4% (2 h) e coradas com hematoxilina de Harris durante 30 min. As células migrando para o lado inferior das membranas foram contadas em quatro campos de potência elevada selecionados aleatoriamente, e a contagem média foi determinada a partir de experimentos em duplicata. Os resultados são mostrados na figura 6. Todas as formulações de hidrogel superam em desempenho a situação controle (apenas meio), com destaque para o NINJA10.

[00137] O ensaio de arranhão in vitro foi realizado de acordo com o protocolo acima. Em resumo, os queratinócitos cultivados (5 x 104/mL) foram plaqueados em placas de cultura de tecidos pré-revestidas com hidrogel de diferentes propriedades, e controle sem ser hidrogel, e foram incubados de um dia para o outro. Os queratinócitos cultivados em meio controle foram semeados em diferentes placas de cultura de 24 poços revestidas com hidrogel durante 3 dias. Em seguida, a monocamada de células foi arranhada de forma padrão com um aparelho de plástico para criar uma zona livre de células em cada placa. O meio foi, em seguida, aspirado, seguido por uma lavagem extensiva para remover os fragmentos celulares. As superfícies desnudadas foram recobertas com meio de cultura de queratinócitos e hidrogel durante 1 h a 37 °C. Em seguida, o meio de cultura contendo hidrogel foi aspirado e as camadas de células foram lavadas uma vez. As placas de cultura foram reabastecidas com meio para queratinócitos fresco. Fotografias foram coletadas em intervalos de 24 horas após o ferimento durante até 4 dias. A re- epitelização in vitro foi documentada por fotografia, e a quantidade de migração foi manualmente quantificada por análise de imagens assistida por computador. Os dados foram expressos como uma porcentagem da área do arranhão preenchida pelos queratinócitos (figura 7). Os resultados foram obtidos de todo o campo do "arranhão, tomados em duplicata. Além disso, um segundo grupo duplicado de poços foi testado com a presença adicional de mitomicina c (MMC +/-). O uso de MMC retarda a proliferação celular. Assim, diferenças na cicatrização de arranhões in vitro com e sem o MMC podem fornecer uma indicação sobre a função do hidrogel a migração versus a mera proliferação e vice- versa.

[00138] Conforme ilustrado na figura 7, de todos o hidrogéis testados, NINJA10 resultou no mais alto grau de cicatrização. Ele foi significativamente melhor do que o meio controle no dia 2 e continuou a ser até o término do teste. O próximo melhor hidrogel foi NINJA30. NINJA30 apresentou uma resposta de crescimento retardada. Ela foi indistinguível de outros hidrogéis e meios até o último dia, quando ela passou de 33% a 75% em 24 horas. A viscosidade mais alta do NINJA30 pode ter abrandado a difusão dos nutrientes celulares necessários, até o tempo no qual o hidrogel foi diluído devido à difusão do contador.

[00139] Diferenças na cicatrização de arranhões in vitro com e sem (+/-) MMC podem fornecer uma indicação sobre a função do hidrogel na migração versus a mera proliferação e vice-versa. No grupo controle com meio MMC-, o efeito sobre a cicatrização foi conforme o esperado. As células MMC+ mostraram cicatrização retardada, em comparação com as células MMC-, embora a diferença não foi significativa. Esse efeito, no entanto, foi revertido no grupo HA30, com o MMC+ mostrando melhor cicatrização. O HA10 MMC+ apresentou cicatrização retardada durante os primeiros 3 dias em comparação com HA10 MMC- mas, posteriormente, foi invertido no quarto dia. NINJA30 e NINJA10 MMC+ também mostrou ligeiros retardos na cicatrização.

[00140] Em seguida, os hidrogéis atuam para suprarregular a proliferação e a migração celular. Devido à tendência geral de todos os hidrogéis contribuírem para a cicatrização, e a importância do grupo NINJA10 (e parte do grupo NINJA30), NINJA pode ser uma tecnologia apropriada para aumentar a ReCell ® e a cicatrização de feridas.

[00141] Como discutido acima, o mecanismo dominante em qualquer sistema in vitro é a difusão molecular. Os nutrientes do meio se difundem nos hidrogéis, e os polímeros se difundem para fora dos hidrogéis ao longo do tempo. Isso é referido como uma contradifusão. Condições in vivo aumentam a complexidade de qualquer modelo, devido à introdução de mecanismos adicionais, incluindo convecção forçada (fluxo sanguíneo) e degradação enzimática. Portanto, é possível que embora os testes acima sugerem que 0,3 mg de polímero/mL é o limite da viabilidade, isto é apenas verdade para sistemas in vitro. Os limites de viabilidade in vivo são, provavelmente, maiores. De fato, a tecnologia NINJA™ foi extensivamente injetada em pacientes ao longo dos últimos vários anos, especialmente na articulação temporomandibular, que contém uma variedade de condrócitos, fibroblastos e outras populações de células. Injeções de 30 mg de polímero/mL mostraram um aumento significativo na cicatrização. Portanto, concentrações de gel de polímero mais altas na faixa que parece comprometer a viabilidade celular in vitro podem ser toleradas in vivo.

[00142] Os resultados positivos iniciais sugerem uma solução com viscosidade mais alta como veículo para a aplicação de células autólogas. As soluções podem incluir a formulação NINJA10 ou uma variante da mesma.

[00143] Modificações e variações dos métodos e do dispositivo da invenção descritos serão evidentes para as pessoas versadas na técnica, sem se afastar do escopo e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita juntamente com as incorporações preferenciais específicas, deve ser entendido que a invenção, tal como reivindicada, não deve ser demasiadamente limitada a tais modalidades específicas. De fato, várias modificações dos modos descritos para a realização da invenção, que são óbvias para as pessoas versadas nos domínios relevantes em que essa invenção se encontra, se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00144] Todas as publicações e patentes aqui mencionadas são incorporadas, por meio desse documento, em suas totalidades, como se cada publicação individual ou patente fosse especificamente e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

Claims

1. Método para preparar células para uso cosmético em um procedimento relacionado ao epitélio, caracterizado pelo fato de compreender: fornecer uma população de células, incluindo células viáveis e funcionais, derivadas de uma amostra de tecido epitelial; e expor a população de células a um agente exógeno, em que o agente exógeno é uma proteína de choque térmico ou um fragmento da mesma, ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, um fator de crescimento, células tronco adiposas ou qualquer combinação dos itens anteriores, em que o dito uso cosmético é para dermoabrasão cosmética de renovação e rejuvenescimento cosmético, e em que o dito método não é realizado no corpo humano ou corpo animal.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células viáveis incluem células diferenciadas que são funcionais, e células capazes de dividir ou se diferenciar.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido epitelial é obtida de um ou mais dentre epitélio da pele, epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio córneo e epitélio glandular.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, quando a amostra de tecido epitelial é epitélio de pele, as células viáveis são derivadas de uma camada dérmica, camada epidérmica, ou de uma camada dérmica e uma camada epidérmica do epitélio de pele.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, quando a amostra de tecido epitelial é epitélio de pele, a população de células compreende queratinócitos, melanócitos, fibroblastos, células de Langerhans ou qualquer combinação das mesmas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, quando a amostra de tecido epitelial é epitélio de pele, a população de células compreende as células tronco da pele.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as células tronco da pele são combinadas com células que não são células tronco.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda semear a população de células a uma matriz ou estrutura in vitro.

9. Método para preparar células para uso cosmético em um procedimento no epitélio, caracterizado pelo fato de compreender: fornecer à população de células uma condição selecionada do grupo consistindo em estresse e um agente exógeno, em que a população de células inclui células viáveis e funcionais de uma amostra epitelial, em que o agente exógeno é uma proteína de choque térmico ou um fragmento da mesma, ácido hialurônico, plasma enriquecido com plaquetas, um fator de crescimento, células tronco adiposas ou qualquer combinação dos itens anteriores, em que o referido método não é realizado no corpo humano ou animal.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as células viáveis incluem células diferenciadas que são funcionais, e células capazes de dividir ou se diferenciar.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido epitelial é obtida de um ou mais dentre epitélio da pele, epitélio respiratório, epitélio vascular, epitélio córneo e epitélio glandular.

12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, quando a amostra de tecido epitelial é uma amostra de tecido da pele, as células viáveis são derivadas de uma camada dérmica, camada epidérmica, ou de uma camada dérmica e uma camada epidérmica de epitélio da pele.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, quando a amostra de tecido epitelial é epitélio da pele, a população de células compreende queratinócitos, melanócitos, fibroblastos, células de Langerhans ou qualquer combinação das mesmas.

14. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que, quando a amostra de tecido epitelial é epitélio da pele, a população de células compreende as células tronco da pele.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as células tronco da pele são combinadas com células que não são células tronco.

16. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito estresse é um ou mais dentre hipóxia, calor, trauma mecânico, privação de nutrientes e exposição à enzima.

17. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito estresse induz a população de células a exibir uma característica induzida por estresse.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a característica induzida por estresse é um nível elevado de expressão de uma proteína selecionada do grupo consistindo em Hsp90 e Hsp90a.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito estresse induz a expressão de uma proteína de choque térmico pela população de células, obtendo assim as células para uso no dito procedimento relacionado ao epitélio que tem um elevado nível da dita proteína de choque térmico em comparação com um nível controle da dita proteína de choque térmico, sem ser exposta ao dito estresse.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a proteína de choque térmico é selecionada do grupo consistindo em Hsp90 e Hsp90a.